CN116396382A - 一种靶向幽门螺杆菌HpaA的鲨鱼单域抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种靶向幽门螺杆菌HpaA的鲨鱼单域抗体及其应用。所述鲨鱼单域抗体为氨基酸序列分别如SEQ ID No.1所示的2A2、SEQ ID No.2所示的3D6、SEQ ID No.3所示的2D9。本发明还利用所述鲨鱼单域抗体构建基于双价单域抗体的幽门螺杆菌检测方法，检测灵敏度较高。本发明所述的靶向HpaA的单域抗体能有效与HpaA抗原和幽门螺杆菌结合，且pH稳定性好，为开发幽门螺杆感染的治疗药物和诊断试剂奠定基础。

Description

一种靶向幽门螺杆菌HpaA的鲨鱼单域抗体及其应用

技术领域

本发明属于抗体制备领域，特别涉及一种靶向幽门螺杆菌HpaA的鲨鱼单域抗体及其应用。

背景技术

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)被认为是人类主要的胃部病原体，世界卫生组织将其定为Ⅰ类致癌因子。H.pylori感染可引发一些的胃肠道疾病，如慢性活动性胃炎、消化性溃疡、胃腺癌和粘膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤、胃癌等，且全球有近一半的人感染H.pylori。然而，目前H.pylori的治疗主要依赖抗生素疗法，但随着抗生素耐药问题日益严重，迫使人们寻找新的治疗方法。

H.pylori adhesin A(HpaA)为神经氨酰乳糖结合原纤维血凝素，是幽门螺杆菌多种粘附素中的一种，介导细菌在胃肠道定植。电镜下观察，HpaA蛋白存在于H.pylori的菌体和鞭毛鞘表面，并且在H.pylori各菌株间保守存在，与其他蛋白同源性低，具有较强的免疫原性。且研究发现，将HpaA基因敲除的H.pylori较野生型在小鼠体内的定植能力显著下降。因此，HpaA是用于H.pylori治疗和诊断的关键靶点。

鲨鱼等海洋软骨鱼类的体内存在一种仅含有重链的抗体(IgNAR)，其重链可变区具有完整的抗原结合活性，通过基因工程技术将重链可变区单独克隆表达，得到的新型抗体被称为VNAR，因其分子量小(11-15kDa)，也被称为纳米抗体。鲨鱼单域抗体具有分子量小、结构简单、理化性质稳定、易于基因工程改造以及可识别隐藏的抗原表位等特点，在各类疾病的诊断与治疗等方面具有广阔的应用前景。目前研究较多的靶向H.pylori的抗体主要为单克隆抗体和卵黄抗体等。单克隆抗体因其稳定性较差、分子量大且结构复杂，主要应用于临床H.pylori感染的检测和诊断，并未有抗体药物用于H.pylori感染的治疗。

免疫分析方法是常用的致病微生物的检测方法，具有灵敏度高、准确度高、操作简便等优点，而高质量的抗体是免疫检测的关键。因此，开发靶向HpaA的VNAR，可以对开发H.pylori感染的口服抗体药物和免疫诊断试剂奠定基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种靶向HpaA的鲨鱼单域抗体及其应用。本发明得到了3种特异性针对HpaA的单域抗体2A2、3D6和2D9，所述单域抗体具有很好的亲和力和靶向性。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一种靶向HpaA的鲨鱼单域抗体，其具有如SEQ ID No.1所示、或者SEQ ID No.2所示、或者SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。

进一步的，所述鲨鱼单域抗体包括框架区FR、高变区HV和互补决定区CDR。

进一步的，所述框架区FR包括FR1、FR 2、FR3和FR4；所述FR1的氨基酸序列为：AARVEQTPTTTTKEAGESLTINCVLR；所述FR2的氨基酸序列为：TNWYFTKKGATK或TAWYFTKKGATK或ARTDWDFTKKGATK；所述FR3的氨基酸序列为：SLSNGGRYAESFSLRISDLRVEDSGTYHC；所述FR4的氨基酸序列为：EGGGTILTVKP。

进一步的，所述高变区HV包括HV2和HV4；所述HV2的氨基酸序列为：KKESLSNG；所述HV4的氨基酸序列为：NKASKS。

进一步的，所述互补决定区CDR包括CDR1和CDR3；所述CDR1的氨基酸序列为：DSSCKLAST或DSACVLART；所述CDR3的氨基酸序列为：KVSANTWMICDTD或KALLAGCHWELPFDY或VASSWSICAG。

本发明还提供了一种编码所述的鲨鱼单域抗体的基因，其具有如SEQ ID No.4所示、或者SEQ ID No.5所示、或者SEQ ID No.6所示的核苷酸序列。

本发明还提供了一种含有所述的基因的重组载体。

本发明还提供了一种含有所述的基因的工程菌株。

本发明还提供了一种双价单域抗体，其是由两个相同的权利要求1所述的鲨鱼单域抗体的氨基酸序列中间加上一个柔性的连接子(G₄S)₃构建获得的。

进一步的，所述双价单域抗体具体为BiNb-2A2和BiNb-3D6。

本发明还提供了所述的鲨鱼单域抗体或者所述的双价单域抗体在制备HpaA蛋白靶向剂中的应用。

本发明还提供了所述的鲨鱼单域抗体或者所述的双价单域抗体在制备检测幽门螺杆菌的免疫试剂中的应用。

进一步的，所述免疫试剂检测幽门螺杆菌的检测限为不小于152.4ng/mL。

进一步的，所述免疫试剂检测幽门螺杆菌中HpaA蛋白的最低检测限是3.9ng/mL。

本发明还提供了一种用于检测或免疫诊断幽门螺杆菌感染的试剂盒，其中包含权利要求5所述的双价单域抗体，其作为捕获抗体和/或检测抗体。

进一步的，所述捕获抗体为BiNb-2A2，其浓度为5μg/mL；所述检测抗体为BiNb-3D6，其浓度为1.25μg/mL。

进一步的，所述试剂盒中还包含封闭液、包被液；所述包被液为0.01mol/L pH 7.4的PBS，所述封闭液为4％MPBS。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：

本发明制备得到的鲨鱼单域抗体2A2、3D6和2D9分子量小，pH稳定性好，可胞内表达，亲和力高和结构简单易于表达和纯化的特点，可用于幽门螺杆菌检测，且具有较高的灵敏度，在幽门螺杆菌的检测试剂和治疗药物开发方面具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为鲨鱼单域抗体VNAR扩增结果。

图2为鲨鱼单域抗体噬菌体展示文库菌液PCR鉴定结果。

图3为特异性噬菌体的单克隆ELISA鉴定结果。

图4为鲨鱼单域抗体初筛结果。

图5为鲨鱼单域抗体2A2、3D6和2D9的纯化结果。

图6为间接ELISA检测单域抗抗体与抗原HpaA结合结果。

图7为BLI检测单域抗体亲和力结果。

图8为生物素标记单域抗体2A2与2A2、3D6和2D9的竞争ELISA结果。

图9为间接ELISA检测单域抗体与幽门螺杆菌菌体结合结果。

图10为双价单域抗体的制备与亲和力测定结果；其中，(A)为双价单域抗体纯化结果；(B)间接ELISA检测双价单域抗体与抗原HpaA结合结果。

图11为双价单域抗体在酸性pH稳定性结果。

图12为双抗夹心ELISA最适抗体工作浓度确定结果。

图13基于双价单域抗体的双抗夹心ELISA最低检测限结果；其中，(A)为检测重组HpaA蛋白的结果；(B)为检测幽门螺杆菌裂解液结果。

具体实施方式

为了更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。

实施例1：构建HpaA的单域抗体免疫文库

1.抗原的制备与鲨鱼免疫

(1)取100ng实验室保藏的pET28a-HpaA重组表达质粒，用热激法转化到100μLE.coli BL21(DE3)感受态细胞中，在含有终浓度为50μg/mL卡那霉素的LB固体培养板上，37℃培养箱中培养过夜。挑取单克隆，接种到10mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃摇床中过夜培养。按1:100转接到新鲜的液体培养基中，菌液OD₆₀₀＝0.4-0.6，加入终浓度0.01mM IPTG在25℃、180rpm培养24h，然后将菌体进行超声破碎，经过镍离子亲和层析纯化，获得重组HpaA蛋白。

(2)首次免疫将200μg重组HpaA蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合，免疫条纹斑竹鲨；随后每两周加强免疫一次，共加强免疫5次，将200μg重组HpaA蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂混合进行加强免疫。

2.单域抗体文库构建

从免疫后的鲨鱼的尾静脉采集血，提取外周血淋巴细胞，并处死鲨鱼取鲨鱼的脾脏，提取鲨鱼外周血淋巴细胞和脾脏的RNA，反转录成cDNA。

以cDNA为模板，利用简并引物扩增VNAR片段。所用的引物序列为：

扩增体系如下：

反应条件如下：

1％的琼脂糖凝胶电泳检测基因扩增结果，VNAR片段在500bp左右(图1)，胶回收VNAR PCR片段。将回收的VNAR片段和噬菌粒pComb3XSS用限制性内切酶SfiⅠ酶切，酶切体系如下：

酶切反应条件为50℃过夜，酶切完成后用DNA回收试剂盒回收片段和载体，然后进行T4连接，连接体系如下：

16℃连接过夜，对连接产物进行回收浓缩。

将电击杯预冷，TG1感受态细胞于冰上融化后，加入取5μL连接产物，轻轻混匀，置于冰上10min,转移至电击杯中，1.8kV电击5ms,立即加入950μL的Recovery Medium,立即于37℃、250rpm培养1h。随后将菌液分别稀释10³、10⁴、10⁵、10⁶，分别取100μL涂布于含有氨苄青霉素抗性的2×YT固体平板，37℃倒置培养过夜。根据平板上的菌落数，计算构建的鲨鱼单域抗体免疫文库的库容量。

随机挑取20个单克隆进行菌液PCR鉴定(图2)及测序，将所得序列进行对比，得到文库的库容量，插入率及多样性，如下表所示：

实施例2：鲨鱼单域抗体免疫免疫文库的淘选

1、鲨鱼单域抗体噬菌体原始文库的扩增

取500μL文库菌种加到200mL 2×YT液体培养基(含100μg/mL Amp)中，调节菌液OD₆₀₀在0.1左右，37℃，200rpm培养1-2h。使OD₆₀₀＝0.4-0.6，加入菌体量20倍的M13K07进行感染，37℃静置感染，30min混匀一次，共感染1h，然后室温5000rpm离心30min收集菌体，弃上清。用200mL新鲜的2×YT液体培养基(50μg/mL Kana,100μg/mL Amp,0.1mM IPTG)重悬，30℃、190rpm培养过夜。

次日将培养过夜的菌液4℃、4900rpm离心30min，上清用0.45μm的滤膜过滤，加入终体积为20％的PEG8000/NaCl溶液，冰浴30min。然后4℃、6000rpm离心20min，弃上清，用5mL的PBS重悬，加入终浓度为10％的甘油于-80℃保存。

2、鲨鱼抗体噬菌体文库的淘选

(1)第一轮淘选

(A)取重组蛋白HpaA用PBS稀释至10μg/mL和3％BSA，200μL/孔包被于酶标板4℃过夜。

(B)PBST(0.1％ Tween-20in PBS)洗板3次后，包被抗原的孔加入300μL/孔3％BSA封闭；包被3％BSA的孔加入1×10¹¹pfu的文库噬菌体，200μL/孔，37℃孵育1h。

(C)取出包被3％BSA孔中的文库噬菌体于EP管中，PBST洗板3次，将噬菌体加入抗原孔中，37℃孵育1-1.5h。

(D)PBST洗板9次，将处于生长对数期的TG1菌液加入包被抗原的孔中，200μL/孔，37℃静置感染30min，收集感染好的TG1，更换新鲜的TG1，如此重复3次。

(E)将收集的TG1菌液梯度稀释10³、10⁴、10⁵倍，分别取100μL分别涂板含氨苄青霉素抗性的2×YT固体平板，37℃培养过夜，计算长出的菌落数。

(F)在剩余的TG1菌液中加入20倍菌体量的M13K07辅助噬菌体，37℃静置1h。将菌液室温8000rpm离心5min，收集菌体，重悬于10mL新鲜2×YT液体培养基(50μg/mL Kana,100μg/mL Amp,0.1mM IPTG)，30℃，200rpm培养过夜。

(2)第二轮淘选

步骤同第一轮淘选，抗原包被浓度为4μg/mL，封闭液为5％MPBST，洗板次数为12次，其余操作同第一轮淘选。

(3)第三轮淘选

步骤同第一轮淘选，抗原包被浓度为2μg/mL，洗板次数为13次，其余操作同第一轮淘选。

三轮淘选后，特异性噬菌体得到明显富集，如下表所示。

(4)间接噬菌体ELISA筛选靶向HpaA的单域抗体的阳性单克隆

(A)向96孔深孔板每孔加入200μL新鲜的2×YT/A100液体培养基，从第三轮淘选过夜培养的平板上挑取单菌落190个于96孔板中，37℃摇床220rpm培养6h，另取一个96孔深孔板加入新鲜的2×YT(20倍菌体量M13K07辅助噬菌体、100μg/mL Amp、0.1mM IPTG)100μL/孔，每孔对应加入对数生长期的菌液100μL，37℃静置感染30min，30℃摇床220rpm过夜培养。

(B)用PBS稀释HpaA重组蛋白至1μg/ml，按100μL/孔包被于酶标板上，4℃过夜；

(C)弃去上清液，每孔用300μL PBST缓冲液洗涤，共洗涤3次；

(D)加入200μL/孔5％MPBST，在37℃下封闭2h；

(E)PBST清洗板3次，步骤同(C)；

(F)将培养过夜的96孔深孔板于4℃、3000rpm离心30min，取96孔深孔板中上清加入酶标板，以培养基为空白对照，100μL/孔，37℃孵育1h；

(G)PBST清洗板3次，步骤同(C)；

(H)加入100μL/孔的HRP标记的Anti-M13抗体(1:1000稀释在5％MPBST)，37℃孵育1h；

(I)PBST清洗板3次，步骤同(C)；

(J)向孔板中加入100μL/孔的TMB底物，室温反应5-10min。加入50μL/孔1M H₂SO₄终止显色反应，酶标仪读取OD₄₅₀处的读数，取读数大于空白对照2.1倍为阳性克隆，将阳性克隆送至北京擎科生物科技有限公司进行测序。

结果如图3所示，190个单克隆中有92个的吸光度值在阴性对照的2.1倍以上，即为阳性单克隆，即有92个与HpaA特异性结合的噬菌体，则阳性率为48.4％。将这92个阳性单克隆送去测序，经过与数据库中序列比对，这92个单克隆的基因序列均为鲨鱼单域抗体基因序列。将测序结果翻译成氨基酸序列，通过比对，除去重复的氨基酸序列，最终得到17株不同序列的鲨鱼单域抗体，可用于后续的表达纯化。

(5)鲨鱼单域抗体的初步筛选

根据IMGT网站以及Greenberg等对鲨鱼单域抗体氨基酸序列的分区原则，分析出17株鲨鱼单域抗体的FR、HV和CDR区。根据单域抗体的CDR区氨基酸序列的相似程度，将17株单域抗体共分为4组。通过比较每组单域抗体的亲和力，选择其中亲和力较强的序列进行后续的重组表达纯化。将17个特异性噬菌粒转化至E.coli HB215感受态细胞中，37℃培养过夜后，挑取单克隆至2×YT/A100液体培养基中，于37℃摇床190rpm培养6h，按1:100转接至新鲜的2×YT/A100液体培养基，37℃摇床培养1-2h，摇至OD₆₀₀约为0.4-0.6左右，加入终浓度为1mM IPTG，于30℃，200rpm培养过夜。次日，在4℃，5000rpm离心15min，收集菌体，每管中加1mL的1×PBS重悬菌体，加100×蛋白酶抑制剂混合和PMSF在冰浴中超声破碎，菌液于4℃，12000rpm离心10min，取上清，-80℃保存，用于后续的检测。

用PBS稀释HpaA重组蛋白至4μg/ml，按100μL/孔包被于酶标板上，4℃过夜；翌日，PBST洗板3次后，每孔加入200μL的5％MPBST，在37℃下封闭2h；PBST洗板后，将不同单克隆诱导裂解液上清2倍梯度稀释，以pComb3XSS噬菌粒诱导裂解液上清为阴性对照，100μL/孔加入板中，37℃孵育1.5h；PBST洗板后，加入100μL/孔的HRP Anti-HA tag(1:5000稀释在5％MPBST中)，37℃孵育1h；PBST清洗板3次，加入100μL/孔的TMB底物，室温反应5-10min。加入50μL/孔1M H₂SO₄终止显色反应，酶标仪读取OD₄₅₀处的信号值。

结果如图4，单域抗体1B6、3E2、1G7和1B1表达菌株裂解液上清与抗原HpaA无明显结合，其余单域抗体表达菌株的裂解液上清均与抗原有明显结合。四组单域抗体中与重组HpaA亲和力相对强的分为2A2、2D9、3D6和1A4。但1A4与HpaA的亲和力较2A2、3D6以及2D9的低，因此，我们选择2A2、3D6和2D9这三株单域抗体进行重组表达纯化。

单域抗体2A2的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；单域抗体3D6的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；单域抗体2D9的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

实施例3：鲨鱼单域抗体原核诱导表达与纯化

利用同源重组ClonExpress II One Step Cloning试剂盒，将实施例2中淘选得到的2A2、3D6和2D9三株单域抗体克隆至pET28a表达载体，反应体系如下表：

将反应体系置于37℃反应30min，连接产物用于转化。

将上述连接产物直接转化入E.coli DH10β感受态细胞中，37℃过夜培养。挑单克隆经测序验证重组表达载体构建成功，随着提质粒，转化至E.coli BL21(DE3)感受态中，经IPTG诱导表达，超声破碎经镍离子亲和层析纯化，纯化结果如图5所示，将纯化得到的抗体置于-80℃保存。

实施例4：单域抗体与抗原的亲和力检测

首先按照生物素化试剂盒说明书将单域抗体重组蛋白及重组抗原进行生物素标记。

1.间接ELISA检测单域抗体与抗原的亲和力

(1)用PBS稀释HpaA重组蛋白至4μg/ml，按100μL/孔包被于酶标板上，4℃过夜；

(2)弃去上清液，每孔用300μL PBST缓冲液洗涤，共洗涤3次；

(3)加入200μL/孔含3％BSA的PBST，在37℃下封闭2h；

(4)PBST清洗板3次，同步骤(2)；

(5)加入100μL/孔的不同浓度(100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001、0μg/mL)的生物素化的单域抗体，37℃孵育1.5h；

(6)PBST清洗板3次，同步骤(2)；

(7)加入100μL/孔的Streptadivin-HRP(1:10000稀释在3％BSA的PBST中)，37℃孵育1h；

(8)PBST清洗板3次，同步骤(2)；

(9)向孔板中加入100μL/孔的TMB底物，室温反应5-10min。加入50μL/孔1M H₂SO₄终止显色反应，酶标仪读取OD₄₅₀处的读数。

结果如图6所示，生物素标记的单域抗体2A2与HpaA的结合最强。

2.BLI检测单域抗体与抗原的亲和力

单域抗体的结合动力学通过使用Octet RED96e分析系统测定。先将HpaA蛋白如上所述进行生物素化。用含有0.1％BSA和0.002％Tween-20的PBS将生物素化的HpaA蛋白稀释至10μg/mL，固定到链霉亲和素(SA)生物传感器上，固定时间为90s，之后在缓冲液中baseline 120s使得基线平稳，再与不同浓度的单域抗体(15.6nM、31.2nM、62.5nM、125nM、500nM)结合，结合时间为120s，然后缓冲液中进行解离，解离时间为180s。所有步骤均在室温下进行，蛋白样品均以200μL/孔加入黑色96孔板。使用Octet数据分析软件对响应数据进行拟合。

结果如图7及表1所示，2A2与HpaA的亲和力最强，3D6其次。

表1：单域抗体亲和力结果

实施例5：间接ELISA检测单域抗体与幽门螺杆菌的结合

H.pylori菌株在微需氧的条件下培养2-3天后，收集菌体，1mL PBS重悬，室温12000rpm离心5min，弃上清。用含3％(v/v)多聚甲醛的PBS重悬菌体，4℃固定24h；于4℃、12000rpm离心5min，弃上清，菌体重悬于PBS中，重复一次。按照10⁷CFU/孔，100μL/孔包被于酶标板上，4℃过夜；弃去上清液，每孔用300μL PBST缓冲液洗涤，共洗涤3次；其余操作同实施例4，二抗用Anti-6×His-HRP(1:10000稀释在3％BSA的PBST中)，37℃孵育1h。

结果如图8所示，单域抗体2A2、3D6及2D9均可与幽门螺杆菌结合，且有较高的亲和力，表明三株重组单域抗体可识别天然的HpaA蛋白。

实施例6：竞争ELISA检测单域抗体的结合表位

(1)用PBS稀释HpaA重组蛋白至4μg/mL，按100μL/孔包被于酶标板上，4℃过夜；

(2)弃去上清液，每孔用300μL PBST缓冲液洗涤，共洗涤3次；

(3)加入200μL/孔含3％BSA的PBST，在37℃下封闭2h；

(4)PBST清洗板3次，步骤同(2)；

(5)加入200μL/孔预先与1.2μg/mL生物素化的2A2混合的2A2、3D6、2D9和1A4(150、30、6、1.2、0.24、0.048、0.0096、0μg/mL)在37℃下孵育1.5h；

(6)PBST清洗板3次，步骤同(2)；

(7)加入100μL/孔的Streptavidin-HRP(1:10000稀释在3％BSA的PBST中)，在37℃下孵育1h；

(8)PBST清洗板3次，步骤同(2)；

(9)向孔板中加入100μL/孔的TMB底物，室温反应5-10min。加入50μL/孔1M H₂SO₄终止显色反应，酶标仪读取OD₄₅₀处的读数。

结果如图9所示，生物素标记的单域抗体2A2与无生物素标记的2A2和抗原HpaA的结合有明显的竞争，2D9与其和抗原结合存在部分竞争，3D6与其无明显竞争关系，表明单域抗体2A2和3D6识别不同的抗原表位。

实施例7：双价单域抗体的制备及与HpaA结合能力检测

在两个相同的单域抗体的氨基酸序列中间加上一个柔性的连接子(G₄S)₃构建同源双价单域抗体，即BiNb-2A2和BiNb-3D6，将基因片段克隆至原核表达载体pET28a中，转化至E.coli BL21(DE3)进行重组表达，经镍离子亲和层析及分子筛纯化后SDS-PAGE检测。结果如图10A所示，在分子量26kDa附近，有一条明显的条带，与预期的双价单域抗体的分子量大小一致。

通过间接ELISA检测双价单域抗体与抗原HpaA的结合，具体操作参照实施例4。结果如图10B所示，双价单域抗体BiNb-2A2和BiNb-3D6与HpaA的EC₅₀分别提高了2倍和230倍。

实施例8：单域抗体pH稳定性鉴定

用含0.5％BSA的PBS将单域抗体原液稀释至200μg/mL。反应总体积为20μL，取不同pH水平(1.2、2.0、4.0、7.4)的pH缓冲液18μL，加入2μL单域抗体稀释缓冲液，涡旋混合均匀。然后将样品在37℃孵育1h后，用10μL的1M Tris-HCl pH 7.5中和。反应结束后，所有样本均储存在-80℃，然后如前所述通过ELISA检测单域抗体的亲和力。

结果如图11所示，BiNb-2A2和BiNb-3D6在pH 1.2、pH 2.0、pH 4.0条件下均保持抗原结合活性。与pH 7.4相比，在pH 1.2和pH 2.0时BiNb-2A2与抗原的结合活性略高。在pH4.0条件下，BiNb-3D6的结合活性仍保持在85％以上。

实施例9：双抗夹心ELISA检测体系的建立

1.ELISA检测方法操作步骤

(1)用包被缓冲液将稀释的BiNb-2A2，按每孔100μL加入酶标板中，4℃包被过夜；

(2)弃去上清液，每孔用300μL PBST缓冲液洗涤，共洗涤3次；

(3)加入200μL/孔封闭液，在37℃下孵育2h；

(4)PBST清洗板3次，同步骤(2)；

(5)加入100μL/孔的PBS稀释的不同浓度的HpaA重组蛋白或幽门螺杆菌菌体超声裂解液上清，以PBS为阴性对照，在37℃下孵育1h；

(6)PBST清洗板3次，同步骤(2)；

(7)分别加入100μL/孔1.5％MPBST稀释的BiNb-3D6，37℃下孵育1.5h；

(8)PBST清洗板3次，同步骤(2)；

(9)加入100μL/孔的anti-HA-HRP(1:5000稀释在5％(w/v)MPBST)，在37℃下孵育1h；

(10)剩余步骤参照实施例4。

2.抗体最适工作浓度确定

将捕获抗体BiNb-2A2和检测抗体BiNb-3D6分别稀释至1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL，按100μL/孔加入酶标板中。其余反应条件同上，测定OD₄₅₀值，比较P/N的大小，确定最适捕获抗体的包被量和最适检测抗体的浓度。

结果如图12所示，当捕获抗体浓度为5μg/mL，检测抗体浓度为1.25μg/mL时，P/N值最大，因此后续选择此条件为最适抗体工作浓度。

3.最适包被液和最适封闭液确定

在最优检测抗体和捕获抗体浓度的条件下，分别用0.05mol/L pH 9.6的碳酸盐缓冲液以及0.01mol/L pH 7.4的PBS作为包被液，其余步骤按照之前的操作步骤操作，根据P/N值的大小确定最佳包被液。

在以上最优条件下，分别用1％BSA、2％BSA、3％BSA、4％BSA和5％BSA以及1％MPBS、2％MPBS、3％MPBS、4％MPBS、5％MPBS作为封闭液，其余步骤按照之前的操作步骤操作，根据P/N值的大小确定最佳包被液。

结果如表2和表3所示，最适包被液为0.01mol/L pH 7.4的PBS，最适封闭液为4％MPBS。

表2：最适包被液的确定结果

表3：最适封闭液的确定结果

4.最低检测限的确定

在以上最优条件下，将抗原HpaA重组蛋白和幽门螺杆菌超声裂解液上清梯度稀释，操作步骤同上，检测OD₄₅₀值，以P/N值大于2.1判断为阳性。

结果如图13所示，该ELISA检测方法检测HpaA蛋白的最低检测限是3.9ng/mL，且该方法检测幽门螺杆菌裂解液的最低检测限是152.4ng/mL。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种靶向幽门螺杆菌HpaA的鲨鱼单域抗体，其特征在于，所述鲨鱼单域抗体具有如SEQ ID No.1所示、或者SEQ ID No.2所示、或者SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。

2.一种编码权利要求1所述的鲨鱼单域抗体的基因，其特征在于，所述基因具有如SEQID No.4所示、或者SEQ ID No.5所示、或者SEQ ID No.6所示的核苷酸序列。

3.一种含有权利要求2所述的基因的重组载体。

4.一种含有权利要求2所述的基因的工程菌株。

5.一种双价单域抗体，其特征在于，所述双价单域抗体是由两个相同的权利要求1所述的鲨鱼单域抗体的氨基酸序列中间加上一个柔性的连接子(G₄S)₃构建获得的。

6.权利要求1所述的鲨鱼单域抗体或者权利要求5所述的双价单域抗体在制备HpaA蛋白靶向剂中的应用。

7.权利要求1所述的鲨鱼单域抗体或者权利要求5所述的双价单域抗体在制备检测幽门螺杆菌的免疫试剂中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述免疫试剂检测幽门螺杆菌的检测限为不小于152.4ng/mL。

9.一种用于检测或免疫诊断幽门螺杆菌感染的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含权利要求5所述的双价单域抗体，其作为捕获抗体和/或检测抗体。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包含封闭液、包被液；所述包被液为0.01mol/L pH 7.4的PBS，所述封闭液为4％MPBS。

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