CN114106187A

CN114106187A - 一种靶向ogt的特异性鲨鱼单域抗体及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN114106187A
Application number: CN202111461840.4A
Authority: CN
Inventors: 顾玉超; 席晓志; 肖国凯; 于文功
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2022-01-05
Filing date: 2022-01-05
Publication date: 2022-03-01
Anticipated expiration: 2042-01-05
Also published as: CN114106187B

Abstract

本发明公开了一种靶向OGT的特异性鲨鱼单域抗体及其制备方法和应用。本发明不仅公开了单域抗体的氨基酸序列，同时还公开了其编码基因的核苷酸序列；并且该单域抗体制备方法简单，通过分离免疫斑竹鲨外周血淋巴细胞，提取总RNA，反转录为cDNA；以cDNA为模板，扩增斑竹鲨VNAR片段，与载体连接构建噬菌体文库；从噬菌体文库中淘洗识别OGT的阳性克隆；构建表达载体，诱导表达OGT单域抗体，最终获得靶向OGT的单域抗体。本发明所述的靶向OGT的单域抗体能有效与OGT抗原结合。所述的单域抗体及其编码序列为基于OGT靶点的研究及抗体药物开发提供了研发基础，为肿瘤的诊断和治疗提供了新思路。

Description

一种靶向OGT的特异性鲨鱼单域抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于抗体制备领域，特别涉及一种靶向OGT的特异性鲨鱼单域抗体及其制备方法和应用。

背景技术

抗体是生物治疗应用中的重要工具。抗体的类型主要有两种，分别为双链抗体与单链抗体。双链抗体也称为传统抗体(VH)，它的单体是由四条肽链形成的对称结构，主要包括两条轻链和两条重链，重链和轻链之间由二硫键连接形成抗原结合位。传统抗体由于相对分子质量分子大、结构复杂、制备难度大等限制了其生产及在临床应用上的推广。非典型的单链抗体结构，在羊驼、骆驼以及海洋软骨鱼类中被发现。在驼科动物和海洋软骨鱼类中存在着天然缺失轻链的纯重链抗体，其具有分子量小、基因操作方便、组织渗透性强、亲水性高溶解性好、可胞内表达、易改造与表达等特点，能克服传统抗体的不足，并有望成为治疗性抗体的良好来源。

O-连N-乙酰氨基葡萄糖(O-GlcNAc)糖基化是一种广泛存在于蛋白质丝氨酸、苏氨酸残基上的动态、可逆的蛋白质翻译后修饰。在体内，O-GlcNAc动态修饰由N-乙酞氨基葡萄糖转移酶(OGT)和N-乙酞氨基葡萄糖苷酶(OGA)协同完成。OGT为糖蛋白N-糖链加工酶之一，起着决定N-糖链类型及复杂型糖链结构的重要作用。研究表明，乳腺癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌等多种不同肿瘤中OGT的表达和O-GlcNAc修饰水平显著增加，OGT介导的糖基化修饰在肿瘤发生中发挥着重要作用。但目前关于靶向OGT的抗体基本上都是以传统的双链抗体为主，但在利用鲨鱼进行单域抗体(VNAR)的制备方面未见报道。因此，开发有效的靶向OGT的鲨鱼单域抗体用于特异性识别OGT的有力工具，对于生物医学基础研究和肿瘤的诊断与治疗具有重要意义。

发明内容

本发明提供了一种靶向OGT的特异性鲨鱼单域抗体及其制备方法和应用。本发明得到了3种特异性针对OGT的单域抗体2D9、3F7和4G2，这些单域抗体具有很好的亲和力和靶向性。

本发明还提供了靶向OGT的特异性鲨鱼单域抗体的编码序列和制备方法及在诊断治疗中的用途。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一种靶向OGT的特异性鲨鱼单域抗体，所述特异性鲨鱼单域抗体具有下列氨基酸序列之一：

(1)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

(2)如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；

(3)如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

进一步的，所述特异性鲨鱼单域抗体包括框架区FR和互补决定区CDR。

进一步的，所述框架区FR包括FR1、FR2、FR3；所述FR1的氨基酸序列为：VEQTPTTTTKEAGESLTINCVLR；所述FR2的氨基酸序列为：TYWYFTKKGATKKE；所述FR3的氨基酸序列为：SLSNGGRYAETVNKASKSFSLRISDLRVEDSGTYHC。

进一步的，所述互补决定区CDR包括CDR1、CDR3；所述CDR1的氨基酸序列为：DSSCALDS或DSSCALGN；所述CDR1的氨基酸序列为：CKAYTAGYCYTGMG或KARNHLNERCYRD。

本发明还提供了所述的靶向OGT的特异性鲨鱼单域抗体的编码基因，所述编码基因具有下列核苷酸序列之一：

(1)如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；

(2)如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列；

(3)如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。

本发明还提供了含有所述的靶向OGT的特异性鲨鱼单域抗体编码基因的表达载体。

本发明还提供了含有所述的表达载体的工程菌株。

本发明还提供了所述的靶向OGT的特异性鲨鱼单域抗体的制备方法，包括以下步骤：

(1)利用pET28a-ncOGT表达质粒转化诱导表达得到的OGT重组蛋白，对鲨鱼进行免疫处理，得到免疫鲨鱼；

(2)采集步骤(1)的免疫鲨鱼的血液或组织，提取总RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板，进行PCR扩增，PCR产物连接到噬菌粒载体上，得到连接产物，将所述连接产物电转化大肠杆菌，构建噬菌体文库；

(3)从步骤(2)的噬菌体文库中淘洗识别OGT蛋白的阳性克隆：利用OGT重组蛋白进行三轮鲨鱼单域抗体噬菌体淘选，将淘选得到的大肠杆菌单菌落进行ELISA鉴定，取OD450值大于0.1以上的单菌落进行测序，得到单域抗体的核苷酸序列；

(4)将步骤(3)的单域抗体的核苷酸序列克隆到pET28a载体上，得到的表达载体转化大肠杆菌，扩大培养后诱导表达，收集纯化得到特异性鲨鱼单域抗体。

进一步的，所述步骤(2)中PCR扩增引物为：

上游引物：CGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGCCGCACGGGTTGAACAAACACCG；

下游引物：GAACCGCCTCCACCAGCGGCCGCCACAGTCAGAGGGGTGCCGCCTCC。

本发明还提供了所述的靶向OGT的特异性鲨鱼单域抗体在用于制备OGT靶向剂中的应用。

本发明还提供了所述的靶向OGT的特异性鲨鱼单域抗体在用于制备诊断或治疗肿瘤的检测剂或药物中的应用。

进一步的，所述肿瘤为非小细胞肺癌。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：

1、本发明制备得到的特异性鲨鱼单域抗体2D9、3F7和4G2分子量小，只有12KD左右；其组织渗透性好、可胞内表达，且与OGT具有很好的亲和力和靶向性，因此，对于靶向OGT的鲨鱼单域抗体的研究以及肿瘤的诊断治疗均具有重要的科学意义，为肿瘤的诊断和治疗提供了新思路。

2、本发明的单域抗体2D9、3F7和4G2是利用条纹斑竹鲨作为抗体制备材料得到的，该种鲨鱼体型小、易于人工繁养，适合用于抗体开发，本发明也拓展了抗体制备材料来源。

附图说明

图1为鲨鱼单域抗体VNAR基因的扩增结果。

图2为单域抗体噬菌体文库阳性率的测定结果。

图3为特异性噬菌体的单克隆ELISA鉴定结果。

图4为2D9、3F7和4G2单域抗体纯化结果；其中，(A)2D9单域抗体纯化结果；(B)3F7单域抗体纯化结果；(C)4G2单域抗体纯化结果；M：Protein Marker；1：上清；2：穿透液；3-11：20mM、25mM、50mM、100mM、200mM、250mM、300mM、400mM、500mM咪唑洗脱液。

图5为OGT特异性单域抗体的SPR检测结果。

图6为间接ELISA法检测偶联OGT单域抗体的结果。

图7为鲨鱼单域抗体免疫荧光结果，其中A：对照组；B：阳性对照组；C：3F7；D：2D9；E：4G2。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式和附图对本发明的技术方案做进一步的详细说明，但本发明要求保护的范围并不局限于实例表述的范围。

靶向OGT的单域抗体(VNAR)序列组成为FR1、CDR1、HV2、HV4、CDR3和FR4，其中FR1和FR4为固定氨基酸序列；HV2和HV4为高变区域，其影响抗原的结合位点；CDR1和CDR3为抗体的互补决定区，其决定于不同抗原结合。VNAR具有识别OGT的能力，且具有高度的稳定性，且对于抗原的识别作用具有高度的潜力，同时，由于其特殊的可变结构域，VNAR是分子量最小的抗体结构。因此，VNAR克服了传统抗体在应用方面的缺点和不足。本发明选择条纹斑竹鲨(Chiloscyllium plagiosum)作为抗体制备材料进行VNAR的制备，其不属于濒危鲨鱼种类，且体型小、易于人工繁养，适合用于抗体开发。

实施例1：结合重组OGT蛋白鲨鱼噬菌体抗体库的构建

1、条纹斑竹鲨免疫

1)pET28a-ncOGT表达质粒可从中国海洋大学处获得。

取1μL实验室保藏的pET28a-ncOGT重组表达质粒，加入到100μL E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，轻轻混匀后置于冰上孵育30min，随后42℃热击90s，冰上静置5min。加入900μL LB液体培养基，37℃摇床中培养1h，然后3000rpm离心5min，将菌体重悬在100μLLB液体培养基中后，全部涂布在含有终浓度为50μg/mL卡那霉素的LB固体培养板上，37℃培养箱中培养过夜。挑取过夜培养板上长出的单克隆，接种到5mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃摇床中过夜培养。转接到新的培养基中，培养至菌液OD₆₀₀值大约在0.6时，加入IPTG(终浓度为0.01mM)诱导表达，获得重组OGT蛋白。

2)实验试剂：重组OGT蛋白；弗氏完全佐剂(Sigma-Aldrich公司，F5881)；弗氏不完全佐剂(Sigma-Aldrich公司，F5506)。

(1)首次免疫时取100μg的OGT重组蛋白溶解于PBS中，与完全弗式佐剂按照1:1的比例混合免疫条纹斑竹鲨第一次；

(2)三周后，取抗原2μg与非完全弗式佐剂按照1:1的比例混合免疫条纹斑竹鲨第二次；

(3)三周后，取抗原2μg与非完全弗式佐剂按照1:1的比例混合免疫条纹斑竹鲨第三次；

(4)三周后，取抗原2μg与非完全弗式佐剂按照1:1的比例混合免疫条纹斑竹鲨第四次；

(5)三周后，取抗原2μg与非完全弗式佐剂按照1:1的比例混合免疫条纹斑竹鲨第五次；

(6)三周后，取抗原2μg与非完全弗式佐剂按照1:1的比例混合免疫条纹斑竹鲨第六次。

2、VNAR文库构建

(1)cDNA的获得

用上述经大肠杆菌BL21原核表达的OGT重组蛋白免疫鲨鱼，收集鲨鱼外周血淋巴细胞PBMC或脾脏组织，采用TRIZOL法提取RNA，然后反转录为cDNA。

(2)目的基因的克隆

利用引物对cDNA进行PCR扩增，得到的PCR产物用NotⅠ和NcoⅠ酶切后连接到噬菌粒载体PHEN2上。

所用引物的序列为：

上游引物：CGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGCCGCACGGGTTGAACAAACACCG(SEQ ID NO.7)；

下游引物：GAACCGCCTCCACCAGCGGCCGCCACAGTCAGAGGGGTGCCGCCTCC(SEQ IDNO.8)。

PCR扩增的反应体系为：菌液0.5μL，上游引物0.2μL，下游引物0.2μL，

Robust PCR Master Mix 5μL，ddH₂O补充到10μL。

PCR的扩增条件为：预变性94℃5min；变性94℃10s，退火55℃20s，延伸72℃10s，重复30个循环；终延伸72℃5min；4℃保存。

通过PCR法扩增获得全套条纹斑竹鲨VNAR区编码如图1所示。

(3)文库构建

将连接产物电转化到大肠杆菌TG1感受态，形成原始噬菌体文库。随后将菌液分别稀释10²、10³、10⁴、10⁵倍，各梯度稀释的菌液取100μL涂布到新鲜制备的2×YT/A100固体培养基(16g胰蛋白胨、10g酵母提取物、5g NaCl，分别加入900mL双蒸水溶解后，用1M NaOH溶液调节pH值为7.0后加双蒸水定容至1L，灭菌后于室温保存)上，37℃培养过夜。根据菌落生长情况统计稀释10⁵倍的平板上的菌落数，计算可得构建的鲨鱼单域抗体文库库容量。

库容量的计算按下列公式进行：

鲨鱼单域抗体噬菌体文库滴度＝菌落数×10×稀释梯度×文库体积。

VNAR文库质量评价见表1，包括库容量、基因插入率以及基因多样性如图2所示。

表1：评价噬菌体文库的质量

实施例2：OGT鲨鱼单域抗体噬菌体的淘选

利用实施例1的原始噬菌体文库制备出7×10¹²pfu/mL的辅助噬菌体，用于感染TG1。

1、第一轮淘选：

(1)将纯化的OGT重组蛋白用PBS稀释至100μg/mL，取4mL包被免疫管，密封后4℃过夜。

(2)免疫管弃去包被液，用PBS清洗一次，加入含有3％脱脂奶粉的PBS缓冲液(MPBS)封闭免疫管，4℃过夜。

(3)封闭过夜的免疫管用PBS清洗三次。向免疫管中加入3mL配制的MPBS和1mL制备的原始噬菌体单域抗体库。密封后在室温下旋转孵育1h，室温静置1h。

(4)将免疫管中的溶液倒入含灭菌剂的废液缸中，用含0.1％Tween-20的PBS溶液清洗免疫管10次，每次加满后立即倒出，沥干多余的MPBS溶液。

(5)加入1mL 100mM的三乙胺溶液(1mL PBS中加入14μL三乙胺原液，三乙胺溶液需要现用现配)，密封后室温旋转孵育不超过10min，洗脱液加入到0.5mL的1M Tris-HCl溶液(pH 7.4)中，轻轻混匀。

(6)用250μL的1M Tris-HCl溶液洗涤免疫管中残留的噬菌体，合并所有洗脱下来的噬菌体。

(7)取1mL洗脱下来的噬菌体溶液，侵染新鲜的TG1大肠杆菌，37℃水浴静置30min。

(8)同上述方法测定淘选下来噬菌体的滴度(鲨鱼单域抗体噬菌体文库滴度＝菌落数×10×稀释梯度×文库体积)。取出过夜培养的平板，进行菌落计数后计算噬菌体滴度。

(9)剩余侵染完的菌液，4000rpm离心10min，沉淀重悬后全部涂布在2×YT/A100/G2大的培养板上，30℃培养过夜。

(10)向过夜生长的培养板上加入5mL的2×YT/A100/G2的液体培养基，用涂布棒刮取菌落，菌落太多时可加入大量的培养基刮取菌落，离心后重悬于5mL培养基中。重复离心，最终噬菌体沉淀用2mL PBS进行重悬。重悬液在4℃、12000rpm离心10min，上清液即为第一轮噬菌体单域抗体库。其中，1mL用于下一轮淘选，1mL于4℃保存。

2、第二轮淘选

第二轮淘选步骤与第一轮淘选相同，只需将步骤(1)包被抗原的浓度递减为10μg/mL，取4mL包被免疫管；步骤(2)封闭时选择含3％BSA的PBST封闭免疫管，4℃过夜；步骤(4)用PBST清洗免疫管20次，其余实验操作步骤均与第一轮淘选相同。

3、第三轮淘选

第三轮淘选步骤与第一轮淘选相同，只需将步骤(1)包被抗原的浓度递减为1μg/mL，取4mL包被免疫管；步骤(2)封闭时选择含3％脱脂奶粉的PBST封闭免疫管，4℃过夜；步骤(4)用PBST清洗免疫管20次，其余实验操作步骤均与第一轮淘选相同。

参见表2，淘选噬菌体的滴度在第二轮有明显的上升，特异性的噬菌体也得到富集。

表2：原始及三轮淘选噬菌体单域抗体库的滴度结果

为了获得高亲和的单一噬菌体，我们从第三轮淘选得到的平板中挑取380个单菌落进行鉴定。挑取的380个单克隆中有6个阳性的单克隆，由于阳性率过低(1.56％)，为避免由于培养时菌液交叉污染以及实验操作不当，将OD₄₅₀值在0.1以上的14个单克隆挑出进行二次鉴定(图3)。为防止交叉污染，扩增噬菌体的过程中不同的单克隆充分隔开，最终确定挑取的14个单菌落均符合要求，将这14个单菌落的菌液送至测序公司进行测序。对测序结果进行分析，得到2D9、3F7和4G2三种序列。

2D9的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；3F7的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；4G2的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。将三者的序列与数据库进行比对，结果表示这些序列均为鲨鱼来源的单域抗体基因序列。

三种鲨鱼单域抗体2D9、3F7和4G2中包括框架区FR和互补决定区CDR，其中框架区FR包括FR1、FR2、FR3的氨基酸序列，分别如下：

FR1：VEQTPTTTTKEAGESLTINCVLR；

FR2：TYWYFTKKGATKKE；

FR3：SLSNGGRYAETVNKASKSFSLRISDLRVEDSGTYHC。

互补决定区CDR包括CDR1、CDR3的氨基酸序列，对应上述各FR，三种鲨鱼单域抗体2D9、3F7和4G2的CDR氨基酸序列分别为：

实施例3：单域抗体体外重组表达及纯化

将实施例2中的三个鲨鱼单域抗体基因VNAR片段2D9、3F7、4G2分别与pET28a载体进行连接。

连接体系如下：

配制上述反应体系，轻轻混匀后迅速离心，16℃连接过夜。连接产物直接用于下一步转化。

直接将上述连接产物转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，随后进行菌液PCR验证重组表达载体是否构建成功。

利用his标签用镍离子螯合填料进行纯化，每个纯化后的蛋白(图4)分装后-80℃保存。

实施例4：重组单域抗体蛋白与OGT的亲和力测定

采用SPR检测实施例3中纯化得到的三个特异性的鲨鱼单域抗体2D9、3F7、4G2对OGT的亲和力，检测的亲和力测定结果和动力学参数分别如图5和表2所示，三个单域抗体与OGT结合的解离常数KD值分别为3.55×10^-8、5.34×10^-8和2.97×10^-8M，说明鲨鱼单域抗体2D9、3F7、4G2与OGT的亲和力都很强。

表3：OGT特异性单域抗体SPR分析

实施例5：生物素化单域抗体间接ELISA方法

(1)OGT重组蛋白用PBS稀释至2μg/mL，ELISA板的每孔加入100μL进行包被，4℃过夜；

(2)弃去上清包被液，每孔用200μL PBST进行洗涤，洗涤3次；

(3)用含5％脱脂牛奶的PBST进行封闭抗原孔，每孔200μL，37℃封闭2h；

(4)弃去孔内的封闭液，每孔用200μL PBST进行洗涤，洗涤3次；

(5)加入偶联的单域抗体2D9、3F7或4G2，每孔加入100μL，37℃孵育1h。其中单域抗体设置浓度梯度为40μg/mL、4μg/mL、400ng/mL、40ng/mL、4ng/mL。

(6)弃去液体，每孔用200μL PBST洗涤3次；

(7)每孔加入100μL 1：1000稀释的HRP标记的链霉亲和素的抗体，37℃孵育1h；

(8)弃去液体，每孔用200μL PBST洗涤3次；

(9)每孔加入100μL TMB显色液，室温反应10-15min，利用100μL 1M H₂SO₄终止反应，读取450nm处的OD值。

结果如图6，通过实验优化得到生物素与抗体摩尔15:1进行偶联后，偶联抗体3F7同OGT进行结合的活性较强。

实施例6：生物素化的OGT鲨鱼单域抗体免疫荧光实验

选择NCI-H1299细胞直接用生物素化的单域抗体进行检测。

(1)NCI-H1299细胞接种到12孔板的玻片上，过夜培养后，待细胞汇合度达到60-70％时，弃去培养液。

(2)PBS洗一遍后加4％多聚甲醛(PFA)固定30min后，用PBS洗三遍。

(3)加TBP(0.1％Triton-100、4％BSA溶于PBS中)室温孵育1h后，用PBS洗三遍。

(4)加相应的一抗(TBP稀释一抗，单域抗体1-2μg/mL)置于4℃冰箱中孵育过夜。

(5)第二天用PBS洗三遍，加相应的荧光标记的二抗(TBP稀释二抗，抗His标签的抗体，对应的荧光二抗)室温孵育2h，用PBS洗三遍。

(6)加DAPI(0.1-1μg/mL)染色5min后用PBS洗三遍，用无菌水洗一遍后加防淬灭剂封片后共聚焦拍照。

免疫荧光实验结果如图7，单域抗体2D9、3F7和4G2可以在NCI-H1299细胞内定位OGT蛋白。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的。

序列表

<110> 中国海洋大学

<120> 一种靶向OGT的特异性鲨鱼单域抗体及其制备方法和应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Gln Trp Val Glu Gln Thr Pro Thr Thr Thr Thr Lys Glu Ala

1 5 10 15

Gly Glu Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val Leu Arg Asp Ser Ser Cys Ala

20 25 30

Leu Asp Ser Thr Tyr Trp Tyr Phe Thr Lys Lys Gly Ala Thr Lys Lys

35 40 45

Glu Ser Leu Ser Asn Gly Gly Arg Tyr Ala Glu Thr Val Asn Lys Ala

50 55 60

Ser Lys Ser Phe Ser Leu Arg Ile Ser Asp Leu Arg Val Glu Asp Ser

65 70 75 80

Gly Thr Tyr His Cys Lys Ala Tyr Thr Ala Gly Tyr Cys Tyr Thr Gly

85 90 95

Met Gly Tyr Ile Glu Gly Gly Gly Thr Ile Leu Thr Val Lys Pro Ala

100 105 110

Ala

<210> 2

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Gln Trp Val Glu Gln Thr Pro Thr Thr Thr Thr Lys Glu Ala

1 5 10 15

Gly Glu Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val Leu Arg Asp Ser Ser Cys Ala

20 25 30

Leu Gly Asn Thr Tyr Trp Tyr Phe Thr Lys Lys Gly Ala Thr Lys Lys

35 40 45

Ala Thr Leu Ser Thr Gly Gly Arg Tyr Ala Glu Thr Val Asn Arg Ala

50 55 60

Ser Lys Ser Phe Ser Leu Arg Ile Ser Asp Leu Arg Val Glu Asp Ser

65 70 75 80

Gly Thr Tyr His Cys Lys Ala Arg Asn His Leu Asn Glu Arg Cys Tyr

85 90 95

Arg Asp Ser His Tyr Glu Gly Gly Gly Thr Ile Leu Thr Val Lys Pro

100 105 110

Ala Ala

<210> 3

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Ala Gln Trp Val Glu Gln Thr Pro Thr Thr Thr Thr Lys Glu Ala

1 5 10 15

Gly Glu Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val Leu Arg Asp Ser Ser Cys Ala

20 25 30

Leu Gly Asn Thr Tyr Trp Tyr Phe Thr Lys Lys Gly Ala Thr Lys Lys

35 40 45

Ala Thr Leu Ser Thr Gly Gly Arg Tyr Ala Glu Thr Val Asn Arg Ala

50 55 60

Ser Lys Ser Phe Ser Leu Arg Ile Ser Asp Leu Gly Val Glu Asp Ser

65 70 75 80

Gly Thr Tyr His Cys Lys Ala Arg Asn His Leu Asn Glu Arg Cys Tyr

85 90 95

Arg Asp Ser His Tyr Glu Gly Gly Gly Thr Ile Leu Thr Val Lys Pro

100 105 110

Ala Ala

<210> 4

<211> 343

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccatggccca atgggttgaa caaacaccga caacgacaac aaaggaggca ggcgaatcac 60

tgaccatcaa ttgcgtccta agagattcca gctgtgcatt ggatagcacg tactggtatt 120

tcacaaaaaa gggcgcaaca aagaaggaga gcttatcaaa tggcggacga tacgcggaaa 180

cagtgaacaa ggcatcaaag tccttttctt tgcgaattag tgacctaaga gttgaagaca 240

gtggtacata tcactgtaaa gcgtatacag ctggttactg ttatactgga atgggctata 300

ttgaaggagg cggcaccatt ctgactgtga aacctgcggc cgc 343

<210> 5

<211> 346

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccatggccca atgggttgaa caaacaccga caacgacaac aaaggaggca ggcgaatcac 60

tgaccatcaa ttgcgtccta agagattcca gctgtgcatt ggggaacacg tactggtatt 120

tcacaaaaaa gggcgcaaca aagaaggcga ccttatcaac tggcggacga tacgcggaaa 180

cagtcaacag ggcatcaaag tccttttctt tgcgaattag tgacctaaga gttgaagaca 240

gtggtacata tcactgtaaa gctcgtaatc acctgaatga gcgctgttac cgggattctc 300

attatgaagg aggcggcacc attctgactg tgaaacctgc ggccgc 346

<210> 6

<211> 346

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

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tgaccatcaa ttgcgtccta agagattcca gctgtgcatt ggggaacacg tactggtatt 120

tcacaaaaaa gggcgcaaca aagaaggcga ccttatcaac tggcggacga tacgcggaaa 180

cagtcaacag ggcatcaaag tccttttctt tgcgaattag tgacctagga gttgaagaca 240

gtggtacata tcactgtaaa gctcgtaatc acctgaatga gcgctgttac cgggattctc 300

attatgaagg aggcggcacc attctgactg tgaaacctgc ggccgc 346

<210> 7

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgcggcccag ccggccatgg ccgccgcacg ggttgaacaa acaccg 46

<210> 8

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gaaccgcctc caccagcggc cgccacagtc agaggggtgc cgcctcc 47

Claims

1.一种靶向OGT的特异性鲨鱼单域抗体，其特征在于，所述特异性鲨鱼单域抗体具有下列氨基酸序列之一：

（1）如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

（2）如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；

（3）如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的靶向OGT的特异性鲨鱼单域抗体，其特征在于，所述特异性鲨鱼单域抗体包括框架区FR和互补决定区CDR。

3.根据权利要求2所述的靶向OGT的特异性鲨鱼单域抗体，其特征在于，所述框架区FR包括FR1、FR2、FR3；所述FR1的氨基酸序列为：VEQTPTTTTKEAGESLTINCVLR；所述FR2的氨基酸序列为：TYWYFTKKGATKKE；所述FR3的氨基酸序列为：SLSNGGRYAETVNKASKSFSLRISDLRVEDSGTYHC。

4.根据权利要求2所述的靶向OGT的特异性鲨鱼单域抗体，其特征在于，所述互补决定区CDR包括CDR1、CDR3；所述CDR1的氨基酸序列为：DSSCALDS或DSSCALGN；所述CDR1的氨基酸序列为：CKAYTAGYCYTGMG或KARNHLNERCYRD。

5.权利要求1-4任一项所述的靶向OGT的特异性鲨鱼单域抗体的编码基因，其特征在于，所述编码基因具有下列核苷酸序列之一：

（1）如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；

（2）如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列；

（3）如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。

6.含有权利要求5所述的靶向OGT的特异性鲨鱼单域抗体编码基因的表达载体。

7.含有权利要求6所述的表达载体的工程菌株。

8.权利要求1-4任一项所述的靶向OGT的特异性鲨鱼单域抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）利用pET28a-ncOGT表达质粒转化诱导表达得到的OGT重组蛋白，对鲨鱼进行免疫处理，得到免疫鲨鱼；

（2）采集步骤（1）的免疫鲨鱼的血液或组织，提取总RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板，进行PCR扩增，PCR产物连接到噬菌粒载体上，得到连接产物，将所述连接产物电转化大肠杆菌，构建噬菌体文库；

（3）从步骤（2）的噬菌体文库中淘洗识别OGT蛋白的阳性克隆：利用OGT重组蛋白进行三轮鲨鱼单域抗体噬菌体淘选，将淘选得到的大肠杆菌单菌落进行ELISA鉴定，取OD450值大于0.1以上的单菌落进行测序，得到单域抗体的核苷酸序列；

（4）将步骤（3）的单域抗体的核苷酸序列克隆到pET28a载体上，得到的表达载体转化大肠杆菌，扩大培养后诱导表达，收集纯化得到特异性鲨鱼单域抗体。

9.权利要求1-4任一项所述的靶向OGT的特异性鲨鱼单域抗体在用于制备OGT靶向剂中的应用。

10.权利要求1-4任一项所述的靶向OGT的特异性鲨鱼单域抗体在用于制备诊断或治疗肿瘤的检测剂或药物中的应用。