WO2023137994A1 - 结直肠癌相关脆弱拟杆菌毒素蛋白激活体的特异性纳米抗体Nb3.27及其应用 - Google Patents

结直肠癌相关脆弱拟杆菌毒素蛋白激活体的特异性纳米抗体Nb3.27及其应用 Download PDF

Info

Publication number
WO2023137994A1
WO2023137994A1 PCT/CN2022/103030 CN2022103030W WO2023137994A1 WO 2023137994 A1 WO2023137994 A1 WO 2023137994A1 CN 2022103030 W CN2022103030 W CN 2022103030W WO 2023137994 A1 WO2023137994 A1 WO 2023137994A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
bacteroides fragilis
colorectal cancer
toxin protein
seq
protein
Prior art date
Application number
PCT/CN2022/103030
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
温玉荣
郑芳
郭玉呈
Original Assignee
陕西海司诺维科技有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 陕西海司诺维科技有限公司 filed Critical 陕西海司诺维科技有限公司
Publication of WO2023137994A1 publication Critical patent/WO2023137994A1/zh

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

本发明公开了一种结直肠癌相关脆弱拟杆菌毒素蛋白激活体的特异性纳米抗体Nb3.27及其应用，通过深入研究肿瘤患者产肠毒素脆弱拟杆菌和其分泌的毒素脆弱拟杆菌毒素蛋白的激活体形式（BFT-211），采用噬菌体展示技术对BFT-211纳米抗体进行表达；通过生物淘筛技术筛选出与抗原具有较高结合力的纳米抗体；得到了具有BFT-211纳米抗体，也称为Nb3.27。本发明表达并优化获得亲和力高且稳定均一的BFT-211纳米抗体蛋白，开辟了靶向BFT-211的纳米抗体的早期诊断直结肠癌和乳腺癌的新领域，具有良好的研究价值和应用前景。

Description

结直肠癌相关脆弱拟杆菌毒素蛋白激活体的特异性纳米抗体Nb3.27及其应用 技术领域
本发明属于生物制药技术领域，涉及一种抗脆弱拟杆菌毒素蛋白激活体(B.fragilis toxin以下简称BFT-211)的特异性纳米抗体，该抗体与BFT的激活体氨基酸结合位点结合，具体涉及一种结直肠癌相关脆弱拟杆菌毒素蛋白激活体的特异性纳米抗体Nb3.27及其应用。
背景技术
肠道菌群紧邻大肠黏膜，内含数以万亿计的多种微生物，这些微生物与宿主细胞相互作用以调节多种生理过程，例如能量收集，代谢和免疫反应等。拟杆菌属(Bacteroides)在人类胃肠道最为常见，约占微生物群落的25％，能够发酵各种糖并产生供宿主利用的挥发性脂肪酸。其中脆弱拟杆菌(B.fragilis)是拟杆菌属中最常见的模式种，也是所有临床分离厌氧菌株中最常见拟杆菌种。脆弱拟杆菌中的产肠毒素脆弱拟杆菌(Enterotoxigenic Bacteroides fragilis,ETBF)是一种条件致病菌，当宿主黏膜屏障受损时，可以侵入黏膜下层，引起感染腹泻，也可以经血液流动，引起其他器官感染并发脓肿。除引起腹泻和炎症性肠病外，还能够诱导癌症的发生，导致自发性肿瘤的形成，如结直肠癌以及乳腺癌。
脆弱拟杆菌毒素(B.fragilis toxin，BFT)是ETBF分泌的毒素，它的前肽区通过天冬氨酸转换机制抑制其催化结构域活性，BFT1的全长蛋白(BFT1-sFL)经过加工后将具有催化活性的结构域(也称为蛋白激活体或者成熟体,以下简称为BFT-211)释放到细胞外环境中，留下Pro Domain部分BFT在菌体内部。
ETBF在正常人和结直肠癌以及乳腺癌患者体内均有定植，但是并不是所有人都会致病，故而，BFT催化活性区也成为激活体(BFT-211)的定量是疾病 发生发展的重要指标，因此，需要建立新型、快速、准确和特异性的BFT-211的诊断方法，是准确评估和研究相关疾病机制的关键，同时也是ETBF疾病治疗试验的重要前提。毒素蛋白激活体BFT1相关纳米抗体研究并未报道，对BFT-211纳米抗体进行研究，可以有效弥补传统抗体稳定性差，产量低，成本高的缺陷。
因此，开发具有临床应用潜力的毒素蛋白激活体抗BFT1-211的纳米抗体有极大的现实意义和应用价值。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种结直肠癌相关脆弱拟杆菌毒素蛋白激活体的特异性纳米抗体Nb3.27及其应用。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明公开了一种结直肠癌相关的抗脆弱拟杆菌毒素蛋白激活体的特异性纳米抗体Nb3.27，该特异性纳米抗体Nb3.27的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
优选地，该特异性纳米抗体Nb3.27的重链包括4个框架区FR1～FR4，以及3个抗原互补决定区CDR1～CDR3；其中：
所述4个框架区FR1～FR4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8所示；
所述3个抗原互补决定区CDR1～CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7所示。
本发明还公开了一种核酸，编码上述的结直肠癌相关的抗脆弱拟杆菌毒素的特异性纳米抗体Nb3.27，该核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。
本发明还公开了一种原核表达载体，含有上述的核酸。
本发明还公开了一种原核宿主细胞，含有上述的原核表达载体。
本发明还公开了一种突变体，是以上述的结直肠癌相关的抗脆弱拟杆菌毒 素蛋白激活体的特异性纳米抗体Nb3.27为前体，经随机突变、点突变或双特异性抗体改造，获得的特异性或靶向性增强的突变体。
本发明还公开了上述的结直肠癌相关的抗脆弱拟杆菌毒素的特异性纳米抗体Nb3.27、核酸、原核表达载体、原核宿主细胞或突变体在制备抗脆弱拟杆菌毒素蛋白吸附剂中的应用。
本发明还公开了上述的结直肠癌相关的抗脆弱拟杆菌毒素蛋白激活体的特异性纳米抗体Nb3.27、核酸、原核表达载体、原核宿主细胞或突变体在制备脆弱拟杆菌毒素蛋白激活体的检验试剂中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过深入研究抗脆弱拟杆菌毒素的蛋白激活体(BFT1-211)，采用噬菌体展示技术对纳米抗体进行表达；通过生物淘筛技术筛选出与抗原脆弱拟杆菌毒素全长(BFT1-sFL)的活性区域(BFT1-211)具有较高结合力的纳米抗体；也称为Nb3.27。本发明表达并优化获得亲和力高且稳定均一的BFT1-211纳米抗体蛋白，开辟检验人肠道细菌产肠毒素脆弱拟杆菌和脆弱拟杆菌毒素的新领域，具有良好的研究价值和应用前景。
附图说明
图1为BFT1经过加工后将具有催化活性的结构域(BFT1-211)；
图2为全长蛋白BFT1-sFL抗原重组蛋白纯化图；其中，(a)为经凝胶过滤层析柱Superdex75PG纯化后的蛋白结果图(b)为蛋白电泳结果；
图3用ELISA方法评价免疫效果图；
图4为用PCR方法随机挑取20个菌落计算插入率；
图5为SDS-PAGE考马斯亮蓝染色结果验证纳米抗体大小和完整性实验结果；
图6为纳米抗体以及全长蛋白BFT1-sFL抗原与纳米抗体复合物小量表达可溶性分析结果；
图7为等温滴定量热法(ITC)筛选高亲和力纳米抗体亲和力数据；
图8为Nb3.27+BFT1-sFL复合物结晶结果；
图9为PDBePISA鉴定得出的抗原全长蛋白与纳米抗体结合的结合表位是在蛋白的激活体C段区域。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
下面结合附图对本发明做进一步详细描述：
如图1所示，BFT经过加工后将具有催化活性的结构域BFT-211，前肽区通过天冬氨酸转换机制抑制其催化结构域活性，BFT全长(BFT1-sFL)经过加工后将具有催化活性的结构域(也称为成熟体,以下简称为BFT-211)释放到细胞外环境中，留下Pro Domain部分BFT在菌体内部。
本发明利用噬菌体展示技术，从羊驼免疫的单域重链抗体中筛选能与靶重组蛋白BFT激活体特异性结合的纳米抗体克隆，以作为BFT的检测纯化和试 剂。
通用BFT重组蛋白对羊驼进行免疫，分离血液中的白细胞，利用噬菌体展示技术，构建噬菌体展示文库，经过3次连续生物淘筛法获得与BFT蛋白结合的噬菌体，经测序后和生物比对后，用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA)法筛选出抗BFT的高亲和力纳米抗体。
1、BFT原核表达系统的构建和蛋白表达
分别构建了bft1-sFL不含信号肽全长原核表达质粒。通过NcoI和EcoRI限制性内切酶位点构建在pET28a载体上，同时在蛋白的N端添加6*HIS标签。Fpn通过NcoI和EcoRI限制性内切酶位点构建在pET28a载体上，同时在蛋白的C端添加6*HIS标签。通过使用IPTG诱导BFT重组蛋白表达，当细菌培养液OD600在0.6左右时，加0.4M IPTG，18℃低温诱导过夜。BFT1-sFL具有较好的可溶性。BFT1-sFL重组蛋白的体积排阻色谱的结果，图2中可以看出BFT1-sFL蛋白质表达纯度高，蛋白质纯化为单峰，表达蛋白预期分子量为44kDa，与考马斯亮蓝染色结果相符。
2、以BFT1-sFL为抗原的纳米抗体文库的构建
1)羊驼免疫血清的抗体检测
向一只5岁的健康雌性羊驼每周皮下注射100μg纯化的BFT1-sFL蛋白和免疫佐剂共6次。在第一次注射前和最后一次注射后第7天从颈静脉采集外周血，分离获得血清，用ELISA方法比较抗体滴度。向96孔板包被100μg/mL的BFT1-sFL蛋白，以PBS作为阴性对照。经洗板和封闭后，加入梯度稀释的免疫前和免疫后血清。以偶联HRP的山羊抗Llama抗体作为二抗，加入ABTS试剂进行反应。用酶标仪在405nm处测量吸光度值。结果参见图3，从图3中可以看出免疫后羊驼血清中靶向BFT1-sFL的抗体水平显著高于免疫前，证明以BFT重组蛋白混合免疫佐剂皮下注射的方法能够成功诱导羊驼的体液免疫反应，对实验动物的免疫达到了预期目的，可以进行后续构建文库等工作。
2)噬菌体文库的构建
于最后一次免疫后7天，从羊驼颈静脉收集100mL外周血，用Sepmate管和Lymphoprep分离外周血单个核细胞。用Trizol试剂从PBMCs中提取总RNA，用Random引物和逆转录酶合成cDNA。
用CALL001和CALL002引物进行巢式PCR扩增VHH基因，以1％琼脂糖凝胶电泳，用快速凝胶提取编码重链抗体的基因片段(700bp)。
然后用VHH-for和VHH-Back引物作为第二次PCR模板，这对引物是为VHH的框架1和框架4区域设计的，包含PstI和Eco91I酶切位点。第二轮PCR产物经电泳回收，用PstI、XbaI和Eco91I限制性内切酶酶切噬菌体载体pMES4，用PstI和Eco91I酶切第二轮PCR产物。用T4DNA连接酶连接经酶切的pMES4和PCR产物。将重组载体转染大肠杆菌TG1感受态细胞，并在含氨苄西林的LB琼脂平板上进行培养。
随机挑取20个菌落，用GIII和MP57载体引物进行菌落PCR，计算插入率。经转化的TG1由M13K07辅助噬菌体感染在噬菌体上展示VHH片段。感染的细菌在含氨苄西林和卡那霉素的培养基中培养过夜。培养基下离心后，将上清液与PEG6000/NaCl混合分离噬菌体，之后将噬菌体颗粒重悬在1mL冰冷PBS中。VHH库的规模达到1.93*10 7/mL。对20个随机挑选的菌落进行PCR筛选，结果表明，大多数克隆插入了VHH基因，计算插入率(95％)，结果参见图4，图4为琼脂糖凝胶电泳检测菌落PCR产物大小共1-20个菌落，条带分子量大小为700bp认定为插入了VHH片段的克隆，分子量大小400bp左右的条带认为转入了空质粒。M：DL2000核酸Marker。1-20为随机挑取的20个菌落。
3、纳米抗体筛选
1)生物淘筛
在包被100μL BFT1-sFL蛋白的96孔板上进行三轮生物淘筛以富集特异性 结合BFT1-sFL的噬菌体。封闭后洗涤5次。将噬菌体文库加入抗原孔和阴性孔，室温孵育2h后用洗涤10-15次，用蛋白酶洗脱。分别取10μL从抗原孔和阴性孔中洗脱的噬菌体，梯度稀释并感染对数期大肠杆菌TG1，在含有氨苄西林的LB琼脂平板上划线。通过比较抗原孔和阴性孔噬菌体的效价，评价包含BFT1-sFL特异性结合VHHs的噬菌体的富集情况。其余的噬菌体用于感染TG1并过夜培养，取菌液加入M13K07辅助噬菌体，重复上一节沉淀过程，将噬菌体亚文库扩增至后用于下一轮生物淘筛。经过三轮淘选，富集率达到4×10 4，如下表1所示：
表1噬菌体的富集程度
Figure PCTCN2022103030-appb-000001
c.f.u:菌落形成单位。
表1结果显示，第三轮后抗原孔的滴度高于阴性孔1000倍以上，表明噬菌体文库中特异性结合BFT1-sFL的部分已充分富集，满足筛选阳性克隆的条件，。
2)细菌胞质提取物ELISA
在含有氨苄西林的LB琼脂平板上分别培养第二轮和第三轮噬菌体子文库感染的大肠杆菌TG1细胞。筛选结果如下表2所示：随机挑取第二轮亚文库94个菌落和第三轮亚文库94个菌落，在含氨苄西林的TB培养基中培养。以1M IPTG在28℃过夜诱导。通过TES溶液提取胞质蛋白，以鼠源抗HIS抗体作为一抗，偶联HRP的羊抗鼠抗体作为二抗，以TMB试剂显色。用抗BFT抗体和偶联HRP的羊抗兔抗体作为阳性对照。以酶标仪检测吸光度值。将OD450的值比阴性孔的值高出2倍的克隆判定为阳性。将阳性克隆提取质粒进行测序，并按CDR3区进行分类。
表2噬菌体文库的筛选
Figure PCTCN2022103030-appb-000002
4、纳米生物的表达、纯化以及鉴定
1)表达纯化
将BFT1-sFL特异性纳米抗体序列插入pHEN6c质粒，转染大肠杆菌WK6细胞。以1L TB培养基中，1mM IPTG诱导并提取HIS标记的重组纳米抗体，然后用Ni-NTA柱和固定化金属亲和层析纯化，将纳米抗体由咪唑透析至PBS。结果参见图5，纳米抗体表达量良好12.7mg/L。
2)SDS-PAGE分析
将40μL纯化后的BFT1-sFL纳米抗体加入10μL 5×loading buffer，100℃5min水浴。上样量为5uL至4％-15％的SDS-PAGE凝胶并电泳，用考马斯亮蓝染液染色2h。结果参见图6，图6可清晰地表明只有一个15kDa大小的条带。具体地，可见Nb3.27纳米抗体条带均位于15kD附近，符合测序结果。
3)等温滴定量热法(ITC)亲和力测定
使用Microcal PEAQ-ITC完成，反应在20℃进行，纳米抗体和BFT1-sFL蛋白样品均将缓冲液置换到bufferA(20mM Tris-Hcl pH 8.0，150mM NaCl，5％Glycerol)中，蛋白质样品通过Nanodrop分光光度计进行定量。纳米抗体蛋白浓度在20μM左右，BFT1-sFL蛋白浓度在200μM左右。见图7实验数据使用Microcal PEAQ-ITC自带软件处理，计算纳米抗体Nb3.27的亲和力为15.3nM。
5、BFT重组蛋白与Nb2.82结合符合物晶体学解析
1)复合物蛋白质纯化
离心收集BFT1过夜诱导表达的菌体(1L)，弃上清，加入30mL buffer A将菌体重悬，加入1mmol/L PMSF。在冰水混合物中超声破碎，离心收集上清， 上清经0.2μm针式微型过滤器过滤后备用。离心收集纳米抗体过夜诱导表达的菌体(1L)，弃上清，菌体重悬后裂解过夜。离心收集上清，上清经0.2μm针式微型过滤器过滤后备用。
使用Ni-NTA亲和层析和凝胶过滤层析两步法对重组蛋白进行纯化,先将过滤后上清使用Ni-NTA进行纯化，使用5％buffer B洗去杂蛋白，用100％buffer B洗脱目的蛋白。
将含有目的蛋白的洗脱液进行浓缩后，用凝胶过滤层析柱Superdex75PG纯化，观察出峰位置并收集出峰位置的蛋白。每管收集1mL，用NanoDrop 2000测定收集样品蛋白浓度。将收集的蛋白样品进行12％SDS-PAGE电泳检测，考马斯亮蓝染色，检验蛋白分离纯化效果。
2)结晶和晶体结构解析
①、结晶条件的筛选和优化
首先将纯化后的蛋白浓缩到毫克级别浓度，使用座滴法对蛋白晶体生长条件进行初步筛选，0.5μL蛋白样品加0.5μL结晶液，池液加45μL，于20℃恒温条件下培养晶体。使用Hampton公司的Crystal Screen I+II、PEG/Ion、Index，以及Molecular Dimensions公司的PACT和JCSG等将用于初始的结晶条件筛选。然后根据初筛的条件对晶体生长条件进行进一步的沉淀剂浓度、盐浓度、pH等条件优化获得高质量的可收集X射线衍射，分辨率高的晶体。
对于BFT1-sFL与纳米抗体复合物晶体：先将纯化好的BFT1-sFL和纳米抗体蛋白以摩尔比1：1.5的比例混和，以形成复合物。复合物经凝胶过滤层析柱Superdex75PG纯化，浓缩至30mg/mL用于结晶。晶体板密封好后置于20℃的晶体培养箱中，如图8所示。
②、晶体数据收集和结构解析
优化好的重组蛋白及其与蛋白/蛋白复合物的晶体挑至配好的冻存液中，立刻放入液氮中保存。将首先使用In house的X射线源收集晶体X射线衍射数 据，在In house的X射线衍射数据基础上，将前往上海同步辐射光源(Shanghai Synchrotron Radiation Facility，SSRF)国家蛋白质中心线站收集高分辨率的X射线衍射数据，结果证明BFT1与Nb3.37特异性结合并获得了抗原表位见图9，PDBePISA鉴定得出的抗原与纳米抗体结合的结合表位,Nb3.27结合抗原的氨基酸序列211到C端部分，也就是BFT1-211的具有酶活性的部分。
综上所述，本发明从实验动物羊驼的免疫开始，构建了大容量纳米抗体的噬菌体展示文库。以生物淘筛(bio-panning)方法经过3轮筛选后，大量表达及纯化、我们得到了高亲和力的BFT1-sFL纳米抗体，经ITC鉴定抗体结合活性，结果显示纳米抗体Nb3.27具有最高的结合活性的亲和力(KD)为15.3nM，是首个BFT-211活性部位的特异性抗体，可以用于鉴定病人粪便样本中的BFT-211，作为结直肠癌以及乳腺癌早期诊断指标之一，具有较大的科学意义和临床应用价值。
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

Claims (8)

  1. 一种结直肠癌相关的抗脆弱拟杆菌毒素蛋白激活体的特异性纳米抗体Nb3.27，其特征在于，该特异性纳米抗体Nb3.27的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
  2. 根据权利要求1所述的结直肠癌相关的抗脆弱拟杆菌毒素蛋白激活体的特异性纳米抗体Nb3.27，其特征在于，该特异性纳米抗体Nb3.27的重链包括4个框架区FR1～FR4，以及3个抗原互补决定区CDR1～CDR3；其中：
    所述4个框架区FR1～FR4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8所示；
    所述3个抗原互补决定区CDR1～CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7所示。
  3. 一种核酸，其特征在于，编码权利要求1所述的结直肠癌相关的抗脆弱拟杆菌毒素蛋白激活体的特异性纳米抗体Nb3.27，该核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。
  4. 一种原核表达载体，其特征在于，含有权利要求3所述的核酸。
  5. 一种原核宿主细胞，其特征在于，含有权利要求4所述的原核表达载体。
  6. 一种突变体，其特征在于，是以权利要求1所述的结直肠癌相关的抗脆弱拟杆菌毒素蛋白激活体的特异性纳米抗体Nb3.27为前体，经随机突变、点突变或双特异性抗体改造，获得的特异性或靶向性增强的突变体。
  7. 权利要求1或2所述的结直肠癌相关的抗脆弱拟杆菌毒素蛋白激活体的特异性纳米抗体Nb3.27、权利要求3所述的核酸、权利要求4所述的原核表达载体、权利要求5所述的原核宿主细胞或权利要求6所述的突变体在制备抗脆弱拟杆菌毒素蛋白吸附剂中的应用。
  8. 权利要求1或2所述的结直肠癌相关的抗脆弱拟杆菌毒素蛋白激活体的特异性纳米抗体Nb3.27、权利要求3所述的核酸、权利要求4所述的原核表达载体、权利要求5所述的原核宿主细胞或权利要求6所述的突变体在制备脆弱 拟杆菌毒素蛋白激活体的检验试剂中的应用。
PCT/CN2022/103030 2022-01-20 2022-06-30 结直肠癌相关脆弱拟杆菌毒素蛋白激活体的特异性纳米抗体Nb3.27及其应用 WO2023137994A1 (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210068597.8A CN114409777B (zh) 2022-01-20 2022-01-20 结直肠癌相关脆弱拟杆菌毒素蛋白激活体的特异性纳米抗体Nb3.27及其应用
CN202210068597.8 2022-01-20

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023137994A1 true WO2023137994A1 (zh) 2023-07-27

Family

ID=81274859

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/CN2022/103030 WO2023137994A1 (zh) 2022-01-20 2022-06-30 结直肠癌相关脆弱拟杆菌毒素蛋白激活体的特异性纳米抗体Nb3.27及其应用

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN114409777B (zh)
WO (1) WO2023137994A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114409777B (zh) * 2022-01-20 2023-09-01 温玉荣 结直肠癌相关脆弱拟杆菌毒素蛋白激活体的特异性纳米抗体Nb3.27及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1987006616A1 (en) * 1986-04-25 1987-11-05 Technology Licence Company Limited Monoclonal antibodies and their use
WO2020237023A1 (en) * 2019-05-21 2020-11-26 Scaled Microbiomics, Llc Formulations for altering microbiome to reduce risks of hereditary and spontaneous colorectal cancers
CN112739376A (zh) * 2018-07-03 2021-04-30 工匠生物科技股份有限公司 用于治疗炎性肠疾病的组合物和方法
CN114409777A (zh) * 2022-01-20 2022-04-29 陕西海司诺维科技有限公司 结直肠癌相关脆弱拟杆菌毒素蛋白激活体的特异性纳米抗体Nb3.27及其应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109705215B (zh) * 2019-02-21 2020-09-04 武汉中科兴达技术有限公司 一种具有高特异性识别黄曲霉毒素b1的纳米抗体2018afb-n11及其应用
CN113150152B (zh) * 2021-04-13 2022-08-09 西安交通大学 一种人源t细胞表面抑制性分子的特异性纳米抗体及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1987006616A1 (en) * 1986-04-25 1987-11-05 Technology Licence Company Limited Monoclonal antibodies and their use
CN112739376A (zh) * 2018-07-03 2021-04-30 工匠生物科技股份有限公司 用于治疗炎性肠疾病的组合物和方法
WO2020237023A1 (en) * 2019-05-21 2020-11-26 Scaled Microbiomics, Llc Formulations for altering microbiome to reduce risks of hereditary and spontaneous colorectal cancers
CN114409777A (zh) * 2022-01-20 2022-04-29 陕西海司诺维科技有限公司 结直肠癌相关脆弱拟杆菌毒素蛋白激活体的特异性纳米抗体Nb3.27及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHENG WAI TENG, KANTILAL HARESH KUMAR, DAVAMANI FABIAN: "The Mechanism of Bacteroides fragilis Toxin Contributes to Colon Cancer Formation", MALAYSIAN JOURNAL OF MEDICAL SCIENCE, KERIAN, vol. 27, no. 4, 1 January 2020 (2020-01-01), pages 9 - 21, XP093080111, ISSN: 1394-195X, DOI: 10.21315/mjms2020.27.4.2 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114409777B (zh) 2023-09-01
CN114409777A (zh) 2022-04-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112094342B (zh) 与SARS-CoV-2 RBD结合的羊驼源纳米抗体
CN112094343B (zh) 与SARS-CoV-2 RBD结合的羊驼源纳米抗体
CN113201070B (zh) 抗ceacam5纳米抗体
CN108892723B (zh) 用于检测猪流行性腹泻病毒的单域重链抗体、制备方法及应用
CN108383907A (zh) 针对降钙素原的纳米抗体及其应用
WO2023137994A1 (zh) 结直肠癌相关脆弱拟杆菌毒素蛋白激活体的特异性纳米抗体Nb3.27及其应用
CN110577594B (zh) 一种金黄色葡萄球菌肠毒素a纳米抗体a21、应用及试剂盒
CN110423277B (zh) Pd-1的纳米抗体及其临床应用
CN110396128B (zh) 抗cd19纳米抗体的制备
CN110257405B (zh) 牛支原体乙醇脱氢酶基因及其编码蛋白与应用
CN114106187B (zh) 一种靶向ogt的特异性鲨鱼单域抗体及其制备方法和应用
CN110423273B (zh) 抗绿脓杆菌外毒素a纳米抗体及其应用
CN114478761B (zh) 绿色荧光蛋白鲨源纳米抗体、制备方法及其应用
CN113461816A (zh) 一种针对绿色荧光蛋白gfp的纳米抗体及其应用
CN110903359B (zh) 一种空肠弯曲菌重组蛋白及其单克隆抗体的制备
CN114395036B (zh) 一种抗脆弱拟杆菌毒素蛋白前体的特异性纳米抗体Nb2.82及其应用
CN113583119A (zh) 抗金黄色葡萄球菌的纳米抗体Nb56、应用及试剂盒
CN115160437A (zh) 一种抗体或其抗原结合片段及其应用
CN114249820B (zh) 与SARS-CoV-2 RBD结合的羊驼源纳米抗体
CN114805578B (zh) 一种白细胞免疫球蛋白样受体亚家族b成员2的羊驼纳米抗体、制备方法及其应用
CN114249822B (zh) 与SARS-CoV-2 RBD结合的羊驼源纳米抗体
CN114249821B (zh) 与SARS-CoV-2 RBD结合的羊驼源纳米抗体
CN114591436B (zh) 胃蛋白酶原i的特异性抗体及其制备方法与应用
CN114644710A (zh) 一种抗前胃泌素释放肽单链抗体及其制备方法与用途
CN115948346A (zh) 一株能稳定分泌抗芋螺毒素μ-KIIIA-CTX单克隆抗体的杂交瘤细胞株

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22921425

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1