CN114395036B - 一种抗脆弱拟杆菌毒素蛋白前体的特异性纳米抗体Nb2.82及其应用 - Google Patents

一种抗脆弱拟杆菌毒素蛋白前体的特异性纳米抗体Nb2.82及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗脆弱拟杆菌毒素蛋白前体的特异性纳米抗体Nb2.82及其应用，通过深入研究肿瘤患者产肠毒素脆弱拟杆菌和其产生的脆弱拟杆菌毒素蛋白，采用噬菌体展示技术对脆弱拟杆菌毒素蛋白前体(BFT‑sFL)纳米抗体进行表达；通过生物淘筛技术筛选出与BFT‑sFL具有较高结合力的纳米抗体Nb2.82。本发明表达并优化获得亲和力高且稳定均一的BFT‑sFL纳米抗体蛋白，开辟了靶向BFT‑sFL的纳米抗体的早期诊断直结肠癌和乳腺癌的新领域，具有良好的研究价值和应用前景。

Description

一种抗脆弱拟杆菌毒素蛋白前体的特异性纳米抗体Nb2.82及 其应用
技术领域
本发明属于生物制药技术领域，涉及一种抗脆弱拟杆菌毒素蛋白前体(B.fragilis toxin以下简称BFT-sFL)的特异性纳米抗体，该抗体与BFT的活性短氨基酸结合位点结合，具体涉及一种抗脆弱拟杆菌毒素蛋白前体的特异性纳米抗体Nb2.82及其应用。
背景技术
脆弱拟杆菌(B.fragilis)是拟杆菌属中最常见的模式种，也是所有临床分离厌氧菌株中最常见拟杆菌种。根据是否产毒素，脆弱拟杆菌可分为产肠毒素脆弱拟杆菌(Enterotoxigenic Bacteroides fragilis,ETBF)和不产肠毒素脆弱拟杆菌(Non-toxigenic Bacteroides fragilis,NTBF)。对脆弱拟杆菌群进行抗菌药物敏感性测定和耐药机制研究发现，临床分离脆弱拟杆菌群菌株对甲硝唑和氯霉素最为敏感，但对碳青霉烯类在内的抗菌药出现多重耐药，且耐药率及耐药基因携带率高于其他国家和我国既往研究报道，应引起临床高度关注。在其治疗方法中，抗生素是目前采取的主要手段，抗生素治疗可以使机体产生耐药性，还会对人体内的有益菌造成损伤。
ETBF可以重塑细菌群落以增强其自身的诱导能力以及选择性地“排挤”有益微生物物种。其中ETBF和产生遗传毒素的pks+大肠杆菌可以共同促进家族性腺瘤性息肉病(FAP)患者肿瘤的形成。研究发现，ETBF在结直肠癌患者肠道内的富集量明显高于健康人群，在结直肠癌患者中的检出率随结直肠癌的肿瘤分期的增大而增加。Purcell RV等人在对150位接受结肠镜检查的病人进行追踪，发现约有80％初次镜检携带ETBF的病人在12-15年后患有癌前病变，ETBF的定植可能是早期大肠癌发生的潜在标志。
脆弱拟杆菌毒素(B.fragilis toxin，BFT)是ETBF的毒性来源，具有很强的活性和毒性，BFT是一种大小约为20kDa的含锌蛋白酶。包括三种亚型，分别由bft1、bft2、bft3三种等位基因编码，三种等位基因具有高度同源性，碱基序列89％～94％相同。BFT共由397个氨基酸残基组成，包括含有18个氨基酸残基的信号肽，含有193个氨基酸残基的前肽区和186个氨基酸残基的催化活性区。其中BFT2毒性最强，BFT1分布最广，BFT3似乎仅分布在东南亚地区。BFT基因由6kb的致病性岛BfPAI编码，只包含编码BFT的bft基因和编码另一种金属蛋白酶基因mpII，部分ETBF可存在双拷贝致病岛基因。
ETBF菌株的体外检测手段主要分为四种：第一种是PCR检测，即从粪便中提取DNA对bft基因进行检测，但是粪便中含有大量Taq聚合酶的抑制物质,因此提取的DNA扩增效果不佳。第二种是通过HT29/C1细胞形态学观察，利用BFT能改变肠上皮细胞形态的特性。BFT的毒性作用会使细胞变圆、细胞簇散裂。但是该方法成本高，需要大量劳动力，而且还需要厌氧微生物学专业知识和HT29/C1细胞分析的主观解释。第三种方法是使用酶联免疫吸附法(ELISA)检测[12]，使用BFT多克隆抗体作为抗原。第四种方法是通过免疫磁性分离技术(IMS-PCR)检测，为了更高的灵敏度该方法需要两种脆弱拟杆菌抗体，其中的一种抗体还遗失了。与此同时，传统抗体在鉴定过程中由于其稳点性差、产量低、纯度低和成本高等缺点，故而不能广泛使用。纳米抗体分子量小，稳定性强、抗酸碱性强、热稳定好，成本低廉，可以克服普通抗体的以上缺点。因此，建立以纳米抗体为探针的新型、快速、准确和灵敏的诊断方法，是评估ETBF流行病学及其疾病相关性的关键，同时也是ETBF疾病治疗试验的重要前提。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种抗脆弱拟杆菌毒素蛋白前体的特异性纳米抗体Nb2.82及其应用。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明公开了一种抗脆弱拟杆菌毒素蛋白前体的特异性纳米抗体Nb2.82，该特异性纳米抗体Nb2.82的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
优选地，该特异性纳米抗体Nb2.82的重链包括4个框架区FR1～FR4，以及3个抗原互补决定区CDR1～CDR3；其中：
所述4个框架区FR1～FR4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：6和SEQ ID NO：8所示；
所述3个抗原互补决定区CDR1～CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：5和SEQ ID NO：7所示。
本发明还公开了一种核酸，编码权利要求1所述的抗脆弱拟杆菌毒素蛋白前体的特异性纳米抗体Nb2.82，该核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。
本发明还公开了一种原核表达载体，含有上述的核酸。
本发明还公开了一种原核宿主细胞，含有上述的原核表达载体。
本发明还公开了一种突变体，是以上述的抗脆弱拟杆菌毒素蛋白前体的特异性纳米抗体Nb2.82为模板，经随机突变、点突变或双特异性抗体改造，获得的特异性或靶向性增强的突变体。
本发明还公开了上述的抗脆弱拟杆菌毒素蛋白前体的特异性纳米抗体Nb2.82、核酸、原核表达载体、原核宿主细胞或突变体在制备抗脆弱拟杆菌毒素蛋白吸附剂中的应用。
本发明还公开了上述的抗脆弱拟杆菌毒素的特异性纳米抗体Nb2.82、核酸、原核表达载体、原核宿主细胞或突变体在制备脆弱拟杆菌毒素的检验试剂中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过深入研究抗脆弱拟杆菌毒素蛋白前体(BFT-sFL)，采用噬菌体展示技术对BFT-sFL纳米抗体进行表达，并通过生物淘筛技术筛选出与抗原具有较高结合力的纳米抗体，称为Nb2.82，该纳米抗体Nb2.82为抗脆弱拟杆菌毒素的特异性纳米抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明通过实验表达并优化获得亲和力高且稳定均一的BFT-sFL纳米抗体蛋白即Nb2.82，开辟检验人肠道细菌产肠毒素脆弱拟杆菌和脆弱拟杆菌毒素的新领域，具有良好的研究价值和应用前景。
附图说明
图1为BFT-sFL毒素蛋白质结构示意图；
图2为BFT1-sFL抗原重组蛋白纯化图；其中，(a)为经凝胶过滤层析柱Superdex75PG纯化后的蛋白结果图(b)为蛋白电泳结果；
图3用ELISA方法评价免疫效果图；
图4为用PCR方法随机挑取20个菌落计算插入率；
图5 SDS-PAGE考马斯亮蓝染色结果验证纳米抗体大小和完整性实验结果；
图6纳米抗体以及BFT1-sFL抗原与纳米抗体复合物小量表达可溶性分析；
图7为等温滴定量热法(ITC)筛选高亲和力纳米抗体Nb2.82亲和力数据；
图8为Nb2.82+BFT1-sFL复合物结晶结果；
图9 PDBePISA鉴定得出的抗原与纳米抗体结合的结合表位。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
下面结合附图对本发明做进一步详细描述：
如图1所示，BFT蛋白前体(BFT1-sFL)BFT共由397个氨基酸残基组成，包括含有18个氨基酸残基的信号肽，含有193个氨基酸残基的前肽区和186个氨基酸残基的催化活性区。
本发明利用噬菌体展示技术，从羊驼免疫的单域重链抗体中筛选能与靶重组蛋白BFT1-sFL特异性结合的纳米抗体克隆，以作为BFT1-sFL的检测纯化和试剂。
通用BFT1-sFL重组蛋白对羊驼进行免疫，分离血液中的白细胞，利用噬菌体展示技术，构建噬菌体展示文库，经过3次连续生物淘筛法获得与BFT1-sFL蛋白结合的噬菌体，经测序后和生物比对后，用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA)法筛选出抗BFT1-sFL的高亲和力纳米抗体。
1、BFT1-sFL原核表达系统的构建和蛋白表达
首先分别构建了bft1-sFL不含信号肽全长原核表达质粒。通过NcoI和EcoRI限制性内切酶位点构建在pET28a载体上，同时在蛋白的N端添加6*HIS标签。Fpn通过NcoI和EcoRI限制性内切酶位点构建在pET28a载体上，同时在蛋白的C端添加6*HIS标签。通过使用IPTG诱导BFT重组蛋白表达，当细菌培养液OD600在0.6左右时，加0.4M IPTG，18℃低温诱导过夜。BFT1-sFL具有较好的可溶性。BFT1-sFL重组蛋白的体积排阻色谱的结果，如图2所示，从图2中可以看出BFT1-sFL蛋白质表达纯度高，蛋白质纯化为单峰，表达蛋白预期分子量为44kDa，与考马斯亮蓝染色结果相符。
2、以BFT1-sFL为抗原的纳米抗体文库的构建
1)羊驼免疫血清的抗体检测
向一只5岁的健康雌性羊驼每周皮下注射100μg纯化的BFT1-sFL蛋白和免疫佐剂，共注射6次。在第一次注射前和最后一次注射后第7天从颈静脉采集外周血，分离获得血清，用ELISA方法比较抗体滴度。向96孔板包被100μg/mL的BFT1-sFL蛋白，以PBS作为阴性对照。经洗板和封闭后，加入梯度稀释的免疫前和免疫后血清。以偶联HRP的山羊抗Llama抗体作为二抗，加入ABTS试剂进行反应。用酶标仪在405nm处测量吸光度值。结果参见图3，图3中实线为免疫前的血清，虚线为免疫后的血清，从图3中可以看出，免疫后羊驼血清中靶向BFT1-sFL的抗体水平显著高于免疫前，证明以BFT重组蛋白混合免疫佐剂皮下注射的方法能够成功诱导羊驼的体液免疫反应，对实验动物的免疫达到了预期目的，可以进行后续构建文库等工作。
2)噬菌体文库的构建
于最后一次免疫后7天，从羊驼颈静脉收集100mL外周血，用Sepmate管和Lymphoprep分离外周血单个核细胞。用Trizol试剂从PBMCs中提取总RNA，用Random引物和逆转录酶合成cDNA。
用CALL001和CALL002引物进行巢式PCR扩增VHH基因，以1％琼脂糖凝胶电泳，用快速凝胶提取编码重链抗体的基因片段(700bp)。
然后用VHH-for和VHH-Back引物作为第二次PCR模板，这对引物是为VHH的框架1和框架4区域设计的，包含PstI和Eco91I酶切位点。第二轮PCR产物经电泳回收，用PstI、XbaI和Eco91I限制性内切酶酶切噬菌体载体pMES4，用PstI和Eco91I酶切第二轮PCR产物。用T4DNA连接酶连接经酶切的pMES4和PCR产物。将重组载体转染大肠杆菌TG1感受态细胞，并在含氨苄西林的LB琼脂平板上进行培养。
随机挑取20个菌落，用载体引物GIII和MP57进行菌落PCR，计算插入率。经转化的TG1由M13K07辅助噬菌体感染在噬菌体上展示VHH片段。感染的细菌在含氨苄西林和卡那霉素的培养基中培养过夜。培养基下离心后，将上清液与PEG6000/NaCl混合分离噬菌体，之后将噬菌体颗粒重悬在1mL冰冷PBS中。VHH库的规模达到1.93*107/mL。对20个随机挑选的菌落进行PCR筛选，结果表明，大多数克隆插入了VHH基因，计算插入率(95％)，结果参见图4，图4为琼脂糖凝胶电泳检测菌落PCR产物大小共1-20个菌落，条带分子量大小为700bp认定为插入了VHH片段的克隆，分子量大小400bp左右的条带认为转入了空质粒。M：DL2000核酸Marker。1-20为随机挑取的20个菌落。
3、纳米抗体筛选
1)生物淘筛
在包被100μL BFT1-sFL蛋白的96孔板上进行三轮生物淘筛以富集特异性结合BFT1-sFL的噬菌体。封闭后洗涤5次。将噬菌体文库加入抗原孔和阴性孔，室温孵育2h后用洗涤10-15次，用蛋白酶洗脱。分别取10μL从抗原孔和阴性孔中洗脱的噬菌体，梯度稀释并感染对数期大肠杆菌TG1，在含有氨苄西林的LB琼脂平板上划线。通过比较抗原孔和阴性孔噬菌体的效价，评价包含BFT1-sFL特异性结合VHHs的噬菌体的富集情况。其余的噬菌体用于感染TG1并过夜培养，取菌液加入M13K07辅助噬菌体，重复上一节沉淀过程，将噬菌体亚文库扩增至后用于下一轮生物淘筛。经过三轮淘选，富集率达到4×104，如下表1所示：
表1噬菌体的富集程度
c.f.u:菌落形成单位。
表1结果显示，第三轮后抗原孔的滴度高于阴性孔1000倍以上，表明噬菌体文库中特异性结合BFT1-sFL的部分已充分富集，满足筛选阳性克隆的条件。
2)细菌胞质提取物ELISA
在含有氨苄西林的LB琼脂平板上分别培养第二轮和第三轮噬菌体子文库感染的大肠杆菌TG1细胞，筛选结果如下表2所示。随机挑取第二轮亚文库94个菌落和第三轮亚文库94个菌落，在含氨苄西林的TB培养基中培养。以1M IPTG在28℃过夜诱导。通过TES溶液提取胞质蛋白，以鼠源抗HIS抗体作为一抗，偶联HRP的羊抗鼠抗体作为二抗，以TMB试剂显色。用抗BFT抗体和偶联HRP的羊抗兔抗体作为阳性对照。以酶标仪检测吸光度值。将OD450的值比阴性孔的值高出2倍的克隆判定为阳性。将阳性克隆提取质粒进行测序，并按CDR3区进行分类。
表2噬菌体文库的筛选
4、纳米生物的表达、纯化以及鉴定
1)表达纯化
将特异性纳米抗体序列插入pHEN6c质粒，转染大肠杆菌WK6细胞。以1L TB培养基中，1mM IPTG诱导并提取HIS标记的重组纳米抗体，然后用Ni-NTA柱和固定化金属亲和层析纯化，将纳米抗体由咪唑透析至PBS。纳米抗体表达量良好12.7mg/L。
2)SDS-PAGE分析
将40μL纯化后的纳米抗体加入10μL 5×loading buffer，100℃5min水浴。上样量为5μL至4％-15％的SDS-PAGE凝胶并电泳，用考马斯亮蓝染液染色2h。结果参见图5，图5可清晰地表明只有一个15kDa大小的条带。具体地，可见Nb2.82纳米抗体条带均位于15kD附近，符合测序结果。
3)等温滴定量热法(ITC)亲和力测定
使用Microcal PEAQ-ITC完成，反应在20℃进行，纳米抗体和BFT1-sFL蛋白样品均将缓冲液置换到bufferA(20mM Tris-Hcl pH 8.0，150mM NaCl，5％Glycerol)中，蛋白质样品通过Nanodrop分光光度计进行定量。纳米抗体蛋白浓度在20μM左右，BFT1-sFL蛋白浓度在200μM左右。实验数据使用Microcal PEAQ-ITC自带软件处理，结果如图7所示，计算纳米抗体Nb2.82的亲和力为11.9nM。
5、BFT1-sFL重组蛋白与Nb2.82结合符合物晶体学解析
1)复合物蛋白质纯化
离心收集BFT1-sFL过夜诱导表达的菌体(1L)，弃上清，加入30mL buffer A将菌体重悬，加入1mmol/L PMSF。在冰水混合物中超声破碎，离心收集上清，上清经0.2μm针式微型过滤器过滤后备用。离心收集纳米抗体过夜诱导表达的菌体(1L)，弃上清，菌体重悬后裂解过夜。离心收集上清，上清经0.2μm针式微型过滤器过滤后备用。
使用Ni-NTA亲和层析和凝胶过滤层析两步法对重组蛋白进行纯化，先将过滤后上清使用Ni-NTA进行纯化，使用5％buffer B洗去杂蛋白，用100％buffer B洗脱目的蛋白。
将含有目的蛋白的洗脱液进行浓缩后，用凝胶过滤层析柱Superdex75PG纯化，观察出峰位置并收集出峰位置的蛋白。每管收集1mL，用NanoDrop 2000测定收集样品蛋白浓度。将收集的蛋白样品进行12％SDS-PAGE电泳检测，考马斯亮蓝染色，检验蛋白分离纯化效果。
2)结晶和晶体结构解析
①结晶条件的筛选和优化
首先将纯化后的蛋白浓缩到毫克级别浓度，使用座滴法对蛋白晶体生长条件进行初步筛选，0.5μL蛋白样品加0.5μL结晶液，池液加45μL，于20℃恒温条件下培养晶体。使用Hampton公司的Crystal Screen I+II、PEG/Ion、Index，以及Molecular Dimensions公司的PACT和JCSG等将用于初始的结晶条件筛选。然后根据初筛的条件对晶体生长条件进行进一步的沉淀剂浓度、盐浓度、pH等条件优化获得高质量的可收集X射线衍射，分辨率高的晶体。
对于BFT1-sFL与纳米抗体复合物晶体：先将纯化好的BFT1-sFL和纳米抗体蛋白以摩尔比1：1.5的比例混和，以形成复合物。复合物经凝胶过滤层析柱Superdex75PG纯化，如图6所示，浓缩至30mg/mL用于结晶。晶体板密封好后置于20℃的晶体培养箱中，Nb2.82+BFT1-sFL复合物结晶照片如图8所示。
②晶体数据收集和结构解析
优化好的重组蛋白及其与蛋白/蛋白复合物的晶体挑至配好的冻存液中，立刻放入液氮中保存。将首先使用In house的X射线源收集晶体X射线衍射数据，在In house的X射线衍射数据基础上，将前往上海同步辐射光源(Shanghai Synchrotron RadiationFacility，SSRF)国家蛋白质中心线站收集高分辨率的X射线衍射数据，结果证明BFT1与Nb2.82特异性结合并获得了抗原表位见图7，PDBePISA鉴定得出的抗原与纳米抗体结合的结合表位。
根据图9所示，PDBePISA鉴定得出，BFT1-FL与Nb2.82特异性结合并获得了抗原表位，Nb2.82结合抗原的氨基酸序列N端到210氨基酸位置的部分，也就是结合BFT的N段蛋白质前体部分。
综上所述，本发明从实验动物羊驼的免疫开始，构建了大容量纳米抗体的噬菌体展示文库。以生物淘筛(bio-panning)方法经过3轮筛选后，大量表达及纯化得到了高亲和力的BFT-PD纳米抗体，经ITC鉴定抗体结合活性，结果显示纳米抗体Nb2.82具有最高的结合活性的亲和力(KD)为11.9nM，是首个BFT1-sFL特异性抗体，可以用于鉴定病人粪便样本中的BFT1-sFL，作为结直肠癌以及乳腺癌早期诊断指标之一，具有较大的科学意义和临床应用价值。
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。
序列表
<110> 陕西海司诺维科技有限公司
<120> 一种抗脆弱拟杆菌毒素蛋白前体的特异性纳米抗体Nb2.82及其应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Thr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Asn Ile Asn Ser Asp Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ile Pro Lys Arg Thr Tyr Val Pro Pro Ser Gln Phe Asp Asp Arg
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser His His His His His His
115 120 125
<210> 2
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr Thr
1 5
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
1 5 10 15
Thr
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Asn Ile Asn Ser Asp Gly Gly Arg
1 5
<210> 6
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Thr Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 7
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Ala Ile Pro Lys Arg Thr Tyr Val Pro Pro Ser Gln Phe Asp Asp
1 5 10 15
<210> 8
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 9
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
caggtgcagc tgcaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agatatacta tgacttgggt ccgccaggct 120
ccaggaaagg ggctcgagtg ggtctcaaat attaatagtg atggtggtcg cacatactat 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca acaccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgaa gcctgaggac acggccgttt attactgtgc aataccgaag 300
cgtacctatg tacccccaag tcagtttgac gacaggggcc aggggaccca ggtcaccgtc 360
tcctca 366

Claims (6)

1. 一种抗脆弱拟杆菌毒素蛋白前体的特异性纳米抗体Nb2.82，其特征在于，该特异性纳米抗体Nb2.82的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2. 一种核酸，其特征在于，编码权利要求1所述的抗脆弱拟杆菌毒素蛋白前体的特异性纳米抗体Nb2.82，该核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。
3.一种原核表达载体，其特征在于，含有权利要求2所述的核酸。
4.一种原核宿主细胞，其特征在于，含有权利要求3所述的原核表达载体。
5.权利要求1所述的抗脆弱拟杆菌毒素蛋白前体的特异性纳米抗体Nb2.82、权利要求2所述的核酸、权利要求3所述的原核表达载体或权利要求4所述的原核宿主细胞在制备抗脆弱拟杆菌毒素蛋白吸附剂中的应用。
6.权利要求1所述的抗脆弱拟杆菌毒素的特异性纳米抗体Nb2.82、权利要求2所述的核酸、权利要求3所述的原核表达载体或权利要求4所述的原核宿主细胞在制备脆弱拟杆菌毒素的检验试剂中的应用。
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