CN109705215A - 一种具有高特异性识别黄曲霉毒素b1的纳米抗体2018afb-n11及其应用 - Google Patents
一种具有高特异性识别黄曲霉毒素b1的纳米抗体2018afb-n11及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种具有高特异性识别黄曲霉毒素B1的纳米抗体2018AFB‑N11及其应用。利用黄曲霉毒素B1完全抗原免疫羊驼，提取免疫后羊驼血液中的RNA，采用一步法RT‑PCR系统扩增出羊驼重链抗体可变区VHH基因，与pComb3X载体连接后转化大肠杆菌得到高质量的纳米抗体基因库，将黄曲霉毒素B1完全抗原包被在酶标板上，筛选噬菌体展示纳米抗体基因库，获得特异性识别黄曲霉毒素B1的纳米抗体基因，再将此基因转化至大肠杆菌中，建立能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体菌株。本发明公开的黄曲霉毒素B1纳米抗体2018AFB‑N11灵敏度高、特异性好，对黄曲霉毒素B1的50％抑制浓度IC50为1.26ng/mL；与黄曲霉毒素B2、G1、G2、M1的交叉反应率均小于0.1％。其可用于高特异性识别黄曲霉毒素B1的检测试剂的研发。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种具有高特异性识别黄曲霉毒素B1的纳米抗体2018AFB-N11及其应用。
背景技术
黄曲霉毒素(Aflatoxins，AFs)主要是由黄曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)产生的次级代谢产物，最常见的黄曲霉毒素包括AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和AFM1等，而AFB1的毒性最强，污染最广，被国际癌症研究机构列为对人体造成危害的I类致癌物。研究发现，黄曲霉毒素属肝脏毒，除抑制DNA、RNA的合成外，也抑制肝脏蛋白质的合成，长期摄入黄曲霉毒素污染的食品是诱发肝癌的重要原因之一。我国属于黄曲霉毒素B1污染情况较重的地区，在各种食物及农产品，尤其是玉米、花生及其制品中都很有可能存在黄曲霉毒素的污染。现行有效的食品安全国家标准GB 2761-2017《食品中真菌毒素限量》规定了食品中黄曲霉毒素AFB1和AFM1的最大允许量，不同种类食品中AFB1的限量范围为0.5-20μg/kg。因此加强农产品和食品中黄曲霉毒素B1的检测，开发高灵敏、高特异的黄曲霉毒素B1检测方法，对保障我国食品消费安全具有重要意义。
现有检测黄曲霉毒素污染的方法主要包括基于色谱分析的理化分析法和基于抗体抗原特异性结合反应的免疫分析法。色谱分析法检测黄曲霉毒素依赖大型精密仪器，精确度高但样品前处理复杂，不适合大量样品的现场筛查和快速测定。而免疫分析法具有快捷、成本低、高通量和适合现场操作等优点，已成为仪器分析法的重要补充，也是目前黄曲霉毒素等真菌毒素快速筛查的主要手段。免疫分析是基于抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应的原理，抗体的性能是免疫分析方法灵敏度、特异性、准确度等指标的决定性因素。要研究建立针对黄曲霉毒素的免疫学检测技术，必须先制备高灵敏的黄曲霉毒素特异性抗体。
免疫分析需要高质量的抗体，随着抗体技术的发展，基因工程抗体在黄曲霉毒素的检测领域也逐渐被应用。纳米抗体技术是采用分子生物学手段，克隆出骆驼科动物(包括骆驼、驼马和羊驼等)体内的重链抗体可变区片段(VHH)，得到单域重链抗体(又称纳米抗体)，并能与抗原特异性结合。纳米抗体具有体积小、易制备、稳定性好、便于批量化生产和进行抗体亲和力改造等优势，已经成为基因工程抗体研制的重要方向，对于黄曲霉毒素的低成本、可批量制备的免疫检测试剂的开发有重要的实用价值。
申请号为CN201410121842.2的专利公开了一种黄曲霉毒素纳米抗体基因库、构建方法、用途及黄曲霉毒素B1纳米抗体2014AFB-G15，虽然具有耐有机试剂、耐高温等特性，稳定性好的特点，但是其对黄曲霉毒素B2、G1、G2、M1的交叉反应率高，在高特异性识别黄曲霉毒素B1方面的灵敏度及特异性低。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的问题，提供一种具有高特异性识别黄曲霉毒素B1的纳米抗体2018AFB-N11，同时提供该纳米抗体的编码序列及该纳米抗体用于检测黄曲霉毒素B1的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种具有高特异性识别黄曲霉毒素B1的纳米抗体2018AFB-N11，所述纳米抗体2018AFB-N11包括四个框架区FR和三个互补决定区CDR，所述四个框架区FR的氨基酸序列分别为：FR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示、FR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示、FR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示、FR4的氨基酸序列如序列表SEQ IDNO:4所示；所述三个互补决定区CDR的氨基酸序列分别为：CDR1的氨基酸序列如序列表SEQID NO:5所示、CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:6所示、CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:7所示。
进一步的，所述纳米抗体2018AFB-N11的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:8所示。
进一步的，所述纳米抗体2018AFB-N11包括一条如序列表SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的驼源单域重链抗体VHH链。
本发明提供一种核酸分子，编码基因序列如序列表SEQ ID NO:9所示，其编码的蛋白质为本发明所述的高特异性识别黄曲霉毒素B1的纳米抗体2018AFB-N11。
所述高特异性识别黄曲霉毒素B1的纳米抗体2018AFB-N11在检测黄曲霉毒素B1方面的应用。
本发明所提供的高特异性识别黄曲霉毒素B1的纳米抗体2018AFB-N11是采用噬菌体展示纳米抗体基因库构建及生物淘选法获得的，所述的噬菌体展示纳米抗体基因库构建，具体操作方法如下：对羊驼免疫黄曲霉毒素B1完全抗原，提取经免疫后羊驼血液中的RNA，采用一步法RT-PCR方法，通过特异性引物扩增得到羊驼血液中重链抗体IgG2和IgG3的可变区基因，即VHH基因，然后将VHH基因与pComb3X载体连接后转化大肠杆菌，构建黄曲霉毒素纳米抗体基因库。所述的生物淘选法筛选黄曲霉毒素B1纳米抗体，具体通过如下技术方案实现：将构建成功的黄曲霉毒素纳米抗体基因库通过M13KO7辅助噬菌体拯救为展示在噬菌体衣壳表面的形式之后，通过“吸附-洗脱-富集”的方法进行淘选，筛选出与黄曲霉毒素B1特异性结合而不和载体蛋白BSA结合的阳性孔，然后采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔培养液进行检测，用黄曲霉毒素B1作为竞争原，选择灵敏度较高的克隆，最终筛选获得噬菌体展示的黄曲霉毒素B1纳米抗体。
本发明提供的高特异性识别黄曲霉毒素B1的纳米抗体2018AFB-N11的制备方法，步骤如下：将获得的噬菌体展示的黄曲霉毒素B1纳米抗体，提取含有纳米抗体基因的噬菌粒DNA，转化至大肠杆菌Top10F’中，通过诱导表达和金属离子亲和层析进行纯化，获得高特异性识别黄曲霉毒素B1的纳米抗体2018AFB-N11。
上述高特异性识别黄曲霉毒素B1的纳米抗体2018AFB-N11在黄曲霉毒素B1富集以及纯化中的应用。
上述高特异性识别黄曲霉毒素B1的纳米抗体2018AFB-N11在通过随机或定点突变技术进行改造所获得能与黄曲霉毒素B1特异性结合的抗体中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明提供的的高特异性识别黄曲霉毒素B1的纳米抗体2018AFB-N11具有灵敏度高、特异性好的特征，对黄曲霉毒素B1的50％抑制浓度IC50为1.26ng/mL，与黄曲霉毒素B2、G1、G2、M1的交叉反应率均小于0.1％。
2、本发明提供的高特异性黄曲霉毒素B1纳米抗体2018AFB-N11为原核生物大肠杆菌表达，因此，能有效降低抗体生产成本。
3、本发明提供的高特异性黄曲霉毒素B1纳米抗体2018AFB-N11可应用于黄曲霉毒素B1单一组分的测定，特异性好，准确性高。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：黄曲霉毒素B1纳米抗体基因库的构建
1、动物免疫
购买2岁龄的雄性羊驼一只，免疫黄曲霉毒素B1完全抗原(AFB1-BSA,Sigma公司)。将200μg黄曲霉毒素B1完全抗原与弗式不完全佐剂乳化后，对羊驼进行皮下多点注射。间隔2周免疫一次，每次免疫后7-10天对羊驼进行静脉取血，采用间接ELISA法测定血清效价，选取效价最高的一次免疫后，取血10mL，提取总RNA。
2、黄曲霉毒素B1纳米抗体基因库的构建
(1)提取总RNA：选取羊驼血清效价最高的一次免疫，免疫后7-10天，对羊驼进行静脉取血10mL，提取总RNA：采用Life Technology公司的LeukoLOCK总RNA分离试剂盒提取羊驼血液中的总RNA。
(2)一步法RT-PCR扩增羊驼重链抗体VHH基因：以羊驼血液总RNA为模板，采用Invitrogen公司的SuperScriptTM III One-Step RT-PCR System withPlatinumTMTaqHigh Fidelity DNA Polymerase试剂盒，采用一步法RT-PCR方法，通过特异性引物扩增得到羊驼血液中重链抗体IgG2和IgG3的可变区基因，即VHH基因。
上述方案中，所述特异性引物是根据FR1区设计上游引物F，根据IgG2和IgG3铰链区分别设计下游引物R2、R1，即IgG2的重链可变区引物为“F、R2”，IgG3的重链可变区引物为“F、R1”。引物上均含有Sfi I酶切位点(引物序列下划线处)，能与pComb3X载体上相应的酶切位点进行连接，形成重组质粒；所述特异性引物为：
R1:5’-CATGCCATGACTCGCGGCCGGCCTGGCCATGGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG-3’
F:5’-CATGCCATGACTGTGGCCCAGGCGGCCCAGKTGCAGCTCGTGGAGTC-3’；
或
R2:5’-CATGCCATGACTCGCGGCCGGCCTGGCCGTCTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGG-3’
F:5’-CATGCCATGACTGTGGCCCAGGCGGCCCAGKTGCAGCTCGTGGAGTC-3’
其中横线部分表示的引物序列为Sfi I酶切位点。
上述方案中，所述一步法RT-PCR扩增的反应体系为：
所述一步法RT-PCR扩增的程序为：
45-60℃ 15-30min，94℃ 2min，扩增1个循环；
94℃ 15s，55℃ 30s，68℃ 1min，扩增40个循环；
68℃ 5min。
其中，以“F、R1”为引物进行4个PCR扩增反应，以“F、R2”为引物进行6个PCR扩增反应。PCR产物经过0.7％的琼脂糖凝胶电泳分离后，用试剂盒纯化回收450bp大小的DNA片段。
(3)酶切处理VHH基因与pComb3X载体：将VHH基因与pComb3X载体分别进行Sfi I酶切处理。
VHH基因的Sfi I酶切：
pComb3X载体的Sfi I酶切：
50℃水浴16h后用琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒进行回收。
(4)VHH基因与pComb3X载体的连接：
按照如下体系进行连接：
16℃水浴过夜后，用琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒进行回收，-20℃保存待用。
(5)连接产物的电转化：
将上述连接产物取3μL加入到25μL E.coli ER2738电转化感受态细胞中，混匀后，加入到预冷的0.1cm电转化杯(Bio-rad)中，快速放置于Bio-rad电转化仪上进行电转化，电转化条件：1.8kV，200Ω，25μF，电转化后立即在电转化杯中加入1mL 37℃预热的SOC液体培养基，用移液枪轻轻吸打混匀，转移至摇菌管中，37℃缓慢振摇复苏1h。取2μL菌液倍比稀释后涂布于LB氨苄平板上，37℃倒置过夜，第二天数菌落个数计算库容量。
(6)黄曲霉毒素纳米抗体基因库的拯救：共进行十次上述的电转化，将复苏后的菌液全部转入200mL SB培养基中，于37℃ 250rpm振摇至OD600值为0.5时，加入1mL，1×1012pfu的辅助噬菌体M13KO7，37℃静置1h后，继续振摇2h，加入卡那霉素至终浓度为70μg/mL，并振摇过夜。次日，将过夜菌于4℃ 10000rpm离心15min，将上清转移至无菌的离心瓶中，加入1/4体积的5×PEG/NaCl，于冰上静置2h后，4℃ 12000rpm离心20min，用10mL无菌的重悬溶液(含1×蛋白酶抑制剂，0.02％NaN3和0.5％BSA的PBS缓冲液)溶解沉淀得到拯救后的黄曲霉毒素纳米抗体基因库。
实施例2：黄曲霉毒素B1纳米抗体的筛选以及序列测定
1、黄曲霉毒素B1纳米抗体的淘选
用AFB1-BSA(1μg/孔)及3％的BSA-PBS溶液(用作阴性对照)分别包被ELISA板，4℃过夜；次日，倾掉包被液后，PBST洗板3次，然后用3％脱脂奶粉封闭1h；PBST洗板3次，在包被有AFB1-BSA的孔中加入上述拯救后的黄曲霉毒素纳米抗体基因库100μL，37℃孵育1h；PBST洗板10次后，每孔加入100μL、500ng/mL AFB1(黄曲霉毒素)溶液，室温(20℃～30℃)震荡30min洗脱。将洗脱液转至包被有3％BSA-PBS溶液的孔中，37℃孵育1h(去除非特异性吸附)；孵育后，取上清侵染2mL生长至对数期的ER2738菌液，37℃侵染20min，取1μL、10μL分别涂布LB氨苄平板上，并于37℃培养箱中静置过夜，次日数平板上的菌落数确定洗脱液中噬菌体滴度。另将上述剩余的被侵染后的ER2738菌液转入6mL SB培养基中，加100mg/mL的氨苄青霉素3μL，37℃振摇1h，补加氨苄青霉素至终浓度为50μg/mL，继续振摇1h后，加入1mL辅助噬菌体M13KO7(1×1012pfu/mL)，37℃静置30min，转入100mL SB培养基，补加氨苄青霉素(100mg/mL)50μL，继续振摇2h后，加入卡那霉素至终浓度为70μg/mL，并于37℃振摇过夜。次日，将菌液于10000rpm 4℃离心15min，转移上清，并加入1/4体积5×PEG/NaCl溶液，于冰上孵育2h，12000rpm 4℃离心20min，用1％BSA-PBS溶液溶解沉淀，得到第一轮淘选扩增产物，并用于下一轮淘选。在随后几轮的淘选中，包被抗原AFB1-BSA的浓度分别为0.5μg/孔、0.1μg/孔、0.05μg/孔，洗脱液分别为100ng/mL、20ng/mL、10ng/mL的AFB1标准品溶液。
2、阳性克隆的鉴定：
经过4轮淘选后，取2μL洗脱液倍比稀释后侵染生长至对数期的ER2738菌液，涂布LB氨苄平板上，37℃倒置过夜。次日，随机挑取30个克隆分别于3mL SB-氨苄培养基中，37℃震荡培养6-8h，至OD600为0.6左右，加入30μL辅助噬菌体M13KO7(1×1012pfu/mL)，37℃静置30min后继续振摇2h，加入卡那霉素至终浓度为70μg/mL，并震荡培养过夜；次日，将菌液于10000rpm 4℃离心15min后，得到菌液上清。
用包被液配制AFB1-BSA至终浓度0.2μg/mL，包被96孔ELISA板，每孔100μL，同时另取ELISA板，其中的32个孔用3％BSA包被，4℃包被过夜；次日，倾掉包被液后，PBST洗板3次，然后用3％脱脂奶粉-PBS封闭1h；取AFB1标准品储存液，用10％甲醇/PBS配制成100ng/mL、0ng/mL的工作液，分别取50μL加入到包被有AFB1-BSA抗原的孔中，再每孔加入50μL上述菌液上清，每种工作液浓度重复3次；在包被有BSA的孔中加入10％甲醇/PBS和50μL上述菌液上清作为对照，轻摇板子混匀后，置37℃温箱反应1h；PBST洗板10次后，每孔加入100μL用PBS按1:5000比例稀释的HRP标记的抗M13鼠单抗，37℃孵育1h；PBST洗板6次，每孔加入100μL新鲜配制的TMB底物溶液，37℃孵育15min；加2mol/L H2SO4，每孔50μL中止反应，用酶标仪分别测定OD450值；对BSA不吸附，对AFB1-BSA有吸附，并且加入AFB1标准品后存在竞争反应的即为阳性噬菌体克隆，由此筛选得到吸光值和灵敏度均较高的孔，得到噬菌体展示的黄曲霉毒素B1纳米抗体2018AFB-N11。
3、黄曲霉毒素B1纳米抗体2018AFB-N11的特性及测序分析结果如下：
采用间接竞争ELISA方法测定黄曲霉毒素B1纳米抗体2018AFB-N11的抗体特异性，具体用交叉反应率描述，测试方法如下：将AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和AFM1五种不同标准品储存液，用10％甲醇/PBS梯度稀释至10个不同的工作浓度，同等条件下采用间接竞争ELISA方法进行测定，依次绘制五种黄曲霉毒素的竞争ELISA曲线，求出各自抑制率为50％时的标准品浓度，用IC50表示，并根据下述计算公式计算交叉反应率：交叉反应率(％)＝(AFB1IC50/类似物IC50)×100％，所述类似物为AFB2、AFG1、AFG2或AFM1，得到黄曲霉毒素B1纳米抗体2018AFB-N11对于对黄曲霉毒素B1的50％抑制浓度IC50为1.26ng/mL；与黄曲霉毒素B2、G1、G2、M1的交叉反应率均小于0.1％。因此，黄曲霉毒素B1纳米抗体2018AFB-N11是一种抗黄曲霉毒素B1的高特异性纳米抗体，能够应用于特异性识别黄曲霉毒素B1的检测试剂的研发。
同时将筛选到的含有黄曲霉毒素B1纳米抗体2018AFB-N11的克隆菌液送至上海桑尼科技有限公司进行测序分析，测序引物为噬菌体载体通用引物R1：5’-CCATGATTACGCCAAGCT TTGGAGCC-3’。得到黄曲霉毒素B1纳米抗体2018AFB-N11的氨基酸序列为序列表SEQ ID NO:8所示，编码基因序列为序列表SEQ ID NO:9所示，其中三个互补决定区的氨基酸序列分别为：CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:5所示、CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:6所示、CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:7所示。
实施例3：黄曲霉毒素B1纳米抗体2018AFB-N11的制备
(1)获得能分泌黄曲霉毒素B1纳米抗体2018AFB-N11的ER2738菌液，使用Qiagen的DNA小量提取试剂盒提取质粒，转化到Top10F’感受态细胞中，并涂布到LB-氨苄平板上；
(2)挑取含有黄曲霉毒素B1纳米抗体2018AFB-N11质粒的Top10F’菌落于100mL SB氨苄液体培养基中，250rpm，37℃培养至OD600＝0.5-0.8，加入100μL 1.0M IPTG溶液诱导过夜。
(3)4℃，10000rpm离心15min，无菌操作台中小心去除上清，菌体沉淀采用细菌蛋白抽提试剂盒(Clontech Technology)进行周质蛋白提取，得到蛋白粗提液。将蛋白粗提液用平衡缓冲液(50mM磷酸盐，300mM氯化钠，20mM咪唑；pH 7.4)透析过夜。
(4)采用His60镍柱(Clontech Technology)纯化抗体：首先用10倍柱体积的平衡缓冲液冲洗镍柱，将步骤(3)中透析后的上清蛋白进样His60镍柱(Clontech Technology)进行抗体纯化，用10倍柱体积淋洗缓冲液(50mM磷酸盐，300mM氯化钠，40mM咪唑；pH 7.4)洗涤柱子，最后用10倍柱体积的洗脱缓冲液(50mM磷酸盐，300mM氯化钠，300mM咪唑；pH 7.4)洗脱抗体2018AFB-N11，收集洗脱液，装入透析袋，用0.01M，pH 7.4的磷酸盐缓冲液透析3-4次后浓缩，分装并于-20℃保存备用。
实施例4：黄曲霉毒素B1纳米抗体2018AFB-N11的应用
1、样品前处理：
称取不含黄曲霉毒素的花生、大米和玉米样品各三份，分别加入AFB1标准溶液10μg/kg、50μg/kg、100μg/kg，用15mL 70％的甲醇-PBS溶液涡旋震荡30min，将各样品提取物离心，6000g、15min，上清用双层滤纸过滤，滤液用0.45μm有机相滤膜过滤，滤液用PBS稀释后备用。
2、间接竞争酶联免疫分析：
用包被缓冲液(0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH 9.6)配制1.0μg/mL AFB1-BSA溶液，加入ELISA微孔板中，100μL/孔，4℃过夜。次日，PBST洗板三次后，用200μL溶于PBS的1.5％OVA封闭微孔，37℃恒温箱反应1h。PBST洗板三次，每孔加入50μL黄曲霉毒素B1纳米抗体2018AFB-N11(0.1mg/mL)和50μL AFB1标准溶液或待测样品。37℃反应1h后，PBST洗板三次，每孔加入100μL，用PBS按1:5000稀释的抗HA tag酶标二抗，37℃反应1h。PBST洗板6次后，每孔加入100μL新鲜配制的TMB底物溶液，37℃保温15min；再加入50μL 2mol/L H2SO4终止反应，立即用酶标仪在450nm下测定吸光值。根据样品测定的吸光值计算样品中AFB1的含量，测得花生的添加回收率在83.6％-105.4％之间、大米的添加回收率在90.5％-98.0％之间、玉米样品的添加回收率在89.6％-97.7％之间，具有较好的重复性和准确性。
综上，黄曲霉毒素B1纳米抗体2018AFB-N11能有效识别黄曲霉毒素B1，可应用于黄曲霉毒素B1的ELISA检测等，对农产品安全领域黄曲霉毒素B1监控有重要意义。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 武汉中科兴达技术有限公司
<120> 一种具有高特异性识别黄曲霉毒素B1的纳米抗体2018AFB-N11及其应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> PRT
<213> 羊驼(Vicugna vicugna)
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser
20 25
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 羊驼(Vicugna vicugna)
<400> 2
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala
1 5 10 15
Ala
<210> 3
<211> 38
<212> PRT
<213> 羊驼(Vicugna vicugna)
<400> 3
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Leu Cys
35
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 羊驼(Vicugna vicugna)
<400> 4
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> 羊驼(Vicugna vicugna)
<400> 5
Gly Arg Thr Phe Arg Ser Asn Ala
1 5
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 羊驼(Vicugna vicugna)
<400> 6
Ile Arg Trp Ser Gly Gly Ser Thr
1 5
<210> 7
<211> 15
<212> PRT
<213> 羊驼(Vicugna vicugna)
<400> 7
Ala Ala Gly Val Trp Arg Ser Ser Gly Trp Asp Thr Pro Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 8
<211> 122
<212> PRT
<213> 羊驼(Vicugna vicugna)
<400> 8
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Phe Arg Ser Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Arg Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Leu Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Val Trp Arg Ser Ser Gly Trp Asp Thr Pro Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 9
<211> 366
<212> DNA
<213> 羊驼(Vicugna vicugna)
<400> 9
caggtgcagc tcgtggagtc tgggggaggg ttggtgcagg ctgggggctc tctgagactc 60
tcctgtgtag cctctggacg caccttcaga agtaatgcca tgggctggtt ccgccaggct 120
ccagggaagg agcgtgagtt tgtagcagct attaggtgga gtggtggtag cacatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacggtgtat 240
ctccaaatga acagcctgaa acccgaggac acggccgttt atttgtgtgc agcaggtgtt 300
tggagatcgt cgggttggga taccccggac tactggggcc aggggaccca ggtcaccgtc 360
tcctca 366
Claims (8)
1.一种具有高特异性识别黄曲霉毒素B1的纳米抗体2018AFB-N11，所述纳米抗体2018AFB-N11包括四个框架区FR和三个互补决定区CDR，其特征在于，所述四个框架区FR的氨基酸序列分别为：FR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示、FR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示、FR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示、FR4的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:4所示；所述三个互补决定区CDR的氨基酸序列分别为：CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:5所示、CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:6所示、CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:7所示。
2.如权利要求1所述的一种具有高特异性识别黄曲霉毒素B1的纳米抗体2018AFB-N11，其特征在于，所述纳米抗体2018AFB-N11的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:8所示。
3.如权利要求1所述的一种具有高特异性识别黄曲霉毒素B1的纳米抗体2018AFB-N11，其特征在于，所述纳米抗体2018AFB-N11包括一条如序列表SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的驼源单域重链抗体VHH链。
4.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求2或3中的氨基酸序列。
5.如权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子具有如序列表SEQ ID NO:9所示的核酸序列。
6.权利要求1～3任一项所述的一种具有高特异性识别黄曲霉毒素B1的纳米抗体2018AFB-N11在检测黄曲霉毒素B1方面的应用。
7.权利要求1～3任一项所述的一种具有高特异性识别黄曲霉毒素B1的纳米抗体2018AFB-N11在黄曲霉毒素B1富集以及纯化中的应用。
8.权利要求1～3任一项所述的一种具有高特异性识别黄曲霉毒素B1的纳米抗体2018AFB-N11在通过随机或定点突变技术进行改造所获得能与黄曲霉毒素B1特异性结合的抗体中的应用。
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