CN104650227B

CN104650227B - 一种针对vsg的伊氏锥虫纳米抗体及其编码序列与应用

Info

Publication number: CN104650227B
Application number: CN201410795750.2A
Authority: CN
Inventors: 陈睿; 马格斯斯蒂芬; 陆绍红; 童群波; 孔庆明; 郑斌; 楼涤; 丁建祖
Original assignee: Zhejiang Academy of Medical Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Medical Sciences
Priority date: 2014-12-22
Filing date: 2014-12-22
Publication date: 2018-03-13
Anticipated expiration: 2034-12-22
Also published as: CN104650227A

Abstract

本发明公开了针对于伊氏锥虫（Trypanosoma evansi）变异表面糖蛋白（VSG）表位的纳米抗体，同时还公开了编码该纳米抗体的基因序列以及表达该纳米抗体的宿主细胞。通过本发明所公布的纳米抗体基因序列及宿主细胞，该纳米抗体能够在大肠杆菌内高效表达，应用于锥虫检测试剂的研发。

Description

一种针对VSG的伊氏锥虫纳米抗体及其编码序列与应用

技术领域

本发明涉及生物技术或生物医学领域，涉及一种针对于伊氏锥虫变异表面糖蛋白（variant surface glucoprotein, VSG）的纳米抗体，其编码序列及应用。

背景技术

伊氏锥虫(Trypanosoma evansi)病是由伊氏锥虫引起的一种血液原虫病，在世界范围内广泛分布，我国许多地区都有分布。伊氏锥虫主要寄生于马、驴、骡、水牛、黄牛、奶牛、绵羊等家畜，一些野生动物如虎、鹿和骆驼也常见感染。伊氏锥虫病能直接引起动物的急性死亡或隐性感染，造成贫血，死胎、流产，泌乳减少等，给我国畜牧业造成极大的损失。另外，国外还有感染人的报道，因此伊氏锥虫病也是一种人畜共患寄生虫病。该病的控制有赖于有效的检测诊断方法。

目前伊氏锥虫病的检测和诊断方法主要有:

(1)病原学方法，如镜检法；

(2)分子生物学检测方法，如聚合酶链反应(PCR)法、环介导等温扩增

（lamp）法。

(3)免疫学检测方法，如补体结合试验、间接血凝试验、胶乳凝集试验、酶联免疫吸附测定法、间接荧光抗体试验等等。目前应用的最多的仍然是免疫学检测方法，而免疫学方法检测的关键就是筛选出活性高的特异性抗体。

纳米抗体技术，是在传统抗体的基础上，运用分子生物学技术研发得到，是目前已知最小的可结合抗原的抗体分子。最初有比利时科学家Hamers.R在骆驼血液中发现，普通的抗体蛋白由两条重链和两条轻链组成，而从骆驼血液中发现的新型抗体只有两条重链，没有轻链，这些新型抗体能像正常抗体一样于抗原紧密结合，但不像单链抗体那样相互粘连聚集成块。以其为基础构建的纳米抗体不仅分子量为普通抗体的1/10，而且化学性质也更加灵活，稳定性好，可溶性高，表达容易且容易获得，并能够偶联其他分子，因此应用纳米抗体技术研发锥虫检测试剂具有广阔的应用前景。本发明正是利用该技术，利用筛选得到的伊氏锥虫变异表面糖蛋白抗原特异的纳米抗体，用于检测锥虫感染。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种针对伊氏锥虫变异表面糖蛋白（VSG）的纳米抗体，同时提供该纳米抗体的编码序列及该纳米抗体在制备检测的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种针对VSG的纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区CDR，所述框架区FR包括FR1～FR4的氨基酸序列：其中，FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1 所示，FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：3 所示的，FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：5 所示，FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO：7 所示；所述互补决定区CDR包括CDR1～CDR3的氨基酸序列：CDR1的氨基酸序列SEQ ID NO：2 所示，CDR2的氨基酸序列SEQID NO：4 所示，CDR3的氨基酸序列SEQ ID NO：6 所示。

进一步的，所述的VSG纳米抗体的VHH链，它具有SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。

一种VSG纳米抗体，它针对VSG表位的纳米抗体，包括两条具有SEQ ID NO：9所示氨基酸序列的VHH链。

一种DNA分子，它编码选自下组的蛋白质：上述的针对VSG纳米抗体的VHH链，或上述的VSG纳米抗体。

一种表达载体，它含有SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。

一种宿主细胞，它可以表达VSG纳米抗体。

一种VSG纳米抗体在制备VSG检测试剂方面的应用。

有益效果：与现有技术相比，本发明的优点如下：本发明首先制备及纯化伊氏锥虫变异表面糖蛋白，将其免疫骆驼，制备VSG特异的纳米抗体库，然后将纯化后的VSG偶联在酶标板上，利用噬菌体展示技术筛选高表达的VSG特异的纳米抗体，并将其转入大肠杆菌TG1，建立能在大肠杆菌TG1中高效表达的纳米抗体株。

附图说明

图1 是VSG纳米抗体的DNA电泳图，M 分子量marker，1阴性对照，2-19 PCR产物，条带约600bp。

图2是VSG纳米抗体经镍柱亲和层析纯化后再经AKTAexpress纯化后的SDS-PAGE电泳图和Western blot印迹图；其中M为分子量标记，单位kD，1-5表示 VSG纳米抗体；

图3是应用VSG纳米抗体识别伊氏锥虫VSG的酶联免疫吸附试验（ELISA）结果。图中“▲ ”曲线为VSG纳米抗体，“ ■”曲线为阴性对照抗体SEA。

具体实施方式

以下实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。

本发明应用针对VSG纳米抗体偶联在酶标板上，展示蛋白质的正确空间构象，以此形式的抗原筛选免疫纳米抗体库（骆驼重链抗体噬菌体展示库），而获得了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1

本实施例构建伊氏锥虫VSG特异纳米抗体库，步骤如下：

（1）首先纯化伊氏锥虫VSG抗原，然后将1mg VSG抗原与弗氏佐剂等体积混合，免疫一只羊驼（Alpa-Vet，www.alpa-vet.be），每周一次，共免疫7次，刺激B细胞表达抗原特异性的纳米抗体；

（2）7次免疫结束后，提取100ml羊驼外周血淋巴细胞并提取总RNA；

（3）合成cDNA并利用套式PCR扩增VHH；

（4）利用限制性内切酶pstI及NotI酶切20ug 噬菌体展示载体及10ulVHH并连接两个片段；

（5）将连接产物转化至电转感受态细胞TG1中，构建VSG纳米抗体文库并测定库容，库容大小为5.1×10⁹。

实施例2

本实施例筛选VSG特异的纳米抗体，步骤如下：

（1）将溶解在100mM NaHCO₃、pH8.2的20ug VSG包被在NUNC酶标板上，4℃放置过夜；

（2）第二天加入100ul 3%milk，室温封闭2h；

（3）2h后，加入100ul 10¹¹tfu含有VSG纳米抗体文库的辅助噬菌体，室温作用1h；

（4）第一轮淘选用0.05%PBS+Tween-20洗10遍/第二轮 20-25遍/第三轮20遍，除掉非特异性结合的噬菌体；

（5）用100mM TEA(triethylamine)将与VSG特异结合的噬菌体解离下，并感染处于对数生长期的大肠杆菌TG1，37℃培养1h，产生并纯化噬菌体用于下一轮的筛选，相同筛选过程重复3-4轮，逐步得到富集。

实施例3

本实施例用噬菌体的酶联免疫方法（ELISA）筛选特异性单个阳性克隆，步骤如下：

（1）从上述3-4轮筛选后含有噬菌体的细胞培养皿中，挑选96个单个菌落并接种于含有100ug/ml的氨苄青霉素的TB培养基中，生长到对数期后，加终浓度1mM的IPTG，28℃培养过夜。

（2）利用渗透法获得粗提抗体，并将抗体转移到经抗原包被的ELISA板中，室温下放置1小时；

（3）用PBST洗去未结合的抗体，加入mouse anti-His antibody(鼠抗HIS抗体，R&Dsystem)，室温下放置1小时；

（4）用PBST洗去未结合的抗体，加入anti-mouse alkaline phosphataseconjugate(羊抗鼠AP标记抗体，sigma)。

（5）用PBST洗去未结合的抗体，加入碱性磷酸酶显色液，在酶标仪上405nm波长读取吸收值。

（6）当样品孔OD值大于对照孔OD值2.1倍以上时，判断为阳性克隆孔。

（7）将阳性克隆孔的菌转摇在含有100ug/ml的氨苄青霉素的TB培养基，提取质粒进行测序。

根据测序结果，应用Vector NTI^® 11.5( Invitrogen, USA)和 IMGT^®软件分析各个克隆株，把CDR1、CDR2和CDR3序列相同的株视为同一克隆株，而序列不同的视为不同克隆株。所筛选建立的特异性VSG纳米抗体的VHH链的核苷酸序列如SEQ ID NO .8所示，氨基酸序列如SEQ ID NO .9所示。VHH链的氨基酸序列，由框架区FR和互补决定区CDR组成，所述框架区FR包括SEQ ID NO：1 所示的FR1，SEQ ID NO：3 所示的FR2，SEQ ID NO：5 所示的FR3，SEQ ID NO：7 所示的FR4；所述互补决定区CDR包括SEQ ID NO：2 所示的CDR1，SEQ ID NO：4所示的CDR2，SEQ ID NO：6 所示的CDR3。FR1～FR4

以及CDR1～CDR3的序列如下所示：

FR1：MAQVQLQESGGGLVQAGDSLRLACAASG

CDR1：RTFGNYAMGWFR

FR2：QAPGKEREFVARISTSG

CDR2：GTIYYAESVR

FR3：GRATISRDNAKNTVNLQMNSLKPEDTAVYY

CDR3：CAAGNRARYSGT

FR4：YYSNPGNYDY WGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGS

基于VHH链的核苷酸序列和氨基酸序列，还可以得到以下产物：

一种DNA分子，它编码选自下组的蛋白质：上述的针对VSG的纳米抗体的VHH链，或上述的VSG纳米抗体。

一种表达载体，它含有SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。

一种宿主细胞，它可以表达VSG纳米抗体。

实施例4

应用筛选得到的特异性VSG纳米抗体进行酶联免疫检测，步骤如下：

为检测所筛选得到的特异性VSG纳米抗体是否能识别VSG抗原，将VSG抗原(2 μ g/mL)加入96孔酶标板，100 μ L/孔，4°C过夜；用PBST洗板3次，后用3%milk封闭酶标板，37°C作用lh，用PBST洗板3次，加入不同稀释浓度的VSG纳米抗体，37°C作用2h；PBST洗板3次后，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的鼠抗His单克隆抗体 (AbD Serotec, UK)作用1h；PBST洗板3次后，加入TMB底物液后检测，并用构建的血吸虫特异性SEA纳米抗体作为阴性对照。

如图3显示，VSG纳米抗体可以特异性识别VSG抗原，而阴性对照血吸虫SEA纳米抗体则与VSG抗原无反应。

应用该VSG纳米抗体可进一步开发检测VSG抗原的试剂。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，在不脱离本发明原理的前提下，还可对本发明做出改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江省医学科学院

<120> 一种针对VSG的伊氏锥虫纳米抗体及其编码序列与应用

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala

1 5 10 15

Gly Asp Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Ala Ser Gly

20 25

<210> 2

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

Arg Thr Phe Gly Asn Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg

1 5 10

<210> 3

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 3

Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Arg Ile Ser Thr Ser

1 5 10 15

Gly

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 4

Gly Thr Ile Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Arg

1 5 10

<210> 5

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 5

Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asn Leu

1 5 10 15

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

20 25 30

<210> 6

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 6

Cys Ala Ala Gly Asn Arg Ala Arg Tyr Ser Gly Thr

1 5 10

<210> 7

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 7

Tyr Tyr Ser Asn Pro Gly Asn Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln

1 5 10 15

Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr

20 25 30

Gly Ser

<210> 8

<211> 429

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

atggcgcaag tacaattgca agaatccggc ggtggcctcg tccaagctgg tgattcgttg 60

aggttagcct gtgcggcctc tggcagaact tttggcaatt atgcaatggg ctggtttaga 120

caagctccgg gcaaagaacg cgaatttgta gccagaataa gtacgagtgg cggcacgata 180

tattatgcgg aaagcgtcag gggcagggct acgataagtc gcgataacgc gaaaaatacg 240

gtcaacctcc aaatgaatag tttgaaaccg gaagatacag ccgtttatta ctgtgccgcg 300

ggtaatcgcg ctcgctatag tggcacttat tacagcaatc ccggtaatta tgattactgg 360

gggcaaggca ctcaagttac tgtcagtagt gcggccgcat atccgtatga cgtcccggat 420

tatggcagc 429

<210> 9

<211> 143

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 9

Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala

1 5 10 15

Gly Asp Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Gly

20 25 30

Asn Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu

35 40 45

Phe Val Ala Arg Ile Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ile Tyr Tyr Ala Glu

50 55 60

Ser Val Arg Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr

65 70 75 80

Val Asn Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Ala Gly Asn Arg Ala Arg Tyr Ser Gly Thr Tyr Tyr Ser

100 105 110

Asn Pro Gly Asn Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val

115 120 125

Ser Ser Ala Ala Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Gly Ser

130 135 140

Claims

1.一种针对VSG的纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区CDR，其特征在于，所述框架区FR包括FR1～FR4的氨基酸序列：其中，FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1 所示，FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：3 所示的，FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：5 所示，FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO：7 所示；所述互补决定区CDR包括CDR1～CDR3的氨基酸序列：CDR1的氨基酸序列SEQ ID NO：2 所示，CDR2的氨基酸序列SEQ ID NO：4 所示，CDR3的氨基酸序列SEQID NO：6 所示。

2.根据权利要求1所述的VHH链，其特征在于，它具有SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。

3.一种VSG纳米抗体，其特征在于，它针对VSG表位的纳米抗体，包括两条具有SEQ IDNO：9所示氨基酸序列的VHH链。

4.一种DNA分子，其特征在于，它编码选自下组的蛋白质：权利要求1或2所述的VSG纳米抗体的VHH链，或权利要求3所述的VSG纳米抗体。

5.一种表达载体，其特征在于，它含有SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。

6.一种宿主细胞，其特征在于，它能表达权利要求3所述的VSG纳米抗体。

7.一种权利要求3所述的VSG纳米抗体在制备VSG检测试剂方面的应用。