JP6614523B2 - インフルエンザウイルスのｒｎａ依存性ｒｎａポリメラーゼのｐｂ２サブユニットに対するモノクローナル抗体 - Google Patents
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Description
本発明は、インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（以下、「iRdRP」と呼ぶことがある）のＰＢ２サブユニットに対するモノクローナル抗体に関する。
新型インフルエンザを始め、鳥インフルエンザH5N1、H7N9 は世界的な大流行が懸念され、日本を含め、世界的な規模による具体的な対策が必要とされている。我が国も新型インフルエンザウイルスの対策を昨年度から本格的に打ち出しており、新型インフルエンザに変異する可能性が高い鳥インフルエンザ（H5N1、H7N9）をもとにすでに製剤化されているプレ・パンデミックワクチンや、抗ウイルス剤であるタミフルやリレンザなどの備蓄をしている。厚労省の報告によると日本でパンデミックが起きた場合、感染者3200万人、死者最大64万人と予想されている。このような観点から、変異をほとんど起こさないiRdRPが全世界の製薬会社をはじめ各研究機関から重要な創薬ターゲットとして注目されてきた。
iRdRPに対するモノクローナル抗体で現在市販されているものは非常に少ない。iRdRPに対するモノクローナル抗体であって、インフルエンザウイルスを中和しない、すなわち、インフルエンザウイルスの増殖を阻害しないモノクローナル抗体がもしあれば、iRdRPの発現確認に使用できるだけでなく、抗体を結合させた後のインフルエンザウイルスをそのまま培養して増殖させることが可能であり、また、iRdRPと抗インフルエンザウイルス薬候補との複合体も検出可能となるので、インフルエンザウイルスの分子生物学的研究や抗インフルエンザウイルス剤の開発のためのツールとして有用であるがそのようなモノクローナル抗体は知られていない。
Fujimoto Y et al., Vet J. 2013 Nov;198(2):487-93. doi: 10.1016/j.tvjl.2013.09.019. Epub 2013 Sep 21
MacDonald LA et al., Virology. 2012 Apr 25;426(1):51-9. doi: 10.1016/j.virol.2012.01.015. Epub 2012Feb 8.
Hatta M et al., Arch Virol. 2000;145(9):1947-61.
Ochoa M et al.,Virus Res. 1995 Aug;37(3):305-15.
Barcena J et al., J Virol. 1994 Nov;68(11):6900-9.
したがって、本発明の目的は、iRdRPに対するモノクローナル抗体であって、インフルエンザウイルスを中和しない新規なモノクローナル抗体を提供することである。
本願発明者らは、鋭意研究の結果、iRdRPのＰＢ２サブユニットに対するモノクローナル抗体であって、インフルエンザウイルスを中和しない新規なモノクローナル抗体を作出することに成功し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＢ２サブユニットと抗原抗体反応し、該インフルエンザウイルスを中和しないモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片であって、Ｈ鎖の可変領域中のＣＤＲ１のアミノ酸配列がGYTFTDYW、ＣＤＲ２のアミノ酸配列がIDTSDSYT、ＣＤＲ３のアミノ酸配列がARWYDEIDYであり、Ｌ鎖の可変領域中のＣＤＲ１のアミノ酸配列がKSVSTSGYSY、ＣＤＲ２のアミノ酸配列がLVS、ＣＤＲ３のアミノ酸配列がQHIRELTRSである、モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を提供する。
本発明により、iRdRPに対するモノクローナル抗体であって、インフルエンザウイルスを中和しないモノクローナル抗体が初めて提供された。本発明のモノクローナル抗体は、iRdRPの発現確認に使用できるだけでなく、インフルエンザウイルスの増殖を阻害しないので、インフルエンザウイルスの分子生物学的研究や、抗インフルエンザウイルス剤の開発のためのツールとして有用である。
本発明のモノクローナル抗体は、下記実施例に詳述するように、遺伝子工学的にiRdRPのＰＢ２サブユニット（以下、単に「ＰＢ２」）のＣ末端側の部分領域を作製し、これをマウスに免疫して常法によりハイブリドーマを作製し、得られたハイブリドーマのうち、ＰＢ２に対して親和性を持つがインフルエンザウイルスの増殖を阻害しないモノクローナル抗体を産生するものをスクリーニングし、得られたハイブリドーマを培養して上清からモノクローナル抗体を回収することにより得られた。
下記実施例に具体的に記載するとおり、下記実施例で得られたモノクローナル抗体のＨ鎖及びＬ鎖の可変領域をコードする遺伝子の塩基配列及びそれがコードするアミノ酸配列を決定した。配列番号１にＨ鎖の可変領域をコードする遺伝子の塩基配列、配列番号２にこの遺伝子がコードするアミノ酸配列、配列番号３にＬ鎖の可変領域をコードする遺伝子の塩基配列、配列番号４にこの遺伝子がコードするアミノ酸配列を示す。
配列番号２に示されるアミノ酸配列中、Ｎ末端から１８番目（以下、「18aaのように記載」）のグリシンから25aaのトリプトファンまでの領域、すなわち、GYTFTDYWがＨ鎖の可変領域中のＣＤＲ１(相補性決定領域１（complementarity-determining region 1）)配列、43aaのイソロイシンから50aaのスレオニンまでの領域、すなわち、IDTSDSYTがＨ鎖の可変領域中のＣＤＲ２配列、89aaのアラニンから97aaのチロシンまでの領域、すなわち、ARWYDEIDYがＨ鎖の可変領域中のＣＤＲ３配列である。
配列番号４に示されるアミノ酸配列中、19aaのリシンから28aaのチロシンまでの領域、すなわち、KSVSTSGYSYがＬ鎖の可変領域中のＣＤＲ１配列、46aaのロイシンから48aaのセリンまでの領域、すなわち、LVSがＬ鎖の可変領域中のＣＤＲ２配列、85aaのグルタミンから93aaのセリンまでの領域、すなわち、QHIRELTRSがＬ鎖の可変領域中のＣＤＲ３配列である。
周知の通り、抗体の対応エピトープや親和性は、相補性決定領域（ＣＤＲ）により決定される。したがって、本発明のモノクローナル抗体と同様な性質を持つモノクローナル抗体、すなわち、ＰＢ２と抗原抗体反応し、インフルエンザウイルスの増殖を阻害しないモノクローナル抗体は、このような性質を持たないモノクローナル抗体の遺伝子のＨ鎖及びＬ鎖の可変領域をコードする領域中の各ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３領域を、上記した各ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３領域に変換することにより作出することが可能である。なお、各ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３領域のみを個別に上記した各ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３領域に変換してもよいが、これらの各領域を含む領域を変換してもよく、例えば、Ｈ鎖の可変領域全体を配列番号２で示す塩基配列を持つ遺伝子に変換し、Ｌ鎖の可変領域全体を配列番号４で示す塩基配列を持つ遺伝子に変換してもよく、この場合には組み換え操作がより簡便になる。このような組み換え遺伝子を持つハイブリドーマを常法により培養し、培養上清や腹水等から本発明のモノクローナル抗体を常法により回収することにより本発明のモノクローナル抗体を生産することができる。通常、IgH（重鎖）のＣＤＲ１〜ＣＤＲ３領域を含む可変領域（CH1）をたとえば、ヒトのIgG1発現ベクターであるpFUSE-CHIg-hG1（商品名、InvivoGen社）に乗せ換え、また、IgL（軽鎖）のＣＤＲ１〜ＣＤＲ３領域を含む可変領域をたとえば、ヒトのIgL-kL発現ベクターであるpFUSE2-CLIg-hk（商品名、InvivoGen社）に乗せ換える。この２つの遺伝子をCHO細胞などで発現させ、抗体を回収することができる。これはキメラ化と呼ばれる常法である。なお、可変領域は、配列番号１及び配列番号３に示すように塩基配列が明らかになっているので、遺伝子工学的手法等の常法により容易に調製することができる。もちろん、本発明のモノクローナル抗体は、後述する実施例と同様な方法によっても作出可能である。
本発明は、上記したモノクローナル抗体のみならず、その抗原結合性断片をも提供する。抗原結合性断片は、例えば、Fab断片やF(ab')2断片等の、この抗体の結合性を維持した断片であり、モノクローナル抗体から周知の方法により得ることができる。一本鎖抗体も抗原結合性断片に包含されるものと解釈する。また、本発明のモノクローナル抗体の定常領域のみを他の定常領域に変換した、例えば、ヒト化抗体等も本発明のモノクローナル抗体の抗原結合性断片を含むので、本発明の範囲内に含まれる。
本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、ＰＢ２と抗原抗体反応するので、周知の種々の免疫測定法に供してＰＢ２の検出を行うことができる。免疫測定法自体は周知であり、サンドイッチ法、凝集法、競合法、ウェスタンブロット法、免疫沈降法、免疫染色法等種々の周知の方法に用いることができる。また、抗体の標識方法も周知であり、本発明のモノクローナル抗体も、常法により、蛍光標識、酵素標識、化学発光標識、ビオチン標識、放射標識等の標識を結合することが可能である。
以下、実施例に基づき本発明を具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
１．PB2タンパク質の発現系構築
インフルエンザRNAポリメラーゼのPB2の遺伝子が、pET14b（Addgeneより入手可能）に組み込まれたcDNA (influenza/Puerto Rico/8/1934, H1N1)を鋳型として、PCR法により増幅した。PB2の530-759のタンパク質を発現する遺伝子領域を制限酵素BamHI及びNotIで処理し、市販のpET28aベクター（Novagen社製）とライゲーションを行った。市販のpET28aベクターのXbaI及びBamHIサイトの間にSD(Shine Dargarno)配列、開始ATG、ヒスチジンタグとTEV(tobacco etch virus)プロテアーゼ切断サイトのDNA配列を付加し、発現されたPB2タンパク質のN末端側にヒスチジンタグ及びTEVプロテアーゼ切断サイトが付加されるように、発現系プラスミドを構築した。
インフルエンザRNAポリメラーゼのPB2の遺伝子が、pET14b（Addgeneより入手可能）に組み込まれたcDNA (influenza/Puerto Rico/8/1934, H1N1)を鋳型として、PCR法により増幅した。PB2の530-759のタンパク質を発現する遺伝子領域を制限酵素BamHI及びNotIで処理し、市販のpET28aベクター（Novagen社製）とライゲーションを行った。市販のpET28aベクターのXbaI及びBamHIサイトの間にSD(Shine Dargarno)配列、開始ATG、ヒスチジンタグとTEV(tobacco etch virus)プロテアーゼ切断サイトのDNA配列を付加し、発現されたPB2タンパク質のN末端側にヒスチジンタグ及びTEVプロテアーゼ切断サイトが付加されるように、発現系プラスミドを構築した。
２．PB2タンパク質の発現
作製したプラスミドDNA pET28a-PB2(530-759)を用いて、タンパク質発現用大腸菌BL21(DE3)codonplus RILP（商品名、Merck社製）を形質転換し、抗生物質カナマイシン40μｇ/mlとクロラムフェニコール35μｇ/ml含有のLBプレート培地上にて、37℃で16時間培養した。培養した大腸菌のコロニーを、カナマイシン50 μｇ/mlとクロラムフェニコール35 μｇ/ml含有のLB液体培地1Lで振盪培養した。37℃で培養を開始し、OD600の値が0.6になった段階で氷上にて1時間冷却した。冷却後、終濃度0.5 mM IPTG(イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド)を添加し、15℃で16時間振盪培養しタンパク質を発現させた。培養液を5,000rpmで15分間遠心処理し、培養上清と菌体を分離させ、菌体のみを回収した。
作製したプラスミドDNA pET28a-PB2(530-759)を用いて、タンパク質発現用大腸菌BL21(DE3)codonplus RILP（商品名、Merck社製）を形質転換し、抗生物質カナマイシン40μｇ/mlとクロラムフェニコール35μｇ/ml含有のLBプレート培地上にて、37℃で16時間培養した。培養した大腸菌のコロニーを、カナマイシン50 μｇ/mlとクロラムフェニコール35 μｇ/ml含有のLB液体培地1Lで振盪培養した。37℃で培養を開始し、OD600の値が0.6になった段階で氷上にて1時間冷却した。冷却後、終濃度0.5 mM IPTG(イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド)を添加し、15℃で16時間振盪培養しタンパク質を発現させた。培養液を5,000rpmで15分間遠心処理し、培養上清と菌体を分離させ、菌体のみを回収した。
３．PB2タンパク質の精製
大量培養した菌体を、菌体破砕用バッファー(20mM Tris-HCl(pH8.0), 500mM NaCl, 500mM 尿素、25mMイミダゾール、10mM 2-メルカプトエタノール)で懸濁し、超音波破砕装置(商品名Vibra cell)を用いて破砕した。破砕条件を振幅(Amplitude): 80、パルス: 1秒、時間: 10分に設定し、これを2サイクル行った。破砕液を19,000rpm、30分の条件で遠心分離し、上清を回収した。
大量培養した菌体を、菌体破砕用バッファー(20mM Tris-HCl(pH8.0), 500mM NaCl, 500mM 尿素、25mMイミダゾール、10mM 2-メルカプトエタノール)で懸濁し、超音波破砕装置(商品名Vibra cell)を用いて破砕した。破砕条件を振幅(Amplitude): 80、パルス: 1秒、時間: 10分に設定し、これを2サイクル行った。破砕液を19,000rpm、30分の条件で遠心分離し、上清を回収した。
上清を0.45 μｍフィルターで濾過した後、Ni-NTA Aバッファー(20 mM Tris-HCl(pH8.0), 500mM NaCl, 500 mM尿素、25 mM イミダゾール、10 mM 2-メルカプトエタノール)で平衡化したNi-NTA superflowレジン(QIAGEN)と混合し、タンパク質をレジンに吸着させた。レジンとタンパク質の混合液を30 分、4℃で転倒混和させた後、レジンをNi-NTA Aバッファー400 mlで洗浄した。洗浄後、Ni-NTA Bバッファー(20 mM Tris-HCl(pH8.0), 500mM NaCl, 500 mM 尿素, 500 mMイミダゾール、10 mM 2-メルカプトエタノール)を60 ml加えレジンからタンパク質を溶出させた。PB2タンパク質からヒスチジンタグを除去するために、Ni-NTAレジンからの溶出液60mlに対し、21μｍのTEVプロテアーゼ3mlを加え、20℃で12時間反応させた。反応後、Ni-NTA Aバッファー2Lにタンパク質を12時間透析した。再度、Ni-NTA Aバッファーで平衡化したNi-NTAレジンと透析したサンプルを混合させ、レジンからの素通り画分を回収することで、タンパク質を精製した。素通り画分をQカラム Aバッファー(20 mM Tris-HCl(pH8.0), 300 mM NaCl, 1 mM DTT)に12時間透析した。透析したタンパク質溶液を、QカラムAバッファーで平衡化したHi Trap Q-column(GEヘルスケア)で精製した。精製はAKTA purifier(GEヘルスケア)を用いて行い、Qカラムからの素通り画分を回収した。精製したタンパク質溶液を、最終バッファー(20 mM Tris-HCl(pH8.0), 100 mM NaCl, 1 mM DTT) 2Lに対し12時間透析し、遠心濃縮チューブcentricon YM-10 (MILLIPORE)を用いて濃縮した。
４．ハイブリドーマPB2 3-1.6の調製
上記で作製精製したインフルエンザウイルス H1N1 由来の RNA 依存性 RNA ポリメラーゼPB2 サブユニット（530-759）タンパク質をTiterMax Gold (CytRx社)でエマルジョン化し、BALB/c マウス（８週齢、メス）に皮下注射し、免疫を開始した。２週間間隔で合計4回の免疫をした後、採血し、取得した血清を用いてイムノブロット（PB2 サブユニット（530-759）に myc3 タグを融合させ293T 細胞に発現させた細胞溶解液をSDS-PAGEで泳動、コントロールには遺伝子を導入していない293T 細胞の細胞溶解液を泳動）により抗体価を確認した。
上記で作製精製したインフルエンザウイルス H1N1 由来の RNA 依存性 RNA ポリメラーゼPB2 サブユニット（530-759）タンパク質をTiterMax Gold (CytRx社)でエマルジョン化し、BALB/c マウス（８週齢、メス）に皮下注射し、免疫を開始した。２週間間隔で合計4回の免疫をした後、採血し、取得した血清を用いてイムノブロット（PB2 サブユニット（530-759）に myc3 タグを融合させ293T 細胞に発現させた細胞溶解液をSDS-PAGEで泳動、コントロールには遺伝子を導入していない293T 細胞の細胞溶解液を泳動）により抗体価を確認した。
抗体価の上昇を確認した免疫済みのマウスから脾臓細胞を調製後、Galfreらによる方法（Galfre, G. and Milstein, C.: Preparation of monoclonal antibodies: strategies and procedures. Methods Enzymol., 73: 3-46, 1981）に準じて、ポリエチレングリコールを用いてマウスミエローマ細胞P3/NSI/1-Arg-1（ATCC TIB-18）と融合を行った。混合させる脾臓細胞／ミエローマ細胞比は、脾臓細胞：ミエローマ=10:1でおこなった。これを、前々日に96ウェル培養プレートに蒔き込んだフィーダー細胞（腹腔浸出細胞）に重層して、炭酸ガス培養器で培養（37℃、5%CO2）した。培養の翌日、20% FCS（fetal calf serum）およびHAT（ヒポキサンチン，アミノプテリン、チミジン）（ICN社）RPMI1640培地（ニッスイ社）を用いて細胞を培養し、選択を開始した。２週間後、HAT選択培地において増殖した細胞を含むウェルの培養上清を回収した後、作製精製したインフルエンザウイルス H1N1 由来の RNA 依存性 RNA ポリメラーゼPB2 サブユニット（530-759）タンパク質を用いたELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）法により、抗体生成を確認するとともに、抗体価を評価した。ELISA陽性の抗体を産生する融合細胞（ハイブリドーマ）をさらに限界希釈法により３回のクローニングをおこない、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得た。以下、このハイブリドーマを「ハイブリドーマPB2 3-1.6」といい、当該ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体を「PB2 3-1.6抗体」と称する。
５．モノクローナル抗体のサブタイプの決定
取得したモノクローナル抗体（PB2 3-1.6抗体）の抗体クラスを、IsoStrip マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（Roche社）を用いた酵素免疫測定法で評価したところ、IgG1κであることが確認された。
取得したモノクローナル抗体（PB2 3-1.6抗体）の抗体クラスを、IsoStrip マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（Roche社）を用いた酵素免疫測定法で評価したところ、IgG1κであることが確認された。
６．ウェスタンブロット法
得られたモノクローナル抗体（PB2 3-1.6抗体）をウェスタンブロット法に供した。具体的には、次のように行った。細胞溶解液を、SDS-ポリアクリルアミドゲルで電気泳動後、PVDF（フッ化ポリビニリデン）膜（Millipore社）にセミドライ法により転写した。タンパク質が転写された膜を5% 脱脂粉乳および0.1% Tween-20を含むPBSによるブロッキング後、それぞれの特異抗体液を一次抗体として転写膜に結合させ、0.1% Tween-20を含むPBSにより余分な一次抗体をよく洗い落とした。さらにHRP（horseradish peroxidase）標識二次抗体を転写膜に結合させ、0.1% Tween-20を含むPBSにより余分な二次抗体をよく洗い落とした。HRPの基質として、分解されると発光する蛍光試薬（Western Lightning Chemiluminescence試薬、パーキンエルマー社）を用いて、転写膜上の目的のタンパク質のバンドからの蛍光によりX線フィルム（富士フィルム社）に感光し、検出した。
得られたモノクローナル抗体（PB2 3-1.6抗体）をウェスタンブロット法に供した。具体的には、次のように行った。細胞溶解液を、SDS-ポリアクリルアミドゲルで電気泳動後、PVDF（フッ化ポリビニリデン）膜（Millipore社）にセミドライ法により転写した。タンパク質が転写された膜を5% 脱脂粉乳および0.1% Tween-20を含むPBSによるブロッキング後、それぞれの特異抗体液を一次抗体として転写膜に結合させ、0.1% Tween-20を含むPBSにより余分な一次抗体をよく洗い落とした。さらにHRP（horseradish peroxidase）標識二次抗体を転写膜に結合させ、0.1% Tween-20を含むPBSにより余分な二次抗体をよく洗い落とした。HRPの基質として、分解されると発光する蛍光試薬（Western Lightning Chemiluminescence試薬、パーキンエルマー社）を用いて、転写膜上の目的のタンパク質のバンドからの蛍光によりX線フィルム（富士フィルム社）に感光し、検出した。
結果を図１に示す（図１中、Ｍは分子量マーカー）。図１に示されるとおり、ウエスタンブロット法において、PB2 3-1.6 抗体は既存のmycタグ抗体（9E10）より強く細胞内で発現したPB2 サブユニット（530-759）タンパク質を認識した。つまり、PB2 3-1.6 抗体はウエスタンブロット法で使用できることが明らかとなった。
７． 免疫沈降法
得られたモノクローナル抗体（PB2 3-1.6抗体）を免疫沈降法に供した。具体的には、次のように行った。それぞれの特異的抗体をプロテインＡセファロースビーズ（GEヘルスケア・ジャパン社）に結合させ、余分な抗体をよく洗い落とした。特異的抗体を結合させたビーズをそれぞれの細胞溶解液に加え結合させ、ビーズに特異的に結合するタンパク質以外をよく洗い落とした。ビーズを2×SDS サンプル緩衝液に懸濁後、100℃, 5分間処理してサンプルとした。そのサンプルを、SDS-ポリアクリルアミドゲルで電気泳動後、PVDF（フッ化ポリビニリデン）膜（Millipore社）にセミドライ法により転写した。タンパク質が転写された膜を5% 脱脂粉乳および0.1% Tween-20（商品名）を含むPBSによるブロッキング後、それぞれの特異抗体液を一次抗体として転写膜に結合させ、0.1% Tween-20を含むPBSにより余分な一次抗体をよく洗い落とした。さらにHRP（horseradish peroxidase）標識二次抗体を転写膜に結合させ、0.1% Tween-20を含むPBSにより余分な二次抗体をよく洗い落とした。HRPの基質として、分解されると発光する蛍光試薬（Western Lightning Chemiluminescence試薬、パーキンエルマー社）を用いて、転写膜上の目的のタンパク質のバンドからの蛍光によりX線フィルム（富士フィルム社）に感光し、検出した。
得られたモノクローナル抗体（PB2 3-1.6抗体）を免疫沈降法に供した。具体的には、次のように行った。それぞれの特異的抗体をプロテインＡセファロースビーズ（GEヘルスケア・ジャパン社）に結合させ、余分な抗体をよく洗い落とした。特異的抗体を結合させたビーズをそれぞれの細胞溶解液に加え結合させ、ビーズに特異的に結合するタンパク質以外をよく洗い落とした。ビーズを2×SDS サンプル緩衝液に懸濁後、100℃, 5分間処理してサンプルとした。そのサンプルを、SDS-ポリアクリルアミドゲルで電気泳動後、PVDF（フッ化ポリビニリデン）膜（Millipore社）にセミドライ法により転写した。タンパク質が転写された膜を5% 脱脂粉乳および0.1% Tween-20（商品名）を含むPBSによるブロッキング後、それぞれの特異抗体液を一次抗体として転写膜に結合させ、0.1% Tween-20を含むPBSにより余分な一次抗体をよく洗い落とした。さらにHRP（horseradish peroxidase）標識二次抗体を転写膜に結合させ、0.1% Tween-20を含むPBSにより余分な二次抗体をよく洗い落とした。HRPの基質として、分解されると発光する蛍光試薬（Western Lightning Chemiluminescence試薬、パーキンエルマー社）を用いて、転写膜上の目的のタンパク質のバンドからの蛍光によりX線フィルム（富士フィルム社）に感光し、検出した。
結果を図２に示す（図２中、Ｍは分子量マーカー）。図２に示されるとおり、PB2 3-1.6 抗体は、細胞内で発現したPB2 サブユニット（530-759）タンパク質を、既存のmyc 抗体（9E10）と同等あるいはそれ以上に強く認識し免疫沈降可能であった。つまり、PB2 3-1.6 抗体はPB2 サブユニット（530-759）を認識し免疫沈降できるモノクローナル抗体であることが明らかとなった。
８． 結合実験
ハイブリドーマを移植したマウスの腹水から、免疫グロブリンG(IgG)の単離精製により得られたPB2 3-1.6モノクローナル抗体に、抗原タンパク質PB2を結合せて、複合体での合計分子量の量測定を行った。測定機器は、分析用超遠心機(AUC)を使用し、分子量測定した。
ハイブリドーマを移植したマウスの腹水から、免疫グロブリンG(IgG)の単離精製により得られたPB2 3-1.6モノクローナル抗体に、抗原タンパク質PB2を結合せて、複合体での合計分子量の量測定を行った。測定機器は、分析用超遠心機(AUC)を使用し、分子量測定した。
結果を図３に示す。図３に示されるように、PB2 3-1.6モノクローナル抗体と抗原タンパク質PB2が強く結合している事が明確になった。
９．インフルエンザウイルスの増殖阻害
PB2 3-1.6モノクローナル抗体がインフルエンザウイルスの増殖を阻害するか否かを試験した。これは次のようにして行った。ハイブリドーマを移植したマウスの腹水から免疫グロブリンG(IgG)として単離精製したPB2 3-1.6モノクローナル抗体をさらに、ImmunoPure Fab Preparation kit（Pierce 社）を用いて Fab 断片として精製した。そして、Alexa Fluor 488 Protein Labeling Kit（Molecular Probe社）を用いて、Fab 断片として精製したPB2 3-1.6モノクローナル抗体をAlexa Fluor 488で標識した。アイソタイプが同じコントロール抗体 G196 についても同様に行った。
PB2 3-1.6モノクローナル抗体がインフルエンザウイルスの増殖を阻害するか否かを試験した。これは次のようにして行った。ハイブリドーマを移植したマウスの腹水から免疫グロブリンG(IgG)として単離精製したPB2 3-1.6モノクローナル抗体をさらに、ImmunoPure Fab Preparation kit（Pierce 社）を用いて Fab 断片として精製した。そして、Alexa Fluor 488 Protein Labeling Kit（Molecular Probe社）を用いて、Fab 断片として精製したPB2 3-1.6モノクローナル抗体をAlexa Fluor 488で標識した。アイソタイプが同じコントロール抗体 G196 についても同様に行った。
ビーズ法（McNeil, PL. Methods Cell Biol., 29:153-173,1989）を用いて、Madin Darby Canine Kidney（MDCK）細胞株（JCRB 細胞バンクより購入。JCRB9029）にAlexa Fluor 488で標識したFab 断片を導入した。３０分後、インフルエンザウイルス A/Aichi/2/68(H3N2)を感染させた。３０分後に余剰のウイルスを洗い流し、７時間後にインフルエンザウイルス A/Aichi/2/68(H3N2)を認識するポリクローナル抗体（自家製）を用いて、細胞表面に出芽してきたウイルスを検出した。
その結果、アイソタイプが同じコントロール抗体 G196と同様に、PB2 3-1.6モノクローナル抗体は、インフルエンザウイルスの増殖を阻害しないことが明らかになった。
１０．モノクローナル抗体（PB2 3-1.6抗体）の遺伝子解析
取得したハイブリドーマ PB2 3-1.6 からRNAを抽出した後、oligo-dTプライマーを用いて、逆転写し、cDNAを作製した。かかるcDNAを鋳型として、下記に示すＨ鎖プライマーセット及びＬ鎖プライマーセットを用いてPCRを行い、Ｈ鎖可変領域をコードするヌクレオチド及びそのアミノ酸配列、並びにＬ鎖可変領域をコードするヌクレオチド及びそのアミノ酸配列を解析した。各プライマーセットの塩基配列は次のとおりであった。
取得したハイブリドーマ PB2 3-1.6 からRNAを抽出した後、oligo-dTプライマーを用いて、逆転写し、cDNAを作製した。かかるcDNAを鋳型として、下記に示すＨ鎖プライマーセット及びＬ鎖プライマーセットを用いてPCRを行い、Ｈ鎖可変領域をコードするヌクレオチド及びそのアミノ酸配列、並びにＬ鎖可変領域をコードするヌクレオチド及びそのアミノ酸配列を解析した。各プライマーセットの塩基配列は次のとおりであった。
＜Ｈ鎖プライマーセット＞
VH1-1S: 5'-ggggatcc ag gts mar ctg cag sag tcw gg-3'（配列番号５）
s=g+c、m=a+c、r=a+g、w=a+t
IgG2-1AS: 5’-gggaattc ctt gac cag gca tcc tag agt ca-3′（配列番号６）
＜Ｌ鎖プライマーセット＞
VK-1S: 5′-ggggatcc gay att gtg mts acm car wct mca -3′（配列番号７）
y=c+t、m=a+c、s=g+c、r=a+g、w=a+t
CK-2AS: 5’-gggaattcgaa gat gga tac agt tgg tgc-3’（配列番号８）
VH1-1S: 5'-ggggatcc ag gts mar ctg cag sag tcw gg-3'（配列番号５）
s=g+c、m=a+c、r=a+g、w=a+t
IgG2-1AS: 5’-gggaattc ctt gac cag gca tcc tag agt ca-3′（配列番号６）
＜Ｌ鎖プライマーセット＞
VK-1S: 5′-ggggatcc gay att gtg mts acm car wct mca -3′（配列番号７）
y=c+t、m=a+c、s=g+c、r=a+g、w=a+t
CK-2AS: 5’-gggaattcgaa gat gga tac agt tgg tgc-3’（配列番号８）
Ｈ鎖の可変領域をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号１に、この遺伝子がコードするアミノ酸配列を配列番号２に、Ｌ鎖の可変領域をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号３に、この遺伝子がコードするアミノ酸配列を配列番号４に示す。
Claims (2)
- インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＢ２サブユニットと抗原抗体反応し、該インフルエンザウイルスを中和しないモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片であって、Ｈ鎖の可変領域中のＣＤＲ１のアミノ酸配列がGYTFTDYW、ＣＤＲ２のアミノ酸配列がIDTSDSYT、ＣＤＲ３のアミノ酸配列がARWYDEIDYであり、Ｌ鎖の可変領域中のＣＤＲ１のアミノ酸配列がKSVSTSGYSY、ＣＤＲ２のアミノ酸配列がLVS、ＣＤＲ３のアミノ酸配列がQHIRELTRSである、モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
- Ｈ鎖の可変領域のアミノ酸配列が配列番号２で表され、Ｌ鎖の可変領域のアミノ酸配列が配列番号４で表される請求項１記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
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