CN102046654A - 针对甲型流感病毒h5n1株系的抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明人提供了可中和甲型流感病毒H5N1株系的人类抗体。发明人还提供了可中和H5亚型进化枝2中的甲型流感病毒株系的抗体，可中和甲型流感病毒H5N1株系并具有λ轻链的抗体，和是可中和甲型流感病毒H5N1株系的IgG抗体(但不具有IgG1重链)的抗体。

Description

针对甲型流感病毒H5N1株系的抗体
本申请要求2007年3月13日提交的美国临时申请第60/894,612号的权益，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及对流感病毒，并且特别是对人类H5N1甲型流感病毒具有特异性的人类抗体。
背景技术
甲型流感病毒是在人类中引起严重疾病的病原体。可参考株系的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)表面蛋白的亚型对它们进行分类。目前有抗原性彼此不同的16种已知的HA亚型(H1至H16)和9种NA亚型(N1至N9)。人类群体中目前流行的甲型流感病毒是H1N1或H3N2株系。
当出现能够进行人类-至-人类(水平)传播并且相对于目前流行的株系具有新HA或NA亚型的甲型流感病毒株系时，即产生流感大流行。例如，人类群体目前在免疫学上首次接触(immunoligically naive)H5N1株系，H5N1株系已在禽类群体中流行了若干年。如果H5N1株系变得适应于人类-至-人类传播，则它可引起流感感染的大范围爆发。
目前应对H5N1爆发的方法包括预防性免疫接种或使用神经氨酸酶抑制剂诸如奥司他韦(达菲TM(TamifluTM))和扎那米韦(瑞乐沙TM(RelenzaTM))。参考文献1报道，具有人类恒定域(κ轻链和IgG1重链)和鼠可变域的嵌合单克隆抗体可中和H5N1病毒株系，并因而适合用于预防和治疗。参考文献2公开了针对禽流感株系A/Ck/HK/Yu22/02制备的鼠单克隆抗体，并提议可将它们人源化。
在H5亚型内，根据HA序列病毒落入不同的谱系(称为进化枝)。2004年和2005年分别在越南和印度尼西亚分离的病毒指定为进化枝1和进化枝2(有时提及时使用罗马数字I和II)的参考株系。参考文献1的抗体是针对A/Vietnam/1203/04和A/Hong Kong/213/03株系制备的，二者均在进化枝1中[3]。
需要进一步的和改进的材料来预防和治疗H5N1甲型流感病毒感染和疾病，包括H5N1的各个进化枝。
发明内容
如下文更详细地说明的，本发明人提供了可中和甲型流感病毒H5N1株系的血凝素的人类单克隆抗体。
发明人还提供了具有选自由FLA5.10、FLD21.140、FLA3.14和FLD20.19组成的组中的抗体的一个或多个CDR的抗体。优选地，这些抗体可中和甲型流感病毒H5N1株系的血凝素。
发明人还提供了具有选自由FLD84、FLD93、FLD122、FLD127、FLD129、FLD132和FLD194组成的组中的抗体的一个或多个CDR的抗体。优选地，这些抗体可中和甲型流感病毒H5N1株系的血凝素。
发明人还提供了与选自由FLA5.10、FLD21.140、FLA3.14和FLD20.19组成的组中的抗体结合相同表位的抗体。优选地，这些抗体可中和甲型流感病毒H5N1株系的血凝素。
发明人还提供了与选自由FLD84、FLD93、FLD122、FLD127、FLD129、FLD132和FLD194组成的组中的抗体结合相同表位的抗体。优选地，这些抗体可中和甲型流感病毒H5N1株系的血凝素。
发明人还提供了与选自由FLA5.10、FLD21.140、FLA3.14、FLD20.19、FLD84、FLD93、FLD122、FLD127、FLD129、FLD132和FLD194组成的组中的抗体竞争结合H5血凝素蛋白的抗体。优选地，这些抗体可中和甲型流感病毒H5N1株系的血凝素。
发明人还提供了可中和H5亚型进化枝2中的甲型流感病毒株系的血凝素的抗体。
发明人还提供了可中和甲型流感病毒H5N1株系的血凝素的抗体，其中所述抗体具有lambda(λ)轻链。
发明人还提供了可中和甲型流感病毒H5N1株系的血凝素的IgG抗体，条件是所述抗体不具有IgG1重链。
发明人还提供了本发明第一抗体和本发明第二抗体的组合，其中所述第一抗体和第二抗体结合甲型流感病毒H5N1株系的血凝素上的不同表位。因此所述抗体可能能够同时结合单个血凝素蛋白分子。一个此类组合包含抗体FLD20.19和FLD194。另一组合包含(i)与FLD20.19竞争结合H5血凝素蛋白的抗体，和(ii)与FLD194竞争结合H5血凝素蛋白的抗体。另一组合包含(i)与FLD20.19结合相同表位的抗体，和(ii)与FLD194结合相同表位的抗体。
这些不同抗体可以各种方式生产，并可用于预防和治疗病毒感染和疾病。它们还可在诊断情况中使用。
人类单克隆抗体
在一些实施方案中，本发明提供可中和甲型流感病毒H5N1株系的血凝素的人类单克隆抗体。和非人类抗体不同，这些人类抗体在施用于人类时将不会引起针对它们的恒定域的免疫应答。与嵌合抗体(诸如参考文献1中公开的那些)不同，这些人类抗体的可变域是100％人类的(特别是除了互补性决定区[CDR]之外，可变域的构架区是100％人类的)，并且因此不会在施用于人类时引起针对可变域构架区的免疫应答(任选地，任何抗独特型应答除外)。人类抗体不包括不具有人类来源的任何序列。
术语“单克隆”在最初涉及抗体使用时指由免疫细胞的单个克隆系产生的抗体，其与“多克隆”抗体相反，多克隆抗体虽然全部识别相同靶蛋白，但是却由不同B细胞产生，并且将针对所述蛋白上的不同表位。如本文所用，词语“单克隆”并不暗示任何特定的细胞来源，而是指全部具有相同的氨基酸序列并识别相同靶蛋白中的相同表位的抗体的任何群体。因此，单克隆抗体可使用任何合适的蛋白质合成系统包括免疫细胞、非免疫细胞、非细胞系统等产生。这一用法在本领域中是常见的，例如以下产品的产品数据表均提到这些产品为单克隆抗体：表达于鼠骨髓瘤NS0细胞系的CDR移植的人源化抗体SynagisTM，表达于CHO细胞系的人源化抗体赫赛汀TM(HerceptinTM)，和表达于CHO细胞系的噬菌体展示抗体HumiraTM。
人类单克隆抗体可通过各种方法制备。例如，产生目标抗原的人类B细胞可通过例如用埃巴病毒(EBV)感染而被永生化。人类单克隆抗体还可在非人类宿主中产生，通过将所述宿主自身的免疫系统替换为有功能的人类免疫系统，例如至Scid小鼠或三合体(Trimera)小鼠中。人类Ig基因座转基因的小鼠已成功用于产生人类单克隆抗体(包括针对流感病毒M2蛋白的人类抗体[4])，例如Abgenix的“异种小鼠(xeno-mouse)”[5]。噬菌体展示也已成功[6]，并得到了HumiraTM产品。产生人类单克隆抗体的优选方法公开于参考文献7&8。在此方法中，使用EBV在多克隆B细胞活化物的存在下转化靶抗原特异性的人类B记忆淋巴细胞。
在本发明的具体实施方案中，发明人制备了本文称作FLA5.10、FLD21.140、FLA3.14和FLD20.19的人类单克隆抗体。在本发明的进一步具体的实施方案中，发明人制备了本文称作FLD84、FLD93、FLD122、FLD127、FLD129、FLD132和FLD194的人类单克隆抗体。这些抗体是使用参考文献7&8的技术制备的。
抗体FLA5.10特异性识别进化枝1中的H5N1病毒。表位作图研究显示它识别HA蛋白。它的重链可变域的氨基酸序列是SEQ ID NO：13(由SEQID NO：14编码)，并且它的轻链(κ)可变域是SEQ ID NO：15(由SEQ ID NO：16编码)。因此它的CDR具有以下序列：
  CDR   H1   H2   H3   L1   L2   L3
  SEQ ID NO：   17   18   19   20   21   22
抗体FLD21.140特异性识别进化枝1中的H5N1病毒。它识别HA蛋白。它的重链可变域的氨基酸序列是SEQ ID NO：5(由SEQ ID NO：6编码)，并且它的轻链(λ)可变域是SEQ ID NO：7(由SEQ ID NO：8编码)。因此它的CDR具有以下序列：
  CDR   H1   H2   H3   L1   L2   L3
  SEQ ID NO：   23   24   25   26   27   28
抗体FLA3.14识别进化枝1和进化枝2中的H5N1病毒。表位作图研究显示它识别HA蛋白。它的重链可变域的氨基酸序列是SEQ ID NO：9(由SEQ ID NO：10编码)，并且它的轻链(κ)可变域是SEQ ID NO：11(由SEQ IDNO：12编码)。因此它的CDR具有以下序列：
  CDR   H1   H2   H3   L1   L2   L3
  SEQ ID NO：   29   30   31   32   33   34
抗体FLD20.19识别进化枝1和进化枝2中的H5N1病毒。它识别HA蛋白。它的重链可变域的氨基酸序列是SEQ ID NO：1(由SEQ ID NO：2编码)，并且它的轻链(κ)可变域是SEQ ID NO：3(由SEQ ID NO：4编码)。因此它的CDR具有以下序列：
  CDR   H1   H2   H3   L1   L2   L3
  SEQ ID NO：   35   36   37   38   39   40
抗体FLD84识别进化枝1和进化枝2中的H5N1病毒。它识别HA蛋白。它的重链可变域的氨基酸序列是SEQ ID NO：42(由SEQ ID NO：41编码)，并且它的轻链(κ)可变域是SEQ ID NO：44(由SEQ ID NO：43编码)。因此它的CDR具有以下序列：
  CDR   H1   H2   H3   L1   L2   L3
  SEQ ID NO：   45   46   47   48   49   50
抗体FLD93识别进化枝1和进化枝2中的H5N1病毒。它识别HA蛋白。它的重链可变域的氨基酸序列是SEQ ID NO：52(由SEQ ID NO：51编码)，并且它的轻链(κ)可变域是SEQ ID NO：54(由SEQ ID NO：53编码)。因此它的CDR具有以下序列：
  CDR   H1   H2   H3   L1   L2   L3
  SEQ ID NO：   55   56   57   58   59   60
抗体FLD122识别进化枝1和进化枝2中的H5N1病毒。它识别HA蛋白。它的重链可变域的氨基酸序列是SEQ ID NO：62(由SEQ ID NO：61编码)，并且它的轻链(κ)可变域是SEQ ID NO：64(由SEQ ID NO：63编码)。因此它的CDR具有以下序列：
  CDR   H1   H2   H3   L1   L2   L3
  SEQ ID NO：   65   66   67   68   69   70
抗体FLD127识别进化枝1中的H5N1病毒。它识别HA蛋白。它的重链可变域的氨基酸序列是SEQ ID NO：72(由SEQ ID NO：71编码)，并且它的轻链(κ)可变域是SEQ ID NO：74(由SEQ ID NO：73编码)。因此它的CDR具有以下序列：
  CDR   H1   H2   H3   L1   L2   L3
  SEQ ID NO：   75   76   77   78   79   80
抗体FLD129识别进化枝1中的H5N1病毒且识别携带进化枝1和进化枝2二者中的病毒的流感H5 HA的假型病毒(pseudotypes)。它识别HA蛋白。它的重链可变域的氨基酸序列是SEQ ID NO：82(由SEQ ID NO：81编码)，并且它的轻链(λ)可变域是SEQ ID NO：84(由SEQ ID NO：83编码)。因此它的CDR具有以下序列：
  CDR   H1   H2   H3   L1   L2   L3
  SEQ ID NO：   85   86   87   88   89   90
抗体FLD132识别进化枝1中的H5N1病毒且识别携带进化枝1和进化枝2二者中的病毒的流感H5HA的假型病毒。它识别HA蛋白。它的重链可变域的氨基酸序列是SEQ ID NO：92(由SEQ ID NO：91编码)，并且它的轻链(κ)可变域是SEQ ID NO：94(由SEQ ID NO：93编码)。因此它的CDR具有以下序列：
  CDR   H1   H2   H3   L1   L2   L3
  SEQ ID NO：   95   96   97   98   99   100
抗体FLD194识别进化枝1和进化枝2中的H5N1病毒。它识别HA蛋白。它的重链可变域的氨基酸序列是SEQ ID NO：102(由SEQ ID NO：101编码)，并且它的轻链(κ)可变域是SEQ ID NO：104(由SEQ ID NO：103编码)。因此它的CDR具有以下序列：
  CDR   H1   H2   H3   L1   L2   L3
  SEQ ID NO：   105   106   107   108   109   110
一个或多个这些抗体的CDR序列可被转移到可选的可变域以生成共有它们的抗原结合特异性的进一步抗体，这一过程称为‘CDR移植’[9-14]。虽然CDR移植过程通常用于在不同动物物种的可变域之间转移抗原结合特异性，但是它还可用于将结合特异性从一种类型的抗体转移至不同类型的抗体。H1、H2和H3 CDR可一起转移到接受体VH结构域，但是仅转移它们中的一个或两个也可以是足够的[12]。相似地，L1、L2和L3 CDR的一个、两个或全部三个可转移到接受体VL结构域。优选的抗体将具有供体CDR的1、2、3、4、5或全部6个。当仅转移一个CDR时，通常不是L2 CDR，L2 CDR通常是六者中最短的。通常供体CDR将全部来自相同的人类抗体，但是也可以混合它们，例如转移来自第一抗体的轻链CDR和来自第二抗体的重链CDR。
CDR从供体可变域向接受体可变域的转移通常伴有一个或多个构架残基的修饰。
作为CDR移植的替代，也可使用‘SDR移植’过程[15、16]，其中仅CDR内的特异性决定残基被转移。
根据Kabat编号[17]，轻链可变区中的CDR是氨基酸24-34(L1)、50-56(L2)& 89-97(L3)，而重链可变区中的CDR是氨基酸31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)。根据Chothia编号[18]，轻链可变区中的CDR是氨基酸26-32(L1)、50-52(L2)&91-96(L3)，而重链可变区中的CDR是氨基酸26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)。上面的表格通过标准化的IMGT编号系统限定CDR[19-21]，即：CDR1＝IMGT位置27-38；CDR2＝IMGT 56-65；和CDR3＝IMGT 105-117。构架或“FR”残基是CDR之外的可变域残基。
参考文献22公开了针对流感病毒，但不是针对H5株系的人类单克隆抗体。
抗体
本发明的抗体可采用各种形式。例如，它们可以是天然抗体，如在哺乳动物中天然发现的。天然抗体由重链和轻链构成。重链和轻链均划分为可变域和恒定域。不同抗体识别不同抗原的能力源自它们轻链和重链二者中的可变域的差异。脊椎动物物种中的天然抗体的轻链是kappa(κ)或lambda(λ)，基于它们恒定域的氨基酸序列而言。天然抗体重链的恒定域将是α、δ、ε、γ或μ，分别相应产生IgA、IgD、IgE、IgG或IgM类的抗体。类可进一步划分为亚类或同种型例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgA2等。抗体还可通过同种异型来分类，例如γ重链可具有G1m同种异型a、f、x或z，G2m同种异型n，或G3m同种异型b0、b1、b3、b4、b5、c3、c5、g1、g5、s、t、u或v；κ轻链可具有Km(1)、Km(2)或Km(3)同种异型。天然IgG抗体具有两条相同的轻链(一个恒定域CL和一个可变域VL)和两条相同的重链(三个恒定域CH1 CH2 & CH3和一个可变域VH)，它们通过二硫桥维持在一起。不同类的天然抗体的结构域和三维结构是公知的。
当本发明的抗体具有含恒定域的轻链时，它可以是κ或λ轻链(虽然在一些实施方案中，抗体必须具有λ轻链)。当本发明的抗体具有含恒定域的重链时，它可以是α、δ、ε、γ或μ重链。γ类(即IgG抗体)中的重链是优选的。IgG1亚类是优选的(虽然在一些实施方案中，抗体不具有IgG1重链)。SynagisTM抗体是含κ轻链的IgG1。本发明的抗体可以具有任何合适的同种异型(参见上文)。
本发明的抗体可以是保留了抗原结合活性的天然抗体片段。例如，木瓜蛋白酶消化天然抗体产生两个相同的抗原结合片段(称为“Fab”片段，每个片段具有单个抗原结合位点)和无抗原结合活性的残留“Fc”片段。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点的“F(ab′)2”片段。“Fv”是含有完整抗原结合位点的天然抗体最小片段，其由一个重链和一个轻链可变域的二聚体组成。因此，本发明的抗体可以是天然抗体的Fab、Fab′、F(ab′)2、FV或任何其他类型片段。
本发明的抗体可以是“单链Fv”(“scFv”或“sFv”)，包含VH和VL结构域作为单个多肽链[23-25]。通常VH和VL结构域通过VH和VL结构域之间短的多肽接头(如≥12氨基酸)连接，所述多肽接头使得scFv形成用于抗原结合的期望结构。表达scFv蛋白的典型方式(至少对于初始选择)是在噬菌体展示文库或其他组合文库环境中[26-28]。单个多肽链中可连接多个scFv[29]。
本发明的抗体可以是“双抗体(diabody)”或“三链抗体(triabody)”等[30-33]，其包含多个连接的Fv(scFv)片段。通过在VH和VL结构域之间使用太短以至于不能允许它们彼此配对的接头(如＜12氨基酸)，它们被迫改而与另一Fv片段的互补结构域配对，并因此产生两个抗原结合位点。
本发明的抗体可以是单个可变域或VHH抗体。骆驼科动物(如骆驼和羊驼(llama))和鲨鱼中天然发现的抗体含有重链但不含轻链。因此抗原识别是通过单个可变域决定的，这与哺乳动物天然抗体不同[34-36]。此类抗体的恒定域可被省略而却保持抗原结合活性。表达单个可变域抗体的一种方式(至少对于初始选择)是在噬菌体展示文库或其他组合文库环境中[37]。参考文献38公开了针对甲型流感病毒H5N2株系产生的并具有神经氨酸酶特异性的骆驼科动物抗体(CC07)。
本发明的抗体可以是“结构域抗体”(dAb)。此类dAb是基于人类抗体重链或轻链的可变域，并具有大约13kDa的分子量(小于完整抗体大小的十分之一)。通过配对识别不同靶的重链和轻链dAb，可制备具有双重特异性的抗体，并且本发明的dAb将包括至少一个可结合甲型流感病毒H5N1株系的血凝素的结构域。dAb从身体中快速清除，但是可通过与结合血液蛋白质(如血清白蛋白)的第二dAb融合、通过与聚合物(如聚乙二醇)缀合或通过其他技术而保留在循环中。
本发明的抗体可以是具有来自一种生物体(如人类)的恒定域但是来自不同生物体(如非人类)的可变域的嵌合抗体。最初开发抗体的嵌合化是为了促进抗原特异性从容易获得的鼠单克隆抗体向人类抗体转移，从而避免直接产生人类单克隆抗体的困难。因为发明人已经提供了人类抗体作为进一步工作的起点，所以嵌合化对于实施本发明来说通常是不需要的。但是，如果产生了针对甲型流感病毒H5N1株系的非人类抗体，则它们可用于制备嵌合抗体。相似地，如果本发明的人类抗体用于非人类生物体，则它们的可变域可与来自非人类生物体的恒定域连接。
本发明的抗体可以是CDR移植抗体。CDR移植过程如上所述。因为发明人已经提供了人类抗体作为进一步工作的起点，所以和嵌合化一样，CDR移植通常是不需要的。
因此，本文所用的术语“抗体”涵盖了具有多样化结构特征的一系列蛋白(通常包括至少一个免疫球蛋白结构域，该免疫球蛋白结构域具有全β蛋白质折叠(all-β protein fold)，所述全β蛋白质折叠为安排在两个β片层之间的反平行β链的双层三明治)，但是所有蛋白质均拥有结合甲型流感病毒H5N1株系病毒体中存在的蛋白质(通常是血凝素，其是两种主要表面糖蛋白之一)的能力。
本发明的抗体可包括单个抗原结合位点(如在Fab片段或scFv中)或多个抗原结合位点(如在F(ab’)2片段或双抗体或天然抗体中)。当抗体具有多于一个抗原结合位点时，则有利地其可以造成抗原的交联。
当抗体具有多于一个抗原结合位点时，所述抗体可以是单特异性的(即所有抗原结合位点识别相同抗原)或其可以是多特异性的(即抗原结合位点识别多于一种抗原)。因此，在多特异性抗体中，至少一个抗原结合位点将识别H5N1甲型流感病毒且至少一个抗原结合位点将识别不同的抗原。
本发明的抗体可包括非蛋白质物质，例如通过共价缀合。例如，抗体可包括放射性同位素，例如泽娃灵TM(ZevalinTM)和百克沙TM(BexxarTM)产品分别包括90Y和131I同位素。作为进一步的实例，抗体可包括细胞毒性分子，例如麦罗塔TM(MylotargTM)连接于N-乙酰基-γ-加利车霉素(一种细菌毒素)。作为进一步的实例，抗体可包括共价附着的聚合物，例如已报道附着聚氧乙烯化多元醇或聚乙二醇(PEG)增加抗体的循环半衰期。
在本发明的一些实施方案中，抗体可包括一个或多个恒定域(如包括CH或CL结构域)。如上文提及的，恒定域可形成κ或λ轻链，或α、δ、ε、γ或μ重链。当本发明的抗体包括恒定域时，它可以是天然恒定域或修饰的恒定域。重链可包括三个(如在α、γ、δ类中)或四个(如在μ、ε类中)恒定域。恒定域不直接参与抗体和抗原之间的结合相互作用，但是它们可以提供各种效应功能，包括但不限于：抗体参与抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)；C1q结合；依赖补体的细胞毒性；Fc受体结合；吞噬作用；和细胞表面受体的下调。
恒定域可形成“Fc区”，其是天然抗体重链的C-末端区。当本发明的抗体包括Fc区时，它可以是天然Fc区或修饰的Fc区。Fc区对于一些抗体的功能是重要的，例如赫赛汀TM的活性是Fc依赖性的。尽管天然抗体Fc区的边界可能不同，但是人类IgG重链Fc区通常被定义为从位置Cys226或Pro230处的氨基酸残基延伸至重链的C-末端。Fc区将通常能够结合一种或多种Fc受体，诸如FcγRI(CD64)、FcγRII(如FcγRIIA、FcγRIIB1、FcγRIIB2、FcγRIIC)、FcγRIII(如FcγRIIIA、FcγRIIIB)、FcRn、FcαR(CD89)、FcδR、FcμR、FcεRI(如FcεRIαβγ2或FcεRIαγ2)、FcεRII(如FcεRIIA或FcεRIIB)等。Fc区还可或替代地能够结合补体蛋白，如C1q。抗体Fc区的修饰可用于改变其效应功能，例如增加或降低受体结合亲和力。例如，参考文献39报道通过突变Fc区残基234、235、236、237、297、318、320和/或322可修饰效应功能。相似地，参考文献40报道突变以下Fc区残基(EU目录Kabat编号)可改善人类IgG1的效应功能：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438和/或439。Fc残基322、329和/或331的修饰在参考文献41中报道用于修饰人类IgG抗体的C1q亲和力，而参考文献42中选择残基270、322、326、327、329、331、333和/或334用于修饰。参考文献43报道了对人类IgG与FcRI、FcRII、FcRIII和FcRn受体的结合重要的残基的作图，以及具有改善的FcR结合性质的变体的设计。完整的CH结构域可在同种型之间替代，例如参考文献44公开了其中人类IgG4的CH3结构域(和任选地CH2结构域)被人类IgG1的CH3结构域替代的抗体，以提供抑制的聚集体形成。参考文献44还报道了将人类IgG4位置409(EU目录Kabat)的精氨酸突变为例如赖氨酸显示抑制的聚集体形成。用来改变其效应功能的可用单克隆抗体的Fc区的突变是已知的，例如参考文献45报道美罗华TM(RITUXANTM)的突变研究改变C1q结合，而参考文献46报道NUMAXTM的突变研究改变FcR结合，且残基252、254和256的突变使FcRn结合增加10倍而不影响抗原结合。
本发明的抗体将通常是糖基化的。例如附着在重链CH2结构域的N-联聚糖可影响C1q和FcR结合[43]，未糖基化的抗体对这些受体具有更低的亲和力。聚糖结构还可影响活性，例如根据聚糖双天线链(biantennary chain)末端的半乳糖数量(0、1或2)可观察到补体介导的细胞死亡差异。抗体的聚糖优选地在施用后不导致人类免疫原性应答。
本发明的抗体可制备为不含与它们天然缔合的产物的形式。抗体的天然环境中的污染物组分包括材料如酶、激素或其他宿主细胞蛋白。
本发明的抗体可直接使用(如作为药物或诊断试剂的活性成份)，或它们可用作进一步的开发工作的基础。例如，抗体可进行序列变化或化学修饰以改善期望的特性，例如结合亲和力或亲合力、药代动力学性质(如体内半衰期)等。以这种方式修饰抗体的技术在本领域是已知的。例如，抗体可进行“亲和力成熟”，其中一个或多个残基(通常位于CDR)被突变以改善它对靶抗原的亲和力。可使用随机或定向诱变，但是参考文献47描述了通过VH和VL结构域改组作为随机点突变的替代的亲和力成熟。参考文献48报道了NUMAXTM是如何通过SYNAGISTM重链和轻链CDR的体外亲和力成熟过程衍生的，产生了具有对RSV F蛋白的增强效价和70倍更高的结合亲和力的抗体。
本发明的优选抗体对来自甲型流感病毒H5N1株系的抗原是特异性的。因此所述抗体对所述抗原将具有比对任意的对照抗原(例如人类蛋白质)更紧密的结合亲和力。优选的抗体具有对靶抗原的纳摩尔或皮摩尔亲和力常数，例如10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M或更紧密的)。此类亲和力可使用常规分析技术确定，例如使用BIAcoreTM仪器中配备的表面等离子体共振技术并根据生产商的说明进行操作。使用放射标记的靶抗原(血凝素)的放射免疫测定是测量结合亲和力的另一方法。
本发明的抗体可识别H5病毒的进化枝1和/或进化枝2。它们还可识别其他H5进化枝。在一些实施方案中，抗体必须识别进化枝2。
参考文献49公开了与H5血凝素反应的单克隆抗体用于免疫测定设备。
中和活性
本发明的抗体可用于中和可感染人类的甲型流感病毒H5N1株系的血凝素。因此，它们可以中和所述病毒在人类宿主中启动和/或持续感染的能力。各种测定可用于确定中和活性，如本文所述的微量中和测定。优选的抗体可中和100TCID50(50％组织培养感染剂量)的H5N1病毒对MDCK细胞的感染性。用于此类测定的H5N1病毒可从任何合适的来源获得，如CDC(Atlanta，GA)的流感病毒部门。它们还可分离自感染的患者，或通过使用反向遗传学技术将H5-亚型HA和N1-亚型NA与六个其他病毒区段组合。作为使用病毒进行流感中和测定的替代，在本发明的一些实施方案中可改而使用携带流感H5HA的逆转录病毒假型病毒[50]。
测定使用的MDCK细胞可从ATCC获得，目录号为CCL-34。
在本发明的优选实施方案中，抗体可以100μg/ml或更低例如75μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、500ng/ml、250ng/ml、100ng/ml、75ng/ml、50ng/ml、10ng/ml或更低的浓度中和100TCID50的H5N1甲型流感病毒。特别优选的抗体可在100ng/ml或更低进行中和。特别有用的抗体可在这些浓度下中和100 TCID50的分别为进化枝1中的H5N1甲型流感病毒株系和进化枝2中的H5N1甲型流感病毒株系。
中和甲型流感病毒H5株系的能力并不必然意味着所述抗体不能中和其他15种血凝素亚型的任一种。在一些实施方案中，抗体可中和多种血凝素亚型(如所有16种亚型)。在其他实施方案中，抗体可能不中和H3N2流感病毒。在其他实施方案中，抗体可仅中和H5亚型。
核酸和重组抗体表达
本发明还涵盖编码本发明的抗体的核酸序列。当本发明的抗体具有多于一条链(如重链和轻链)时，本发明涵盖编码各条链的核酸。本发明还涵盖编码本发明抗体CDR的氨基酸序列的核酸序列。
编码抗体的核酸可从表达目标抗体的细胞、病毒或噬菌体制备。例如，核酸(如mRNA转录物或DNA)可从目标永生B细胞制备，然后编码目标抗体的基因可被克隆并用于后续重组表达。对于药物目的而言，来自重组来源的表达要比来自B细胞或杂交瘤的表达更常见，例如出于稳定性、再现性、培养容易等原因。从B细胞获得并测序免疫球蛋白基因的方法是本领域公知的，例如参见参考文献51。因此，可进行培养、传代培养、克隆、亚克隆、测序、核酸制备等各种步骤以使目标细胞或噬菌体持续表达抗体。本发明涵盖此类步骤过程中使用和制备的所有细胞、核酸、载体、序列、抗体等。
本发明提供制备编码目标抗体的一种或多种核酸分子(例如重链和轻链基因)的方法，其包含如下步骤：(i)提供表达目标抗体的永生B细胞克隆；(ii)从所述B细胞克隆获得编码所述目标抗体的核酸。步骤(ii)中获得的核酸可插入不同的细胞类型，或可对它进行测序。
本发明还提供制备重组细胞的方法，其包括如下步骤：(i)从B细胞克隆获得编码目标抗体的一种或多种核酸(例如重链和/或轻链基因)；和(ii)将所述核酸插入表达宿主以允许目标抗体在该宿主中表达。
相似地，本发明提供制备重组细胞的方法，其包括如下步骤：(i)测序来自B细胞克隆的编码目标抗体的核酸；和(ii)使用步骤(i)的序列信息制备核酸以插入表达宿主以允许目标抗体在该宿主中表达。
这些方法产生的重组细胞然后可用于表达和培养目的。它们对于表达抗体用于大规模药物生产特别有用。
本发明提供制备本发明的抗体的方法，其包括培养细胞以使它产生抗体的步骤。所述方法可进一步包括回收已产生的抗体以提供纯化抗体的步骤。如本文其它地方所述，这些方法中使用的细胞可以是重组细胞、永生B细胞或任何其他合适的细胞。来自这些方法的纯化的抗体然后可用于药物和/或诊断组合物等。
用于重组表达的细胞包括细菌、酵母和动物细胞，特别是哺乳动物细胞(如CHO细胞，人类细胞诸如PER.C6(ECACC保藏96022940[52])、NSO细胞(ECACC保藏85110503)或HKB-11[53、54]细胞)等)，以及植物细胞。优选的表达宿主可使本发明的抗体糖基化，特别是使用自身在人类中无免疫原性的碳水化合物结构(参见上文)。优选可在无血清培养基中生长的表达宿主。优选可在不存在动物衍生产品的培养基中生长的表达宿主。
可培养表达宿主以产生细胞系。
可操作本发明所用的核酸以插入、缺失或修改某些核酸序列。此类操作带来的变化包括但不限于，引入限制位点、修改密码子使用、添加或优化转录和/或翻译调节序列等的变化。还可能改变核酸以改变所编码的氨基酸。例如，向抗体的氨基酸序列引入一个或多个(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个等)氨基酸取代、一个或多个(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个等)氨基酸缺失和/或一个或多个(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个等)氨基酸插入可以是有用的。此类点突变可修饰效应功能、抗原结合亲和力、翻译后修饰、免疫原性等，可引入氨基酸以附着共价基团(如标记物)或可引入标签(如用于纯化目的)。突变可在特异性位点引入或可随机引入，然后进行选择(如分子进化)。
本发明的特定核酸序列包含SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14和/或16中的一个或多个。
本发明的核酸可存在于载体(如质粒)，例如于克隆载体或于表达载体中。因此，编码目标氨基酸序列的序列可位于启动子下游，以使其转录受到适当控制。本发明提供此类载体，并且还提供含有它们的细胞。
本发明还提供可分泌可中和甲型流感病毒H5N1株系的血凝素的抗体的永生人类B细胞。本发明还提供可分泌本发明抗体的永生人类B细胞。
药物组合物
抗体作为药物活性成分的用途现在是普遍的，包括产品赫赛汀TM(曲妥珠单抗)、美罗华TM、麦罗塔TM、泽娃灵TM、SynagisTM(帕利珠单抗)、赛尼哌TM(ZenapaxTM)(达利珠单抗)等。特别是SynagisTM和NumaxTM(莫维珠单抗(motavizumab))在预防呼吸道疾病中是有效的。因此发明人提供含有本发明的一种或多种抗体的药物组合物。将单克隆抗体纯化至药物级的技术是本领域公知的。
可中和H5N1甲型流感病毒的进化枝1株系的至少一种抗体和可中和H5N1甲型流感病毒进化枝2株系的至少一种抗体的组合是特别有用的。包含结合甲型流感病毒H5N1株系的血凝素上的不同表位的两种抗体的组合也是有用的。这些组合中的抗体可通过同时分开或顺序施用给予患者。
因此，例如，发明人提供包含可中和甲型流感病毒H5N1株系的第一人类单克隆抗体和可中和甲型流感病毒H5N1株系的第二人类单克隆抗体的药物组合物，其中所述第一抗体和第二抗体分别结合甲型流感病毒H5N1株系的血凝素上的不同表位。第一抗体和第二抗体共同(between them)可中和H5N1甲型流感病毒的进化枝1株系和进化枝2株系，和/或它们可分别结合相同H5血凝素上的不同表位。
作为将抗体作为活性成分递送于患者(如在被动免疫接种中)的替代，可以递送包括本发明的抗体所识别的表位的肽(如在主动免疫接种中)。因此，本发明的药物组合物可含有包含表位的多肽，所述表位被选自由FLA5.10、FLD21.140、FLA3.14、FLD20.19、FLD84、FLD93、FLD122、FLD127、FLD129、FLD132和FLD194组成的组中的抗体所识别。所述多肽可短于全长HA0、HA1或HA2肽。
作为递送抗体的进一步替代，可递送编码抗体的核酸，以使所述核酸可于患者中原位表达。因此，本发明的药物组合物可含有编码本发明的抗体的核酸。核酸可以是复制或非复制载体的形式。可使用病毒或非病毒载体。合适的基因治疗和核酸递送载体是本领域已知的。
药物组合物将通常含有一种或多种药学可接受载体和/或赋形剂。此类组分的详尽讨论可在参考文献55中获得。这些可包括液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，辅助物质如润湿剂或乳化剂或pH缓冲物质可存在于此类组合物中。
药物组合物可以各种形式制备，例如作为注射剂，无论是作为液体溶液还是悬浮液。还可制备成适合在注射之前溶解或悬浮于液体运载体(vehicle)的固体形式(如冻干的组合物，像SynagisTM和赫赛汀TM，其使用无菌水或缓冲液重构(reconstitution)，任选地含有防腐剂)。组合物可制备为用于局部施用，例如作为软膏剂、乳膏或粉剂。组合物可制备为用于经口施用，例如作为片剂或胶囊，作为喷雾剂，或作为糖浆(任选地调味的)，在这种情形下它将通常含有保护活性成分不被降解的物质。组合物可制备为用于肺部施用，例如作为吸入剂，使用细小的粉末或喷雾。组合物可制备为栓剂或阴道栓剂。组合物可制备为用于鼻部、耳部或眼部施用，例如作为滴剂。组合物可以是试剂盒形式，其设计为使组合的组合物在施用于患者之前使用时重构(如用无菌水或无菌缓冲液)，例如抗体可以干燥形式提供。
用于抗体施用的优选药物形式包括适合胃肠外施用的形式，如通过注射或输注，例如通过团注或持续输注。当产品用于注射或输注时，它可采用于油性或水性运载体中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且它可含有载体/赋形剂，如悬浮剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂。
药物组合物将通常具有介于5.5和8.5、优选地介于6和8和更优选地约7的pH。pH可通过缓冲液维持。
组合物将通常是无菌的。组合物将通常是无热原的，例如含有＜1 EU(内毒素单位，一种标准度量)每剂量，并且优选地＜0.1 EU每剂量。组合物优选地不含谷蛋白。组合物可以是相对于人类基本上等渗的。
组合物可包括抗微生物剂和/或防腐剂。
组合物可包含去污剂。当存在时，去污剂一般以低水平使用，例如＜0.01％。
组合物可包括钠盐(如氯化钠)以产生张力。通常是10±2mg/ml浓度的NaCl。
组合物可包含糖醇(如甘露醇)或二糖(如蔗糖或海藻糖)，例如在15-30mg/ml左右(如25mg/ml)，特别是如果它们将被冻干或如果它们包括从冻干材料重构的材料时。
组合物可包括游离氨基酸，例如组氨酸。例如，参考文献56公开了用于SynagisTM抗体的改进的水性制剂，所述制剂包含于水性载体中的组氨酸。
药物组合物将包括有效量的活性成分。组合物中的成分浓度当然将根据待递送的组合物体积而变化，并且已知的基于抗体的药物将在这方面提供指导。例如，提供SynagisTM用于重构，以在0.5ml中产生50mg抗体或在1.0ml中产生100mg抗体。基于它们的建议剂量向患者递送合适的体积。
配制后，本发明的组合物可直接施用于对象(参见下文)。优选使组合物适于施用于人类对象。这将一般是以液体(如水性)形式。
在包括抗体的组合物特别是药物组合物中，抗体优选地构成组合物中总蛋白的至少50％(以重量计)(如至少60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或更多)。所述抗体因而是纯化形式的。
本发明的药物组合物优选地以密封容器供应。
本发明还提供制备药物组合物的方法，其包括将本发明的抗体与一种或多种药学可接受成分混合的步骤。
医疗和用途
本发明的抗体可用于治疗和/或预防甲型流感病毒H5N1株系引起的疾病，特别是在人类中。因此本发明提供用于治疗的本发明抗体。还提供治疗患者的方法，其包括向所述患者施用本发明的抗体。还提供本发明的抗体在制备用于治疗和/或预防甲型流感病毒H5N1株系引起的疾病的药物中的用途。还提供用于治疗和/或预防甲型流感病毒H5N1株系引起的疾病的本发明的抗体。
发明人还提供了用于同时分开施用或顺序施用的第一抗体和第二抗体。在一些实施方案中，所述第一抗体和第二抗体共同可中和进化枝1株系和进化枝2株系，如上所述。在一些实施方案中，所述第一抗体和第二抗体结合相同H5血凝素上的不同表位，如上所述。
发明人还提供了组合用于治疗的所述第一抗体和第二抗体。他们还提供了用于治疗的所述第一抗体和第二抗体的组合。他们还提供了用于治疗和/或预防甲型流感病毒H5N1株系引起的疾病的方法的所述第一抗体和第二抗体。
发明人还提供了所述第一抗体和第二抗体在制备用于治疗和/或预防甲型流感病毒H5N1株系引起的疾病的药物中的用途。他们还提供了所述第一抗体在制备用于治疗和/或预防甲型流感病毒H5N1株系引起的疾病的药物中的用途，其中所述药物制备为与所述第二抗体一起施用。相似地，他们提供所述第二抗体在制备用于治疗和/或预防甲型流感病毒H5N1株系引起的疾病的药物中的用途，其中所述药物制备为与所述第一抗体一起施用。
发明人还提供了所述第一抗体在制备用于治疗和/或预防甲型流感病毒H5N1株系引起的疾病的药物中的用途，其中所述患者先前已用第二抗体治疗。相似地，他们提供所述第二抗体在制备用于治疗和/或预防甲型流感病毒H5N1株系引起的疾病的药物中的用途，其中所述患者先前已用第一抗体治疗。所述预治疗的患者可在身体循环中仍具有先前施用的抗体。
发明人还提供了用于治疗和/或预防甲型流感病毒H5N1株系引起的疾病的方法的所述第一抗体，其中所述第一抗体与所述第二抗体一起施用(或制备为与所述第二抗体一起施用)。他们还提供了用于治疗和/或预防甲型流感病毒H5N1株系引起的疾病的方法的所述第二抗体，其中所述第二抗体与所述第一抗体一起施用(或制备为与所述第一抗体一起施用)。
抗体的治疗用途与以下两方面有关：人类的来自非人类生物体(通常是禽类)的H5N1病毒的动物传染的感染和H5N1流感的人类大流行爆发。
抗体可用于免疫预防(被动免疫接种)和/或免疫治疗。为了确认预防性功效而不对患者施加感染攻击，可在例如中和测定中检验循环抗体水平。为了确认施用本发明的药物组合物后的治疗功效，可使用用于评估甲型流感病毒感染存在和/或严重度的任何已知方法。此类方法在抗病毒和疫苗领域中通常用于流感。
治疗可针对特别具有H5N1感染风险或易受H5N1感染的患者组。此类对象组包括但不限于：免疫受损对象，如患有HIV的那些或经受免疫抑制治疗的那些例如移植患者；年长者(如≥50岁、≥60岁和优选地≥65岁)；年幼者(如≤5岁)；住院患者；医护工作者；武装部队和军事人员；孕妇；慢性病患者；免疫缺陷患者；在接受疫苗之前7天内服用抗病毒化合物(如奥司他韦或扎那米韦化合物)的患者；已用抗病毒化合物进行治疗但显示不足的抗病毒应答的患者；和出国旅游的人们。
本发明的药物组合物可通过多种路径施用，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、髓内、腹膜内、鞘内、心室内、透皮、经皮、经口、局部、皮下、鼻内、肠内、舌下、阴道内或直肠路径。无针注射器(Hypospray)也可用于施用本发明的药物组合物。通常治疗组合物可制备为注射剂，无论是作为液体溶液还是悬浮液。还可制备成适合在注射之前溶解或悬浮于液体运载体的固体形式。
组合物的直接递送将一般通过皮下、腹膜内、静脉内或肌内注射，或递送于组织的胞间隙而实现。组合物还可施用于损伤。剂量治疗可以是单个剂量方案或多个剂量方案。已知的基于抗体的药物提供关于施用频率的一些指导，例如药物是否应每天一次、每周一次、每月一次等递送。频率和剂量还可取决于症状的严重度。
患者将接受有效量的活性成分，即足以治疗、改善或预防H5N1甲型流感病毒感染的量。治疗效应还可包括身体症状的减轻。用于任何特定对象的最佳有效量将取决于他们的体型和健康、病症的本质和程度，以及选择来施用的治疗剂或治疗剂的组合。给定情形递送的有效量可通过常规实验确定，并在医师的判断范围内。对于本发明目的，有效剂量将通常是在其所施用的个体中约0.01mg/kg至约50mg/kg，或约0.05mg/kg至约10mg/kg的本发明组合物。已知的基于抗体的药物在此方面提供指导，例如赫赛汀TM通过静脉内输注21mg/ml溶液施用，初始加载剂量为4mg/kg体重，且每周维持剂量为2mg/kg体重；美罗华TM以375mg/m2施用每周一次；SynagisTM以15mg/kg体重肌内施用，通常在RSV季节期间每月一次；等等。
本发明的抗体可与其他治疗剂一起施用(组合或分开地)，例如与针对流感病毒有活性的抗病毒化合物(例如奥司他韦和/或扎那米韦)一起。这些抗病毒剂包括神经氨酸酶抑制剂，如(3R，4R，5S)-4-乙酰基氨基-5-氨基-3(1-乙基丙氧基)-1-环己烯-1-羧酸或5-(乙酰基氨基)-4-[(氨基亚氨甲基)-氨基]-2，6-酐-3，4，5-三脱氧-D-甘油-D-半乳糖酰-2-烯酸(5-(acetylamino)-4-[(aminoiminomethyl)-amino]-2，6-anhydro-3，4，5-trideoxy-D-glycero-D-galactonon-2-enonic acid)，包括其酯(如乙酯)和其盐(如磷酸盐)。优选的抗病毒剂是(3R，4R，5S)-4-乙酰基氨基-5-氨基-3(1-乙基丙氧基)-1-环己烯-1-羧酸，乙酯，磷酸盐(1∶1)，也称为奥司他韦磷酸盐(达菲TM)。此类组合治疗可提供治疗功效的协同改善。此类抗病毒剂在与多于一种的本发明抗体在组合治疗时一起施用时特别有效，如本文其他地方所公开的。
诊断
除了治疗有用之外，本发明抗体(包括非中和性抗体)的结合活性意味着它们可用于诊断。抗体可用作免疫测定、放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)等中的试剂。本发明的抗体可因此附着于固体支持物。此附着可有利于它们在诊断测定中的使用。其还可有利于它们在纯化它们的靶抗原中的使用。
本发明的抗体可用分析学可检测的试剂如放射性同位素、荧光分子或酶进行标记。此标记有利于它们在诊断测定中的使用。
在一些实施方案中，本发明的抗体可用作免疫测定中的试剂，以筛选和/或鉴别抗原性或免疫原性肽，例如鉴别在施用于患者时可引起有用的抗HA应答的肽。
一般术语
术语“包含”涵盖“包括”以及“由...组成”，例如“包含”X的组合物可唯一地由X组成或可包括其他的事物，例如X+Y。
词语“基本上”不排除“完全”，例如“基本上不含”Y的组合物可完全不含Y。必要时，词语“基本上”可从本发明的定义中省略。
术语“约”在关于数值x时指例如x±10％。
本发明方法中的不同步骤可任选地由不同地方(如不同国家)的不同人们在不同的时间执行。
附图简述
图1显示免疫预防实验中感染(第0天)之后15天时间段内小鼠的存活比例(％)(Kaplan-Meier存活曲线)。图4和5显示血清治疗实验的相似数据。
图2显示预防研究中小鼠脑、脾和肺中的平均病毒滴度(log10TCID50每克组织)。显示了感染后第2天和第4天抗体D2.2(对照)、FLA3.14和FLA5.10的数据。星号指示统计学显著性(*＝P＜0.01，对比D2.2；**＝P＜0.001，对比D2.2)。箭头显示测定中的检测下限(1.5log10TCID50/g)。
图3显示小鼠肺的免疫组织化学分析。图A&C显示用FLA5.10抗体治疗的小鼠的肺。图B&D显示未治疗的对照小鼠的肺。图E&F是图B&D的放大视图。‘Br’指示细支气管。
发明实施方式
永生B细胞的产生
四名成年人被诊断为HPAI(高致病性禽流感)H5N1感染。在早期的康复过程中(疾病发作后1-4个月)，所有对象具有针对他们自体病毒的可检测的中和抗体滴度。获得患者的书面知情同意后，从所有四名患者采集血液。
融化冷冻的外周血单核细胞(PBMC)，并用针对CD22、IgM、IgD和IgA的抗体染色。CD22+IgM-、IgD-、IgA-B细胞使用FACSAria仪器分离。然后使用EBV在CpG寡脱氧核苷酸2006和受辐照的异基因PBMC存在下，以30个细胞/孔对B细胞进行永生化[8]。细胞在补充10％胎牛血清的完全RPMI 1640(cRPMI)中培养。14天后收集培养物上清液并筛选中和活性。
中和通过微量中和测定使用MDCK细胞和100 TCID50A/VietNam/1203/04(H5N1)评估，基本如参考文献58所述。简要而言，在添加至MDCK细胞单层之前，将纯上清液与100TCID50病毒在室温温育1小时。将细胞单层温育另外2-3天并检查细胞病变效应(CPE)。中和抗体滴度终点的确定以相似的方式执行，除了血浆或上清液样品在与100TCID50病毒混合之前进行连续两倍稀释。血浆样品以1∶10的起始稀释度开始检验，而上清液以1∶8的起始稀释度开始检验，并且检验每种稀释度下4个孔中的残留感染性。中和滴度定义为100TCID50的适当野生型H5N1病毒对MDCK细胞的感染性在50％的孔中被完全中和的血清最高稀释度的倒数。感染性通过第4天CPE的存在鉴定并且通过Reed-Muench方法计算滴度。
通过有限稀释以0.5个细胞/孔在CpG 2006和受辐照的PBMC的存在下克隆具有可测量的中和活性的培养物。B细胞克隆以高细胞密度在cRPMI10％Ig-耗竭FCS中于CELLine双室生物反应器(Two-CompartmentBioreactors)中培养以产生含有1-3mg/ml抗体的富集上清液。抗体还在G蛋白柱上纯化。抗体的同种型、亚类和轻链通过使用特异性抗体和HRP-标记的抗人Ig抗体的ELISA表征。抗体参考标准认证制品(Sigma-Aldrich，Buchs，SG)定量。
分离了产生中和性人类抗体的几个独立克隆。还从每个供体中鉴定了产生通过ELISA识别H5-HA但不中和活病毒的抗体的克隆。选择命名为‘FLA3.14’、‘FLA5.10’、‘FLD20.19’和‘FLD21.140’的四个克隆用于进一步的研究。所有克隆分泌具有针对在越南分离的甲型流感进化枝1H5N1病毒的中和活性的IgG1抗体。记录了针对100 TCID50的三个不同H5N1进化枝1株系的人类抗体中和滴度：
Figure G2008800130493D00221
NB：D2.2是不识别流感病毒的对照抗体
FLA5.10和FLD21.140显示针对进化枝1H5N1病毒的参考株系的体外中和活性，FLD21.140比FLA5.10更有效。FLA3.14和FLD20.19显示针对进化枝1和进化枝2二者的参考H5N1病毒的体外中和活性。特别是FLD20.19高效中和进化枝1和进化枝2H5N1甲型流感病毒。所述抗体无一中和H3N2流感病毒A/Califomia/7/04。倒数中和滴度如下所示，已归一化为1mg/ml抗体浓度：
  株系   HK/491/97   HK/213/03   VN/1203/04   JPHN/30321/05   Indo/5/05   CA/7/04
  亚型   H5N1   H5N1   H5N1   H5N1   H5N1   H3N2
  H5N1进化枝   1   1   1   1   2   -
  FLA3.14.   403   508   226   508   508   10
  FLA5.10   127   4,064   508   806   10   10
  FLD20.19   905   5,120   1,613   6,451   5.120   10
  FLD21.140   32   ≥14,882   5,120   12,902   10   19
  D2.2   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10   ＜10
另一系列单克隆抗体是从分离自4个供体之一的冷冻PBMC的B细胞产生的。分离了产生中和性人类抗体的几个独立克隆。选择命名为‘FLD84’、‘FLD93’、‘FLD122’、‘FLD127’、‘FLD129’、‘FLD132’和‘FLD194’的七个克隆用于进一步的研究。FLD127、FLD129和FLD132显示针对进化枝1H5N1病毒参考株系的体外中和活性，FLD132和FLD129比FLD127更有效。FLD84、FLD93、FLD122、FLD194显示针对进化枝1和进化枝2二者的参考H5N1病毒的体外中和活性。特别是FLD194和FLD122高效中和进化枝1和进化枝2H5N1甲型流感病毒。培养物上清液的倒数中和滴度如下所示：
Figure G2008800130493D00231
*FLD20.19的这些滴度不能直接与先前的数据比较。此测定使用了不同的抗体初始浓度和不同的病毒剂量。
特别是FLD122和FLD194中和所检验的三种病毒，其效价与先前筛选中分离的最佳单克隆抗体(FLD20.19)所显示的效价相当。
小鼠中的预防性和治疗性血清治疗
BALB/c小鼠对1997年和2003年以来在亚洲分离的HPAI H5N1病毒感染高度易感。采用鼻内施用，1997年以来在亚洲分离的H5N1病毒在小鼠肺中复制到高滴度，并且一些分离株散布至肺外位点，且对小鼠是致死性的。为了探索抗H5N1人类抗体对接触前免疫预防或接触后免疫治疗的功效，将BALB/c小鼠用抗体被动免疫，然后在24小时后鼻内用A/Vietnam/1203/04(H5N1)攻击，或用A/Vietnam/1203/04(H5N1)攻击并在24、48或72小时后注射抗体。4-8只雌性BALB/c小鼠(4-6周龄)组用于所有实验。小鼠的接种和组织收获由佩戴动力式空气净化呼吸器(powered airpurifying respirators)的人员在生物安全柜中执行。
为了测量预防性功效，小鼠腹膜内(i.p.)注射分级剂量的1ml单克隆抗体FLA3.14或FLA5.10，或注射针对A/VN/1203/2004(H5N1)的重组HA产生的高免疫绵羊抗血清。作为对照，小鼠接受人类单克隆抗体D2.2(白喉毒素特异性的)或A146(炭疽保护性抗原特异性的)。i.p.施用24小时后，对小鼠放血以测量中和抗体滴度，然后用50μl的105TCID50A/Vietnam/1203/04(H5N1)鼻内攻击。病毒感染之前和之后每天观察并称重。如图1所示，接受高免疫抗-H5多克隆绵羊抗血清的小鼠得到了完全的保护。所有FLA5.10制品在预防性功效测定中对A/Vietnam/1203/04致死性赋予100％的保护。FLA3.14也赋予致死性保护，但是功效较低且呈剂量依赖性方式。接受最高剂量FLA3.14的小鼠几乎得到了完全的保护。检验的最低剂量的FLA3.14(1mg/kg)延迟了死亡时间，但是没有防止致命感染。这些数据显示FLA5.10相对FLA3.14在体内相对更高的效价，这与针对A/Vietnam/1203/04测量的体外中和滴度(参见上文)是一致的。
为了探索FLA3.14和FLA5.10抗体如何能赋予致死性保护，研究了被动免疫小鼠中的病毒感染动力学。FLA3.14、FLA5.10或D2.2被动免疫的小鼠在24小时后用A/Vietnam/1203/04(H5N1)攻击。在第2天和第4天杀死小鼠并在无菌条件下取出肺、脑和脾。组织在补充抗生素-抗真菌剂溶液的Leibovitz L-15培养基中匀浆以得到肺(10％w/v)、脾(5％w/v)和脑(10％w/v)的悬浮液，然后以一式四份将悬浮液滴定至MDCK细胞单层上。病毒滴度通过Reed Muench方法计算并表示为log10TCID50/g组织。图2显示在第2天和第4天在接受FLA3.14或FLA5.10的小鼠的脑、脾和肺组织中回收的病毒显著少于接受对照D2.2抗体的小鼠。
为了进行病理学研究，对小鼠进行尸体剖检，肺用10％中性缓冲的福尔马林膨胀，包埋于石蜡中并制备切片。载玻片用苏木精和伊红染色。为了H5抗原的免疫组织化学展示，制备石蜡切片并使用针对禽流感H5的山羊抗体山羊αH5(以1∶1000稀释)和Vector兔抗山羊二抗进行ABC免疫组织化学，且Vector ABC Elite标记物二氨基联苯胺作为发色团和苏木精作为复染剂。图3显示接受FLA5.10预防的小鼠在肺部气道和实质组织具有显著更少的病理变化。因此，在接受FLA5.10预防的小鼠肺切片中具有坏死和病毒HA抗原的异常细支气管的百分比(13％)低于对照小鼠(80％)(图3，图A&C对比B&D或对比E&F)。相似地，给予FLA5.10的小鼠的肺切片中通过免疫组织化学染色检测到H5抗原的炎性间质性(I)损伤相对于对照抗体D2.2较少(1对比10+)。这些数据暗示FLA3.14或FLA5.10预防很可能通过限制肺中的病毒复制、弱化病毒诱导的肺病理学和阻断病毒向远端器官的肺外散布的组合赋予致死性攻击保护。
已建立的感染的弱化代表针对H5N1感染的抗病毒治疗的临床有关的终点。为此，在BALB/c小鼠中确定了FLA3.14、FLA5.10、FLD20.19和FLD21.140(以1mg/只小鼠i.p注射)的治疗功效，所述小鼠在24、48或72小时前用5LD50A/Vietnam/1203/04鼻内感染。图4显示FLA3.14、FLA5.10、FLD20.19和FLD21.140在A/Vietnam/1203/04感染的小鼠中于所有时间点提供有力的致死性保护，而对照(D2.2)则没有保护。还评估了抗体FLA3.14、FLA5.10和FLD20.19针对A/Indonesia/5/05(一种来自进化枝2的不同抗原性的H5N1病毒)的治疗功效。图5显示FLA3.14和FLD20.19在于病毒攻击24小时后给予时在A/Indonesia/5/05感染的小鼠中提供有力的致死性保护，而FLA5.10和对照(D2.2)则无保护作用，这与体外中和数据一致(参见上文)。这些数据提供了概念证明，即在小鼠模型中感染后至少多达72小时进行单克隆抗体治疗可显著改善高毒性H5N1感染的存活率。重要的是，这些数据还暗示使用由进化枝1病毒引发的抗体可能获得针对进化枝2H5N1病毒的显著交叉保护，例如通过共用的表位。
针对一组H5N1病毒的单克隆抗体的反应性的宽度
使用逆转录病毒假型病毒评估了中和性单克隆抗体的交叉反应性的宽度[50]。使用含有来自H5N1甲型流感病毒进化枝1、2.1、2.2和2.3的全长HA开放读框的假型病毒。数据代表以ng/ml表达的IC50值：
株系   HK/213/03   VN/1203/04   VN/1194.04   IN/5/05   WS/Mong/244/05   TY/TY/1/05   Anhui/1/05
  进化枝   1   1   1   2.1   2.2   2.2   2.3
  FLA3.14   33   65   86   12   67   76   172
  FLA5.10   2.5   24   26   Nn   Nn   Nn   Nn
  FLD20.19   10   16   13   77   4   10   104
  FLD21.119   0.7   5   7   Nn   22   5   Nn
  FLD84   14   42   17   30   30   32   118
  FLD93   11   48   22   59   11   13   Nn
  FLD122   2   5   6   4   6   8   19
  FLS127   750   13   19   Nn   Nn   Nn   Nn
  FLD129   0.5   1.7   1.2   678   3   6   16
  FLD132   0.5   1   1.6   Nn   1   1   1800
  FLD194   2   5   4   5   3   5   2
Nn：不中和
除了FLD20.19之外，两种其它mAb(FLD122&FLD194)显示高反应性宽度，能够以高效价中和来自不同进化枝的所有测试病毒。
抗体表征
测序了编码抗体FLA5.10、FLD21.140、FLA3.14和FLD20.19的重链和轻链的基因(SEQ ID NO 2、4、6、8、10、12、14、16)。推断了所编码的氨基酸序列(SEQ ID NO 1、3、5、7、9、11、13、15)并使用IMGT编号系统鉴定了CDR残基[19-21](SEQ ID NO 17至40)。
测序了编码抗体FLD84、FLD93、FLD122、FLD127、FLD129、FLD132和FLD194的重链和轻链的基因(SEQ ID NO 41、43、51、53、61、63、71、73、81、83、91、93、101、103)。推断了所编码的氨基酸序列(SEQ ID NO42、44、52、54、62、64、72、74、82、84、92、94、102、104)并使用IMGT编号系统鉴定了CDR残基[19-21](SEQ ID NO 45-50、55-60、65-70、75-80、85-90、95-100、105-110)。
使用交叉抑制实验鉴定抗体的非重叠特异性。测试了不同抗体针对FLD20.19、FLA3.14和FLD194.110的竞争，和％抑制如下所示：
Figure G2008800130493D00261
因此，FLD20.19和FLD194不交叉竞争结合HA，所以它们应识别不同的非重叠表位。这些抗体因此可组合用于围堵(containment)病毒逃逸突变体。
应理解，本发明仅通过示例方式描述，并且可进行修饰而仍保留在本发明的范围和精神内。
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<212>PRT
<213>人类
 
<400>1
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Thr Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr
            20                  25                  30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Asp Trp Met
        35                  40                  45
Gly Gly Ile Ile Pro Leu Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Ser Ser Asn
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Val His Asn Tyr Asp Phe Leu Thr Gly Tyr Pro Leu His
            100                 105                 110
Leu Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
        115                  120                 125
Ser
 
<210>2
<211>388
<212>DNA
<213>人类
 
<400>2
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgacggtc    60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc aattatggta tcagttgggt gcgacaggcc   120
cctggacaag gtcttgattg gatgggaggg atcatccctt tgtttggaac agcaaactac   180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag ctcctccaac   240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagatgtc   300
cacaattacg attttttgac tggttatcca cttcatctct acggtatgga cgtctggggc   360
caagggacca cggtcaccgt ctcctcag                                      388
 
<210>3
<211>107
<212>PRT
<213>人类
 
<400>3
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1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Tyr
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ile Pro Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Asn Val Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Ser Ser Pro Pro
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
 
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<212>DNA
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<400>4
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<400>5
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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
            20                  25                  30
Thr Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg His His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr His Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Glu Ser Arg Val Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr
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Cys Ala Arg Ala Glu Asn Leu Leu Ser Pro Tyr Leu Ala Glu Gly Phe
            100                 105                 110
Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
 
<210>6
<211>376
<212>DNA
<213>人类
 
<400>6
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcgcagac cctgtccctc    60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtgggactt actactggag ctggatccgc   120
catcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct atcacagtgg gagcgcctac   180
tacaatccgt ccctcgagag tcgagttacc atgtcagtag acacgtctaa gaatcagttc   240
tccctgaagc tgagctctgt gactgccgcg gacacggcca tatattactg tgcgagagct   300
gagaatcttt tgtctcctta tttagccgag ggcttcgacc cctggggcca gggaaccctg   360
gtcaccgtct cctcag                                                   376
 
<210>7
<211>111
<212>PRT
<213>人类
 
<400>7
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Thr Ser Asn Ile Gly Ser Asn
            20                  25                  30
Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
                85                  90                  95
Ser Gly Ser Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
            100                 105                 110
 
<210>8
<211>334
<212>DNA
<213>人类
 
<400>8
cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc    60
tcttgttctg gaagcacctc caacatcgga agtaatgctg taaactggta ccagcagctc   120
ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat agtaataatc agcggccctc aggggtccct   180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag   240
tctgaggatg aggctgatta ctactgtgca gcatgggatg acagcctgag tggttcttgg   300
gtgttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc ctag                               334
 
<210>9
<211>125
<212>PRT
<213>人类
 
<400>9
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Gln Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Arg
            20                  25                  30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Gly Phe Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Asp Val Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
    50                  55                  60
Arg Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Leu Gly Gly Asn Lys Asp Tyr Gly Asp Tyr Leu Trp Tyr Phe
            100                 105                 110
Asp Leu Trp Gly Arg Gly Ala Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
 
<210>10
<211>376
<212>DNA
<213>人类
 
<400>10
gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc    60
tcctgtcagg cgtctggata cagctttacc agccgctgga tcggctgggt gcgccagatg   120
cccgggaaag gcctggagtg ggtgggattc atctatccta gtgactctga tgttagatat   180
agtccgtcct ttcgaggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac   240
ctacagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt atttctgtgc gagacttggg   300
ggaaataagg actacggtga ctacctctgg tacttcgatc tctggggccg tggcgccctg   360
gtcactgtct cctcag                                                   376
 
<210>11
<211>106
<212>PRT
<213>人类
 
<400>11
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asn Arg Arg
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
        35                  40                  45
His Asp Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Trp Leu Ser
                85                  90                  95
Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
            100                 105
 
<210>12
<211>319
<212>DNA
<213>人类
 
<400>12
gaaatagtga tgacgcagtc tccagacacc ctgtctgtgt ctccaggaga aagagccacc    60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttaac aggaggttag cctggtacca gcagaaacct   120
ggccaggctc ccaggctcct catccatgat gcatccacca gggccactgg tatcccagcc   180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct   240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag tatgataact ggctctcctt cggccagggg   300
acacgactgg agattaaac                                                319
 
<210>13
<211>120
<212>PRT
<213>人类
 
<400>13
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Glu Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ala Met Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Asp
            20                  25                  30
Ala Phe Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Gly Ile Ile Pro Val Phe Gln Thr Ala Asn Tyr Gly Pro Asn Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Val Tyr Thr Thr Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Glu Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Gly Asp Gly Tyr Asn Tyr Tyr Phe Pro Leu Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
 
<210>14
<211>361
<212>DNA
<213>人类
 
<400>14
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgaa gtgaaggagc ctgggtccgc gatgaaggtc    60
tcctgcaagg cctctggagg caccttcagt agtgatgcct tctgctgggt gcgacaggcc   120
cctggacgag ggcttgagtg gatgggaggg atcatccctg tctttcaaac tgcaaactac   180
ggaccgaact tccagggcag agtcaccatt agcgcggacg tttacacgac cacgctttac   240
ctggaattga gtggcctgac atctgaggac acggccgtgt atttttgtgc gagatccggg   300
gatggctaca actactactt tcccctctgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca   360
g                                                                   361
 
<210>15
<211>107
<212>PRT
<213>人类
 
<400>15
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Gly Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Gly Pro Trp
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Glu Ser Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Ser Arg Ala Ser Ile Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Thr Gly Thr Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Asn Ala Tyr Trp Gly
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Asn
            100                 105
 
<210>16
<211>321
<212>DNA
<213>人类
 
<400>16
gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctggat cagtaggaga cagagtcacc    60
atcacttgcc gggccagtca gaatattggt ccctggttgg cctggtacca acaagaatca   120
gggaaagccc ctaagctcct gatctctagg gcgtctattt tagaaagtgg ggtcccatca   180
agattcagcg gcactggaac tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct   240
gatgattttg caacttatta ctgccaacac tataatgctt attgggggac gttcggccaa   300
gggaccaagg tggaaatcaa c                                             321
 
<210>17
<211>8
<212>PRT
<213>人类
 
<400>17
Gly Gly Thr Phe Ser Ser Asp Ala
1               5
 
<210>18
<211>8
<212>PRT
<213>人类
 
<400>18
Ile Ile Pro Val Phe Gln Thr Ala
1               5
 
<210>19
<211>13
<212>PRT
<213>人类
 
<400>19
Ala Arg Ser Gly Asp Gly Tyr Asn Tyr Tyr Phe Pro Leu
1               5                   10
 
<210>20
<211>6
<212>PRT
<213>人类
 
<400>20
Gln Asn Ile Gly Pro Trp
1               5
 
<210>21
<211>3
<212>PRT
<213>人类
 
<400>21
Arg Ala Ser
1
 
<210>22
<211>9
<212>PRT
<213>人类
 
<400>22
Gln His Tyr Asn Ala Tyr Trp Gly Thr
1               5
 
<210>23
<211>10
<212>PRT
<213>人类
 
<400>23
Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly Thr Tyr Tyr
1               5
 
<210>24
<211>7
<212>PRT
<213>人类
 
<400>24
Ile Tyr His Ser Gly Ser Ala
1               5
 
<210>25
<211>17
<212>PRT
<213>人类
 
<400>25
Ala Arg Ala Glu Asn Leu Leu Ser Pro Tyr Leu Ala Glu Gly Phe Asp
1               5                   10                  15
Pro
 
<210>26
<211>8
<212>PRT
<213>人类
 
<400>26
Thr Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala
1               5
 
<210>27
<211>3
<212>PRT
<213>人类
 
<400>27
Ser Asn Asn
1
 
<210>28
<211>12
<212>PRT
<213>人类
 
<400>28
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly Ser Trp Val
1               5                   10
 
<210>29
<211>8
<212>PRT
<213>人类
 
<400>29
Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Arg Trp
1               5
 
<210>30
<211>8
<212>PRT
<213>人类
 
<400>30
Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Asp Val
1               5
 
<210>31
<211>18
<212>PRT
<213>人类
 
<400>31
Ala Arg Leu Gly Gly Asn Lys Asp Tyr Gly Asp Tyr Leu Trp Tyr Phe
1               5                   10                  15
Asp Leu
 
<210>32
<211>6
<212>PRT
<213>人类
 
<400>32
Gln Ser Val Asn Arg Arg
1               5
 
<210>33
<211>3
<212>PRT
<213>人类
 
<400>33
Asp Ala Ser
1
 
<210>34
<211>8
<212>PRT
<213>人类
 
<400>34
Gln Gln Tyr Asp Asn Trp Leu Ser
1               5
 
<210>35
<211>8
<212>PRT
<213>人类
 
<400>35
Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr Gly
1               5
 
<210>36
<211>8
<212>PRT
<213>人类
 
<400>36
Ile Ile Pro Leu Phe Gly Thr Ala
1               5
 
<210>37
<211>22
<212>PRT
<213>人类
 
<400>37
Ala Arg Asp Val His Asn Tyr Asp Phe Leu Thr Gly Tyr Pro Leu His
1               5                   10                  15
Leu Tyr Gly Met Asp Val
            20
 
<210>38
<211>6
<212>PRT
<213>人类
 
<400>38
Gln Ser Ile Ser Thr Tyr
1               5
 
<210>39
<211>3
<212>PRT
<213>人类
 
<400>39
Val Ala Ser
1
 
<210>40
<211>9
<212>PRT
<213>人类
 
<400>40
Gln Gln Thr Tyr Ser Ser Pro Pro Thr
1               5
 
<210>41
<211>388
<212>DNA
<213>人类
 
<400>41
caggtgcaac tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc    60
atctgcgctg tctctggtgc ctccataagt agttcttact ggagctggat tcggcagccc   120
ccagggaagg gactggagtg gattggatat atctattaca gtggggtcac caaatacaac   180
ccctccctca agagtcgagt caccctttct gtggacacgt ccaagaacca cttctccctg   240
aagctgagct atgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag aaatcttccg   300
gatattgcgg tggtgactgc tgttcaggat gcgactccgg tctggttcga cccctggggc   360
ccgggcaccc tggtctccgt ctcctcag                                      388
 
<210>42
<211>129
<212>PRT
<213>人类
 
<400>42
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Ile Cys Ala Val Ser Gly Ala Ser Ile Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Val Thr Lys Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
    50                  55                  60
Ser Arg Val Thr Leu Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn His Phe Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Ser Tyr Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Asn Leu Pro Asp Ile Ala Val Val Thr Ala Val Gln Asp Ala Thr
            100                 105                 110
Pro Val Trp Phe Asp Pro Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Ser Val Ser
        115                 120                 125
Ser
 
<210>43
<211>325
<212>DNA
<213>人类
 
<400>43
gacatccagt tgacccagtc tccatcatcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc    60
atcacttgcc gggcaagtca gggcattatc acgtatttaa attggtatca gcagaaacca   120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgcg acatacagtt tgcaaaatgg ggtcccatcg   180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct   240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta gcctcatgtt cacttttggc   300
caggggacca agctggacat caaac                                         325
 
<210>44
<211>108
<212>PRT
<213>人类
 
<400>44
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ile Thr Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Thr Tyr Ser Leu Gln Asn Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Leu Met
                85                  90                  95
Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Asp Ile Lys
            100                 105
 
<210>45
<211>8
<212>PRT
<213>人类
 
<400>45
Gly Ala Ser Ile Ser Ser Ser Tyr
1               5
 
<210>46
<211>7
<212>PRT
<213>人类
 
<400>46
Ile Tyr Tyr Ser Gly Val Thr
1               5
 
<210>47
<211>23
<212>PRT
<213>人类
 
<400>47
Ala Arg Asn Leu Pro Asp Ile Ala Val Val Thr Ala Val Gln Asp Ala
1               5                   10                  15
Thr Pro Val Trp Phe Asp Pro
            20
 
<210>48
<211>6
<212>PRT
<213>人类
 
<400>48
Gln Gly Ile Ile Thr Tyr
1               5
 
<210>49
<211>3
<212>PRT
<213>人类
 
<400>49
Ala Thr Tyr
1
 
<210>50
<211>10
<212>PRT
<213>人类
 
<400>50
Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Leu Met Phe Thr
1               5                   10
 
<210>51
<211>382
<212>DNA
<213>人类
 
<400>51
tggtggcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc    60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgata tcagctgggt gcgacaggcc   120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctatggcac agcaaactac   180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatc accgcggacg aatccacgag cacagcctac   240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgttt attactgtgc gagagcaggt   300
ggtgatagta gtggttatta tggtgccttg gggcggttct tccagcactg gggccagggc   360
accctggtca ccgtctcctc ag                                            382
 
<210>52
<211>127
<212>PRT
<213>人类
 
<400>52
Trp Trp Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Tyr Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ala Gly Gly Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Gly Ala Leu Gly Arg
            100                 105                 110
Phe Phe Gln His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
 
<210>53
<211>322
<212>DNA
<213>人类
 
<400>53
gtcatctgga tgacccagtc tccatcttta ctctctgcat ctacaggaga cagagtcacc    60
atcagttgtc ggatgagtca gggcattagc agttatttag cctggtatca gcaaaaacca   120
gggaaagccc ctgagctcct gatccatact gcatacactt tgaaaagtgg ggtcccatca   180
aggttcagtg gcagtggatc tgggaaagat ttcactctca ccatcagtgg cctgcagtct   240
gaagattttg caacttatta ctgtcaacag tattatagtt tcccgtacac ttttggccag   300
gggaccaagg tggagatcaa ac                                            322
 
<210>54
<211>107
<212>PRT
<213>人类
 
<400>54
Val Ile Trp Met Thr Gln Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala Ser Thr Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Met Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Leu Leu Ile
        35                  40                  45
His Thr Ala Tyr Thr Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Lys Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Phe Pro Tyr
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
 
<210>55
<211>8
<212>PRT
<213>人类
 
<400>55
Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Asp
1               5
 
<210>56
<211>8
<212>PRT
<213>人类
 
<400>56
Ile Ile Pro Ile Tyr Gly Thr Ala
1               5
 
<210>57
<211>20
<212>PRT
<213>人类
 
<400>57
Ala Arg Ala Gly Gly Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Gly Ala Leu Gly Arg
1               5                   10                  15
Phe Phe Gln His
            20
 
<210>58
<211>6
<212>PRT
<213>人类
 
<400>58
Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
1               5
 
<210>59
<211>3
<212>PRT
<213>人类
 
<400>59
Thr Ala Tyr
1
 
<210>60
<211>9
<212>PRT
<213>人类
 
<400>60
Gln Gln Tyr Tyr Ser Phe Pro Tyr Thr
1               5
 
<210>61
<211>370
<212>DNA
<213>人类
 
<400>61
cagtttcaac tggtgcagtc tggacctgag gtgaagaagc ctgggacctc agtgaaggtc    60
tcctgcaagg cctctggcta cacttccacc acctacggga tcagctgggt gcgacaggtc   120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcaaccctt acaacggaaa cccacattat   180
ggacagaagt tccagggcag agtcaccttg accagagaca catccacaaa tactgcctac   240
ctggaaatat tgagcctcag atctgacgac acggccgtct attactgtgc gagagatggg   300
tggggccagc aactggttcc ctattacttt gactactggg gccagggaac cctggtcacc   360
gtctcctcag                                                          370
 
<210>62
<211>123
<212>PRT
<213>人类
 
<400>62
Gln Phe Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Ser Thr Thr Tyr
            20                  25                  30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Trp Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asn Pro His Tyr Gly Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Glu Ile Leu Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Gly Trp Gly Gln Gln Leu Val Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr
            100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
 
<210>63
<211>337
<212>DNA
<213>人类
 
<400>63
gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc    60
atctcctgca gggctagtca gagcctcctg catagtaatg gatacaacta tttggattgg   120
tacctgcaga agccagggca gtctccacag ctcctgattc agttgggttc tactcgggcc   180
tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagatttcac actcgaaatc   240
agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaagctct acaacttccc   300
ctcgccttcg gccaagggac acgactggag attaaac                            337
 
<210>64
<211>112
<212>PRT
<213>人类
 
<400>64
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu IIe Gln Leu Gly Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Glu Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
                85                  90                  95
Leu Gln Leu Pro Leu Ala Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
 
<210>65
<211>8
<212>PRT
<213>人类
 
<400>65
Gly Tyr Thr Ser Thr Thr Tyr Gly
1               5
 
<210>66
<211>8
<212>PRT
<213>人类
 
<400>66
Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asn Pro
1               5
 
<210>67
<211>16
<212>PRT
<213>人类
 
<400>67
Ala Arg Asp Gly Trp Gly Gln Gln Leu Val Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1               5                   10                  15
 
<210>68
<211>11
<212>PRT
<213>人类
 
<400>68
Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr
1               5                   10
 
<210>69
<211>3
<212>PRT
<213>人类
 
<400>69
Leu Gly Ser
1
 
<210>70
<211>9
<212>PRT
<213>人类
 
<400>70
Met Gln Ala Leu Gln Leu Pro Leu Ala
1               5
 
<210>71
<211>376
<212>DNA
<213>人类
 
<400>71
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc    60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agttatggca tgcactgggt ccgccaggct   120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtg atatggtatg atggagataa taaatactat   180
ggagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cactctgttt   240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt actactgtgc gaaagacacg   300
gccgaccacg gtgactacgt agacctcggg ttttttgacg cctggggcca gggaaccctg   360
gtcaccgtct cctcag                                                   376
 
<210>72
<211>125
<212>PRT
<213>人类
 
<400>72
G1n Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20               25               30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35               40               45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Asp Asn Lys Tyr Tyr Gly Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Lys Asp Thr Ala Asp His Gly Asp Tyr Val Asp Leu Gly Phe Phe
            100                 105                 110
Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
 
<210>73
<211>322
<212>DNA
<213>人类
 
<400>73
gacatccaga tgacccagtc tccatcttct gtgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc    60
atcacttgtc gggcgagtca ggatgtgagc acctggttag cctggtatca gctgaaacca   120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca   180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ctgtcagcag cctgcagcct   240
gaagattttg caacttacta ttgtcaacag gctaacagtt tcccattcac tttcggccct   300
gggaccaaag tggatatcaa ac                                            322
 
<210>74
<211>107
<212>PRT
<213>人类
 
<400>74
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Trp
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Leu Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Val Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Phe
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
            100                 105
 
<210>75
<211>8
<212>PRT
<213>人类
 
<400>75
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly
1               5
 
<210>76
<211>8
<212>PRT
<213>人类
 
<400>76
Ile Trp Tyr Asp Gly Asp Asn Lys
1               5
 
<210>77
<211>18
<212>PRT
<213>人类
 
<400>77
Ala Lys Asp Thr Ala Asp His Gly Asp Tyr Val Asp Leu Gly Phe Phe
1               5                   10                  15
Asp Ala
 
<210>78
<211>6
<212>PRT
<213>人类
 
<400>78
Gln Asp Val Ser Thr Trp
1               5
 
<210>79
<211>3
<212>PRT
<213>人类
 
<400>79
Ala Ala Ser
1
 
<210>80
<211>9
<212>PRT
<213>人类
 
<400>80
Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Phe Thr
1               5
 
<210>81
<211>388
<212>DNA
<213>人类
 
<400>81
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctgggaggtc cctgagactc    60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt gacttttgga tgagctgggt ccgccaggct   120
ccagggaagg ggctggagtg ggtggccaac atagaccaag atggaaatga gagattctat   180
gcggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat   240
ctgcaaatga ccagcctgag agccgacgac acggccgttt attactgtgc gagagatggg   300
agagagggat atttctatgg ttcggggagt ttttataacc ttaagggtct caattggggc   360
cagggaaccc tgctcaccgt ctcctcag                                      388
 
<210>82
<211>129
<212>PRT
<213>人类
 
<400>82
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe
            20                  25                  30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Asn Ile Asp Gln Asp Gly Asn Glu Arg Phe Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Gly Arg Glu Gly Tyr Phe Tyr Gly Ser Gly Ser Phe Tyr
            100                 105                 110
Asn Leu Lys Gly Leu Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Leu Thr Val Ser
        115                 120                 125
Ser
 
<210>83
<211>331
<212>DNA
<213>人类
 
<400>83
cagtctgtgt tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagag ggtcaccatc    60
tcctgctctg gaaccagctc caacattggg aaaaattatg tctcctggta ccagcagctc   120
ccaggagcag cccccaaact cctcatttat gacaatgata agcgaccctc agggattcct   180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tgggcatcac cggactccag   240
actggggacg aggccgatta ttattgcggc acatgggata gcagtctgag tgttgggatg   300
ttcggcggag ggaccaggct gaccgtccta g                                  331
 
<210>84
<211>110
<212>PRT
<213>人类
 
<400>84
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Thr Ser Ser Asn Ile Gly Lys Asn
            20                  25                  30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Ala Ala Pro Lys Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Asp Asn Asp Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln
65                  70                  75                  80
Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu
                85                  90                  95
Ser Val Gly Met Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu
            100                 105                 110
 
<210>85
<211>8
<212>PRT
<213>人类
 
<400>85
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe Trp
1               5
 
<210>86
<211>8
<212>PRT
<213>人类
 
<400>86
Ile Asp Gln Asp Gly Asn Glu Arg
1               5
 
<210>87
<211>22
<212>PRT
<213>人类
 
<400>87
Ala Arg Asp Gly Arg Glu Gly Tyr Phe Tyr Gly Ser Gly Ser Phe Tyr
1               5                   10                  15
Asn Leu Lys Gly Leu Asn
            20
 
<210>88
<211>8
<212>PRT
<213>人类
 
<400>88
Ser Ser Asn Ile Gly Lys Asn Tyr
1               5
 
<210>89
<211>3
<212>PRT
<213>人类
 
<400>89
Asp Asn Asp
1
 
<210>90
<211>11
<212>PRT
<213>人类
 
<400>90
Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Ser Val Gly Met
1               5                   10
 
<210>91
<211>376
<212>DNA
<213>人类
 
<400>91
gaggtgcaac tggtgcagtc tggagcagag ctgaaaatgc ccggggagtc tctgaagatc    60
tcctgtaagg cttctggata cacctttacg aattactgga tcggctgggt gcgccagacg   120
cccgggaaag gcctggaatg gatggggatc atctttcctc ctgactctca aacttcatac   180
agtccgtcct tccaaggcca ggtcaccttc tcagtcgaca actccattag tgttgcctac   240
atacagtgga gtagcctgaa ggcctcggac actgccatat attactgtgc gagatcagga   300
atttttgatt ggtccgcccc ccttgttgaa gcttttgata tttggggcca agggacagtg   360
gtcaccgtct cttcag                                                   376
 
<210>92
<211>125
<212>PRT
<213>人类
 
<400>92
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu Lys Met Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ile Ile Phe Pro Pro Asp Ser Gln Thr Ser Tyr Ser Pro Ser Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Gln Val Thr Phe Ser Val Asp Asn Ser Ile Ser Val Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Ile Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Gly Ile Phe Asp Trp Ser Ala Pro Leu Val Glu Ala Phe
            100                 105                 110
Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Val Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
 
<210>93
<211>322
<212>DNA
<213>人类
 
<400>93
gacatccagt tgacccagtc tccatccttc ctgtctgcat ctgtgggaga cggagtcacc    60
atcacttgcc gggccagtca ggacatttac atttatttag cctggtatca gcaaaaaccg   120
gggaaagccc ctaaactcct gatctatgct gcctccactc tgcagggtgg ggtcccatca   180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcaacaa cctgcagcct   240
gaggattttg caacttattt ctgtcagcaa cttaatggct accccctcac tttcggcgga   300
gggaccaagg tggagatcaa ac                                            322
 
<210>94
<211>107
<212>PRT
<213>人类
 
<400>94
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Gly Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Tyr Ile Tyr
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Gly Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Asn Asn Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Leu Asn Gly Tyr Pro Leu
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
 
<210>95
<211>8
<212>PRT
<213>人类
 
<400>95
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Trp
1               5
 
<210>96
<211>8
<212>PRT
<213>人类
 
<400>96
Ile Phe Pro Pro Asp Ser Gln Thr
1               5
 
<210>97
<211>18
<212>PRT
<213>人类
 
<400>97
Ala Arg Ser Gly Ile Phe Asp Trp Ser Ala Pro Leu Val Glu Ala Phe
1               5                   10                  15
Asp Ile
 
<210>98
<211>6
<212>PRT
<213>人类
 
<400>98
Gln Asp Ile Tyr Ile Tyr
1               5
 
<210>99
<211>3
<212>PRT
<213>人类
 
<400>99
Ala Ala Ser
1
 
<210>100
<211>9
<212>PRT
<213>人类
 
<400>100
Gln Gln Leu Asn Gly Tyr Pro Leu Thr
1               5
 
<210>101
<211>376
<212>DNA
<213>人类
 
<400>101
gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc    60
tcctgtaagg gttctggata cagttttagc gattactgga tcggctgggt gcgccagatg   120
cccggggaag gcctggaatg gatggggatc atctatcctg ctagttctga aatcagatac   180
agcccgtcct tccagggcct ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcaa caccgcctcc   240
ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatct attactgcgc gagacatgcc   300
tcttgtagtg ctcgtagctg ttattggggg cccgttgact actggggcca gggaaccctg   360
gtcaccgtct cctcag                                                   376
 
<210>102
<211>125
<212>PRT
<213>人类
 
<400>102
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Asp Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ile Ile Tyr Pro Ala Ser Ser Glu Ile Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Leu Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Asn Thr Ala Ser
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg His Ala Ser Cys Ser Ala Arg Ser Cys Tyr Trp Gly Pro Val
            100                 105                 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
 
<210>103
<211>337
<212>DNA
<213>人类
 
<400>103
gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtct cccctggaga gccggcctcc    60
atctcctgca ggtctagtca gagcctccta catggtaatg gatacaacta tttggattgg   120
tacctgcaga agccagggca gtctccacgc ctcctgatct atttgggttc taatcgggcc   180
tccggggtcc ctgataggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc   240
agcagagtgg aggctgaaga tgttggggtt tattactgca tgcaagctct acaaactccg   300
ctcactttcg gcggagggac caaggtggag atcaaac                            337
 
<210>104
<211>112
<212>PRT
<213>人类
 
<400>104
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Gly
            20                  25                  30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
                85                  90                  95
Leu Gln Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105                 110
 
<210>105
<211>8
<212>PRT
<213>人类
 
<400>105
Gly Tyr Ser Phe Ser Asp Tyr Trp
1               5
 
<210>106
<211>8
<212>PRT
<213>人类
 
<400>106
Ile Tyr Pro Ala Ser Ser Glu Ile
1               5
 
<210>107
<211>18
<212>PRT
<213>人类
 
<400>107
Ala Arg His Ala Ser Cys Ser Ala Arg Ser Cys Tyr Trp Gly Pro Val
1               5                   10                  15
Asp Tyr
 
<210>108
<211>11
<212>PRT
<213>人类
 
<400>108
Gln Ser Leu Leu His Gly Asn Gly Tyr Asn Tyr
1               5                   10
 
<210>109
<211>3
<212>PRT
<213>人类
 
<400>109
Leu Gly Ser
1
 
<210>110
<211>9
<212>PRT
<213>人类
 
<400>110
Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Leu Thr
1               5

Claims (29)

1.一种人类单克隆抗体，其可中和甲型流感病毒H5N1株系。
2.如权利要求1所述的抗体，其结合甲型流感病毒H5N1株系的病毒体中存在的血凝素。
3.如权利要求2所述的抗体，其具有包含SEQ ID NO：13的重链和包含SEQ ID NO：15的轻链。
4.如权利要求2所述的抗体，其具有包含SEQ ID NO：5的重链和包含SEQ ID NO：7的轻链。
5.如权利要求2所述的抗体，其具有包含SEQ ID NO：9的重链和包含SEQ ID NO：11的轻链。
6.如权利要求2所述的抗体，其具有包含SEQ ID NO：1的重链和包含SEQ ID NO：3的轻链。
7.如权利要求2所述的抗体，其具有包含SEQ ID NO：42的重链和包含SEQ ID NO：44的轻链。
8.如权利要求2所述的抗体，其具有包含SEQ ID NO：52的重链和包含SEQ ID NO：54的轻链。
9.如权利要求2所述的抗体，其具有包含SEQ ID NO：62的重链和包含SEQ ID NO：64的轻链。
10.如权利要求2所述的抗体，其具有包含SEQ ID NO：72的重链和包含SEQ ID NO：74的轻链。
11.如权利要求2所述的抗体，其具有包含SEQ ID NO：82的重链和包含SEQ ID NO：84的轻链。
12.如权利要求2所述的抗体，其具有包含SEQ ID NO：92的重链和包含SEQ ID NO：94的轻链。
13.如权利要求2所述的抗体，其具有包含SEQ ID NO：102的重链和包含SEQ ID NO：104的轻链。
14.一种抗体，其具有选自由FLA5.10、FLD21.140、FLA3.14、FLD20.19、FLD84、FLD93、FLD122、FLD127、FLD129、FLD132和FLD194组成的组中的抗体的一个或多个CDR(SEQ ID NO：17-40、45-50、55-60、65-70、75-80、85-90、95-100、105-110)。
15.一种抗体，其与选自由FLA5.10、FLD21.140、FLA3.14、FLD20.19、FLD84、FLD93、FLD122、FLD127、FLD129、FLD132和FLD194组成的组中的抗体结合相同的表位。
16.一种抗体，其可与选自由FLA5.10、FLD21.140、FLA3.14、FLD20.19、FLD84、FLD93、FLD122、FLD127、FLD129、FLD132和FLD194组成的组中的抗体竞争结合H5血凝素蛋白。
17.一种抗体，其可中和H5亚型进化枝2中的甲型流感病毒株系。
18.一种抗体，其可中和甲型流感病毒H5N1株系，其中所述抗体具有λ轻链。
19.一种IgG抗体，其可中和甲型流感病毒H5N1株系，条件是所述抗体不具有IgG1重链。
20.如权利要求14至19的任一项所述的抗体，其是人类抗体。
21.如前述权利要求的任一项所述的抗体，其中所述抗体可以100μg/ml或更低例如1μg/ml或更低的浓度中和100TCID50的H5N1甲型流感病毒。
22.如权利要求21所述的抗体，其中所述抗体可以100μg/ml或更低例如1μg/ml或更低的浓度中和100TCID50的进化枝1中的H5N1甲型流感病毒株系和进化枝2中的H5N1甲型流感病毒株系二者。
23.如权利要求21或权利要求22所述的抗体，其中所述抗体可以100ng/ml或更低的浓度进行中和。
24.一种核酸，其编码前述权利要求的任一项所述的抗体的重链和/或轻链。
25.根据权利要求1至23的任一项所述的第一抗体和根据权利要求1至23的任一项所述的第二抗体的组合，其中所述第一抗体和第二抗体结合甲型流感病毒H5N1株系的血凝素上的不同表位。
26.一种治疗患者的方法，所述方法包括向需要其的患者施用权利要求1至23的任一项所述的抗体或权利要求25所述的组合。
27.第一抗体和第二抗体，其同时分开施用或顺序施用，其中所述第一抗体是根据权利要求1至23的任一项所述的抗体，且所述第二抗体是根据权利要求1至23的任一项所述的抗体，且其中所述第一抗体和第二抗体不同。
28.如权利要求27所述的第一抗体和第二抗体，它们共同可中和H5N1甲型流感病毒的进化枝1株系和进化枝2株系。
29.如权利要求28所述的第一抗体和第二抗体，其结合相同H5血凝素上的不同表位。
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