CN106795223A

CN106795223A - 针对Fcγ受体IIB及Fcε受体的新型抗体

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Publication number: CN106795223A
Application number: CN201580055566.7A
Authority: CN
Inventors: A·卡尔; C·德恩伯格; P·松德尔曼; M·米勒; N·里特; T·波尔
Original assignee: Suppremol GmbH
Current assignee: Suppremol GmbH
Priority date: 2014-08-13
Filing date: 2015-08-13
Publication date: 2017-05-31
Anticipated expiration: 2035-08-13
Also published as: SG11201701028SA; TWI713464B; AU2015303142B2; ES2802176T3; US20170226208A1; CN106795223B; TW201629099A; EA035269B1; EP3180358B1; BR112017002755B1; MY180940A; CA2957850A1; JP2017529832A; BR112017002755A2; CO2017001384A2; AU2015303142A1; CL2017000360A1; EP3180358A1; AR101555A1; US10730946B2

Abstract

本文公开了以第一结合结构域结合Fcε受体(FcεR)和以第二结合结构域结合Fcγ受体IIB(FcγRIIB)的识别分子，以及这种识别分子的用途。

Description

针对Fcγ受体IIB及Fcε受体的新型抗体

背景技术

抗体结合抗原并通过阻止该抗原与其内源靶标(如，受体或配体)结合或通过诱导导致抗原移除的效应物响应来中和该抗原。为了有效移除和/或破坏身体外来的抗原，抗体应当表现出对其抗原的高亲和性和有效的效应物功能。具有多特异性的抗体(比如，例如双特异性抗体)对介导多种抗原的互补或协同响应是有用的。

抗体效应物功能由抗体Fc区介导。效应物功能分为两类：(1)在抗体结合抗原之后运作的效应物功能(这些功能涉及补体级联或Fc受体(FcR)-承载细胞的参与)；和(2)独立于抗原结合运作的效应物功能(这些功能赋予抗体在循环中的持久性以及其通过胞吞转运作用而跨细胞屏障转移的能力)。由于Fc受体通过结合受体同源抗体的Fc区来介导抗体效应物功能，因此由FcR对免疫球蛋白同种型的特异性来定义FcR：对IgG抗体特异性的Fc受体是指FcγR；对IgE抗体特异性的Fc受体是FcεR；对IgA抗体特异性的Fc受体是FcαR等等。

已经鉴定了FcγR的三个子类：FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。FcγRIIB的特征在于在胞质结构域中存在ITIM基序(共有序列：V/I-X-Y-X₂-V/L,Isakov(1997),Immunol Res.16,85-100)，其在Ig-聚集体或IC结合和与携带ITAM的活化Fcγ受体共连接后被激酶Lyn磷酸化。磷酸化的ITIM吸引多磷酸肌醇5’-磷酸酶(SHIP)的SH2-结构域，SHIP转而水解磷酸肌醇信使，所述磷酸肌醇信使由于含ITAM的FcγR-介导的酪氨酸激酶活化而释放，因而阻止细胞内Ca²⁺的内流。FcγRIIB交联抑制对FcγR连接的活化响应，其继而抑制B细胞活化、增殖和抗体分泌。

在肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面以及人的嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和血小板上发现了Fcε受体(FcεR)。有两种类型的Fcε受体，FcεRI(I型Fcε受体)，其是一种高亲和性IgE受体，和FcεRII(II型Fcε受体)，也称为CD23，其是一种低亲和性IgE受体。IgE可以上调两种类型的Fcε受体的表达。

免疫球蛋白E(IgE)是一类仅在哺乳动物中发现的抗体(或免疫球蛋白(Ig)“同种型”)。IgE以由两个重链(ε链)和两个轻链组成的单体存在，其中所述ε链包含4个Ig-样恒定结构域(Cε1-Cε4)。IgE还在I型超敏反应中起重要作用(Gould H等.(2003),Annu.Rev.Immunol.21:579–628)，其表现出多种过敏性疾病，例如过敏性哮喘、大多数类型的鼻窦炎、过敏性鼻炎、食物变态反应(allergy)和一些类型的慢性荨麻疹和特应性皮炎。IgE还在过敏病症(例如对某些药物、蜂蜇和用于特异性脱敏免疫治疗的抗原制剂的过敏反应)中扮演重要角色。

IgE通过结合在肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面上发现的FcεR来引发IgE介导的过敏响应。抗原与已经由肥大细胞上的FcεRI结合的IgE的结合导致结合的IgE的交联及下面的FcεRI的聚集，从而导致介质脱粒和从细胞释放。嗜碱性粒细胞，在其表面IgE被抗原交联后，释放如白细胞介素-4(IL-4)和白细胞介素-13(IL-13)的2型细胞因子和其它炎性介质。低亲和性受体(FcεRII)总是在B细胞上表达，但其表达可以通过IL-4在巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、血小板和一些T细胞的表面上诱导。

肥大细胞和嗜碱性粒细胞是IgE依赖性过敏反应和许多其它急性或慢性炎症过程中的重要免疫调节细胞和中枢效应细胞。这些细胞类型具有IgG受体和IgE受体。在过敏性效应细胞如肥大细胞和嗜碱性粒细胞上IgE的高亲和性受体(FcεRI)的活化通过基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)诱导多种阳性信号，从而导致过敏性炎症反应的快速表现(manifestation)。作为平衡，IgG受体FcγRIIB的共聚集通过基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)介导抑制性信号。

Fc受体表达和信号转导的阳性和阴性调节的进展阐明了Fc受体在免疫系统中的作用，表明它们是双功能、抑制性和活化性结构的。基于这些发现，已经开发了新的治疗策略，例如使用同时激活FcεRI和FcγRIIB的嵌合融合蛋白。这些新方法利用了Fc受体的二价特性，并为调节过敏性免疫反应的创新策略铺平了道路。这种嵌合融合蛋白的一个实例公开在WO 2002/088317中。

然而，尽管在现有技术中甚至更多这样的嵌合融合蛋白是已知的，还参见WO2006/028956，但是仍然高度期望提供改进的嵌合融合蛋白，其发挥至少两种功能—一种是结合Fcε受体和第二种是结合Fcγ受体IIB，由此共聚集这两种受体。

发明内容

通过提供本文下文描述的、在权利要求中进行表征且通过随附的实施例和附图进行说明的识别分子，本发明满足了这一需求。

已知IgE受体与嗜碱性粒细胞或肥大细胞上的IgG受体(FcγRIIb)的聚集抑制过敏原诱导的细胞脱粒(Daeron(1997),Int.Arch.Allergy Immunol.113,138-141)，本发明人提供识别分子，其不仅交联或共聚集这两种受体以抑制肥大细胞和嗜碱性粒细胞的IgE介导的活化，而且还增强FcγRIIB的负调节功能以改善与嗜碱性粒细胞和/或肥大细胞相关的疾病(比如过敏性疾病)的治疗。如上所述，对过敏性效应细胞(如肥大细胞和嗜碱性粒细胞)上的IgE高亲和性的受体(FcεRI)的活化导致过敏性炎症反应的快速表现。作为抗衡，IgG受体FcγRIIB的共聚集通过基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)介导抑制性信号。因此，不受理论束缚，本发明人假定增强/强化已知由FcγRIIB和Fcε受体的共聚集产生的FcγRIIB的ITIM磷酸化(参见Zhu等，(2002),Nat.Med.8(5),518-521)可能在抗衡或甚至克服Fcε受体在IgE结合时的活化功能有益，其导致预先形成的介体的释放和之后起作用的白三烯和趋化因子的合成，而这些都有助于如过敏性疾病。

出于这一目的，令人惊讶的是，本发明人观察到本发明提供的识别分子，特别是抗体显著地增加了FcγRIIB的ITIM磷酸化，据此推测增强了已经通过共聚集FcγRIIB和Fcε受体实现的抑制性信号，使得其理想地克服了由结合IgE时Fcε受体的活化触发的激活信号。因此，识别分子，特别是本文公开的抗体提供两个有利的功能—它们交联导致ITIM磷酸化的FcγRIIB和FcεR，并由此抑制FcεR信号传导；并且它们通过其与所述受体的结合增强了FcγRIIB的ITIM磷酸化，这再次抑制了嗜碱性粒细胞和肥大细胞中的Fcε受体信号传导。因此，本发明的识别分子，特别是抗体对于大量有助于与肥大细胞和/或嗜碱性粒细胞相关的疾病的细胞中FcγRIIB介导的信号传导的抑制性作用发挥两倍的效果。为了在嗜碱性粒细胞和肥大细胞中利用这种FcγRIIB介导的抑制性信号转导，本发明人提供了本发明的识别分子，特别是抗体，与例如本领域已知的针对FcγRIIB的抗体相比，令人惊讶地显示出无法预期的对ITIM磷酸化的更强的效果。这种更强的效果是有益的，因为其有助于肥大细胞和/或嗜碱性粒细胞中的抑制性信号传导，从而抑制IgE介导的肥大细胞和嗜碱性粒细胞的活化，这两种细胞在如过敏性疾病的发作和表现中起重要作用。

从图30中可以看出，本文公开的抗FcγIIB受体-IgE抗体确实能够将被花粉(55.1％)活化后的活化的嗜酸性粒细胞的数量减少至对应于未处理的嗜酸性粒细胞(10.6％相对于未处理的嗜酸性粒细胞的9.5％)的水平。这显示了一旦这些细胞已经被过敏原通过IgE与该过敏原的结合和以其Fc结构域与Fcε受体的结合活化，这种抗体在涉及如过敏性疾病的细胞的负调节中的效力。嗜酸性粒细胞以及肥大细胞和/或嗜碱性粒细胞参与过敏性疾病。因此，本发明人假设增强/强化已知由FcγRIIB和Fcε受体的共聚集产生的FcγRIIB的ITIM磷酸化(参见Zhu等，(2002),Nat.Med.8(5),518-521)可能在抗衡或甚至克服Fcε受体在IgE结合时的活化性功能是有益的，而这在对抗例如过敏性疾病方面似乎确实是有希望的。

从现有技术的结合FcγRIIB的识别分子，特别是例如本文公开的抗体的识别分子，既无法预料也无法预见多肽的有利性质，更不必说对成功提供它们的合理预期，特别是如本文所表征的抗体的CDR或可变重链和/或轻链。除了这一改善的性质，本文所述的识别分子还有利地对人FcγRIIB具有高特异性和/或是非封闭性的，即它们通过其可变区与Fc受体的结合不干扰免疫复合物(IC)或聚集的IgG与细胞的结合。

有利地，如本文公开的抗体的识别分子以“顺式(cis)”结合表达Fcε受体(FcεR)和Fcγ受体IIB(FcγRIIB)的细胞，即，所述识别分子结合相同细胞上的FcεR和FcγRIIB，其中这种细胞表达FcεR和FcγRIIB。除了没有抗原加入到肝素化的全血中，识别分子的这一性质可以根据实施例5中描述的嗜碱性粒细胞活化试验容易地测试。简言之，使肝素化的全血与本文公开的识别分子接触。随后，将该全血与结合全血中嗜碱性粒细胞上的分子CD63的检测抗体一起温育，其中所述检测抗体的特征在于可检测标记(如荧光标记)并且通过例如FACS技术(荧光激活细胞分选术)手段测量阈值水平以上的表达CD63的细胞的数量。可基于未与所述识别分子接触的肝素化的全血(其对应于对照组)来确定阈值水平。若细胞不表达阈值水平以上的CD63，则所述识别分子优先以顺式结合，而阈值水平以上的CD63表达表明识别分子以反式(trans)结合细胞，即识别分子结合第一细胞上的FcεR和结合第二细胞上的FcγRIIB或结合第一细胞上的FcγRIIB和结合第二细胞上的FcεR。然而，如所述，在本发明的上下文中，顺式-结合的识别分子是优选的。

因此，本发明提供识别分子，其以第一结合结构域结合Fcε受体(FcεR)且以第二结合结构域结合Fcγ受体IIB(FcγRIIB)。

本发明的识别分子被认为与身体自身病原性IgE抗体竞争，以通过其Fc部分结合Fcε受体RI(FcεRI)并同时使FcεRI与FcγRIIB共交联。这种作用模式被认为阻止介质不依赖于结合的IgE的过敏原特异性从肥大细胞和/或嗜碱性粒细胞释放。本发明人已经通过例如采用来自特应性(atopic)供体(即具有响应于过敏原的超敏免疫反应的发展倾向的供体)的表达FcεRI的嗜碱性粒细胞表征了这一机制。与在所附实施例中证明的对照组相比，前述用本文所公开的识别分子处理的特应性供体的过敏原激发的嗜碱性粒细胞显示出显著降低的活化。

当将“识别分子”用于本文时，其是包含一个或多个结合结构域的多肽，其以第一结合结构域结合Fcε受体(FcεR)且以第二结合结构域结合Fcγ受体IIB(FcγRIIB)。识别分子为所述一个或多个结合结构域提供支架，使得所述结合结构域可与给定靶结构/抗原/表位结合/相互作用。例如，这种支架可由蛋白质A，特别是其Z-结构域(亲和体)；ImmE7(免疫蛋白)；BPTI/APPI(Kunitz结构域)；Ras-结合蛋白AF-6(PDZ-结构域)；灯水母毒素(charybdotoxin)(蝎毒素)；CTLA-4；Min-23(打结素(knottin))；脂质运载蛋白(anticalin)；新抑癌素蛋白(neokarzinostatin)；纤连蛋白结构域；锚蛋白共有重复结构域或硫氧还蛋白提供(Skerra,Curr.Opin.Biotechnol.18,295-304(2005)；Hosse等，Protein Sci.15,14-27(2006)；Nicaise等，ProteinSci.13,1882-1891(2004)；Nygren和Uhlen,Curr.Opin.Struc.Biol.7,463-469(1997))。优选的识别分子是抗体。

本发明的识别分子的结合结构域可通过连接子连接。所述连接子可以是肽连接子。所述连接子可包含(或由)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个氨基酸(组成)。肽连接子的优选的实例是(G₄S)_n，其中n是1至5范围内的间隔；(AP)₂；(AP)₄；(AP)_5-7。

术语“结合结构域”结合本发明表征了能够分别与其靶分子FcεR和FcγRIIB上的给定靶表位或给定靶位点特异性结合/相互作用的结构域。结合结构域可以源自结合结构域供体，比如，例如源自抗体或源自任何上述提及的支架。

当将术语“结合结构域”用于本文时，其涵盖可以主动结合靶标或可以被动地被如受体结合的结合结构域。因此，在本文公开的分子的意义上的结合结构域可以是受体(比如Fc受体)的配体。

识别分子的优选的结合结构域是Fab结构域的至少一部分。当将“Fab结构域”用于本文时，其涵盖重链和/或轻链可变区或者来自重链和/或轻链可变区的CDR和/或框架区。因此，优选地，本文所述的结合结构域包含如重链和/或轻链可变区的可变区，或者重链和/或轻链可变区的CDR和/或框架区。因此，识别分子优选包含Fab结构域作为第一和第二结合结构域，优选地包含如重链和/或轻链可变区的可变区，或者重链和/或轻链可变区的CDR和/或框架区。

另一个被称为识别分子结合结构域的是IgG或IgE抗体的恒定区(或结构域)(Fc结构域)或其部分。当将Fc结构域的“部分”用于本文时，其优选的是使得其被其同源Fc受体(如Fcε受体或FcγIIB受体)结合的长度。

因此，优选的识别分子优选包含IgG或IgE抗体的Fc结构域或其部分作为第一和第二结合结构域，该部分分别被FcγIIB受体或Fcε受体结合。

还优选地，本发明的识别分子包含与Fcε受体结合的Fab结构域作为第一结合结构域，优选地包含如重链和/或轻链可变区的可变区，或者重链和/或轻链可变区的CDR和/或框架区，和被FcγIIB受体结合的IgG的Fc结构域或其部分作为第二结合结构域。

更优选地，本发明的识别分子包含被Fcε受体结合的IgE的Fc结构域或其部分作为第一结合结构域，和被FcγIIB受体结合的Fab结构域作为第二结合结构域，优选地包含如重链和/或轻链可变区的可变区，或者重链和/或轻链可变区的CDR和/或框架区。

术语“表位”是指结合结构域与其特异性结合的抗原上的位点。“表位”为抗原性的，因此本文所述术语表位有时也指“抗原性结构”或“抗原决定簇(determinant)”。因此，所述结合结构域为“抗原相互作用位点”。所述结合/相互作用也可理解为定义“特异性识别”。本发明意义上优选的表位分别位于Fcε受体和FcγIIB受体内。优选地，这种表位位于这两种Fc受体的任一个的胞外部分。

“表位”既可由邻接氨基酸也可由通过蛋白质的三级折叠而并列的非邻接氨基酸形成。“线性表位”是其中氨基酸一级序列含有被识别表位的表位。线性表位通常包括在特定序列中的至少3个或至少4个、更通常至少5个或至少6个或至少7个、例如约8个至约10个氨基酸。

与线性表位相比，“构象表位”是这样的表位，其中构成所述表位的氨基酸一级序列不是被识别的表位的唯一定义部件(如，其中氨基酸的一级序列不一定被结合结构域识别的表位)。典型地，构象表位相对于线性表位包含数量增加的氨基酸。关于构象表位的识别，所述结合结构域识别抗原、优选肽或蛋白或其片段的三维结构。例如，当蛋白分子折叠形成三维结构时，形成构象表位的某些氨基酸和/或多肽骨架成为并列形式，从而使该抗体能够识别仅存在于三维结构中的三维表位。确定表位构象的方法包括但不限于，X-射线晶体学、二维核磁共振(2D-NMR)谱和定点自旋标记法及电子顺磁共振(EPR)光谱。

识别分子特别是本发明的抗体的结合结构域有利地分别特异性结合FcεR和FcγRIIB。就本发明而言，术语“(能够)结合”、“特异性识别”、“针对”和“与…反应”的含义是结合结构域能够特异性与表位的一个或多个，如至少两个、至少三个或至少四个氨基酸相互作用。

本文所用术语“Fcγ受体IIB”可与“FcgRIIB”或“Fcgamma受体IIB”或“Fcγ受体IIB”或“FcγRIIB”互换使用，并且同时包含膜FcγRIIB和可溶性FcγRIIB(即FcγIIB受体的细胞外部分)。所述术语还包括FcγRIIB的变体，诸如以在FcγRIIB1的胞质结构域中的19个氨基酸序列插入而彼此不同的FcγRIIB1和FcγRIIB2。所述术语涵盖的另一个变体是FcγRIIB3，其与FcγRIIB2相同但缺少假定的信号肽酶切割位点的信息。

有时候，FcγRIIB还可以指本文的“CD32B”。因此，该术语以及用于指定如上所述的Fcγ受体IIB的其他术语都可以与术语“CD32B”互换使用。Fcγ受体IIB属于蛋白质的免疫球蛋白超家族，并且可见于许多造血谱系。正如其名称所表明的，Fc受体IIB识别并结合抗体的Fc(片段，可结晶的)部分，即对应于所述抗体的两条重链的两个C-端结构域并且典型地与效应分子和细胞相互作用的片段。一种优选的FcγRIIB如SEQ ID NO.5中所示。一种优选的可溶性FcγRIIB如SEQ ID NO.12中所示。

“可溶性FcγRIIB”也称为“sFcγRIIB”。本文所用的术语“可溶性Fcγ受体IIB”和类似术语是指Fcγ受体IIB的细胞外部分。该部分可溶解于液体中。一般而言，任何FcγR类型、同种型或等位基因的可溶形式都可以通过前缀“s”进行识别，例如，sCD32或sFcγRII是指可溶性FcγRII受体。典型地，相比于膜(即膜结合的)FcγR，可溶性FcγR不包含跨膜区或胞质内尾。

优选地，本发明所公开的FcγRIIB是人起源的或是人FcγRIIB。所述术语“人起源的”以其最广义理解。通常其意味着FcγR(或其区域或片段)就氨基酸序列和/或结构而言类似于人FcγR(即在人体内发现的蛋白)或与人FcγR(即在人体发现的蛋白)相似。

或者，“人起源的”FcγRIIB可以是通过在宿主细胞内表达重组核酸而获得的重组FcγRIIB，例如Sondermann和Jacob(1999),Bioll.Chem.380(6),717-721所述的。简言之，从生物体获得目标基因并将其引入载体中，所述载体例如质粒或病毒，其随后被用于将所述基因转移到表达所述重组基因并产生重组蛋白产品的宿主细胞内。本领域技术人员易于知晓选择何种宿主细胞以便获得例如适用于药物组合物的制备的FcγRIIB。例如，在一些实施方案中，可能需要非糖基化的FcγRIIB。然后本领域技术人员可以选择缺少蛋白质糖基化所必需的酶机制的原核宿主细胞来表达所述FcγRIIB。在一个实施方案中，所述FcγRIIB可以在原核生物中表达，随后根据WO 00/32767所述进行纯化并重新折叠。

在另一个实施方案中，还可在真核表达系统中产生FcγRIIB。合适的系统包括具有用于产生细胞外蛋白的专门机构(apparatus)的真核细胞，例如B细胞。其他可用的真核表达系统包括但不限于CHO或HEK细胞。因此所述可溶性FcγRIIB是重组的、可溶的且糖基化的FcγRIIB。

本文所指的FcγRIIB进一步涵盖相比于野生型FcγR已就氨基酸序列修改或改变并且包括例如另外的糖基化位点等的FcγRIIB。然而，非糖基化形式的FcγRIIB也被设想到，并且是FcγRIIB的一个有用实施方案。

出于本发明的目的，FcεR包括FcεRI和FcεRII。本文中还使用的术语如“FcεR”或“Fcε受体”，它们都指结合IgE的恒定区或其部分的受体。因此，所有这些术语可以互换使用。

一种优选的本发明的识别分子的第一和第二结合结构域源自抗体，优选地所述第一和/或第二结构域是抗体的一部分，诸如Fab结构域、重链和/或轻链可变区，或者来自抗体的重链和/或轻链可变区的CDR和/或框架。

或者优选地，在本文公开的识别分子意义上的结合结构域可以是由Fc受体，如Fcε受体或Fcγ受体IIB结合的恒定区(恒定结构域)或其至少一部分。因此，优选的实施方案是第一和第二结合结构域均可以是抗体的恒定区或其至少一部分，如由Fc受体(如Fcε受体或Fcγ受体)结合的IgG的Fc区或IgE的Fc区。因此，优选地，所述第一结合结构域可以是由Fcε受体结合的IgE的Fc区或其部分。优选地，所述第二结合结构域可以是由FcγRII受体结合的IgG的Fc区或其部分。

或者，优选地，所述第一结合结构域可以是与Fcε受体结合的抗体的至少一部分，和所述第二结合结构域可以是由FcγIIB受体结合的IgG恒定区的至少一部分或其部分。这种分子是有用的识别分子且被认为是本文公开的抗体，即其具有可变结构域和恒定区，如IgG Fc区。

类似地，优选地，所述第一结构域可以是由Fcε受体结合的IgE恒定区的至少一部分或其部分，和所述第二结构域可以是与FcγIIB受体结合的抗体的至少一部分。这种分子是有用的识别分子且在一个实施方案中是本文公开的抗体，即其具有可变结构域和恒定区，如IgE Fc区。

若本文所述的识别分子的第二结合结构域(与FcγIIB受体结合)是Fab结构域的一部分，则优选地其在其重链可变区中包含SEQ ID NO.29、30和31中所示的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3，并且在其轻链可变区中包含SEQ ID NO.32、33和34中所示的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3，其中，相比于未经所述识别分子处理的Daudi细胞，如上定义的具有第二结合结构域的识别分子，优选地抗体，使Daudi细胞的FcγRIIB的ITIM磷酸化增加约4至10倍。

从图7中明显可见，现有技术的抗体GB3(参见WO 2005/051999)和2B6(参见WO2004/016750)不能如本文公开的识别分子，优选地抗体(诸如8A6，或者作为嵌合的或人源化的8A6抗体)那样增加FcγRIIB的ITIM磷酸化。故而能否增加FcγRIIB的ITIM磷酸化似乎取决于CDR，特别是取决于存在于8A6中而非GB3和/或2B6中的一些关键氨基酸残基。因此，仅存在于8A6的CDR中的处于对应于2B6或GB3的CDR内各自位置的位置处的氨基酸可以被看作是“关键残基”。

对2B6、GB3和8A6中的CDR关键残基的视觉比较表明，在H-CDR1中有益地存在SEQID NO.29中所示的氨基酸序列，在H-CDR2中有益地存在SEQ ID NO.30中所示的氨基酸序列，在H-CDR3中有益地存在SEQ ID NO.31中所示的氨基酸序列，在L-CDR1中有益地存在SEQID NO.32中所示的氨基酸序列，在L-CDR2中有益地存在SEQ ID NO.33中所示的氨基酸序列，和在L-CDR3中有益地存在SEQ ID NO.34中所示的氨基酸序列。

8A6、GB3和2B6的CDR的氨基酸序列之间的差异还可以被表示为在使用8A6的CDR作为参考序列时在本文公开的抗体的CDR中所允许的同一性程度(以同一性百分比表示)。因此，本发明的第二结合结构域的H-CDR1优选地表征为与SEQ ID NO.20中所示的H-CDR1具有60％或更多(诸如70％、80％或90％)的同一性。

在某些实施方案中，本文公开的第二结合结构域的H-CDR2表征为与SEQ ID NO.21中所示的H-CDR2具有36％或更多(诸如40％、50％、60％、70％、80％或90％)的同一性。

在某些实施方案中，本文公开的第二结合结构域的H-CDR3表征为与SEQ ID NO.22中所示的H-CDR3具有50％或更多(诸如60％、70％、80％或90％)的同一性。

在某些实施方案中，本文公开的第二结合结构域的L-CDR1表征为与SEQ ID NO.23中所示的L-CDR1具有64％或更多(诸如70％、80％或90％)的同一性。

在某些实施方案中，本文公开的第二结合结构域的L-CDR2表征为与SEQ ID NO.24中所示的L-CDR2具有29％或更多(诸如30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)的同一性。

在某些实施方案中，本文公开的第二结合结构域的L-CDR3表征为与SEQ ID NO.25中所示的L-CDR3具有78％或更多(诸如80％或90％)的同一性。

因此，在某些实施方案中，本发明提供一种具有第二结合结构域(与FcγIIB受体结合)的识别分子，所述第二结合结构域在其重链可变区中包含与SEQ ID NO.20中所示的H-CDR1序列具有60％或更多同一性的H-CDR1序列，与SEQ ID NO.21中所示的H-CDR2序列具有36％或更多同一性的H-CDR2序列，与SEQ ID NO.22中所示的H-CDR3序列具有50％或更多同一性的H-CDR3序列，与SEQ ID NO.23中所示的L-CDR1序列具有64％或更多同一性的L-CDR1序列，与SEQ ID NO.24中所示的L-CDR2序列具有29％或更多同一性的L-CDR2序列，和与SEQ ID NO.25中所示的L-CDR3序列具有78％或更多同一性的L-CDR3序列。

在一些实施方案中，诸如抗体的识别分子在其第二结合结构域的重链和轻链可变区CDR中仍然包含如SEQ ID NO.29、30、31(H-CDR)和SEQ ID NO.32、33、34(L-CDR)中所定义的“关键残基”。

相比于未经所述识别分子处理的Daudi细胞，具有这种第二结合结构域的识别分子使Daudi细胞的FcγRIIB的ITIM磷酸化增加约4至10倍。

本文所用术语“同一性百分比”是指在以如可得自www.clustal.org的ClustalW或X技术所示例的最佳序列比对或者等同技术来比较两个氨基酸序列时，序列内相应位置处的相同氨基酸残基的百分数。例如，在CDR比对的情况下，SEQ ID NO.20-25中所示的每个CDR(分别来自重链和轻链可变区)都分别作为重链或轻链可变区的目标CDR序列的参考序列，例如SEQ ID NO.20的H-CDR1与目标H-CDR1比对。因此，比对两个序列(参考序列和目标序列)，两个序列之间相同的氨基酸残基被识别，然后将相同氨基酸的总数分别除以SEQ IDNO.20、21、22、23、24或25氨基酸的总数(氨基酸长度)，具体取决于是比对H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2还是L-CDR3。相除的结果是一个百分比值，即同一性百分比值/程度。

应用相同的程序，加以必要的改变来比较两个可变区的同一性程度。

SEQ ID NO.14和20中所示的H-CDR1序列是SEQ ID NO.29中所示的H-CDR1的示例性序列种类。

SEQ ID NO.15和21中所示的H-CDR2序列是SEQ ID NO.30中所示的H-CDR2的示例性序列种类。

SEQ ID NO.16和22中所示的H-CDR3序列是SEQ ID NO.31中所示的H-CDR3的示例性序列种类。

SEQ ID NO.17和23中所示的L-CDR1序列是SEQ ID NO.32中所示的L-CDR1的示例性序列种类。

SEQ ID NO.18和24中所示的L-CDR2序列是SEQ ID NO.33中所示的L-CDR2的示例性序列种类。

SEQ ID NO.19和25中所示的L-CDR3序列是SEQ ID NO.34中所示的L-CDR3的示例性序列种类。

因此，本文提供具有第二结合结构域(与FcγIIB受体结合)的识别分子，所述第二结合结构域

(a)在其重链可变区中包含SEQ ID NO.14、15和16中所示的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3，并且在其轻链可变区中包含SEQ ID NO.17、18和19中所示的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3；或

(b)在其重链可变区中包含SEQ ID NO.20、21和22中所示的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3，并且在其轻链可变区中包含SEQ ID NO.23、24和25中所示的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3，

其中优选地，相比于未经所述识别分子处理的Daudi细胞，所述识别分子使Daudi细胞的FcγRIIB的ITIM磷酸化增加约4至10倍。

具有在其重链可变区中包含SEQ ID NO.14、15和16中所示的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3并且在其轻链可变区中包含SEQ ID NO.17、18和19中所示的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3的第二结合结构域的识别分子(与FcγIIB受体结合)，或者在其重链可变区中具有SEQ IDNO.20、21和22中所示的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3并且在其轻链可变区中具有SEQ IDNO.23、24和25中所示的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3的识别分子(与FcγIIB受体结合)是示例性识别分子。优选地，相比于未经所述识别分子处理的Daudi细胞，这种示例性识别分子使Daudi细胞的FcγRIIB的ITIM磷酸化增加约4至10倍。

在一个实施方案中，所述识别分子(与FcγIIB受体结合)具有第二结合结构域，该第二结合结构域含有至少(i)包含与氨基酸序列SEQ ID NO.1具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区和(ii)包含与氨基酸序列SEQ ID NO.2具有至少65％同一性的氨基酸序列的轻链可变区。

此外，所述识别分子(与FcγIIB受体结合)可具有第二结合结构域，该第二结合结构域含有以下列中的至少一个：(i)包含与氨基酸序列SEQ ID NO.3具有至少90％同一性的氨基酸序列的重链可变区和(ii)包含与氨基酸序列SEQ ID NO.4具有至少90％同一性的氨基酸序列的轻链可变区。

相比于未经所述识别分子处理的Daudi细胞，这种识别分子使Daudi细胞的FcγRIIB的ITIM磷酸化增加约4至10倍。

如上所述，示例性识别分子是抗体。优选的抗体是这样一种抗体，其以第一结合结构域(其是Fab结构域的至少一部分)结合Fcε受体，即抗-FcεR抗体，优选地为IgG型的，和以第二结合结构域(其是IgG的恒定区或由FcγIIB受体结合的IgG的恒定区的一部分)结合FcγIIB受体。

另一示例性抗体以第一结合结构域(其是Fab结构域的至少一部分)结合Fcε受体和以第二结合结构域(其是Fab结构域的至少一部分)结合FcγIIB受体，即双功能或双特异性抗-FcεR抗体×抗-FcγIIB抗体。在某些实施方案中，所述抗体不与Fcγ受体IIA(FcγIIA)结合。

还设想一种抗体，该抗体包含IgE的Fc结构域或其部分作为第一结合结构域和包含IgG的Fc结构域或其部分作为第二结合结构域。

另一示例性抗体是这样一种抗体，其以第一结合结构域(其是IgE的恒定区或由Fcε受体结合的IgE的恒定区的一部分)结合Fcε受体，和以第二结合结构域(其是Fab结构域的至少一部分)结合FcγIIB受体，即抗-FcγIIB抗体，优选地为IgG型的。在某些实施方案中，所述抗体不与Fcγ受体IIA(FcγIIA)结合。

本文所用“抗体”是包含一个或多个基本上或部分地由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段编码的多肽(其包含一个或多个结合结构域，优选抗原结合结构域)的蛋白质。本文所述术语“免疫球蛋白”(Ig)与“抗体”可互换使用。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因以及无数免疫球蛋白可变区基因。特别地，本文所用的“抗体”是典型地由两个轻(L)链(每个约25kDa)和两个重(H)链(每个约50kDa)组成的四聚体糖基化蛋白。在抗体中可以发现两种轻链，称作λ和κ。根据重链恒定结构域的氨基酸序列，可以将免疫球蛋白划分为五个主要类别：A、D、E、G和M，这些中若干类别可进一步划分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2，其中IgG或IgE在本发明的某些实施方案中是优选的。IgM抗体由5个基本异源四聚体单元连同一个另外的称为J链的多肽组成，并含有10个抗原结合位点，而IgA抗体包含与J链组合的2-5个可聚合形成多价聚集体的基本4-链单元。在IgG的情况下，4-链单元通常约150,000道尔顿。每个轻链包括N端可变(V)结构域(VL)和恒定(C)结构域(CL)。每个重链包括N端V结构域(VH)、三或四个C结构域(CH)和铰链区。

所述恒定结构域并不直接参与抗体与抗原的结合，而是可展现出多种效应物作用，诸如参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。如果抗体会施加ADCC，则其优选为IgG1亚类，而IgG4亚类不会具有施加ADCC的能力。识别分子(如抗体)的恒定结构域可以是本文所述的每一亚类，优选地是IgG或IgE亚类，更优选地是IgE亚类。

本文所用术语“抗体”不仅指免疫球蛋白(或完整的抗体)，还指其片段，并涵盖任何包含抗原-结合片段或抗原-结合结构域的多肽，诸如Fab、F(ab')、F(ab')₂、Fv、scFv、Fd、二硫键连接的Fv(sdFv)以及其它保留本文所述的抗原-结合功能的抗体片段。典型地，这样的片段将包含抗原-结合结构域并与本文所述抗体具有相同的性质。

术语“抗体”还包括但不限于单克隆、单特异性、聚-或多-特异性抗体诸如双特异性抗体、人源化的、骆驼化的、人的、单链、嵌合的、合成的、重组的、杂交的、突变的、移植的和在体外产生的抗体，其中优选嵌合的或人源化的抗体。术语“人源化的抗体”通常被定义为其中HC和LC的特异性编码CDR已经被转移到适当的人可变框架(“CDR移植”)的抗体。术语“抗体”还包括scFv、单链抗体、双体或四体、结构域抗体(dAb)和纳米抗体。就本发明而言，术语“抗体”应还包含具有若干抗原结合位点的双、三或多聚体抗体或者双、三或多功能抗体，优选地，所述抗原结合位点中的至少一个是FcγRIIB特异性结合位点。

此外，本文中所用术语“抗体”还涉及本文所述抗体(包括片段)的衍生物。抗体的“衍生物”包含由引入氨基酸残基置换、缺失或添加而被改变的氨基酸序列。此外，衍生物涵盖由任意类型的分子共价连接到抗体或蛋白质而被修饰的抗体。这样的分子的实例包括糖、PEG、羟基、乙氧基、羧基或氨基，但不限于这些。实际上，所述抗体的共价修饰导致糖基化、聚乙二醇化、乙酰化、磷酸化和酰胺化，而又不限于这些。

所述的抗体优选为“分离的”抗体。本文用于描述所公开抗体的“分离的”意味着已经从其产生环境的组分中识别、分离和/或回收的抗体。优选地，所述分离的抗体不与来自其产生环境的任何其他组分关联。其产生环境的污染物组分，诸如由重组转染细胞引起的，是典型地干扰多肽的诊断或治疗用途的材料，并且可以包括酶、激素和其它蛋白质性或非蛋白质性的溶质。在优选的实施方案中，所述抗体将被纯化(1)至足以通过使用旋转杯测序仪获得N端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或者(2)至使用考马斯蓝或优选地使用银染在非还原或还原条件下通过SDS-PAGE同质。然而，通常分离的抗体将通过至少一个纯化步骤制备。

本文所用术语“特异性结合”是指识别分子(优选地抗体)或其片段或其衍生物与FcγRIIB或其片段特异性结合而不与其他Fc受体特异性结合。所述识别分子(优选地抗体)或其片段或其衍生物通过第二结合结构域(如通过抗体的可变结构域)与FcγRIIB结合。然而，这些识别分子(如抗体)也可以被FcγRIIB如通过它们的Fc结构域结合。

VH和VL配对一起形成单一抗原-结合位点。离VH最近的CH结构域被指定为CH1。每个L链通过一个共价二硫键连接到H链，而两个H链则通过一个或多个二硫键彼此连接，具体取决于H链同种型。所述VH和VL结构域包括四个相对保守的序列区域，称为构架区(FR1、FR2、FR3和FR4)，其为三个高变序列区域(互补决定区，CDR)形成支架。所述CDR包含负责抗体与抗原的特异性相互作用的大部分残基。CDR被称作CDR1、CDR2和CDR3。因此，重链上的CDR成分被称作H1或H-CDR1、H2或H-CDR2和H3或H-CDR3，而轻链上的CDR成分被称作L1或L-CDR1、L2或L-CDR2和L3或L-CDR3。

术语“可变(的)”是指免疫球蛋白结构域中在其序列上展现出可变性并且参与决定特定抗体的特异性和结合亲和性的部分(即所述“可变结构域”)。可变性并非均匀分布于抗体的整个可变结构域；而是集中于每个重链可变区和轻链可变区的高变亚结构域。这些高变亚结构域称为“互补性决定区”(CDR)，所述CDR的三个(L1-CDRL1、L2-CDR和L3-CDR)构成轻链可变区的结合特征，并且三个(H1-CDR、H2-CDR和H3-CDR)构成重链可变区的结合特征。CDR促进抗体分子的功能活性并被包含支架或框架区的氨基酸序列分开。精确的定义上的CDR边界和长度受制于不同的分类和编号系统。因此CDR可以是指通过Kabat、Chothia、contact或者任何其它的边界定义的，包括本文所述的编号系统。尽管边界不同，但这些系统中每一个都在构成可变序列内的所谓的“高变区”的序列方面具有一定程度的重叠。因此，关于邻近的框架区，根据这些系统的CDR定义在长度和边界区域上可能不同。参见例如Kabat、Chothia和/或MacCallum等(Kabat等，上述引文；Chothia等，J.MoI.Biol,1987,196:901；和MacCallum等，J.MoI.Biol,1996,262:732)。然而，优选根据所谓的Kabat系统的编号。

识别分子(如抗体)的第二结合结构域(与FcγIIB受体结合)的示例性可变区如SEQ ID No.1、2、3和4中所示。

术语“框架区”是指抗体可变区中存在于更相异的(即高变的)CDR之间的领域公认部分。该框架区典型地是指框架1至4(FR1、FR2、FR3和FR4)，并且在三维空间为六个CDR(三个来自重链，三个来自轻链)的呈现提供支架以形成抗原-结合表面。

相比于未经所述识别分子处理的Daudi细胞，如抗体的识别分子(与FcγIIB受体结合)(包括其片段和衍生物)有利地使Daudi细胞的FcγRIIB的ITIM磷酸化增加约1.5、2、3或更多倍，诸如约4倍或更多，约5倍或更多，约6倍或更多，约7倍或更多，约8倍或更多，约9倍或更多或者约10倍(即甚至接近10倍)。对于这一比较，所述抗体的用量在5μg/ml至50μg/ml的范围内，诸如10、15、20或25μg/ml。

从图6、7和8中所示的结果来看，很明显，与现有技术的抗体GB3相比，嵌合的8A6(ch8A6)抗体(包含大鼠可变区和人恒定区)或人源化的8A6抗体(hu8A6)显著地增加ITIM磷酸化。记住嵌合的和人源化的8A6抗体之间的CDR是几乎相同的，而它们的框架区(FR)是不同的，并且这两种抗体增加FcγRIIB的ITIM磷酸化的效能是几乎相同的(见图8)，有理由推断，所述CDR是使本文所公开的抗体显著增加(例如与现有技术的抗体GB3相比)ITIM磷酸化的有利性质的原因。

技术人员易于有能力按照本文所述将识别分子的第二结合结构域的所述CDR移植到适当的框架中，或者反之亦然，将框架区移植到识别分子(如具有本文所述CDR的抗体)的第二结合结构域中，使得如此产生的识别分子(如抗体)具有有利性质，特别是本文所述增加CD32B的ITIM磷酸化的性质。

如上所述，与WO 2005/051999中所述的现有技术的抗体GB3相比，本文公开的识别分子(如抗体)具有增加Daudi细胞的FcγRIIB(CD32B)的ITIM磷酸化的性质，所述GB3的特征在于具有WO 2005/051999的SEQ ID NO:7(参见SEQ ID NO.26)中所示的重链的可变区和WO 2005/051999的SEQ ID NO:5(参见SEQ ID NO.27)中所示的轻链的可变区。

相比于未经所述识别分子处理的Daudi细胞，由识别分子(如抗体)产生的Daudi细胞的FcγRIIB(CD32B)的ITIM磷酸化增加为约4倍或更多，约5倍或更多，约6倍或更多，约7倍或更多，约8倍或更多，约9倍或更多或者约10倍(即甚至接近10倍)。

Daudi细胞的CD32B(FcγRIIB受体)的ITIM磷酸化优选地如下测定：

悬浮在补充有1％的FBS(胎牛血清)的RPMI 1640培养基中的3×10⁵个Daudi细胞或者不进行处理(对照组)，或者在37℃、5％CO₂下用包含小鼠抗-人IgM(α-hIgM)和兔抗-小鼠IgG(α-mIgG)的抗体混合物一起温育25分钟，其中所述抗体混合物包含2μg/ml的α-hIgM(mAB，克隆UHB)和20μg/mlα-mIgG。随后在37℃、5％CO₂下将所述细胞或者用识别分子(如本文公开的抗体)或者用下文定义的目标分子(诸如WO 2005/051999的GB3抗体)分别处理20分钟，识别分子和目标分子都优选地以相同的浓度应用，并可选地用缓冲液作为对照组(w/o)。在4℃下温育后收获细胞，将其裂解并进行蛋白质印迹分析，由此通过抗-磷酸酪氨酸抗体(抗-CD32B(磷光体Y292)抗体)检测磷酸化。所述蛋白质印迹可选地用检测例如作为蛋白质印迹分析的上样对照的β-Actin的抗体进行探测。作为Daudi细胞的替代选择，还可以使用PBMC或Raji细胞。因此，在所有测定ITIM磷酸化时应用Daudi细胞的实施方案中，Daudi细胞都可以被Raji细胞或PBMC替代。

所述磷酸酪氨酸抗体优选地与信号生成基团耦联。信号生成基团是指可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学或化学方法检测的组合物。例如，有用的标记包括放射性标记诸如³²P、³⁵S或¹²⁵I；荧光染料(例如Cy-3、Cy-5)；发色团，电子致密的试剂；生成可检测信号的酶(例如，如ELISA中通常使用的)；或者自旋标记。所述标记或可检测部分具有或产生可测量的信号，诸如放射性、显色的或荧光的信号，这些信号可用来量化样品中结合的可检测部分的量。

所述信号生成基团可共价地或非共价地与磷酸酪氨酸抗体结合。信号可以通过磷酸酪氨酸抗体的信号生成基团提供的信号来测定。所述信号可以是可通过例如光谱、光化学、生物化学、免疫化学或化学方法检测的任何信号。

通过如下方式测定ITIM磷酸化的增加：比较(i)由与未经处理的细胞的CD32B的ITIM基序结合的磷酸酪氨酸抗体的信号生成基团所生成的信号(“参考值”)与(ii)由与经识别分子(如本文公开的抗体)处理的细胞的CD32B的ITIM基序结合的磷酸酪氨酸抗体的信号生成基团所生成的信号，由此如果信号(ii)高于信号(i)，则由本文公开的识别分子产生了CD32B的ITIM磷酸化的增加。对于所述比较，识别分子以约5μg/ml至约50μg/ml范围内的量使用，诸如10、15、20或25μg/ml。例如，在将现有技术的抗体GB3或任何其它分子(如与CD32B结合的抗体)(统称为“目标分子”)(如结合本文所述的CD32B上的表位的分子和/或如本文所述非封闭性的分子)与识别分子相比较，以便测定目标分子和识别分子增加CD32B的ITIM磷酸化的能力时，如上所述测定目标分子和识别分子的ITIM磷酸化。即，用未经处理的细胞得到目标分子的用于比较的值，用未经处理的细胞得到识别分子的用于比较的值。这些值可以相互比较以便确定识别分子是否具有将ITIM磷酸化增加至更高程度的能力，所述更高程度诸如是目标分子的4至10倍(包括4、5、6、7、8、9、10)。对于所述比较，目标分子和识别分子以5μg/ml至50μg/ml范围内的量使用，诸如10、15、20或25μg/ml。

至于本文公开的识别分子的第二结合结构域(与FcγIIB受体结合)的重链可变区，在某些实施方案中所述重链可变区包含SEQ ID NO.3中所示的氨基酸序列，并具有选自以下的突变中的至少一个：位置1处的氨基酸Q被E替代，位置11处的氨基酸V被L替代，位置42处的氨基酸G被K替代，位置50处的氨基酸S被V替代，位置53处的氨基酸Y被S替代，位置58处的氨基酸K被T替代，位置61处的氨基酸G被A替代，位置75处的氨基酸S被T替代，位置76处的氨基酸K被R替代，位置77处的氨基酸N被S替代，和位置78处的氨基酸T被N替代。这样的抗体的特征在于包含IgE恒定结构域作为第一结合结构域。

在识别分子的第二结合结构域是由FcγIIB受体结合的IgG恒定结构域或其部分的情况下，识别分子具有以下特征：包含重链恒定区即SEQ ID NO.6中所示的氨基酸序列和/或轻链恒定区即SEQID NO.7中所示的氨基酸序列。

在本文公开的抗体中，所述重链的恒定区在位置297(根据Edelman等1969年所述的EU蛋白质编号，对应于图2所示的SEQ ID NO.6代表的序列的编号)处包含丙氨酸残基(N297A)。本文为具有在位置297处包含丙氨酸(Ala，A)残基(N297A)的重链的抗体指定了后缀“_N297A”，而在所述位置处具有天冬氨酸(Asn，N)残基的抗体是“野生型”的，因而为其指定了后缀“(wt)”。如图2中可见，人源化抗体8A6野生型的重链的可变区以位置113(根据EU蛋白质编号)处的氨基酸残基“S”结尾。所述抗体的恒定区以位置118开始。产生的4个氨基酸残基的显著间隙是由对于恒定区转换成EU蛋白质编号系统引起的，而不意味着任何氨基酸残基的丢失。

这种在SEQ ID NO:6代表的所述氨基酸序列的位置297处具有丙氨酸残基的恒定结构域由于抗体的Fc部分与Fc受体的结合减少或不存在而确实具有减少的或者没有抗体依赖性细胞毒性。SEQ ID NO.28中显示了这类N297A恒定区的氨基酸序列。因此，本文公开的识别分子可以含有SEQ ID NO:28中所示的氨基酸序列作为恒定区。这样的抗体在位置297(根据EU蛋白质编号)处缺少糖基化。因此，本文不仅公开了在位置297(根据重链恒定区的EU蛋白质编号)处缺少糖基化的抗体，还涵盖在位置297(根据重链恒定区的EU蛋白质编号)处发生糖基化的抗体。

在一些实施方案中，识别分子(如本文公开的抗体)的恒定结构域(Fc结构域)具有在位置214处包含氨基酸K(Lys)、在356位置处包含氨基酸E(Glu)、在位置358处包含氨基酸M(Met)以及在位置431处包含氨基酸A(Ala)并且缺少C-端K(Lys)的同种异型G1m17(Beck等，2010)。

若识别分子的第二结合结构域是由FcγIIB受体结合的IgG的恒定结构域或其部分，则具有该Km3同种异型的恒定轻链结构域可在位置153处包含氨基酸A(Ala)并在位置191处包含氨基酸V(Val)。

本文所用术语“同种异型”是指本文公开的抗体的人同种异型。同种异型是特定同种型的恒定区序列内的等位基因/遗传变体。所述同种异型以等位基因的方式进行遗传。因此物种的不同成员就他们从其亲本继承的给定同种型的特定等位基因而彼此不同。Km1和Km2是人κ链的同种异型；G1m(4)和G1m(17)是人γ-1链的同种异型。

若识别分子的第二结合结构域是由FcγIIB受体结合的IgG的恒定结构域或其部分，则识别分子可包含重链恒定区即SEQ ID NO.6中所示的氨基酸序列和轻链恒定区即SEQID NO.7中所示的氨基酸序列。这种识别分子的特征在于第一结合结构域是由Fcε受体结合的IgE恒定结构域或其部分。

至于识别分子的第二结合结构域(与FcγIIB受体结合)的轻链可变区，在一些实施方案中，其包含SEQ ID NO.4中所示的氨基酸序列，并具有选自以下的突变中的至少一个：位置1处的氨基酸Q被N替代，位置28处的氨基酸S被N替代，位置31处的氨基酸S被T替代，位置33处的氨基酸V被L替代，位置34处的氨基酸D被A替代，位置49处的氨基酸Y被F替代，位置53处的氨基酸T被N替代，位置55处的氨基酸Y被A替代，位置89处的氨基酸L被Q替代，和位置93处的氨基酸N被Y替代。这样的抗体具有以下特征：包含重链恒定区即SEQID NO.6中所示的氨基酸序列和/或轻链恒定区即SEQID NO.7中所示的氨基酸序列。这样的识别分子的特征还在于第一结合结构域是由Fcε受体结合的IgE恒定结构域或其部分。

识别分子(与FcγIIB受体结合，例如抗体)包含SEQ ID NO.1或3中所示的重链可变区和/或SEQ ID NO.2或4中所示的轻链可变区。因此，识别分子可以包含SEQ ID NO.1中所示的重链可变区和SEQ ID NO.2中所示的轻链可变区，或者其包含SEQ ID NO.3中所示的重链可变区和SEQ ID NO.4中所示的轻链可变区。

识别分子(与FcγIIB受体结合，例如本文公开的抗体)与根据SEQ ID NO.5的人FcγRIIB的第20-40号氨基酸内的表位特异性结合。

在一些实施方案中，识别分子与包含SEQ ID NO.5中的基序GTHSPES的表位特异性结合。已经表明，该氨基酸基序是FcγRIIB的非常特异的表位。与该表位特异性结合的识别分子(如抗体)不与人FcγRIIA结合。优选地，识别分子(如抗体)通过其可变区与该表位的结合不会干扰抗体的Fc部分与所述受体的结合并且不会阻断所述受体的正常生理功能。

在一些实施方案中，所述识别分子(与FcγIIB受体结合，例如抗体)在体外以具有至少4.9×10^-4s^-1的解离速率(off-rate)常数的亲和性结合人FcγRIIb。解离速率常数(k_off)可通过表面等离子体共振实验进行测量。特别是，与sFcγRIIB结合的抗体可通过使用BIAcore T200生物传感器(GE Healthcare/Biacore)的表面等离子体共振来分析。

本文所用术语“亲和性”是指抗体或其片段或其衍生物的一个重链和一个轻链的可变区与其抗原(例如FcγRIIB受体)之间的结合强度，并且在体外进行测量。亲和性决定了表位与抗体的抗原结合位点之间相互作用的强度。可以使用以下公式计算亲和性：

KA＝[AB-AG]/[AB]*[AG]＝k_on/k_off

其中：

KA＝亲和性常数；

[AB]＝抗体上未被占用的结合位点的摩尔浓度

[AG]＝抗原上未被占用的结合位点的摩尔浓度

[AB-AG]＝抗体-抗原复合物的摩尔浓度

本文所用术语“亲合力(avidity)”是指抗体-抗原复合物的整体强度的测量值，其实际上取决于以下参数：(1)抗体对表位的亲和性，(2)抗体和抗原的效价，和(3)相互作用部分的结构布置。

设想识别分子(优选为抗体)可以被糖基化或去糖基化。

若本文公开的识别分子的第一结合结构域是由Fcε受体结合的IgE的恒定结构域或其部分，则其可具有SEQ ID NO:35或36的氨基酸序列或其部分。

Fc IgE结构域的优选部分包括结构域Cε3和/或结构域Cε4(参见图15和SEQ IDNO.36)。这些结构域与IgG-Cγ2和Cγ3同源。在IgG抗体中，铰链区负责分子所需的柔性并通过二硫键形成二聚体。该铰链区不存在于IgE抗体中。而额外的Cε2结构域承担了这一功能。

Fc IgE结构域的其它示例性部分包括Cε2、Cε3和/或Cε4结构域(参见图15和SEQID NO.35)。

另一种变化关于Fcε-结构域中不同量的N-糖基化位点。描述了IgE分子的若干糖基化位点：N265、N371、N383和N394。设想这些位点中的一个或多个保持原样或被突变使得它们不再是糖基化的。

此外，在一些实施方案中，识别分子(如抗体)包含IgE的Fc结构域作为第一结合结构域并能以具有至少1.2×10^-7Kd(M)的亲和性体外结合人FcεRI。

本文还提供了编码本文所述的识别分子的核酸序列。本文所用术语“核酸”或“核苷酸序列”是指DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)、RNA(mRNA)、其组合或者包含DNA和RNA的杂合分子。所述核酸可以是双链或单链的，还可以同时含有双链和单链的片段。最优选的是双链DNA分子。

因此，编码所公开的识别分子的核酸序列包含至少编码赋予所述抗体特异性结合性质的抗体的那些部分的核苷酸。

在一些实施方案中，所公开的核酸序列编码所述可变区，例如至少编码本文所述的CDR。

SEQ ID NO.8-11显示了示例性的核酸序列。本领域技术人员能够知晓，这些核苷酸序列可以根据所用的表达方法和所用系统而变化。

本文进一步提供一种核酸载体，其包含本文所述的编码本文公开的识别分子的核酸序列中的至少一种。所述载体优选地包含启动子，上述核酸序列位于所述启动子的控制下。所述载体可以是原核或真核表达载体，其中重组核酸或单独表达或者与其它肽或蛋白融合表达。

本文还公开一种用上述载体转染的宿主细胞。所述宿主细胞可以是任何细胞、原核细胞或者真核细胞，并且可用于至少产生抗体或者其片段或衍生物的部分。

还提供一种用于产生识别分子的方法，所述方法包括在允许表达被所述核酸载体包含的核酸序列的条件下培养本文所述的宿主细胞，并回收如此产生的识别分子。

本文公开的识别分子可有利地用于药物组合物。该药物组合物可应用于治疗或预防与嗜碱性粒细胞相关的疾病，优选过敏性疾病。

因此，还提供治疗或预防与嗜碱性粒细胞相关的疾病，优选过敏性疾病的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的本文公开的识别分子。

“过敏性疾病”或“变态反应”指其中对环境抗原的免疫应答引起组织炎症和器官功能障碍的某些疾病。过敏原指引起变态反应的任何抗原。因此，它可以是抗原性分子本身或其来源，诸如花粉粒、动物毛屑、昆虫毒液或食品。IgE在过敏性障碍中发挥重要作用。IgE高亲和性受体(FcεRI)位于肥大细胞和嗜碱性粒细胞上，其充当刺激产生许多过敏性疾病表现的炎性介质进一步释放的抗原靶标。

术语“过敏性疾病”还涵盖IgE介导的炎症。“IgE介导的炎症”在抗原结合肥大细胞上占据FcεRI受体的IgE抗体时发生。在几分钟内，此结合引起肥大细胞脱粒，释放某些预形成的介质。随后，脱粒细胞开始从头合成和释放另外的介质。结果是一个两阶段应答：起初是对血管、平滑肌和腺性分泌的速发效应(速发型超敏反应)，几小时后是所涉及部位的细胞浸润。IgE介导的炎症是特应性变态反应(诸如干草热、哮喘和特应性皮炎)、系统性过敏性反应和过敏性荨麻疹(荨麻疹)的潜在机制。它可能通常发挥免疫防御第一道防线的作用，因为它引起迅速的血管舒张，促进循环的可溶性因子和细胞进入抗原接触部位。过敏性疾病的许多最具破坏性特征是由于受到化学吸引的白细胞的作用。

因此，另一方面，本发明涉及包含识别分子作为活性成分的药物组合物。所述药物组合物可以包含至少一种药学上可接受的载体或佐剂或赋形剂。识别分子可以在本领域已知的或列于公认的用于动物、更特别地用于人的药典中的药学上可接受的组合物中提供。

所述组合物，如果需要，还可以含有少量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、混悬液、乳液、片剂、丸剂、胶囊剂、粉末、缓释制剂等的形式。所述组合物可以配制为中性或盐的形式。

药学上可接受的盐包括但不限于与诸如源自盐酸、磷酸、醋酸、草酸、酒石酸等的那些阴离子形成的盐，和与诸如源自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙胺乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的那些阳离子形成的盐。

上述药物组合物可用于治疗或预防或诊断任何疾病或障碍，优选与嗜碱性粒细胞相关的疾病，最优选过敏性疾病。

所述术语“治疗有效的”和“预防有效的”涵盖了施用的剂量和频率。施用剂量和频率会进一步典型地根据对每个患者特定的因素而变化，具体取决于施用的特定治疗性或预防性试剂、疾病种类、施药途径以及患者的年龄、体重、反应和既往病史。本领域技术人员能够选择合适的方案。本文所用术语“治疗有效量”是指足以治疗或改善疾病或障碍、推迟疾病发作或在疾病的治疗或管理中提供任何治疗有益效果的治疗活性组分或试剂的量。

对于本文涵盖的作为示例性识别分子的抗体，给患者施用的剂量典型地为0.0001mg/kg至100mg/kg患者体重。示例性施用剂量为约0.1至约30mg/kg，约0.1至约25mg/kg，约0.5至约25mg/kg，约1至约100mg/kg，约1至约75mg/kg，约1至约50mg/kg，约5至约50mg/kg，约5至约40mg/kg，约5至约30mg/kg，约5mg/kg，约10mg/kg，约12mg/kg，约14mg/kg，约15mg/kg，约17mg/kg，约20mg/kg，或约25mg/kg。众所周知，人抗体在人体内的半衰期要比来自其他物种的抗体长。因此，与来自其他物种的抗体通常所用的剂量相比，所述抗体或者其片段或衍生物的施用剂量和频率可以降低。

用治疗或预防有效量的所述抗体或者其片段或衍生物对患者进行治疗可以包括单次治疗，或者优选地可以包括一系列治疗。在某些实施方案中，可以用上文公开的剂量范围内的抗体或者其片段或衍生物对患者进行治疗，对于约1至约10周、约2至约8周、更优选地约3至约7周的每周一次。可以选择最有利的应用形式和方法以最有益于待治疗的患者。

施用抗体或者其片段或衍生物的方法包括但不限于肠胃外给药(例如皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内和皮下)、硬膜外和粘膜(例如鼻内和口服途径)。在一个特殊的实施方案中，肌肉内、静脉内或皮下施用所述抗体。可以通过任何方便的途径施用所述组合物，例如，通过输液注射或弹丸注射、通过上皮或皮肤黏膜衬里(例如口腔黏膜、直肠粘膜和肠粘膜等)吸收，还可以与其他生物活性剂一起施用。可以全身或局部施用。此外，还可以采用肺部施用，例如通过使用吸入器或喷雾器以及具有雾化剂的制剂。

本文所用术语“处理”和“治疗”是指对患者施用治疗有效量的药物组合物。“治疗有效量”是指足以治疗或改善疾病或障碍、推迟疾病发作或在疾病的治疗或管理中提供任何治疗有益效果的药物组合物或抗体的量。

本文所用术语“预防”是指用于预防疾病或障碍发作的试剂的使用。“预防有效量”定义足以预防疾病的发作或复发的活性组分或药剂的量。

本文所用术语“障碍”和“疾病”可互换使用，用与指代受试者的病况。特别地，所述术语“自身免疫性疾病”与术语“自身免疫性障碍”可互换使用，用于指受试者的具有以下特征的病况：由受试者对其自身细胞、组织和/或器官的免疫性反应引起的细胞、组织和/或器官损伤。

此外，所公开的抗体可用于诊断的目的以检测、诊断或监控疾病或障碍，特别是自身免疫性疾病。抗体或者其片段或衍生物可用于通过本文所述的或本领域技术人员已知的经典的免疫组化方法测定生物学样品中的FcγRIIB水平(例如参见Jalkanen等，1985,J.Cell.Biol.101:976-985；Jalkanen等，1987,J.Cell.Biol.105:3087-3096)。其他用于检测蛋白基因表达的基于抗体的方法包括免疫测定，诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射性免疫测定(RIA)。

因此，本发明进一步涉及包含识别分子，优选包含本文公开的抗体的诊断组合物。

序列

SEQ ID NO.1：大鼠抗体8A6的重链可变区的氨基酸序列

SEQ ID NO.2：大鼠抗体8A6的轻链可变区的氨基酸序列

SEQ ID NO.3：人源化抗体hu8A6的重链可变区的氨基酸序列

SEQ ID NO.4：人源化抗体hu8A6的轻链可变区的氨基酸序列

SEQ ID NO.5：人FcγRIIB的氨基酸序列

SEQ ID NO.6：人源化抗体hu8A6_wt的重链恒定区的氨基酸序列

SEQ ID NO.7：人源化抗体hu8A6_wt的轻链恒定区的氨基酸序列

SEQ ID NO.8：编码人源化抗体hu8A6的重链可变区的核酸序列

SEQ ID NO.9：编码人源化抗体hu8A6的轻链可变区的核酸序列

SEQ ID NO.10：编码人源化抗体hu8A6_wt的重链恒定区的核酸序列

SEQ ID NO.11：编码人源化抗体hu8A6_wt的轻链恒定区的核酸序列

SEQ ID NO.12：人可溶性FcγRIIA(sFcγRIIA)的氨基酸序列

SEQ ID NO.13：突变的人可溶性FcγRIIA(sFcγRIIAmut)的氨基酸序列

SEQ ID NO.14：大鼠抗体8A6的重链可变区的CDR1的氨基酸序列

SEQ ID NO.15：大鼠抗体8A6的重链可变区的CDR2的氨基酸序列

SEQ ID NO.16：大鼠抗体8A6的重链可变区的CDR3的氨基酸序列

SEQ ID NO.17：大鼠抗体8A6的轻链可变区的CDR1的氨基酸序列

SEQ ID NO.18：大鼠抗体8A6的轻链可变区的CDR2的氨基酸序列

SEQ ID NO.19：大鼠抗体8A6的轻链可变区的CDR3的氨基酸序列

SEQ ID NO.20：人源化抗体hu8A6的重链可变区的CDR1的氨基酸序列

SEQ ID NO.21：人源化抗体hu8A6的重链可变区的CDR2的氨基酸序列

SEQ ID NO.22：人源化抗体hu8A6的重链可变区的CDR3的氨基酸序列

SEQ ID NO.23：人源化抗体hu8A6的轻链可变区的CDR1的氨基酸序列

SEQ ID NO.24：人源化抗体hu8A6的轻链可变区的CDR2的氨基酸序列

SEQ ID NO.25：人源化抗体hu8A6的轻链可变区的CDR3的氨基酸序列

SEQ ID NO.26：抗体GB3的重链可变区的氨基酸序列(还参见WO2005/051999的SEQID NO.7)

SEQ ID NO.27：抗体GB3的轻链可变区的氨基酸序列(还参见WO2005/051999的SEQID NO.5)

SEQ ID NO.28：在位置297处含有N到A的置换的重链恒定区的氨基酸序列(假定序列表中所示的序列的位置1是位置118)

SEQ ID NO.29：包含来自嵌合的和人源化抗体8A6的关键氨基酸残基的重链可变区的CDR1的氨基酸序列

SEQ ID NO.30：包含来自嵌合的和人源化抗体8A6的关键氨基酸残基的重链可变区的CDR2的氨基酸序列

SEQ ID NO.31：包含来自嵌合的和人源化抗体8A6的关键氨基酸残基的重链可变区的CDR3的氨基酸序列

SEQ ID NO.32：包含来自嵌合的和人源化抗体8A6的关键氨基酸残基的轻链可变区的CDR1的氨基酸序列

SEQ ID NO.33：包含来自嵌合的和人源化抗体8A6的关键氨基酸残基的轻链可变区的CDR2的氨基酸序列

SEQ ID NO.34：包含来自嵌合的和人源化抗体8A6的关键氨基酸残基的轻链可变区的CDR3的氨基酸序列

SEQ ID NO.35：包含结构域2、3和4的IgE的Fc结构域的氨基酸序列

SEQ ID NO.36：包含结构域3和4的IgE的Fc结构域的氨基酸序列

SEQ ID NO.37：sFcεRIα的质粒DNA序列

SEQ ID NO.38：肽甲酰甲硫氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸的氨基酸序列

附图说明

图1：根据SEQ.ID.No.3和4的人源化8A6(其为野生型或N297A形式)、ch8A6_N297A(根据SEQ.ID.NO.14和15)和chGB3_N297A的表面等离子体共振分析。

图2：hu8A6_wt和hu8A6_N297A序列，示出了在N297A形式中N到A的氨基酸交换的位置。

图3：ch8A6_N297A的非封闭性特征。用设置量的聚集的人IgG和不同量的ch8A6_N297A、chGB3_N297A或封闭性抗体2B6或R&D Ab温育Raji细胞。所述抗体是非封闭性的。

图4：15μg/ml至0.005μg/ml的蛋白质A纯化的抗体(hu8A6_VL+hu8A6_VH和ch8A6_N297A)与在Raji细胞上表达的天然(native)FcγRIIB的结合。人源化的8A6变体以高亲合性与在Raji细胞上表达的FcγRIIB结合。

图5：15μg/ml的抗体(hu8A6_VH+hu8A6_VL和ch8A6_N297A)与在K562细胞上表达的天然FcγRIIA的结合。所述抗体不与K-562上的FcγRIIA结合。

图6a：在来自健康供体的PBMC中嵌合的8A6(ch8A6_N297A)增加ITIM-磷酸化。使用Ficoll分离法从健康供体分离PBMC，随后不做处理或者用含有抗-IgM(抗-人，小鼠)和抗-小鼠IgG(兔)的抗体混合物温育25分钟。随后，用5μg/mL的ch8A6_N297A或缓冲液(作为对照组(w/o))处理所述细胞20分钟。温育后收获细胞并根据操作程序进行裂解。对裂解物进行WB-分析。β-肌动蛋白＝上样对照。

图6b：ITIM-磷酸化的对照实验。将Daudi细胞不经处理或用同种型对照抗体、多克隆抗-人抗-IgM(polycl.抗-hIgM)、单克隆抗人IgM(抗-hIgM)、抗-hIgM+5μg/mL ch8A6_N297A、来自兔的抗-小鼠IgG(α-小鼠IgG)、α-小鼠IgG+5μg/mL ch8A6_N297A、抗-hIgM和α-小鼠IgG的混合物(抗体混合物)或抗体混合物+5μg/mL ch8A6_N297A处理25分钟。β-肌动蛋白＝上样对照。

图6c：本发明所述的抗体在存在和不存在BCR和Fcgamma RIIB(FcγRIIB)的交联/连接的情况下在原代PBMC中增强ITIM磷酸化。

图7：ch8A6_N297A与现有技术的抗体(chGB3_N297A)的比较。人Daudi细胞用含有抗-IgM(抗-人，小鼠)和抗-小鼠IgG(兔)的抗体混合物温育25分钟或者不经处理。随后用不同量的chGB3_N297A或ch8A6_N297A或缓冲液(对照组(w/o))处理所述细胞20分钟。温育后收获细胞并根据操作程序进行裂解。对裂解物进行WB-分析。β-肌动蛋白＝上样对照。

图8：人源化的变体hu8A6_N297A和ch8A6_N297A以及chGB3_N297A对原代PBMC中的ITIM磷酸化的作用的比较。将BCR和FcγRIIB通过抗体混合物进行交联后，以5μg/ml加入不同抗体并对ITIM磷酸化进行蛋白质印迹分析。β-肌动蛋白＝上样对照。

图9：磷酸化的SHIP-1与FcγRIIB ITIM的免疫共沉淀。用抗体混合物和ch8A6_N297A、封闭性抗-FcγRIIB抗体2B6或chGB3_N297A(5μg/mL)对Daudi细胞进行刺激后，FcγRIIB从细胞裂解物中沉淀，并且对磷酸酶SHIP-1进行蛋白质印迹分析。利用pan抗-CD32抗体(AF1330)的抗-CD32＝上样对照。

图10：人源化的8A6变体(hu8A6-VH10+VL2/VH10+VL6/VH10+VL7/VH12+VL2/VH12+VL6/VH12+VL7)与ch8A6_N297A的比较。用缓冲液(未经处理的)或含有抗-IgM(抗-人，小鼠)和抗-小鼠IgG(兔)的混合物(抗体混合物)温育Daudi细胞25分钟。随后用0.25μg/mL的ch8A6_N297A或人源化的8A6变体(hu8A6-VH10+VL2/VH10+VL6/VH10+VL7/VH12+VL2/VH12+VL6/VH12+VL7)处理所述细胞20分钟。温育后收获细胞并根据操作程序进行裂解。对裂解物进行WB-分析。β-肌动蛋白＝上样对照。

图11：人源化的8A6变体(hu8A6-VH10+VL2/VH10+VL6/VH10+VL7/VH12+VL2/VH12+VL6/VH12+VL7)与ch8A6_N297A、封闭性抗-FcγRIIB和chGB3_N297A的比较。用缓冲液(未经处理的)或含有抗-IgM(抗-人，小鼠)和抗-小鼠IgG(兔)的混合物(抗体混合物)温育Daudi细胞25分钟。随后用0.25μg/mL的ch8A6_N297A、人源化的8A6变体(hu8A6-VH10+VL2/VH10+VL6/VH10+VL7/VH12+VL2/VH12+VL6/VH12+VL7)、封闭性抗-FcγRIIB抗体2B6或chGB3_N297A处理所述细胞20分钟。温育后收获细胞，根据操作程序进行裂解并用蛋白质印迹分析进行分析。对裂解物进行WB-分析。β-肌动蛋白＝上样对照。

图12：SLE-PBL小鼠模型的实验建立。将来自人SLE患者的PBL转移到免疫妥协小鼠体内。植入PBL细胞，随后用对照(PBS)或根据本发明所述的抗-FcγRIIB ch8A6_N297A抗体处理小鼠。

图13：在移植了来自患有SLE的人供体的PBL的小鼠体内的人IgG总体水平[μg/mL]。图示为用对照(#2，PBS)或ch8A6_N297A(#3和#4)处理的小鼠。

图14：在使用来自患有SLE的人供体的PBL进行SLE-PBL转移/移植后第4周开始，在经ch8A6_N297A处理的小鼠体内的疾病特异性人抗-DNA IgG的下降。图示为在两种不同小鼠即#3和#4(用ch8A6_N297A处理)体内的抗-DNA IgG滴度，#2显示了PBS对照组。

图15：由嵌合FcγRIIB特异性IgG抗体的Fab结构域和IgE抗体的Fcε结构域组成的构建体。所述构建体在从基于IgG的Fab和Fcε结构域的转换(B.具有Cε2结构域，C.无Cε2但是具有IgG铰链区)和N-糖基化位点数量方面不同。为了比较，示出了完整IgG和完整IgE分子的示意图(A)。

图16：由ELISA测试的8A6_IgE与SM101(sFcγRIIB)的结合。该图描绘了代表性的ELISA。ch8A6-IgE变体与嵌合抗-FcγRIIB抗体具有相同的对抗原SM101(可溶性FcγRIIB)的亲和性。

图17：由ELISA测定的8A6_IgE变体与sFcεRIα的结合。该图描绘了代表性的ELISA。人源化抗-FcγRIIB-IgE变体以与各自嵌合抗-FcγRIIB-IgE形式(version)相同的亲和性结合sFcεRIα。

图18：抗-FcγRIIB-IgE抗体与Raji上表达的FcγRIIB的细胞结合。与采用ch8A6_N297A实施相比，该图描绘了代表性的采用变体8A6_cε2-4-degly和8A6_cε3-4-degly的FACS实验。对天然抗原FcγRIIB，8A6-IgE变体和ch8A6_N297A具有相同的亲和性。

图19：由ELISA测试的8A6_IgE与SM101的结合。该图描绘了代表性的ELISA。人源化8A6-IgE变体以与嵌合抗-FcγRIIB受体抗体相同的亲和性结合抗原SM101(可溶性FcγRIIB)。

图20：由ELISA测定的8A6_IgE变体与sFcεRIα的结合。该图描绘了代表性的ELISA。人源化抗-FcγRIIB-IgE变体以与各自嵌合抗-FcγRIIB-IgE形式(version)相同的亲和性结合sFcεRIα。

图21：Raji细胞上标记的8A6_IgE-Fluo488的结合试验。测试荧光标记的构建体与Raji细胞上的FcγRIIB的结合，并将CHO细胞(FcγRIIB阴性的)作为对照。评估FITC通道中的荧光。

图22：PBMC内ch8A6_ce2-4-degly和ch8A6_N297A与B细胞的结合。8A6-IgE(左行)、用SM101掩蔽的8A6-IgE(中间行)和8A6-IgG(右行)与B细胞结合的FACS分析。在右侧指示的时间点时，用α-hCD19-PeCy7染色后，通过FACS分析对B细胞进行8A6-IgE结合分析。右上方象限中的数字显示了所指示的象限的平均荧光强度。

图23：嗜碱性粒细胞检测的门控策略。将具有低SSC的CD193阳性细胞对嗜碱性粒细胞设门。应用象限门，其中未处理的细胞的CD63表达设定为0。

图24：以不同浓度的8A6_N297A和8A6_cε2-4-degly处理的嗜碱性粒细胞的CD63表达。为了排除8A6_N297A和8A6_ce2-4-degly自身的潜在活化作用，分析用8A6_N297A和8A6_ce2-4-degly温育过夜的样品的CD63表达，而无进一步的抗原活化。

图25：对8A6_ce2-4-degly温育的LPS对照。将全血用50EU/ml LPS温育24小时并分析CD63的表达。

图26：6小时后对照组的活化。

图27：6小时后用8A6-IgG或8A6-IgE处理的样品的活化。

图28：24小时后对照组的活化。

图29：24小时后用8A6-IgG或8A6-IgE(8A6_cε2-cε4_去糖基化)处理的样品的活化。

图30：花粉活化试验。

具体实施方式

抗FcγIIB受体抗体的产生

实施例1：单克隆抗体8A6的制备

通过用重组的可溶性人FcγRIIB受体免疫Long-Evans大鼠，产生单克隆抗体克隆8A6。产生来自大鼠脾细胞的杂交瘤细胞系，并对其进行抗体筛选，所述抗体以比与FcγRIIA结合更高的亲和性与人FcγRIIB特异性结合。第二，使用本领域已知的技术筛选由前述杂交瘤产生的抗体的非封闭性特征，即这些抗体仍允许IgG或IC与膜结合的FcγRIIB相结合。

使用补充有5nmol CpG 2006(TIB MOLBIOL，德国柏林)的弗氏不完全佐剂，向LOU/C大鼠中腹膜内(i.p.)和皮下(s.c.)注射50μg纯化的重组可溶性人FcγRIIB(sFcγRIIB，SEQ ID NO.5)。6周间隔后，在融合前3天，腹膜内(i.p.)和皮下(s.c.)施以50μg的sFcγRIIB和CpG 2006的最后增强。根据标准程序进行所述骨髓瘤细胞系与大鼠免疫脾细胞的融合。用涂布至ELISA板上的sFcγRIIB或不相关的sFcγRIIA(SEQ ID NO.12)蛋白在固相免疫测定中测试杂交瘤上清液。用抗大鼠IgG同种型的缀合HRP的mAb(全部来自ATCC的TIB173抗-IgG2a、TIB174抗-IgG2b、TIB170抗-IgG1；自制的R-2c抗-IgG2c)检测来自组织培养上清液的与所述蛋白质相结合的MAb，从而避免IgM类的mAb。所述mAb 8A6(大鼠IgG2a)识别FcγRIIB，并且通过所述抗原-特异性ELISA测定未与FcγRIIA结合。用基于FACS的测定对于天然抗原的特异性结合对所述抗体进行筛选。此外，筛选抗体的非封闭性特征，即这些抗体仍允许IgG或免疫复合物与膜结合的FcγRIIB相结合。

为了产生足够量的抗体以进行嵌合的和人源化的构建体的表征，瞬时转染FreeStyle^TM CHO-S细胞。

转染前一天，以0.5x 10⁶个细胞/ml接种细胞。将细胞离心并重悬浮于培养基中以得到最终20x 10⁶个细胞/ml的细胞浓度。对于每次转染，将3ml的所述细胞悬浮液转移到6孔板中。按照制造商的说明用HiSpeed Plasmid Maxi Kit(Qiagen)分离用于转染的质粒DNA并在无内毒素的水中洗脱。

对于每次转染，将75μg编码所述轻链的质粒DNA和75μg编码所述重链的质粒DNA加入到所述细胞悬浮液中并轻轻混合。然后加入PEI(Polyplus)并轻轻混合。在37℃、5％CO₂下，在连续振荡(100rpm)下，温育所述细胞3小时。用培养基填充所述细胞悬浮液至最终15ml的体积，以得到最终的4x 10⁶个细胞/ml的细胞浓度，并将细胞悬浮液转移到125ml的烧瓶内。在37℃、5％CO₂下，在连续振荡(100rpm)下，温育所述细胞，6天后通过对其进行2次离心(4000rpm，5分钟)收获上清液。通过0.2μm的过滤器过滤所述上清液，测定抗体滴度(参见下文)。

通过两种不同的HPLC方法，反相(RP)HPLC和蛋白质A-HPLC，进行所述抗体滴度测定。用Agilent 1200系列HPLC系统进行所述RP-HPLC分析。用“LC系统化学工作站(ChemStation for LC System)”Rev.B.04.02软件对数据进行分析。溶剂组分为：异丙醇(HPLC级；Roth)，乙腈(HPLC梯度级；Roth)，H₂O(0.2μm过滤的)和四氟乙酸(TFA)(用于肽合成；Sigma)。溶剂A：H₂O，0.1％TFA；溶剂B：60％异丙醇，30％乙腈，9.9％H₂O和0.1％TFA。使用多孔性为的Phenomenex Jupiter柱(#525166-6)以及颗粒直径为5μm的分离材料。在10分钟内，以30％至43％溶剂B的线性梯度洗脱结合的抗体。用UV/VIS检测器在λ＝210nm处进行检测。

用Agilent 1200系列HPLC系统进行蛋白质A-HPLC分析。用“化学工作站(Chemstation)”版Rev.B.04.02软件进行数据分析。使用以下溶剂：溶剂A：0.05M Tris/HCl，0.1M甘氨酸，0.15M NaCl，pH 8.0；溶剂B：0.05M Tris/HCl，0.1M甘氨酸，0.15M NaCl，pH 3.0。为进行分析，用120μl的Applied Biosystems20A灌注层析介质(Lifetechnologies)装填Upchurch 2x 20mm分析型保护柱。用100％的溶剂B对结合的抗体进行洗脱。如果收集到纯化的抗体，则用pH 8.0 56mM的Tris对级分进行中和。

通过快速蛋白液相色谱法(Explorer)用1ml HiTrap^TM rProtein A FF柱(GEHealthcare)纯化表达的抗体。运行缓冲液含有10mM pH 8.0的Tris-HCl、150mM NaCl，洗脱缓冲液由pH 2.7的100mM甘氨酸、150mM NaCl组成。洗脱的抗体用60mM pH 8.0的Tris-HCl中和，浓缩，无菌过滤并在-80℃下贮存。

实施例2：抗体筛选和8A6的表征

用本领域已知的技术，例如ELISA-结合测定、Biacore测定或FACS-结合分析，对杂交瘤上清液进行筛选。为测试嵌合的8A6或人源化的变体的抗原特异性结合，将ELISA板(Nunc-Immuno Plate，F96Maxisorp)用在PBS(100μl/孔)中的1μg/ml sFcγRIIB、sFcγRIIA(SEQ ID NO.12)或sFcγRIIAmut(SEQ ID NO.13)在4℃下涂布过夜。在PBS中0.01％的吐温中三次洗涤步骤后，室温下用在PBS(300μl/孔)中的2％BSA进行封闭2小时。三次洗涤步骤后，应用纯化的抗体或上清液的系列稀释物(100μl/孔)并在室温下温育1小时。纯化的抗体在PBS,2％BSA中稀释。给上清液补充10倍PBS和20％BSA以得到PBS中2％BSA的最终浓度。用山羊-抗-人FcγRIIA(R&D Systems，AF1875)作为FcγRIIA的阳性对照。在PBS中0.01％的吐温中的三次洗涤步骤后，室温下温育各自的第二抗体驴-抗-山羊-HRP(F(ab′)₂，Jackson-Immuno-Research)或山羊-抗-人-HRP(F(ab′)₂，Dianova)1小时(100μl/孔)。将孔在PBS中0.01％的吐温中洗孔6次。加入底物(包含0.03％H₂O₂的OPD)(100μl/孔)，用4M H₂SO₄(50μl/孔)停止反应。然后在光谱仪中在492nm处测量吸光度。

通过Raji(CCL-86^TM)和K-562细胞(CCL-243^TM)上的细胞结合对嵌合的8A6或人源化的变体与天然抗原的特异性结合进行分析。

通过离心(400g，5min)使细胞成粒状并在FACS-缓冲液(Hanks平衡盐溶液，1％FCS，0.01％NaN₃)中洗涤。再进行一次离心步骤后，将细胞重悬在FACS-缓冲液中以得到2x10⁶个细胞/ml的最终细胞浓度，将50μl的所述细胞悬浮液分装在96-孔U型底的板中。在FACS-缓冲液中制备所述人源化的变体和ch8A6的系列稀释物。

为验证FcγRIIA在K-562细胞上的表达，在FACS-缓冲液中对小鼠-抗-人CD32抗体(Stem Cell Tecnolgogies Inc.，克隆VI.3)进行稀释。向细胞中加入50μl所述稀释的抗体，在4℃下温育30分钟。在FACS-缓冲液中洗涤细胞2次。然后，将50μl山羊-抗-人IgG-PE缀合的(F(ab′)₂，Dianova)或山羊-抗-小鼠IgG-PE缀合的(F(ab′)₂，Dianova)第二抗体在FACS-缓冲液中稀释，加入所述细胞中，并在4℃下温育30分钟。在FACS-缓冲液中进行两次洗涤步骤后，将细胞重悬在300μl FACS-缓冲液中并在BD FACSCanto^TM II(软件：BDFACSDiva^TM)中进行测量。

为确定FcγRIIB抗体是否仍允许IgG或免疫复合物与膜结合的FcγRIIB相结合，进行基于FACS的测定。通过离心(400g，5min)使细胞成粒状并在FACS-缓冲液(Hanks平衡盐溶液，1％FCS，0.01％NaN₃)中洗涤。再进行一次离心步骤后，将细胞重悬在FACS-缓冲液中以得到2x10⁶个细胞/ml的最终细胞浓度。在FACS-缓冲液中制备抗体(ch8A6_N297A、chGB3_N297A、R&D Ab mab1875)的系列稀释物。将25μl所述稀释的抗体在96-孔U型底的板中与25μl Alexa488-标记的聚集的Beriglobin(2.5μl/孔)混合。在Superdex-200(16/60)上通过尺寸排阻色谱法将聚集的人IgG与商购可用的合并的IgG产品(Beriglobin)分离。

将50μl的所述细胞悬浮液加入到所述抗体-Beriglobin混合物中并在4℃下温育1小时。在FACS-缓冲液中洗涤细胞2次。然后，将50μl山羊-抗-人IgG-PE缀合的(F(ab′)₂，Dianova)或抗-大鼠-PE第二抗体在FACS-缓冲液中稀释，加入所述细胞中，并在4℃下温育30分钟。在FACS-缓冲液中进行两次洗涤步骤后，将细胞重悬在300μl FACS-缓冲液中并在BD FACSCanto^TM II(软件：BD FACSDiva^TM)中进行测量(图3)。

FACS结合测定

通过Raji和K-562细胞上的细胞结合对嵌合的8A6或人源化的变体与天然抗原的特异性结合进行分析。

用浓度渐增的人源化的抗体和嵌合的抗体(作为对照)温育Raji和K562细胞。用Raji细胞来测试FcγRIIB上的结合(图4)，用K562细胞来分析与FcγRIIA的非特异性结合(图5)。用PE缀合的第二抗体检测细胞结合的抗体。全部人源化的变体以比得上ch8A6_N297A的亲和性与FcγRIIB结合，全部人源化的变体还以比FcγRIIA高的亲合力结合FcγRIIB。

用Biacore T200生物传感器(GE Healthcare/Biacore)通过表面等离子共振对与sFcγRIIB和sFcγRIIA结合的抗体进行分析。在LMU生物学和微生物学系Servive UnitBioanalytic进行实验。按照制造商的操作规程，使用人抗体捕获试剂盒(Human AntibodyCapture Kit)在Series S Sensor Chip CM5传感器芯片上捕获分析的抗体。在10nM的浓度下捕获Hu8A6变体或ch8A61分钟。以不同浓度注射分析物sFcγRIIB 3分钟。在25℃和持续流动(10μl/min)下进行测量。使用Biacore T200评估软件(1.0版本)对数据进行评估，假定1:1结合。

实施例3：8A6大鼠抗体的嵌合

通过将大鼠8A6VH区与信号肽和人IgG1恒定区相融合来构建抗-FcγRIIB嵌合的单克隆抗体8A6。此外，使用包含N297A突变的IgG1恒定结构域产生所述重链的去糖基化变体。为构建所述8A6轻链基因，同样将所述大鼠8A6VL区与信号序列和人κ恒定区的序列相融合，然后亚克隆至哺乳动物表达载体中。

体外测定

细胞，试剂和抗体

从DSMZ购买人Burkitt淋巴瘤细胞系Daudi和Ramos(ACC 78和ACC 603)，并在37℃、5％CO₂下维持在补充有10％FBS(Gibco/Invitrogen)、MEM NEAA(Gibco/Invitrogen)、1mM丙酮酸钠(Gibco/Invitrogen)和2mM L-谷氨酰胺(Gibco/Invitrogen)的RPMI 1640(Gibco/Invitrogen)中。使用Ficoll密度梯度(Leucosep,Greiner Bio-One,BiocollSeparating Solution,Biochrom)和负磁分离(Dynabeads Untouched Human B Cells,Invitrogen)从健康供体的肝素化血液中纯化原代人B细胞。通过用抗-hCD19-APC(BDPharmingen#555415)、抗-hCD3-PerCP-Cy5.5(BD Biosciences#332771)和抗-hCD56-PE(BDPharmingen#555515)染色的FACS分析研究富集的B细胞的纯度。原代B细胞直接用于实验而不进行进一步的培养。根据EP1534335封闭抗-FcγRIIB抗体2B6。

使用可溶性抗体刺激混合物的刺激操作规程

为同时刺激BCR和FcγRIIB，使用2μg/ml单克隆小鼠抗-hIgM(Southern Biotech#9022-01，克隆UHB)和20μg/ml单克隆兔抗-mIgG(1、2a、3)(Epitomics#3020-1，克隆M111-2)(其Fc部分与人FcγRIIB受体交叉反应)，建立抗体体系。用20μg/ml多克隆兔抗-hIgM(antibodies online#ABIN117299)或含有2μg/ml抗-hIgM和同种型对照mIgG2b(克隆MPC-11，BD Pharmingen#557351)的混合物进行对照。通过离心收获淋巴瘤细胞系Daudi或Ramos和原代B细胞的3x10⁵个细胞，然后在37℃下在测定介质(RPMI 1640+1％FBS)中用不同的刺激混合物温育20分钟。

随后，将5μg/ml抗-FcγRIIB抗体ch8A6(1:10稀释，0.8μl)、2B6(1:10稀释，1.5μl)或chGB3_N297A(1:10稀释，1.1μl)加入到所述样本中，进一步温育细胞25-30分钟。分别如所述进行裂解。

磷酸化模式的蛋白质印迹分析

细胞裂解

在4℃下使细胞成粒状，用冰冷的PBS洗涤并在冰上在10μL补充有磷酸酶抑制剂(PhosStop，Roche)、蛋白酶抑制剂(Complete Ultra Mini，无EDTA，Roche)和1mM PMSF(Fluka Biochemica)的裂解缓冲液(RIPA缓冲液(Cell Signaling))中温育30-45分钟。

SDS-PAGE

离心后，使用应用于SDS PAGE(NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gels，MES SDSRunning Buffer(Invitrogen))的样品缓冲液(NuPAGE LDS Sample Buffer,NuPAGESample Reducing Agent,Invitrogen)将上清液上样。对于SDS-PAGE，加入LDS样品缓冲液和还原剂，并且在95℃下加热样品5分钟。在-20℃下贮藏样品或通过SDS-PAGE和蛋白质印迹法直接分析样品。

向PVDF膜的蛋白质转移和检测

随后，将蛋白质转移至PVDF膜(Roti-PVDF,Roth，转移缓冲液10mM Tris、100mM甘氨酸、10％甲醇，转移条件240mA常数，在4℃下90分钟)。用TBS-T(10mM Tris，150mM NaCl，0.1％吐温20)中的5％BSA将膜封闭并用抗-FcγRIIB/CD32 Phospho(pY292)(CellEpitomics#2308-1，1:50000，4℃过夜)或抗-磷酸化SHIP(1:1000，Cell Signaling#3941)和抗-兔-HRP(Jackson ImmunoResearch#111-036-045，TBS-T中1:50,000，1h RT)对膜进行染色。在X射线膜上检测化学发光(用WesternLightning Plus,Perkin Elmer显影)。

剥离

为了随后对针对其他磷酸化蛋白的抗体进行分析，将膜剥离(Re-Blot Plus，Millipore)10分钟，洗涤，封闭，然后用抗-β-肌动蛋白抗体(Sigma-Aldrich#A1978，1:50,000和抗-小鼠IgG-HRP，Sigma-Aldrich#A9044)或用于其他信号传导蛋白的抗体染色。

来自健康供体的PBMC中FcγRIIB-ITIM磷酸化被本文公开的抗体显著增加

从健康供体分离PBMC，或者不经处理，或者用刺激混合物(单克隆小鼠抗-hIgM和单克隆兔抗-mIgG)温育25分钟。随后，用ch8A6或缓冲液(作为对照)处理细胞。使用如上所述的适当的检测抗体对细胞裂解物进行蛋白质印迹分析。检测到细胞(PBMC，B细胞)的FcγRIIB-IITIM基序的磷酸化显著增加(图6a)。单独用刺激混合物或仅单克隆小鼠抗-hIgM、单克隆兔抗-mIgG与ch8A6组合的细胞刺激的对照实验未显示出增加的FcγRIIB-ITIM-磷酸化(图6b)。因此，本文公开的抗体显示出对具有交联的BCR和膜结合(内源性表达)的FcγRIIB的人细胞的ITIM-磷酸化的显著影响，但不影响未经刺激的细胞，即无交联的BCR和膜结合的FcγRIIB的细胞。在自身免疫性疾病期间，BCR和膜结合的FcγRIIB将被自体-抗原或免疫复合物(IC)交联。所述抗体在自身免疫性疾病中能够通过增加FcγRIIB-ITIM-磷酸化而抑制致病性自身反应性B细胞。然而，所述抗体还能够在没有交联的BCR的情况下增加ITIM-磷酸化(图6c)。

ch8A6与抗体chGB3_N297A的作用的比较

克隆ch8A6_N297A和克隆chGB3_N297A对ITIM磷酸化的作用的比较。用抗体混合物，然后用上述ch8A6_N297A、chGB3_N297A或2B6处理人Daudi细胞。与ch8A6_N297A相似，抗体chGB3_N297A也是一种非封闭性抗-FcγRIIB抗体并且识别相似的表位。

向经抗体混合物处理的细胞中加入ch8A6_N297A在0.05μg/ml浓度下显示出FcγRIIB-ITIM磷酸化的增加。尽管渐增浓度的chGB3_N297A表现出抑制性基序的磷酸化的剂量依赖型刺激，但令人惊讶的是，该抗体克隆不能够达到可与8A6相比的磷酸化水平。用“ImageJ”软件进行的X射线膜的光密度定量，计算出最大2.8倍磷酸化信号的值，而与未经处理的细胞相比，hu8A6_N297A导致了9.8倍的增加(图7)。因此，与抗体chGB3_N297A相比，本发明所述的抗体清楚而惊人地显示出增加的FcγRIIB-ITIM-磷酸化。

人源化的变体hu8A6、嵌合的8A6_N297A和chGB3_N297A对原代PBMC中ITIM磷酸化的作用的比较

比较抗体chGB3_N297A、ch8A6_N297A和人源化的8A6对原代人PBMC的FcγRIIB-ITIM磷酸化的作用。通过所述抗体混合物对BCR和FcγRIIB进行交联后，以5μg/ml加入不同抗体并对ITIM磷酸化进行蛋白质印迹分析。与现有技术的抗体相比，所述抗体再次惊人地对FcγRIIB-ITIM-磷酸化表现出显著增加的作用(图8)。

磷酸化的FcγRIIB-ITIM基序和SHIP-1的免疫共沉淀

受体交联后，磷酸酶SHIP通过其SH2结构域与FcγRIIB-ITIM基序中磷酸-酪氨酸的结合而被募集到膜，随后在SHIP-1的C-末端结构域中的NPXY基序处进行酪氨酸磷酸化。在膜中的重定位和随后的NPXY基序磷酸化对SHIP-1的调节性功能是必不可少的。其对钙通量、细胞存活、生长、细胞周期阻滞和细胞凋亡的影响通过PI3K和Akt途径介导。Tyr1021定位于SHIP-1的NPXY基序之一中，并且其磷酸化对SHIP-1的功能很重要(Nimmerjahn,Ravetch,2008)。

用以上部分【00103】中所述的抗体混合物刺激人Daudi细胞，在温和的裂解缓冲液(CoIP裂解缓冲液)中进行裂解后，用2B6温育样品以捕获FcγRIIB。将复合物与蛋白G-耦合的铁磁珠子结合并用磁轨将其分离。

在500μl CoIP裂解缓冲液中制备1x10⁷个细胞/样品的裂解物，在冰上温育所述细胞30分钟，每10分钟进行涡旋。在4℃下以13,000rpm 10分钟将细胞碎片旋转下来，然后将上清液转移到新的试管中。在4℃下用10μg2B6温育500μl所述裂解物2-3小时，上下翻转。用500μl裂解缓冲液洗涤磁性蛋白G-耦合的珠子两次，将50μl珠子(1.5mg)加入裂解物-抗体-复合物中，在4℃下过夜(旋转轮)。通过用200μl裂解缓冲液洗涤两次并在25μl包含还原剂的1x LDS样品缓冲液中加热所述珠子5分钟而使复合物从所述珠子洗脱。在4000x g下离心30秒后，将10μl的上清液应用于SDS-PAGE以进行蛋白质印迹分析。

裂解物的蛋白质印迹分析显示，经抗体混合物和ch8A6_N297A处理的细胞样品中磷酸化-SHIP-1的水平显著提高。由于用FcγRIIB-特异性抗体2B6进行沉淀，因此只有已经与FcγRIIB结合的分离的SHIP-1被共沉淀。经剥离和重染色后的膜显示出在经ch8A6_N297A处理的样品中增强的FcγRIIB-ITIM基序的磷酸化，与磷酸化-SHIP1信号相关联。用α-hFcγRIIB a、b、c(人FcγRII/CD32Ab，多克隆，羊IgG，R&D Systems，AF1330)进行的第二次重染色在所有样品中显示出相同量的沉淀的受体FcγRIIB，作为SDS-PAGE的上样对照(图9)。

实施例4：IgG形式的ch8A6的人源化

通过从大鼠抗体向人框架移植互补决定区序列对ch8A6进行人源化。为选择人框架，将V_H和V_L序列与人Ig可变和连接区种系片段的那些序列(获自公共可得的数据库(IMGT；V-BASE))进行比较。分别为重链和轻链选择VH_3_30plus IGHJ4人种系序列和VK3_15plusIGKJ2人种系序列。

产生了人源化的重链和轻链的若干变体。随后将编码所述人源化的V_H和V_L的设计序列的基因亚克隆到哺乳动物表达载体中。所述抗体变体的筛选操作直接由转染的CHO-S细胞(Invitrogen)的上清液进行。嵌合的8A6抗体在人源化的变体的筛选过程中充当转染对照和标准。在Raji细胞上对Hu8A6变体通过ELISA分析在sFcγRIIB和sFcγRIIA上的结合，并且通过FACS分析在天然FcγRIIB上的结合(参见上文)。此外，用表面等离子体共振进行所述抗体变体的动力学表征。

人源化的8A6变体的测试

为测试8A6人源化变体的磷酸化活性，将Daudi细胞用所述抗体混合物刺激，用0.5或5μg/ml的不同8A6变体处理，并对ITIM磷酸化进行蛋白质印迹分析。

人源化的8A6变体与ch8A6_N297A的比较

全部测试的人源化的8A6变体都能够诱导受体的磷酸化，并且磷酸化水平与由来自相同纯化批次的ch8A6_N297A诱导的磷酸化水平相当。因此，在第二次人源化轮次后未检测到活性丧失。尽管Biacore数据表明，重链和轻链的不同组合具有不同的亲和性，但通过蛋白质印迹分析未检测到那些不同(图10)。

人源化的8A6变体与ch8A6_N297A、封闭性的抗-FcγRIIB(2B6)和chGB3_N297A的比较

选择最终的人源化链组合后，将组合重链V_H10与轻链V_L6的该变体与抗体ch8A6_N297A、2B6和chGB3_N297A进行比较(图11)。

体内测定

SLE-PBL-模型

以6Gy的剂量辐射Rag2/γ-c/Fcγ-/-小鼠，并腹膜内注射不同量的500μl PBS中的人外周血白细胞。

在人SLE-患者PBL移植到小鼠体内并由hIgM或hIgG的存在而得到证实后，对小鼠进行细胞注射后2周开始对小鼠的治疗。用200μl缓冲液(PBS)或200μl PBS中的20μg抗体(ch8A6_N297A)腹膜内注射对小鼠进行治疗，一周两次，治疗四周。小鼠每周进行一次称重并取血以得到血清。在-80℃下冷冻血清样品至进一步使用(图12)。

ELISA

通过ELISA分析血清样品中总体人IgG、IgM和抗-DNA IgM与IgG的存在。

为了将血清样品中的总体血清IgM和IgG定量，根据制造商的说明使用BethylHuman IgM ELISA Quantitation Kit和Human IgG ELISA Quantitation Kit(Biomol)。用VersaMax可调微量读板仪(Molecular Deivces)在450和650nm处测量OD。

为检测抗-DNA抗体，在室温下用PBS中10μg/mL的甲基化BSA(Sigma)涂布ELISA板2小时。洗涤后，在4℃下用PBS中50μg/mL的小牛胸腺DNA(Sigma)涂布该板过夜。在室温下用PBS/0.1％明胶/3％BSA/1mM EDTA封闭非特异性结合2小时。在所述封闭溶液中以1:100稀释血清，在室温下温育1小时。作为检测抗体，使用人IgM Quantitation Kit(Bethyl)的HRP-缀合的抗体，并在封闭溶液中以1:10000稀释，随后在室温下温育1小时。PBS用于所有的洗涤步骤。为进行检测，加入TMB溶液，用6％的正磷酸停止反应。

SLE PBL模型，总体人血清免疫球蛋白

分析在移植了来自患有SLE的人供体的PBL的小鼠体内总体人IgG水平[μg/mL]。未检测到PBS或抗-FcγRIIB之间的总体人IgG的显著差异。根据本发明所述的抗体不会显著影响总体人IgG(图13)。

SLE PBL模型，对抗-DNA抗体的影响(疾病特异性IgG)

在SLE-PBL转移/移植后第4周开始在抗-FcγRIIB小鼠体内观察到疾病特异性人抗-DNA IgG的显著减少。所公开的抗体特异性地减少了疾病相关抗-DNA抗体的量(图14)。

实施例5：结合FcγRIIB受体和Fcε受体的双特异性抗体的产生

8A6-IgG和8A6-IgE构建体命名的定义：

嵌合的：

人源化的：

不同FcγRIIB IgE抗体的产生、表达和纯化的描述。

构建体设计

如图15所示，所有构建体具有共同之处，即杂合抗体的Fab-结构域等同于IgG分子(可变结构域和CL-/CH1-结构域)。此外，所有构建体都具有IgE-恒定结构域Cε3和Cε4。这些结构域与IgG-Cg2和Cg3同源。在IgG抗体中，铰链区负责分子所需的柔性并通过二硫桥形成二聚体。该铰链区不存在于IgE抗体中。代替铰链区的是额外的Cε2结构域承担了这一功能。8A6-IgE抗体显示Fab结构域的高柔性以及从Cg1-结构域到Cε结构域的最佳转换。因此，设计了保持IgG铰链区(参见图15)或IgE完整Fcε结构域(Cε2、Cε3、Cε4)的变体(参见图15)的变体。另一个变化是在Fcε-结构域中N-糖基化位点的不同量。IgE-Fc结构域的糖基化对与FcεRI的亲和性没有影响，但对抗体的表达和稳定性有影响。按照标准实验室程序将这些构建体克隆到质粒载体中。

细胞系和培养条件

根据供应商的建议培养CHO-S细胞。简言之，在补充有2mM Glutamax的FreestyleCHO-S培养基中培养细胞并每2-3天进行传代。在37℃、5％CO₂、100rpm下培养细胞。在转染前一天，将细胞以0.5×10⁶/ml的密度分开并检查活力(>96％)。

将人Burkitt淋巴瘤细胞系Raji和Daudi在37℃、5％CO₂下培养在补充有10％FBS、MEM NEAA、1mM丙酮酸钠和2mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640中。将细胞以0.2-1.0x10⁶个细胞/ml的密度每2-3天进行传代。

用FcγRIIB_IgE构建体转染CHO-S

在转染当天，细胞密度为1.0-2.0x10⁶/ml。将8.0x10⁸个细胞稀释在20ml CHOFreestyle培养基(40x 10⁶/ml)中。加入1000μg质粒-DNA(重链和轻链各500μg)(50μg DNA/ml转染体积)，然后加入2000μg PEI(00μg PEI/ml转染体积)。在37℃、5％CO₂、100rpm下温育所述细胞3小时。之后，用CHO Freestyle培养基以1:10稀释所述细胞悬浮液，加入0.5mM丙戊酸，并在31℃、5％CO₂、100rpm下温育10天。通过以4000x g离心2x 10min收获上清液。

滴度测定、纯化和尺寸排阻色谱

通过蛋白质A-HPLC的抗体滴度测定

用Agilent 1200系列HPLC系统进行蛋白质A-HPLC分析。用“化学工作站(ChemStation)”版本Rev.B.04.02软件对数据进行分析。采用如下溶剂：溶剂A：0.05MTris/HCl，0.1M甘氨酸，0.15M NaCl，pH8.0；溶剂B：0.05M Tris/HCl，0.1M甘氨酸，0.15MNaCl，pH3.0。为进行分析，用120μl Applied 20A灌注层析介质(LifeTechnologies，#4374732)装填Upchurch 2x 20mm分析保护柱(#C-130B)。用100％溶剂B洗脱结合的抗体。如果收集到纯化的抗体，则用56mM Tris pH 8.0对级分进行中和。

8A6-IgE的纯化

培养6天后，收获细胞，通过以4000×g离心2×10分钟获得含抗体的上清液。通过快速蛋白质液相色谱用5ml High trap Protein A FF柱(GEHealthcare)纯化抗体。抗体与蛋白质A的结合通过其VH3框架介导。运行缓冲液含有pH 8.0的10mM Tris-HCl、150mM NaCl，洗脱缓冲液由pH2.7的100mM甘氨酸、150mM NaCl组成。将洗脱的抗体用pH8.0的60mM Tris-HCl中和，浓缩(Sartorius Vivaspin4)至约1.0mg/ml，用0.2μm过滤器无菌过滤并贮存在-80℃下。

实施例6：嵌合的8A6-IgE构建体的表征

尺寸排阻-HPLC

为了确定纯化的8A6-IgE变体的低聚体状态和均一性，将样品应用于SE-HPLC。使用Agilent 1200系列HPLC系统进行所述SE-HPLC。用“化学工作站(ChemStation)”版本Rev.B.04.02软件对数据进行分析。使用Superdex200 10/300GL柱(GE Healthcare)进行分析。采用以下溶剂：5mM His、150mM NaC，pH6.5。将25μg蛋白质以0.5μg/μl的浓度应用。

这表明与标准ch8A6_N297A相比，糖基化的8A6-IgE变体可能具有形成更多二聚体的趋势，而与标准ch8A6_N297A相比，去糖基化的8A6-IgE似乎更多地被降解并且具有较高百分比的片段。

结合测定

进行几个结合测定以分析抗体的结合亲和性和特异性。对于这些结合测定，根据以下操作规程产生可溶性FcεRIα：

可溶性FcεRIα的产生

用sFcεRIα转染CHO-S

在转染当天，细胞密度为～1.0x10⁶/ml。将500ml的细胞悬浮液转移至两个1升的烧瓶中。将Freestyle Max试剂轻轻倒置并在5ml Optipro SFM(RT)中稀释312.5μl。将312.5μg质粒DNA(pAC91，sFcεRIa-H6)(SEQ ID NO：37)在5ml OptiPro SFM中稀释并轻轻混合。将稀释的FreestyleMax试剂加入DNA/OptiPro SFM混合物中并在室温下温育15分钟。将DNA-脂质混合物缓慢加入细胞，同时缓慢地旋转烧瓶。在37℃、5％CO₂、100rpm下将转染的细胞温育6天。通过以4000×g离心2×10分钟收获上清液。

sFcεRIα的纯化

对于重组可溶性FcεRIα的产生，如所述用His-标记的人FcεRIα(pAC91)的细胞外结构域转染CHO-S细胞。采用Explorer通过NiNTA-纯化(Qiagen,#1018244)进行从细胞上清液中的sFcεRIα的纯化。采用以下缓冲液：含有50mM NaH₂PO₄、300mM NaCl、10mM咪唑、pH8.0的结合缓冲液；含有50mM NaH₂PO₄、300mM NaCl、400mM咪唑、pH 8.0的洗脱缓冲液。用从0％至100％B的线性梯度洗脱结合的sFcεRIα。将sFcεRIα级分浓缩后，用pH 6.5的10mMHis进行缓冲液交换。然后通过采用Explorer的DEAE Sepharose FF(GEHealthcare，#17-0709-10)用弱阴离子交换色谱法纯化sFcεRIα。溶剂A由pH 6.5的10mMHis组成；溶剂B包含10mM His、0.5mM NaCl，pH 6.5。用从2％至100％B的线性梯度洗脱结合的sFcεRIα。浓缩的蛋白质贮存在10mM His、150mM NaCl、pH6.5中，-80℃。

SDS-PAGE

对于SDS-PAGE分析，将1μg纯化抗体或Trenzyme材料应用于NuPAGE Bis-Tris(4-12％)凝胶。根据制造商的建议，将抗体置于NuPAGE LDS样品缓冲液中或还原条件下另外加入样品还原剂，并预热至75℃10分钟。以200V的恒定功率进行SDS-PAGE 30分钟。然后将凝胶在H₂O中洗涤两次，并用简单的蓝色染色溶液(Life Technologies)染色。除去H₂O中过量的染料，使用透射仪(UV，白光)进行凝胶的可视化。

ELISA结合测定

8A6-IgE与sFcγRIIB或sFcεRIα的结合

为了测试糖基化和非糖基化形式的8A6_cε2-4/8A6_cε3-4抗体对sFcγRIIB和sFcεRIα的结合功效，建立了ELISA测定。为此，在室温下用PBS(体积100μl)中1μg/ml的SM101或sFcεRIα涂布96孔板1小时。将板在0.01％-20的PBS中洗涤2次，并在室温下在250μl/孔的2％BSA的PBS中封闭2小时。洗涤步骤后，在室温下将抗体样品以在2％BSA的PBS中的适当的稀释系列加入涂布的孔中1小时。将板在0.01％-20的PBS中洗涤3次，然后在室温下将针对人κ轻链HRP缀合的第二检测抗体以在2％BSA的PBS中1:8000加入1小时。三次洗涤步骤后，用OPD、0.03％H₂O₂ 100μl/孔检测结合的HRP缀合的抗体。用50μl 4M H₂SO₄终止该反应，并用ELISA读数仪(Tecan，Spectra FluorPlus)在492nm处测量吸光度。与sFcγRIIB的直接结合显示，由于共有的Fab结构域，所有四种8A6_IgE构建体都具有与ch8A6_N297A抗体相同的与sFcγRIIB的亲和性(图16)。然而，8A6-IgE构建体与sFcεRIα的结合证明了具有全长IgE Fc部分(cε2-4)的构建体与具有较短版本(cε3-4)的构建体之间的差异(图17)。

8A6-IgE与sFcγRIIB和sFcεRIα的结合—夹心ELISA

同时进行显示与两种抗原结合的夹心ELISA。在该夹心ELISA测定中测试产生的8A6_cε2-4/8A6_cε3-4变体对两个靶标sFcγRIIB以及sFcεRIα的结合功效。为此，在室温下将96孔板用PBS(体积100μl)中的1μg/ml可溶性FcγRIIB(SM101)涂布1小时。将板在0.01％的吐温-20的PBS中洗涤2次，并在室温下在2％BSA的PBS(250μl/孔)中封闭2小时。洗涤步骤后，在室温下将抗体样品以在2％BSA的PBS中的适当的稀释系列加入涂布的孔中1小时。将板在0.01％-20的PBS中洗涤3次，且在室温下在2％BSA的PBS中用0.005μg/mlsFcεRIα温育1小时。将板在0.01％-20的PBS中洗涤3次，然后将针对人FcεRIαCRA1的第二生物素化的检测抗体(在2％BSA的PBS中0.5μg/ml)加入1小时。将板在0.01％-20的PBS中洗涤3次，然后在室温下将HRP-缀合的链霉亲和素以在PBS中1:200加入20分钟。三次洗涤步骤后，用OPD、0.03％H₂O₂ 100μl/孔检测结合的HRP-缀合的链霉亲和素。用50μl 4M H₂SO₄终止该反应，并用ELISA读数仪在492nm处测量吸光度。

该夹心ELISA证实了ELISA的结果。再次，同时用抗体的Fab片段结合FcγRIIB，显示了8A6_cε3-4构建体对FcεRIα的低亲和性。

FACS结合分析

通过FACS分析确定抗体对细胞表面表达的天然FcγRIIB的结合。使用Raji细胞，因为这一来自Burkitt淋巴瘤的B淋巴细胞细胞系表达高水平的FcγRIIB。使Raji细胞成粒状并将其以1.0×10⁵个细胞/孔接种在50μl FACS-缓冲液(HBSS，5％FBS，0.01％NaN₃)中的96孔圆底培养板中。将待测试的抗体以在50μl FACS缓冲液中的适当的稀释系列施加至Raji细胞，并在4℃下温育1小时。在两个采用200μl FACS缓冲液的洗涤步骤后，在4℃下将细胞用在FACS缓冲液中1:200稀释的针对人κ轻链FITC-缀合的第二抗体(Fab)₂温育1小时。两个洗涤步骤后，将细胞团粒重悬于150μl FACS缓冲液中，并用FACS Canto II(BDBiosciences)通过流式细胞术分析。

该测定对于所有8A6变体显示，与ch8A6_N297A相比Fab片段保留了FcγRIIB的结合能力，而与抗体Fc部分中引入的变化无关(图18)。

Biacore

通过采用Biacore^TM T200系统的表面等离子体共振(SPR)进一步分析抗体构建体对FcγRIIB和FcεRIα的亲和性。

使用标准胺-偶联操作规程(BIAsensor surface Handbook,Biacore)将sFcγRIIB共价固定在系列S传感器芯片CM5(Biacore，BR-1005-30)上。以50nM的浓度捕获抗体变体1分钟。将分析物sFcεRIα以0.1-25nM的各种浓度注射3分钟，然后进行解离步骤7分钟。通过溶解配体与SM101的相互作用，用包含3M MgCl₂的缓冲液再生CM5芯片，从而制备芯片以用于新的分析循环。测量在25℃和连续流动(10μl/min)下进行。使用Biacore T200评估软件(版本1.0)进行数据评估，假设1:1结合。

结合实验总结：

发现所有构建体对FcγRIIB的结合亲和性等于原始IgG抗体的结合亲和性。关于与FcεRIα的结合，对8A6-IgE的两种抗原的结合表征的结果表明，缩短的变体8A6_cε3-4/degly不能与全长IgE构建体一样发挥相同的与FcεRI的高亲和性。

实施例7：人源化的8A6-IgE抗体的生产和表征

8A6-IgE的人源化

对于ch8A6-IgE的人源化，将该抗体的可变重链与SEQ ID NO.3的人源化可变重链(VH10)交换。可变轻链6(VL6；SEQ ID NO.4)与人源化重链一起用于人源化的8A6-IgE构建体的表达。

通过标准克隆程序进行可变重链的交换。通过标准克隆程序进行可变重链的交换。通过DNA测序验证插入片段的正确插入。

此外，将重链序列的C-末端赖氨酸移除并交换为终止密码子(AAA→TAA)。这显著减少了带电变体的量。这一过程通过诱变PCR完成，并通过测序验证突变成功。

通过ELISA的人源化8A6-IgE的抗原结合的表征

使用与实施例2相同的操作程序进行ELISA。测试与ch8A6_N297A相比的hu8A6-IgE变体的结合。此处，未检测到对可溶性FcγRIIB的结合亲和性的差异(图19)。测试人源化的和嵌合的8A6-IgE变体以其Fc部分与sFcεRIα的结合。与具有完整Fc部分(cε2-4)的8A6-IgE变体相比，具有缩短的Fc部分(cε3-4)嵌合和人源化的两种8A6-IgE变体显示出较低的对FcεRIα的亲和性。然而，未检测到嵌合和人源化抗体的差异(图20)。

实施例8：外周血单核细胞(PBMC)上的8A6-IgE标记和结合动力学

采用全长ch8A6_cε2-4构建体以其去糖基化形式进行FcεRI的结合研究。

方法：

用荧光染料NHS-Fluo488标记8A6(IgE)和(IgG)。

根据制造商的说明，通过PD-10柱将500μg每种抗体脱盐到PBS中。使用光度计在280nm(参考：320nm)处测量洗脱级分的吸光度，并且合并含有最高抗体量的级分。通过Vivaspin4柱浓缩后，可以重新获得约400μg的抗体。

将荧光染料Fluo488在DMSO中重构，并且通过在517nm处测量在其发射最大值处的荧光来计算其浓度。

将抗体和染料以1:10的摩尔比混合，在使样品涡旋下将染料缓慢加入到抗体溶液中。抗体和染料量的确切计算可见附录。在25℃下以300rpm恒速振荡(EppendorfThermomixer)温育溶液1小时。通过采用PD-10柱的纯化将游离的染料分子分离。将在280nm(抗体)和510nm(染料)处测量的具有最高标记蛋白质量的级分合并，再次通过Vivaspin4柱浓缩，并计算最终浓度和标记度(D.O.L.)。

计算最终标记的抗体：

ch8A6-cε2-4-degly-T：1.35μg/μl，D.O.L.:2.2

ch8A6_cε3-4-degly-T：1μg/μl，D.O.L.:2.86

荧光染料和抗体量的计算：

·8A6(IgE)的分子量：约176,000Da＝176,000g/mol

→350μg抗体＝2nmol

·Fluo488的分子量：约981mol/l

→在DMSO中不定量的重悬浮

→在水中以1:5,000的稀释和OD₅₁₇的测量(染料的最大发射)

→浓度[μg/μl]＝稀释因子×OD517×918/80,000

＝8.6nmol/μl

·染料与抗体比率的计算：

→染料:抗体的所需摩尔比＝10:1

→抗体2nmol→染料20nmol

→2.3μl染料

标记度(D.O.L)的计算：

·用于计算蛋白质浓度和D.O.L的定义

→A_max＝染料的最大发射处的吸光度，Fluo488为517nm

→A₂₈₀＝280nm处的吸光度(蛋白质)

→CF＝校正因子；由Interchim专门针对与蛋白质结合的每种染料而定义；A₂₈₀(游离染料)/A_max(游离染料)

→MW：蛋白质的分子量

→ε：消光系数

·c[蛋白质]＝1,4×(A₂₈₀–A_max×CF)

·D.O.L.＝(A_max×MW)/(c[蛋白质]×ε_染料)

通过Ficoll密度梯度离心法制备PBMC

将来自健康供体的血沉棕黄层用HBSS 1:1稀释，并使30ml在50ml Falcon管中的15ml Biocoll分离溶液上分层。在1000xg下离心20分钟而不中断的情况下，用塑料移液管收集白细胞部分。将细胞用完全生长培养基洗涤两次，并在Neubauer计数室中计数。

ch8A6_cε2-4-degly-T和ch8A6_N297A在PBMC上的结合动力学

将100μl完全生长培养基中的0.5×10⁶个PBMC在位于37℃下的培养箱中的96孔板(平底)中用以下抗体稀释物温育：2μg/ml ch8A6_cε2-4-degly-T cFluo488、2μg/mlch8A6_N297A-Fluo488、2μg/ml8A6cε2-4-degly-T。每一时间点都准备一个额外的孔。作为对照，通过在室温下用5倍摩尔过量SM101预温育ch8A6_cε2-4-degly-T-Fluo48830分钟来阻断PBMC上与FcγRIIB的结合。在Raji细胞上温育后，通过FACS分析测试FcγRIIB结合位点的封闭。

温育10、30、60、120和240分钟后，以及温育过夜后，将细胞在400xg下旋转(spundown)5分钟并重悬浮于在圆底96孔板中的含有2.5μlα-hCD19-PeCy7、5μlα-hCD63 PerCP和2.5μlα-hCD193-APC的100μl FACS缓冲液中并在冰上达30分钟。在采用FACS缓冲液的两次洗涤步骤后，用FACS Canto II分析样品。

Fluo488标记的8A6-IgG和8A6-IgE与Raji细胞的结合

用不同浓度的标记抗体温育Raji细胞，并将平均荧光值相对于抗体浓度作图。在Raji细胞表面，抗体8A6_cε2-4-degly显示出了结合其受体FcγRIIB的高亲和性(参见图21)。通过对用相同构建体温育的CHO细胞的分析证实了该结合的特异性，其中，由于CHO细胞缺乏FcεRI受体，如预期那样未检测到标记抗体的表面信号。这些数据确认，在整个标记过程或通过结合的荧光染料NHS-Fluo488，抗体的结合没有改变。

8A6_cε2-4-degly的FcγRIIB结合位点的SM101掩蔽控制

为了能够检测到8A6-IgE的Fc部分与细胞的结合，通过用SM101预温育抗体分别阻断F(ab)₂结构域，FcγRIIB结合位点。用FACS分析构建体的结合能力。FACS分析清楚地显示了在用5倍摩尔过量的可溶性受体(SM101)预温育后8A6_cε2-4-degly与其受体FcγRIIB的阻断。与未处理的抗体相比，用SM101预温育后的平均荧光值降低至11.8％。因此，掩蔽的8A6_cε2-4-degly抗体可用作PBMC温育的对照。

PBMC上的结合动力学

通过FACS分析评估分离的PBMC上的用Fluo488标记的抗体8A6_IgE的结合。因此，将细胞用α-hCD193-APC和α-hCD19-PeCy7染色以区分B细胞(CD19)和嗜碱性粒细胞(CD193，低SSC)。将CD63染色以分析嗜碱性粒细胞的活化。

在测量过程中，嗜碱性粒细胞上的CD63表达不变(未示出)。

图22示出了通过α-hCD19-PeCy7抗体检测的B细胞上的荧光信号。绿色数字反映了测量的对于Fluo488标记的抗体的CD19阳性细胞的平均荧光值。

实施例9：嗜碱性粒细胞的活化试验(BAT)

这一测定基于最初由Sainte-Laudy等1994(Sainte-Laudy,J等，Analysis ofmembrane expression of the CD63human basophil activation marker.Applicationsto allergologic diagnosis.Allerg.Immunol.(Paris)26,211-4)和1996(Sabbah,A和Sainte-Laudy,J.,Flow Cytometry applied to the analysis of Lymphocyte andBasophil activation.ACI International 8,116-9)描述的方法，其中通过测量细胞表面上CD63(gp53)增加的流式细胞术来检测由过敏原或对照引起的嗜碱性粒细胞活化。将过敏原和阳性对照加入肝素化全血中，并通过包含鉴定嗜碱性粒细胞的抗-hCD193和测量活化的抗-hCD63的特异性抗体染色来测量CD63表面表达。可以平行测量组胺释放，以作为嗜碱性粒细胞活化和脱粒的第二个参数。

通过在嗜碱性粒细胞表面处使FcγRIIB和FcεRI与8A6-IgE交联，通过FcεRI的对过敏原的细胞响应下调。

获得了50μl来自具有已知花粉变态反应(或其他定义的具有可用于测试的过敏原的变态反应)的供体的肝素化全血。

在这些实验中，使用ch8A6_cε2-4-degly抗体与ch8A6_N297A嵌合8A6(IgG)(N297A突变体)进行比较。

如试剂盒手册中所述，对于阳性和阴性对照，用过敏原或对照的15分钟温育时间足以使嗜碱性粒细胞适当活化。

用50μl刺激物(过敏原，fMLP或抗FcεRI对照抗体)和100μl刺激缓冲液温育50μl肝素化全血。按照试剂盒手册中所述溶解α-FcεRI和fMLP，不经稀释使用。将过敏原在刺激缓冲液中1:5稀释。在Falcon管中制备缓冲液和刺激物，并将50μl血液样品直接加入到该溶液中而不与管壁接触。加入溶解在刺激缓冲液中的20μl染色试剂或商购可获得的抗体(α-hCD63-PE和α-hCD193-Alexa647)。将样品轻轻涡旋，并在预热至37℃的水浴中温育15分钟。为了裂解，将2ml裂解试剂施加到每个管中，然后将样品涡旋，并在室温下、黑暗中温育10分钟。在500xg下离心5分钟后，移除上清液，将团粒重新悬浮于试剂盒的300μl洗涤缓冲液中。采用以下设置在FACS Canto II上进行FACS分析：

FSC 线性电压：269

SSC 线性电压：401

FITC log 电压：447

PE log 电压：379

所述试剂盒中含有α-FcεRI抗体和肽fMLP(甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸，SEQID NO:38)，且每个样品使用50μl。

门控策略

图23示出了在裂解的全血上的门控策略。将参数FSC和SSC设置为线性。三个群是可见的：淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。可以在与淋巴细胞相同的SSC水平检测嗜碱性粒细胞。针对SSC绘制CD193表达，得到表达CD193的两个不同群的检测。将具有低SSC的群鉴定为嗜碱性粒细胞。在显示CD193(Y轴)相对于CD63(X轴)表达的图中应用象限门，以使得未处理样品中的CD63荧光几乎为零。

采用背栅(backgating)策略，进一步表征所述细胞群。

将包括CD63低表达群和CD63高表达群体的门与用未门控全血裂解物的FSC-SSC图叠加。发现低表达群在淋巴细胞群附近沉降，这证实该门控群是嗜碱性粒细胞。相反，在SSC轴的最右极限处发现高表达群，这反映了那些细胞是高度颗粒状的并且是嗜酸性粒细胞。

阳性和阴性对照的CD63表达

将未处理细胞的CD63表达设定为0％或者在已经设定在嗜碱性粒细胞上的象限门的下象限中的仅极少数阳性细胞。α-FcεRI抗体可再重现地活化嗜碱性粒细胞至90％CD63阳性细胞的水平，而肽fMLP仅诱导其中25-30％的细胞为阳性的中等CD63表达。

为了确定应当测试其降低过敏反应的能力的抗体是否可以活化嗜碱性粒细胞本身，以两种不同浓度施用ch8A6_N297A和ch8A6_cε2-4-degly，而不进一步活化细胞。

图24示出了这些样品获得的数据。

如上图所示，用0.5或2μg/ml的8A6-IgG或8A6-IgE温育全血样品并未活化嗜碱性粒细胞本身。CD63的表面表达没有变化，并在两个独立实验中检测到小于1％的阳性细胞。

在下一步的分析中，研究了内毒素污染对嗜碱性粒细胞活化的作用。由于8A6_cε2-4-degly含有～30EU/ml来自生产过程的内毒素，因此进行LPS对照以排除源自污染物质的作用。因此，与单独的8A6_cε2-4-degly平行，用50EU/ml LPS(在测定中以1:4稀释)温育单独的血液样品。如图25所示，用以污染生产中预期浓度的LPS处理嗜碱性粒细胞没有导致细胞的非特异性活化。因此，用8A6_cε2-4-degly处理后测量的作用可以直接与抗体的活性关联。

用8A6_cε2-4-degly的嗜碱性粒细胞的预防性处理

用不同浓度的对照8A6_N297A和8A6_cε2-4-degly温育全血样品。在不同的时间点采集样品并测量嗜碱性粒细胞被花粉活化的能力。

A)时间点0时

在将相应的抗体加入全血等分试样后，直接取时间点0的第一样品，并分析它们被花粉刺激活化的潜力。在两个独立的实验中测量这一时间点。代表了用所述抗体温育约5分钟(从移液到样品温育的时间)的这一时间点没有观察到8A6_N297A或8A6_cε2-4-degly的作用。所有样品中的嗜碱性粒细胞都可被花粉活化至约90％的CD63表达细胞。

B)时间点2时

温育2小时后，如通过α-FcεRI活化(92％阳性细胞)和未经花粉刺激处理的细胞(93.4％)所示，检测到未损失活性的嗜碱性粒细胞的活化。以浓度范围为0.5-5μg/ml的8A6_N297A的温育未影响花粉对嗜碱性粒细胞的活化(其值为91至91.6％阳性细胞)。在这个时间点，虽然没有检测到剂量依赖性，但是用8A6_cε2-4-degly处理的样品中嗜碱性粒细胞活化似乎减少了(84.4至88％)。

C)时间点6时

温育6小时后，细胞被阳性对照活化的潜力降低至花粉活化的约85％，和用α-FcεRI处理的87％(图26)。而用8A6-IgG处理显示出与阳性对照相当的结果(85-88％)，用8A6-IgE温育的细胞显示出降低的活化潜力(76-84％)(图27)。用0.5μg/ml 8A6_cε2-4-degly温育后，只有76.6％的嗜碱性粒细胞可被花粉活化。然而，没有检测到剂量依赖性，且与0.5μg/ml处理相比，较高剂量显示出略高的CD63表达。

D)时间点24时

在两个独立实验中测量的最后时间点显示，α-FcεRI处理的活化降低至75％CD63表达(图28和图29)。

实施例10：花粉活化试验

将来自对花粉特应性测试为阳性的健康供体的肝素化全血分别用5μg/ml的去糖基化8A6_ce2-4或去糖基化的8A6_ce3-4(SM301cε2-4或cε3-4)温育过夜。为了分析，将50μl血液样品与50μl花粉(在刺激缓冲液中以1:5预稀释)、100μl刺激缓冲液(FlowCast Kit)和20μl染色溶液(3μl a-hCD193-Alexa647、3μl a-hCD63–PerCP、3μl a-hCD203c-PE、11μl刺激缓冲液)混合。将样品在涡旋混合器上轻轻混合并在预热至37℃的水浴中温育15分钟。为了裂解，将2ml PharmLyse试剂(BD Biosciences)施加到每个管中，然后将样品再次混合，并在室温下在黑暗中温育10分钟。以500xg离心5分钟后，除去上清液，将团粒重悬浮于300μl FACS缓冲液中。在SSC高、CD193阳性但CD203c阴性的细胞上设置门，构成嗜酸性粒细胞。

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本文描述了本发明的某些实施方案，包括本发明人已知的用于实施本发明的最佳模式。当然，本领域技术人员通过阅读上述说明将明白这些所述实施方案的变化。本发明人预期技术人员视需要采用这些变化，并且本发明人有意以与本文特别描述的不同的方式实践本发明。因此，本发明包括适用法律允许的在所附权利要求中列举的主题的所有变型和等同物。此外，除非本文另外指出或者上下文明确地有相反含义，否则其所有可能变化中的上述元素的任何组合都由本发明涵盖。

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此外，贯穿本说明，已经参考了许多专利和印刷公开。每个上述参考文献和印刷公开都单独地通过引用以其整体并入本文。

总而言之，应理解，本文公开的本发明的实施方案是本发明的原理的例示。可采用的其它修变在本发明的范围内。因而，作为示例，但不作为限制，可根据本文的教导采用本发明的可替换构造。因而，本发明不限于精确所示和所述的内容。

序列表

<110> 苏伯利莫尔公司

<120> 针对Fcγ受体IIB及Fcε受体的新型抗体

<130> LC17310002P

<150> EP14002825.9

<151> 2014-08-13

<160> 38

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 113

<212> PRT

<213> 褐鼠(Rattus norvegicus)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(113)

<223> VH r8A6

<400> 1

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Lys Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Ser Asp Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Arg Ser Asn Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Pro Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 2

<211> 108

<212> PRT

<213> 褐鼠

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> VL r8A6

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(108)

<223> VL r8A6

<400> 2

Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Thr Ser Met Phe Ile Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Met Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Tyr

20 25 30

Val Asp Trp Phe Gln Gln Lys Thr Gly Gln Ser Pro Thr Leu Leu Ile

35 40 45

Phe Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Ser Asn Met Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asn Tyr His Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Pro Gly Thr Thr Leu Glu Leu Lys Arg

100 105

<210> 3

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人源化抗体

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(113)

<223> VH hu8A6

<400> 3

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Gly Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Pro Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 4

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人源化抗体

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(108)

<223> VL hu8A6

<400> 4

Gln Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Tyr

20 25 30

Val Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asn Asn His Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 5

<211> 181

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(181)

<223> 人FcyRIIB

<400> 5

Met Gly Thr Pro Ala Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro

1 5 10 15

Gln Trp Ile Asn Val Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Arg

20 25 30

Gly Thr His Ser Pro Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly

35 40 45

Asn Leu Ile Pro Thr His Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn

50 55 60

Asn Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu

65 70 75 80

Ser Asp Pro Val His Leu Thr Val Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln

85 90 95

Thr Pro His Leu Glu Phe Gln Glu Gly Glu Thr Ile Val Leu Arg Cys

100 105 110

His Ser Trp Lys Asp Lys Pro Leu Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn

115 120 125

Gly Lys Ser Lys Lys Phe Ser Arg Ser Asp Pro Asn Phe Ser Ile Pro

130 135 140

Gln Ala Asn His Ser His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile

145 150 155 160

Gly Tyr Thr Leu Tyr Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Ala

165 170 175

Pro Ser Ser Ser Pro

180

<210> 6

<211> 329

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人源化抗体

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(329)

<223> CH hu8A6_wt

<400> 6

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

325

<210> 7

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人源化抗体

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(106)

<223> CL hu8A6_wt

<400> 7

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

1 5 10 15

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

20 25 30

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

35 40 45

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

50 55 60

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

65 70 75 80

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

85 90 95

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 8

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 人源化抗体

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(339)

<223> VH hu8A6

<400> 8

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt gactattaca tggcctgggt ccgccaggct 120

ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcatcc atatcatacg atggaagcaa taagtactac 180

ggagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gagaccggga 300

gactactggg gccaaggaac cctggtcacc gtcagctca 339

<210> 9

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 人源化抗体

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(324)

<223> VL hu8A6

<400> 9

cagatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 60

ctctcctgca gggccagtca gtccgttggc tcctatgtcg actggtacca gcagaaacct 120

ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatccacca ggtacactgg tatcccagcc 180

aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 240

gaagattttg cagtttatta ctgtctgcag tataacaacc atccttacac ttttggccag 300

gggaccaagc tggagatcaa acgt 324

<210> 10

<211> 990

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 人源化抗体

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(990)

<223> CH hu8A6_wt

<400> 10

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggttgagccc 300

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 720

atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960

cagaagagcc tctccctgtc tccgggttaa 990

<210> 11

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 人源化抗体

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(321)

<223> CL hu8A6_wt

<400> 11

acggtggctg caccatcggt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 60

actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg 120

aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc 180

aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa 240

cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc 300

ttcaacaggg gagagtgtta g 321

<210> 12

<211> 125

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(125)

<223> hu可溶性FCyRIIA

<400> 12

Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Thr Cys Gln Thr

1 5 10 15

Gly Gln Thr Ser Leu Ser Asp Pro Val His Leu Thr Val Leu Ser Glu

20 25 30

Trp Leu Val Leu Gln Thr Pro His Leu Glu Phe Gln Glu Gly Glu Thr

35 40 45

Ile Met Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asp Lys Pro Leu Val Lys Val

50 55 60

Thr Phe Phe Gln Asn Gly Lys Ser Gln Lys Phe Ser Arg Leu Asp Pro

65 70 75 80

Thr Phe Ser Ile Pro Gln Ala Asn His Ser His Ser Gly Asp Tyr His

85 90 95

Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr Thr Leu Phe Ser Ser Lys Pro Val Thr

100 105 110

Ile Thr Val Gln Val Pro Ser Met Gly Ser Ser Ser Pro

115 120 125

<210> 13

<211> 179

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(179)

<223> 可溶性突变的人FCyRIIA

<400> 13

Met Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Pro Trp Ile Asn

1 5 10 15

Val Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Gln Gly Ala Arg Ser

20 25 30

Pro Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu Ile Pro

35 40 45

Thr His Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn Asp Ser

50 55 60

Gly Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser Asp Pro Val

65 70 75 80

His Leu Thr Val Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr Pro His Leu

85 90 95

Glu Phe Gln Glu Gly Glu Thr Ile Met Leu Arg Cys His Ser Trp Lys

100 105 110

Asp Lys Pro Leu Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly Lys Ser Lys

115 120 125

Lys Phe Ser Arg Ser Asp Pro Asn Phe Ser Ile Pro Gln Ala Asn His

130 135 140

Ser His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr Thr Leu

145 150 155 160

Phe Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Val Pro Ser Met Gly

165 170 175

Ser Ser Pro

<210> 14

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 来自大鼠抗体8A6的重链CDR1

<400> 14

Asp Tyr Tyr Met Ala

1 5

<210> 15

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 来自大鼠抗体8A6的重链CDR2

<400> 15

Ser Ile Ser Ser Asp Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 16

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 来自大鼠抗体8A6的重链CDR3

<400> 16

Ala Arg Pro Gly Asp Tyr

1 5

<210> 17

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 来自大鼠抗体8A6的轻链CDR1

<400> 17

Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Tyr Val Asp

1 5 10

<210> 18

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 来自大鼠抗体8A6的轻链CDR2

<400> 18

Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr

1 5

<210> 19

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 来自大鼠抗体8A6的轻链CDR3

<400> 19

Leu Gln Tyr Asn Tyr His Pro Tyr Thr

1 5

<210> 20

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 来自人源化抗体8A6的重链CDR1

<400> 20

Asp Tyr Tyr Met Ala

1 5

<210> 21

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 来自人源化抗体8A6的重链CDR2

<400> 21

Ser Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 22

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 来自人源化抗体8A6的重链CDR3

<400> 22

Ala Arg Pro Gly Asp Tyr

1 5

<210> 23

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 来自人源化抗体8A6的轻链 CDR1

<400> 23

Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Tyr Val Asp

1 5 10

<210> 24

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 来自人源化抗体8A6的轻链CDR2

<400> 24

Gly Ala Ser Thr Arg Tyr Thr

1 5

<210> 25

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 来自人源化抗体8A6的轻链CDR3

<400> 25

Leu Gln Tyr Asn Asn His Pro Tyr Thr

1 5

<210> 26

<211> 104

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 抗体GB3重链的可变区

<400> 26

Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser

1 5 10 15

Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr

20 25 30

Ile Tyr Trp Val Lys Gln Trp Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Trp Ile Phe Pro Gly Thr Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Asn Phe Lys

50 55 60

Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ile Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met

65 70 75 80

Leu Leu Gly Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Tyr

85 90 95

Gly Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100

<210> 27

<211> 104

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 抗体GB3轻链的可变区

<400> 27

Arg Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Leu Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Thr Ser Ala Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Asn Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Asn Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

100

<210> 28

<211> 329

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 关于位置1作为位置118时在位置297处具有N到A变化的IgG重链恒定区

<400> 28

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

325

<210> 29

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 来自重链可变区的CDR1

<220>

<221> misc

<222> (1)..(1)

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<220>

<221> misc

<222> (1)..(1)

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<220>

<221> misc

<222> (2)..(2)

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<220>

<221> misc

<222> (3)..(3)

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<220>

<221> misc

<222> (3)..(3)

<223> Xaa 可以是任何氨基酸

<400> 29

Xaa Xaa Xaa Met Ala

1 5

<210> 30

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 来自重链可变区的CDR2

<220>

<221> misc

<222> (2)..(2)

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<220>

<221> misc

<222> (2)..(2)

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<220>

<221> misc

<222> (8)..(8)

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<220>

<221> misc

<222> (9)..(9)

<223> Xaa可以是K或T

<220>

<221> misc

<222> (10)..(10)

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<220>

<221> misc

<222> (11)..(11)

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<220>

<221> misc

<222> (16)..(16)

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<220>

<221> misc

<222> (17)..(17)

<223> Xaa 可以是任何氨基酸

<220>

<221> misc

<222> (17)..(17)

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<400> 30

Ser Xaa Ser Tyr Asp Gly Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Asp Ser Val Xaa

1 5 10 15

Xaa

<210> 31

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 来自重链可变区的CDR3

<220>

<221> misc

<222> (3)..(3)

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<220>

<221> misc

<222> (3)..(3)

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<220>

<221> misc

<222> (5)..(5)

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<220>

<221> misc

<222> (6)..(6)

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<220>

<221> misc

<222> (6)..(6)

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<400> 31

Ala Arg Xaa Gly Xaa Xaa

1 5

<210> 32

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 来自轻链可变区的CDR1

<220>

<221> misc

<222> (1)..(1)

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<220>

<221> misc

<222> (2)..(2)

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<220>

<221> misc

<222> (3)..(3)

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<220>

<221> misc

<222> (4)..(4)

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<220>

<221> misc

<222> (5)..(5)

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<220>

<221> misc

<222> (7)..(7)

<223> Xaa 可以是任何氨基酸

<220>

<221> misc

<222> (8)..(8)

<223> Xaa可以是S或T

<220>

<221> misc

<222> (9)..(9)

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<400> 32

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa Xaa Xaa Val Asp

1 5 10

<210> 33

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 来自轻链可变区的CDR2

<220>

<221> misc

<222> (2)..(2)

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<220>

<221> misc

<222> (3)..(3)

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<220>

<221> misc

<222> (4)..(4)

<223> Xaa可以是T或N

<400> 33

Gly Xaa Xaa Xaa Arg Tyr Thr

1 5

<210> 34

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 来自轻链可变区的CDR3

<220>

<221> misc

<222> (1)..(1)

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<220>

<221> misc

<222> (1)..(1)

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<220>

<221> misc

<222> (2)..(2)

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<220>

<221> misc

<222> (3)..(3)

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<220>

<221> misc

<222> (4)..(4)

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<220>

<221> misc

<222> (7)..(7)

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<220>

<221> misc

<222> (8)..(8)

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<220>

<221> misc

<222> (9)..(9)

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<220>

<221> misc

<222> (9)..(9)

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<400> 34

Xaa Xaa Xaa Xaa Asn His Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 35

<211> 433

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人IgE恒定区

<400> 35

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr Phe Ser Val Ser Ser Arg

100 105 110

Asp Phe Thr Pro Pro Thr Val Lys Ile Leu Gln Ser Ser Cys Asp Gly

115 120 125

Gly Gly His Phe Pro Pro Thr Ile Gln Leu Leu Cys Leu Val Ser Gly

130 135 140

Tyr Thr Pro Gly Thr Ile Asn Ile Thr Trp Leu Glu Asp Gly Gln Val

145 150 155 160

Met Asp Val Asp Leu Ser Thr Ala Ser Thr Thr Gln Glu Gly Glu Leu

165 170 175

Ala Ser Thr Gln Ser Glu Leu Thr Leu Ser Gln Lys His Trp Leu Ser

180 185 190

Asp Arg Thr Tyr Thr Cys Gln Val Thr Tyr Gln Gly His Thr Phe Glu

195 200 205

Asp Ser Thr Lys Lys Cys Ala Asp Ser Asn Pro Arg Gly Val Ser Ala

210 215 220

Tyr Leu Ser Arg Pro Ser Pro Phe Asp Leu Phe Ile Arg Lys Ser Pro

225 230 235 240

Thr Ile Thr Cys Leu Val Val Asp Leu Ala Pro Ser Lys Gly Thr Val

245 250 255

Asn Leu Thr Trp Ser Arg Ala Ser Gly Lys Pro Val Asn His Ser Thr

260 265 270

Arg Lys Glu Glu Lys Gln Arg Asn Gly Thr Leu Thr Val Thr Ser Thr

275 280 285

Leu Pro Val Gly Thr Arg Asp Trp Ile Glu Gly Glu Thr Tyr Gln Cys

290 295 300

Arg Val Thr His Pro His Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr Thr

305 310 315 320

Lys Thr Ser Gly Pro Arg Ala Ala Pro Glu Val Tyr Ala Phe Ala Thr

325 330 335

Pro Glu Trp Pro Gly Ser Arg Asp Lys Arg Thr Leu Ala Cys Leu Ile

340 345 350

Gln Asn Phe Met Pro Glu Asp Ile Ser Val Gln Trp Leu His Asn Glu

355 360 365

Val Gln Leu Pro Asp Ala Arg His Ser Thr Thr Gln Pro Arg Lys Thr

370 375 380

Lys Gly Ser Gly Phe Phe Val Phe Ser Arg Leu Glu Val Thr Arg Ala

385 390 395 400

Glu Trp Glu Gln Lys Asp Glu Phe Ile Cys Arg Ala Val His Glu Ala

405 410 415

Ala Ser Pro Ser Gln Thr Val Gln Arg Ala Val Ser Val Asn Pro Gly

420 425 430

Lys

<210> 36

<211> 332

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 恒定IgE结构域3和4

<400> 36

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Val Ser Ala Tyr Leu Ser Arg Pro

115 120 125

Ser Pro Phe Asp Leu Phe Ile Arg Lys Ser Pro Thr Ile Thr Cys Leu

130 135 140

Val Val Asp Leu Ala Pro Ser Lys Gly Thr Val Asn Leu Thr Trp Ser

145 150 155 160

Arg Ala Ser Gly Lys Pro Val Asn His Ser Thr Arg Lys Glu Glu Lys

165 170 175

Gln Arg Asn Gly Thr Leu Thr Val Thr Ser Thr Leu Pro Val Gly Thr

180 185 190

Arg Asp Trp Ile Glu Gly Glu Thr Tyr Gln Cys Arg Val Thr His Pro

195 200 205

His Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr Thr Lys Thr Ser Gly Pro

210 215 220

Arg Ala Ala Pro Glu Val Tyr Ala Phe Ala Thr Pro Glu Trp Pro Gly

225 230 235 240

Ser Arg Asp Lys Arg Thr Leu Ala Cys Leu Ile Gln Asn Phe Met Pro

245 250 255

Glu Asp Ile Ser Val Gln Trp Leu His Asn Glu Val Gln Leu Pro Asp

260 265 270

Ala Arg His Ser Thr Thr Gln Pro Arg Lys Thr Lys Gly Ser Gly Phe

275 280 285

Phe Val Phe Ser Arg Leu Glu Val Thr Arg Ala Glu Trp Glu Gln Lys

290 295 300

Asp Glu Phe Ile Cys Arg Ala Val His Glu Ala Ala Ser Pro Ser Gln

305 310 315 320

Thr Val Gln Arg Ala Val Ser Val Asn Pro Gly Lys

325 330

<210> 37

<211> 600

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 可溶性FcεRI的质粒DNA序列

<400> 37

atgggtgaca atgacatcca ctttgccttt ctctccacag gtgtccagtc cgtccctcag 60

aaacctaagg tctccttgaa ccctccatgg aatagaatat ttaaaggaga gaatgtgact 120

cttacatgta atgggaacaa tttctttgaa gtcagttcca ccaaatggtt ccacaatggc 180

agcctttcag aagagacaaa ttcaagtttg aatattgtga atgccaaatt tgaagacagt 240

ggagaataca aatgtcagca ccaacaagtt aatgagagtg aacctgtgta cctggaagtc 300

ttcagtgact ggctgctcct tcaggcctct gctgaggtgg tgatggaggg ccagcccctc 360

ttcctcaggt gccatggttg gaggaactgg gatgtgtaca aggtgatcta ttataaggat 420

ggtgaagctc tcaagtactg gtatgagaac cacaacatct ccattacaaa tgccacagtt 480

gaagacagtg gaacctacta ctgtacgggc aaagtgtggc agctggacta tgagtctgag 540

cccctcaaca ttactgtaat aaaagctccg cgtgagaagc accatcacca ccatcactga 600

<210> 38

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> fMLF肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> 甲酰化

<400> 38

Met Leu Phe

1

Claims

1.一种识别分子，其以第一结合结构域结合Fcε受体(FcεR)且以第二结合结构域结合Fcγ受体IIB(FcγRIIB)。

2.根据权利要求1所述的识别分子，其是抗体。

3.根据权利要求2所述的识别分子，其中所述抗体不结合Fcγ受体IIA(FcγRIIA)。

4.根据权利要求2或3所述的识别分子，其中所述抗体是非封闭性抗体，使得所述抗体通过其可变区与所述Fc受体的结合不干扰免疫复合物、或聚集的IgG与细胞的结合。

5.根据权利要求4所述的识别分子，其中所述抗体是嵌合的或人源化的。

6.根据前述权利要求中任一项所述的识别分子，其中所述第一结合结构域包含IgE恒定区的至少一部分。

7.根据前述权利要求中任一项所述的识别分子，其中所述第二结构域包含Fab结构域的至少一部分。

8.根据前述权利要求中任一项所述的识别分子，其中所述第二结合结构域至少含有：(i)重链可变区，其包含与氨基酸序列SEQ ID NO.1具有至少80％同一性的氨基酸序列，和(ii)轻链可变区，其包含与氨基酸序列SEQ ID NO.2具有至少65％同一性的氨基酸序列。

9.根据前述权利要求中任一项所述的识别分子，其中所述第二结合结构域含有以下中的至少一个：(i)重链可变区，其包含与氨基酸序列SEQ ID NO.3具有至少90％同一性的氨基酸序列，和(ii)轻链可变区，其包含与氨基酸序列SEQ ID NO.4具有至少90％同一性的氨基酸序列。

10.根据前述权利要求中任一项所述的识别分子，所述识别分子在其第二结合结构域中包含下列可变重区和轻区的CDR序列：

(i)H-CDR1序列，其与SEQ ID NO.20中所示的H-CDR1序列具有60％或更多的同一性；

(ii)H-CDR2序列，其与SEQ ID NO.21中所示的H-CDR2序列具有36％或更多的同一性；

(iii)H-CDR3序列，其与SEQ ID NO.22中所示的H-CDR3序列具有50％或更多的同一性；

(iv)L-CDR1序列，其与SEQ ID NO.23中所示的L-CDR1序列具有64％或更多的同一性；

(v)L-CDR2序列，其与SEQ ID NO.24中所示的L-CDR2序列具有29％或更多的同一性；和

(vi)L-CDR3序列，其与SEQ ID NO.25中所示的L-CDR3序列具有78％或更多的同一性；

其中与未采用所述识别分子处理的Daudi细胞相比，所述识别分子使Daudi细胞的FcγRIIB的ITIM磷酸化增加约4至10倍。

11.根据权利要求10所述的识别分子，所述识别分子在其重链可变区中包含SEQ IDNO.29、30和31中所示的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3，和在其轻链可变区中包含SEQ ID NO.32、33和34中所示的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3，其中与未采用所述识别分子处理的Daudi细胞相比，所述识别分子使Daudi细胞的FcγRIIB的ITIM磷酸化增加约4至10倍。

12.根据权利要求10或11所述的识别分子，所述识别分子在其重链和轻链可变区中包含下列CDR序列：

(a)在其重链可变区中包含SEQ ID NO.14(CDR-H1)、SEQ ID NO.15(CDR-H2)和SEQ IDNO.16(CDR-H3)，和在其轻链可变区中包含SEQ ID NO.17(CDR-L1)、SEQ ID NO.18(CDR-L2)和SEQ ID NO.19(CDR-L3)；或

(b)在其重链可变区中包含SEQ ID NO.20(CDR-H1)、SEQ ID NO.21(CDR-H2)和SEQ IDNO.22(CDR-H3)，和在其轻链可变区中包含SEQ ID NO.23(CDR-L1)、SEQ ID NO.24(CDR-L2)和SEQ ID NO.25(CDR-L3)。

13.根据前述权利要求中任一项所述的识别分子，其中所述重链可变区包含SEQ IDNO.3中所示的氨基酸序列，并具有至少一个选自以下的突变：位置1处的氨基酸Q被E取代，位置11处的氨基酸V被L取代，位置42处的氨基酸G被K取代，位置50处的氨基酸S被V取代，位置53处的氨基酸Y被S取代，位置58处的氨基酸K被T取代，位置61处的氨基酸G被A取代，位置75处的氨基酸S被T取代，位置76处的氨基酸K被R取代，位置77处的氨基酸N被S取代，和位置78处的氨基酸T被N取代。

14.根据前述权利要求中任一项所述的识别分子，其中所述轻链可变区包含SEQ IDNO.4中所示的氨基酸序列，并具有至少一个选自以下的突变：位置1处的氨基酸Q被N取代，位置28处的氨基酸S被N取代，位置31处的氨基酸S被T取代，位置33处的氨基酸V被L取代，位置34处的氨基酸D被A取代，位置49处的氨基酸Y被F取代，位置53处的氨基酸T被N取代，位置55处的氨基酸Y被A取代，位置89处的氨基酸L被Q取代，和位置93处的氨基酸N被Y取代。

15.根据前述权利要求中任一项所述的识别分子，其中与未采用所述识别分子处理的Daudi细胞相比，所述识别分子使Daudi细胞的FcγRIIB的ITIM磷酸化增加约4至10倍。

16.根据前述权利要求中任一项所述的识别分子，其中所述第二结合结构域在其重链可变区中具有SEQ ID NO.1或3中所示的氨基酸序列和/或在其轻链可变区中具有SEQ IDNO.2或4中所示的氨基酸序列。

17.根据权利要求6至16中任一项所述的识别分子，其中所述IgE恒定区具有SEQ IDNO.35、36或其部分的氨基酸序列。

18.根据权利要求2至17中任一项所述的识别分子，其中所述抗体是糖基化的或去糖基化的。

19.根据权利要求2至18中任一项所述的识别分子，其中所述抗体在体外以具有至少4.9x10^-4s^-1的解离速率常数的亲和性结合人FcγRIIB。

20.根据权利要求2至19中任一项所述的识别分子，其中所述抗体在体外以具有至少1.2x10^-7Kd(M)的亲和性结合人FcεRI。

21.根据前述权利要求中任一项所述的识别分子，其特异性结合包含根据SEQ ID NO.7的人FcγRIIB的氨基酸20-40的表位。

22.一种编码权利要求1至21中任一项所述识别分子的核酸序列。

23.一种载体，其包含插入所述载体的根据权利要求22所述的核酸序列中的至少一种。

24.一种用根据权利要求22所述的核酸序列或根据权利要求23所述的载体转染的宿主细胞。

25.一种药物组合物，其包含权利要求1至21中任一项所述的识别分子、权利要求22所述的核酸、权利要求23所述的载体或权利要求24所述的宿主细胞作为活性成分。

26.根据权利要求25所述的药物组合物，其用于治疗或预防与嗜碱性粒细胞相关的疾病。

27.根据权利要求26所述的药物组合物，其用于治疗或预防过敏。

28.根据权利要求1至21中任一项所述的识别分子，其用于在治疗中的用途。

29.根据权利要求1至21中任一项所述的识别分子，其用于在治疗或预防与嗜碱性粒细胞相关的疾病中的用途。

30.根据权利要求29所述的用于所述用途的识别分子，其中所述与嗜碱性粒细胞相关的疾病是过敏性疾病。