JP6808611B2 - Fcγ受容体IIBおよびFcε受容体に対する新規の抗体 - Google Patents
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Description
本発明の認識分子の結合ドメインはリンカーを介して連結され得る。リンカーはペプチドリンカーであり得る。リンカーは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個またはそれ以上のアミノ酸を含み(またはからなり)得る。ペプチドリンカーの好ましい例は、(G4S)n(nは1〜5の範囲内の整数);(AP)2;(AP)4;(AP)5-7である。
用語「結合ドメイン」は、その標的分子(FcεRおよびFcγRIIBそれぞれ)上の所定の標的エピトープまたは所定の標的部位と特異的に結合/相互作用することができるドメインを本開示に関して特徴付ける。結合ドメインは、結合ドメインドナー(例えば、抗体または上述の足場のいずれか)に由来し得る。
用語「結合ドメイン」は、本明細書において使用される場合、結合ドメインが、能動的に標的に結合し得るか、または、例えば受容体によって、受動的に結合され得ることを包含する。従って、結合ドメインは、本発明の開示される分子の意味において、Fc受容体などの受容体のリガンドであり得る。
「エピトープ」は、連続アミノ酸、またはタンパク質の三次元折り畳みによって並置される非連続アミノ酸の両方によって形成され得る。「線形エピトープ」は、アミノ酸一次配列が認識されるエピトープを含むエピトープである。線形エピトープは、典型的には、ユニーク配列中に少なくとも3個、または少なくとも4個、より通常は、少なくとも5個、または少なくとも6個、または少なくとも7個、例えば、約8〜約10個のアミノ酸を含む。
「コンフォメーショナルエピトープ」は、線形エピトープとは対照的に、エピトープを含むアミノ酸の一次配列が、認識されるエピトープの唯一の定義要素ではないエピトープ(例えば、アミノ酸の一次配列が必ずしも結合ドメインによって認識されないエピトープ)である。典型的には、コンフォメーショナルエピトープは、線形エピトープと比べて増加した数のアミノ酸を含む。コンフォメーショナルエピトープの認識に関して、結合ドメインは、抗原(好ましくはペプチドもしくはタンパク質またはそのフラグメント)の三次元構造を認識する。例えば、タンパク質分子が折り畳まれて三次元構造が形成されると、コンフォメーショナルエピトープを形成する特定のアミノ酸および/またはポリペプチド骨格は並置された状態になり、三次元構造でのみ存在する三次元エピトープを抗体が認識できるようになる。エピトープのコンフォメーションを決定する方法としては、X線結晶構造解析、二次元核磁気共鳴(2D-NMR)分光分析および部位特異的スピンラベリングおよび電子常磁性共鳴(EPR)分光分析が挙げられるが、これらに限定されない。
FcγRIIBは「CD32B」と呼ばれる場合もある。従って、この用語および上述したようなFcγ受容体IIBを指定するために用いられる他の用語は、用語「CD32B」と交換可能に用いられ得る。Fcγ受容体IIBは、タンパク質の免疫グロブリンスーパーファミリーに属しており、多くの造血系の表面で見られる。その名称が示しているように、Fc受容体IIBは、抗体のFc(結晶化可能フラグメント)部、即ち、抗体の両重鎖の2つのC末端ドメインに対応し、典型的にはエフェクター分子および細胞と相互作用するフラグメントを認識して結合する。好ましいFcγRIIBはSEQ ID NO: 5に示される。好ましい可溶性FcγRIIBはSEQ ID NO: 12に示される。
先行技術の抗体であるGB3(WO2005/051999を参照のこと)および2B6(WO2004/016750を参照のこと)は、本明細書に開示される認識分子(好ましくは抗体、例えば8A6(キメラまたはヒト化8A6抗体のいずれか))によって増加され得るようには、FcγRIIBのITIMリン酸化を増加させることができないことが、図7から明らかである。従って、FcγRIIBのITIMリン酸化を増加させる能力の有無は、それぞれ、8A6に存在するがGB3および/または2B6のそれぞれには存在しないCDR(特に、いくつかのキーとなるアミノ酸残基)に依存しているようである。従って、2B6またはGB3のCDR内のそれぞれの位置に対応する位置で8A6のCDRにのみ存在するアミノ酸は、「キー残基」とみなされ得る。
8A6、GB3および2B6のCDRのアミノ酸配列間の差異はまた、同一性の程度として(%同一性で)表され得、これは、参照配列として8A6のCDRを用いる場合、本明細書に開示される抗体のCDRにおいて許容される。従って、本発明の第2結合ドメインのH-CDR1は、好ましくは、SEQ ID NO: 20に示されるH-CDR1と60%以上、例えば70%、80%または90%、同一であると特徴付けられる。
ある態様において、本明細書に開示される第2結合ドメインのH-CDR2は、SEQ ID NO: 21に示されるH-CDR2と36%以上、例えば40%、50%、60%、70%、80%、または90%、同一であると特徴付けられる。
ある態様において、本明細書に開示される第2結合ドメインのH-CDR3は、SEQ ID NO: 22に示されるH-CDR3と50%以上、例えば60%、70%、80%、または90%、同一であると特徴付けられる。
ある態様において、本明細書に開示される第2結合ドメインのL-CDR1は、SEQ ID NO: 23に示されるL-CDR1と64%以上、例えば70%、80%、または90%、同一であると特徴付けられる。
ある態様において、本明細書に開示される第2結合ドメインのL-CDR2は、SEQ ID NO: 24に示されるL-CDR2と29%以上、例えば30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%、同一であると特徴付けられる。
ある態様において、本明細書に開示される第2結合ドメインのL-CDR3は、SEQ ID NO: 25に示されるL-CDR3と78%以上、例えば80%、または90%、同一であると特徴付けられる。
いくつかの態様において、認識分子(例えば抗体)は、その第2結合ドメインの重鎖および軽鎖可変領域CDR中において、SEQ ID NO: 29、30、31(H-CDR)ならびにSEQ ID NO: 32、33および34(L-CDR)において定義される「キー残基」を依然として含む。
そのような第2結合ドメインを有する認識分子は、Daudi細胞のFcγRIIBのITIMリン酸化を、前記認識分子で処理されていないDaudi細胞と比較して約4〜10倍増加させる。
SEQ ID NO: 15および21に示されるH-CDR2配列は、SEQ ID NO: 30に示されるH-CDR2の例示的な種配列である。
SEQ ID NO: 16および22に示されるH-CDR3配列は、SEQ ID NO: 31に示されるH-CDR3の例示的な種配列である。
SEQ ID NO: 17および23に示されるL-CDR1配列は、SEQ ID NO: 32に示されるL-CDR1の例示的な種配列である。
SEQ ID NO: 18および24に示されるL-CDR2配列は、SEQ ID NO: 33に示されるL-CDR2の例示的な種配列である。
SEQ ID NO: 19および25に示されるL-CDR3配列は、SEQ ID NO: 34に示されるL-CDR3の例示的な種配列である。
(a)その重鎖可変領域においてSEQ ID NO: 14、15および16に示されるH-CDR1、H-CDR2およびH-CDR3を含み、かつその軽鎖可変領域においてSEQ ID NO: 17、18および19に示されるL-CDR1、L-CDR2およびL-CDR3を含むか;または
(b)その重鎖可変領域においてSEQ ID NO: 20、21および22に示されるH-CDR1、H-CDR2およびH-CDR3を含み、かつその軽鎖可変領域においてSEQ ID NO: 23、24および25に示されるL-CDR1、L-CDR2およびL-CDR3を含み、
ここで、前記認識分子は、好ましくは、Daudi細胞のFcγRIIBのITIMリン酸化を、前記認識分子で処理されていないDaudi細胞と比較して約4〜10倍増加させる、認識分子を提供する。
定常ドメインは、抗原への抗体の結合に直接的には関与しないが、様々なエフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞傷害(ADCC)への関与を示すことができる。抗体がADCCを発揮するとすれば、それは好ましくはIgG1サブタイプのものであり、一方ではIgG4サブタイプはADCCを発揮する能力を有していない。認識分子(例えば抗体)の定常ドメインは、本明細書に記載されるような各サブタイプのものであり得、IgGまたはIgEサブタイプが好ましく、より好ましくはIgEサブタイプのものである。
図6、7および8に示される結果から、キメラ8A6(ch8A6)抗体(ラット可変領域およびヒト定常領域を含む)またはヒト化8A6抗体(hu8A6)のいずれかが、先行技術の抗体GB3と比較してITIMリン酸化を著しく増加させることが明らかである。キメラ8A6抗体およびヒト化8A6抗体の間でフレームワーク領域(FR)は異なるがCDRはほぼ同一であり、両抗体のFcγRIIBのITIMリン酸化を増加させる効力がほぼ同じである(図8を参照のこと)ことを踏まえれば、CDRが、例えば先行技術の抗体GB3と比較してITIMリン酸化を著しく増加させる本明細書に開示される抗体の有利な特性の原因となると結論付けることが合理的である。
認識分子の第2結合ドメインについて本明細書に記載されるようなCDRを適切なフレームワーク中に移植すること、または、逆に、フレームワーク領域を本明細書に記載されるようなCDRを有する認識分子(例えば抗体)の第2結合ドメイン中に移植することは、当業者には容易であり、その結果、このように得られた認識分子(例えば抗体)は、有利な特性(特に、本明細書に記載されるようなCD32BのITIMリン酸化を増加させる特性)を有する。
認識分子(例えば抗体)によりもたらされるDaudi細胞のFcγRIIB(CD32B)のITIMリン酸化における増加は、前記認識分子で処理されていないDaudi細胞と比較して、約4倍以上、約5倍以上、約6倍以上、約7倍以上、約8倍以上、約9倍以上、または約10倍(即ち、ほぼ10倍でさえ)である。
Daudi細胞のCD32B(FcγIIB受容体)のITIMリン酸化は、好ましくは、以下のように決定される。
1% FBS(ウシ胎仔血清)が補われたRPMI 1640培地中に懸濁させた3×105個のDaudi細胞を、未処理のままにする(対照)か、または、マウス抗ヒトIgM(αhIgM)およびウサギ抗マウスIgG(αmIgG)を含有する抗体混合物(2μg/ml αhIgM(mAB, クローンUHB)および20μg/ml αmIgGを含む)と共に37℃、5% CO2で25分間インキュベートする。続いて、本明細書に開示される認識分子(例えば抗体)または本明細書において以下に定義される関心対象の分子(例えば、WO2005/051999のGB3抗体)、任意で対照としてのバッファ(w/o)で、それぞれ、37℃、5% CO2にて20分間、細胞を処理する(認識分子および関心対象の分子の両方を、好ましくは等しい濃度で加える)。細胞を、4℃でのインキュベーション後に採取し、溶解させ、ウェスタンブロット分析に供し、それによって、抗ホスホチロシン抗体(抗CD32B(ホスホY292)抗体)でリン酸化を検出する。ウェスタンブロットは、例えば、ウェスタンブロット分析のためのローディング対照として役立つβ-アクチンを検出する抗体でプローブされてもよい。Daudi細胞の代替としてPBMCまたはRaji細胞を使用することができる。従って、Daudi細胞を適用する全ての態様において、ITIMリン酸化を決定する場合に、Daudi細胞をRaji細胞またはPBMCに置き換えることができる。
シグナル発生基は、ホスホチロシン抗体へ共有結合的または非共有結合的に結合することができる。シグナルは、ホスホチロシン抗体のシグナル発生基によりもたらされるシグナルによって決定され得る。シグナルは、例えば、分光学的、光化学的、生物化学的、免疫化学的または化学的な手段により検出可能ないずれのシグナルであってもよい。
SEQ ID NO:6によって示されるアミノ酸配列の位置297でアラニン残基を有するそのような定常ドメインは、Fc受容体への抗体のFc部の結合が低減しているかまたは存在しないことに起因して、抗体依存性細胞傷害が低減しているかまたは有していない。そのようなN297A定常領域のアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 28に示される。従って、本明細書に開示される認識分子は、定常領域として、SEQ ID NO: 28に示されるアミノ酸配列を含有してもよい。そのような抗体は、EUタンパク質ナンバリングによる位置297でグリコシル化を欠いている。従って、本明細書に開示されるのは、重鎖定常領域のEUタンパク質ナンバリングによる位置297でグリコシル化を欠いている抗体であり、重鎖定常領域のEUタンパク質ナンバリングによる位置297でグリコシル化されている抗体も包含される。
いくつかの態様において、認識分子は、SEQ ID NO: 5におけるモチーフGTHSPESを含むエピトープに特異的に結合する。このアミノ酸モチーフは、FcγRIIBの極めて特異的なエピトープであることが示されている。このエピトープに特異的に結合する抗体などの認識分子は、ヒトFcγRIIAに結合しない。このエピトープへの認識分子(例えば抗体)のその可変領域を介しての結合は、好ましくは、受容体への抗体のFc部の結合を妨げず、受容体の通常の生理学的機能をブロックしない。
KA = [AB-AG]/[AB]*[AG] = kon/koff
式中:
KA = 親和性定数
[AB] = 抗体上の非占有結合部位のモル濃度
[AG] = 抗原上の非占有結合部位のモル濃度
[AB-AG] = 抗体-抗原複合体のモル濃度
従って、開示される認識分子をコードする核酸配列は、抗体の特異的結合特性を与える抗体の少なくとも一部をコードするヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、開示される核酸配列は、本明細書に記載される少なくともCDRなどの可変領域をコードする。例示的な核酸配列をSEQ ID NO: 8〜11によって示す。当業者は、これらのヌクレオチド配列が、使用される発現方法およびそのために使用さるシステムに依存して変化し得ることを承知している。
薬学的に許容される塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するもののようなアニオンと形成されるもの、および、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものようなカチオンと形成されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において包含される例示的な認識分子である抗体について、患者に投与される投薬量は、典型的には、患者の体重当たり0.0001 mg/kg〜100 mg/kgである。例示的な投与される投薬量は、約0.1〜約30 mg/kg、約0.1 mg/kg〜約25 mg/kg、約0.5 mg/kg〜約25 mg/kg、約1 mg/kg〜約100 mg/kg、約1 mg/kg〜約75 mg/kg、約1 mg/kg〜約50 mg/kg、約5 mg/kg〜約50 mg/kg、約5 mg/kg〜約40 mg/kg、約5 mg/kg〜約30 mg/kg、約5 mg/kg、約10 mg/kg、約12 mg/kg、約14 mg/kg、約15 mg/kg、約17 mg/kg、約20 mg/kg、または約25 mg/kgである。ヒト抗体が他の種に由来する抗体と比べて人体内でより長い半減期を有することが周知である。従って、抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体の投薬量および投与頻度は、他の種に由来する抗体の通常用いられる投薬量と比較して減少させてもよい。
抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体を投与する方法は、非経口投与(例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内および皮下)、硬膜外投与、粘膜投与(例えば、鼻腔内および経口経路)を含むが、これらに限定されない。特定の態様において、抗体は、筋肉内、静脈内または皮下に投与される。組成物は、任意の好都合な経路により、例えば、注入またはボーラス注射により、上皮または粘膜皮膚の内層(口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など)を通じた吸収により投与されてもよく、他の生物学的に活性な薬剤と共に投与されてもよい。投与は、全身または局所とすることができる。さらに、例えば、吸入器またはネブライザの使用、およびエアロゾル化剤での製剤化により、肺内投与を用ることも可能である。
本明細書において使用されるように、用語「治療する」および「治療」は、治療上有効量の薬学的組成物を対象に投与することを指す。「治療上有効量」は、疾患または障害を治療または改善するために、疾患の発症を遅らせるために、または、疾患の治療または管理において治療的利益をもたらすために十分である、薬学的組成物または抗体の量を指す。
本明細書において使用されるように、用語「予防」は、疾患または障害の発症の予防のための薬剤の使用を指す。「予防上有効量」は、疾患の発症または再発を予防するために十分な活性成分または薬学的薬剤の量を定義する。
本明細書において使用されるように、用語「障害」および「疾患」は、交換可能に用いられ、対象における状態を指す。特に、用語「自己免疫疾患」は、用語「自己免疫障害」と交換可能に用いられ、対象自身の細胞、組織および/または器官に対する対象の免疫反応にょり引き起こされる細胞、組織および/または器官の傷害により特徴付けられる、対象における状態を指す。
従って、本開示は、さらに、本明細書に開示される認識分子(好ましくは抗体)を含む診断用組成物に関する。
SEQ ID NO: 1:ラット抗体8A6の重鎖可変領域のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 2:ラット抗体8A6の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 3:ヒト化抗体hu8A6の重鎖可変領域のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 4:ヒト化抗体hu8A6の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 5:ヒトFcγRIIBのアミノ酸配列
SEQ ID NO: 6:ヒト化抗体hu8A6_wtの重鎖定常領域のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 7:ヒト化抗体hu8A6_wtの軽鎖定常領域のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 8:ヒト化抗体hu8A6の重鎖可変領域をコードする核酸配列
SEQ ID NO: 9:ヒト化抗体hu8A6の軽鎖可変領域をコードする核酸配列
SEQ ID NO: 10:ヒト化抗体hu8A6_wtの重鎖定常領域をコードする核酸配列
SEQ ID NO: 11:ヒト化抗体hu8A6_wtの軽鎖定常領域をコードする核酸配列
SEQ ID NO: 12:ヒト可溶性FcγRIIA(sFcγRIIA)のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 13:変異ヒト可溶性FcγRIIA(sFcγRIIAmut)のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 14:ラット抗体8A6の重鎖可変領域のCDR1のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 15:ラット抗体8A6の重鎖可変領域のCDR2のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 16:ラット抗体8A6の重鎖可変領域のCDR3のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 17:ラット抗体8A6の軽鎖可変領域のCDR1のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 18:ラット抗体8A6の軽鎖可変領域のCDR2のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 19:ラット抗体8A6の軽鎖可変領域のCDR3のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 20:ヒト化抗体hu8A6の重鎖可変領域のCDR1のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 21:ヒト化抗体hu8A6の重鎖可変領域のCDR2のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 22:ヒト化抗体hu8A6の重鎖可変領域のCDR3のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 23:ヒト化抗体hu8A6の軽鎖可変領域のCDR1のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 24:ヒト化抗体hu8A6の軽鎖可変領域のCDR2のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 25:ヒト化抗体hu8A6の軽鎖可変領域のCDR3のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 26:抗体GB3の重鎖可変領域のアミノ酸配列(WO2005/051999のSEQ ID NO: 7も参照のこと)
SEQ ID NO: 27 抗体GB3の軽鎖可変領域のアミノ酸配列(WO2005/051999のSEQ ID NO: 5も参照のこと)
SEQ ID NO: 28 位置297におけるNからAへの置換を含有する重鎖定常領域のアミノ酸配列(配列表に示される配列の位置1が位置118であると仮定する)
SEQ ID NO: 29 キメラおよびヒト化抗体8A6からのキーとなるアミノ酸残基を含む重鎖可変領域のCDR1のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 30 キメラおよびヒト化抗体8A6からのキーとなるアミノ酸残基を含む重鎖可変領域のCDR2のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 31 キメラおよびヒト化抗体8A6からのキーとなるアミノ酸残基を含む重鎖可変領域のCDR3のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 32 キメラおよびヒト化抗体8A6からのキーとなるアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域のCDR1のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 33 キメラおよびヒト化抗体8A6からのキーとなるアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域のCDR2のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 34 キメラおよびヒト化抗体8A6からのキーとなるアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域のCDR3のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 35 ドメイン2、3および4を含有するIgEのFcドメインのアミノ酸配列
SEQ ID NO: 36 ドメイン3および4を含有するIgEのFcドメインのアミノ酸配列
SEQ ID NO: 37:sFcεRIαのプラスミドDNA配列
SEQ ID NO: 38:ホルミルメチオニン-ロイシン-フェニルアラニンというペプチドのアミノ酸配列
実施例1.モノクローナル抗体8A6の作製
組換え可溶性ヒトFcγRllB受容体でLong-Evansラットを免疫することによって、モノクローナル抗体クローン8A6を作製した。ラット脾臓細胞からハイブリドーマ細胞株を作製し、FcγRllAに対してよりも大きな親和性でヒトFcγRllBに特異的に結合する抗体についてスクリーニングした。次に、上述のハイブリドーマによって産生された抗体を、当技術分野において公知の技術を使用して、非ブロッキング特徴についてスクリーニングした(即ち、これらの抗体は、膜結合性FcγRllBへのIgGまたはICの結合を依然として可能にする)。
50μgの精製組換え可溶性ヒトFcγRllB(sFcγRllB、SEQ ID NO: 5)を、5 nmol CpG 2006(TIB MOLBIOL, Berlin, Germany)が補われたフロイント不完全アジュバントを使用して、LOU/Cラット中へ腹腔内(i.p.)および皮下(s.c.)注射した。6週間のインターバル後に、50μg sFcγRllBおよびCpG 2006での最終的な追加免疫を、融合の3日前にi.p.およびs.c.で与えた。骨髄腫細胞株とラット免疫脾臓細胞との融合を標準的な手順により行った。ハイブリドーマ上清を、ELISAプレートへコーティングされたsFcγRllBまたは無関係のsFcγRllA(SEQ ID NO: 12)タンパク質での固相免疫アッセイにおいて試験した。タンパク質に結合された組織培養上清由来のMabを、ラットIgGアイソタイプに対するHRPコンジュゲート化mAbを用いて検出し(TIB173 抗IgG2a、TIB174 抗IgG2b、TIB170 抗IgG1(全てATCC製)、R-2c 抗IgG2c(自家製))、従って、IgMクラスのmAbを回避した。抗原特異的ELISAアッセイを用いたところ、mAb 8A6(ラットIgG2a)は、FcγRllBを認識し、FcγRllAには結合しなかった。FACSベースのアッセイを用いて、天然抗原の特異的結合について抗体をスクリーニングした。さらに、抗体を非ブロッキング特徴についてスクリーニングした(即ち、これらの抗体は、膜結合性FcγRllBへのIgGまたは免疫複合体の結合を依然として可能にする)。
キメラおよびヒト化構築物の特徴付けのために十分な量の抗体を産生するために、FreeStyle(商標)CHO-S細胞を一過性にトランスフェクトした。
トランスフェクションの前日に、細胞を0.5×106個/mlで播種した。細胞を遠心分離し、培地中に再懸濁し、20×106個/mlの最終細胞濃度を得た。各トランスフェクションについて、3 mlの細胞懸濁液を6ウェルプレートに移した。トランスフェクションのためのプラスミドDNAを、製造業者の説明書に従ってHiSpeed Plasmid Maxi Kit(Qiagen)を使用して単離し、内毒素フリーのH2O中に溶出させた。
各トランスフェクションについて、軽鎖をコードするプラスミドDNA 75μgおよび重鎖をコードするプラスミドDNA 75μgを細胞懸濁液に添加し、穏やかに混合した。その後、PEI(Polyplus)を添加し、穏やかに混合した。細胞を、連続的な振盪(100 rpm)下で37℃および5% CO2にて3時間インキュベートした。細胞懸濁液を15 mlの最終体積まで培地で充填し、4×106個/mlの最終細胞濃度を達成し、125 mlフラスコ中に移した。細胞を連続的な振盪(100 rpm)下で37℃および5% CO2にてインキュベートし、6日後、上清を、それを2回遠心分離する(4000 rpm, 5分間)ことによって採取した。上清を0.2μmフィルターで濾過し、抗体力価を決定した(下記を参照のこと)。
抗体力価決定を、2つの異なるHPLC法、逆相(RP)HPLCおよびプロテインA-HPLCによって行った。RP-HPLC分析をAgilent 1200 Series HPLCシステムで行った。データをソフトウェア「Chem Station for LC Systems」Rev. B.04.02で分析した。溶媒成分は以下であった:イソプロパノール(HPLC等級; Roth)、アセトニトリル(HPLC勾配等級; Roth)、H20(0.2μm濾過)およびテトラフルオロアセテート(tetrafluoracetate)(TFA)(ペプチド合成用; Sigma)。溶媒A: H2O, 0.1% TFA;溶媒B: 60%イソプロパノール、30%アセトニトリル、9.9% H2O、および0.1% TFA。300 Åの多孔性および5μmの粒子直径を有する分離材料を含むPhenomenex Jupiterカラム(#525166-6)を使用した。結合した抗体を、30%から43%への溶媒Bの線形勾配で10分以内に溶出させた。検出をUV/VIS検出器でλ = 210 nmにて行った。
プロテインA-HPLC分析をAgilent 1200 Series HPLCシステムで行った。データをソフトウェア「Chemstation」バージョン Rev. B.04.02で分析した。以下の溶媒を使用した;溶媒A: 0.05M Tris/HCl、0.1Mグリシン、0.15M NaCl、pH 8.0;溶媒B: 0.05M Tris/HCl、0.1Mグリシン、0.15M NaCl、pH 3.0。分析のために、Upchurch 2x 20 mm分析ガードカラムに、120μlのApplied Biosystems Poros(登録商標)20Aパーフュージョンクロマトグラフィー媒体(Life technologies)を詰めた。結合した抗体を100%溶媒Bで溶出させた。精製抗体を回収した場合、フラクションを56 mM Tris pH 8.0で中和した。
発現された抗体を、高速タンパク質液体クロマトグラフィー(Akta Explorer)によって1 ml HiTrap(商標)rProtein A FFカラム(GE Healthcare)で精製した。ランニングバッファは10 mM Tris-HCl pH 8.0、150 mM NaClを含有し、溶出バッファは100 mMグリシン、150 mM NaCl、pH 2.7から構成された。溶出された抗体を60 mM Tris-HCl pH 8.0で中和し、濃縮し、滅菌濾過し、-80℃で保存した。
ハイブリドーマ上清のスクリーニングを、技術水準において公知の技術、例えば、ELISA結合アッセイ、Biacoreアッセイ、またはFACS結合分析を使用して行う。キメラ8A6またはヒト化変異体の抗原特異的結合を試験するために、ELISAプレート(Nunc-Immuno Plate, F96 Maxisorp)を、PBS中の1μg/ml sFcγRllB、sFcγRllA(SEQ ID NO: 12)またはsFcγRllAmut(SEQ ID NO: 13)(100μl/ウェル)で、4℃にて一晩コーティングした。PBS中0.01% Tweenによる3回の洗浄工程後、PBS中2% BSAによるブロッキング(300μl/ウェル)を室温で2時間行った。3回の洗浄工程後、精製抗体または上清の希釈系列をアプライし(100μl/ウェル)、室温で1時間インキュベートした。精製抗体をPBS, 2% BSAにて希釈した。上清に10倍PBSおよび20% BSAを補い、PBS中2% BSAの最終濃度を得た。FcγRllAについての陽性対照として、ヤギ抗ヒトFcγRllA(R&D Systems, AF1875)を使用した。PBS中0.01% Tweenによる3回の洗浄工程後、それぞれの二次抗体であるロバ抗ヤギ-HRP(F(ab’)2, Jackson-Immuno-Research)またはヤギ抗ヒト-HRP(F(ab’)2, Dianova)を室温で1時間インキュベートした(100μl/ウェル)。ウェルをPBS中の0.01% Tweenにより6回洗浄した。基質(0.03% H2O2を含有するOPD)を添加し(100μl/ウェル)、反応を4 M H2SO4 (50μl/ウェル)で停止させた。その後、分光計にて492 nmでの吸光度を測定した。
キメラ8A6またはヒト化変異体の天然抗原への特異的結合の分析を、Raji細胞(ATCC(登録商標)CCL-86(商標))およびK-562細胞(ATCC(登録商標)CCL-243(商標))上での細胞結合によって行った。
細胞を遠心分離(400 g, 5分間)によってペレット化し、FACSバッファ(ハンクス平衡塩類溶液, 1 % FCS, 0.01 % NaN3)により洗浄した。追加の遠心分離工程後、細胞をFACSバッファ中に再懸濁し、2×106個/mlの最終細胞濃度を得て、50μlの細胞懸濁液を96ウェルU底プレート中に等分した。ヒト化変異体およびch8A6の希釈系列をFACSバッファにて調製した。
K-562細胞上のFcγRllAの発現を確認するために、マウス抗ヒトCD32抗体(Stem Cell Technologies Inc., クローンVI.3)をFACSバッファにて希釈した。希釈された抗体50μlを細胞に添加し、4℃で30分間インキュベートした。細胞をFACSバッファにより2回洗浄した。その後、50μlヤギ抗ヒトIgG-PEコンジュゲート化(F(ab’)2, Dianova)またはヤギ抗マウスIgG-PEコンジュゲート化(F(ab’)2, Dianova)二次抗体をFACSバッファにて希釈し、細胞に添加し、4℃で30分間インキュベートした。FACSバッファによる2回の洗浄工程後、細胞を300μl FACSバッファ中に再懸濁し、BD FACSCanto(商標)II(Software: BD FACSDiva(商標))において測定した。
FcγRllB抗体が膜結合性FcγRllBへのIgGまたは免疫複合体の結合を依然として可能にするかどうかを決定するために、FACSベースのアッセイを行った。細胞を遠心分離(400 g, 5分間)によってペレット化し、FACSバッファ(ハンクス平衡塩類溶液, 1% FCS, 0.01 % NaN3)により洗浄した。追加の遠心分離工程後、細胞をFACSバッファ中に再懸濁し、2×106個/mlの最終細胞濃度を得た。抗体(ch8A6_N297A、chGB3_N297A、R&D Ab mab1875)の希釈系列をFACSバッファにて調製した。希釈された抗体25μlを、Alexa488標識された凝集Beriglobin(2.5μl/ウェル)25μlと96ウェルU底プレート中において混合した。凝集ヒトIgGを、市販のプールされたIgG製品(Beriglobin)からSuperdex-200 (16/60)におけるサイズ排除クロマトグラフィーによって単離した。
50μlの細胞懸濁液を抗体-Beriglobin混合物に添加し、4℃で1時間インキュベートした。細胞をFACSバッファにより2回洗浄した。その後、50μlヤギ抗ヒトIgG-PEコンジュゲート化(F(ab’)2, Dianova)または抗ラット-PE二次抗体をFACSバッファにて希釈し、細胞に添加し、4℃で30分間インキュベートした。FACSバッファによる2回の洗浄工程後、細胞を300μl FACSバッファ中に再懸濁し、BD FACSCanto(商標)II(Software: BD FACSDiva(商標))において測定した(図3)。
FACS結合アッセイ
キメラ8A6またはヒト化変異体の天然抗原への特異的結合の分析を、Raji細胞およびK-562細胞上での細胞結合によって行った。細胞を遠心分離(400 g, 5分間)によってペレット化し、FACSバッファ(ハンクス平衡塩類溶液, 1% FCS, 0.01% NaN3)により洗浄した。追加の遠心分離工程後、細胞をFACSバッファ中に再懸濁し、2×106個/mlの最終細胞濃度を得、50μlの細胞懸濁液を96ウェルU底プレート中に等分した。ヒト化変異体およびch8A6の希釈系列をFACSバッファにて調製した。Raji細胞およびK562細胞を、漸増濃度のヒト化抗体およびキメラ抗体(対照として)と共にインキュベートした。FcγRIIB上での結合を試験するためにRaji細胞を使用し(図4)、FcγRIIAへの非特異的結合を分析するためにK562細胞を使用した(図5)。細胞に結合した抗体をPEコンジュゲート化二次抗体で検出した。全てのヒト化変異体が、ch8A6_N297Aに匹敵する親和性でFcγRIIBに結合し、全てのヒト化変異体が依然として、FcγRIIAに対するよりも大きなアビディティでFcγRIIBに結合する。
sFcγRllBおよびsFcγRllAへの抗体結合を、Biacore T200バイオセンサー(GE Healthcare / Biacore)を使用して表面プラズモン共鳴によって分析した。実験はLMU, Department of Biology and Microbiology, Service Unit Bioanalyticで行われた。分析される抗体を、製造業者のプロトコルに従ってHuman Antibody Capture Kitを使用してSeries S Sensor Chip CM5センサーチップ上にキャプチャーした。Hu8A6変異体またはch8A6を10 nMの濃度で1分間キャプチャーした。分析物sFcγRllBを3分間様々な濃度で注入した。測定を25℃および連続的なフロー(10μl/分)で行った。データを、1:1結合を仮定して、Biacore T200 Evaluation Software(バージョン1.0)を使用して評価した。
抗FcγRIIBキメラモノクローナル抗体8A6を、ラット8A6 VH領域をシグナルペプチドおよびヒトIgG1定常領域と融合することによって構築した。さらに、N297A変異を含有するIgG1定常ドメインを使用して、重鎖の脱グリコシル化変異体を作製した。8A6軽鎖遺伝子を構築するために、ラット8A6 VL領域を、同様に、シグナル配列およびヒトκ定常領域の配列と融合し、続いて哺乳動物発現ベクターにサブクローニングした。
細胞、試薬および抗体
ヒトバーキットリンパ腫細胞株DaudiおよびRamosをDSMZから購入し(ACC 78およびACC 603)、10% FBS(Gibco/Invitrogen)、MEM NEAA(Gibco/Invitrogen)、1 mMピルビン酸ナトリウム(Gibco/Invitrogen)および2 mM L-グルタミン(Gibco/Invitrogen)が補われたRPMI 1640(Gibco/Invitrogen)中にて37℃および5% CO2で維持した。Ficoll密度勾配(Leucosep, Greiner Bio-One, Biocoll分離溶液, Biochrom)およびネガティブ磁気分離(Dynabeads Untouched Human B Cells, Invitrogen)を使用して、健康なドナーのヘパリン添加血から初代ヒトB細胞を精製した。濃縮されたB細胞の純度を、抗hCD19-APC(BD Pharmingen #555415)、抗hCD3-PerCP-Cy5.5(BD Biosciences #332771)および抗hCD56-PE(BD Pharmingen #555515)での染色によりFACS分析によって試験した。初代B細胞をさらに培養することなく直接、実験に用いた。EP1534335に記載のブロッキング抗FcγRIIB抗体2B6。
可溶性抗体刺激混合物を使用する刺激プロトコル
BCRおよびFcγRllBの同時刺激のために、2μg/mlマウスモノクローナル抗hIgM(Southern Biotech #9022-01, クローンUHB)および20μg/mlウサギモノクローナル抗mIgG(1,2a,3)(Epitomics #3020-1, クローンM111-2)(このFc部はヒトFcγRllB受容体と交差反応する)の抗体混合物を用いて抗体システムをセットアップした。20μg/mlウサギポリクローナル抗hIgM(Antibodies online #ABIN117299)、または2μg/ml抗hIgMおよびアイソタイプ対照mIgG2b(クローンMPC-11, BD Pharmingen #557351)を含有する混合物を対照として用いた。3×105個のリンパ腫細胞株DaudiまたはRamosおよび初代B細胞を遠心分離によって採取し、アッセイ培地(RPMI 1640 + 1% FBS)中において異なる刺激混合物と共に37℃で20分間インキュベートした。続いて、5μg/ml抗FcγRIIB抗体ch8A6(0.8μlの1:10希釈物)、2B6(1.5μlの1:10希釈物)またはchGB3_N297A(1.1μlの1:10希釈物)をサンプルに添加し、細胞をさらに25〜30分間インキュベートした。別に記載したように溶解を行った。
リン酸化パターンのウェスタンブロット分析
細胞溶解
細胞を4℃でペレット化し、氷冷PBSで洗浄し、ホスファターゼ阻害剤(PhosStop, Roche)、プロテアーゼ阻害剤(Complete Ultra Mini, EDTAフリー, Roche)および1 mM PMSF(Fluka Biochemica)が補われた10μL溶解バッファ(RIPAバッファ(Cell Signaling)中、氷上で30〜45分間インキュベートした。
SDS-PAGE
遠心分離後、上清をサンプルバッファ(NuPAGE LDSサンプルバッファ、NuPAGEサンプル還元剤、Invitrogen)と共にロードし、SDS PAGE(NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gels、MES SDSランニングバッファー(Invitrogen))へアプライした。SDS-PAGEのために、LDSサンプルバッファおよび還元剤を添加し、サンプルを95℃で5分間加熱した。サンプルを-20℃で保存したか、またはSDS-PAGEおよびウェスタンブロットによって直接分析した。
タンパク質のPVDF膜への転写および検出
続いて、タンパク質をPVDF膜に転写した(Roti-PVDF, Roth, 転写バッファ 10 mM Tris、100 mMグリシン、10%メタノール、転写条件 240 mA一定、90分間、4℃)。膜をTBS-T(10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.1% Tween20)中5% BSAでブロックし、抗FcγRllB/CD32 Phospho(pY292)(Cell Epitomics # 2308-1, 1:50000, 4℃一晩)または抗ホスホSHIP(1:1000, Cell Signaling #3941)および抗ウサギ-HRP(Jackson ImmunoResearch #111-036-045, TBS-T中 1:50,000, 1時間 RT)で染色した。化学発光(WesternLightning Plus, Perkin Elmerで現像)をX線フィルム上で検出した。
ストリッピング
他のリン酸化されたタンパク質に対する抗体による後続の分析のために、膜を10分間ストリップし(Re-Blot Plus, Millipore)、洗浄し、ブロックし、その後、抗β-アクチン抗体(Sigma-Aldrich # A1978, 1:50,000および抗マウスIgG-HRP, Sigma-Aldrich # A9044)または他のシグナリングタンパク質に対する抗体で染色した。
健康なドナー由来のPBMCを単離し、未処理のままにしたか、または、刺激混合物(マウスモノクローナル抗hIgMおよびウサギモノクローナル抗mIgG)と共に25分間インキュベートした。続いて、細胞を、ch8A6または対照としてのバッファのいずれかで処理した。細胞溶解物を、上記で概説したように、適切な検出抗体を使用するウェスタンブロット分析に供した。細胞(PBMC、B細胞)のFcγRIIB-ITIMモチーフのリン酸化の著しい増加が検出された(図6a)。刺激混合物単独、または、マウスモノクローナル抗hIgMのみ、ch8A6と組み合わせてのウサギモノクローナル抗mIgGでの細胞の刺激による対照実験は、増加したFcγRIIB-ITIMリン酸化を示さなかった(図6b)。従って、開示される抗体は、架橋されたBCR(B細胞受容体)および(内因性発現された)膜結合性FcγRIIBでのヒト細胞のITIMリン酸化に対して著しい効果を示し、刺激されていない細胞、即ち、架橋されたBCRおよび膜結合性FcγRIIBを有さない細胞に対しては効果を示さない。自己免疫疾患の間、BCRおよび膜結合性FcγRIIBは、自己抗原または免疫複合体(IC)によって架橋される。抗体は、FcγRIIB-ITIMリン酸化を増加させることによって、自己免疫疾患における病原性自己反応性B細胞を抑制することができる。しかし、抗体はまた、架橋されたBCR無しでITIMリン酸化を増加させることができる(図6c)。
ITIMリン酸化に対するクローンch8A6_N297AおよびクローンchGB3_N297Aの効果の比較。ヒトDaudi細胞を、上述したように、抗体混合物、続いて、ch8A6_N297A、chGB3_N297Aまたは2B6で処理した。抗体chGB3_N297Aは、ch8A6_N297Aと同様に、非ブロッキング抗FcγRIIB抗体であり、同様のエピトープを認識する。抗体混合物で処理した細胞へのch8A6_N297Aの添加は、既に0.05μg/mlの濃度でFcγRIIB-ITIMリン酸化の増加を示した。漸増濃度のchGB3_N297Aは抑制モチーフのリン酸化の用量依存的刺激を示したが、驚くべきことに、この抗体クローンは、8A6に匹敵するリン酸化レベルに到達できなかった。ソフトウェア「ImageJ」でのX線フィルムのデンシトメトリック定量化によって最大2.8倍のリン酸化シグナル値が算出されたが、hu8A6_N297Aは未処理細胞と比較して9.8倍増加をもたらす(図7)。従って、本発明の抗体は、抗体chGB3_N297Aと比較して、明らかにかつ驚くべきことに、増加したFcγRIIB-ITIMリン酸化を示す。
抗体chGB3_N297A、ch8A6_N297Aおよびヒト化8A6を、初代ヒトPBMCのFcγRIIB-ITIMリン酸化に対するそれらの影響において比較した。抗体混合物によるBCRおよびFcγRIIBの架橋後、異なる抗体を5μg/mlで添加し、ITIMリン酸化についてウェスタンブロット分析を行った。この場合も、抗体は、驚くべきことに、技術水準の抗体と比較してFcγRIIB-ITIMリン酸化に対して著しく増加した効果を有する(図8)。
受容体の架橋に続いて、FcγRIIB-ITIMモチーフ中のリン酸化チロシンへのホスファターゼSHIPのSH2ドメインの結合によってホスファターゼSHIPが膜に動員され、続いて、SHIP-1のC末端ドメイン中のNPXYモチーフにおけるチロシンがリン酸化される。膜における再局在化およびそれに続くNPXYモチーフのリン酸化は、SHIP-1の調節機能に必須である。カルシウム流出、細胞生存、増殖、細胞周期停止およびアポトーシスに対するSHIP-1の効果は、PI3KおよびAkt経路を通じて媒介される。Tyr1021は、SHIP-1中のNPXYモチーフのうちの1つに位置しており、そのリン酸化はSHIP-1の機能に重要である(Nimmerjahn, Ravetch, 2008)。
ヒトDaudi細胞を、上記の段落[0105]において定義された抗体混合物で刺激し、マイルドな溶解バッファ(CoIP溶解バッファ)によって溶解した後、サンプルを、FcγRIIBをキャプチャーするために2B6と共にインキュベートした。複合体をプロテインG結合強磁性ビーズに結合させ、磁気ラックで単離した。
500μl CoIP溶解バッファにて1×107細胞/サンプルの溶解物を調製し、氷上で30分間細胞をインキュベートし、10分毎にボルテックスした。細胞残屑を13,000 rpmで4℃にて10分間遠沈させ、上清を新しいチューブに移した。500μlの溶解物を、10μg 2B6と共に4℃で2〜3時間回転させながらインキュベートした。プロテインG結合磁気ビーズを500μl溶解バッファで2回洗浄し、50μlビーズ(1.5 mg)を溶解物-抗体-複合体へ4℃で一晩添加した(回転ホイール)。200μl溶解バッファで2回洗浄し、還元剤を含有する25μl 1x LDSサンプルバッファ中においてビーズを5分間加熱することによって、複合体をビーズから溶出させた。4000 × gで30秒間遠心分離した後、10μlの上清をウェスタンブロット分析のためにSDS-PAGEにアプライした。
溶解物のウェスタンブロット分析は、抗体混合物およびch8A6_N297Aで処理された細胞のサンプル中のリン酸化SHIP-1の顕著に上昇したレベルを示す。FcγRIIB-特異的抗体2B6による沈降を行ったため、FcγRIIBに結合した、単離されたSHIP-1のみが共沈降した。ストリッピングおよび再染色後の膜は、ch8A6_N297Aで処理されたサンプル中のFcγRIIB-ITIMモチーフの増強されたリン酸化を示し、リン酸化SHIP1シグナルと相関した。αhFcγRIIB a, b, c (ヒトFcγRII/CD32 Ab, ポリクローナル, ヤギ IgG, R&D Systems, AF1330)による第2の再染色は、全てのサンプル中において等量の沈降した受容体FcγRIIBを示し、SDS-PAGEについてのローディング対照として役立った(図9)。
ラット抗体由来の相補性決定領域配列をヒトフレームワークに移植することによって、ch8A6をヒト化した。ヒトフレームワークを選択するために、VHおよびVL配列を、公的に利用可能なデータベース(IMGT; V-BASE)から得られたヒトIg可変および連結領域生殖細胞系セグメントの配列と比較した。VH_3_30 plus IGHJ4ヒト生殖細胞系配列およびVK3_15 plus IGKJ2ヒト生殖細胞系配列をそれぞれ重鎖および軽鎖のために選択した。
ヒト化重鎖および軽鎖のためのいくつかの変異体を作製した。ヒト化VHおよびVLの設計した配列をコードする遺伝子を、続いて哺乳動物発現ベクターへサブクローニングした。抗体変異体のスクリーニング手順を、トランスフェクトされたCHO-S細胞(Invitrogen)の上清から直接行った。キメラ8A6抗体は、ヒト化変異体のスクリーニングの間、トランスフェクション対照および標準として役立った。sFcγRllBおよびsFcγRllAへのHu8A6変異体の結合をELISAによって分析し、天然FcγRllBへのHu8A6変異体の結合をRaji細胞上でのFACSによって分析した(上記を参照のこと)。さらに、抗体変異体の速度論特徴付けを表面プラズモン共鳴で行った。
8A6ヒト化変異体のリン酸化活性を試験するために、Daudi細胞を、抗体混合物で刺激し、0.5または5μg/mlの異なる8A6変異体で処理し、ITIMリン酸化についてウェスタンブロット分析を行った。
試験した8A6のヒト化変異体の全てが受容体のリン酸化を誘導することができ、リン酸化レベルは、同じ精製バッチ由来のch8A6_N297Aによって誘導されたものに匹敵した。従って、第2のヒト化ラウンド後に活性の低下は検出されなかった。Biacoreデータは重鎖および軽鎖の異なる組み合わせについての異なる親和性を示唆したが、それらの差異はウェスタンブロット分析によって検出可能ではなかった(図10)。
最終のヒト化鎖組み合わせを選択した後、重鎖VH10と軽鎖VL6とを組み合わせた変異体を、抗体ch8A6_N297A、2B6およびchGB3_N297Aと比較した(図11)。
SLE-PBL-モデル
Rag2/γc/Fcγ-/-マウスに6 Gyの線量を照射し、500μl PBS中の異なる量のヒト末梢血白血球を腹腔内注射した。マウスへのヒトSLE患者PBLの移植がhIgMまたはhIgGの存在によって確認された後、細胞の注射の2週間後にマウスの処置を開始した。200μlバッファ(PBS)または200μl PBS中の20μg抗体(ch8A6_N297A)で、腹腔内に週2回で4週間マウスを処置した。マウスを週1回計量および採血し、血清を得た。血清サンプルをさらに使用するまで-80℃で凍結した(図12)。
ELISA
総ヒトIgG、IgMならびに抗DNA IgMおよびIgGの存在について、血清サンプルをELISAによって分析した。血清サンプル中の総血清IgMおよびIgGの定量化のために、Bethyl Human IgM ELISA Quantitation KitおよびHuman IgG ELISA Quantitation Kit(Biomol)を製造業者の説明書に従って使用した。ODを450および650 nmでVersaMaxチューナブルマイクロプレートリーダー(Molecular Devices)によって測定した。
抗DNA抗体の検出のために、ELISAプレートをPBS中10μg/mLメチル化BSA(Sigma)で室温にて2時間コーティングした。洗浄後、プレートをPBS中50μg/mL仔牛胸腺DNA(Sigma)で4 ℃にて一晩コーティングした。非特異的結合のブロッキングをPBS/0.1%ゼラチン/3% BSA/1mM EDTAで室温にて2時間行った。血清をブロッキング溶液中に1:100で希釈し、室温にて1時間インキュベートした。検出抗体として、ヒトIgM Quantitation Kit(Bethyl)のHRPコンジュゲート化抗体を使用し、ブロッキング溶液中に1:10,000で希釈し、続いて、室温にて1時間インキュベートした。PBSを全ての洗浄工程に使用した。検出のために、TMB溶液を添加し、反応を6%オルトリン酸で停止させた。
SLEに罹患しているヒトドナー由来のPBLが移植されたマウスにおいて総ヒトIgGレベル[μg/mL]を分析した。PBSと抗FcγRIIBとの間で総ヒトIgGの有意差は検出されなかった。本発明の抗体は総ヒトIgGに有意な影響を与えなかった(図13)。
SLE-PBL移植後の第4週で開始する抗FcγRIIBマウス中における疾患特異的ヒト抗DNA IgGの著しい減少が観察された。開示される抗体は、疾患関連抗DNA抗体の量を特異的に減少させる(図14)。
8A6-IgGおよび8A6-IgE構築物の命名の定義:
異なるFcγRIIB IgE抗体の作製、発現および精製の説明。
構築物設計
図15に示されるように、全ての構築物は、ハイブリッド抗体のFabドメインがIgG分子(可変ドメインおよびCL/CH1ドメイン)に等しいという共通点を有する。さらに、全ての構築物はIgE定常ドメインCε3およびCε4を有する。これらのドメインはIgG-Cg2およびCg3と相同である。IgG抗体において、ヒンジ領域は、分子の必要とされる柔軟性を担い、ジスルフィド架橋を介して二量体を形成する。このヒンジ領域はIgE抗体には存在しない。ヒンジ領域の代わりに、追加のドメインCε2がこの機能を採用する。8A6-IgE抗体は、Cg1ドメインからCεドメインへの最適な変更と共に、Fabドメインの高い柔軟性を示す。従って、IgGのヒンジ領域(図15を参照のこと)またはIgEの完全なFcεドメイン(Cε2、Cε3、Cε4)(図15を参照のこと)のいずれかを保持する変異体を設計した。別のバリエーションは、Fcεドメイン中の異なる量のN-グリコシル化部位を考える。IgE-Fcドメインのグリコシル化は、FcεRIへの親和性に対して影響を有さなかったが、抗体の発現および安定性に対して影響を有した。これらの構築物を、標準実験手順に従ってプラスミドベクター中にクローニングした。
細胞株および培養条件
CHO-S細胞を供給業者の推奨に従って培養した。簡潔には、2 mM Glutamaxが補われたFreestyle CHO-S培地中で細胞を培養し、2〜3日毎に継代した。細胞を37℃、5% CO2、100 rpmで培養した。トランスフェクションの1日前に、細胞を密度0.5×106 /mlで分割し、生存可能性を検査した(> 96%)。ヒトバーキットリンパ腫細胞株RajiおよびDaudiを、10% FBS、MEM NEAA、1mMピルビン酸ナトリウムおよび2 mM L-グルタミンが補われたRPMI 1640中にて37℃および5% CO2で培養した。細胞を0.2〜1.0×106個/mlの密度で2〜3日毎に継代した。
FcγRIIB_IgE構築物によるCHO-Sのトランスフェクション
トランスフェクションの日に、細胞密度は1.0〜2.0×106/mlであった。8.0×108個の細胞を20 ml CHO Freestyle培地にて希釈した(40×106/ ml)。1000μgのプラスミドDNA(重鎖および軽鎖それぞれ500μg)を添加し(50μg DNA/mlトランスフェクション体積)、続いて2000μg PEI(00μg PEI/ mlトランスフェクション体積)を添加した。細胞を37℃、5% CO2、100 rpmで3時間インキュベートした。この後、細胞懸濁液をCHO Freestyle培地にて1:10で希釈し、0.5 mMバルプロ酸を添加し、31℃、5% CO2、100 rpmで10日間インキュベートした。4000 × gでの2 × 10分間の遠心分離によって上清を採取した。
力価決定、精製およびサイズ排除クロマトグラフィー
プロテインA-HPLCによる抗体力価決定
プロテインA-HPLC分析をAgilent 1200 Series HPLCシステムで行った。データをソフトウェア「Chemstation」バージョンRev. B.04.02で分析した。以下の溶媒を使用した;溶媒A: 0.05M Tris/HCl、0.1Mグリシン、0.15M NaCl、pH 8.0;溶媒B: 0.05M Tris/HCl、0.1M グリシン、0.15M NaCl、pH 3.0。分析のために、Upchurch 2x 20 mm分析ガードカラム(#C-130B)に、120μlのApplied Biosystems Poros(登録商標)20Aパーフュージョンクロマトグラフィー媒体(Life Technologies, #4374732)を詰めた。結合した抗体を100%溶媒Bで溶出させた。精製抗体を回収した場合、フラクションを56 mM Tris pH 8.0で中和した。
8A6-IgEの精製
6日間の培養後に細胞を採取し、4000 × gでの2 × 10分間の遠心分離によって抗体含有上清を得た。抗体を、高速タンパク質液体クロマトグラフィー(Akta Explorer)によって5 ml High trap プロテインA FFカラム(GE Healthcare)で精製した。プロテインAへの抗体の結合は抗体のVH3フレームワークによって媒介される。ランニングバッファは10 mM Tris-HCl pH 8.0、150 mM NaClを含有し、溶出バッファは100 mMグリシン pH 2.7、150mM NaClから構成された。溶出された抗体を60 mM Tris-HCl, pH 8.0で中和し、およそ1.0 mg/mlへ濃縮し(Sartorius Vivaspin4)、0.2μmフィルターで滅菌濾過し、-80℃で保存した。
サイズ排除-HPLC
精製された8A6-IgE変異体のオリゴマー状態および均質性を決定するために、サンプルをSE-HPLCに供した。SE-HPLCをAgilent 1200 Series HPLCシステムで行った。データをソフトウェア「Chemstation」バージョン Rev. B.04.02で分析した。分析をSuperdex 200 10/300 GLカラム(GE Healthcare)で行った。以下の溶媒を使用した;5mM His, 150 mM NaC, pH 6.5。25μgのタンパク質を0.5μg/μlの濃度でアプライした。
これにより、グリコシル化8A6-IgE変異体は、標準ch8A6_N297Aと比較してより多くの二量体を形成する傾向を有し得、一方、脱グリコシル化8A6-IgEは、標準ch8A6_N297Aと比較してより分解されそしてより高い割合のフラグメントを有するようであることが明らかとなった。
結合アッセイ
いくつかの結合アッセイを行い、抗体の結合親和性および特異性を分析した。これらの結合アッセイのために、可溶性FcεRIαを下記プロトコルに従って作製した。
可溶性FcεRIαの作製
sFcεRIαによるCHO-Sのトランスフェクション
トランスフェクションの日に、細胞密度は約1.0×106/mlであった。500 mlの細胞懸濁液を2個の1リットルフラスコに移した。Freestyle Max試薬を穏やかにひっくり返し、312.5μlを5 ml Optipro SFMにて希釈した(RT)。312.5μgのプラスミドDNA(pAC91, sFcεRIa-H6)(SEQ ID NO: 37)を5 ml OptiPro SFMにて希釈し、穏やかに混合した。希釈されたFreestyleMax試薬をDNA/ Optipro SFM混合物に添加し、RTで15分間インキュベートした。フラスコを徐々に回しながら、DNA-脂質混合物を細胞へ徐々に添加した。トランスフェクト細胞を37℃、5% CO2、100 rpmで6日間インキュベートした。上清を4000 × gでの2 × 10分間の遠心分離によって採取した。
sFcεRIαの精製
組換え可溶性FcεRIαの産生のために、CHO-S細胞を、記載したように、ヒトFcεRIαのHisタグ化細胞外ドメイン(pAC91)でトランスフェクトした。細胞上清からのsFcεRIαの精製をAkta ExplorerでNiNTA-精製(Qiagen, #1018244)によって行った。以下のバッファを使用した:50mM NaH2PO4、300mM NaCl、10 mM イミダゾール, pH8.0を含有する結合バッファ;50mM NaH2PO4、300mM NaCl、400 mMイミダゾール, pH 8.0を含有する溶出バッファ。結合したsFcεRIαを、0%から100% Bへの線形勾配で溶出させた。sFcεRIαフラクションの濃縮後、10 mM His, pH 6.5でのバッファ交換を行った。これに続いて、Akta ExplorerでDEAE Sepharose FF(GE Healthcare, # 17-0709-10)で弱アニオン交換クロマトグラフィーを用いて、sFcεRIαを精製した。溶媒Aは10 mM His, pH 6.5から構成され;溶媒Bは10 mM His, 0.5 mM NaCl, pH 6.5を含有した。結合されたsFcεRIαを、2%から100% Bへの線形勾配で溶出させた。濃縮されたタンパク質を10 mM His, 150 mM NaCl, pH6.5, -80℃中に保存した。
SDS-PAGE
SDS-PAGE分析のために、1μgの精製抗体またはTrenzyme材料をNuPAGE Bis-Tris(4〜12%)ゲルへアプライした。抗体を、製造業者の推奨に従って、NuPAGE LDSサンプルバッファ中に、または、サンプル還元試薬が添加されかつ75℃へ10分間予熱される還元条件下に、適用した。SDS-PAGEを200Vの定電力で30分間行った。その後、ゲルをH2Oで2回洗浄し、シンプリーブルー染色溶液(Life Technologies)で染色した。過剰な色素をH2Oで除去し、ゲルの可視化をTransilluminator(UV, 白色光)を使用して行った。
ELISA結合アッセイ
sFcγRIIBまたはsFcεRIαへの8A6-IgEの結合
sFcγRIIBおよびsFcεRIαの両方へのグリコシル化および非グリコシル化型の8A6_cε2-4/8A6_cε3-4抗体の結合効果を試験するために、ELISAアッセイを確立した。このために、96ウェルプレートを、RTで1時間、SM101またはsFcεRIα、PBS中1μg/ml(体積100μl)でコーティングした。プレートをPBS, 0.01% Tween(登録商標)-20により2回洗浄し、RTで2時間、PBS, 2% BSA, 250μl/ウェルによりブロックした。洗浄工程後、抗体サンプルを、RTで1時間、コーティングされたウェルへ、PBS, 2% BSA中の適切な希釈系列で添加した。プレートをPBS, 0.01% Tween(登録商標)-20により3回洗浄し、ヒトκ軽鎖に対する検出二次抗体(HRPコンジュゲート化)を、RTで1時間、PBS, 2% BSA中1:8000で添加した。3回の洗浄工程後、結合したHRP-コンジュゲート化抗体をOPD, 0.03% H2O2 100μl/ウェルで検出した。反応を50μlの4 M H2SO4で停止させ、ELISAリーダー(Tecan, Spectra FluorPlus)にて492 nmでの吸収を測定した。sFcγRIIBへの直接結合は、4つの8A6_IgE構築物の全てが、共有されるFabドメインに起因して、ch8A6_N297A抗体と同じ親和性をsFcγRIIBに対して有することを明らかにした(図16)。しかし、sFcεRIαへの8A6-IgE構築物の結合は、全長IgE Fc部を有する構築物(cε2-4)とより短いバージョン(cε3-4)との差異を実証した(図17)。
sFcγRIIBおよびsFcεRIαへの8A6-IgEの結合−サンドイッチELISA
サンドイッチELISAを行い、これは同時に両方の抗原への結合を示した。両方の標的sFcγRIIBおよびsFcεRIαへの作製した8A6_cε2-4/8A6_cε3-4変異体の結合効果を、このサンドイッチELISAアッセイにおいて試験した。このために、96ウェルプレートを、RTで1時間、可溶性FcγRIIB(SM101), PBS中1μg/ml(体積100μl)でコーティングした。プレートをPBS, 0.01% Tween(登録商標)-20により2回洗浄し、RTで2時間、PBS, 2% BSA, 250μl/ウェルによりブロックした。洗浄工程後、コーティングされたウェルに、抗体サンプルを、RTで1時間、PBS, 2% BSA中の適切な希釈系列で添加した。プレートをPBS, 0.01% Tween(登録商標)-20により3回洗浄し、RTで1時間、sFcεRIα(PBS, 2% BSA中0.005μg/ml)と共にインキュベートした。プレートをPBS, 0.01% Tween(登録商標)-20により3回洗浄し、ヒトFcεRIαに対するビオチン化検出二次抗体CRA1を、RTで1時間、添加した(PBS, 2% BSAにて希釈された0.5μg/ml)。プレートをPBS, 0.01% Tween(登録商標)-20により3回洗浄し、HRP-コンジュゲート化ストレプトアビジンを、RTで20分間、PBS中1:200で添加した。3回の洗浄工程後、結合されたHRP-コンジュゲート化ストレプトアビジンを、OPD, 0.03% H2O2 100μl/ウェルで検出した。反応を50μlの4 M H2SO4で停止させ、ELISAリーダーにて492 nmでの吸収を測定した。
サンドイッチELISAはELISAからの結果を確認した。この場合も、FcεRIαへの8A6_cε3-4構築物の低親和性が、抗体のFabフラグメントでのFcγRIIBへの同時結合と共に示された。
FACS結合分析
細胞の表面に発現した天然FcγRIIBへの抗体の結合をFACS分析によって決定した。Raji細胞を使用し、何故ならば、バーキットリンパ腫に由来するこのBリンパ球細胞株は高レベルのFcγRIIBを発現するためである。Raji細胞をペレット化し、1.0×105個/ウェルを、50μlのFACSバッファ(HBSS, 5% FBS, 0.01% NaN3)中の96ウェル丸底細胞培養プレート中に播種した。試験される抗体を、50μlのFACSバッファ中の適切な希釈系列でRaji細胞に加え、4℃で1時間インキュベートした。200μlのFACSバッファでの2回の洗浄工程後、細胞を、FACSバッファ中に1:200で希釈された、ヒトκ軽鎖に対するFITC-コンジュゲート化二次抗体(Fab)2と共に、4℃で30分間、インキュベートした。2回の洗浄工程後、細胞ペレットを150μlのFACSバッファ中に再懸濁し、FACS Canto II(BD Biosciences)でのフローサイトメトリーによって分析した。
アッセイは、全ての8A6変異体について、FcγRIIBへのFabフラグメントの結合能が、抗体のFc部に導入された変化に関係なく、ch8A6_N297Aと比較して残っていることを示した(図18)。
Biacore
FcγRIIBおよびFcεRIαへの抗体構築物の親和性を、Biacore(商標)T200システムを使用する表面プラズモン共鳴(SPR)によってさらに分析した。
sFcγRIIBを、標準アミンカップリングプロトコル(BIAsensor surface Handbook, Biacore)を使用して、Series S Sensor Chip CM5(Biacore, BR-1005-30)へ共有結合で固定した。抗体変異体を1分間50 nMの濃度でキャプチャーした。分析物sFcεRIαを3分間0.1〜25 nMの様々な濃度で注入し、続いて7分間の解離工程を行った。CM5チップを、3M MgCl2を含有するバッファでリガンドおよびSM101の相互作用を消滅させるによって再生し、従って、それを新しい分析サイクルのために準備した。測定を25℃および連続的なフロー(10μl/分)で行った。データ評価を、1:1結合を仮定して、Biacore T200 Evaluation Software(バージョン1.0)を使用して行った。
結合実験の概要:
全ての構築物のFcγRIIBに対する結合親和性は、オリジナルのIgG抗体の結合親和性と等しいことが分かった。FcεRIαへの結合に関しては、8A6-IgEの両方の抗原への結合特徴付けの結果は、短縮変異体8A6_cε3-4/deglyは、FcεRIに対して全長IgE構築物と同じ高い親和性を発揮しないかもしれないことを示唆している。
8A6-IgEのヒト化
ch8A6-IgEのヒト化のために、抗体の可変重鎖を、SEQ ID NO: 3のヒト化可変重鎖10(VH10)と交換した。ヒト化8A6-IgE構築物の発現のために、ヒト化重鎖と一緒に可変軽鎖6(VL6;SEQ NO.4)を使用した。
可変重鎖の交換を標準クローニング手順によって行った。可変重鎖の交換を標準クローニング手順によって行った。挿入物の正しい挿入はDNA配列決定によって確認した。さらに、重鎖配列のC末端リジンを除去して終止コドンに交換した(AAA→TAA)。これは、荷電変異体の量を有意に減少させる。それは変異誘発PCRによって達成し、変異の成功は配列決定によって確認した。
ELISAによるヒト化8A6-IgEの抗原結合の特徴付け
実施例2と同じプロトコルを使用して、ELISAを行った。hu8A6-IgE変異体の結合をch8A6_N297Aと比較して試験した。ここで、可溶性FcγRIIBへの結合親和性の差異は検出されなかった(図19)。ヒト化およびキメラ8A6-IgE変異体のFc部におけるsFcεRIαへの結合を試験した。短縮されたFc部(cε3-4)を有するキメラおよびヒト化8A6-IgE変異体は両方とも、完全なFc部(cε2-4)を有する8A6-IgE変異体と比較して、FcεRIαに対するより低い親和性を示した。しかし、キメラ抗体およびヒト化抗体において差異は検出されなかった(図20)。
全長ch8A6_cε2-4構築物の脱グリコシル化バージョンを用いてFcεRIに対する結合試験を行った。
方法:
8A6(IgE)および(IgG)を蛍光色素NHS-Fluo488で標識した。500μgの各抗体を、製造業者の説明書に従ってPD-10カラムによってPBS中へ脱塩した。溶出フラクションの吸光度を280 nm(参照:320 nm)で光度計によって測定し、最も高い抗体量を含有するフラクションをプールした。Vivaspin4カラムによる濃縮後、およそ400μgの抗体を取り戻すことができた。
蛍光色素Fluo488をDMSO中に再構成し、その濃度を、517 nmでのその発光最大値で蛍光を測定することによって計算した。
サンプルをボルテックスしながら色素を抗体溶液へ徐々に添加して、抗体および色素を1:10のモル比で混合した。抗体および色素の量についての正確な計算は付録に見られ得る。溶液を300 rpmでの一定の振盪下で25℃にて1時間インキュベートした(Eppendorf Thermomixer)。遊離色素分子をPD-10カラムによる精製によって分離した。280 nm(抗体)および510 nm(色素)で測定された、最も高い標識タンパク質量を含むフラクションをプールし、Vivaspin4カラムによって再び濃縮し、最終濃度および標識化の程度(D.O.L.)を計算した。
最終の標識抗体を計算した:
ch8A6 -cε2-4-degly-T:1.35μg/μl、D.O.L.:2.2
ch8A6_cε3-4-degly-T:1μg/μl、D.O.L.:2.86
蛍光色素および抗体量の計算:
・8A6(IgE)の分子量:およそ176,000 Da = 176,000 g/mol
→350μg 抗体 = 2 nmol
・Fluo488の分子量:およそ981 mol/l
→DMSO中の不定量の再懸濁
→希釈 水中に1:5,000およびOD517の測定(色素の発光最大値)
→濃度[μg/μl] = 希釈係数 × OD517 × 918/ 80,000 = 8.6 nmol/μl
・色素対抗体比の計算:
→色素:抗体の所望のモル比 = 10:1
→抗体 2 nmol→色素 20 nmol
→2.3μl色素
標識化の程度(D.O.L)の計算:
・タンパク質濃度およびD.O.Lの計算についての定義
→Amax = 色素の発光最大値、Fluo488については517 nmでの吸光度
→A280 = 280 nmでの吸光度(タンパク質)
→CF= 補正係数;タンパク質に結合される全ての色素について特異的にInterchimによって定義される;A280(遊離色素)/ Amax(遊離色素)
→MW:タンパク質の分子量
→ε:減衰係数
・c[タンパク質] = 1.4 × (A280 - Amax x CF)
・D.O.L. = (Amax × MW)/(c[タンパク質] × ε色素)
Ficoll密度勾配遠心分離によるPBMCの調製
健康なドナー由来の軟膜をHBSSで1:1に希釈し、30 mlを50 ml Falconチューブ中の15 ml Biocoll分離溶液上に重層した。破損させることなく1000 × gで20分間遠心分離した後、白血球フラクションをプラスチックピペットで回収した。細胞を完全増殖培地で2回洗浄し、Neubauerカウンティングチャンバ中においてカウントした。
PBMC上でのch8A6_cε2-4-degly-Tおよびch8A6_N297Aの結合速度論
100μl完全増殖培地中の0.5×106 PBMCを、以下の抗体希釈物と共に37℃でインキュベータ中の96ウェルプレート(平底)中においてインキュベートした:2μg/ml ch8A6_cε2-4-degly-T cFluo488、2μg/ml ch8A6_N297A -Fluo488、2μg/ml 8A6 cε2-4-degly-T。全ての時点について余分のウェルを準備した。対照として、ch8A6_cε2-4-degly-T -Fluo488を5倍モル過剰量のSM101と共にRTで30分間プレインキュベートすることによって、PBMC上のFcγRIIBへの結合をブロックした。FcγRIIB結合部位の遮断を、Raji細胞上でインキュベーション後にFACS分析によって試験した。
10、30、60、120および240分後、ならびに一晩インキュベーション後、細胞を400 × gで5分間遠沈させ、丸底96ウェルプレート中の、2.5μlのαhCD19-PeCy7、5μlのαhCD63-PerCPおよび2.5μlのαhCD193-APCを含有する100μlのFACSバッファ中に、氷上で30分間再懸濁した。FACSバッファでの2回の洗浄工程後、サンプルをFACS Canto IIで分析した。
Raji細胞へのFluo488-標識8A6-IgGおよび8A6-IgEの結合
Raji細胞を異なる濃度の標識抗体と共にインキュベートし、平均蛍光値を抗体濃度に対してプロットした。抗体8A6_cε2-4-deglyは、Raji細胞の表面でのその受容体FcγRIIBへの高親和性結合を示した(図21を参照のこと)。この結合の特異性を、同じ構築物と共にインキュベートされたCHO細胞の分析によって確認したところ、標識抗体についての表面シグナルは検出されず、何故ならば、それはCHO細胞がFcεRI受容体を欠いていることに起因すると予想されたためである。これらのデータは、抗体の結合は、標識プロセスによっても、結合された蛍光色素NHS-Fluo488によっても変更されなかったことを確認した。
8A6_cε2-4-deglyのFcγRIIB結合部位のSM101マスキングの対照
細胞への8A6-IgEのFc部の結合の検出を可能にするために、抗体をSM101と共にプレインキュベーションすることによって、F(ab)2ドメイン、FcγRIIB結合部位それぞれをブロックした。構築物の結合能をFACSで分析した。FACS分析は、5倍モル過剰量の可溶性受容体(SM101)と共にプレインキュベーションした後の、8A6_cε2-4-deglyのその受容体FcγRIIBへの遮断を明らかに示した。SM101と共にプレインキュベーションした後の平均蛍光値は、未処理抗体と比較して、11.8%へと減少した。従って、マスクされた8A6_cε2-4-degly抗体は、PBMCインキュベーションについての対照として使用することができた。
PBMC上における結合速度論
単離されたPBMC上での、Fluo488で標識された抗体8A6-IgEの結合を、FACS分析によって評価した。従って、B細胞(CD19)と好塩基球(CD193、低SSC)とを識別するために、細胞をαhCD193-APCおよびαhCD19-PeCy7で染色した。CD63を染色し、好塩基球の活性化を分析した。
好塩基球上のCD63発現は測定の間変化しなかった(示さず)。
図22は、αhCD19-PeCy7抗体によって検出された、B細胞上の蛍光シグナルを示す。緑色の数字は、Fluo488標識抗体についてのCD19陽性細胞の測定された平均蛍光値を反映する。
アッセイは、Sainte-Laudyらによって最初に1994年(Sainte-Laudy, J, et al., Analysis of membrane expression of the CD63 human basophil activation marker. Applications to allergologic diagnosis. Allerg. Immunol. (Paris) 26, 211-4)および1996年(Sabbah, A and Sainte-Laudy, J., Flow Cytometry applied to the analysis of Lymphocyte and Basophil activation. ACI International 8, 116-9)に記載された方法に基づき、ここで、アレルゲンまたは対照による好塩基球活性化は、細胞表面上のCD63(gp53)の増加を測定するフローサイトメトリーによって検出される。アレルゲンおよび陽性対照をヘパリン添加全血に添加し、好塩基球を同定するための抗hCD193と活性化を測定するための抗hCD63とを含有する特異的抗体染色によって、CD63表面発現を測定する。並行して、好塩基球活性化および脱顆粒についての第2のパラメータとして、ヒスタミン放出を測定することができる。
8A6-IgEによる好塩基球の表面におけるFcγRIIBとFcεRIの架橋によって、FcεRIを介するアレルゲンに対する細胞応答がダウンレギュレートされる。
公知の花粉アレルギー(または試験に利用可能なアレルゲンを有する他の定義されるアレルギー)を有するドナーに由来するヘパリン添加全血50μlを得た。
これらの実験において、ch8A6_cε2-4-degly抗体を、ch8A6_N297Aキメラ8A6(IgG), N297A変異体と比較して使用した。
陽性対照および陰性対照について、キットのマニュアルに記載されているように、アレルゲンまたは対照とのインキュベーション時間15分間は、好塩基球の適切な活性化にとって十分であった。
50μlのヘパリン添加全血を、50μlの刺激物(アレルゲン、fMLP、または抗FcεRI対照抗体)および100μlの刺激バッファと共にインキュベートした。αFcεRIおよびfMLPは、キットのマニュアルに記載されているとおりに溶解し、希釈せずに使用した。アレルゲンは刺激バッファにて1:5に希釈した。Falconチューブにてバッファおよび刺激物を調製し、当該溶液に50μlの血液サンプルを(チューブ壁に接触させることなく)直接添加した。刺激バッファ中に溶解された20μlの染色試薬または市販の抗体(αhCD63-PEおよびαhCD193-Alexa647)を添加した。サンプルを穏やかにボルテックスし、37℃に予熱されたウォーターバス中にて15分間インキュベートした。溶解のために、2 ml溶解試薬を各チューブにアプライし、次いでサンプルをボルテックスし、暗所においてRTで10分間インキュベートした。500 × gで5分間の遠心分離後、上清を除去し、ペレットをキットの洗浄バッファ300μl中に再懸濁した。FACS分析を、以下の設定を使用してFACS Canto IIにおいて行った:
FSC リニア電圧:269
SSC リニア電圧:401
FITC ログ電圧:447
PE ログ電圧:379
αFcεRI抗体およびペプチドfMLP(ホルミル-メチオニル-ロイシル-フェニルアラニン、SEQ ID NO: 38)はキットに含有されており、1サンプル当たり50μlで使用した。
ゲーティング戦略
図23は、溶解された全血におけるゲーティング戦略を示す。パラメータFSCおよびSSCをリニアに設定した。3つの集団が可視化された:リンパ球、単球および顆粒球。好塩基球は、リンパ球と同じSSCレベルで検出され得る。SSCに対してCD193発現をプロットすることは、CD193を発現する2つの別個の集団の検出をもたらす。SSCが低い集団は好塩基性顆粒球と同定された。CD193(Y軸)対CD63(X軸)発現を示すプロットに象限ゲートを適用した結果、未処理サンプル中のCD63蛍光はほぼゼロであった。
バックゲーティング戦略を使用して、細胞集団をさらに特徴付けた。CD63低発現集団を含むゲートおよびCD63高発現集団を含むゲートを、ゲーティングなしの全血溶解物のFSC-SSCプロットと重ね合わせた。低発現集団は、リンパ球集団の近くにあると分かり、このゲーティングされた集団は好塩基球であることが確認された。対照的に高発現集団は、SSC軸の非常に右の限界で見られ、このことは、当該細胞が高度に顆粒状であることおよび好酸性顆粒球であることを反映している。
陽性および陰性対照のCD63発現
未処理細胞のCD63発現を0%に設定するか、または好塩基球に設定された象限ゲートの下部象限中のごく僅かの陽性細胞に設定した。αFcεRI抗体は、CD63陽性細胞が90%のレベルへと再現性よく好塩基球を活性化したが、ペプチドfMLPは、中程度のCD63発現しか誘導しなかった(陽性細胞が25〜30%)。アレルギー反応を減少させる能力について試験されるべき抗体が好塩基球自体を活性化できるかを決定するために、ch8A6_N297Aおよびch8A6_cε2-4-deglyを、細胞のさらなる活性化無しに、2つの異なる濃度で投与した。
図24は、これらのサンプルについて得られたデータを示す。
上側の図に示されるように、全血サンプルを0.5または2μg/mlの8A6-IgGまたは8A6-IgEと共にインキュベーションしても、好塩基球自体は活性化されなかった。2つの独立した実験において、CD63の表面発現は変化せず、検出された陽性細胞は1%未満であった。
分析の次の段階では、内毒素の混入が好塩基球活性化に与える効果を試験した。8A6_cε2-4-deglyは製造プロセスに由来する約30 EU/mlの内毒素を含有するため、LPS対照を行い、混入物質に由来する効果を排除した。従って、別個の血液サンプルを、8A6_cε2-4-degly単独と並行して、50 EU/ml LPS(アッセイにおいて1:4に希釈)と共にインキュベートした。図25に示されるように、混入生産物において予想された濃度でのLPSによる好塩基球の処理は、細胞の非特異的活性化をもたらさなかった。従って、8A6_cε2-4-deglyによる処理後に測定された効果は、抗体の活性に直接相関し得る。
8A6_cε2-4-deglyによる好塩基球の予防的処理
全血サンプルを、異なる濃度の対照、8A6_N297Aおよび8A6_cε2-4-deglyと共にインキュベートした。サンプルを異なる時点で採取し、好塩基球が花粉によって活性化されるポテンシャルを測定した。
A)0時間時点
各抗体を全血アリコートに添加した直後に、0時点について最初のサンプルを採取し、当該サンプルについて、花粉刺激によって活性化されるポテンシャルを分析した。この時点を2つの独立した実験で測定した。抗体との約5分間のインキュベーション(ピペッティングからサンプルインキュベーションまでの時間)を表すこの時点で、8A6_N297Aまたは8A6_cε2-4-deglyの効果は認められなかった。全サンプル中の好塩基球は、花粉によって約90%のCD63発現細胞へと活性化され得た。
B)2時間時点
2時間のインキュベーション後、αFcεRI活性化(陽性細胞が92%)および花粉刺激を受けた未処理細胞(93.4%)によって見られたような活性の低下を伴わずに好塩基球活性化が検出された。0.5〜5μg/mlの範囲の濃度の8A6_N297Aとのインキュベーションは、花粉による好塩基球活性化に影響を与えなかった(陽性細胞が91〜91.6%)。この時点で、8A6_cε2-4-deglyで処理されていたサンプルにおいては、好塩基球活性化が減少したようであったが(84.4〜88%)、用量依存性は検出されなかった。
C)6時間時点
6時間のインキュベーション後、細胞が陽性対照によって活性化されるポテンシャルは、花粉による活性化の場合は約85%、αFcεRIによる処理の場合は87%へと減少した(図26)。8A6-IgGによる処理は陽性対照に匹敵する結果(85〜88%)を示したが、8A6-IgEと共にインキュベートされた細胞は減少した活性化ポテンシャル(76〜84%)を示した(図27)。0.5μg/ml 8A6_cε2-4-deglyと共のインキュベーション後、好塩基球の76.6%のみが花粉によって活性化され得た。しかし、用量依存性は検出されず、より多い投薬量は0.5μg/ml処理と比較して僅かに上昇したCD63発現を示した。
D)24時間時点
2つの独立した実験において測定された、最後の時点は、αFcεRI処理の場合の活性化におけるCD63発現75%への減少を示した(図28および図29)。
花粉アトピーについて陽性と試験結果が出た健康なドナーに由来するヘパリン添加全血を、それぞれ5μg/mlの8A6_ce2-4脱グリコシル化または8A6_ce3-4脱グリコシル化(SM301 cε2-4またはcε3-4)と共に一晩インキュベートした。分析のために、50μl血液サンプルを、50μlの花粉(刺激バッファ中に1:5で予め希釈)、100μlの刺激バッファ(FlowCast Kit)および20μlの染色溶液(3μlのa-hCD193-Alexa647、3μlのa-hCD63-PerCP、3μlのa-hCD203c-PE、11μl刺激バッファ)と混合した。サンプルをボルテックスミキサーにおいて穏やかに混合し、37℃に予熱されたウォーターバス中において15分間インキュベートした。溶解のために、2 ml PharmLyse試薬(BD Biosciences)を各チューブにアプライし、次いでサンプルを再び混合し、暗所においてRTで10分間インキュベートした。500 × gで5分間の遠心分離後、上清を除去し、ペレットを300μlのFACSバッファ中に再懸濁した。好酸球を構成する、SSCが高くCD193陽性だがCD203c陰性の細胞に、ゲートを設定した。
Claims (21)
- 第1結合ドメインでFcε受容体(FcεR)に結合し、かつ第2結合ドメインでFcγ受容体IIB(FcγRIIB)に結合する、認識分子であって、前記第1結合ドメインがIgE定常領域の少なくとも一部を含み、前記一部は少なくともCε3及びCε4を含み、前記認識分子はその重鎖および軽鎖可変領域において、以下のCDR配列:
(a)その重鎖可変領域におけるSEQ ID NO: 14(CDR-H1)、SEQ ID NO: 15(CDR-H2)、およびSEQ ID NO: 16(CDR-H3)、ならびにその軽鎖可変領域におけるSEQ ID NO: 17(CDR-L1)、SEQ ID NO: 18(CDR-L2)、およびSEQ ID NO: 19(CDR-L3);または
(b)その重鎖可変領域におけるSEQ ID NO: 20(CDR-H1)、SEQ ID NO: 21(CDR-H2)、およびSEQ ID NO: 22(CDR-H3)、ならびにその軽鎖可変領域におけるSEQ ID NO: 23(CDR-L1)、SEQ ID NO: 24(CDR-L2)、およびSEQ ID NO: 25(CDR-L3)を含む抗体である、認識分子。 - 前記抗体がFcγ受容体IIA(FcγRIIA)に結合しない、請求項1に記載の認識分子。
- 前記抗体が、該抗体の可変領域を介するFc受容体への該抗体の結合が細胞への免疫複合体または凝集IgGの結合を妨げない非ブロッキング抗体である、請求項1または2に記載の認識分子。
- 前記抗体がキメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項3に記載の認識分子。
- 前記第2ドメインがFabドメインの少なくとも一部を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の認識分子。
- 前記第2結合ドメインが、(i)アミノ酸配列SEQ ID NO: 3に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および(ii)アミノ酸配列SEQ ID NO: 4に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、のうちの少なくとも1つを含有する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の認識分子。
- Daudi細胞のFcγRIIBのITIMリン酸化を、前記認識分子で処理されていないDaudi細胞と比較して約4〜10倍増加させる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の認識分子。
- 前記第2結合ドメインが、
(1)その重鎖可変領域においてSEQ ID NO: 1に示されるアミノ酸配列を有し、かつその軽鎖可変領域においてSEQ ID NO: 2に示されるアミノ酸配列を有する、または
(2)その重鎖可変領域においてSEQ ID NO: 3に示されるアミノ酸配列を有し、かつその軽鎖可変領域においてSEQ ID NO: 4に示されるアミノ酸配列を有する、請求項1〜7のいずれか一項に記載の認識分子。 - 前記IgE定常領域が、SEQ ID NO: 35、36、またはその一部のアミノ酸配列を有する、請求項5〜8のいずれか一項に記載の認識分子。
- 前記抗体がグリコシル化または脱グリコシル化されている、請求項1〜9のいずれか一項に記載の認識分子。
- 前記抗体が、インビトロで少なくとも4.9×10-4s-1の解離速度定数を有する親和性でヒトFcγRIIBに結合する、請求項1〜10のいずれか一項に記載の認識分子。
- 前記抗体が、インビトロで少なくとも1.2×10-7 Kd(M)を有する親和性でヒトFcεRIに結合する、請求項1〜11のいずれか一項に記載の認識分子。
- 請求項1〜12のいずれか一項に記載の認識分子をコードする核酸。
- ベクター中に挿入された請求項13に記載の核酸のうちの少なくとも1つを含むベクター。
- 請求項13に記載の核酸または請求項14に記載のベクターでトランスフェクトされた宿主細胞。
- 請求項1〜12のいずれか一項に記載の認識分子、請求項13に記載の核酸、請求項14に記載のベクター、または請求項15に記載の宿主細胞を有効成分として含む、薬学的組成物。
- 好塩基球と関連する疾患の治療または予防のための、請求項16に記載の薬学的組成物。
- アレルギーの治療または予防のための、請求項17に記載の薬学的組成物。
- 治療における使用のための、請求項1〜12のいずれか一項に記載の認識分子。
- 好塩基球と関連する疾患の治療または予防のための使用のための、請求項1〜12のいずれか一項に記載の認識分子。
- 好塩基球と関連する前記疾患がアレルギー性疾患である、請求項20に記載の使用のための認識分子。
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