TWI764291B - 抗tigit抗體及使用方法 - Google Patents
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Abstract
揭露與TIGIT結合的抗體與抗原結合片段。本揭露進一步涉及通過施用於此揭露之組合物用於治療免疫相關疾病(例如,癌症或感染或感染性疾病)的方法與組成物。
Description
本揭露關於與T細胞免疫球蛋白及ITIM域(TIGIT)結合的抗體及其抗原結合片段。 本揭露進一步關於用於使用於此揭露之抗TIGIT抗體與抗原結合片段於例如治療免疫相關疾病(例如,癌症或感染或傳染性疾病)的方法與組成物。也提供了用於篩選與產生所揭露之抗TIGIT抗體與抗原結合片段的方法與組成物。
在慢性抗原暴露的情況下,例如在癌症或病毒感染中,T細胞可能會精疲力竭/功能失調。精疲力竭的T細胞可表現出不良的增殖能力與細胞激素產生。精疲力竭的T細胞還可以向上調控結合於由腫瘤細胞及抗原呈現細胞(antigen-presenting cells, APC)所表現之配體的抑制受體/免疫檢查點 (Zarour (2016) Clin Cancer Res. 22(8):1856-64)。
TIGIT是一種免疫檢查點蛋白,是免疫球蛋白超家族的成員,由多個域組成,包括細胞外IgV域,I型跨膜區與胞質尾巴。尾巴由基於免疫受體酪胺酸的抑制性基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif ITIM與免疫球蛋白尾巴酪胺酸(immunoglobulin tail tyrosine, ITT)狀基序組成,兩者均參與轉譯後修飾及隨之而來的TIGIT活化調控TIGIT (Manieri et al. (2017) Trends Immunol. 38(1):20-8)。
TIGIT作為共抑制受體,在自然殺手(NK)細胞與T細胞上表現,它們可以通過不同的蛋白質與APC相互作用。 TIGIT與CD155(PVR)高親和力結合,並與CD112(PVRL2,nectin-2)弱相互作用(Levin et al. (2011) Eur J Immunol. 41(4):902-15; Stanietsky et al. (2009) Proc Natl Acad Sci USA. 106(42):17858-63; Yu et al. (2009) Nat Immunol. 10(1):48-57)。這些配體都在APC以及多種非造血細胞類型(包括腫瘤細胞)上表現,並與CD226共享(Bottino et al. (2003) J Exp Med. 198(4):557-67; Casado et al. (2009) Cancer Immunol Immunother. 58(9):1517-26; Mendelsohn et al. (1989) Cell. 56(5):855-65)。共刺激受體CD226以比TIGIT低約10倍的親和力結合兩個配體,從而可以劑量依賴性抑制CD226和CD155之間的相互作用(Lozano et al. (2012) J Immunol. doi: 10.4049/jimmunol.1103627)。除配體競爭外,TIGIT還可以順式直接與CD226結合併破壞其同二聚作用和其共刺激功能(Johnston et al. (2014) Cancer Cell. 26(6):923-37)。
在效應T細胞中,TIGIT可以例如通過抑制效應細胞活化,抑制增殖從而限制效應細胞池及/或藉由降低效應細胞功能與細胞激素產生來充當細胞內在抑制劑(Joller and Kuchroo (2017) Curr Top Microbiol Immunol. 410:127-56)。TIGIT還可以在調節性T細胞(Tregs)上高表現,從而促進其抑制功能。 TIGIT + Tregs表現更高水平的Treg簽名基因,例如Foxp3、CD25與CTLA-4,並在Treg特異性去甲基化區域 (TSDR)中顯示增強的去甲基化,從而導致更高的譜系穩定性(Joller et al. (2014) Immunity 40(4):569-81; Fuhrman et al. (2015) J Immunol. 195(1):145-55)。因此,在調節細胞中,TIGIT可通過直接誘導抑制介體來促進譜系穩定性並增強其抑制功能。 TIGIT在效應細胞和調節細胞中的功能,特別是那些可能限制免疫細胞對腫瘤和持久性病原體做出有效反應的能力,使其成為有吸引力的免疫治療靶標。
已經描述了能夠靶向TIGIT的試劑(Johnston et al. (2014) Cancer Cell. 26(6):923-37; Chauvin et al. (2015) J Clin Invest.125(5):2046-58; Srivastava et al. (2017) In: Proceedings of the AACR Annual Meeting; Cancer Res. 77(13 Suppl):Abstract 2612; Hung et al. (2018) Oncoimmunology 7(8):e1466769;也參見ClinicalTrials.gov, e.g., NCT04256421, NCT04165070, NCT02913313, NCT04262856)。 然而,這些試劑在臨床上顯示出有限的治療效用,尤其是當用作單一療法時(參見,例如,Johnston et al. (2014) Cancer Cell. 26(6):923-37)。 因此,仍然需要可調節其功能並克服當前治療選擇的局限性的TIGIT靶向劑。
在一些實施例中,本揭露部分提供了新穎的抗體與抗原結合片段,其與TIGIT結合,例如特異性結合。這些被投予為單獨試劑或為組合療法之一部分。
在一些實施例中,於此揭露之抗體和抗原結合片段特異性結合TIGIT。在一些實施例中,於此揭露之抗體和抗原結合片段能夠減少或阻斷TIGIT和CD155的相互作用。在一些實施例中,與參考抗TIGIT抗體或抗原結合片段相比,於此揭露之抗體和抗原結合片段具有一或更多之優異的特性。在一些實施例中,這些性質對於治療性抗體是所需的,並且可以包括以下一種或多種:對人類TIGIT的高結合親和力;人類TIGIT、食蟹猴(cyno) TIGIT及/或小鼠TIGIT之間的交叉反應;有效的T細胞活化活性;有效的體內抗癌活性;及/或有效的抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(例如,針對調節性T細胞),例如與參考抗TIGIT抗體或抗原結合片段相比。由於這些改善的特性中的一些或全部,於此揭露之抗TIGIT抗體和抗原結合片段可用於治療患有免疫相關疾病(例如,癌症或感染或傳染性疾病)的人類患者。
在一些實施例中,本揭露提供一種經分離之抗體或抗原結合片段,其特異性地結合至人類T細胞免疫球蛋白與ITIM域(T cell immunoglobulin and ITIM domain, TIGIT),其中該抗體或抗原結合片段包括:
(a) 三個重鏈互補性決定區(heavy chain complementarity determining regions、HCDRs),其包括序列辨識號:1 (HCDR1)、序列辨識號:2 (HCDR2)與序列辨識號:3 (HCDR3)之胺基酸序列;及三個輕鏈互補性決定區(light chain complementarity determining regions, LCDRs),其包括序列辨識號:4 (LCDR1)、序列辨識號:5 (LCDR2)與序列辨識號:23 (LCDR3)之胺基酸序列;
(b) 三個重鏈互補性決定區(HCDRs),其包括序列辨識號:1 (HCDR1)、序列辨識號:2 (HCDR2)與序列辨識號:3 (HCDR3)之胺基酸序列;及三個輕鏈互補性決定區(LCDRs),其包括序列辨識號:4 (LCDR1)、序列辨識號:5 (LCDR2)與序列辨識號:24 (LCDR3)之胺基酸序列;
(c) 三個重鏈互補性決定區(HCDRs),其包括序列辨識號:1 (HCDR1)、序列辨識號:2 (HCDR2)與序列辨識號:3 (HCDR3)之胺基酸序列;及三個輕鏈互補性決定區(LCDRs),其包括序列辨識號:4 (LCDR1)、序列辨識號:5 (LCDR2)與序列辨識號:6 (LCDR3)之胺基酸序列;
(d) 三個重鏈互補性決定區(HCDRs),其包括序列辨識號:1 (HCDR1)、序列辨識號:2 (HCDR2)與序列辨識號:19 (HCDR3)之胺基酸序列;及三個輕鏈互補性決定區(LCDRs),其包括序列辨識號:4 (LCDR1)、序列辨識號:5 (LCDR2)與序列辨識號:6 (LCDR3)之胺基酸序列;
(e) 三個重鏈互補性決定區(HCDRs),其包括序列辨識號:1 (HCDR1)、序列辨識號:2 (HCDR2)與序列辨識號:20 (HCDR3)之胺基酸序列;及三個輕鏈互補性決定區(LCDRs),其包括序列辨識號:4 (LCDR1)、序列辨識號:5 (LCDR2)與序列辨識號:6 (LCDR3)之胺基酸序列;
(f) 三個重鏈互補性決定區(HCDRs),其包括序列辨識號:1 (HCDR1)、序列辨識號:2 (HCDR2)與序列辨識號:21 (HCDR3)之胺基酸序列;及三個輕鏈互補性決定區(LCDRs),其包括序列辨識號:4 (LCDR1)、序列辨識號:5 (LCDR2)與序列辨識號:6 (LCDR3)之胺基酸序列;
(g) 三個重鏈互補性決定區(HCDRs),其包括序列辨識號:7 (HCDR1)、序列辨識號:8 (HCDR2)與序列辨識號:9 (HCDR3)之胺基酸序列;及三個輕鏈互補性決定區(LCDRs),其包括序列辨識號:10 (LCDR1)、序列辨識號:11 (LCDR2)與序列辨識號:12 (LCDR3)之胺基酸序列;或
(h) 三個重鏈互補性決定區(HCDRs),其包括序列辨識號:13 (HCDR1)、序列辨識號:14 (HCDR2)與序列辨識號:15 (HCDR3)之胺基酸序列;及三個輕鏈互補性決定區(LCDRs),其包括序列辨識號:16 (LCDR1)、序列辨識號:17 (LCDR2)與序列辨識號:18 (LCDR3)之胺基酸序列。
在一些實施例中,抗體或抗原結合片段包含三個重鏈互補決定區(HCDR),其包含序列辨識號:1(HCDR1)、序列辨識號:2(HCDR2)與序列識別的胺基酸序列號:3(HCDR3);以及三個輕鏈互補決定區(LCDR),其包含序列辨識號:4(LCDR1)、序列辨識號:5(LCDR2)和序列辨識號:23(LCDR3)的胺基酸序列。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段包含人類生殖系列(germline)重鏈與輕鏈框架區,或人類生殖系列重鏈與輕鏈框架區經突變以包含一個或更多之胺基酸取代。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段包含與序列辨識號:39的胺基酸序列至少90%相同的重鏈可變區與序列辨識號:39的胺基酸序列至少90%相同的輕鏈可變區。序列辨識號:40的胺基酸序列。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段包含含有序列辨識號:39的胺基酸序列的重鏈可變區與含有序列辨識號:40的胺基酸序列的輕鏈可變區。
在一些實施例中,抗體或抗原結合片段包含經突變以修飾效應子功能的人類IgG1重鏈恆定區或人類IgG1重鏈恆定區。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段包含重鏈恆定區,該重鏈恆定區包含序列辨識號:43的胺基酸序列。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段包含重鏈恆定區,該重鏈恆定區包含序列辨識號:43的胺基酸序列,其被突變為包含在位置239、330與332之胺基酸取代。在序列辨識號:43之位置239的S被以D取代;在序列辨識號:43之位置330的A被以L取代;及在序列辨識號:43之位置332的I被以E取代。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段包含重鏈恆定區,該重鏈恆定區包含序列辨識號:44的胺基酸序列。在一些實施例中,重鏈恆定區還包含C端離胺酸(K)。
在一些實施例中,抗體或抗原結合片段包含人類Ig κ輕鏈恆定區。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段包含輕鏈恆定區,該輕鏈恆定區包含序列辨識號:45的胺基酸序列。
在一些實施例中,抗體或抗原結合片段包括:
(a) 包含序列辨識號:43的胺基酸序列的重鏈恆定區與包含序列辨識號:45的胺基酸序列的輕鏈恆定區;或
(b) 包含序列辨識號:44的胺基酸序列的重鏈恆定區與包含序列辨識號:45的胺基酸序列的輕鏈恆定區。
在一些實施例中,抗體或抗原結合片段包括:
(a) 重鏈,其包含序列辨識號:46的胺基酸序列;與輕鏈,其包含序列辨識號:48的胺基酸序列;或
(b) 重鏈,其包含序列辨識號:47的胺基酸序列;與輕鏈,其包含序列辨識號:48的胺基酸序列。
在一些實施例中,抗體或抗原結合片段包含:重鏈恆定區,其包含序列辨識號:44的胺基酸序列;和輕鏈恆定區,其包含序列辨識號:45的胺基酸序列。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段包含含有序列辨識號:47的胺基酸序列的重鏈與含有序列辨識號:48的胺基酸序列的輕鏈。在一些實施例中,重鏈恆定區或重鏈更包括C端離胺酸(K)。
在一些實施例中,本揭露提供了與人類TIGIT特異性結合的分離的抗體或抗原結合片段,其中抗體或抗原結合片段結合至人類TIGIT之一區域,該區域包括在序列辨識號:22之位置106的Y。在一些實施例中,該區域還包括更包括以下之一或更多:在序列辨識號:22之位置56的Q;在序列辨識號:22之位置74的G;在序列辨識號:22之位置110的Y;及在序列辨識號:22之位置111的H。在一些實施例中,該區域至少包括:在序列辨識號:22之位置56的Q;與在序列辨識號:22之位置106的Y。 在一些實施例中,該區域至少包括:在序列辨識號:22之位置56的Q;在序列辨識號:22之位置74的G;在序列辨識號:22之位置106的Y;與在序列辨識號:22之位置110的Y。在一些實施例中,該區域是非線性的。
在一些實施例中,抗體或抗原結合片段與參考抗體或抗原結合片段競爭與人類TIGIT的結合,其中參考抗體或抗原結合片段包含三個重鏈互補決定區(HCDR),其包含胺基酸序列序列辨識號:1(HCDR1)、序列辨識號:2(HCDR2)與序列辨識號:3(HCDR3)的序列;以及三個輕鏈互補決定區(LCDR),其包含序列辨識號:4(LCDR1)、序列辨識號:5(LCDR2)與序列辨識號:23(LCDR3)的胺基酸序列。在一些實施例中,該抗體或抗原結合片段與參考抗體或抗原結合片段結合到人類TIGIT的相同區域,其中該參考抗體或抗原結合片段包含三個重鏈互補決定區(HCDR),其包含序列辨識號:1(HCDR1)、序列辨識號:2(HCDR2)與序列辨識號:3(HCDR3)的胺基酸序列;以及三個輕鏈互補決定區(LCDR),其包含序列辨識號:4(LCDR1)、序列辨識號:5(LCDR2)與序列辨識號:23(LCDR3)的胺基酸序列。在一些實施例中,參考抗體或抗原結合片段包含人類生殖系列重鏈與輕鏈框架區,或人類生殖系列重鏈與輕鏈框架區經突變以包含一個或更多之胺基酸取代。在一些實施例中,參考抗體或抗原結合片段包含含有序列辨識號:39的胺基酸序列的重鏈可變區與含有序列辨識號:40的胺基酸序列的輕鏈可變區。在一些實施例中,參考抗體或抗原結合片段包含包含序列辨識號:44的胺基酸序列的重鏈恆定區和包含序列辨識號:45的胺基酸序列的輕鏈恆定區。在一些實施例中,參考抗體或抗原結合片段包含含有序列辨識號:47的胺基酸序列的重鏈與含有序列辨識號:48的胺基酸序列的輕鏈。在一些實施例中,重鏈恆定區或重鏈還包含C端離胺酸(K)。
在一些實施例中,本揭露提供了包含所述抗體及/或抗原結合片段的醫藥組成物。在一些實施例中,醫藥組成物包含一或更多之抗體及/或一或更多之抗原結合片段,以及至少一種藥學上可接受的載體。
在一些實施例中,於此還提供了用於所述抗體及/或抗原結合片段的治療方法和用途,例如用於活化及/或殺死一或更多之免疫細胞。
在一些實施例中,本揭露提供了在需要其的個體中活化及/或殺死一個或更多之免疫細胞的方法,包括對個體投予有效量之於此所述的抗體或抗原結合片段,或於此所述的醫藥組成物。在一些實施例中,活化一或更多之免疫細胞包括活化一或更多之天然殺手細胞、一或更多之細胞毒性T細胞、一或更多之輔助T細胞及/或一或更多之單核細胞。在一些實施例中,一或更多之免疫細胞包含一或更多之天然殺手細胞及/或一或更多之細胞毒性T細胞。在一些實施例中,殺死一或更多之免疫細胞包括殺死一或更多之調節性T細胞。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段或醫藥組成物與至少一種其他治療劑組合投予。在一些實施例中,至少一種其他治療劑包括檢查點抑制劑。在一些實施例中,檢查點抑制劑是PD-1抑制劑。在一些實施例中,檢查點抑制劑是抗PD-1拮抗劑抗體(例如,派姆單抗(pembrolizumab))。
在一些實施例中,本揭露提供了於此所述的抗體或抗原結合片段,或於此所述的醫藥組成物,用於在需要其的個體中活化及/或殺死一個或更多之免疫細胞。在一些實施例中,活化一或更多之免疫細胞包括活化一或更多之天然殺手細胞、一或更多之細胞毒性T細胞、一或更多之輔助T細胞及/或一或更多之單核細胞。在一些實施例中,一或更多之免疫細胞包含一或更多之天然殺手細胞及/或一或更多之細胞毒性T細胞。在一些實施例中,殺死一或更多之免疫細胞包括殺死一或更多之調節性T細胞。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段或醫藥組成物與至少一種其他治療劑組合施用。在一些實施例中,至少一種其他治療劑包括檢查點抑制劑。在一些實施例中,檢查點抑制劑是PD-1抑制劑。在一些實施例中,檢查點抑制劑是抗PD-1拮抗劑抗體(例如,派姆單抗)。
在一些實施例中,本揭露提供了於此所述的抗體或抗原結合片段或於此所述的醫藥組成物在需要其的個體中活化及/或殺死一或更多之免疫細胞的用途。在一些實施例中,活化一或更多之免疫細胞包括活化一或更多之天然殺手細胞、一或更多之細胞毒性T細胞、一或更多之輔助T細胞及/或一或更多之單核細胞。在一些實施例中,一或更多之免疫細胞包含一或更多之天然殺手細胞及/或一或更多之細胞毒性T細胞。在一些實施例中,殺死一或更多之免疫細胞包括殺死一或更多之調節性T細胞。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段或醫藥組成物與至少一種其他治療劑組合施用。在一些實施例中,至少一種其他治療劑包括檢查點抑制劑。在一些實施例中,檢查點抑制劑是PD-1抑制劑。在一些實施例中,檢查點抑制劑是抗PD-1拮抗劑抗體(例如,派姆單抗)。
在一些實施例中,本揭露提供於此所述的抗體或抗原結合片段在製備用於活化及/或殺死需要其的個體中的一個或更多之免疫細胞的藥物中的用途。在一些實施例中,活化一或更多之免疫細胞包括活化一或更多之天然殺手細胞、一或更多之細胞毒性T細胞、一或更多之輔助T細胞及/或一或更多之單核細胞。在一些實施例中,一或更多之免疫細胞包含一或更多之天然殺手細胞及/或一或更多之細胞毒性T細胞。在一些實施例中,殺死一或更多之免疫細胞包括殺死一或更多之調節性T細胞。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段將與至少一種其他治療劑組合施用。在一些實施例中,至少一種其他治療劑包括檢查點抑制劑。在一些實施例中,檢查點抑制劑是PD-1抑制劑。在一些實施例中,檢查點抑制劑是抗PD-1拮抗劑抗體(例如,派姆單抗)。
在一些實施例中,於此提供了所描述的抗體及/或抗原結合片段的治療方法與用途,例如用於治療癌症。
在一些實施例中,本揭露提供了在有需要的個體中治療癌症的方法,其包括向個體施用治療有效量的於此所述的抗體或抗原結合片段或於此所述的醫藥組成物。在一些實施例中,癌症表現CD155。在一些實施例中,癌症是實體瘤。在一些實施例中,所述癌症是結腸直腸癌。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段或醫藥組成物與至少一種其他治療劑組合投予。在一些實施例中,至少一種其他治療劑包括檢查點抑制劑。在一些實施例中,檢查點抑制劑是PD-1抑制劑。在一些實施例中,檢查點抑制劑是抗PD-1拮抗劑抗體(例如,派姆單抗)。
在一些實施例中,本揭露提供了於此所述的抗體或抗原結合片段,或於此所述的醫藥組成物,用於治療有此需要的個體的癌症。在一些實施例中,癌症表現CD155。在一些實施例中,癌症是實體瘤。在一些實施例中,所述癌症是結腸直腸癌。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段或醫藥組成物與至少一種其他治療劑組合施用。在一些實施例中,至少一種其他治療劑包括檢查點抑制劑。在一些實施例中,檢查點抑制劑是PD-1抑制劑。在一些實施例中,檢查點抑制劑是抗PD-1拮抗劑抗體(例如,派姆單抗)。
在一些實施例中,本揭露提供了於此所述的抗體或抗原結合片段或於此所述的醫藥組成物在治療有此需要的個體中的癌症的用途。在一些實施例中,癌症表達CD155。在一些實施例中,癌症是實體瘤。在一些實施例中,所述癌症是結腸直腸癌。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段或醫藥組成物與至少一種其他治療劑組合施用。在一些實施例中,至少一種其他治療劑包括檢查點抑制劑。在一些實施例中,檢查點抑制劑是PD-1抑制劑。在一些實施例中,檢查點抑制劑是抗PD-1拮抗劑抗體(例如,派姆單抗)。
在一些實施例中,本揭露提供了於此所述的抗體或抗原結合片段在製備用於治療有此需要的個體中的癌症的藥物中的用途。在一些實施例中,癌症表現CD155。在一些實施例中,癌症是實體瘤。在一些實施例中,所述癌症是結腸直腸癌。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段將與至少一種其他治療劑組合施用。在一些實施例中,至少一種其他治療劑包括檢查點抑制劑。在一些實施例中,檢查點抑制劑是PD-1抑制劑。在一些實施例中,檢查點抑制劑是抗PD-1拮抗劑抗體(例如,派姆單抗)。
在一些實施例中,於此提供了所描述的抗體及/或抗原結合片段的治療方法和用途,例如,用於治療感染或傳染病。
在一些實施例中,本揭露提供了一種在有需要的個體中治療感染或感染性疾病的方法,該方法包括向該個體施用治療有效量的於此所述的抗體或抗原結合片段或藥物於此所述的組成。在一些實施例中,感染或感染性疾病是人T細胞白血病病毒1型相關疾病。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段或醫藥組成物與至少一種其他治療劑組合施用。在一些實施例中,至少一種其他治療劑包括檢查點抑制劑。在一些實施例中,檢查點抑制劑是PD-1抑制劑。在一些實施例中,檢查點抑制劑是抗PD-1拮抗劑抗體(例如,派姆單抗)。
在一些實施例中,本揭露提供了於此所述的抗體或抗原結合片段,或於此所述的醫藥組成物,用於治療有此需要的個體的感染或感染性疾病。在一些實施例中,感染或感染性疾病是人T細胞白血病病毒1型相關疾病。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段或醫藥組成物與至少一種其他治療劑組合施用。在一些實施例中,至少一種其他治療劑包括檢查點抑制劑。在一些實施例中,檢查點抑制劑是PD-1抑制劑。在一些實施例中,檢查點抑制劑是抗PD-1拮抗劑抗體(例如,派姆單抗)。
在一些實施例中,本揭露提供了於此所述的抗體或抗原結合片段或於此所述的醫藥組成物在治療需要其的個體中的感染或傳染性疾病中的用途。在一些實施例中,感染或感染性疾病是人T細胞白血病病毒1型相關疾病。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段或醫藥組成物與至少一種其他治療劑組合施用。在一些實施例中,至少一種其他治療劑包括檢查點抑制劑。在一些實施例中,檢查點抑制劑是PD-1抑制劑。在一些實施例中,檢查點抑制劑是抗PD-1拮抗劑抗體(例如,派姆單抗)。
在一些實施例中,本揭露提供了於此所述的抗體或抗原結合片段在製備用於治療需要其的個體的感染或傳染性疾病的藥物中的用途。在一些實施例中,感染或感染性疾病是人T細胞白血病病毒1型相關疾病。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段將與至少一種其他治療劑組合施用。在一些實施例中,至少一種其他治療劑包括檢查點抑制劑。在一些實施例中,檢查點抑制劑是PD-1抑制劑。在一些實施例中,檢查點抑制劑是抗PD-1拮抗劑抗體(例如,派姆單抗)。
在一些實施例中,還提供了編碼本揭露的抗體或抗原結合片段的核酸。核酸可以是分離的核酸及/或摻入分離的載體中的核酸的形式。
在其他實施例中,本揭露提供了產生所述抗體及/或抗原結合片段的方法。在一些實施例中,本揭露提供了產生抗體或抗原結合片段的方法,包括在適合於產生抗體或抗原結合片段的條件下培養宿主細胞或修飾成包含一個或更多之編碼抗體或抗原結合片段的核酸的細胞群。抗體或抗原結合片段。在一些實施例中,該方法進一步包括分離,純化及/或回收產生的抗體或抗原結合片段。
通過參考以下詳細描述,可以更容易地理解所公開的組合物和方法。除非於此另外定義,否則與本揭露內容結合使用的所有科學和技術術語具有與該技術領域中具有通常知識者通常理解的相同含義。
出於任何目的,通過引用將於此引用的所有參考文獻併入。在所引用的參考文獻與於此的公開內容衝突的程度上,以說明書為準。
除非上下文另有明確規定,否則於此所用的單詞的單數形式也包括複數形式;作為示例,術語“一”,“一個”與“該”應理解為單數或複數。舉例來說,“一個元素”是指一個或更多之元素。除非特定上下文另外指出,否則術語“或”表示“及/或”。除非上下文另外指出,否則所有範圍,包括以“在X值和Y值之間”形式表示的範圍,都包括端點與之間的所有點。
術語“抗體”在最廣義上使用是指一種免疫球蛋白分子,藉由該免疫球蛋白分子之可變區內的至少一個抗原識別位點,識別並結合於一標靶(target),例如蛋白質、多肽、碳水化合物、多核苷酸、脂質或其組合。抗體的重鏈由重鏈可變區(VH
)與重鏈恆定區(CH
)構成。輕鏈由輕鏈可變區(VL
)與輕鏈恆定區(CL
)構成。為了本申請案的目的,增強的重鏈與輕鏈可變區各自包括三個互補決定區(CDR1、CDR2與CDR3)與四個構架區(FR1、FR2、FR3與FR4),被從N端到C端設置為:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3與FR4。“抗體”可以是天然存在的或人造的,如經由一般融合瘤技術產生的單株抗體。抗體可包括一個或更多之重鏈及/或輕鏈。術語“抗體”包括全長單株抗體與全長多株抗體,以及抗體片段,如Fab、Fab’、F(ab’)2
、Fv與單鏈抗體。抗體可以是免疫球蛋白的五種主要類別中的任何一種:IgA、IgD、IgE、IgG與IgM,或其亞類(subclass)(例如同型IgG1、IgG2(如,IgG2a、IgG2b)、IgG3、IgG4)。該術語還涵蓋人類抗體、嵌合抗體、人源化抗體與任何包含抗原識別位點之經修飾的免疫球蛋白分子,只要其顯示出一種或更多之所需的生物學活性(例如,結合TIGIT等)即可。
描述抗體中CDR和FR區位置的編碼系統已被各種團體所定義。一種此類的系統是Kabat編碼系統(參見,例如,Kabat et al. “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” Diane Publishing Company (1992);也參見Kabat et al. “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1987 and 1991))。由Kabat編碼系統定義的示例性CDR序列在表2中列出,並且可以用於於此揭示之任何示例性抗體與抗原結合片段。在一些實施例中,本揭露的抗體與抗原結合片段包括與於此所述的CDR序列以100%同一性匹配的CDR序列。在一些實施例中,本揭露的抗體與抗原結合片段包含與於此所述的CDR序列以90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性匹配的CDR序列。
用於定義抗體中CDR與FR區位置的其他編碼系統包括,例如IMGT編碼系統(International ImMunoGeneTics Information System (IMGT®)、Chothia編碼系統(例如,參見Al-Lazikani et al. J Mol Biol. 1997;273:927-48)與化學計算組(Chemical Computing Group, CCG)編碼系統(例如,參見Molecular Operating Environment (MOE), 2013.08; Chemical Computing Group ULC, Montreal, QC, Canada, H3A 2R7, 2018) 。
如於此所使用,術語“單株抗體”意指從實質上同質(homogeneous)的抗體族群中所獲得的抗體,即,除了可能少量存在的可能自然發生的突變以外,構成該群體的各個抗體是相同的。單株抗體針對單個抗原之抗原決定位具有高度特異性。相對地,一般的(多株)抗體製品通常包括針對(或特異於)不同抗原決定位的一大群抗體。修飾語“單株”代表抗體的特徵為從實質上同質的抗體族群所獲得,而不應解釋為需要藉由任何特定方法產生抗體。於此描述了用於產生單株抗體的示例性方法,而其他方法為該領域已知的。
於此所述的單株抗體具體包括“嵌合”抗體,其中一部分重鏈及/或輕鏈與衍生自特定物種或屬於特定抗體類別或亞類的抗體中的對應序列相同或同源,而鏈的其餘部分與衍生自另一物種或屬於另一種抗體類別或亞類的抗體中的對應序列及此類抗體的片段相同或同源,只要它們與TIGIT結合及/或顯現出所需之生物學活性。
如於此所使用之術語“嵌合抗體”係指,抗體,於其中(a) 恆定區被改變,置換或交換,而使抗原結合位點(可變區)與不同或改變之類別、效應子功能及/或物種的一恆定區連接。類;及/或(b) 可變區或其一部分被具有不同或改變的抗原特異性的可變區或其一部分改變、置換或交換。修飾語“嵌合”意指抗體的特徵為具有來自大於一種物種之結構要素,而不應解釋為需要藉由任何特定方法產生抗體。例如,為了產生嵌合抗體,可以使用該領域已知的方法將來自非人類供體抗體(例如,小鼠供體抗體)的可變區序列連接至人類恆定區。例如,小鼠抗人類TIGIT抗體可以藉由將其恆定區以來自人類免疫球蛋白之恆定區取代來修飾。由於經人類恆定區的取代,因此相較於原始小鼠抗體,嵌合抗體可以保留其識別人類TIGIT的特異性,同時具有經減低之人體內的免疫原性(immunogenicity)。
如於此所使用,術語“人源化抗體”是指包含至少一些人類序列和至少一些非人類序列之抗體的形式。通常,此抗體主要包含人類序列與一小部分之賦予對標靶抗原之結合特異性的非人類序列。此類抗體包括嵌合抗體,其包含衍生自非人類抗體的最少序列並保留非人內抗體的反應性,同時在人中為免疫原性較低。通常,人源化抗體是藉由將來自人受體抗體的高變區序列置換為來自與感興趣之抗原(例如,人類TIGIT)結合之非人類供體抗體(例如,小鼠供體抗體)的高變區序列而產生的。在一些例子中,受體抗體的構架區序列也可以供體抗體的對應序列來置換(例如,經由反向突變)。除了衍生自供體與受體抗體的序列外,人源化抗體還可以藉由在框架區中及/或經置換的非人類殘基內之殘基取代來修飾,以優化與最適化抗體特異性、選擇性、親和力及/或活性,如於此所討論。
在一些實施例中,於此揭露之抗體與抗原結合片段是人源化的。在一些實施例中,所揭露之抗體與抗原結合片段含有源自非人類抗體的最小序列。在一些實施例中,所揭露之抗體與抗原結合片段保留了非人類抗體的親和力,但是包含在一個或更多之CDR及/或框架中的修飾。在一些實施例中,所揭露之抗體與抗原結合片段也顯現出非人類抗體並未顯現的一種或更多之所需的特性,包括,但不限於較低之免疫原性與經減低的毒性。在一些實施例中,非人類抗體為一小鼠抗體。在一些實施例中,非人類抗體為一小鼠抗人類TIGIT抗體。示例性的小鼠抗人類TIGIT抗體於此描述,且包括,但不限於7D4、2C9與3A9。在一些實施例中,將非人類抗體,或其抗原結合片段或抗原結合域作為比較物或“參考”抗體、抗原結合片段或抗原結合域,例如,以評估比較結合親和力(comparative binding affinity)。
如於此所使用,術語抗體之“抗原結合片段”係指保留對抗原(例如,TIGIT)結合之能力的一抗體或蛋白質的一個或更多之片段。抗原結合片段也可以保留免疫效應子活性。 已經顯示,全長抗體的片段可以執行全長抗體之抗原結合功能。術語抗體之“抗原結合片段”中涵蓋的結合片段的例子包括:(i) 一Fab片段,由VL
、VH
、CL
與CH1
域組成的單價片段;(ii) 一F(ab')2
片段,其為包含兩個藉由在鉸鏈區之一雙硫鍵連接之Fab片段的雙價片段;(iii) 一Fd片段,由VH
與CH1
結構組成; (iv) 一Fv片段,由一抗體之單臂的VL
與VH
域組成;(v) 一dAb片段,其包括單個可變域,例如VH
域(參見,例如,Ward et al. (1989) Nature 341:544-6; and Intl. Pub. No. WO 1990/005144);(vi) 一經分離的互補決定區 (CDR)。此外,儘管Fv片段的兩個域VL
與VH
係由不同的基因所編碼,然而它們可以經由合成之連接子(synthetic linker)來連接(例如,使用重組方法),此可使它們被做成一單一蛋白鏈,於其中VL
與VH
區配對形成單價分子(稱為單鏈Fv (single chain Fv, scFv))。參見,例如Bird et al. (1988) Science 242:423-6; and Huston et al. (1988) Proc Natl Acad Sci. USA 85:5879-83。 此類單鏈抗體也意圖包含在術語抗體之“抗原結合片段”內。 在一些實施例中,將scFv分子併入融合蛋白中。也包括其他形式的單鏈抗體,例如雙抗體(diabody)。雙抗體是二價雙特異性抗體,於其中VH
與VL
域在一單一多肽鏈上表現,但使用的連接子太短,以至於不允許同一條鏈上之兩域之間進行配對,從而迫使這些域與另一條鏈之互補域配對 並產生兩個抗原結合位點(參見,例如,Holliger等(1993)Proc Natl Acad Sci.USA 90:6444-8;和Poljak等(1994)Structure 2:1121-3)。可以使用該技術領域已知的一般技術來獲得抗原結合片段,並且可以以與完整抗體相同的方式篩選結合片段的效用(例如,結合親和力)。 抗原結合片段可藉由切割完整蛋白,例如藉由蛋白酶或化學切割來製備。
除非另有說明,如於此所使用,術語“T細胞免疫球蛋白與ITIM域”或“TIGIT”是指來自任何脊椎動物來源之TIGIT的任何天然形式,而脊椎動物來源包括哺乳動物,例如靈長類動物(例如,人與猴子)與囓齒動物(例如,小鼠與大鼠)。 TIGIT在該領域中也稱為DKFZp667A205、FLJ39873、含V-set與免疫球蛋白域之蛋白質9(V-set and immunoglobulin domain-containing protein 9)、含V-set與跨膜域之蛋白質3(V-set and transmembrane domain-containing protein 3)、VSIG9、VSTM3及WUCAM。此術語涵蓋“全長”未經處理之TIGIT(例如,具有序列辨識號:22之胺基酸序列的全長人類TIGIT),以及由於如選擇性剪接事件(alternative splicing event)、可變啟動子使用(variable promoter usage)、轉錄後修飾(post-transcriptional modifications)、轉譯後修飾(post-translational modifications)等之細胞表現或處理而產生的任何形式的TIGIT(例如,經過處理的沒有信號序列之人類TIGIT,即具有序列辨識號:22之胺基酸22-244之胺基酸序列的TIGIT)。此術語也涵蓋TIGIT的功能變體或片段,包括,但不限於保留TIGIT的一種或更多之生物學功能的剪接變體(splice variants)、等位基因變體(allelic variants)與同功型(isoforms)(即,除非上下文指示該術語僅用於指野生型蛋白,否則包括變體和片段)。示例性之人類TIGIT的胺基酸序列可以在UniProt登錄號Q495A1下找到。
術語“抗TIGIT抗體”或“結合TIGIT的抗體”意指結合,例如特異性結合TIGIT之任何形式的抗體或其抗原結合片段的。該術語涵蓋單株抗體(包括全長單株抗體)、多株抗體與生物學功能性抗體片段,只要它們結合,例如特異性結合TIGIT即可。 在一些實施例中,於此所揭露之抗TIGIT抗體或抗原結合片段可以結合,例如特異性結合於TIGIT之胞外域(extracellular domain)中之一個或更多之胺基酸。在一些實施例中,TIGIT之細胞外域包括序列辨識號:22之胺基酸24-138。
如於此所使用,術語“特異性”、“特異性結合”或“特異地結合”是指在異質族群(heterogeneous population)之蛋白質與其他生物製劑(biologics)中,抗體或抗原結合片段(例如,抗TIGIT抗體)與標靶抗原(例如,TIGIT)之間的結合反應。藉由在一給定組之條件(set of coditions)下比較對於適當抗原的結合與對於替代抗原或抗原混合物的結合,可以測試抗體的結合之特異性。若抗體以比替代抗原或抗原混合物高至少2、5、7、10或更多倍之親和力結合適當的抗原,則其認為是特異性的。“特異性抗體”或“標靶特異性抗體”是僅結合標標靶抗原(例如,TIGIT),但不與其他抗原結合(或顯現最小結合)的抗體。在一些實施例中,特異性結合標靶抗原(例如,TIGIT)的抗體或抗原結合片段也具有小於1x10-6
M,小於1x10-7
M,小於1x10-8
M、小於1x10-9
M、小於1x10-10
M、小於1x10-11
M、小於1x10-12
M或小於1x10-13
M之針對該標靶的KD
。在一些實施例中,KD
為1 pM至500 pM。在一些實施例中,KD
介於500 pM至1 μ、1 μM至100 nM或100 mM至10 nM之間。
術語“抗原決定位”是指能夠被抗體識別並特異性結合的抗原部分。當抗原是多肽時,抗原決定位可以形成自經由多肽之三級折疊而並列的連續胺基酸或不連續胺基酸。可以使用該領域已知的任何抗原決定位匹配技術(epitope mapping)來鑑定與抗體結合的抗原決定位,包括通過直接觀察抗原-抗體複合物之用於抗原決定位鑑定的X射線晶體學(X-ray crystallography),以及監測抗體對抗原之片段或突變的結合,或監控抗體與抗原之不同部分的溶劑可及性(solvent accessibility)。匹配抗體抗原決定位的示例性方法在於此之實施例中描述(參見,例如實施例20),且為該領域已知的。示例性之策略包括,但不限於基於陣列的寡肽掃描(array-based oligo-peptide scanning)、限制性蛋白水解(limited proteolysis)、定點誘變(site-directed mutagenesis)、高通量誘變匹配(high-throughput mutagenesis mapping)、氫-氘交換(hydrogen-deuterium exchange)與質譜分析(參見,例如,Gershoni et al. (2007) 21:145-56; and Hager-Braun and Tomer (2005) Expert Rev Proteomics 2:745-56)。
競爭性結合與抗原決定位合併(epitope binning)也可用於確認共享相同或重疊之抗原決定位的抗體。可以使用交叉阻斷分析法評估競爭性結合,例如於“Antibodies, A Laboratory Manual,” Cold Spring Harbor Laboratory, Harlow and Lane (1st
edition 1988, 2nd
edition 2014)中所述的分析。在一些實施例中,當測試抗體或結合蛋白減少參考抗體或結合蛋白對標靶抗原,如TIGIT的結合(例如,包含選自表2與3中鑑定之那些的CDR及/或可變區的結合蛋白)時,確認競爭結合在交叉阻斷試驗中至少降低了約50%(例如,50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、99.5%或更多,或任何百分比在兩者之間),及/或反之亦然。在一些實施例中,競爭性結合可以歸因於共享的或相似的(例如,部分重疊的)抗原決定位,或者歸因於立體阻礙(steric hindrance),其中抗體或結合蛋白結合於附近的抗原決定位上(參見,例如,Tzartos, Methods in Molecular Biology (Morris, ed. (1998) vol. 66, pp. 55-66))。在一些實施例中,競爭性結合可以用於對共有相似抗原決定位的結合蛋白進行分類。例如,於結合競爭的結合蛋白可以“放入(binned)”為一組具有重疊或附近抗原決定位的結合蛋白,而那些不競爭的蛋白則被放置在沒有重疊或附近抗原決定位的結合蛋白的分開之組(即,箱(bin))中。
與參考抗體“結合至相同之抗原決定位的抗體”係指在競爭分析中阻斷了參考體對其抗原之結合達50%或更多的抗體,及/或相反,在競爭分析中,參考抗體將抗體對其抗原之結合阻斷了50%或更多。示例性競爭分析於此進行了描述與示例。
如於此所使用,術語“胺基酸”與“殘基”是指天然存在的與合成的胺基酸,以及以類似於天然存在的胺基酸的方式起作用的胺基酸類似物與胺基酸模擬物。天然存在的胺基酸是由遺傳密碼(genetic code)所編碼的胺基酸,以及後來在體內(in vivo)被修飾的胺基酸,例如羥脯胺酸(hydroxyproline)、γ-羧基穀胺酸(γ-carboxyglutamate)與O-磷酸絲胺酸(O-phosphoserine)。胺基酸類似物是指具有與天然胺基酸相同之基本化學結構的化合物,即與氫、羧基、胺基與R基團結合的α碳,例如硒代半胱胺酸(selenocysteine)、高絲胺酸(homoserine)、正亮胺酸(norleucine)與蛋胺酸亞碸(methionine sulfoxide)。此類的類似物可以具有經修飾的R基團(例如,硒代半胱胺酸,正亮胺酸)或經修飾的肽主鏈(例如,高絲胺酸),但是保留與天然胺基酸相同之基本化學結構。胺基酸模擬物是指具有與胺基酸的一般化學結構不同的結構但以相似於天然胺基酸的方式起作用的化合物。表1中提供了示例性胺基酸的三字母與一字母代碼。
表1、示例性之胺基酸的三字母代碼與一字母代碼
胺基酸 | 三字母 代碼 | 一字母代碼 |
丙胺酸(Alanine) | Ala | A |
精胺酸(Arginine) | Arg | R |
天門冬醯胺酸(Asparagine) | Asn | N |
天門冬胺酸(Aspartic acid) | Asp | D |
半胱胺酸(Cysteine) | Cys | C |
麩胺酸(Glutamic acid) | Glu | E |
麩醯胺酸(Glutamine) | Gln | Q |
甘胺酸(Glycine) | Gly | G |
組胺酸(Histidine) | His | H |
異白胺酸(Isoleucine) | Ile | I |
白胺酸(Leucine) | Leu | L |
離胺酸(Lysine) | Lys | K |
甲硫胺酸(Methionine) | Met | M |
苯丙胺酸(Phenylalanine) | Phe | F |
脯胺酸(Proline) | Pro | P |
絲胺酸(Serine) | Ser | S |
蘇胺酸(Threonine) | Thr | T |
色胺酸(Tryptophan) | Trp | W |
酪胺酸(Tyrosine) | Tyr | Y |
纈胺酸 (Valine) | Val | V |
在特定位置,例如在抗體的Fc區中的“胺基酸修飾”是指特定殘基的取代或缺失,或與特定殘基鄰接的至少一個胺基酸殘基的插入。 與特定殘基“鄰接”的插入是指在其一至兩個殘基內插入。插入可以在特定殘基的N-端或C-端。在一些實施例中,於所述的胺基酸修飾是取代。
對於胺基酸序列,術語“同一性(identity)”或“同源性”是指藉由比較序列來所確定的兩個或更多之多肽的序列之間的關係。 術語“同一性”還指多肽之間的序列相關性的程度,其由兩個或更多之胺基酸殘基的串之間的匹配數目決定。 兩個序列之間的“同一性”百分比是該序列共享的相同位置之數目的函數(即,同一性百分比等於相同位置之數目/位置之總數x 100),並考慮了缺口數,與各缺口的長度,其需要被引入才能實現兩個序列的最佳比對(optimal alignment)。序列的比較與兩個序列之間同一性百分比的確定可以使用數學演算法(mathematical algorithm)來完成。為了進行序列比較,通常將一個序列做為參考序列,將其與測試序列進行比較。使用序列比較演算法時,將測試序列與參考序列輸入一電腦,必要時指定子序列座標(subsequence coordinates),並指定序列演算法程式參數(sequence algorithm program parameters)。 可以使用默認程序參數,也可以指定替代參數。 然後,序列比較演算法根據程式參數計算測試序列相對於參考序列的序列同一性百分比。 另外地或可替代地,本揭露的蛋白質序列可以進一步用作“查詢序列(query sequence)”以對公共數據庫進行搜索以例如鑑定相關序列。 例如,可以使用Altschul et al. ((1990) J Mol Biol. 215(3):403-10)的BLAST程序執行此類搜索。
通常,介於於此揭露之蛋白質及其變體,包括TIGIT的變體和抗體可變域的變體(包括個別的變體CDR)之間的胺基酸同一性或同源性與於此所述之序列為至少80%相同或同源,例如,至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、幾乎100%或100%的同一性或同源性。
以相似的方式,相對於編碼於此所鑑定之抗體與其他蛋白質的核酸序列的“核酸序列同一性”百分比被定義為在與特定抗體或其他蛋白質之編碼序列中之核苷酸殘基相同的候選序列中的核苷酸殘基百分比。
如於此所使用,術語“經分離的(isolated)”是指從其源環境(例如,自然環境,若其自然存在的話)被移出的材料。 例如,自然存在於活生物體(living organism)中的多核苷酸或多肽,為未經分離的,而與於活生物體中之一些或全部共存物質分開之相同多核苷酸或多肽,為經分離的。
如於此所使用,“經分離的抗體”為一抗體,其已經鑑定並與其來源環境的一種或更多之(例如,大部分)組分(以重量計),例如與融合瘤細胞培養物或用於生產的其他細胞培養物(例如重組的表現抗體的生產細胞,例如小鼠骨髓瘤NS0細胞或中國倉鼠卵巢細胞(Chinese hamster ovary cells)(例如CHO-S細胞))的組分分離。在一些實施例中,進行分離使得其充分除去可能以其他方式干擾抗體對所需應用(例如,用於抗TIGIT抗體的治療性)的組分。製備經分離的抗體的方法是該領域已知的,並且包括,但不限於蛋白質A層析(protein A chromatography)、陰離子交換層析(anion exchange chromatography)、陽離子交換層析(cation exchange chromatography)、病毒保留過濾(virus retentive filtration)與超濾(ultrafiltration)。
結合“親和力”是指在單個抗原性位點(antigenic site)介於抗體與抗原之間之相互作用的強度。 在每個抗原性位點內,抗體“臂(arm)”的可變區經由弱的非共價力(non-covalent force)與抗原在許多位點相互作用。通常,相互作用越多,親和力就越強。KD
和親和力成逆相關。 在一些實施例中,本揭露之抗TIGIT抗體或其抗原結合片段保持以約1×10-6
M或更小的KD
結合TIGIT(例如,人類TIGIT)的能力。
如於此所使用,術語“KD
”是指平衡解離常數,其由kd
與ka
的比率(即kd
/ka
)所獲得,並且通常表示為莫耳濃度(M)。 如於此所使用的術語“ka
”是指特定抗體-抗原相互作用的締合速率,而如於此所使用的術語“kd
”是指特定抗體-抗原相互作用的解離速率。 在於此所述之實施例中描述了測量抗體之KD
值的示例性方法(參見,例如,實施例5),其他方法為該領域已知的。
“親和力增強的”抗體是一個或更多之改變於其一個或更多之CDR中的抗體,與不具有這些改變的親本抗體相比,此導致抗體對標靶抗原的親和力得到改善。在一些實施例中,親和力增強的抗體對靶抗原具有奈莫耳(nanomolar)或甚至皮莫耳(picomolar)的親和力。產生親和力增強的抗體的示例性方法在於此所述之實施例中描述(參見,例如實施例13、14與17),並且為該領域已知的,包括藉由VH
與VL
域混編(VH
- and VL
-domain shuffling)、CDR及/或框架殘基的隨機誘變(random mutagenesis)等的親和力增強。
於此之術語“Fc區”用於定義免疫球蛋白重鏈的C端區域,包括天然序列Fc區與變體Fc區。可以例如在抗體的產生或純化過程中,或藉由重組地建造編碼抗體重鏈的核酸來移除Fc區的C端離胺酸。因此,完整抗體的組成物可以包括移除了C端離胺酸殘基的抗體族群、未移除C端離胺酸殘基的抗體族群以及具有帶有與不帶有C端離胺酸殘基的抗體混合物的抗體族群。用於本揭露的抗體的合適的天然序列Fc區包括人類IgG1、IgG2(例如,IgG2a、IgG2b)、IgG3與IgG4。
如於此所使用,“ Fc受體”或“ FcR”描述了與抗體的Fc區結合的受體。 在一些實施例中,FcR是天然序列人類FcR。 在一些實施例中,FcR是結合IgG抗體(γ受體)的FcR,並且包括FCγRI、FCγRII與FCγRIII亞類的受體,包括這些受體的等位基因變體與剪接形式。於此之術語“FcR”涵蓋其他FcR,包括未來要被鑑定的那些。
“效應細胞”是指表現一種或更多之FcR並執行效應子功能的白血球。在一些實施例中,細胞至少表現FCγRIII及/或執行ADCC效應子功能。介導ADCC之人類白血球的例子包括外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)、自然殺傷(natural killer, NK)細胞、單核細胞(monocyte)、細胞毒性T細胞(cytotoxic T cell)與嗜中性白細胞(neutrophil)。
“效應子功能”是指歸因於抗體之Fc區的那些生物活性,其隨抗體同型而變化。抗體效應子功能的例子包括:C1q結合和補體依賴性細胞毒性(C1q binding and complement dependent cytotoxicity, CDC);Fc受體結合(Fc receptor binding);抗體依賴性的細胞媒介之細胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC);吞噬作用;細胞表面受體(cell surface receptor)的向下調控(例如,B細胞受體);與B細胞活化。
“抗體依賴性的細胞媒介之細胞毒性”或“ADCC”是指細胞毒性的一種形式,其中所分泌的免疫球蛋白結合到存在於某些細胞毒性效應細胞(例如NK細胞,單核細胞)上的Fc受體上,使細胞毒性效應細胞能特異性結合到帶有抗原的標靶細胞上,並隨後用細胞毒素(cytotoxin)殺死標靶細胞。為了評估ADCC活性,在一些實施例中,可以進行體外(in vitro
) ADCC分析,例如美國專利號5,500,362或5,821,337或6,737,056中所述的那些。用於此類分析的有用的效應細胞包括PBMC與NK細胞。替代地,或另外地,可以在體內,例如在諸如Clynes et al. ((1998) PNAS (USA) 95:652-6)中揭露的動物模型中評估ADCC活性。 於此的實施例中也描述了用於評估ADCC活性的示例性分析法(參見,例如實施例19)。
如於此所使用,術語“免疫細胞”包括為造血來源並且在免疫反應中起作用的細胞。免疫細胞包括淋巴細胞,例如B細胞與T細胞(例如,細胞毒性T細胞、輔助T細胞);自然殺手細胞;與髓樣細胞,例如單核細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞、嗜鹼性粒細胞與粒細胞。術語“T細胞”包括細胞毒性(CD8+)T細胞和輔助(CD4+)T細胞。術語T細胞還包括T輔助1型T細胞(T helper 1 type T cell)與T輔助2型T細胞(T helper 2 type T cell)。術語“抗原呈現細胞”包括專業的抗原呈遞細胞(professional antigen-presenting cell)(例如,B淋巴細胞(B lymphocyte)、單核細胞(monocyte)、樹突狀細胞(dendritic cell)與蘭格漢氏細胞(Langerhans cell))以及其他抗原呈現細胞(例如角質形成細胞(keratinocyte)、內皮細胞(endothelial cell)、星形膠質細胞(astrocyte)、成纖維細胞(fibroblast)與寡樹突細胞(oligodendrocyte))。
於此所使用,術語“免疫反應”包括受T細胞共刺激的調節影響的T細胞介導的及/或B細胞介導的免疫反應。示例性的免疫反應包括B細胞反應(例如,抗體產生)、T細胞反應(例如,細胞激素產生、細胞之細胞毒性),及細胞激素應答細胞,例如巨噬細胞的活化。如於此所使用,關於免疫反應的術語“向下調控(downmodulation)”包括任何一種或更多之免疫反應的減少,而關於免疫反應的術語“向上調控(upmodulation)”包括任何一種或更多之免疫反應的增加、增強或刺激。將理解的是,一種類型的免疫反應的向上調控可導致另一種類型的免疫反應的相應向下調控。 例如,特定細胞激素之產生的向上調控可導致細胞免疫反應的向下調控。
如於此所使用,術語“共刺激受體(costimulatory receptor)”包括將共刺激信號傳遞至免疫細胞,例如CD28或ICOS的受體。如於此所使用,術語“抑制性受體(inhibitory receptor)”包括將反信號(negative single)傳遞至免疫細胞的受體(例如,CTLA-4或PD-1)。
如於此所使用,相對於活化的免疫細胞,術語“共刺激(costimulate)”包括共刺激分子提供誘導增殖或效應子功能的第二非活化受體介導的信號(“共刺激信號costimulatory signal”)的能力。例如,共刺激信號可以導致例如,在已經接受T細胞受體介導的信號(T cell-receptor-mediated signal)的T細胞中之細胞激素分泌。已經例如通過活化受體(activating receptor)接收到細胞受體介導的信號的免疫細胞於此稱為“經活化的免疫細胞(activated immune cell)”。
即使在免疫細胞上不存在共刺激受體(如,CD28或ICOS),也可發生由抑制受體轉導的抑制信號,因此,這不僅僅是介於抑制受體與共刺激受體之間之共刺激分子之結合的競爭的功能(Fallarino et al. (1998) J. Exp. Med. 188:205)。抑制信號傳遞至免疫細胞可導致免疫細胞無反應、變應性缺失或程序性死亡。在一些實施例中,抑制信號的傳輸操作藉由不涉及細胞凋亡(apoptosis)的機制進行。如於此所使用,術語“細胞凋亡”包括程序性細胞死亡,其可以使用該領域已知的技術表徵。細胞凋亡細胞死亡可以例如經由細胞收縮(cell shrinkage)、膜起泡(membrane blebbing)與染色質聚集(chromatin condensation)最終導致細胞碎裂為特徵。經歷細胞凋亡的細胞也表現出核小體間DNA切割(internucleosomal DNA cleavage)的特徵性模式。
在一些實施例中,於此提供了所描述的抗體及/或抗原結合片段的治療方法與用途,例如用於活化及/或殺死一種或更多之免疫細胞。 在一些實施例中,於此所述的治療方法與用途可用於在一個體中增加、增強或刺激的免疫反應或功能。在一些實施例中,通過於個體中活化效應細胞(例如,T細胞)、擴展(增加)效應細胞群體及/或殺死的靶細胞(例如靶標腫瘤細胞)來增加、增強及/或刺激免疫反應或功能,為以本揭露之抗體或抗原結合片段之處理的結果。
如於此所使用,“免疫細胞活化”以及該根術語(root term)的多個變化(例如,“活化免疫細胞”)是指免疫細胞增殖、活化或增強免疫細胞的一種或更多之標誌物的表現(例如,CD69、CD71)、信號物質(例如,IFN-γ、IL-2)分泌的誘導、溶細胞分子(例如,穿孔素(perforin)、顆粒酶B(granzyme B))的分泌的誘導、增強的細胞毒性、細胞激素的產生、細胞遷移、細胞增殖,或這些特性中之任意兩個或更多的組合。在一些實施例中,免疫細胞活化的特徵在於細胞激素的分泌(例如,IFN-γ、IL-2或兩者的分泌)。在一些實施例中,免疫細胞活化的特徵在於增強的T細胞功能。免疫細胞活化可以在體外測量,例如,藉由評估依據抗原或TCR介導的刺激的T細胞增殖。於此描述了評估免疫細胞活化的示例性方法(參見,例如,實施例7-9),其他方法是該領域已知的。
“增強T細胞功能”是指誘導,引起或刺激T細胞以具有持續的或擴增的生物學功能,或更新或重新激活耗盡或失活的T細胞。增強T細胞功能的例子包括相對於干預前之此種水平,細胞毒性T細胞分泌IFN-γ增加,增殖增加以及抗原應答性(例如,病毒、病原體或腫瘤清除率)增加。 在一些實施例中,增強之水平為至少50%、60%、70%、80%、90%、100%、120%、150%、200%,並且可以使用該技術領域具有通常知識者已知的方法來測量。
“免疫相關疾病”是指當生理途徑在正常生理中對損傷或傷害作出反應,發起損傷或傷害的修復,及/或進行先天與後天防禦,引起直接與反應強度(例如,由於異常調節或過度刺激所致)或對自我的反應相關之額外的侮辱或傷害時發生的任何病理狀態。於此所述的與免疫相關的疾病的特定例子包括,癌症(腫瘤形成(neoplasia))、免疫介導的發炎疾病(immune-mediated inflammatory disease)、非免疫介導的發炎疾病(non-immune-mediated inflammatory diseases)、感染性疾病(infectious diseases)與免疫缺陷性疾病(immunodeficiency diseases)。在一些實施例中,免疫相關疾病可以是特徵在於對抗原刺激的響應性降低之T細胞的疾病,病症或病狀。在一些實施例中,免疫相關疾病可以是其中T細胞無能或具有降低之分泌細胞激素,增殖或執行細胞溶解活性的能力的疾病。在一些實施例中,降低的反應性導致表現免疫原的病原體或腫瘤的無效控制。以T細胞功能障礙為特徵的免疫相關疾病的例子包括,未解決的急性感染、慢性感染與腫瘤免疫。
“腫瘤免疫性”是指腫瘤逃脫免疫識別(tumors evade immune recognition)與清除的過程。因此,作為治療概念,當此類逃脫減弱,並且腫瘤被免疫系統識別並攻擊時,腫瘤免疫性為“經處理(treated)的”。腫瘤識別的例子包括腫瘤結合,腫瘤縮小(tumor shrinkage)與腫瘤清除(tumor clearance)。
“免疫原性(immunogenicity)”或“免疫原性(immunogenic)”是指特定試劑或組合物引發免疫反應,例如T細胞反應的能力。免疫反應可以是抗體介導的或細胞介導的,或兩者皆有。腫瘤具有免疫原性,而增強腫瘤的免疫原性可藉由免疫反應幫助清除腫瘤細胞。在一些實施例中,可以藉由以於此所述的抗TIGIT抗體或抗原結合片段的治療來增強腫瘤的免疫原性。
如於此所使用,術語“檢查點抑制劑(checkpoint inhibitor)”是指抑制一種或更多之減少對於一免疫刺激之免疫反應的分子的任何治療劑,包括任何小分子化合物、抗體、核酸分子或多肽或其任何片段,從而允許更廣泛的免疫活性。
如於此所使用,術語“抑制(inhibit)”或“的抑制(inhibition of)”是指與控制組(例如,一未處理的樣品)相比在統計學上顯著之可測量的量減少,並且可以包括但不要求完全的預防或抑制。
如於此所使用,術語“癌症”與“腫瘤”可以單數或複數形式互換使用,並且意指經歷了使其宿主生物病理化的惡性轉化的細胞。藉由良好建立的技術,例如組織學檢查,可以很容易地區分原發性癌細胞與非癌細胞。如於此所使用,癌細胞的定義不僅包括原發性癌細胞,而且包括源自癌細胞祖先的任何細胞。此包括轉移的癌細胞,以及源自癌細胞的體外培養物與細胞株。癌症可表現為實體瘤,例如通過諸如計算機斷層掃描(computed tomography, CT)掃描、磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)、X射線,超音波或觸診之物理檢查(physical examination)的程序檢查之如基於腫瘤塊可檢測到的腫瘤,及/或其由於可從個體獲得的樣品中一種或更多之癌症特異性抗原的表現而為可偵測的。腫瘤也可以是造血(或血液學(hematologic)或血液(hematological)或與血液相關的)癌症,例如源自血細胞或免疫細胞的癌症,可以稱為“液體腫瘤”。於此描述的癌症的特定實例包括大腸直腸癌與白血病。在一些實施例中,癌症是大腸直腸癌。
如於此所用,術語“感染”是指致病因子侵入生物體的身體組織,它們的繁殖以及宿主組織對感染因子及其產生的毒素的反應。該術語包括急性與慢性感染。示例性的傳染原包括病原體,例如病毒與相關的因子,如類病毒(viroids)與普里昂蛋白(prions);細菌;真菌;及寄生蟲。“感染病”,也稱為傳染病或傳染病,是由感染引起的疾病。 一種示例性的感染或傳染性疾病是人類T細胞白血病病毒1型相關疾病(human T cell leukemia virus type 1-associated disease)。
術語“個體(subject)”與“患者(patient)”於此可互換使用,以指任何動物,例如任何哺乳動物,包括,但不限於人類,非人類靈長類,囓齒類動物等。 在一些實施例中,個體或患者為一哺乳動物。 在一些實施例中,個體或患者是一人類。
如於此所使用,術語“試劑”是指化合物,化合物的混合物,生物大分子(biological macromolecule)或由生物材料製成的萃取物。術語“治療劑”是指能夠調節生物學過程及/或具有生物學活性的試劑。於此所述的抗TIGIT抗體與抗原結合片段是示例性治療劑。
“醫藥組成物”是指製劑,其形式為允許投予並隨後提供活性試劑之預期生物學活性及/或達到治療效果,並且不包含對要向其施用製劑的個體產生不可接受的毒性的其他成分。該醫藥組成物可以是無菌的。
如於此所使用,“藥學上可接受的載體”包括以所採用的劑量和濃度對暴露於其的細胞或哺乳動物無毒的載體、稀釋劑、賦形劑或穩定劑。在一些實施例中,藥學上可接受的載體為水性pH緩衝溶液。藥學上可接受的載體的例子包括緩沖劑,例如磷酸鹽、檸檬酸鹽與其他有機酸;抗氧化劑,包括抗壞血酸;低分子量(例如少於約10個殘基)多肽;蛋白質,例如血清白蛋白,明膠或免疫球蛋白;親水聚合物,例如聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone);胺基酸,例如甘胺酸、麩醯胺酸、天門冬醯胺酸、精胺酸或離胺酸;單醣、雙糖與其他碳水化合物,包括葡萄糖、甘露糖或糊精(dextrin);螯合劑,如EDTA;糖醇,例如甘露醇或山梨糖醇;成鹽的相對離子(salt-forming counterions),例如鈉;及/或非離子表面活性劑,例如聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)。這種載體用於藥物活性物質的用途是該領域眾所周知的。除非任何一般載體與活性試劑不相容,否則可考慮將其用於所揭露之組成物中。
一“有效量”之例如於此揭露的抗體或抗原結合片段是足以執行一明確陳述之目的的量,例如在投予後產生治療作用,如免疫反應的向上或向下調控、一或更多之免疫細胞的活化、一或更多之免疫細胞的殺死、腫瘤生長速率或腫瘤體積的減少、免疫相關疾病(例如癌症、感染或傳染病)症狀的減少或一些其他治療效果指標。術語“治療有效量”是指有效治療於一個體中之疾病或病症的抗體或抗原結合片段的量。在癌症的情況下,治療有效量的抗體或抗原結合片段可以減少癌細胞的數量、減小腫瘤的尺寸、抑制(例如,減慢或停止)腫瘤轉移、抑制(例如,減慢或停止)腫瘤生長及/或緩解一種或更多之症狀。“預防有效量”是指在必要的劑量與時間之期間內有效達到所需之預防結果的量。通常,由於預防劑量是在疾病之前或疾病早期於個體中被使用,因此預防有效量將小於治療有效量。
如於此所使用,術語“治療(treat)”或“治療(treatment)”或“治療的(therapeutic)”(以及語法相關的術語)是指疾病的任何後果的任何改善,例如延長的生存期,較低的發病率及/或減輕之 由其他治療方式導致的副作用。如本領域中容易理解的,涵蓋了疾病的完全根除,但對於治療行為並非必需的。於此所用的術語“治療(treat)”或“治療(treatment)”也可以指將所述抗體或抗原結合片段投予於個體,例如患有或懷疑患有免疫相關疾病的個體,例如癌症,感染或傳染病。治療可以是治癒(cure)、痊癒(heal)、減輕(alleviate)、緩解(relieve)、改變(alter)、補救(remedy)、改善(ameliorate)、減輕(palliate)或改善(improve)其他方式影響疾病,疾病之症狀或個體對疾病的易感性。在一些實施例中,除了治療患有疾病的個體之外,還可以預防性地提供於此揭露之組成物以預防或減少發展該疾病的可能性。
抗TIGIT抗體
在一些實施例中,本揭露關於結合及/或調節TIGIT活性的抗體及其抗原結合片段,以及它們在治療組成物中的用途。在一些實施例中,於此揭露之抗體和抗原結合片段特異性結合TIGIT。 在一些實施例中,於此揭露之抗體與抗原結合片段能夠減少或阻斷TIGIT與CD155的相互作用。 在一些實施例中,於此揭露之抗體和抗原結合片段可以單獨使用或作為藥學組成物或組合療法(combination therapy)的一部分被投予。
在一些實施例中,於此揭露之抗體與抗原結合片段是人源化的。在一些實施例中,於此揭露之抗體與抗原結合片段含有源自非人類(例如,小鼠)抗體的最小序列,並保留非人類抗體的反應性,同時在人中的免疫原性較低。在一些實施例中,相較於參考抗TIGIT抗體或抗原結合片段,於此揭露之抗體與抗原結合片段具有一或更多之經改善的性質,包括,例如結合親和力,交叉反應性,T細胞活化活性,體內抗癌活性或抗體依賴性細胞媒介細胞毒性。具體而言,在一些實施例中,於此揭露之抗體和抗原結合片段可證明以下之一或更多:例如相較於參考抗TIGIT抗體或抗原結合片段,對人類TIGIT的高結合親和力;人類TIGIT、食蟹猴(cyno)TIGIT及/或小鼠TIGIT之間的交叉反應;有效的T細胞活化活性;有效的體內抗癌活性;及/或強有力之對TIGIT表現之調節性T細胞的抗體依賴性細胞介導的細胞毒性。由於這些改善的特性中的一些或全部,所揭露之抗體和抗原結合片段可以用作治療劑,例如用於治療或延緩個體(例如,人類)中與免疫有關的疾病(例如,癌症,感染或傳染性疾病)的進展。
在一些實施例中,於此揭露之抗體和抗原結合片段結合例如在免疫細胞上表現的TIGIT。 抗體或抗原結合片段可以藉由例如流式細胞分析技術分析以≤1 mM、≤100 nM、≤10 nM或其之間的任何量的解離常數(KD
)結合TIGIT。在一些實施例中,通過例如流式細胞術分析技術測量,KD
在0.1 nM至10 nM之間。
在一些實施例中,抗體或抗原結合片段是包含兩條重鏈與兩條輕鏈的四鏈抗體(也稱為免疫球蛋白)。 在一些實施例中,抗體或抗原結合片段是兩鏈半體(一條輕鏈與一條重鏈)或一免疫球蛋白的抗原結合片段。 在一些實施例中,抗體或抗原結合片段是免疫球蛋白的抗原結合片段,其保留結合標靶抗原(例如TIGIT)及/或提供免疫球蛋白之功能的能力。
在一些實施例中,於此揭露之抗體或抗原結合片段可以包含選自表3中列出的那些的成對的重鏈與輕鏈可變區組,或來自成對的重鏈與輕鏈組的六個CDR序列組,例如,表2中列出的一組CDR。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段還包含人重鏈與輕鏈框架(任選地具有一個或更多之反向突變,例如,以改善結合親和力)及/或人重鏈與輕鏈恆定區或其片段。例如,抗體或抗原結合片段可包含人類IgG重鏈恆定區(任選地具有一個或更多之突變,例如以修飾效應子功能)與人類κ或λ輕鏈恆定區。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段包含具有人類Ig κ輕鏈恆定區的人類免疫球蛋白G亞型1(IgG1)重鏈恆定區。
本揭露之示例性抗體的胺基酸序列列於表2-5中列出。
表2、抗TIGIT抗體之Kabat CDR的胺基酸序列
mAb | Ig 鏈 CDR | 序列辨識號 | 胺基酸序列 |
7D4 | HCDR1 | 1 | YTFTNYWIG |
HCDR2 | 2 | DIYPGSSFTNSNEKFKG | |
HCDR3 | 3 | LGRGYWYFDV | |
LCDR1 | 4 | SASSSVSYIH | |
LCDR2 | 5 | TTSNLAS | |
LCDR3 | 6 | HQWSRYPT | |
2C9 | HCDR1 | 7 | YTFTDSYIN |
HCDR2 | 8 | RFYPGSGNTY | |
HCDR3 | 9 | EAWLLFYGMDY | |
LCDR1 | 10 | SANSSVSYMY | |
LCDR2 | 11 | RTSNLAS | |
LCDR3 | 12 | QQYHSYPLT | |
3A9 | HCDR1 | 13 | YTFTSYWMH |
HCDR2 | 14 | NIDPSDSATH | |
HCDR3 | 15 | TGIDYGSSYFDY | |
LCDR1 | 16 | RASQSVSTSSYSYIH | |
LCDR2 | 17 | YASNLES | |
LCDR3 | 18 | QHNWEIPRT | |
hz7D4 | HCDR1 | 1 | YTFTNYWIG |
HCDR2 | 2 | DIYPGSSFTNSNEKFKG | |
HCDR3 | 3 | LGRGYWYFDV | |
LCDR1 | 4 | SASSSVSYIH | |
LCDR2 | 5 | TTSNLAS | |
LCDR3 | 6 | HQWSRYPT | |
1G3 | HCDR1 | 1 | YTFTNYWIG |
HCDR2 | 2 | DIYPGSSFTNSNEKFKG | |
HCDR3 | 19 | DMVGYWYFDV | |
LCDR1 | 4 | SASSSVSYIH | |
LCDR2 | 5 | TTSNLAS | |
LCDR3 | 6 | HQWSRYPT | |
2F1 | HCDR1 | 1 | YTFTNYWIG |
HCDR2 | 2 | DIYPGSSFTNSNEKFKG | |
HCDR3 | 20 | VIVGYWYFDV | |
LCDR1 | 4 | SASSSVSYIH | |
LCDR2 | 5 | TTSNLAS | |
LCDR3 | 6 | HQWSRYPT | |
3H2 | HCDR1 | 1 | YTFTNYWIG |
HCDR2 | 2 | DIYPGSSFTNSNEKFKG | |
HCDR3 | 21 | IRLGYWYFDV | |
LCDR1 | 4 | SASSSVSYIH | |
LCDR2 | 5 | TTSNLAS | |
LCDR3 | 6 | HQWSRYPT | |
1A11 | HCDR1 | 1 | YTFTNYWIG |
HCDR2 | 2 | DIYPGSSFTNSNEKFKG | |
HCDR3 | 3 | LGRGYWYFDV | |
LCDR1 | 4 | SASSSVSYIH | |
LCDR2 | 5 | TTSNLAS | |
LCDR3 | 23 | QLFRSGSA | |
1E3 | HCDR1 | 1 | YTFTNYWIG |
HCDR2 | 2 | DIYPGSSFTNSNEKFKG | |
HCDR3 | 3 | LGRGYWYFDV | |
LCDR1 | 4 | SASSSVSYIH | |
LCDR2 | 5 | TTSNLAS | |
LCDR3 | 24 | STFTVINL |
表3、抗TIGIT抗體之可變區的胺基酸序列
mAb | Ig 鏈 | 序列辨識號 | 胺基酸序列 |
7D4 | 重鏈 | 25 | QVQLKHSGAELVRPGTSVKMSCKASGYTFTNYWIGWAKQRPGHGLEWIGDIYPGSSFTNSNEKFKGKATLTADKSSSTAYMQFSSLTSEDSAIYYCAKLGRGYWYFDVWGTGTSVTVSA |
輕鏈 | 26 | DIVLTQSPAIMSASLGEEITLTCSASSSVSYIHWYQQKSGTSPKLLIYTTSNLASGVPSRFSGSGSGTFYSLTISSVEAEDAADYYCHQWSRYPTFGGGTKLEIK | |
2C9 | 重鏈 | 27 | DIQLKQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTDSYINWVKQRPGQGLEWIARFYPGSGNTYYNEKFKGKATLTAEKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAREAWLLFYGMDYWGQGTTVTVSS |
輕鏈 | 28 | DIVLTQSPAIMSASPGEKVTISCSANSSVSYMYWYQQKPGSSPKPWIYRTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQYHSYPLTFGAGTKLELK | |
3A9 | 重鏈 | 29 | QVQLQQPGAELVRPGSSVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPIQGLEWIGNIDPSDSATHYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMHLSSLTSEDSAVYYCARTGIDYGSSYFDYWGQGTILTVSS |
輕鏈 | 30 | DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASQSVSTSSYSYIHWYQQKPGQPPKLLIKYASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDTATYYCQHNWEIPRTFGGGTKLEIK | |
hz7D4 | 重鏈 | 31 | EVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGYTFTNYWIGWVRQTPGKGLEWVGDIYPGSSFTNSNEKFKGRFTISADKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGRGYWYFDVWGQGTLVTVSS |
輕鏈 | 32 | DIVLTQSPATLSASLGERATLSCSASSSVSYIHWYQQKPGQAPKLLIYTTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEAEDFATYYCHQWSRYPTFGGGTKLEIK | |
1G3 | 重鏈 | 33 | DIQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGYTFTNYWIGWVRQTPGKGLEWVGDIYPGSSFTNSNEKFKGRFTISADKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARDMVGYWYFDVWGQGTLVTVSS |
輕鏈 | 34 | DIVLTQSPATLSASLGERATLSCSASSSVSYIHWYQQKPGQAPKLLIYTTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEAEDFATYYCHQWSRYPTFGGGTKLEIK | |
2F1 | 重鏈 | 35 | DIQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGYTFTNYWIGWVRQTPGKGLEWVGDIYPGSSFTNSNEKFKGRFTISADKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARVIVGYWYFDVWGQGTLVTVSS |
輕鏈 | 36 | DIVLTQSPATLSASLGERATLSCSASSSVSYIHWYQQKPGQAPKLLIYTTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEAEDFATYYCHQWSRYPTFGGGTKLEIK | |
3H2 | 重鏈 | 37 | DIQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGYTFTNYWIGWVRQTPGKGLEWVGDIYPGSSFTNSNEKFKGRFTISADKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARIRLGYWYFDVWGQGTLVTVSS |
輕鏈 | 38 | DIVLTQSPATLSASLGERATLSCSASSSVSYIHWYQQKPGQAPKLLIYTTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEAEDFATYYCHQWSRYPTFGGGTKLEIK | |
1A11 | 重鏈 | 39 | EVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGYTFTNYWIGWVRQTPGKGLEWVGDIYPGSSFTNSNEKFKGRFTISADKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGRGYWYFDVWGQGTLVTVSS |
輕鏈 | 40 | DIVLTQSPATLSASLGERATLSCSASSSVSYIHWYQQKPGQAPKLLIYTTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEAEDFATYYCQLFRSGSAFGGGTKLEIK | |
1E3 | 重鏈 | 41 | EVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGYTFTNYWIGWVRQTPGKGLEWVGDIYPGSSFTNSNEKFKGRFTISADKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGRGYWYFDVWGQGTLVTVSS |
輕鏈 | 42 | DIVLTQSPATLSASLGERATLSCSASSSVSYIHWYQQKPGQAPKLLIYTTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEAEDFATYYCSTFTVINLFGGGTKLEIK |
表4、抗TIGIT抗體之恆定區的胺基酸序列
Ig 鏈 | 類型 | 序列辨識號 | 胺基酸序列 |
重鏈 | hIgG1 | 43 | ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
hIgG1-DLE | 44 | ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPD VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPL PE EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG | |
輕鏈 | κ | 45 | RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC |
表5、選擇之抗TIGIT抗體全長Ig鏈的胺基酸序列
mAb | Ig 鏈 | 序列辨識號 | 胺基酸序列 |
1A11 | 重鏈 (hIgG1) | 46 | EVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGYTFTNYWIGWVRQTPGKGLEWVGDIYPGSSFTNSNEKFKGRFTISADKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGRGYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
重鏈 (hIgG1-DLE) | 47 | EVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGYTFTNYWIGWVRQTPGKGLEWVGDIYPGSSFTNSNEKFKGRFTISADKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGRGYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPD VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPL PE EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG | |
輕鏈 | 48 | DIVLTQSPATLSASLGERATLSCSASSSVSYIHWYQQKPGQAPKLLIYTTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEAEDFATYYCQLFRSGSAFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | |
1E3 | 重鏈 (hIgG1) | 49 | EVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGYTFTNYWIGWVRQTPGKGLEWVGDIYPGSSFTNSNEKFKGRFTISADKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGRGYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
重鏈 (hIgG1-DLE) | 50 | EVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGYTFTNYWIGWVRQTPGKGLEWVGDIYPGSSFTNSNEKFKGRFTISADKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGRGYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPD VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPL PE EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG | |
輕鏈 | 51 | DIVLTQSPATLSASLGERATLSCSASSSVSYIHWYQQKPGQAPKLLIYTTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEAEDFATYYCSTFTVINLFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC |
在一些實施例中,所揭露之抗體或抗原結合片段可包含上表所列的任何組之重鏈與輕鏈可變區,或來自重鏈與輕鏈組的六個CDR序列的組,例如,藉由將六個CDR移植到選定的人類供體抗體框架中。在一些實施例中,於此所揭露之抗體或抗原結合片段可包含與上表所列序列同源的胺基酸序列,只要抗體或抗原結合片段保持結合TIGIT的能力(例如,具有小於1×10-8
M的KD
)及/或保留於此所揭露之抗體和抗原結合片段的一種或更多之功能特性(例如,減少或阻斷TIGIT與CD155的相互作用的能力等)。
在一些實施例中,抗TIGIT抗體或其抗原結合片段包含,三個HCDR,其包含序列辨識號:1(HCDR1)、序列辨識號:2(HCDR2)與序列辨識號:3(HCDR3)的胺基酸序列;及三個LCDR,其包含序列辨識號:4(LCDR1)、序列辨識號:5(LCDR2)與序列辨識號:23(LCDR3)的胺基酸序列。
在一些實施例中,抗TIGIT抗體或抗原結合片段包含人類生殖系列(germline)重鏈與輕鏈框架區,或人類生殖系列重鏈與輕鏈框架區經突變以包含一個或更多之胺基酸取代。在一些實施例中,抗TIGIT抗體或抗原結合片段包含:重鏈可變區,其包含序列辨識號:39的胺基酸序列;及輕鏈可變區,其包含序列辨識號:40的胺基酸序列。在一些實施例中,抗TIGIT抗體或抗原結合片段包含與序列辨識號:39的胺基酸序列至少90%相同的重鏈可變區,及與序列辨識號:40的胺基酸序列至少90%相同的輕鏈可變區。在一些實施例中,抗TIGIT抗體或抗原結合片段包含與序列辨識號:39的胺基酸序列至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的重鏈可變區,及與序列辨識號:40的胺基酸序列至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的輕鏈可變區。在一些實施例中,抗TIGIT抗體或其抗原結合片段包含成對的1A11之重鏈與輕鏈可變區,或來自成對的1A11重鏈與輕鏈的六個CDR序列。
於此所述之示例性抗TIGIT抗體或抗原結合片段包含,三個重鏈互補決定區(HCDR),其包含序列辨識號:1(HCDR1)、序列辨識號:2(HCDR2)與序列辨識號:3的胺基酸序列(HCDR3);及三個輕鏈互補決定區(LCDR),其包含序列辨識號:4(LCDR1)、序列辨識號:5(LCDR2)與序列辨識號:23(LCDR3)的胺基酸序列。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段包含人類生殖系列(germline)重鏈與輕鏈框架區,或人類生殖系列重鏈與輕鏈框架區經突變以包含一個或更多之胺基酸取代。在一些實施例中,抗TIGIT抗體或抗原結合片段包含與序列辨識號:39的胺基酸序列至少90%相同的重鏈可變區,及與序列辨識號:40的胺基酸序列至少90%相同的輕鏈可變區。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段包含含有序列辨識號:39的胺基酸序列的重鏈可變區與含有序列辨識號:40的胺基酸序列的輕鏈可變區。
在一些實施例中,抗體或抗原結合片段包含含有序列辨識號:46的胺基酸序列的重鏈與含有序列辨識號:48的胺基酸序列的輕鏈。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段包含與序列辨識號:46的胺基酸序列至少90%相同的重鏈,及與序列辨識號:48的胺基酸序列至少90%相同的輕鏈。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段包含與序列辨識號:46的胺基酸序列至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的重鏈胺基酸序列,及與序列辨識號:48的胺基酸序列至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的輕鏈胺基酸序列。在一些實施例中,重鏈進一步包含C端離胺酸(lysine, K)。
在一些實施例中,抗體或抗原結合片段包含含有序列辨識號:47的胺基酸序列的重鏈與和含有序列辨識號:48的胺基酸序列的輕鏈。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段包含與序列辨識號:47的胺基酸序列至少90%相同的重鏈,及與序列辨識號:48的胺基酸序列至少90%相同的輕鏈。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段包含與序列辨識號:47至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的重鏈胺基酸序列,及/或與序列辨識號:48至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的輕鏈胺基酸序列。在一些實施例中,重鏈進一步包含C端離胺酸(K)。
於此所述之的示例性抗TIGIT抗體或抗原結合片段包括包含序列辨識號:44的胺基酸序列的重鏈恆定區與包含序列辨識號:45的胺基酸序列的輕鏈恆定區。 在一些實施例中,抗體或抗原結合片段包含含有序列辨識號:47的胺基酸序列的重鏈與含有序列辨識號:48的胺基酸序列的輕鏈。在一些實施例中,重鏈恆定區或重鏈還包含C端離胺酸(K)。在一些實施例中,抗TIGIT抗體或其抗原結合片段是1A11。
在一些實施例中,抗TIGIT抗體或其抗原結合片段包含,三個HCDR,其包含序列辨識號:1(HCDR1),序列辨識號:2(HCDR2)與序列辨識號:3(HCDR3)的胺基酸序列;及三個LCDR,其包含序列辨識號:4(LCDR1),序列辨識號:5(LCDR2)與序列辨識號:24(LCDR3)的胺基酸序列。
在一些實施例中,抗TIGIT抗體或抗原結合片段包含人類生殖系列重鏈與輕鏈框架區,或人類生殖系列重鏈與輕鏈框架區經突變以包含一個或更多之胺基酸取代。在一些實施例中,抗TIGIT抗體或抗原結合片段包含:重鏈可變區,其包含序列辨識號:41的胺基酸序列;及輕鏈可變區,其包含序列辨識號:42的胺基酸序列。在一些實施例中,抗TIGIT抗體或抗原結合片段包含:重鏈可變區,其包含序列辨識號:41的胺基酸序列;及輕鏈可變區,其包含序列辨識號:42的胺基酸序列,或與所揭露之續列至少90%相同之序列。在一些實施例中,抗TIGIT抗體或抗原結合片段包含與序列辨識號:41的胺基酸序列至少90%相同的重鏈可變區,及與序列辨識號:42的胺基酸序列至少90%相同的輕鏈可變區。在一些實施例中,抗TIGIT抗體或抗原結合片段包含與序列辨識號:41至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的重鏈可變區胺基酸序列;及/或與序列辨識號:42至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的輕鏈可變區胺基酸序列。在一些實施例中,抗TIGIT抗體或其抗原結合片段包含成對的1E3之重鏈與輕鏈可變區,或來自成對的1E3重鏈與輕鏈的六個CDR序列。在一些實施例中,抗TIGIT抗體或其抗原結合片段是1E3。
在一些實施例中,抗TIGIT抗體或其抗原結合片段包含,三個HCDR,其包含序列辨識號:1(HCDR1)、序列辨識號:2(HCDR2)與序列辨識號:3(HCDR3)的胺基酸序列 ;及三個LCDR,其包含序列辨識號:4(LCDR1),序列辨識號:5(LCDR2)與序列辨識號:6(LCDR3)的胺基酸序列。
在一些實施例中,抗TIGIT抗體或抗原結合片段包含:重鏈可變區,其包含序列辨識號:25的胺基酸序列;及輕鏈可變區,其包含序列辨識號:26的胺基酸序列。在一些實施例中,抗TIGIT抗體或抗原結合片段包含:重鏈可變區,其包含序列辨識號:25的胺基酸序列;及輕鏈可變區,其包含序列辨識號:26的胺基酸序列,或與所揭露之續列至少90%相同之序列。在一些實施例中,抗TIGIT抗體或抗原結合片段包含與序列辨識號:25的胺基酸序列至少90%相同的重鏈可變區,及與序列辨識號:26的胺基酸序列至少90%相同的輕鏈可變區。在一些實施例中,抗TIGIT抗體或抗原結合片段包含與序列辨識號:25至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的重鏈可變區胺基酸序列;及/或與序列辨識號:26至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的輕鏈可變區胺基酸序列。在一些實施例中,抗TIGIT抗體或其抗原結合片段包含成對的7D4之重鏈與輕鏈可變區,或來自成對的7D4重鏈與輕鏈的六個CDR序列。在一些實施例中,抗TIGIT抗體或其抗原結合片段是7D4。
在一些實施例中,抗TIGIT抗體或其抗原結合片段包含,三個HCDR,其包含序列辨識號:1(HCDR1)、序列辨識號:2(HCDR2)與序列辨識號:3(HCDR3)的胺基酸序列;及三個LCDR,其包含序列辨識號:4(LCDR1)、序列辨識號:5(LCDR2)與序列辨識號:6(LCDR3)的胺基酸序列。
在一些實施例中,抗TIGIT抗體或抗原結合片段包含人類生殖系列重鏈與輕鏈框架區,或人類生殖系列重鏈與輕鏈框架區經突變以包含一個或更多之胺基酸取代。在一些實施例中,抗TIGIT抗體或抗原結合片段包含:重鏈可變區,其包含序列辨識號:31的胺基酸序列;及輕鏈可變區,其包含序列辨識號:32的胺基酸序列。在一些實施例中,抗TIGIT抗體或抗原結合片段包含:重鏈可變區,其包含序列辨識號:31的胺基酸序列;及輕鏈可變區,其包含序列辨識號:32的胺基酸序列,或與所揭露之續列至少90%相同之序列。在一些實施例中,抗TIGIT抗體或抗原結合片段包含與序列辨識號:31的胺基酸序列至少90%相同的重鏈可變區,及與序列辨識號:32的胺基酸序列至少90%相同的輕鏈可變區。在一些實施例中,抗TIGIT抗體或抗原結合片段包含與序列辨識號:31至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的重鏈可變區胺基酸序列;及/或與序列辨識號:32至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的輕鏈可變區胺基酸序列。在一些實施例中,抗TIGIT抗體或其抗原結合片段包含成對的hz7D4之重鏈與輕鏈可變區,或來自成對的hz7D4重鏈與輕鏈的六個CDR序列。在一些實施例中,抗TIGIT抗體或其抗原結合片段是hz7D4。
在一些實施例中,抗TIGIT抗體或其抗原結合片段包含,三個HCDR,其包含序列辨識號:1(HCDR1),序列辨識號:2(HCDR2)與序列辨識號:19(HCDR3)的胺基酸序列 ;及三個LCDR,其包含序列辨識號:4(LCDR1),序列辨識號:5(LCDR2)與序列辨識號:6(LCDR3)的胺基酸序列。
在一些實施例中,抗TIGIT抗體或抗原結合片段包含人類生殖系列重鏈與輕鏈框架區,或人類生殖系列重鏈與輕鏈框架區經突變以包含一個或更多之胺基酸取代。在一些實施例中,抗TIGIT抗體或抗原結合片段包含:重鏈可變區,其包含序列辨識號:33的胺基酸序列;及輕鏈可變區,其包含序列辨識號:34的胺基酸序列。在一些實施例中,抗TIGIT抗體或抗原結合片段包含:重鏈可變區,其包含序列辨識號:33的胺基酸序列;及輕鏈可變區,其包含序列辨識號:34的胺基酸序列,或與所揭露之續列至少90%相同之序列。在一些實施例中,抗TIGIT抗體或抗原結合片段包含與序列辨識號:33的胺基酸序列至少90%相同的重鏈可變區,及與序列辨識號:34的胺基酸序列至少90%相同的輕鏈可變區。在一些實施例中,抗TIGIT抗體或抗原結合片段包含與序列辨識號:33至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的重鏈可變區胺基酸序列;及/或與序列辨識號:34至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的輕鏈可變區胺基酸序列。在一些實施例中,抗TIGIT抗體或其抗原結合片段包含成對的1G3之重鏈與輕鏈可變區,或來自成對的1G3重鏈與輕鏈的六個CDR序列。在一些實施例中,抗TIGIT抗體或其抗原結合片段是1G3。
在一些實施例中,抗TIGIT抗體或其抗原結合片段包含,三個HCDR,其包含序列辨識號:1(HCDR1),序列辨識號:2(HCDR2)與序列辨識號:20(HCDR3)的胺基酸序列;及三個LCDR,其包含序列辨識號:4(LCDR1),序列辨識號:5(LCDR2)與序列辨識號:6(LCDR3)的胺基酸序列。
在一些實施例中,抗TIGIT抗體或抗原結合片段包含人類生殖系列重鏈與輕鏈框架區,或人類生殖系列重鏈與輕鏈框架區經突變以包含一個或更多之胺基酸取代。在一些實施例中,抗TIGIT抗體或抗原結合片段包含:重鏈可變區,其包含序列辨識號:35的胺基酸序列;及輕鏈可變區,其包含序列辨識號:36的胺基酸序列。在一些實施例中,抗TIGIT抗體或抗原結合片段包含:重鏈可變區,其包含序列辨識號:35的胺基酸序列;及輕鏈可變區,其包含序列辨識號:36的胺基酸序列,或與所揭露之續列至少90%相同之序列。在一些實施例中,抗TIGIT抗體或抗原結合片段包含與序列辨識號:35的胺基酸序列至少90%相同的重鏈可變區,及與序列辨識號:36的胺基酸序列至少90%相同的輕鏈可變區。在一些實施例中,抗TIGIT抗體或抗原結合片段包含與序列辨識號:35至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的重鏈可變區胺基酸序列;及/或與序列辨識號:36至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的輕鏈可變區胺基酸序列。在一些實施例中,抗TIGIT抗體或其抗原結合片段包含成對的2F1之重鏈與輕鏈可變區,或來自成對的2F1重鏈與輕鏈的六個CDR序列。在一些實施例中,抗TIGIT抗體或其抗原結合片段是2F1。
在一些實施例中,抗TIGIT抗體或其抗原結合片段包含,三個HCDR,其包含序列辨識號:1(HCDR1)、序列辨識號:2(HCDR2)與序列辨識號:21(HCDR3)的胺基酸序列; 及三個LCDR,其包含序列辨識號:4(LCDR1),序列辨識號:5(LCDR2)與序列辨識號:6(LCDR3)的胺基酸序列。
在一些實施例中,抗TIGIT抗體或抗原結合片段包含人類生殖系列重鏈與輕鏈框架區,或人類生殖系列重鏈與輕鏈框架區經突變以包含一個或更多之胺基酸取代。在一些實施例中,抗TIGIT抗體或抗原結合片段包含:重鏈可變區,其包含序列辨識號:37的胺基酸序列;及輕鏈可變區,其包含序列辨識號:38的胺基酸序列。在一些實施例中,抗TIGIT抗體或抗原結合片段包含:重鏈可變區,其包含序列辨識號:37的胺基酸序列;及輕鏈可變區,其包含序列辨識號:38的胺基酸序列,或與所揭露之續列至少90%相同之序列。在一些實施例中,抗TIGIT抗體或抗原結合片段包含與序列辨識號:37的胺基酸序列至少90%相同的重鏈可變區,及與序列辨識號:38的胺基酸序列至少90%相同的輕鏈可變區。在一些實施例中,抗TIGIT抗體或抗原結合片段包含與序列辨識號:37至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的重鏈可變區胺基酸序列;及/或與序列辨識號:38至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的輕鏈可變區胺基酸序列。在一些實施例中,抗TIGIT抗體或其抗原結合片段包含成對的3H2之重鏈與輕鏈可變區,或來自成對的3H2重鏈與輕鏈的六個CDR序列。在一些實施例中,抗TIGIT抗體或其抗原結合片段是3H2。
在一些實施例中,抗TIGIT抗體或其抗原結合片段包含,三個HCDR,其包含以下序列的胺基酸序列:序列辨識號:7(HCDR1),序列辨識號:8(HCDR2)與序列辨識號:9(HCDR3);及三個LCDR,其包含序列辨識號:10(LCDR1),序列辨識號:11(LCDR2)與序列辨識號:12(LCDR3)的胺基酸序列。
在一些實施例中,抗TIGIT抗體或抗原結合片段包含:重鏈可變區,其包含序列辨識號:27的胺基酸序列;及輕鏈可變區,其包含序列辨識號:28的胺基酸序列。在一些實施例中,抗TIGIT抗體或抗原結合片段包含:重鏈可變區,其包含序列辨識號:27的胺基酸序列;及輕鏈可變區,其包含序列辨識號:28的胺基酸序列,或與所揭露之續列至少90%相同之序列。在一些實施例中,抗TIGIT抗體或抗原結合片段包含與序列辨識號:27的胺基酸序列至少90%相同的重鏈可變區,及與序列辨識號:28的胺基酸序列至少90%相同的輕鏈可變區。在一些實施例中,抗TIGIT抗體或抗原結合片段包含與序列辨識號:27至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的重鏈可變區胺基酸序列;及/或與序列辨識號:28至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的輕鏈可變區胺基酸序列。在一些實施例中,抗TIGIT抗體或其抗原結合片段包含成對的2C9之重鏈與輕鏈可變區,或來自成對的2C9重鏈與輕鏈的六個CDR序列。在一些實施例中,抗TIGIT抗體或其抗原結合片段是2C9。
在一些實施例中,抗TIGIT抗體或其抗原結合片段包含,三個HCDR,其包含序列辨識號:13(HCDR1)、序列辨識號:14(HCDR2)與序列辨識號:15(HCDR3)的胺基酸序列;及三個LCDR,其包含序列辨識號:16(LCDR1)、序列辨識號:17(LCDR2)與序列辨識號:18(LCDR3)的胺基酸序列。
在一些實施例中,抗TIGIT抗體或抗原結合片段包含:重鏈可變區,其包含序列辨識號:29的胺基酸序列;及輕鏈可變區,其包含序列辨識號:30的胺基酸序列。在一些實施例中,抗TIGIT抗體或抗原結合片段包含:重鏈可變區,其包含序列辨識號:29的胺基酸序列;及輕鏈可變區,其包含序列辨識號:30的胺基酸序列,或與所揭露之續列至少90%相同之序列。在一些實施例中,抗TIGIT抗體或抗原結合片段包含與序列辨識號:29的胺基酸序列至少90%相同的重鏈可變區,及與序列辨識號:30的胺基酸序列至少90%相同的輕鏈可變區。在一些實施例中,抗TIGIT抗體或抗原結合片段包含與序列辨識號:29至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的重鏈可變區胺基酸序列;及/或與序列辨識號:30至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的輕鏈可變區胺基酸序列。在一些實施例中,抗TIGIT抗體或其抗原結合片段包含成對的3A9之重鏈與輕鏈可變區,或來自成對的3A9重鏈與輕鏈的六個CDR序列。在一些實施例中,抗TIGIT抗體或其抗原結合片段是3A9。
在一些實施例中,於此所述的抗TIGIT抗體或抗原結合片段(例如,以上討論的任何示例性抗體或抗原結合片段)包含IgG1重鏈恆定區,或經突變以修飾效應子(effector)功能之一人類IgG1重鏈恆定區。在一些實施例中,重鏈恆定區是人類IgG1重鏈恆定區。在一些實施例中,抗TIGIT抗體或抗原結合片段包含重鏈恆定區,其包含序列辨識號:43的胺基酸序列。在一些實施例中,抗TIGIT抗體或抗原結合片段包含重鏈恆定區,其包括經突變以包括在位置239、330與332之胺基酸取代之序列辨識號:43之胺基酸序列。在序列辨識號:43之位置239的S被以D取代;在序列辨識號:43之位置330的A被以L取代;在序列辨識號:43之位置332的I被以E取代。在一些實施例中,抗TIGIT抗體或抗原結合片段包含重鏈恆定區,其包含序列辨識號:44的胺基酸序列。在一些實施例中,重鏈恆定區還包含C端離胺酸(K)。
在一些實施例中,於此所述的抗TIGIT抗體或抗原結合片段(例如,以上討論的任何示例性抗體或抗原結合片段)包含IgG2(例如,IgG2a、IgG2b)、IgG3或IgG4重鏈恆定區,或經突變以修飾效應子功能之IgG2(例如,IgG2a、IgG2b)、IgG3或IgG4重鏈恆定區。在一些實施例中,重鏈恆定區是人類IgG2(例如,IgG2a、IgG2b)、IgG3或IgG4重鏈恆定區。
在一些實施例中,於此所述的抗TIGIT抗體或抗體或抗原結合片段(例如,以上討論的任何示例性抗體或抗原結合片段)包含Ig κ輕鏈恆定區。在一些實施例中,所述Ig κ輕鏈恆定區是人類Ig κ輕鏈恆定區。在一些實施例中,抗TIGIT抗體或抗原結合片段包含輕鏈恆定區,該輕鏈恆定區包含序列辨識號:45的胺基酸序列。
在一些實施例中,於此所述的抗TIGIT抗體或抗體或抗原結合片段(例如,以上討論的任何示例性抗體或抗原結合片段)包含Ig λ (lambda)輕鏈恆定區。 在一些實施例中,Ig λ輕鏈恆定區是人類Ig λ輕鏈恆定區。
在一些實施例中,於此揭露之抗體或抗原結合片段特異性結合人類TIGIT,其中所述抗體或抗原結合片段結合至人類TIGIT之一區域,此區域包括在序列辨識號:22之位置106的Y。在一些實施例中,以下之一或更多序列辨識號:22之位置56的Q;序列辨識號:22之位置74的G;序列辨識號:22之位置110處的Y;及在序列辨識號:22之位置111的H。在一些實施例中,此區域還包括在序列辨識號:22之位置56的Q。在一些實施例中,該區域還包括在序列辨識號:22之位置74的G。在一些實施例中,該區域還包括在序列辨識號:22之位置110的Y。在一些實施例中,該區域還包括在序列辨識號:22之位置111的H。在一些實施例中,此區域包括以下全部:序列辨識號:22之位置56的Q;序列辨識號:22之位置74的G;序列辨識號:22之位置106的Y;序列辨識號:22之位置110的Y;與序列辨識號:22之位置111的H。
在一些實施例中,該區域至少包括:在序列辨識號:22之位置56的Q;與序列辨識號:22之位置106的Y。在一些實施例中,該區域至少包括:在序列辨識號:22之位置56的Q;在序列辨識號:22之位置74的G;序列辨識號:22之位置106的Y;與序列辨識號:22之位置110的Y。在一些實施例中,此區域是非線性的。
在一些實施例中,抗體或抗原結合片段與參考抗體或抗原結合片段競爭結合人類TIGIT,其中參考抗體或抗原結合片段包含三個重鏈互補決定區(HCDR),其包含胺基酸序列序列辨識號:1(HCDR1),序列辨識號:2(HCDR2)和序列辨識號:3(HCDR3)的序列;及三個輕鏈互補決定區(LCDR),其包含序列辨識號:4(LCDR1),序列辨識號:5(LCDR2)和序列辨識號:23(LCDR3)的胺基酸序列。在一些實施例中,該抗體或抗原結合片段與參考抗體或抗原結合片段結合到人類TIGIT的相同區域,其中該參考抗體或抗原結合片段包含,三個重鏈互補決定區(HCDR),其包含序列辨識號:1(HCDR1),序列辨識號:2(HCDR2)與序列辨識號:3(HCDR3)的胺基酸性序列;及三個輕鏈互補決定區(LCDR),其包含序列辨識號:4(LCDR1),序列辨識號:5(LCDR2)與序列辨識號:23(LCDR3)的胺基酸序列。在一些實施例中,參考抗體或抗原結合片段包含人類生殖系列重鏈與輕鏈框架區,或人類生殖系列重鏈與輕鏈框架區經突變以包含一個或更多之胺基酸取代。在一些實施例中,參考抗體或抗原結合片段包含含有序列辨識號:39的胺基酸序列的重鏈可變區和含有序列辨識號:40的胺基酸序列的輕鏈可變區。在一些實施例中,參考抗體或抗原結合片段包含包含序列辨識號:44的胺基酸序列的重鏈恆定區和包含序列辨識號:45的胺基酸序列的輕鏈恆定區。在一些實施例中,參考抗體或抗原結合片段包含含有序列辨識號:47的胺基酸序列的重鏈與含有序列辨識號:48的胺基酸序列的輕鏈。在一些實施例中,重鏈恆定區或重鏈還包含C端離胺酸(K)。在一些實施例中,參考抗體或抗原結合片段是1A11。在一些實施例中,參考抗體或抗原結合片段是於此揭露的另一種示例性抗體或抗原結合片段。
於此揭露之抗體和抗原結合片段可以包括進一步的修飾(例如,一個或更多之胺基酸取代,缺失及/或插入),同時保持與TIGIT結合的能力。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段包含特定的修飾(例如相對於參考序列),並且除了指定的修飾外,任選地包含至多約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9或約10個胺基酸修飾。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段包含重鏈可變區,該重鏈可變區除了任何指定的胺基酸修飾外還包含多達約2個,多達約5個或多達約10個胺基酸的修飾。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段包含重鏈恆定區,該重鏈恆定區除了任何指定的胺基酸修飾之外還包含多達約2個,多達約5個或多達約10個胺基酸的修飾。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段包含輕鏈可變區,該輕鏈可變區除了任何指定的胺基酸修飾之外還包含多達約2個,多達約5個或多達約10個胺基酸的修飾。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段包含輕鏈恆定區,該輕鏈恆定區除了任何指定的胺基酸修飾之外還包含多達約2個,多達約5個或多達約10個胺基酸的修飾。
在一些實施例中,胺基酸取代是單個殘基。插入通常將在約1至約20個胺基酸殘基的數量級,儘管只要保留了生物學功能(例如,與TIGIT結合)即可以容許相當大的插入。缺失通常在約1至約20個胺基酸殘基的範圍內,儘管在某些情況下,只要保留生物學功能(例如,與TIGIT結合),缺失可能要大得多。取代,缺失,插入或其任何組合可用於獲得最終的衍生物或變體。通常,這些改變是在盡可能少的胺基酸上進行的,以最小化分子的改變,特別是抗原結合蛋白的免疫原性與特異性。然而,在某些情況下,只要保留生物學功能(例如,與TIGIT結合),即可以容許較大的變化。保守取代通常根據提供功能相似胺基酸的表進行,例如以下表6所示的示例性表與其他在本領域中為已知者。
表6
原始殘基 | 示例性殘基 |
Ala | Ser |
Arg | Lys |
Asn | Gln, His |
Asp | Glu |
Cys | Ser |
Gln | Asn |
Glu | Asp |
Gly | Pro |
His | Asn, Gln |
Ile | Leu, Val |
Leu | Ile, Val |
Lys | Arg, Gln, Glu |
Met | Leu, Ile |
Phe | Met, Leu, Tyr |
Ser | Thr |
Thr | Ser |
Trp | Tyr |
Tyr | Trp, Phe |
Val | Ile, Leu |
在一些實施例中,可以藉由選擇比表6所示的保守度低的取代度來進行功能或免疫學特性的實質性改變。 例如,可以進行更顯著影響的取代:在改變區域中的多肽主鏈的結構,例如α-螺旋或β-褶板結構;標靶位點上分子的電荷或疏水性;或大部分側鏈。通常可在多肽特性上產生最大變化的取代是其中(a) 親水殘基(例如絲胺酸或蘇胺酸)取代為疏水殘基(或被其取代),例如白胺酸,白亮胺酸、苯丙胺酸、纈胺酸或丙胺酸;(b) 半胱胺酸或脯胺酸取代為(或被其取代)其他殘基;(c) 具有正電側鏈的殘基,例如離胺酸、精胺酸或組胺酸取代為(或被其取代)麩胺酸或天門冬胺酸等電負性殘基;或(d) 具有龐大的側鏈例如苯丙胺酸的殘基取代為(或被其取代)沒有側鏈的甘胺酸。
在抗體或抗原結合片段中使用變體抗體序列的一些實施例中,變體通常表現出相同的定性生物學活性並會引發相同的免疫反應,儘管也可以選擇變體以根據需要修飾抗原結合蛋白的特徵。此外,在一些實施例中,本揭露的抗體可以被化學修飾(例如,一個或更多之化學部分可以連接至抗體)或被修飾以改變其糖基化,例如,以改變抗體或抗原結合片段的一或更多之功能特性。
可以在框架或CDR區域內進行改變(例如取代),例如以維持或改善抗體親和力。此類改變可以在“熱點(hotspots)”中進行,即由在體細胞增強過程中經歷高頻突變的密碼子所編碼的殘基(參見,例如,Chowdhury(2008)Methods Mol.Biol.207:179-96),及/或與抗原接觸的殘基,並測試所得變異體VH或VL的結合親和力。藉由構建與從二級庫(secondary library)中重選來進行親和力增強,例如在Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, N.J., (2001))中,已有描述。在親和力增強的一些實施例中,藉由多種方法(例如,易錯(PCR error-prone PCR)、鏈改組(chain shuffling)或寡核苷酸定向誘變(oligonucleotide-directed mutagenesis))中的任一種將多樣性引入選擇用於增強的可變基因中。然後創建一個二級庫。然後篩選該庫以鑑定具有所需親和力的任何抗體變體。引入多樣性的另一種方法涉及CDR定向方法,其中幾個CDR殘基(例如一次4-6個殘基)是隨機的。可以例如使用丙胺酸掃描誘變(alanine scanning mutagenesis)或建模(modeling)來特異性地鑑定涉及抗原結合的CDR殘基。特別是HCDR3與LCDR3通常是為標的。在於此之實施例中描述了用於親和力增強的示例性方法(參見,例如,實施例13、14與17)。
除了在框架或CDR區域內進行的修飾外,還可對本揭露內容的抗體進行改造,使其包括在Fc區域內的修飾,通常可改變抗體或抗原結合片段的一或更多之功能特性,例如血清半衰期(serum half-life)、補體固定(complement fixation)、Fc受體結合(Fc receptor binding)及/或抗原依賴性細胞毒性(antigen-dependent cellular cytotoxicity)。此類的抗體在於此描述與舉例說明。在一些實施例中,將一或更多之胺基酸修飾引入本揭露的抗體或抗原結合片段的Fc區中,從而產生Fc區變體。Fc區變體可包含在一個或更多之胺基酸位置包含胺基酸修飾(例如,取代)的人類Fc區序列(例如,人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc區)。可以例如使用EU編碼系統來描述Fc區內的胺基酸位置(Kabat et al. “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991))。在一些實施例中,此類的變體包含具有一個或更多之胺基酸取代的Fc區,以修飾效應子功能,例如以改善或增強ADCC,例如在Fc區的239、330及/或332位上的取代(EU殘基的編號)(參見,例如, Lazar et al. (2006) Proc Natl Acad Sci USA 103(11):4005-10)。
於此所述的胺基酸取代可以藉由列出絕對殘基位置,然後列出取代的(即,置換)胺基酸之三個字母或一個字母的代碼來表示。例如,可以將序列辨識號:43(殘基的EU編號)的位置239位絲胺酸的天門冬胺酸取代表示為“Ser239Asp”或“S239D”。 在該例子中,絲胺酸是被取代的胺基酸(或“被取代的”胺基酸),而天門冬胺酸是要取代絲胺酸的胺基酸(或“置換”胺基酸)。
在一些實施例中,於此所述的抗體或抗原結合片段能夠結合人類TIGIT,食蟹猴(cyno)TIGIT及/或小鼠TIGIT。 在一些實施例中,於此所述的抗體或抗原結合片段除人類TIGIT外還能夠與小鼠TIGIT結合。在一些實施例中,於此所述的抗體或抗原結合片段除人類TIGIT外還能夠與食蟹猴TIGIT結合。在一些實施例中,於此所述的抗體或抗原結合片段能夠結合人類TIGIT,但不能結合小鼠或食蟹猴TIGIT。 在一些實施例中,於此所述的抗體或抗原結合片段能夠與人類TIGIT、食蟹猴TIGIT與小鼠TIGIT結合。
在一些實施例中,於此揭露之抗體或抗原結合片段可以單獨使用(例如,作為抗體或抗原結合片段),與一或更多之另外的試劑連接(例如,作為抗體-藥物綴合物),或為較大之大分子(macromolecule)的一部分(例如,雙特異性抗體或多特異性抗體)。例如,在一些實施例中,抗體或抗原結合片段是雙特異性或多特異性抗體中的抗原結合域及/或是其一部分。在一些實施例中,抗原結合域是抗原結合片段。在一些實施例中,抗原結合域及/或抗原結合片段是單鏈可變片段(scFv)或Fab片段。在一些實施例中,單獨或作為較大的大分子的一部分使用的於此揭露之抗體和抗原結合片段可包括進一步的修飾(例如,一個或更多之胺基酸取代,缺失及/或插入),同時保留TIGIT結合功能。
在一些實施例中,本揭露提供了分離的及/或基本上純化的核酸分子(也稱為多核苷酸),其編碼全長多肽或包含於此所述之抗體和抗原結合片段的片段的多肽。在一些實施例中,單個核酸可以同時包含於此所揭露之抗體或抗原結合片段的重鏈可變區與輕鏈可變區的編碼序列,並且還任選地包含一個或更多之恆定區的編碼序列。 或者,這些編碼序列中的一些或全部可以駐留在分開的核酸分子上。當從合適的表現載體表現時,由這些多核苷酸編碼的多肽能夠結合TIGIT(例如,人類TIGIT)。
於此還提供了多核苷酸,其編碼來自本揭露的示例性抗TIGIT抗體或抗原結合片段的重鏈及/或輕鏈的至少一個CDR區,並且通常編碼所有三個CDR區。於此還提供了編碼本揭露的示例性抗TIGIT抗體或抗原結合片段的重鏈及/或輕鏈的全部或基本上所有可變區序列的多核苷酸。由於遺傳密碼的簡併性(degeneracy of the genetic code),多種核酸序列將編碼於此所揭露之的各示例性胺基酸序列。
於此還提供了表現載體、宿主細胞與產生本揭露的抗TIGIT抗體和抗原結合片段的方法。
在一些實施例中,本揭露提供了編碼於此揭露之抗體或抗原結合片段的分離的核酸。在一些實施例中,本揭露提供了分離的載體,其包含編碼於此揭露之抗體或抗原結合片段的分離的核酸。在一些實施例中,本揭露提供了分離的細胞或細胞族群,其包含分離的核酸,或載體,其包含編碼於此揭露之抗體或抗原結合片段的分離的核酸。在一些實施例中,本揭露提供了在適於產生抗體或抗原結合片段的條件下,藉由培養經修飾以包含編碼於此所述的抗體或抗原結合片段的一個或更多之核酸序列的宿主細胞或細胞群體來產生抗體或抗原結合片段的方法。在一些實施例中,該方法進一步包括分離,純化及/或回收產生的抗體或抗原結合片段的步驟。
術語“載體”旨在指能夠運輸及/或控制已與其連接的另一多核苷酸的表現的多核苷酸分子。載體的一種類型是“質體”,其是指環狀的雙鏈DNA環,其中可以連接另外的DNA區段。載體的另一種類型是病毒載體,其中可以將另外的DNA區段連接到病毒基因組中。某些載體能夠在引入它們的宿主細胞中自主複製(例如,具有細菌複製起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體(episomal mammalian vector))。在導入宿主細胞後,可以將其他載體(例如,非附加型哺乳動物載體(non-episomal mammalian vector))整合到宿主細胞的基因組中,從而與宿主基因組一起複製。此外,某些載體可以指導與其可操作連接的基因的表現。此類載體在於此中稱為“表現載體”或“重組表現載體”。通常,在重組DNA技術中有用的表現載體通常是質體的形式。本揭露意在包括質體以及其他形式的表現載體,例如病毒載體(例如複製缺陷型反轉錄病毒(retroviruses)或慢病毒(lentiviruses)、腺病毒(adenoviruses)與腺相關病毒(adeno-associated viruses)),其具有相同的功能。
用於接收編碼抗TIGIT抗體重鏈及/或輕鏈可變區或其抗原結合片段的序列的載體有時也編碼恆定區或其部分。此類的載體允許可變區或其片段表現為具有恆定區的融合蛋白,從而導致全長抗體或其抗原結合片段的產生。在一些實施例中,這樣的恆定區是人類的。在一些實施例中,恆定區是人類IgG1重鏈恆定區。 在一些實施例中,恆定區是人類Ig κ輕鏈恆定區。在其他實施例中,恆定區是小鼠IgG2(例如,IgG2a)重鏈恆定區。在一些實施例中,恆定區是小鼠Ig κ輕鏈恆定區。
術語“宿主細胞”是指被人工改造為包含編碼肽序列的核酸的細胞(或細胞族群),其將轉錄並轉譯,並任選地將肽分泌到細胞生長培養基中。為了重組產生目的,通常藉由一般方法合成或選殖編碼肽的胺基酸序列的核酸,並將其整合到表現載體中。術語“宿主細胞”不僅指特定的個體細胞,而且指此類細胞的後代。因為由於突變或環境影響,某些修飾可能在後代中發生,所以此類後代實際上可能與親本細胞不同,但仍包括在於此所使用之術語的範圍內。
帶有和表現編碼抗TIGIT抗體鏈或抗原結合片段的核酸的宿主細胞可以是原核或真核的。在一些實施例中,哺乳動物宿主細胞用於表現與產生本揭露的抗TIGIT多肽。例如,它們可以是表現內源性免疫球蛋白基因的融合瘤細胞株,也可以是具有外源性表現載體的哺乳動物細胞株。這些包括任何正常的會死的,或正常或異常的永生的動物或人類細胞。例如,已經開發了許多能夠分泌完整免疫球蛋白的合適宿主細胞株,包括CHO細胞株,各種COS細胞株、HeLa細胞、骨髓瘤細胞株、轉化的B細胞與融合瘤。示例性宿主細胞包括,但不限於中國倉鼠卵巢(CHO)細胞(例如CHO-S)、人類胚腎(human embryonic kidney, HEK)細胞(例如293T)、猴腎(COS)細胞(例如COS-1, COS-7)、幼倉鼠腎(baby hamster kidney, BHK)細胞(例如,BHK-21)、非洲綠猴腎(African green monkey kidney)細胞(例如,BSC-1)、HeLa細胞、人類肝癌細胞(例如,Hep G2)、骨髓瘤細胞(例如,NS0、653 SP2/0)與淋巴瘤細胞,或其任何衍生的、永生的或轉形的細胞。在一些實施例中,宿主細胞或細胞族群包含一個或更多之CHO細胞(例如,CHO-S)。在一些實施例中,宿主細胞或細胞群體包含一個或更多之骨髓瘤細胞(例如,NS0)。
在一些實施例中,可以將編碼抗TIGIT抗體或抗原結合片段的重鏈及/或輕鏈的一或更多之核酸分子,或包含這種核酸分子的一或更多之表現載體,引入合適的宿主細胞中 (例如,一個或更多之CHO-S細胞或一個或更多之NS0細胞),使用適合所選宿主細胞的任何方法(例如,轉形、轉染、電穿孔、感染)創建重組宿主細胞, 從而使核酸分子可操作地連接至一個或更多之表現控制元件(例如,在載體中,在藉由細胞中的過程產生的構築體中,或整合到宿主細胞基因組中)。在一些實施例中,可以將所得重組宿主細胞維持在適於表現或產生的條件下(例如,在誘導劑的存在下,在合適的非人類動物中或在補充有合適的鹽、生長因子、抗生素、營養補品等),從而產生編碼的多肽。若需要,可以分離或回收編碼的蛋白質(例如,從動物、宿主細胞或培養基中)。該過程包括在轉基因非人類動物的宿主細胞中表現(參見,例如國際公開號WO 1992/003918)。此外,可以使用已知技術來增強來自生產細胞系的抗體鏈或其抗原結合片段的表現。例如,麩醯胺酸合成酶(glutamine synthetase)與DHFR基因表現系統(DHFR gene expression system)是在特定條件下增強表現的常用方法。可以使用常規技術,例如限制性稀釋選殖體(limited dilution cloning)、凝膠微滴技術(gel micro-drop technology)或該領域已知的任何其他方法,來鑑定高表現的細胞選殖體。
醫藥組成物
在一些實施例中,本揭露提供了醫藥組成物,其包含一或更多之於此揭露之抗體及/或一或更多之抗原結合片段和至少一種藥學上可接受的載體。
合適的載體包括當與治療組合物結合時保留治療組合物的功能並且通常與患者的免疫系統不反應的任何材料。藥學上可接受的載體包括生理上相容的任何和所有溶劑、分散介質、包衣、抗菌和抗真菌劑,等滲劑和吸收延遲劑等。藥學上可接受的載體的實例包括水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)、組胺酸、右旋糖,甘油、乙醇、甲磺酸鹽等中的一或更多之,及其的組合。在一些實施例中,組成物中包括等滲劑,例如糖、多元醇如甘露醇、山梨糖醇或氯化鈉。藥學上可接受的載體可進一步包含少量輔助物質,例如潤濕劑或乳化劑、防腐劑或緩沖劑,其可延長抗體或抗原結合片段的保質期或有效性。
在一些實施例中,於此所述之醫藥組成物包含抗體或抗原結合片段的多個複本。在一些實施例中,於此所述之醫藥組成物包含至少一種其他試劑。在一些實施例中,醫藥組成物可以包含一或更多之另外的治療劑,例如,一或更多之能夠治療或延遲免疫相關疾病(例如,癌症或感染或傳染性疾病)的進展的藥劑。這種治療劑的非限制性實例包括檢查點抑制劑,例如靶向PD-1、PD-L1、CTLA-4、OX40、CD40、LAG3、TIM3、GITR及/或KIR的檢查點抑制劑。在一些實施例中,檢查點抑制劑是對其標靶具有抑制或激動活性的抗體。在一些實施例中,檢查點抑制劑被抑制性抗體或其他類似的抑制性分子所靶向。在其他實施例中,檢查點抑制劑被激動劑抗體或其他類似的激動劑分子所靶向。在一些實施例中,檢查點抑制劑靶向PD-1及/或PD-L1。
治療用途與組成物
於此揭露之抗體、抗原結合片段及/或醫藥組成物可用於各種治療應用中。於此揭露使用公開的抗體、抗原結合片段及/或醫藥組成物治療個體的免疫相關疾病(例如,癌症或感染或感染性疾病)的方法。抗體及/或抗原結合片段可以單獨施用或與一或更多之其他治療劑組合投予,並且可以任何藥學上可接受的製劑,劑量和給藥方案投予。 可以評估於此所述的抗體或抗原結合片段治療的毒性以及功效指標,並據此進行調整。
在一些實施例中,於此提供了所描述的抗體及/或抗原結合片段的治療方法和用途,例如用於活化及/或殺死一或更多之免疫細胞。在一些實施例中,於此所述的治療方法和用途可用於增加,增強或刺激個體的免疫反應或功能。在一些實施例中,例如,藉由活化效應細胞(例如,T細胞),擴大效應細胞族群及/或殺死個體中的標靶細胞(例如,標靶腫瘤細胞)來增加,增強及/或刺激至少一種免疫反應或功能為以本揭露的抗體或抗原結合片段治療的結果。
在一些實施例中,以本揭露之抗體、抗原結合片段及/或組成物治療的個體中的一或更多之免疫細胞(例如,T或NK細胞,例如細胞毒性T細胞)具有一或更多之增加或增強的作用。與治療前的這些特性相比,這些特性包括啟動、活化、增殖、細胞激素釋放及/或細胞溶解活性。在一些實施例中,與治療前的數目相比,以本揭露之抗體、抗原結合片段及/或組成物治療的個體中的免疫細胞(例如,T或NK細胞,例如細胞毒性T細胞)的數目增加了。在一些實施例中,與治療前的數目相比,與本揭露相比,以抗體、抗原結合片段及/或組成物治療的個中的經活化的免疫細胞(例如,活化的T或NK細胞,例如活化的細胞毒性T細胞)的數目增加了。在一些實施例中,與治療前的活性相比,活化的免疫細胞的特徵在於產生IFN-γ的CD4 +及/或CD8+T細胞及/或細胞溶解活性增強。在一些實施例中,與治療之前的釋放相比,活化的免疫細胞可表現出增加的細胞激素(例如,IFN-γ,TNF-α和白介素(例如,IL-2))的釋放。
在一些實施例中,本揭露提供了一種在需要其的個體中活化及/或殺死一個或更多之免疫細胞的方法,其包括向該個體投予有效量的於此所述的抗體或抗原結合片段,或於此所述的藥物組成物。在一些實施例中,活化一或更多之免疫細胞包括活化一或更多之天然殺手細胞、一或更多之細胞毒性T細胞、一或更多之輔助T細胞及/或一或更多之單核細胞。在一些實施例中,一或更多之免疫細胞包含一或更多之天然殺手細胞及/或一或更多之細胞毒性T細胞。在一些實施例中,殺死一或更多之免疫細胞包括殺死一或更多之調節性T細胞。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段或醫藥組成物與至少一種其他治療劑組合投予。在一些實施例中,至少一種其他治療劑包括檢查點抑制劑。在一些實施例中,檢查點抑制劑是PD-1抑制劑。在一些實施例中,檢查點抑制劑是抗PD-1拮抗劑抗體。在一些實施例中,檢查點抑制劑是派姆單抗(pembrolizumab)。
在一些實施例中,本揭露提供了於此所述的抗體或抗原結合片段或於此所述的醫藥組成物,用於在需要其的個體中活化及/或殺死一個或更多之免疫細胞。在一些實施例中,活化一或更多之免疫細胞包括活化一或更多之天然殺手細胞、一或更多之細胞毒性T細胞,一或更多之輔助T細胞及/或一或更多之單核細胞。在一些實施例中,一或更多之免疫細胞包含一或更多之天然殺手細胞及/或一或更多之細胞毒性T細胞。在一些實施例中,殺死一或更多之免疫細胞包括殺死一或更多之調節性T細胞。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段或醫藥組成物與至少一種其他治療劑組合投予。在一些實施例中,至少一種其他治療劑包括檢查點抑制劑。在一些實施例中,檢查點抑制劑是PD-1抑制劑。在一些實施例中,檢查點抑制劑是抗PD-1拮抗劑抗體。在一些實施例中,檢查點抑制劑是派姆單抗。
在一些實施例中,本揭露提供了於此所述的抗體或抗原結合片段或於此所述的醫藥組成物在活化及/或殺死需要其的個體中的一個或更多之免疫細胞中的用途。在一些實施例中,活化一或更多之免疫細胞包括活化一或更多之天然殺手細胞、一或更多之細胞毒性T細胞、一或更多之輔助T細胞及/或一或更多之單核細胞。在一些實施例中,一或更多之免疫細胞包含一或更多之天然殺手細胞及/或一或更多之細胞毒性T細胞。在一些實施例中,殺死一或更多之免疫細胞包括殺死一或更多之調節性T細胞。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段或醫藥組成物與至少一種其他治療劑組合投予。在一些實施例中,至少一種其他治療劑包括檢查點抑制劑。在一些實施例中,檢查點抑制劑是PD-1抑制劑。在一些實施例中,檢查點抑制劑是抗PD-1拮抗劑抗體。在一些實施例中,檢查點抑制劑是派姆單抗。
在一些實施例中,本揭露提供於此文所述的抗體或抗原結合片段在製造用於活化及/或殺死需要其的個體中的一個或更多之免疫細胞的藥物中的用途。在一些實施例中,活化一或更多之免疫細胞包括活化一或更多之天然殺手細胞,一或更多之細胞毒性T細胞,一或更多之輔助T細胞及/或一或更多之單核細胞。在一些實施例中,一或更多之免疫細胞包含一或更多之天然殺手細胞及/或一或更多之細胞毒性T細胞。在一些實施例中,殺死一或更多之免疫細胞包括殺死一或更多之調節性T細胞。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段將與至少一種其他治療劑組合投予。在一些實施例中,至少一種其他治療劑包括檢查點抑制劑。在一些實施例中,檢查點抑制劑是PD-1抑制劑。在一些實施例中,檢查點抑制劑是抗PD-1拮抗劑抗體。在一些實施例中,檢查點抑制劑是派姆單抗。
在一些實施例中,於此提供了所描述的抗體及/或抗原結合片段的治療方法和用途,例如用於治療癌症。可以治療多種癌症及/或可以延遲其發展。在一些實施例中,所述癌症是結腸直腸癌。癌症(例如,大腸直腸癌)可以處於早期、中間或晚期。
在一些實施例中,本揭露提供了一種在有此需要的個體中治療癌症的方法,該方法包括對個體投予治療有效量的於此所述的抗體或抗原結合片段或於此所述的醫藥組成物。在一些實施例中,癌症表現CD155。在一些實施例中,癌症是實體瘤。在一些實施例中,所述癌症是大腸直腸癌。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段或醫藥組成物與至少一種其他治療劑組合投予。在一些實施例中,至少一種其他治療劑包括檢查點抑制劑。在一些實施例中,檢查點抑制劑是PD-1抑制劑。在一些實施例中,檢查點抑制劑是抗PD-1拮抗劑抗體。在一些實施例中,檢查點抑制劑是派姆單抗。
在一些實施例中,本揭露提供了於此所述的抗體或抗原結合片段,或於此所述的醫藥組成物,用於在需要其的個體中治療癌症。在一些實施例中,癌症表現CD155。在一些實施例中,癌症是實體瘤。在一些實施例中,所述癌症是大腸直腸癌。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段或醫藥組成物與至少一種其他治療劑組合投予。在一些實施例中,至少一種其他治療劑包括檢查點抑制劑。在一些實施例中,檢查點抑制劑是PD-1抑制劑。在一些實施例中,檢查點抑制劑是抗PD-1拮抗劑抗體。在一些實施例中,檢查點抑制劑是派姆單抗。
在一些實施例中,本揭露提供了於此所述的抗體或抗原結合片段或於此所述的醫藥組成物在治療有此需要的個體中的癌症的用途。在一些實施例中,癌症表現CD155。在一些實施例中,癌症是實體瘤。在一些實施例中,所述癌症是大腸直腸癌。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段或醫藥組成物與至少一種其他治療劑組合投予。在一些實施例中,至少一種其他治療劑包括檢查點抑制劑。在一些實施例中,檢查點抑制劑是PD-1抑制劑。在一些實施例中,檢查點抑制劑是抗PD-1拮抗劑抗體。在一些實施例中,檢查點抑制劑是派姆單抗。
在一些實施例中,本揭露提供於此所述的抗體或抗原結合片段在製備用於治療有此需要的個體中的癌症的藥物中的用途。 在一些實施例中,癌症表現CD155。在一些實施例中,癌症是實體瘤。在一些實施例中,所述癌症是結腸直腸癌。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段將與至少一種其他治療劑組合施用。 在一些實施例中,至少一種其他治療劑包括檢查點抑制劑。 在一些實施例中,檢查點抑制劑是PD-1抑制劑。在一些實施例中,檢查點抑制劑是抗PD-1拮抗劑抗體。在一些實施例中,檢查點抑制劑是派姆單抗。
在一些實施例中,於此提供了所描述的抗體及/或抗原結合片段的治療方法和用途,例如用於治療感染或傳染病。 在一些實施例中,感染或傳染性疾病是急性或慢性感染(例如,急性或慢性病毒感染)。在一些實施例中,感染或感染性疾病是逆轉錄病毒感染,例如影響T細胞的反轉錄病毒感染,例如人類T細胞白血病病毒1型相關疾病(human T cell leukemia virus type 1-associated disease)。在一些實施例中,感染或感染性疾病是人類T細胞白血病病毒1型相關疾病。
在一些實施例中,本揭露提供了一種在有此需要的個體中治療感染或傳染性疾病的方法,其包括對個體投予治療有效量的於此所述的抗體或抗原結合片段或於此所述的醫藥組成物。 在一些實施例中,感染或感染性疾病是人類T細胞白血病病毒1型相關疾病。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段或醫藥組成物與至少一種其他治療劑組合投予。在一些實施例中,至少一種其他治療劑包括檢查點抑制劑。在一些實施例中,檢查點抑制劑是PD-1抑制劑。 在一些實施例中,檢查點抑制劑是抗PD-1拮抗劑抗體。在一些實施例中,檢查點抑制劑是派姆單抗。
在一些實施例中,本揭露提供了於此所述的抗體或抗原結合片段,或於此所述的醫藥組成物,用於在有需要的個體中治療感染或傳染性疾病。在一些實施例中,感染或感染性疾病是人T細胞白血病病毒1型相關疾病。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段或醫藥組成物與至少一種其他治療劑組合施用。 在一些實施例中,至少一種其他治療劑包括檢查點抑制劑。在一些實施例中,檢查點抑制劑是PD-1抑制劑。在一些實施例中,檢查點抑制劑是抗PD-1拮抗劑抗體。 在一些實施例中,檢查點抑制劑是派姆單抗。
在一些實施例中,本揭露提供了於此所述的抗體或抗原結合片段或於此所述的醫藥組成物在治療有此需要的個體中的感染或傳染性疾病中的用途。在一些實施例中,感染或感染性疾病是人類T細胞白血病病毒1型相關疾病。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段或醫藥組成物與至少一種其他治療劑組合施用。 在一些實施例中,至少一種其他治療劑包括檢查點抑制劑。 在一些實施例中,檢查點抑制劑是PD-1抑制劑。在一些實施例中,檢查點抑制劑是抗PD-1拮抗劑抗體。在一些實施例中,檢查點抑制劑是派姆單抗。
在一些實施例中,本揭露內容提供了於此所述的抗體或抗原結合片段在製備用於治療需要其的個體的感染或傳染性疾病的藥物中的用途。在一些實施例中,感染或感染性疾病是人T細胞白血病病毒1型相關疾病。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段將與至少一種其他治療劑組合施用。在一些實施例中,至少一種其他治療劑包括檢查點抑制劑。在一些實施例中,檢查點抑制劑是PD-1抑制劑。 在一些實施例中,檢查點抑制劑是抗PD-1拮抗劑抗體。在一些實施例中,檢查點抑制劑是派姆單抗。
可以通過任何合適的方式投予本揭露的抗TIGIT抗體,抗原結合片段及/或組合物(及/或任何其他治療劑),包括腸胃外,肺內和鼻內,且若需要的話,局部治療(local treatment)病灶內投予(intralesional administration)。示例性的腸胃外給藥途徑包括肌內,靜脈內,動脈內,腹膜內和皮下。給藥可以通過任何合適的途徑進行,例如通過注射,例如靜脈內或皮下注射,部分取決於給藥是急性還是慢性。於此考慮了各種給藥方案,包括但不限於在各個時間點上的單次或多次給藥,推注給藥和脈衝輸注。在一些實施例中,本揭露的抗TIGIT抗體,抗原結合片段及/或組合物在被診斷出患有疾病之後並且在疾病被治癒或消除之前被施用。在一些實施例中,個體處於疾病的早期階段。在一些實施例中,所述個體處於疾病的中期。在一些實施例中,個體處於疾病的晚期。在一些實施例中,當鑑定出個體處於危險中但在個體發展出疾病症狀之前,投予本揭露的抗TIGIT抗體,抗原結合片段及/或組合物。.
本揭露的抗TIGIT抗體,抗原結合片段及/或組合物可以單獨施用或與至少一種其他治療劑(例如檢查點抑制劑,抗癌劑等)組合施用。 當與另外的治療劑組合施用時,可以根據其標準劑量及/或給藥方案來施用另外的治療劑。 或者,與其標準劑量及/或給藥方案相比,可以以更高或更低的量及/或頻率投予另外的治療劑。 在一些實施例中,相較於其標準劑量及/或給藥方案,另外的治療劑以較低的量及/或頻率投予。
另外的治療劑(例如,可以與於此所述的抗TIGIT抗體或抗原結合片段組合施用的治療劑)可以包含適合於所治療的特定適應症的任何活性劑(例如,癌症或感染或傳染性疾病) ),例如具有互補活動且彼此之間沒有不利影響的活動。 在一些實施例中,另外的治療劑是檢查點抑制劑,免疫調節劑,細胞毒性劑或細胞抑制劑。 在一些實施例中,另外的治療劑是檢查點抑制劑。
如於此所述,檢查點抑制劑的治療策略通常基於以下假設:治療促進及/或增強針對弱或差抗原性腫瘤(例如,CTLA-4)的T細胞應答的引發,或治療可恢復及/或恢復對抗原有反應,但由於抗原呈現的長期性質(例如PD-1,PD-L1)而變得“精疲力竭”之T細胞活力(Chen and Mellman (2013) Immunity 39(1):1-10)。合適的檢查點抑制療法和試劑例如抗PD-1,抗PD-L1和抗CTLA-4抗體的例子是本領域已知的。參見例如,WO 2001/014424、WO 2013/173223、WO 2016/007235。
在一些實施例中,檢查點抑制劑(例如,可以與於此所述的抗TIGIT抗體或抗原結合片段組合施用的檢查點抑制劑)是細胞毒性T淋巴細胞相關抗原(CTLA-4)途徑的抑制劑。CTLA-4,也稱為CD152,是一種向下調控之免疫反應的蛋白質受體。 CTLA-4在調節性T細胞中組成性表現,但在激活後僅在常規T細胞中向上調控。如於此所用,術語“ CTLA-4抑制劑”是指CTLA-4及/或CTLA-4途徑的任何抑制劑。示例性的CTLA-4抑制劑包括但不限於抗CTLA-4抗體。示例性的抗CTLA-4抗體包括但不限於依匹莫單抗(ipilimumab)(MDX-010)和曲美木單抗(tremelimumab)(CP-675,206),兩者都是完全人類的。依匹莫單抗是一種IgG1,血漿半衰期約為12-14天。曲美木單抗是一種IgG2,血漿半衰期約為22天。參見,例如,Phan et al. (2003) Proc Natl Acad Sci USA. 100:8372-7; Ribas et al. (2005) J Clin Oncol. 23:8968-77; Weber et al. (2008) J Clin Oncol. 26:5950-6。在一些實施例中,檢查點抑制劑是依匹莫單抗。在一些實施例中,檢查點抑制劑是曲美木單抗。
在一些實施例中,檢查點抑制劑(例如,可以與於此所述的抗TIGIT抗體或抗原結合片段組合施用的檢查點抑制劑)是程序性死亡1(PD-1)途徑的抑制劑。程序性細胞死亡1(PD-1)途徑代表一種免疫控制開關,腫瘤細胞可能參與該開關,以克服主動性T細胞免疫監視。PD-1的配體(PD-L1和PD-L2)在各種腫瘤中組成性表現或誘導。如於此所用,術語“ PD 1抑制劑”是指PD-1及/或PD-L1途徑的任何抑制劑。示例性的PD-1抑制劑包括但不限於抗PD-1和抗PD-L1抗體。在一些實施例中,檢查點抑制劑是抗PD-1抗體。示例性的抗PD-1抗體包括但不限於尼武單抗和派姆單抗(MK-3475)。例如,Nivolumab是一種完全人免疫球蛋白G4(IgG4)PD-1免疫檢查點抑制劑抗體,可破壞PD-1受體與其配體PD-L1和PD-L2的相互作用,從而抑制細胞免疫反應(Guo et al. (2017) J Cancer 8(3):410-6)。在一些實施例中,檢查點抑制劑是尼武單抗。例如,Pembrolizumab是一種有效且高度選擇性的IgG4/κ (kappa)同種型人源化單克隆抗體,旨在直接阻斷PD-1及其配體PD-L1和PD-L2之間的相互作用。派姆單抗可增強健康人類捐獻者、癌症患者與靈長類動物培養血細胞中的T淋巴細胞免疫反應。Pembrolizumab也據報導可調節白介素2(IL-2)、腫瘤壞死因子α(TNFα)、干擾素γ(IFN-γ)與其他細胞激素的水平。在一些實施例中,檢查點抑制劑是派姆單抗。示例性的抗PD-L1抗體包括但不限於阿妥珠單抗(atezolizumab)、阿伐單抗(avelumab)與杜魯伐單抗(durvalumab)。例如,阿妥珠單抗是一種IgG1人源化單克隆抗體,據報導可通過將表現的PD-L1靶向多種惡性細胞來阻斷PD-1/PD-L1相互作用。PD-1/PD-L1途徑的這種阻斷可能會刺激針對腫瘤的免疫防禦機制(Abdin et al. (2018) Cancers (Basel) 10(2):32)。在一些實施例中,檢查點抑制劑是阿妥珠單抗、阿伐單抗或杜魯伐單抗。
在一些實施例中,檢查點抑制劑(例如可以與於此所述的抗TIGIT抗體或抗原結合片段組合施用的檢查點抑制劑)靶向PD-1/PD-L1、CTLA-4、OX40、CD40、LAG3、TIM3、GITR及/或KIR。 在一些實施例中,檢查點抑制劑靶向CTLA-4,OX40、CD40及/或GITR。在一些實施例中,檢查點抑制劑被抑制性抗體或其他類似的抑制性分子(例如,抑制性抗CTLA-4或抗PD-1/PD-L1抗體)靶向。在一些其他實施例中,將檢查點抑制劑與激動劑一起靶向所述靶;或將所述激動劑與靶點結合。此類的例子包括刺激目標OX40、CD40及/或GITR。在一些實施例中,靶向OX40,CD40及/或GITR的檢查點抑制劑是激動劑抗體。針對OX40的激動劑抗體可具有雙重作用,抑制調節性T細胞抑制,同時增強效應T細胞功能。也已經顯示出激動劑抗GITR抗體使效應T細胞對調節性T細胞誘導的抑制作用更具抗性(Karaki et al. (2016) Vaccines (Basel) 4(4):37)。同樣,激動劑CD40抗體表現出T細胞依賴性抗腫瘤活性。樹突狀細胞上CD40的激活增加了腫瘤抗原的交叉呈遞,從而增加了激活的腫瘤導向效應T細胞的數量(Ellmark et al. (2015) Oncoimmunol. 4(7):e1011484)。
如於此所用,術語“組合”或“組合療法”是指將至少一種抗TIGIT抗體,抗原結合片段或組合物與另外的藥劑或療法(例如,檢查點抑制劑)一起投予, 作為一種治療方案的一部分,該方案旨在藉由一或更多之被投予藥物的共同作用提供有益的作用。在一些實施例中,所述組合還可包含一或更多之另外的試劑,包括但不限於化學治療劑和減少免疫抑制的試劑(例如第二檢查點抑制劑)。組合的有益作用包括但不限於由治療劑組合產生的藥代動力學或藥效學協同作用。這些治療劑的組合給藥通常在限定的時間段內進行(例如,數分鐘、數小時、數天或數週,取決於所選擇的組合)。
如於此所用,以“組合”投予或“共同投予”是指在個體患有疾病,病症或病狀(例如癌症,感染或傳染病)期間向個體提供兩種或更多種不同的治療。這包括兩種或多種治療的同時投予,以及以任何順序連續投予。例如,在一些實施例中,在已經診斷出個體患有疾病之後並且在疾病已經治癒或消除之前,或當個體被確定為有風險但在個體出現疾病症狀之前,進行兩種或更多種治療。在一些實施例中,當開始第二種治療的遞送時,一種治療的遞送仍在發生,從而存在重疊。在一些實施例中,第一和第二治療同時開始。這些類型的遞送有時在於此中被稱為“同時(simultaneous)” 、“同時(concurrent)”或“伴隨(concomitant)”遞送。在其他實施例中,一種治療的遞送在第二種治療的遞送開始之前結束。在於此中有時將這種類型的傳遞稱為“連續(successive)” 遞送或“順序(sequential)”遞送。
在一些實施例中,兩種治療(例如,於此揭露的抗TIGIT抗體,抗原結合片段或組成物與檢查點抑制劑)包含在同一組合物中。此類組成物可以以任何合適的形式與藉由任何適合的途徑投予。在其他實施例中,兩種治療(例如,於此揭露之抗TIGIT抗體、抗原結合片段或組成物與檢查點抑制劑)以單獨之組成物以任何合適的形式與藉由任何適合的途徑投予。例如,在一些實施例中,包含抗TIGIT抗體或抗原結合片段的組成物與包含檢查點抑制劑的組成物可以在不同的時間點以任何順序同時或順序地施用;較佳為,在任何時間點。無論哪種情況,充足即時投予,以提供所需的治療或預防效果。
在同時或順序遞送的實施例中,由於組合投予,治療可能更有效。在一些實施例中,第一治療更有效,例如,相較於第一治療在不存在第二治療的情況下投予,較少之第一治療(例如,較低劑量)看到相同之效果。在一些實施例中,第一治療更有效,從而使症狀或與疾病相關的其他參數的減少大於在不存在第二治療的情況下遞送第一治療所觀察到的減少。在其他實施例中,第二治療觀察到類似情況。
通常,在本揭露的醫藥組成物中採用治療有效量的抗TIGIT抗體或抗原結合片段。可以通過該領域已知的一般方法將抗體或抗原結合片段配製成藥學上可接受的劑型。
單獨或與至少一種另外的治療劑組合的抗TIGIT抗體或抗原結合片段的示例性劑量方案包括,例如,一次單次推注(single bolus)一種或兩種藥劑,或在預定時間段內分幾次劑量。 對於任何特定的個體,可以根據個人需要與治療醫師的專業判斷隨時間調整特定的劑量方案。腸胃外組成物可以配製成劑量單位形式,以便於投予與劑量均勻。如於此所使用,劑量單位形式是指適合作為待治療個體的單位劑量的物理上離散的單位;每個單元包含預定量的活性劑,該活性劑經計算可產生所需的治療效果,並與所需的藥學上可接受的載體結合。
可以基於活性劑的獨特特性與要實現的特定治療效果來選擇包含抗TIGIT抗體或抗原結合片段及/或任何其他治療劑的組合物的劑量值。醫師或獸醫可以在醫藥組成物中使用的抗體或抗原結合片段的起始劑量低於達到所需治療效果所需的劑量,並逐漸增加劑量直至獲得所需效果。通常,用於治療免疫相關疾病(例如,癌症或感染或傳染性疾病)的本揭露組成物的有效劑量可以根據許多不同因素而變化,包括所治療的特定病症、被治療的個體、個體的生理狀態、疾病的原因、藥劑的遞送部位、個體是人類還是動物、治療是預防性還是治療性,以及醫學從業人員已知的其他因素。選擇的劑量水平還可以取決於多種藥代動力學因素,包括所用本揭露內容的特定組成物的活性、投藥途徑、給藥時間,所用特定化合物的排泄速率、治療之持續時間,與所使用的特定組合物結合使用的其他藥物、化合物及/或材料、年齡、性別、體重、狀況、一般健康狀況與所治療對象的既往病史,以及類似因素。
於此所述的治療有效量之抗體與抗原結合片段通常將提供治療益處而不會引起實質性毒性。抗體或抗原結合片段的毒性與治療功效可通過標準藥學方法,例如在細胞培養或動物模型中確定。細胞培養分析法與動物研究可用於確定LD50(對50%族群致命的劑量)和ED50(對50%族群有效的治療劑量)。毒性與治療效果之間的劑量比是治療指數,可以表示為LD50/ED50之比。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段顯現出高的治療指數。從細胞培養分析法和動物研究(例如在小鼠及/或靈長類動物中)獲得的數據用於配製適用於人類的一劑量範圍。在一些實施例中,所述劑量在循環濃度的範圍內,所述循環濃度包括具有最小毒性或無毒性的ED50。劑量可根據多種因素在該範圍內變化,例如上述因素。治療醫師可以根據個體的病情選擇確切的製劑、投予途徑與劑量。
在一些實施例中,於此所述的抗TIGIT抗體,抗原結合片段或組成物在單一情況下投予。在其他實施例中,在多種情況下投予於此所述的抗TIGIT抗體、抗原結合片段或組成物。單一劑量之間的間隔可以是例如每小時、每天、每週,每兩週,每月或每年。基於測量個體中所投予的活性劑(例如抗體或抗原結合片段)的血液水平,間隔也可以是不規則的,以維持該試劑的血漿濃度相對一致。抗TIGIT抗體或抗原結合片段的投予劑量與頻率也可以根據治療是預防性還是治療性而變化。在預防性應用中,可以在一長段時間內以相對不頻繁的間隔施用相對較低的劑量。一些個體可能會在餘生中繼續接受治療。在治療應用中,有時需要以相對較短的時間間隔使用相對較高的劑量,直到疾病的進展減少或終止,及/或直至個體顯示出一或更多之疾病症狀的部分或完全緩解。此後,可以給個體施用較低的,例如預防性劑量方案。
在一些實施例中,還提供了用於於此所述的治療應用的套組。 在一些實施例中,本揭露提供了包含抗TIGIT抗體或抗原結合片段的套組。 在一些實施例中,套組進一步包含一或更多之另外的組分,包括但不限於:使用說明書;其他試劑,例如其他治療劑(例如,一檢查點抑制劑),藥學上可接受的載體等; 以及用於將抗體或抗原結合片段以準備用於投予的裝置、容器或其他材料。 使用說明可以包括用於治療應用的指南,包括例如在患有或懷疑患有免疫相關疾病(例如,癌症或感染或傳染性疾病)的個體中的建議劑量及/或投予方式。
在一些實施例中,本揭露提供了套組,其包括抗TIGIT抗體或抗原結合片段語包裝插頁,所述包裝插頁包含使用抗體或抗原結合片段在個體中治療或延遲免疫相關疾病(例如,癌症,感染或傳染病)的進展的說明書。在一些實施例中,本揭露內容提供了套組,其包含抗TIGIT抗體或抗原結合片段,至少一種其他治療劑(例如,一檢查點抑制劑)和包裝插頁,該包裝插頁包括用於使用該組合以治療或延遲進展個體中與免疫相關的疾病(例如,癌症或感染或傳染性疾病)的發生的說明書的說明書。個體可以是例如人類。套組中可包括單獨或與一或更多之其他治療劑組合之於此所述的任何示例性抗TIGIT抗體或抗原結合片段。
在一些實施例中,本揭露提供了套組,其包括抗TIGIT抗體或抗原結合片段和包裝插頁,所述包裝插頁包含使用抗體或抗原結合片段在個體中活化及/或殺死一個或更多之免疫細胞的說明書。在一些實施例中,本揭露內容提供了套組,其包含抗TIGIT抗體或抗原結合片段、至少一種其他治療劑(例如,一檢查點抑制劑)與包裝插頁,所述包裝插頁包括用於使用該組合來活化及/或殺死個體中一個或更多之免疫細胞的說明書。 在一些實施例中,個體是人類。 套組中可包括單獨或與一或更多之其他治療劑組合的於此所述的任何示例性抗TIGIT抗體或抗原結合片段。
實施例
以下實例提供本揭露的說明性實施例。該技術領域具有通常知識者將認識到可以在不改變本揭露的精神或範圍的情況下進行多種修改和變化。此類的修改和變化涵蓋在本揭露的範圍內。提供的示例並不以任何方式限制本揭露本揭露。
實施例1: TIGIT免疫原(immunogen)之產生
編碼人類與小鼠之TIGIT IgV域的cDNA片段分別被合成(Integrated DNA Technologies, Inc.)並次選殖(subcloned)進一哺乳動物表現載體pSecTag2/Hygro (Invitrogen)。藉由使用Effectene (Qiagen)將各個之表現構築體(expression constructs)轉染至小鼠骨髓瘤NS0細胞(European Collection of Authenticated Cell Cultures (ECACC))來產生重組蛋白。以潮黴素B(hygromycin B)(400 μg/ml)篩選2週後,將細胞以5 x 105
細胞/ml之起始接種密度接種於無添加血清之化學性界定培養基HyQNS0 (Hyclone)中培養於搖瓶中。5天後收取培養基,並藉由Strep-Tactin XT Superflow色層分析法(chromatography)(IBA Technology, Inc.)從上清液分別純化人類與小鼠TIGIT IgV域。藉由SDS-PAGE分析重組之人類與小鼠TIGIT IgV域的純度(第1圖)。將經純化的蛋白質用於動物免疫。
實施例2:抗TIGIT單株抗體之產生
將10隻6至12週大的SJL/J小鼠以50 μg重組之人類與小鼠TIGIT IgV域之各個在完全弗氏佐劑(complete Freund’s adjuvant)存在下以1:1 (v/v)之體積比混合的混合物經由腹膜內注射(intraperitoneal injection)來進行免疫。將動物藉由注射在不完全弗氏佐劑(incomplete Freund’s)存在下以1:1 (v/v)之體積比混合之相同的免疫原進行免疫追加(boost)。經由ELISA依據血清抗體效價而定,以每週一次的時間間隔投予總數一至四次的免疫追加。
使用來自具有抗人類或小鼠TIGIT IgV域之最高血清抗體效價的8隻小鼠的脾細胞(Splenocytes)與淋巴細胞以與骨髓瘤NS0細胞(ECACC)融合。篩選抗人類與小鼠TIGIT IgV之融合瘤細胞,與一人類Fc域融合 (Sino Biological Inc.)。提供一0.5 μg/ml之固定濃度的重組CD155-人類Fc融合蛋白(Sino Biological Inc.)的競爭以確認具有阻斷TIGIT與CD155之交互作用的融合瘤株(clones)。選擇了五種具有TIGIT/CD155阻斷能力的融合瘤單株,並藉由AlphaLISA競爭分析(AlphaLISA competition assays)進一步評估。
實施例3:AlphaLISA競爭分析
為了評估經由抗TIGIT抗體之TIGIT對CD155之結合的抑制,使用TIGIT:CD155均相分析套組(Homogeneous Assay Kit) (PBS Biosciences, #72029)來執行AlphaLISA分析。將包含TIGIT-生物素(最終濃度為0.2 ng/μl)之溶液的等分試樣(6 μl)與4倍系列稀釋的測試抗體(最終體積為2 μl)添加到384孔盤中。將培養盤以上蓋蓋住並於室溫培養30分鐘。之後,於各孔中添加 2 μl組胺酸標籤之CD155(終濃度為0.05 ng/μl),並在室溫下培養60分鐘。最後,加入等分試樣 (5 μl)的抗生蛋白鏈菌素結合的供體(donor)珠(最終濃度為10 μg/ ml)與5 μl的抗His標籤受體(acceptor)珠(最終濃度為20 μg/ml),並將培養盤於黑暗中在室溫下培養30分鐘。於EnSpire Alpha 2390 (Perkin-Elmer Life Sciences)上測量AlphaLISA訊號。將15A6 (U.S. Patent No. 10,189,902)與MBSA43 (Thermo Fisher Scientific, # 16-9500-82)使用為參考抗體。
結果顯示於第2A-2E圖中。三種抗TIGIT單株抗體7D4、2C9與3A9分別顯示0.32、0.40與0.55 nM之TIGIT/CD155阻斷能力(IC50
)。選擇這些抗體用於進一步之功能研究。
實施例4:抗TIGIT單株抗體之V基因定序
從約106
個細胞之分泌抗TIGIT IgG的融合瘤株7D4、2C9與3A9分離出總RNA分離,且依據製造商之步驟,使用 SMARTer RACE 5’/3’ Kit (Takara Bio USA, Inc., # 634913)藉由RT-PCR獲得編碼各抗體之重鏈與輕鏈可變區的cDNA片段。7D4、2C9與3A9抗體之胺基酸序列列於表2-5中。
實施例5:抗TIGIT抗體對表現人類TIGIT之Jurkat細胞的結合
將系列稀釋之經蛋白質A管柱純化之7D4、2C9與3A9抗體分別與5 x 105
個人類TIGIT表現之Jurkat細胞(TIGIT/Jurkat)於冰上培養於50 μl之FACS緩衝溶液(0.2% BSA 於含有0.09%疊氮化鈉(sodium azide)之杜氏磷酸緩衝鹽溶液(Dulbecco's phosphate-buffered saline, DPBS)中)1小時。於清洗後,將細胞以結合PE染劑之抗小鼠IgG染色,並藉由流式細胞分析技術(flow cytometry)分析抗體結合強度。
結果顯示於第3A-3C圖。7D4、2C9與3A9分別對於TIGIT/Jurkat細胞顯現0.27、2.0與1.86 nM之平衡結合常數(equilibrium binding constants)(KD
)。
實施例6:抗TIGIT抗體對人類、食蟹猴(cynomolgus monkey, cyno)與小鼠的結合
為了評估抗TIGIT抗體7D4、2C9與3A9的物種交叉反應性(species cross-reactivity),進行針對人、食蟹猴與小鼠TIGIT之ELISA結合分析。於4℃將各於50 μl之DPBS的1 μg/ml的人類、食蟹猴(R&D Systems, Inc., # 9380-TG)與小鼠TIGIT隔夜塗覆於96孔盤。在以含0.05%之Tween 20的磷酸緩衝鹽溶液 (PBST)清洗後,分別添加系列稀釋的7D4、2C9與3A9抗體,並將培養盤在37℃培養1小時。在以PBST清洗培養盤三次後,將培養盤與結合山葵過氧化酶(horseradish peroxidase, HRP)之抗小鼠Fcγ多株抗體於37℃培養1小時。在以PBST清洗培養盤3次後,將100μl的3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(3,3',5,5'-tetra-methylbenzidine, TMB)基質(Thermo Fisher Scientific, #34018)加入各孔中。顯色5至10分鐘後,將50 μl終止溶液(2 N HCl)添加到各孔中,並藉由分光光度計在450 nm的波長讀取培養盤。
結果顯示於第4圖中。7D4、2C9與3A9顯現在次nM(sub-nM)範圍中之對於人類TIGIT的EC50
值。7D4對於小鼠TIGIT顯現10.53 nM之EC50
值。
實施例7:TIGIT/CD155阻斷分析
根據製造商的步驟,使用TIGIT/CD155阻斷生物分析套組(Promega,#J2405)藉由基於細胞的螢光素酶報告基因分析來測定抗TIGIT抗體對於抑制TIGIT:CD155細胞信號轉導的效力。簡而言之,將經冷凍之表現CD155的CHO-K1細胞(CD155/CHO)與表現TIGIT的Jurkat細胞(TIGIT/Jurkat)融化,且以新鮮培養基恢復,並在37℃下隔夜培養。於隔日,將CD155/CHO細胞以4 x104
細胞/孔的密度接種在96孔培養盤於100 μl培養基中。將抗TIGIT抗體的系列稀釋液(體積為40 μl)添加至各孔中,接著以1.5 x 105
個細胞/孔的密度添加40 μl TIGIT /Jurkat細胞。將細胞於37°C共培養6小時。隨後,添加80 μlOne Glo試劑,並將培養盤在室溫下培養15分鐘。然後將反應溶液轉移至用於發光測量的白盤中。
結果顯示於第5A-5B圖。抗TIGIT抗體7D4、2C9與3A9阻斷了TIGIT與CD155的交互作用,導致以劑量依賴性方式之T細胞活化(第5A圖)。此外,在TIGIT/CD155阻斷分析中,相較於參考抗體15A6,7D4顯現較高之T細胞活化的提升(第5B圖)。
實施例8:PD-1/PD-L1與TIGIT/CD155組合阻斷分析
為了評估抗TIGIT抗體7D4與參考抗體15A6組合抗PD-1拮抗劑抗體(pembrolizumab)的效力,根據製造商的步驟,使用PD-1+TIGIT組合生物分析套組(Promega, # J2120)來進行基於細胞的螢光素酶報告基因分析。
簡而言之,將經冷凍之表現PD-L1+CD155的CHO-K1細胞解凍,並以之4×104
細胞/孔的密度接種在96孔培養盤於100 μl培養基中。將細胞在37°C下培養以使細胞附著。於隔天,將培養基除去,並將抗-TIGIT與抗PD-1抗體的系列稀釋液添加於各孔中(體積為40 μl)。最後,將1 x 105
個冷凍恢復之PD-1+TIGIT /Jurkat細胞添加至各孔中(體積為40 μl)。於一6小時培養後,將80 μl Bio-Glo試劑添加至各個孔中,並使用光度計對冷光進行定量。
結果顯示於第6圖。抗PD-1抗體pembrolizumab與7D4或參照15A6的組合於1:1之抗PD-1:抗TIGIT抗體濃度比(範圍從0.1至100 μg/ml),相較於pembrolizumab單獨,具有更高脂T細胞活化活性。此外,相較於參考抗體15A6,7D4與pembrolizumab的組合顯現較高之T細胞活化的提升。
實施例9:藉由7D4、2C9與3A9之T細胞活化
將CD155/CHO細胞以4 x 104
個細胞/孔的密度接種到96孔盤中的100 μlRPMI 1640培養基中,並隔夜培養。於隔天,在去除培養上清液後,分別添加抗TIGIT抗體(7D4、2C9與3A9)與參考抗體(15A6與MBSA43)一系列稀釋液(40 μl/孔),然後1.5 x 105
個細胞/孔之密度添加TIGIT/Jurkat細胞於40 μl培養基中。於共培養26小時之後,將培養盤以4000 rpm離心5分鐘,並藉由ELISA來分析上清液中IL-2的濃度。
結果如第7圖所示。不同的抗TIGIT抗體以濃度依賴性方式增加經由TIGIT/Jurkat細胞的IL-2分泌。
為了評估來自人類外周血單核細胞(human peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)之表現TIGIT之細胞的活化,在7D4的10倍系列稀釋液存在下,於37°C下。以塗覆於培養盤之重組的人類CD155-Fc融合蛋白(1 μg/ml於DPBS中在96孔培養盤中)處理來自3個獨立健康捐獻者的PBMC(5 x 104
細胞/孔)1小時。將抗人類CD3抗體(OKT3)以1 μg/ml的最終濃度添加至各孔中。於48小時之培養後,將培養盤在1500rpm下離心3分鐘,並藉由ELISA分析IL-2與IFN-γ的上清液濃度。
結果顯示於第8A-8B圖中。在來自三個不同健康人類捐獻者的PBMC中,在T細胞活化抗CD3抗體OKT3存在下,7D4阻斷了表現TIGIT的T細胞與CD155之間的交互作用所產生的T細胞抑制信號。經活化的T細胞也分泌促發炎細胞激素(proinflammatory cytokines) IL-2與IFN-γ。捐獻者1-3顯示出響應於7D4的添加的劑量依賴性T細胞活化,而捐獻者1顯示出最強的響應。捐獻者2與3中藉由抗CD3抗體之T細胞活化的基礎水平(於0 μg/ ml之7D4)高於捐獻者1。
實施例10:重組抗TIGIT抗體的構築、表現與純化
為了表現重組之小鼠抗體,將編碼各抗體之重鏈與輕鏈可變區的cDNA片段次選殖進哺乳動物表現載體pFUSEss-CHIg-mG2a(Invivogen)與pSecTag2/Hygro(Thermo Fisher Scientific)中。使用Effectene (Qiagen)將含有各抗體的重鏈與輕鏈之cDNA的質體共轉染到小鼠骨髓瘤NS0細胞中。在以潮黴素B(400 μg/ml)與G418(800 μg/ml)選擇4週後,藉由重組人類TIGIT IgV域為塗覆層,抗小鼠IgGFcγ-HRP為偵測試劑的ELISA,從培養基中篩選出幾個表現量高的細胞株。挑選各抗體的高表現選殖株,並在搖瓶中以5 x 105
細胞/ml的初始接種密度於無添加血清之化學性界定培養基HyQNS0 (Hyclone)中培養,無需添加血清。5天後收取培養基,並藉由蛋白質A (MabSelect SuRe)管柱 (Cytiva)從上清液中純化抗體。
實施例11:7D4之抗體人源化
依照Fan et al. ((2017) Biochem Biophys Rep 9: 51-60)的方法進行同源性模擬(homology modeling)。抗TIGIT抗體7D4之小鼠VH與VL區的CDR區分別移植至人類生殖系列(germline)家族之IGHV3-11與IGKV3-11框架區。人類框架區中的數個胺基酸殘基被回復突變(back mutated)為原始的小鼠殘基,以維持抗體結合親和力。hz7D4抗體之胺基酸序列列於表2-5中。
分別合成hz7D4的VH與VL區的核苷酸序列,並將其次選殖至帶有信號肽序列的哺乳動物表現載體pFUSE-CHIg-hIG1 (Invivogen)(Invivogen)與包含人κ鏈恆定區的pSecTag2/Hygro (Invitrogen)中。參考人類IgG1抗體15A6與1D3分別依據美國專利號10,189,902與10,017,572中的VH
與VL
序列產生。重組之hz7D4、15A6與1D3 hIgG1抗體在CHO-S細胞(Thermo Fisher Scientific)中產生,並藉由蛋白質A (MabSelect SuRe)柱進行純化。
實施例12:人源化7D4 (hz7D4) 抗體之細胞競爭結合分析
包括hz7D4之抗TIGIT抗體與參考抗體(15A6與1D3)被用於與CD155競爭針對表現人類TIGIT的細胞的結合。MJ[G11](美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC),CRL-8294)是一種攜帶人T細胞白血病病毒(human T cell leukemia virus, HTLV-I)的CD3+CD4+T淋巴瘤細胞系。MJ [G11]細胞的特徵在於,以包括CD4、CD25、CD127與FoxP3之調節性T細胞表型抗體標記進行免疫染色,被發現是一種調節性T細胞樣細胞系(第9A圖)。又,MJ [G11]細胞本質地表現人類TIGIT,如以PE結合之抗人類TIGIT,MBSA43抗體之免疫染色所顯示(第9B圖)。將抗TIGIT抗體的3倍系列稀釋液添加至在50μl FACS緩衝液中(0.2%BSA於含0.09%疊氮化鈉的DPBS中)中之5x105
的表現人類TIGIT的Jurkat細胞或3x105
的MJ [G11]細胞並在冰上培養30分鐘。然後,將10 μl DyLight 650結合之CD155-人類Fc融合蛋白添加至細胞,以使人類TIGIT-Jurkat細胞的終濃度達到1 μg/ml,而MJ[G11]細胞的終濃度達到1.5 μg/ml,且於4°C培養30分鐘。清洗細胞並將其藉由FACSCalibur細胞儀(Becton Dickinson)。基於標準化之中位數螢光強度(median fluorescence intensity, MFI)值計算IC50
值
結果顯示於第10A-10B圖中。抗TIGIT hIgG1抗體hz7D4、15A6與1D3阻斷CD155對於TIGIT/Jurkat與MJ[G11]細胞者之結合。達成hz7D4的50%CD155結合抑制(IC50
)所需的阻斷抗體的濃度,對於TIGIT/Jurkat細胞為0.2 nM(第10A圖),而對於MJ[G11]細胞為0.3 nM(第10B圖)。
實施例13:噬菌體展示抗體庫的構建與hz7D4的親和力增強
將人源化的7D4(hz7D4)scFv基因選殖進噬菌粒(phagemid)載體pKH於Nco I與Not I限制性切點。以含有一段NNK序列的引子,將編碼重鏈與輕鏈之CDR3區的胺基酸序列隨機突變。重鏈CDR3 (HCDR3)與輕鏈CDR3 (LCDR3)庫分別被擴增,藉由在50 μl反應溶液中的重疊延伸PCR (overlapping extension-PCR),經由兩個等莫耳量的片段與25 pmol載體選殖引子進行95℃,30秒,60℃,30秒及72℃,1分鐘的30個循環的融合。將擴增的產物進行凝膠純化,以Nco I與Not I消化,並次選殖進pKH噬菌粒中。藉由電穿孔將質體庫轉形至大腸桿菌(Escherichia coli
) TG1細胞中。將攜帶hz7D4 scFv之重鏈CDR3 (HCDR3)或輕鏈CDR3 (LCDR3)的最終M13噬菌體抗體庫(repertoire)分別利用KM13輔助噬菌體製造出來。
實施例14:hz7D4抗小鼠TIGIT的親和力增強
為了使hz7D4抗小鼠TIGIT的親和力增強,將來自重鏈CDR3(HCDR3)庫的噬菌體(109
cfu)與1 nM之生物素化的小鼠TIGIT IgV域在1 ml含3%脫脂牛奶之PBS/0.1%Tween-20中於室溫培養1小時。藉由與50 μlM280鏈黴親和素(streptavidin)磁珠(Thermo Fisher Scientific, # 11205D)一起培養15分鐘來捕獲噬菌體。藉由以PBS/0.1%Tween-20清洗十次,接著以PBS洗滌十次,每次5分鐘來消除非特異性噬菌體。將結合之噬菌體以0.1 M甘胺酸(pH 2.0)洗脫,以1 M Tris-HCl (pH 8.0)中和,並再次感染至對數期TG1細胞中。在第二輪淘選(panning)中,將噬菌體(109
cfu)用於對抗0.1 nM之生物素化小鼠TIGIT IgV域。
確定結合至小鼠TIGIT IgV域之噬菌體選殖株的核苷酸序列。選擇三個選殖株,分別命名為1G3、2F1與3H2。表2列出包括HCDR3之CDR胺基酸序列。
將所選擇的三個在HCDR3區具有不同胺基酸序列的scFv選殖株轉化為在Fc區具有DLE突變的小鼠IgG2a同型(isotype) (mIgG2a-DLE),並如上所述在CHO-S細胞中表現並純化重組之抗體。據報導具有S239D/A330L/I332E (DLE)突變的抗體Fc變體可增強效應子功能 (Lazar et al. (2006) Proc Natl Acad Sci USA 103:4005-10)。將人類與小鼠TIGIT的ELISA結合,及三個hz7D4衍生的抗體選殖株(1G3、2F1與3H2)對小鼠TIGIT / CD155的競爭進行分析,並總結於表7中。將hz7D4與參考抗體1G9(Bio X Cell, # BE0150)包含為比較物。
表7、針對hz7D4衍生抗體1G3、2F1與3H2之ELISA結合測量
hz7D4 | 1G3 | 2F1 | 3H2 | 1G9 | |
小鼠同型(isotype) | mIgG2a | mIgG2a-DLE | mIgG2a-DLE | mIgG2a-DLE | IgG1 |
hTIGIT結合 EC50 (nM) | 0.3 | 9.4 | 463.6 | 0.9 | 無結合 |
mTIGIT 結合 EC50 (nM) | 217 | 3.6 | 1.1 | 0.7 | 0.3 |
mTIGIT/mCD155競爭 IC50 (nM) | 無競爭 | 61.7 | 33.8 | 12.4 | 1.5 |
實施例15:抗TIGIT抗體與小鼠TIGIT表現之CHO細胞的結合
將表7中列出的經蛋白質A管柱純化的抗TIGIT抗體分別與5 x 105
之小鼠TIGIT表現的CHO細胞(mTIGIT/CHO)在50μl FACS緩衝液(0.2%BSA於含有0.09%疊氮化鈉之杜氏磷酸緩衝鹽溶液(DPBS)中)中以2 µg/ml的終濃度在冰上培養1小時。於清洗後,細胞用結合有PE染劑之抗小鼠IgG染色,並藉由流式細胞分析技術分析抗體結合強度。
第11圖顯示流式細胞分析技術圖,其顯示了不同的抗TIGIT抗體對mTIGIT/CHO細胞的結合。細胞結合程度與表7中所示的ELISA結合數據一致。
實施例16:在同基因(syngeneic)結腸癌腫瘤模型中之抗腫瘤功效
對於同基因腫瘤模型實驗,將6至8周大的BALB / c小鼠皮下(s.c.)注射2×105
個細胞之CT26結腸癌細胞(ATCC, CRL-2638)。當腫瘤平均達到〜80 mm3
時,將小鼠分組(n = 9),並將其以每週兩次腹膜內(i.p.)注射200 μg抗體(1G9、2F1與3H2)或PBS控制(control)處理3週。監測腫瘤生長並測量腫瘤體積。
結果顯示於第12A-12B圖中。hz7D4衍生之小鼠親和力增強的2F1與3H2 mIgG2a-DLE抗體抑制了在BALB/c小鼠中之CT26腫瘤的生長。在以2F1與3H2處理的組別中觀察到腫瘤生長延遲。以2F1與3H2抗體處理之9隻小鼠中有六隻具有長達120天的完全反應(complete response)(臨床終點(clinical endpoint))。
實施例17:hz7D4抗人類與食蟹猴TIGIT的親和力增強
對於hz7D4 scFv抗人類與食蟹猴TIGIT的親和力增強,將重鏈與輕鏈CDR3庫中的噬菌體(109
cfu)分別與0.1 nM生物素化的人類TIGIT IgV域在1 ml含3%脫脂牛奶之PBS/0.1%Tween-20中於室溫培養1小時。藉由與50 μl之M280鏈黴親和素磁珠(Thermo Fisher Scientific)一起培養15分鐘來捕獲噬菌體。藉由以PBS/0.1%Tween-20清洗十次,接著以PBS洗滌十次,每次5分鐘來消除非特異性噬菌體。將結合之噬菌體以0.1 M甘胺酸(pH 2.0)洗脫,以1 M Tris-HCl (pH 8.0)中和,並再次感染至對數期TG1細胞中。在第二輪篩選中,將噬菌體(109
cfu)用於對抗0.1 nM之生物素化食蟹猴TIGIT IgV域。
確定結合至人類與食蟹猴TIGIT IgV域兩者之噬菌體選殖株的核苷酸序列。所有重鏈CDR3 (HCDR3)選殖株均含有LGRGYWYFDV(序列辨識號:3)的野生型HCDR3胺基酸序列。通過輕鏈庫篩選的兩個輕鏈CDR3 (LCDR3)選殖株,分別命名為1A11與1E3,分別含有QLFRSGSA(序列辨識號:23)與STFTVINL(序列辨識號:24)之LCDR3胺基酸序列。
為了增強ADCC效應子功能,將所選擇之在LCDR3區具有不同的胺基酸序列的scFv選植體1A11與1E3轉換為在Fc區具有DLE突變的人類IgG1同型(hIgG1-DLE)。兩種重組之抗體1A11 hIgG1-DLE與1E3 hIgG1-DLE在CHO-S細胞中表現,並藉由蛋白質A(MabSelect SuRe)管柱進行純化。表2-5中列出人源化之1A11 hIgG1-DLE與1E3 hIgG1-DLE抗體的胺基酸序列。
實施例18:抗TIGIT抗體與表現食蟹猴TIGIT之CHO細胞的結合
包括hz7D4 hIgG1、1A11 hIgG1-DLE、1E3 hIgG1-DLE與參考抗體(15A6 hIgG1 and 1D3 hIgG1)的抗TIGIT抗體分別與5 x 105
之食蟹猴TIGIT表現的CHO細胞 (cynoTIGIT/CHO)在50 μl FACS緩衝液(0.2%BSA於含有0.09%疊氮化鈉之杜氏磷酸緩衝鹽溶液(DPBS)中)中以1 µg/ml的終濃度在冰上培養1小時。於清洗後,將細胞以結合有Alexa-647染劑之抗人類IgG染色,並藉由流式細胞分析技術分析抗體結合強度。結果顯示於第13圖中。
實施例19:hz7D4 hIgG1、1A11 hIgG1-DLE與1E3 hIgG1-DLE之抗體依賴性之細胞媒介的細胞毒性功能(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity function)
在不同的抗TIGIT抗體,包括hz7D4 hIgG1、1A11 hIgG1-DLE與1E3 hIgG1-DLE及參考抗體(15A6 hIgG1與1D3 hIgG1)存在下,使用T淋巴瘤細胞株MJ[G11] (ATCC, CRL-8294)來評估經由表現FcRγIIIa(F176V)之人類NK92細胞株(ATCC, PTA-6967)的抗體依賴性之細胞媒介的細胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity ADCC)。首先將MJ[G11]細胞膜以10 μM之鈣黃綠素(calcein)AM螢光染劑染色,然後於37℃培養30分鐘。將細胞以培養基清洗三次。通過台盼藍(trypan blue)計數細胞數,並將細胞密度調整為2 x105
細胞/ml。將不同的抗TIGIT抗體的系列稀釋液,以從10-5
至10 µg/ ml之範圍的濃度每種為20 µl的體積,添加到96孔V型底微量滴定盤中。清洗NK92細胞,並將其調整為1.6 x 105
個細胞/ml之培養基。將8,000個NK92(效應細胞(effector cells),E)與10,000 MJ[G11](靶細胞(target cells),T)細胞各50 μl加到同一孔中,以使E:T比= 0.8:1。之後將滴定盤於37°C培養4小時。將滴定盤以500 x g離心5分鐘以沉澱細胞。然後將來自每個樣品孔的100 μl上清液轉移到96孔黑色微量滴定盤中,並藉由滴定盤讀取儀分析螢光(激發:488 nm,發射:518 nm)。將無抗體的靶細胞的螢光光強度作為靶細胞的自發釋放。將為了實現靶細胞的完全裂解之20 μl之1%Triton X-100的添加作為最大釋放。根據螢光強度,藉由以下方程式計算在經處理之抗體存在下透過NK92細胞之靶細胞之裂解的百分比:
結果顯示於第14圖中。Fc工程改造的1A11與1E3 (hIgG1-DLE)變體兩者皆增強了藉由人類自然殺手細胞之抗體依賴性之細胞媒介的細胞毒性(ADCC),從而殺死了表現TIGIT的MJ[G11]細胞,而1A11 hIgG1-DLE顯現出經測試之抗體之最強的ADCC活性。缺乏人Fc的對照組中的7D4 mIgG2a表現出基礎水平的ADCC活性(即,無任何抗體的共同培養的效應細胞與靶細胞的水平)。
實施例20:7D4與人源化7D4變體1A11之抗原決定位匹配(mapping)
為了確定所選的抗TIGIT抗體是否識別人類TIGIT的連續(線性)或不連續(構形)抗原決定位,使用斑點印跡(dot blot)轉移設備將以或不經過SDS與還原劑變性之0.1 μg重組之人類TIGIT IgV蛋白直接轉移到硝酸纖維素膜上。於阻斷與清洗步驟後,將膜條分別以7D4、2C9、3A9與MBSA43抗體進行免疫印跡(immunoblotted),並分別藉由抗小鼠Fcγ-HRP偵測。結果顯示於第15圖。抗TIGIT單克隆抗體7D4、2C9與3A9僅與天然形式的人類TIGIT蛋白結合,此指出它們識別TIGIT構形抗原決定位。相對地,抗體MBSA43與天然TIGIT及變性TIGIT兩者結合,此指出其識別TIGIT線性抗原決定位。
使用PEPperMAP構形抗原決定位匹配法(PEPperMAP Conformational Epitope Mapping),經由重組之7D4抗體(在小鼠IgG2a同型中)鑑定人類TIGIT(序列辨識號:22)的結合區。使用胜肽合成儀在微晶片上合成覆蓋整個TIGIT IgV域(序列辨識號:22,底線標示)的環狀胜肽,其具7、10或13個胺基酸殘基之環肽長度(loop loop peptide length)。對於每個斑點的重疊胜肽序列相差一個胺基酸殘基。接著,將微晶片與重組之7D4抗體雜合。於清洗後,藉由與Dylight 680結合之抗小鼠IgG來將斑點強度進行定量。如第15B圖中所示,7D4顯示了與包含共有基序(consensus motif)YFCIY之7、10與13個胺基酸環狀胜肽的最強結合信號。
人類TIGIT(IgV域底線標示)MRWCLLLIWAQGLRQAPLASGMMTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTQVNWEQQDQLLAICNADLGWHISPSFKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDAGEYF
CIY
HTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARF
QIPLLGAMAATLVVICTAVIVVVALTRKKKALRIHSVEGDLRRKSAGQEEWSPSAPSPPGSCVQAEAAPAGLCGEQRGEDCAELHDYFNVLSYRSLGNCSFFTETG
(序列辨識號:22)
為了進一步鑑定與重組7D4 mIgG2a抗體相互作用的TIGIT胺基酸殘基,使用標準分子技術藉由定點誘變(site-directed mutagenesis)在人類TIGIT IgV域中生成了單個丙胺酸取代突變。然後進行ELISA結合分析以評估7D4結合強度。
第16圖顯示人類、食蟹猴與小鼠TIGIT IgV域之胺基酸序列比對。突變成丙胺酸以研究TIGIT/7D4結合的單個胺基酸殘基係以粗體表示。為了抗原決定位匹配(epitope mapping),下列將10個突變用於ELISA結合分析:Q56A、N70A、D72A、G74A、Y106A、F107A、Y110A、H111、Y113A與F123A。Q56、N70、D72、G74與Y113的胺基酸殘基靠近TIGIT/CD155複合物的界面(Stengel et al. (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109:5399-5404),而Y106、F107與Y110位於TIGIT中親本小鼠7D4抗體結合共有基序YFCIY上。基於第15B圖所示的微陣列數據的螢光信號強度,依照製造商的步驟,在Expi293F細胞(Thermo Fisher Scientific, # A14527)中產生重組之TIGIT IgV點取代突變體,並藉由Strep-Tactin XT Superflow色譜法(IBA Technology, Inc.)將其從培養上清液分別純化。
第17圖顯示7D4與TIGIT突變體的ELISA結合結果。Q56與Y106單個丙胺酸取代突變體完全消除了7D4的結合。G74、Y110與H111單個丙胺酸取代突變體在濃度高達10 μg/ml時顯示於7D4結合方面顯著降低(超過野生型的50%)。這些數據顯示,位於面向TIGIT/PVR界面的β-褶板(β-sheet)的三個胺基酸殘基Y106、Y110與H111參與了hz7D4對TIGIT的結合。第18圖顯示,根據Stengel et al. ((2012) Proc Natl Acad Sci USA 109: 5399-5404)之用於分析人類PVR(CD155)與TIGIT的共結晶的分子結構模型。
為了鑑定與人源化7D4變體1A11(在人類IgG1-DLE同型中)相互作用的TIGIT胺基酸殘基,以單個丙胺酸取代突變體進行ELISA結合分析以評估1A11結合強度。第19圖顯示了1A11對各種TIGIT突變體的ELISA結合結果。與親本小鼠7D4抗體相似,Q56與Y106單個丙胺酸取代突變體完全消除了1A11的結合。G74、Y110與H111單個丙胺酸替代突變體在濃度高達10 μg/ ml時顯示於1A11結合方面顯著降低(超過野生型的40%)。
雖然本揭露已以較佳實施例揭露如上,然其並非用以限定本揭露,任何熟習此技藝者,在不脫離本揭露之精神和範圍內,當可作些許之更動與潤飾,因此本揭露之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
無
第1圖顯示,SDS-PAGE凝膠,其顯示了在NS0細胞中表現的重組人類與小鼠TIGIT IgV域的純度。在SDS-PAGE分析之前,藉由Strep-Tactin XT Superflow管柱分別純化來自培養基的蛋白質。 泳道1:基準標示物;泳道2:人類TIGIT,3 µg(未還原); 泳道3:人類TIGIT,3 µg(還原); 泳道4:小鼠TIGIT,3 µg(未還原);泳道5:小鼠TIGIT,3 µg(還原)。
第2A-2E圖顯示,通過不同的抗TIGIT抗體,包括參考抗體15A6(第2A圖)與MBSA43(第2B圖)以及抗體7D4(第2C圖)、2C9(第2D圖)與3A9(第2E圖)對人類TIGIT與人CD155結合的抑制作用的圖。使用TIGIT:CD155均相分析法藉由AlphaLISA進行測定。指出每種抗體的半數最大抑制濃度(IC50
)。
第3A-3C圖顯示,顯示抗TIGIT抗體7D4(第3A圖)、2C9(第3B圖)與3A9(第3C圖)與表現人類TIGIT之Jurkat細胞(TIGIT/Jurkat)的流式細胞分析技術結合的圖。將藉由中位數螢光強度(MFI)測量的抗體結合水平相對於抗體濃度作圖。 顯示了每種抗體的平衡結合常數(KD
)。
第4圖顯示,顯示抗TIGIT抗體7D4、2C9與3A9對人類、食蟹猴與小鼠TIGIT的物種交叉反應性的圖。藉由使用每種物種的重組TIGIT IgV域塗覆板,進行基於ELISA的分析。用抗體的連續稀釋液培養後,藉由偵測與HRP綴合的抗小鼠Fcγ多株抗體來測量每種抗TIGIT抗體的結合力。藉由四參數對數擬合方程式繪製結合曲線(four-parameter logistic fit equation),並測定結合力(EC50
)。
第5A圖顯示,藉由不同的抗人類TIGIT抗體,包括參考抗體15A6與MBSA43,以及抗體7D4、2C9與3A9進行人類TIGIT/ CD155阻斷生物分析的結果。
第5B圖顯示,抗體7D4與15A6之間抑制CD155/CHO結合TIGIT/Jurkat細胞的比較。使用基於TIGIT/CD155細胞的報告系統進行分析。
第6圖顯示,將15A6(參考抗體)或抗體7D4與拮抗性抗PD-1抗體(派姆單抗)結合以評估T細胞活化的分析結果。使用基於PD-1/PD-L1 + TIGIT/CD155組合細胞的報告系統(Promega)進行分析。藉由發光強度測量T細胞活化。
第7圖顯示,通過培養不同抗TIGIT抗體的連續稀釋液來誘導表現人類TIGIT的Jurkat細胞的IL-2分泌,所述抗TIGIT抗體包括參考抗體15A6與MBSA43,以及抗體7D4、2C9與3A9。
第8A-8B圖顯示,將7D4抗體的連續稀釋液與來自三個不同健康人類捐獻者的PBMC一起培養後的白細胞介素2(IL-2)(第8A圖)和干擾素-γ(IFN-γ)(第8B圖)分泌。在固定的CD155與T細胞活化之抗CD3抗體存在下。
第9A-9B圖顯示,MJ[G11]細胞的示例性特徵。第9A圖顯示了由MJ [G11]細胞表現的人類調節性T細胞樣表型標記(CD3 +CD4+CD25high
CD127low
FoxP+)。MJ[G11]細胞以結合了螢光染劑的抗人類抗體染色,包括抗CD4-Per-CP,抗CD25-APC、抗CD127-PE與抗FoxP3-Alexa488。FoxP3在細胞內進行染色,而其他抗體則染色細胞表面。第9B圖顯示了流式細胞分析技術圖,其顯示了經由由MJ[G11]細胞之人類TIGIT的組成型表現。用與PE螢光染劑結合之抗TIGIT抗體MBSA43對細胞染色。
第10A-10B圖顯示,重組之抗TIGIT抗體(hz7D4人類IgG1(“ hIgG1”)、15A6hIgG1與1D3hIgG1)與人類CD155之間對於表現人類TIGIT的Jurkat細胞(第10A圖)與MJ [G11]細胞(圖10B)之結合的競爭測定結果的圖。培養與清洗後,藉由流式細胞分析技術定量剩餘的結合的DyLight 650-綴合的CD155-人Fc融合體。數據以最大螢光強度的百分比表示,其定義為在不存在阻斷抗體(控制組)的情況下,藉由使用DyLight 650結合之CD155-人類Fc融合蛋白染色細胞而獲得的平均螢光強度。計算抑制一半最大螢光強度(IC50
)所需的每種抗體的濃度。
第11圖顯示,流式細胞分析技術圖,其顯示了不同的抗TIGIT抗體與表現小鼠TIGIT的CHO細胞(mTIGIT/CHO)的結合。
第12A-12B圖顯示,在單一療法中用抗TIGIT抗體治療的小鼠的CT26腫瘤細胞生長曲線。繪製每個治療組的腫瘤大小(中位數SE)(第12A圖)與單個腫瘤生長曲線(第12B圖)。當腫瘤體積超過2,000 mm3
時,處死小鼠。
第13圖顯示,流式細胞分析技術圖,顯示了抗TIGIT抗體hz7D4、1E3、1A11、15A6與1D3與表現cyno TIGIT的CHO細胞(cynoTIGIT/CHO)以1 μg/ml的抗體濃度結合。
第14圖顯示,顯示不同抗TIGIT抗體的抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)活性的圖,所述抗TIGIT抗體包括親本抗體hz7D4 hIgG1,Fc工程化的hz7D4變體1A11與1E3 hIgG1-DLE以及參考抗體15A6 hIgG1與1D3 hIgG1。將NK細胞和鈣黃綠素AM染色的MJ [G11]細胞與不同濃度的抗體共培養4小時。7D4的小鼠IgG2a同型(7D4 mIgG2a)用作陰性對照。
第15A-15B圖顯示,來自抗原決定位結合分析的結果。第15A圖顯示了針對人類TIGIT蛋白的變性(DeNat)和天然(Nat)形式的不同抗體的斑點印跡分析。第15B圖顯示了微陣列分析圖,其顯示了7D4抗體與包含7、10與13個胺基酸殘基的人類TIGIT肽環結合的構象抗原決定位作圖。鑑定了保守的7D4結合肽環,其在YFCIY的共有基序中具有胺基酸殘基Y106。
第16圖顯示,包含信號肽的人類、食蟹猴與小鼠TIGIT IgV域的胺基酸序列比對(以斜體顯示)。將位於TIGIT/PVR界面上的保守(V/I)(S/T)Q,AX6G與T(F/Y)P基序裝箱。 Q56、N70、G74與Y110的胺基酸殘基用星號(*)表示。保守的7D4結合肽環YFCIY在灰色框中突出顯示。粗體表示突變為丙胺酸以評估TIGIT/7D4結合的單個胺基酸殘基。
第17圖顯示了針對人類TIGIT IgV域的不同點突變的7D4的ELISA結合分析。
第18圖示出,帶狀圖,其顯示了人類TIGIT/PVR(CD155)複合體的相互作用。 TIGIT的胺基酸殘基Q56、N70、G74與Y113位於TIGIT/PVR的界面。用粗斜體數字表示通過人類TIGIT IgV域的點突變的ELISA結合分析法鑑定的參與1A11結合的胺基酸殘基Q56、N70、G74、Y106、Y110與H111。胺基酸殘基Y106位於面對TIGIT/PVR界面的β-褶板結構中。
第19圖顯示,針對人類TIGIT IgV域的不同點突變的1A11的ELISA結合分析。
Claims (40)
- 一種經分離之抗體或抗原結合片段,其特異性地結合至人類T細胞免疫球蛋白與ITIM域(T cell immunoglobulin and ITIM domain,TIGIT),其中該抗體或抗原結合片段包括:(a)三個重鏈互補性決定區(heavy chain complementarity determining regions、HCDRs),其包括序列辨識號:1(HCDR1)、序列辨識號:2(HCDR2)與序列辨識號:3(HCDR3)之胺基酸序列;及三個輕鏈互補性決定區(light chain complementarity determining regions,LCDRs),其包括序列辨識號:4(LCDR1)、序列辨識號:5(LCDR2)與序列辨識號:23(LCDR3)之胺基酸序列;(b)三個重鏈互補性決定區(HCDRs),其包括序列辨識號:1(HCDR1)、序列辨識號:2(HCDR2)與序列辨識號:3(HCDR3)之胺基酸序列;及三個輕鏈互補性決定區(LCDRs),其包括序列辨識號:4(LCDR1)、序列辨識號:5(LCDR2)與序列辨識號:24(LCDR3)之胺基酸序列;(c)三個重鏈互補性決定區(HCDRs),其包括序列辨識號:1(HCDR1)、序列辨識號:2(HCDR2)與序列辨識號:3(HCDR3)之胺基酸序列;及三個輕鏈互補性決定區(LCDRs),其包括序列辨識號:4(LCDR1)、序列辨識號:5(LCDR2)與序列辨識號:6(LCDR3)之胺基酸序列;(d)三個重鏈互補性決定區(HCDRs),其包括序列辨識號:1(HCDR1)、序列辨識號:2(HCDR2)與序列辨識號:19 (HCDR3)之胺基酸序列;及三個輕鏈互補性決定區(LCDRs),其包括序列辨識號:4(LCDR1)、序列辨識號:5(LCDR2)與序列辨識號:6(LCDR3)之胺基酸序列;(e)三個重鏈互補性決定區(HCDRs),其包括序列辨識號:1(HCDR1)、序列辨識號:2(HCDR2)與序列辨識號:20(HCDR3)之胺基酸序列;及三個輕鏈互補性決定區(LCDRs),其包括序列辨識號:4(LCDR1)、序列辨識號:5(LCDR2)與序列辨識號:6(LCDR3)之胺基酸序列;或(f)三個重鏈互補性決定區(HCDRs),其包括序列辨識號:1(HCDR1)、序列辨識號:2(HCDR2)與序列辨識號:21(HCDR3)之胺基酸序列;及三個輕鏈互補性決定區(LCDRs),其包括序列辨識號:4(LCDR1)、序列辨識號:5(LCDR2)與序列辨識號:6(LCDR3)之胺基酸序列。
- 如請求項1之抗體或抗原結合片段,其中該抗體或抗原結合片段包括,三個重鏈互補性決定區(HCDRs),其包括序列辨識號:1(HCDR1)、序列辨識號:2(HCDR2)與序列辨識號:3(HCDR3)之胺基酸序列;及三個輕鏈互補性決定區(LCDRs),其包括序列辨識號:4(LCDR1)、序列辨識號:5(LCDR2)與序列辨識號:23(LCDR3)之胺基酸序列。
- 如請求項1或請求項2之抗體或抗原結合片段,其中該抗體或抗原結合片段包括,人類生殖系列(germline)重鏈與輕鏈框架區(framework region),或經突變以包括一或更多之胺酸取代 之人類生殖系列重鏈與輕鏈框架區。
- 如請求項1之抗體或抗原結合片段,其中該抗體或抗原結合片段包括,一重鏈可變區,其與序列辨識號:39之胺基酸序列至少90%相同,及一輕鏈可變區,其與序列辨識號:40之胺基酸序列至少90%相同。
- 如請求項1之抗體或抗原結合片段,其中該抗體或抗原結合片段包括,一重鏈可變區,其包括序列辨識號:39之胺基酸序列,及一輕鏈可變區,其包括序列辨識號:40之胺基酸序列。
- 如請求項1之抗體或抗原結合片段,其中該抗體或抗原結合片段包括一人類IgG1重鏈恆定區,或經突變以修飾效應子(effector)功能之一人類IgG1重鏈恆定區。
- 如請求項1之抗體或抗原結合片段,其中該抗體或抗原結合片段包括,一重鏈恆定區,其包括序列辨識號:43之胺基酸序列,或一重鏈恆定區,其包括經突變以包括在位置239、330與332之胺基酸取代之序列辨識號:43之胺基酸序列。
- 如請求項7之抗體或抗原結合片段,其中:在序列辨識號:43之位置239的S被以D取代;在序列辨識號:43之位置330的A被以L取代;及在序列辨識號:43之位置332的I被以E取代。
- 如請求項1之抗體或抗原結合片段,其中該抗體或抗原結合片段包括,一重鏈恆定區,其包括序列辨識號:44之胺基酸序列。
- 如請求項1之抗體或抗原結合片段,其中該抗體或抗原結合片段包括,一人類Ig κ輕鏈恆定區。
- 如請求項1之抗體或抗原結合片段,其中該抗體或抗原結合片段包括,一輕鏈恆定區,其包括序列辨識號:45之胺基酸序列。
- 如請求項1之抗體或抗原結合片段,其中該抗體或抗原結合片段包括,一重鏈恆定區,其包括序列辨識號:44之胺基酸序列,及一輕鏈恆定區,其包括序列辨識號:45之胺基酸序列,或其中該抗體或抗原結合片段包括,一重鏈,其包括序列辨識號:47之胺基酸序列,及一輕鏈,其包括序列辨識號:48之胺基酸序列。
- 如請求項1之抗體或抗原結合片段,其中該重鏈恆定區或重鏈更包括一C端離胺酸(lysine,K)。
- 一種經分離之抗體或抗原結合片段,其特異性地結合至人類TIGIT,其中該抗體或抗原結合片段結合至人類TIGIT之一區域,該區域包括在序列辨識號:22之位置106的Y,且該抗體或抗原結合片段包括,三個重鏈互補性決定區(HCDRs),其包括序列辨識號:1(HCDR1)、序列辨識號:2(HCDR2)與序列辨識號:3(HCDR3)之胺基酸序列;及三個輕鏈互補性決定區(LCDRs),其包括序列辨識號:4(LCDR1)、序列辨識號:5(LCDR2)與序列辨識號:23(LCDR3)之胺基酸序列。
- 如請求項14之抗體或抗原結合片段,其中該區域更包括以下之一或更多: 在序列辨識號:22之位置56的Q;在序列辨識號:22之位置74的G;在序列辨識號:22之位置110的Y;及在序列辨識號:22之位置111的H。
- 如請求項15之抗體或抗原結合片段,其中該區域至少包括:在序列辨識號:22之位置56的Q;及在序列辨識號:22之位置106的Y。
- 如請求項15或請求項16之抗體或抗原結合片段,其中該區域至少包括:在序列辨識號:22之位置56的Q;在序列辨識號:22之位置74的G;在序列辨識號:22之位置106的Y;及在序列辨識號:22之位置110的Y。
- 如請求項14之抗體或抗原結合片段,其中該抗體或抗原結合片段包括,一重鏈可變區,其包括序列辨識號:39之胺基酸序列,及一輕鏈可變區,其包括序列辨識號:40之胺基酸序列。
- 如請求項18之抗體或抗原結合片段,其中該抗體或抗原結合片段,包括一重鏈,其包括序列辨識號:47之胺基酸序列,及一輕鏈,其包括序列辨識號:48之胺基酸序列。
- 如請求項7至9、12、13或19之任一項之抗體或抗原結合片段,其中該重鏈更包括一C端離胺酸(K)。
- 一種醫藥組成物,其包括如請求項1至請求項20之任一項之抗體或抗原結合片段與一藥學上可接受之載體。
- 一種如請求項1至20之任一項之抗體或抗原結合片段的用途,其係用於製備用於活化或殺死於一需要之個體中之一或更多之免疫細胞之藥物。
- 如請求項22之用途,其中活化一或更多之免疫細胞包括,活化一或更多之自然殺手細胞、一或更多之毒殺性T細胞、一或更多之輔助型T細胞,及/或一或更多之單核球(monocyte)細胞。
- 如請求項22之用途,其中殺死一或更多之免疫細胞包括殺死一或更多之調節T細胞(regulatory T cell)。
- 如請求項22至24之任一項之用途,其中該藥物組合至少一額外之治療劑被投予。
- 如請求項25之方法,其中該至少一額外之治療劑包括檢查點抑制劑(checkpoint inhibitor)。
- 一種如請求項1至20之任一項之抗體或抗原結合片段的用途,其係用於製備用於治療在一需要之個體中之癌症之藥物。
- 如請求項27之用途,其中該癌症表現CD155。
- 如請求項27之用途,其中該癌症為大腸直腸癌。
- 如請求項27之用途,其中該藥物組合至少一額外之治療劑被投予。
- 如請求項30之用途,其中該至少一額外之治療劑包括一檢查點抑制劑。
- 一種如請求項1至20之任一項之抗體或抗原結合片段的用途,其係用於製備用於治療在一需要之個體中之感染或傳染疾病之藥物。
- 如請求項32之用途,其中該感染或傳染疾病為一人類T細胞白血病病毒第1型(human T cell leukemia virus type 1)相關疾病。
- 如請求項32之用途,其中該藥物組合至少一額外之治療劑被投予。
- 如請求項34之用途,其中該至少一額外之治療劑包括一檢查點抑制劑。
- 一種經分離之核酸,其編碼如請求項1至20之任一項之抗體或抗原結合片段。
- 一種經分離之載體,其包括請求項36之核酸。
- 一種經分離之細胞或細胞族群,其包括請求項36之核酸或請求項37之載體。
- 一種產生一抗體或抗原結合片段的方法,包括於適合產生該抗體或抗原結合片段之條件下培養請求項38之細胞或細胞族群。
- 如請求項39之方法,更包括分離、純化及/或回收所產生之抗體或抗原結合片段。
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