KR20170049554A - Cd123 결합제 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

CD123에 면역특이적으로 결합하는 항체가 본 명세서에 제공된다. 또한, 제공된 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편을 인코딩할 수 있는 관련 폴리뉴클레오티드, 제공된 항체 또는 항원-결합 단편을 발현하는 세포, 이뿐만 아니라 관련 벡터 및 검출가능하게 표지화된 항체 또는 항원-결합 단편도 기재된다. 게다가, 제공된 항체의 사용 방법이 기재된다. 예를 들어, 제공된 항체는 CD123-발현 암을 진단하거나, 그를 치료하거나, 또는 그의 진행, 퇴행, 또는 안정성을 모니터링하기 위해 사용되거나; 환자가 암에 대해 치료되어야 하는지의 여부를 결정하기 위해 사용되거나; 또는 대상체가 CD123-발현 암으로 괴로워하고 이에 따라 CD123-특이적 항암 치료제, 예컨대 본 명세서에 기재된 CD123 및 CD3에 대한 다중특이성 항체에 의한 치료에 적합할 수 있는지의 여부를 결정하기 위해 사용될 수 있다.

Description

CD123 결합제 및 그의 용도{CD123 BINDING AGENTS AND USES THEREOF}
본 명세서에 제공된 본 발명은 클러스터 결정인자(cluster determinant) 123(CD123; IL-3Rα로도 알려짐)에 면역특이적으로 결합하는 단일클론 항체, CD123 및 클러스터 결정인자 3(CD3)에 면역특이적으로 결합하는 다중특이성 항체, 및 기재된 항체의 생성 및 사용 방법에 관한 것이다.
대략적으로 매 3분마다, 혈액암에 관한 새로운 진단이 이루어진다. 가장 일반적인 혈액암은 백혈병, 림프종 및 골수종인데, 2014년에 미국에서는 156,420명의 새로운 사람이 이들로 진단받게 될 것이다. 대략적으로 매 10분마다, 미국에서 누군가가 혈액암으로 사망한다. 혈액암은 골수, 혈액 세포, 림프절, 및 림프계의 기타 부분에 영향을 줄 수 있는 질병이다. 이들 암은 불균형적으로 젊은 사람들을 표적으로 하는데, 백혈병은 소아 및 20세 미만의 청소년에서 가장 일반적인 암 유형이다.
한 가지 유형의 혈액암 세포는 CD123(IL-3Rα)으로 알려진 세포 마커를 발현한다. CD123을 발현하는 혈액암 세포의 예에는 아세포(blast) 및 백혈병 줄기 세포가 포함된다. CD123의 발현과 관련된 질병은 급성 골수성 백혈병(AML), 골수이형성 증후군(MDS; 저위험 및 고위험), 급성 림프구성 백혈병(ALL, 모든 아형), 미만성 대 B-세포 림프종(DLBCL), 만성 골수성 백혈병(CML), 및 아구성 형질세포양 수지상 세포 신생물(DPDCN)을 포함한다.
현재, 이들 질병에 대한 치료는 50가지 초과의 개별 약물을 포함하며, 다른 것들이 연구 중이고 임상 시험 중에 있다. 방사선 요법(RT)이 또한 혈액암을 치료하는 데 일반적으로 사용되며, 때때로 이것은 약물 요법과 함께 실시된다. 면역요법, 유전자 요법 및 개인맞춤형 의료가 또한 사용된다. 그러나, 이들 요법은 상당한 부작용 및 유해 반응을 가질 수 있다. 따라서, CD123(IL-3Rα)-발현 혈액암에 대한 새로운 개선된 치료에 대한 필요성이 있다.
CD123에 면역특이적으로 결합하는 항체 및 그의 항원-결합 단편이 본 명세서에 제공된다. 또한, 제공된 CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편을 인코딩할 수 있는 관련 폴리뉴클레오티드, 제공된 항체 및 항원-결합 단편을 발현하는 세포, 이뿐만 아니라 관련 벡터 및 검출가능하게 표지화된 항체 및 항원-결합 단편도 기재된다. 게다가, 제공된 항체 및 항원-결합 단편의 사용 방법이 기재된다. 예를 들어, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 CD123-발현 암을 진단하거나 그의 진행, 퇴행, 또는 안정성을 모니터링하기 위해 사용되거나; 환자가 암에 대해 치료되어야 하는지의 여부를 결정하기 위해 사용되거나; 또는 대상체가 CD123-발현 암을 앓고 있고 이에 따라 CD123-특이적 항암 치료제, 예컨대 본 명세서에 기재된 CD123 및 CD3에 대한 다중특이성 항체에 의한 치료에 적합할 수 있는지의 여부를 결정하기 위해 사용될 수 있다.
CD123 및 CD3에 면역특이적으로 결합하는 다중특이성 항체 및 그의 다중특이성 항원-결합 단편이 본 명세서에 추가로 제공된다. 또한, 제공된 CD123 × CD3 다중특이성 항체를 인코딩할 수 있는 관련 폴리뉴클레오티드, 제공된 항체를 발현하는 세포, 이뿐만 아니라 관련 벡터 및 검출가능하게 표지화된 다중특이성 항체도 기재된다. 게다가, 제공된 다중특이성 항체의 사용 방법이 기재된다. 예를 들어, CD123 × CD3 다중특이성 항체는 CD123-발현 암을 진단하거나 그의 진행, 퇴행, 또는 안정성을 모니터링하기 위해 사용되거나; 환자가 암에 대해 치료되어야 하는지의 여부를 결정하기 위해 사용되거나; 또는 대상체가 CD123-발현 암을 앓고 있고 이에 따라 CD123-특이적 항암 치료제, 예컨대 본 명세서에 기재된 CD123 × CD3 다중특이성 항체에 의한 치료에 적합할 수 있는지의 여부를 결정하기 위해 사용될 수 있다.
CD123-특이적 항체
CD123에 대해 특이적인 단리된 항체 및 항원-결합 단편이 본 명세서에 기재된다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 인간 CD123 SP1(서열 번호 1)에 결합한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 인간 CD123 SP2(서열 번호 2)에 결합한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 인간 CD123 SP1 및 SP2에 결합한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 인간 CD123 SP1 및 사이노몰거스 원숭이 CD123(서열 번호 3)에 결합한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 (i) 잔기 195-202(RARERVYE(서열 번호 234))를 포함하는 CD123 SP2 세포외 도메인(ECD)의 절편 및/또는 잔기 156-161(RKFRYE(서열 번호 232))을 포함하는 CD123 SP2 ECD의 절편 및/또는 잔기 173―178(TEQVRD(서열 번호 233))을 포함하는 CD123 SP2 ECD의 절편, 또는 (ii) 잔기 164-175(IQKRMQPVITEQ(서열 번호 228))를 포함하는 CD123 SP2 ECD의 절편 및/또는 잔기 184-189(LLNPGT(서열 번호 229))를 포함하는 CD123 SP2 ECD의 절편으로부터의 하나 이상의 잔기를 포함하는 에피토프(epitope)에 결합한다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 5×10-7 M 이하, 예컨대 1×10-7 M 이하, 5×10-8 M 이하, 1×10-8 M 이하, 5×10-9 M 이하, 또는 1×10-9 M 이하의 친화도로 CD123에 결합할 수 있다.
일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 CD123에 결합하기 위하여, (i) 잔기 195-202(RARERVYE(서열 번호 234))를 포함하는 CD123 SP2 ECD의 절편 또는 (ii) 잔기 164-175(IQKRMQPVITEQ(서열 번호 228))를 포함하는 CD123 SP2 ECD의 절편으로부터의 하나 이상의 잔기를 포함하는 에피토프에 결합하는 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편과 경쟁한다. 이들 에피토프 내의 적어도 하나의 잔기에 결합하는 항체 또는 단편은 또한 (i) 잔기 156-161(RKFRYE(서열 번호 232))을 포함하는 CD123 SP2 ECD의 절편 및/또는 잔기 173―178(TEQVRD(서열 번호 233))을 포함하는 CD123 SP2 ECD의 절편으로부터의 하나 이상의 잔기, 또는 ii) 잔기 184-189(LLNPGT(서열 번호 229))를 포함하는 CD123 SP2 ECD의 절편으로부터의 하나 이상의 잔기를 포함하는 CD123 ECD 내의 추가 잔기에 결합할 수 있다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 5×10-7 M 이하, 예컨대 1×10-7 M 이하, 5×10-8 M 이하, 1×10-8 M 이하, 5×10-9 M 이하, 또는 1×10-9 M 이하의 친화도로 CD123에 결합할 수 있다.
일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편, 예컨대 앞서의 2개의 단락에서 논의된 것들은 중화 항체(neutralizing antibody)이다. 중화 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은, TF-1 세포를 rhIL-3으로 자극 시에 STAT5 인산화의 감소를 측정함으로써 결정되는 바와 같이, CD123에 대한 IL-3의 결합을 억제할 수 있는 것들을 포함한다.
일부 실시 형태에서, CD3123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 CD123(IL3Ra)/CD131(IL3Rb) 수용체에 대한 IL-3 결합을 방지할 수 있다. 다른 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 IL3R 수용체(CD123(IL3Ra)/CD131(IL3Rb))의 α 및 β 쇄의 회합을 방지할 수 있다. 항체 또는 항원-결합 단편은, 증가하는 항체 농도에 따라, CD123과 CD131 사이의 회합의 감소를 측정하고 이종복합체화(heteromerization)의 손실을 측정함으로써 결정되는 바와 같이, IL3의 결합을 억제할 수 있고/있거나 CD123/CD133의 이종복합체화를 억제할 수 있는 것들을 포함한다. 표 1은 본 명세서에 기재된 일부 CD123-특이적 항체의 예에 대한 요약을 제공한다:
[표 1]
Figure pct00001
Figure pct00002
일부 실시 형태에서는, 표 1에 기재된 항체들 중 어느 하나의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 중쇄를 포함하는 CD123-특이적 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 제공된다. 일부 실시 형태에서는, 표 1에 기재된 항체들 중 어느 하나의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 중쇄 및 표 1에 기재된 항체들 중 어느 하나의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 경쇄를 포함하는 CD123-특이적 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 제공된다. 본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CD123에 결합하기 위하여, 표 1에 기재된 항체들 중 어느 하나의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 중쇄 및 표 1에 기재된 항체들 중 어느 하나의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체 또는 항원-결합과 경쟁한다.
IgG 부류는 인간에서 하기의 4가지 동종형으로 세분된다: IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4. 이들은 Fc 영역의 아미노산 서열에서 95% 초과의 상동성(homology)을 공유하지만, 힌지(hinge) 영역의 아미노산 조성 및 구조에서 큰 차이를 나타낸다. Fc 영역은 효과기 기능, 예컨대 항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC) 및 보체-의존성 세포독성(CDC)을 매개한다. ADCC에서는, 항체의 Fc 영역이 자연 살해세포 및 대식세포와 같은 면역 효과기 세포의 표면 상의 Fc 수용체(FcgR)에 결합하여, 표적화된 세포의 식세포작용 또는 용해로 이어진다. CDC에서는, 항체가 세포 표면에서 보체 캐스케이드를 촉발시킴으로써 표적화된 세포를 살해한다. 본 명세서에 기재된 항체는, 상이한 효과기 기능들을 달성하도록 Fc 서열이 변형되어 있는 변형된 버전을 포함한, IgG 동종형들 중 임의의 것과 조합된 가변 도메인의 기재된 특징을 갖는 항체를 포함한다.
치료적 항체의 많은 응용에 있어서, Fc-매개 효과기 기능은 작용 기전의 일부가 아니다. 이들 Fc-매개 효과기 기능은 탈기전(off-mechanism) 독성을 야기함으로써 유해할 수 있고 잠재적으로 안전성 위험을 제기할 수 있다. Fc 영역을 조작하여 FcgR 또는 보체 인자에 대한 그의 결합을 감소시킴으로써 효과기 기능의 변형이 달성될 수 있다. 활성화 FcgR(FcgRI, FcgRIIa, FcgRIIIa 및 FcgRIIIb) 및 억제성 FcgR(FcgRIIb) 또는 제1 보체 성분(C1q)에 대한 IgG의 결합은 힌지 영역 및 CH2 도메인에 위치된 잔기에 의존한다. Fc 기능성을 감소 또는 침묵시키기 위해 돌연변이가 IgG1, IgG2 및 IgG4에 도입되어 왔다. 본 명세서에 기재된 항체는 이들 변형을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 항체는 하기 특성들 중 하나 이상을 갖는 Fc 영역을 포함한다: (a) 모(parent) Fc와 비교할 때 감소된 효과기 기능; (b) Fcg RI, Fcg RIIa, Fcg RIIb, Fcg RIIIb 및/또는 Fcg RIIIa에 대한 감소된 친화성; (c) FcgRI에 대한 감소된 친화성; (d) FcgRIIa에 대한 감소된 친화성; (e) FcgRIIb에 대한 감소된 친화성; (f) Fcg RIIIb에 대한 감소된 친화성; 또는 (g) FcgRIIIa에 대한 감소된 친화성.
일부 실시 형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 IgG 또는 그의 유도체, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4 동종형이다. 항체가 IgG1 동종형을 갖는 일부 실시 형태에서, 항체는 그의 Fc 영역 내에 L234A, L235A, 및/또는 K409R 치환(들)을 함유한다. 항체가 IgG4 동종형을 갖는 일부 실시 형태에서, 항체는 그의 Fc 영역 내에 S228P, L234A, 및 L235A 치환을 함유한다. 본 명세서에 기재된 항체는 이들 변형을 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 기재된 항체는 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 측정될 때 5 nM 이하의 해리 상수로 CD123에 결합할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항체는 상기 표 1에 제시된 항체들의 CDR을 포함한다. SPR에 의해 친화도를 측정하기 위한 검정은 BIAcore 3000 또는 Biacore T200 기계를 사용하여 수행되는 검정을 포함하는데, 여기서 검정은 실온에서(예를 들어, 25℃ 또는 그 부근에서) 수행되며, CD123에 결합할 수 있는 항체를 항-Fc 항체(예를 들어, 염소 항-인간 IgG Fc 특이적 항체, Jackson ImmunoResearch laboratories 제품 번호 109-005-098)에 의해 Biacore 센서 칩 상에 약 75 RU의 수준까지 포획한 후, 40 μl/min의 유량으로 회합 및 해리 데이터의 수집을 행한다.
기재된 CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편에 더하여, 기재된 항체 및 항원-결합 단편을 인코딩할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열이 또한 제공된다. 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 또한 제공되며, 마찬가지로 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편을 발현하는 세포도 본 명세서에 제공된다. 개시된 벡터를 발현할 수 있는 세포가 또한 기재된다. 이들 세포는 포유류 세포(예컨대, 293F 세포, CHO 세포), 곤충 세포(예컨대, Sf7 세포), 효모 세포, 식물 세포, 또는 세균 세포(예컨대, E. 콜라이(E. coli))일 수 있다. 기재된 항체는 또한 하이브리도마 세포에 의해 생성될 수 있다.
CD123-특이적 항체의 사용 방법
기재된 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편의 사용 방법이 또한 개시된다. 이 섹션에서 논의된 방법에서 사용하기 위한 특정 항체는 상기 표 1에서의 항체들, 또는 CD123에 결합하기 위하여, 표 1에서의 항체들 중 하나와 경쟁하는 항체들에 대해 기재된 CDR들의 세트를 갖는 것들을 포함한다. 예를 들어, 이들 항체 또는 항원-결합 단편은 IL-3이 IL-3R에 결합하는 것을 방지하여 IL-3의 생물학적 효과를 억제함으로써, 또는 항체가 독소에 접합되는 경우, 이에 따라 독소가 CD123-발현 암을 표적으로 하게 됨으로써 암을 치료하는 데 유용할 수 있다. 또한, 이들 항체 또는 항원-결합 단편은 생물학적 샘플, 예컨대 혈액 또는 혈청에서 CD123의 존재를 검출하는 데; 생물학적 샘플, 예컨대 혈액 또는 혈청 중의 CD123의 양을 정량화하는 데; CD123-발현 암을 진단하는 데; 암을 앓고 있는 대상체의 치료 방법을 결정하는 데; 또는 대상체에서의 CD123-발현 암의 진행을 모니터링하는 데 유용할 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD123-발현 암은 혈액암, 예컨대 급성 골수성 백혈병(AML), 골수이형성 증후군(MDS, 저위험 또는 고위험), 급성 림프구성 백혈병(ALL, 모든 아형을 포함함), 미만성 대 B-세포 림프종(DLBCL), 만성 골수성 백혈병(CML), 또는 아구성 형질세포양 수지상 세포 신생물(DPDCN)일 수 있다. 기재된 방법은 대상체가 CD123-발현 암에 대한 치료, 예컨대 CD123 및 CD3에 대한 다중특이성 항체에 의한 치료를 받기 전에 수행될 수 있다. 더욱이, 기재된 방법은 대상체가 CD123-발현 암에 대한 치료, 예컨대 본 명세서에 기재된 CD123 및 CD3에 대한 다중특이성 항체에 의한 치료를 받은 후에 수행될 수 있다.
생물학적 샘플에서 CD123을 검출하는 기재된 방법은 생물학적 샘플을 본 명세서에 기재된 하나 이상의 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편에 노출시키는 단계를 포함한다.
대상체에서 CD123-발현 암을 진단하는 기재된 방법은 또한 생물학적 샘플을 본 명세서에 기재된 하나 이상의 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편에 노출시키는 단계를 수반하지만; 본 방법은 또한 샘플에 존재하는 CD123의 양을 정량화하는 단계; 샘플에 존재하는 CD123의 양을 알려진 표준 또는 참조 샘플과 대비하는 단계; 및 대상체의 CD123 수준이 암과 관련된 CD123의 수준 내에 있는지의 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
또한, 대상체에서 CD123-발현 암을 모니터링하는 방법이 본 명세서에 기재된다. 기재된 방법은 생물학적 샘플을 본 명세서에 기재된 하나 이상의 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편에 노출시키는 단계; 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 의해 결합된 샘플에 존재하는 CD123의 양을 정량화하는 단계; 샘플에 존재하는 CD123의 양을 알려진 표준 또는 참조 샘플 또는 대상체로부터 미리 획득된 유사한 샘플 중의 CD123의 양과 대비하는 단계; 및 대상체의 CD123 수준이, 비교된 샘플들 중의 CD123의 양의 차이에 기초하여 암 진행, 퇴행 또는 안정된 질병을 나타내는지의 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
대상체로부터 획득되거나 유래된 샘플은 소변, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 복수(ascites), 순환 세포, 순환 종양 세포, 조직과 관련되지 않은 세포, 조직, 외과적으로 절제된 종양 조직, 생검, 미세 바늘 흡인 샘플, 또는 조직 프레파라트(histological preparation)와 같은 생물학적 샘플이다.
기재된 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 기재된 방법, 또는 당업자에게 알려진 다른 방법과 함께 사용하기 위해 표지화될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 방사성표지, 형광 표지, 에피토프 태그, 비오틴, 발색단 표지, ECL 표지, 효소, 루테늄, 111In-DOTA, 111In-다이에틸렌트라이아민펜타아세트산(DTPA), 고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제 및 베타-갈락토시다제, 또는 폴리-히스티딘 또는 당업계에 알려진 유사한 그러한 표지로 표지화될 수 있다.
CD123-특이적 항체 키트
개시된 CD123-특이적 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 키트가 본 명세서에 기재된다. 기재된 키트는 본 명세서에 제공된 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편을 사용하는 방법, 또는 당업자에게 알려진 다른 방법을 수행하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 기재된 키트는 본 명세서에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편 및 생물학적 샘플에서 CD123의 존재를 검출하는 데 사용하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 따라서, 기재된 키트는 본 명세서에 기재된 하나 이상의 항체 또는 그의 항원-결합 단편(들), 및 사용 중이 아닐 때 항체 또는 단편을 담기 위한 용기, 항체 또는 단편, 고체 지지체에 부착된 항체 또는 단편, 및/또는 항체 또는 단편의 검출가능하게 표지화된 형태의 사용에 대한 설명서를 포함할 수 있으며, 이는 본 명세서에 기재된 바와 같다.
CD123 × CD3 다중특이성 항체
CD123 및 CD3에 결합하는 단리된 다중특이성 항체("CD123 × CD3 다중특이성 항체") 및 그의 다중특이성 항원-결합 단편이 본 명세서에 기재된다. 일부 실시 형태에서, CD123 SP2(IL3-Rα) 및 CD123 SP1(IL3-Rα)에 면역특이적으로 결합하는, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 제공된다.
일부 실시 형태에서, 다중특이성 항체의 CD123-특이적 아암(arm)은 인간 CD123 및/또는 사이노몰거스 원숭이 CD123에 결합한다. 일부 실시 형태에서, CD123 × CD3 다중특이성 항체 또는 항원-결합 단편의 CD123-특이적 아암은 인간 CD123의 SP1 및/또는 SP2 단편에 결합한다. 바람직한 실시 형태에서, CD123 × CD3 다중특이성 항체 또는 항원-결합 단편은 이중특이성 항체 또는 항원-결합 단편이다. 일부 실시 형태에서, a) 제1 중쇄(HC1); b) 제2 중쇄(HC2); c) 제1 경쇄(LC1); 및 d) 제2 경쇄(LC2)를 포함하며, HC1과 LC1이 쌍을 이루어서 CD123(IL3-Rα)에 면역특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위를 형성하고, HC2와 LC2가 쌍을 이루어서 CD3에 면역특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 형성하는, 단리된 CD123(IL3-Rα) × CD3 이중특이성 항체 또는 그의 CD123(IL3-Rα) × CD3 이중특이성 결합 단편이 제공된다. 다른 실시 형태에서, 항체 또는 이중특이성 결합 단편을 발현하는 단리된 세포가 제공된다. 일부 실시 형태에서, CD123 × CD3 다중특이성 항체의 CD123-결합 아암(또는 "CD123-특이적 아암")은 본 명세서에 기재된 CD123 항체로부터(예를 들어, 표 1에 열거된 CDR 서열을 갖는 항체로부터) 유래된다.
일부 실시 형태에서, CD123 × CD3 다중특이성 항체 또는 항원-결합 단편의 CD123-특이적 아암은 IgG 또는 그의 유도체이다. 일부 실시 형태에서, 기재된 CD123 × CD3 다중특이성 항체는 표면 플라즈몬 공명, 또는 MSD-CAT에 의해 측정될 때 5 nM 이하의 해리 상수로 CD123에 결합할 수 있다.
일부 실시 형태에서, CD123 × CD3 다중특이성 항체의 CD3-결합 아암(또는 "CD3-특이적 아암")은 마우스 IgG3/람다 동종형인 마우스 단일클론 항체 SP34로부터 유래된다. (문헌[Pessano, S., etal, 1995. EMBO J. 4, 337-344]). 일부 실시 형태에서, CD123 × CD3 다중특이성 항체의 CD3-결합 아암은 표 2로부터 선택되는 하나의 VH 도메인 및 하나의 VL 도메인을 포함한다. 표 2는 CD3-특이적 항체 및 항원-결합 단편의 일부 중쇄 및 경쇄의 예의 요약을 제공한다.
[표 2]
Figure pct00003
일부 실시 형태에서, CD3-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 표 3으로부터의 중쇄 및 표 3으로부터의 경쇄를 포함한다. 표 3은 CD3-특이적 항체 및 항원-결합 단편의 중쇄 및 경쇄의 매트릭스의 요약을 제공한다.
[표 3]
Figure pct00004
IgG 부류는 인간에서 하기의 4가지 동종형으로 세분된다: IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4. 이들은 Fc 영역의 아미노산 서열에서 95% 초과의 상동성을 공유하지만, 힌지 영역의 아미노산 조성 및 구조에서 큰 차이를 나타낸다. Fc 영역은 효과기 기능, 예컨대 항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC) 및 보체-의존성 세포독성(CDC)을 매개한다. ADCC에서는, 항체의 Fc 영역이 자연 살해세포 및 대식세포와 같은 면역 효과기 세포의 표면 상의 Fc 수용체(FcgR)에 결합하여, 표적화된 세포의 식세포작용 또는 용해로 이어진다. CDC에서는, 항체가 세포 표면에서 보체 캐스케이드를 촉발시킴으로써 표적화된 세포를 살해한다.
치료적 항체의 많은 응용에 있어서, Fc-매개 효과기 기능은 작용 기전의 일부가 아니다. 이들 Fc-매개 효과기 기능은 탈기전 독성을 야기함으로써 유해할 수 있고 잠재적으로 안전성 위험을 제기할 수 있다. Fc 영역을 조작하여 FcgR 또는 보체 인자에 대한 그의 결합을 감소시킴으로써 효과기 기능의 변형이 달성될 수 있다. 활성화 FcgR(FcgRI, FcgRIIa, FcgRIIIa 및 FcgRIIIb) 및 억제성 FcgR(FcgRIIb) 또는 제1 보체 성분(C1q)에 대한 IgG의 결합은 힌지 영역 및 CH2 도메인에 위치된 잔기에 의존한다. Fc 기능성을 감소 또는 침묵시키기 위해 돌연변이가 IgG1, IgG2 및 IgG4에 도입되어 왔다. 침묵 돌연변이는 IgG1 AA(F234A, L235A), 또는 IgG4 PAA(S228P, F234A, L235A), 또는 IgG2 AA(V234A, G237A), 또는 IgG1 FEA(L234F, L235E, D265A), 또는 IgG1 FES(L234F/L235E/P331S)를 포함할 수 있지만 이로 한정되지 않는다.
일 실시 형태에서, 항체는 하기 특성들 중 하나 이상을 갖는 Fc 영역을 포함한다: (a) 모 Fc와 비교할 때 감소된 효과기 기능; (b) Fcg RI, Fcg RIIa, Fcg RIIb, Fcg RIIIb 및/또는 Fcg RIIIa에 대한 감소된 친화성; (c) FcgRI에 대한 감소된 친화성; (d) FcgRIIa에 대한 감소된 친화성; (e) FcgRIIb에 대한 감소된 친화성; (f) Fcg RIIIb에 대한 감소된 친화성; 또는 (g) FcgRIIIa에 대한 감소된 친화성.
일부 실시 형태에서, 다중특이성 항체의 CD3-특이적 아암의 유래가 되는 CD3-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 IgG 또는 그의 유도체이다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성 항체의 CD3-특이적 아암의 유래가 되는 CD3-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 IgG1 또는 그의 유도체이다. 일부 실시 형태에서, 예를 들어, CD3-결합 아암의 유래가 되는 CD3-특이적 IgG1 항체의 Fc 영역은 그의 Fc 영역 내에 L234A, L235A, 및 F405L 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성 항체의 CD3-특이적 아암의 유래가 되는 CD3-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 IgG4 또는 그의 유도체이다. 일부 실시 형태에서, 예를 들어, CD3-결합 아암의 유래가 되는 CD3-특이적 IgG4 항체의 Fc 영역은 그의 Fc 영역 내에 S228P, L234A, L235A, F405L, 및 R409K 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성 항체의 CD3-특이적 아암의 유래가 되는 CD3-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 IgG-AA Fc이다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성 항체의 CD3-특이적 아암의 유래가 되는 CD3-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 IgG-AA Fc-L234A, L235A, 및 F405L(여기서, L234A, L235A, 및 F405L은 돌연변이임)이다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성 항체의 CD3-특이적 아암의 유래가 되는 CD3-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 1차 인간 T 세포 및/또는 1차 사이노몰거스 T 세포 상의 CD3ε에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성 항체의 CD3-특이적 아암의 유래가 되는 CD3-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 1차 인간 CD4+ T 세포 및/또는 1차 사이노몰거스 CD4+ T 세포를 활성화한다. 일부 실시 형태에서, 기재된 CD123 × CD3 다중특이성 항체는 기지의 친화도를 갖는 표지화된 항-CD3 항체와의 경쟁 결합에 의해 결정될 때 500 nM 미만, 또는 100 nM 미만 또는 20 nM 미만의 해리 상수로 인간 또는 사이노몰거스 원숭이 T-세포 상의 CD3에 결합할 수 있다.
기재된 CD123 × CD3 다중특이성 항체에 더하여, 기재된 CD123 × CD3 다중특이성 항체를 인코딩할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열이 또한 제공된다. 일부 실시 형태에서, CD123(IL3-Rα) × CD3 이중특이성 항체 또는 이중특이성 결합 단편의 HC1, HC2, LC1 또는 LC2를 인코딩하는 단리된 합성 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 또한 제공되며, 마찬가지로 CD123 × CD3 다중특이성 항체를 발현하는 세포도 본 명세서에 제공된다. 개시된 벡터를 발현할 수 있는 세포가 또한 기재된다. 이들 세포는 포유류 세포(예컨대, 293F 세포, CHO 세포), 곤충 세포(예컨대, Sf7 세포), 효모 세포, 식물 세포, 또는 세균 세포(예컨대, E. 콜라이)일 수 있다. 기재된 항체는 또한 하이브리도마 세포에 의해 생성될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 세포를 배양함으로써 CD123(IL3-Rα) × CD3 이중특이성 항체 또는 이중특이성 결합 단편을 생성하기 위한 방법이 제공된다.
CD123(IL3-Rα) × CD3 다중특이성 항체 또는 항원-결합 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 본 명세서에 추가로 제공된다.
CD123 × CD3 다중특이성 항체의 사용 방법
기재된 CD123 × CD3 다중특이성 항체 및 그의 다중특이성 항원-결합 단편의 사용 방법이 또한 개시된다. 예를 들어, CD123 × CD3 다중특이성 항체 및 그의 다중특이성 항원-결합 단편은 CD123-발현 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 CD123-발현 암의 치료에 유용할 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD123-발현 암은 혈액암, 예컨대 급성 골수성 백혈병(AML), 골수이형성 증후군(MDS, 저위험 또는 고위험), 급성 림프구성 백혈병(ALL, 모든 아형을 포함함), 미만성 대 B-세포 림프종(DLBCL), 만성 골수성 백혈병(CML), 또는 아구성 형질세포양 수지상 세포 신생물(DPDCN)이다.
CD123-발현 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 CD123-발현 암을 치료하는 기재된 방법은 기재된 CD123 × CD3 다중특이성 항체 또는 그의 다중특이성 항원-결합 단편의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 대상체는 포유동물, 바람직하게는 인간이다. 바람직한 실시 형태에서, 암을 갖는 대상체를 치료하기 위한 방법이 제공되는데, 본 방법은 암을 치료하기에 충분한 시간 동안 암의 치료를 필요로 하는 환자에게 CD123(IL3-Rα) × CD3 이중특이성 항체 또는 이중특이성 항원-결합 단편의 치료적 유효량을 투여하는 것에 의한다.
암 세포의 성장 또는 증식을 억제하기 위한 방법이 본 명세서에 추가로 제공되는데, 본 방법은 CD123(IL3-Rα) × CD3 이중특이성 항체 또는 이중특이성 결합 단편의 치료적 유효량을 투여하여 암 세포의 성장 또는 증식을 억제하는 것에 의한다.
T 세포를 CD123-발현 암 세포로 방향전환(redirecting)시키는 방법이 본 명세서에 추가로 제공되는데, 본 방법은 CD123(IL3-Rα) × CD3 이중특이성 항체 또는 이중특이성 결합 단편의 치료적 유효량을 투여하여 T 세포를 암으로 방향전환시키는 것에 의한다.
CD123 × CD3-특이적 항체 키트
개시된 CD123 × CD3 다중특이성 항체를 포함하는 키트가 본 명세서에 기재된다. 기재된 키트는 본 명세서에 제공된 CD123 × CD3 다중특이성 항체를 사용하는 방법, 또는 당업자에게 알려진 다른 방법을 수행하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 기재된 키트는 본 명세서에 기재된 항체 및 CD123-발현 암을 치료하는 데 사용하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 따라서, 기재된 키트는 본 명세서에 기재된 하나 이상의 다중특이성 항체 또는 그의 다중특이성 항원-결합 단편(들), 및 사용 중이 아닐 때 항체 또는 단편을 담기 위한 용기, 및/또는 항체 또는 단편, 고체 지지체에 부착된 항체 또는 단편, 및/또는 항체 또는 단편의 검출가능하게 표지화된 형태의 사용에 대한 설명서를 포함할 수 있으며, 이는 본 명세서에 기재된 바와 같다.
도 1. 도 1은 CD123 세포외 도메인을 클로닝하는 데 사용되는 pDisplay 벡터를 나타낸다.
도 2. 도 2(도 2a, 도 2b, 및 도 2c)는 CD123 발현 세포에 대한 파지 패널 양성 결합제의 결합능(binding potential)을 입증한 세포 결합 검정을 나타낸다.
도 3. 도 3은 항체 패널과 항-CD123 항체 7G3 사이의 경쟁 ELISA를 나타낸다.
도 4. 도 4(도 4의 A 및 도 4의 B)는 CD123 세포-기반 STAT5 기능 검정을 나타낸다. 도 4의 C는 I3RB18 및 7G3 항체에 대한 용량-의존적 CD123 세포-기반 STAT5 기능 검정을 나타낸다.
도 5. 도 5(도 5의 A, 도 5의 B, 및 도 5의 C)는 AML 세포주, OCI-AML5 상에 발현된 내인성 CD123에 대한 Mab I3RB2, I3RB18, 및 7G3의 결합을 나타낸다.
도 6. 도 6(도 6의 A 및 도 6의 B)은 표지화된 I3RB2 및 I3RB18 mAb와 스크린에서 확인된 다른 항-CD123 Ab 사이의 경쟁 결합 검정을 나타낸다.
도 7. 도 7(도 7의 A(서열 번호 232) 및 도 7의 B(서열 번호 232))은 Fab의 존재 또는 부재 하에서의 CD123 SP2에 대한 중수소 수준의 차이를 보여주는 수소/중수소 교환-질량 분석(HDX-MS)에 의한 에피토프 맵핑 연구의 결과를 나타낸다.
도 8. 도 8은 CD123 SP2 ECD 및 scFv로부터 유래된 I3RB18의 공결정 구조에서 관찰된 CD123 sp2의 결합에 관여하는 항체 잔기를 나타낸다. 넘버링: CD123 sp2는 타원 내에 있고; I3RB18의 CDR은 사각형 내에 있음.
도 9. 도 9의 A는 CD123 sp2:I3RB18(B18로 표시됨)의 공결정 구조를 나타내고, 도 9의 B는 PDB 엔트리 4JZJ로부터의 mAb 7G3의 인간화된 형태인 CD123 sp1:CSL362 Fab의 공결정 구조를 나타낸다.
도 10. 도 10은 순차적 넘버링을 갖는 SP34의 아미노산 서열을 나타낸다. AbM 정의에서의 CDR(문헌[K.R. Abhinandan and A. C. Martin, 2008. Mol. Immunol. 45, 3832-3839])은 밑줄 그어져 있다. Ser230이 파파인-절단된 Fab에 존재하는 마지막 HC 잔기이다. 잔기 231-455는 IGHG3_MOUSE(마우스 IgG3, 아이소형(isoform) 2)로부터 유래된다.
도 11. 도 11은 도시된 VL/VH 계면에서 중요 잔기를 갖는 SP34의 가변 도메인을 나타낸다. VL 내의 잔기 38, 48, 및 51(표시됨)은 CDR-H3과 접촉 상태이다.
도 12. 도 12는 VH에 대한 인간 프레임워크 적응화("HFA") 변이체(보이는 순서대로 각각 서열 번호 5 및 184-187) 및 VL 에 대한 인간 프레임워크 적응화 변이체(보이는 순서대로 각각 서열 번호 4 및 188-190)를 나타낸다. 넘버링은 순차적이며; AbM 정의에서의 CDR은 밑줄 그어져 있고; SP34와 상이한 잔기는 볼드체로 강조되어 있고; HFA 변이체에서의 복귀 돌연변이는 볼드체이고 밑줄 그어져 있다.
도 13. 도 13은 1차 인간 T 세포에 대한 SP34 HFA 변이체의 결합을 나타낸다.
도 14. 도 14는 사이노몰거스 1차 T 세포에 대한 SP34 HFA 변이체의 결합을 나타낸다.
도 15. 도 15는 SP34 HFA 변이체가 1차 인간 T 세포를 시험관내에서 활성화함을 나타낸다. 음성 대조군은 백색으로 나타나 있고 양성 대조군은 흑색으로 나타나 있다.
도 16. 도 16은 SP34 HFA 변이체가 1차 사이노몰거스 T 세포를 시험관내에서 활성화함을 나타낸다. 음성 대조군은 백색으로 나타나 있고 양성 대조군은 흑색으로 나타나 있다.
도 17. 도 17은 SP34 HFA 변이체에 의한 결합과 활성화의 상관관계를 나타낸다. 인간(도 17의 A) 및 사이노몰거스(도 17의 B)에 대한 평균 결합 및 CD69 평균 형광 세기("MFI") 값이 서로에 대해 도표로 나타나 있다.
도 18. 도 18은 MV4-11 세포주에 대해 공여자 M6587(도 18의 A) 및 공여자 M7020(도 18의 B)에 대한 T-세포 매개 세포독성 검정을 나타낸다.
도 19. 도 19는 OCI-M2 세포주에 대해 공여자 M6587(도 19의 A) 및 공여자 M7020(도 19의 B)에 대한 T-세포 매개 세포독성 검정을 나타낸다.
도 20. 도 20은 OCI-AML 세포주에 대해 공여자 M6587(도 20의 A) 및 공여자 M7020(도 20의 B)에 대한 T-세포 매개 세포독성 검정을 나타낸다.
도 21. 도 21은 KG-1 종양 이종이식편(xenograft) 모델에서의 I3RB186의 효능을 나타낸다.
도 22. 도 22는 CD45+(도 22의 A) 및 CD8+/CD4+(도 22의 B)에서의 일수 30에서의 말초 혈액의 형광-활성화 세포 분류(FACS) 분석에 의한 KG-1 종양 이종이식편 모델에서의 I3RB186의 효능을 나타낸다.
도 23. 도 23은 CD45+(도 23의 A) 및 CD8+/CD4+(도 23의 B)에서 종양 삽입 후 일수 53에 말초 혈액의 FACS 분석에 의한 KG-1 종양 이종이식편 모델에서의 I3RB186의 효능을 나타낸다.
도 24. 도 24는 처리에 의한 체중 변화를 보여줌으로써 KG-1 종양 이종이식편 모델에서의 I3RB186의 효능을 나타낸다.
도 25. 도 25는 KG-1 종양 이종이식편 모델에서의 CD123 × CD3 이중특이성 Ab I3RB186의 효능을 대조군 널(null) 아암 이중특이성 Ab I3RB191 및 I3RB192와 함께 나타낸다.
도 26. 도 26은 CD45+(도 26의 A) 및 CD8+/CD4+(도 26의 B)에서의 종양 삽입 후 일수 36에 FACS 분석에 의한 KG-1 종양 이종이식편 모델에서의 CD123 × CD3 이중특이성 Ab I3RB186의 효능을 대조군 널 아암 이중특이성 Ab I3RB191 및 I3RB192와 함께 나타낸다.
도 27. 도 27은 CD45+(도 27의 A) 및 CD8+/CD4+(도 27의 B)에서의 종양 삽입 후 일수 63에 FACS 분석에 의한 KG-1 종양 이종이식편 모델에서의 CD123 × CD3 이중특이성 Ab I3RB186의 효능을 대조군 널 아암 이중특이성 Ab I3RB191 및 I3RB192와 함께 나타낸다.
도 28. 도 28은 처리에 의한 체중 변화를 보여줌으로써 KG-1 종양 이종이식편 모델에서의 CD123 × CD3 이중특이성 Ab I3RB186의 효능을 대조군 널 아암 이중특이성 Ab I3RB191 및 I3RB192와 함께 나타낸다.
도 29. 도 29는 사용된 포화 결합 곡선이 1차 인간 T 세포(도 29의 A) 및 사이노몰거스 원숭이 T 세포(도 29의 B) 상에서의 SP34-2에 대한 세포 결합 친화도(Kd)를 결정함을 나타낸다.
도 30. 표 30은 표지화된 항체를 사용하는 1차 인간 T 세포(도 30의 A) 및 사이노몰거스 원숭이 T 세포(도 30의 B) 상에서의 경쟁 결합 실험을 나타낸다. Alexa FluorR 488B146, 및 증가하는 농도의 비표지화된 CD123 × CD3 항체.
도 31. 도 31은 OCI-AML 세포주에 대해 공여자 M6948(도 31의 A) 및 공여자 M6521(도 31의 B)에 대한 T-세포 매개 세포독성 검정을 나타낸다.
도 32. 도 32는 KG-1 세포주에 대해 공여자 M6948(도 32의 A) 및 공여자 M6521(도 32의 B)에 대한 T-세포 매개 세포독성 검정을 나타낸다.
도 33. 도 33은 JIM3 세포주에 대해 공여자 M6948(도 33의 A) 및 공여자 M6521(도 33의 B)에 대한 T-세포 매개 세포독성 검정을 나타낸다.
도 34. 도 34의 A, B, C 및 D는 I3RB218(도 34의 A), 8747(도 34의 B), I3RB217(도 34의 C) 및 7959(도 34의 D)에 대한 CD123 및 CD131의 IL-3 유도 이종복합체화에 대한 CD123 × CD3 항체의 효과를 나타낸다.
도 35. 도 35는 평균 종양 부피의 비교에 의한 KG-1 종양 이종이식편 모델에서의 CD123 × CD3 Ab 7959, 및 Ab 9958의 효능을 나타낸다.
도 36. 도 36은 평균 종양 부피의 비교에 의한 KG-1 종양 이종이식편 모델에서의 CD123 × CD3 Ab 3978의 효능을 나타낸다.
도 37. 도 37은 평균 종양 부피의 비교에 의한 KG-1 종양 이종이식편 모델에서의 CD123 × CD3 Ab 8747의 효능을 나타낸다.
도 38. 도 38은 평균 종양 부피의 비교에 의한 KG-1 종양 이종이식편 모델에서의 CD123 × CD3 Ab 8876의 효능을 나타낸다.
도 39. 도 39는 처리에 의한 체중 변화의 비교에 의한 KG-1 종양 이종이식편 모델에서의 CD123 × CD3 Ab 7959, 및 Ab 9958의 효능을 나타낸다.
도 40. 도 40은 처리에 의한 체중 변화의 비교에 의한 KG-1 종양 이종이식편 모델에서의 CD123 × CD3 Ab 3978의 효능을 나타낸다.
도 41. 도 41은 처리에 의한 체중 변화의 비교에 의한 KG-1 종양 이종이식편 모델에서의 CD123 × CD3 Ab 8747의 효능을 나타낸다.
도 42. 도 42는 처리에 의한 체중 변화의 비교에 의한 KG-1 종양 이종이식편 모델에서의 CD123 × CD3 Ab 8876의 효능을 나타낸다.
도 43. 도 43은 CD123 × CD3 이중특이성 항체 3978, 7955, 7959, 9958의 생체내 마우스 PK를 나타낸다.
정의
상세한 설명의 태양과 관련된 다양한 용어가 본 명세서 및 청구범위 전체에 걸쳐 사용된다. 이러한 용어는 달리 지시되지 않으면 본 기술 분야에서의 그의 통상적인 의미로 주어져야 한다. 다른 구체적으로 정의된 용어는 본 명세서에 제공된 정의와 일치하는 방식으로 해석된다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수형("a", "an" 및 "the")은 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않으면, 복수의 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "세포"에 대한 언급은 2개 이상의 세포의 조합 등을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 측정가능한 값, 예컨대 양, 시간적 지속기간 등을 지칭할 때 용어 "약"은 지정된 값으로부터 최대 ±10%의 변동을 포함함을 의미하는데, 이러한 변동은 개시된 방법을 수행하기에 적절하기 때문이다. 달리 지시되지 않는 한, 본 명세서 및 청구범위에 사용되는 성분의 양, 특성, 예컨대 분자량, 반응 조건 등을 표현하는 모든 수는 모든 경우에 용어 "약"에 의해 수식된 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 반대로 나타내지 않는 한, 하기의 명세서 및 첨부된 청구범위에 기재된 수치 파라미터는 근사치로, 이는 본 발명에 의해 얻고자 하는 원하는 특성에 따라 변동될 수 있다. 적어도, 그리고 청구범위의 범주와 동등한 원칙의 응용을 제한하려는 시도로서가 아니라, 각각의 수치 파라미터는 적어도, 보고된 유효 숫자의 개수를 고려하여 그리고 통상적인 반올림 기법을 적용함으로써 해석되어야 한다.
본 발명의 넓은 범주를 나타내는 수치 범위 및 파라미터가 근사치임에도 불구하고, 구체적인 실시예에 기재된 수치들은 가능한 한 정확하게 기록하였다. 그러나, 임의의 수치는 그들 각자의 시험 측정에서 발견되는 표준 편차로부터 반드시 유래하는 소정의 오차를 본질적으로 포함한다.
"단리된"은 생물학적 성분(예컨대, 핵산, 펩티드 또는 단백질)이, 그러한 성분이 천연 발생하는 유기체의 다른 생물학적 성분들, 즉 다른 염색체 또는 염색체외 DNA 및 RNA, 및 단백질로부터 사실상 분리되거나, 따로 생성되거나, 또는 따로 정제되었음을 의미한다. 따라서, "단리된" 핵산, 펩티드 및 단백질은 표준 정제 방법에 의해 정제된 핵산 및 단백질을 포함한다. "단리된" 핵산, 펩티드 및 단백질은 조성물의 일부일 수 있고, 그러한 조성물이 핵산, 펩티드, 또는 단백질의 천연 환경의 일부가 아닌 경우 여전히 단리될 수 있다. 이 용어는 또한 숙주 세포에서의 재조합 발현에 의해 제조된 핵산, 펩티드 및 단백질뿐만 아니라 화학적으로 합성된 핵산도 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "단리된" 항체 또는 항원-결합 단편은 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체 또는 항원-결합 단편이 사실상 없는 항체 또는 항원-결합 단편을 지칭하고자 한다(예를 들어, CD123에 특이적으로 결합되는 단리된 항체에는 CD123 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 사실상 없다). 그러나, CD123의 에피토프, 아이소형 또는 변이체에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는, 예를 들어 다른 종 유래의 다른 관련 항원(예컨대, CD123 종 상동체)에 대한 교차반응성을 가질 수 있다.
"폴리뉴클레오티드" - 동의어로 "핵산 분자", "뉴클레오티드" 또는 "핵산"으로 지칭됨 - 는 임의의 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 지칭하며, 이는 비변형된 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있다. "폴리뉴클레오티드"는, 제한 없이, 단일- 및 이중-가닥 DNA, 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 DNA, 단일- 및 이중-가닥 RNA, 및 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 RNA, 단일-가닥, 또는 더 전형적으로는 이중-가닥일 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하거나 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물을 포함하는 혼성(hybrid) 분자를 포함한다. 게다가, "폴리뉴클레오티드"는 RNA 또는 DNA 또는 RNA 및 DNA 둘 모두를 포함하는 삼중-가닥 영역을 지칭한다. 용어 폴리뉴클레오티드는 또한 하나 이상의 변형된 염기를 함유하는 DNA 또는 RNA, 및 안정성 또는 다른 이유로 골격이 변형된 DNA 또는 RNA를 포함한다. "변형된" 염기는, 예를 들어 트리틸화(tritylated) 염기 및 통상이 아닌 염기, 예컨대 이노신을 포함한다. DNA 및 RNA에 대해 다양한 변형이 이루어질 수 있으며; 이에 따라, "폴리뉴클레오티드"는 천연에서 전형적으로 발견되는 바와 같은 화학적으로, 효소적으로 또는 대사적으로 변형된 형태의 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라, 바이러스 및 세포에 특징적인 화학적 형태의 DNA 및 RNA도 포함한다. "폴리뉴클레오티드"는, 종종 올리고뉴클레오티드로 지칭되는 비교적 짧은 핵산 쇄를 또한 포함한다.
"사실상 동일한"이라는 의미는 그 용어가 사용되는 문맥에 따라 상이할 수 있다. 중쇄 및 경쇄, 그리고 그들을 인코딩하는 유전자 중에서 존재할 가능성이 높은 천연 서열 변이로 인해, 본 명세서에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편을 인코딩하는 아미노산 서열 또는 유전자 내에는 약간의 수준의 변이가 발견될 것으로 예측될 것인데, 이때 이러한 변이는 그들의 고유 결합 특성(예를 들어, 특이성 및 친화도)에 대해 거의 또는 전혀 영향을 주지 않는다. 그러한 예측은 유전자 코드의 축퇴성뿐만 아니라, 보존적 아미노산 서열 변이의 진화적 성공에도 부분적으로 기인되는데, 이때 이는 인코딩된 단백질의 성질을 크게 변경시키지 않는다. 따라서, 핵산 서열과 관련하여, "사실상 동일한"은 2개 이상의 서열들 사이의 적어도 65% 동일성을 의미한다. 바람직하게는, 이 용어는 2개 이상의 서열들 사이의 적어도 70% 동일성, 더 바람직하게는 적어도 75% 동일성, 더 바람직하게는 적어도 80% 동일성, 더 바람직하게는 적어도 85% 동일성, 더 바람직하게는 적어도 90% 동일성, 더 바람직하게는 적어도 91% 동일성, 더 바람직하게는 적어도 92% 동일성, 더 바람직하게는 적어도 93% 동일성, 더 바람직하게는 적어도 94% 동일성, 더 바람직하게는 적어도 95% 동일성, 더 바람직하게는 적어도 96% 동일성, 더 바람직하게는 적어도 97% 동일성, 더 바람직하게는 적어도 98% 동일성, 그리고 더 바람직하게는 적어도 99% 또는 그 이상의 동일성을 지칭한다. 2개의 서열들 사이의 퍼센트 동일성은 서열들에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수(즉, % 상동성 = 동일한 위치의 수/위치의 총수 × 100)이며, 이때 2개의 서열의 최적의 정렬을 위해 도입되어야 할 필요가 있는 갭(gap)의 수, 및 각각의 갭의 길이를 고려한다. 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열들 사이의 퍼센트 동일성은, 예를 들어, PAM120 가중치 잔기(weight residue) 표, 12의 갭 길이 페널티 및 4의 갭 페널티를 사용하여, ALIGN 프로그램(버전 2.0) 내로 포함된 문헌[E. Meyers and W. Miller, Comput. Appl. Biosci 4, 11-17 (1988)]의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 게다가, 2개의 아미노산 서열들 사이의 퍼센트 동일성은 문헌[Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48, 444-453 (1970)]의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다.
단백질 기능에 대해 사실상 영향을 주지 않고서 단백질의 아미노산 서열 내에서 일어날 수 있는 변이의 정도는 핵산 서열의 변이의 정도보다 훨씬 더 낮은데, 동일한 축퇴성 원리가 아미노산 서열에는 적용되지 않기 때문이다. 따라서, 항체 또는 항원-결합 단편과 관련하여, "사실상 동일한"은 기재된 항체 또는 항원-결합 단편과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 항체 또는 항원-결합 단편을 의미한다. 다른 실시 형태는, 프레임워크, 스캐폴드, 또는 본 명세서에 기재된 항체 및 항원-결합 단편과 상당한 동일성을 공유하지 않고, 본 명세서에 기재된 그러한 서열과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 결합을 제공하는 데 필요한 하나 이상의 CDR 또는 다른 서열을 포함하는 다른 비결합 영역을 갖는 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편을 포함한다. "벡터"는 레플리콘, 예컨대 플라스미드, 파지, 코스미드, 또는 바이러스이며, 이것 내에 다른 핵산 절편이 작동가능하게 삽입되어 절편의 복제 또는 발현을 일으키도록 할 수 있다.
"클론"은 단세포 또는 공통된 조상으로부터 유사분열에 의해 유래된 세포들의 집단이다. "세포주"는 많은 세대 동안 시험관내에서 안정한 성장이 가능한 1차 세포의 클론이다. 본 명세서에 제공된 일부 예에서는, 세포를 DNA로 형질감염시킴으로써 세포가 형질전환된다.
용어 "발현하다" 및 "생성하다"는 본 명세서에서 동의어로 사용되고, 유전자 산물의 생합성을 지칭한다. 이들 용어는 RNA로의 유전자의 전사를 포함한다. 이들 용어는 또한 하나 이상의 폴리펩티드로의 RNA의 번역을 포함하고, 모든 천연 발생 전사 후 및 번역 후 변형을 추가로 포함한다. 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 발현 또는 생성은 세포의 세포질 내에서 행해지거나, 또는 세포외 환경, 예컨대 세포 배양의 성장 배지 내로 행해질 수 있다.
용어 "치료하는" 또는 "치료"는 손상, 병리 또는 상태의 약화 또는 개선의 임의의 성공 또는 성공 징후를 지칭하는 것으로, 이에는 증상의 감퇴, 관해, 감소와 같은, 또는 상태를 환자가 더 참을 수 있게 하거나, 퇴화 또는 저하 속도를 늦추거나, 퇴화의 최종점을 덜 쇠약하게 하거나, 대상체의 신체적 또는 정신적 웰빙(well-being)을 개선하거나, 생존 기간을 연장시키는, 임의의 객관적 또는 주관적 파라미터가 포함된다. 치료는 신체 검사, 신경학적 검사, 또는 정신 감정의 결과를 포함한 객관적 또는 주관적 파라미터에 의해 평가될 수 있다.
"유효량" 또는 "치료적 유효량"은 필요한 투여량에서 그리고 필요한 시간 동안 원하는 치료적 결과를 달성하는 데 유효한 양을 지칭한다. CD123 × CD3 항체의 치료적 유효량은 개체의 질병 상태, 연령, 성별, 및 체중, 그리고 항체가 개체에서 원하는 반응을 유도하는 능력과 같은 인자들에 따라 변동될 수 있다. 또한, 치료적 유효량은 항체 또는 항체 부분의 임의의 독성 효과 또는 유해 효과보다 치료적으로 유익한 효과가 더 큰 것이다.
"항체"는, 달리 명시되지 않는 한, 다양한 단량체 형태, 중합체 형태 및 키메라 형태를 포함한 면역글로불린의 모든 동종형(IgG, IgA, IgE, IgM, IgD, 및 IgY)을 지칭한다. 구체적으로, 용어 "항체"에는 다중클론 항체, 단일클론 항체(mAb), 및 항체-유사 폴리펩티드, 예컨대 키메라 항체 및 인간화 항체가 포함된다.
항원-결합 단편은 특정 항원에 대해 결합 친화성을 나타낼 수 있는 임의의 단백질성 구조(proteinaceous structure)이다. 항원-결합 단편은 임의의 알려진 기법, 예컨대 효소적 절단, 펩티드 합성, 및 재조합 기법에 의해 제공된 것들을 포함한다. 일부 항원-결합 단편은 모 항체 분자의 항원-결합 특이성을 보유하는 온전한 항체의 일부분으로 구성된다. 예를 들어, 항원-결합 단편은 특정 항원에 결합하는 것으로 알려진 항체의 적어도 하나의 가변 영역(중쇄 또는 경쇄 가변 영역) 또는 하나 이상의 CDR을 포함할 수 있다. 적합한 항원-결합 단편의 예에는, 제한 없이, 다이아바디(diabody) 및 단일쇄 분자뿐만 아니라, Fab, F(ab')2, Fc, Fabc, 및 Fv 분자, 단일쇄(Sc) 항체, 개별 항체 경쇄, 개별 항체 중쇄, 항체 쇄 또는 CDR과 다른 단백질, 단백질 스캐폴드 사이의 키메라 융합, 중쇄 단량체 또는 이량체, 경쇄 단량체 또는 이량체, 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄로 이루어진 이량체, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편, 또는 국제 특허 출원 공개 WO2007059782호에 기재된 바와 같은 1가 항체, 힌지 영역에서 이황화물 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편, VH 및 CH1 도메인으로 본질적으로 이루어진 Fd 단편; 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 본질적으로 이루어진 Fv 단편, dAb 단편(문헌[Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989)]) - 이는 VH 도메인으로 본질적으로 이루어지고, 도메인 항체로도 불림(문헌[Holt et al; Trends Biotechnol. 2003 Nov.; 21(11):484-90]); 카멜리드(camelid) 또는 나노바디(nanobody)(문헌[Revets et al; Expert Opin Biol Ther. 2005 Jan.; 5(1):111-24]); 단리된 상보성 결정 영역(CDR) 등도 포함한다. 모든 항체 동종형이 항원-결합 단편을 생성하는 데 사용될 수 있다. 추가적으로, 항원-결합 단편은 주어진 관심 항원에 대해 친화성을 부여하는 배향으로 폴리펩티드 절편을 성공적으로 포함시킬 수 있는 비항체 단백질성 프레임워크, 예컨대 단백질 스캐폴드를 포함할 수 있다. 항원-결합 단편은 재조합적으로 생성되거나 온전한 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생성될 수 있다. 문구 "항체 또는 그의 항원-결합 단편"은 주어진 항원-결합 단편이 이 문구에 언급된 항체의 하나 이상의 아미노산 절편을 포함함을 나타내기 위해 사용될 수 있다.둘 이상의 항체 또는 항원-결합 단편과 관련하여 본 명세서에서 사용될 때, 용어 "~와 경쟁한다" 또는 "~와 교차-경쟁한다"는 둘 이상의 항체 또는 항원-결합 단편이 CD123에 결합하기 위하여 경쟁함을, 예를 들어 실시예 9에 기재된 검정에서 CD123 결합을 위하여 경쟁함을 나타낸다. 항체 또는 항원-결합 단편의 일부 쌍의 경우, 실시예의 검정에서의 경쟁 또는 차단이 하나의 항체가 플레이트 상에 코팅되고 다른 하나가 경쟁하기 위해 사용되는 경우에만 단지 관찰되고, 역으로는 성립되지 않는다. 문맥에 의해 달리 정의되거나 부인되지 않는 한, 본 명세서에서 사용될 때 용어 "~와 경쟁한다" 또는 "~와 교차-경쟁한다"는 또한 그러한 쌍의 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하고자 한다.
용어 "에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정인자를 의미한다. 에피토프는 통상 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 표면 그룹화(grouping)로 이루어지며, 통상 특이적인 3차원 구조 특징뿐만 아니라 특이적인 전하 특징도 갖는다. 입체형태 및 비입체형태 에피토프는 전자에 대한 결합이 변성 용매의 존재 하에서 소실되나 후자는 그렇지 않다는 점에서 구별된다. 에피토프는 결합에 직접 관여하는 아미노산 잔기, 및 결합에 직접 관여하지 않는 다른 아미노산 잔기, 예컨대 특이적 항원 결합 펩티드에 의해 효과적으로 차단되거나 덮이는 아미노산 잔기(다시 말하면, 이러한 아미노산 잔기는 특이적 항원 결합 펩티드의 풋프린트(footprint) 내에 있음)를 포함할 수 있다.
항체 또는 항체 단편과 관련하여 사용될 때, "특이적 결합" 또는 "면역특이적 결합" 또는 이들의 파생어는, 혼합된 분자 집단을 함유하는 샘플 중의 다른 분자에 우선적으로 결합하지 않고서, 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자의 단편에 의해 인코딩된 도메인을 통한 관심 단백질의 하나 이상의 에피토프에 대한 결합을 나타낸다. 전형적으로, 항체는 표면 플라즈몬 공명 검정 또는 세포 결합 검정에 의해 측정될 때 약 1×10-8 M 미만의 Kd로 동종 항원에 결합한다. "[항원]-특이적" 항체(예를 들어, CD123-특이적 항체)와 같은 문구는 언급된 항체가 언급된 항원에 특이적으로 결합함을 나타내고자 한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "kd"(sec-1)는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도 상수를 지칭한다. 상기 값은 koff 값으로 지칭되기도 한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "ka"(M-1 sec-1)는 특정 항체-항원 상호작용의 회합 속도 상수를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "KD"(M)는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 평형 상수를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "KA"(M-1)는 특정 항체-항원 상호작용의 회합 평형 상수를 지칭하고, ka를 kd로 나눔으로써 얻어진다.
용어 "대상체"는 인간 및 비인간 동물을 지칭하며, 비인간 동물에는 모든 척추동물, 예를 들어 포유동물 및 비포유동물, 예컨대 비인간 영장류, 마우스, 토끼, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류, 및 파충류가 포함된다. 기재된 방법의 많은 실시 형태에서, 대상체는 인간이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "샘플"은 대상체로부터 단리된, 유사한 유체, 세포, 또는 조직(예를 들어, 외과적으로 절제된 종양 조직, 생검 - 미세 바늘 흡인물을 포함함)의 수집물뿐만 아니라, 대상체 내에 존재하는 유체, 세포, 또는 조직도 지칭한다. 일부 실시 형태에서, 샘플은 생물학적 유체이다. 생물학적 유체는 전형적으로 생리학적 온도의 액체이고, 대상체 또는 생물학적 공급원에 존재하거나, 그로부터 적출되거나, 발현되거나 달리 추출되는 천연 발생 유체를 포함할 수 있다. 소정의 생물학적 유체는 특정 조직, 기관 또는 국부 영역으로부터 유래되고, 소정의 다른 생물학적 유체는 대상체 또는 생물학적 공급원 내에 더 전체적으로 또는 전신적으로 위치될 수 있다. 생물학적 유체의 예에는 혈액, 혈청 및 장막 유체, 혈장, 림프, 소변, 타액, 낭액(cystic fluid), 눈물, 대변, 가래, 분비성 조직 및 기관의 점막 분비물, 질 분비물, 복수, 예컨대 비고형 종양과 관련된 것들, 흉막, 심막, 복막, 복부 및 기타 체강의 유체, 기관지 세척액에 의해 수집된 유체 등이 포함된다. 생물학적 유체는 또한 대상체 또는 생물학적 공급원과 접촉된 액체 용액, 예를 들어, 세포 및 기관 배양 배지 - 세포 또는 기관 컨디셔닝된 배지를 포함함 -, 세척액 등을 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "샘플"은 대상체로부터 적출된 물질 또는 대상체에 존재하는 물질을 포함한다.
"기지 표준물"은 기지량 또는 기지 농도의 CD123을 갖는 용액일 수 있으며, 여기서 이 용액은 천연 발생 용액, 예컨대 초기, 중기, 말기, 진행성, 또는 정지(static) 암을 갖는 것으로 알려진 환자로부터의 샘플일 수 있거나, 이 용액은 합성 용액, 예컨대 기지량의 CD123이 희석된 완충수일 수 있다. 본 명세서에 기재된 기지 표준물은 대상체로부터 단리된 CD123, 재조합 또는 정제된 CD123 단백질, 또는 질병 상태와 관련된 CD123 농도의 값을 포함할 수 있다.
용어 "CD3"은 인간 CD3 단백질 다중-하위단위(multi-subunit) 복합체를 지칭한다. CD3 단백질 다중-하위단위 복합체는 6개의 독특한 폴리펩티드 쇄로 구성된다. 이들은 CD3γ 쇄(SwissProt P09693), CD3δ 쇄(SwissProt P04234), 2개의 CD3ε 쇄(SwissProt P07766), 및 하나의 CD3ζ 쇄 동종이량체(SwissProt 20963) - 그리고 이는 T 세포 수용체 α 및 β 쇄와 관련됨 - 를 포함한다. 용어 "CD3"은, 달리 기재되지 않는 한, 임의의 CD3 변이체, 아이소형 및 종 상동체를 포함하는데, 이는 세포(T 세포를 포함함)에 의해 천연 발현되거나 또는 그러한 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자 또는 cDNA로 형질감염된 세포 상에서 발현될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "IL-3 수용체의 알파 하위단위", "IL3Rα", "CD123", "IL3Rα 쇄" 및 "IL3Rα 하위단위"는, 인터류킨-3(IL3)에 면역결합하는, 백혈병 전구 세포 상에서 검출가능한 항원 결정기(antigenic determinant)를 상호교환 가능하게 지칭한다. 구체적인 실시 형태에서, CD123은 인간 CD123이다. 구체적인 실시 형태에서, CD123은 사이노몰거스 원숭이 CD123이다. 구체적인 실시 형태에서, CD123은 CD123 SP1이다. 구체적인 실시 형태에서, CD123은 CD123 SP2이다. 용어 "CD123"은, 달리 기재되지 않는 한, 임의의 CD123 변이체, 아이소형 및 종 상동체를 포함한다.
"CD123 × CD3 항체"는 다중특이성 항체, 선택적으로 이중특이성 항체이며, 이중특이성 항체는 2개의 상이한 항원-결합 영역을 포함하는데, 이들 중 하나는 항원 CD123에 특이적으로 결합하고, 이들 중 하나는 CD3에 특이적으로 결합한다. 다중특이성 항체는 이중특이성 항체, 다이아바디, 또는 유사한 분자일 수 있다(예를 들어, 다이아바디에 대한 설명을 위해 문헌[PNAS USA 90(14), 6444-8 (1993)]을 참조한다). 본 명세서에 제공된 이중특이성 항체, 다이아바디 등은 CD123의 일부분에 더하여 임의의 적합한 표적에 결합할 수 있다. 용어 "이중특이성 항체"는 상이한 항체 서열에 의해 한정된 2개의 상이한 항원-결합 영역을 갖는 항체로서 이해되어야 한다. 이는 상이한 표적 결합으로서 이해될 수 있지만, 하나의 표적 내의 상이한 에피토프들에 대한 결합도 마찬가지로 포함한다.
"참조 샘플"은 다른 샘플, 예컨대 시험 샘플과 대비될 수 있는 샘플인데, 이러한 대비는 비교된 샘플의 특성화를 가능하게 한다. 참조 샘플은 시험 샘플과의 비교를 위한 기초로서의 역할을 하는 일부 특성화된 특성을 가질 것이다. 예를 들어, 참조 샘플은 암을 갖는 대상체를 나타내는 CD123 수준에 대한 벤치마크로서 사용될 수 있다. 참조 샘플은 반드시 시험 샘플과 동시에 분석되어야 하는 것은 아니며, 이에 따라 일부 경우에, 참조 샘플은 주어진 조건을 특성화하도록 미리 결정된 수치값 또는 수치 범위, 예컨대 대상체에서 암을 나타내는 CD123 수준일 수 있다. 이 용어는 또한 생리학적 상태 또는 질병 상태, 예컨대 CD123-발현 암과 관련된 것으로 알려져 있지만 미지량의 CD123을 갖는, 비교 목적으로 사용되는 샘플을 포함한다.
CD123-발현 암의 진행과 관련하여 사용되는 바와 같이, 용어 "진행"은 덜 심각한 상태로부터 더 심각한 상태로의 암의 변화를 포함한다. 이는 종양의 수 또는 중증도, 전이 정도, 암이 성장하거나 퍼지는 속도 등의 증가를 포함할 수 있다. 예를 들어, "결장암의 진행"은 덜 심각한 상태로부터 더 심각한 상태로의 그러한 암의 진행, 예컨대 I 기로부터 II 기로의 진행, II 기로부터 III 기로의 진행 등을 포함한다.
CD123-발현 암의 퇴행과 관련하여 사용되는 바와 같이, 용어 "퇴행"은 더 심각한 상태로부터 덜 심각한 상태로의 암의 변화를 포함한다. 이는 종양의 수 또는 중증도, 전이 정도, 암이 성장하거나 퍼지는 속도 등의 감소를 포함할 수 있다. 예를 들어, "결장암의 퇴행"은 더 심각한 상태로부터 덜 심각한 상태로의 그러한 암의 퇴행, 예컨대 III 기로부터 II 기로의 진행, II 기로부터 I 기로의 진행 등을 포함한다.
안정된 CD123-발현 암과 관련하여 사용되는 바와 같이, 용어 "안정된"은 진행성 암 또는 퇴행성 암인 것으로 간주되기까지 임상적으로 관련된 기간에 걸쳐 충분히 상당히 변화되지 않거나 변화되어 오지 않은 질병 상태를 기재하고자 한다.
본 명세서에 기재된 실시 형태는 특정 방법, 시약, 화합물, 조성물 또는 생물학적 시스템으로 제한되지 않으며, 이들은 물론 다양할 수 있다.
CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편
CD123에 특이적으로 결합하는 단리된 단일클론 항체 또는 항원-결합 단편이 본 명세서에 기재된다. 항체 분자의 일반적 구조는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항원 결합 도메인, 및 보체 결합(complement fixation) 및 항체 수용체에 대한 결합을 포함한 다양한 기능을 제공하는 Fc 도메인을 포함한다.
기재된 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 모든 동종형, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM, 및 4쇄 면역글로불린 구조의 합성 다량체를 포함한다. 기재된 항체 또는 항원-결합 단편은 또한 암탉 또는 터키 혈청 및 암탉 또는 터키 난황에서 대체로 발견되는 IgY 동종형을 포함한다.
CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 재조합 수단에 의해 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 항원-결합 단편은 마우스, 래트, 염소, 말, 돼지, 소, 닭, 토끼, 카멜리드, 당나귀, 인간, 또는 이들의 키메라 버전일 수 있다. 인간에 대한 투여에 사용하기 위하여, 비인간 유래 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 환자에게 투여 시 더 적은 항원성을 나타내도록 유전자적으로 또는 구조적으로 변경될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 키메라 항체 또는 항원-결합 단편이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "키메라"는 비인간 포유동물, 설치류, 또는 파충류의 항체 아미노산 서열로부터 유래되는 적어도 하나의 가변 도메인의 적어도 일부분을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 지칭하며, 한편 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 나머지 부분은 인간으로부터 유래된다.
일부 실시 형태에서, 항체는 인간화 항체이다. 인간화 항체는 비인간 면역글로불린으로부터 유래되는 최소한의 서열을 함유하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 이들의 단편(예컨대, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원-결합 하위서열)일 수 있다. 대부분, 인간화 항체는, 수령자의 상보성 결정 영역(CDR)으로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화도, 및 능력(capacity)을 갖는 비인간 종(공여 항체), 예컨대 마우스, 래트 또는 토끼의 CDR로부터의 잔기에 의해 대체된 인간 면역글로불린(수령 항체)이다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 하나, 그리고 전형적으로는 2개의, 사실상 모든 가변 도메인을 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 사실상 모든 CDR 영역은 비인간 면역글로불린의 것들에 상응하고, 모든 또는 사실상 모든 프레임워크 영역은 인간 면역글로불린 서열의 것들이다. 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역(Fc), 전형적으로는 인간 면역글로불린의 것의 적어도 일부분을 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편은 다양한 형태로 존재할 수 있지만, 표 1에 나타낸 항체 CDR들 중 하나 이상을 포함할 것이다.
CD123에 면역특이적으로 결합하는 단리된 항체 및 항원-결합 단편이 본 명세서에 기재된다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 IgG 또는 그의 유도체이다. 본 명세서에 예시된 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 항체 또는 항원-결합 단편이지만, 예시된 항체 또는 항원-결합 단편은 키메라화될(chimerized) 수 있다.
일부 실시 형태에서는, 표 1에 기재된 항체들 중 어느 하나의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 중쇄를 포함하는 CD123-특이적 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 제공된다. 일부 실시 형태에서는, 표 1에 기재된 항체들 중 어느 하나의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 중쇄 및 표 1에 기재된 항체들 중 어느 하나의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 경쇄를 포함하는 CD123-특이적 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 제공된다.
일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 006을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 007을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 008을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 006을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 007을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 008을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 009를 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 010을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 011을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 5×10-7 M 이하, 예컨대 1×10-7 M 이하, 5×10-8 M 이하, 1×10-8 M 이하, 5×10-9 M 이하, 또는 1×10-9 M 이하의 친화도로 CD123에 결합할 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 119와 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 119와 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 164와 사실상 동일하거나 동일한 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 하나의 아암이 항-CD123 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 012를 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 013을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 014를 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 012를 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 013을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 014를 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 015를 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 016을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 017을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 5×10-7 M 이하, 예컨대 1×10-7 M 이하, 5×10-8 M 이하, 1×10-8 M 이하, 5×10-9 M 이하, 또는 1×10-9 M 이하의 친화도로 CD123에 결합할 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 120과 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 120과 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 165와 사실상 동일하거나 동일한 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 하나의 아암이 항-CD123 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 018을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 019를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 020을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 018을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 019를 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 020을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 009를 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 010을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 011을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 5×10-7 M 이하, 예컨대 1×10-7 M 이하, 5×10-8 M 이하, 1×10-8 M 이하, 5×10-9 M 이하, 또는 1×10-9 M 이하의 친화도로 CD123에 결합할 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 121과 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 121과 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 164와 사실상 동일하거나 동일한 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 하나의 아암이 항-CD123 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 021을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 022를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 023을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 021을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 022를 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 023을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 024를 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 025를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 026을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 5×10-7 M 이하, 예컨대 1×10-7 M 이하, 5×10-8 M 이하, 1×10-8 M 이하, 5×10-9 M 이하, 또는 1×10-9 M 이하의 친화도로 CD123에 결합할 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 122와 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 122와 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 166과 사실상 동일하거나 동일한 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 하나의 아암이 항-CD123 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 027을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 028을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 029를 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 027을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 028을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 029를 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 030을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 031을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 032를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 5×10-7 M 이하, 예컨대 1×10-7 M 이하, 5×10-8 M 이하, 1×10-8 M 이하, 5×10-9 M 이하, 또는 1×10-9 M 이하의 친화도로 CD123에 결합할 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 123과 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 123과 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 167과 사실상 동일하거나 동일한 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 하나의 아암이 항-CD123 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 033을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 035를 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 033을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034를 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 035를 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 030을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 031을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 032를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 5×10-7 M 이하, 예컨대 1×10-7 M 이하, 5×10-8 M 이하, 1×10-8 M 이하, 5×10-9 M 이하, 또는 1×10-9 M 이하의 친화도로 CD123에 결합할 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 124와 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 124와 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 167과 사실상 동일하거나 동일한 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 하나의 아암이 항-CD123 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 033을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 036을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 033을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034를 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 036을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 030을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 031을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 032를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 5×10-7 M 이하, 예컨대 1×10-7 M 이하, 5×10-8 M 이하, 1×10-8 M 이하, 5×10-9 M 이하, 또는 1×10-9 M 이하의 친화도로 CD123에 결합할 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 125와 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 125와 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 167과 사실상 동일하거나 동일한 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 하나의 아암이 항-CD123 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 033을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 037을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 033을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034를 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 037을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 030을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 031을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 032를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 5×10-7 M 이하, 예컨대 1×10-7 M 이하, 5×10-8 M 이하, 1×10-8 M 이하, 5×10-9 M 이하, 또는 1×10-9 M 이하의 친화도로 CD123에 결합할 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 126과 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 126과 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 167과 사실상 동일하거나 동일한 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 하나의 아암이 항-CD123 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 033을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 038을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 033을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034를 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 038을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 030을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 031을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 032를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 5×10-7 M 이하, 예컨대 1×10-7 M 이하, 5×10-8 M 이하, 1×10-8 M 이하, 5×10-9 M 이하, 또는 1×10-9 M 이하의 친화도로 CD123에 결합할 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 127과 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 127과 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 167과 사실상 동일하거나 동일한 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 하나의 아암이 항-CD123 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 039를 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 040을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 041을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 039를 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 040을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 041을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 030을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 031을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 032를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 5×10-7 M 이하, 예컨대 1×10-7 M 이하, 5×10-8 M 이하, 1×10-8 M 이하, 5×10-9 M 이하, 또는 1×10-9 M 이하의 친화도로 CD123에 결합할 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 128과 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 128과 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 167과 사실상 동일하거나 동일한 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 하나의 아암이 항-CD123 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 039를 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 042를 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 039를 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034를 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 042를 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 030을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 031을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 032를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 5×10-7 M 이하, 예컨대 1×10-7 M 이하, 5×10-8 M 이하, 1×10-8 M 이하, 5×10-9 M 이하, 또는 1×10-9 M 이하의 친화도로 CD123에 결합할 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 129와 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 129와 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 167과 사실상 동일하거나 동일한 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 하나의 아암이 항-CD123 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 033을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 043을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 034를 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034를 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 043을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 030을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 031을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 032를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 5×10-7 M 이하, 예컨대 1×10-7 M 이하, 5×10-8 M 이하, 1×10-8 M 이하, 5×10-9 M 이하, 또는 1×10-9 M 이하의 친화도로 CD123에 결합할 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 130과 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 130과 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 167과 사실상 동일하거나 동일한 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 하나의 아암이 항-CD123 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 039를 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 044를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 045를 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 039를 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 044를 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 045를 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 015를 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 016을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 017을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 5×10-7 M 이하, 예컨대 1×10-7 M 이하, 5×10-8 M 이하, 1×10-8 M 이하, 5×10-9 M 이하, 또는 1×10-9 M 이하의 친화도로 CD123에 결합할 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 131과 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 131과 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 165와 사실상 동일하거나 동일한 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 하나의 아암이 항-CD123 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 039를 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 046을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 047을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 039를 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 046을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 047을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 030을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 031을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 032를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 5×10-7 M 이하, 예컨대 1×10-7 M 이하, 5×10-8 M 이하, 1×10-8 M 이하, 5×10-9 M 이하, 또는 1×10-9 M 이하의 친화도로 CD123에 결합할 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 132와 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 132와 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 167과 사실상 동일하거나 동일한 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 하나의 아암이 항-CD123 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 033을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 048을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 033을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034를 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 048을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 030을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 031을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 032를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 5×10-7 M 이하, 예컨대 1×10-7 M 이하, 5×10-8 M 이하, 1×10-8 M 이하, 5×10-9 M 이하, 또는 1×10-9 M 이하의 친화도로 CD123에 결합할 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 133과 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 133과 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 167과 사실상 동일하거나 동일한 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 하나의 아암이 항-CD123 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 033을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 049를 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 033을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034를 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 049를 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 030을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 031을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 032를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 5×10-7 M 이하, 예컨대 1×10-7 M 이하, 5×10-8 M 이하, 1×10-8 M 이하, 5×10-9 M 이하, 또는 1×10-9 M 이하의 친화도로 CD123에 결합할 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 134와 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 134와 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 167과 사실상 동일하거나 동일한 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 하나의 아암이 항-CD123 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 033을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 050을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 033을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034를 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 050을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 030을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 031을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 032를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 5×10-7 M 이하, 예컨대 1×10-7 M 이하, 5×10-8 M 이하, 1×10-8 M 이하, 5×10-9 M 이하, 또는 1×10-9 M 이하의 친화도로 CD123에 결합할 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 135와 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 135와 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 167과 사실상 동일하거나 동일한 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 하나의 아암이 항-CD123 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 051을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 052를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 053을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 051을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 052를 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 053을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 024를 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 025를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 054를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 5×10-7 M 이하, 예컨대 1×10-7 M 이하, 5×10-8 M 이하, 1×10-8 M 이하, 5×10-9 M 이하, 또는 1×10-9 M 이하의 친화도로 CD123에 결합할 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 136과 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 136과 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 168과 사실상 동일하거나 동일한 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 하나의 아암이 항-CD123 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 055를 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 056을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 057을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 055를 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 056을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 057을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 058을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 059를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 032를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 5×10-7 M 이하, 예컨대 1×10-7 M 이하, 5×10-8 M 이하, 1×10-8 M 이하, 5×10-9 M 이하, 또는 1×10-9 M 이하의 친화도로 CD123에 결합할 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 137과 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 137과 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 169와 사실상 동일하거나 동일한 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 하나의 아암이 항-CD123 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 033을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 060을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 033을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034를 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 060을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 030을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 031을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 032를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 5×10-7 M 이하, 예컨대 1×10-7 M 이하, 5×10-8 M 이하, 1×10-8 M 이하, 5×10-9 M 이하, 또는 1×10-9 M 이하의 친화도로 CD123에 결합할 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 138과 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 138과 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 167과 사실상 동일하거나 동일한 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 하나의 아암이 항-CD123 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 033을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 061을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 033을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034를 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 061을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 062를 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 063을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 064를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 5×10-7 M 이하, 예컨대 1×10-7 M 이하, 5×10-8 M 이하, 1×10-8 M 이하, 5×10-9 M 이하, 또는 1×10-9 M 이하의 친화도로 CD123에 결합할 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 139와 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 139와 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 170과 사실상 동일하거나 동일한 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 하나의 아암이 항-CD123 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 033을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 065를 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 033을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034를 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 065를 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 066을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 067을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 068을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 5×10-7 M 이하, 예컨대 1×10-7 M 이하, 5×10-8 M 이하, 1×10-8 M 이하, 5×10-9 M 이하, 또는 1×10-9 M 이하의 친화도로 CD123에 결합할 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 140과 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 140과 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 171과 사실상 동일하거나 동일한 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 하나의 아암이 항-CD123 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 039를 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 069를 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 039를 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034를 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 069를 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 030을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 031을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 070을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 5×10-7 M 이하, 예컨대 1×10-7 M 이하, 5×10-8 M 이하, 1×10-8 M 이하, 5×10-9 M 이하, 또는 1×10-9 M 이하의 친화도로 CD123에 결합할 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 141과 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 141과 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 172와 사실상 동일하거나 동일한 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 하나의 아암이 항-CD123 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 033을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 071을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 033을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034를 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 071을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 030을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 031을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 032를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 5×10-7 M 이하, 예컨대 1×10-7 M 이하, 5×10-8 M 이하, 1×10-8 M 이하, 5×10-9 M 이하, 또는 1×10-9 M 이하의 친화도로 CD123에 결합할 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 142와 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 142와 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 167과 사실상 동일하거나 동일한 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 하나의 아암이 항-CD123 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 039를 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 072를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 073을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 039를 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 072를 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 073을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 030을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 031을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 032를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 5×10-7 M 이하, 예컨대 1×10-7 M 이하, 5×10-8 M 이하, 1×10-8 M 이하, 5×10-9 M 이하, 또는 1×10-9 M 이하의 친화도로 CD123에 결합할 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 143과 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 143과 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 167과 사실상 동일하거나 동일한 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 하나의 아암이 항-CD123 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 039를 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 074를 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 039를 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034를 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 074를 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 075를 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 076을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 077을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 5×10-7 M 이하, 예컨대 1×10-7 M 이하, 5×10-8 M 이하, 1×10-8 M 이하, 5×10-9 M 이하, 또는 1×10-9 M 이하의 친화도로 CD123에 결합할 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 144와 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 144와 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 173과 사실상 동일하거나 동일한 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 하나의 아암이 항-CD123 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 033을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 078을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 033을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034를 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 078을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 079를 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 063을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 080을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 5×10-7 M 이하, 예컨대 1×10-7 M 이하, 5×10-8 M 이하, 1×10-8 M 이하, 5×10-9 M 이하, 또는 1×10-9 M 이하의 친화도로 CD123에 결합할 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 145와 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 145와 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 174와 사실상 동일하거나 동일한 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 하나의 아암이 항-CD123 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 033을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 081을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 033을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034를 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 081을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 030을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 031을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 032를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 5×10-7 M 이하, 예컨대 1×10-7 M 이하, 5×10-8 M 이하, 1×10-8 M 이하, 5×10-9 M 이하, 또는 1×10-9 M 이하의 친화도로 CD123에 결합할 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 146과 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 146과 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 167과 사실상 동일하거나 동일한 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 하나의 아암이 항-CD123 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 033을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 082를 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 033을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034를 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 082를 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 083을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 031을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 084를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 5×10-7 M 이하, 예컨대 1×10-7 M 이하, 5×10-8 M 이하, 1×10-8 M 이하, 5×10-9 M 이하, 또는 1×10-9 M 이하의 친화도로 CD123에 결합할 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 147과 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 147과 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 175와 사실상 동일하거나 동일한 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 하나의 아암이 항-CD123 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 033을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 085를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 086을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 033을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 085를 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 086을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 087을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 067을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 088을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 5×10-7 M 이하, 예컨대 1×10-7 M 이하, 5×10-8 M 이하, 1×10-8 M 이하, 5×10-9 M 이하, 또는 1×10-9 M 이하의 친화도로 CD123에 결합할 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 148과 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 148과 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 176과 사실상 동일하거나 동일한 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 하나의 아암이 항-CD123 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 033을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 089를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 090을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 033을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 089를 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 090을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 091을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 076을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 092를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 5×10-7 M 이하, 예컨대 1×10-7 M 이하, 5×10-8 M 이하, 1×10-8 M 이하, 5×10-9 M 이하, 또는 1×10-9 M 이하의 친화도로 CD123에 결합할 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 149와 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 149와 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 177과 사실상 동일하거나 동일한 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 하나의 아암이 항-CD123 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 039를 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 093을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 039를 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034를 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 093을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 030을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 031을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 032를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 5×10-7 M 이하, 예컨대 1×10-7 M 이하, 5×10-8 M 이하, 1×10-8 M 이하, 5×10-9 M 이하, 또는 1×10-9 M 이하의 친화도로 CD123에 결합할 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 150과 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 150과 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 167과 사실상 동일하거나 동일한 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 하나의 아암이 항-CD123 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 039를 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 094를 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 039를 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034를 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 094를 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 095를 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 076을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 096을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 5×10-7 M 이하, 예컨대 1×10-7 M 이하, 5×10-8 M 이하, 1×10-8 M 이하, 5×10-9 M 이하, 또는 1×10-9 M 이하의 친화도로 CD123에 결합할 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 151과 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 151과 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 178과 사실상 동일하거나 동일한 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 하나의 아암이 항-CD123 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 033을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 097을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 033을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034를 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 097을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 098을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 067을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 099를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 5×10-7 M 이하, 예컨대 1×10-7 M 이하, 5×10-8 M 이하, 1×10-8 M 이하, 5×10-9 M 이하, 또는 1×10-9 M 이하의 친화도로 CD123에 결합할 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 152와 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 152와 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 179와 사실상 동일하거나 동일한 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 하나의 아암이 항-CD123 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 033을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 100을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 033을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034를 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 100을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 030을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 031을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 101을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 5×10-7 M 이하, 예컨대 1×10-7 M 이하, 5×10-8 M 이하, 1×10-8 M 이하, 5×10-9 M 이하, 또는 1×10-9 M 이하의 친화도로 CD123에 결합할 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 153과 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 153과 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 180과 사실상 동일하거나 동일한 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 하나의 아암이 항-CD123 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 039를 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 102를 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 039를 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034를 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 102를 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 030을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 031을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 032를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 5×10-7 M 이하, 예컨대 1×10-7 M 이하, 5×10-8 M 이하, 1×10-8 M 이하, 5×10-9 M 이하, 또는 1×10-9 M 이하의 친화도로 CD123에 결합할 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 154와 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 154와 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 167과 사실상 동일하거나 동일한 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 하나의 아암이 항-CD123 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 033을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 103을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 033을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034를 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 103을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 104를 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 031을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 105를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 5×10-7 M 이하, 예컨대 1×10-7 M 이하, 5×10-8 M 이하, 1×10-8 M 이하, 5×10-9 M 이하, 또는 1×10-9 M 이하의 친화도로 CD123에 결합할 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 155와 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 155와 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 181과 사실상 동일하거나 동일한 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 하나의 아암이 항-CD123 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 039를 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 106을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 039를 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034를 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 106을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 030을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 031을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 032를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 5×10-7 M 이하, 예컨대 1×10-7 M 이하, 5×10-8 M 이하, 1×10-8 M 이하, 5×10-9 M 이하, 또는 1×10-9 M 이하의 친화도로 CD123에 결합할 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 156과 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 156과 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 167과 사실상 동일하거나 동일한 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 하나의 아암이 항-CD123 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 033을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 107을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 033을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034를 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 107을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 108을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 109를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 110을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 5×10-7 M 이하, 예컨대 1×10-7 M 이하, 5×10-8 M 이하, 1×10-8 M 이하, 5×10-9 M 이하, 또는 1×10-9 M 이하의 친화도로 CD123에 결합할 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 157과 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 157과 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 182와 사실상 동일하거나 동일한 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 하나의 아암이 항-CD123 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 033을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 111을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 033을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034를 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 111을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 112를 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 076을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 113을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 5×10-7 M 이하, 예컨대 1×10-7 M 이하, 5×10-8 M 이하, 1×10-8 M 이하, 5×10-9 M 이하, 또는 1×10-9 M 이하의 친화도로 CD123에 결합할 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 158과 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 158과 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 183과 사실상 동일하거나 동일한 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 하나의 아암이 항-CD123 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 114를 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 022를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 115를 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 114를 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 022를 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 115를 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 024를 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 025를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 026을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 5×10-7 M 이하, 예컨대 1×10-7 M 이하, 5×10-8 M 이하, 1×10-8 M 이하, 5×10-9 M 이하, 또는 1×10-9 M 이하의 친화도로 CD123에 결합할 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 159와 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 159와 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 166과 사실상 동일하거나 동일한 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 하나의 아암이 항-CD123 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 114를 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 022를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 116을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 114를 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 022를 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 116을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 015를 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 016을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 017을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 5×10-7 M 이하, 예컨대 1×10-7 M 이하, 5×10-8 M 이하, 1×10-8 M 이하, 5×10-9 M 이하, 또는 1×10-9 M 이하의 친화도로 CD123에 결합할 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 160과 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 160과 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 165와 사실상 동일하거나 동일한 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 하나의 아암이 항-CD123 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 117을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 013을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 118을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 117을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 013을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 118을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 015를 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 016을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 017을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 5×10-7 M 이하, 예컨대 1×10-7 M 이하, 5×10-8 M 이하, 1×10-8 M 이하, 5×10-9 M 이하, 또는 1×10-9 M 이하의 친화도로 CD123에 결합할 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 161과 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 161과 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 165와 사실상 동일하거나 동일한 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 하나의 아암이 항-CD123 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 051을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 052를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 053을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 051을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 052를 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 053을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 030을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 031을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 032를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 5×10-7 M 이하, 예컨대 1×10-7 M 이하, 5×10-8 M 이하, 1×10-8 M 이하, 5×10-9 M 이하, 또는 1×10-9 M 이하의 친화도로 CD123에 결합할 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 162와 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 162와 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 167과 사실상 동일하거나 동일한 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 하나의 아암이 항-CD123 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 033을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 042를 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 033을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034를 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 042를 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 030을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 031을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 032를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이러한 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 5×10-7 M 이하, 예컨대 1×10-7 M 이하, 5×10-8 M 이하, 1×10-8 M 이하, 5×10-9 M 이하, 또는 1×10-9 M 이하의 친화도로 CD123에 결합할 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 163과 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 163과 사실상 동일하거나 동일한 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 167과 사실상 동일하거나 동일한 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 하나의 아암이 항-CD123 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
본 발명에 의해 제공된 항-CD123 항체 및 항원-결합 단편은 또한 결합을 위하여 전술된 항체와 경쟁하는 항체를 포함한다. 결합에 대한 경쟁은, 하기에서 실시예 5에 기재된 기법에 따라 경쟁 결합 ELISA를 사용하여 결정될 수 있다. 제2 항체에 의한 제1 항체의 결합의 적어도 20% 억제를 검출함으로써 경쟁적 결합이 결정될 수 있는데, 이는 항체들이 CD123에 결합되는 순서와는 관계없다(즉, 항체 A가 항체 B보다 먼저 CD123에 결합되는 경우, 단지 10% 억제가 관찰되지만, 항체 B가 항체 A보다 먼저 CD123에 결합되는 경우, 30% 억제가 관찰되는데, 20% 초과의 억제가 실험 중 하나에서 관찰되었기 때문에, 경쟁적 결합으로 결론지을 수 있다).
일부 실시 형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 IgG 또는 그의 유도체, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4 동종형이다. 항체가 IgG1 동종형을 갖는 일부 실시 형태에서, 항체는 그의 Fc 영역 내에 L234A, L235A, 및 K409R 치환(들)을 함유한다. 항체가 IgG4 동종형을 갖는 일부 실시 형태에서, 항체는 그의 Fc 영역 내에 S228P, L234A, 및 L235A 치환을 함유한다. 상기 단락들에서 논의된 CDR 및/또는 가변 도메인 서열에 의해 한정된 특이적 항체는 이들 변형을 포함할 수 있다.
CD123에 면역특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편을 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드가 또한 개시된다. 본 명세서에 제공된 가변 도메인 절편을 인코딩할 수 있는 단리된 폴리뉴클레오티드는 동일한 또는 상이한 벡터 상에 포함되어 항체 또는 항원-결합 단편을 생성할 수 있다.
재조합 항원-결합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 또한 본 발명의 범주 내에 있다. 일부 실시 형태에서, 기재된 폴리뉴클레오티드(및 이것이 인코딩하는 펩티드)는 리더(leader) 서열을 포함한다. 당업계에 알려진 임의의 리더 서열이 사용될 수 있다. 리더 서열은 제한 부위 또는 번역 개시 부위를 포함할 수 있지만 이로 한정되지 않는다.
본 명세서에 기재된 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 기재된 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편의 생물학적 특성(예를 들어, 결합 친화성 또는 면역 효과기 활성)을 보유하는 단일 또는 다수의 아미노산 치환, 결실, 또는 부가를 갖는 변이체를 포함한다. 본 발명과 관련하여, 달리 지시되지 않는 한, 돌연변이를 기재하기 위해 하기의 표기법이 사용된다: i) 주어진 위치에서의 아미노산의 치환은, 예를 들어 K409R로 표기되는데, 이는 위치 409에서의 라이신의 아르기닌으로의 치환을 의미하고; ii) 특정 변이체의 경우, 임의의 아미노산 잔기를 나타내기 위해 코드 Xaa 및 X를 포함한, 특정 3 문자 또는 1 문자 코드가 사용된다. 따라서, 위치 409에서의 라이신 대신 아르기닌의 치환은 K409R로 표기되거나, 또는 위치 409에서의 라이신 대신 임의의 아미노산 잔기의 치환은 K409X로 표시된다. 위치 409에서 라이신이 결실된 경우에, 그것은 K409*로 나타낸다. 당업자는 단일 또는 다수의 아미노산 치환, 결실, 또는 부가를 갖는 변이체를 생성할 수 있다.
이들 변이체는 하기를 포함할 수 있다: (a) 하나 이상의 아미노산 잔기가 보존적 또는 비보존적 아미노산으로 치환된 변이체, (b) 하나 이상의 아미노산이 폴리펩티드에 부가되거나 그로부터 결실된 변이체, (c) 하나 이상의 아미노산이 치환기를 포함하는 변이체, 및 (d) 폴리펩티드가, 그 폴리펩티드에 유용한 특성을 부여할 수 있는 다른 펩티드 또는 폴리펩티드, 예컨대 융합 파트너, 단백질 태그 또는 다른 화학적 모이어티, 예컨대 항체에 대한 에피토프, 폴리히스티딘 서열, 비오틴 모이어티(moiety) 등과 융합된 변이체. 본 명세서에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편은, 하나의 종으로부터의 아미노산 잔기가, 보존 또는 비보존된 위치에서, 다른 종에서의 상응하는 잔기 대신 치환된 변이체를 포함할 수 있다. 다른 실시 형태에서, 비보존된 위치에서의 아미노산 잔기가 보존 또는 비보존된 잔기로 치환된다. 유전자적(결실, 돌연변이 등), 화학적, 및 효소적 기법을 포함한 이들 변이체를 얻기 위한 기법은 당업자에게 알려져 있다.
본 명세서에 기재된 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 몇몇 항체 동종형, 예컨대 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE를 구현할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항체 동종형은 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 동종형, 바람직하게는 IgG1 또는 IgG4 동종형이다. 항체 또는 그의 항원-결합 단편 특이성은 CDR의 아미노산 서열, 및 배열에 의해 대체로 결정된다. 따라서, 하나의 동종형의 CDR은 항원 특이성을 변경시키지 않고서 다른 동종형으로 전달될 수 있다. 대안적으로, 하이브리도마가 항원 특이성을 변경시키지 않고서 하나의 항체 동종형을 생성하는 것으로부터 다른 항체 동종형으로 전환(동종형 전환)되게 하기 위한 기법이 확립되어 왔다. 따라서, 그러한 항체 동종형들은 기재된 항체 또는 항원-결합 단편의 범주 내에 있다.
본 명세서에 기재된 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 CD123 SP1에 대한 결합 친화도가 약 5×10-7 M 미만, 바람직하게는 약 5×10-8 M 미만의 해리 상수(KD)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 CD123 SP2에 대한 결합 친화도가 약 5×10-7 M 미만, 바람직하게는 약 5×10-8 M 미만의 해리 상수(KD)를 포함한다. 기재된 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편의 친화도는 당업계에 알려진 다양한 방법, 예컨대 표면 플라즈몬 공명 또는 ELISA-기반 방법에 의해 결정될 수 있다. SPR에 의해 친화도를 측정하기 위한 검정은 BIAcore 3000 기계를 사용하여 수행되는 검정을 포함하는데, 여기서 검정은 실온에서(예를 들어, 25℃ 또는 그 부근에서) 수행되며, CD123에 결합할 수 있는 항체를 항-Fc 항체(예를 들어, 염소 항-인간 IgG Fc 특이적 항체, Jackson ImmunoResearch laboratories 제품 번호 109-005-098)에 의해 BIAcore 센서 칩 상에 약 75 RU의 수준까지 포획한 후, 40 μl/min의 유량으로 회합 및 해리 데이터의 수집을 행한다.
본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 또한 제공된다. 벡터는 발현 벡터일 수 있다. 따라서, 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 함유하는 재조합 발현 벡터는 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 고려된다. 발현 벡터는 조절 서열(예를 들어, 프로모터, 인핸서), 선택 마커, 및 폴리아데닐화 신호와 같은 그러나 이로 한정되지 않는 하나 이상의 추가의 서열을 함유할 수 있다. 매우 다양한 숙주 세포를 형질전환시키기 위한 벡터는 잘 알려져 있으며, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 배큘로바이러스, 박미드(bacmid), 세균 인공 염색체(BAC), 효모 인공 염색체(YAC)뿐만 아니라, 다른 세균, 효모 및 바이러스 벡터를 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
본 발명의 범주 내의 재조합 발현 벡터는 적합한 조절 요소에 작동가능하게 연결될 수 있는 적어도 하나의 재조합 단백질을 인코딩하는 합성, 게놈, 또는 cDNA-유래 핵산 단편을 포함한다. 그러한 조절 요소는 전사 프로모터, 적합한 mRNA 리보솜 결합 부위를 인코딩하는 서열, 및 전사 및 번역의 종결을 제어하는 서열을 포함할 수 있다. 발현 벡터, 특히 포유류 발현 벡터는 또한 하나 이상의 비전사 요소, 예컨대 복제 기점, 발현시키고자 하는 유전자에 연결된 적합한 프로모터 및 인핸서, 다른 5' 또는 3' 플랭킹(flanking) 비전사 서열, 5' 또는 3' 비번역 서열(예컨대, 필요한 리보솜 결합 부위), 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 도너 및 억셉터 부위, 또는 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. 숙주에서 복제하는 능력을 부여하는 복제 기점이 또한 포함될 수 있다.
척추동물 세포를 형질전환시키는 데 사용되는 발현 벡터에서의 전사 및 번역 제어 서열은 바이러스 공급원에 의해 제공될 수 있다. 예시적인 벡터가 문헌[Okayama and Berg, 3 Mol. Cell. Biol. 280 (1983)]에 의해 기재된 바와 같이 작제될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 항체- 또는 항원-결합 단편-코딩 서열은 강력한 구성적 프로모터, 예컨대 하기 유전자에 대한 프로모터의 제어 하에 놓여 있다: 하이포잔틴 포스포리보실 트랜스퍼라제(HPRT), 아데노신 데아미나제, 피루베이트 키나제, 베타-액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴, 및 기타. 게다가, 많은 바이러스성 프로모터가 진핵 세포에서 구성적으로 기능하고, 기재된 실시 형태와 함께 사용하기에 적합하다. 그러한 바이러스성 프로모터는, 제한 없이, 거대세포바이러스(CMV) 극초기 프로모터, SV40의 초기 및 후기 프로모터, 마우스 유선 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, 말로니(Maloney) 백혈병 바이러스의 긴 말단 반복부(LTR), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 엡스타인 바 바이러스(Epstein Barr Virus)(EBV), 라우스 육종 바이러스(Rous Sarcoma Virus)(RSV), 및 다른 레트로바이러스, 및 단순 헤르페스 바이러스의 티미딘 키나제 프로모터를 포함한다. 일 실시 형태에서, CD123-특이적 항체 또는 그의 항원-결합 단편 코딩 서열은 유도성 프로모터, 예컨대 메탈로티오네인 프로모터, 테트라사이클린-유도성 프로모터, 독시사이클린-유도성 프로모터, 하나 이상의 인터페론-자극 반응 요소(ISRE)를 함유하는 프로모터, 예컨대 단백질 키나제 R 2',5'-올리고아데닐레이트 신테타제, Mx 유전자, ADAR1 등의 제어 하에 놓여 있다.
본 명세서에 기재된 벡터는 하나 이상의 내부 리보솜 침입 부위(들)(IRES)를 함유할 수 있다. 융합 벡터 내로의 IRES 서열의 포함은 일부 단백질의 발현을 향상시키는 데 유익할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 벡터 시스템은 하나 이상의 폴리아데닐화 부위(예를 들어, SV40)를 포함할 것이며, 이는 상기 언급된 핵산 서열들 중 임의의 것의 상류 또는 하류에 있을 수 있다. 벡터 성분들은 (즉, ORF들 사이에의 "스페이서" 뉴클레오티드의 도입에 의해) 유전자 산물을 발현시키기 위한 최적의 간격을 제공하는 방식으로 인접하게 연결 또는 배열될 수 있거나, 또는 다른 방식으로 위치될 수 있다. 조절 요소, 예컨대 IRES 모티프는 또한 발현을 위한 최적의 간격을 제공하도록 배열될 수 있다.
벡터는 선택 마커를 포함할 수 있으며, 선택 마커는 당업계에 잘 알려져 있다. 선택 마커는 양성 및 음성 선택 마커, 예를 들어 항생제 저항성 유전자(예를 들어, 네오마이신 저항성 유전자, 하이그로마이신 저항성 유전자, 카나마이신 저항성 유전자, 테트라사이클린 저항성 유전자, 페니실린 저항성 유전자), 글루타메이트 신타제 유전자, 간시클로비르 선택을 위한 HSV-TK, HSV-TK 유도체, 또는 6-메틸푸린 선택을 위한 세균성 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라제 유전자를 포함한다(문헌[Gadi et al., 7 Gene Ther. 1738-1743 (2000)]). 선택 마커 또는 클로닝 부위를 인코딩하는 핵산 서열은 관심 폴리펩티드 또는 클로닝 부위를 인코딩하는 핵산 서열의 상류 또는 하류에 있을 수 있다.
본 명세서에 기재된 벡터는 다양한 세포를 기재된 항체 또는 항원-결합 단편을 인코딩하는 유전자로 형질전환시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 벡터는 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편-생성 세포를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 다른 태양은 CD123에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 예컨대 본 명세서에 기재되고 예시된 항체 또는 항원-결합 단편을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.
세포 내로의 외래 유전자의 도입을 위한 다수의 기법이 당업계에 알려져 있고, 본 명세서에 기재되고 예시된 다양한 실시 형태에 따라, 기재된 방법을 수행하려는 목적을 위하여 재조합 세포를 작제하는 데 사용될 수 있다. 사용되는 기법은 숙주 세포로의 이종 유전자 서열의 안정한 전달을 제공하여, 이종 유전자 서열이 세포의 자손에 의해 상속가능하고 발현가능하도록, 그리고 수령 세포의 필요한 발달 및 생리학적 기능이 파괴되지 않도록 해야 한다. 사용될 수 있는 기법은 염색체 전달(예를 들어, 세포 융합, 염색체 매개 유전자 전달, 마이크로 세포 매개 유전자 전달), 물리적 방법(예를 들어, 형질감염, 스페로플라스트 융합, 현미주사(microinjection), 전기천공, 리포솜 담체), 바이러스성 벡터 전달(예를 들어, 재조합 DNA 바이러스, 재조합 RNA 바이러스) 등(문헌[Cline, 29 Pharmac. Ther. 69-92 (1985)]에 기재됨)을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 인산칼슘 침전 및 세균 프로토플라스트(bacterial protoplast)와 포유류 세포의 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-유도 융합이 또한 세포를 형질전환시키는 데 사용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편의 발현에 사용하기에 적합한 세포는 바람직하게는 진핵 세포, 더 바람직하게는 식물, 설치류, 또는 인간 기원의 세포, 예를 들어, 그러나 제한 없이, 특히 NSO, CHO, CHOK1, perC.6, Tk-ts13, BHK, HEK293 세포, COS-7, T98G, CV-1/EBNA, L 세포, C127, 3T3, HeLa, NS1, Sp2/0 골수종 세포, 및 BHK 세포주이다. 게다가, 항체의 발현은 하이브리도마 세포를 사용하여 달성될 수 있다. 하이브리도마를 생성하기 위한 방법이 당업계에 잘 확립되어 있다.
본 명세서에 기재된 발현 벡터로 형질전환된 세포는 본 명세서에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편의 재조합 발현을 위해 선택되거나 스크리닝될 수 있다. 재조합-양성 세포는 원하는 표현형, 예컨대 고수준 발현, 향상된 성장 특성, 또는, 예를 들어 단백질 변형 또는 변경된 번역 후 변형으로 인해 원하는 생화학적 특성을 갖는 단백질을 산출하는 능력을 나타내는 하위클론을 위해 증폭 및 스크리닝된다. 이들 표현형은 주어진 하위클론의 고유 특성에 기인하거나 돌연변이에 기인할 수 있다. 돌연변이는 화학물질, UV-파장 광, 방사선, 바이러스, 삽입 돌연변이원, DNA 불일치 수복의 억제, 또는 그러한 방법들의 조합의 사용을 통해 달성될 수 있다.
치료를 위해 CD123-특이적 항체를 사용하는 방법
요법에 사용하기 위한 CD123-특이적 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 본 명세서에 제공된다. 특히, 이들 항체 또는 항원-결합 단편은 암, 예컨대 CD123-발현 암을 치료하는 데 유용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체, 예컨대 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편을 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 방법을 제공한다. 예를 들어, 이러한 사용은 IL-3이 IL-3R에 결합하는 것을 방지하여 IL-3의 생물학적 효과를 억제함으로써, 또는 항체가 독소에 접합되는 경우, 이에 따라 독소가 CD123-발현 암을 표적으로 하게 됨으로써 행해질 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD123-발현 암은 혈액암, 예컨대 급성 골수성 백혈병(AML), 골수이형성 증후군(MDS, 저위험 또는 고위험), 급성 림프구성 백혈병(ALL, 모든 아형을 포함함), 미만성 대 B-세포 림프종(DLBCL), 만성 골수성 백혈병(CML), 또는 아구성 형질세포양 수지상 세포 신생물(DPDCN)을 포함한다. 이들 방법에 사용하기 위한 항체는 상기에서 본 명세서에 기재된 것들, 예를 들어 잔기 195-202(RARERVYE(서열 번호 234))를 포함하는 CD123 SP2 ECD의 절편 및/또는 잔기 156-161(RKFRYE(서열 번호 232))을 포함하는 CD123 SP2 ECD의 절편 및/또는 잔기 173―178(TEQVRD(서열 번호 233))을 포함하는 CD123 SP2 ECD의 절편으로부터의 하나 이상의 잔기를 포함하는 에피토프에 결합하는 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편을 포함한다. 표 1에 기재된 특징부, 예를 들어 CDR 또는 가변 도메인 서열을 갖는 항체들, 및 이들 항체의 추가의 논의에 기재된 그러한 항체들이 이들 방법에 사용하기에 또한 유용하다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, CD123-특이적 항체의 면역 효과기 특성이 당업자에게 알려진 기법에 의해 Fc 변형을 통해 향상되거나 또는 침묵될 수 있다. 예를 들어, Fc 효과기 기능, 예컨대 C1q 결합, 보체 의존성 세포독성(CDC), 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC), 항체-의존성 세포-매개 식작용(ADCP), 세포 표면 수용체(예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등이, 이들 활성을 담당하는 Fc 내의 잔기를 변형시킴으로써 제공 및/또는 제어될 수 있다.
"항체-의존성 세포-매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 Fc 수용체(FcR)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포(예를 들어, 천연 살해(NK) 세포, 호중구, 및 대식세포)가 표적 세포 상에 결합된 항체를 인식하고 후속적으로 표적 세포의 용해를 야기하는 세포-매개 반응을 지칭한다.
ADCC를 유도하는 단일클론 항체의 능력은 그의 올리고당 성분을 조작함으로써 향상될 수 있다. 인간 IgG1 또는 IgG3은 잘 알려진 바이안테나리(biantennary) G0, G0F, G1, G1F, G2 또는 G2F 형태의 글리칸의 대부분에 의해 Asn297에서 N-글리코실화된다. 비조작된 CHO 세포에 의해 생성된 항체는 전형적으로 약 85% 이상의 글리칸 푸코스 함량을 갖는다. Fc 영역에 부착된 바이안테나리 복합형(complex-type) 올리고당으로부터의 코어(core) 푸코스의 제거는, 항원 결합 또는 CDC 활성을 변경시키지 않고서, 개선된 FcγRIIIa 결합을 통해 항체의 ADCC를 향상시킨다. 그러한 mAb는 바이안테나리 복합형의 Fc 올리고당을 담지하는 비교적 고도로 탈푸코실화된 항체의 성공적인 발현으로 이어지는 것으로 보고된 상이한 방법들을 사용하여 달성될 수 있는데, 이러한 방법에는, 예컨대 하기와 같은 것이 있다: 배양물 오스몰랄 농도(osmolality)의 제어(문헌[Konno et al., Cytotechnology 64:249-65, 2012]), 숙주 세포주로서의 변이체 CHO 세포주 Lec13의 적용(문헌[Shields et al., J Biol Chem 277:26733-26740, 2002]), 숙주 세포주로서의 변이체 CHO 세포주 EB66의 적용(문헌[Olivier et al., MAbs; 2(4), 2010; Epub ahead of print; PMID:20562582]), 숙주 세포주로서의 래트 하이브리도마 세포주 YB2/0의 적용(문헌[Shinkawa et al., J Biol Chem 278:3466-3473, 2003]), 특이적으로 α 1,6-푸코실트랜스퍼라제(FUT8) 유전자에 대한 짧은 간섭(small interfering) RNA의 도입(문헌[Mori et al., Biotechnol Bioeng 88:901-908, 2004]), 또는 β-1,4-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III과 골지(Golgi) α-만노시다제 II 또는 강력한 알파-만노시다제 I 억제제인 키푸넨신(kifunensine)의 공발현(문헌[Ferrara et al., J Biol Chem 281:5032-5036, 2006], 문헌[Ferrara et al., Biotechnol Bioeng 93:851-861, 2006]; 문헌[Xhou et al., Biotechnol Bioeng 99:652-65, 2008]).
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, CD123 항체에 의해 유도되는 ADCC는 또한 항체 Fc 내에서의 소정의 치환에 의해 향상될 수 있다. 예시적인 치환은, 예를 들어 미국 특허 제6,737,056호에 기재된 바와 같은 아미노산 위치 256, 290, 298, 312, 356, 330, 333, 334, 360, 378 또는 430(잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따름)에서의 치환이다.
CD123의 검출 방법
생물학적 샘플에서 CD123을 검출하기 위한 방법이 본 명세서에 제공되는데, 본 방법은 샘플을 본 명세서에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 접촉시킴에 의한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 샘플은 소변, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 복수, 순환 세포, 순환 종양 세포, 조직과 회합되지 않은 세포(즉, 유리 세포), 조직(예를 들어, 외과적으로 절제된 종양 조직, 생검 - 미세 바늘 흡인물을 포함함), 조직 프레파라트 등으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 기재된 방법은 생물학적 샘플을 본 명세서에 기재된 CD123-특이적 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들 중 임의의 것과 접촉시킴으로써 샘플에서 CD123을 검출하는 단계를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 샘플은 본 명세서에 기재된 하나 초과의 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편과 접촉될 수 있다. 예를 들어, 샘플은 제1 CD123-특이적 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 접촉되고, 이어서 제2 CD123-특이적 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 접촉될 수 있으며, 여기서 제1 항체 또는 항원-결합 단편 및 제2 항체 또는 항원-결합 단편은 동일한 항체 또는 항원-결합 단편이 아니다. 일부 실시 형태에서, 제1 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 샘플과 접촉시키기 전에 표면, 예컨대 멀티웰 플레이트, 칩, 또는 유사한 기재에 고정될 수 있다. 다른 실시 형태에서, 제1 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 샘플과 접촉시키기 전에 어떠한 것에도 전혀 고정 또는 부착되지 않을 수 있다.
기재된 CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 검출가능하게 표지화될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 표지화된 항체 및 항원-결합 단편이 본 명세서에 기재된 방법을 통해 CD123의 검출을 촉진시킬 수 있다. 많은 그러한 표지가 당업자에게 용이하게 알려져 있다. 예를 들어, 적합한 표지는 방사선 표지, 형광 표지, 에피토프 태그, 비오틴, 발색단 표지, ECL 표지, 또는 효소를 포함하지만 이로 한정되는 것으로 여겨져서는 안 된다. 더 구체적으로는, 기재된 표지는 루테늄, 111In-DOTA, 111In-다이에틸렌트라이아민펜타아세트산(DTPA), 고추냉이 퍼옥사이드, 알칼리성 포스파타제 및 베타-갈락토시다제, 폴리-히스티딘(HIS 태그), 아크리딘 염료, 시아닌 염료, 플로오론 염료, 옥사진 염료, 페난트리딘 염료, 로다민 염료, 알렉사 플루오르(Alexa Fluor)® 염료 등을 포함한다.
기재된 CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 생물학적 샘플에서 CD123을 검출하기 위한 다양한 검정에 사용될 수 있다. 일부 적합한 검정은 웨스턴 블롯(Western blot) 분석, 방사면역검정, 표면 플라즈몬 공명, 면역형광측정(immunofluorimetry), 면역침전, 평형 투석, 면역확산, 전기화학발광(ECL) 면역검정, 면역조직화학, 형광-활성화 세포 분류(FACS) 또는 ELISA 검정을 포함하지만 이로 한정되는 것으로 여겨져서는 안 된다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 대상체가 CD123에 대해 유도된 치료제로 치료될 수 있는지를 결정하기 위하여 대상체에서의 CD123-발현 암 세포의 검출이 사용될 수 있다.
CD123은 혈액 및 혈청 샘플 중에 검출가능한 수준으로 존재한다. 따라서, 혈액으로부터 유래된 샘플, 예컨대 혈청 샘플에서 CD123을 검출하기 위한 방법이 본 명세서에 제공되는데, 본 방법은 샘플을 CD123에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 접촉시킴에 의한다. 혈액 샘플 또는 그의 유도체는, 기재된 방법이 수행될 수 있는 샘플을 산출하도록 희석, 분획화, 또는 달리 처리될 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD123은 하기와 같은 그러나 이로 한정되지 않는 당업계에 알려진 다수의 검정에 의해 혈액 샘플 또는 그의 유도체에서 검출될 수 있다: 웨스턴 블롯 분석, 방사면역검정, 표면 플라즈몬 공명, 면역형광측정, 면역침전, 평형 투석, 면역확산, 전기화학발광(ECL) 면역검정, 면역조직화학, 형광-활성화 세포 분류(FACS) 또는 ELISA 검정.
암의 진단 방법
대상체에서 CD123-발현 암을 진단하기 위한 방법이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시 형태에서, CD123-발현 암은 혈액암, 예컨대 급성 골수성 백혈병(AML), 골수이형성 증후군(MDS, 저위험 또는 고위험), 급성 림프구성 백혈병(ALL, 모든 아형을 포함함), 미만성 대 B-세포 림프종(DLBCL), 만성 골수성 백혈병(CML), 또는 아구성 형질세포양 수지상 세포 신생물(DPDCN)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 전술된 바와 같이, 생물학적 샘플, 예컨대 혈액 샘플 또는 혈청 샘플에서 CD123을 검출하는 것은 샘플이 획득된 대상체에서 암을 진단하는 능력을 제공한다. 대안적으로, 일부 실시 형태에서, 다른 샘플, 예컨대 조직학적 샘플, 미세 바늘 흡인 샘플, 절제된 종양 조직, 순환 세포, 순환 종양 세포 등이 또한 샘플이 획득된 대상체가 암을 갖는지의 여부를 평가하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 샘플이 획득된 대상체가 암을 갖는다는 것이 이미 알려져 있을 수 있지만, 대상체가 앓고 있는 암의 유형은 아직 진단되지 않았을 수 있거나, 또는 예비 진단이 불명확할 수 있으며, 이에 따라 대상체로부터 획득된 생물학적 샘플에서 CD123을 검출하는 것은 암의 진단을 가능하게 하거나 명확하게 할 수 있다. 예를 들어, 대상체는 암을 갖는 것으로 알려져 있을 수 있지만, 대상체의 암이 CD123-발현인지의 여부가 알려져 있지 않을 수 있거나, 또는 불명확할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 기재된 방법은 대상체로부터 유래된 생물학적 샘플에 존재하는 CD123의 양을 결정함으로써 대상체가 CD123-발현 암을 앓고 있는지의 여부를 평가하는 단계; 및 관찰된 CD123의 양을 대조군 샘플 또는 참조 샘플 중의 CD123의 양과 비교하는 단계를 수반하며, 여기서 대상체로부터 유래되는 샘플 중의 CD123의 양과 대조군 샘플 또는 참조 샘플 중의 CD123의 양 사이의 차이는 대상체가 CD123-발현 암을 앓고 있는지를 나타내는 지표이다. 다른 실시 형태에서, 대상체로부터 획득된 생물학적 샘플에서 관찰되는 CD123의 양은 암의 소정의 형태 또는 단계와 관련된 것으로 알려진 CD123의 수준과 대비되어, 대상체의 암의 형태 또는 단계를 결정할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 대상체로부터 유래된 샘플 중의 CD123의 양은 샘플을 CD123에 면역특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 예컨대 본 명세서에 기재된 CD123-특이적 항체와 접촉시킴으로써 평가된다. CD123의 존재에 대해 평가되는 샘플은 소변, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 복수, 순환 세포, 순환 종양 세포, 조직과 회합되지 않은 세포(즉, 유리 세포), 조직(예를 들어, 외과적으로 절제된 종양 조직, 생검 - 미세 바늘 흡인물을 포함함), 조직 프레파라트 등으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD123-발현 암은 혈액암, 예컨대 급성 골수성 백혈병(AML), 골수이형성 증후군(MDS, 저위험 또는 고위험), 급성 림프구성 백혈병(ALL, 모든 아형을 포함함), 미만성 대 B-세포 림프종(DLBCL), 만성 골수성 백혈병(CML), 또는 아구성 형질세포양 수지상 세포 신생물(DPDCN)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 대상체는 인간이다.
일부 실시 형태에서, CD123-발현 암의 진단 방법은 대상체의 생물학적 샘플을 CD123-특이적 항체 또는 그의 항원-결합 단편(예컨대, 표 1에 제공된 항체 및 단편으로부터 유도가능한 것들)과 접촉시키는 단계, 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 의해 결합된 샘플에 존재하는 CD123의 양을 정량화하는 단계, 샘플에 존재하는 CD123의 양을 기지 표준 또는 참조 샘플과 대비하는 단계; 및 대상체의 CD123 수준이 암과 관련된 CD123의 수준 내에 있는지의 여부를 결정하는 단계를 수반할 것이다. 추가의 실시 형태에서, 진단 방법 이후에는 암-특이적 치료를 실시 또는 처방하는 추가 단계가 행해질 수 있다. 다른 실시 형태에서, 진단 방법 이후에는 결정의 결과를 전송하여 암의 치료를 촉진시키는 추가 단계가 행해질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 암-특이적 치료는 CD123-발현 암에 대해 유도될 수 있으며, 예컨대 본 명세서에 기재된 CD123 × CD3 다중특이성 항체이다.
일부 실시 형태에서, 기재된 방법은 대상체로부터 획득된 혈액 또는 혈청 샘플에 존재하는 CD123의 양을 결정함으로써 대상체가 CD123-발현 암을 앓고 있는지의 여부를 평가하는 단계; 및 관찰된 CD123의 양을 대조군 샘플 또는 참조 샘플 중의 CD123의 양과 비교하는 단계를 수반하며, 여기서 대상체로부터 유래되는 샘플 중의 CD123의 양과 대조군 샘플 또는 참조 샘플 중의 CD123의 양 사이의 차이는 대상체가 CD123-발현 암을 앓고 있는지를 나타내는 지표이다.
일부 실시 형태에서, 대조군 샘플 또는 참조 샘플은 CD123-발현 암을 앓고 있지 않은 대상체로부터 유래될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 대조군 샘플 또는 참조 샘플은 CD123-발현 암을 앓고 있는 대상체로부터 유래될 수 있다. 대조군 샘플 또는 참조 샘플이 CD123-발현 암을 앓고 있지 않은 대상체로부터 유래되는 일부 실시 형태에서, 대조군 샘플 또는 참조 샘플에 대해 관찰된 양과 대비하여, 시험 샘플에 존재하는 CD123의 양의 관찰된 증가는 평가되는 대상체가 CD123-발현 암을 앓고 있음을 나타내는 지표이다. 대조군 샘플이 CD123-발현 암을 앓고 있지 않은 대상체로부터 유래되는 일부 실시 형태에서, 대조군 샘플 또는 참조 샘플에 대해 관찰된 양과 대비하여, 시험 샘플에 존재하는 CD123의 양의 관찰된 감소 또는 유사성은 평가되는 대상체가 CD123-발현 암을 앓고 있지 않음을 나타내는 지표이다. 대조군 샘플 또는 참조 샘플이 CD123-발현 암을 앓고 있는 대상체로부터 유래되는 일부 실시 형태에서, 대조군 샘플 또는 참조 샘플에 대해 관찰된 양과 대비하여, 시험 샘플에 존재하는 CD123의 양의 관찰된 유사성은 평가되는 대상체가 CD123-발현 암을 앓고 있음을 나타내는 지표이다. 대조군 샘플 또는 참조 샘플이 CD123-발현 암을 앓고 있는 대상체로부터 유래되는 일부 실시 형태에서, 대조군 샘플 또는 참조 샘플에 대해 관찰된 양과 대비하여, 시험 샘플에 존재하는 CD123의 양의 관찰된 감소는 평가되는 대상체가 CD123-발현 암을 앓고 있지 않음을 나타내는 지표이다.
일부 실시 형태에서, 대상체로부터 유래된 샘플 중의 CD123의 양은 샘플을 CD123에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 예컨대 본 명세서에 기재된 항체와 접촉시킴으로써 평가된다. CD123의 존재에 대해 평가되는 샘플은 혈액 샘플, 혈청 샘플, 순환 세포, 순환 종양 세포, 조직과 회합되지 않은 세포(즉, 유리 세포), 조직(예를 들어, 외과적으로 절제된 종양 조직, 생검 - 미세 바늘 흡인물을 포함함), 조직 프레파라트 등으로부터 유래될 수 있다.
다양한 태양에서, CD123의 양은 샘플을 CD123에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 접촉시킴으로써 결정된다. 일부 실시 형태에서, 샘플은 CD123에 특이적으로 결합하는 하나 초과 유형의 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 접촉될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 샘플은 CD123에 특이적으로 결합하는 제1 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 의해 접촉되고, 이어서 CD123에 특이적으로 결합하는 제2 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 의해 접촉될 수 있다. CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편, 예컨대 본 명세서에 기재된 것들은 이러한 능력에 사용될 수 있다.
CD123-특이적 항체 및 항원-결합 단편의 다양한 조합이 기재된 진단 방법을 수행하도록 "제1" 및 "제2" 항체 또는 항원-결합 단편을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD123-발현 암은 혈액암, 예컨대 급성 골수성 백혈병(AML), 골수이형성 증후군(MDS, 저위험 또는 고위험), 급성 림프구성 백혈병(ALL, 모든 아형을 포함함), 미만성 대 B-세포 림프종(DLBCL), 만성 골수성 백혈병(CML), 또는 아구성 형질세포양 수지상 세포 신생물(DPDCN)을 포함한다.
소정 실시 형태에서, CD123의 양은 웨스턴 블롯 분석, 방사면역검정, 면역형광측정, 면역침전, 평형 투석, 면역확산, 전기화학발광(ECL) 면역검정, 면역조직화학, 형광-활성화 세포 분류(FACS) 또는 ELISA 검정에 의해 결정된다.
기재된 진단 방법의 다양한 실시 형태에서, 대조군 샘플 또는 참조 샘플이 사용된다. 이러한 샘플은 사용되는 검정이 적절하게 수행되고 있음을 보장하는 양성 또는 음성 검정 대조군일 수 있으며; 예를 들어, 이러한 성질의 검정 대조군은 면역조직화학 검정에 일반적으로 사용될 수 있다. 대안적으로, 샘플은 건강한 대상체로부터의 생물학적 샘플 중의 CD123의 양에 대한 표준화된 참조물일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 시험된 대상체의 관찰된 CD123 수준은 CD123-발현 암을 갖는 것으로 알려진 대상체로부터의 샘플에서 관찰되는 CD123 수준과 비교될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 대조군 대상체는 특정 관심 암을 앓고 있을 수 있다. 일부 실시 형태에서, 대조군 대상체는 초기 암을 갖는 것으로 알려져 있는데, 이는 CD123-발현 암일 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 일부 실시 형태에서, 대조군 대상체는 중기 암을 갖는 것으로 알려져 있는데, 이는 CD123-발현 암일 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 일부 실시 형태에서, 대조군 대상체는 말기 암을 갖는 것으로 알려져 있는데, 이는 CD123-발현 암일 수 있거나 그렇지 않을 수 있다.
암의 모니터링 방법
대상체에서 CD123-발현 암을 모니터링하기 위한 방법이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시 형태에서, CD123-발현 암은 혈액암, 예컨대 급성 골수성 백혈병(AML), 골수이형성 증후군(MDS, 저위험 또는 고위험), 급성 림프구성 백혈병(ALL, 모든 아형을 포함함), 미만성 대 B-세포 림프종(DLBCL), 만성 골수성 백혈병(CML), 또는 아구성 형질세포양 수지상 세포 신생물(DPDCN)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 기재된 방법은 대상체로부터 유래된 시험 샘플에 존재하는 CD123의 양을 결정함으로써 CD123-발현 암이 진행 중인지, 퇴행 중인지, 또는 안정되게 유지되고 있는지를 평가하는 단계; 및 관찰된 CD123의 양을, 조기 시점에서 대상체로부터, 유사한 방식으로, 획득된 생물학적 샘플 중의 CD123의 양과 비교하는 단계를 수반하며, 여기서 시험 샘플과 조기 샘플 중의 CD123의 양 사이의 차이는 암이 진행 중인지, 퇴행 중인지, 또는 안정되게 유지되고 있는지의 지표를 제공한다. 이에 관하여, 조기 샘플에 대해 관찰된 양과 대비하여 증가된 CD123의 양을 갖는 시험 샘플은 CD123-발현 암의 진행을 나타낼 수 있다. 대조적으로, 조기 샘플에 대해 관찰된 양과 대비하여 감소된 CD123의 양을 갖는 시험 샘플은 CD123-발현 암의 퇴행을 나타낼 수 있다.
따라서, 조기 샘플에 대해 관찰된 양과 대비하여 CD123의 양에 있어서 유의하지 않은 차이를 갖는 시험 샘플은 CD123-발현 암에 대한 안정된 질환의 상태를 나타낼 수 있다. 일부 실시 형태에서, 대상체로부터 유래된 생물학적 샘플 중의 CD123의 양은 샘플을 CD123에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편, 예컨대 본 명세서에 기재된 항체와 접촉시킴으로써 평가된다. CD123의 존재에 대해 평가되는 샘플은 소변, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 복수, 순환 세포, 순환 종양 세포, 조직과 회합되지 않은 세포(즉, 유리 세포), 조직(예를 들어, 외과적으로 절제된 종양 조직, 생검 - 미세 바늘 흡인물을 포함함), 조직 프레파라트 등으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 대상체는 인간이다.
일부 실시 형태에서, CD123-발현 암의 모니터링 방법은 대상체의 생물학적 샘플을 CD123-특이적 항체 또는 그의 항원-결합 단편(예컨대, 표 1에 제공된 항체 및 단편으로부터 유도가능한 것들)과 접촉시키는 단계, 샘플에 존재하는 CD123의 양을 정량화하는 단계, 샘플에 존재하는 CD123의 양을, 조기 시점에서 동일한 대상체로부터, 유사한 방식으로, 획득된 생물학적 샘플 내에 있는 것으로 결정된 CD123의 양과 대비하는 단계; 및 대상체의 CD123 수준이 시간 경과에 따라 변화되었는지의 여부를 결정하는 단계를 수반할 것이다. 조기 샘플에 대해 관찰된 양과 대비하여 증가된 CD123의 양을 갖는 시험 샘플은 암의 진행을 나타낼 수 있다. 대조적으로, 조기 샘플에 대해 관찰된 양과 대비하여 감소된 CD123의 양을 갖는 시험 샘플은 CD123-발현 암의 퇴행을 나타낼 수 있다. 따라서, 조기 샘플에 대해 관찰된 양과 대비하여 CD123의 양에 있어서 유의하지 않은 차이를 갖는 시험 샘플은 CD123-발현 암에 대한 안정된 질환의 상태를 나타낼 수 있다. 일부 실시 형태에서, 샘플의 CD123 수준은 기지 표준 또는 참조 샘플과 대비될 수 있는데, 이는 기지 표준 또는 참조 샘플 단독으로 행해지거나, 또는 조기 시점에서 평가된 샘플에 대해 관찰된 CD123 수준에 더하여 행해진다. 추가의 실시 형태에서, 진단 방법 이후에는 암-특이적 치료를 실시하는 추가 단계가 행해질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 암-특이적 치료는 CD123-발현 암에 대해 유도될 수 있으며, 예컨대 본 명세서에 기재된 CD123 × CD3 다중특이성 항체이다.
다양한 태양에서, CD123의 양은 샘플을 CD123에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 접촉시킴으로써 결정된다. 일부 실시 형태에서, 샘플은 CD123에 특이적으로 결합하는 하나 초과 유형의 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 접촉될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 샘플은 CD123에 특이적으로 결합하는 제1 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 의해 접촉되고, 이어서 CD123에 특이적으로 결합하는 제2 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 의해 접촉될 수 있다. 항체, 예컨대 본 명세서에 기재된 것들은 이러한 능력에 사용될 수 있다.
표 1에 기재된 항체 및 항원-결합 단편의 다양한 조합이 기재된 모니터링 방법을 수행하도록 "제1" 및 "제2" 항체 또는 항원-결합 단편을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD123-발현 암은 혈액암, 예컨대 급성 골수성 백혈병(AML), 골수이형성 증후군(MDS, 저위험 또는 고위험), 급성 림프구성 백혈병(ALL, 모든 아형을 포함함), 미만성 대 B-세포 림프종(DLBCL), 만성 골수성 백혈병(CML), 또는 아구성 형질세포양 수지상 세포 신생물(DPDCN)을 포함한다.
소정 실시 형태에서, CD123의 양은 웨스턴 블롯 분석, 방사면역검정, 면역형광측정, 면역침전, 평형 투석, 면역확산, 전기화학발광(ECL) 면역검정, 면역조직화학, 형광-활성화 세포 분류(FACS) 또는 ELISA 검정에 의해 결정된다.
CD123을 검출하기 위한 키트
생물학적 샘플에서 CD123을 검출하기 위한 키트가 본 명세서에 제공된다. 이러한 키트는 본 명세서에 기재된 하나 이상의 CD123-특이적 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 및 키트의 사용에 대한 설명서를 포함한다.
제공된 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 용액 상태일 수 있거나; 동결건조될 수 있거나; 기재, 담체, 또는 플레이트에 고정될 수 있거나, 또는 검출가능하게 표지화될 수 있다.
기재된 키트는 또한 본 명세서에 기재된 방법을 수행하기에 유용한 추가 성분을 포함할 수 있다. 예로서, 키트는 대상체로부터 샘플을 획득하기 위한 수단, 대조군 샘플 또는 참조 샘플, 예를 들어 느리게 진행되는 암을 갖는 대상체 및/또는 암을 갖지 않는 대상체로부터의 샘플, 하나 이상의 샘플 구획, 및/또는 본 발명의 방법의 성능 및 조직 특이적 대조물 또는 표준물을 설명한 교육용 자료를 포함할 수 있다.
CD123의 수준을 결정하기 위한 수단은, 예를 들어 완충액 또는 CD123의 수준을 결정하기 위한 검정에서 사용하기 위한 다른 시약들을 추가로 포함할 수 있다. 설명서는, 예를 들어, 검정을 수행하는 것에 대한 인쇄된 설명서 및/또는 CD123의 발현의 수준을 평가하는 것에 대한 설명서일 수 있다.
기재된 키트는 또한 대상체로부터 샘플을 단리하기 위한 수단을 포함할 수 있다. 이들 수단은 대상체로부터 유체 또는 조직을 획득하기 위해 사용될 수 있는 시약 또는 장비 중 하나 이상의 아이템을 포함할 수 있다. 대상체로부터 샘플을 획득하기 위한 수단은 또한 혈액 샘플로부터 혈액 성분, 예컨대 혈청을 단리하기 위한 수단을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 키트는 인간 대상체에 대한 사용을 위해 설계된다.
다중특이성 항체
본 명세서에 기재된 항-CD123 항체의 결합 도메인은 표면 상에 CD123을 발현하는 세포를 인식한다. 상기에 기재된 바와 같이, CD123 발현은 암성 세포를 나타낼 수 있다. 특정 하위세트의 세포들에 대한 더 특이적인 표적화가 CD123 및 다른 표적에 결합하는 이중특이성 분자, 예컨대 항체 또는 항체 단편을 제조함으로써 달성될 수 있다. 그러한 추가의 표적의 예에는 CD3 및 CD33이 포함된다. 이는 CD123에 결합하는 제1 영역 및 추가의 항원에 결합하는 제2 결합 영역을 포함하는 분자를 제조함으로써 달성된다. 항원-결합 영역은 표적의 특이적 인식을 가능하게 하는 임의의 형태를 취할 수 있으며, 예를 들어 결합 영역은 중쇄 가변 도메인 또는 Fv(중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인의 조합)일 수 있거나 그를 포함할 수 있다. 따라서, CD123 및 다른 항원에 각각 결합하는 2개의 상이한 항원-결합 영역을 포함하는 이중특이성 분자가 제공된다.
본 명세서에 기재된 다중특이성 항체들 중 일부는 CD123 및 CD3에 각각 결합하는 2개의 상이한 항원-결합 영역을 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, CD123 및 CD3에 결합하는 다중특이성 항체(CD123 × CD3 다중특이성 항체) 및 그의 다중특이성 항원-결합 단편이 제공된다. 일부 실시 형태에서, CD123 × CD3 다중특이성 항체는, 쌍을 이루어서 CD123에 면역특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위를 형성하는 제1 중쇄(HC1) 및 제1 경쇄(LC1), 및 쌍을 이루어서 CD3에 면역특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 형성하는 제2 중쇄(HC2) 및 제2 경쇄(LC2)를 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, CD123 × CD3 다중특이성 항체는, 쌍을 이루어서 CD123에 면역특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위를 형성하는 제1 중쇄(HC1) 및 제1 경쇄(LC1)를 포함하는 CD123-특이적 아암, 및 쌍을 이루어서 CD3에 면역특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 형성하는 제2 중쇄(HC2) 및 제2 경쇄(LC2)를 포함하는 CD3-특이적 아암을 포함하는 이중특이성 항체이다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 이중특이성 항체는 전장 항체 구조를 갖는 항체를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "전장 항체"는 2개의 전장 항체 중쇄 및 2개의 전장 항체 경쇄를 갖는 항체를 지칭한다. 전장 항체 중쇄(HC)는 중쇄 가변 및 불변 도메인 VH, CH1, CH2, 및 CH3을 포함한다. 전장 항체 경쇄(LC)는 경쇄 가변 및 불변 도메인 VL 및 CL을 포함한다. 전장 항체는 어느 하나 또는 둘 모두의 중쇄에 C-말단 라이신(K)이 결여되어 있을 수 있다. 용어 "Fab-아암(Fab-arm)" 또는 "하프 분자(half molecule)"는 항원에 특이적으로 결합하는 하나의 중쇄-경쇄 쌍을 지칭한다.
본 명세서에 제공된 다중특이성 항체의 CD123-결합 아암은 전술된 CD123-특이적 항체들 중 임의의 것으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD123-결합 아암은 (i) 잔기 195-202(RARERVYE(서열 번호 234))를 포함하는 CD123 SP2 ECD의 절편 및/또는 잔기 156-161(RKFRYE(서열 번호 232))을 포함하는 CD123 SP2 ECD의 절편 및/또는 잔기 173―178(TEQVRDR(서열 번호 233))을 포함하는 CD123 SP2 ECD의 절편, 또는 (ii) 잔기 164-175(IQKRMQPVITEQ(서열 번호 228))를 포함하는 CD123 SP2 ECD의 절편 및/또는 잔기 184-189(LLNPGT(서열 번호 229))를 포함하는 CD123 SP2 ECD의 절편으로부터의 하나 이상의 잔기를 포함하는 에피토프에 결합한다. 일부 실시 형태에서, CD123-결합 아암은 CD123에 결합하기 위하여, (i) 잔기 195-202(RARERVYE(서열 번호 234))를 포함하는 CD123 SP2 ECD의 절편 및/또는 잔기 156-161(RKFRYE(서열 번호 232))을 포함하는 CD123 SP2 ECD의 절편 및/또는 잔기 173―178(TEQVRDR(서열 번호 233))을 포함하는 CD123 SP2 ECD의 절편, 또는 (ii) 잔기 164-175(IQKRMQPVITEQ(서열 번호 228))를 포함하는 CD123 SP2 ECD의 절편 및/또는 잔기 184-189(LLNPGT(서열 번호 229))를 포함하는 CD123 SP2 ECD의 절편으로부터의 하나 이상의 잔기를 포함하는 에피토프에 결합하는 CD123-특이적 항체 또는 항원-결합 단편과 경쟁한다. 이들 에피토프 내의 적어도 하나의 잔기에 결합하는 CD123-결합 아암은 또한 CD123 ECD 내의 추가의 잔기에 결합할 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD123-결합 아암은 중화 CD123-결합 아암이다. 중화 CD123-결합 아암은, TF-1 세포를 rhIL-3으로 자극 시에 STAT5 인산화의 감소를 측정함으로써 결정되는 바와 같이, CD123에 대한 IL-3의 결합을 억제할 수 있는 것들을 포함한다. 이중특이성 항체의 일부 실시 형태에서, CD123-결합 아암은 인간 CD123 SP1, 바람직하게는 그의 세포외 도메인에 결합한다.
그러한 CD123 SP1-결합 아암의 일부 예시적인 실시 형태에서, CD123에 결합하는 제1 항원-결합 영역은 표 1에 기재된 바와 같은 항체 클론으로부터 유래되는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다. 그러한 CD123 SP1-결합 아암의 일부 예시적인 실시 형태에서, CD123에 결합하는 제1 항원-결합 영역은 표 1에 기재된 바와 같은 항체 클론으로부터 유래되는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 및 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다. 그러한 CD123 SP1-결합 아암의 일부 예시적인 실시 형태에서, CD123에 결합하는 제1 항원-결합 영역은 클론 I3RB1, I3RB2, I3RB5, I3RB6, I3RB7, I3RB8, I3RB9, I3RB11, I3RB12, I3RB16, I3RB17, I3RB18, I3RB19, I3RB20, I3RB21, I3RB22, I3RB24, I3RB28, I3RB29, I3RB30, I3RB32, I3RB33, I3RB34, I3RB35, I3RB36, I3RB37, I3RB38, I3RB40, 또는 I3RB47의 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다. 그러한 CD123 SP1-결합 아암의 일부 예시적인 실시 형태에서, CD123에 결합하는 제1 항원-결합 영역은 클론 I3RB1, I3RB2, I3RB5, I3RB6, I3RB7, I3RB8, I3RB9, I3RB11, I3RB12, I3RB16, I3RB17, I3RB18, I3RB19, I3RB20, I3RB21, I3RB22, I3RB24, I3RB28, I3RB29, I3RB30, I3RB32, I3RB33, I3RB34, I3RB35, I3RB36, I3RB37, I3RB38, I3RB40, 또는 I3RB47의 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 및 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다. 그러한 CD123 SP1-결합 아암의 일부 예시적인 실시 형태에서, CD123에 결합하는 제1 항원-결합 영역은 표 1에 기재된 바와 같은 항체 클론으로부터 유래되는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 그러한 CD123 SP1-결합 아암의 일부 예시적인 실시 형태에서, CD123에 결합하는 제1 항원-결합 영역은 표 1에 기재된 바와 같은 항체 클론으로부터 유래되는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 그러한 CD123 SP1-결합 아암의 일부 예시적인 실시 형태에서, CD123에 결합하는 제1 항원-결합 영역은 클론 I3RB1, I3RB2, I3RB5, I3RB6, I3RB7, I3RB8, I3RB9, I3RB11, I3RB12, I3RB16, I3RB17, I3RB18, I3RB19, I3RB20, I3RB21, I3RB22, I3RB24, I3RB28, I3RB29, I3RB30, I3RB32, I3RB33, I3RB34, I3RB35, I3RB36, I3RB37, I3RB38, I3RB40, 또는 I3RB47의 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 그러한 CD123 SP1-결합 아암의 일부 예시적인 실시 형태에서, CD123에 결합하는 제1 항원-결합 영역은 클론 I3RB1, I3RB2, I3RB5, I3RB6, I3RB7, I3RB8, I3RB9, I3RB11, I3RB12, I3RB16, I3RB17, I3RB18, I3RB19, I3RB20, I3RB21, I3RB22, I3RB24, I3RB28, I3RB29, I3RB30, I3RB32, I3RB33, I3RB34, I3RB35, I3RB36, I3RB37, I3RB38, I3RB40, 또는 I3RB47의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
이중특이성 항체의 일부 실시 형태에서, CD123-결합 아암은 인간 CD123 SP2, 바람직하게는 그의 세포외 도메인에 결합한다. 이중특이성 항체의 바람직한 실시 형태에서, CD123-결합 아암은 인간 CD123 SP1 및 인간 CD123 SP2, 그리고 더 바람직하게는 이들의 세포외 도메인에 결합한다. 그러한 CD123 SP2-결합 아암의 일부 예시적인 실시 형태에서, CD123에 결합하는 제1 항원-결합 영역은 클론 I3RB1, I3RB2, I3RB5, I3RB18, I3RB19, 또는 I3RB30의 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다. 그러한 CD123 SP2-결합 아암의 일부 예시적인 실시 형태에서, CD123에 결합하는 제1 항원-결합 영역은 클론 I3RB1, I3RB2, I3RB5, I3RB18, I3RB19, 또는 I3RB30의 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 및 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다. 그러한 CD123 SP2-결합 아암의 일부 예시적인 실시 형태에서, CD123에 결합하는 제1 항원-결합 영역은 클론 I3RB1, I3RB2, I3RB5, I3RB18, I3RB19, 또는 I3RB30의 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 그러한 CD123 SP2-결합 아암의 일부 예시적인 실시 형태에서, CD123에 결합하는 제1 항원-결합 영역은 클론 I3RB1, I3RB2, I3RB5, I3RB18, I3RB19, 또는 I3RB30의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
이중특이성 항체의 일부 실시 형태에서, CD123-결합 아암은 또한 사이노몰거스 CD123, 바람직하게는 그의 세포외 도메인에 결합한다.
이중특이성 항체의 일부 실시 형태에서, CD123-결합 아암은 CD123에 결합하기 위하여, 항체 클론 I3RB2, I3RB60, I3RB70, I3RB79, 또는 I3RB118과 경쟁하는 CD123-특이적 항체로부터 유래된다. 이중특이성 항체의 일부 실시 형태에서, CD123-결합 아암은 CD123에 결합하기 위하여, 항체 클론 I3RB18, I3RB49, 또는 I3RB55와 경쟁하는 CD123-특이적 항체로부터 유래된다. 결합에 대한 경쟁은, 하기에서 실시예 5에 기재된 기법에 따라 경쟁 결합 ELISA를 사용하여 결정될 수 있다. 제2 항체에 의한 제1 항체의 결합의 적어도 20% 억제를 검출함으로써 경쟁적 결합이 결정될 수 있는데, 이는 항체들이 CD123에 결합되는 순서와는 관계없다(즉, 항체 A가 항체 B보다 먼저 CD123에 결합되는 경우, 단지 10% 억제가 관찰되지만, 항체 B가 항체 A보다 먼저 CD123에 결합되는 경우, 30% 억제가 관찰되는데, 20% 초과의 억제가 실험 중 하나에서 관찰되었기 때문에, 경쟁적 결합으로 결론지을 수 있다).
일부 실시 형태에서, 다중특이성 항체의 CD123-결합 아암은 IgG 또는 그의 유도체, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4 동종형이다. CD123-결합 아암이 IgG1 동종형을 갖는 일부 실시 형태에서, 그것은 그의 Fc 영역 내에 L234A, L235A, 및 K409R 치환(들)을 함유한다. CD123-결합 아암이 IgG4 동종형을 갖는 일부 실시 형태에서, 그것은 그의 Fc 영역 내에 S228P, L234A, 및 L235A 치환(들)을 함유한다.
이중특이성 항체의 일부 실시 형태에서, 제2 항원-결합 아암은 인간 CD3에 결합한다. 일부 바람직한 실시 형태에서, CD123 × CD3 이중특이성 항체의 CD3-특이적 아암은 인간 1차 T 세포 및/또는 사이노몰거스 원숭이 1차 T 세포에 결합하고 그것을 활성화하는 CD3-특이적 항체로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, CD3-결합 아암은 CD3ε의 N-말단에 있는 에피토프에 결합한다. 일부 실시 형태에서, CD3-결합 아암은 CD3ε의 6개의 N-말단 아미노산을 포함하는 에피토프와 접촉한다. 일부 실시 형태에서, 이중특이성 항체의 CD3-특이적 결합 아암은 마우스 IgG3/람다 동종형인 마우스 단일클론 항체 SP34로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, CD3-결합 아암은 항체 SP34의 CDR을 포함한다. 그러한 CD3-결합 아암은 5×10-7 M 이하, 예컨대 1×10-7 M 이하, 5×10-8 M 이하, 1×10-8 M 이하, 5×10-9 M 이하, 또는 1×10-9 M 이하의 친화도로 CD3에 결합할 수 있다. CD3-특이적 결합 아암은 마우스 단일클론 항체 SP34의 아암의 인간화 버전일 수 있다. CD3-특이적 아암의 유래가 되는 항-CD3 항체를 인간화하기 위해 인간 프레임워크 적응화(HFA)가 사용될 수 있다. 이중특이성 항체의 일부 실시 형태에서, CD3-결합 아암은 표 2로부터 선택되는 중쇄와 경쇄 쌍을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD123 × CD3 이중특이성 항체의 CD3-결합 아암은 표 3으로부터 유래된다.
일부 실시 형태에서, CD3-결합 아암은 IgG 또는 그의 유도체이다. 일부 실시 형태에서, CD3-결합 아암은 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4이다. CD3-결합 아암이 IgG1 동종형을 갖는 일부 실시 형태에서, 그것은 그의 Fc 영역 내에 L234A, L235A, 및 F405L 치환(들)을 함유한다. CD3-결합 아암이 IgG4 동종형을 갖는 일부 실시 형태에서, 그것은 그의 Fc 영역 내에 S228P, L234A, L235A, F405L, 및 R409K 치환(들)을 함유한다. 일부 실시 형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 IgG-AA Fc이다. 일부 실시 형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 IgG-AA Fc-L234A, L235A, 및 F405L이다. 일부 실시 형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 1차 인간 T 세포 상의 CD3ε에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 1차 사이노몰거스 T 세포 상의 CD3ε에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 1차 인간 및 사이노몰거스 T 세포 상의 CD3ε에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 1차 인간 CD4+ T 세포를 활성화한다. 일부 실시 형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 1차 사이노몰거스 CD4+ T 세포를 활성화한다.
일부 실시 형태에서, 항체 클론 I3RB179, I3RB180, I3RB181, I3RB182, I3RB183, I3RB186, I3RB187, I3RB188, I3RB189, CD3B191, Ab 7959, Ab3978, Ab 7955, Ab 9958, Ab 8747, Ab 8876, Ab 4435, 또는 Ab 5466의 중쇄를 포함하는 CD123-결합 아암을 갖는 CD123 × CD3 이중특이성 항체가 제공된다. 일부 실시 형태에서, 항체 클론 I3RB179, I3RB180, I3RB181, I3RB182, I3RB183, I3RB186, I3RB187, I3RB188, I3RB189, CD3B191, Ab 7959, Ab3978, Ab 7955, Ab 9958, Ab 8747, Ab 8876, Ab 4435, 또는 Ab 5466의 중쇄 및 경쇄를 포함하는 CD123-결합 아암을 갖는 CD3 × CD123 이중특이성 항체가 제공된다. 일부 실시 형태에서, 항체 클론 I3RB179, I3RB180, I3RB181, I3RB182, I3RB183, I3RB186, I3RB187, I3RB188, I3RB189, CD3B191, Ab 7959, Ab3978, Ab 7955, Ab 9958, Ab 8747, Ab 8876, Ab 4435, 또는 Ab 5466의 중쇄를 포함하는 CD3-결합 아암을 갖는 CD3 × CD3 이중특이성 항체가 제공된다. 일부 실시 형태에서, 항체 클론 I3RB179, I3RB180, I3RB181, I3RB182, I3RB183, I3RB186, I3RB187, I3RB188, I3RB189, CD3B191, Ab 7959, Ab3978, Ab 7955, Ab 9958, Ab 8747, Ab 8876, Ab 4435, 또는 Ab 5466의 중쇄 및 경쇄를 포함하는 CD3-결합 아암을 갖는 CD3 × CD3 이중특이성 항체가 제공된다. 일부 실시 형태에서, 항체 클론 I3RB179, I3RB180, I3RB181, I3RB182, I3RB183, I3RB186, I3RB187, I3RB188, I3RB189, CD3B191, mAB 7959, Ab3978, Ab 7955, Ab 9958, Ab 8747, Ab 8876, Ab 4435, 또는 Ab 5466의 중쇄를 포함하는 CD123-결합 아암 및 항체 클론 I3RB179, I3RB180, I3RB181, I3RB182, I3RB183, I3RB186, I3RB187, I3RB188, I3RB189, CD3B191, AbB 7959, Ab3978, Ab 7955, Ab 9958, Ab 8747, Ab 8876, Ab 4435, 또는 Ab 5466의 중쇄를 포함하는 CD3-결합 아암을 갖는 CD123 × CD3 이중특이성 항체가 제공된다. 일부 실시 형태에서, 항체 클론 I3RB179, I3RB180, I3RB181, I3RB182, I3RB183, I3RB186, I3RB187, I3RB188, I3RB189, CD3B191, Ab 7959, Ab3978, Ab 7955, Ab 9958, Ab 8747, Ab 8876, Ab 4435, 또는 Ab 5466의 중쇄 및 경쇄를 포함하는 CD123-결합 아암 및 항체 클론 I3RB179, I3RB180, I3RB181, I3RB182, I3RB183, I3RB186, I3RB187, I3RB188, I3RB189, CD3B191, Ab 7959, Ab3978, Ab 7955, Ab 9958, Ab 8747, Ab 8876, Ab 4435, 또는 Ab 5466의 중쇄 및 경쇄를 포함하는 CD3-결합 아암을 갖는 CD123 × CD3 이중특이성 항체가 제공된다.
바람직한 CD123 × CD3 이중특이성 항체가 표 13 및 표 17에 제공되어 있다.
상이한 포맷의 이중특이성 항체들이 기재되어 왔고, 최근에는 문헌[Chames and Baty (2009) Curr Opin Drug Disc Dev 12: 276]에 의해 검토되었다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 이중특이성 항체는 다이아바디, 크로스-바디(cross-body), 또는 본 발명에 기재된 것들로서의 제어된 Fab 아암 교환을 통해 획득된 이중특이성 항체이다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 항체는, 이종이량체화를 강제로 일으키는 상보적 CH3 도메인을 갖는 IgG-유사 분자; 재조합 IgG-유사 이중 표적화 분자 - 여기서는, 분자의 2개의 측 각각이 적어도 2개의 상이한 항체의 Fab 단편 또는 Fab 단편의 일부를 함유함 -; IgG 융합 분자 - 여기서는, 전장 IgG 항체가 추가 Fab 단편 또는 Fab 단편의 일부에 융합됨 -; Fc 융합 분자 - 여기서는, 단일쇄 Fv 분자 또는 안정화된 다이아바디가 중쇄 불변-도메인, Fc-영역 또는 이들의 일부에 융합됨 -; Fab 융합 분자 - 여기서는, 상이한 Fab-단편들이 함께 융합됨 -; ScFv- 및 다이아바디-기반 및 중쇄 항체(예를 들어, 도메인 항체, 나노바디) - 여기서는, 상이한 단일쇄 Fv 분자들 또는 상이한 다이아바디 또는 상이한 중쇄 항체들(예를 들어, 도메인 항체, 나노바디)이 서로 또는 다른 단백질 또는 담체 분자에 융합됨 - 를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 상보적 CH3 도메인 분자를 갖는 IgG-유사 분자는 Triomab/Quadroma (Trion Pharma/Fresenius Biotech), 놉-인투-홀(Knob-into-Hole) (Genentech), CrossMAb (Roche) 및 정전기적으로 일치된 항체(electrostatically-matched) (Amgen), LUZ-Y (Genentech), 가닥 교환 조작된 도메인 바디(Strand Exchange Engineered Domain body)(SEEDbody) (EMD Serono), Biclonic (Merus) 및 DuoBody (Genmab A/S)를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 재조합 IgG-유사 이중 표적화 분자는 이중 표적화(Dual Targeting)(DT)-Ig (GSK/Domantis), 투-인-원 항체(Two-in-one Antibody) (Genentech), 가교결합된(Cross-linked) Mab (Karmanos Cancer Center), mAb2 (F-Star) 및 CovX-바디 (CovX/Pfizer)를 포함한다.
일부 실시 형태에서, IgG 융합 분자는 이중 가변 도메인(Dual Variable Domain)(DVD)-Ig (Abbott), IgG-유사 이중특이성 항체(IgG-like Bispecific (InnClone/Eli Lilly), Ts2Ab (MedImmune/AZ) 및 BsAb (Zymogenetics), HERCULES (Biogen Idec) 및 TvAb (Roche)를 포함한다.
일부 실시 형태에서, Fc 융합 분자는 ScFv/Fc 융합(Fusion) (Academic Institution), SCORPION (Emergent BioSolutions/Trubion, Zymogenetics/BMS), 이중 친화성 재표적화 기술(Dual Affinity Retargeting Technology)(Fc-DART) (MacroGenics) 및 이중(Dual)(ScFv)2-Fab (National Research Center for Antibody Medicine--China)를 포함한다.
일부 실시 형태에서, Fab 융합 이중특이성 항체는 F(ab)2 (Medarex/AMGEN), 이중-작용(Dual-Action) 또는 Bis-Fab (Genentech), 독-앤드-록(Dock-and-Lock)(DNL) (ImmunoMedics), 2가 이중특이성 항체(Bivalent Bispecific) (Biotecnol) 및 Fab-Fv (UCB-Celltech)를 포함한다. ScFv-, 다이아바디-기반 및 도메인 항체는 이중특이성 T 세포 인게이저(Bispecific T Cell Engager)(BITE) (Micromet), 탠덤 다이아바디(Tandem Diabody)(Tandab) (Affimed), 이중 친화성 재표적화 기술(DART) (MacroGenics), 단일쇄 다이아바디(Single-chain Diabody) (Academic), TCR-유사 항체(TCR-like Antibody) (AIT, ReceptorLogics), 인간 혈청 알부민 ScFv 융합(Human Serum Albumin ScFv Fusion) (Merrimack) 및 COMBODY (Epigen Biotech), 이중 표적화 나노바디(dual targeting nanobody) (Ablynx), 이중 표적화 중쇄 단독 도메인 항체를 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
본 발명의 전장 이중특이성 항체는, 예를 들어 2개의 단일특이성 2가 항체들 사이에서의 Fab 아암 교환(또는 하프 분자 교환)을 사용하여 생성될 수 있는데, 이는 공발현을 사용하거나 또는 무세포 환경에서의 시험관내에서, 각각의 하프 분자 내의 중쇄 CH3 계면에 치환을 도입하여 별개의 특이성을 갖는 2개의 항체 하프 분자의 이종이량체 형성을 유리하게 함으로써 행해진다. Fab 아암 교환 반응은 이황화물-결합 이성질화 반응 및 CH3 도메인의 해리-회합의 결과이다. 모 단일특이성 항체의 힌지 영역 내의 중쇄 이황화물 결합은 환원된다. 모 단일특이성 항체들 중 하나의, 생성된 유리 시스테인은, 제2 모 단일특이성 항체 분자의 시스테인 잔기와 중쇄간 이황화물 결합을 형성하고, 동시에 모 항체의 CH3 도메인이 해리-회합에 의해 방출 및 재형성된다. Fab 아암의 CH3 도메인은 동종이량체화에 비하여 이종이량체화에 유리하도록 조작될 수 있다. 생성된 산물은, 각각이 별개의 에피토프, 즉 CD123(IL3-Rα) 상의 에피토프 및 CD3 상의 에피토프에 결합하는 2개의 Fab 아암 또는 하프 분자를 갖는 이중특이성 항체이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "동종이량체화"는 동일한 CH3 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄의 상호작용을 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "동종이량체"는 동일한 CH3 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "이종이량체화"는 동일하지 않은 CH3 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄의 상호작용을 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "이종이량체"는 동일하지 않은 CH3 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.
"놉-인-홀(knob-in-hole)" 전략(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO 2006/028936호 참조)이 전장 이중특이성 항체를 생성하는 데 사용될 수 있다. 간략하게 말해서, 인간 IgG 내의 CH3 도메인의 계면을 형성하는 선택된 아미노산이 CH3 도메인 상호작용에 영향을 주는 위치에서 돌연변이되어 이종이량체 형성을 촉진할 수 있다. 작은 측쇄(홀)를 갖는 아미노산이 제1 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 내로 도입되고, 큰 측쇄(노브)를 갖는 아미노산이 제2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 내로 도입된다. 2개의 항체의 공발현 후에, "홀"을 갖는 중쇄와 "노브"를 갖는 중쇄의 우선적인 상호작용의 결과로서 이종이량체가 형성된다. 노브와 홀을 형성하는 예시적인 CH3 치환 쌍은 하기와 같다(제1 중쇄의 제1 CH3 도메인 내의 변형된 위치/제2 중쇄의 제2 CH3 도메인 내의 변형된 위치로서 표현됨): T366Y/F405A, T366W/F405W, F405W/Y407A, T394W/Y407T, T394S/Y407A, T366W/T394S, F405W/T394S 및 T366W/T366S_L368A_Y407V.
하나의 CH3 표면에서 양으로 하전된 잔기를, 그리고 제2 CH3 표면에서 음으로 하전된 잔기를 치환함으로써 정전기 상호작용을 사용하여 중쇄 이종이량체화를 촉진하는 것과 같은 다른 전략이 사용될 수 있으며, 이는 미국 특허 출원 공개 제2010/0015133호; 미국 특허 출원 공개 제2009/0182127호; 미국 특허 출원 공개 제2010/028637호 또는 미국 특허 출원 공개 제2011/0123532호에 기재된 바와 같다. 다른 전략에서는, 미국 특허 출원 공개 제2012/0149876호 또는 미국 특허 출원 공개 제2013/0195849호에 기재된 바와 같이 하기의 치환(제1 중쇄의 제1 CH3 도메인 내의 변형된 위치/제2 중쇄의 제2 CH3 도메인 내의 변형된 위치로서 표현됨)에 의해 이종이량체화가 촉진될 수 있다: L351Y_F405AY407V/T394W, T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V, T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V, L351Y_Y407A/T366A_K409F, L351Y_Y407A/T366V K409F Y407A/T366A_K409F, 또는 T350V_L351Y_F405A Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W.
전술된 방법에 더하여, 본 발명의 이중특이성 항체는, 2개의 단일특이성 동종이량체성 항체의 CH3 영역 내에 비대칭 돌연변이를 도입시키고, 이황화물 결합 이성질화를 가능하게 하는 환원성 조건에서 2개의 모 단일특이성 동종이량체성 항체로부터 이중특이성 이종이량체성 항체를 형성함으로써 무세포 환경에서 시험관내에서 생성될 수 있는데, 이는 국제 특허 출원 공개 W02011/131746호에 기재된 방법에 따른 것이다. 이들 방법에서, 제1 단일특이성 2가 항체(예를 들어, 항-CD123(IL3-Rα) 항체) 및 제2 단일특이성 2가 항체(예를 들어, 항-CD3 항체)는 CH3 도메인에서 이종이량체 안정성을 촉진하는 소정의 치환을 갖도록 조작되며; 이들 항체는 힌지 영역 내의 시스테인이 이황화물 결합 이성질화를 거칠 수 있게 하기에 충분한 환원성 조건 하에서 함께 인큐베이션되고; 그럼으로써 Fab 아암 교환에 의해 이중특이성 항체를 생성한다. 인큐베이션 조건은 비환원성 상태로 최적으로 회복될 수 있다. 사용될 수 있는 예시적인 환원제는 2-메르캅토에틸아민(2-MEA), 다이티오트레이톨(DTT), 다이티오에리트리톨(DTE), 글루타티온, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP), L-시스테인 및 베타-메르캅토에탄올이며, 바람직하게는 환원제는 2-메르캅토에틸아민, 다이티오트레이톨 및 트리스(2-카르복시에틸)포스핀으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예를 들어, pH 5 내지 8에서, 예를 들어 pH 7.0에서 또는 pH 7.4에서 적어도 25 mM 2-MEA의 존재 하에서 또는 적어도 0.5 mM 다이티오트레이톨의 존재 하에서 20℃ 이상의 온도에서 90분 이상 동안의 인큐베이션이 사용될 수 있다.
기재된 CD123 × CD3 다중특이성 항체에 더하여, 기재된 CD123 × CD3 다중특이성 항체를 인코딩할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열이 또한 제공된다. 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 또한 제공되며, 마찬가지로 CD123 × CD3 다중특이성 항체를 발현하는 세포도 본 명세서에 제공된다. 개시된 벡터를 발현할 수 있는 세포가 또한 기재된다. 이들 세포는 포유류 세포(예컨대, 293F 세포, CHO 세포), 곤충 세포(예컨대, Sf7 세포), 효모 세포, 식물 세포, 또는 세균 세포(예컨대, E. 콜라이)일 수 있다. 기재된 항체는 또한 하이브리도마 세포에 의해 생성될 수 있다.
다중특이성 항체 및 그의 다중특이성 항원-결합 단편을 사용하는 치료적 조성물 및 치료 방법
상기에 논의된 CD123 이중특이성 항체, 예를 들어 상기 논의된 CD123 × CD3 이중특이성 항체는 요법에 유용하다. 특히, CD123 이중특이성 항체는 암을 치료하는 데 유용하다. 또한, 포유동물에서 과다증식성 장애의 치료를 위한 치료적 조성물이 본 명세서에 제공되며, 본 치료적 조성물은 본 명세서에 기재된 다중특이성 항체 또는 다중특이성 항원-결합 단편의 치료적 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 다중특이성 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 CD123 × CD3 다중특이성 항체, 또는 그의 다중특이성 항원-결합 단편, 그리고 더 바람직하게는 본 명세서에 기재된 바와 같은 CD123 × CD3 이중특이성 항체, 또는 그의 CD123 × CD3 이중특이성 항원-결합 단편이다. 일 실시 형태에서, 상기 약제학적 조성물은 하기를 포함하는(그러나 이로 한정되지 않는) CD123-발현 암의 치료를 위한 것이다: CD123-발현 혈액암, 예컨대 급성 골수성 백혈병(AML), 골수이형성 증후군(MDS, 저위험 또는 고위험), 급성 림프구성 백혈병(ALL, 모든 아형을 포함함), 미만성 대 B-세포 림프종(DLBCL), 만성 골수성 백혈병(CML), 또는 아구성 형질세포양 수지상 세포 신생물(DPDCN); 및 CD123이 발현되는 아직 결정되지 않은 다른 암. 상기에 논의된 특정 암을 포함한 암, 예컨대 혈액암을 치료하기 위해 사용될 수 있는 특정 이중특이성 항체는 항체 7959, 3978, 7955, 9958, 8747, 4435, 및 5466을 포함한다. 이들 특정 암을 포함한 암, 예컨대 혈액암을 치료하기에 유용한 이중특이성 항체의 하나의 예는 항체 9958이다. 이들 특정 암을 포함한 암, 예컨대 혈액암을 치료하기에 유용한 이중특이성 항체의 다른 예는 항체 3978이다. 이들 특정 암을 포함한 암, 예컨대 혈액암을 치료하기에 유용한 이중특이성 항체의 다른 예는 항체 8747이다. 이들 특정 암을 포함한 암, 예컨대 혈액암을 치료하기에 유용한 이중특이성 항체의 다른 예는 항체 7959이다.
본 명세서에 제공된 약제학적 조성물은 a) 본 발명의 다중특이성 항체 또는 항체 단편의 유효량, 및 b) 약제학적으로 허용되는 담체 - 이는 불활성이거나 생리학적으로 활성일 수 있음 - 를 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 다중특이성 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 CD123 × CD3 다중특이성 항체, 또는 그의 다중특이성 항원-결합 단편, 그리고 더 바람직하게는 본 명세서에 기재된 바와 같은 CD123 × CD3 이중특이성 항체, 또는 그의 CD123 × CD3 이중특이성 항원-결합 단편이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 생리학적으로 적합한 임의의 그리고 모든 용매, 분산 매체, 코팅, 항세균제 및 항진균제 등을 포함한다. 적합한 담체, 희석제 및/또는 부형제의 예에는 물, 식염수, 인산염 완충 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등뿐만 아니라, 이들의 임의의 조합 중 하나 이상을 포함한다. 많은 경우에, 조성물 중에 등장화제, 예컨대 당류, 폴리알코올, 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 특히, 적합한 담체의 관련 예에는 (1) 약 1 mg/mL 내지 25 mg/mL의 인간 혈청 알부민을 함유하거나 함유하지 않는 둘베코(Dulbecco) 인산염 완충 식염수, pH 약 7.4, (2) 0.9% 식염수(0.9% w/v 염화나트륨(NaCl)), 및 (3) 5% (w/v) 덱스트로스가 포함되고; 또한 산화방지제, 예컨대 트립타민 및 안정제, 예컨대 Tween 20®을 함유할 수 있다.
본 발명에서의 조성물은 또한, 필요하다면 치료되는 특정 장애를 위하여, 추가의 치료제를 함유할 수 있다. 바람직하게는, 다중특이성 항체 또는 항체 단편과 보충적 활성 화합물은 서로에게 불리한 영향을 주지 않는 상보적 활성을 가질 것이다. 바람직한 실시 형태에서, 추가의 치료제는 시타라빈, 안트라사이클린, 히스타민 다이하이드로클로라이드, 또는 인터류킨 2이다. 바람직한 실시 형태에서, 추가의 치료제는 화학치료제이다.
본 발명의 조성물은 다양한 형태일 수 있다. 이들은, 예를 들어 액체, 반고체, 및 고체 투여형을 포함하지만, 바람직한 형태는 의도된 투여 방식 및 치료적 응용에 좌우된다. 전형적인 바람직한 조성물은 주사가능 또는 주입가능 용액의 형태이다. 바람직한 투여 방식은 비경구(예를 들어, 정맥내, 근육내, 복막내, 피하) 투여이다. 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 조성물은 일정 시간에 걸쳐 연속 주입에 의해 또는 볼루스(bolus)로서 정맥내 투여된다. 다른 바람직한 실시 형태에서, 이들은 국부뿐만 아니라 전신 치료적 효과를 발휘하도록 근육내, 피하, 관절내, 골액낭내, 종양내, 종양 주변, 병변내, 또는 병변 주변 경로에 의해 주사된다.
본 발명의 항체, 항체 단편 또는 항체 접합체를 적절한 용매 중에 필요한 양으로 혼입시킨 후, 미세여과에 의해 멸균함으로써 비경구 투여를 위한 멸균 조성물이 제조될 수 있다. 용매 또는 비히클로서, 물, 식염수, 인산염 왕충 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등뿐만 아니라 이들의 조합도 사용될 수 있다. 많은 경우에, 조성물 중에 등장화제, 예컨대 당류, 폴리알코올, 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 이들 조성물은 또한 애쥬번트(adjuvant), 특히 습윤제, 등장화제, 유화제, 분산제 및 안정제를 함유할 수 있다. 비경구 투여를 위한 멸균 조성물은 또한 멸균 고체 조성물 형태로 제조될 수 있는데, 이것은 멸균수 또는 임의의 다른 주사가능 멸균 매체 중에서 사용 시에 용해될 수 있다.
다중특이성 항체 또는 항체 단편은 또한 경구 투여될 수 있다. 경구 투여를 위한 고체 조성물로서, 정제, 환제, 분말(젤라틴 캡슐, 샤세(sachet)) 또는 과립이 사용될 수 있다. 이들 조성물에서, 본 발명에 따른 활성 성분은 아르곤 스트림 하에서 하나 이상의 불활성 희석제, 예컨대 전분, 셀룰로스, 수크로스, 락토스 또는 실리카와 혼합된다. 이들 조성물은 또한 희석제 이외의 물질, 예를 들어 하나 이상의 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트 또는 활석, 착색제, 코팅(당-코팅 정제) 또는 글레이즈를 포함할 수 있다.
경구 투여를 위한 액체 조성물로서, 불활성 희석제, 예컨대 물, 에탄올, 글리세롤, 식물성 오일 또는 파라핀유를 함유하는 약제학적으로 허용되는 용액, 현탁액, 에멀젼, 시럽 및 엘릭서(elixir)가 사용될 수 있다. 이들 조성물은 희석제 이외의 물질, 예를 들어 습윤, 감미, 증점, 향미 또는 안정화 제품을 포함할 수 있다.
용량은 원하는 효과, 치료 지속시간 및 사용되는 투여 경로에 좌우되며; 이것은 대체로 성인의 경우 경구로 일일 5 mg 내지 1000 mg이며, 이때 단위 용량은 1 mg 내지 250 mg 활성 물질의 범위이다. 일반적으로, 의사는 치료되는 대상체의 연령, 체중 및 그에 특이적인 임의의 다른 인자들에 따라 적절한 투여량을 결정할 것이다.
또한, CD123+ 세포를 사멸하기 위한 방법이 본 명세서에 제공되며, 본 방법은 이를 필요로 하는 환자에게, 상기 CD123에 결합하고 T 세포를 동원하여 상기 CD123+ 세포를 사멸할 수 있는(즉, T 세포 방향전환) 다중특이성 항체를 투여함에 의한다. 본 발명의 다중특이성 항체 또는 항체 단편 중 임의의 것이 치료적으로 사용될 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 다중특이성 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 CD123 × CD3 다중특이성 항체, 또는 그의 다중특이성 항원-결합 단편, 그리고 더 바람직하게는 본 명세서에 기재된 바와 같은 CD123 × CD3 이중특이성 항체, 또는 그의 CD123 × CD3 이중특이성 항원-결합 단편이다.
바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 다중특이성 항체 또는 항체 단편은 포유동물에서의 과다증식성 장애의 치료에 사용된다. 더 바람직한 실시 형태에서, 상기에 개시되고 본 발명의 다중특이성 항체 또는 항체 단편을 함유하는 약제학적 조성물들 중 하나가 포유동물에서의 과다증식성 장애의 치료에 사용된다. 일 실시 형태에서, 장애는 암이다. 특히, 암은 하기를 포함하는(그러나 이로 한정되지 않는) CD123-발현 암이다: CD123-발현 혈액암, 예컨대 급성 골수성 백혈병(AML), 골수이형성 증후군(MDS, 저위험 또는 고위험), 급성 림프구성 백혈병(ALL, 모든 아형을 포함함), 미만성 대 B-세포 림프종(DLBCL), 만성 골수성 백혈병(CML), 또는 아구성 형질세포양 수지상 세포 신생물(DPDCN); 및 CD123이 발현되는 아직 결정되지 않은 다른 암. 바람직한 실시 형태에서, 다중특이성 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 CD123 × CD3 다중특이성 항체, 또는 그의 다중특이성 항원-결합 단편, 그리고 더 바람직하게는 본 명세서에 기재된 바와 같은 CD123 × CD3 이중특이성 항체, 또는 그의 CD123 × CD3 이중특이성 항원-결합 단편이다.
따라서, 본 발명의 약제학적 조성물은 CD123-발현 암을 포함하는(그러나 이로 한정되지 않는) 다양한 암의 치료 또는 예방에 유용하며, CD123-발현 암은 하기를 포함한다(그러나 이로 한정되지 않는다): CD123-발현 혈액암, 예컨대 급성 골수성 백혈병(AML), 골수이형성 증후군(MDS, 저위험 또는 고위험), 급성 림프구성 백혈병(ALL, 모든 아형을 포함함), 미만성 대 B-세포 림프종(DLBCL), 만성 골수성 백혈병(CML), 또는 아구성 형질세포양 수지상 세포 신생물(DPDCN); 및 CD123이 발현되는 아직 결정되지 않은 다른 암.
유사하게, 선택된 세포 집단의 성장을 억제하기 위한 방법이 본 명세서에 추가로 제공되며, 본 방법은 CD123-발현 표적 세포, 또는 그러한 표적 세포를 함유하는 조직을, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 존재 하에서, 단독으로의 또는 다른 세포독성제 또는 치료제와 병용된 본 발명의 다중특이성 항체 또는 항체 단편의 유효량과 접촉시키는 단계를 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 다중특이성 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 CD123 × CD3 다중특이성 항체, 또는 그의 다중특이성 항원-결합 단편, 그리고 더 바람직하게는 본 명세서에 기재된 바와 같은 CD123 × CD3 이중특이성 항체, 또는 그의 CD123 × CD3 이중특이성 항원-결합 단편이다. 바람직한 실시 형태에서, 추가의 치료제는 시타라빈, 안트라사이클린, 히스타민 다이하이드로클로라이드, 또는 인터류킨 2이다. 바람직한 실시 형태에서, 추가의 치료제는 화학치료제이다. 선택된 세포 집단의 성장을 억제하기 위한 방법은 시험관내, 생체내(in vivo), 또는 생체외(ex vivo)에서 실시될 수 있다.
시험관내 사용의 예에는, 이환된 또는 악성 세포를 사멸하기 위한, 동일한 환자 내로의 이식 전에의 자가 골수의 치료; 컴피턴트(competent) T 세포를 사멸하여 이식편-대-숙주-질병(GVHD)을 예방하기 위한, 이식 전에의 골수의 치료; 표적 항원을 발현하지 않는 원하는 변이체를 제외한 모든 세포를 사멸하기 위한 또는 원치 않는 항원을 발현하는 변이체를 사멸하기 위한, 세포 배양물의 치료가 포함된다. 비임상적 시험관내 사용의 조건은 당업자에 의해 용이하게 결정된다.
임상적 생체외 사용의 예는 암 치료에서 자가 이식 전에 골수로부터 종양 세포를 제거하기 위한 것이다. 치료는 하기와 같이 수행될 수 있다. 골수가 환자 또는 다른 개체로부터 수거되고, 이어서 본 발명의 세포독성제가 첨가된 혈청을 함유하는 배지 중에서 인큐베이션된다. 농도는 약 37℃에서 약 30분 내지 약 48시간 동안 약 10 uM 내지 1 uM의 범위이다. 인큐베이션의 시간 및 농도의 정확한 조건, 즉 용량은 당업자에 의해 용이하게 결정된다. 인큐베이션 후에, 골수 세포를 혈청을 함유하는 배지로 세척하고, 알려진 방법에 따라 i.v. 주입에 의해 환자에게 반환시킨다. 환자가 골수의 수거와 치료된 세포의 재주입의 시간 사이에 다른 치료, 예컨대 일련의 절제 화학요법 또는 전신 방사선 조사를 받는 상황에서, 치료된 골수 세포는 표준 의료 장비를 사용하여 액체 질소 중에 동결 상태로 저장된다.
임상적 생체내 사용을 위하여, 다중특이성 항체 또는 항원-결합 단편의 치료적 유효량이 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 예를 들어, CD123 × CD3 다중특이성 항체 및 그의 다중특이성 항원-결합 단편은 CD123-발현 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 CD123-발현 암의 치료에 유용할 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD123-발현 암은 혈액암, 예컨대 급성 골수성 백혈병(AML), 골수이형성 증후군(MDS, 저위험 또는 고위험), 급성 림프구성 백혈병(ALL, 모든 아형을 포함함), 미만성 대 B-세포 림프종(DLBCL), 만성 골수성 백혈병(CML), 또는 아구성 형질세포양 수지상 세포 신생물(DPDCN)이다. 바람직한 실시 형태에서, 다중특이성 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 CD123 × CD3 다중특이성 항체, 또는 그의 다중특이성 항원-결합 단편, 그리고 더 바람직하게는 본 명세서에 기재된 바와 같은 CD123 × CD3 이중특이성 항체, 또는 그의 CD123 × CD3 이중특이성 항원-결합 단편이다. 일부 실시 형태에서, 대상체는 포유동물, 바람직하게는 인간이다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성 항체 또는 항원-결합 단편은 멸균성에 대해 시험된 용액으로서 투여될 것이다.
상기의 치료 및 사용 방법에서의 투여 계획은 최적의 원하는 반응(예를 들어, 치료적 반응)을 제공하도록 조정된다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있거나, 수회 분할 용량이 시간 경과에 따라 투여될 수 있거나, 또는 치료적 상황의 위급 상황에 의해 지시되는 바와 같이 용량이 비례해서 감소 또는 증가될 수 있다. 비경구 조성물은 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위하여 투여 단위형으로 제형화될 수 있다.
다중특이성 항체 및 단편에 대한 효율적인 투여량 및 투여 계획은 치료하고자 하는 질병 또는 질환에 좌우되고, 당업자에 의해 결정될 수 있다. 본 발명의 화합물의 치료적 유효량에 대한 예시적인 비제한적인 범위는 약 0.001 내지 10 mg/㎏, 예컨대 약 0.001 내지 5 mg/㎏, 예를 들어 약 0.001 내지 2 mg/㎏, 예컨대 약 0.001 내지 1 mg/㎏, 예를 들어 약 0.001, 약 0.01, 약 0.1, 약 1 또는 약 10 mg/㎏이다.
본 기술분야에서 통상의 기술을 가진 의사 또는 수의사는 필요한 약제학적 조성물의 유효량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 예를 들어, 의사 또는 수의사는 약제학적 조성물에 사용되는 다중특이성 항체 또는 단편의 용량을 원하는 치료적 효과를 달성하기 위해 필요한 수준보다 더 낮은 수준에서 시작해서 원하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점차적으로 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 이중특이성 항체의 적합한 일일 용량은 치료적 효과를 생성하기에 유효한 최저 용량인 화합물의 그러한 양일 것이다. 투여는, 예를 들어 비경구, 예컨대 정맥내, 근육내 또는 피하 투여일 수 있다. 일 실시 형태에서, 다중특이성 항체 또는 단편은 mg/m2로 계산된 매주 투여량으로 주입에 의해 투여될 수 있다. 그러한 투여량은, 예를 들어, 하기에 따라 상기에 제공된 mg/㎏ 투여량을 기준으로 할 수 있다: 용량(mg/㎏)×70: 1.8. 그러한 투여는, 예를 들어 1 내지 8회, 예컨대 3 내지 5회 반복될 수 있다. 투여는 2 내지 24시간, 예컨대 2 내지 12시간의 기간에 걸쳐 연속 주입에 의해 수행될 수 있다. 일 실시 형태에서, 다중특이성 항체 또는 단편은 독성 부작용을 감소시키기 위해 장기간, 예컨대 24시간 초과에 걸쳐 느린 연속 주입에 의해 투여될 수 있다.
일 실시 형태에서, 다중특이성 항체 또는 단편은 주 1회 제공될 때 최대 8회, 예컨대 4 내지 6회 동안 고정 용량으로서 계산된 매주 투여량으로 투여될 수 있다. 그러한 계획은, 예를 들어 6개월 또는 12개월 후에, 필요하다면 1회 이상 반복될 수 있다. 그러한 고정 투여량은, 예를 들어, 70 ㎏의 체중 추산치로, 상기에 제공된 mg/㎏ 투여량을 기준으로 할 수 있다. 투여량은, 투여 시에 혈액 중의 본 발명의 이중특이성 항체의 양을 측정함으로써 결정 또는 조정될 수 있는데, 이는, 예를 들어 생물학적 샘플을 취하고, 본 발명의 다중특이성 항체의 CD123 항원 결합 영역을 표적으로 하는 항-이디오타입(anti-idiotypic) 항체를 사용함으로써 행해진다.
일 실시 형태에서, 다중특이성 항체 또는 단편은 유지 요법(maintenance therapy)에 의해, 예를 들어 6개월 이상의 기간 동안 주 1회 투여될 수 있다.
다중특이성 항체 또는 단편은 또한 암 발생 위험을 감소시키고/시키거나, 암 진행에서의 사건의 발생의 개시를 지연시키고/시키거나, 암이 관해기에 있을 때 재발 위험을 감소시키기 위하여 예방적으로 투여될 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 다중특이성 항체 및 그의 단편은 또한 병용 요법으로 투여될 수 있는데, 즉 치료하고자 하는 질병 또는 질환에 대해 관련된 다른 치료제와 병용되어 투여될 수 있다. 따라서, 일 실시 형태에서, 본 항체-함유 약제는 하나 이상의 추가의 치료제, 예컨대 화학치료제와의 병용을 위한 것이다. 일부 실시 형태에서, 다른 치료제는 시타라빈, 안트라사이클린, 히스타민 다이하이드로클로라이드, 또는 인터류킨 2이다. 그러한 병용 투여는 동시적, 개별적 또는 순차적 - 임의의 순서임 - 일 수 있다. 동시적 투여의 경우, 작용제들은, 필요에 따라, 하나의 조성물로서 또는 개별 조성물들로서 투여될 수 있다.
일 실시 형태에서, 대상체에서 CD123을 발현하는 세포를 수반하는 장애를 치료하기 위한 방법이 제공되며, 본 방법은 다중특이성 항체 또는 단편, 예컨대 본 명세서에 기재된 CD123 × CD3 이중특이성 항체의 치료적 유효량의 투여를 포함하고, 이를 필요로 하는 대상체에 대한 방사선요법이 제공된다. 일 실시 형태에서, 암을 치료 또는 예방하기 위한 방법이 제공되며, 본 방법은 다중특이성 항체 또는 단편, 예컨대 본 명세서에 기재된 CD123 × CD3 항체의 치료적 유효량의 투여를 포함하고, 이를 필요로 하는 대상체에 대한 방사선요법이 제공된다. 방사선요법은 방사선을 포함할 수 있거나, 또는 환자에 대한 방사성 의약품의 관련 투여가 제공된다. 방사선의 공급원은 치료되는 환자에 대해 외부 또는 내부에 있을 수 있다(방사선 치료는, 예를 들어 외부 빔 방사선 요법(EBRT) 또는 근접방사선요법(brachytherapy)(BT)의 형태일 수 있다). 그러한 방법을 실시하는 데 사용될 수 있는 방사성 원소는, 예를 들어 라듐, 세슘-137, 이리듐-192, 아메리슘-241, 금-198, 코발트-57, 구리-67, 테크네튬-99, 요오다이드-123, 요오다이드-131, 및 이리듐-111을 포함한다.
키트
본 명세서에는 키트가 또한 제공되며, 본 키트는, 예를 들어 기재된 다중특이성 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 및 특정 세포 유형의 사멸을 위한 항체 또는 단편의 사용에 대한 설명서를 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 다중특이성 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 CD123 × CD3 다중특이성 항체, 또는 그의 다중특이성 항원-결합 단편, 그리고 더 바람직하게는 본 명세서에 기재된 바와 같은 CD123 × CD3 이중특이성 항체, 또는 그의 CD123 × CD3 이중특이성 항원-결합 단편이다. 설명서는 시험관내, 생체내 또는 생체외에서 다중특이성 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용하는 것에 대한 지시사항을 포함할 수 있다.
전형적으로, 키트는 다중특이성 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 담긴 구획을 가질 것이다. 다중특이성 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 동결건조된 형태, 액체 형태, 또는 키트에 포함되기에 적합한 다른 형태일 수 있다. 키트는 또한 키트 내의 설명서에 기재된 방법을 실시하는 데 필요한 추가 요소들, 예컨대 동결건조된 분말을 재구성하기 위한 멸균 용액, 환자에게 투여하기 전에 다중특이성 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 병용하기 위한 추가 작용제, 및 다중특이성 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 환자에게 투여하는 데 도움이 되는 도구를 수용할 수 있다.
진단적 용도
본 명세서에 기재된 다중특이성 항체 및 단편은 또한 진단 목적으로 사용될 수 있다. 따라서, 또한, 본 명세서에 정의된 바와 같은 다중특이성 항체 또는 단편을 포함하는 진단용 조성물이 제공되고, 그의 용도에 대해 제공된다. 바람직한 실시 형태에서, 다중특이성 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 CD123 × CD3 다중특이성 항체, 또는 그의 다중특이성 항원-결합 단편, 그리고 더 바람직하게는 본 명세서에 기재된 바와 같은 CD123 × CD3 이중특이성 항체, 또는 그의 CD123 × CD3 이중특이성 항원-결합 단편이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 암 진단용 키트를 제공하며, 본 키트는 이중특이성 CD123 × CD3 항체, 및 CD123에 대한 항체의 결합을 검출하기 위한 하나 이상의 시약을 포함하는 용기를 포함한다. 시약은, 예를 들어 형광 태그, 효소 태그, 또는 다른 검출가능한 태그를 포함할 수 있다. 시약은 또한 효소적 반응을 위한 2차 또는 3차 항체 또는 시약을 포함할 수 있으며, 여기서 효소적 반응은 시각화될 수 있는 생성물을 생성한다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 다중특이성 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 방사성표지, 형광 표지, 에피토프 태그, 비오틴, 발색단 표지, ECL 표지, 효소, 루테늄, 111In-DOTA, 111In-다이에틸렌트라이아민펜타아세트산(DTPA), 고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제 및 베타-갈락토시다제, 또는 폴리-히스티딘 또는 당업계에 알려진 유사한 그러한 표지로 표지화될 수 있다.
하기의 실시예는 앞서의 개시내용을 보충하기 위해 그리고 본 명세서에 기재된 발명 요지에 대한 더 우수한 이해를 주기 위해 제공된다. 이들 실시예는 기재된 발명 요지를 한정하는 것으로 여겨져서는 안 된다. 본 명세서에 기재된 실시예 및 실시 형태는 단지 예시적인 목적을 위한 것이고, 그에 비추어 다양한 변형 또는 변화가 당업자에게 명백할 것이고, 이는 본 발명의 진정한 범주 내에 포함되어야 하고 그로부터 벗어나지 않고서 이루어질 수 있음이 이해된다.
실시예 1: 재료
CD123 세포주의 생성
항-CD123 선도항체(lead)를 평가하기 위한 스크리닝 툴로서 사용하기 위하여, 인간 CD123 SP1 ECD (아미노산 20-305)(서열 번호 1), 인간 CD123 SP2 ECD (서열 번호 2의 아미노산 19-227), 및 사이노(cyno) CD123 ECD (서열 번호 3의 아미노산 19―305)를 제시하는 pDisplay™ 벡터 세트를 생성하였다. 세포 표면 상에 단백질의 디스플레이를 가능하게 하는 포유류 발현 벡터, pDisplay (Invitrogen)를 사용하였다(도 1). pDisplay™로부터 발현된 단백질을, N-말단에서는 뮤린 Ig κ-쇄 리더 서열 - 이는 단백질을 분비 경로로 유도함 - 에, 그리고 C-말단에서는 혈소판 유래 성장 인자 수용체(PDGFR) 막관통 도메인 - 이는 단백질을 혈장 막에 고착시켜, 그것을 세포외 측 상에 디스플레이함 - 에 융합시킨다. pDisplay™로부터 발현된 재조합 단백질은 웨스턴 블롯 또는 면역형광에 의해 검출하기 위한 혈구응집소 A 및 myc 에피토프를 함유한다. CMV 프로모터가 발현을 구동시킨다.
표준 방법을 사용하여 벡터를 HEK293T 세포 내로 일시적으로 형질감염시켰다. 형질감염된 293F 부착성 세포를 안정한 플라스미드 통합을 위해 선택하고, 이어서 단세포를 분류하고, CD123 표면 수용체 발현을 BangsLabs Quantum FITC-5kit (카탈로그 번호 855, Bangs Laboratories, Inc)를 사용하여 FACS에 의해 정량화하였다. 각각의 세포주에 대해 10개의 단세포 클론의 세트를 스크리닝을 위하여 선택하고, CD123 ECD 발현에 대해 정량화하였다. 후속 히트 스크리닝(hit screening)에 사용된 세포주는 세포당 대략 500,000개 CD123 ECD 카피의 표면 발현을 가졌다.
가용성 CD123 ECD 단백질의 생성
CD123 SP1의 아미노산 20 내지 305(서열 번호 1)에 상응하는 재조합 인간 CD123 SP1 ECD-His 태그 단백질(로트 번호 LV081110A)을 파지 패닝 및 히트 스크리닝에서의 사용을 위하여 R&D Systems (번호 301-R3/CF)로부터 입수하였다. 단백질을 사용 전에 내독소에 대해 시험하고, 파지 패닝 연구를 위하여 비오티닐화하였다. 이 물질을 또한 결합 및 친화도 측정에 사용하였다.
인간 CD123 SP2의 아미노산 18-225(서열 번호 2)에 상응하는 재조합 인간 CD123 SP2 ECD 단백질을 결합 및 친화도 측정에서의 사용을 위해 정제하였다. cDNA를 유전자 합성 기법을 사용하여 제조하였다(미국 특허 제6,670,127호; 미국 특허 제6,521,427호). 합성 가용성 CD123 ECD SP2의 발현을 위한 플라스미드를 표준 분자생물학 기법을 사용하여 제조하였다. N-말단 gp67 신호 서열 및 c-말단 6-His 태그를 갖는 CD123 ECD SP2 유전자 단편을 pFastbac1 (Invitrogen)의 Eco RI 및 Not I 부위 내로 클로닝하고, High Five Cell (Invitrogen) 중에서 Bac to Bac 시스템 (Invitrogen)을 사용하여 발현시켰다. 분비된 단백질(서열 번호 226)을 HisTrap (GE) 및 Superdex 75 (GE) 컬럼을 통해 정제하였다. 이 물질을 결합 및 친화도 측정 및 에피토프 맵핑에 사용하였다.
가용성 CD123 ECD 단백질을 제조자의 설명서에 따라 SureLink 비오티닐화 키트(Biotinylation Kit) (KPL 번호 86-00-01)를 사용하여 비오티닐화였다. 단백질을 SDS/PAGE 상에서 이동시켜 단량체 상태를 확인하였다.
X-선 결정구조해석(crystallography)을 위한 항-CD3 항체
마우스 IgG3/람다 동종형인 SP34 mAb를 BD Biosciences Pharmingen (미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)(카탈로그 번호 556611)로부터 구매하였으며, 이는 서열 번호 4 및 5에 각각 나타낸 경쇄 및 중쇄를 포함하였다.
실시예 2: 항-인간 CD123 mAb의 확인
Vk1-39, 3-11, 3-20 및 4-1 경쇄 라이브러리와 쌍을 이룬 VH1-69, 3-23 및 5-51 중쇄 라이브러리로 이루어진 드 노보(de novo) 인간 Fab-pIX 라이브러리의 용액 패닝(solution panning)(문헌[Shi, L., et al J Mol Biol, 2010. 397(2): p. 385-396], 국제 특허 출원 공개 WO 2009/085462호)을 4회의 후속 라운드에서 기재된 바와 같은 비오티닐화 항원-스트렙타비딘 자성 비드 포획 방법(문헌[Rothe et al., J. Mol. Biol. 376:1182-1200, 2008]; 문헌[Steidl et al., Mol. Immunol. 46: 135-144, 2008])을 사용하여 수행하였다.
패닝의 제4 라운드 후에 pIX 유전자를 파지미드 DNA로부터 절제하여 가용성 his-태깅된 Fab 코딩 영역을 생성하였다. Fab를 E. 콜라이 중에서 발현시키고, ELISA에서 재조합 인간 CD123 SP1 ECD-His 태그 단백질에 대한 결합에 대해 스크리닝하였다. 간략히 말하면, 96웰 Nunc Maxisorp 플레이트 (Nunc 번호 437111)를 4℃에서 하룻밤 PBS 중 1 ㎍/mL의 양 항-인간 Fd (The Binding Site 번호 PC075)로 코팅하였다. Fab 발현 벡터를 함유하는 세균 콜로니를 탁해질(OD600
Figure pct00005
0.6) 때까지 딥웰 배양 플레이트에서 450 μL의 2xYT (카르베니실린) 중에서 성장시켰다. IPTG를 1 mM 농도까지 첨가함으로써 Fab 발현을 유도하였다. 배양물을 30℃에서 하룻밤 성장시키고, 이어서 원심분리에 의해 청징화하였다. 항-Fd 코팅된 Maxisorp 플레이트를 TBS, 0.5% Tween-20 (Sigma 번호 79039-10PAK)로 1회 세척하고, 실온에서 1시간 동안 웰당 200 μL의 PBS-Tween (0.5%) + 탈지분유(3%)로 블로킹하였다. 이 단계 및 모든 후속 단계에서, 플레이트를 TBS, 0.5% Tween-20 (Sigma 번호 79039-10PAK)으로 3회 세척하였다. 각각의 웰은 50 μL의 Fab 상층액을 받은 후, 실온에서 1시간 인큐베이션하였다. 세척 후, 50 uL의 비오티닐화 CD123을 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 50 μL의 스트렙타비딘:HRP (Pierce 번호 21130)를 1:5000 희석률로 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고, 50 uL의 화학발광 기질, PoD (Roche 번호 121-5829500001)를 제조자의 설명서에 따라 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 EnVision (Perkin Elmer) 플레이트 판독기 상에서 발광에 대해 판독하였다. 백그라운드에 비하여 5배 초과의 신호를 디스플레이하는 웰을 히트로 간주하였다.
재조합 인간 CD123 SP1 ECD-His 태그 단백질에 대한 결합을 보여준 클론을 중쇄(HC) 및 경쇄(LC) 가변 영역에서 서열분석하였다. 파지 패닝을 통해 총 52개의 고유 Fab 서열을 확인하였으며, 내부-융합(in-fusion) 클로닝에 의해 45개를 궁극적으로 IgG1 동종형으로 변환시켰다. (표 1) HC 및 LC 가변 영역의, PCR SuperMix High Fidelity 키트 (Life Technologies 번호 10790-020)를 사용하여 PCR-증폭에 의해 내부-융합 클로닝을 수행하고, In-Fusion® HD Cloning Plus 키트 (Clontech 번호 638909)를 사용하여 HC에 대해서는 vDR149에서의 그리고 LC에 대해서는 vDR157에서의 Esp3I 부위 내로 클로닝을 수행하였다. 히트들의 VH 및 VL이 하기 표 4에 나타나 있다.
[표 1]
Figure pct00006
Figure pct00007
[표 4]
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
실시예 3: hCD123 SP1, hCD123 SP2, 및 cynoCD123 SP1에 대한 MSD 세포 결합
조작된 pDisplay 세포에 대한 CD123 항체의 결합을 MSD(Mesoscale) 세포 결합 검정을 사용하여 평가하였다. 스크리닝 검정의 목적은 hCD123 SP1 및 SP2를 발현하는 세포에 결합된 항체를 확인하는 것뿐만 아니라 cynoCD123 SP1을 발현하는 세포와의 교차 반응성도 확인하는 것이었다.
세포를 고정시키고, 파지를 3회 반복하여 검정하였다. 간단히 말하면, 발현 상층액 또는 정제된 CD123 항체를 10 ㎍/mL로 정규화하였다. 웰당 5000개 세포를 384웰 플레이트(MA6000, 카탈로그 L21XB, MSD) 내로 플레이팅하고, 2시간 동안 접착되게 하였다. 이어서, 세포를 15분 동안 PBS 중 20% FBS (Gibco)로 블로킹하였다. 이어서, 항체 상층액을 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 그대로 두었다. 세포를 PBS로 3회 세척하고, 이어서 루테늄 표지화된 2차 항체 (Jackson Immuno Research)를 1 ㎍/mL로 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 추가의 세척 단계를 적용하고, 이어서 웰당 35 μL의 MSD 판독 완충액(Read buffer) T(계면활성제 무함유)를 첨가하고, 검출을 위하여 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, Sector Imager 2400 (MSD)을 사용하여 플레이트를 판독하였다. 데이터를 대조군에 대해 정규화하고, GraphPad Prism 버전 5를 사용하여 그래프로 나타내었다. 백그라운드보다 3배 더 큰 신호를 갖는 양성 결합제를 히트인 것으로 결정하였다(도 2a, 도 2b, 및 도 2c). 데이터 일관성을 위해 검정을 반복하였으며, 최고의 결합제들을 추가의 개발을 위해 선택하였다. 하기의 히트들이 3가지 모든 세포주에 대한 결합에 대해 양성이었다: I3RB2, I3RB5, I3RB8, I3RB18, I3RB20, I3RB21, 및 I3RB35.
실시예 4: SPR에 의한 친화도 측정.
ProteOn 친화도 측정
재조합 인간 CD123 SP1 ECD 및 CD123 SP2 ECD에 대한 29개의 항-CD123 후보의 친화도를 ProteOn XPR36 단백질 상호작용 어레이 시스템 (BioRad)을 사용하여 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 측정하였다.
CD123 SP1 ECD 또는 CD123 SP2 ECD 회합 및 해리의 속도를 각각의 변이체에 대하여 측정하였다. 아민-커플링 화학에 대한 제조사의 설명서를 사용하여, 염소 항-인간 IgG(Fc) 항체를 GLC 칩 (BioRad)의 표면에 공유 커플링함으로써 바이오센서 표면을 제조하였다. 대략 8800 RU(반복 단위)의 염소 항-인간 IgG(Fc) 항체(Jackson ImmunoResearch laboratories 제품 번호 109-005-098)를 고정시켰다. 고정된 RU는 또한 염소 항-마우스 Fc 항체를 포함하였는데, 염소 항-마우스 Fc 항체는 여기에서 기록된 것들에 포함되지 않은 다른 항체들을 포획하기 위해 첨가하였다. 혼합물은 1:1이기 때문에, 고정된 이들 RU의 약 50%는 염소 항-인간 Fc인 것으로 예상된다. 속도론 실험(kinetic experiment)을 전개 완충액(running buffer)(PBS pH 7.4, 0.005% P20, 3 mM EDTA) 중에서 25℃에서 수행하였다. 400 nM에서 시작하여 인간 CD123 SP1 ECD 및 CD123 SP2 ECD의 4배(1:3) 연속 희석물을 전개 완충액 중에 제조하였다. 평균 300 RU의 mAb(174 내지 600)를 센서 칩의 각각의 채널 상에 포획하였다. 포획된 후보를 함유하지 않는 참조 스폿(염소 항-인간 IgG(Fc)-변형된 표면)을 참조 표면으로서 사용하였다. mAb를 포획한 후, 40 μL/min으로 항원을 3분 주입하고(회합 단계), 이후에 10분간 완충액을 유동시켰다(해리 단계). 100 μL/min으로 0.85% 인산을 주입함으로써 칩 표면을 재생시켰다. 데이터를 기기 소프트웨어에서 처리하였다. 피분석물 주입에 대한 참조물질-감산된 곡선으로부터 완충액 주입에 의해 생성된 곡선을 감산함으로써, 데이터의 이중 참조 감산을 수행하였다. 군 적합도(group fit)와 함께 1:1 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델을 사용하여 데이터의 속도론 분석을 수행하였다. 각각의 mAb에 대한 결과를 Ka(kon 또는 결합-속도(on-rate)), Kd(koff 또는 해리-속도(off-rate)), KD(평형 해리 상수)의 형식으로 기록하였다.
결과는, 모든 29개 mAb는 CD123 SP1 ECD에 결합되었지만, 그들 중 단지 6개만이 CD123 SP2 ECD에 대한 결합을 보여준 것으로 나타내었다. 데이터 재현성에 접근하기 위하여, 이들 항체들 중 4개를 적어도 2회 반복하여 실시하였다. 일반적으로, 결과는, 낮은 결합-속도를 갖는 I3RB1을 제외하고는, 2회 반복 실시들 사이에 우수한 재현성을 나타내었다.
[표 5]
Figure pct00012
Biacore 친화도 측정.
또한, CD123 SP1 ECD 및 CD123 SP2 ECD에 대한 몇몇 항체의 친화도를 Biacore 기기를 사용하여 mAb 및 Fab 포맷 둘 모두로 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 측정하였다. Biacore 3000 (BIAcore, Inc., 지금은 GE Healthcare의 파트)을 사용하여 25℃에서 속도론 연구를 수행하였다. 염소 항-인간 IgG(Fc) 특이적 항체 (Jackson ImmunoResearch laboratories 제품 번호 109-005-098)를 카르복시메틸 덱스트란 코팅 금 표면(CM-5 칩, Biacore)의 2개의 유동 세포(통상 1 및 2)에 공유 부착시켰다. 양 항-인간 Fd 특이적 항체 (The Binding Site 제품 번호 PC075)를 카르복시메틸 덱스트란 코팅 금 표면(CM-5 칩, Biacore)의 2개의 유동 세포(통상 3 및 4)에 공유 부착시켰다. 덱스트란의 카르복시메틸 기를 N-에틸-N′-(3-다이메틸아미노프로필)카르보다이이미드(EDC) 및 N-하이드록시석신이미드(NHS)로 활성화하였다. 항체를 10 mM 소듐 아세테이트 중에서 pH 4.5에서 커플링하였다. 표면 상의 임의의 나머지 반응 부위를 에탄올아민과의 반응에 의해 블로킹하였다. 속도론적 결합 측정을 위하여, 항-CD123 항체를 항-인간 Fcγ 특이적 항체 상에 포획하였으며, 한편 5 또는 6 μL/min의 유량으로 항-CD123 분자를 주입함으로써 Fab를 항-Fd 특이적 항체 상에 포획하였다. 약 75 RU의 항체 및 약 50 RU의 Fab를 각각 포획하였다. Ab 및 Fab 포획 후에, 인간 CD123 SP1 또는 인간 CD123 SP2를 40 μL/min으로 1.6 nM 내지 400 nM의 농도로 주입하였다. 회합 데이터를 2분 동안 수집한 후, 10분간 해리하였다. 표면을 100 μL/min으로 30 μL의 100 mM H3PO4로 재생시켰다. 모든 샘플은 3 mM EDTA 및 0.005% 계면활성제 P20을 함유하는 D-PBS 중에 준비하였다. 기록된 데이터는 포획된 항체 또는 Fab를 함유하는 유동 세포와 포획된 항체 또는 Fab를 함유하지 않는 참조 세포 사이의 SPR 신호의 차이이다. 신호에 대한 추가의 기기상의 기여를 참조-공제된(reference-subtracted) 신호로부터 블랭크 주입으로부터의 데이터를 뺌으로써 제거하였다. 데이터를 3회 반복하여 실시하고, BIAevaluation 소프트웨어 (BIAcore, Inc.)를 사용하여 1:1 결합 모델을 통해 모든 농도에서의 회합 및 해리 단계를 적합화함으로써(전체 적합도(global fit)) 분석하였다. 2회 반복 실험을 실시하였으며, 이들은 양호하게 일치하였다. 제시된 데이터는 평균이다.
결과는 mAb(I3RB2, I3RB18, I3RB35, I3RB37)에 대한 CD123 SP1 ECD 및 CD123 SP2 ECD 결합의 친화도가 그들의 상응하는 Fab(I3RB120, I3RB119, I3RB121, I3RB122)와 일치하고 있음을 보여주었다(표 6). 분석된 모든 항-CD123에 대한 결과는 또한 CD123 SP1 ECD 및 CD123 SP2 ECD에 대한 Fab 결합의 친화도 범위가 각각 1.8 내지 46.9 nM 및 0.4 내지 12.5 nM임을 보여주었으며; 한편, mAb 결합의 친화도 범위는 각각 1.2 내지 52 nM 및 0.3 내지 11.7 nM이었다.
[표 6]
Figure pct00013
실시예 5: 7G3과의 경쟁
ELISA에 의한 CD123 경쟁적 검정
CD123 항체 패널을 7G3 결합 경쟁 ELISA에서 스크리닝하였다. 7G3은 중화 단일클론 항체이며, 이에 대한 에피토프는 CD123 SP1 항원의 최초의 50개 아미노산 내로 국부화되었다(미국 특허 제6177078B1호). 7G3 mAb를 BD Biosciences Pharmingen (미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재, 카탈로그 번호 554526)으로부터 구매하고, 제조자의 설명서(Meso Scale Discovery)에 따라 MSD Sulfo-Tag™ NHS-에스테르로 표지화하였다.
CD123 경쟁적 ELISA의 경우, 96웰 투명 Maxisorb 플레이트를, 중탄산염 완충액, pH 9.4 (Pierce 번호: 28382) 중에 준비된 100 μL/웰의 2 ㎍/mL 항-6x 히스티딘 (R&D Systems 카탈로그 번호: MAB050)으로 처리하고, 4 ℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 ELISA 세척 완충액(PBS, 0.01% Tween-20)으로 3회 세척하고, 이어서 Tween-20, PBST를 함유하는 StartingBlock (Thermo Scientific 번호: 37539) 300 μL/웰로 블로킹하였다. 모든 웰을 1 ng의 재조합 huCD123 ECD SP1로 처리하고, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 결합되지 않은 huCD123 ECD SP1을 ELISA 세척 완충액으로 세척하였다. 7G3 또는 마우스 IgG2A(mIgG2A)를 20 ㎍/mL로 발현 배지 (FreeStyle™ 발현 배지, Gibco 번호: 12338-018) 중에 준비하고, 플레이트에 그의 각각의 웰들에 대해 50 μl/웰로 2회 반복하여 첨가하였으며, 한편 시험 항-CD123 mAb를 나머지 웰에 50 μl/웰의 2 ㎍/mL 또는 니트(neat)로 첨가하고, 플레이트를 온화하게 진탕하면서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 비오티닐화 7G3을 모든 웰에 대해 100 ng/mL의 최종 농도로 첨가하고, 플레이트를 추가 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 ELISA 세척 완충액으로 3회 세척하고, 결합된 비오티닐화 7G3을 450 nm의 광학 밀도로 SA-HRP 접합체를 사용하여 검출하였다.
7G3:CD123 결합을 억제한 항-CD123 mAb는 활성의 20% 억제로 정의하였다. 즉, 항체가 인간 CD123 ECD에 대한 비오티닐화 7G3의 결합을 적어도 20% 억제할 수 있다면, 그러한 항체는 억제제인 것으로 간주되었다. 이러한 선택 기준에 기초하여, 하기의 3개의 억제제가 확인되었다: 13RB18, 13RB34, 및 13RB44(도 3).
실시예 6: pSTAT5 기능 검정
항체의 효능제 또는 길항제 활성을 평가하기 위하여, (구매되는 경우에) TF-1 세포를 사용하여 IL-3-유도 STAT5 포스포릴화의 세포-기반 검정에서 패널을 스크리닝하였다. 항-CD123 mAb 억제제의 존재는 rhIL-3에 의한 자극 시에 STAT5 포스포릴화의 감소를 야기한다. 20% 억제 기준을 STAT5 기능 검정에서 사용하였다(rhIL-3 활성의 20% 억제).
대략 50,000개 TF-1(인간 적백혈병) 세포를 96웰 플레이트의 각각의 웰에서 10% FBS를 함유하는 RPMI 60 μL 중에 플레이팅하고, 5% CO2 인큐베이터를 사용하여 37 ℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 모든 샘플은 발현 배지 중에 준비하였다(FreeStyleTM 발현 배지. Gibco 번호: 12338-018). 대조군 샘플은 20 ㎍/mL의 7G3, 또는 mIgG2A 동종형 대조군 70 μL/웰을 받았다. 나머지 웰에는, 70 μL/웰의 2 ㎍/mL 또는 니트 항-인간CD123 mAb 샘플을 첨가하였다. 모든 샘플을 5% CO2 인큐베이터를 사용하여 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 제로-, 7G3-, 또는 동종형-단독 처리된 세포를 제외하고는, 세포를 재조합 인간 IL-3, rhIL-3 (PeproTech 카탈로그 번호: 200-03)로 처리하였는데, 이때 10% FBS를 함유하는 RPMI 중 10 ng/mL의 최종 농도로 처리하였다. 이어서, 샘플을 5% CO2 인큐베이터를 사용하여 37 ℃에서 추가 15분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 웰당 46.7 μl의 빙랭 완전 용해 완충액으로 용해시키고, 샘플을 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 용해물을 10회 상하로 피펫팅함으로써 혼합하였다. 이어서, Meso Scale Discovery (MSD 번호: K15163D-2)로부터 그리고 제조자의 설명서에 따라 Phospho(Tyr694)/Total STAT5a,b 키트를 사용하여 포스포릴화 STAT5(pSTAT5a,b)를 결정하였다.
rhIL-3에 의한 STAT5 포스포릴화를 억제한 항-CD123 mAb는 활성의 20% 억제로 정의하였다. 즉, 항체가 rhIL-3에 의한 STAT5의 포스포릴화를 적어도 20% 억제할 수 있다면, 그러한 항체는 억제제인 것으로 간주되었다.
5개의 mAb가 STAT5의 IL-3 자극을 차단하는 능력을 보여주었다(도 4의 A). 이들 5개는 13RB18뿐만 아니라 13RB19, 13RB30, 13RB34, 및 13RB44도 포함하였다. 그러나, 1 ㎍/mL로 시험될 때에는, 단지 하나의 항체 13RB18만이 TF-1 세포에서 STAT5 포스포릴화의 IL-3 자극을 차단하였다(도 4의 B). 더욱이, 13RB18(B18)은 이 검정에서 용량 의존성을 보여주었다(도 4의 C). 이들 데이터로부터, I3RB18이 유일한 길항 항체인 것으로 결론지었다.
실시예 7: hCD123에 대한 1가 친화도의 확인
세포-표면 발현된 인간 또는 사이노 CD123 SP1에 대한 2개의 항-CD123 히트(I3RB120(I3RB2 Fab), I3RB119(I3RB18 Fab)의 Fab 결합을 MSD-세포 친화성 기술(MSD-Cell Affinity Technology)에 의해 2회 반복하여 분석하여, 세포-표면 CD123에 대한 1가 결합의 측정값을 획득하였다.
세포-표면 발현된 hCD123 또는 cynoCD123에 대한 선택된 항-CD123 선도항체의 1가 친화도를 MSD-세포 친화성 기법(MSD-CAT) 방법을 사용하여 수행하였다. MSD-CAT는 고처리량 포맷으로 온전한 세포를 사용하여 친화도를 결정하기 위한 무표지(label-free) 방법으로서 사내(in-house)에서 개발하였다. 이들 실험을 수행하여 세포-표면 인간 또는 사이노몰거스(사이노) CD123 SP1에 대한 항-CD123 후보들의 결합 친화도 및 특이성을 평가하였다. 이러한 분석은 재조합 가용성 사이노 CD123의 부재 하에서 인간 및 사이노 항원에 대한 항-CD123 후보들의 친화도의 비교를 가능하게 하였다. 사용된 세포주는 인간 pDisplay CD123SP1 및 사이노 pDisplay CD123SP1이었다. MSD-CAT 방법을 사용하여 이들 상호작용의 친화도를 측정하기 위하여, 고정 농도의 항-CD123(1000, 200, 40 및/또는 8 pM) 및 변동하는 농도의 세포(1.5 ×107 내지 0 762 ×107개 세포/mL)를 갖는 연속 혼합물을 제조하고, 4℃에서 24시간 동안 플레이트를 회전시킴으로써 평형에 도달하게 하였다. 이들 샘플을 0.05% 아지드, 1% BSA, 3 mM EDTA를 함유하는 DMEM 글루타맥스 배지 중에 준비하였다. (3.15 내지 4.18) X 106개 hCD123/세포 및 (4.78 내지 9.24) 106개 cyCD123/세포의 수용체 수를 반응 부피, 세포 밀도(세포수/L) 및 아보가드로수(Avogadro's number)에 기초하여 혼합물 중 M 수용체 농도로 변환시켰다. 이것은, 인간 CD123에 대해서는 104 nM 내지 5.3 pM, 그리고 사이노 CD123에 대해서는 12 nM 내지 0.6 pM의 농도 범위를 가져왔다. 평형 후에, 플레이트를 5분 동안 약 1000 rpm으로 원심분리하고, 유리 항-CD3을 상층액 상에서 검출하였다. 혼합물 중의 유리 항-CD123은 Mesoscale Discovery(MSD) 판독기 기기를 사용하여 전기화학발광(ECL)에 의해 검출하였다. 전기화학발광 면역검정(ECL)에 의해 평형화된 혼합물 중의 유리 항-CD123의 검출을 위하여, 검출 플레이트를 제조하였다. 검출 플레이트(SA-MSD 플레이트 상의 플레이트 결합된 항원)를 제조하기 위하여, MSD 스트렙타비딘 표준 플레이트를 5분 동안 50 μL/웰의 검정 완충액(PBS (Life Sciences GIBCO 14190-136), 0.05% Tween 20, 0.2% BSA)으로 블로킹하였다. 검정 완충액을 세척 없이 제거하고, 검정 완충액 중 0.7 ㎍/mL 비오티닐화 항원 50 μL/웰을 MSD 플레이트에 첨가하고, 하룻밤 인큐베이션하였다(4℃에서 약 16시간). 하룻밤 인큐베이션 후에, 코팅 항원의 제거 없이 150 μL/웰의 검정 완충액을 첨가함으로서 플레이트를 블로킹하고, 주위 온도에서 약 1시간 동안 인큐베이션하고, 세척 완충액(BSA를 함유하지 않는 검정 완충액)으로 5회 세척하였다. 샘플 플레이트로부터의 상층액 50 μL/웰을 항원-코팅된 플레이트에 전달하고, 60분 동안 인큐베이션하고, 이어서 세척 완충액으로 3회 세척하였다. 이후에, 루테늄 표지화된 검출 항체(항-인간 H+L) 50 μL/웰을 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이션하였다. 1시간 후에, 플레이트를 세척하고, 웰당 150 μL의 MSD 판독 완충액(d. H2O 중에 스톡(stock)을 1:4로 희석함으로써 제조됨)을 첨가하였다. 플레이트를 발광 수준에 대해 MSD Sector Imager 6000 판독기 상에서 즉시 판독하였다. MSD에 의해 검출된 ECL 신호는 혼합물 중의 % 유리 항체로 표현하였으며, Prism 소프트웨어에 소개된 (질량 작용의 법칙으로부터 도출된) 사용자 지정 식(user defined equation)을 사용하여 데이터를 분석하여 친화도를 결정하였다. 데이터는 I3RB18 및 그의 Fab(I3RB119)가 pM 친화도(또는 mAb에 대한 겉보기 친화도)를 갖는 세포-표면 CD123 SP1에 대한 가장 강한 결합제이지만, 사이노 CD123 SP1에 대해서는 10배 초과로 더 약하게 결합됨을 보여준다. I3RB18 및 그의 Fab(I3RB119)의 경우, mAb 또는 Fab의 cynoSP1 발현 세포에 대한 친화도 값을 얻는 것이 불가능하였다. 말할 수 있는 모든 것은 친화도가 12 nM 초과라는 것이다. 그러나, I3RB120은 nM 친화도로 두 항원 모두에 결합하지만, 그것은 5배 이하의 친화도로 인간 및 사이노 CD123 SP1에 결합한다. hCD123 SP1에 대해 SPR을 통해 획득된 친화도는 세포 상에서 관찰된 것보다 더 약하다. 이 차이는 세포 표면 상에의 항원의 제시 및 항체의 에피토프의 위치에 기인할 가능성이 가장 높다. 결과는 표 7에 나타나 있다.
[표 7]
Figure pct00014
I3RB2 Fab에 대해 측정된 친화도는 Proteon을 통해 획득된 mAb 데이터와 일치한다. 추가적으로, 이 Fab와 cynoCD123 세포 결합이 우수하며, 이는 I3RB2가 교차-반응성 히트라는 명백한 지표를 제공한다. I3RB18 mAb 및 그의 상응하는 Fab(I3RB119)의 평가는 재조합 CD123 SP1에 대한 Proteon을 통해 획득된 친화도가 세포 상에서 관찰된 것보다 더 약함을 나타낸다: 재조합 단백질에 대해서는 1 nM vs. 세포에 대해서는 55 내지 300 pM. 이 차이는 세포 표면 상에의 항원의 제시 및 항체의 에피토프의 위치에 기인할 가능성이 가장 높다. mAb 또는 Fab에 대해 친화도 값을 얻는 것은 불가능하였다(친화도 > 12 nM). 이는 항체가 1가 포맷에서는 교차-반응성이 아님을 시사할 것이다. 앞서의 세포 결합 데이터는 교차-반응성을 나타내었으며, 이는 세포 표면에 대한 2가 결합에 의해 촉진되었을 가능성이 가장 높았다.
실시예 8: 내인성 세포 결합
AML 세포 상의 내인성 CD123에 대한 I3RB2 및 I3RB18의 결합의 확인을 측정하였다. 세포 표면 상에 대략 75,000개 카피의 CD123을 발현하는 OCI-AML5 세포(DSMZ)를 용량 의존성 MSD 세포 결합 검정에 사용하였다. AML 세포에 대한 CD123 항체의 결합을 MSD(Mesoscale) 세포 결합 검정을 사용하여 평가하였다. 간단히 말하면, 발현 상층액 또는 정제된 CD123 항체를 40 ㎍/mL 내지 0.039 ㎍/mL의 용량 범위에서 사용하였다. 웰당 50,000개 세포를 96웰 플레이트(Mesoscale 고결합 플레이트) 내로 플레이팅하고, 2시간 동안 접착되게 하였다. 이어서, 세포를 PBS 중 20% FBS + Fc 블로킹제(Fc 블로킹제는 파파인-절단된 항체의 정제된 Fc 부분(서열 번호 209)임)로 15분 동안 블로킹하였다. 이어서, 항체 상층액을 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 그대로 두었다. 세포를 PBS로 3회 세척하고, 이어서 루테늄 표지화된 2차 항체 (Jackson Immuno Research)를 1 ㎍/mL로 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 추가의 세척 단계를 적용하고, 이어서 웰당 150 μL의 MSD 판독 완충액 T(계면활성제 무함유)를 첨가하고, 검출을 위하여 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, Sector Imager 2400 (MSD)을 사용하여 플레이트를 판독하였다. 데이터를 대조군에 대해 정규화하고, GraphPad Prism 버전 5를 사용하여 그래프로 나타내었다.
결과는 I3RB2 및 I3RB18이 용량 의존성 방식으로 OCI-AML5 세포 상에 발현된 내인성 CD123에 결합함을 보여주었다(도 5의 A 및 B). 양성 대조군, mAb 7G3이 또한 비교물로서 이 검정에 포함되었다(도 5의 C).
실시예 9: CD123mAB의 13RB2 및 13RB18과의 경쟁 결합 분석
다른 교차-반응성 CD123 SP1/SP2 히트들 및 7G3 대조군에 대한 13RB2 및 13RB18에 대해 경쟁 연구를 수행하여 항-CD123 항체 경쟁 그룹 또는 "에피토프 빈(epitope bin)"을 결정하였다.
경쟁적 ELISA를 위하여, 실시예 1에 기재된 바와 같이 생성된 5 μL(20 ㎍/mL)의 정제된 인간 CD123 ECD 단백질을 MSD HighBind 플레이트 (Meso Scale Discovery, 미국 매사추세츠주 게이더스버그 소재) 상에 실온에서 2시간 동안 웰당 코팅하였다. 150 μL-분취물의 5% MSD 블로커 A 완충액 (Meso Scale Discovery)을 각각의 웰에 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 0.1 M HEPES 완충액, pH 7.4로 3회 세척한 후, 표지화된 항-CD123 mAb와 상이한 경쟁자 항-CD123 mAb의 혼합물을 첨가하였다. 표지화된 항체(20 nM)를 2 μM의 비표지화된 항-CD123 경쟁자 항체와 인큐베이션하고, 이어서 25 μL 혼합물 부피로 지정된 웰에 첨가하였다. 실온에서 온화하게 진탕하면서 2시간 인큐베이션한 후에, 플레이트를 0.1 M HEPES 완충액(pH 7.4)으로 3회 세척하였다. MSD 판독 완충액 T를 증류수로 희석시키고(4배), 150 μL/웰의 부피로 분배하고, SECTOR Imager 6000으로 분석하였다. 항체를 제조사의 설명서 (Meso Scale Discovery)에 따라, MSD Sulfo-Tag™ NHS-에스테르로 표지화하였다.
경쟁 ELISA 결과는 I3RB2가 13RB60, 13RB70, 13RB79 및 13RB118과는 경쟁하지만, I3RB18을 포함한 다른 항체와는 경쟁하지 않음을 나타낸다(도 6의 A). I3RB2가 표지화되었을 경우에는, I3RB60과의 경쟁이 관찰되었지만; I3RB60이 표지화되었을 경우에는, 경쟁이 관찰되지 않았음에 주목해야 한다. 이에 대해 한 가지 가능한 이유는 일부 비특이적 결합 상호작용이다. I3RB18을 평가하였을 때, 13RB49 및 13RB55와는 경쟁하지만, 13RB2와는 경쟁하지 않는 것으로 확인되었다(도 6의 B).
경쟁 결합 분석은 교차-반응성 CD123 SP1/SP2 항체에 대해 2개의 경쟁 그룹을 규정하였다(도 8). 단일클론 항체 I3RB2는 I3RB18과 경쟁하지 않고, 이들은 상이한 에피토프 그룹에 속한다. 그룹 1(암회색)은 mAb 13RB2, 13RB60, I3RB70, I3RB79 및 I3R118을 포함한다. 그룹 2(담회색)는 mAb I3RB18, I3RB49 및 I3RB55로 이루어진다. 시판 mAb 7G3은 어떠한 사내 항-CD123 항체와도 경쟁하지 않는다.
[표 8]
Figure pct00015
실시예 10: I3RB2 및 I3RB18의 에피토프 맵핑
H/D 교환 연구.
인간 CD123 상의 I3RB2 및 I3RB18에 대한 에피토프를 확인하기 위하여, 용액 수소/중수소 교환-질량 분석(HDX-MS)을, 상응하는 Fab를 사용하여 수행하였다. H/D 교환에 있어서, Fab 섭동을 분석하기 위하여 사용된 절차는 이전에 기재된 것과 유사하되, 단 몇 가지 변형을 가하였다(문헌[Hamuro et al., J. Biomol. Techniques 14:171―182, 2003]; 문헌[Horn et al., Biochemistry 45:8488-8498, 2006]). CD123 SP2 ECD 항원을 이들 연구에 사용하였는데, 이 항원은 글리코실화 부위의 감소된 수로 인해 SP1 분자보다 덜 복잡하기 때문이다. 재조합 CD123 SP2 ECD(서열 번호 226)를 미리 결정된 시간 동안 중수소화 수용액 중에서 인큐베이션하여, 그 결과 교환가능한 수소 원자에서의 중수소 혼입을 가져왔다. 중수소화 CD123 SP2 ECD는 4℃에서 30초, 2분, 10분 및 60분 동안 43 μL의 산화중수소(D2O) 중에서 I3RB119(I3RB18의 Fab) 또는 I3RB120(I3RB2의 Fab)과 복합체를 형성하였다. 낮은 pH에 의해 교환 반응을 켄칭하고, 단백질을 펩신으로 분해하였다. 확인된 펩티드에서의 중수소 수준을 LC-MS 상에서의 질량 시프트로부터 모니터링하였다. 참조 대조군으로서, Fab 분자와 복합체를 형성하지 않은 것을 제외하고는 CD123 SP2 ECD 샘플을 유사하게 처리하였다. Fab에 결합된 영역은 교환으로부터 상대적으로 보호된 부위인 것으로 추론되며, 이에 따라 참조 CD123 SP2 ECD 샘플보다 더 높은 분율의 중수소를 함유한다. 약 94%의 단백질이 특정 펩티드로 맵핑될 수 있었다.
I3RB119 및 I3RB120에 대한 CD123 ECD SP2의 용액 HDX-MS 섭동 맵이 도 7의 A 및 B에 각각 나타나 있다. CD123 sp2의 아미노산 잔기 195―202에 상응하는 하나의 절편, 잔기 176-184(RARERVYEF(서열 번호 227))는 I3RB119에 의해 강하게 보호된다. CD123 sp2의 잔기 164―175 및 잔기 184―189 각각에 상응하는, 2개의 상이한 영역, 잔기 145-156(IQKRMQPVITEQ(서열 번호 228)) 및 잔기 165-170(LLNPGT(서열 번호 229))은 I3RB120에 의해 인식되었다. 이들 HDX-MS 결과는 I3RB119 및 I3RB120에 대한 펩티드 수준 에피토프를 시사한다. 이들 2개의 항체에 대해 중복된 에피토프 영역은 없었다. 이들 결과는 I3RB2와 I3RB18이 서로 경쟁하지 않는다는 앞서의 경쟁 결합 데이터와 일치한다.
실시예 11: 결정 구조에 의한 항-CD123 항체 I3RB18의 에피토프 맵핑
항체 I3RB18의 결합 에피토프를 X-선 결정구조해석에 의해 결정하였다.
항-CD123 mAb I3RB18의 단일쇄 Fv 단편을 하기 형태로 생성하였다: VL-(Gly4Ser)4-VH-Gly-His6(서열 번호 230). 이것을 HEK293 Expi 세포에서 발현시키고, 친화성 크로마토그래피(HisTrap) 및 이온 교환 크로마토그래피(Source 15S 및 Mono S)로 정제하였다.
C-말단 8xHis 태그를 갖는 인간 CD123 ECD(서열 번호 231)의 sp2 아이소형을 배큘로바이러스-감염된 곤충 세포에서 발현시키고, 친화성 크로마토그래피(HisTrap) 및 크기-배제 크로마토그래피(Superdex 75)로 정제하였다.
1.8 mg의 CD123(1.1 mg/mL)을 2.4 mg의 scFv(1.6 mg/mL)와 1:1.2(과량의 scFv)의 대략적인 몰비로 혼합하고, 4℃에서 하룻밤 인큐베이션함으로써 CD123:I3RB18 scFv 복합체를 제조하였다. 소규모(150 ㎍) SEC는 복합체 형성을 나타내었다. 이 단백질을 20 mM HEPES, pH 7.5, 100 mM NaCl 중에 18 mg/mL의 농도가 되게 하였다.
MRC 2웰 결정화 플레이트 (Swissci)에서 시팅 드롭(sitting drop) 포맷으로 20℃에서 증기 확산 방법에 의해 결정화를 수행하였다. X-선 실험에 적합한 복합체의 결정을 하기 조건 하에서 획득하였다: 2.0 M (NH4)2SO4, 0.1 M MES 완충액, pH 6.5. 결정 데이터는 표 9에 주어져 있다. 하나의 결정을 24% 글리세롤로 보충된 모액에 전달하고, 액체 질소 중에서 동결시키고, X-선 회절 데이터 수집에 사용하였다. 구조를 3.5 Å 분해능에서 결정하였다.
[표 9]
Figure pct00016
I3RB18은 CD123 sp2에, ECD의 (세포 표면에 근접한) C-말단 도메인에서 결합한다. 에피토프는 입체형태 에피토프이고, CD123 sp1의 잔기 234―239, 251―256 및 273―280에 상응하는, CD123 sp2 쇄의 3개의 절편, 잔기 156―161(RKFRYE(서열 번호 232)), 173―178(TEQVRD(서열 번호 233)) 및 195―202(RARERVYE(서열 번호 234))를 포함한다. 항체-항원 상호작용은 주로 정전기 상호작용이다. CD123 sp2 상의 에피토프는 많은 수의 염기성 잔기들을 함유하고, 한편 I3RB18의 CDR은 산성 잔기들로 구성된다. CD123의 결합에 관여하는 항체 잔기는 경쇄로부터의 7개의 잔기 및 중쇄로부터의 9개의 잔기를 포함한다(도 8). LCDR2를 제외한 모든 CDR이 결합에 관여한다.
CD123 SP2에 대한 I3RB18의 결합(도 9의 A)은 그것을 다른 항-CD123 항체, 7G3과 구별되게 하는데, 이는 CD123 SP1과 복합체를 형성한 인간화 7G3 Fab, CSL362의 결정 구조(도 9의 B)에 도시된 바와 같이 CD123 sp1 ECD의 N-말단 도메인 1에 결합한다(문헌[pdb:4JZJBroughton et al. Cell Rep. 2014; 8:410-419]).
실시예 11: 항-CD3 Fab의 결정 구조
SP34 Fab의 결정 구조를 2.1 Å 분해능에서 결정하였다. 이것은 완전한 아미노산 서열을 보여주었고, SP34 mAb의 유래가 되는 가능한 마우스 생식세포계열을 확인시켜 주었다.
재료
마우스 IgG3/람다 동종형인 SP34 mAb를 BD Biosciences Pharmingen(미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)(카탈로그 번호 556611)로부터 구매하였다. 기술 데이터 시트에 따라, 그것을 조직 배양 상층액으로부터 친화성 크로마토그래피로 정제하고, 4℃에서 저장하였다. Fab 단편을 mAb의 파파인 분해에 의해 생성하고 (Pierce, 카탈로그 번호 44985, Thermofisher), 제조사의 프로토콜에 따라 Nab 단백질 A 플러스 스핀(Protein A Plus Spin) 컬럼 (Pierce, 카탈로그 번호 44985, Thermofisher)을 사용하여 Fc로부터 분리하였다. Fab를 20 mM MES, pH 6.5(완충액 A)로 평형화된 MonoS 컬럼 (GE Healthcare) 상에서 추가로 정제하였다. 50 컬럼 부피 중에서 1 M NaCl의 13 내지 28% 구배로 완충액 A를 사용하여 용출을 수행하였다. 주 피크에 상응하는 분획들을 풀링(pooling)하고, 9.2 mg/mL로 농축시키고, 결정화에 사용하였다.
결정화
96웰 Corning 3550 플레이트에서 시팅 드롭 포맷으로 20℃에서 증기 확산 방법에 의해 결정화를 수행하였다. X-선 분석에 사용되는 Fab 결정을 12% PEG 3350, 0.2 M K/Na 주석산염(pH 7.4), 3% 아이소프로판올 및 3% 다이옥산으로부터 획득하였다. 결정 데이터는 표 10에 주어져 있다.
[표 10]
Figure pct00017
X-선 데이터 수집 및 구조 결정
X-선 데이터 수집을 위하여, 하나의 결정을 20% 글리세롤로 보충된 모액 중에 수초 동안 액침하고, 액체 질소 중에서 급속 동결시켰다. 회절 데이터를 Pilatus CCD 검출기를 사용하여 Advanced Photon Source(미국 일리노이주 아르곤 소재) IMCA 빔라인에서 수집하였다. X-선 데이터 통계가 표 10에 제공되어 있다.
이 구조를 IgG3/카파 동종형인 마우스 항-톰젠-프리덴라이히(Thomsen-Friedenreich) 항원 항체 Jaa-F11 (PDB 3gnm)로부터 작제된 Fab 모델을 사용하여 분자 대체에 의해 해석하였다. 모든 결정학적 계산은 CCP4 프로그램 제품군을 사용하여 수행하였다(문헌[CCP4. 1994, Acta Crystallogr. D50:760-763]). 모델 조정은 프로그램 COOT를 사용하여 수행하였다(문헌[Emsley P, and Cowtan K. 2004. Acta Crystallogr. D60:2126-2132]). 정밀화 통계가 표 10에 제공되어 있다.
SP34의 서열은 도 10에 나타나 있으며, 여기서 경쇄의 잔기 1―215 및 중쇄의 잔기 1-230은 전자 밀도 맵으로부터 직접 도출되고, 잔기 231―455는 IGHG3_MOUSE(마우스 IgG3, 아이소형 2)로부터 도출되었다.
실시예 12: 항-CD3 항체 SP34의 인간 프레임워크 적응화
항-CD3 뮤린 항체 SP34를 인간 프레임워크 적응화 방법에 의해 인간화하였다(문헌[Fransson, et al, JMB, 2010 398(2):214-31]). 4개의 상이한 중쇄를 3개의 상이한 경쇄와 조합하여 12개의 인간화 변이체를 생성하였다.
SP34 인간화 및 친화성 성숙
인간 생식세포계열의 선택
4개의 인간 중쇄 및 3개의 경쇄 가변 영역 서열의 매트릭스를 시험을 위하여 선택하였다. 인간 생식세포계열의 선택은 프레임워크 영역(FR)에서의 SP34와의 전체 서열 유사성에만 오로지 기초하였다. CDR 서열도, 그의 길이 또는 표준 구조도 이들 어느 것도 이 선택에서는 고려하지 않았다.
중쇄에 대한 가장 근접한 매치는 인간 GLs IGHV3-72 및 IGHV3-73이다. 다른 GL, IGHV3-23을, 인간 B-세포 레파토리에서의 그의 높은 발생 빈도로 인해 선택하였다.
경쇄에 대한 가장 근접한 매치는 인간 람다 GLs IGLV7-43 (aka 7a), IGLV7-46 (aka 7b) 및 IGLV1-51 (aka 1b)이다. IGLV7-46은 IGLV7-43과 사실상 동일하지만, 위치 2에 있는 Ala의 이점을 갖는데, 즉 이는 SP34에서와 같다.
선택된 J-영역은 하기와 같다: 중쇄에 대해서는 IGHJ1; 람다 경쇄에 대해서는 IGLJ3.
복귀 돌연변이
CDR-H3의 입체형태를 보존하기 위하여, VL 내의 몇몇 프레임워크 위치, 가장 특히는 위치 Val38, Gly48 및 Gly51(도 11)에서의 잔기는 유지되어야 한다. 이러한 '복귀 돌연변이'를 인간화 계획에 추가하였다.
중쇄의 위치 57에 있는 Asn은 이러한 구조에서 우수한 측쇄 밀도를 갖지 않는다. 이는 또한 CDR-H2의 중간에 놓여 있고, 전형적인 결합 위치로부터 멀어지는 쪽으로 향한다. 이러한 분석에 기초하여, 그것은 결합에 유의하게 기여할 수 없다. 게다가, 골격 기하학적 형태는 라마찬드란(Ramachadran) 도표에서 Gly 잔기에 대해 가장 유리한 영역 내에 놓여 있다. 따라서, 그것을 돌연변이 계획에서 Gly까지 절두하여, 필요한 융통성을 가능하게 하고, 결합에 영향을 미치지 않으면서 (비-글리신 관련 국소 구조적 변형을 감소시킴으로써) 안정성을 잠재적으로 개선하였다.
인간화 설계에서는 고려해야 할 몇몇 다른 사항이 있었다. 먼저, 인간 GL IGLV7-46 및 IGLV7-43은 원치 않는 산화 잠재성을 가지면서 위치 59에 Trp을 도입한다. 2개의 다른 GL들은 이 위치에 Gly을 갖는데, 이는 마우스 서열에 상응한다. 따라서, Gly59를 IGLV7-46 및 IGLV7-43 변이체 둘 모두에서 보존하였다. 마지막으로, VH의 위치 49에 있는 Ala은 본질적일 수 있다. 또한, 위치 99에 있는 잔기(SP34에서의 Val)는 항원 결합에 영향을 미칠 수 있다. 이들 위치를 시험하기 위하여, 일부 변이체에 복귀 돌연변이를 도입하였다(도 12).
HFA 매트릭스
HFA 매트릭스(표 11)는 4개의 VH 변이체 및 3개의 VL 변이체로 구성된다(도 12). HFA의 목적을 위하여, AbM CDR 정의(문헌[K.R. Abhinandan and A. C. Martin, 2008. Mol. Immunol. 45, 3832-3839])가 사용된다.
VH에 대한 변이체:
CD3H141 (서열 번호 184) 마우스 CDR + Gly49Ala을 갖는 IGHV3 -72*01
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS
CD3H142(서열 번호 185) 마우스 CDR + Ser49Ala을 갖는 IGHV3-23*01
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS
CD3H143(서열 번호 186) 마우스 CDR + Ser49Ala, Ala99Val을 갖는 IGHV3-23*01
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVKHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS
CD3H144(서열 번호 187): 마우스 CDR + Asn57Gly을 갖는 IGHV3-73*01
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQASGKGLEWVGRIRSKYNGYATYYAASVKGRFTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS
VL에 대한 변이체:
CD3L63(서열 번호 188) 마우스 CDR + F38V, A48G, Y51G, W59G를 갖는 IGLV7-46*01
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL
CD3L64(서열 번호 189) 마우스 CDR + Y38V, L48G, Y51G를 갖는 IGLV1-51*01
QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCRSSTGAVTTSNYANWVQQLPGTAPKGLIGGTNKRAPGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL
CD3L66(서열 번호 190) 마우스 CDR + F38V, A48G, Y51G, W59G를 갖는 IGLV7-43*01
QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL
[표 11]
Figure pct00018
아미노산 서열을 DNA로 역번역하고, cDNA를 유전자 합성 기법을 사용하여 제조하였다(미국 특허 제6,670,127호; 미국 특허 제6,521,427호). 표준 분자 생물학 기법을 사용하여 CMV 프로모터를 갖는 사내 발현 벡터를 사용하여 L234A, L235A, 및 F405L 돌연변이를 함유하는 인간 IgG1-AA Fc 상에 중쇄(HC) 가변 영역을 하위클로닝하였다. 표준 분자 생물학 기법을 사용하여 CMV 프로모터를 갖는 사내 발현 벡터를 사용하여 인간 람다(λ) 불변 영역 상에 경쇄(LC) 가변 영역을 하위클로닝하였다. 생성된 플라스미드를 Expi293F 세포 (Invitrogen) 내로 형질감염시키고, mAb를 발현시켰다. 단백질 A 컬럼(HiTrap MabSelect SuRe 컬럼)을 사용하여 표준 방법에 의해 정제하였다. 용출 후, 풀(pool)들을 D-PBS, pH 7.2 내로 투석하였다. 항체의 VH 및 VL 서열이 표 12에 나타나 있다.
[표 12]
Figure pct00019
Figure pct00020
서열 번호 184의 VH 및 서열 번호 188의 VL을 갖는 VH 및 VL 영역 및 L234A, L235A, F405L 치환을 갖는 IgG1 불변 영역을 포함하는 단일특이성 항-CD3 항체 CD3B143을 생성하였다. 서열 번호 184의 VH 및 서열 번호 189의 VL을 갖는 VH 및 VL 영역 및 L234A, L235A 및 F405L 치환을 갖는 IgG1 불변 영역을 포함하는 단일특이성 항-CD3 항체 CD3B144를 생성하였다. 서열 번호 184의 VH 및 서열 번호 190의 VL을 갖는 VH 및 VL 영역 및 L234A, L235A 및 F405L 치환을 갖는 IgG1 불변 영역을 포함하는 단일특이성 항-CD3 항체 CD3B146을 생성하였다. 서열 번호 185의 VH 및 서열 번호 188의 VL을 갖는 VH 및 VL 영역 및 L234A, L235A 및 F405L 치환을 갖는 IgG1 불변 영역을 포함하는 단일특이성 항-CD3 항체 CD3B147을 생성하였다. 서열 번호 185의 VH 및 서열 번호 189의 VL을 갖는 VH 및 VL 영역 및 L234A, L235A 및 F405L 치환을 갖는 IgG1 불변 영역을 포함하는 단일특이성 항-CD3 항체 CD3B148을 생성하였다. 서열 번호 185의 VH 및 서열 번호 190의 VL을 갖는 VH 및 VL 영역 및 L234A, L235A 및 F405L 치환을 갖는 IgG1 불변 영역을 포함하는 단일특이성 항-CD3 항체 CD3B150을 생성하였다. 서열 번호 186의 VH 및 서열 번호 188의 VL을 갖는 VH 및 VL 영역 및 L234A, L235A 및 F405L 치환을 갖는 IgG1 불변 영역을 포함하는 단일특이성 항-CD3 항체 CD3B151을 생성하였다. 서열 번호 186의 VH 및 서열 번호 189의 VL을 갖는 VH 및 VL 영역 및 L234A, L235A 및 F405L 치환을 갖는 IgG1 불변 영역을 포함하는 단일특이성 항-CD3 항체 CD3B152를 생성하였다. 서열 번호 186의 VH 및 서열 번호 190의 VL을 갖는 VH 및 VL 영역 및 L234A, L235A 및 F405L 치환을 갖는 IgG1 불변 영역을 포함하는 단일특이성 항-CD3 항체 CD3B154를 생성하였다. 서열 번호 187의 VH 및 서열 번호 188의 VL을 갖는 VH 및 VL 영역 및 L234A, L235A 및 F405L 치환을 갖는 IgG1 불변 영역을 포함하는 단일특이성 항-CD3 항체 CD3B155를 생성하였다. 서열 번호 187의 VH 및 서열 번호 189의 VL을 갖는 VH 및 VL 영역 및 L234A, L235A 및 F405L 치환을 갖는 IgG1 불변 영역을 포함하는 단일특이성 항-CD3 항체 CD3B156을 생성하였다. 서열 번호 187의 VH 및 서열 번호 190의 VL을 갖는 VH 및 VL 영역 및 L234A, L235A 및 F405L 치환을 갖는 IgG1 불변 영역을 포함하는 단일특이성 항-CD3 항체 CD3B158을 생성하였다.
실시예 13: 1차 T 세포에 대한 인간화 항-CD3 히트들의 내인성 세포 결합
항-CD3 항체들의 생성된 패널을 1차 인간 T 세포 상의 세포-표면 CD3ε에 대한 결합에 대해 시험하였다. 이렇게 하기 위하여, 발현 상층액으로부터의 항체의 결합을 다중클론 항-인간 2차 항체를 사용하여 시각화하고 유세포측정에 의해 분석하였다. 간략하게 말하면, 음성 선택에 의해 정제된 1차 인간 T 림프구 (Biological Specialty, 미국 콜마 소재)를 사용하여 유세포측정에 의해 세포-표면 CD3ε에 대한 항-CD3 항체의 결합을 평가하였다. 발현 상층액 또는 정제된 항체를 각각 배지 또는 FACS 완충액 (BD BioSciences) 중에 10 ㎍/ml로 정규화하였다. 2×105개 세포를 표지화를 위하여 96웰 둥근바닥 플레이트 (CoStar)의 웰 내로 분취하였다. 발현 상층액 중의 항체를 세포에 첨가하고, 4℃에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 3분 동안 1300 rpm으로 원심분리하고 상층액을 제거한 후에, 50 μL의 항-인간 IgG (H+L) Alexa Fluor 647 2차 항체 (Life technologies Inc.)를 직사광선을 피해서 4℃에서 30분 동안 10 ㎍/mL의 최종 농도로 세포와 인큐베이션하였다. 세척 후에, 30 μL의 FACS 완충액 (BD BioSciences) 중에 재현탁하였다. ForeCyt 소프트웨어를 사용하여 Intellicyt HTFC 시스템 상에서 샘플 수집을 수행하였다. 녹색 또는 적색 고정가능 Llive/Dead 염료 (Life Technologies Inc.) 및 전방/측방 산란(forward/side scatter) 면적 및 높이 파라미터를 각각 사용하여, 결합의 분석 전에 생존 단세포를 게이팅하였다. 평균 형광 세기 값을 사용하여 GraphPad Prism 버전 5에서 그래프를 생성하였다.
적정 시리즈를 실시하였지만, 명확함을 위하여 중간 농도가 도 13에 제시되어 있다. 치료적 항체와 동일한 Fc 영역을 갖는 하기의 2개의 사내 파지-유래 항체를 대조군으로서 사용하였다: 비-사이노 교차-반응성, 효능 항체인 G11(HC 서열 번호 222, LC 서열 번호 223)을 양성 대조군으로서 사용하고, 비-결합제/비-효능 항체인 CD3B94(HC - 서열 번호 224, LC ― 서열 번호 225)를 비특이적 결합을 평가하기 위해 사용하였다. 시판 SP34 항체는 이 검정에서 비교물로서 사용하지 않았는데, 이것은 마우스 항체이고 상이한 2차 검출 시약의 사용은 시험되는 변이체들과의 직접 비교를 불가능하게 것이기 때문이다.
데이터는 인간화 항-CD3 히트들의 패널에서의 다수의 결합능을 입증하는데, 이때 2개의 항체(CD3B144, CD3B152)는 인간 T 세포에 대한 결합의 완전한 손실을 보여준다. 나머지 항체들은 임의적인 역치로서의 G11 결합을 사용하여 강한 결합제 및 약한 결합제로 광범위하게 분리될 수 있는 일정 범위의 결합능을 보여주었다. 이들 파라미터를 사용하여, 7개의 강한 결합제 및 7개의 약한 결합제를 변이체들의 패널로부터 확인하였다(도 13).
이어서, 교차-반응성의 보유를 평가하기 위해 1차 사이노몰거스 CD4+ T 세포에 대한 항-CD3 히트들의 결합 분석을 시험하였다. 사이노몰거스 원숭이 (Zen Bio, 미국 트라이앵글 리서치 파크 소재)의 말초 혈액으로부터의 정제된 CD4+ T 세포를 사용하였다. 검정 프로토콜은 전술된 것들과 유사하였다. G11은 사이노몰거스 CD3ε과 교차-반응하지 않기 때문에, 인간 IgG1 Fc 및 뮤린 프레임워크와 함께 SP34의 VH 및 VL을 갖는, 사내 키메라 SP34-유래 항체인 CD3B124를 이 검정에서 양성 대조군으로서 사용하였다(도 14). 흥미롭게도, 몇몇 변이체는 인간 세포에 대해 관찰된 것과 비교하여 감소된 결합능을 보여주었다. 이는 강한 결합제 CD3B150, CD3B151 및 CD3B154 - 여기서는, 결합이 감소되었음 - 및 몇몇 약한 결합제 - 여기서는, 백그라운드에 비하여 결합이 더 이상 검출될 수 없었음 - 를 포함하였다. 이러한 결합 손실은 특정 면역글로불린 쇄에 관련되지 않았는데, 이는 중쇄 및 경쇄의 조합이 교차-반응성의 손실에서 역할을 하였음을 시사한다. 이와 함께, 이들 검정은 인간 CD3ε과 사이노몰거스 CD3ε 사이에 종 교차-반응성이 유지된 변이체의 확인을 가능하게 하였다.
실시예 14: 1차 T 세포에서의 인간화 항-CD3 히트들의 기능 분석
결합 분석은 인간화 항-CD3 히트들의 패널이 인간 및 사이노몰거스 T-세포에 대한 광범위한 결합능을 보여줌을 입증하였다. 각각의 변이체가 CD3ε 가교결합을 통해 활성화를 유도하는 능력을 조사하기 위하여, 1차 T-세포를 비드-접합된 항체의 존재 하에서 하룻밤 배양하였다. 다음날, 세포를 수거하고 항-CD69 항체로 표지화하여 활성화를 측정하였다(도 15). 인간화 항-CD3 항체를, 10 ㎍/m의 항체와 함께 하룻밤 인큐베이션에 의해 단백질 A 코팅된 자성 비드 (SpheroTech, 미국 레이크 포레스트 소재)에 결합시켰다. 다음날, 2×105개 1차 인간 T 세포를 둥근바닥 세포 배양 플레이트에서 3회 반복하여 플레이팅하고, 2×105개 코팅 비드를 첨가하였다. 37℃에서 하룻밤 배양 후에, 세포를 수거하고, 항-CD69 Alexa Fluor® 488 항체 (클론 FN50; Biolegend)로 표지화하여 이 활성화 마커의 상향조절을 평가하였다. 결합에 대해 전술된 바와 같이 샘플 수집 및 분석을 수행하였다. 몇몇 음성 대조군에 대해 실시하였는데, 이에는 T-세포 단독, 코팅되지 않은 비드를 갖는 T-세포, 및 동종형 대조군(CD3B94)-코팅된 비드를 갖는 T-세포가 포함되었다. 이들 모두는 무염색 T-세포에 비견되는 유사한 평균 형광 세기 값을 보여주었으며, 이는 백그라운드가 이 검정에서 낮았음을 나타낸다. 비교를 위해 몇몇 양성 대조군에 대해 실시하였는데, 이에는 OKT3(미국 특허 제5929212호) 및 구매가능한 SP34-2 항체가 포함되었다.
이어서, 인간화 항-CD3 히트들을 동일한 검정에서 1차 사이노몰거스 CD4+ T 세포 (Zen Bio, 미국 트라이앵글 리서치 파크 소재)를 활성화하는 그들의 능력에 대해 시험하였다(도 16). FN50 항-CD69 항체는 비인간 단백질과 교차-반응하는 것으로 기재되어 왔으며, 이에 따라 이들 세포의 활성화를 시험하는 데 사용될 수 있었다.
인간 및 사이노몰거스 활성화 데이터는, 히트들의 패널이 광범위한 활성화능(activation potential)을 나타내었다는 점에서 결합 데이터와 상관되었다. 다수의 강한 결합제는 구매가능한 SP34-2와 비교할 때 동등하거나 더 큰 정도로 인간 T-세포를 활성화하는 능력을 보여주었다. 몇몇 변이체는 SP34-2와 비교하여 더 낮은 활성화능을 보여주었으며, 한편 일부 결합제는 CD69 자극의 증거를 보여주지 않았다. 활성화 불능은, 약한 결합을 보여주거나 결합을 전혀 보여주지 않은 변이체에서만 관찰되었고, 모든 강한 결합제는 어떤 수준의 활성화를 보여주었는데, 이는 인간(도 17의 A) 및 사이노몰거스(도 17의 B) 둘 모두에 대한 결합능과 활성화능 사이의 상관관계를 시사한다.
실시예 15: IgG1 L234A, L235A에서 이중특이성 포맷의 항체의 제조
몇몇 단일특이성 CD123 항체들을, 그들의 Fc 영역 내에 (항-CD123 상에서) Fc 치환 L234A, L235A, 및 K409R(넘버링은 EU 인덱스에 따름)을 갖는 IgG1로서 발현시켰다. 단일특이성 항체들을 HEK 세포주 내에서 발현시켰다. 단일특이성 CD3 항체는 Fc 치환 L234A, L235A, 및 F405L을 갖는 IgG1이었다.
서열 번호 120의 VH 및 서열 번호 165의 VL을 갖는 항-CD123 항체 I3RB2의 VH 및 VL 영역 및 L234A, L235A 및 K409R 치환을 갖는 IgG1 불변 영역을 포함하는 단일특이성 항-CD123 항체 I3RB135-K409R을 생성하였다.
서열 번호 136의 VH 및 서열 번호 168의 VL을 갖는 항-CD123 항체 I3RB18의 VH 및 VL 영역 및 L234A, L235A 및 K409R 치환을 갖는 IgG1 불변 영역을 포함하는 단일특이성 항-CD123 항체 I3RB125-K409R을 생성하였다.
대조군으로서, 널 아암으로서 이중특이성 항체의 CD3 또는 CD123 아암과 파트너가 되기 위하여 서열 번호 191의 VH 및 서열 번호 192의 VL을 갖는 VH 및 VL 영역 및 L234A, L235A 및 K409R 또는 F405L을 갖는 IgG1 불변 영역을 포함하는 단일특이성 항-RSV 항체, B21M을 생성하였다.
이들 단일특이성 항체를 단백질 A 컬럼(HiTrap MabSelect SuRe 컬럼)을 사용하여 표준 방법을 사용하여 정제하였다. 용출 후, 풀들을 D-PBS, pH 7.2 내로 투석하였다.
단일특이성 항-CD123 항체들을 시험관내 Fab 아암 교환으로 매트릭스에서 조합하여 이중특이성 항체들을 생성하였으며, 이어서 이들을 추가로 특성화하였다(표 13).
[표 13]
(국제 특허 출원 공개 WO2011/131746호에 기재된 바와 같이) 시험관내 Fab 아암 교환으로 단일특이성 CD3 mAb와 단일특이성 CD123 mAb를 조합함으로써 이중특이성 CD123 × CD3 항체를 생성하였다. 간략하게 말하면, PBS(pH 7 내지 7.4) 및 75 mM 2-메르캅토에탄올아민(2-MEA) 중에서 항-CD123/항-CD3 항체를 약 1 내지 20 mg/mL로 1.08:1 몰비로 함께 혼합하고 2 내지 6시간 동안 25 내지 37℃에서 인큐베이션한 후, 표준 방법을 사용하여 투석, 투석여과, 접선 유동 여과 및/또는 스핀 세포 여과를 통해 2-MEA를 제거하였다. 항-RSV-(B21M) 아암을 갖는 대조군 이중특이성 항체를 유사하게 생성하였다.
생성된 단일특이성 항-CD3 및 CD123 항체들을 매트릭스에서 시험관내 Fab 아암 교환을 위해 혼합하였으며, 다양한 검정으로 특성화하였다. 이중특이성 항체 I3RB179-Ab는 mAb CD3B146-F405L의 CD3 결합 아암 및 mAb I3RB135-K409R의 CD123 결합 아암을 포함한다. 이중특이성 항체 I3RB186-Ab는 mAb CD3B146-F405L의 CD3 결합 아암 및 mAb I3RB125-K409R의 CD123 결합 아암을 포함한다. 이중특이성 항체 I3RB180-Ab는 mAb CD3B147-F405L의 CD3 결합 아암 및 mAb I3RB135-K409R의 CD123 결합 아암을 포함한다. 이중특이성 항체 I3RB187-Ab는 mAb CD3B147-F405L의 CD3 결합 아암 및 mAb I3RB125-K409R의 CD123 결합 아암을 포함한다. 이중특이성 항체 I3RB181-Ab는 mAb CD3B151-F405L의 CD3 결합 아암 및 mAb I3RB135-K409R의 CD123 결합 아암을 포함한다. 이중특이성 항체 I3RB188-Ab는 mAb CD3B155-F405L의 CD3 결합 아암 및 mAb I3RB125-K409R의 CD123 결합 아암을 포함한다. 이중특이성 항체 I3RB182-Ab는 mAb CD3B154-F405L의 CD3 결합 아암 및 mAb I3RB135-K409R의 CD123 결합 아암을 포함한다. 이중특이성 항체 I3RB189-Ab는 mAb CD3B154-F405L의 CD3 결합 아암 및 mAb I3RB125-K409R의 CD123 결합 아암을 포함한다. 이중특이성 항체 I3RB183-Ab는 mAb CD3B155-F405L의 CD3 결합 아암 및 mAb I3RB135-K409R의 CD123 결합 아암을 포함한다. 이중특이성 항체 CD3B191-Ab는 mAb CD3B155-F405L의 CD3 결합 아암 및 mAb I3RB125-K409R의 CD123 결합 아암을 포함한다.
대조군 이중특이성 항체의 경우, 항-RSV 항체, B21M(HC 서열 번호 207 ― F405L 돌연변이를 갖는 것으로 나타남, LC 서열 번호 208)을 하기와 같이 CD3 아암 또는 CD123 아암과 조합하였다. 이중특이성 항체 I3RB185-Ab는 mAb B21M-F405L의 항-RSV 결합 아암 및 mAb I3RB135-K409R의 CD123 결합 아암을 포함한다. 이중특이성 항체 I3RB191-Ab는 mAb B21M-F405L의 항-RSV 결합 아암 및 mAb I3RB125-K409R의 CD123 결합 아암을 포함한다. 이중특이성 항체 I3RB192-Ab는 mAb B21M-K409R의 항-RSV 결합 아암 및 mAb CD3B146-F405L의 CD3 결합 아암을 포함한다. 이중특이성 항체 I3RB193-Ab는 mAb B2M-F409R의 RSV 결합 아암 및 mAb CD3B147-F405L의 CD3 결합 아암을 포함한다. 이중특이성 항체 I3RB194-Ab는 mAb B2M-F409R의 항-RSV 결합 아암 및 mAb CD3B151-F405L의 CD3 결합 아암을 포함한다. 이중특이성 항체 I3RB195-Ab는 mAb B21M-K409R의 항-RSV 결합 아암 및 mAb CD3B154-F405L의 CD3 결합 아암을 포함한다. 이중특이성 항체 I3RB196-Ab는 mAb B21M-K409R의 RSV 결합 아암 및 mAb CD3B155-F405L의 CD3 결합 아암을 포함한다.
CD123 × CD3 이중특이성 Ab에 대한 중쇄 및 경쇄가 하기 표 14에 나타나 있다.
[표 14]
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
실시예 16: 세포 사멸 기능 검정에서 이중특이성 항체의 평가
T-세포 매개 세포독성 검정은 건강한 공여자로부터의 T-세포를 사용하여 세포 용해에 대한 CD123 × CD3 이중특이성 항체를 평가하기 위한 기능 검정이다.
Laszlo 등의 프로토콜을 따랐다(문헌[Laszlo, G., et al 2014 BLOOD 123:4, 554-561]). 간단하게 말하면, 효과기 세포를 수거하고, 카운팅하고, 세척하고, RPMI(10% FBS) 세포 배지 중에 1×106개 세포/ml로 재현탁하였다. 표적 세포를 CFSE (Invitrogen 번호 C34554)로 표지화하고, 10% FBS (Invitrogen 번호 10082-147)를 함유하는 RPMI (Invitrogen 번호 61870-036) 중에 2×105개 세포/mL로 재현탁하였다. 효과기 및 CFSE-표지화된 표적 세포를 멸균 96웰 둥근바닥 플레이트에서 E:T=5:1로 혼합하였다. 각각의 이중특이성 항체의 5 μL 분취물을 다양한 농도를 함유하는 각각의 웰에 첨가하였다. 배양물을 5% CO2 하에서 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 48시간 후에, LIVE/DEAD® 고정가능 근적외 사세포 염색(Fixable Near-IR Dead Cell Stain) 완충액 (Life Technologies 카탈로그 번호 L10119)을 샘플에 첨가하고, 배양물을 실온에서 암소에서 20분 동안 인큐베이션하고, 세척하고, 170 μL의 FACS 완충액 중에 재현탁하였다. CANTO II 유세포측정기 (BD Biosciences)를 사용하여 약물-유도 세포독성을 결정하였으며, FlowJo 소프트웨어 또는 Dive 소프트웨어 (BD Biosciences)를 사용하여 분석하였다. 관심 집단은 이중 양성 CFSE+/ 생/사+ 세포이다.
37℃, 5% CO2에서 48시간 인큐베이션 후의 AML 세포주 MV4-11(도 18의 A 및 B), OCI-AML5(도 19의 A 및 B), 및 OCI-M2(도 20의 A 및 B)의 T-세포 매개 세포 용해의 결과가 나타나 있다. MV4-11 및 OCI-AML5는 CD123 발현 세포주이고, OCI-M2는 유의하게 낮은 CD123 발현을 갖는다. 이 연구에 대한 효과기/표적 세포 비는 5:1이었다. Fc 차단제의 2 mg/mL 분취물을 첨가하여 Fc 기능을 차단하였다.
I3RB2 및 I3RB18 항체 둘 모두는, 이중특이성 포맷으로 항-CD3 항체와 조합될 때, CD123+ 세포를 특이적으로 사멸하는 데 효능이 있다.추가적으로, 이 데이터는 I3RB135(I3RB2-기반) 이중특이성 항체와 I3RB125(I3RB18-기반) 이중특이성 항체 사이의 명확한 순위매김을 가능하게 하는데, I3RB125 × CD3 이중특이성 항체가 I3RB135 × CD3 이중특이성 항체보다 더 강력하다. 각각의 패밀리 내에서, CD3B146- 및 CD3B155-기반 이중특이성 항체(더 높은 친화성의 mAb)는 CD3B151- 및 CD3B154-기반 이중특이성 항체보다 더 강력하였다. 저수준의 용량-의존적 백그라운드 세포독성이 낮은 CD123 발현 세포주 OCI-M2에 대해 관찰되었다.
실시예 17: 질병의 종양 모델에서 이중특이성 항체, I3RB186의 평가
재료 및 방법
세포주. 이중특이성 항체, I3RB186의 생체내 효능을 결정하기 위하여, 고 CD123 발현을 갖는 구매가능한 종양 세포주를 효능 연구를 위해 선택하였다. KG-1(DSMZ, 카탈로그 번호 ACC 14) 인간 급성 골수성 백혈병(AML) 종양 세포를 공기 중 5% CO2의 분위기에서 37℃에서 열 불활성화된 소태아 혈청(10% v/v)으로 보충된 RPMI 배지 중에 시험관내에서 유지하였다. 세포를 매주 2회 또는 3회 일상적으로 계대배양하였다. 지수 성장기에서 성장하는 세포를 수거하고 종양 세포 접종을 위해 카운팅하였다.
생착을 위한 인간 PBMC의 제조. Biological Specialty Corporation(미국 펜실베이니아주 콜마 소재)으로부터 입수된 인간 단핵 부화 세포(Human, Mononuclear Enriched Cell)(카탈로그 213-15-04)를 hIgG1-AA 분자 시험에 사용하였다. PBMC를 Ficoll 밀도 구배 분리(Ficoll-Paque™ 플러스(Plus), GE Healthcare Bio-Sciences AB, 카탈로그 17-1440-03)를 통해 단리하고, 동결 배지(Recovery 세포 배양 동결 배지(Cell Culture Freezing Medium), Gibco, 카탈로그 12648-010) 중에서 바이알당 50×106개 세포로 분취하였다. 바이알을 대략 24시간 동안 -80℃에서 저장하고, 이어서 장기간 저장을 위하여 액체 질소에 전달하였다. HemaCare(미국 캘리포니아주 밴 나이즈 소재)로부터 입수된, 동결된 단리된 말초 혈액 단핵 세포 바이알(바이알당 100×106개 세포, 카탈로그 PB009-3)을 IgG4 분자 시험에 사용하였다. PBMC를 해동하기 위하여, 동결된 바이알을 37℃의 수조에 넣었다.세포를 저온 해동 배지가 담긴 원추형 튜브에 전달하였다. 원추형 튜브를 원심분리하고, 세포를 멸균 PBS 중에 재현탁하였다. 트리판 블루 배제 방법을 사용하여 세포 생존율을 평가하였다. 세포를 주사용 멸균 PBS 중에 mL당 50×106개 세포의 세포 농도로 재현탁하였다.
FACS 분석을 위한 말초 혈액 수집. 이를 위하여, 50 μL의 혈액을 후안와동을 통해 각각의 동물로부터 수집하여 리튬 헤파린 코팅된 튜브 내로 넣었다. 각각의 샘플로부터의 혈액의 25 μL 분취물을 2개의 각각의 96웰 플레이트 내의 175 μL의 배지(10% FBS를 함유하는 RPMI) 내로 넣었다. 플레이트들을 원심분리하고, ACK 용해 완충액에 의한 3회의 처리를 사용하여 적혈구를 용해시켰다. 나머지 세포를 각각의 샘플에 대해 통합하고, CD45, CD3, CD8, 및 CD4에 대해 염색하여 순환 인간 T 림프구를 정량화하였다(마우스 말초 혈액 수거/염색: 백혈구 단리 및 FACS 분석을 위한 프로토콜 참조).
백혈구 FACS 분석을 위한 프로토콜. 백혈구 FACS 분석을 위한 프로토콜. 순환 인간 PBMC의 형광-활성화 세포 분류(FACS) 분석에 대한 연구 동안 말초 혈액을 최대 2회 수집하였다. 전혈(25 μL)을 96웰 플레이트 내의 175 μL의 RPMI 배지 중에 희석시켰다. 플레이트를 4분 동안 1400 rpm으로 원심분리하고, 상층액을 디캔팅(decanting)하였다. 세포를 200 μL의 ACK 용해 완충액 중에 재현탁하고, 얼음 상에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 5분 동안 1300 rpm으로 원심분리 후에, 상층액을 흡인하였다. 세포를 ACK 용해 완충액으로 2회 이상 재처리하고, 200 μL의 PBS 중에서 1회 세척하고 5분 동안 1500 rpm으로 재원심분리하였다. 세포 펠릿을 Live/Dead 염색제(stain) (Invitrogen, 카탈로그 번호 L10119, 0.25 μL/웰의 스톡. 스톡은 150 μL의 DMSO 중에 희석된 1개의 바이알임)를 함유하는 PBS 중 항체 칵테일 50 μL/웰에 재현탁하고, 암소에서 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 하기의 항체를 사용하여 세포를 표지화하였다: CD4 (Becton Dickinson 카탈로그 557922, 0.5 μL/웰), CD8 (Invitrogen, Q010055, PBS 중 1:10 희석물 0.5 μL/웰), CD3 (Becton Dickinson, 카탈로그 558117, 0.5 μL/웰), CD45 (BioLegend 카탈로그 304006, 0.5 μL/웰). 세포를 FACS 완충액(200 μL/웰)으로 3회 세척하고, 170 μL의 FACS 완충액 중에 재현탁하였다. 샘플 수집을 BD LSR Fortessa 유세포측정 분석기(Flow Cytometry Analyzer) 상에서 수행하였다. 근적외 Live/Dead 염료 (Life Technologies Inc.) 및 전방/측방 산란 면적 및 높이 파라미터를 각각 사용하여, 분석 전에 생존 단세포를 게이팅하였다. BD FACS Diva 소프트웨어 버전 7을 사용하여 데이터를 분석하였다.
생체내 설계. 암컷 NSG(NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl /SzJ) 마우스에, 각각의 동물의 등쪽 옆구리에 KG-1 세포(200 μL 부피의 인산염 완충 식염수 중 5×106개 세포)를 피하 접종하였다. 종양 세포 접종 일자는 일수 0으로서 표기하였다. 삽입 후 7일에서 시작하여 종양 부피가 100 내지 150 ㎣의 범위가 될 때까지(삽입 후 14일), 매주 2회 종양 측정을 모니터링하였으며, 이 시점에서 마우스를 종양 부피에 따라 처리군에 무작위 배정하였다. 이어서, 마우스에 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)(200 μL 부피의 인산염 완충 식염수 중 10×106개 세포)를 정맥내(외측 꼬리 정맥) 생착하였다. PBMC 생착 직후에, 마우스는 정맥내 요법 이중특이성 Ab I3RB186(PBS 중에 희석되고 100 μL 부피로 투여된 이중특이성 항체)을 투여받았다. 처리는 총 5회 용량을 위하여 대략 격일로 일어났다(정확한 투여 일수에 대해서는 표 15 참조). 종양 측정치 및 체중을 매주 2회 기록하였다.
연구의 종점은 하기와 같았다: 종양 성장 억제, 최대 종양 부하(1500 ㎣ 초과의 군 평균), 및 처리 개시 체중의 20% 초과의 체중 손실. 캘리퍼를 사용하여 종양 크기를 2개의 치수에서 매주 2회 측정하였으며, 부피는 하기 식을 사용하여 ㎣로 표현하였다: V=0.5a×b2(여기서, a 및 b는 각각 종양의 긴 직경 및 짧은 직경임). 완전 종양 퇴행(complete tumor regression)(CR)은 촉진(palpation)의 한계(50 ㎣) 미만으로 감소된 종양으로서 규정된다. 부분 종양 퇴행(partial tumor regression)(PR)은 초기 종양 부피로부터 감소된 종양으로서 규정된다. 3회 이상의 연속 종양 측정에서의 CR 또는 PR의 최소한의 지속시간이, CR 또는 PR을 지속적이라고 간주하는 데 필요하다.
인간 PBMC의 생착은 마우스에서 궁극적인 이식편-대-숙주 질병(GVHD)으로 이어지는데, 여기서는 생착된 공여자 T 세포가 활성화되게 되고 숙주 조직을 침윤시켜, 기관 부전, 극도의 체중 손실, 및 필연적으로, 사망으로 이어진다. 이 모델에서 GVHD의 개시 및 중증도를 모니터링하기 위하여, 체중을 매주 2회 기록하고 그램(g)으로 표현하였다. 하기 식을 사용하여 % 체중 변화를 계산하였다: 체중 변화 = [(C-I)/I]*100 (여기서, C는 현재 체중이고, I는 치료 개시 시의 체중임).
평균 및 평균의 표준 오차(SEM)를 포함하는 요약 통계치가 각각의 시점에서 각각의 군 사이의 종양 부피의 차이의 종양 부피에 대해 제공되며, 이는 상응하는 연구 표에 나타나 있다. 군들 사이의 종양 부피의 차이의 통계학적 분석을 이원분산분석(two-way ANOVA)을 사용하여 평가하고, 측정 시험을 반복한 후, GraphPad Prism 버전 5.01을 사용하여 본페로니 사후-검정(Bonferroni post-test)을 행하였다. p<0.05가 통계학적으로 유의한 것으로 간주되었다.
CD123×CD3 IgG1, F234A, L235A 이중특이성 Ab의 효능
NSG 마우스에 KG-1 세포를 피하 접종하고, 이어서 앞서 기재된 인간 PBMC를 정맥내 생착하였으며, 앞서 기재된 바와 같이, 종양이 확립되었을 때(평균 종양 부피 = 102 +/- 5.9 ㎣), CD123 × CD3 이중특이성 Ab, I3RB186을 동물당 0.01, 0.1, 1, 및 10 ㎍의 용량으로 투여하였다. 대조군 이중특이성 Ab의 부재 하에서의 이중특이성 항체의 기전에 대한 대조군으로서, 종양-보유 마우스의 하위세트에 PBMC를 생착하지 않고 투여하였다. 또한, 말초 혈액 FACS 분석을 위한 대조군으로서, 종양-비보유 마우스의 하위세트에 PBMC를 생착하고 투여하였다(연구 설계를 위해 표 15 참조).
[표 15]
Figure pct00029
생체내 효능 연구의 결과
도 21은 인간 PBMC가 존재하는 경우의 KG-1 인간 AM 이종이식편에서, 2개의 용량, 동물당 0.1 및 1 ㎍에서의 CD123×CD3 IgG1-AA 이중특이성, I3RB186 ― IgG1, F234A, L235A의 효능을 나타낸다(p<0.001). 동물당 1 ㎍으로의 이중특이성 항체(회색으로 채워진 사각형)는 0.1 ㎍에서보다 더 즉각적인 항-종양 효능을 보여주었는데, 완전 퇴행이 8 마리 동물 중 3 마리에서 일어났고, 부분 퇴행이 8 마리 동물 중 3 마리에서 일어났다. 그러나, 종양 삽입 후 일수 55에서 시작하여 8 마리 마우스 중 6 마리에서 종양 재성장이 관찰되었다. 동물당 0.1 ㎍으로의 이중특이성 항체(회색으로 채워진 다이아몬드)는 지연되었지만 더 우수한 효능을 보여주었는데, 완전 및 부분 퇴행이 모든 동물에서 일어났다. 이 데이터는 이중특이성 항체에 의한 표적 세포 사멸에 있어서의 효과기 T 림프구의 존재의 필요성을 입증한다.
도 22는 종양 삽입 후 일수 30에 마우스로부터 수집된 말초 혈액의 FACS 분석을 나타낸다. CD8+ T 림프구의 증가에 의해 유도된 CD45+ 세포의 증가가 0.1 및 1 ㎍ 이중특이성 항체로 처리된 종양-보유 동물에서 명백하였다. CD8+ T 림프구의 이러한 증폭은, 항-종양 효능이 관찰된 군에서, 표적 세포(KG-1)가 존재하는 경우에만 단지 일어났다. 대안적으로, 10 ㎍의 이중특이성 항체는 말초 혈액으로부터 CD45+ PBMC를 제거하는 것으로 나타났다. 효과기 세포의 이러한 제거는 이 용량에서 관찰되는 효능의 결여를 설명할 수 있다.
도 23은 종양 삽입 후 일수 53에 마우스로부터 수집된 말초 혈액의 FACS 분석을 나타낸다. CD45+, CD8+, 및 CD4+ 세포는, PBS 및 0.01 및 0.1 ㎍의 이중특이성 항체로 처리된 종양-비보유 마우스에서와 같이, 0.1 및 1 ㎍의 이중특이성 항체로 처리된 종양-보유 마우스에서 유사한 수준이었다. 1 및 10 ㎍의 이중특이성 항체로 처리된 종양-비보유 마우스는 매우 낮은 수준의 CD45+, CD8+, 및 CD4+ 세포를 가졌는데; 이의 원인은 현재 알려져 있지 않다.
도 24는 시간 경과에 따른 치료군의 평균 체중 변화를 나타낸다. 앞서 기재된 바와 같이, 체중 손실은 GVHD의 개시 및 중증도와 상관되며, 이는 활성화된 T 세포에 의해 야기된다. 종양-보유 및 종양-비보유 마우스 둘 모두에서, 체중 손실은 0.1 ㎍의 이중특이성 항체에 의한 처리에 대해 가장 심각하였다. 1 ㎍의 이중특이성 항체로 처리된 종양-보유 마우스는 심각한 체중 손실을 겪지 않았다. T 림프구가 종양 삽입 후 일수 53에 존재하였지만(FACS 분석에 의함, 도 23), 체중 손실 및 GVHD 개시의 결여는 활성화된 T 세포의 손실을 나타내며, 이는 종양 삽입 후 일수 55에서 시작하여 이 군에서 관찰된 종양 재성장을 설명할 수 있다(도 21).
실시예 18. I3RB186 및 대조군 이중특이성 Ab(I3RB191 및 I3RB192)의 생체내 평가
두 번째 생체내 실험에서는, CD3 널 아암 Ab인 I3RB191 및 CD123 널 아암 Ab인 I3RB192의 이중특이성 Ab 대조군을 첨가하였다. 프로토콜은 실시예 16에 대한 것과 동일하였다. KG-1 인간 AML 종양 이종이식편을 암컷 NSG 마우스 내로 피하 삽입하였다. 삽입 후 14일에, 마우스를 종양 부피에 따라 처리군에 무작위 배정하였다. 인간 PBMC를 정맥내 삽입한 후, I3RB186, 및 I3RB191과 I3RB192 대조군 이중특이성 Ab를 동물당 1 ㎍으로 정맥내 처리하였다(표 16의 투여 일정 참조). 처리는 종양 삽입 후 일수 14, 16, 18, 21, 및 23에 일어났다. 도면에서의 화살표는 이중특이성 Ab 투여 일수를 나타낸다.
[표 16]
Figure pct00030
이중특이성 Ab의 항종양 활성이 시간 경과에 따른 종양 크기(㎣)의 변화로서 나타나 있다(도 25). 1 ㎍으로의 I3RB186에 의한 처리는 PBS 및 대조군 이중특이성 Ab-처리된 동물과 대비하여 종양 성장을 유의하게 억제하였다(p<0.001).
종양 삽입 후 일수 36에, 순환 인간 PBMC의 FACS 분석을 위하여 말초 혈액을 수집하였다. 첫 번째 연구와 달리, PBS 및 I3RB191과 비교하여, I3RB186으로 처리된 동물에서 인간 CD45+ PBMC의 빈도(A) 또는 CD8+ 및 CD4+ T 림프구 빈도(B)에 차이가 없었다(도 26). CD45+, CD8+, 및 CD4+ 세포는 CD123 널 아암 대조군 이중특이성 Ab인 I3RB192로 처리된 종양-보유 및 종양-비보유 동물에서 더 낮은 빈도로 존재하였다.
종양 삽입 후 일수 63에, 순환 인간 PBMC의 FACS 분석을 위하여 말초 혈액을 수집하였다. 종양-보유 동물들 중, 1 ㎍으로의 I3RB186으로 처리된 동물만이 존속하였다(도 27). PBS 또는 1 ㎍의 I3RB186으로 처리된 종양-비보유 동물과 비교하여, 1 ㎍의 I3RB186으로 처리된 종양-보유 동물에서 CD45+ 인간 PBMC(A) 및 CD8+ T 림프구(B)의 빈도에 있어서 상승이 있었다(도 25). CD4+ T 림프구는 모든 나머지 군에 걸쳐 유사한 빈도로 존재하였다. PBS 및 1 ㎍의 I3RB186으로 처리된 종양-비보유 마우스는 매우 낮은 빈도의 CD45+, CD8+, 및 CD4+ 세포를 가졌다.
도 28은 시간 경과에 따른 치료군의 평균 체중 변화를 나타낸다. 앞서 기재된 바와 같이, 체중 손실은 GVHD의 개시 및 중증도와 상관되며, 이는 활성화된 T 세포에 의해 야기된다. 종양-보유 마우스에서는, 모든 다른 군에 비하여, 1 ㎍의 이중특이성 항체에 의한 처리에 대해 체중에 있어서 더 큰 손실이 있었다. 이는 첫 번째 연구와 모순되었는데, 첫 번째 연구에서는 1 ㎍의 이중특이성 항체로 처리된 종양-보유 마우스는 심각한 체중 손실을 겪지 않았다. T 림프구는 종양 삽입 후 일수 63에 존재하였지만(도 27), 1 ㎍ 용량에서의 효능은 첫 번째 연구에서만큼 현저하지는 않았다(도 21, 도 25).
실시예 19. IgG4 S228P F234A, L235A에서 이중특이성 포맷의 항체의 제조
단일특이성 CD3 및 CD123 항체들 중 몇몇을, 그들의 Fc 영역 내에 Fc 치환 S228P, F234A, 및 L235Ax(CD123 아암) 또는 S228P, F234A, L235A, F405L, 및 R409K(CD3 아암)(넘버링은 EU 인덱스에 따름)를 갖는 IgG4로서 발현시켰다. 단일특이성 항체들을 CMV 프로모터 하에서 CHO 세포주 내에서 발현시켰다.
서열 번호 184의 VH 및 서열 번호 190의 VL을 갖는 VH 및 VL 영역 및 S228P, F234A, L235A, F405L, 및 R409K 치환을 갖는 IgG4 불변 영역을 포함하는 단일특이성 항-CD3 항체 CD3B219를 생성하였다. 서열 번호 186의 VH 및 서열 번호 188의 VL을 갖는 VH 및 VL 영역 및 S228P, F234A, L235A, F405L, 및 R409K 치환을 갖는 IgG4 불변 영역을 포함하는 단일특이성 항-CD3 항체 CD3B217을 생성하였다. 서열 번호 186의 VH 및 서열 번호 190의 VL을 갖는 VH 및 VL 영역 및 S228P, F234A, L235A, F405L, 및 R409K 치환을 갖는 IgG4 불변 영역을 포함하는 단일특이성 항-CD3 항체 CD3B218을 생성하였다. 서열 번호 187의 VH 및 서열 번호 188의 VL을 갖는 VH 및 VL 영역 및 S228P, F234A, L235A, F405L, 및 R409K 치환을 갖는 IgG4 불변 영역을 포함하는 단일특이성 항-CD3 항체 CD3B220을 생성하였다.
서열 번호 120의 VH 및 서열 번호 165의 VL을 갖는 항-CD123 항체 I3RB2의 VH 및 VL 영역 및 S228P, F234A 및 L235A 치환을 갖는 IgG4 불변 영역을 포함하는 단일특이성 항-CD123 항체 I3RB218을 생성하였다. 서열 번호 136의 VH 및 서열 번호 168의 VL을 갖는 항-CD123 항체 I3RB18의 VH 및 VL 영역 및 S228P, F234A 및 L235A 치환을 갖는 IgG4 불변 영역을 포함하는 단일특이성 항-CD123 항체 I3RB217을 생성하였다.
대조군으로서, 널 아암으로서 이중특이성 항체의 CD3 또는 CD123 아암과 파트너가 되기 위하여 서열 번호 191의 VH 및 서열 번호 192의 VL을 갖는 VH 및 VL 영역 및 S228P, F234A, L235A, 또는 F234A, L235A, R409K, F405L을 갖는 IgG4 불변 영역을 포함하는, B21M으로부터 유래된 단일특이성 항-RSV 항체를 생성하였다.
단일특이성 항체들을 정제하고, 생성된 단일특이성 항-CD3 및 CD123 항체들을 실시예 15에서 앞서 기재된 바와 같이 매트릭스(표 12)에서 시험관내 Fab 아암 교환을 위해 혼합하였으며, 다양한 검정으로 특성화하였다. 이중특이성 항체 Ab 7959는 mAb CD3B219 -F405L, R409K의 CD3 결합 아암 및 mAb I3RB217 -R409의 CD123 결합 아암을 포함한다. 이중특이성 항체 Ab 3978은 mAb CD3B217 -F405L, R409K의 CD3 결합 아암 및 mAb I3RB217 -R409의 CD123 결합 아암을 포함한다. 이중특이성 항체 Ab 7955는 mAb CD3B218 -F405L, R409K의 CD3 결합 아암 및 mAb I3RB217 -R409의 CD123 결합 아암을 포함한다. 이중특이성 항체 9958 Ab는 mAb CD3B220 -F405L, R409K의 CD3 결합 아암 및 mAb I3RB217 -R409의 CD123 결합 아암을 포함한다. 이중특이성 항체 Ab 8747은 mAb CD3B219 -F405L, R409K의 CD3 결합 아암 및 mAb I3RB218 -R409의 CD123 결합 아암을 포함한다. 이중특이성 항체 Ab 8876은 mAb CD3B217 -F405L, R409K의 CD3 결합 아암 및 mAb I3RB218 -R409의 CD123 결합 아암을 포함한다. 이중특이성 항체 Ab 4435는 mAb CD3B218 -F405L, R409K의 CD3 결합 아암 및 mAb I3RB218 -R409의 CD123 결합 아암을 포함한다. 이중특이성 항체 Ab 5466은 mAb CD3B220 -F405L, R409K의 CD3 결합 아암 및 mAb I3RB218 -R409의 CD123 결합 아암을 포함한다.
대조군 이중특이성 항체의 경우, IgG4 PAA 포맷의 B2M1을 생성하고, 정제하고, 하기 표 17에서의 매트릭스에 따라 CD3 아암 또는 CD123 아암과 조합하였다.
[표 17]
Figure pct00031
CD123 × CD3 이중특이성 항체에 대한 중쇄 및 경쇄가 표 18에 나타나 있다.
[표 18]
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
실시예 20. 재조합 항원을 사용하는 IgG4-PAA 포맷의 이중특이성 항체의 CD123 1가 친화도
표면 플라즈몬 공명(SPR) 실험을 수행하여, 인간 CD123 SP1 ECD 및 CD123 SP2 ECD에 대한 CD3 × CD123 이중특이성 항체의 결합에 대한 속도론 및 친화도를 결정하였다.
재조합 인간 CD123 SP1 및 재조합 인간 CD123 SP2 ECD에 대한 항-CD123 × CD3 이중특이성 Ab 3978, 7955, 7959, 9958, 8876, 8747, 5466의 친화도를 Biacore 기기를 사용하여 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 측정하였다. Biacore T200 (Biacore, Inc., 지금은 GE Healthcare의 파트)을 사용하여 25℃에서 속도론 연구를 수행하였다. 염소 항-인간 IgG(Fc) 특이적 항체 (Jackson ImmunoResearch laboratories 제품 번호 109-005-098)를 CM-5 센서 칩 (GE Healthcare)의 카르복시메틸 덱스트란 코팅 금 표면에 공유 부착시켰다. 덱스트란의 카르복시메틸 기를 N-에틸-N′-(3-다이메틸아미노프로필)카르보다이이미드(EDC) 및 N-하이드록시석신이미드(NHS)로 활성화하였다. 항-Fc 항체를 10 mM 소듐 아세테이트 중에서 pH 4.5에서 커플링하였다. 표면 상의 임의의 나머지 반응 부위를 에탄올아민과의 반응에 의해 블로킹하였다. 속도론적 결합 측정을 위하여, 항-CD123 항체를 항-인간 Fcγ 특이적 항체 상에 포획하였으며, 40 내지 70 RU의 항체가 포획되었다. Ab 포획 후에, 인간 CD123 SP1 또는 인간 CD123 SP2를 40 μL/min으로 0.4 nM 내지 400 nM의 농도로 주입하였다. 회합 데이터를 2분 동안 수집한 후, 10분간 해리하였다. 표면을 100 μL/min으로 30 μL의 100 mM H3PO4에 이어서, 50 mM NaOH로 재생시켰다. 속도론 분석을 위한 샘플은 PBS-기반 완충액(3 mM EDTA 및 0.005% 계면활성제 P20을 함유하는 D-PBS) 중에 준비하였다. 기록된 데이터는 포획된 항체를 함유하는 유동 세포와 포획된 항체를 함유하지 않는 참조 세포 사이의 SPR 신호의 차이이다. 신호에 대한 추가의 기기상의 기여를 참조-공제된 신호로부터 블랭크 주입으로부터의 데이터를 뺌으로써 제거하였다. BIAevaluation 소프트웨어 (BIAcore, Inc.)를 사용하여 1:1 결합 모델을 통해 모든 농도에서의 회합 및 해리 단계를 적합화함으로써(전체 적합도)) 데이터를 분석하였다. 표 20 및 표 21에는 Biacore에 의해 획득된 속도론 및 친화도 결과가 요약되어 있다. 두 표 모두는 3회 이상의 독립 실험 동안 획득된 데이터를 보여준다.
Biacore 데이터는, 동일한 패밀리 내에서, I3RB18-유래 이중특이성 Ab 및 I3RB2-유래 이중특이성 Ab는 CD123 SP1(표 19)에 유사한 친화도로 그리고 CD123 SP2(표 20)에 유사한 친화도로 결합하고, I3RB18-유래 이중특이성 Ab는 재조합 CD123 SP1에 I3RB2-유래 이중특이성 Ab보다 10배 초과로 더 강하게 결합함 - 각각 약 1 nM 및 14 nM의 친화도로 결합함 - 을 보여준다. 재조합 CD123 SP2에 결합될 때, I3RB18-유래 이중특이성 Ab는 I3RB2 유래 이중특이성 Ab보다 5배 초과로 더 강하게 결합하는데, 이때 각각 약 0.3 nM 및 1.7 nM의 친화도로 결합한다. 표 19 및 표 20에서의 표준 편차는 데이터가 매우 재현가능하였음을 나타낸다.
[표 19]
Figure pct00037
[표 20]
Figure pct00038
실시예 21. MSD-CAT에 의한 세포-표면 발현된 항원에 대한 IgG4-PAA 포맷의 이중특이성 항체의 CD123 1가 친화도
세포-표면 발현된 hCD123 SP1 및 SP2에 대한 선택된 항-CD123 이중특이성 항체의 1가 친화도를 MSD-세포 친화성 기법(MSD-CAT) 방법을 사용하여 수행하였다. MSD-CAT는 고처리량 포맷으로 온전한 세포를 사용하여 친화도를 결정하기 위한 무표지 방법으로서 사내에서 개발하였다. 이들 실험을 수행하여 세포-표면 인간 CD123 SP1 및 CD123 SP2에 대한 항-CD123 후보들의 결합 친화도 및 특이성을 평가하였다. 사용된 세포주는 인간 pDisplay CD123SP1 및 pDisplay CD123SP2였다. 음성 대조군 항체를 사용하여, 이중특이성 Ab가 이들 세포에 비특이적으로 스캐폴드 결합되고 CD123에 대한 비특이적 대 특이적 결합을 구별하는지를 시험하였다. MSD-CAT 방법을 사용하여 이들 상호작용의 친화도를 측정하기 위하여, 고정 농도의 항-CD123(800, 160, 32 및 6 pM) 및 변동하는 농도의 세포(2000만 내지 1016개 세포/mL)를 갖는 연속 혼합물을 제조하고, 4℃에서 24시간 동안 플레이트를 회전시킴으로써 평형에 도달하게 하였다. 이들 샘플을 0.05% 아지드, 1% BSA, 3 mM EDTA를 함유하는 DMEM 글루타맥스 배지 중에 준비하였다. (0.29 내지 1.08) × 106개 hCD123 SP1/세포 및 (0.57 내지 1.5) × 106개 hCD123 SP2/세포의 수용체 수를 반응 부피, 세포 밀도(세포수/L) 및 아보가드로수에 기초하여 혼합물 중 M 수용체 농도로 변환시켰다. 이것은, 인간 CD123 SP1에 대해서는 35 nM 내지 0.5 M; 그리고 인간 CD123 SP2에 대해서는 49 nM 내지 0.97 pM 범위의 농도를 가져왔다. 평형 후에, 플레이트를 5분 동안 약 1000 rpm으로 원심분리하고, 유리 항-CD3을 상층액 상에서 검출하였다. 혼합물 중의 유리 항-CD123은 Mesoscale Discovery(MSD) 판독기 기기를 사용하여 전기화학발광(ECL)에 의해 검출하였다. 전기화학발광 면역검정(ECL)에 의해 평형화된 혼합물 중의 유리 항-CD123의 검출을 위하여, 검출 플레이트를 제조하였다. 검출 플레이트(SA-MSD 플레이트 상의 플레이트 결합된 항원)를 제조하기 위하여, MSD 스트렙타비딘 표준 플레이트를 5분 동안 50 uL/웰의 검정 완충액(PBS (Life Sciences GIBCO 14190-136), 0.05% Tween 20, 0.2% BSA)으로 블로킹하였다. 검정 완충액을 세척 없이 제거하고, 검정 완충액 중 0.7 ug/mL 비오티닐화 항원 50 uL/웰을 MSD 플레이트에 첨가하고, 하룻밤 인큐베이션하였다(4℃에서 약 16시간). 하룻밤 인큐베이션 후에, 코팅 항원의 제거 없이 150 uL/웰의 검정 완충액을 첨가함으로서 플레이트를 블로킹하고, 주위 온도에서 약 1시간 동안 인큐베이션하고, 세척 완충액(BSA를 함유하지 않는 검정 완충액)으로 5회 세척하였다. 샘플 플레이트로부터의 상층액 50 uL/웰을 항원-코팅된 플레이트에 전달하고, 60분 동안 인큐베이션하고, 이어서 세척 완충액으로 3회 세척하였다. 이후에, 루테늄 표지화된 검출 항체(항-인간 H+L) 50 uL/웰을 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이션하였다. 1시간 후, 플레이트를 세척 완충액으로 세척하고, 웰당 150 uL의 MSD 판독 완충액(판독 완충액 T 4X, R92TD-2, MSD)을 첨가하였다. 플레이트를 발광 수준에 대해
Figure pct00039
판독기 상에서 즉시 판독하였다. MSD에 의해 검출된 ECL 신호는 혼합물 중의 % 유리 항체로 표현하였으며, Prism 소프트웨어에 소개된 (질량 작용의 법칙으로부터 도출된) 사용자 지정 식을 사용하여 데이터를 분석하여 친화도를 결정하였다. MSD-CAT 실험에 대한 결과가 표 21에 나타나 있다.
[표 21]
Figure pct00040
세포-표면 CD123 SP1에 대한 이중특이성 Ab의 MSD-CAT 친화도는 재조합 CD123 SP1에 대한 SPR 데이터보다 6배 초과로 더 강하지만; 세포-표면 CD123 SP2에 대한 친화도는 재조합 CD123 SP2와 유사하다(2배 미만으로 상이함). CD123 SP1에 대한 SPR 대 MSD-CAT 친화도의 차이는 재조합 항원에 비하여 세포 표면 상에서의 항원의 제시에 기인할 가능성이 가장 높다. MSD-CAT는 I3RB18-유래 이중특이성 Ab들(3978, 7955, 7959, 9958)이 pM 친화도로 세포-표면 인간 CD123 SP1 및 인간 CD123 SP2에 대한 가장 강한 결합제임을 보여주었다. I3RB18-유래 친화도는 I3RB2-유래 이중특이성 Ab보다 세포-표면 CD123 SP1 및 CD123 SP2에 대해 각각 약 10배 및 약 5배 더 강하다. 친화도는 동일한 패밀리 내에서 이중특이성 Ab들에 대해 유사하였다.
전체적으로, Biacore 및 MSD-CAT를 사용하는 분자 상호작용 분석은 I3RB18-유래 이중특이성 Ab가 I3RB2-유래 이중특이성 Ab에 대해서보다 재조합 및 세포-표면 인간 CD123(SP1 및 SP2)에 더 강하게 결합된다는 것을 보여주어 일치하고 있다.
실시예 22. 유세포측정에 의한 세포-표면 발현된 항원에 대한 IgG4-PAA 포맷의 이중특이성 항체의 CD123 1가 친화도
유세포측정을 사용하여 인간 T 세포 (Biological Specialty, 미국 콜마 소재) 및 사이노몰거스 원숭이 T 세포 (Zen Bio, 미국 트라이앵글 리서치 파크 소재) 상의 CD3에 대한 몇몇 CD123×CD3 이중특이성 Ab의 친화도 값을 측정하였다. 이 포맷은 기지 친화도의 고정 농도의 표지화된 항-CD3 mAb와 증가하는 농도의 비표지화된 시험 Ab를 사용하는 경쟁 결합을 수반하였다(문헌[Ashkenazi A et al. PNAS: 88:10535, 1991]). 사용된 항-CD3 mAb는 친화도 값이 SP34-2와 유사한 CD3B146 hu IgG1-AlaAla F405L 항체였다. SP34-2에 대한 Kd를 포화 결합을 사용하여 결정하였으며, 인간 및 사이노몰거스 원숭이 T-세포 결합 곡선의 예가 도 29에 나타나 있다. 도 30은, 인간 T-세포(도 30의 A) 및 사이노몰거스 T-세포(도 30의 B)에 대해 획득된, 표지화된 B146과 다양한 농도의 비표지화된 CD123 × CD3 이중특이성 항체들의 경쟁 결합을 나타낸다. 비견되는 값들이 인간 및 사이노몰거스 원숭이 T 세포에 대해 획득되었다. 분석된 샘플들 사이에 하기의 3개의 CD3 친화도 그룹이 있는 것으로 나타나며: 고(9 내지 15 nM), 중간(25 내지 50 nM) 및 저(110 내지 270 nM), 이들은 표 22에 요약되어 있다.
[표 22]
Figure pct00041
실시예 23. 세포 사멸 기능 검정에서 IgG4-PAA CD123 × CD3 이중특이성 Ab의 평가
실시예 16에 기재된 바와 같은 T-세포 매개 세포독성 검정을 사용하여, 2명의 건강한 공여자로부터의 T-세포를 사용하여 세포 용해에 대한 CD123 × CD3 이중특이성 Ab를 평가하였다. 이들 실험을 위하여, OCI-AML5, KG-1 및 JIM3 세포를 사용하였다. JIM3은 골수종 종양주이고 CD123 발현을 갖지 않으며, 이를 대조군으로서 사용하였다. 세포를 이중특이성 Ab로 48시간 동안 처리하였다. 이 연구에 대한 E:T 비는 5:1이었으며, 2 mg/mL의 Fc 차단제를 첨가하여 Fc 기능을 차단하였다.
37℃, 5% CO2에서 48시간 인큐베이션 후의 AML 세포주 OCI-AML(도 31), KG-1(도 32), 및 JIM3(도 33)의 T-세포 매개 세포 용해의 결과가 나타나 있다. MV4-11 및 OCI-AML5는 CD123 발현 세포주이고, JIM3은 CD123 발현을 아주 거의 또는 전혀 갖지 않는다. 이 연구에 대한 효과기/표적 세포 비는 5:1이었다. Fc 차단제의 2 mg/mL 분취물을 첨가하여 Fc 기능을 차단하였다.
결과는 IgG1-AA 포맷의 CD123 × CD3 이중특이성 Ab에 관한 앞서의 세포-사멸 실험과 유사하다. I3RB217(I3RB18) 및 I3RB218(I3RB2) 항체 둘 모두는, 이중특이성 포맷으로 항-CD3 항체와 조합될 때, CD123+ 세포를 특이적으로 사멸하는 데 효능이 있다. 세포-사멸은 CD123-함유 세포에 특이적인데, 이는 JIM3 세포에 대한 효과의 결여에 의해 입증되는 바와 같다. 추가적으로, 이 데이터는 I3RB218(I3RB2-기반) 이중특이성 항체와 I3RB217(I3RB18-기반) 이중특이성 항체 사이의 명확한 순위매김을 가능하게 하는데, I3RB217 × CD3 이중특이성 Ab가 I3RB218 × CD3 이중특이성 Ab보다 더 강력하며, 이는 앞서의 세포 사멸 데이터와 일치한다.
실시예 24. 수용체 이종이량체화 검정에서 이중특이성 항체의 평가
IL3RA/CD131 (DiscoveRx 93-0969-C1)에 대한 DiscoveRx 수용체 이량체화(Receptor Dimerization) 검정을 사용하여, IL3R®(CD123)/IL3Rβ(CD131)의 IL3-유도 이종복합체화를 방지하는 CD123 항체의 능력을 평가하였다. CD123 및 CD131에는 ProLink™ (PK) 또는 효소 억셉터(Enzyme Acceptor)(EA)를 태깅한다. IL3-유도 활성화 시에, 이들 단백질은 이량체화되어 IL3 수용체를 형성하며, 이는 2개의 β-gal 성분이 보완하여 활성 효소를 생성되게 한다. 활성 β-gal은 기질의 존재 하에서 화학발광 신호를 생성한다. 항체 농도가 증가함에 따라 감소하는 신호를 보여주는 항-CD123 항체 또는 이중특이성 항체는 이종이량체화를 방지하는 데 있어서 양성이다.
이들 세포를 제조사의 프로토콜에 따라 PathHunter® 검출 시약 (DiscoveRx)을 사용하여 IL-3 리간드의 존재 하에서의 효소 활성의 증가에 대해 시험하였다. HEK293 IL3RA-PK/CSF2RB-EA 세포주를 384웰 플레이트 상에서 5,000개 세포/웰로 4회 반복하여 20 uL의 검정 배지 중에 플레이팅하였다. 항체 스톡을, 높은 화합물 농도가 10 ug/mL가 되도록 0.1% BSA/PBS 중에 연속 희석시켰다. 이 높은 용량을 시험되는 용량이 11개가 되도록 1:3으로 연속 희석시켰다. 5 μl의 희석된 항체를 웰에 첨가하였다. 세포를 37C에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 100 ㎍/mL의 재조합 인간 IL-3 스톡 용액을 희석시켜, IL-3의 60 ng/mL 희석물 5 μl를 각각의 웰에 첨가하였다. 사용된 IL-3의 최종 농도는 10 ng/mL였다. 세포를 37C에서 추가 6시간 인큐베이션하였다. 용해 완충액 및 효소 기질을 함유하는 PathHunter 플래시 검출 시약(Flash Detection Reagent)을 세포에 첨가하고, 실온에서 30분 인큐베이션하고, Envision 발광광도계(luminometer) 상에서 판독하였다. GraphPad Prism 6을 사용하여 데이터를 분석하였다. 제한(constraint) 없이 가변 기울기(4 파라미터)를 갖는 S자형 용량 반응을 사용하여 곡선을 적합화하였다: 적합 방법 = 최소 제곱법(표준 적합).
IgG4 PAA 이중특이성 항체 8747 및 7959뿐만 아니라, 모 항체 I3RB218 및 I3RB217도 이 검정에서 실시하였다. 이 검정은 10 ng/ml의 IL-3의 존재 하에서 2회의 독립 횟수로 실시하였으며, 양성 대조군 CD123 항체 7G3을 이 검정에서 비교물로서 사용하였다. 항-CD123 아암 I3RB18 서열, I3RB217 및 7959(도 34의 C 및 D)를 함유한 항체는 IL-3 리간드의 존재 하에서 기능적 IL-3 수용체의 형성을 방지할 수 있었다. 항-CD123 아암 I3RB2, I3RB218 및 8747(도 34의 A 및 B)을 함유한 항체는 이 검정에서 기능적 IL-3 수용체의 형성을 방지하지 못했다. 이는 I3RB18이 기능적 IL-3 수용체와 관련된 하류 신호전달을 억제할 수 있었음을 보여준 앞서의 데이터와 상관된다.
실시예 24. KG-1 종양 모델에서의 몇몇 이중특이성 항체의 평가
CD123 × CD3 이중특이성 Ab들 중 몇몇을 앞서 기재된 바와 같이 KG-1 AML 뮤린 모델에서의 효능에 대해 평가하였다. HemaCare (미국 캘리포니아주 밴 나이즈 소재)로부터 입수된, 동결된 단리된 말초 혈액 단핵 세포 바이알(바이알당 100×106개 세포, 카탈로그 PB009-3)을 IgG4 이중특이성 항체를 시험하는 데 사용한 것을 제외하고는, 이 프로토콜은 이 연구에 있어서 실시예 16 및 실시예 17에서와 동일하였다. NSG 마우스에 KG-1 세포를 피하 접종하고, 이어서 종양이 확립되었을 때(평균 종양 부피 = 135.7 +/- 4.7 ㎣), 인간 PBMC를 정맥내 생착하였다. 이어서, 마우스에 다양한 친화도를 갖는 IgG4 PAA CD123 × CD3 이중특이성 Ab, 및 표 23에 기재된 바와 같은 다양한 용량의 상응하는 대조군 이중특이성 Ab를 투여하였다.
[표 23]
Figure pct00042
다수의 CD123 × CD3 이중특이성 Ab에 대한 생체내 효능 연구의 결과가 도 35 내지 도 42에 나타나 있다. 도 35 내지 도 38은 KG-1 인간 AML 이종이식편에서의 다양한 친화도 및 용량에서의 CD123 × CD3 IgG4-PAA 이중특이성 Ab의 효능을 나타낸다. 도 35에서, 고친화도 CD123 및 CD3 아암을 갖는 이중특이성 Ab는 종양 삽입 후 일수 25부터 일수 36까지 PBS 및 대조군 이중특이성 Ab에 비하여 유의한 효능을 가졌다(p<0.001). 종양 삽입 후 일수 36까지, 1 ㎍ 용량의 이중특이성 Ab 9958은 0.1 ㎍에 비하여 유의한 효능을 가졌으며, 이중특이성 Ab 7959의 두 용량 모두는 유의한 효능을 가졌다(p<0.01). 이는 고친화도 CD123 및 CD3 아암이 이 모델에서 현저한 효능을 위해 필요함을 나타낸다.
도 36에서, 10 ㎍ 용량의 이중특이성 Ab 3978은 종양 삽입 후 일수 28부터(p<0.05) 일수 36까지(p<0.001) PBS 및 대조군 이중특이성 Ab에 비하여 유의한 효능을 가졌으며, 1 ㎍ 용량은 종양 삽입 후 일수 32부터(p<0.05) 일수 36까지(p<0.01), 그리고 0.1 ㎍ 용량은 종양 삽입 후 일수 32부터(p<0.01) 일수 36까지(p<0.001) 그러하였다. 이 이중특이성 Ab에 대해 용량-의존적 반응이 있었으며, 이는 고용량의 고친화도 CD123 아암이 이 모델에서 효능을 가져올 수 있음을 나타낸다.
도 37에서, 0.1 ㎍ 용량의 이중특이성 Ab 8747은 종양 삽입 후 일수 32부터 일수 36까지 PBS 및 대조군 이중특이성 Ab에 비하여 유의한 효능을 가졌으며(p<0.001), 종양 삽입 후 일수 36까지 1 및 10 ㎍ 용량에 비하여 유의한 효능을 가졌다(p<0.001). 이는 저용량의 고친화도 CD3 아암이 이 모델에서 효능을 가져올 수 있음을 나타낸다.
도 38에서, 이중특이성 Ab 8876은 어떠한 용량에서도 PBS 및 대조군 이중특이성 Ab에 비하여 유의한 효능을 갖지 못하였다.
도 39 내지 도 42는 시간 경과에 따른 치료군의 평균 체중 변화를 나타낸다. 앞서 기재된 바와 같이, 체중 손실은 GVHD의 개시 및 중증도와 상관되며, 이는 활성화된 T 세포에 의해 야기된다.
0.1 ㎍의 이중특이성 Ab 7959 및 1 ㎍의 이중특이성 Ab 9958로 처리된 동물들은 PBS, 대조군 이중특이성 Ab, 및 다른 용량의 이중특이성 Ab 7959 및 이중특이성 Ab 9958로 처리된 것들보다 더 심각하고 더 이른 개시의 체중 손실을 가졌다(도 39). 이는 1 ㎍의 이중특이성 Ab 9958에서 관찰된 유의한 항-종양 효능과 상관된다(도 35).
10 ㎍ 용량의 이중특이성 Ab 3978로 처리된 동물들은 PBS 및 대조군 이중특이성 Ab로 처리된 것들과 비교하여 더 심각하고 더 이른 개시의 체중 손실을 가졌다(도 40). 1 ㎍ 및 0.1 ㎍ 용량으로 처리된 마우스는 용량-의존적 방식으로 체중 손실이 이어졌다. 용량-의존적 체중 손실은 도 36에 나타낸 용량-의존적 항-종양 효능과 상관된다.
0.1 ㎍ 용량의 이중특이성 Ab 8747로 처리된 동물들은 PBS-처리된 군의 것과 유사한 체중 손실을 가졌지만, 마우스는 종양 삽입 후 일수 39에서 시작하여 체중을 재획득하였다(도 41). 1 또는 10 ㎍ 용량에 대해서는 체중 손실이 없었다. 0.1 ㎍ 용량에서 관찰된 체중 손실은 이 용량에서 관찰된 항-종양 효능과 상관된다(도 37).
이중특이성 Ab 8876으로 처리된 동물들은 PBS 또는 대조군 이중특이성 항체 처리된 마우스의 체중 손실과 상이한 체중 손실을 나타내지 않았으며(도 42), 이는 이 이중특이성 항체에 대해 관찰된 항-종양 효능의 결여에 상응한다(도 38).
요약하면, CD123 × CD3 이중특이성 Ab는, 단지 효과기 세포(T 림프구)의 존재 하에서만, CD123 발현 인간 AML 세포주, KG-1에서 일관된 효능을 보여준다. 단지 질병(KG-1 이종이식편)의 존재 하에서만, 투여 기간 직후에 T 세포 증폭이 관찰되었다. 추가적으로, 이중특이성 효능은 체중 손실에 의해 측정된 바와 같이 GVHD 개시와 상관되며, 이는 활성화된 T 림프구가 존재함을 나타낸다. 이와 함께, 이들 데이터는 CD123 × CD3 이중특이성 항체가 표적 및 효과기 세포 생착의 제안된 기전을 통해 항-종양 효능, 및 T 세포 사멸을 가짐을 나타낸다.
실시예 24. 생체내 마우스 PK 연구
시험 Ab 대상물을 0.2 mg/mL로 인산염-완충 식염수 중에 제형화하였다. Nanodrop 분광광도계를 사용하여 농도를 확인하고, 이어서 0.2 마이크로미터 시린지 필터로 멸균-여과하였다.
이들 연구에서 사용된 유전자도입 동물은 C57BL/6 마우스로부터 유래된다. Jackson Laboratory(미국 바 하버 소재)로부터 라이센스를 받은 Tg32는 그들의 내인성 마우스 FcRn α 유전자가 녹아웃되어 있고, 천연 인간 유전자 프로모터의 제어 하에서 인간 FcRn α 유전자로 유전자도입된다. Tg32 헤미(hemi)는 FcRn 도입유전자에 대해 반접합성인 마우스를 지칭하는데, 후자는 동형접합성 유전자도입 마우스를 FcRn ® 녹아웃 마우스와 교배함으로써 유도된다. Tg32 헤미 마우스 모델에 대해 인간 항체의 PK와 영장류에서의 PK 사이에 유의한 상관관계가 관찰되었으며, 이에 따라 이것을 후속 PK 연구에 사용하여 Ab 반감기를 평가하였다. 모든 마우스 교배는 미국 펜실베이니아주 보여타운 공장의 SAGE Research Labs에서 행하였다.
이 연구 동안, 6 주령된 마우스를 사용하였는데, 이때 48 마리의 암컷 Tg32 헤미 마우스에 군당 5 마리의 마우스를 사용하여 hIgG4-PAA 이중특이성 Ab를 IV 주사하였다. 후안와동 채혈을 동일한 시점에서 실시하였다.
샘플 수집 후, 혈청 분석을 수행하였다. 혈청 샘플 중 인간 IgG의 농도를 MESO Scale Discovery(MSD) 포맷으로 전기화학발광 면역검정에 의해 결정하였다. 스트렙타비딘 MSD 플레이트를 Starting Block T20 (Thermo) 중 2 ㎍/mL 비오티닐화 F(ab')2 염소 항 hu IgG (H+L, Jackson 로트 109-066-08) 50 μL/웰로 4 ℃에서 하룻밤 코팅하였다. 플레이트를 PBS 완충액으로 세척하고, 샘플을 Starting Block T20 중 10% 마우스 혈청 (Bioreclamations, 미국 뉴욕주 소재) 중에 희석시켰다. 0.1 mg/mL에서 시작해서 연속 2배 희석에 대한, 각각의 시험 대상물의 표준 곡선을 각각의 플레이트 상에 포함하였다. 플레이트를 진탕기 상에서 실온에서 2 내지 3시간 동안 인큐베이션하고, 세척하고, 이어서 진탕기 상에서 실온에서 1시간 동안 2 ㎍/mL의 MSD-TAG(루테늄-표지화된 항-인간 IgG mAb, R10Z8E9, MSD)와 함께 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고, 200 μL의 MSD 판독 완충액(MSD)을 첨가하고, MSD Sector Imager 6000 상에서 판독하였다.
PK 혈청 샘플이, 시험 샘플의 PK에 영향을 줄 수 있는 현저한 면역 역가를 가졌는지의 여부를 결정하기 위하여, 10 ㎍/mL로 각각의 시험 대상물로 코팅하고 4 ℃에서 하룻밤 인큐베이션한 Maxisorb 플레이트 (Nunc) 상에서 ELISA를 수행하였다. 혈청 샘플을 1% BSA-PBS 중에 희석시키고, 실온에서 진탕하면서 2 내지 3시간 동안 플레이트 상에서 인큐베이션하였다. 고추냉이 퍼옥시다제-접합된 당나귀 항-마우스 IgG (Jackson ImmunoResearch)를 사용하여 포획된 항체를 검출한 후; 기질 발현을 위하여 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 첨가 (Fitzgerald)를 행하였다. 플레이트를 판독하고, 완충액 또는 대조군 혈청 값보다 3배 더 큰 분광광도계 판독치를 양성으로 간주하였다. 면역 역가를 1/혈청 희석으로 표현하였다. 면역 역가는 관찰되지 않았다(데이터는 나타내지 않음).
마지막으로, 분자에 대해 약물동태를 결정하였다. Prism 버전 5.01 소프트웨어 (GraphPad Software, Inc.)를 사용하여 자연 로그 농도 대 시간의 선형 회귀에 의해 적합화된 1-단계 지수 감쇠 모델(1-phase exponential decay model)을 사용하여 PK 연구에 대한 제거 단계의 최종 반감기(t1/2) 계산을 결정하였다. 2 단계 모델은 배제시켰는데, 각각의 시험 대상물에 대해, 최적-적합 모델은 대부분의 동물에 대한 추가 제곱합(extra sum of square) F 검정의 비유의성(p > 0.05)에 의해 결정된 바와 같이 1-단계 지수 감소 모델이었기 때문이다. 최소 제곱 선형 감쇠 모델을 1/적합화된 농도에 의해 가중치를 주었다. 제거 단계의 반감기 계산은 화학식 t1/2 = ln2/β를 사용하여 결정하였는데, 여기서 β는 초회-투여 후에 시작하여 최소 제곱 회귀 분석에 의해 적합화된 선의 -기울기이다.
본 명세서에 기재된 PK 연구에서, 항체에 대한 최종 반감기 값은 시험군 내의 각각의 동물에 대해 계산된 t1/2 값의 평균을 취함으로써 결정하였다. 이들 연구에서의 이상치(outlier)는 투여 후 약 7d에 1 대 1000 초과의 마우스 항-인간 IgG 역가를 보여주거나 또는 군 내의 다른 마우스에 대한 값보다 2배 초과로 더 낮은 초기 혈청 값 - 이는 아마도 완전히 투여되지 않은 것에 기인될 것임 - 을 보여주는 동물로서 확인되었다.
마우스 데이터로부터의 인간 PK 예측은, 클리어런스가 마우스 또는 인간에서의 표적 결합에 의해 유의하게 영향을 받지 않는 것으로 여겨지는 8개의 인간 IgG 항체들의 패널에 대해 huFcRn-유전자도입 마우스 대 인간에서의 관찰된 반감기 차이에 기초하였다. 그러한 분석에 기초하여, CD123 × CD3 이중특이성 Ab에 대한 인간에서의 최종 반감기는 huFcRn-유전자도입 마우스에서 관찰된 것보다 2 내지 4배 더 길 것으로 추산되었으며, 이때 외삽은 클리어런스에 대한 표적 결합의 영향이 마우스 및 인간에서 비견되는 것으로 가정한다. 표 24는 다양한 이중특이성 항체 변이체에 대한 관찰된 마우스 반감기 값 및 그러한 가정을 반영하는 상응하는 예측된 인간 값을 요약한다. 종에 걸친 상대성장 스케일링(allometric scaling)에 기초한, 잘 알려진 인간 PK 예측 방법은 마우스 PK 데이터를 사용해서는 검증되어 있지 않기 때문에, 상대성장 스케일링은 이러한 예측에 사용하지 않았다. PK 결과는 혈청 농도 대 시간으로 도 43에 나타나 있다. PK 프로파일은 28일의 경과에 걸쳐 혈청 농도의 선형 감소를 나타낸다. 모든 CD123 × CD3 이중특이성 항체 Ab에 대해 추산된 마우스 반감기 값은 5.2 내지 6.6일에서 유사하였다. 최소 면역 역가(1:40 미만)가 모든 군에서 관찰되었다. 예측된 인간 클리어런스 및 인간 반감기 값과 함께 마우스 PK 데이터(평균 +/- 표준 편차를 가짐)가 표 24에 요약되어 있다. 인간 반감기 예측은 인간에서의 표적 결합이 마우스에서보다 더 크지 않는 것으로 가정한다.
IgG4-PAA 이중특이성 항체 Ab는 마우스에서 I3RB2 군과 I3RB18 군 사이에 유사한 값을 보여주었다. 기재된 바와 같이 자연 로그 농도 대 시간의 선형 회귀에 의해 적합화된 1-단계 지수 감쇠 모델을 사용하여 제거 단계의 마우스 반감기 계산을 결정하였다. Tg32 헤미 마우스에서 8개의 이중특이성 항체 Ab에 대해 계산된 반감기 값은 하기와 같았다: 3978, 6.6 +/- 0.7일; 7955, 5.2 +/- 0.4일; 7959, 6.6 +/- 0.6일; 9958, 6.4 +/- 0.7일; 8876, 4.1 +/- 0.7일; 4435, 5.4 +/- 1.0일; 8747, 6.4 +/- 0.4일; 5466, 5.6 +/- 0.1일. 마우스 데이터로부터의 인간 PK 예측은 huFcRn-유전자도입 마우스 대 인간에서의 관찰된 반감기 차이에 기초하였다. 그러한 분석에 기초하여, CD123×CD3 이중특이성 항체에 대한 인간에서의 추산된 최종 반감기는 huFcRn-유전자도입 마우스에서 관찰된 것보다 2 내지 4배 더 길 것인데, 이때 클리어런스에 대한 표적 결합의 영향이 마우스 및 인간에서 비견되는 것으로 가정한다. 표 24는 이중특이성 항체 변이체에 대한 관찰된 마우스 반감기 값 및 그러한 가정을 반영하는 상응하는 예측된 인간 값을 요약한다.
[표 24]
Figure pct00043
CD123XCD3 이중특이성 항체에 대한 마우스 PK 연구의 결과는, Tg32 헤미 마우스에서 관찰된 t1/2 값이 동일한 방식으로 프로파일링된 8개의 임상 항체와 양호하게 비교됨을 보여준다(문헌[Tam, et al, MAbs (2013) 5(3):3987-405]).
SEQUENCE LISTING <110> Francois, Gaudet Nemeth, Jennifer F Attar, Ricardo F Harman, Benjamin C Li, Yingzhe Luo, Jinquan McDaid, Ronan F Pomerantz, Steven C Tam, Susan H Teplyakov, Alexey Wheeler, John Wu, Sheng-Juin <120> CD123 BINDING AGENTS AND USES THEREOF <130> 620466B2 <160> 234 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 378 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Val Leu Leu Trp Leu Thr Leu Leu Leu Ile Ala Leu Pro Cys Leu 1 5 10 15 Leu Gln Thr Lys Glu Asp Pro Asn Pro Pro Ile Thr Asn Leu Arg Met 20 25 30 Lys Ala Lys Ala Gln Gln Leu Thr Trp Asp Leu Asn Arg Asn Val Thr 35 40 45 Asp Ile Glu Cys Val Lys Asp Ala Asp Tyr Ser Met Pro Ala Val Asn 50 55 60 Asn Ser Tyr Cys Gln Phe Gly Ala Ile Ser Leu Cys Glu Val Thr Asn 65 70 75 80 Tyr Thr Val Arg Val Ala Asn Pro Pro Phe Ser Thr Trp Ile Leu Phe 85 90 95 Pro Glu Asn Ser Gly Lys Pro Trp Ala Gly Ala Glu Asn Leu Thr Cys 100 105 110 Trp Ile His Asp Val Asp Phe Leu Ser Cys Ser Trp Ala Val Gly Pro 115 120 125 Gly Ala Pro Ala Asp Val Gln Tyr Asp Leu 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Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 219 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> I3RB217 LC <400> 219 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Gly Phe Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly 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Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 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Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Asn Gly Gly Gly Gly Ser Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Thr Ser Ala Gln Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 223 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> 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Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 224 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3B94 HC <400> 224 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Pro Ala Arg Leu Tyr Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Leu Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 225 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3B94 LC <400> 225 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 226 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD123 SP2 with 6His tag <400> 226 Gln Thr Lys Glu Gly Lys Pro Trp Ala Gly Ala Glu Asn Leu Thr Cys 1 5 10 15 Trp Ile His Asp Val Asp Phe Leu Ser Cys Ser Trp Ala Val Gly Pro 20 25 30 Gly Ala Pro Ala Asp Val Gln Tyr Asp Leu Tyr Leu Asn Val Ala Asn 35 40 45 Arg Arg Gln Gln Tyr Glu Cys Leu His Tyr Lys Thr Asp Ala Gln Gly 50 55 60 Thr Arg Ile Gly Cys Arg Phe Asp Asp Ile Ser Arg Leu Ser Ser Gly 65 70 75 80 Ser Gln Ser Ser His Ile Leu Val Arg Gly Arg Ser Ala Ala Phe Gly 85 90 95 Ile Pro Cys Thr Asp Lys Phe Val Val Phe Ser Gln Ile Glu Ile Leu 100 105 110 Thr Pro Pro Asn Met Thr Ala Lys Cys Asn Lys Thr His Ser Phe Met 115 120 125 His Trp Lys Met Arg Ser His Phe Asn Arg Lys Phe Arg Tyr Glu Leu 130 135 140 Gln Ile Gln Lys Arg Met Gln Pro Val Ile Thr Glu Gln Val Arg Asp 145 150 155 160 Arg Thr Ser Phe Gln Leu Leu Asn Pro Gly Thr Tyr Thr Val Gln Ile 165 170 175 Arg Ala Arg Glu Arg Val Tyr Glu Phe Leu Ser Ala Trp Ser Thr Pro 180 185 190 Gln Arg Phe Glu Cys Asp Gln Glu Glu Gly Ala Asn Thr Arg Ala His 195 200 205 His His His His His 210 <210> 227 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 227 Arg Ala Arg Glu Arg Val Tyr Glu Phe 1 5 <210> 228 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 228 Ile Gln Lys Arg Met Gln Pro Val Ile Thr Glu Gln 1 5 10 <210> 229 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 229 Leu Leu Asn Pro Gly Thr 1 5 <210> 230 <211> 253 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> I3RB18 scFv used in x-ray crystallography <400> 230 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Gly Phe Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly 100 105 110 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 130 135 140 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 145 150 155 160 Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 165 170 175 Gly Ile Ile Asp Pro Ser Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 180 185 190 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 195 200 205 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 210 215 220 Ala Arg Gly Asp Gly Ser Thr Asp Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 225 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Gln Ile 165 170 175 Arg Ala Arg Glu Arg Val Tyr Glu Phe Leu Ser Ala Trp Ser Thr Pro 180 185 190 Gln Arg Phe Glu Cys Asp Gln Glu Glu Gly Ala Asn Thr Arg Ala His 195 200 205 His His His His His His His 210 215 <210> 232 <400> 232 000 <210> 233 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 233 Thr Glu Gln Val Arg Asp 1 5 <210> 234 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 234 Arg Ala Arg Glu Arg Val Tyr Glu 1 5

Claims (86)

  1. CD123 SP2(IL-3Ra) 및 CD123 SP1(IL3Ra)에 면역특이적으로 결합하는, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  2. 제1항에 있어서,
    a. 서열 번호 006의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 007의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 008의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3,
    b. 서열 번호 012의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 013의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 014의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3,
    c. 서열 번호 027의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 028의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 029의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3,
    d. 서열 번호 051의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 052의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 053의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3,
    e. 서열 번호 055의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 056의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 057의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3, 또는
    f. 서열 번호 033의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 085의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 086의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3을 포함하는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
  3. 제2항에 있어서,
    a. 서열 번호 006의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR1, 서열 번호 007의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 008의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR3을 포함하는 상기 항체는 서열 번호 009의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 010의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 011의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 추가로 포함하거나;
    b. 서열 번호 012의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR1, 서열 번호 013의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 014의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR3을 포함하는 상기 항체는 서열 번호 015의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 016의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 017의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 추가로 포함하거나;
    c. 서열 번호 027의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR1, 서열 번호 028의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 029의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR3을 포함하는 상기 항체는 서열 번호 030의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 031의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 032의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 추가로 포함하거나;
    d. 서열 번호 051의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR1, 서열 번호 052의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 053의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR3을 포함하는 상기 항체는 서열 번호 024의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 025의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 054의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 추가로 포함하거나;
    e. 서열 번호 055의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR1, 서열 번호 056의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 057의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR3을 포함하는 상기 항체는 서열 번호 058의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 059의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 032의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 추가로 포함하거나; 또는
    f. 서열 번호 033의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR1, 서열 번호 085의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 086의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR3을 포함하는 상기 항체는 서열 번호 087의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 067의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 088의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 추가로 포함하는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (a)의 항체의 중쇄는 서열 번호 119의 아미노산 서열을 포함하거나; 상기 (b)의 항체의 중쇄는 서열 번호 120의 아미노산 서열을 포함하거나; 상기 (c)의 항체의 중쇄는 서열 번호 123의 아미노산 서열을 포함하거나; 상기 (d)의 항체의 중쇄는 서열 번호 136의 아미노산 서열을 포함하거나; 상기 (e)의 항체의 중쇄는 서열 번호 137의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 상기 (f)의 항체의 중쇄는 서열 번호 148의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (a)의 항체의 경쇄는 서열 번호 164의 아미노산 서열을 포함하거나; 상기 (b)의 항체의 경쇄는 서열 번호 165의 아미노산 서열을 포함하거나; 상기 (c)의 항체의 경쇄는 서열 번호 167의 아미노산 서열을 포함하거나; 상기 (d)의 항체의 경쇄는 서열 번호 168의 아미노산 서열을 포함하거나; 상기 (e)의 항체의 경쇄는 서열 번호 169의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 상기 (f)의 항체의 경쇄는 서열 번호 176의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편.
  6. 제1항에 있어서, 상기 항체의 중쇄는 서열 번호 120의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 항체의 경쇄는 서열 번호 165의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편.
  7. 제1항에 있어서, 상기 항체의 중쇄는 서열 번호 136의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 항체의 경쇄는 서열 번호 168의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 002의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 결합하는, 항체 또는 항원-결합 단편.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 항체 또는 항원-결합 단편인, 항체 또는 항원-결합 단편.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합체인, 항체 또는 항원-결합 단편.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, Fab 단편, Fab2 단편, 또는 단일쇄 항체인, 항원-결합 단편.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정될 때 적어도 5 nM의 친화도로 CD123에 면역특이적으로 결합하는, 항체 또는 항원-결합 단편.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정될 때 적어도 5 nM의 친화도로 CD123 SP1 또는 CD123 SP2에 면역특이적으로 결합하는, 항체 또는 항원-결합 단편.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정될 때 적어도 5 nM의 친화도로 CD123 SP1 및 CD123 SP2에 면역특이적으로 결합하는, 항체 또는 항원-결합 단편.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 동종형(isotype)을 갖는, 항체 또는 항원-결합 단편.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, IgG1 또는 IgG4 동종형인, 항체 또는 항원-결합 단편.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, IgG1 동종형인, 항체 또는 항원-결합 단편.
  18. 제17항에 있어서, 상기 IgG1은 Fc 영역 내에 K409R 치환을 갖는, 항체.
  19. 제18항에 있어서, Fc 영역 내에 L234A 치환 및/또는 L235A 치환을 추가로 포함하는, 항체.
  20. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, IgG4 동종형인, 항체 또는 항원-결합 단편.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 CD123 및 사이노몰거스 원숭이 CD123에 면역특이적으로 결합하는, 항체 또는 항원-결합 단편.
  22. 제21항에 있어서, 인간 SP1에 대한 상기 항체 또는 단편의 결합 친화도의 10배 이내의 결합 친화도로 사이노몰거스 원숭이 CD123에 면역특이적으로 결합하는, 항체 또는 항원-결합 단편.
  23. 제21항에 있어서, 인간 SP1에 대한 상기 항체 또는 단편의 결합 친화도의 5배 이내의 결합 친화도로 사이노몰거스 원숭이 CD123에 면역특이적으로 결합하는, 항체 또는 항원-결합 단편.
  24. 제1항에 있어서, 상기 항체는 CD123 SP2(IL3-Rα)에 결합하기 위하여, 하기를 포함하는 항체와 경쟁하는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편:
    a. 서열 번호 006의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 007의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 008의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3,
    b. 서열 번호 012의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 013의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 014의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3,
    c. 서열 번호 026의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 027의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 028의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3,
    d. 서열 번호 051의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 052의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 053의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3,
    e. 서열 번호 055의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 056의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 057의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3, 또는
    f. 서열 번호 033의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 085의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 086의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3을 포함하는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
  25. 제24항에 있어서, 상기 CD123 SP2(IL3-Rα)는 서열 번호 002의 아미노산 서열을 갖는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
  26. 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서,
    인간 CD123 SP1에 면역특이적으로 결합하며, 상기 항체는
    a. 서열 번호 018의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 019의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 020의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3;
    b. 서열 번호 021의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 022의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 023의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3;
    c. 서열 번호 033의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 035의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3;
    d. 서열 번호 033의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 036의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3;
    e. 서열 번호 033의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 037의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3;
    f. 서열 번호 033의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 038의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3;
    g. 서열 번호 039의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 040의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 041의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3;
    h. 서열 번호 039의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 042의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3;
    i. 서열 번호 033의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 043의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3;
    j. 서열 번호 039의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 044의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 045의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3;
    k. 서열 번호 039의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 046의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 047의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3;
    l. 서열 번호 033의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 048의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3;
    m. 서열 번호 033의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 049의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3;
    n. 서열 번호 033의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 050의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3;
    o. 서열 번호 033의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 060의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3;
    p. 서열 번호 033의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 061의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3;
    q. 서열 번호 033의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 065의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3;
    r. 서열 번호 039의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 069의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3;
    s. 서열 번호 033의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 071의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3;
    t. 서열 번호 039의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 072의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 073의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3;
    u. 서열 번호 039의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 074의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3;
    v. 서열 번호 033의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 078의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3;
    w. 서열 번호 033의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 081의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3;
    x. 서열 번호 033의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 082의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3;
    y. 서열 번호 033의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 089의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 090의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3;
    z. 서열 번호 039의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 093의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3;
    aa. 서열 번호 039의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 094의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3;
    bb. 서열 번호 033의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 097의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3;
    cc. 서열 번호 033의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 100의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3;
    dd. 서열 번호 039의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 102의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3;
    ee. 서열 번호 033의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 103의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3;
    ff. 서열 번호 039의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 106의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3;
    gg. 서열 번호 033의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 107의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3;
    hh. 서열 번호 033의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 111의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3;
    ii. 서열 번호 114의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 022의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 115의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3;
    jj. 서열 번호 114의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 022의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 116의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3;
    kk. 서열 번호 117의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 013의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 118의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3;
    ll. 서열 번호 051의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 052의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 053의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3; 또는
    mm. 서열 번호 033의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 034의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 042의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3을 포함하는, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  27. 제26항에 있어서,
    a. 서열 번호 018의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR1, 서열 번호 019의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 020의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR3을 포함하는 상기 항체는 서열 번호 009의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 010의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 011의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 추가로 포함하거나;
    b. 서열 번호 021의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR1, 서열 번호 022의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 023의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR3을 포함하는 상기 항체는 서열 번호 024의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 025의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 026의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 추가로 포함하거나;
    c. 서열 번호 033의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR1, 서열 번호 034의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 035의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR3을 포함하는 상기 항체는 서열 번호 030의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 031의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 032의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 추가로 포함하거나;
    d. 서열 번호 033의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR1, 서열 번호 034의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 036의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR3을 포함하는 상기 항체는 서열 번호 030의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 031의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 032의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 추가로 포함하거나;
    e. 서열 번호 033의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR1, 서열 번호 034의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 037의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR3을 포함하는 상기 항체는 서열 번호 030의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 031의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 032의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 추가로 포함하거나;
    f. 서열 번호 033의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR1, 서열 번호 034의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 038의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR3을 포함하는 상기 항체는 서열 번호 030의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 031의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 032의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 추가로 포함하거나;
    g. 서열 번호 039의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR1, 서열 번호 040의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 041의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR3을 포함하는 상기 항체는 서열 번호 030의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 031의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 032의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 추가로 포함하거나;
    h. 서열 번호 039의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR1, 서열 번호 034의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 042의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR3을 포함하는 상기 항체는 서열 번호 030의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 031의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 032의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 추가로 포함하거나;
    i. 서열 번호 033의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR1, 서열 번호 034의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 043의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR3을 포함하는 상기 항체는 서열 번호 030의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 031의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 032의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 추가로 포함하거나;
    j. 서열 번호 039의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR1, 서열 번호 044의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 045의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR3을 포함하는 상기 항체는 서열 번호 015의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 016의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 017의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 추가로 포함하거나;
    k. 서열 번호 039의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR1, 서열 번호 046의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 047의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR3을 포함하는 상기 항체는 서열 번호 030의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 031의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 032의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 추가로 포함하거나;
    l. 서열 번호 033의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR1, 서열 번호 034의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 048의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR3을 포함하는 상기 항체는 서열 번호 030의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 031의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 032의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 추가로 포함하거나;
    m. 서열 번호 033의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR1, 서열 번호 034의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 049의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR3을 포함하는 상기 항체는 서열 번호 030의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 031의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 032의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 추가로 포함하거나;
    n. 서열 번호 033의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR1, 서열 번호 034의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 050의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR3을 포함하는 상기 항체는 서열 번호 030의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 031의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 032의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 추가로 포함하거나;
    o. 서열 번호 033의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR1, 서열 번호 034의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 060의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR3을 포함하는 상기 항체는 서열 번호 030의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 031의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 032의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 추가로 포함하거나;
    p. 서열 번호 033의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR1, 서열 번호 034의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 061의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR3을 포함하는 상기 항체는 서열 번호 062의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 063의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 064의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 추가로 포함하거나;
    q. 서열 번호 033의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR1, 서열 번호 034의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 065의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR3을 포함하는 상기 항체는 서열 번호 066의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 067의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 068의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 추가로 포함하거나;
    r. 서열 번호 039의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR1, 서열 번호 034의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 069의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR3을 포함하는 상기 항체는 서열 번호 030의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 031의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 070의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 추가로 포함하거나;
    s. 서열 번호 033의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR1, 서열 번호 034의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 071의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR3을 포함하는 상기 항체는 서열 번호 030의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 031의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 032의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 추가로 포함하거나;
    t. 서열 번호 039의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR1, 서열 번호 072의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 073의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR3을 포함하는 상기 항체는 서열 번호 030의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 031의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 032의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 추가로 포함하거나;
    u. 서열 번호 039의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR1, 서열 번호 034의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 074의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR3을 포함하는 상기 항체는 서열 번호 075의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 076의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 077의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 추가로 포함하거나;
    v. 서열 번호 033의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR1, 서열 번호 034의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 078의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR3을 포함하는 상기 항체는 서열 번호 079의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 063의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 080의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 추가로 포함하거나;
    w. 서열 번호 033의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR1, 서열 번호 034의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 081의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR3을 포함하는 상기 항체는 서열 번호 030의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 031의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 032의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 추가로 포함하거나;
    x. 서열 번호 033의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR1, 서열 번호 034의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 082의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR3을 포함하는 상기 항체는 서열 번호 083의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 031의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 084의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 추가로 포함하거나;
    y. 서열 번호 033의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR1, 서열 번호 089의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 090의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR3을 포함하는 상기 항체는 서열 번호 091의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 076의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 092의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 추가로 포함하거나;
    z. 서열 번호 039의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR1, 서열 번호 034의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 093의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR3을 포함하는 상기 항체는 서열 번호 030의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 031의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 032의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 추가로 포함하거나;
    aa. 서열 번호 039의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR1, 서열 번호 034의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 094의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR3을 포함하는 상기 항체는 서열 번호 095의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 076의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 096의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 추가로 포함하거나;
    bb. 서열 번호 033의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR1, 서열 번호 034의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 097의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR3을 포함하는 상기 항체는 서열 번호 098의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 067의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 099의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 추가로 포함하거나;
    cc. 서열 번호 033의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR1, 서열 번호 034의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 100의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR3을 포함하는 상기 항체는 서열 번호 030의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 031의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 101의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 추가로 포함하거나;
    dd. 서열 번호 039의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR1, 서열 번호 034의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 102의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR3을 포함하는 상기 항체는 서열 번호 030의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 031의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 032의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 추가로 포함하거나;
    ee. 서열 번호 033의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR1, 서열 번호 034의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 103의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR3을 포함하는 상기 항체는 서열 번호 104의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 031의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 105의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 추가로 포함하거나;
    ff. 서열 번호 039의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR1, 서열 번호 034의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 106의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR3을 포함하는 상기 항체는 서열 번호 30의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 031의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 032의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 추가로 포함하거나;
    gg. 서열 번호 033의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR1, 서열 번호 034의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 107의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR3을 포함하는 상기 항체는 서열 번호 108의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 109의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 110의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 추가로 포함하거나;
    hh. 서열 번호 033의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR1, 서열 번호 034의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 111의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR3을 포함하는 상기 항체는 서열 번호 112의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 076의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 113의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 추가로 포함하거나;
    ii. 서열 번호 114의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR1, 서열 번호 022의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 115의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR3을 포함하는 상기 항체는 서열 번호 024의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 025의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 026의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 추가로 포함하거나;
    jj. 서열 번호 114의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR1, 서열 번호 022의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 116의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR3을 포함하는 상기 항체는 서열 번호 015의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 016의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 017의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 추가로 포함하거나;
    kk. 서열 번호 117의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR1, 서열 번호 013의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 118의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR3을 포함하는 상기 항체는 서열 번호 015의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 016의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 017의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 추가로 포함하거나;
    ll. 서열 번호 051의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR1, 서열 번호 052의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 053의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR3을 포함하는 상기 항체는 서열 번호 030의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 031의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 032의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 추가로 포함하거나; 또는
    mm. 서열 번호 033의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR1, 서열 번호 034의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 042의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 CDR3을 포함하는 상기 항체는 서열 번호 030의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 031의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 032의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 추가로 포함하는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원-결합 단편을 발현하는, 단리된 세포.
  29. 제28항에 있어서, 하이브리도마인, 세포.
  30. 제28항에 있어서, 상기 항체는 재조합적으로 생성되는, 세포.
  31. a) 제1 중쇄(HC1);
    b) 제2 중쇄(HC2);
    c) 제1 경쇄(LC1); 및
    d) 제2 경쇄(LC2)를 포함하며,
    상기 HC1과 상기 LC1이 쌍을 이루어서 CD123(IL3-Rα)에 면역특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위를 형성하고, 상기 HC2와 상기 LC2가 쌍을 이루어서 CD3에 면역특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 형성하는, 단리된 CD123(IL3-Rα) × CD3 이중특이성 항체 또는 그의 CD123(IL3-Rα) × CD3 이중특이성 결합 단편.
  32. 제31항에 있어서, 상기 CD123(IL3-Rα)은 CD123(IL3-Rα) SP1인, CD123(IL3-Rα) × CD3 이중특이성 항체 또는 이중특이성 결합 단편.
  33. 제31항에 있어서, 상기 CD123(IL3-Rα)은 CD123(IL3-Rα) SP2인, CD123(IL3-Rα) × CD3 이중특이성 항체 또는 이중특이성 결합 단편.
  34. 제31항에 있어서, 상기 CD123(IL3-Rα)은 CD123(IL3-Rα) SP1 및 CD123(IL3-Rα) SP2인, CD123(IL3-Rα) × CD3 이중특이성 항체 또는 이중특이성 결합 단편.
  35. 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 동종형인, CD123(IL3-Rα) × CD3 이중특이성 항체 또는 이중특이성 결합 단편.
  36. 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, IgG1 또는 IgG4 동종형인, CD123(IL3-Rα) × CD3 이중특이성 항체 또는 이중특이성 결합 단편.
  37. 제31항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, IgG1 동종형인, CD123(IL3-Rα) × CD3 이중특이성 항체 또는 이중특이성 결합 단편.
  38. 제31항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, IgG4 동종형인, CD123(IL3-Rα) × CD3 이중특이성 항체 또는 이중특이성 결합 단편.
  39. 제31항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, HC1은 서열 번호 203을 포함하고, LC1은 서열 번호 204를 포함하는, CD123(IL3-Rα) × CD3 이중특이성 항체 또는 이중특이성 결합 단편.
  40. 제39항에 있어서, HC2는 서열 번호 193을 포함하고, LC2는 서열 번호 194를 포함하는, CD123(IL3-Rα) × CD3 이중특이성 항체 또는 이중특이성 결합 단편.
  41. 제39항에 있어서, HC2는 서열 번호 195를 포함하고, LC2는 서열 번호 196을 포함하는, CD123(IL3-Rα) × CD3 이중특이성 항체 또는 이중특이성 결합 단편.
  42. 제39항에 있어서, HC2는 서열 번호 197을 포함하고, LC2는 서열 번호 198을 포함하는, CD123(IL3-Rα) × CD3 이중특이성 항체 또는 이중특이성 결합 단편.
  43. 제39항에 있어서, HC2는 서열 번호 199를 포함하고, LC2는 서열 번호 200을 포함하는, CD123(IL3-Rα) × CD3 이중특이성 항체 또는 이중특이성 결합 단편.
  44. 제39항에 있어서, HC2는 서열 번호 201을 포함하고, LC2는 서열 번호 202를 포함하는, CD123(IL3-Rα) × CD3 이중특이성 항체 또는 이중특이성 결합 단편.
  45. 제31항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, HC1은 서열 번호 205를 포함하고, LC1은 서열 번호 206을 포함하는, CD123(IL3-Rα) × CD3 이중특이성 항체 또는 이중특이성 결합 단편.
  46. 제45항에 있어서, HC2는 서열 번호 193을 포함하고, LC2는 서열 번호 194를 포함하는, CD123(IL3-Rα) × CD3 이중특이성 항체 또는 이중특이성 결합 단편.
  47. 제45항에 있어서, HC2는 서열 번호 195를 포함하고, LC2는 서열 번호 196을 포함하는, CD123(IL3-Rα) × CD3 이중특이성 항체 또는 이중특이성 결합 단편.
  48. 제45항에 있어서, HC2는 서열 번호 197을 포함하고, LC2는 서열 번호 198을 포함하는, CD123(IL3-Rα) × CD3 이중특이성 항체 또는 이중특이성 결합 단편.
  49. 제45항에 있어서, HC2는 서열 번호 199를 포함하고, LC2는 서열 번호 200을 포함하는, CD123(IL3-Rα) × CD3 이중특이성 항체 또는 이중특이성 결합 단편.
  50. 제45항에 있어서, HC2는 서열 번호 201을 포함하고, LC2는 서열 번호 202를 포함하는, CD123(IL3-Rα) × CD3 이중특이성 항체 또는 이중특이성 결합 단편.
  51. 제31항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정될 때 적어도 5 nM의 친화도로 CD123에 면역특이적으로 결합하는, CD123(IL3-Rα) × CD3 이중특이성 항체 또는 이중특이성 결합 단편.
  52. 제39항, 제40항, 제45항, 제46항, 및 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정될 때 적어도 15 nM의 친화도로 CD3에 면역특이적으로 결합하는, CD123(IL3-Rα) × CD3 이중특이성 항체 또는 이중특이성 결합 단편.
  53. 제39항, 제41항 내지 제44항, 제47항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정될 때 적어도 75 nM의 친화도로 CD3에 면역특이적으로 결합하는, CD123(IL3-Rα) × CD3 이중특이성 항체 또는 이중특이성 결합 단편.
  54. 제31항 내지 제36항, 및 제38항 중 어느 한 항에 있어서, HC1은 서열 번호 220을 포함하고, LC1은 서열 번호 221을 포함하는, CD123(IL3-Rα) × CD3 이중특이성 항체 또는 이중특이성 결합 단편.
  55. 제54항에 있어서, HC2는 서열 번호 210을 포함하고, LC2는 서열 번호 211을 포함하는, CD123(IL3-Rα) × CD3 이중특이성 항체 또는 이중특이성 결합 단편.
  56. 제54항에 있어서, HC2는 서열 번호 212를 포함하고, LC2는 서열 번호 213을 포함하는, CD123(IL3-Rα) × CD3 이중특이성 항체 또는 이중특이성 결합 단편.
  57. 제54항에 있어서, HC2는 서열 번호 214를 포함하고, LC2는 서열 번호 215를 포함하는, CD123(IL3-Rα) × CD3 이중특이성 항체 또는 이중특이성 결합 단편.
  58. 제54항에 있어서, HC2는 서열 번호 216을 포함하고, LC2는 서열 번호 217을 포함하는, CD123(IL3-Rα) × CD3 이중특이성 항체 또는 이중특이성 결합 단편.
  59. 제31항 내지 제36항, 및 제38항 중 어느 한 항에 있어서, HC1은 서열 번호 218을 포함하고, LC1은 서열 번호 219를 포함하는, CD123(IL3-Rα) × CD3 이중특이성 항체 또는 이중특이성 결합 단편.
  60. 제59항에 있어서, HC2는 서열 번호 210을 포함하고, LC2는 서열 번호 211을 포함하는, CD123(IL3-Rα) × CD3 이중특이성 항체 또는 이중특이성 결합 단편.
  61. 제59항에 있어서, HC2는 서열 번호 212를 포함하고, LC2는 서열 번호 213을 포함하는, CD123(IL3-Rα) × CD3 이중특이성 항체 또는 이중특이성 결합 단편.
  62. 제59항에 있어서, HC2는 서열 번호 214를 포함하고, LC2는 서열 번호 215를 포함하는, CD123(IL3-Rα) × CD3 이중특이성 항체 또는 이중특이성 결합 단편.
  63. 제45항에 있어서, HC2는 서열 번호 216을 포함하고, LC2는 서열 번호 217을 포함하는, CD123(IL3-Rα) × CD3 이중특이성 항체 또는 이중특이성 결합 단편.
  64. 제54항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정될 때 적어도 5 nM의 친화도로 CD123에 면역특이적으로 결합하는, CD123(IL3-Rα) × CD3 이중특이성 항체 또는 이중특이성 결합 단편.
  65. 제54항, 제55항, 제59항, 제60항, 및 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정될 때 적어도 15 nM의 친화도로 CD3에 면역특이적으로 결합하는, CD123(IL3-Rα) × CD3 이중특이성 항체 또는 이중특이성 결합 단편.
  66. 제59항, 제56항 내지 제58항, 제61항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정될 때 적어도 75 nM의 친화도로 CD3에 면역특이적으로 결합하는, CD123(IL3-Rα) × CD3 이중특이성 항체 또는 이중특이성 결합 단편.
  67. 제31항 내지 제53항 중 어느 한 항의 항체 또는 이중특이성 결합 단편을 발현하는, 단리된 세포.
  68. 제67항에 있어서, 하이브리도마인, 세포.
  69. 제67항에 있어서, 상기 항체 또는 이중특이성 결합 단편은 재조합적으로 생성되는, 세포.
  70. 암을 갖는 대상체를 치료하기 위한 방법으로서,
    제31항 내지 제51항 중 어느 한 항의 CD123(IL3-Rα) × CD3 이중특이성 항체 또는 이중특이성 결합 단편의 치료적 유효량을 그를 필요로 하는 환자에게 암을 치료하기에 충분한 시간 동안 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  71. 암 세포의 성장 또는 증식을 억제하기 위한 방법으로서,
    제31항 내지 제51항 중 어느 한 항의 CD123(IL3-Rα) × CD3 이중특이성 항체 또는 이중특이성 결합 단편의 치료적 유효량을 투여하여 암 세포의 성장 또는 증식을 억제하는 것을 포함하는, 방법.
  72. T 세포를 CD123-발현 암 세포로 방향전환(redirecting)시키기 위한 방법으로서,
    제31항 내지 제51항 중 어느 한 항의 CD123(IL3-Rα) × CD3 이중특이성 항체 또는 이중특이성 결합 단편의 치료적 유효량을 투여하여 T 세포를 암으로 방향전환시키는 것을 포함하는, 방법.
  73. 제70항, 제71항, 또는 제72항에 있어서, 상기 암은 혈액암인, 방법.
  74. 제73항에 있어서, 상기 혈액암은 CD123(IL3-Rα)-발현 혈액암인, 방법.
  75. 제74항에 있어서, 상기 CD123(IL3-Rα)-발현 혈액암은 급성 골수성 백혈병(AML), 골수이형성 증후군(MDS), 급성 림프구성 백혈병(ALL), 미만성 대 B-세포 림프종(DLBCL), 만성 골수성 백혈병(CML) 또는 아구성 형질세포양 수지상 세포 신생물(DPDCN)인, 방법.
  76. 제75항에 있어서, 상기 CD123(IL3-Rα)-발현 혈액암은 AML인, 방법.
  77. 제70항에 있어서, 제2 치료제를 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  78. 제77항에 있어서, 상기 제2 치료제는 화학치료제 또는 표적화된 항암 요법인, 방법.
  79. 제78항에 있어서, 상기 화학치료제는 시타라빈, 안트라사이클린, 히스타민 다이하이드로클로라이드, 또는 인터류킨 2인, 방법.
  80. 제77항에 있어서, 상기 제2 치료제는 상기 대상체에게 상기 이중특이성 항체와 동시에, 순차적으로, 또는 개별적으로 투여되는, 치료 방법.
  81. 제31항 내지 제66항 중 어느 한 항의 CD123(IL3-Rα) × CD3 이중특이성 항체 또는 이중특이성 결합 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  82. 제54항 내지 제56항 중 어느 한 항의 세포를 배양함으로써 제31항 내지 제66항 중 어느 한 항의 CD123(IL3-Rα) × CD3 이중특이성 항체 또는 이중특이성 결합 단편을 생성하기 위한 방법.
  83. 제31항 내지 제66항 중 어느 한 항의 CD123(IL3-Rα) × CD3 이중특이성 항체 또는 이중특이성 결합 단편의 HC1, HC2, LC1 또는 LC2를 인코딩하는, 단리된 합성 폴리뉴클레오티드.
  84. 제31항 내지 제66항 중 어느 한 항의 CD123(IL3-Rα) × CD3 이중특이성 항체 또는 이중특이성 결합 단편 및 그를 위한 패키징을 포함하는, 키트.
  85. 서열 번호 226의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  86. 서열 번호 234 및 서열 번호 228의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
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