CN113286817A - Dll3结合蛋白及使用方法 - Google Patents

Dll3结合蛋白及使用方法 Download PDF

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CN113286817A CN201980077649.4A CN201980077649A CN113286817A CN 113286817 A CN113286817 A CN 113286817A CN 201980077649 A CN201980077649 A CN 201980077649A CN 113286817 A CN113286817 A CN 113286817A
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霍尔格·韦舍
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Abstract

本文提供了DLL3结合蛋白和靶向DLL3的多特异性蛋白(例如，DLL3靶向三特异性蛋白)，其包含与CD3结合的结构域、半衰期延长结构域和与DLL3结合的结构域(如本文提供的DLL3结合蛋白)。还提供了其药物组合物，以及用于制备这类DLL3结合蛋白、DLL3靶向三特异性蛋白的核酸、重组表达载体和宿主细胞。还公开了使用所公开的DLL3结合蛋白、DLL3靶向三特异性蛋白预防和/或治疗疾病、病况和病症的方法。

Description

DLL3结合蛋白及使用方法
交叉引用
本申请要求2018年9月25日提交的第62/736,368号美国临时申请、2018年9月25日提交的第62/736,358号美国临时申请和2019年7月22日提交的第62/877,227号美国临时申请的权益，所述临时申请中的每一个均通过引用整体并入本文。
序列表
本申请含有序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交，并且通过引用整体并入本文。创建于2019年9月25日的所述ASCII副本被命名为47517-733_601_SL.txt，大小为951,519个字节。
背景技术
在多种临床环境中常常需要选择性破坏单个细胞或特定的细胞类型。例如，癌症疗法的首要目标是特定地破坏肿瘤细胞，同时使健康细胞和组织保持完整且不受损伤。一种这样的方法是诱导针对肿瘤的免疫应答，使得免疫效应细胞如自然杀伤(NK)细胞或细胞毒性T淋巴细胞(CTL)攻击并破坏肿瘤细胞。
发明内容
仍然需要用于治疗与DLL3过表达有关的肿瘤性疾病如神经内分泌肿瘤的其他可用选择。在某些实施方案中，本公开提供了与肿瘤靶细胞表面上的DLL3特异性结合的单结构域蛋白和多特异性蛋白，如本文所述的含有DLL3结合域的三特异性蛋白。在一些实施方案中，本公开提供了如上所述的δ样配体3(DLL3)结合蛋白或多特异性蛋白，其可以用于诊断和治疗与DLL3的表达相关的适应症。
一个实施方案提供了一种DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述蛋白包含(a)第一结构域(A)，其为能与人CD3特异性结合的单链可变片段；(b)第二结构域(B)，其为能与人血清白蛋白特异性结合的单结构域抗体；和(c)第三结构域(C)，其为能与DLL3蛋白特异性结合的单结构域抗体。
在一些实施方案中，所述结构域以H2N-(A)-(B)-(C)-COOH、H2N-(A)-(C)-(B)-COOH、H2N-(B)-(A)-(C)-COOH、H2N-(B)-(C)-(A)-COOH、H2N-(C)-(B)-(A)-COOH或H2N-(C)-(A)-(B)-COOH的顺序连接，或通过连接体L1和L2，以H2N-(A)-L1-(B)-L2-(C)-COOH、H2N-(A)-L1-(C)-L2-(B)-COOH、H2N-(B)-L1-(A)-L2-(C)-COOH、H2N-(B)-L1-(C)-L2-(A)-COOH、H2N-(C)-L1-(B)-L2-(A)-COOH或H2N-(C)-L1-(A)-L2-(B)-COOH的顺序连接。
在一些实施方案中，所述第三结构域(C)包含亲和力成熟的结合分子。在一些实施方案中，所述亲和力成熟的结合分子衍生自与所述DLL3蛋白特异性结合的亲本分子。在一些实施方案中，其中所述亲和力成熟的DLL3结合分子对所述DLL3蛋白的结合亲和力是所述亲本分子对所述DLL3蛋白的结合亲和力的约2倍至约50倍。在一些实施方案中，所述第三结构域(C)包含与选自SEQ ID No.1-442和1886的序列至少80％相同的序列。在一些实施方案中，所述第三结构域(C)包含与选自SEQ ID No.1-52的序列至少80％相同的序列。在一些实施方案中，所述第三结构域(C)包含CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR1包含选自SEQ IDNo.443-884和1887的序列，其中所述CDR2包含选自SEQ ID No.885-1326和1888的序列，并且其中所述CDR3包含选自SEQ ID No.1327-1768和1889的序列。在一些实施方案中，所述CDR1包含选自SEQ ID No.495-528的序列。在一些实施方案中，所述CDR2包含选自SEQ IDNo.937-970的序列。在一些实施方案中，所述CDR3包含选自SEQ ID No.1379-1412的序列。在一些实施方案中，所述第三结构域(C)包含与选自SEQ ID No.53-86的序列至少80％相同的序列。在一些实施方案中，所述CDR1包含选自SEQ ID No.529-809的序列。在一些实施方案中，所述CDR2包含选自SEQ ID No.971-1251的序列。在一些实施方案中，所述CDR3包含选自SEQ ID No.1379-1412的序列。在一些实施方案中，所述第三结构域(C)包含与选自SEQID No.87-367的序列至少80％相同的序列。在一些实施方案中，所述CDR1包含选自SEQ IDNo.810-884的序列。在一些实施方案中，所述CDR2包含选自SEQ ID No.1252-1326的序列。在一些实施方案中，所述CDR3包含选自SEQ ID No.1692-1768的序列。在一些实施方案中，根据权利要求1所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述第三结构域(C)包含与选自SEQ IDNo.368-442的序列至少80％相同的序列。
一个实施方案提供了一种DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述蛋白包含(a)第一结构域(A)，其为能与人CD3特异性结合的单链可变片段；(b)第二结构域(B)，其为能与人血清白蛋白特异性结合的单结构域抗体；和(c)第三结构域(C)，其为能与DLL3特异性结合的单结构域抗体，其中所述第三结构域包含SEQ ID No.68或SEQ ID No.75的序列，或衍生自SEQID No.68或SEQ ID No.75。
在一些实施方案中，所述第三结构域(C)衍生自SEQ ID No.75。在一些实施方案中，所述第三结构域包含CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR1包含以下序列：X1X2X3X4X5X6X7SX8A，所述CDR2包含以下序列：GJ1SJ2J3GJ4J5J6YJ7J8SVKG(SEQ ID No.1894)，并且所述CDR3包含以下序列：Z1Z2Z3Z4Z5Z6Z7Z8Z9。
在一些实施方案中：
X1为A、D、E、F、G、H、K、L、M、N、Q、R、S、V、W或Y；
X2为D、E、H、K、M、P、R、S、T或Y；
X3为A、D、G、H、K、N、P、Q、R、S、T、V或Y；
X4为K、S或V；
X5为A、F、G、H、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；
X6为D、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、V或Y；
X7为L或M；且
X8为I、L、M、S、T或V。
在一些实施方案中：
J1为I或V；
J2为A、D、E、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V或Y；
J3为A、D、E、G、H、N、R或T；
J4为H、P、R或S；
J5为A、H、I、K、M、N、Q、R、T或V；
J6为A、D、G、H、I、L、M、N、S、T、V或Y；
J7为A、F、I、L、M、R、S、T、V或Y；
J8为A、D、E、G、H、K、L、N、R、S或V；
在一些实施方案中：
Z1为L或Y；
Z2为D、E、G、H、K、N、Q、R、S、T、V或Y；
Z3为Q或W；
Z4为A、D、E、G、H、I、K、L、M、P、R、S、T或V；
Z5为A、D、E、G、N、R、S、T或Y；
Z6为A、P、R或S；
Z7为A、D、F、G、H、L、M、N、Q、R、S、T、V或Y；
Z8为A、G、I、K、P、Q、R、S或T；且
Z9为F、H或Y。
在一些实施方案中，连接体L1和L2各自独立地选自(GS)n(SEQ ID No.1809)、(GGS)n(SEQ ID No.1810)、(GGGS)n(SEQ ID No.1811)、(GGSG)n(SEQ ID No.1812)、(GGSGG)n(SEQ ID No.1813)或(GGGGS)n(SEQ ID No.1814)，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或GGGGSGGGS(SEQ ID No.1808)。在一些实施方案中，所述结构域以H2N-(A)-(B)-(C)-COOH的顺序或通过连接体L1和L2以H2N-(A)-L1-(B)-L2-(C)-COOH的顺序连接。
一个实施方案提供了一种DLL3结合蛋白，其包含下式：
f1-r1-f2-r2-f3-r3-f4
其中，r1是互补决定区1(CDR1)，并且与选自SEQ ID No.443-884和1887的序列相同或相对于该序列包含一个或多个氨基酸残基置换；r2是CDR2，并且与选自SEQ IDNo.885-1326和1888的序列相同或相对于该序列包含一个或多个氨基酸残基置换；且r3是CDR3，并且与选自SEQ ID No.1327-1768和1889的序列相同或相对于该序列包含一个或多个氨基酸残基置换；并且其中f1、f2、f3和f4是框架残基。
一个实施方案提供了一种治疗或改善增生性疾病或肿瘤性疾病的方法，其包括向有需要的受试者施用根据本公开的DLL3靶向三特异性蛋白。
在个实施方案提供了一种DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述蛋白包含(a)能与人CD3特异性结合的第一结构域(A)；(b)第二结构域(B)，其为半衰期延长结构域；和(c)能与DLL3蛋白特异性结合的第三结构域(C)。在一些实施方案中，所述结构域以H2N-(A)-(B)-(C)-COOH、H2N-(A)-(C)-(B)-COOH、H2N-(B)-(A)-(C)-COOH、H2N-(B)-(C)-(A)-COOH、H2N-(C)-(B)-(A)-COOH或H2N-(C)-(A)-(B)-COOH的顺序连接。在一些实施方案中，所述第三结构域(C)包含亲和力成熟的结合分子。在一些实施方案中，所述亲和力成熟的结合分子衍生自与所述DLL3蛋白特异性结合的亲本分子。在一些实施方案中，所述亲和力成熟的结合分子在亲和力成熟轮次后衍生自与DLL3特异性结合的亲本分子。在一些实施方案中，所述亲和力成熟轮次包括针对所述DLL3蛋白淘选噬菌体展示文库。在一些实施方案中，所述噬菌体展示文库是通过使所述亲本分子的一个或多个残基突变而生成的。在一些实施方案中，所述噬菌体展示文库表达衍生自所述亲本分子的一种或多种分子。在一些实施方案中，所述亲和力成熟的结合分子选自衍生自所述亲本分子的一种或多种分子。在一些实施方案中，所述亲和力成熟的DLL3结合分子对所述DLL3蛋白的结合亲和力大于所述亲本分子对所述DLL3蛋白的结合亲和力。在一些实施方案中，所述亲和力成熟的DLL3结合分子对所述DLL3蛋白的结合亲和力是所述亲本分子对所述DLL3蛋白的结合亲和力的约2倍至约50倍。在一些实施方案中，所述亲和力成熟的DLL3结合分子对所述DLL3蛋白的结合亲和力是所述亲本分子对所述DLL3蛋白的结合亲和力的约3倍。在一些实施方案中，所述第三结构域(C)包含与选自SEQ ID No.1-442和1886的序列至少约75％相同的序列。在一些实施方案中，所述第三结构域(C)包含与选自SEQ ID No.1-52的序列至少约75％相同的序列。在一些实施方案中，所述第三结构域(C)包含CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，所述CDR1包含选自SEQ ID No.443-884和1887的序列，或相对于选自SEQ ID No.443-884和1887的序列的一个或多个氨基酸置换。在一些实施方案中，所述CDR2包含选自SEQ ID No.885-1326和1888的序列，或相对于选自SEQ ID No.885-1326和1888的序列的一个或多个氨基酸置换。在一些实施方案中，所述CDR3包含选自SEQ IDNo.1327-1768和1889的序列，或相对于选自SEQ ID No.1327-1768和1889的序列的一个或多个置换。在一些实施方案中，所述CDR1包含选自SEQ ID No.495-528的序列，或相对于选自SEQ ID No.495-528的序列的一个或多个氨基酸置换。在一些实施方案中，所述CDR2包含选自SEQ ID No.937-970的序列，或相对于选自SEQ ID No.937-970的序列的一个或多个氨基酸置换。在一些实施方案中，所述CDR3包含选自SEQ ID No.1379-1412的序列，或相对于选自SEQ ID No.1379-1412的序列的一个或多个氨基酸置换。
在一些实施方案中，所述第三结构域(C)包含与选自SEQ ID No.53-86的序列至少约80％相同的序列。在一些实施方案中，所述CDR1包含选自SEQ ID No.529-809的序列，或相对于选自SEQ ID No.529-809的序列的或多个氨基酸置换。在一些实施方案中，所述CDR2包含的序列具有相对于选自SEQ ID No.971-1251的序列的一个或多个氨基酸置换。在一些实施方案中，所述CDR3包含选自SEQ ID No.1379-1412的序列，或相对于选自SEQ IDNo.1379-1412的序列的一个或多个氨基酸置换。在一些实施方案中，所述第三结构域(C)包含与选自SEQ ID No.87-367的序列至少约75％相同的序列。在一些实施方案中，所述CDR1包含选自SEQ ID No.810-884的序列，或相对于选自SEQ ID No.810-884的序列的一个或多个氨基酸置换。在一些实施方案中，所述CDR2包含选自SEQ ID No.1252-1326的序列，或相对于选自SEQ ID No.1252-1326的序列的一个或多个氨基酸置换。在一些实施方案中，所述CDR3包含选自SEQ ID No.1692-1768的序列，或相对于选自SEQ ID No.1692-1768的序列的一个或多个氨基酸置换。在一些实施方案中，所述第三结构域(C)包含与选自SEQ IDNo.368-442的序列至少约75％相同的序列。
在个实施方案提供了一种DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述蛋白包含(a)能与人CD3特异性结合的第一结构域(A)；(b)第二结构域(B)，其为半衰期延长结构域；和(c)能与DLL3特异性结合的第三结构域(C)，其中所述第三结构域包含SEQ ID No.68的序列或衍生自SEQ ID No.68。在一些实施方案中，所述第三结构域(C)衍生自SEQ ID No.68。在一些实施方案中，SEQ ID No.68包含CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述CDR1包含以下序列：GX1X2X3X4X5NX6X7X8。在一些实施方案中，所述CDR2包含以下序列：GJ1SJ2J3J4J5J6J7J8J9J10SJ11KJ12(SEQ ID No.1895)。
在一些实施方案中，所述CDR3包含以下序列：
Z1Z2Z3Z4Z5Z6Z7Z8Z9Z10Z11。在一些实施方案中：
X1为A、E、F、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、V或Y；
X2为A、G、I、K、P、R、S、T或V；
X3为A、D、F、K、L、N、P、Q、R、S、T或Y；
X4为A、D、F、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V或Y；
X5为F、I、K、L、M、N、R、S、T或V；
X6为A或G；
X7为F、I、L、M、T、V或Y；且
X8为A或G。
在一些实施方案中：
J1为I或V；
J2为A、K、P、R或S；
J3为D或N；
J4为D、E、G、K、N、Q、R、S、T或Y；
J5为S或T；
J6为A、E、F、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V或Y；
J7为A、I、L、M、V或Y；
J8为D、F、H、I、L、N、S、T、V或Y；
J9为A、D、E、F、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、V或Y；
J10为A、D、E、G、K、Q、S或V；
J11为A或V；且
J12为G或V。
在一些实施方案中：
Z1为F或Y；
Z2为G、H、I、K、N、R、S或T；
Z3为A、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T或Y；
Z4为A、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V或Y；
Z5为A、C、D、E、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、W或Y；
Z6为G、K、L、R或T；
Z7为A、G、H、L、Q、R、S、T、V或Y；
Z8为A、D、E、G、H、P、Q、S、T、W或Y；
Z9为A、G、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V或Y；
Z10为A、G、K、P、R、S、T或V；且
Z11为A、F、S或Y。
在个实施方案提供了一种DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述蛋白包含(a)能与人CD3特异性结合的第一结构域(A)；(b)第二结构域(B)，其为半衰期延长结构域；和(c)能与DLL3特异性结合的第三结构域(C)，其中所述第三结构域包含SEQ ID No.75的序列或衍生自SEQ ID No.75。在一些实施方案中，SEQ ID No.75包含CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR1包含以下序列：
X1X2X3X4X5X6X7SX8A，所述CDR2包含以下序列：
GJ1SJ2J3GJ4J5J6YJ7J8SVKG(SEQ ID No.1894)，并且所述CDR3包含以下序列：Z1Z2Z3Z4Z5Z6Z7Z8Z9。
在一些实施方案中：
X1为A、D、E、F、G、H、K、L、M、N、Q、R、S、V、W或Y；
X2为D、E、H、K、M、P、R、S、T或Y；
X3为A、D、G、H、K、N、P、Q、R、S、T、V或Y；
X4为K、S或V；
X5为A、F、G、H、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；
X6为D、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、V或Y；
X7为L或M；且
X8为I、L、M、S、T或V。
在一些实施方案中：
J1为I或V；
J2为A、D、E、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V或Y；
J3为A、D、E、G、H、N、R或T；
J4为H、P、R或S；
J5为A、H、I、K、M、N、Q、R、T或V；
J6为A、D、G、H、I、L、M、N、S、T、V或Y；
J7为A、F、I、L、M、R、S、T、V或Y；
J8为A、D、E、G、H、K、L、N、R、S或V；
在一些实施方案中：
Z1为L或Y；
Z2为D、E、G、H、K、N、Q、R、S、T、V或Y；
Z3为Q或W；
Z4为A、D、E、G、H、I、K、L、M、P、R、S、T或V；
Z5为A、D、E、G、N、R、S、T或Y；
Z6为A、P、R或S；
Z7为A、D、F、G、H、L、M、N、Q、R、S、T、V或Y；
Z8为A、G、I、K、P、Q、R、S或T；且
Z9为F、H或Y。
在一些实施方案中，所述第三结构域(C)包含人源化抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述第三结构域(C)包含与DLL3特异性结合的单结构域抗体、VHH结构域、scFv、VH结构域、VL结构域、Fab、Fab’、非Ig结构域、配体、knottin或小分子实体。在一些实施方案中，第三结构域(C)包含所述单结构域抗体。在一些实施方案中，所述第二结构域(B)结合大体积血清蛋白。在一些实施方案中，所述第二结构域(B)包含与所述大体积血清蛋白特异性结合的单结构域抗体、VHH结构域、scFv、VH结构域、VL结构域、Fab、Fab’、非Ig结构域、配体、knottin或小分子实体。在一些实施方案中，所述第二结构域(B)包含与所述大体积血清蛋白特异性结合的单结构域抗体。在一些实施方案中，所述大体积血清蛋白包括白蛋白、转铁蛋白、IgG1、IgG2、IgG4、IgG3、IgA单体、因子XIII、纤维蛋白原、IgE、五聚体IgM或无Igκ的轻链。在一些实施方案中，所述大体积血清蛋白包括白蛋白。在一些实施方案中，所述第二结构域(B)包含与选自SEQ ID No.1769-1778的序列至少约75％相同的序列。在一些实施方案中，所述第二结构域(B)包含与SEQ ID No.1774至少约75％相同的序列。
在一些实施方案中，所述第一结构域(A)包含与CD3特异性结合的单结构域抗体、VHH结构域、scFv、VH结构域、VL结构域、Fab、Fab’、非Ig结构域、配体、knottin或小分子实体。在一些实施方案中，所述第一结构域(A)包含选自SEQ ID No.1793-1807的序列。在一些实施方案中，所述所述第三结构域(C)包含下式：
f1-r1-f2-r2-f3-r3-f4
其中，r1与选自SEQ ID No.443-884和1887的序列相同或相对于该序列包含一个或多个氨基酸残基置换；r2与选自SEQ ID No.885-1326和1888的序列相同或相对于该序列包含一个或多个氨基酸残基置换；且r3与选自SEQ ID No.1327-1768和1889的序列相同或相对于该序列包含一个或多个氨基酸残基置换；并且其中f1、f2、f3和f4是框架残基。在一些实施方案中，所述第三结构域(C)包含与选自SEQ ID No.1-442和1886的序列至少75％相同的序列。在一些实施方案中，结构域C和B通过连接体L1连接，并且结构域B和A通过连接体L2连接。在一些实施方案中，连接体L1和L2各自独立地选自(GS)n(SEQ ID No.1809)、(GGS)n(SEQ ID No.1810)、(GGGS)n(SEQ ID No.1811)、(GGSG)n(SEQ ID No.1812)、(GGSGG)n(SEQID No.1813)或(GGGGS)n(SEQ ID No.1814)，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施方案中，连接体L1和L2各自独立地为(GGGGS)4(SEQ ID No.1817)或(GGGGS)3(SEQ IDNo.1818)。在一些实施方案中，所述蛋白以约0.1nM至约50nM的结合亲和力(Kd)与DLL3结合。在一些实施方案中，所述蛋白与人DLL3、食蟹猴DLL3或人和食蟹猴DLL3两者结合。在一些实施方案中，所述蛋白小于约80kDa。在一些实施方案中，所述蛋白为约50kDa至约75kDa。在一些实施方案中，所述蛋白小于约60kDa。在一些实施方案中，所述蛋白的消除半衰期为至少约50小时。在一些实施方案中，所述蛋白的消除半衰期为至少约100小时。在一些实施方案中，与IgG相比，所述蛋白对同一DLL3具有增加的组织穿透。在一些实施方案中，所述结构域以H2N-(A)-(B)-(C)-COOH的顺序连接。
一个实施方案提供了一种药物组合物，其包含(i)根据上述实施方案中任一项所述的DLL3靶向三特异性蛋白或根据本公开的DLL3结合蛋白，和(ii)药学上可接受的载体。一个实施方案提供了一种制备根据上述实施方案中任一项所述的DLL3靶向三特异性结合蛋白的方法，该方法包括：i)提供DLL3蛋白或其片段；ii)将DLL3结合蛋白的重组文库暴露于所述DLL3蛋白或其片段；iii)从所述文库中选择与所述寡聚物或其衍生物特异性结合的DLL3结合蛋白；以及(iv)使用步骤(iii)中鉴定的DLL3结合蛋白制备DLL3靶向三特异性蛋白。在一些实施方案中，通过用所述DLL3蛋白筛查所述重组文库，将DLL3结合蛋白的所述重组文库在体外暴露于所述DLL3蛋白。在一些实施方案中，所述重组文库在噬菌体的表面上表达。在一些实施方案中，所述重组文库在酵母细胞的表面上表达。在一些实施方案中，所述重组文库在细菌细胞的表面上表达。在一些实施方案中，所述重组文库被表达为RNA-蛋白质融合体。在一些实施方案中，所述重组文库是scFv文库或Fab文库。在一些实施方案中，所述重组抗体文库是单结构域文库。
一个实施方案提供了一种产生根据上述实施方案中任一项所述的DLL3靶向三特异性蛋白的方法，所述方法包括在允许表达DLL3靶向三特异性蛋白的条件下培养用载体转化或转染的宿主，该载体包含编码根据上述实施方案中任一项所述的DLL3三特异性蛋白的核酸序列，以及从培养物中回收并纯化所产生的蛋白。
一个实施方案提供了一种DLL3结合蛋白，其包含下式：
f1-r1-f2-r2-f3-r3-f4
其中，r1是互补决定区1(CDR1)，并且与选自SEQ ID No.443-884和1887的序列相同或相对于该序列包含一个或多个氨基酸残基置换；r2是CDR2，并且与选自SEQ IDNo.885-1326和1888的序列相同或相对于该序列包含一个或多个氨基酸残基置换；且r3是CDR3，并且与选自SEQ ID No.1327-1768和1889的序列相同或相对于该序列包含一个或多个氨基酸残基置换；并且其中f1、f2、f3和f4是框架残基。在一些实施方案中，所述DLL3结合蛋白包含与选自SEQ ID No.1-442和1886的序列至少约75％相同的序列。在一些实施方案中，所述DLL3结合蛋白包含与选自SEQ ID No.1-52的序列至少约75％相同的序列。在一些实施方案中，所述DLL3结合蛋白包含与选自SEQ ID No.53-86的序列至少约75％相同的序列。在一些实施方案中，所述DLL3结合蛋白包含与选自SEQ ID No.87-367的序列至少约75％相同的序列。在一些实施方案中，所述DLL3结合蛋白包含与选自SEQ ID No.368-442的序列至少约75％相同的序列。一个实施方案提供了一种DLL3结合蛋白，其衍生自包含SEQID No.68的序列的亲本DLL3结合蛋白。一个实施方案提供了一种DLL3结合蛋白，其衍生自包含SEQ ID No.75的序列的亲本DLL3结合蛋白，或者包含SEQ ID No.75的序列。
一个实施方案提供了一种制备根据本公开的DLL3结合蛋白的方法，该方法包括：i)提供DLL3蛋白或其片段；ii)将DLL3结合蛋白的重组文库暴露于所述DLL3蛋白或其片段；iii)从所述文库中选择与所述寡聚物或其衍生物特异性结合的DLL3结合蛋白。在一些实施方案中，通过用所述DLL3蛋白筛查所述重组文库，将DLL3结合蛋白的所述重组文库在体外暴露于所述DLL3蛋白。在一些实施方案中，所述重组文库在噬菌体的表面上表达。在一些实施方案中，所述重组文库在酵母细胞的表面上表达。在一些实施方案中，所述重组文库在细菌细胞的表面上表达。在一些实施方案中，所述重组文库被表达为RNA-蛋白质融合体。在一些实施方案中，所述重组文库是scFv文库或Fab文库。在一些实施方案中，所述重组抗体文库是单结构域文库。
一个实施方案提供了一种产生根据本公开的DLL3结合蛋白的方法，所述方法包括在允许表达DLL3结合蛋白的条件下培养用载体转化或转染的宿主，该载体包含编码根据本公开的DLL3结合蛋白的核酸序列，以及从培养物中回收并纯化所产生的蛋白。
一个实施方案提供了一种治疗或改善增生性疾病或肿瘤性疾病的方法，其包括向有需要的受试者施用根据上述实施方案中任一项所述的DLL3靶向三特异性蛋白，根据本公开的DLL3结合蛋白，或本文提供的药物组合物。在一些实施方案中，所述受试者是人。在一些实施方案中，所述方法进一步包括与根据上述实施方案的DLL3靶向三特异性蛋白、根据本公开的DLL3结合蛋白或本文提供的药物组合物联合施用药剂。在一些实施方案中，所述DLL3靶向三特异性蛋白或DLL3结合蛋白选择性地结合表达DLL3的肿瘤细胞。在一些实施方案中，所述DLL3靶向三特异性蛋白介导T细胞对表达DLL3的肿瘤细胞的杀伤。在一些实施方案中，所述肿瘤性疾病包括实体瘤疾病。在一些实施方案中，所述实体瘤疾病包括肺癌、胃癌、卵巢癌或三阴性乳腺癌。在一些实施方案中，所述实体瘤疾病是转移性的。
一个实施方案提供了一种治疗或改善增生性疾病或肿瘤性疾病的方法，其包括施用包含含有选自SEQ ID No.1-442和1886的序列的DLL3结合域的DLL3靶向三特异性蛋白，或包含选自SEQ ID No.1-442和1886的序列的DLL3结合蛋白。在一些实施方案中，所述DLL3靶向三特异性蛋白或DLL3结合蛋白选择性地结合表达DLL3的肿瘤细胞。在一些实施方案中，所述DLL3靶向三特异性蛋白引导T细胞对表达DLL3的肿瘤细胞的杀伤。在一些实施方案中，所述肿瘤性疾病包括实体瘤疾病。在一些实施方案中，所述实体瘤疾病包括肺癌、胃癌、卵巢癌或三阴性乳腺癌。在一些实施方案中，所述实体瘤疾病是转移性的。
一个实施方案提供了一种治疗或改善增生性疾病或肿瘤性疾病的方法，其包括施用包含SEQ ID No.68或75所示序列的DLL3结合域，或包含SEQ ID No.68或75所示序列的DLL3结合蛋白。在一些实施方案中，所述DLL3靶向三特异性蛋白或DLL3结合蛋白的剂量为至多10mg/kg。在一些实施方案中，所述蛋白每周施用至少一次。在一些实施方案中，所述蛋白每周施用两次。在一些实施方案中，所述蛋白每隔一周施用一次。在一些实施方案中，所述蛋白每三周施用一次。
在一个实施方案中提供了一种DLL3结合蛋白，其包含SEQ ID No.1890或SEQ IDNo.1891所示的氨基酸序列。
一个实施方案提供了一种DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述蛋白包含(a)第一结构域(A)，其为能与人CD3特异性结合的单链可变片段；(b)第二结构域(B)，其为能与人血清白蛋白特异性结合的单结构域抗体；和(c)第三结构域(C)，其为能与DLL3蛋白特异性结合的单结构域抗体，其中所述第三结构域(C)包含与选自SEQ ID No.1-442和1886的序列至少80％相同的序列。
在一些实施方案中，所述结构域以H2N-(A)-(B)-(C)-COOH、H2N-(A)-(C)-(B)-COOH、H2N-(B)-(A)-(C)-COOH、H2N-(B)-(C)-(A)-COOH、H2N-(C)-(B)-(A)-COOH或H2N-(C)-(A)-(B)-COOH的顺序连接，或通过连接体L1和L2，以H2N-(A)-L1-(B)-L2-(C)-COOH、H2N-(A)-L1-(C)-L2-(B)-COOH、H2N-(B)-L1-(A)-L2-(C)-COOH、H2N-(B)-L1-(C)-L2-(A)-COOH、H2N-(C)-L1-(B)-L2-(A)-COOH或H2N-(C)-L1-(A)-L2-(B)-COOH的顺序连接。
在一些实施方案中，所述第三结构域(C)是亲和力成熟的结合分子，其衍生自与所述DLL3蛋白特异性结合的亲本分子。在一些实施方案中，所述亲和力成熟的DLL3结合分子对所述DLL3蛋白的结合亲和力是所述亲本分子对所述DLL3蛋白的结合亲和力的约2倍至约50倍。
在一些实施方案中，所述第三结构域(C)包含选自SEQ ID No.1-442和1886的序列。在一些实施方案中，所述第三结构域(C)包含选自SEQ ID No.1-52的序列。在一些实施方案中，所述第三结构域(C)包含CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR1包含选自SEQ IDNo.443-884和1887的序列，其中所述CDR2包含选自SEQ ID No.885-1326和1888的序列，并且其中所述CDR3包含选自SEQ ID No.1327-1768和1889的序列。在一些实施方案中，所述CDR1包含选自SEQ ID No.495-528的序列。在一些实施方案中，所述CDR2包含选自SEQ IDNo.937-970的序列。在一些实施方案中，所述CDR3包含选自SEQ ID No.1379-1412的序列。在一些实施方案中，所述第三结构域(C)包含选自SEQ ID No.53-86的序列。
在一些实施方案中，所述第三结构域(C)包含CDR1、CDR2和CDR3，并且其中所述CDR1包含选自SEQ ID No.529-809的序列。在一些实施方案中，所述CDR2包含选自SEQ IDNo.971-1251的序列。在一些实施方案中，所述CDR3包含选自SEQ ID No.1379-1412的序列。在一些实施方案中，所述第三结构域(C)包含选自SEQ ID No.87-367的序列。在一些实施方案中，所述第三结构域(C)包含CDR1、CDR2和CDR3，并且其中所述CDR1包含选自SEQ IDNo.810-884的序列。在一些实施方案中，所述CDR2包含选自SEQ ID No.1252-1326的序列。在一些实施方案中，所述CDR3包含选自SEQ ID No.1692-1768的序列。在一些实施方案中，所述第三结构域(C)包含选自SEQ ID No.368-442的序列。在一些实施方案中，所述第一结构域(A)包含选自SEQ ID No.1793-1807和1897-1898的序列。
在一些实施方案中，所述第二结构域(B)包含选自SEQ ID No.1769-1778的序列。在一些实施方案中，连接体L1和L2各自独立地选自(GS)n(SEQ ID No.1809)、(GGS)n(SEQ IDNo.1810)、(GGGS)n(SEQ ID No.1811)、(GGSG)n(SEQ ID No.1812)、(GGSGG)n(SEQ IDNo.1813)或(GGGGS)n(SEQ ID No.1814)，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施方案中，所述结构域以H2N-(A)-(B)-(C)-COOH的顺序或通过连接体L1和L2以H2N-(A)-L1-(B)-L2-(C)-COOH的顺序连接。在一些实施方案中，连接体L1和L2独立地包含GGGGSGGGS(SEQ ID No.1808)的序列。在一些实施方案中，所述DLL3靶向三特异性蛋白包含SEQ IDNo.1890或SEQ ID No.1891的序列。
一个实施方案提供了一种DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述蛋白包含(a)第一结构域(A)，其为能与人CD3特异性结合的单链可变片段；(b)第二结构域(B)，其为能与人血清白蛋白特异性结合的单结构域抗体；和(c)第三结构域(C)，其为能与DLL3特异性结合的单结构域抗体，其中所述第三结构域包含SEQ ID No.68或SEQ ID No.75的序列，或衍生自SEQID No.68或SEQ ID No.75。在一些实施方案中，所述第三结构域(C)衍生自SEQ ID No.68或SEQ ID No.75。在一些实施方案中，所述第三结构域(C)包含SEQ ID No.68的序列或SEQ IDNo.75的序列。
一个实施方案提供了一种DLL3结合蛋白，其包含下式：
f1-r1-f2-r2-f3-r3-f4
其中，r1是互补决定区1(CDR1)，并且与选自SEQ ID No.443-884和1887的序列相同或相对于该序列包含一个或多个氨基酸残基置换；r2是CDR2，并且与选自SEQ IDNo.885-1326和1888的序列相同或相对于该序列包含一个或多个氨基酸残基置换；且r3是CDR3，并且与选自SEQ ID No.1327-1768和1889的序列相同或相对于该序列包含一个或多个氨基酸残基置换；并且其中f1、f2、f3和f4是框架残基。在一些实施方案中，所述CDR1包含选自SEQ ID No.443-884和1887的序列，所述CDR2包含选自SEQ ID No.885-1326和1888的序列，并且所述CDR3包含选自SEQ ID No.1327-1768和1889的序列。
一个实施方案提供了一种DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述蛋白包含(a)第一结构域(A)，其为能与人CD3特异性结合的单链可变片段；(b)第二结构域(B)，其为能与人血清白蛋白特异性结合的单结构域抗体；和(c)第三结构域(C)，其为能与DLL3蛋白特异性结合的单结构域抗体，其中所述第三结构域(C)包含具有SEQ ID No.874的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID No.1316的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID No.1758的氨基酸序列的CDR3。
一个实施方案提供了一种DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述蛋白包含(a)第一结构域(A)，其为能与人CD3特异性结合的单链可变片段；(b)第二结构域(B)，其为能与人血清白蛋白特异性结合的单结构域抗体；和(c)第三结构域(C)，其为能与DLL3特异性结合的单结构域抗体，其中所述第三结构域包含具有选自SEQ ID No.851、867、871、872、873、874和1887的氨基酸序列的CDR1；具有选自SEQ ID No.1293、1309、1313、1314、1315、1316和1888的氨基酸序列的CDR2；和具有选自SEQ ID No.1735、1751、1755、1756、1757、1758和1889的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述第三结构域(C)包含与选自SEQ ID No.408、425、432、430、431和1886的序列至少80％相同的序列。在一些实施方案中，所述第三结构域(C)包含选自SEQ ID No.408、425、432、430、431和1886的序列。
在一些实施方案中，所述结构域以H2N-(A)-(B)-(C)-COOH、H2N-(A)-(C)-(B)-COOH、H2N-(B)-(A)-(C)-COOH、H2N-(B)-(C)-(A)-COOH、H2N-(C)-(B)-(A)-COOH或H2N-(C)-(A)-(B)-COOH的顺序连接，或通过连接体L1和L2，以H2N-(A)-L1-(B)-L2-(C)-COOH、H2N-(A)-L1-(C)-L2-(B)-COOH、H2N-(B)-L1-(A)-L2-(C)-COOH、H2N-(B)-L1-(C)-L2-(A)-COOH、H2N-(C)-L1-(B)-L2-(A)-COOH或H2N-(C)-L1-(A)-L2-(B)-COOH的顺序连接。
在一些实施方案中，所述结构域以H2N-(A)-(B)-(C)-COOH的顺序或通过连接体L1和L2以H2N-(A)-L1-(B)-L2-(C)-COOH的顺序连接。在一些实施方案中，所述结构域以H2N-(C)-(B)-(A)-COOH的顺序或通过连接体L1和L2以H2N-(C)-L1-(B)-L2-(A)-COOH的顺序连接。在一些实施方案中，所述第三结构域(C)是亲和力成熟的结合分子，其衍生自与所述DLL3蛋白特异性结合的亲本分子。
在一些实施方案中，所述亲和力成熟的DLL3结合分子对所述DLL3蛋白的结合亲和力是所述亲本分子对所述DLL3蛋白的结合亲和力的约2倍至约50倍。在一些实施方案中，所述亲本分子包含SEQ ID No.68或SEQ ID No.75的氨基酸序列。
在一些实施方案中，连接体L1和L2各自独立地选自(GS)n(SEQ ID No.1809)、(GGS)n(SEQ ID No.1810)、(GGGS)n(SEQ ID No.1811)、(GGSG)n(SEQ ID No.1812)、(GGSGG)n(SEQ ID No.1813)或(GGGGS)n(SEQ ID No.1814)，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施方案中，连接体L1和L2独立地包含GGGGSGGGS(SEQ ID No.1808)的序列。
在一些实施方案中，所述第二结构域(B)包含选自SEQ ID No.1769-1778的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述第一结构域(A)包含选自SEQ ID No.1793-1802和1897-1898的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述DLL3靶向三特异性蛋白包含SEQ ID No.1890或SEQID No.1891的序列。在一些实施方案中，所述第三结构域(C)与包含SEQ ID No.1893的序列的人DLL3蛋白结合。
一个实施方案提供了一种DLL3结合蛋白，其包含具有SEQ ID No.874的氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID No.1316的氨基酸序列的CDR2，和具有SEQ ID No.1758的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述DLL3结合蛋白包含与SEQ ID No.432的氨基酸序列至少80％相同的序列。
一个实施方案提供了一种DLL3结合蛋白，其包含具有选自SEQ ID No.851、867、871、872、873、874和1887的氨基酸序列的CDR1；具有选自SEQ ID No.1293、1309、1313、1314、1315、1316和1888的氨基酸序列的CDR2；和具有选自SEQ ID No.1和SEQ ID No.1735、1751、1755、1756、1757、1758和1889的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述DLL3结合蛋白包含与选自SEQ ID No.408、425、432、430、431和1886的序列至少80％相同的序列。
一个实施方案提供了一种治疗或改善疾病的方法，其包括施用有效量的根据上述实施方案中任一项的DLL3靶向三特异性蛋白。
援引并入
本说明书中所提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度犹如具体地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请均通过引用而并入。
附图说明
本发明的新颖特征在所附权利要求书中具体阐述。通过参考以下对利用本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述以及附图，将会对本发明的特征和优点获得更好的理解，在这些附图中：
图1示出了本公开的示例性DLL3靶向三特异性蛋白的各个结构域。
图2示出了使用包含本公开的DLL3结合域DH18、DH11、DH67和DH56的示例性DLL3靶向三特异性蛋白，对DMS-153细胞的T细胞依赖性细胞毒性(TDCC)测定的结果。
图3示出了使用包含本公开的示例性DLL3结合域DH2、DH43、DH10和DH6的示例性DLL3靶向三特异性蛋白，对DMS-153细胞的TDCC测定的结果。
图4示出了使用包含本公开的示例性DLL3结合域DH82、DH23、DH89和DH17的示例性DLL3靶向三特异性蛋白，对DMS-153细胞的TDCC测定的结果。
图5示出了使用包含本公开的示例性DLL3结合域DH83、DH12、DH61和DH29的示例性DLL3靶向三特异性蛋白，对DMS-153细胞的TDCC测定的结果。
图6示出了使用包含本公开的示例性DLL3结合域DH58和DH70的示例性DLL3靶向三特异性蛋白，以及对照三特异性蛋白，对DMS-153细胞的TDCC测定的结果。
图7示出了使用包含本公开的示例性DLL3靶向域1A011、2E05、1H012、2E02和1C03的示例性亲和力成熟的DLL3靶向三特异性蛋白，对DMS-153细胞的TDCC测定的结果。
图8示出了使用包含本公开的示例性DLL3靶向域2E010、2E01、2H02、2A04和2F11的示例性亲和力成熟的DLL3结合三特异性蛋白，对DMS-153细胞的TDCC测定的结果。
图9示出了使用包含本公开的示例性DLL3靶向域2E011、3C04、4H04、4H011和4D09的示例性亲和力成熟的DLL3结合三特异性蛋白，对DMS-153细胞的TDCC测定的结果。
图10示出了使用包含本公开的示例性DLL3靶向域4B07、4E02、4C06、3H011和3D07的示例性亲和力成熟的DLL3结合三特异性蛋白，对DMS-153细胞的TDCC测定的结果。
图11示出了使用包含本公开的示例性DLL3结合域3H06和4B011以及亲本DLL结合域DH43、DH6的示例性亲和力成熟的DLL3靶向三特异性蛋白，以及对照三特异性蛋白，对DMS-153细胞的TDCC测定的结果。
图12示出了使用包含本公开的示例性DLL3靶向域2E05-M106Y、2E05-M106Q、4D09-M34L和4H11-M34L的示例性纯化的、亲和力成熟的、CHO表达的DLL3结合三特异性蛋白，对DMS-153细胞的TDCC测定的结果。
图13示出了使用包含本公开的示例性DLL3结合域1A011(在图13上标记为1A11)、1H012(在图13上标记为1H12)、2E02和2E05的示例性纯化的、亲和力成熟的、CHO表达的DLL3靶向三特异性蛋白，对DMS-153细胞的TDCC测定的结果。
图14示出了使用包含本公开的示例性DLL3结合域2H02、3C04、4D09和4H11的示例性纯化的、亲和力成熟的、CHO表达的DLL3靶向三特异性蛋白，对DMS-153细胞的TDCC测定的结果。
图15示出了使用包含亲本示例性DLL3结合域DH43和DH6的示例性纯化的DLL3靶向三特异性蛋白，以及靶向GFP的对照三特异性蛋白，对DMS-153细胞的TDCC测定的结果。
图16示出了使用来自第二轮亲和力成熟的包含本公开的示例性DLL3结合域的示例性DLL3靶向三特异性蛋白，对DMS-153细胞的TDCC测定的结果。
图17示出了每个泳道加载2.4微克非还原蛋白质并用考马斯染色的10-20％TRIS甘氨酸SDS-PAGE的图像。泳道编号由凝胶图像顶部的数字示出，分子量标准的迁移由凝胶图像右侧的数字(千道尔顿)示出。凝胶加样：泳道1空，泳道2分子量标准，泳道3空，泳道4包含DLL3结合域51G2的抗DLL3三特异性蛋白，泳道5包含DLL3结合域51G10的抗DLL3三特异性蛋白，泳道6包含DLL3结合域51H5的抗DLL3三特异性蛋白，泳道7包含DLL3结合域51X5的抗DLL3三特异性蛋白，泳道8包含DLL3结合域52B1的抗DLL3三特异性蛋白，泳道9包含DLL3结合域52C4的抗DLL3三特异性蛋白，泳道10包含DLL3结合域52D4的抗DLL3三特异性蛋白，泳道11包含DLL3结合域51A2的抗DLL3三特异性蛋白，泳道12包含DLL3结合域51A5的抗DLL3三特异性蛋白，泳道13包含DLL3结合域51F3的抗DLL3三特异性蛋白，泳道14为空，泳道15空。
图18示出了使用包含本公开的示例性DLL3结合域51G2、51G10、51H5、51X5、52B1、52C4、52D4、51A2以及亲本DLL3结合域DH6的示例性纯化的、亲和力成熟的、CHO表达的DLL3靶向三特异性蛋白，以及对照三特异性蛋白，对DMS-53细胞的TDCC测定的结果。
图19示出了使用包含本公开的示例性DLL3结合域51G2、51G10、51H5、51X5、52B1、52C4、52D4、51A2以及亲本DLL3结合域DH6的本公开的示例性纯化的、亲和力成熟的、CHO表达的DLL3靶向三特异性蛋白，以及靶向GFP的对照结合三特异性蛋白，对DMS-153细胞的TDCC测定的结果。
图20提供了DLL3靶向三特异性蛋白的示意图，其以抗DLL3:抗ALB:抗CD3方向(TAC方向)包含本公开的示例性DLL3结合蛋白(DLL3结合物)、CD3结合域(抗CD3 epsilon scFv)和白蛋白结合(抗ALB)域。
图21提供了DLL3靶向三特异性蛋白的示意图，其以抗CD3:抗ALB:抗DLL3方向(CAT方向)包含本公开的示例性DLL3结合蛋白(DLL3结合物)、CD3结合域(抗CD3 epsilon scFv)和白蛋白结合(抗ALB)域。
图22示出了在人血清白蛋白(HSA)或牛血清白蛋白(BSA)的存在下测试的，使用以抗CD3:抗ALB:抗DLL3(CAT)构型或抗DLL3:抗ALB:抗CD3(TAC)构型包含本公开的DLL3结合域52D04的示例性DLL3三特异性蛋白，对NCI-H2171细胞的T细胞依赖性细胞毒性(TDCC)测定的结果。
图23示出了在存在或不存在人血清白蛋白(HSA)的情况下测试的，使用以抗CD3:抗ALB:抗DLL3(CAT)构型或抗DLL3:抗ALB:抗CD3(TAC)构型包含本公开的DLL3结合域52D04的示例性DLL3靶向三特异性蛋白，对DMS-79细胞的T细胞依赖性细胞毒性(TDCC)测定的结果。
图24示出了在人血清白蛋白(HSA)或牛血清白蛋白(BSA)的存在下测试的，使用以抗CD3:抗ALB:抗DLL3(CAT)构型或抗DLL3:抗ALB:抗CD3(TAC)构型包含本公开的DLL3结合域52D04的示例性DLL3三特异性蛋白，对SHP77细胞的T细胞依赖性细胞毒性(TDCC)测定的结果。
图25示出了在人血清白蛋白(HSA)或牛血清白蛋白(BSA)的存在下测试的，使用以抗CD3:抗ALB:抗DLL3(CAT)构型或抗DLL3:抗ALB:抗CD3(TAC)构型包含本公开的DLL3结合域52D04的示例性DLL3三特异性蛋白，对WM2664细胞的T细胞依赖性细胞毒性(TDCC)测定的结果。
图26描绘了与仅含第二抗体的对照或没有任何抗体或三特异性分子的细胞相比，以抗DLL3:抗ALB:抗CD3(TAC)构型包含本公开的DLL3结合域52D04的示例性DLL3靶向三特异性蛋白与来自四个不同供体的人T细胞的结合。
图27描绘了与仅含第二抗体的对照或没有任何抗体或三特异性分子的细胞相比，以抗CD3:抗ALB:抗DLL3(CAT)构型包含本公开的DLL3结合域52D04的示例性DLL3靶向三特异性蛋白与来自四个不同供体的人T细胞的结合。
图28描绘了与具有GFP结合域的三特异性分子相比，以抗DLL3:抗ALB:抗CD3(TAC)构型包含本公开的DLL3结合域52D04的示例性DLL3靶向三特异性蛋白与表达人DLL3的细胞系NCI-H82(左上)、SHP77(右上)、DMS53(左下)或NCI-H2171(右下)的结合。
图29描绘了与具有GFP结合域的三特异性分子相比，以抗CD3:抗ALB:抗DLL3(CAT)构型包含本公开的DLL3结合域52D04的示例性DLL3靶向三特异性蛋白与表达人DLL3的细胞系NCI-H82(左上)、SHP77(右上)、DMS53(左下)或NCI-H2171(右下)的结合.
图30示出了使用来自四个不同供体的T细胞，在人血清白蛋白(HSA)的存在下测试的，使用以抗DLL3:抗ALB:抗CD3(TAC)构型包含本公开的DLL3结合域52D04的示例性DLL3靶向三特异性蛋白对NCI-H82细胞的TDCC测定的结果。
图31示出了使用来自四个不同供体的T细胞，在人血清白蛋白(HSA)的存在下测试的，使用以抗DLL3:抗ALB:抗CD3(TAC)构型包含本公开的DLL3结合域52D04的示例性DLL3靶向三特异性蛋白对SHP77细胞的TDCC测定的结果。
图32示出了使用来自四个不同供体的T细胞，在人血清白蛋白(HSA)的存在下测试的，使用以抗DLL3:抗ALB:抗CD3(TAC)构型包含本公开的DLL3结合域52D04的示例性DLL3靶向三特异性蛋白对DMS53细胞的TDCC测定的结果。
图33示出了使用来自四个不同供体的T细胞，在人血清白蛋白(HSA)的存在下测试的，使用以抗DLL3:抗ALB:抗CD3(TAC)构型包含本公开的DLL3结合域52D04的示例性DLL3靶向三特异性蛋白对NCI-H2171细胞的TDCC测定的结果。
图34示出了使用来自四个不同供体的T细胞，在人血清白蛋白(HSA)的存在下测试的，使用以抗CD3:抗ALB:抗DLL3(CAT)构型包含本公开的DLL3结合域52D04的示例性DLL3靶向三特异性蛋白对NCI-H82细胞的TDCC测定的结果。
图35示出了使用来自四个不同供体的T细胞，在人血清白蛋白(HSA)的存在下测试的，使用以抗CD3:抗ALB:抗DLL3(CAT)构型包含本公开的DLL3结合域52D04的示例性DLL3靶向三特异性蛋白对SHP77细胞的TDCC测定的结果。
图36示出了使用来自四个不同供体的T细胞，在人血清白蛋白(HSA)的存在下测试的，使用以抗CD3:抗ALB:抗DLL3(CAT)构型包含本公开的DLL3结合域52D04的示例性DLL3靶向三特异性蛋白对DMS53细胞的TDCC测定的结果。
图37示出了使用来自四个不同供体的T细胞，在人血清白蛋白(HSA)的存在下测试的，使用以抗CD3:抗ALB:抗DLL3(CAT)构型包含本公开的DLL3结合域52D04的示例性DLL3靶向三特异性蛋白对NCI-H2171细胞的TDCC测定的结果。
图38示出了在与NCI-H82细胞共培养的T细胞上CD69表达的流式细胞术测量结果，其中滴定了以抗DLL3:抗ALB:抗CD3(TAC)构型包含本公开的DLL3结合域52D04的示例性DLL3靶向三特异性蛋白，使用来自四个不同供体的T细胞，在人血清白蛋白(HSA)的存在下进行测试。
图39示出了在与NCI-H82细胞共培养的T细胞上CD25表达的流式细胞术测量结果，其中滴定了以抗DLL3:抗ALB:抗CD3(TAC)构型包含本公开的DLL3结合域52D04的示例性DLL3靶向三特异性蛋白，使用来自四个不同供体的T细胞，在人血清白蛋白(HSA)的存在下进行测试。
图40示出了在与DMS53细胞共培养的T细胞上CD69表达的流式细胞术测量结果，其中滴定了以抗DLL3:抗ALB:抗CD3(TAC)构型包含本公开的DLL3结合域52D04的示例性DLL3靶向三特异性蛋白，使用来自四个不同供体的T细胞，在人血清白蛋白(HSA)的存在下进行测试。
图41示出了在与DMS53细胞共培养的T细胞上CD25表达的流式细胞术测量结果，其中滴定了以抗DLL3:抗ALB:抗CD3(TAC)构型包含本公开的DLL3结合域52D04的示例性DLL3靶向三特异性蛋白，在人血清白蛋白(HSA)的存在下进行测试。
图42示出了在与NCI-H82细胞共培养的T细胞上CD69表达的流式细胞术测量结果，其中滴定了以抗CD3:抗ALB:抗DLL3(CAT)构型包含本公开的DLL3结合域52D04的示例性DLL3靶向三特异性蛋白，使用来自四个不同供体的T细胞，在人血清白蛋白(HSA)的存在下进行测试。
图43示出了在与NCI-H82细胞共培养的T细胞上CD25表达的流式细胞术测量结果，其中滴定了以抗CD3:抗ALB:抗DLL3(CAT)构型包含本公开的DLL3结合域52D04的示例性DLL3靶向三特异性蛋白，使用来自四个不同供体的T细胞，在人血清白蛋白(HSA)的存在下进行测试。
图44示出了在与DMS53细胞共培养的T细胞上CD69表达的流式细胞术测量结果，其中滴定了以抗CD3:抗ALB:抗DLL3(CAT)构型包含本公开的DLL3结合域52D04的示例性DLL3靶向三特异性蛋白，使用来自四个不同供体的T细胞，在人血清白蛋白(HSA)的存在下进行测试。
图45示出了在与DMS53细胞共培养的T细胞上CD25表达的流式细胞术测量结果，其中滴定了以抗CD3:抗ALB:抗DLL3(CAT)构型包含本公开的DLL3结合域52D04的示例性DLL3靶向三特异性蛋白，在人血清白蛋白(HSA)的存在下进行测试。
图46示出了T细胞和NCI-H82细胞的共培养物在条件培养基中的IFNγ测量的结果，所述细胞与滴定的以抗DLL3:抗ALB:抗CD3(TAC)构型包含本公开的DLL3结合域52D04的示例性DLL3靶向三特异性蛋白一起孵育，在人血清白蛋白(HSA)的存在下进行测试。
图47示出了T细胞和SHP77细胞的共培养物在条件培养基中的IFNγ测量的结果，所述细胞与滴定的以抗DLL3:抗ALB:抗CD3(TAC)构型包含本公开的DLL3结合域52D04的示例性DLL3靶向三特异性蛋白一起孵育，在人血清白蛋白(HSA)的存在下进行测试。
图48示出了T细胞和NCI-H82细胞的共培养物在条件培养基中的IL-2测量的结果，所述细胞与滴定的以抗DLL3:抗ALB:抗CD3(TAC)构型包含本公开的DLL3结合域52D04的示例性DLL3靶向三特异性蛋白一起孵育，在人血清白蛋白(HSA)的存在下进行测试。
图49示出了T细胞和SHP77细胞的共培养物在条件培养基中的IL-2测量的结果，所述细胞与滴定的以抗DLL3:抗ALB:抗CD3(TAC)构型包含本公开的DLL3结合域52D04的示例性DLL3靶向三特异性蛋白一起孵育，在人血清白蛋白(HSA)的存在下进行测试。
图50示出了T细胞和NCI-H82细胞的共培养物在条件培养基中的TNFα测量的结果，所述细胞与滴定的以抗DLL3:抗ALB:抗CD3(TAC)构型包含本公开的DLL3结合域52D04的示例性DLL3靶向三特异性蛋白一起孵育，在人血清白蛋白(HSA)的存在下进行测试。
图51示出了T细胞和SHP77细胞的共培养物在条件培养基中的TNFα测量的结果，所述细胞与滴定的以抗DLL3:抗ALB:抗CD3(TAC)构型包含本公开的DLL3结合域52D04的示例性DLL3靶向三特异性蛋白一起孵育，在人血清白蛋白(HSA)的存在下进行测试。
图52示出了T细胞和NCI-H82细胞的共培养物在条件培养基中的IFNγ测量的结果，所述细胞与滴定的以抗CD3:抗ALB:抗DLL3(CAT)构型包含本公开的DLL3结合域52D04的示例性DLL3靶向三特异性蛋白一起孵育，在人血清白蛋白(HSA)的存在下进行测试。
图53示出了T细胞和SHP77细胞的共培养物在条件培养基中的IFNγ测量的结果，所述细胞与滴定的以抗CD3:抗ALB:抗DLL3(CAT)构型包含本公开的DLL3结合域52D04的示例性DLL3靶向三特异性蛋白一起孵育，在人血清白蛋白(HSA)的存在下进行测试。
图54示出了T细胞和NCI-H82细胞的共培养物在条件培养基中的IL-2测量的结果，所述细胞与滴定的以抗CD3:抗ALB:抗DLL3(CAT)构型包含本公开的DLL3结合域52D04的示例性DLL3靶向三特异性蛋白一起孵育，在人血清白蛋白(HSA)的存在下进行测试。
图55示出了T细胞和SHP77细胞的共培养物在条件培养基中的IL-2测量的结果，所述细胞与滴定的以抗CD3:抗ALB:抗DLL3(CAT)构型包含本公开的DLL3结合域52D04的示例性DLL3靶向三特异性蛋白一起孵育，在人血清白蛋白(HSA)的存在下进行测试。
图56示出了T细胞和NCI-H82细胞的共培养物在条件培养基中的TNFα测量的结果，所述细胞与滴定的以抗CD3:抗ALB:抗DLL3(CAT)构型包含本公开的DLL3结合域52D04的示例性DLL3靶向三特异性蛋白一起孵育，在人血清白蛋白(HSA)的存在下进行测试。
图57示出了T细胞和SHP77细胞的共培养物在条件培养基中的TNFα测量的结果，所述细胞与滴定的以抗CD3:抗ALB:抗DLL3(CAT)构型包含本公开的DLL3结合域52D04的示例性DLL3靶向三特异性蛋白一起孵育，在人血清白蛋白(HSA)的存在下进行测试。
图58描绘了在注射人T细胞与NCI-H82小细胞肺癌细胞混合物的小鼠中，在20μg/kg、100μg/kg或500μg/kg剂量下，以抗DLL3:抗ALB:抗CD3(TAC)构型或抗CD3:抗ALB:抗DLL3(CAT)构型包含本公开的DLL3结合域52D04的示例性DLL3靶向三特异性蛋白能够抑制肿瘤生长。
图59描绘了在注射人T细胞的小鼠中，在10μg/kg和100μg/kg剂量下，以抗CD3:抗ALB:抗DLL3(CAT)构型包含本公开的DLL3结合域52D04的示例性DLL3靶向三特异性蛋白能够消除NCI-H82异种移植肿瘤的生长。
图60描绘了在注射人T细胞与SHP77小细胞肺癌细胞混合物的小鼠中，在10μg/kg和100μg/kg剂量下，以抗CD3:抗ALB:抗DLL3(CAT)构型包含本公开的DLL3结合域52D04的示例性DLL3靶向三特异性蛋白能够抑制肿瘤生长。
图61描绘了以抗CD3:抗ALB:抗DLL3(CAT)构型(ID编号1和2)或抗DLL3:抗ALB:抗CD3(TAC)构型(ID编号3和4)包含本公开的DLL3结合域52D04的示例性DLL3靶向三特异性蛋白的药代动力学谱。图中显示了在以0.3mg/kg注射到食蟹猴后的不同时间点，该DLL3靶向三特异性蛋白的血清水平。
图62描绘了以抗CD3:抗ALB:抗DLL3(CAT)构型包含本公开的DLL3结合域52D04的示例性DLL3靶向三特异性蛋白的药代动力学谱。图中显示了在以1mg/kg或10mg/kg注射到食蟹猴后的不同时间点。
图63描绘了在本公开的示例性DLL3结合TriTAC分子以1mg/kg和10mg/kg剂量或媒介物对照的首次给药后的瞬时细胞因子增加。上图显示了IFNγ的瞬时增加，第二幅图显示了IL-6的瞬时增加，第三幅图显示了IL-10的瞬时增加。
图64示出了对DMS53细胞进行的TDCC测定的结果，其中使用以抗CD3:抗ALB:抗DLL3(CAT)构型包含本公开的DLL3结合域52D04的示例性DLL3靶向三特异性蛋白，使用新鲜融化的蛋白质，或使用在给予10mg/kg DLL3靶向三特异性蛋白质后168小时采集的食蟹猴血清样品中存在的蛋白质，在8.4％食蟹猴血清的存在下进行测量。
具体实施方式
在一些实施方案中，本文描述了特异性结合δ样配体3(DLL3)和含有它的多特异性(例如三特异性)蛋白，其药物组合物，以及用于制备这类蛋白的核酸、重组表达载体和宿主细胞。还提供了使用所公开的DLL3结合蛋白或含有它的DLL3靶向三特异性蛋白中的至少一种预防和/或治疗疾病、病况和病症的方法。所述DLL3靶向三特异性蛋白能够特异性结合DLL3以及CD3，并且具有半衰期延长结构域，如能够特异性结合人白蛋白(ALB)的结构域。图1描绘了三特异性DLL3结合蛋白的一个非限制性实例。在一些实施方案中，该DLL3靶向三特异性蛋白包含抗体，如三特异性抗体。
某些定义
“抗体”通常是指Y形四聚体蛋白质，其包含通过共价二硫键和非共价相互作用保持在一起的两条重(H)多肽链和两条轻(L)多肽链。人轻链包含可变域(VL)和恒定域(CL)，其中基于氨基酸序列和基因座，该恒定域可被容易地分类为κ或λ。每条重链包含一个可变域(VH)和恒定区，在IgG、IgA和IgD的情况下，恒定区包含三个结构域，分别被称为CH1、CH2和CH3(IgM和IgE具有第四个结构域——CH4)。在IgG、IgA和IgD类别中，CH1和CH2结构域被柔性铰链区隔开，该柔性铰链区是可变长度(在IgG中通常为约10个至约60个氨基酸)的富含脯氨酸和半胱氨酸的区段。轻链和重链中的可变域都通过约12个或更多个氨基酸的“J”区与恒定域连接，并且重链还具有约10个额外氨基酸的“D”区。每种类别的抗体进一步包含由成对的半胱氨酸残基形成的链间和链内二硫键。免疫球蛋白分子中存在两种类型的天然二硫桥或二硫键：链间和链内二硫键。链间二硫键的位置和数目根据免疫球蛋白的类别和种类而不同。链间二硫键位于免疫球蛋白的表面上，是溶剂可及的，并且通常相对易于还原。在人IgG1同种型中，存在四个链间二硫键，从每个重链到轻链有一个，而两个在重链之间。链间二硫键不是链缔合所必需的。众所周知，重链的富含半胱氨酸的IgG1铰链区通常被保持为由三个部分组成：上铰链、核心铰链和下铰链。本领域技术人员将会理解，IgG1铰链区在重链中含有半胱氨酸，这些半胱氨酸构成链间二硫键(两个重/重，两个重/轻)，其提供有助于Fab运动的结构柔性。IgG1的轻链和重链之间的链间二硫键在κ或λ轻链的C214与重链上铰链区中的C220之间形成。重链之间的链间二硫键位于位置C226和C229处(全部按照EU索引编号，根据Kabat等人，下文)。
如本文所用的，术语“抗体”包括多克隆抗体、多个克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化和灵长类动物化抗体、CDR移植的抗体、人抗体、重组产生的抗体，胞内抗体(intrabodies)、多特异性抗体、双特异性抗体、单价抗体、多价抗体、抗独特型抗体、合成抗体，包括突变蛋白(muteins)及其变体，免疫特异性抗体片段，如Fd、Fab、F(ab')2、F(ab')片段、单链片段(例如，ScFv和ScFvFc)、二硫键连接的Fv(sdFv)、由VH和CH1结构域组成的Fd片段、线性抗体、单结构域抗体，如sdAb(VH、VL或VHH结构域)；及其衍生物，包括Fc融合物和其他修饰，以及其他任何免疫反应性分子，只要其包含具有与DLL3蛋白优先缔合或结合的结合位点的结构域即可。此外，除非上下文约束另有指示，否则该术语还包括所有类别的抗体(即，IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)和所有亚类(即，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。对应于不同抗体类别的重链恒定域一般分别用相应的小写希腊字母α、δ、ε、γ和μ来表示。来自任何脊椎动物物种的抗体的轻链，基于其恒定域的氨基酸序列，可以归为两种截然不同的类型(称为κ(kappa)和λ(lambda))之一。
在一些实施方案中，本公开的DLL3靶向三特异性蛋白的DLL3结合域包含仅重链的抗体，如VH或VHH结构域。在一些情况下，所述DLL3结合蛋白包含仅重链抗体，其为工程化VH结构域。在一些实例中，通过淘选噬菌体展示文库产生工程化人VH结构域。在一些实施方案中，本公开的DLL3靶向三特异性蛋白的DLL3结合域包含VHH。如本文所用的术语“VHH”是指不含轻链的单链抗体结合域。在一些情况下，VHH衍生自可在骆驼科或软骨鱼中发现的天然缺乏轻链的类型的抗体，或者衍生自可以相应构建的合成和非免疫的VHH。每条重链包含由V-、D-和J-外显子编码的可变区。在一些情况下，VHH是天然的VHH，如骆驼科来源的VHH，或包含重链可变域的重组蛋白。在一些实施方案中，该VHH来源于选自骆驼、美洲驼、骆马(vicugnas)、大羊驼(guanacos)和软骨鱼(例如但不限于鲨鱼)的物种。在另一个实施方案中，该VHH来源于羊驼(例如但不限于霍加耶羊驼(Huacaya Alpaca)或苏里羊驼(Surialpaca))。
如本文所用的，“可变区”或“可变域”是指以下情况：可变域的某些部分在抗体之间在序列上广泛不同，并且在每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性中使用。然而，可变性并非均匀地分布在抗体的整个可变域中。其集中在轻链(VL)和重链(VH)可变域中被称为互补决定区(CDR)或高变区的三个区段中。可变域更高度保守的部分被称为框架(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR区，其主要采取β-折叠构型，通过三个CDR连接，它们形成连接β折叠结构的环，并且在一些情况下形成β折叠结构的一部分。每条链中的CDR通过FR区紧密靠近保持在一起，并且与来自另一条链的CDR一起有助于形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,National Institute of Health,Bethesda,Md.(1991))。恒定域虽然不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种效应物功能，诸如抗体参与抗体的抗体依赖性细胞毒性。在一些情况下通过遗传工程获得的scFv片段(对于单链片段可变)在单个多肽链中缔合抗体的VH和VL区，这两个区域被肽连接体隔开。
在本公开的一些实施方案中，所述DLL3结合域，如DLL3靶向三特异性蛋白的DLL3结合域，包含单结构域抗体，如仅重链的抗体，如VH或VHH结构域，并且包含三个CDR。在一些实施方案中，这类仅重链的抗体以单体形式结合DLL3，其最佳结合亲和力不依赖于与VL(轻链可变)区的二聚化。在本公开的一些实施方案中，所述DLL3靶向三特异性蛋白的CD3结合域包含scFv。在本公开的一些实施方案中，所述DLL3靶向三特异性蛋白的白蛋白结合域包含仅重链的抗体，如包含VH结构域或VHH结构域的单结构域抗体。
在一些实施方案中，除非另有说明，否则将氨基酸指定到每个结构域、框架区和CDR是根据以下提供的编号方案之一：Kabat等人(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest(第5版),US Dept.of Health and Human Services,PHS,NIH,NIH Publication no.91-3242；Chothia等人,1987,PMID:3681981；Chothia等人,1989,PMID:2687698；MacCallum等人,1996,PMID:8876650；或Dubel,Ed.(2007)Handbook ofTherapeutic Antibodies,第3版,Wily-VCH Verlag GmbH and Co or AbM(OxfordMolecular/MSI Pharmacopia)。这并不意味着本公开的CDR必然对应于Kabat编号约定。在本公开的一些实施方案中，所述DLL3结合蛋白包含单结构域抗体，如仅重链的抗体，如VH或VHH结构域，并且包含三个CDR。在一些实施方案中，这类仅重链的抗体以单体形式结合DLL3，其最佳结合亲和力不依赖于与VL(轻链可变)区的二聚化。
“按照Kabat的可变域残基编号”或“按照Kabat的氨基酸位置编号”及其变化形式是指在Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)中用于抗体编译的重链可变域或轻链可变域的编号系统。使用该编号系统，实际的线性氨基酸序列可含有较少的或额外的氨基酸，其对应于可变域的FR或CDR的缩短或向其中的插入。例如，重链可变域可包含在H2的残基52之后的单氨基酸插入(根据Kabat为残基52a)和在重链FR残基82之后的插入残基(例如，根据Kabat为残基82a、82b和82c等)。可通过将抗体序列在同源性区域与“标准”Kabat编号的序列进行比对来确定给定抗体的残基的Kabat编号。
术语“框架”或“FR”残基(或区)是指除本文定义的CDR或高变区残基之外的可变域残基。“人共有框架”是代表在选择人免疫球蛋白VL或VH框架序列中最常出现的氨基酸残基的框架。
如本文所用的，用于序列的术语“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为在将序列进行比对并引入空位(如果需要)以达到最大序列同一性百分比之后，候选序列中的氨基酸残基与特定序列中的氨基酸残基相同的百分比，并且不认为任何保守置换是序列同一性的一部分。用于确定氨基酸序列同一性百分比目的的比对可通过本领域技术范围内的各种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件，如EMBOSS MATCHER、EMBOSS WATER、EMBOSSSTRETCHER、EMBOSS NEEDLE、EMBOSS LALIGN、BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定用于测量比对的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
如本文所用的，“消除半衰期”以其普通含义使用，如在Goodman和Gillman的ThePharmaceutical Basis of Therapeutics 21-25(Alfred Goodman Gilman、LouisS.Goodman和Alfred Gilman编著，第六版1980)中所述。简言之，该术语意在包括药物消除的时间过程的定量量度。大多数药物的消除是指数式的(即，遵循一级动力学)，因为药物浓度通常并未接近消除过程的饱和所需的浓度。指数过程的速率可由其速率常数k或由其半衰期t1/2表示，速率常数k表示每单位时间的分数变化，半衰期t1/2表示该过程完成50％所需的时间。这两个常数的单位分别是时间-1和时间。该反应的一级速率常数和半衰期简单相关(k×t1/2＝0.693)并且可以相应地互换。由于一级消除动力学指示每单位时间损失恒定分数的药物，因此药物浓度的对数相对于时间的图形在初始分布阶段之后(即在药物吸收和分布完成之后)一直是线性的。可从这样的图形准确地确定药物消除的半衰期。
如本文所用的，术语“结合亲和力”是指本公开内容中描述的蛋白质与其结合靶标的亲和力，并且使用“Kd”值以数字表示。如果表明两种或更多种蛋白质对其结合靶标具有相当的结合亲和力，那么各蛋白质与其结合靶标结合的Kd值在彼此的±2倍之内。如果表明两种或更多种蛋白质对单一结合靶标具有相当的结合亲和力，那么各蛋白质与所述单一结合靶标结合的Kd值在彼此的±2倍之内。如果表明蛋白质以相当的结合亲和力结合两种或更多种靶标，那么所述蛋白质与所述两种或更多种靶标结合的Kd值在彼此的±2倍之内。通常，较高的Kd值对应于较弱的结合。在一些实施方案中，使用BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,N.J.)通过放射性标记的抗原结合测定(RIA)或表面等离子体共振测定来测量“Kd”。在某些实施方案中，还使用BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,N.J.)通过表面等离子体共振技术来测定“缔合率”或“缔合的速率”或“缔合速率”或“kon”以及“解离率”或“解离的速率”或“解离速率”或“koff”。在另外的实施方案中，使用
Figure BDA0003083515520000341
Systems(Pall Life Sciences)来测定“Kd”、“kon”和“koff”。在使用
Figure BDA0003083515520000342
Systems测量结合亲和力的示例性方法中，将配体(例如，生物素化的人或食蟹猴DLL3)固定在
Figure BDA0003083515520000343
链霉亲和素毛细管传感器端头表面上，然后按照制造商的说明书使用约20-50μg/ml的人或食蟹猴DLL3蛋白质激活该链霉亲和素端头。还引入PBS/酪蛋白溶液作为封闭剂。对于缔合动力学测量，以约10ng/mL至约100μg/mL、约50ng/mL至约5μg/mL或约2ng/mL至约20μg/mL的浓度引入DLL3结合蛋白变体。在一些实施方案中，DLL3结合单结构域蛋白质以约2ng/mL至约20μg/mL的浓度使用。在阴性对照，即不含结合蛋白的测定缓冲液的情况下观察到完全解离。然后使用适当的工具例如ForteBio软件来确定结合反应的动力学参数。
一个实施方案提供了一种DLL3结合蛋白(本文也称为DLL3结合域，如本公开的DLL3三特异性抗体的DLL3结合域)，其包含单结构域抗体，该单结构域抗体含有包含选自SEQ ID No.443-884和1887的序列的CDR1序列，包含选自SEQ ID No.885-1326和1888的序列的CDR2序列，以及包含选自SEQ ID No.1327-1768和1889的序列的CDR3序列。在一些实施方案中，考虑到本公开的DLL3结合蛋白相当小，并且在一些实施方案中不大于25kD、不大于20kDa、不大于15kDa或不大于10kDa。在某些情况下，如果其为肽或小分子实体，则EGFR结合为5kDa或更小。
在一方面，所述DLL3靶向三特异性蛋白(本文也称为DLL3结合三特异性蛋白、DLL3三特异性蛋白或DLL3 TriTACTM)包含(a)与人CD3特异性结合的第一结构域(A)；(b)第二结构域(B)，其为半衰期延长结构域；和(c)与DLL3特异性结合的第三结构域(C)。DLL3靶向三特异性蛋白中的三个结构域以任意顺序排列。因此，考虑到该DLL3靶向三特异性蛋白的结构域顺序为：
H2N-(A)-(B)-(C)-COOH、
H2N-(A)-(C)-(B)-COOH、
H2N-(B)-(A)-(C)-COOH、
H2N-(B)-(C)-(A)-COOH、
H2N-(C)-(B)-(A)-COOH或
H2N-(C)-(A)-(B)-COOH。
在一些实施方案中，所述DLL3靶向三特异性蛋白具有H2N-(A)-(B)-(C)-COOH的结构域顺序。在一些实施方案中，所述DLL3靶向三特异性蛋白具有H2N-(A)-(C)-(B)-COOH的结构域顺序。在一些实施方案中，所述DLL3靶向三特异性蛋白具有H2N-(B)-(A)-(C)-COOH的结构域顺序。在一些实施方案中，所述DLL3靶向三特异性蛋白具有H2N-(B)-(C)-(A)-COOH的结构域顺序。在一些实施方案中，所述DLL3靶向三特异性蛋白具有H2N-(C)-(B)-(A)-COOH的结构域顺序。在一些实施方案中，所述DLL3靶向三特异性蛋白具有H2N-(C)-(A)-(B)-COOH的结构域顺序。
在一些实施方案中，所述DLL3靶向三特异性蛋白具有HSA(在本文中也称为ALB)结合域作为中间结构域，使得结构域顺序为H2N-(A)-(B)-(C)-COOH或H2N-(C)-(B)-(A)-COOH。预期在HSA结合域作为中间结构域的这类实施方案中，CD3和DLL3结合域被赋予了额外的柔性以与它们各自的靶标结合。
在一些实施方案中，所述三特异性结合蛋白包含特异性结合DLL3的第三结构域，该第三结构域在一些情况下是与DLL3结合的单结构域抗体，其以与参考DLL3结合亲本分子的亲和力相同或更好的亲和力与DLL3结合。在一些实施方案中，第三结构域包含亲和力成熟的DLL3结合分子(例如，亲和力成熟的与DLL3结合的单结构域抗体)，并且衍生自DLL3结合亲本分子，其相对于DLL3结合亲本分子包含一个或多个氨基酸突变(例如，稳定突变、去稳定突变)。在一些实施方案中，亲和力成熟的DLL3结合分子相对于选择的去稳定剂具有比参考DLL3结合亲本分子更好的稳定性。在一些实施方案中，亲和力成熟的DLL3结合分子是在以下过程中鉴定的，该过程包括针对DLL3蛋白，如人DLL3蛋白，淘选在噬菌体展示文库中表达的，由一个或多个DLL3结合亲本分子衍生的一个或多个预候选DLL3结合分子。在一些实施方案中，该预候选DLL3结合分子相对于亲本分子在可变区、CDR或框架残基中包含氨基酸置换。
如本文所用的，“噬菌体展示”是指这样的技术，通过该技术将变异多肽作为融合蛋白展示到噬菌体、丝状噬菌体、颗粒表面上的外壳蛋白的至少一部分。噬菌体展示的实用性在于以下事实：可以为那些以高亲和力与靶分子结合的序列快速而有效地选择随机化蛋白质变体的大型文库。在噬菌体上展示肽和蛋白质文库已用于针对具有特定结合性质的多肽筛选数百万种多肽。多价噬菌体展示方法已用于通过与丝状噬菌体的基因III或基因VIII融合来展示小的随机肽和小的蛋白质。Wells和Lowman,Curr.Opin.Struct.Biol,3:355-362(1992)，以及其中引用的参考文献。在单价噬菌体展示中，将蛋白质或肽文库与基因III或其部分融合，并在野生型基因III蛋白的存在下以低水平表达，从而使噬菌体颗粒展示出一个拷贝的融合蛋白或不展示融合蛋白。相对于多价噬菌体，亲合力作用降低，因此选择是基于固有的配体亲和力，并且使用了噬菌粒载体，从而简化了DNA操作。Lowman和Wells,Methods:A companion to Methods in Enzymology,3:205-0216(1991)。
在一些实施方案中，淘选包括使用变化的结合时间和浓度来从预候选DLL3结合分子中鉴定具有增加或减少的结合速率的DLL3结合分子。在一些实施方案中，淘选包括使用变化的洗涤时间来从预候选DLL3分子中鉴定具有增加或减少的解离速率的DLL3结合分子。在一些实施方案中，淘选包括使用变化的结合时间和变化的洗涤时间两者。在一些实施方案中，例如通过改组以从此类突变体创建第二阶段组合文库并进行第二轮淘选，随后进行结合选择，来组合一个或多个稳定突变，以增加亲和力成熟的DLL3结合分子的稳定性。
在一些实施方案中，亲和力成熟的DLL3结合分子与DLL3结合亲本分子相比具有与DLL3蛋白(如人DLL3蛋白)相同或更好的亲和力，但是具有降低的与诸如配体、蛋白质、抗原等所选物质的交叉反应性，或在一些实施方案中，具有增加的交叉反应性，该所选物质不是DLL3结合亲本分子对其具有特异性的或被设计为对其具有特异性的DLL3表位。关于后者，在一些实施方案中，如果亲和力成熟的DLL3结合分子与人DLL3和动物模型的相应靶标小鼠DLL3或食蟹猴DLL3反应，则在动物模型中更成功地测试亲和力成熟的DLL3结合分子。在一些实施方案中，亲本DLL3结合分子以约10nM或更低的亲和力与人DLL3结合，并以约15nM或更低的亲和力与食蟹猴DLL3结合。在一些实施方案中，在一轮淘选后鉴定的亲和力成熟的DLL3结合分子以约5nM或更低的亲和力与人DLL3结合，并以约7.5nM或更低的亲和力与食蟹猴DLL3结合。在一些实施方案中，在两轮淘选后鉴定的亲和力成熟的DLL3结合分子以约2.5nM或更低的亲和力与人DLL3结合，并以约3.5nM或更低的亲和力与食蟹猴DLL3结合。
在一些实施方案中，本公开的三特异性结合蛋白的结构域A、结构域B和结构域C独立地是抗原特异性结合域，其特异性结合靶标，如病变细胞上的靶标或支持疾病状态的其他细胞上的靶标，如支持肿瘤生长的基质细胞上的靶标或支持疾病介导的免疫抑制的免疫细胞上的靶标。在一些实例中，抗原特异性结合域包括抗体、仅重链的抗体，包括单链抗体、Fab、Fv、T细胞受体结合域、配体结合域、受体结合域、结构域抗体、单结构域抗体、小型抗体(minibodies)、纳米抗体、肽抗体(peptibodies)或各种其他抗体模拟物(如affimers、affitins、alphabodies、atrimers、基于CTLA4的分子、adnectins,anticalins、基于Kunitz结构域的蛋白质、avimers、knottins、fynomers、darpins、affibodies、affilins、单抗体(monobodies)和基于犰狳重复蛋白的蛋白质)。
在一些实施方案中，本文所述的DLL3靶向三特异性蛋白包含具有选自SEQ IDNo.1-442和1886的序列、其子序列及其变体的DLL结合多肽。在一些实施方案中，该三特异性抗原结合蛋白包含与选自SEQ ID No.1-442和1886的序列、其子序列及其变体具有至少70％-95％或更高同源性的DLL3结合多肽(即，第三结构域(C))。在一些实施方案中，该三特异性抗原结合蛋白包含与选自SEQ ID No.1-442和1886的序列、其子序列及其变体具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同源性的DLL3结合多肽(即，第三结构域(C))。在一些实施方案中，该三特异性抗原结合蛋白包含与选自SEQ IDNo.1-442和1886的序列、其子序列及其变体具有至少70％-95％或更高同一性的DLL3结合多肽(即，第三结构域(C))。在一些实施方案中，该三特异性抗原结合蛋白包含与选自SEQID No.1-442和1886的序列、其子序列及其变体具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的DLL3结合多肽(即，第三结构域(C))。
本文所述的DLL3靶向三特异性蛋白被设计为允许通过募集细胞毒性T细胞来特异性靶向表达DLL3的细胞。在一些实施方案中，这与ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)相比提高了功效，ADCC是利用针对唯一抗原的全长抗体并且不能直接募集细胞毒性T细胞。相反，通过接合在这些细胞上特异性表达的CD3分子，所述DLL3靶向三特异性蛋白可使细胞毒性T细胞与表达DLL3的细胞以高度特异性的方式交联，从而将T细胞的细胞毒性潜能引导至靶细胞。本文所述的DLL3靶向三特异性蛋白经由与表面表达的CD3蛋白结合而接合细胞毒性T细胞，这形成TCR的一部分。数种DLL3三特异性抗原结合蛋白与CD3和特定细胞表面上表达的DLL3的同时结合引起T细胞活化，并介导特定DLL3表达细胞的后续裂解。因此，预期DLL3靶向三特异性蛋白显示强烈的、特异的和有效的靶细胞杀伤。在一些实施方案中，本文所述的DLL3靶向三特异性蛋白刺激细胞毒性T细胞杀死靶细胞以消除致病细胞(例如表达DLL3的肿瘤细胞)。在一些这样的实施方案中，细胞被选择性地消除，从而减小毒副作用的可能性。
与传统单克隆抗体和其他较小的双特异性分子相比，本文所述的DLL3靶向三特异性蛋白提供进一步的治疗优点。通常，重组蛋白质药物的有效性在很大程度上取决于蛋白质本身的内在药代动力学。一种这样的优点在于，本文所述的DLL3靶向三特异性蛋白由于具有半衰期延长结构域，如特异性结合血清白蛋白(例如，人血清白蛋白，HSA)的结构域，而具有延长的药代动力学消除半衰期。就此而言，在一些实施方案中，本文所述的DLL3靶向三特异性蛋白具有约两天、三天、约五天、约七天、约10天、约12天或约14天的延长的血清消除半衰期。这与具有相对短得多的消除半衰期的其他结合蛋白如BiTE或DART分子形成对照。例如，BiTE CD19×CD3双特异性scFv-scFv融合分子由于其消除半衰期短而需要连续的静脉内输注(i.v.)药物递送。所述DLL3靶向三特异性蛋白的较长的内在半衰期解决了这个问题，从而允许增加的治疗潜力，如低剂量药物制剂、减少的定期给药和/或新型药物组合物。
本文所述的DLL3靶向三特异性蛋白还具有对于增强的组织穿透和组织分布而言最优的大小。较大的大小限制或阻止蛋白质在靶组织中的穿透或分布。本文所述的DLL3靶向三特异性蛋白通过具有允许增强的组织穿透和分布的小尺寸而避免了这一问题。因此，在一些实施方案中，本文所述的DLL3靶向三特异性蛋白的大小为约50kDa至约80kDa、约50kDa至约75kDa、约50kDa至约70kDa或约50kDa至约65kDa。在一些实施方案中，所述DLL3靶向三特异性蛋白的大小小于约60kDa。因此，所述DLL3靶向三特异性蛋白的大小优于约150kDa的IgG抗体以及约55kDa但半衰期没有延长并因此快速通过肾脏清除的BiTE和DART双抗体分子。
在进一步的实施方案中，本文所述的DLL3靶向三特异性蛋白具有对于增强的组织穿透和分布而言最优的大小。在这些实施方案中，DLL3靶向三特异性蛋白被构建为尽可能小，同时保留对其靶标的特异性。因此，在这些实施方案中，本文所述的DLL3靶向三特异性蛋白的大小为约20kDa至约40kDa，或约25kDa至约35kDa至约40kDa、至约45kDa、至约50kDa、至约55kDa、至约60kDa、至约65kDa。在一些实施方案中，本文所述的DLL3靶向三特异性蛋白的大小为约50kDa、49kDa、48kDa、47kDa、46kDa、45kDa、44kDa、43kDa、42kDa、41kDa、40kDa、约39kDa、约38kDa、约37kDa、约36kDa、约35kDa、约34kDa、约33kDa、约32kDa、约31kDa、约30kDa、约29kDa、约28kDa、约27kDa、约26kDa、约25kDa、约24kDa、约23kDa、约22kDa、约21kDa或约20kDa。获得小尺寸的示例性方法是对于每个结构域都采用单结构域抗体(sdAb)片段。例如，特定的DLL3三特异性抗原结合蛋白具有抗CD3 sdAb、抗ALB sdAb和针对DLL3的sdAb。这使得示例性DLL3三特异性抗原结合蛋白的大小减小至40kDa以下。因此，在一些实施方案中，该DLL3靶向三特异性蛋白的结构域都是单结构域抗体(sdAb)片段。在一些实施方案中，考虑到所述DLL3结合蛋白相当小，并且在一些实施方案中不大于25kDa、不大于20kDa、不大于15kDa或不大于10kDa。在某些情况下，所述DLL3结合蛋白如果是肽或小分子实体，则为5kDa或更小。
在其他实施方案中，本文所述的DLL3靶向三特异性蛋白包含针对ALB、DLL3、CD3或全部的小分子实体(SME)结合物。SME结合物是大小平均为约500Da至2000Da的小分子，并且通过已知方法如分选酶连接或缀合而附接至DLL3靶向三特异性蛋白上。在这些实例中，DLL3三特异性抗原结合蛋白的结构域之一为分选酶识别序列，LPETG(SEQ ID NO.1896)。为了将SME结合物附接至具有分选酶识别序列的DLL3三特异性抗原结合蛋白上，将该蛋白质与分选酶和SME结合物一起孵育，从而分选酶将SME结合物附接至该识别序列上。在另外其他的实施方案中，本文所述的DLL3靶向三特异性蛋白的与DLL3结合的结构域包含用于结合DLL3的knottin肽。Knottin是具有半胱氨酸结支架(knot scaffold)的二硫键稳定的肽，并且具有约3.5kDa的平均大小。已预期Knottin与某些肿瘤分子如DLL3结合。在进一步的实施方案中，本文所述的DLL3靶向三特异性蛋白的与DLL3结合的结构域包含天然DLL3配体。
本文所述的DLL3靶向三特异性蛋白的另一个特征是它们为具有其结构域的柔性连接的单多肽设计。这允许容易地产生并制备DLL3靶向三特异性蛋白，因为它们可以由易于引入载体中的单个cDNA分子编码。另外，由于本文所述的DLL3靶向三特异性蛋白是单体单多肽链，因此不存在链配对问题或不需要二聚化。预计本文所述的DLL3靶向三特异性蛋白的聚集趋势减小，不同于其他报道的分子，如具有Fc-γ免疫球蛋白结构域的双特异性蛋白质。
在本文所述的DLL3靶向三特异性蛋白中，结构域在一些实施方案中通过内部连接体L1和L2连接，其中L1连接该DLL3靶向三特异性蛋白的第一和第二结构域，而L2连接该DLL3靶向三特异性蛋白的第二和第三结构域。连接体L1和L2具有优化的长度和/或氨基酸组成。在一些实施方案中，连接体L1和L2具有相同的长度和氨基酸组成。在其他实施方案中，L1和L2不同。在某些实施方案中，内部连接体L1和/或L2是“短的”，即，由0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基残基组成。因此，在某些实例中，该内部连接体由约12个或更少的氨基酸残基组成。在0个氨基酸残基的情况下，该内部连接体为肽键。在某些实施方案中，内部连接体L1和/或L2是“长的”，即，由15、20或25个氨基残基组成。在一些实施方案中，这些内部连接体由约3个至约15个，例如8、9或10个连续氨基酸残基组成。关于内部连接体L1和L2的氨基酸组成，选择具有以下性质的肽，即，能赋予该DLL3靶向三特异性蛋白柔性，不干扰结合域，以及抵抗蛋白酶切割。例如，甘氨酸和丝氨酸残基通常提供蛋白酶抗性。适合于连接DLL3靶向三特异性蛋白中结构域的内部连接体的实例包括但不限于(GS)n(SEQ IDNo.1809)、(GGS)n(SEQ ID No.1810)、(GGGS)n(SEQ ID No.1811)、(GGSG)n(SEQ IDNo.1812)、(GGSGG)n(SEQ ID No.1813)、(GGGGS)n)SEQ ID No.1814)、(GGGGG)n(SEQ IDNo.1815)或(GGG)n(SEQ ID No.1816)，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一个实施方案中，内部连接体L1和/或L2为(GGGGS)4(SEQ ID No.1817)或(GGGGS)3(SEQ ID No.1818)。在另一个实施方案中，内部连接体L1和/或L2为GGGGSGGGS(SEQ ID No.1808)。
在一些情况下，使用酶促位点特异性缀合方法缀合DLL3靶向三特异性蛋白内的结构域，该方法涉及使用哺乳动物或细菌转谷氨酰胺酶。微生物转谷氨酰胺酶(mTG)是现代研究和生物技术中的多功能工具。大量相对纯的酶的可获得性、易用性以及钙和鸟嘌呤-5’-三磷酸(GTP)的缺乏调控，促使mTG成为在食品工业和生物技术中使用的主要交联酶。当前，mTG在许多应用中用于将蛋白质和肽附接至小分子、聚合物、表面、DNA以及其他蛋白质上。参见，Pavel Strp,Veracity of microbial transglutaminase,Bioconjugate Chem.25,5,855-862)。
在一些实例中提供了DLL3靶向三特异性蛋白，其中结构域之一在恒定区中包含接受体谷氨酰胺，然后其可以通过基于赖氨酸的连接体(例如，作为TGase底物的任何伯胺链，包含烷基胺、草胺(oxoamine))与另一结构域缀合，其中缀合仅发生在抗原结合位点外部(例如，可变区的外部，恒定区中)的靶向部分中存在的一个或多个接受体谷氨酰胺残基上。因此，在可变区内的谷氨酰胺(至少部分表面暴露的谷氨酰胺)上不发生缀合。在一些实例中，通过在TGase的存在下使结构域之一与基于赖氨酸的连接体反应来形成三特异性蛋白。
在一些实施方案中，在DLL3靶向三特异性结合蛋白内的一个或多个结构域直接接合的情况下，制备杂合载体，其中编码直接接合的结构域的DNA本身直接彼此连接。在一些实施方案中，在使用连接体的情况下，制备杂合载体，其中编码三个结构域中的第一结构域的DNA连接至编码第一连接体部分的一端的DNA，并且编码三个结构域中的第二结构域的DNA连接至第一连接体部分的另一端；进一步地，编码三个结构域中的第二结构域的DNA连接至第二连接体部分的一端，并且编码三个结构域中的第三结构域的DNA连接至第二连接体部分的另一端，其中第一结构域、第二结构域和第三结构域是不同的，并且其中第一结构域、第二结构域和第三结构域独立地选自结构域A、结构域B和结构域C。这样的连接例如串联地或作为三向连接来进行。
CD3结合域
T细胞反应的特异性由TCR对抗原(在主要组织相容性复合物MHC的背景下展示)的识别来介导。作为TCR的一部分，CD3是包含CD3γ(gamma)链、CD3δ(delta)链和存在于细胞表面的两条CD3ε(epsilon)链的蛋白质复合物。CD3与TCR的α(alpha)和β(beta)链缔合，并与CD3ζ(zeta)一起构成完整的TCR。CD3在T细胞上诸如通过固定化抗CD3抗体的簇集，导致T细胞活化，这类似于T细胞受体的接合，但不依赖于其克隆特有的特异性。
在一方面，本文所述的DLL3靶向三特异性蛋白包含与CD3特异性结合的结构域。在一方面，本文所述的DLL3靶向三特异性蛋白包含与人CD3特异性结合的结构域。在一些实施方案中，本文所述的DLL3靶向三特异性蛋白包含与CD3γ特异性结合的结构域。在一些实施方案中，本文所述的DLL3靶向三特异性蛋白包含与CD3δ特异性结合的结构域。在一些实施方案中，本文所述的DLL3靶向三特异性蛋白包含与CD3ε特异性结合的结构域。
在进一步的实施方案中，本文所述的DLL3靶向三特异性蛋白包含与TCR特异性结合的结构域。在某些实例中，本文所述的DLL3靶向三特异性蛋白包含特异性结合TCR的α链的结构域。在某些实例中，本文所述的DLL3靶向三特异性蛋白包含特异性结合TCR的β链的结构域。
在某些实施方案中，本文所述的DLL3靶向三特异性蛋白的CD3结合域不仅表现出对于人CD3的有效的CD3结合亲和力，而且还显示出与各自的食蟹猴CD3蛋白的优异的交叉反应性。
在一些实施方案中，所述DLL3三特异性抗原结合蛋白的CD3结合域可以是与CD3结合的任何结构域，包括但不限于来自单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体的结构域。在一些情况下，CD3结合域来源于该DLL3三特异性抗原结合蛋白最终将在其中使用的相同物种是有益的。例如，对于人用而言，DLL3三特异性抗原结合蛋白的CD3结合域包含来自抗体或抗体片段的抗原结合域的人或人源化残基可能是有益的。
因此，在一方面，抗原结合域包含人源化或人抗体或抗体片段，或者鼠抗体或抗体片段。在一个实施方案中，人源化或人抗CD3结合域包含本文所述的人源化或人抗CD3结合域的轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LCCDR3)中的一个或多个(例如，全部三个)，以及/或者本文所述的人源化或人抗-CD3结合域的重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)中的一个或多个(例如，全部三个)，人源化或人抗CD3结合域包含一个或多个、全部三个LCCDR，以及一个或多个、全部三个HC CDR。
在一些实施方案中，人源化或人抗CD3结合域包含对CD3具有特异性的人源化或人轻链可变区，其中对CD3具有特异性的轻链可变区在人轻链框架区中包含人或非人轻链CDR。在某些实例中，该轻链框架区为λ(lamda)轻链框架。在其他实例中，该轻链框架区为κ(kappa)轻链框架。
在一些实施方案中，人源化或人抗CD3结合域包含对CD3具有特异性的人源化或人重链可变区，其中对CD3具有特异性的重链可变区在人重链框架区中包含人或非人重链CDR。
在某些实例中，重链和/或轻链的互补决定区衍生自已知的抗CD3抗体，例如，莫罗单抗CD3(OKT3)、奥昔珠单抗(TRX4)、替利珠单抗(MGA031)、维西珠单抗(Nuvion)、SP34、TR-66或X35-3、VIT3、BMA030(BW264/56)、CLB-T3/3、CRIS7、YTH12.5、F111-409、CLB-T3.4.2、TR-66、WT32、SPv-T3b、11D8、XIII-141、XIII-46、XIII-87、12F6、T3/RW2-8C8、T3/RW2-4B6、OKT3D、M-T301、SMC2、F101.01、UCHT-1和WT-31。
在一个实施方案中，抗CD3结合域为包含本文提供的氨基酸序列的轻链和重链的单链可变片段(scFv)。如本文所用的，“单链可变片段”或“scFv”是指包含轻链可变区的抗体片段和至少一个包含重链可变区的抗体片段，其中该轻链和重链可变区经由短的柔性多肽连接体连续连接，并且能够表达为单多肽链，并且其中该scFv保留其所衍生自的完整抗体的特异性。在一个实施方案中，抗CD3结合域包含：轻链可变区，其包含具有本文提供的轻链可变区的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如，置换)但不超过30、20或10个修饰(例如，置换)的氨基酸序列，或与本文提供的氨基酸序列具有95％-99％同一性的序列；和/或重链可变区，其包含具有本文提供的重链可变区的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如，置换)但不超过30、20或10个修饰(例如，置换)的氨基酸序列，或与本文提供的氨基酸序列具有95％-99％同一性的序列。在一些实例中，抗CD3结合域包含选自SEQ IDNo.1793-1807的序列，或与选自SEQ ID No.1793-1807的序列具有至少约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性的序列。在一些实例中，抗CD3结合域包含三个重链CDR(HCCDR1、HC CDR2和HC CDR3)，以及三个轻链CDR。CD3结合域的重链CDR1(HC CDR1)包含选自SEQ ID No.1820-1831的序列，或在选自SEQ ID No.1820-1831的序列中包含一个或多个修饰或置换的序列，或至少约80％至约99％。CD3结合域的重链CDR2(HC CDR2)包含选自SEQID No.1832-1841的序列，或在选自SEQ ID No.1832-1841的序列中包含的一个或多个修饰或置换的序列。CD3结合域的重链CDR3(HC CDR3)包含选自SEQ ID No.1842-1853的序列，或在选自SEQ ID No.1842-1853的序列中包含一个或多个修饰或置换的序列。CD3结合域的轻链CDR1(LC CDR1)包含选自SEQ ID No.1852-1864的序列，或在选自SEQ ID No.1852-1864的序列中包含一个或多个修饰或置换的序列。CD3结合域的轻链CDR2(LC CDR2)包含选自SEQ ID No.1865-1877的序列，或在选自SEQ ID No.1865-1877的序列中包含一个或多个修饰或置换的序列。CD3结合域的轻链CDR3(LC CDR3)包含选自SEQ ID No.1878-1884的序列，或在选自SEQ ID No.1878-1884的序列中包含一个或多个修饰或置换的序列。在一个实施方案中，人源化或人抗CD3结合域为scFv，并且包含本文所述氨基酸序列的轻链可变区经由scFv连接体附接至包含本文所述氨基酸序列的重链可变区。scFv的轻链可变区和重链可变区可以是例如以下方向中的任何一种：轻链可变区-scFv连接体-重链可变区或重链可变区-scFv连接体-轻链可变区。
在一些实例中，根据已知方法制备与CD3结合的scFv。例如，可通过利用柔性多肽连接体将VH和VL区连接在一起来产生scFv分子。该scFv分子包含具有优化的长度和/或氨基酸组成的scFv连接体(例如，Ser-Gly连接体)。因此，在一些实施方案中，该scFv连接体的长度使得VH或VL结构域可以与其他可变域进行分子间缔合，从而形成CD3结合位点。在某些实施方案中，这样的scFv连接体是“短的”，即，由0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11个或12个氨基残基组成。因此，在某些实例中，scFv连接体由约12个或更少的氨基酸残基组成。在0个氨基酸残基的情况下，该scFv连接体为肽键。在一些实施方案中，这些scFv连接体由约3个至约15个，例如8、9或10个连续氨基酸残基组成。关于scFv连接体的氨基酸组成，选择能赋予柔性、不干扰可变域以及允许链间折叠以使两个可变域一起形成功能性CD3结合位点的肽。例如，包含甘氨酸和丝氨酸残基的scFv连接体通常提供蛋白酶抗性。在一些实施方案中，scFv中的连接体包含甘氨酸和丝氨酸残基。该scFv连接体的氨基酸序列可通过例如噬菌体展示法进行优化，以改善scFv的CD3结合和产率。适合于连接scFv中可变轻链结构域和可变重链结构域的肽scFv连接体的实例包括但不限于(GS)n(SEQ ID No.1809)、(GGS)n(SEQ IDNo.1810)、(GGGS)n(SEQ ID No.1811)、(GGSG)n(SEQ ID No.1812)、(GGSGG)n(SEQ IDNo.1813)、(GGGGS)n)SEQ ID No.1814)、(GGGGG)n(SEQ ID No.1815)或(GGG)n(SEQ IDNo.1816)，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一个实施方案中，该scFv连接体可以是(GGGGS)4(SEQ ID No.1817)或(GGGGS)3(SEQ ID No.1818)。在一些实施方案中，连接体包含由SEQ ID No.1809-1818中所示连接体的任何组合组成的序列，并且在一些实例中，这样的连接体的长度为至多15个氨基酸，或长于15个氨基酸酸。连接体长度的变化可以保持或增强活性，从而在活性研究中产生优异的功效。
在一些实施方案中，DLL3靶向三特异性抗原结合蛋白的CD3结合域对表达CD3的细胞上的CD3具有亲和力，其KD为1000nM或更低、500nM或更低、200nM或更低、100nM或更低、80nM或更低、50nM或更低、20nM或更低、10nM或更低、5nM或更低、1nM或更低或0.5nM或更低。在一些实施方案中，DLL3靶向三特异性抗原结合蛋白的CD3结合域对CD3ε、CD3γ或CD3δ具有亲和力，其KD为1000nM或更低、500nM或更低、200nM或更低、100nM或更低、80nM或更低、50nM或更低、20nM或更低、10nM或更低、5nM或更低、1nM或更低或者0.5nM或更低。在进一步的实施方案中，DLL3靶向三特异性抗原结合蛋白的CD3结合域对CD3具有低亲和力，即，约100nM或更高。
与CD3结合的亲和力可通过例如DLL3靶向三特异性抗原结合蛋白本身或其CD3结合域与在测定板上包被的CD3、在微生物细胞表面上展示的CD3、溶液中的CD3等结合的能力来确定。本公开的DLL3靶向三特异性抗原结合蛋白本身或其CD3结合域与CD3的结合活性可如下测定：将配体(例如，CD3)或DLL3靶向三特异性抗原结合蛋白本身或其CD3结合域固定至珠子、基底、细胞等。可将试剂添加至合适的缓冲液中，并将结合配偶体在给定的温度下孵育一段时间。洗涤以去除未结合的物质后，可采用例如SDS、高pH缓冲液等释放结合的蛋白质，并通过例如表面等离子体共振(SPR)进行分析。
半衰期延长结构域
本文涉及延长抗原结合域的半衰期的结构域。预期这样的结构域包括但不限于白蛋白结合域、Fc结构域、小分子和本领域已知的其他半衰期延长结构域。
人白蛋白(ALB)(分子量为67kDa)是血浆中最丰富的蛋白质，以约50mg/ml(600μM)存在，并且在人体中具有大约20天的半衰期。ALB用来维持血浆pH，对胶体血压有贡献，起到许多代谢物和脂肪酸的载剂的作用，并且充当血浆中主要的药物转运蛋白。
与白蛋白的非共价缔合延长了短寿命蛋白质的消除半衰期。例如，与仅施用Fab片段相比，当分别静脉内施用于小鼠和兔时，白蛋白结合域与Fab片段的重组融合体导致25倍和58倍的体内清除率，以及26倍和37倍的半衰期延长。在另一个实例中，当用脂肪酸对胰岛素进行酰化以促进与白蛋白的缔合时，在兔或猪中皮下注射时观察到持久的效果。总之，这些研究证明了白蛋白结合与延长的作用之间存在联系。
在一方面，本文所述的DLL3靶向三特异性蛋白包含半衰期延长结构域，例如与ALB特异性结合的结构域。在一些实施方案中，DLL3靶向三特异性抗原结合蛋白的ALB结合域可以是与ALB结合的任何结构域，包括但不限于来自单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体的结构域。在一些实施方案中，该ALB结合域是对HSA具有特异性的单链可变片段(scFv)、单结构域抗体如重链可变域(VH)、轻链可变域(VL)和骆驼科来源的单结构域抗体的可变域(VHH)、肽、配体或小分子实体。在某些实施方案中，该ALB结合域是单结构域抗体。在其他实施方案中，该ALB结合域是肽。在进一步的实施方案中，该ALB结合域是小分子。在一些实施方案中，设想DLL3三特异性抗原结合蛋白的HSA结合域相当小，并且不超过25kD、不超过20kDa、不超过15kDa或不超过10kDa。在某些情况下，该ALB结合蛋白如果是肽或小分子实体，则为5kDa或更小。
DLL3靶向三特异性抗原结合蛋白的半衰期延长结构域导致DLL3靶向三特异性抗原结合蛋白本身的药效学和药代动力学改变。如上所述，半衰期延长结构域延长消除半衰期。半衰期延长结构域还改变药效学性质，包括三特异性抗原结合蛋白的组织分布、穿透和扩散的改变。在一些实施方案中，与没有半衰期延长结构域的蛋白质相比，半衰期延长结构域提供改善的组织(包括肿瘤)靶向、组织分布、组织穿透、组织内的扩散和增强的功效。在一个实施方案中，治疗方法有效且高效地利用减少量的三特异性抗原结合蛋白，从而导致副作用减小，如非肿瘤细胞的细胞毒性降低。
此外，可选择半衰期延长结构域的结合亲和力，以便针对特定三特异性抗原结合蛋白中的特定消除半衰期。因此，在一些实施方案中，该半衰期延长结构域具有高结合亲和力。在其他实施方案中，该半衰期延长结构域具有中等结合亲和力。在另外其他的实施方案中，该半衰期延长结构域具有低或微小的结合亲和力。示例性的结合亲和力包括10nM或更低(高)、10nM至100nM(中等)和大于100nM(低)的KD浓度。如上所述，通过已知方法如表面等离子体共振(SPR)测定与ALB的结合亲和力。在一些实施方案中，本文所述的ALB结合域包含单结构域抗体。
在一些实施方案中，半衰期延长结构域包含选自SEQ ID No.1769-1778的序列，或与选自SEQ ID No.1769-1778的序列至少约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％相同的序列。在一些实例中，所述半衰期延长结构域包含三个重链CDR(HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3)和三个轻链CDR。在一些实例中，所述半衰期延长结构域包含三个重链CDR(HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3)或三个轻链CDR。在一些实施方案中，半衰期延长结构域的重链CDR1(HC CDR1)包含选自SEQ ID No.1782-1784的序列，或在选自SEQ ID No.1782-1784的序列中包含一个或多个修饰或置换的序列，或至少约80％至约99％。在一些实施方案中，半衰期延长结构域的重链CDR2(HC CDR2)包含选自SEQID No.1785-1790的序列，或在选自SEQ ID No.1785-1790的序列中包含一个或多个修饰或置换的序列。CD3结合域的重链CDR3(HC CDR3)包含选自SEQ ID No.1791或1792的序列，或在选自SEQ ID No.1791或1792的序列中包含一个或多个修饰或置换的序列。
DLL3结合域
DLL3(也称为δ样配体3或SCDO1)是Notch DSL配体的δ样家族的成员。代表性的DLL3蛋白直向同源物包括但不限于人类(登录号NP_058637和NP_982353)、黑猩猩(登录号XP_003316395)、小鼠(登录号NP_031892)和大鼠(登录号NP_446118)。在人类中，DLL3基因由位于染色体19q13上，跨越9.5kbp的8个外显子组成。最后一个外显子内的可变剪接产生两个经加工的转录物，一个为2389个碱基(登录号NM_0l6941)，另一个为2052个碱基(登录号NM_203486)。前一个转录物编码618个氨基酸的蛋白质(登录号NP_058637)，而后者编码587个氨基酸的蛋白质(登录号NP_982353)。DLL3的这两种蛋白质同种型在其胞外域和跨膜域中共有100％的同一性，不同之处仅在于较长的同种型包含一个延伸的胞质尾，该尾在蛋白质的羧基末端包含另外32个残基。DLL3蛋白的胞外区包含六个EGF样结构域、单个DSL结构域和N末端结构域。通常，EGF结构域被识别为出现在大约氨基酸残基216-249(结构域1)、274-310(结构域2)、312-351(结构域3)、353-389(结构域4)、391-427(结构域5)和429-465(结构域6)处，其中DSL结构域位于hDLL3的大约氨基酸残基176-215处，N末端结构域位于hDLL3的大约氨基酸残基27-175处。每个EGF-样结构域、DSL结构域和N末端结构域均包含由不同的氨基酸序列定义的DLL3蛋白的一部分。在一些实施方案中，EGF样结构域被称为EGF1至EGF6，其中EGF1最接近蛋白质的N末端部分。通常，DSL配体由一系列结构域组成：独特的N末端结构域，其后是保守的DSL结构域、多个串联表皮生长因子(EGF)样重复、跨膜域和在配体之间并非高度保守的胞质域，但其中一个包含多个赖氨酸残基，这些赖氨酸残基是独特的E3泛素连接酶引起的泛素化的潜在位点。DSL结构域是简并的EGF结构域，对于与Notch受体的相互作用而言是必需的，但不是充分的。此外，大多数DSL配体的前两个EGF样重复包含较小的蛋白质序列基序，称为DOS结构域，该结构域在激活Notch信号传导时与DSL结构域协同作用。
在一些实施方案中，产生、制备、工程化或选择本文公开的DLL3三特异性结合蛋白，以便与DLL3蛋白内的所选结构域、基序或表位反应。在一些实施方案中，DLL3靶向三特异性蛋白与DSL结构域结合，并且在一些实施方案中，与DSL结构域内包含G203、R205、P206的表位结合。
在一些实施方案中，对本公开的DLL3靶向三特异性蛋白的结合域进行工程化制造和/或选择，以与DLL3的两种同种型或该蛋白的单一同种型反应，或者相反地，包含泛-DLL结合域，除了DLL3之外，它还与至少一个另外的DLL家族成员反应或缔合。在一些实施方案中，对DLL3结合域如DLL3结合域进行工程改造、制备和/或选择，使得它们与仅被DLL3展示的结构域(或其中的表位)反应，或与至少在一定程度上在多个或所有DLL家族成员之间保守的结构域反应。
在一些实施方案中，DLL3结合域与DLL3的特定表位、部分、基序或结构域缔合或结合。两种DLL3同种型均包含相同的胞外区，该区至少包含N末端结构域、DSL(Delta/Serrate/lag-2)结构域和六个EGF样结构域(即EGF1-EGF6)。因此，在某些实施方案中，DLL3结合域与DLL3的N末端结构域(成熟蛋白中的氨基酸27-175)结合或缔合，而在其他实施方案中，DLL3结合域与DSL结构域(氨基酸176-215)或其中的表位缔合。在本公开的其他方面，DLL3结合域与位于DLL3的特定EGF样结构域中的特定表位缔合或结合。在一些实施方案中，DLL3结合域与位于EGF1(氨基酸216-249)、EGF2(氨基酸274-310)、EGF3(氨基酸312-351)、EGF4(氨基酸353-389)、EGF5(氨基酸391-427)或EGF6(氨基酸429-465)中的表位缔合或结合。在一些实施方案中，每个上述结构域包含一个以上的表位和/或一个以上的箱元(bin)。在一些实施方案中，DLL3结合域与DSL结构域或其中的表位结合、反应或缔合。在其他实施方案中，DLL3结合域与特定EGF样结构域或其中的表位结合、反应或缔合。在一些实施方案中，DLL3结合域与N末端结构域或其中的表位结合、反应或缔合。
在一些实施方案中，本公开的DLL3结合蛋白，如本公开的三特异性蛋白的DLL3结合域，与全长DLL3蛋白或其片段，如全长DLL3蛋白内包含表位的片段结合，如上所述。在一些情况下，包含表位的片段包含DLL3蛋白的抗原性或免疫原性片段及其衍生物。在一些实施方案中，包含抗原决定基的片段，包括抗原性或免疫原性片段，为12个氨基酸或更多，20个氨基酸或更多，50或100个氨基酸或更多。在一些实施方案中，DLL3片段占完整蛋白质长度的95％或更多，完整蛋白质长度的90％或更多，75％或50％或25％或10％或更多。在一些实施方案中，DLL3的包含表位的片段，包括抗原性或免疫原性片段，能够在患者中引发相关的免疫应答。在一些实施方案中，DLL3的衍生物包括序列上的变体，其中已对SEQ IDNo.1885(UniProtKB登录Q9NYJ7)中提供的DLL3序列已进行了一个或多个(例如1-20个，如15个氨基酸，或基于蛋白质总长按氨基酸数目计最多20％，如最多10％或5％或1％)缺失、插入或置换。在一些实施方案中，置换包括保守置换。在一些实例中，DLL3的衍生物和变体与它们所衍生自的DLL3蛋白具有基本相同的生物学功能。例如，在一些情况下，DLL3的衍生物和变体与它们所衍生自的蛋白质具有相当的抗原性或免疫原性，具有它们所衍生自的蛋白质的配体结合活性或活性受体复合物形成能力，或者优选地两者兼具，并且具有与DLL3相同的组织分布。
本文所述的DLL3靶向三特异性蛋白的设计允许DLL3结合域为柔性的，因为该DLL3结合域可以是任何类型的结合域，包括但不限于来自单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体的结构域。在一些实施方案中，该DLL3结合域是单链可变片段(scFv)、单结构域抗体，如重链可变域(VH)、轻链可变域(VL)和骆驼科来源的单结构域抗体的可变域(VHH)。在其他实施方案中，该DLL3结合域为非Ig结合域，即，抗体模拟物，如anticalins、affilins、affibody分子、affimers、affitins、alphabodies、avimers、DARPins、fynomers、kunitz结构域肽和单抗体(monobodies)。在进一步的实施方案中，该DLL3结合域为与DLL3结合或缔合的配体或肽。在更进一步的实施方案中，该DLL3结合域为knottin。在更进一步的实施方案中，该DLL3结合域为小分子实体。
在一些实施方案中，所述DLL3结合域与包含SEQ ID No.1885(UniProtKB登录Q9NYJ7)的序列的蛋白质结合。在一些实施方案中，该DLL3结合域与包含与SEQ ID No.1885(UniProtKB登录Q9NYJ7)相比截短的序列的蛋白质结合。在一些实施方案中，DLL3结合域与包含SEQ ID No.1892或SEQ ID No.1893的序列(其为DLL3蛋白的成熟胞外域)的蛋白质结合。在一些实施方案中，DLL3结合域与包含SEQ ID No.1892的氨基酸47-492的蛋白质结合。在一些实施方案中，DLL3结合域识别SEQ ID No.1892的氨基酸47-4492内的表位。
在一些实施方案中，所述DLL3结合域是抗DLL3抗体或抗体变体。如本文所用的，术语“抗体变体”是指本文所述抗体的变体和衍生物。在某些实施方案中，涉及本文所述的抗DLL3抗体的氨基酸序列变体。例如，在某些实施方案中，预期本文所述的抗DLL3抗体的氨基酸序列变体改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学性质。用于制备氨基酸变体的示例性方法包括但不限于将适当的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中，或者通过肽合成。这类修饰包括，例如，抗体的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或置换。
可进行缺失、插入和置换的任意组合以得到最终构建体，条件是最终构建体具有期望的特性，抗原结合。在某些实施方案中，提供了具有一个或多个氨基酸置换的抗体变体。用于置换诱变的感兴趣的位点包括CDR和框架区。以下描述了此类置换的实例。可将氨基酸置换引入感兴趣的抗体中，并针对所需活性、保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性或改善的T细胞介导的细胞毒性(TDCC)来筛选产物。保守和非保守的氨基酸置换均考虑用于制备抗体变体。
在用来产生变异抗DLL3抗体的置换的另一个实例中，亲本抗体的一个或多个高变区残基被置换。通常，之后基于与亲本抗体相比的所需性质的改善，例如，增加的亲和力、降低的亲和力、降低的免疫原性、增加的结合的pH依赖性来选择变体。
在一些实施方案中，所述DLL3靶向三特异性蛋白的DLL3结合域是单结构域抗体，诸如对DLL3具有特异性的重链可变域(VH)、美洲驼(llama)来源的sdAb的可变域(VHH)、肽、配体或小分子实体。在一些实施方案中，本文所述的DLL3靶向三特异性蛋白的DLL3结合域是与DLL3结合的任何结构域，包括但不限于来自单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体的结构域。在某些实施方案中，该DLL3结合域为单结构域抗体。在其他实施方案中，该DLL3结合域为肽。在进一步的实施方案中，该DLL3结合域为小分子。
通常，应当注意，本文中以其最广泛的含义使用的术语单结构域抗体不限于特定的生物学来源或特定的制备方法。单结构域抗体是其互补决定区是单结构域多肽的一部分的抗体。实例包括但不限于重链抗体、天然不含轻链的抗体、衍生自常规4链抗体的单结构域抗体、工程抗体以及与衍生自抗体的那些不同的单结构域支架。单结构域抗体可以是本领域的任何单结构域抗体，或任何未来的单结构域抗体。单结构域抗体可来源于任何物种，包括但不限于小鼠、人、骆驼、美洲驼、山羊、兔、牛。例如，在一些实施方案中，通过以下方法获得本公开的单结构域抗体：(1)通过分离天然存在的重链抗体的VHH结构域；(2)通过表达编码天然存在的VHH结构域的核苷酸序列；(3)通过天然存在的VHH结构域的“人源化”或通过表达编码这样的人源化VHH结构域的核酸；(4)通过来自任何动物物种，特别是来自哺乳动物物种，如来自人类的天然存在的VH结构域的“骆驼化”，或通过表达编码这样的骆驼化VH结构域的核酸；(5)通过“结构域抗体”或“Dab”的“骆驼化”，或通过表达编码这样的骆驼化VH结构域的核酸；(6)通过使用合成或半合成技术制备蛋白质、多肽或其他氨基酸序列；(7)通过使用本领域已知的核酸合成技术制备编码单结构域抗体的核酸，然后表达由此获得的核酸；以及/或者(8)通过前述一种或多种的任意组合。
在一个实施方案中，单结构域抗体对应于针对DLL3的天然存在的重链抗体的VHH结构域。如本文进一步描述的，这样的VHH序列通常可以通过以下方法来生成或获得：用DLL3适当地免疫美洲驼物种(即，以产生针对DLL3的免疫应答和/或重链抗体)，获得来自所述美洲驼的合适的生物样品(如血液样品、血清样品或B细胞样品)，并使用本领域已知的任何合适技术从所述样品开始生成针对DLL3的VHH序列。
在另一个实施方案中，这类天然存在的针对DLL3的VHH结构域从骆驼科VHH序列的幼稚文库获得，例如通过使用本领域已知的一种或多种筛选技术使用DLL3或其至少一个部分、片段、抗原决定簇或表位筛查这样的文库。这类文库和技术例如在WO 99/37681、WO 01/90190、WO 03/025020和WO 03/035694中描述。或者，使用衍生自幼稚VHH文库的改进的合成或半合成文库，如通过诸如随机诱变和/或CDR改组等技术从幼稚VHH文库获得的VHH文库，例如WO 00/43507所述。
在进一步的实施方案中，又一种获得针对DLL3的VHH序列的技术涉及适当地免疫能够表达重链抗体的转基因哺乳动物(即，以产生针对DLL3的免疫应答和/或重链抗体)，从所述转基因哺乳动物获得合适的生物样品(如血液样品、血清样品或B细胞样品)，然后使用本领域已知的任何合适技术从所述样品开始生成针对DLL3的VHH序列。例如，为此目的，可以使用表达重链抗体的大鼠或小鼠以及在WO 02/085945和WO 04/049794中描述的其他方法和技术。
在一些实施方案中，所述DLL3靶向三特异性蛋白的抗DLL3单结构域抗体包括单结构域抗体，其具有对应于天然存在的VHH结构域的氨基酸序列的氨基酸序列，但是已经“人源化”，即通过用存在于来自人类的常规4链抗体(例如，如上所述)的VH结构域中相应位置处的一个或多个氨基酸残基替换所述天然存在的VHH序列(特别是框架序列中)的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基。这可以按本领域已知的方式进行，该方式对于本领域技术人员将会是显而易见的，例如基于本文的进一步描述。此外，应当注意，本公开的此类人源化抗DLL3单结构域抗体以本质上已知的任何合适的方式获得(即，如以上(1)-(8)点所示)，因此不严格限于使用包含天然存在的VHH结构域的多肽作为起始材料获得的多肽。在一些另外的实施方案中，如本文所述的单结构域抗DLL3抗体包括单结构域抗体，其具有对应于天然存在的VH结构域的氨基酸序列的氨基酸序列，但是已经“骆驼化”，即通过用存在于重链抗体的VHH结构域中的相应位置处的一个或多个氨基酸残基替换来自常规4链抗体的天然存在的VH结构域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基。此类“骆驼化”置换优选地在形成VH-VL界面和/或存在于VH-VL界面处的氨基酸位置处以及/或者在所谓的骆驼科标志残基处插入(参见例如WO 94/04678，以及Davies和Riechmann(1994和1996))。优选地，用作生成或设计骆驼化单结构域的起始材料或起始点的VH序列优选地是来自哺乳动物的VH序列，更优选地是人类的VH序列，如VH3序列。然而，应当注意，在某些实施方案中，本公开的此类骆驼化抗DLL3单结构域抗体以本领域已知的任何合适的方式获得(即，如以上(1)-(8)点所示)，因此不严格限于使用包含天然存在的VH结构域的多肽作为起始材料获得的多肽。例如，如本文进一步描述的，“人源化”和“骆驼化”均通过分别提供编码天然存在的VHH结构域或VH结构域的核苷酸序列，然后分别以新核苷酸序列编码“人源化”或“骆驼化”单结构域抗体的方式改变所述核苷酸序列中的一个或多个密码子来进行。然后可以表达该核酸，以提供本公开的期望的抗DLL3单结构域抗体。或者，在其他实施方案中，分别基于天然存在的VHH结构域或VH结构域的氨基酸序列，分别设计本公开的期望的人源化或骆驼化抗DLL3单结构域抗体的氨基酸序列，然后使用已知的肽合成技术从头合成。在一些实施方案中，分别基于天然存在的VHH结构域或VH结构域的氨基酸序列或核苷酸序列，分别设计编码本公开的期望的人源化或骆驼化抗DLL3单结构域抗体的核苷酸序列，然后使用已知的核酸合成技术从头合成，之后使用已知的表达技术表达由此获得的核酸，以提供本公开的期望的抗DLL3单结构域抗体。
用于从天然存在的VH序列或VHH序列开始获得本公开的抗DLL3单结构域抗体和/或编码该抗BCMA单结构域抗体的核酸的其他合适方法和技术包括例如以合适的方式组合一个或多个天然存在的VH序列(诸如一个或多个框架(FR)序列和/或互补决定区(CDR)序列)的一个或多个部分、一个或多个天然存在的VHH序列(诸如一个或多个FR序列或CDR序列)的一个或多个部分以及/或者一个或多个合成或半合成序列，以提供本公开的抗DLL3单结构域抗体或编码该抗BCMA单结构域抗体的核苷酸序列或核酸。
在一些实施方案中，所述DLL3结合域是抗DLL3特异性抗体，其包含重链可变互补决定区CDR1、重链可变CDR2、重链可变CDR3、轻链可变CDR1、轻链可变CDR2和轻链可变CDR3。在一些实施方案中，该DLL3结合域包含与DLL3结合的任何结构域，包括但不限于来自以下的结构域：单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体，或者抗原结合片段如单结构域抗体(sdAb)、Fab、Fab'、F(ab)2和Fv片段，由一个或多个CDR组成的片段、单链抗体(例如，单链Fv片段(scFv))、二硫键稳定的Fv(dsFv)片段、异缀合抗体(例如，双特异性抗体)、pFv片段、重链单体或二聚体、轻链单体或二聚体，以及由一条重链和一条轻链组成的二聚体。在一些实施方案中，该DLL3结合域为单结构域抗体。在一些实施方案中，抗DLL3单结构域抗体包含重链可变互补决定区(CDR)，CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，所述DLL3结合域是包含氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列由被三个互补决定区/序列中断的四个框架区/序列(f1-f4)组成，如下式所示：f1-r1-f2-r2-f3-r3-f4，其中r1、r2和r3分别是互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，并且f1、f2、f3和f4是框架残基。本公开的DLL3结合蛋白的框架残基包含例如75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93或94个氨基酸残基，并且互补决定区包含例如24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个氨基酸残基。在一些实施方案中，该DLL3结合域包含选自SEQID No.1-442和1886的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述DLL3结合域的CDR1包含选自SEQ ID No.443-884和1887的序列，或相对于选自SEQ ID No.443-884和1887的序列的一个或多个氨基酸置换。在一些实施方案中，CDR2包含选自SEQ ID No.885-1326和1888的序列，或相对于选自SEQ ID No.885-1326和1888的序列的一个或多个氨基酸置换。在一些实施方案中，所述CDR3包含选自SEQ ID No.1327-1768和1889的序列，或相对于选自SEQ IDNo.1327-1768和1889的序列的一个或多个置换。
在一些实施方案中，所述CDR1包含选自SEQ ID No.443-884和1887的氨基酸序列，或在选自SEQ ID No.443-884和1887的氨基酸中具有一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸置换的变体。在一些实施方案中，所述CDR2包含选自SEQ IDNo.885-1326和1888的氨基酸序列，或在选自SEQ ID No.885-1326和1888的氨基酸序列中具有一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸置换的变体。在一些实施方案中，所述CDR3包含选自SEQ ID No.1327-1768和1889的氨基酸序列，或在选自SEQID No.1327-1768和1889的序列中具有一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸置换的变体。
在一些实施方案中，所述CDR1包含选自SEQ ID No.495-528的氨基酸序列，或在选自SEQ ID No.495-528的氨基酸中具有一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸置换的变体。在一些实施方案中，所述CDR2包含选自SEQ ID No.937-970的氨基酸序列，或在选自SEQ ID No.937-970的氨基酸序列中具有一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸置换的变体。在一些实施方案中，所述CDR3包含选自SEQ ID No.1379-1412的氨基酸序列，或在选自SEQ ID No.1379-1412的序列中具有一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸置换的变体。
在一些实施方案中，所述CDR1包含选自SEQ ID No.529-809的氨基酸序列，或在选自SEQ ID No.529-809的氨基酸中具有一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸置换的变体。在一些实施方案中，所述CDR2包含选自SEQ ID No.971-1251的氨基酸序列，或在选自SEQ ID No.971-1251的氨基酸序列中具有一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸置换的变体。在一些实施方案中，所述CDR3包含选自SEQ ID No.1379-1412的氨基酸序列，或在选自SEQ ID No.1379-1412的序列中具有一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸置换的变体。
在一些实施方案中，所述CDR1包含选自SEQ ID No.810-884的氨基酸序列，或在选自SEQ ID No.810-884的氨基酸中具有一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸置换的变体。在一些实施方案中，所述CDR2包含选自SEQ ID No.1252-1326的氨基酸序列，或在选自SEQ ID No.1252-1326的氨基酸序列中具有一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸置换的变体。在一些实施方案中，所述CDR3包含选自SEQ ID No.1692-1768的氨基酸序列，或在选自SEQ ID No.1692-1768的序列中具有一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸置换的变体。
在各个实施方案中，本公开的DLL3结合域与选自SEQ ID No.1-442和1886的氨基酸序列至少约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％相同。在各个实施方案中，本公开的DLL3结合域与选自SEQ ID No.53-86的氨基酸序列至少约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％相同。
在各个实施方案中，本公开的DLL3结合域与选自SEQ ID No.87-367的氨基酸序列至少约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％相同。
在各个实施方案中，本公开的DLL3结合域与SEQ ID No.68或由SEQ ID No.68衍生的序列至少约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％相同。
在各个实施方案中，本公开的DLL3结合域与SEQ ID No.75或由SEQ ID No.75衍生的序列至少约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％相同。
在一些实施方案中，所述DLL3靶向三特异性结合蛋白的DLL3结合域与人和食蟹猴DLL3具有交叉反应性。在一些实施方案中，该DLL3结合域对人DLL3是特异性的。在某些实施方案中，本文公开的DLL3结合域以人Kd(hKd)与人DLL3结合。在某些实施方案中，本文公开的DLL3结合域以食蟹猴Kd(cKd)与食蟹猴DLL3结合。在某些实施方案中，本文公开的DLL3结合域分别以食蟹猴Kd(cKd)和人Kd(hKd)与食蟹猴DLL3和人DLL3结合。在一些实施方案中，该DLL3结合蛋白以相当的结合亲和力(即，hKd和cKd值相差不超过±10％)与人和食蟹猴DLL3结合。在一些实施方案中，所述hKd和cKd在约0.001nM至约500nM的范围内。在一些实施方案中，所述hKd和cKd在约0.001nM至约450nM的范围内。在一些实施方案中，所述hKd和cKd在约0.001nM至约400nM的范围内。在一些实施方案中，所述hKd和cKd在约0.001nM至约350nM的范围内。在一些实施方案中，所述hKd和cKd在约0.001nM至约300nM的范围内。在一些实施方案中，所述hKd和cKd在约0.001nM至约250nM的范围内。在一些实施方案中，所述hKd和cKd在约0.001nM至约200nM的范围内。在一些实施方案中，所述hKd和cKd在约0.001nM至约150nM的范围内。在一些实施方案中，所述hKd和cKd在约0.001nM至约100nM的范围内。在一些实施方案中，所述hKd和cKd在约0.1nM至约90nM的范围内。在一些实施方案中，所述hKd和cKd在约0.2nM至约80nM的范围内。在一些实施方案中，所述hKd和cKd在约0.3nM至约70nM的范围内。在一些实施方案中，所述hKd和cKd在约0.4nM至约50nM的范围内。在一些实施方案中，所述hKd和cKd在约0.5nM至约30nM的范围内。在一些实施方案中，所述hKd和cKd在约0.6nM至约10nM的范围内。在一些实施方案中，所述hKd和cKd在约0.7nM至约8nM的范围内。在一些实施方案中，所述hKd和cKd在约0.8nM至约6nM的范围内。在一些实施方案中，所述hKd和cKd在约0.9nM至约4nM的范围内。在一些实施方案中，所述hKd和cKd在约1nM至约2nM的范围内。
在某些实施方案中，本公开的DLL3结合域相对于可溶性DLL3优先结合膜结合的DLL3。膜结合的DLL3是指在表达DLL3的细胞的细胞膜表面之中或之上存在DLL3。可溶性DLL3是指不再存在于正表达或已表达DLL3的细胞的细胞膜表面之中或之上的DLL3。在某些情况下，可溶性DLL3存在于受试者的血液和/或淋巴循环中。在一个实施方案中，所述DLL3结合蛋白与膜结合的DLL3的结合至少是与可溶性DLL3的结合的5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、100倍、500倍或1000倍。在一个实施方案中，本公开的抗原结合蛋白优先结合膜结合的DLL3，是与可溶性DLL3的结合的30倍。使用本领域公知的测定可以容易地确定抗原结合蛋白与膜结合的DLL3相对于可溶性DLL3的优先结合。
在一些实施方案中，任何前述DLL3结合域(例如，SEQ ID NO.1-442和1886的抗DLL3单结构域抗体)是为了易于纯化而标记的亲和肽。在一些实施方案中，亲和肽标签是六个连续的组氨酸残基，也称为6X-his(SEQ ID No.1819)。
在一些实施方案中，任何前述DLL3结合域(例如，SEQ ID NO.1-442和1886的抗DLL3单结构域抗体)是为了易于纯化而标记的亲和肽。在一些实施方案中，亲和肽标签是六个连续的组氨酸残基，也称为6X-his(SEQ ID No.1819)。
向嵌合抗原受体(CAR)中的整合
在某些实例中，本公开的DLL3靶向三特异性抗原结合蛋白可以并入嵌合抗原受体(CAR)中。工程化的免疫效应细胞、T细胞或NK细胞可以用来表达CAR，该CAR包括本文所述的含有抗DLL3单结构域抗体的抗DLL3靶向三特异性蛋白。在一个实施方案中，包括本文所述的抗DLL3靶向三特异性蛋白的CAR经由铰链区连接至跨膜域，并进一步连接至共刺激域，获自OX40、CD27、CD28、CD5、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)或4-1BB的功能性信号传导域。在一些实施方案中，该CAR进一步包含编码细胞内信号传导域如4-1BB和/或CD3ζ的序列。
肿瘤生长减少性质
在某些实施方案中，当施用于具有表达DLL3的肿瘤细胞的受试者时，本公开的DLL3靶向三特异性蛋白在体内减少肿瘤细胞的生长。肿瘤细胞生长减少的测量可以通过本领域公知的多种不同方法来确定。非限制性实例包括直接测量肿瘤尺寸，测量切除的肿瘤块并与对照对象进行比较，通过可能使用或可能不使用同位素或发光分子(例如萤光素酶)增强分析的成像技术(例如CT或MRI)进行测量，等等。
在特定实施方案中，与对照抗原结合剂相比，本公开的三特异性蛋白的施用导致肿瘤细胞的体内生长减少至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，肿瘤生长减少约100％表明完全反应和肿瘤消失。在进一步的实施方案中，与对照抗原结合剂相比，本公开的三特异性蛋白的施用导致肿瘤细胞的体内生长减少约50-100％、约75-100％或约90-100％。在进一步的实施方案中，与对照抗原结合剂相比，本公开的三特异性蛋白的施用导致肿瘤细胞的体内生长减少约50-60％、约60-70％、约70-80％、约80-90％或约90-100％。
DLL3靶向三特异性蛋白修饰
本文所述的DLL3靶向三特异性蛋白包括衍生物或类似物，其中(i)氨基酸被不是由遗传密码编码的氨基酸残基置换，(ii)成熟多肽与另一化合物如聚乙二醇融合，或(iii)额外的氨基酸与该蛋白质融合，如前导序列或分泌序列或用于纯化该蛋白质的序列。
典型的修饰包括但不限于乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价附接、血红素部分的共价附接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价附接、脂质或脂质衍生物的共价附接、磷脂酰肌醇的共价附接、交联、环化、二硫键形成、脱甲基化、共价交联的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、转移RNA介导的向蛋白质添加氨基酸，如精氨酰化和泛素化。
在本文所述的DLL3靶向三特异性蛋白中的任何位置进行修饰，所述位置包括肽骨架、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。可用于修饰DLL3靶向三特异性蛋白的某些常见肽修饰包括糖基化、脂质附接、硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧化、羟基化、多肽中的氨基或羧基或两者被共价修饰的封闭，以及ADP-核糖基化。
在一些实施方案中，如本文所述的DLL3靶向三特异性蛋白的衍生物包含免疫反应性调节剂衍生物和包含一个或多个修饰的抗原结合分子。
在一些实施方案中，本公开的三特异性DLL3结合分子是单价或多价、二价、三价等。如本文所用的，术语“价”是指与抗体相关的潜在靶标结合位点的数目。每个靶结合位点特异性结合一个靶分子或靶分子上的特定位置或座位。当抗体为单价时，分子的每个结合位点将特异性结合一个抗原位置或表位。当抗体包含一个以上的靶结合位点(多价)时，每个靶标结合位点可以特异性结合相同或不同的分子(例如，可以结合不同的配体或不同的抗原，或相同抗原上的不同表位或位置)。
在一些实施方案中，本公开的DLL3靶向三特异性蛋白尤其包含一个或多个另外的氨基酸残基置换、突变和/或修饰，其导致具有优选特性的化合物，所述特性包括但不限于：改变的药代动力学、增加的血清半衰期、增加的结合亲和力、降低的免疫原性、增加的产量、改变的Fc配体与Fc受体(FcR)的结合、增强或降低的“ADCC”(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)或“CDC”(补体依赖性细胞毒性)活性、改变的糖基化和/或二硫键以及改变的结合特异性。在一些情况下，这些DLL3靶向三特异性蛋白变体有利地用于增强所公开的DLL3靶向三特异性蛋白的有效抗肿瘤性质。
在一些实施方案中，本公开的DLL3靶向三特异性蛋白在哺乳动物如人或食蟹猴中的半衰期为少于约5天、约5天、长于约5天、长于10天、长于约15天、长于约20天、长于约25天、长于约30天、长于约35天、长于约40天、长于约45天、长于约2个月、长于约3个月、长于约4个月或长于约5个月。在一些情况下，延长的半衰期导致较高的血清滴度，从而降低DLL3靶向三特异性蛋白的给药频率，降低待施用的抗体的浓度，或两者兼具。
另外其他的实施方案包括一种或多种工程化糖型，即，包含共价连接于该蛋白的改变的糖基化模式或改变的碳水化合物组成的DLL3靶向三特异性结合蛋白。在一些情况下，工程化糖型可用于多种目的，包括但不限于增强或降低效应物功能、增加三特异性蛋白对靶标的亲和力或促进三特异性蛋白的产生。在需要降低效应物功能的某些实施方案中，将分子工程改造成表达无糖基化形式。在一些实施方案中包括导致消除一个或多个可变区框架糖基化位点从而消除该位点处的糖基化的置换。相反，在一些情况下，通过在一个或多个另外的糖基化位点进行工程改造，将增强的效应物功能或改善的结合赋予本公开的包含Fc的三特异性蛋白。
在一些情况下，DLL3靶向三特异性蛋白在生产过程中或之后通过糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、采用已知保护基/封闭基团衍生化、蛋白水解切割、与抗体分子或其他细胞配体的连接等进行差异修饰。通过技术进行多种化学修饰中的任何一种，这些技术包括但不限于通过以下试剂进行特异性化学切割：溴化氰、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、V8蛋白酶、NaBH4、乙酰化、甲酰化、氧化、还原、在衣霉素存在下的代谢合成等。
本公开还涵盖的各种翻译后修饰包括，例如，N-连接或O-连接的碳水化合物链、N末端或C末端的加工、化学部分与氨基酸骨架的连接、N连接的或O连接的碳水化合物链的化学修饰，以及作为原核宿主细胞表达的结果，N末端甲硫氨酸残基的添加或缺失。此外，在一些情况下，用可检测标记如酶、荧光、放射性标记或亲和标记修饰DLL3靶向三特异性结合蛋白，以允许检测和分离调节剂。
编码DLL3靶向三特异性蛋白的多核苷酸
在一些实施方案中，还提供了编码本文所述的抗DLL3三特异性结合蛋白的多核苷酸分子。在一些实施方案中，该多核苷酸分子以DNA构建体的形式提供。在其他实施方案中，该多核苷酸分子以信使RNA转录物的形式提供。
所述多核苷酸分子通过已知方法构建，例如通过将编码由肽连接体隔开，或在其他实施方案中通过肽键直接连接的三个结合域的基因组合到单个基因构建体中，该单个基因构建体与合适的启动子以及可选的合适的转录终止子可操作地连接，并且将其在细菌或其他适当的表达系统例如CHO细胞中表达。在DLL3结合域为小分子的实施方案中，多核苷酸含有编码CD3结合域和半衰期延长结构域的基因。在半衰期延长结构域为小分子的实施方案中，多核苷酸含有编码与CD3和DLL3结合的结构域的基因。根据所采用的载体系统和宿主，可使用任何数目的合适的转录和翻译元件，包括组成型和诱导型启动子。选择启动子，以使其驱动多核苷酸在相应宿主细胞中的表达。
在一些实施方案中，将所述多核苷酸插入载体中，优选表达载体中，这代表进一步的实施方案。该重组载体可根据已知方法来构建。特别感兴趣的载体包括质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、病毒(virii)(例如，逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、慢病毒等)和粘粒。
可利用多种表达载体/宿主系统，以包含并表达编码所述三特异性抗原结合蛋白的多肽的多核苷酸。表达载体的实例是用于在大肠杆菌中表达的pSKK(Le Gall等人,JImmunol Methods.(2004)285(1):111-27)，或用于在哺乳动物细胞中表达的pcDNA5(Invitrogen)。
因此，在一些实施方案中，如本文所述的DLL3靶向三特异性蛋白通过以下步骤产生：将编码如上所述蛋白质的载体引入宿主细胞中，并在允许蛋白质结构域表达的条件下培养所述宿主细胞，可将其分离并任选地进一步纯化。
药物组合物
在一些实施方案中，还提供了药物组合物，其包含本文所述的抗DLL3三特异性结合蛋白、包含编码该DLL3靶向三特异性蛋白的多肽的多核苷酸的载体或被该载体转化的宿主细胞，以及至少一种药学上可接受的载剂。术语“药学上可接受的载剂”包括但不限于不干扰成分的生物活性的有效性且对所施用的患者无毒的任何载剂。合适的药物载剂的实例是本领域公知的，并且包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液如水包油乳液、各种类型的润湿剂、无菌溶液等。这样的载剂可通过常规方法配制，并且可以以合适的剂量施用于受试者。优选地，该组合物是无菌的。这些组合物还可含有辅料如防腐剂、乳化剂和分散剂。可通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂来确保阻止微生物的作用。另一个实施方案提供了一种或多种上述DLL3靶向三特异性蛋白，其以冻干形式包装或包装在水性介质中。
在药物组合物的一些实施方案中，本文所述的DLL3靶向三特异性蛋白被包封在纳米颗粒中。在一些实施方案中，该纳米颗粒是富勒烯、液晶、脂质体、量子点、超顺磁纳米颗粒、树状聚体或纳米棒。在药物组合物的其他实施方案中，将DLL3靶向三特异性蛋白附接至脂质体。在一些情况下，DLL3靶向三特异性蛋白与脂质体表面缀合。在一些情况下，DLL3靶向三特异性蛋白被包封在脂质体的壳内。在一些情况下，该脂质体为阳离子脂质体。
本文所述的DLL3靶向三特异性蛋白被考虑用作药物。给药通过不同方式，通过静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、局部或真皮内给药来实现。在一些实施方案中，给药途径取决于疗法的种类和药物组合物中包含的化合物的种类。给药方案将由主治医师根据其他临床因素来确定。对于任何一名患者的剂量依赖于许多因素，包括患者体型、体表面积、年龄、性别、待施用的具体化合物、给药时间和途径、疗法的种类、总体健康和其他同时施用的药物。“有效剂量”是指活性成分的量，该量足以影响疾病的病程和严重程度，从而导致这种病理学的减轻或缓解，并且可使用已知方法来确定。
在一些实施方案中，本公开的DLL3靶向三特异性蛋白以至多10mg/kg的剂量以每周一次的频率施用。在一些情况下，剂量范围为约1ng/kg至约10mg/kg。在一些实施方案中，该剂量为约1ng/kg至约10ng/kg、约5ng/kg至约15ng/kg、约12ng/kg至约20ng/kg、约18ng/kg至约30ng/kg、约25ng/kg至约50ng/kg、约35ng/kg至约60ng/kg、约45ng/kg至约70ng/kg、约65ng/kg至约85ng/kg、约80ng/kg至约1μg/kg、约0.5μg/kg至约5μg/kg、约2μg/kg至约10μg/kg、约7μg/kg至约15μg/kg、约12μg/kg至约25μg/kg、约20μg/kg至约50μg/kg、约35μg/kg至约70μg/kg、约45μg/kg至约80μg/kg、约65μg/kg至约90μg/kg、约85μg/kg至约0.1mg/kg、约0.095mg/kg至约10mg/kg。在一些情况下，该剂量为约0.1mg/kg至约0.2mg/kg、约0.25mg/kg至约0.5mg/kg、约0.45mg/kg至约1mg/kg、约0.75mg/kg至约3mg/kg、约2.5mg/kg至约4mg/kg、约3.5mg/kg至约5mg/kg、约4.5mg/kg至约6mg/kg、约5.5mg/kg至约7mg/kg、约6.5mg/kg至约8mg/kg、约7.5mg/kg至约9mg/kg或约8.5mg/kg至约10mg/kg。在一些实施方案中，给药频率约为少于每天一次、每隔一天一次、少于每天一次、每周两次、每周一次、7天一次、两周一次、两周一次、三周一次、每四周一次或每月一次。在一些情况下，给药频率为每周一次。在一些情况下，给药频率为每周一次，剂量最高为10mg/kg。在一些情况下，给药持续时间为约1天至约4周或更长。
治疗方法
在一些实施方案中，施用本公开的DLL3结合蛋白或DLL3靶向三特异性蛋白以治疗赘生性病况。在一些实施方案中，赘生性病况是良性或恶性的；实体瘤或其他血液肿瘤；并且在一些实施方案中，选自包括但不限于以下疾病的组：肾上腺肿瘤、与AIDS相关的癌症、肺泡软质部分肉瘤、星形细胞肿瘤、自主神经节肿瘤、膀胱癌(鳞状细胞癌和移行细胞癌)、囊胚腔病症、骨癌(釉质瘤、动脉瘤性骨囊肿、骨软骨瘤、骨肉瘤)、脑和脊髓癌、转移性脑瘤、乳腺癌(包括三阴性乳腺癌)、颈动脉体肿瘤、宫颈癌、软骨肉瘤、脊索瘤、嫌色性肾细胞癌癌、透明细胞癌、结肠癌、结直肠癌、皮肤良性纤维组织细胞瘤、增生性小圆形细胞肿瘤、室管膜瘤、上皮病症、尤因肿瘤、骨外粘液样软骨肉瘤、不完全性骨纤维生成、骨纤维结构发育不良、胆囊和胆管癌、胃癌、胃肠道、妊娠滋养细胞性疾病、生殖细胞肿瘤、腺体病症、头颈癌、下丘脑、肠癌、胰岛细胞瘤、卡波西肉瘤、肾癌(肾母细胞瘤、乳头状肾细胞癌)、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤、脂肪肉瘤/恶性脂肪瘤、肝癌(肝母细胞瘤、肝细胞癌)、淋巴瘤、肺癌(小细胞癌、腺癌、鳞状细胞癌、大细胞癌等)、巨噬细胞病症、髓母细胞瘤、黑素瘤、脑膜瘤、多发性内分泌瘤病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、神经母细胞瘤、神经内分泌肿瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳头状甲状腺癌、甲状旁腺肿瘤、儿科癌症、周围神经鞘瘤、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、前列腺癌、葡萄膜后黑素瘤(posterious unveal melanoma)、罕见血液系统病症、肾转移癌、杆状瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、皮肤癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、基质病症、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺转移癌和子宫癌(宫颈癌、子宫内膜癌和平滑肌瘤)。
在某些实施方案中，本公开的DLL3结合蛋白或DLL3靶向三特异性蛋白用作前线治疗，并施用于先前未接受过癌症治疗的受试者。在其他实施方案中，本公开的DLL3靶向三特异性蛋白用于治疗先前已经(用本公开的DLL3靶向三特异性蛋白或其他抗癌剂)治疗过，并且已经复发或确定对先前治疗为难治性的受试者。在一些实施方案中，本公开的DLL3靶向三特异性蛋白用于治疗患有复发性肿瘤的受试者。
在一些方面，施用本公开的DLL3结合蛋白或DLL3靶向三特异性蛋白以治疗包括实体瘤的增生性病症，包括但不限于肾上腺、肝、肾、膀胱、乳腺、胃、卵巢、宫颈、子宫、食道、结直肠、前列腺、胰腺、肺(小细胞和非小细胞)、甲状腺的癌、肉瘤、胶质母细胞瘤和各种头颈肿瘤。
在一些实施方案中，将本公开的DLL3结合蛋白或DLL3靶向三特异性蛋白施用于患有黑素瘤的受试者。在一些实施方案中，本公开的DLL3靶向三特异性蛋白用于诊断、监测、治疗或预防黑素瘤。如本文所用的，术语“黑素瘤”包括所有类型的黑素瘤，包括但不限于原发性黑素瘤、恶性黑素瘤、皮肤黑素瘤、皮肤外黑素瘤、浅表扩散性黑素瘤、类息肉黑素瘤、黑素癌、黑色素上皮瘤、黑色素肉瘤、原位黑素瘤、结节性恶性黑素瘤、雀斑样痣黑素瘤、恶性雀斑样痣黑素瘤、粘膜雀斑样痣黑素瘤、粘膜黑素瘤、肢端黑色素瘤、软组织黑素瘤、眼黑素瘤、侵袭性黑素瘤、家族性非典型性痣和黑素瘤(FAM-M)综合征、结缔组织增生性恶性黑素瘤或葡萄膜黑素瘤。
DLL3是有效的肿瘤标志物，可在多种不同的癌症中表达，并已发现与癌症干细胞相关。因此，在将本公开的DLL3结合蛋白或DLL3靶向三特异性蛋白并入到在淋巴细胞上表达的嵌合抗原受体中的一些实施方案中，所得的“DLL3致敏淋巴细胞”(例如，自然杀伤细胞或免疫特异性识别DLL3决定簇的T细胞)能够有效地引发针对异常DLL3阳性细胞(包括癌症干细胞)的免疫应答。这种有效消除致瘤“种子”细胞的能力通常对于降低肿瘤复发或转移的可能性至关重要。在一些实施方案中，此类DLL3致敏的淋巴细胞与其他治疗剂联合使用或作为遵循标准医护治疗的维持方案的一部分施用。
更一般地，嵌合抗原受体是含有或包含与信号传导域(例如，T细胞信号传导域或T细胞活化域)连接的抗体的抗原结合域的人工构建的杂合蛋白质或多肽。在一些实施方案中，包含本公开的DLL3靶向三特异性结合蛋白的CAR具有通过利用抗体或其抗原结合片段的抗原结合性质，以非MHC限制的方式将致敏淋巴细胞(例如T细胞)的特异性和反应性重引导至DLL3阳性靶细胞的能力。这种非MHC限制性抗原识别使表达DLL3 CAR的T细胞能够独立于抗原加工而识别致瘤性DLL3，从而绕开了肿瘤逃逸的主要机制。而且，当在T细胞中表达时，CAR不会有利地与内源性T细胞受体(TCR)α和β链发生二聚化。
在选定的方面，将本公开的DLL3结合蛋白或DLL3靶向三特异性蛋白并入嵌合抗原受体(CAR)中，并且以有效治疗肺癌的基于CAR的疗法施用DLL3 CAR，包括以下亚型：小细胞肺癌、非小细胞肺癌(例如鳞状细胞非小细胞肺癌或鳞状细胞小细胞肺癌)和大细胞神经内分泌癌(LCNEC)。
在一些实施方案中，将DLL3结合蛋白或DLL3敏感性淋巴细胞施用于表现出有限阶段疾病或广泛阶段疾病的患者。在其他实施方案中，将公开的DLL3靶向三特异性抗体施用于难治性患者(即，在完成初始治疗过程中或之后不久疾病复发的患者)；敏感患者(即复发时间长于初级治疗后2-3个月的患者)；或对铂类药物(例如卡铂、顺铂、奥沙利铂)和/或紫杉烷(例如多西他赛、紫杉醇、拉罗他赛或卡巴他赛)表现出抗药性的患者。在另一个实施方案中，公开的DLL3 CAR治疗有效地治疗卵巢癌，包括卵巢浆液性癌和卵巢乳头状浆液性癌。
在一些实施方案中，所公开的DLL3结合蛋白或DLL3靶向三特异性结合蛋白用于预防、治疗或诊断具有神经内分泌特征或表型的肿瘤，包括神经内分泌肿瘤。由分散的内分泌系统引起的真正的或规范的神经内分泌肿瘤(NET)相对较少，每100,000人中有2-5例发病，但侵袭性很高。神经内分泌肿瘤发生在肾脏、泌尿生殖道(膀胱、前列腺、卵巢、宫颈和子宫内膜)、胃肠道(结肠、胃)、甲状腺(甲状腺髓样癌)和肺(小细胞肺癌和大细胞神经内分泌癌)。这些肿瘤可能分泌几种激素，包括5-羟色胺和/或嗜铬粒蛋白A，这些激素会引起使人衰弱的症状，被称为类癌综合征。此类肿瘤可由阳性免疫组织化学标记物如神经元特异性烯醇化酶(NSE，也称为γ烯醇化酶，基因符号＝ENO2)、CD56(或NCAM1)、嗜铬粒蛋白A(CHGA)和突触素(SYP)或已知表达升高的基因如ASCL1来指示。传统的化学疗法在治疗神经内分泌肿瘤方面并不是特别有效，肝转移是常见的结局。在一些实施方案中，所公开的DLL3靶向三特异性抗体有利地用于治疗神经内分泌肿瘤，并且在一些实施方案中，它们用于治疗、预防或诊断在基因型或表型上模拟、类似于标准神经内分泌肿瘤或与其表现出共同特征的伪神经内分泌肿瘤(pNET)。伪神经内分泌肿瘤或具有神经内分泌特征的肿瘤是由弥漫性神经内分泌系统的细胞或其中神经内分泌分化级联在致癌过程中已异常重激活的细胞引起的。此类pNET与传统定义的神经内分泌肿瘤共有某些表型或生化特性，包括产生生物活性胺、神经递质和肽激素子集的能力。从组织学上讲，此类肿瘤(NET和pNET)具有共同的外观，通常表现为紧密连接的小细胞，具有极少的温和细胞病理学的细胞质，并呈圆形至卵圆形点状核。在本公开的一些实施方案中，用来定义神经内分泌和伪神经内分泌肿瘤的共同表达的组织学标记或遗传标记包括但不限于嗜铬粒蛋白A、CD56、突触素、PGP9.5、ASCL1和神经元特异性烯醇化酶(NSE)。因此，在一些实施方案中，本公开的DLL3靶向三特异性蛋白、DLL3CAR或DLL3致敏淋巴细胞或其任何组合有益地用于治疗伪神经内分泌肿瘤和规范性神经内分泌肿瘤，例如用于治疗在肾脏、泌尿生殖道(膀胱、前列腺、卵巢、宫颈和子宫内膜)、胃肠道(结肠、胃)、甲状腺(甲状腺髓样癌)和肺(小细胞肺癌和大细胞神经内分泌癌)中发生的神经内分泌肿瘤(NET和pNET)。此外，在一些实施方案中，本公开的DLL3靶向三特异性蛋白、DLL3 CAR或DLL3致敏淋巴细胞或其任何组合用于治疗表达一种或多种标志物例如NSE、CD56、突触素、嗜铬粒蛋白A、ASCL1或PGP9.5(ETCHL1)的肿瘤。在一些实施方案中，本公开的DLL3靶向三特异性蛋白、DLL3 CAR或DLL3致敏淋巴细胞或其任何组合用于治疗患有NSE+或CD56+或PGP9.5+或ASCL1+或SYP+或CHGA+或其任何组合的肿瘤的受试者。
在另一个实施方案中，本公开的DLL3靶向三特异性蛋白、DLL3 CAR或DLL3致敏的淋巴细胞或其任何组合被用于维持治疗中，以减少或消除疾病初次出现后肿瘤复发的机会。在一些情况下，该疾病已得到治疗，并且最初的肿瘤块已消除、减轻或以其他方式得到改善，因此患者无症状或处于缓解状态。在此时，向受试者施用药学有效量的所公开的DLL3结合蛋白、本公开的DLL3靶向三特异性蛋白、DLL3CAR或DLL3致敏的淋巴细胞或其任何组合一次或多次，无论是否存在很少的或根本没有在使用标准诊断程序的疾病适应症。在一些实施方案中，在一段时间内以有规律的时间表，例如每周、每两周、每月、每六周、每两个月、每三个月、每六个月或每年一次施用本公开的DLL3靶向三特异性蛋白、DLL3 CAR或DLL3致敏的淋巴细胞或其任何组合，以减少疾病复发的可能性。此外，在一些实施方式中，取决于患者的反应以及临床和诊断参数，这种治疗持续数周、数月、数年甚至无限期地持续。
在又一个实施方案中，DLL3结合蛋白、本公开的DLL3靶向三特异性蛋白、DLL3CAR或DLL3致敏的淋巴细胞或其任何组合遵循缩减程序用于预防性或辅助治疗，以预防或减少肿瘤转移的可能性。如本公开中所使用的，“缩减程序”被广义地定义并且意指消除、减少、治疗或改善肿瘤或肿瘤增殖的任何程序，技术或方法。示例性的缩减程序包括但不限于手术、放射治疗(即束放射)、化学疗法、免疫疗法或消融。在一些实施方案中，在适当的时间，如临床、诊断或治疗方法所建议的，施用DLL3结合蛋白、本公开的DLL3靶向三特异性蛋白、DLL3 CAR或DLL3致敏的淋巴细胞或其任何组合，以减少肿瘤转移。在一些实施方案中，给药方案伴随适当的诊断或监测技术，其允许对其进行修改。
本公开的其他实施方案包括将DLL3结合蛋白、本公开的DLL3靶向三特异性蛋白、DLL3 CAR或DLL3致敏的淋巴细胞或其任何组合施用于无症状但有发展成增生性疾病风险的受试者。即，在一些实施方案中，DLL3结合蛋白、本公开的DLL3靶向三特异性蛋白、DLL3CAR或DLL3致敏的淋巴细胞或其任何组合以预防性意义使用，并提供给已经过检查或测试并且具有一种或多种值得注意的危险因素(例如，基因组指征、家族史、体内或体外测试结果等)，但尚未发展成瘤的患者。在这样的情况下，本领域技术人员将能够通过经验观察或通过公认的临床实践来确定有效的给药方案。
在一些实施方案中，如本文所用的，“治疗”或“处理”是指治疗性处理，其中目的是减缓(减轻)不期望的生理病况、病症或疾病，或是获得有益或期望的临床结果。对于本文所述的目的，有益或期望的临床结果包括但不限于症状的减轻；病况、病症或疾病程度的减小；病况、病症或疾病状态的稳定(即不恶化)；病况、病症或疾病的延迟发作或进展减缓；病况、病症或疾病状态的改善；以及病况、病症或疾病的可检测到的或不可检测的缓解(部分或全部的)或者增强或改善。治疗包括引起临床显著的反应，而没有过量水平的副作用。治疗还包括与不接受治疗的情况下预期的生存期相比延长生存期。在其他实施方案中，“治疗”或“处理”是指预防性措施，其中目的是例如在易患疾病的人(例如，携带诸如乳腺癌等疾病的遗传标志物的个体)中，延迟不希望的生理病况、病症或疾病的发作或者降低其严重程度。
在本文所述的方法的一些实施方案中，如本文所述的DLL3结合蛋白、DLL3靶向三特异性蛋白或组合物与用于治疗特定疾病、病症或病况的药剂联合施用。药剂包括但不限于涉及抗体、小分子(例如，化疗药物)、激素(甾体、肽等)的疗法、放射疗法(γ射线、X射线，和/或放射性同位素、微波、UV辐射等的定向递送)、基因疗法(例如，反义，逆转录病毒疗法等)和其他免疫疗法。在一些实施方案中，本文所述的抗DLL3结合蛋白或抗DLL3靶向三特异性蛋白与止泻剂、止吐剂、镇痛药、阿片类药物和/或非甾体抗炎剂联合施用。在一些实施方案中，本文所述的抗DLL3结合蛋白或抗DLL3靶向三特异性蛋白与抗癌剂联合施用。可在本公开的各个实施方案(包括本公开的药物组合物和剂型和试剂盒)中使用的抗癌剂的非限制性实例包括：阿西维辛；阿柔比星；盐酸阿考达唑；阿克罗宁；阿多来新；阿地白介素；六甲蜜胺；安波霉素；醋酸阿美蒽醌；氨鲁米特；安吖啶；阿那曲唑；安曲霉素；天冬酰胺酶；曲林菌素；阿扎胞苷；阿扎替派；阿佐霉素；巴马司他；苯佐替派；比卡鲁胺；盐酸比生群；二甲磺酸双奈法德；比折来新；硫酸博来霉素；布喹那钠；溴匹立明；白消安；放线菌素C；卡鲁睾酮；卡醋胺；卡贝替姆；卡铂；卡莫司汀；盐酸卡柔比星；卡折来新；西地芬戈；苯丁酸氮芥；西罗霉素；顺铂；克拉屈滨；甲磺酸克雷斯托；环磷酰胺；阿糖胞苷；达卡巴嗪；放线菌素D；盐酸柔红霉素；地西他滨；右奥马铂；地扎胍宁；甲磺酸地扎胍宁；地吖醌；多西他赛；多柔比星；盐酸多柔比星；屈洛昔芬；柠檬酸屈洛昔芬；丙酸屈他雄酮；达佐霉素；依达曲沙；盐酸依氟乌氨酸；依沙芦星；恩洛铂；恩普氨酯；依匹哌啶；盐酸表柔比星；厄布洛唑；盐酸依索比星；雌莫司汀；雌莫司汀磷酸钠；依他硝唑；依托泊苷；磷酸依托泊苷；艾托卜宁；盐酸法倔唑；法扎拉滨；芬维A胺；氟尿苷；磷酸氟达拉滨；氟尿嘧啶；氟西他滨；磷喹酮；福司曲星钠；吉西他滨；盐酸吉西他滨；羟基脲；盐酸依达比星；异环磷酰胺；伊莫福新；白介素II(包括重组白介素II或rIL2)；干扰素α-2a；干扰素α-2b；干扰素α-n1；干扰素α-n3；干扰素β-I a；干扰素γ-I b；异丙铂；盐酸伊立替康；醋酸兰瑞肽；来曲唑；醋酸亮丙瑞林；盐酸利阿唑；洛美曲索钠；洛莫司汀；盐酸洛索蒽醌；马索罗酚；美坦辛；盐酸氮芥；醋酸甲地孕酮；醋酸美伦孕酮；美法仑；美诺立尔；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；甲氨蝶呤钠；氯苯氨啶；美妥替哌；米丁度胺；米托克星(mitocarcin)；丝裂红素(mitocromin)；米托洁林；丝裂马星；丝裂霉素；米托司培；米托坦；盐酸米托蒽醌；霉酚酸；诺考达唑；诺加霉素；奥马铂；奥昔舒仑；紫杉醇；培门冬酶；培利霉素；戊氮芥；硫酸培洛霉素；培磷酰胺；哌泊溴烷；哌泊舒凡；盐酸吡罗蒽醌；普卡霉素；普洛美坦；卟吩姆钠；泊非霉素；泼尼莫司汀；盐酸丙卡巴肼；嘌呤霉素；盐酸嘌呤霉素；吡唑呋喃菌素；利波腺苷；罗谷亚胺；沙芬戈；盐酸沙芬戈；司莫司汀；辛曲秦；斯帕膦酸钠；司帕霉素；盐酸螺旋锗；螺莫司汀；螺铂；链黑菌素；链脲霉素；磺氯苯脲；他利霉素；替可加兰钠；替加氟；盐酸替洛蒽醌；替莫泊芬；替尼泊苷；替罗昔隆；睾内酯；硫咪嘌呤；硫鸟嘌呤；噻替哌；噻唑羧胺核苷；替拉扎明；柠檬酸托瑞米芬；醋酸曲托龙；磷酸曲西立滨；三甲曲沙；葡糖醛酸三甲曲沙；曲普瑞林；盐酸妥布氯唑；乌拉莫司汀；乌瑞替派；伐普肽；维替泊芬；硫酸长春碱；硫酸长春新碱；长春地辛；硫酸长春地辛；硫酸长春匹定；硫酸长春甘酯；硫酸长春罗新；酒石酸长春瑞滨；硫酸长春罗定；硫酸长春利定；伏氯唑；折尼铂；净司他丁；盐酸佐柔比星。抗癌药的其他实例包括但不限于：20-表-1,25二羟基维生素D3；5-乙炔基尿嘧啶；阿比特龙；阿柔比星；酰基富烯；腺环戊醇；阿多来新；阿地白介素；ALL-TK拮抗剂；六甲蜜胺；氨莫司汀；amidox；氨磷汀；氨基酮戊酸；氨柔比星；安吖啶；阿那格雷；阿那曲唑；穿心莲内酯；血管生成抑制剂；拮抗剂D；拮抗剂G；安雷利克斯；抗背侧化形态发生蛋白-1(anti-dorsalizing morphogenetic protein-1)；抗雄激素；前列腺癌；抗雌激素；抗瘤酮；反义寡核苷酸；甘氨酸阿非科林；凋亡基因调节剂；凋亡调节剂；无嘌呤酸；ara-CDP-DL-PTBA；精氨酸脱氨酶；芥子碱(asulacrine)；阿他美坦；阿莫司汀；阿奇他汀(axinastatin)1；阿奇他汀2；阿奇他汀3；阿扎司琼；阿扎毒素；重氮络氨酸；浆果赤霉素III衍生物；balanol；巴马司他；BCR/ABL拮抗剂；苯并二氢扑酚(benzochlorins)；苯甲酰基星状孢菌素(benzoylstaurosporine)；β-内酰胺衍生物；β-alethine；betaclamycin B；桦木酸；bFGF抑制剂；比卡鲁胺；比生群；双吖丙啶基精胺；双奈法德；双曲群A(bistratene A)；比折来新；breflate；溴匹立明；布朵替坦；丁硫氨酸硫酸亚胺；卡泊三醇；钙磷酸蛋白C；喜树碱衍生物；金丝雀痘IL-2；卡培他滨；羧酰胺-氨基-三唑；羧胺三唑；CaRest M3；CARN 700；软骨衍生抑制剂；卡折来新；酪蛋白激酶抑制剂(ICOS)；栗树精胺；天蚕抗菌肽B；西曲瑞克；二氢卟酚；氯喹喔啉磺酰胺；西卡前列素；顺式卟啉；克拉屈滨；氯米芬类似物；克霉唑；collismycin A；collismycin B；康普瑞汀A4；康普瑞汀类似物；conagenin；crambescidin816；克雷斯托；念珠藻素8；念珠藻素A衍生物；curacin A；环戊蒽醌；环铂(cycloplatam)；塞匹霉素；阿糖胞苷十八烷基磷酸盐；溶细胞因子；磷酸己烷雌酚(cytostatin)；达昔单抗；地西他滨；脱氢膜海鞘素B；地洛瑞林；地塞米松；右异环磷酰胺；右雷佐生；右维拉帕米；地吖醌；膜海鞘素B；didox；二乙基去甲精胺；二氢-5-氮杂胞苷；9-二氢泰素；二氧杂霉菌素(dioxamycin)；二苯基螺莫司汀；多西他赛；廿二醇；多拉司琼；去氧氟尿苷；屈洛昔芬；屈大麻酚；多卡米星SA；依布硒；依考莫司汀；依地福新；依决洛单抗(edrecolomab)；依氟鸟氨酸；榄香烯；乙嘧替氟；表柔比星；爱普列特；雌莫司汀类似物；雌激素激动剂；雌激素拮抗剂；依他硝唑；磷酸依托泊苷；依西美坦；法倔唑；法扎拉滨；芬维A胺；非格司亭；非那雄胺；夫拉平度；氟卓斯汀；fluasterone；氟达拉滨；盐酸氟道诺霉素(fluorodaunorunicinhydrochloride)；福酚美克；福美坦；福司曲星；福莫司汀；德卟啉钆(gadoliniumtexaphyrin)；硝酸镓；加洛他滨；加尼瑞克；明胶酶抑制剂；吉西他滨；谷胱甘肽抑制剂；hepsulfam；调蛋白；六亚甲基双乙酰胺；金丝桃素；伊班膦酸；伊达比星；艾多昔芬；伊决孟酮；伊莫福新；伊洛马司他；咪唑并吖啶酮；咪喹莫特；免疫刺激肽；胰岛素样生长因子-I受体抑制剂；干扰素激动剂；干扰素；白介素；碘苄胍；碘代多柔比星；4-甘薯苦醇；伊罗普拉；伊索拉定；异邦格唑；异高软海绵素B；伊他司琼；加斯普拉诺利得(jasplakinolide)；卡哈拉里德F(kahalalide F)；三乙酸片螺素-N；兰瑞肽；雷那霉素；来格司亭；硫酸香菇多糖；雷波斯他汀；来曲唑；白血病抑制因子；白细胞α干扰素；亮丙瑞林+雌激素+黄体酮；亮丙瑞林；左旋咪唑；利阿唑；线性多胺类似物；亲脂性二糖肽；亲脂性铂化合物；lissoclinamide 7；洛铂；蚯蚓磷脂；洛美曲索；氯尼达明；洛索蒽醌；HMG-CoA还原酶抑制剂(诸如但不限于洛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、他汀类、辛伐他汀和阿托伐他汀)；洛索立宾；勒托替康；lutetium texaphyrin；lysofylline；裂解肽；美坦辛；曼诺他汀A；马立马司他；马索罗酚；乳腺丝抑蛋白；基质溶解因子抑制剂；基质金属蛋白酶抑制剂；美诺立尔；美巴龙(merbarone)；阿伏瑞林；甲硫氨酸酶(methioninase)；甲氧氯普胺；MIF抑制剂；米非司酮；米替福星；米立司亭；错配的双链RNA；米托胍腙；二溴卫矛醇；丝裂霉素类似物；米托萘胺；迈托毒素成纤维细胞生长因子-皂草素；米托蒽醌；莫法罗汀；莫拉司亭；人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体；单磷酰脂质A+分支杆菌细胞壁sk；莫哌达醇；多重耐药基因抑制剂；基于多肿瘤抑制物1的疗法；芥子抗癌剂；印度洋海绵B(mycaperoxide B)；分枝杆菌细胞壁提取物；myriaporone；N-乙酰地那林；N-取代的苯甲酰胺；那法瑞林；nagrestip；纳洛酮+喷他佐辛；napavin；naphterpin；那托司亭；奈达铂；奈莫柔比星；奈立膦酸；中性内肽酶；尼鲁米特；尼萨霉素；一氧化氮调节剂；硝基氧抗氧化剂；nitrullyn；O6-苄基鸟嘌呤；奥曲肽；okicenone；寡核苷酸；奥那司酮；昂丹司琼；昂丹司琼；oracin；口服细胞因子诱导剂；奥马铂；奥沙特隆；奥沙利铂；oxaunomycin；紫杉醇；紫杉醇类似物；紫杉醇衍生物；palauamine；palmitoylrhizoxin；帕米膦酸；人参三醇；帕诺米芬；parabactin；泊泽普汀；培门冬酶；培得星(peldesine)；戊聚糖多硫酸钠；喷司他丁；喷曲唑；全氟溴烷；培磷酰胺；紫苏醇；吩嗪霉素(phenazinomycin)；苯乙酸盐；磷酸酶抑制剂；溶链菌制剂(picibanil)；盐酸毛果芸香碱；吡柔比星；吡曲克辛；placetin A；placetin B；纤溶酶原激活物抑制剂；铂络合物；铂化合物；铂-三胺络合物；卟吩姆钠；泊非霉素；强的松；丙基双吖啶酮；前列腺素J2；蛋白酶体抑制剂；基于蛋白质A的免疫调节剂；蛋白激酶C抑制剂；蛋白激酶C抑制剂；微藻；蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂；嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂；红紫素；甲氧基吡唑啉吖啶；吡哆基化血红蛋白聚氧乙烯缀合物；raf拮抗剂；雷替曲塞；雷莫司琼；ras法尼基蛋白转移酶抑制剂；ras抑制剂；ras-GAP抑制剂；去甲基化瑞替普汀；铼Re 186依替膦酸盐；根霉素；核糖酶；RII异维A酰胺；罗谷亚胺；罗希吐碱；罗莫肽；罗喹美克；rubiginone B1；ruboxyl；沙芬戈；saintopin；SarCNU；肌植醇A；沙格司亭；Sdi 1模拟物；司莫司汀；衰老衍生的抑制剂1；有义寡核苷酸；信号转导抑制剂；信号转导调节剂；单链抗原结合蛋白；西佐喃；索布佐生；硼卡钠；苯乙酸钠；solverol；生长调节素结合蛋白；索纳明；膦门冬酸；穗霉素D(spicamycinD)；螺莫司汀；斯耐潘定；海绵抑素1(spongistatin 1)；角鲨胺；干细胞抑制剂；干细胞分裂抑制剂；stipiamide；溶基质蛋白酶抑制剂；sulfinosine；强效血管活性肠肽拮抗剂；suradista；苏拉明；苦马豆素；合成的糖胺聚糖；他莫司汀；它莫西芬甲硫碘化物；牛磺莫司汀；他扎罗汀；替可加兰钠；替加氟；tellurapyrylium；端粒酶抑制剂；替莫泊芬；替莫唑胺；替尼泊苷；四氯十氧化物(tetrachlorodecaoxid)；tetrazomine；菌体胚素(thaliblastine)；噻可拉林(thiocoraline)；血小板生成素；血小板生成素模拟物；胸腺法新；胸腺生成素受体激动剂；胸腺曲南；促甲状腺激素；本紫红素乙酯锡(tin ethyletiopurpurin)；替拉扎明；二氯化二茂钛(titanocene bichloride)；topsentin；托瑞米芬；全能干细胞因子；翻译抑制剂；维甲酸；三乙酰尿苷；曲西立宾；三甲曲沙；曲普瑞林；托烷司琼；妥罗特来；酪氨酸激酶抑制剂；酪氨酸磷酸化抑制剂(tyrphostin)；UBC抑制剂；乌苯美司；泌尿生殖窦衍生的生长抑制因子；尿激酶受体拮抗剂；伐普肽；variolin B；载体系统；红细胞基因疗法；维拉雷琐；藜芦胺；verdins；维替泊芬；长春瑞滨；vinxaltine；
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伏罗唑；扎诺特隆；折尼铂；亚苄维C(zilascorb)；和净司他丁斯酯。其他抗癌药是5-氟尿嘧啶和亚叶酸。当在使用沙利度胺和拓扑异构酶抑制剂的方法中使用时，这两种药剂特别有用。在一些实施方案中，本公开的DLL3靶向三特异性蛋白与吉西他滨联合使用。在一些实施方案中，本文所述的DLL3靶向三特异性蛋白在手术之前、期间或之后施用。
DLL3表达的检测方法和DLL3相关癌症的诊断
根据本公开的另一个实施方案，提供了用于在体外或体内检测DLL3表达的试剂盒。该试剂盒包括前述的DLL3结合蛋白、DLL3靶向三特异性蛋白(例如，含有标记的抗DLL3单结构域抗体或其抗原结合片段的三特异性蛋白)，以及一种或多种用于检测标记物的化合物。在一些实施方案中，该标记物选自荧光标记物、酶标记物、放射性标记物、核磁共振活性标记物、发光标记物和发色团标记物。
在一些情况下，在生物样品中检测DLL3表达。该样品可以是任何样品，包括但不限于来自活检、尸检和病理学标本的组织。生物样品还包括组织切片，例如，用于组织学目的冷冻切片。生物样品还包括体液，如血液、血清、血浆、痰、脊髓液或尿液。生物样品通常获自哺乳动物，如人或非人灵长类动物。
在一个实施方案中，提供了一种通过使来自受试者的样品与本文公开的抗DLL3单结构域抗体或抗DLL3三特异性蛋白接触并检测该单结构域抗体与样品的结合来确定受试者是否患有癌症的方法。与抗体与对照样品的结合相比，抗体与样品的结合的增加确定该受试者患有癌症。
在另一个实施方案中，提供了一种通过使来自被诊断出患有癌症的受试者的样品与本文公开的抗DLL3单结构域抗体或抗DLL3三特异性蛋白接触并检测该抗体与样品的结合来确认受试者中癌症的诊断的方法。与抗体与对照样品的结合相比，抗体与样品的结合的增加确认了受试者中癌症的诊断。
在所公开方法的一些实例中，所述DLL3结合蛋白或三特异性蛋白的DLL3结合单结构域抗体被直接标记。在一些实例中，所述方法进一步包括使与所述抗DLL3单结构域抗体或抗DLL3三特异性蛋白特异性结合的第二抗体与所述样品接触；以及检测第二抗体的结合。与第二抗体与对照样品的结合相比，第二抗体与样品的结合的增加检测出受试者中的癌症或证实了受试者中癌症的诊断。在一些情况下，所述癌症是神经内分泌癌症、前列腺癌、肺癌、胃癌、鳞状细胞癌、胰腺癌、胆管癌、三阴性乳腺癌或卵巢癌，或表达DLL3的任何其他类型的癌症。在一些实例中，对照样品是来自没有癌症的受试者的样品。在特定的实例中，样品是血液或组织样品。
在一些情况下，结合(例如特异性结合)DLL3的抗体直接用可检测标记物标记。在另一个实施方案中，结合(例如，特异性结合)DLL3的抗体(第一抗体)未被标记，而第二抗体或可以结合特异性结合DLL3的抗体的其他分子被标记。选择第二抗体，使其能够特异性结合特定种类和类别的第一抗体。例如，如果第一抗体是美洲驼IgG，则第二抗体可以是抗美洲驼IgG。可以与抗体结合的其他分子包括但不限于蛋白A和蛋白G，两者均可商购获得。抗体或第二抗体的合适的标记物如上所述，并且包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、磁性剂和放射性材料。合适的酶的非限制性实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶。合适的辅基复合物的非限制性实例包括链霉亲和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素。合适的荧光材料的非限制性实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白。非限制性的示例性发光材料是鲁米诺；非限制性的示例性磁性剂是钆，而非限制性的示例性放射性标记物包括125I、131I、35S或3H。
在备选的实施方案中，可以通过竞争性免疫测定在生物样品中测定DLL3，该测定采用以可检测物质标记的DLL3标准品和特异性结合DLL3的未标记抗体。在该测定中，将生物样品、标记的DLL3标准品和特异性结合DLL3的抗体混合在一起，并测定与未标记的抗体结合的标记的DLL3标准品的量。生物样品中DLL3的量与同特异性结合DLL3的抗体结合的标记DLL3标准品的量成反比。
本文公开的免疫测定和方法可以用于多种目的。在一个实施方案中，特异性结合DLL3的抗体可用来检测细胞培养物中的细胞中DLL3的产生。在另一个实施方案中，该抗体可以用来检测生物样品如组织样品或血液或血清样品中DLL3的量。在一些实例中，该DLL3是细胞表面DLL3。在其他实例中，该DLL3是可溶性DLL3(例如，细胞培养上清液中的DLL3或体液样品如血液或血清样品中的可溶性DLL3。
在一个实施方案中，提供了用于检测生物样品如血液样品或组织样品中的DLL3的试剂盒。例如，为了确认受试者中的癌症诊断，可以进行活检以获得用于组织学检查的组织样品。或者，可以获取血液样品以检测可溶性DLL3蛋白或片段的存在。根据本公开内容，用于检测多肽的试剂盒通常将包含特异性结合DLL3的单结构域抗体。在一些实施方案中，该试剂盒中包括抗体片段，如scFv片段、VH结构域或Fab。在进一步的实施方案中，该抗体被标记(例如，用荧光、放射性或酶标记物标记)。
在一个实施方案中，试剂盒包括说明材料，其公开了使用结合DLL3的抗体的手段。该说明材料可以是书面的、电子形式的(如计算机软盘或光盘)，也可以是可视的(如视频文件)，或者通过电子网络提供，例如经由因特网、万维网、内联网或其他网络提供。试剂盒还可以包括其他组件，以方便试剂盒设计所针对的特定应用。因此，例如，该试剂盒可以另外包含检测标记物的手段(例如用于酶标记物的酶底物，用于检测荧光标记物的滤光器套件，合适的第二标记物，如第二抗体等)。该试剂盒可以另外包括常规用于实施特定方法的缓冲液和其他试剂。这样的试剂盒和合适的内容物是本领域技术人员熟知的。
在一实施方案中，诊断试剂盒包括免疫测定。尽管免疫测定的细节可随所采用的特定形式而不同，但是检测生物样品中DLL3的方法通常包括使生物样品与在免疫反应性条件下与DLL3多肽特异性反应的抗体接触的步骤。使抗体在免疫反应性条件下特异性结合以形成免疫复合物，并直接或间接检测免疫复合物(结合的抗体)的存在。
确定细胞表面标志物存在与否的方法是本领域公知的。例如，抗体可以与包括但不限于酶、磁珠、胶体磁珠、半抗原、荧光染料、金属化合物、放射性化合物或药物的其他化合物缀合。抗体也可用于免疫测定，例如但不限于放射免疫测定(RIA)、ELISA或免疫组织化学测定中。抗体也可用于荧光激活的细胞分选(FACS)。FACS使用多个颜色通道、低角度和钝角光散射检测通道以及阻抗通道，以及其他更复杂的检测级别，来对细胞进行分离或分类(参见第5,061,620号美国专利)。如本文所公开的，结合DLL3的任何单结构域抗体均可在这些测定中使用。因此，这些抗体可以用于常规的免疫测定中，包括但不限于ELISA、RIA、FACS、组织免疫组织化学、Western印迹法或免疫沉淀。
实施例
实施例1：筛选用于鉴定DLL3结合域的噬菌体展示文库的筛查
用在EXPI293TM细胞中表达的纯化的DLL3蛋白免疫美洲驼。从循环B细胞构建用于表达重链可变抗体结构域的噬菌体展示文库(参见van der Linden,de Geus,Stok,Bos,van Wassenaar,Verrips,and Frenken.2000.J Immunol Methods 240:185–195)。通过在大肠杆菌中表达克隆，制备周质提取物，并通过ELISA针对DLL3结合活性筛选克隆，来针对与DLL3的结合筛选噬菌体克隆。鉴定了五十二种独特的仅重链的单结构域抗体，这些抗体在ELISA筛选中产生信号(SEQ ID No.1至52)。这些重可变域的CDR1、CDR2和CDR3序列分别是SEQ ID No.443至494、SEQ ID No.885至936和SEQ ID No.1327至1378。
实施例2：DLL3结合单域抗体的人源化和T细胞依赖性细胞毒性测定
将三十四种(SEQ ID No.53至86)来自实施例1的示例性美洲驼抗DLL3仅重链单结构域抗体进行人源化。这34种仅重链单结构域抗体的CDR1、CDR2和CDR3序列分别为SEQ IDNo.495至528、SEQ ID No.937至970和SEQ ID No.1379至1412。
将人源化的抗DLL3序列克隆到表达载体中的表达载体中，该构建体包含信号域，随后是抗DLL3仅重链可变域，随后是GGGGSGGGS连接体(SEQ ID No.1808)，随后是抗人白蛋白结构域抗体10G(SEQ ID No.1774)，随后是GGGGSGGGS连接体(SEQ ID No.1808)，随后是抗人CD3抗体2B2(SEQ ID No.1793)，随后是HHHHHH标签(SEQ ID No.1819)，从而生成抗DLL3三特异性构建体。
然后将包含人源化抗DLL3结合序列的抗DLL3三特异性构建体转染入EXPI293TM细胞中。用蛋白A结合位点对这些抗DLL3三特异性构建体进行工程改造，并且使用带有蛋白A尖端的Octet仪器对转染的EXPI293TM细胞在条件培养基中抗DLL3三特异性构建体的量进行定量。与抗DLL3三特异性蛋白分子量相似的三特异性蛋白用作标准品。
使用含有已知浓度的抗DLL3三特异性蛋白的条件培养基，使用以下方法测量抗DLL3三特异性蛋白对人和食蟹猴DLL3蛋白的结合亲和力，在该方法中DLL3蛋白被表达为人IgG1-Fc融合体，并且使用具有抗人Fc尖端的Octet仪器进行测量。使用单一50nM浓度的抗DLL3三特异性蛋白进行KD测量，从而允许根据效力进行排序。如上所述测量的相对亲和力列于表1中。发现所有序列均以0.5至42nM的相对亲和力(KD)结合人DLL3。发现一些序列以与人DLL3相似的亲和力结合食蟹猴DLL3，并且这些序列与食蟹猴DLL3结合的相对亲和力也显示在表1中。
还通过T细胞依赖性细胞毒性测定对条件培养基进行了检测(参见Nazarian AA,Archibeque IL,Nguyen YH,Wang P,Sinclair AM,Powers DA.2015.J Biomol Screen.20:519-27)。在该测定中，将萤光素酶标记的DMS-153细胞(小细胞肺癌细胞系；ATCC No.
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CRL-2064TM)与来自供体的纯化人T细胞合并，并滴定所测试的抗DLL3三特异性蛋白。
假设如果抗DLL3三特异性蛋白引导T细胞杀死表达DLL3的DMS-153细胞，则通过在实验开始后48小时进行萤光素酶测定所确定的DMS-153细胞的活力应该降低。
图2-6显示了代表性TDCC数据的图，几种示例性抗DLL3三特异性蛋白能够降低DMS-153细胞的活力。图2显示了针对包含DLL3结合域DH18(SEQ ID No.59)、DH11(SEQ IDNo.55)、DH67(SEQ ID No.42)和DH56(SEQ ID No.73)的抗DLL3三特异性蛋白的TDCC测定结果。图3显示了针对包含DLL3结合域DH2(SEQ ID No.60)、DH43(SEQ ID No.68)、DH10(SEQID No.54)和DH6(SEQ ID No.75)的抗DLL3三特异性蛋白的TDCC测定结果。图4显示了针对包含DLL3结合域DH82(SEQ ID No.81)、DH23(SEQ ID No.62)、DH89(SEQ ID No.84)和DH17(SEQ ID No.58)的DLL3三特异性蛋白的TDCC测定结果。图5显示了针对包含DLL3结合域DH83(SEQ ID No.82)、DH12(SEQ ID No.56)、DH61(SEQ ID No.76)和DH29(SEQ ID No.64)的DLL3三特异性蛋白的TDCC测定结果。图6显示了包含DLL3结合域DH58(SEQ ID No.74)和DH70(SEQ ID No.79)的DLL3三特异性蛋白的TDCC测定结果。TDCC测定的阴性对照是靶向GFP而不是DLL3的三特异性蛋白(如图6所示)，其不引导T细胞杀死DMS-153细胞。表1还列出了TDCC测定得出的EC50值。这些值的范围为69pM至11nM。
表1：人源化抗DLL3三特异性蛋白在DMS-153TDCC测定中的活性及其对人和食蟹猴DLL3蛋白的亲和力。使用单一浓度的抗DLL3三特异性蛋白进行KD测量。使用人T细胞进行TDCC测定。n/d表示未检测到结合。
Figure BDA0003083515520000851
实施例3：使用两种来自先前实施例的人源化DLL3单结构域抗体对噬菌体展示文 库的筛查，以鉴定具有较高结合亲和力的DLL3结合域
使用两种人源化抗体序列DH43(SEQ ID No.68)和DH6(SEQ ID No.75)作为制备噬菌体展示文库的起点(按照WO2016187101A2)。随后将来自该淘选的抗DLL3序列克隆到表达载体中，表达构建体包含信号域，随后是仅重链的抗DLL3可变域，随后是GGGGSGGGS连接体(SEQ ID No.1808)，随后是抗人白蛋白单结构域抗体域，随后是GGGGSGGGS连接体(SEQ IDNo.1808)，随后是抗人CD3抗体片段，再是HHHHHH标签(SEQ ID No.1819)，以产生抗DLL3三特异性蛋白。将这些构建体转染到EXPI293TM细胞中，并按实施例2中所述对表达的抗DLL3三特异性蛋白进行定量。从淘选中鉴定出的克隆的序列是SEQ ID No.87至367。表2提供了噬菌体展示选择后在DH43 DLL3结合物序列中获得的CDR变化。从淘选中鉴定出的三个克隆，SEQ ID No.199(2E05)、330(4D09)和365(4H011)被工程化以产生变体，其中每个变体与亲本序列相比具有单个氨基酸变化，例如，以去除亲本序列的潜在代谢负债。特别地，包含SEQID No.227(2E05-M106Y)、228(2E05-M106Q)的DLL3结合域是SEQ ID No.199(2E05)的工程变体；SEQ ID No.366(4D09-M34L)是SEQ ID No.330(4D09)的工程变体；SEQ ID No.367(4H11-M34L)是SEQ ID No.365(4H011)的工程变体。通过淘选鉴定的这些DLL3结合克隆的CDR1序列为SEQ ID No.529至809，通过淘选鉴定的克隆的CDR2序列为SEQ ID No.971至1251，并且通过淘选鉴定的克隆的CDR3序列为SEQ ID No.1413至1691。
表2：DH43及其衍生物按氨基酸位置在CDR序列中的变异
Figure BDA0003083515520000861
Figure BDA0003083515520000871
使用已知浓度的抗DLL3三特异性蛋白的条件培养基，使用将人DLL3蛋白的生物素化形式表达为人IgG1融合蛋白的方法，测量抗DLL3三特异性蛋白对人DLL3蛋白的结合亲和力，并且结合亲和力的测定是在带有链霉亲和素尖端的Octet仪器中进行的。使用单一50nM浓度的抗DLL3三特异性蛋白进行KD测量，其允许对效力进行排序。在此实验中，亲和力成熟的克隆的相对KD值在2.3nM至64nM的范围内，如表3所示。基于来自四个转染的条件培养基的四个样品，亲代结合物DH43和DH6分别具有7.7±0.6nM和9.9±0.3nM的KD值。
对于在这一轮淘选中确定的特定DLL3结合物分子以及亲本DLL3结合物DH43和DH6，使用60nM、20nM、6.67nM和2.22nM浓度的抗DLL3三特异性蛋白进行针对人DLL3的更精确的亲和力测量。此外，仅使用60nM抗DLL3三特异性蛋白进行相对亲和力测量。由某些抗DLL3结合分子的更精确测量确定的结合亲和力列于表4中[1H012(SEQ ID No.162)；1A011(SEQ ID No.95)；2E05(SEQ ID No.199)；4H011(SEQ ID No.365)；3C04(SEQ ID No.251)；2E02(SEQ ID No.198)；2H02(SEQ ID No.221)；3A011(SEQ ID No.238)；3A02(SEQ IDNo.230)；4D09(SEQ ID No.330)；DH43(SEQ ID No.68)；和DH6(SEQ ID No.75)]。在这项研究中，亲本结合物DH43的KD值为8.9nM，而亲和力最高的子分子1H012(SEQ ID No.162)的亲和力为2.9nM。此外，1H012(SEQ ID No.162)也保留了与食蟹猴DLL3结合的能力。同样在这项研究中，亲代结合物DH6的KD值为9.0nM，而亲和力最高的子分子4H011(SEQ ID No.365)的亲和力为3.9nM。此外，4H011(SEQ ID No.365)也保留了与食蟹猴DLL3结合的能力。
使用与实施例2中所述相同的方案，选择在这一轮淘选中鉴定出的22个DLL3结合物分子用于在采用DMS-153细胞的TDCC测定中进行测试。示例性的TDCC数据在图7-11中以图形的形式绘制，表5中列出了EC50值的总结。在该实验中，亲本DLL3分子DH43和DH6的EC50值分别为200nM和340nM。DH43的最有效的子分子是1H012(SEQ ID No.162)，其EC50值为28nM，显示与亲本DLL3结合物DH43相比，TDCC效力增加了7倍。DH6的最有效的子分子是4H011(SEQ ID No.365)，其EC50值为36nM，因此与亲本DLL3结合物分子相比，TDCC效力增加了8倍。用作对照的靶向GFP的对照三特异性蛋白在该测定中没有活性(如图11所示)。
表3：抗DLL3三特异性蛋白的相对亲和力
Figure BDA0003083515520000901
Figure BDA0003083515520000911
表4：使用三种不同浓度的抗DLL3三特异性蛋白确定的对人DLL3的结合常数，以及使用单一浓度的抗DLL3三特异性蛋白确定的食对蟹猴DLL3的结合常数
Figure BDA0003083515520000921
表5：使用人T细胞一式三份测试的条件培养基中亲和力成熟的抗DLL3三特异性蛋白的DMS-153TDCC值
Figure BDA0003083515520000922
Figure BDA0003083515520000931
实施例4：将来自实施例3的所选DLL3结合分子向哺乳动物中的克隆
将实施例3中所述的抗DLL3三特异性蛋白以及亲本DLL3结合分子亚克隆到CHO细胞表达载体中，并在CHO细胞中稳定转染(参见，Running Deer and Allison2004.Biotechnol.Prog.20:880-889)。DLL3结合分子为：2E05-M106Q(SEQ ID No.228)；2C04(SEQ ID No.181)；4D09-M34L(SEQ ID No.366)；4D09(SEQ ID No.330)；2E05-M106Y(SEQ ID No.227)；1H012(SEQ ID No.162)(在本文中也称为1H12)；2E05(SEQ ID No.199)；2H02(SEQ ID No.221)；4D011(SEQ ID No.332)(在本文中也称为4D11)；2E02(SEQ IDNo.198)；4H11-M34L(SEQ ID No.367)；1A011(SEQ ID No.95)(在本文中也称为1A11)；DH6(SEQ ID No.75)；和DH43(SEQ ID No.68)。抗DLL3三特异性蛋白在CHO细胞中表达后，使用蛋白A和离子交换色谱法从稳定克隆合并物的条件培养基中纯化。使用与实施例2所述相同的方法在TDCC测定中测试纯化的蛋白质。表6中列出了来自本实施例的TDCC测定的EC50值，并且数据的图示在图12-15中给出。最有效的分子2E05-M106Q(SEQ ID No.228)的EC50值为41nM，是其亲本分子DH43的6.6倍。衍生自DH6的最有效的分子是4D09-M34L(SEQ IDNo.366)，其EC50值为54nM，效力是亲本分子DH6的4.4倍。
表6：CHO表达并纯化的亲和力成熟的抗DLL3三特异性蛋白的TDCC活性
Figure BDA0003083515520000932
Figure BDA0003083515520000941
实施例5：获得亲和力提高的抗DLL3结合物的亲和力成熟
为了获得更有效的抗DLL3结合物，进行了第二轮亲和力成熟。基于DH6(SEQ IDNo.75)和DH58(SEQ ID No.74)亲本序列创建噬菌体展示文库。SEQ ID No.368至442提供了来自这一轮亲和力成熟的结合物的序列。在这轮亲和力成熟中鉴定出的DLL3结合物的CDR1序列为SEQ ID No.810至884，在这轮亲和力成熟中鉴定出的DLL3结合物的CDR2序列为SEQID No.1252-1326，而在这一轮亲和力成熟中鉴定出的DLL3结合物的CDR3序列为SEQ IDNo.1692至1768。表7提供了噬菌体展示选择后在DH6 DLL3结合序列中获得的CDR变化。
将如上所述鉴定的亲和力成熟的抗DLL3序列克隆到表达载体中，表达构建体包含信号域，随后是抗DLL3序列，随后是GGGGSGGGS连接体(SEQ ID No.1808)，随后是抗人白蛋白单结构域抗体10G(SEQ ID No.1774)，随后是GGGGSGGGS连接体(SEQ ID No.1808)，随后是抗人CD3抗体2B2(SEQ ID No.1793)，随后是HHHHHH标签(SEQ ID No.1819)，以生成抗DLL3三特异性构建体。
然后将含有亲和力成熟的抗DLL3结合序列的抗DLL3三特异性构建体转染入EXPI293TM细胞中。随后用蛋白A结合位点对这些抗DLL3三特异性构建体进行工程改造，并使用带有蛋白A尖端的Octet仪器对转染的EXPI293TM细胞的条件培养基中抗DLL3三特异性构建体的量进行定量。分子量与抗DLL3三特异性蛋白相似的对照三特异性蛋白用作标准品。
使用具有已知浓度的抗DLL3三特异性蛋白的条件培养基，使用将人DLL3蛋白的生物素化形式表达为人IgG1融合蛋白的方法，测量抗DLL3三特异性蛋白对人DLL3蛋白的相对结合亲和力，并在带有链霉亲和素尖端的Octet仪器中进行结合亲和力测量。使用单一50nM浓度的抗DLL3三特异性蛋白进行KD测量，其允许对效力进行排序。表8中列出了测得的亲和力。发现所有测试的序列均结合人DLL3，KD值范围为0.3nM至34nM。
还通过T细胞依赖性细胞毒性测定对条件培养基进行了检测(参见Nazarian AA,Archibeque IL,Nguyen YH,Wang P,Sinclair AM,Powers DA.2015.J Biomol Screen.20:519-27)。在该测定中，将萤光素酶标记的DMS-153细胞与纯化的人T细胞和滴定的抗DLL3三特异性蛋白合并。假设如果抗DLL3三特异性蛋白引导T细胞杀死表达DLL3的DMS-153细胞，则通过在实验开始后48小时进行萤光素酶测定所确定的DMS-153细胞的活力应该降低。图16示出了含有以下DLL3结合域的抗DLL3三特异性蛋白的代表性TDCC数据的图：51A02(SEQID No.409)，51G02(SEQ ID No.425)，52B01(SEQ ID No.430)，52C04(SEQ ID No.431)，51A05(SEQ ID No.411)，52D04(SEQ ID No.432)，51E05(SEQ ID No.420)，51H05(SEQ IDNo.429)，以及用于纯化的DH43蛋白(SEQ ID No.68)和纯化的DH6蛋白(SEQ ID No.75)。表9列出了TDCC测定得出的EC50值。值范围为4.2pM至1.5nM。用于TDCC测定的阴性对照是靶向GFP的三特异性蛋白(如图16所示)，其不引导T细胞杀死DMS-153细胞。
表7：DH6及其衍生物按氨基酸位置在CDR序列中的变异
Figure BDA0003083515520000961
表8：使用单一浓度的抗DLL3三特异性蛋白测定的针对人DLL3的结合常数
Figure BDA0003083515520000971
Figure BDA0003083515520000981
Figure BDA0003083515520000991
Figure BDA0003083515520001001
表9：使用人T细胞一式三份测试的条件培养基中亲和力成熟的抗DLL3三特异性蛋白的DMS-153 TDCC值
Figure BDA0003083515520001002
Figure BDA0003083515520001011
Figure BDA0003083515520001021
实施例6：用于获得亲和力改善的抗DLL3结合物的亲和力成熟
将某些含有在实施例5中所述测定中具有最强TDCC活性的DLL-3结合序列的抗DLL3三特异性蛋白和含有亲本DLL3结合物DH6的抗DLL3三特异性蛋白亚克隆到CHO细胞表达载体中，并在CHO细胞中稳定转染(参见Running Deer and Allison2004.Biotechnol.Prog.20:880-889)。DLL3结合序列为：DH6(SEQ ID No.75)；51A2(SEQ IDNo.408)；51A5(SEQ ID No.411)；51F3(SEQ ID No.423)；51G2(SEQ ID No.425)；51G10(SEQID No.427)；51H5(SEQ ID No.429)；51X5(SEQ ID No.1886)；52B1(SEQ ID No.430)；52C4(SEQ ID No.431)；和52D4(SEQ ID No.432)。使用蛋白A和离子交换色谱法从稳定克隆合并物中将三特异性蛋白纯化到条件培养基中。图17提供了纯化蛋白的SDS-PAGE图像。
使用固定在Octet链霉亲和素尖端上的60nM、20nM、6.67nM和2.22nM浓度的生物素化DLL3靶向三特异性蛋白进行针对人和食蟹猴DLL3的亲和力测量。由测量确定的亲和力在表10中列出。在该实验中，含有DH6(亲和力成熟的DLL3结合物序列的亲本DLL3结合物序列)的抗DLL3三特异性抗体对于人DLL3的KD值为13.5nM，对于食蟹猴DLL3的KD值为11nM。相比之下，在此实验中测试的包含亲和力成熟的DLL3结合物分子的十种抗DLL3三特异性蛋白的KD值对于人DLL3为0.9至2.2nM，对于食蟹猴DLL3为1.4至3.4nM。因此，对于人DLL3，亲和力的改善范围为6.1至15倍，对于食蟹猴DLL3，亲和力的改善范围为3.2至7.9倍。
使用与实施例2中描述的相同方法在TDCC测定中测试纯化的蛋白质，不同之处在于测定中包括两个另外的表达DLL3的细胞系DMS-53和NCI-H510A。这些TDCC测定的EC50值列在表11中，DMS-53和DMS-153TDCC数据的图示分别在图18-19中提供。在这些测定中，靶向GFP的三特异性分子没有活性(如图18-19所示)。与亲本分子DH6相比，DMS-153细胞的EC50值改善了2.3至12.1倍，NCI-H510A细胞的EC50值改善了4.5至31.5倍，DMS-153细胞的EC50值改善了8.1至26.1倍。
表10：纯化的CHO表达的亲和力成熟的抗DLL3三特异性蛋白在体外对人和猕猴DLL3蛋白的亲和力
Figure BDA0003083515520001031
Figure BDA0003083515520001041
表11：使用DMS153、NCI-H510A和DMS53细胞系以及人类T细胞，纯化的CHO表达的亲和力成熟的抗DLL3三特异性蛋白的TDCC活性
Figure BDA0003083515520001042
实施例7：使用包含本公开的DLL3结合蛋白的示例性DLL3靶向三特异性蛋白的T细 胞依赖性细胞毒性测定
在T细胞依赖性细胞毒性(TDCC)测定(参见Nazarian AA,Archibeque IL,NguyenYH,Wang P,Sinclair AM,Powers DA.2015.JBiomol Screen.20:519-27)中测试了几种包含本公开的DLL3结合域52D04(SEQ ID NO.432)的示例性DLL3三特异性蛋白，结果显示在图22-24中。如图20所示，三特异性蛋白如图21所示以抗DLL3:抗ALB:抗CD3构型(TAC)或者如图21所示以抗CD3:抗ALB:抗DLL3(CAT)构型包含DLL3结合域、白蛋白结合域(抗ALB)和CD3结合域(抗CD3)。在存在或不存在15mg/ml人血清白蛋白(HSA)的情况下进行TDCC测定。在该测定中，在存在或不存在白蛋白的情况下，萤光素酶标记的NCI-H2171(图22)、DMS-79(图23)、SHP77(图24)或WM2664(图25)细胞与纯化的人T细胞和滴定的示例性DLL3结合三特异性蛋白合并。假设如果DLL3结合三特异性蛋白引导T细胞杀死表达DLL3的NCI-H2171、DMS-79、SHP77或WM2664细胞，则通过在实验开始后48小时进行萤光素酶测定所确定的这些细胞的活力应该降低。图22示出了使用NCI-H2171细胞对以TAC或CAT构型包含以下DLL3结合域的DLL3结合三特异性蛋白的代表性TDCC数据的图。图23示出了使用DMS-79细胞对以TAC或CAT构型以下DLL3结合域的的DLL3结合三特异性蛋白的代表性TDCC数据的图。图24示出了使用SHP77细胞对以TAC或CAT构型包含以下DLL3结合域的DLL3结合三特异性蛋白的代表性TDCC数据的图。图25示出了使用WM2664细胞对以TAC或CAT构型以下DLL3结合域的DLL3结合三特异性蛋白的代表性TDCC数据的图。表12列出了TDCC测定的EC50值。如图所示并由EC50值表示，在人血清白蛋白(HSA)的存在下，具有CAT方向的DLL3结合三特异性蛋白(图21)比具有TAC构型的DLL3结合三特异性蛋白更有效。
表12：采用NCI-H2171、DMS-79、SHP77和细胞系以及人T细胞，示例性抗DLL3三特异性蛋白的TDCC活性
Figure BDA0003083515520001051
Figure BDA0003083515520001061
实施例8：示例性DLL3靶向三特异性蛋白与人T细胞的结合
在细胞结合研究中，将人T细胞在存在或不存在示例性DLL3靶向三特异性蛋白(以抗DLL3:抗ALB:抗CD3(TAC)构型(SEQ ID No.1891；或抗CD3:抗ALB:抗DLL3(CAT)构型(SEQID No.1890))的情况下孵育。人T细胞进一步与同Alexa Fluor 647缀合的第二抗体(抗三特异性抗体)一起孵育，该第二抗体能够识别与示例性三特异性分子中的抗白蛋白结构域。通过流式细胞术测量抗三特异性抗体的结合。相比于与单独的第二抗体孵育的细胞或没有与示例性三特异性蛋白或第二抗体孵育的细胞(图26中图形中的左峰)，在抗DLL3:抗ALB:抗CD3(TAC)构型的示例性DLL3三特异性蛋白的存在下观察到抗三特异性抗体的牢固结合(图26中图形中的右峰)。相比于与单独的第二抗体孵育的细胞或没有与示例性三特异性蛋白或第二抗体孵育的细胞(图27中图形中的左峰)，在抗CD3:抗ALB:抗DLL3(CAT)构型的示例性DLL3三特异性蛋白的存在下也观察到抗三特异性抗体的牢固结合(图27中图形中的右峰)。
实施例9：示例性DLL3靶向三特异性蛋白与表达DLL3的癌细胞系的结合
在另一项结合研究中，将表达DLL3的癌细胞[NCI-H82(肺癌细胞系)、SHP77(肺癌细胞系)、DMS53(肺癌)或NCI-H2171(肺癌细胞系)]与示例性DLL3靶向三特异性分子(以CAT或TAC构型；SEQ ID No.1890和SEQ ID No.1891)或靶向GFP的对照三特异性分子一起孵育。孵育后，洗涤细胞以除去未结合的三特异性分子，并进一步与同Alexa Fluor 647或FITC缀合的第二抗体一起孵育，该第二抗体能够识别三特异性分子中的抗白蛋白结构域。通过流式细胞术测量示例性DLL3靶向三特异性分子或对照三特异性分子与细胞的结合。相比于与靶向GFP的对照三特异性分子一起孵育的细胞(图28中图形中的左峰)，观察到DLL3靶向三特异性蛋白(以TAC构型)与每种细胞系的牢固结合(图28中图形中的右峰)。相比于与靶向GFP的对照三特异性分子一起孵育的细胞(图29中图形中的左峰)，观察到DLL3靶向三特异性蛋白(以CAT构型)与每种细胞系的牢固结合(图28中图形中的右峰)。在采用缺乏DLL3表达的细胞系HCTI16(结肠癌细胞系)和NCI-H292(肺癌细胞系)的对照实验中，将相似量的抗三特异性抗体结合到与示例性DLL3靶向三特异性蛋白或靶向GFP的对照三特异性分子(数据未示出)一起孵育的细胞上，表明示例性DLL3靶向三特异性分子不与缺乏DLL3表达的细胞结合。
实施例10：示例性DLL3靶向三特异性蛋白引导T细胞介导的对表达DLL3的癌细胞 系的杀伤的能力
这项研究的目的是评估示例性DLL3靶向三特异性分子是否能够引导T细胞杀死表达DLL3的细胞系NCI-H82、SHP77、DMS53和NCI-H2171。该研究中使用的DLL3表达细胞被工程化为表达萤光素酶。
对于TDCC测定(T细胞依赖性细胞毒性测定)，将来自四名健康供体(供体2；供体47；供体81；供体86)的T细胞与表达DLL3的细胞混合，并向混合物中加入不同量的示例性DLL3靶向三特异性蛋白(以CAT或TAC构型；SEQ ID No.1890和SEQ ID No.1891)。将混合物在37℃下孵育48小时。作为对照，使用靶向GFP的对照三特异性分子进行平行实验。48小时后，使用发光测定对剩余的表达DLL3的活细胞进行定量。观察到，DLL3靶向三特异性分子(以TAC和CAT构型两者)能够有效地引导来自所有四名健康供体的T细胞杀死所有四种表达DLL3的细胞系(使用TAC构型的结果参见图30、31、32和33；使用CAT构型的结果参见图34、35、36和37)，而对照GFP TriTAC分子则不能完成这一点(也显示在图30-37中)。EC50值显示在表13和表14中。使用靶向DLL3的TriTAC和缺乏DLL3表达的细胞系NCI-H292和HCT116进行了进一步的TDCC测定。观察到靶向DLL3的TriTAC不能引导T细胞杀死这两种缺乏DLL3表达的细胞系(数据未示出)。
表13：使用来自四个不同供体的T细胞，在人血清白蛋白(HSA)的存在下测试的，使用以抗DLL3:抗ALB:抗CD3(TAC)构型包含本公开的DLL3结合域52D04的示例性DLL3靶向三特异性蛋白进行的TDCC测定的EC50值。
Figure BDA0003083515520001081
表14：使用来自四个不同供体的T细胞，在人血清白蛋白(HSA)的存在下测试的，使用以抗CD3:抗ALB:抗DLL3(CAT)构型包含本公开的DLL3结合域52D04的示例性DLL3靶向三特异性蛋白进行的TDCC测定的EC50值。
Figure BDA0003083515520001082
Figure BDA0003083515520001091
实施例11：示例性DLL3靶向三特异性蛋白对T细胞的DLL3依赖性活化
在该测定中，将来自4名不同健康供体(供体2；供体35；供体47；和供体86)的T细胞和NCI-H82或DMS53细胞与DLL3靶向三特异性蛋白(以CAT或TAC构型；SEQ ID No.1890和SEQID No.1891)在37℃下孵育48小时。来自相同供体的T细胞也在37℃下与靶向GFP的对照三特异性分子GFP TriTAC和NCI-H82或DMS53细胞一起孵育48小时。48小时后，收集T细胞，并通过流式细胞术测量T细胞上的CD69和CD25表达。如图38-45所示，在NCI-H82或SHP77细胞和DLL3靶向三特异性分子的存在下，在来自所有4名健康供体的T细胞上检测到CD69或CD25表达增加，但在阴性对照GFP TriTAC的存在下未检测到。使用缺乏DLL3表达的HCT116细胞进行了平行实验。使用HCT116细胞测试的DLL3三特异性分子未观察到CD69或CD25表达增加(数据未显示)。
实施例12：由示例性DLL3靶向三特异性蛋白诱导的T细胞产生的DLL3依赖性细胞 因子
在该测定中，将来自健康供体的T细胞和NCI-H82或SHP77细胞与示例性DLL3靶向三特异性分子(以CAT或TAC构型；SEQ ID No.1890和SEQ ID No.1891)在37℃下孵育48小时。来自同一供体的T细胞也在37℃下与靶向GFP的对照三特异性分子GFP TriTAC和NCI-H82或DMS53细胞一起孵育48小时。48小时后，收集条件培养基，并使用电化学发光测定(Meso Scale Discovery)测量条件培养基中存在的各种细胞因子的量。观察到，在NCI-H82或SHP77细胞和DLL3靶向三特异性分子的存在下，IFNγ、IL-2和TNFα被分泌到培养基中，而在对照靶向GFP的TriTAC分子的存在下则没有。对于TAC构型的DLL3靶向三特异性分子：IFNγ的产生在图46和47中示出；IL-2的产生在图48和49中示出；TNFα的产生在图50和51中示出。对于CAT构型的DLL3靶向三特异性分子：IFNγ的产生在图52和53中示出；IL-2的产生在图54和55中示出；TNFα的产生在图56和57中示出。
实施例13：示例性DLL3靶向三特异性蛋白对NCI-H82异种移植物生长的抑制
对于本研究，在第0天将5x 106个人类T细胞和5x 106个NCI-H82小细胞肺癌细胞注入小鼠体内。在第1天到第10天，每天向小鼠腹膜内(ip)注射20、100或500μg/kg剂量的示例性DLL3靶向三特异性分子(以CAT或TAC构型；SEQ ID No.1890和SEQ ID No.1891)，或500μg/kg剂量的阴性对照靶向GFP的TriTAC。从第7天开始到第24天结束每隔几天测量一次肿瘤体积。与以500μg/kg剂量给予靶向GFP的TriTAC的小鼠相比，在所有剂量下均在DLL3靶向三特异性蛋白注射的小鼠中观察到了肿瘤生长的显著抑制，如图58所示。
实施例14：示例性DLL3靶向三特异性蛋白消除NCI-H82异种移植物
对于本研究，在第0天皮下注射5x106个NCI-H82小细胞肺癌细胞。在第8天将小鼠随机化，并且每只小鼠注射2x107个人类T细胞。在第9至18天，每天向小鼠腹膜内注射有1、10或100μg/kg剂量的示例性DLL3靶向三特异性分子(以CAT构型；SEQ ID No.1890)或100μg/kg剂量的阴性对照靶向GFP的TriTAC。从第8天开始到第29天结束，每隔几天测量一次肿瘤体积。与以100μg/kg剂量给予靶向GFP的TriTAC的小鼠相比，在以10和100μg/kg的剂量注射DLL3靶向三特异性分子的小鼠中观察到肿瘤生长的显著抑制，如图59所示。
实施例15：示例性DLL3靶向三特异性蛋白对SHP77异种移植物生长的抑制
对于本研究，在第0天将5x106个人类T细胞和5x106个SHP77小细胞肺癌细胞注入小鼠体内。在第1天到第10天，每天向小鼠腹膜内注射1、10或100μg/kg剂量的DLL3靶向三特异性分子(以CAT构型；SEQ ID No.1890)，或100μg/kg剂量的阴性对照靶向GFP的TriTAC。从第6天开始到第28天结束每隔几天测量一次肿瘤体积。与以100μg/kg剂量给予靶向GFP的TriTAC的小鼠相比，在10和100μg/kg剂量下在DLL3靶向三特异性蛋白注射的小鼠中观察到了肿瘤生长的显著抑制，如图60所示。
实施例16：示例性DLL3靶向三特异性蛋白的药代动力学谱
当以0.3mg/kg给药时，DLL3靶向三特异性蛋白在食蟹猴中的半衰期为约3天至约3.9天
对于本研究，向食蟹猴静脉内注射0.3mg/kg剂量的示例性DLL3靶向三特异性分子(以CAT或TAC构型；SEQ ID No.1890和SEQ ID No.1891)，并在注射后不同时间点采集血清样品。每个剂量注射两只猴子。在电化学发光测定中，使用识别三特异性分子的抗独特型抗体来测量血清中DLL3靶向三特异性分子的量。图61示出了在不同时间点DLL3靶向三特异性分子水平的血清水平的图。然后将数据用于计算DLL3靶向三特异性分子的药代动力学性质，如表15所示。基于药代动力学数据，可以考虑每周一次或两次的人用给药时间表。
表15：示例性DLL3靶向三特异性分子的药代动力学
Figure BDA0003083515520001121
当以1或10mg/kg给药时，DLL3靶向三特异性蛋白在食蟹猴中的半衰期为约2.8至约3.3天：
对于本研究，向食蟹猴静脉内注射1mg/kg或10mg/kg剂量的示例性DLL3靶向三特异性分子，并在注射后不同时间点采集血清样品。每个剂量注射两只猴子。在电化学发光测定中，使用识别TriTAC分子的抗独特型抗体来测量血清中DLL3靶向TriTAC的量。图62示出了在不同时间点DLL3靶向三特异性分子水平的血清水平的图。然后将数据用于计算该TriTAC分子的药代动力学性质，如表16所示。药代动力学数据提示每周一次或两次给药。
表16：示例性DLL3靶向三特异性分子的的药代动力学
Figure BDA0003083515520001122
当以最高10mg/kg的单次剂量给予时，示例性DLL3靶向三特异性蛋白在食蟹猴中可耐受：
观察到血清细胞因子水平的短暂增加，主要是在以10mg/kg的剂量施用示例性DLL3靶向三特异性蛋白(以CAT构型)时(图63；IFNγ-图63上图，IL-6图63第二幅图；IL-10图63第三幅图)。还观察到瞬时T细胞边缘化和T细胞活化(数据未显示)。在终末和恢复安乐死时，未观察到与DLL3三特异性蛋白相关的肉眼发现或器官重量差异，而在恢复安乐死时，未观察到与DLL3三特异性蛋白相关的显微镜下发现。
为了证明在向食蟹猴施用后，DLL3靶向TriTAC保留细胞引导的杀伤活性，在DMS53TDCC测定检测了在给药后168小时收集的10mg/kg剂量组的血清样品，并将其与新鲜融化的DLL3靶向TriTAC进行比较。对于血清样品和新鲜融化的蛋白观察到相同的细胞DMS53细胞杀伤(图64)，表明DLL3靶向TriTAC在食蟹猴给药1周后保留了引导T细胞杀死靶细胞的能力。
实施例17：异种移植肿瘤模型
在异种移植模型中评价本公开的示例性抗DLL3靶向三特异性蛋白。
向雌性免疫缺陷NOD/scid小鼠进行亚致死照射(2Gy)，并将1x106个NCI-H28细胞皮下接种到它们的右背侧。当肿瘤达到100至200mm3时，将动物分成3个处理组。第2组和第3组(各8只动物)腹膜内注射1.5x107个活化的人T细胞。三天后，用示例性DLL3三特异性抗原结合蛋白的总共9个静脉内剂量(如1、10、50或100μg/kg)(qdx9d)处理第3组的动物。第1组和第2组仅用媒介物处理。测量体重和肿瘤体积30天。
与相应媒介物处理的对照组相比，预期用前述实施例的示例性DLL3靶向三特异性蛋白治疗的动物具有统计学上显著的肿瘤生长延迟。
实施例18：关于将示例性DLL3三特异性抗原结合蛋白(抗DLL3三特异性蛋白)施用 于神经内分泌癌症患者的概念验证临床试验方案
这是用于研究示例性DLL3三特异性抗原结合蛋白作为神经内分泌癌症治疗的I/II期临床试验。
研究结局指标：
主要：示例性DLL3靶向三特异性蛋白的最大耐受剂量。
次要：确定示例性DLL3靶向三特异性蛋白的体外反应是否与临床反应相关
I期
最大耐受剂量(MTD)在该试验的I期部分确定。
1.1最大耐受剂量(MTD)在该试验的I期部分中确定。
1.2满足合格性标准的患者加入试验中，以评价示例性DLL3靶向三特异性蛋白。
1.3目标是确定示例性抗DLL3三特异性蛋白可以在参与者中安全地施用而没有严重的或难以处理的副作用的最高剂量。给定的剂量取决于之前已经入选该研究的参与者的数目以及剂量耐受程度。并非所有参与者都接受相同的剂量。
II期
2.1随后的II期部分以MTD进行治疗，目的是确定采用示例性DLL3靶向三特异性蛋白的疗法是否会导致至少20％的反应率。
II期的主要结果---确定采用示例性DLL3靶向三特异性蛋白的疗法是否会致使至少20％的患者实现临床反应(强烈反应(blast response)、轻微反应、部分反应或完全反应)。
合格性：活检证实神经内分泌肿瘤，生长抑素受体PET证实为生长抑素受体阳性。
所有地点或来源均有资格。
允许功能性和非功能性肿瘤。
不适合进行外科手术缩减。
ECOG体力状态为0、1或2
年龄>18岁。
能够理解书面知情同意文件并愿意签字。
虽然本文已经显示并描述了本发明的优选实施方案，但是对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现将想到许多变化、改变和替换。应当理解，在实施本发明的过程中可以采用本文所述的本发明实施方案的各种替代方案。旨在以所附权利要求书限定本发明的范围，由此涵盖在这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。
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连接体
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CD3结合域CDR序列s
Figure BDA0003083515520001722
Figure BDA0003083515520001731
Figure BDA0003083515520001741
Figure BDA0003083515520001751
DLL3 Protein UniProtKB登录Q9NYJ7(SEQ ID NO:1885)
>sp|Q9NYJ7|DLL3_人Delta-样蛋白3OS＝智人OX＝9606GN＝DLL3 PE＝1SV＝1MVSPRMSGLLSQTVILALIFLPQTRPAGVFELQIHSFGPGPGPGAPRSPCSARLPCRLFFRVCLKPGLSEEAAESPCALGAALSARGPVYTEQPGAPAPDLPLPDGLLQVPFRDAWPGTFSFIIETWREELGDQIGGPAWSLLARVAGRRRLAAGGPWARDIQRAGAWELRFSYRARCEPPAVGTACTRLCRPRSAPSRCGPGLRPCAPLEDECEAPLVCRAGCSPEHGFCEQPGECRCLEGWTGPLCTVPVSTSSCLSPRGPSSATTGCLVPGPGPCDGNPCANGGSCSETPRSFECTCPRGFYGLRCEVSGVTCADGPCFNGGLCVGGADPDSAYICHCPPGFQGSNCEKRVDRCSLQPCRNGGLCLDLGHALRCRCRAGFAGPRCEHDLDDCAGRACANGGTCVEGGGAHRCSCALGFGGRDCRERADPCAARPCAHGGRCYAHFSGLVCACAPGYMGARCEFPVHPDGASALPAAPPGLRPGDPQRYLLPPALGLLVAAGVAGAALLLVHVRRRGHSQDAGSRLLAGTPEPSVHALPDALNNLRTQEGSGDGPSSSVDWNRPEDVDPQGIYVISAPSIYAREVATPLFPPLHTGRAGQRQHLLFPYPSSILSVK
51X5(SEQ ID NO:1886)
EVQLVESGGGLVQPGGSLTLSCAASLSSVSVLSIAWYRQAPGKKRELVAGISTDGSTVYIDSVKGRFTISRD
NAKNSVYLQMNSLRAEDTAVYYCYAYSWTTSLPYWGQGTLVTVSS
51X5 CDR1(SEQ ID NO:1887)
LSSVSVLSIA
51X5 CDR2(SEQ ID NO:1888)
GISTDGSTVYIDSVKG
51X5 CDR3(SEQ ID NO:1889)
YSWTTSLPY
>NP_058637.1δ-样蛋白3同种型1前体[智人](SEQ ID No.1892)
MVSPRMSGLLSQTVILALIFLPQTRPAGVFELQIHSFGPGPGPGAPRSPCSARLPCRLFFRVCLKPGLSEEAAESPCALGAALSARGPVYTEQPGAPAPDLPLPDGLLQVPFRDAWPGTFSFIIETWREELGDQIGGPAWSLLARVAGRRRLAAGGPWARDIQRAGAWELRFSYRARCEPPAVGTACTRLCRPRSAPSRCGPGLRPCAPLEDECEAPLVCRAGCSPEHGFCEQPGECRCLEGWTGPLCTVPVSTSSCLSPRGPSSATTGCLVPGPGPCDGNPCANGGSCSETPRSFECTCPRGFYGLRCEVSGVTCADGPCFNGGLCVGGADPDSAYICHCPPGFQGSNCEKRVDRCSLQPCRNGGLCLDLGHALRCRCRAGFAGPRCEHDLDDCAGRACANGGTCVEGGGAHRCSCALG
FGGRDCRERADPCAARPCAHGGRCYAHFSGLVCACAPGYMGARCEFPVHPDGASALPAAPPGLRPGDPQR
YLLPPALGLLVAAGVAGAALLLVHVRRRGHSQDAGSRLLAGTPEPSVHALPDALNNLRTQEGSGDGPSSSVDWNRPEDVDPQGIYVISAPSIYAREVATPLFPPLHTGRAGQRQHLLFPYPSSILSVK
DLL3蛋白质序列(SEQ ID NO:1893)
RSPCSARLPCRLFFRVCLKPGLSEEAAESPCALGAALSARGPVYTEQPGAPAPDLPLPDGLLQVPFRDAWPGTFSFIIETWREELGDQIGGPAWSLLARVAGRRRLAAGGPWARDIQRAGAWELRFSYRARCEPPAVGTACTRLCRPRSAPSRCGPGLRPCAPLEDECEAPLVCRAGCSPEHGFCEQPGECRCLEGWTGPLCTVPVSTSSCLSPRGPSSATTGCLVPGPGPCDGNPCANGGSCSETPRSFECTCPRGFYGLRCEVSGVTCADGPCFNGGLCVGGADPDSAYICHCPPGFQGSNCEKRVDRCSLQPCRNGGLCLDLGHALRCRCRAGFAGPRCEHDLDDCAGRACANGGTCVEGGGAHRCSCALGFGGRDCRERADPCAARPCAHGGRCYAHFSGLVCACAPGYMGARCEFPVHPDGASALPAAPPGLRPGDPQRYL

Claims (122)

1.一种DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述蛋白包含
(a)能与人CD3特异性结合的第一结构域(A)；
(b)第二结构域(B)，其为半衰期延长结构域；和
(c)能与DLL3蛋白特异性结合的第三结构域(C)。
2.根据权利要求1所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述结构域以H2N-(A)-(B)-(C)-COOH、H2N-(A)-(C)-(B)-COOH、H2N-(B)-(A)-(C)-COOH、H2N-(B)-(C)-(A)-COOH、H2N-(C)-(B)-(A)-COOH或H2N-(C)-(A)-(B)-COOH的顺序连接。
3.根据权利要求1或2所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述第三结构域(C)包含亲和力成熟的结合分子。
4.根据权利要求3所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述亲和力成熟的结合分子衍生自与所述DLL3蛋白特异性结合的亲本分子。
5.根据权利要求3或4所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述亲和力成熟的结合分子在亲和力成熟轮次后衍生自与DLL3特异性结合的亲本分子。
6.根据权利要求5所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述亲和力成熟轮次包括针对所述DLL3蛋白淘选噬菌体展示文库。
7.根据权利要求6所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述噬菌体展示文库是通过使所述亲本分子的一个或多个残基突变而生成的。
8.根据权利要求7所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述噬菌体展示文库表达衍生自所述亲本分子的一种或多种分子。
9.根据权利要求8所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述亲和力成熟的结合分子选自衍生自所述亲本分子的一种或多种分子。
10.根据权利要求3-9中任一项所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述亲和力成熟的DLL3结合分子对所述DLL3蛋白的结合亲和力大于所述亲本分子对所述DLL3蛋白的结合亲和力。
11.根据权利要求10所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述亲和力成熟的DLL3结合分子对所述DLL3蛋白的结合亲和力是所述亲本分子对所述DLL3蛋白的结合亲和力的约2倍至约50倍。
12.根据权利要求10所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述亲和力成熟的DLL3结合分子对所述DLL3蛋白的结合亲和力是所述亲本分子对所述DLL3蛋白的结合亲和力的约3倍。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述第三结构域(C)包含与选自SEQ ID No.1-442和1886的序列至少约75％相同的序列。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述第三结构域(C)包含与选自SEQ ID No.1-52的序列至少约75％相同的序列。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述第三结构域(C)包含CDR1、CDR2和CDR3。
16.根据权利要求15所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述CDR1包含选自SEQ IDNo.443-884和1887的序列，或相对于选自SEQ ID No.443-884和1887的序列的一个或多个氨基酸置换。
17.根据权利要求15或16所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述CDR2包含选自SEQID No.885-1326和1888的序列，或相对于选自SEQ ID No.885-1326和1888的序列的一个或多个氨基酸置换。
18.根据权利要求15、16和17中任一项所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述CDR3包含选自SEQ ID No.1327-1768和1889的序列，或相对于选自SEQ ID No.1327-1768和1889的序列的一个或多个置换。
19.根据权利要求15所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述CDR1包含选自SEQ IDNo.495-528的序列，或相对于选自SEQ ID No.495-528的序列的一个或多个氨基酸置换。
20.根据权利要求15或19所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述CDR2包含选自SEQID No.937-970的序列，或相对于选自SEQ ID No.937-970的序列的一个或多个氨基酸置换。
21.根据权利要求15、19和20中任一项所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述CDR3包含选自SEQ ID No.1379-1412的序列，或相对于选自SEQ ID No.1379-1412的序列的一个或多个氨基酸置换。
22.根据权利要求15所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述第三结构域(C)包含与选自SEQ ID No.53-86的序列至少约80％相同的序列。
23.根据权利要求22所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述CDR1包含选自SEQ IDNo.529-809的序列，或相对于选自SEQ ID No.529-809的序列的多个氨基酸置换。
24.根据权利要求22或23所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述CDR2包含的序列具有相对于选自SEQ ID No.971-1251的序列的一个或多个氨基酸置换。
25.根据权利要求23或24所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述CDR3包含选自SEQID No.1379-1412的序列，或相对于选自SEQ ID No.1379-1412的序列的一个或多个氨基酸置换。
26.根据权利要求15所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述第三结构域(C)包含与选自SEQ ID No.87-367的序列至少约75％相同的序列。
27.根据权利要求26所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述CDR1包含选自SEQ IDNo.810-884的序列，或相对于选自SEQ ID No.810-884的序列的一个或多个氨基酸置换。
28.根据权利要求26或27所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述CDR2包含选自SEQID No.1252-1326的序列，或相对于选自SEQ ID No.1252-1326的序列的一个或多个氨基酸置换。
29.根据权利要求26、27或28所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述CDR3包含选自SEQ ID No.1692-1768的序列，或相对于选自SEQ ID No.1692-1768的序列的一个或多个氨基酸置换。
30.根据权利要求15所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述第三结构域(C)包含与选自SEQ ID No.368-442的序列至少约75％相同的序列。
31.一种DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述蛋白包含
(a)能与人CD3特异性结合的第一结构域(A)；
(b)第二结构域(B)，其为半衰期延长结构域；和
(c)能与DLL3特异性结合的第三结构域(C)，其中所述第三结构域包含SEQ ID No.68的序列或衍生自SEQ ID No.68。
32.根据权利要求31所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述第三结构域(C)衍生自SEQ ID No.68。
33.根据权利要求32所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中SEQ ID No.68包含CDR1、CDR2和CDR3。
34.根据权利要求33所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述CDR1包含以下序列：GX1X2X3X4X5NX6X7X8。
35.根据权利要求33或34所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述CDR2包含以下序列：GJ1SJ2J3J4J5J6J7J8J9J10SJ11KJ12(SEQ ID No.1895)。
36.根据权利要求33、34或35所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述CDR3包含以下序列：Z1Z2Z3Z4Z5Z6Z7Z8Z9Z10Z11。
37.根据权利要求34-36中任一项所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中：
X1为A、E、F、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、V或Y；
X2为A、G、I、K、P、R、S、T或V；
X3为A、D、F、K、L、N、P、Q、R、S、T或Y；
X4为A、D、F、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V或Y；
X5为F、I、K、L、M、N、R、S、T或V；
X6为A或G；
X7为F、I、L、M、T、V或Y；且
X8为A或G。
38.根据权利要求34-37中任一项所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中：
J1为I或V；
J2为A、K、P、R或S；
J3为D或N；
J4为D、E、G、K、N、Q、R、S、T或Y；
J5为S或T；
J6为A、E、F、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V或Y；
J7为A、I、L、M、V或Y；
J8为D、F、H、I、L、N、S、T、V或Y；
J9为A、D、E、F、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、V或Y；
J10为A、D、E、G、K、Q、S或V；
J11为A或V；且
J12为G或V。
39.根据权利要求34-38中任一项所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中：
Z1为F或Y；
Z2为G、H、I、K、N、R、S或T；
Z3为A、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T或Y；
Z4为A、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V或Y；
Z5为A、C、D、E、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、W或Y；
Z6为G、K、L、R或T；
Z7为A、G、H、L、Q、R、S、T、V或Y；
Z8为A、D、E、G、H、P、Q、S、T、W或Y；
Z9为A、G、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V或Y；
Z10为A、G、K、P、R、S、T或V；且
Z11为A、F、S或Y。
40.一种DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述蛋白包含
(a)能与人CD3特异性结合的第一结构域(A)；
(b)第二结构域(B)，其为半衰期延长结构域；和
(c)能与DLL3特异性结合的第三结构域(C)，其中所述第三结构域包含SEQ ID No.75的序列或衍生自SEQ ID No.75。
41.根据权利要求40所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中SEQ ID No.75包含CDR1、CDR2和CDR3。
42.根据权利要求41所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述CDR1包含以下序列：X1X2X3X4X5X6X7SX8A。
43.根据权利要求41或42所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述CDR2包含以下序列：GJ1SJ2J3GJ4J5J6YJ7J8SVKG(SEQ ID NO.1894)。
44.根据权利要求41、42和43中任一项所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述CDR3包含以下序列：Z1Z2Z3Z4Z5Z6Z7Z8Z9。
45.根据权利要求42-44中任一项所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中：
X1为A、D、E、F、G、H、K、L、M、N、Q、R、S、V、W或Y；
X2为D、E、H、K、M、P、R、S、T或Y；
X3为A、D、G、H、K、N、P、Q、R、S、T、V或Y；
X4为K、S或V；
X5为A、F、G、H、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；
X6为D、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、V或Y；
X7为L或M；且
X8为I、L、M、S、T或V。
46.根据权利要求42-45中任一项所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中：
J1为I或V；
J2为A、D、E、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V或Y；
J3为A、D、E、G、H、N、R或T；
J4为H、P、R或S；
J5为A、H、I、K、M、N、Q、R、T或V；
J6为A、D、G、H、I、L、M、N、S、T、V或Y；
J7为A、F、I、L、M、R、S、T、V或Y；
J8为A、D、E、G、H、K、L、N、R、S或V。
47.根据权利要求42-46中任一项所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中：
Z1为L或Y；
Z2为D、E、G、H、K、N、Q、R、S、T、V或Y；
Z3为Q或W；
Z4为A、D、E、G、H、I、K、L、M、P、R、S、T或V；
Z5为A、D、E、G、N、R、S、T或Y；
Z6为A、P、R或S；
Z7为A、D、F、G、H、L、M、N、Q、R、S、T、V或Y；
Z8为A、G、I、K、P、Q、R、S或T；且
Z9为F、H或Y。
48.根据权利要求1-47中任一项所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述第三结构域(C)包含人源化抗体或其抗原结合片段。
49.根据权利要求1-48中任一项所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述第三结构域(C)包含与DLL3特异性结合的单结构域抗体、VHH结构域、scFv、VH结构域、VL结构域、Fab、Fab’、非Ig结构域、配体、knottin或小分子实体。
50.根据权利要求49中任一项所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述第三结构域(C)包含所述单结构域抗体。
51.根据权利要求1-50中任一项所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述第二结构域(B)结合大体积血清蛋白。
52.根据权利要求51所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述第二结构域(B)包含与所述大体积血清蛋白特异性结合的单结构域抗体、VHH结构域、scFv、VH结构域、VL结构域、Fab、Fab’、非Ig结构域、配体、knottin或小分子实体。
53.根据权利要求52所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述第二结构域(B)包含与所述大体积血清蛋白特异性结合的单结构域抗体。
54.根据权利要求53所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述大体积血清蛋白包括白蛋白、转铁蛋白、IgG1、IgG2、IgG4、IgG3、IgA单体、因子XIII、纤维蛋白原、IgE、五聚体IgM或无Igκ的轻链。
55.根据权利要求54所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述大体积血清蛋白包括白蛋白。
56.根据权利要求55所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述第二结构域(B)包含与选自SEQ ID No.1769-1778的序列至少约75％相同的序列。
57.根据权利要求56所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述第二结构域(B)包含与SEQ ID No.1774至少约75％相同的序列。
58.根据权利要求1-57中任一项所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述第一结构域(A)包含与CD3特异性结合的单结构域抗体、VHH结构域、scFv、VH结构域、VL结构域、Fab、Fab’、非Ig结构域、配体、knottin或小分子实体。
59.根据权利要求58所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述第一结构域(A)包含选自SEQ ID No.1793-1807的序列。
60.根据权利要求1-59中任一项所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述第三结构域(C)包含下式：
f1-r1-f2-r2-f3-r3-f4
其中，r1与选自SEQ ID No.443-884和1887的序列相同或相对于该序列包含一个或多个氨基酸残基置换；r2与选自SEQ ID No.885-1326和1888的序列相同或相对于该序列包含一个或多个氨基酸残基置换；且r3与选自SEQ ID No.1327-1768和1889的序列相同或相对于该序列包含一个或多个氨基酸残基置换；并且其中f1、f2、f3和f4是框架残基。
61.根据权利要求60所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述第三结构域(C)包含与选自SEQ ID No.1-442和1886的序列至少75％相同的序列。
62.根据权利要求1-61中任一项所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中结构域C和B通过连接体L1连接，并且结构域B和A通过连接体L2连接。
63.根据权利要求62所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中连接体L1和L2各自独立地选自(GS)n(SEQ ID No.1809)、(GGS)n(SEQ ID No.1810)、(GGGS)n(SEQ ID No.1811)、(GGSG)n(SEQ ID No.1812)、(GGSGG)n(SEQ ID No.1813)或(GGGGS)n(SEQ ID No.1814)，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，或GGGGSGGGS(SEQ ID No.1808)。
64.根据权利要求63所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中连接体L1和L2各自独立地为(GGGGS)4(SEQ ID No.1817)、(GGGGS)3(SEQ ID No.1818)或GGGGSGGGS(SEQ ID No.1808)。
65.根据权利要求1-64中任一项所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述蛋白以约0.1nM至约50nM的结合亲和力(Kd)与DLL3结合。
66.根据权利要求1-65中任一项所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述蛋白与人DLL3、食蟹猴DLL3或人和食蟹猴DLL3两者结合。
67.根据权利要求1-66中任一项所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述蛋白小于约80kDa。
68.根据权利要求1-67中任一项所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述蛋白为约50kDa至约75kDa。
69.根据权利要求1-68中任一项所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述蛋白小于约60kDa。
70.根据权利要求1-69中任一项所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述蛋白的消除半衰期为至少约50小时。
71.根据权利要求1-70中任一项所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述蛋白的消除半衰期为至少约100小时。
72.根据权利要求1-69中任一项所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述蛋白在施用于人类受试者时具有至少约25小时、至少约50小时或至少约100小时的消除半衰期。
73.根据权利要求1-72中任一项所述的DLL3靶向三特异性蛋白，其中所述结构域以H2N-(A)-(B)-(C)-COOH的顺序连接。
74.一种DLL3结合蛋白，其包含下式：
f1-r1-f2-r2-f3-r3-f4
其中，r1是互补决定区1(CDR1)，并且与选自SEQ ID No.443-884和1887的序列相同或相对于该序列包含一个或多个氨基酸残基置换；r2是CDR2，并且与选自SEQ ID No.885-1326和1888的序列相同或相对于该序列包含一个或多个氨基酸残基置换；且r3是CDR3，并且与选自SEQ ID No.1327-1768和1889的序列相同或相对于该序列包含一个或多个氨基酸残基置换；并且其中f1、f2、f3和f4是框架残基。
75.根据权利要求74所述的DLL3结合蛋白，其包含与选自SEQ ID No.1-442和1886的序列至少约75％相同的序列。
76.根据权利要求74或75所述的DLL3结合蛋白，其包含与选自SEQ ID No.1-52的序列至少约75％相同的序列。
77.根据权利要求74或75所述的DLL3结合蛋白，其包含与选自SEQ ID No.53-86的序列至少约75％相同的序列。
78.根据权利要求74或75所述的DLL3结合蛋白，其包含与选自SEQ ID No.87-367的序列至少约75％相同的序列。
79.根据权利要求74或75所述的DLL3结合蛋白，其包含与选自SEQ ID No.368-442的序列至少约75％相同的序列。
80.一种DLL3结合蛋白，其衍生自包含SEQ ID No.68的序列的亲本DLL3结合蛋白，或者包含SEQ ID No.68的序列。
81.一种DLL3结合蛋白，其衍生自包含SEQ ID No.75的序列的亲本DLL3结合蛋白，或者包含SEQ ID No.75的序列。
82.一种药物组合物，其包含(i)根据权利要求1-73中任一项所述的DLL3靶向三特异性蛋白或根据权利要求74-81中任一项所述的DLL3结合蛋白，和(ii)药学上可接受的载体。
83.一种制备根据权利要求1-73中任一项所述的DLL3靶向三特异性结合蛋白的方法，该方法包括：i)提供DLL3蛋白或其片段；ii)将DLL3结合蛋白的重组文库暴露于所述DLL3蛋白或其片段；iii)从所述文库中选择与所述寡聚物或其衍生物特异性结合的DLL3结合蛋白；以及(iv)使用步骤(iii)中鉴定的DLL3结合蛋白制备DLL3靶向三特异性蛋白。
84.根据权利要求83所述的方法，其中通过用所述DLL3蛋白筛查所述重组文库，将DLL3结合蛋白的所述重组文库在体外暴露于所述DLL3蛋白。
85.根据权利要求83或84所述的方法，其中所述重组文库在噬菌体的表面上表达。
86.根据权利要求83或84所述的方法，其中所述重组文库在酵母细胞的表面上表达。
87.根据权利要求83所述的方法，其中所述重组文库在细菌细胞的表面上表达。
88.根据权利要求83或84所述的方法，其中所述重组文库被表达为RNA-蛋白质融合体。
89.根据权利要求83-88中任一项所述的方法，其中所述重组文库是scFv文库或Fab文库。
90.根据权利要求83-88中任一项所述的方法，其中所述重组抗体文库是单结构域文库。
91.一种产生根据权利要求1-73中任一项所述的DLL3靶向三特异性蛋白的方法，所述方法包括在允许表达DLL3靶向三特异性蛋白的条件下培养用载体转化或转染的宿主，该载体包含编码根据权利要求1-73中任一项所述的DLL3三特异性蛋白的核酸序列，以及从培养物中回收并纯化所产生的蛋白。
92.一种制备根据权利要求74-81中任一项所述的DLL3结合蛋白的方法，该方法包括：i)提供DLL3蛋白或其片段；ii)将DLL3结合蛋白的重组文库暴露于所述DLL3蛋白或其片段；iii)从所述文库中选择与所述寡聚物或其衍生物特异性结合的DLL3结合蛋白。
93.根据权利要求92所述的方法，其中通过用所述DLL3蛋白筛查所述重组文库，将DLL3结合蛋白的所述重组文库在体外暴露于所述DLL3蛋白。
94.根据权利要求92或93所述的方法，其中所述重组文库在噬菌体的表面上表达。
95.根据权利要求92或93所述的方法，其中所述重组文库在酵母细胞的表面上表达。
96.根据权利要求93所述的方法，其中所述重组文库在细菌细胞的表面上表达。
97.根据权利要求92或93所述的方法，其中所述重组文库被表达为RNA-蛋白质融合体。
98.根据权利要求92-97中任一项所述的方法，其中所述重组文库是scFv文库或Fab文库。
99.根据权利要求92-97中任一项所述的方法，其中所述重组抗体文库是单结构域文库。
100.一种产生根据权利要求74-81中任一项所述的DLL3结合蛋白的方法，所述方法包括在允许表达DLL3结合蛋白的条件下培养用载体转化或转染的宿主，该载体包含编码根据权利要求74-81中任一项所述的DLL3结合蛋白的核酸序列，以及从培养物中回收并纯化所产生的蛋白。
101.一种治疗或改善增生性疾病或肿瘤性疾病的方法，其包括向有需要的受试者施用根据权利要求1-73中任一项所述的DLL3靶向三特异性蛋白，或根据权利要求74-81中任一项所述的DLL3结合蛋白，或根据权利要求82所述的药物组合物。
102.根据权利要求101所述的方法，其中所述受试者是人。
103.根据权利要求102所述的方法，其中所述方法进一步包括与根据权利要求1-73中任一项所述的DLL3靶向三特异性蛋白、根据权利要求74-81中任一项所述的DLL3结合蛋白或根据权利要求82所述的药物组合物联合施用药剂。
104.根据权利要求101-103中任一项所述的方法，其中所述DLL3靶向三特异性蛋白或DLL3结合蛋白选择性地结合表达DLL3的肿瘤细胞。
105.根据权利要求104所述的方法，其中所述DLL3靶向三特异性蛋白介导T细胞对表达DLL3的肿瘤细胞的杀伤。
106.根据权利要求101-105中任一项所述的方法，其中所述肿瘤性疾病包括实体瘤疾病。
107.根据权利要求106所述的方法，其中所述实体瘤疾病包括肺癌、胃癌、卵巢癌或三阴性乳腺癌。
108.根据权利要求107所述的方法，其中所述实体瘤疾病是转移性的。
109.一种治疗或改善增生性疾病或肿瘤性疾病的方法，其包括施用包含含有选自SEQID No.1-442和1886的序列的DLL3结合域的DLL3靶向三特异性蛋白，或包含选自SEQ IDNo.1-442和1886的序列的DLL3结合蛋白。
110.根据权利要求109所述的方法，其中所述DLL3靶向三特异性蛋白或DLL3结合蛋白选择性地结合表达DLL3的肿瘤细胞。
111.根据权利要求110所述的方法，其中所述DLL3靶向三特异性蛋白引导T细胞对表达DLL3的肿瘤细胞的杀伤。
112.根据权利要求109-111中任一项所述的方法，其中所述肿瘤性疾病包括实体瘤疾病。
113.根据权利要求112所述的方法，其中所述实体瘤疾病包括肺癌、胃癌、卵巢癌或三阴性乳腺癌。
114.根据权利要求113所述的方法，其中所述实体瘤疾病是转移性的。
115.一种治疗或改善增生性疾病或肿瘤性疾病的方法，其包括施用包含含有SEQ IDNo.68或75所示序列的DLL3结合域的DLL3靶向三特异性蛋白，或包含SEQ ID No.68或75所示序列的DLL3结合蛋白。
116.根据权利要求101-115中任一项所述的方法，其包括以至多10mg/kg的剂量施用所述DLL3靶向三特异性蛋白或DLL3结合域。
117.根据权利要求101-116中任一项所述的方法，其中所述蛋白每周施用至少一次。
118.根据权利要求101-117中任一项所述的方法，其中所述蛋白每周施用两次。
119.根据权利要求101-116中任一项所述的方法，其中所述蛋白每隔一周施用一次。
120.根据权利要求101-116中任一项所述的方法，其中所述蛋白每三周施用一次。
121.一种DLL3结合蛋白，其包含SEQ ID No.1890或SEQ ID No.1891所示的氨基酸序列。
122.根据权利要求1-81和104中任一项所述的DLL3结合蛋白，其中所述蛋白能够结合包含SEQ ID No.1892和1893中任一个所示的氨基酸序列的DLL3序列。
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