JP2010500876A - Ｉｌ−６媒介性シグナル伝達に関連する疾患及び障害の治療のための、ｉｌ−６ｒに指向性を有するアミノ酸配列及びこれを含むポリペプチド - Google Patents

Ｉｌ−６媒介性シグナル伝達に関連する疾患及び障害の治療のための、ｉｌ−６ｒに指向性を有するアミノ酸配列及びこれを含むポリペプチド Download PDF

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Abstract

本発明は、ＩＬ−６受容体に指向性を有する及び／又はこれと特異的に結合することができるアミノ酸配列と、当該アミノ酸配列を含む化合物又は構築物と、当該アミノ酸配列、化合物又は構築物をコードする核酸と、当該アミノ酸配列、化合物又は構築物を含む薬学的組成物と、ＩＬ−６受容体に関連がある疾患及び障害を予防及び／又は治療する方法とに関する。
【選択図】なし

Description

本発明は、（本明細書に規定の）インターロイキン−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）に指向性を有するアミノ酸配列と、１つ又は複数のこのようなアミノ酸配列を含むか、又は本質的にこれから成る、化合物又は構築物、特にタンパク質及びポリペプチド（本明細書でそれぞれ、「本発明のアミノ酸配列」、「本発明の化合物」、及び「本発明のポリペプチド」とも称される）とに関する。
本発明は、このようなアミノ酸配列及びポリペプチドをコードする核酸（本明細書で、「本発明の核酸」又は「本発明のヌクレオチド配列」とも称される）と、このようなアミノ酸配列及びポリペプチドを製造する方法と、このようなアミノ酸配列又はポリペプチドを発現する（又は発現することができる）宿主細胞と、このようなアミノ酸配列、ポリペプチド、核酸及び／又は宿主細胞を含む組成物、特に薬学的組成物と、特に予防目的、治療目的又は診断目的（例えば、本明細書で言及される予防目的、治療目的又は診断目的）のためのこのようなアミノ酸配列若しくはポリペプチド、核酸、宿主細胞及び／又は組成物の使用とにも関する。
本発明の他の態様、実施の形態、利点及び用途は、本明細書中のさらなる記載から明らかになる。
元々Ｂ細胞分化因子として同定されたタンパク質であるＩＬ−６（特許文献１）と、ＩＬ−６Ｒ（特許文献２）との相互作用によって、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体が形成される。この複合体は、標的細胞上の膜タンパク質であるｇｐ１３０（特許文献３）と結合し、ＩＬ−６の様々な生理作用を伝える。現在ＩＬ−６は、とりわけ免疫応答の調節、造血、急性期応答、骨代謝、血管形成、及び炎症に関与することが知られている。ＩＬ−６産生の脱調節は、幾つかの自己免疫疾患プロセス及び慢性炎症増殖性疾患プロセスの病変に関与する（非特許文献１）。結果として、過去にはＩＬ−６誘導性シグナル伝達の阻害剤に大きな注目が集まった（非特許文献２）。ＩＬ−６（特許文献４）、ＩＬ−６Ｒ（特許文献５）又はｇｐ１３０（特許文献６）とのポリペプチドの特異的結合がＩＬ−６の機能化に対して有効な阻害作用を示すことが証明された。
ＩＬ−６過剰産生及びシグナル伝達（特にいわゆるトランスシグナル伝達（trans-signalling））は、様々な疾患及び障害（例えば敗血症（非特許文献３）、及び多発性骨髄腫疾患（ＭＭ）、腎細胞癌（ＲＣＣ）、形質細胞性白血病（非特許文献４）、リンパ腫、Ｂ−リンパ増殖性障害（ＢＬＰＤ）及び前立腺癌等の様々な形態の癌）に関与する。過剰なＩＬ−６産生又はシグナル伝達によって引き起こされる他の疾患の非限定的な例としては、骨吸収（骨粗鬆症）（非特許文献５、非特許文献６）、悪液質（非特許文献７）、乾癬、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、カポジ肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫（非特許文献８）、炎症性疾患及び障害（例えばリウマチ性関節炎、全身性発症若年性特発性関節炎、高ガンマグロブリン血症（非特許文献９）、クローン病、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症、キャッスルマン病、ＩｇＭ免疫グロブリン血症、心臓粘液腫、喘息（特にアレルギー性喘息）及び自己免疫インスリン依存性糖尿病（非特許文献１０））が挙げられる。他のＩＬ−６関連障害は当業者にとって明らかである。
例えば上記の参考文献から分かるように、従来技術は、ＩＬ−６関連障害の予防及び治療のためのヒトＩＬ−６、ヒトＩＬ−６Ｒ及びヒトｇｐ１３０タンパク質に指向性を有する抗体及び抗体断片を説明している。例は、トシリズマブ（非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１４を参照されたい）、ＢＥ８（非特許文献１５、非特許文献１６、非特許文献１７、非特許文献１８を参照されたい）及びCentocorのＣＮＴＯ−３２８（非特許文献１９、非特許文献２０、非特許文献２１を参照されたい）である。ＩＬ−６関連障害の予防及び治療のための当該技術分野で既知の別の有効成分は、可溶性ｇｐ１３０のＦｃ融合である（非特許文献２２、非特許文献２３、非特許文献２４、非特許文献２５を参照されたい）。
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本発明のアミノ酸配列、ポリペプチド及び組成物は概して、ＩＬ−６ＲとＩＬ−６との結合及び／又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体とｇｐ１３０との結合を調節（特に抑制及び／又は阻害）するために、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体若しくはｇｐ１３０によって媒介されるシグナル伝達を調節（特に抑制及び／又は阻害）するために、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体及び／又はｇｐ１３０が関与する生物学的経路を調節するために、及び／又はこのようなシグナル伝達若しくはこれらの経路に関連する生物学的機構、応答及び作用を調節するために使用することができる。
本発明に関して、例えば「ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体とｇｐ１３０との間の相互作用を調節すること」は、本発明のアミノ酸配列又はナノボディの非存在下での複合体の形成及び当該複合体とｇｐ１３０との結合と比べて、
複合体とｇｐ１３０との結合によって誘導／媒介されるシグナル伝達を調節（例えば低減）するように、複合体とｇｐ１３０との結合（例えばｇｐ１３０に対する複合体の親和性）を低減する（又は逆にｇｐ１３０と複合体との結合（例えば複合体に対するｇｐ１３０の親和性）を低減する）ように、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体の形成を抑制するか、又はこれに作用する（例えば完全に又は部分的に破壊する）ようなＩＬ−６Ｒ（即ちそれ自体又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体で存在する）との結合、或いは
複合体とｇｐ１３０との結合によって誘導／媒介されるシグナル伝達を調節（例えば低減）するように、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体の形成には本質的に作用しないが、当該複合体とｇｐ１３０との結合を調節（例えば抑制）するようなＩＬ−６Ｒ（即ちそれ自体又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体で存在する）との結合を意味し得る。
したがって１つの具体的ではあるが、非限定的な態様において、本発明は、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−６媒介性シグナル伝達若しくはＩＬ−６Ｒ媒介性シグナル伝達、及び／又はＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ及び／又はＩＬ−６媒介性シグナル伝達若しくはＩＬ−６Ｒ媒介性シグナル伝達に関与する生物学的経路機構、応答及び／又は作用の拮抗因子である、及び／又は拮抗因子として使用することができる、ポリペプチド及び組成物を提供する。
このように、本発明のアミノ酸配列、ポリペプチド及び組成物は、例えばＩＬ−６Ｒ上のＩＬ−６結合部位にある、このＩＬ−６結合部位の一部を形成する、又はこのＩＬ−６結合部位と（即ち一次構造又は三次構造で）重なる、又はこのＩＬ−６結合部位と（即ち一次構造又は三次構造で）密接しているエピトープと（例えばＩＬ−６と競合して）結合し、ＩＬ−６Ｒ上のｇｐ１３０結合部位にある、このｇｐ１３０結合部位の一部を形成する、又はこのｇｐ１３０結合部位と（即ち一次構造又は三次構造で）重なる、又はこのｇｐ１３０結合部位と（即ち一次構造又は三次構造で）密接しているエピトープと（例えばｇｐ１３０と競合して）結合し、及び／又は複合体上のｇｐ１３０結合部位にある、この複合体上のｇｐ１３０結合部位の一部を形成する、又はこの複合体上のｇｐ１３０結合部位と（即ち一次構造又は三次構造で）重なる、又はこの複合体上のｇｐ１３０結合部位と（即ち一次構造又は三次構造で）密接しているエピトープと（例えばｇｐ１３０と競合して）結合し得る。好ましくは、任意のこのようなエピトープは細胞外エピトープである。好ましくは本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドが結合し得る、特定のエピトープの幾つかは、さらなる本明細書中の記載から明らかになる。
このように、本発明のアミノ酸配列、ポリペプチド及び組成物は、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−６及び／又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体（任意でさらにｇｐ１３０との複合体）に、及び／又はＩＬ−６及び／又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体（任意でさらにｇｐ１３０との複合体）が関与するシグナル伝達経路（複数可）及び／又は生物学的機能及び応答に関連する疾患及び障害の予防及び治療のために、並びに特にＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−６及び／又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体（任意でさらにｇｐ１３０との複合体）に、及び／又はＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ及び／又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体（任意でさらにｇｐ１３０との複合体）が関与するシグナル伝達経路（複数可）及び／又は生物学的機能及び応答に関連する疾患及び障害の予防及び治療のために使用することができ、これらはＩＬ−６Ｒによって媒介される過剰及び／又は不要なシグナル伝達、又はＩＬ−６Ｒが関与する経路（複数可）を特徴とする。ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−６及び／又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に、及び／又はＩＬ−６及び／又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体が関与するシグナル伝達経路（複数可）及び／又は生物学的機能及び応答に関連する、このような疾患及び障害の例は、本明細書中の開示に基づき、当業者にとって明らかであり、例えば以下の疾患及び障害を含む：敗血症（非特許文献３）及び多発性骨髄腫疾患（ＭＭ）、腎細胞癌（ＲＣＣ）、形質細胞性白血病（非特許文献４）、リンパ腫、Ｂ−リンパ増殖性障害（ＢＬＰＤ）及び前立腺癌等の様々な形態の癌。過剰なＩＬ−６産生又はシグナル伝達によって引き起こされる他の疾患の非限定的な例としては、骨吸収（骨粗鬆症）（非特許文献５、非特許文献６）、悪液質（非特許文献７）、乾癬、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、カポジ肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫（非特許文献８）、リウマチ性関節炎、全身性発症若年性特発性関節炎、高ガンマグロブリン血症（非特許文献９）等の炎症性疾患及び障害、クローン病、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症、キャッスルマン病、ＩｇＭ免疫グロブリン血症、心臓粘液腫、喘息（特にアレルギー性喘息）及び自己免疫インスリン依存性糖尿病（非特許文献１０）が挙げられる。他のＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−６及び／又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体関連障害は当業者にとって明らかである。このような疾患及び障害は一般的に、「ＩＬ−６Ｒ関連障害」とも称される。
したがってこれに限定されないが、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは例えば、ＩＬ−６Ｒ媒介シグナル伝達を調節することができる活性成分（例えば上記の従来技術で言及されるもの）で現在予防又は治療されている全ての疾患及び障害を予防及び／又は治療するのに使用することができる。本発明のポリペプチドは、このような活性成分による治療が現在展開中であるか、提案されているか、又は将来提案若しくは展開予定である全て疾患及び障害を予防及び／又は治療するのに使用することができることも予想される。また、本明細書でさらに記載される有利な特性から、本発明のポリペプチドは、これらの既知の活性成分が現在使用中か又は提案若しくは展開予定であるもの以外の疾患及び障害の予防及び治療に使用してもよいこと、及び／又は本発明のポリペプチドは、本明細書に記載の疾患及び障害を治療する新規の方法及びレジメンを提供し得ることが予想される。
本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドの他の用途及び使用は、本明細書のさらなる開示から当業者にとって明らかになる。
概して本発明の目的は、（本明細書に規定の）１つ又は複数のＩＬ−６Ｒ関連障害の診断、予防及び／又は治療に使用することができる、薬理学的に活性のある作用物質、及びこれを含む組成物を提供すること、並びにこのような作用物質及び組成物の投与及び／又は使用を伴う、このような疾患及び障害を診断、予防及び／又は治療する方法を提供することである。
具体的には本発明の目的は、現在当該技術分野で使用されている、及び／又は既知の作用物質、組成物及び／又は方法に比べて或る特定の利点を有するような薬理学的に活性のある作用物質、組成物及び／又は方法を提供することである。これらの利点は、以下のさらなる記載から明らかになる。
より具体的には本発明の目的は、（本明細書に規定のように）１つ又は複数のＩＬ−６Ｒ関連障害の診断、予防及び／又は治療に、薬理学的に活性のある作用物質、及びこれを含む組成物として使用することができる治療タンパク質を提供すること、並びにこのような治療タンパク質及び組成物の投与及び／又は使用を伴うような疾患及び障害を診断、予防及び／又は治療する方法を提供することである。
したがって本発明の特定の目的は、（本明細書に規定の）ＩＬ−６Ｒ、具体的には温血動物由来のＩＬ−６Ｒ、より具体的には哺乳動物由来のＩＬ−６Ｒ、特にヒトＩＬ−６Ｒに指向性があるアミノ酸配列及びポリペプチドを提供すること、並びに少なくとも１つのこのようなアミノ酸配列を含むか、又は本質的にこれから成るタンパク質及びポリペプチドを提供することである。
具体的には本発明の特定の目的は、温血動物、具体的に哺乳動物、より具体的にヒトにおいて予防的用途、治療的用途及び／又は診断的用途に好適であるようなアミノ酸配列及びタンパク質及び／又はポリペプチドを提供することである。
より具体的には本発明の特定の目的は、温血動物、具体的に哺乳動物、より具体的にヒトにおいて（本明細書に規定の）１つ又は複数のＩＬ−６Ｒ関連障害の予防、治療、緩和及び／又は診断に使用することができるようなアミノ酸配列及びタンパク質及び／又はポリペプチドを提供することである。
本発明の特定の目的は、温血動物、具体的に哺乳動物、より具体的にヒトにおいて（本明細書に規定の）１つ又は複数のＩＬ−６Ｒ関連障害の予防及び／又は治療のための薬学的組成物又は獣医学的組成物の調製に使用することができるようなアミノ酸配列及びタンパク質及び／又はポリペプチドを提供することでもある。
本発明において概して、これらの目的は、本明細書に記載のアミノ酸配列、タンパク質、ポリペプチド及び組成物の使用によって達成される。
概して本発明は、（本明細書に規定のように）ＩＬ−６Ｒに指向性を有する、及び／又は（本明細書に規定のように）ＩＬ−６Ｒと特異的に結合することができる、アミノ酸配列及びポリペプチド、並びに少なくとも１つのこのようなアミノ酸配列を含む、化合物及び構築物、特にタンパク質及びポリペプチドを提供する。
より具体的には本発明は、本明細書に規定のように（さらに本明細書に記載されるような（実際又は見掛けの）ＫＤ値、（実際又は見掛けの）ＫＡ値、ｋｏｎ速度及び／又はｋｏｆｆ速度、又は代替的にＩＣ５０値として好適に測定される、及び／又は表される）親和性でＩＬ−６Ｒと結合することができるアミノ酸配列、並びに少なくとも１つのこのようなアミノ酸配列を含む、化合物及び構築物、特にタンパク質及びポリペプチドを提供する。
特に、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドが、１０−５モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及び好ましくは１０−７モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及びより好ましくは１０−８モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌの解離定数（ＫＤ）で（即ち１０５Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モル以上、及び好ましくは１０７Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モル以上、及びより好ましくは１０８Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モルの結合定数（ＫＡ）で）ＩＬ−６Ｒと結合するようなもの、及び／又は
１０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０３Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは１０４Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１等のｋｏｎ速度でＩＬ−６Ｒと結合するようなもの、及び／又は
１ｓ−１（ｔ１／２＝０．６９ｓ）〜１０−６ｓ−１（ｔ１／２が数日である略不可逆的な複合体の場合）、好ましくは１０−２ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−３ｓ−１〜１０−６ｓ−１、１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１等のｋｏｆｆ速度でＩＬ−６Ｒと結合するようなものであるのが好ましい。
好ましくは、本発明の一価のアミノ酸配列（又は本発明のアミノ酸配列を１つだけ含有するポリペプチド）が、５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、５００ｐＭ未満等の親和性でＩＬ−６Ｒと結合するようなものであるのが好ましい。
本発明のアミノ酸配列又はポリペプチドとＩＬ−６Ｒとの結合に関する幾つかの好ましいＩＣ５０値は、本明細書のさらなる記載及び実施例から明らかになる。
ＩＬ−６Ｒとの結合のために、本発明のアミノ酸配列は通常、そのアミノ酸配列内に１つ又は複数のアミノ酸残基或いは１つ又は複数のアミノ酸残基のストレッチ（即ちそれぞれの「ストレッチ」が、（即ちアミノ酸配列の一次構造又は三次構造で）互いに隣接しているか、又は互いに密接している２つ以上のアミノ酸残基を含む）を含有し、それを介して本発明のアミノ酸配列はＩＬ−６Ｒと結合することができ、このようにしてアミノ酸残基又はアミノ酸残基のストレッチは、ＩＬ−６Ｒと結合する「部位」（本明細書で「抗原結合部位」とも表される）を形成する。
本発明で与えられるアミノ酸配列は、（本明細書で規定のように）本質的に単離形態であるか、又は（本明細書で規定のように）本発明のタンパク質若しくはポリペプチド（１つ又は複数の本発明のアミノ酸配列を含むか、又は本質的にこれから成り、任意でさらに１つ又は複数のさらなるアミノ酸配列を含んでもよい（全て任意で１つ又は複数の好適なリンカーを介して連結される））の一部を形成するのが好ましい。例えば、これに限定されないが、１つ又は複数の本発明のアミノ酸配列は、全て本明細書に記載される、それぞれ本発明の一価、多価、又は多重特異性のポリペプチドを提供するように、このようなタンパク質又はポリペプチドにおける結合単位として使用してもよい（任意で（即ちＩＬ−６Ｒ以外の１つ又は複数の他の標的に対する）結合単位としての役割を果たし得る１つ又は複数のさらなるアミノ酸配列を含有してもよい）。このようなタンパク質又はポリペプチドは、（本明細書に規定のように）本質的に単離形態でもあり得る。
概して、本発明のアミノ酸配列（又はこれを含む化合物、構築物若しくはポリペプチド）は、（例えば本明細書に記載の治療目的及び／又は診断目的のための）被験者への投与を目的とする場合、当該被験者において自然発生しないか、又は当該被験者において自然発生する場合は、（本明細書に規定のように）本質的に単離形態であるのが好ましい。
薬学的用途の場合、本発明のアミノ酸配列（並びにこれを含む化合物、構築物及びポリペプチド）はヒトＩＬ−６Ｒに指向性を有するのが好ましく、一方で獣医学目的の場合は、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは治療する種由来のＩＬ−６Ｒに指向性を有するか、又は治療する種由来のＩＬ−６Ｒと少なくとも交差反応性であるのが好ましいことも、当業者にとって明らかである。
さらに、本発明のアミノ酸配列（或いは１つ又は複数のこのようなアミノ酸配列を含む化合物、構築物又はポリペプチド）は、任意でＩＬ−６Ｒとの結合のための少なくとも１つの結合部位の他に、他の抗原、タンパク質又は標的との結合のための１つ又は複数のさらなる結合部位を含有し得る。
発症する特定の疾患又は障害に応じて、任意の好適なｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、細胞ベースのアッセイ、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイ及び／又はそれ自体が既知の動物モデル、又はそれらの任意の組合せを使用して、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチド、並びにこれを含む組成物の有効性を試験することができる。好適なアッセイ及び動物モデルは当業者にとって明らかであり、例えばＩＬ−６依存性細胞株（Ｂ９、ＸＧ−１及び７ＴＤ１を含む）を使用する増殖アッセイ及びコラーゲン誘導関節炎モデル、ＳＣＩＤマウスにおける滑膜組織の移植モデル、様々なヒトの癌（リンパ腫、骨髄腫、前立腺癌及び腎細胞癌を含む）の移植片モデル、ＩＢＤモデル（ＴＮＢＳ、ＤＳＳ及びＩＬ１０ノックアウトモデルを含む）、並びに以下の実験部部分及び本明細書で言及される従来技術で使用されるアッセイ及び動物モデルが挙げられる（Peake et al., Rheumatology 2006; 45（12）:1485-9、Wahid et al.; Clin Exp Immunol. 2000, 122:133-142、Matsuno et al., Arthritis and rheumatism, 1998, 41 : 2014-2021）。
また本発明によれば、第１の種の温血動物由来のＩＬ−６Ｒに指向性を有するアミノ酸配列及びポリペプチドは、１つ又は複数の他の種の温血動物由来のＩＬ−６Ｒと交差反応性を示しても又は示さなくてもよく、このことはこれらのアミノ酸配列がまた、（本明細書で規定のように）当該温血動物由来のＩＬ−６Ｒ「に指向性を有する」、及び／又は（本明細書で規定のように）ＩＬ−６Ｒと特異的に結合することができることを意味する。例えば、ヒトＩＬ−６Ｒに指向性を有するアミノ酸配列及びポリペプチドは、１つ又は複数の他の種の霊長類（例えば、これらに限定されないが、マカク属のサル（例えば特にカニクイザル（マカク・ファシクラリス（Macaca fascicularis））及び／又はアカゲザル（マカク・ムラット（Macaca mulatta）））及びヒヒ（パピオ・ウルジヌス（Papio ursinus））由来のＩＬ−６Ｒ、疾患のために動物モデル（例えばマウス、ラット、ウサギ、ブタ又はイヌ）及び特にＩＬ−６Ｒに関連がある疾患及び障害のために動物モデルで使用されることが多い、１種又は複数種の動物（例えば本明細書で言及される種及び動物モデル）由来のＩＬ−６Ｒと交差反応性を示しても又は示さなくてもよい。この態様では、このような疾患モデルでヒトＩＬ−６Ｒに対するアミノ酸配列及びポリペプチドを試験することが可能であるので、存在する場合、このような交差反応性は薬剤開発の観点から都合がいいことが当業者にとって明らかである。好ましいが、非限定的な態様では、本発明のアミノ酸配列（並びにこれを含む化合物、構築物及びポリペプチド）は、配列番号６３３で与えられる、マカク・ファシクラリス由来のＩＬ−６Ｒに関するアミノ酸配列と交差反応性であり得る。またこの配列及び対応するｃＤＮＡ配列に関しては、２００７年７月１９日にAblynx N. V.によって出願された、表題"Receptor for interleukin-6 （IL-6） from Macaca fascicularis"の未公開（non-prepublished）米国仮特許出願を参照し、ｃＤＮＡ配列に関しては、配列番号３及び図１Ｂを参照し、アミノ酸配列に関しては、配列番号４及び図３Ｂを参照されたい。
より一般的には、複数種の哺乳動物由来のＩＬ−６Ｒと交差反応性である本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドが複数種にわたって使用することが可能であるので、このアミノ酸配列及びポリペプチドは通常、獣医学用途に使用するのに有利である。したがって、或る種の動物由来のＩＬ−６Ｒに指向性を有するアミノ酸配列及びポリペプチド（例えばヒトＩＬ−６Ｒに対するアミノ酸配列及びポリペプチド）は、アミノ酸配列及び／又はポリペプチドの使用によって、治療する種において所望の効果が提供されれば、別の種の動物の治療に使用することができることも本発明の範囲内に包含される。
本発明は広義で、また特に本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドが指向性を有するＩＬ−６Ｒの特定の抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット若しくはコンホメーション（適用可能な場合）に限定されず、又はこれによって定義されない。しかし概して好ましくは、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは、ＩＬ−６受容体とＩＬ−６との相互作用に関与するＩＬ−６受容体の任意のエピトープに指向性を有すると推測される。
このようなエピトープ又は相互作用部位は、Boulanger et al.（2003）（Science 300, 2101-2104）で詳細に説明され、特に引用文献の図２を参照する。より好ましくは、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは、ＩＬ−６受容体の細胞外ドメインに指向性を有する。さらにより好ましくは、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは、ＩＬ−６受容体の細胞外Ｄ３ドメインに指向性を有する。さらにより好ましくは、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは、ＩＬ−６受容体とＩＬ−６との相互作用に寄与するＩＬ−６受容体の細胞外Ｄ３ドメインに存在する、（Boulanger et al.（2003）（Science 300, 2101-2104）に記載された）１つ又は複数の１８接触残基と相互作用する。最も好ましくは、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは、ＩＬ−６受容体の細胞外Ｄ３ドメインに存在するアミノ酸残基Ｐｈｅ２２９及びＰｈｅ２７９と相互作用する。
したがって好ましいが、非限定的な１つの態様では、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは、ＩＬ−６受容体とＩＬ−６との相互作用に関与するＩＬ−６受容体の任意のエピトープに指向性を有し、本明細書にさらに規定されるようなものである。
代替的に、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは、ＩＬ−６受容体とｇｐ１３０との相互作用に関与するＩＬ−６受容体の任意のエピトープに指向性を有する。このようなエピトープ又は相互作用部位は、Boulanger et al.（2003）（Science 300, 2101-2104）で詳細に説明され、特に引用文献の図２を参照する。
これに関して、非限定的な態様によれば、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは、ＩＬ−６受容体との結合のために、例えば実施例２９に記載のアッセイにおいて市販のヒト−マウス再構成キメラモノクローナル抗ＩＬ−６Ｒ抗体であるトシリズマブ（ＭＲＡ）（Chugai/Roche）又はその抗原結合断片（例えば国際公開第９２／１９７５９号パンフレット、及び対応する欧州特許出願公開第０６２８６３９号明細書、並びにShinkura et al., 1998, Anticancer Research 18, 1217-1222を参照されたい）と拮抗することができるようなもの、及び／又はトシリズマブとしてＩＬ−６Ｒ上で同じエピトープ若しくは結合部位と、又は当該結合部位の近くで及び／又は当該結合部位と重なってエピトープと結合することができるようなものが好ましい。
また、非限定的な態様によれば、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは、ＩＬ−６受容体と結合するために、欧州特許出願公開第０６２８６３９号明細書による参照ＩｇＧ及び／又は参照Ｆａｂと拮抗することができるようなもの、及び／又は当該参照ＩｇＧ若しくは参照ＦａｂとしてＩＬ−６Ｒ上で同じエピトープ若しくは結合部位と、又は当該結合部位の近くで及び／又は当該結合部位と重なってエピトープと結合することができるようなものが好ましい。当該参照ＩｇＧ及び参照Ｆａｂの調製及び配列に関しては、以下の参照例１、及び配列番号６２９〜配列番号６３２を参照する。
したがって、一般的であってこれに限定されないが、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは、ＩＬ−６受容体と、ＩＬ−６及び／又はｇｐ１３０との相互作用に関与するＩＬ−６受容体の任意のエピトープに指向性を有し得る。
また本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは、（これらに限定されないが）治療に関連する量で哺乳動物に投与する場合、当該哺乳動物（例えばヒト被験者、又は以下の実験部部分で使用されるカニクイザルモデル等の炎症に好適な動物モデル）においてＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）レベルの低減（即ち少なくとも１％、少なくとも１０％以上等）をもたらすようなものが好ましい。
本発明のアミノ酸配列又はポリペプチドが、（適用可能な場合）ＩＬ−６Ｒの２つ以上の抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット又はコンホメーションと結合することができることも、本発明の範囲内である。このような場合、本発明のアミノ酸配列及び／又はポリペプチドが結合するＩＬ−６Ｒの抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン又はサブユニットは本質的に同じであり得るか（例えば、ＩＬ−６Ｒが反復構造モチーフを含有するか、又は多量体形態で発生する場合）、又は異なり得る（後者の場合、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは、同じであり得るか又は異なり得る親和性及び／又は特異性で、ＩＬ−６Ｒのこのような異なる抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニットと結合し得る）。また例えば、ＩＬ−６Ｒが活性化構造及び不活性化構造で存在する場合、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは、これらのコンホメーションのいずれか１つと結合し得るか、又はこれらのコンホメーションの両方と（即ち同じであり得るか又は異なり得る親和性及び／又は特異性で）結合し得る。また例えば、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは、関連リガンドと結合するＩＬ−６Ｒ構造と結合し得るか、関連リガンドと結合しないＩＬ−６Ｒ構造と結合し得るか、又は（さらに同じであり得るか又は異なり得る親和性及び／又は特異性で）このような構造の両方と結合し得る。
本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは概して、ＩＬ−６Ｒの全ての天然又は合成の類似体、変異体、突然変異体、対立遺伝子、一部及び断片と、又は少なくとも本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドがＩＬ−６Ｒ（例えば野生型ＩＬ−６Ｒ）で結合する抗原決定基（複数可）又はエピトープ（複数可）と本質的に同じ１つ又は複数の抗原決定基又はエピトープを含有する、ＩＬ−６Ｒの類似体、変異体、突然変異体、対立遺伝子、一部及び断片と結合することも予測される。またこのような場合、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは、本発明のアミノ酸配列が（野生型の）ＩＬ−６Ｒと結合する親和性及び特異性と同じ又は異なる（即ちより高いか、又はより低い）、親和性及び／又は特異性で、このような類似体、変異体、突然変異体、対立遺伝子、一部及び断片と結合し得る。本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドと結合する、ＩＬ−６Ｒの類似体、変異体、突然変異体、対立遺伝子、一部及び断片もあれば、結合しないものもあることも本発明の範囲内に含まれる。
ＩＬ−６Ｒが単量体形態で、及び１つ又は複数の多量体形態で存在する場合、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドが、単量体形態のＩＬ−６Ｒのみと結合するか、多量体形態のＩＬ−６Ｒのみと結合するか、又は単量体形態及び多量体形態の両方のＩＬ−６Ｒと結合することは本発明の範囲内である。またこのような場合、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは、本発明のアミノ酸配列が多量体形態のＩＬ−６Ｒと結合する親和性及び特異性と同じ又は異なる（即ちより高いか、又はより低い）、親和性及び／又は特異性で単量体形態のＩＬ−６Ｒと結合し得る。
またＩＬ−６Ｒがタンパク質又はポリペプチドと結び付き、（例えば複数のサブユニットを有する）タンパク質複合体を形成することができる場合、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドが、非結合状態のＩＬ−６Ｒと、結合状態のＩＬ−６Ｒと、又はその両方と結合することは本発明の範囲内である。これらの場合の全て、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドが単量体で非結合状態のＩＬ−６Ｒと結合する親和性及び特異性と同じ又は異なる可能性がある（即ちより高いか、又はより低い）親和性及び／又は特異性で、このような多量体又は結合タンパク質複合体と結合し得る。
また当業者にとって明らかなように、ＩＬ−６Ｒに指向性を有する２つ以上のアミノ酸配列を含有するタンパク質又はポリペプチドは、対応する単量体アミノ酸配列（複数可）より高い結合活性（avidity：親和力）でＩＬ−６Ｒと結合し得る。例えば、これに限定されないが、異なるＩＬ−６Ｒのエピトープに指向性を有する２つ以上のアミノ酸配列を含有するタンパク質又はポリペプチドは、異なる単量体のそれぞれよりも高い結合活性で結合する可能性があり（及び通常結合し）、またＩＬ−６Ｒに指向性を有する２つ以上のアミノ酸配列を含有するタンパク質又はポリペプチドは、より高い結合活性で多量体のＩＬ−６Ｒと結合する可能性がある（及び通常結合する）。
概して当業者にとって明らかなように、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは、少なくとも生物学的及び／又は治療的観点から最も関連があるこれらの形態のＩＬ−６Ｒ（単量体、多量体及び結合形態を含む）と結合する。
本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドの一部、断片、類似体、突然変異体、変異体、対立遺伝子及び／又は誘導体を使用すること、及び／又は本明細書で想定される使用に好適である限り、１つ又は複数のこのような一部、断片、類似体、突然変異体、変異体、対立遺伝子及び／又は誘導体を含むか、又は本質的にこれから成るタンパク質又はポリペプチドを使用することも本発明の範囲内である。このような一部、断片、類似体、突然変異体、変異体、対立遺伝子及び／又は誘導体は通常、ＩＬ−６Ｒとの結合に機能的な抗原結合部位（の少なくとも一部）を含有し、より好ましくはＩＬ−６Ｒと特異的に結合することができ、さらにより好ましくは本明細書に規定のように（さらに本明細書に記載されるような（実際又は見掛けの）ＫＤ値、（実際又は見掛けの）ＫＡ値、ｋｏｎ速度及び／又はｋｏｆｆ速度、又は代替的にＩＣ５０値として好適に測定される、及び／又は表される）親和性でＩＬ−６Ｒと結合することができる。このような一部、断片、類似体、突然変異体、変異体、対立遺伝子、誘導体、タンパク質及び／又はポリペプチドの幾つかの非限定的な例は、本明細書のさらなる記載から明らかになる。また本発明のさらなる断片又はポリペプチドは、本明細書に記載の１つ又は複数の（より小さい）一部又は断片を好適に混合することによって（即ち連結又は遺伝子融合によって）提供し得る。
本明細書でさらに記載される、具体的であるが、本発明の１つの非限定的な態様において、このような類似体、突然変異体、変異体、対立遺伝子、誘導体は、それら由来のアミノ酸配列に比べて（本明細書にさらに記載されるように）増大した血清半減期を有する。例えば、本発明のアミノ酸配列は、本発明のアミノ酸配列の誘導体の半減期が増大するように、（化学的に又は別の方法で）半減期を延長する１つ又は複数の基又は部分（例えばＰＥＧ）と連結し得る。
具体的ではあるが、非限定的な１つの態様では、本発明のアミノ酸配列は、免疫グロブリンフォールドを含むアミノ酸配列であり得るか、又は好適な条件（例えば生理的条件）下で（即ちフォールディングによって）免疫グロブリンフォールドを形成することができるアミノ酸配列であり得る。特にHalaby et al., J. （1999） Protein Eng. 12, 563-71による概説を参照する。好ましくは、免疫グロブリンフォールドを形成するように適切にフォールディングする場合、このようなアミノ酸配列は、ＩＬ−６Ｒと（本明細書に規定のように）特異的に結合することができ、より好ましくは本明細書に規定のように（さらに本明細書に記載されるような（実際又は見掛けの）ＫＤ値、（実際又は見掛けの）ＫＡ値、ｋｏｎ速度及び／又はｋｏｆｆ速度、又は代替的にＩＣ５０値として好適に測定される、及び／又は表される）親和性でＩＬ−６Ｒと結合することができる。また、このようなアミノ酸配列の一部、断片、類似体、突然変異体、変異体、対立遺伝子及び／又は誘導体は、免疫グロブリンフォールドを含むか、又は好適な条件下で免疫グロブリンフォールドを形成することができるようなものであるのが好ましい。
具体的であるが、非限定的に、本発明のアミノ酸配列は、本質的に４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから成るアミノ酸配列、又はこのようなアミノ酸配列の任意の好適な断片（したがって通常、本明細書でさらに記載されるように、少なくとも１つのＣＤＲを形成するアミノ酸残基の少なくとも幾つかを含有する）であり得る。
本発明のアミノ酸配列は、具体的に免疫グロブリン配列又はその好適な断片、より具体的には免疫グロブリン可変ドメイン配列又はその好適な断片（例えば軽鎖可変ドメイン配列（例えばＶＬ配列）若しくはその好適な断片、又は重鎖可変ドメイン配列（例えばＶＨ配列）若しくはその好適な断片）であり得る。本発明のアミノ酸配列が重鎖可変ドメイン配列である場合、従来の４鎖抗体由来の重鎖可変ドメイン配列（例えば、これに限定されないが、ヒト抗体由来のＶＨ配列）又はいわゆる（本明細書に規定の）「重鎖抗体」由来のいわゆる（本明細書に規定の）ＶＨＨ配列であり得る。
しかし本発明が、本発明のアミノ酸配列（又はこれを発現するのに使用される本発明のヌクレオチド配列）の起源に関しても、また本発明のアミノ酸配列又はヌクレオチド配列を生成又は入手する（或いは生成又は入手している）方法に関しても限定されないことに留意すべきである。したがって本発明のアミノ酸配列は、（任意の好適な種由来の）天然アミノ酸配列、又は合成若しくは半合成のアミノ酸配列であり得る。具体的ではあるが、本発明の非限定的な態様では、アミノ酸は（任意の好適な種由来の）天然免疫グロブリン配列、又は合成若しくは半合成の免疫グロブリン配列であり、これにはこれらに限定されないが、（本明細書に規定の）「ヒト化」免疫グロブリン配列（例えば部分又は完全ヒト化マウス又はウサギ免疫グロブリン配列、及び特に部分又は完全ヒト化ＶＨＨ配列又はナノボディ）、（本明細書に規定の）「ラクダ化」免疫グロブリン配列、並びに親和性成熟（例えば、合成、ランダム又は天然免疫グロブリン配列から開始する）、ＣＤＲグラフト化、ベニヤリング（veneering）、異なる免疫グロブリン配列由来の断片の結合（combining）、重複プライマーを使用したＰＣＲアセンブリ、及び当業者に既知の免疫グロブリン配列を遺伝子操作する（engineering）同様の技法、又は上記のいずれかの任意の好適な組合せ等の技法によって得られる免疫グロブリン配列が含まれる。例えば標準的なハンドブック、並びに本明細書に言及されるさらなる記載及び従来技術を参照する。
同様に、本発明のヌクレオチド配列は、天然ヌクレオチド配列、又は合成若しくは半合成の配列であってもよく、例えばＰＣＲによって好適な天然鋳型から単離される配列（例えば細胞から単離されるＤＮＡ又はＲＮＡ）、ライブラリ（特に発現ライブラリ）から単離されたヌクレオチド配列、（それ自体が既知の任意の好適な技法（例えばミスマッチＰＣＲ）を使用して）天然ヌクレオチド配列に突然変異を導入することによって調製されたヌクレオチド配列、重複プライマーを使用してＰＣＲによって調製されたヌクレオチド配列、又はそれ自体が既知のＤＮＡ合成のための技法を使用して調製されたヌクレオチド配列であり得る。
本発明のアミノ酸配列は特に、ドメイン抗体（又はドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列）、単一ドメイン抗体（又は単一ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列）、「ｄＡｂ」（又はｄＡｂとしての使用に好適なアミノ酸配列）、又はナノボディ（登録商標）（本明細書に規定のように、ＶＨＨ配列を含むが、これに限定されない）、他の単一可変ドメイン、或いはそれらのいずれか１つの任意の好適な断片であり得る。（単一）ドメイン抗体の概要に関しては、上記で言及された従来技術、及び欧州特許第０３６８６８４号明細書を参照する。用語「ｄＡｂ」に関しては、例えばWard et al.（Nature 1989 Oct 12; 341 （6242）: 544-6）、Holt et al.（Trends Biotechnol., 2003, 21（11）:484-490）、例えば国際公開第０６／０３０２２０号パンフレット、国際公開第０６／００３３８８号パンフレット、及びDomantis Ltd.の他の公開特許出願を参照する。哺乳動物起源ではないため、本発明に関してあまり好ましくはないが、単一ドメイン抗体又は単一可変ドメインは、或る特定種のサメ由来である可能性があることにも留意すべきである（例えばいわゆる「ＩｇＮＡＲドメイン」、例えば国際公開第０５／１８６２９号パンフレットを参照されたい）。
特に本発明のアミノ酸配列は、（本明細書で規定の）ナノボディ（登録商標）又はその好適な断片（備考：ナノボディ（登録商標）、ナノボディ（Nanobodies）（登録商標）及びナノクローン（登録商標）は、Ablynx N. V.の登録商標である）。ＩＬ−６Ｒに指向性を有するこのようなナノボディは、「本発明のナノボディ」とも称される。
ナノボディの概要に関しては、以下のさらなる記載、及び本明細書で言及される従来技術を参照する。しかしこれに関して、本明細書及び従来技術は主に、いわゆる「ＶＨ３クラス」のナノボディ（即ちＤＰ−４７、ＤＰ−５１又はＤＰ−２９等のＶＨ３クラスのヒト生殖細胞系列との高度な配列相同性を有するナノボディ）を説明し、このナノボディは本発明の好ましい態様を形成することに留意すべきである。しかし概して、本発明は広義で、ＩＬ−６Ｒに指向性を有する任意種のナノボディをカバーし、例えばAblynx N. V.によって２００６年４月１４日に出願された表題"DP-78-like Nanobodies"の米国仮特許出願第６０／７９２，２７９号明細書に記載されるように、例えばいわゆる「ＶＨ４クラス」に属するナノボディ（即ちＤＰ−７８等のＶＨ４クラスのヒト生殖細胞系列細胞に対して高度な配列相同性を有するナノボディ）もカバーすることに留意すべきである。
概して、ナノボディ（特にＶＨＨ配列及び部分ヒト化ナノボディ）は特に、（また本明細書にさらに記載される）１つ又は複数のフレームワーク配列において（本明細書に記載される）１つ又は複数の「特徴的な（Hallmark：ホールマーク）残基」の存在を特徴とし得る。
したがって概して、ナノボディは、（一般）構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれ、フレームワーク領域１〜フレームワーク領域４を表し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ、相補性決定領域１〜相補性決定領域３を表し、１つ又は複数の特徴的な残基は本明細書にさらに規定されるようなものである）を有するアミノ酸配列として定義することができる。
特にナノボディは、（一般）構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（式中、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれ、フレームワーク領域１〜フレームワーク領域４を表し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ、相補性決定領域１〜相補性決定領域３を表し、フレームワーク配列は本明細書にさらに規定されるようなものである）を有するアミノ酸配列であり得る。
したがって本発明は、（本明細書に規定のように）ＩＬ−６Ｒと結合することができる、及び／又はこれに指向性を有するようなナノボディに、その好適な断片に、並びにこのようなナノボディ及び／又は好適な断片の１つ又は複数を含むか、若しくは本質的にこれから成るポリペプチドにも関する。
配列番号３９９〜配列番号４７１は、ＩＬ−６Ｒに指向性を有する多くのＶＨＨ配列のアミノ酸配列を示す。
したがって、幾つかの特に好ましい本発明のナノボディは、（本明細書にさらに規定のように）ＩＬ−６Ｒと結合することができる、及び／又はこれに指向性を有するナノボディであり、
ａ）配列番号３９９〜配列番号４７１のアミノ酸配列の少なくとも１つと８０％のアミノ酸同一性を有し、ここでアミノ酸同一性の程度を決定するためにＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基は無視する（またこれに関して、表Ａ−１を参照し、これは配列番号３９９〜配列番号４７１のナノボディのフレームワーク１配列（配列番号４２〜配列番号９２）、フレームワーク２配列（配列番号１４４〜配列番号１９４）、フレームワーク３配列（配列番号２４６〜配列番号２９６）及びフレームワーク４配列（配列番号３４８〜配列番号３９８）を列挙する）（フレームワーク１配列の１位〜４位及び２７位〜３０位のアミノ酸残基に関しては、以下で為されるコメントも参照する。したがって、アミノ酸同一性の程度を決定するためにこれらのアミノ酸残基は無視するのが好ましい）、
ｂ）好ましくはカバットナンバリング（Kabat numbering）に従った、１１位、３７位、４４位、４５位、４７位、８３位、８４位、１０３位、１０４位及び１０８位の１つ又は複数のアミノ酸残基が、以下の表Ａ−３で言及される特徴的な残基から選択される（ＶＨＨ配列が１つ又は複数の特徴的な残基を含有すること、及び部分ヒト化ナノボディは通常（依然として）、１つ又は複数の特徴的な残基を含有するのが好ましいこと（しかし本発明に従って好適であれば、全ての特徴的な残基がヒト化されるが、１つ又は複数の他のアミノ酸残基はヒト化されない部分ヒト化ナノボディを提供することも本発明の範囲内である）、及び完全ヒト化ナノボディでは本発明に従って好適であれば、特徴的な残基位置の全てのアミノ酸残基がヒトＶＨ３配列で生じるアミノ酸残基であることが理解される。本明細書中の開示に基づいて当業者にとって明らかなように、このようなＶＨＨ配列、少なくとも１つの特徴的な残基を有するこのような部分ヒト化ナノボディ、特徴的な残基を有しないこのような部分ヒト化ナノボディ、及びこのような完全ヒト化ナノボディは全て本発明の態様を形成する）。
これらのナノボディにおいて、概してＣＤＲ配列は、本明細書にさらに規定されるようなものである。
またこのようなナノボディは、任意で好適な方法で任意の好適な供給源から誘導されてもよく、例えば（好適なラクダ種由来の）天然ＶＨＨ配列、又は合成若しくは半合成のアミノ酸配列であってもよく、これにはこれらに限定されないが、（本明細書に規定の）「ヒト化」ナノボディ、（本明細書に規定の）「ラクダ化」免疫グロブリン配列（特にラクダ化重鎖可変ドメイン配列）、並びに本明細書にさらに記載されるように、親和性成熟（例えば、合成、ランダム又は天然免疫グロブリン配列から開始する）、ＣＤＲグラフト化、ベニヤリング、異なる免疫グロブリン配列由来の断片の結合、重複プライマーを使用したＰＣＲアセンブリ、及び当業者に既知の免疫グロブリン配列を遺伝子操作する同様の技法、又は上記のいずれかの任意の好適な組合せ等の技法によって得られるナノボディが含まれる。また、ナノボディがＶＨＨ配列を含む場合、当該ナノボディは、１つ又は複数の本発明のさらなる（部分又は完全）ヒト化ナノボディを提供するように、本明細書でさらに記載されるように好適にヒト化し得る。同様に、ナノボディが合成又は半合成の配列（例えば部分ヒト化配列）を含む場合、当該ナノボディは、ここでもまた１つ又は複数の本発明のさらなる（部分又は完全）ヒト化ナノボディを提供するように、ここでもまた本明細書で記載されるように任意でさらに好適にヒト化し得る。
特にヒト化ナノボディは、概してこれまでの段落でナノボディに関して規定されたようなものであるが、この中に（本明細書に規定の）ヒト化置換である、及び／又はヒト化置換に対応する少なくとも１つのアミノ酸残基が（特にフレームワーク残基の少なくとも１つに）存在する。本明細書中の開示に基づいて当業者にとって、幾つかの好ましいが、非限定的なヒト化置換（及びその任意の組合せ）は明らかである。付加的に又は代替的に、天然ＶＨＨ配列のフレームワーク領域の配列を、１つ又は複数の密接に関連したヒトＶＨ配列の対応するフレームワーク配列と比較することによって、他の潜在的に有用なヒト化置換を確認することができ、その後このようにして決定した潜在的に有用なヒト化置換（又はその組合せ）の１つ又は複数を上記ＶＨＨ配列に（それ自体が既知の任意の方法で、本明細書にさらに記載のように）導入することができ、得られたヒト化ＶＨＨ配列を、親和性、標的、安定性、発現の容易さ及びレベル、及び／又は他の所望の特性に関して試験することができる。このように、試行錯誤による限定によって、本明細書中の開示に基づき当業者によって、他の好適なヒト化置換（又はその好適な組合せ）を決定することができる。また上記に基づいて、ナノボディ（のフレームワーク領域）を部分ヒト化又は完全ヒト化してもよい。
幾つかの特に好ましい本発明のヒト化ナノボディは、配列番号３９９〜配列番号４７１のナノボディのヒト化変異体である。
したがって、幾つかの他の好ましい本発明のナノボディは、（本明細書にさらに規定のように）ＩＬ−６Ｒと結合することができるナノボディであり、
ａ）配列番号３９９〜配列番号４７１のアミノ酸配列の１つのヒト化変異体であり、及び／又は
ｂ）配列番号３９９〜配列番号４７１のアミノ酸配列の少なくとも１つと８０％のアミノ酸同一性を有し、ここでアミノ酸同一性の程度を決定するためにＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基は無視する、且つ
ｃ）好ましくはカバットナンバリングに従った、１１位、３７位、４４位、４５位、４７位、８３位、８４位、１０３位、１０４位及び１０８位のアミノ酸残基の１つ又は複数が、以下の表Ａ−３で言及される特徴的な残基から選択される。
本発明のヒト化ナノボディの幾つかの好ましいが、非限定的な例は、配列番号６０９〜配列番号６２８で与えられる。
本発明の別の特定の態様によれば、本発明は、ＩＬ−６Ｒとの結合に特に適する多くのアミノ酸残基のストレッチ（即ち低分子ペプチド）を提供する。これらのアミノ酸残基のストレッチは、特に本発明のアミノ酸配列の抗原結合部位の（一部）を形成するように、本発明のアミノ酸配列に存在し得る、及び／又は組み込まれ得る。初めに、これらのアミノ酸残基のストレッチを重鎖抗体のＣＤＲ配列、又はＩＬ−６Ｒに指向性を有するＶＨＨ配列として生成された（又は本明細書でさらに記載されるように、このようなＣＤＲ配列に基づき得る、及び／又はこれに由来し得る）ので、これらのアミノ酸残基のストレッチは概して、本明細書で「ＣＤＲ配列」（即ちそれぞれＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列）とも称される。しかし、本発明が広義で、これらのアミノ酸残基のストレッチによる本発明のアミノ酸配列とＩＬ−６Ｒとの結合が可能である限り、これらのアミノ酸残基のストレッチが本発明のアミノ酸配列中に有し得る特定の構造的役割又は機能に限定されないことに留意すべきである。したがって概して、本発明は広義で、全アミノ酸配列が、ＩＬ−６Ｒと結合することができる結合ドメイン及び／又は結合単位を形成するように、ＩＬ−６Ｒと結合することができ、本明細書に記載の１つ又は複数のＣＤＲ配列及び特に２つ以上のこのようなＣＤＲ配列の好適な組合せを含み、１つ又は複数のさらなるアミノ酸配列を介して互いに好適に連結する、任意のアミノ酸配列を含む。しかし、本発明のアミノ酸配列における１つだけのこのようなＣＤＲ配列の存在は、それ自体で既にＩＬ−６Ｒと結合することができる本発明のアミノ酸配列を提供するのに十分であり得ることにも留意すべきである。例えばここでもまた、国際公開第０３／０５０５３１号パンフレットに記載される、いわゆる「促進断片（Expedite fragments）」を参照する。
したがって別の具体的ではあるが、非限定的な態様において、本発明のアミノ酸配列は、本明細書に記載のＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列（又はそれらの任意の好適な組合せ）から成る群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列であり得る。特に、本発明のアミノ酸配列は、少なくとも１つの抗原結合部位（当該抗原結合部位は、本明細書に記載のＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列（又はそれらの任意の好適な組合せ）から成る群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む）を含むアミノ酸配列であり得る。
概して本発明のこの態様において、本発明のアミノ酸配列は、少なくとも１つのアミノ酸残基のストレッチ（当該アミノ酸残基のストレッチは、本明細書に記載のＣＤＲ配列の少なくとも１つの配列に対応するアミノ酸配列を有する）を含む任意のアミノ酸配列であり得る。このようなアミノ酸配列は、免疫グロブリンフォールドを含んでも、又は含んでいなくてもよい。例えば、これに限定されないが、このようなアミノ酸配列は、少なくとも１つのこのようなＣＤＲ配列を含むが、（完全）免疫グロブリンフォールドを形成するのに十分な大きさではない好適な免疫グロブリン配列の断片であり得る（例えばここでもまた、国際公開第０３／０５０５３１号パンフレットに記載される、「促進断片」を参照する）。代替的に、このようなアミノ酸配列は、このようなＣＤＲ配列に対応する（即ちその抗原結合部位の一部として）少なくとも１つのアミノ酸残基のストレッチを含む、好適な「タンパク質足場」であり得る。アミノ酸配列を提示するのに好適な足場が当業者にとって明らかであり、例えばこれらに限定されないが、（本明細書に既に記載の免疫グロブリン配列以外の）免疫グロブリンに基づく若しくはこれに由来する結合足場、プロテインＡドメイン由来のタンパク質足場（例えばアフィボディ（Affibodies）（商標））、テンダミスタット、フィブロネクチン、リポカリン、ＣＴＬＡ−４、Ｔ細胞受容体、設計アンキリン反復、アビマー（avimers）及びＰＤＺドメイン（Binz et al, Nat. Biotech 2005, Vol 23:1257）、並びにＤＮＡ又はＲＮＡに基づく結合部分（ＤＮＡアプタマー又はＲＮＡアプタマーを含むが、これに限定されない）（Ulrich et al.Comb Chem High Throughput Screen 2006 9（8）:619- 32）が含まれる。
また、１つ又は複数のこれらのＣＤＲ配列を含む、任意の本発明のアミノ酸配列は、ＩＬ−６Ｒと（本明細書に規定のように）特異的に結合することができるようなもの、及びより具体的には本明細書に規定のように（さらに本明細書に記載されるような（実際又は見掛けの）ＫＤ値、（実際又は見掛けの）ＫＡ値、ｋｏｎ速度及び／又はｋｏｆｆ速度、又は代替的にＩＣ５０値として好適に測定される、及び／又は表される）親和性でＩＬ−６Ｒと結合することができるようなものであるのが好ましい。
より具体的には、本発明のこの態様のアミノ酸配列は、少なくとも１つの抗原結合部位（当該抗原結合部位は、（ｉ）第１のアミノ酸配列が、本明細書に記載のＣＤＲ１配列から選択される場合、第２のアミノ酸配列が、本明細書に記載のＣＤＲ２配列又は本明細書に記載のＣＤＲ３配列から選択されるように、（ｉｉ）第１のアミノ酸配列が、本明細書に記載のＣＤＲ２配列から選択される場合、第２のアミノ酸配列が、本明細書に記載のＣＤＲ１配列又は本明細書に記載のＣＤＲ３配列から選択されるように、或いは（ｉｉｉ）第１のアミノ酸配列が、本明細書に記載のＣＤＲ３配列から選択される場合、第２のアミノ酸配列が、本明細書に記載のＣＤＲ１配列又は本明細書に記載のＣＤＲ３配列から選択されるように、本明細書に記載のＣＤＲ１配列、本明細書に記載のＣＤＲ２配列、及び本明細書に記載のＣＤＲ３配列から成る群から選択される、少なくとも２つのアミノ酸配列を含む）を含む任意のアミノ酸配列であり得る。
さらにより具体的には、本発明のアミノ酸配列は、少なくとも１つの抗原結合部位（当該抗原結合部位は、第１のアミノ酸配列が、本明細書に記載のＣＤＲ１配列から選択され、第２のアミノ酸配列が、本明細書に記載のＣＤＲ２配列から選択され、第３のアミノ酸配列が、本明細書に記載のＣＤＲ３配列から選択されるように、本明細書に記載のＣＤＲ１配列、本明細書に記載のＣＤＲ２配列、及び本明細書に記載のＣＤＲ３配列から成る群から選択される、少なくとも３つのアミノ酸配列を含む）を含むアミノ酸配列であり得る。ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列の好ましい組合せは、本明細書中のさらなる記載から明らかになる。当業者にとって明らかなように、このようなアミノ酸配列は、（本明細書にさらに記載のように）免疫グロブリン配列であるのが好ましいが、例えばまた上記ＣＤＲ配列を提示するのに好適な足場を含む、任意の他のアミノ酸配列であってもよい。
したがって具体的ではあるが、非限定的な１つの態様において、本発明は、ＩＬ−６Ｒに指向性を有するアミノ酸配列であって、
ａ）配列番号９３〜配列番号１４３のアミノ酸配列、
ｂ）配列番号９３〜配列番号１４３のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｃ）配列番号９３〜配列番号１４３のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、
ｄ）配列番号１９５〜配列番号２４５のアミノ酸配列、
ｅ）配列番号１９５〜配列番号２４５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｆ）配列番号１９５〜配列番号２４５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、
ｇ）配列番号２９７〜配列番号３４７のアミノ酸配列、
ｈ）配列番号２９７〜配列番号３４７のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｉ）配列番号２９７〜配列番号３４７のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、又は
任意の好適なこれらの組合せから成る群から選択される１つ又は複数のアミノ酸残基のストレッチを含む、ＩＬ−６Ｒに指向性を有するアミノ酸配列に関する。
本発明のアミノ酸配列が、１つ又は複数のｂ）及び／又はｃ）によるアミノ酸配列を含有する場合、
ｉ）（本明細書に規定のように）このようなｂ）及び／又はｃ）によるアミノ酸配列における任意のアミノ酸置換は好ましく、対応するａ）によるアミノ酸配列に比べて保存的なアミノ酸置換であり、及び／又は
ｉｉ）ｂ）及び／又はｃ）によるアミノ酸配列は、対応するａ）によるアミノ酸配列に比べてアミノ酸置換だけを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有しないのが好ましく、及び／又は
ｉｉｉ）ｂ）及び／又はｃ）によるアミノ酸配列は、それ自体が既知の１つ又は複数の親和性成熟技法を用いる親和性成熟によって、ａ）によるアミノ酸配列から誘導されるアミノ酸配列であり得る。
同様に本発明のアミノ酸配列が、１つ又は複数のｅ）及び／又はｆ）によるアミノ酸配列を含有する場合、
ｉ）（本明細書に規定のように）このようなｅ）及び／又はｆ）によるアミノ酸配列における任意のアミノ酸置換は好ましく、対応するｄ）によるアミノ酸配列に比べて保存的なアミノ酸置換であり、及び／又は
ｉｉ）ｅ）及び／又はｆ）によるアミノ酸配列は、対応するｄ）によるアミノ酸配列に比べてアミノ酸置換だけを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有しないのが好ましく、及び／又は
ｉｉｉ）ｅ）及び／又はｆ）によるアミノ酸配列は、それ自体が既知の１つ又は複数の親和性成熟技法を用いる親和性成熟によって、ｄ）によるアミノ酸配列から誘導されるアミノ酸配列であり得る。
また同様に本発明のアミノ酸配列が、１つ又は複数のｈ）及び／又はｉ）によるアミノ酸配列を含有する場合、
ｉ）（本明細書に規定のように）このようなｈ）及び／又はｉ）によるアミノ酸配列における任意のアミノ酸置換は好ましく、対応するｇ）によるアミノ酸配列に比べて保存的なアミノ酸置換であり、及び／又は
ｉｉ）ｈ）及び／又はｉ）によるアミノ酸配列は、対応するｇ）によるアミノ酸配列に比べてアミノ酸置換だけを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有しないのが好ましく、及び／又は
ｉｉｉ）ｈ）及び／又はｉ）によるアミノ酸配列は、それ自体が既知の１つ又は複数の親和性成熟技法を用いる親和性成熟によって、ｇ）によるアミノ酸配列から誘導されるアミノ酸配列であり得る。
概して上述の段落は、それぞれ１つ又は複数のｂ）、ｃ）、ｅ）、ｆ）、ｈ）又はｉ）によるアミノ酸配列を含む、任意の本発明のアミノ酸配列にも適用することが理解されるべきである。
この特定の態様において、アミノ酸配列は、
ｉ）配列番号９３〜配列番号１４３のアミノ酸配列、
ｉｉ）配列番号１９５〜配列番号２４５のアミノ酸配列、及び
ｉｉｉ）配列番号２９７〜配列番号３４７のアミノ酸配列、又は
任意の好適なそれらの組合せから成る群から選択される１つ又は複数のアミノ酸残基のストレッチを含むのが好ましい。
また好ましくはこのようなアミノ酸配列において、上記のアミノ酸残基のストレッチの少なくとも１つが、ＩＬ−６Ｒと結合するための抗原結合部位の一部を形成する。
より具体的ではあるが、さらに非限定的な態様において、本発明は、ＩＬ−６Ｒに指向性を有するアミノ酸配列であって、
ａ）配列番号９３〜配列番号１４３のアミノ酸配列、
ｂ）配列番号９３〜配列番号１４３のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｃ）配列番号９３〜配列番号１４３のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、
ｄ）配列番号１９５〜配列番号２４５のアミノ酸配列、
ｅ）配列番号１９５〜配列番号２４５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｆ）配列番号１９５〜配列番号２４５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、
ｇ）配列番号２９７〜配列番号３４７のアミノ酸配列、
ｈ）配列番号２９７〜配列番号３４７のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｉ）配列番号２９７〜配列番号３４７のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択される２つ以上のアミノ酸残基のストレッチを含み、このため、（ｉ）アミノ酸残基の第１のストレッチがａ）、ｂ）又はｃ）によるアミノ酸配列の１つに対応する場合、アミノ酸残基の第２のストレッチは、ｄ）、ｅ）、ｆ）、ｇ）、ｈ）又はｉ）によるアミノ酸配列の１つに対応し、（ｉｉ）アミノ酸残基の第１のストレッチがｄ）、ｅ）又はｆ）によるアミノ酸配列の１つに対応する場合、アミノ酸残基の第２のストレッチは、ａ）、ｂ）、ｃ）、ｇ）、ｈ）又はｉ）によるアミノ酸配列の１つに対応し、或いは（ｉｉｉ）アミノ酸残基の第１のストレッチがｇ）、ｈ）又はｉ）によるアミノ酸配列の１つに対応する場合、アミノ酸残基の第２のストレッチは、ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）又はｆ）によるアミノ酸配列の１つに対応する、ＩＬ−６Ｒに指向性を有するアミノ酸配列に関する。
この特定の態様において、アミノ酸配列は、
ｉ）配列番号９３〜配列番号１４３のアミノ酸配列、
ｉｉ）配列番号１９５〜配列番号２４５のアミノ酸配列、及び
ｉｉｉ）配列番号２９７〜配列番号３４７のアミノ酸配列から成る群から選択される２つ以上のアミノ酸残基のストレッチを含むのが好ましく、このため、（ｉ）アミノ酸残基の第１のストレッチが配列番号９３〜配列番号１４３のアミノ酸配列の１つに対応する場合、アミノ酸残基の第２のストレッチは、配列番号１９５〜配列番号２４５又は配列番号２９７〜配列番号３４７のアミノ酸配列の１つに対応し、（ｉｉ）アミノ酸残基の第１のストレッチが配列番号１９５〜配列番号２４５のアミノ酸配列の１つに対応する場合、アミノ酸残基の第２のストレッチは、配列番号９３〜配列番号１４３又は配列番号２９７〜配列番号３４７のアミノ酸配列の１つに対応し、或いは（ｉｉｉ）アミノ酸残基の第１のストレッチが配列番号２９７〜配列番号３４７のアミノ酸配列の１つに対応する場合、アミノ酸残基の第２のストレッチは、配列番号９３〜配列番号１４３又は配列番号１９５〜配列番号２４５のアミノ酸配列の１つに対応する。
またこのようなアミノ酸配列において、少なくとも２つのアミノ酸残基のストレッチが、ＩＬ−６Ｒと結合するための抗原結合部位の一部を形成する。
さらにより具体的であるが、非限定的な態様において、本発明は、ＩＬ−６Ｒに指向性を有するアミノ酸配列であって、３つ以上のアミノ酸残基のストレッチを含み、アミノ酸残基の第１のストレッチが、
ａ）配列番号９３〜配列番号１４３のアミノ酸配列、
ｂ）配列番号９３〜配列番号１４３のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｃ）配列番号９３〜配列番号１４３のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、
アミノ酸残基の第２のストレッチが、
ｄ）配列番号１９５〜配列番号２４５のアミノ酸配列、
ｅ）配列番号１９５〜配列番号２４５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｆ）配列番号１９５〜配列番号２４５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、且つ
アミノ酸残基の第３のストレッチが、
ｇ）配列番号２９７〜配列番号３４７のアミノ酸配列、
ｈ）配列番号２９７〜配列番号３４７のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｉ）配列番号２９７〜配列番号３４７のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択される、ＩＬ−６Ｒに指向性を有するアミノ酸配列に関する。
好ましくはこの特定の態様において、アミノ酸残基の第１のストレッチは、配列番号９３〜配列番号１４３のアミノ酸配列から成る群から選択され、アミノ酸残基の第２のストレッチは、配列番号１９５〜配列番号２４５のアミノ酸配列から成る群から選択され、且つアミノ酸残基の第３のストレッチは、配列番号２９７〜配列番号３４７のアミノ酸配列から成る群から選択される。
また好ましくはこのようなアミノ酸配列において、少なくとも３つのアミノ酸残基のストレッチが、ＩＬ−６Ｒと結合するための抗原結合部位の一部を形成する。
このようなアミノ酸配列のストレッチの好ましい組合せは、本明細書中のさらなる開示から明らかになる。
好ましくはこのようなアミノ酸配列において、ＣＤＲ配列が、配列番号３９９〜配列番号４７１の少なくとも１つのアミノ酸配列のＣＤＲ配列と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性、９５％以上のアミノ酸同一性等、又はさらに本質的に１００％のアミノ酸同一性を有する。
またこのアミノ酸配列は、（本明細書に規定のように）ＩＬ−６Ｒと特異的に結合することができるようなもの、及びより具体的には本明細書に規定のように（さらに本明細書に記載されるような（実際又は見掛けの）ＫＤ値、（実際又は見掛けの）ＫＡ値、ｋｏｎ速度及び／又はｋｏｆｆ速度、又は代替的にＩＣ５０値として好適に測定される、及び／又は表される）親和性でＩＬ−６Ｒと結合することができるようなものであるのが好ましい。
本発明のアミノ酸配列が、本質的に４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから成る場合、本発明のアミノ酸配列は、ＣＤＲ１が、
ａ）配列番号９３〜配列番号１４３のアミノ酸配列、
ｂ）配列番号９３〜配列番号１４３のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｃ）配列番号９３〜配列番号１４３のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、及び／又は
ＣＤＲ２が、
ｄ）配列番号１９５〜配列番号２４５のアミノ酸配列、
ｅ）配列番号１９５〜配列番号２４５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｆ）配列番号１９５〜配列番号２４５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、及び／又は
ＣＤＲ３が、
ｇ）配列番号２９７〜配列番号３４７のアミノ酸配列、
ｈ）配列番号２９７〜配列番号３４７のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｉ）配列番号２９７〜配列番号３４７のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択されるようなものであるのが好ましい。
特にこのような本発明のアミノ酸配列は、ＣＤＲ１が配列番号９３〜配列番号１４３のアミノ酸配列から成る群から選択され、及び／又はＣＤＲ２が配列番号１９５〜配列番号２４５のアミノ酸配列から成る群から選択され、及び／又はＣＤＲ３が配列番号２９７〜配列番号３４７のアミノ酸配列から成る群から選択されるようなものであり得る。
特に本発明のアミノ酸配列が、本質的に４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから成る場合、本発明のアミノ酸配列は、ＣＤＲ１が、
ａ）配列番号９３〜配列番号１４３のアミノ酸配列、
ｂ）配列番号９３〜配列番号１４３のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｃ）配列番号９３〜配列番号１４３のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、且つ
ＣＤＲ２が、
ｄ）配列番号１９５〜配列番号２４５のアミノ酸配列、
ｅ）配列番号１９５〜配列番号２４５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｆ）配列番号１９５〜配列番号２４５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、且つ
ＣＤＲ３が、
ｇ）配列番号２９７〜配列番号３４７のアミノ酸配列、
ｈ）配列番号２９７〜配列番号３４７のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｉ）配列番号２９７〜配列番号３４７のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択されるようなもの、又はこのようなアミノ酸配列の任意の好適な断片であるのが好ましい。
特にこのような本発明のアミノ酸配列は、ＣＤＲ１が配列番号９３〜配列番号１４３のアミノ酸配列から成る群から選択され、且つＣＤＲ２が配列番号１９５〜配列番号２４５のアミノ酸配列から成る群から選択され、且つＣＤＲ３が配列番号２９７〜配列番号３４７のアミノ酸配列から成る群から選択されるようなものであり得る。
また、ＣＤＲ配列の好ましい組合せは、本明細書中のさらなる開示から明らかになる。
またこのアミノ酸配列は、（本明細書に規定のように）ＩＬ−６Ｒと特異的に結合することができるようなもの、及びより具体的には本明細書に規定のように（さらに本明細書に記載されるような（実際又は見掛けの）ＫＤ値、（実際又は見掛けの）ＫＡ値、ｋｏｎ速度及び／又はｋｏｆｆ速度、又は代替的にＩＣ５０値として好適に測定される、及び／又は表される）親和性でＩＬ−６Ｒと結合することができるようなものであるのが好ましい。
好ましいが、非限定的な１つの態様において本発明は、本質的に４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから成るアミノ酸配列であって、アミノ酸配列のＣＤＲ配列が、配列番号３９９〜配列番号４７１のアミノ酸配列の少なくとも１つのＣＤＲ配列と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性、９５％以上のアミノ酸同一性等、又はさらに実質的に１００％のアミノ酸同一性を有する、アミノ酸配列に関する。このアミノ酸同一性の程度は、上記アミノ酸残基と、配列番号３９９〜配列番号４７１の１つ又は複数の配列との間のアミノ酸同一性の程度を（本明細書に記載の方法で）求めることによって決定することができる（フレームワーク領域を形成するアミノ酸残基は無視する）。このような本発明のアミノ酸配列は、本明細書にさらに記載されるようなものであり得る。
このような本発明のアミノ酸配列において、フレームワーク配列は任意の好適なフレームワーク配列であってもよく、好適なフレームワーク配列の例は、例えば標準的なハンドブック、並びに本明細書に言及されるさらなる開示及び従来技術に基づいて当業者にとって明らかである。
フレームワーク配列は、免疫グロブリンフレームワーク配列、又は（例えばヒト化又はラクダ化によって）免疫グロブリンフレームワーク配列から誘導されているフレームワーク配列（の好適な組合せ）であるのが好ましい。例えば、フレームワーク配列は、軽鎖可変ドメイン（例えばＶＬ配列）及び／又は重鎖可変ドメイン（例えばＶＨ配列）から誘導されているフレームワーク配列であり得る。特に好ましい１つの態様では、フレームワーク配列は、ＶＨＨ配列（当該フレームワーク配列は任意で、部分又は完全ヒト化し得る）から誘導されているか、又は（本明細書に規定のように）ラクダ化した従来のＶＨ配列であるいずれかのフレームワーク配列である。
フレームワーク配列は、本発明のアミノ酸配列が、ドメイン抗体（又はドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列）、単一ドメイン抗体（又は単一ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列）、「ｄＡｂ」（又はｄＡｂとしての使用に好適なアミノ酸配列）、又はナノボディ（登録商標）（ＶＨＨ配列を含むが、これに限定されない）であるようなものであるのが好ましい。また、好適なフレームワーク配列は、例えば標準的なハンドブック、並びに本明細書に言及されるさらなる開示及び従来技術に基づいて当業者にとって明らかである。
特に、本発明のアミノ酸配列に存在するフレームワーク配列は、本発明のアミノ酸配列がナノボディ（登録商標）になるように（本明細書に規定の）特徴的な残基の１つ又は複数を含有し得る。このようなフレームワーク配列（の好適な組合せ）の幾つかの好ましいが、非限定的な例は、本明細書中のさらなる開示から明らかになる。
また概して、本発明のアミノ酸配列に関して本明細書に記載のように、上記のいずれかの好適な断片（又は断片の組合せ）（例えば１つ又は複数のフレームワーク配列に好適に隣接した、及び／又はこれを介して連結した、１つ又は複数のＣＤＲ配列を含有する断片）を使用することも可能である（例えばこれらと同じ配列（order）で、ＣＤＲ配列及びフレームワーク配列は、断片が誘導された完全長の（full-sized：フルサイズの）免疫グロブリン配列で発生し得る。またこのような断片は、免疫グロブリンフォールドを含むか、若しくは形成することができるようなもの、又は代替的に免疫グロブリンフォールドを含まないか、若しくは形成することができないようなものであってもよい。
１つの特定の態様において、このような断片は、本明細書に記載の単一ＣＤＲ配列（特にＣＤＲ３配列）を含み、フレームワーク配列（の一部）（特に断片が誘導される免疫グロブリン配列において当該ＣＤＲ配列に隣接するフレームワーク配列（複数可）の一部）が両側に位置する。例えば、ＣＤＲ３配列は、ＦＲ３配列（の一部）の後にあり、ＦＲ４配列（の一部）の前にあり得る。このような断片はまた、ジスルフィド架橋、特にそれぞれＣＤＲ配列の前後にある２つのフレームワーク領域と連結するジスルフィド架橋を含有してもよい（このようなジスルフィド架橋を形成するために、当該フレームワーク領域で自然発生するシステイン残基を使用するか、又は代替的にシステイン残基を当該フレームワーク領域に合成的に付加若しくは導入してもよい）。これらの「促進断片」のさらなる説明に関しては、ここでもまた国際公開第０３／０５０５３１号パンフレットを参照する。
表Ａ−１：ＣＤＲとフレームワーク配列との好ましい組合せ
別の態様において本発明は、化合物又は構築物、特にタンパク質又はポリペプチド（それぞれ「本発明の化合物」又は「本発明のポリペプチド」とも称される）であって、１つ又は複数の本発明のアミノ酸（又はその好適な断片）を含むか、或いは本質的にこれから成り、任意で１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位をさらに含む、化合物又は構築物、特にタンパク質又はポリペプチドに関する。本明細書中のさらなる開示から当業者にとって明らかになるように、このようなさらなる基、残基、部分、結合単位又はアミノ酸配列は、本発明のアミノ酸配列（及び／又は存在する化合物又は構築物）に対するさらなる機能性を与えても、又は与えなくてもよく、本発明のアミノ酸配列の特性を変えても、又は変えなくてもよい。
例えば、このようなさらなる基、残基、部分又は結合単位は、化合物又は構築物が（融合）タンパク質又は（融合）ポリペプチドになるように、１つ又は複数のさらなるアミノ酸配列であり得る。好ましいが、非限定的な態様において、当該１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位は免疫グロブリン配列である。さらにより好ましくは、当該１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位は、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列、「ｄＡｂ」、ｄＡｂとしての使用に好適なアミノ酸配列、又はナノボディ（登録商標）から成る群から選択される。
代替的に、このような基、残基、部分又は結合単位は例えば、化学的な基、残基、部分（それ自体が生物学的に及び／又は薬理学的に有効であっても、又は有効でなくてもよい）を有し得る。例えば、これに限定されないが、このような基は、本明細書にさらに記載されるように、本発明のアミノ酸配列又はポリペプチドの「誘導体」を提供するように、１つ又は複数の本発明のアミノ酸配列と連結し得る。
本明細書に記載のように、１つ又は複数の誘導体を含むか、又は本質的にこれから成り、任意で１つ又は複数のリンカーを介して連結した、１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位を任意でさらに含む、化合物又は構築物も本発明の範囲内である。好ましくは、当該１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位はアミノ酸配列である。
上記の化合物又は構築物において、１つ又は複数の本発明のアミノ酸配列、及び１つ又は複数の基、残基、部分又は結合単位は、互いに直接、及び／又は１つ又は複数の好適なリンカー又はスペーサを介して連結してもよい。例えば、１つ又は複数の基、残基、部分又は結合単位がアミノ酸配列である場合、リンカーは、得られる化合物又は構築物が融合（タンパク質）又は融合（ポリペプチド）になるようにアミノ酸配列であってもよい。
概して本発明の化合物又はポリペプチドは、本発明の化合物又はポリペプチドを提供するように、任意で１つ又は複数の好適なリンカーを介して、１つ又は複数の本発明のアミノ酸配列と、１つ又は複数のさらなる基、残基、部分又は結合単位とを好適に連結する工程を少なくとも１つ含む方法で調製することができる。本発明のポリペプチドは、概して少なくとも本発明のポリペプチドをコードする核酸を準備する工程と、好適な方法で当該核酸を発現する工程と、発現した本発明のポリペプチドを回収する工程とを含む方法で調製することもできる。このような方法は、それ自体が既知の方法で行うことができ、例えば本明細書にさらに記載の方法及び技法に基づいて、当業者にとって明らかである。
本発明のアミノ酸配列から本発明の化合物又はポリペプチドを設計／選択、及び／又は調製する方法は、本明細書では当該本発明のアミノ酸配列を「フォーマットする（formatting）」とも称され、本発明の化合物又はポリペプチドの一部を構成する本発明のアミノ酸は、「フォーマットされた（formatted）」、或いは当該本発明の化合物又はポリペプチド「のフォーマット形態（in the format of）」であるといわれる。本発明のアミノ酸配列をフォーマットすることができる方法の例及びこのようなフォーマットの例が、本明細書中の開示に基づいて当業者にとって明らかであり、このようなフォーマットされたアミノ酸配列は、本発明のさらなる態様を形成する。
本発明の１つの特定の態様において、本発明の化合物、又は本発明のポリペプチドは、対応する本発明のアミノ酸配列に比べて増大した半減期を有し得る。このような化合物及びポリペプチドの幾つかの好ましいが、非限定的な例は、本明細書中のさらなる開示に基づいて当業者にとって明らかであり、例えば半減期が増大するように（例えばペグ化によって）化学修飾された本発明のアミノ酸配列又はポリペプチド、血清タンパク質（例えば血清アルブミン）と結合するための少なくとも１つのさらなる結合部位を含む本発明のアミノ酸配列、又は本発明のアミノ酸配列の半減期を増大させる少なくとも１つの部分（特に少なくとも１つのアミノ酸配列）と連結する少なくとも１つの本発明のアミノ酸配列を含む本発明のポリペプチドが含まれる。このような半減期が延長した部分又はアミノ酸配列を含む本発明のポリペプチドの例は、本明細書中のさらなる開示に基づいて当業者にとって明らかであり、例えばこれらに限定されないが、１つ又は複数の本発明のアミノ酸配列が、１つ又は複数の血清タンパク質若しくはその断片（例えば（ヒト）血清アルブミン又はその好適な断片）、或いは血清タンパク質と結合することができる１つ又は複数の結合単位と好適に連結するポリペプチド（例えばドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列、「ｄＡｂ」、ｄＡｂとしての使用に好適なアミノ酸配列、又はナノボディは、血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）、血清免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）等の血清タンパク質又はトランスフェリンと結合することができ、さらなる記載及び本明細書で言及される参考文献を参照する）；本発明のアミノ酸配列がＦｃ部分（例えばヒトＦｃ）又はその好適な一部若しくは断片と連結するポリペプチド；或いは１つ又は複数の本発明のアミノ酸配列が、血清タンパク質と結合することができる、１つ又は複数の低分子タンパク質又はペプチドと好適に連結するポリペプチドが含まれる（例えば、これに限定されないが、国際公開第９１／０１７４３号パンフレット、国際公開第０１／４５７４６号パンフレット、国際公開第０２／０７６４８９号パンフレットに記載のタンパク質及びペプチド）。
概して、半減期が増大した、本発明の化合物又はポリペプチドは、対応する本発明のアミノ酸配列自体の半減期よりも少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、例えば少なくとも５倍、少なくとも１０倍等、又は２０倍を超えて大きい半減期を有するのが好ましい。例えば、半減期が増大した、本発明の化合物又はポリペプチドは、対応する本発明のアミノ酸配列自体に比べて、１時間を超えて、好ましくは２時間を超えて、より好ましくは６時間を超えて、１２時間等を超えて、又はさらに２４時間、４８時間若しくは７２時間を超えて増大する半減期を有し得る。
好ましいが、本発明の非限定的な態様において、このような本発明の化合物又はポリペプチドは、対応する本発明のアミノ酸配列自体に比べて、１時間を超えて、好ましくは２時間を超えて、より好ましくは６時間を超えて、１２時間等を超えて、又はさらに２４時間、４８時間若しくは７２時間を超えて増大する血清半減期を有する。
別の好ましいが、本発明の非限定的な態様において、このような本発明の化合物又はポリペプチドは、少なくとも約１２時間、好ましくは少なくとも２４時間、より好ましくは少なくとも４８時間、さらにより好ましくは少なくとも７２時間以上のヒトにおける血清半減期を示す。例えば本発明の化合物又はポリペプチドは、少なくとも５日（約５日〜１０日等）、好ましくは少なくとも９日（約９日〜１４日等）、より好ましくは少なくとも約１０日（約１０日〜１５日等）、若しくは少なくとも約１１日（約１１日〜１６日等）、より好ましくは少なくとも約１２日（約１２日〜１８日以上等）、又は１４日超（約１４日〜１９日等）の半減期を有し得る。
別の態様において本発明は、本発明のアミノ酸配列又は本発明のポリペプチド（又はその好適な断片）をコードする核酸に関する。このような核酸は、本明細書で「本発明の核酸」とも称され、例えば本明細書でさらに記載されるように遺伝的構築物の形態であり得る。
別の態様において本発明は、本発明のアミノ酸配列及び／又は本発明のポリペプチドを発現し（又は好適な環境下で発現することができ）、及び／又は本発明の核酸を含有する、宿主又は宿主細胞に関する。このような宿主又は宿主細胞の幾つかの好ましいが、非限定的な例は、本明細書中のさらなる記載から明らかになる。
本発明はさらに、少なくとも１つの本発明のアミノ酸配列（又はその好適な断片）、少なくとも１つの本発明のポリペプチド及び／又は少なくとも１つの本発明の核酸、及び任意で（即ち組成物の目的とする用途に応じて）それ自体が既知のこのような組成物の１つ又は複数のさらなる成分を含有するか又は含む産物又は組成物に関する。このような産物又は組成物は例えば、（本明細書に記載の）薬学的組成物、獣医学的組成物又は（本明細書にも記載の）診断用途のための産物又は組成物であり得る。このような産物又は組成物の幾つかの好ましいが、非限定的な例は、本明細書中のさらなる記載から明らかになる。
別の具体的であるが、非限定的な態様において、本明細書に記載のアミノ酸配列及びポリペプチドは、（ａ）ＩＬ−６受容体と（本明細書に規定のように）特異的に結合するようなもの、及び（ｂ）ＩＬ−６受容体を下方調節することができる、及び／又はＩＬ−６受容体のシグナル伝達及び／又は経路（複数可）、機構（複数可）、又はＩＬ−６若しくはＩＬ−６Ｒが関与するシグナル伝達を抑制、低減、又は下方調節することができるようなものである。当業者にとって明らかなように、概してこのようなアミノ酸配列又はポリペプチドを、ＩＬ−６、ＩＬ−６受容体、及び／又はＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ及び／又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ媒介性シグナル伝達が関与する、生物学的経路、機構又は作用の拮抗因子として使用することができる。任意のこのような低減又は下方調節（アミノ酸配列又はポリペプチドがＩＬ−６受容体と結合しない条件下の同じパラメータに比べて、関連のパラメータで少なくとも１％、少なくとも５％等、又は１０％超、又は最大５０％若しくは１００％以上であり得る）は、例えば実験部部分で使用され、及び／又は本明細書で言及されるアッセイの１つを使用して、それ自体が既知の任意の好適な方法で測定され得る。
例えば、このような拮抗的なアミノ酸配列及びポリペプチドは、ＩＬ−６とＩＬ−６Ｒとの結合の非競合的阻害剤として競合し得る。
より具体的に、上記の（ａ）及び（ｂ）の他に、任意で下記の（ｄ）及び／又は（ｅ）の他に、このような拮抗的なアミノ酸配列及びポリペプチドは、（ｃ）本発明のアミノ酸配列又はナノボディの非存在下でのＩＬ−６とＩＬ−６受容体との結合に比べて、ＩＬ−６とＩＬ−６Ｒとの結合が遮断、抑制又は低減するようにＩＬ−６と結合し得る。
例えば、これに限定されないが、このような拮抗的なアミノ酸配列及びポリペプチドは、ＩＬ−６Ｒ上のＩＬ−６と結合するか、又はこれに近づき得る。
また上記の（ａ）及び（ｂ）の他に、任意で上記の（ｃ）又は下記の（ｅ）の他に、このような拮抗的なアミノ酸配列及びポリペプチドは、（ｄ）本発明のアミノ酸配列又はナノボディの非存在下での複合体の形成及び複合体とｇｐ１３０との結合に比べて、複合体とｇｐ１３０との結合によって誘導／媒介されるシグナル伝達を調節（例えば抑制）するように、複合体とｇｐ１３０との結合（ｇｐ１３０に対する複合体の親和性）を低減する（又は逆にｇｐ１３０と複合体との結合（複合体に対するｇｐ１３０の親和性）を低減する）ように、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体の形成を抑制するか、又はこれに作用する（例えば完全に又は部分的に破壊する）ようにＩＬ−６Ｒ（即ちそれ自体又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体で存在する）と結合し得る。
また上記の（ａ）及び（ｂ）の他に、任意で上記の（ｃ）又は（ｄ）の他に、このような拮抗的なアミノ酸配列及びポリペプチドは、（ｅ）本発明のアミノ酸配列又はナノボディの非存在下での複合体の形成及び複合体とｇｐ１３０との結合と比べて、複合体とｇｐ１３０との結合によって誘導／媒介されるシグナル伝達を調節（例えば低減）するように、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体の形成が本質的に作用しないが、当該複合体とｇｐ１３０との結合を調節（例えば抑制）するように、ＩＬ−６Ｒ（即ちそれ自体又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体）と結合するようにＩＬ−６Ｒ（即ちそれ自体又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体で存在する）と結合し得る。
代替的に、このような拮抗的なアミノ酸配列及びポリペプチドは、ＩＬ−６受容体がＩＬ−６の結合に対する感受性が低くなるように（及び／又はＩＬ−６との結合の際、ＩＬ−６受容体のシグナル伝達が低減するように）、ＩＬ−６受容体上の別のエピトープ、部位、ドメイン又は領域と結合し得る（例えばアロステリック結合）。
このような拮抗的なアミノ酸配列及びポリペプチドは、増殖因子受容体のリガンド媒介性二量化が阻害、低減又は抑制されるように、ＩＬ−６受容体上の別のエピトープ、部位、ドメイン又は領域と結合し得ることも可能である。
したがって本発明に関して、「調節すること（"modulating" or "to modulate"）」は概して、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、及び／又はＩＬ−６及び／又はＩＬ−６Ｒが関与する生物学的経路、応答、シグナル伝達、機構又は作用に関して、それぞれアゴニスト作用又は拮抗作用を及ぼすことを意味する。特に「調節すること」は、好適なｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、細胞アッセイ、又はｉｎ ｖｉｖｏアッセイ（例えば本明細書で言及されるもの）を用いて測定されるように、同じ条件下ではあるが、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドの非存在下で同じアッセイでの同じパラメータに比べて、関連のパラメータが少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、少なくとも１０％等若しくは少なくとも２５％、少なくとも５０％等、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は９０％以上変化するようなアゴニスト作用又は拮抗作用（即ちそれぞれ、完全又は部分的なアゴニスト作用又は拮抗作用）のいずれかを意味し得る。
本発明はさらに、本明細書に記載のアミノ酸配列、ポリペプチド、核酸、宿主細胞、産物及び組成物を製造又は生成する方法に関する。このような方法の幾つかの好ましいが、非限定的な例は、本明細書中のさらなる記載から明らかになる。
概してこれらの方法は、
ａ）アミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリを準備する工程と、
ｂ）ＩＬ−６Ｒと結合することができる、及び／又はＩＬ−６Ｒに対する親和性を有するアミノ酸配列に関して、上記のアミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリをスクリーニングする工程と、
ｃ）ＩＬ−６Ｒと結合することができる、及び／又はＩＬ−６Ｒに対する親和性を有するアミノ酸配列（複数可）を単離する工程とを含み得る。
このような方法では、アミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリは、任意の好適なアミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリであり得る。例えば、アミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリは、（本明細書に記載の）免疫グロブリン配列のセット、コレクション又はライブラリ（例えば免疫グロブリン配列のナイーブセット、ナイーブコレクション又はナイーブライブラリ、免疫グロブリン配列の合成又は半合成のセット、コレクション又はライブラリ、及び／又は親和性成熟を受けている免疫グロブリン配列のセット、コレクション又はライブラリ）であり得る。
またこのような方法では、アミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリは、重鎖可変ドメイン（例えばＶＨドメイン又はＶＨＨドメイン）又は軽鎖可変ドメインのセット、コレクション又はライブラリであり得る。例えば、アミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリは、ドメイン抗体若しくは単一ドメイン抗体のセット、コレクション若しくはライブラリであり得るか、又はドメイン抗体若しくは単一ドメイン抗体として機能することができるアミノ酸配列のセット、コレクション若しくはライブラリであり得る。
この方法の好ましい態様では、アミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリは、例えばＩＬ−６Ｒ、又はこれに基づき若しくはこれに由来する好適な抗原決定基（例えばその抗原の一部、断片、領域、ドメイン、ループ又は他のエピトープ）を好適に免疫付与した哺乳動物由来の免疫グロブリン配列のセット、コレクション又はライブラリであり得る。１つの特定の態様では、当該抗原決定基は、細胞外の一部、領域、ドメイン、ループ又は他の細胞外エピトープ（複数可）であり得る。
上記の方法において、アミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリは、スクリーニングを容易にするように、ファージ、ファージミド、リボソーム又は好適な微小組織（例えば酵母）上に提示してもよい。アミノ酸配列（のセット、コレクション又はライブラリ）を提示及びスクリーニングするのに好適な方法、技法及び宿主生物は、例えば本明細書中のさらなる開示に基づいて当業者にとって明らかである。Nature Biotechnology, 23, 9, 1105-1116（2005）におけるHoogenboomによるレビューも参照する。
別の態様において、アミノ酸配列を生成する方法は、少なくとも
ａ）アミノ酸配列を発現する細胞のコレクション又はサンプルを準備する工程と、
ｂ）ＩＬ−６Ｒと結合することができる、及び／又はＩＬ−６Ｒに対する親和性を有するアミノ酸配列を発現する細胞に関して上記細胞のコレクション又はサンプルをスクリーニングする工程と、
ｃ）（ｉ）上記アミノ酸配列を単離する工程、又は（ｉｉ）当該アミノ酸配列をコードする核酸配列を上記細胞から単離し、その後当該アミノ酸配列を発現する、単離する工程のいずれかとを含む。
例えば、所望のアミノ酸配列が免疫グロブリン配列である場合、細胞のコレクション又はサンプルは例えば、Ｂ細胞のコレクション又はサンプルであり得る。また、この方法では、細胞のサンプルは、ＩＬ−６Ｒ、又はこれに基づき若しくはこれに由来する好適な抗原決定基（例えばその抗原の一部、断片、領域、ドメイン、ループ又は他のエピトープ）を好適に免疫付与した哺乳動物に由来し得る。１つの特定の態様では、当該抗原決定基は、細胞外の一部、領域、ドメイン、ループ又は他の細胞外エピトープ（複数可）であり得る。
上記の方法は、当業者にとって明らかなように任意の好適な方法で行われ得る。例えば欧州特許第０５４２８１０号明細書、国際公開第０５／１９８２４号パンフレット、国際公開第０４／０５１２６８号パンフレット及び国際公開第０４／１０６３７７号パンフレットを参照する。工程ｂ）のスクリーニングは、ＦＡＣＳ等のフローサイトメトリ技法を使用して行うのが好ましい。これに関しては、例えばLieby et al., Blood, Vol. 97, No. 12, 3820を参照する。
別の態様において、ＩＬ−６Ｒに指向性を有するアミノ酸配列を生成する方法は、少なくとも
ａ）アミノ酸配列をコードする核酸配列のセット、コレクション又はライブラリを準備する工程と、
ｂ）ＩＬ−６Ｒと結合することができる、及び／又はＩＬ−６Ｒに対する親和性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列に関して、上記の核酸配列のセット、コレクション又はライブラリをスクリーニングする工程と、
ｃ）上記核酸配列を単離し、その後当該アミノ酸配列を発現する、単離する工程とを含み得る。
このような方法では、アミノ酸配列をコードする核酸配列のセット、コレクション又はライブラリは例えば、免疫グロブリン配列のナイーブセット、ナイーブコレクション又はナイーブライブラリをコードする核酸配列のセット、コレクション又はライブラリ、免疫グロブリン配列の合成又は半合成のセット、コレクション又はライブラリをコードする核酸配列のセット、コレクション又はライブラリ、及び／又は親和性成熟を受けている免疫グロブリン配列のセット、コレクション又はライブラリをコードする核酸配列のセット、コレクション又はライブラリであり得る。
またこのような方法では、核酸配列のセット、コレクション又はライブラリは、重鎖可変ドメイン（例えばＶＨドメイン又はＶＨＨドメイン）又は軽鎖可変ドメインのセット、コレクション又はライブラリをコードし得る。例えば、核酸配列のセット、コレクション又はライブラリは、ドメイン抗体若しくは単一ドメイン抗体のセット、コレクション若しくはライブラリ、又はドメイン抗体若しくは単一ドメイン抗体として機能することができるアミノ酸配列のセット、コレクション若しくはライブラリをコードし得る。
この方法の好ましい態様では、アミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリは、例えばＩＬ−６Ｒ、又はこれに基づき若しくはこれに由来する好適な抗原決定基（例えばその抗原の一部、断片、領域、ドメイン、ループ又は他のエピトープ）を好適に免疫付与した哺乳動物由来の核酸配列の免疫セット、コレクション又はライブラリであり得る。１つの特定の態様では、当該抗原決定基は、細胞外の一部、領域、ドメイン、ループ又は他の細胞外エピトープ（複数可）であり得る。
核酸配列のセット、コレクション又はライブラリは例えば、重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインの免疫セット、コレクション又はライブラリをコードし得る。１つの特定の態様では、ヌクレオチド配列のセット、コレクション又はライブラリは、ＶＨＨ配列のセット、コレクション又はライブラリをコードし得る。
上記の方法において、ヌクレオチド配列のセット、コレクション又はライブラリは、スクリーニングを容易にするように、ファージ、ファージミド、リボソーム又は好適な微小組織（例えば酵母）上に提示してもよい。アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（のセット、コレクション又はライブラリ）を提示及びスクリーニングするのに好適な方法、技法及び宿主生物は、例えば本明細書中のさらなる開示に基づいて当業者にとって明らかである。Nature Biotechnology, 23, 9, 1105-1116（2005）におけるHoogenboomによるレビューも参照する。
本発明は、上記の方法、又は代替的に上記の方法の１つと、さらに少なくとも上記免疫グロブリン配列のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を決定する工程と、それ自体が既知の方法において、例えば好適な宿主細胞若しくは宿主生物における発現によって、又は化学合成によって当該アミノ酸配列を発現又は合成する工程とを含む方法によって得られるアミノ酸配列にも関する。
また上記の工程の後に、１つ又は複数の本発明のアミノ酸配列は好適にヒト化（又は代替的にラクダ化）してもよく、及び／又はこのようにして得られたアミノ酸配列（複数可）は、本発明のポリペプチドを提供するために、（任意で１つ又は複数の好適なリンカーを介して）互いに或いは１つ又は複数の他のアミノ酸配列と連結してもよい。また、本発明のアミノ酸配列をコードする核酸配列は、好適にヒト化（又は代替的にラクダ化）、及び好適に発現してもよく、及び／又は本発明のアミノ酸配列をコードする１つ又は複数の核酸配列は、（任意で１つ又は複数の好適なリンカーをコードするヌクレオチド配列を介して）互いに或いは他の好適なアミノ酸配列をコードする１つ又は複数の核酸配列と連結してもよく、その後このようにして得られたヌクレオチド配列は、本発明のポリペプチドを提供するために好適に発現してもよい。
本発明はさらに、本明細書に記載のアミノ酸配列、ポリペプチド、核酸、宿主細胞、産物及び組成物の適用及び使用に、並びにＩＬ−６Ｒに関連する疾患及び障害を予防及び／又は治療する方法に関する。幾つかの好ましいが、非限定的な適用及び使用は、本明細書中のさらなる記載から明らかになる。
また本発明の他の態様、実施の形態、利点及び用途は、本明細書中のさらなる記載から明らかになり、本発明は、本発明のナノボディ及びこれを含む本発明のポリペプチド（これらは本発明の好ましい態様の幾つかを形成する）に関してより詳細に説明及び考察する。
本明細書中のさらなる記載から明らかになるように、一般的にナノボディは、「ｄＡｂ」又は同様の（単一）ドメイン抗体又は免疫グロブリン配列に比べて（本明細書で概説される）或る特定の利点があり、この利点は本発明のナノボディでも与えられる。しかし、以下の教示のより一般的な態様を、（直接又は同じように）他の本発明のアミノ酸配列に適用することもできることは、当業者にとって明らかである。
［発明の詳細な説明］
本発明の上記及び他の態様、実施の形態及び利点は、本明細書中のさらなる記載から明らかになる。
ａ）特に他に指示又は規定がなければ、使用される全ての用語は当該技術分野における通常の意味を有し、当業者にとって明らかである。例えば標準的なハンドブック（例えばSambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual"（2nd.Ed.）, Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989）、F. Ausubel et al, eds., "Current protocols in molecular biology", Green Publishing and Wiley Interscience, New York（1987）、Lewin, "Genes II", John Wiley & Sons, New York, N.Y.,（1985）、Old et al., "Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering", 2nd edition, University of California Press, Berkeley, CA（1981）、Roitt et al., "Immunology"（6th. Ed.）, Mosby/Elsevier, Edinburgh（2001）、Roitt et al., Roitt's Essential Immunology, 10th Ed. Blackwell Publishing, UK（2001）、及びJaneway et al., "Immunobiology"（6th Ed.）, Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York（2005））、並びに本明細書で言及される一般的な背景技術を参照する。
ｂ）特に他に指示がなければ、用語「免疫グロブリン配列」は、本明細書で重鎖抗体に言及するのに使用されるのか又は従来の４鎖抗体に言及するのに使用されるかに関係なく、全長抗体、その個々の鎖、及びその一部、ドメイン又は断片（これらに限定されないが、それぞれＶＨＨドメイン又はＶＨ／ＶＬドメイン等の抗原結合ドメイン又は断片を含む）の両方を含む一般的な用語として使用される。さらに（例えば「免疫グロブリン配列」、「抗体配列」、「可変ドメイン配列」、「ＶＨＨ配列」又は「タンパク質配列」等の用語で）本明細書で使用される用語「配列」は一般的に、文脈上さらなる限定的な解釈が要求される場合を除き、関連のアミノ酸配列と、これをコードする核酸配列又はヌクレオチド配列との両方を含むと理解されるべきである。
ｃ）特に他に指示がなければ、具体的に詳しく説明されていない全ての方法、工程、技法及び操作を実施することができ、当業者にとって明らかなそれ自体が既知の方法で実施する。また例えば、例えば標準的なハンドブック及び本明細書で言及される一般的な背景技術、並びに本明細書で言及されるさらなる参考文献を参照する。
ｄ）アミノ酸残基は、表Ａ−２に言及されるように標準的な３文字アミノ酸コード又は１文字アミノ酸コードに従って示す。
表Ａ−２：１文字アミノ酸コード及び３文字アミノ酸コード
ｅ）２つ以上のヌクレオチド配列を比較するために、［第２のヌクレオチド配列における対応する位置のヌクレオチドと同一な第１のヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの数］を［第１のヌクレオチド配列におけるヌクレオチド総数］で除算し、［１００％］で乗算することによって、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列との間の「配列同一性」のパーセントを算出することができ、第１のヌクレオチド配列に比べて、第２のヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの欠失、挿入、置換又は付加のそれぞれは、単一ヌクレオチド（位置）での差異と考えられる。
代替的に、標準的な設定を用いて、ＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔ ｖ２．０等の配列アラインメント用の既知のコンピュータアルゴリズムを使用して、２つ以上のヌクレオチド配列間の配列同一性の程度を算出することができる。
配列同一性の程度を決定するための幾つかの他の技法、コンピュータアルゴリズム及び設定は例えば、国際公開第０４／０３７９９９号パンフレット、欧州特許第０９６７２８４号明細書、欧州特許第１０８５０８９号明細書、国際公開第００／５５３１８号パンフレット、国際公開第００／７８９７２号パンフレット、国際公開第９８／４９１８５号パンフレット及び英国特許出願公開第２３５７７６８号明細書に記載されている。
通常、上述で概説された算出方法に従って、２つのヌクレオチド配列間の「配列同一性」のパーセントを決定するために、最も多くのヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を「第１の」ヌクレオチド配列とし、他のヌクレオチド配列を「第２の」ヌクレオチド配列とする。
ｆ）２つ以上のアミノ酸配列を比較するために、［第２のアミノ酸配列における対応する位置のアミノ酸残基と同一な第１のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の数］を［第１のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基総数］で除算し、［１００％］で乗算することによって、第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との間の「配列同一性」（本明細書で「アミノ酸同一性」と称される）のパーセントを算出することができ、第１のアミノ酸配列に比べて、第２のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の欠失、挿入、置換又は付加のそれぞれは、単一アミノ酸残基（位置）での差異、即ち本明細書に規定の「アミノ酸差異」と考えられる。
代替的に、ここでもまた標準的な設定を用いて、既知のコンピュータアルゴリズム（例えばヌクレオチド配列に関する配列同一性の程度を決定するのに上記で言及されるもの）を使用して、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度を算出することができる。
通常、上述で概説された算出方法に従って、２つのアミノ酸配列間の「配列同一性」のパーセントを決定するために、最も多くのアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を「第１の」アミノ酸配列とし、他のアミノ酸配列を「第２の」アミノ酸配列とする。
また、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度を決定する際、当業者は、いわゆる「保存的な」アミノ酸置換を考慮してもよく、これは一般的に、アミノ酸残基が同様の化学構造を有する別のアミノ酸残基に置き換わり、且つポリペプチドの機能、活性又は他の生物学的特性への影響がほとんど、又は本質的に全くないアミノ酸置換と説明することができる。このような保存的なアミノ酸置換は、例えば国際公開第０４／０３７９９９号パンフレット、英国特許出願公開第３３５７７６８号明細書、国際公開第９８／４９１８５号パンフレット、国際公開第００／４６３８３号パンフレット及び国際公開第０１／０９３００号パンフレットから当該技術分野において既知であり、このような置換の（好ましい）種類及び／又は組合せは、関連の教示に基づいて国際公開第０４／０３７９９９号パンフレット及び国際公開第９８／４９１８５号パンフレット、並びに本明細書で言及されるさらなる参考文献から選択することができる。
このような保存的な置換は、以下の（ａ）群〜（ｅ）群内の或るアミノ酸が、同じ群内の別のアミノ酸残基に置換される置換である：（ａ）低分子脂肪族で非極性又はわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ及びＧｌｙ、（ｂ）極性で負に荷電した残基及びこの（非荷電）アミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ及びＧｌｎ、（ｃ）極性で正に荷電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ及びＬｙｓ、（ｄ）巨大な脂肪族で非極性の残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ及びＣｙｓ、並びに（ｅ）芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ及びＴｒｐ。
特に好ましい保存的置換は以下のようなものである：ＡｌａをＧｌｙに又はＳｅｒに、ＡｒｇをＬｙｓに、ＡｓｎをＧｌｎに又はＨｉｓに、ＡｓｐをＧｌｕに、ＣｙｓをＳｅｒに、ＧｌｎをＡｓｎに、ＧｌｕをＡｓｐに、ＧｌｙをＡｌａに又はＰｒｏに、ＨｉｓをＡｓｎ又はＧｌｎに、ＩｌｅをＬｅｕに又はＶａｌに、ＬｅｕをＩｌｅに又はＶａｌに、ＬｙｓをＡｒｇに、Ｇｌｎに又はＧｌｕに、ＭｅｔをＬｅｕに、Ｔｙｒに又はＩｌｅに、ＰｈｅをＭｅｔに、Ｌｅｕに又はＴｙｒに、ＳｅｒをＴｈｒに、ＴｈｒをＳｅｒに、ＴｒｐをＴｙｒに、ＴｙｒをＴｒｐに、及び／又はＰｈｅをＶａｌに、Ｉｌｅに又はＬｅｕに。
本明細書に記載のポリペプチドに適用される任意のアミノ酸置換はまた、Schulz et al., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, 1978によって開発された異なる種の相同タンパク質間のアミノ酸変異頻度の解析、Chou and Fasman, Biochemistry 13: 211, 1974及びAdv. Enzymol., 47: 45-149, 1978によって開発された構造形成可能性（structure forming potentials）の解析、並びにEisenberg et al., Proc. Nad. Acad Sci. USA 81: 140-144, 1984; Kyte & Doolittle; J Molec. Biol. 157: 105-132, 198 1、及びGoldman et al., Ann. Rev. Biophys. Chem. 15: 321-353, 1986によって開発されたタンパク質における疎水性パターンの解析に基づき得る（全て全体が参照により本明細書に援用される）。ナノボディの一次構造、二次構造、及び三次構造に関する情報は、本明細書中の記載及び上記で言及された一般的な背景技術で与えられる。またこのため、ラマ由来のＶＨＨドメインの結晶構造は例えば、Desmyter et al., Nature Structural Biology, Vol. 3, 9, 803（1996）、Spinelli et al., Natural Structural Biology（1996）; 3, 752-757、及びDecanniere et al., Structure, Vol. 7, 4, 361（1999）によって与えられる。従来のＶＨドメインにおいてこれらの位置でＶＨ／ＶＬ界面及び潜在的なラクダ化置換を形成する幾つかのアミノ酸残基に関するさらなる情報は、上記で言及された従来技術で見出すことができる。
ｇ）アミノ酸配列及び核酸配列は、その全長にわたって（本明細書に規定のように）１００％の配列同一性を有する場合、「全く同じ」であると言える。
ｈ）２つのアミノ酸配列を比較するとき、用語「アミノ酸差異」は、第２の配列に比べて第１の配列の位置での単一アミノ酸残基の挿入、欠失又は置換を表し、２つのアミノ酸配列は、１つ又は２つ以上のこのようなアミノ酸差異を含有し得ることが理解される。
ｉ）ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列が、それぞれ別のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を「含む」、又は別のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列「から本質的に成る」というとき、これは、後者のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列がそれぞれ、初めに言及されたヌクレオチド配列又はアミノ酸配列に組み込まれていることを意味するが、より一般的に概してこれは、初めに言及されたヌクレオチド配列又はアミノ酸配列がそれぞれ、（例えば本明細書に記載の任意の好適な方法によるものであり得る）実際にどのように初めに言及された配列を生成又は入手するかに関係なく、その配列内にそれぞれ後者の配列と同じヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を有するヌクレオチド又はアミノ酸残基のストレッチを含むことを意味する。非限定的な例によって、本発明のナノボディがＣＤＲ配列を含むというとき、これは、当該ＣＤＲ配列が、本発明のナノボディに組み込まれていることを意味するが、より一般的に概してこれは、本発明のナノボディが、どのように当該本発明のナノボディを生成又は入手するかに関係なく、その配列内に当該ＣＤＲ配列と同じアミノ酸配列を有するアミノ酸残基のストレッチを含むことを意味する。後者のアミノ酸配列は、特異的な生物学的又は構造的な機能を有する場合、初めに言及されたアミノ酸配列において本質的に同じ、類似の又は同等の生物学的又は構造的な機能を有するのが好ましい（言い換えれば、初めに言及されたアミノ酸配列は、後者の配列が本質的に同じ、類似の又は同等の生物学的又は構造的な機能を果たすことができるようなものであるのが好ましい）ということにも留意すべきである。例えば、本発明のナノボディがそれぞれ、ＣＤＲ配列又はフレームワーク配列を含むというとき、ＣＤＲ配列及びフレームワークはそれぞれ、当該ナノボディでＣＤＲ配列又はフレームワーク配列として機能することができるのが好ましい。また、ヌクレオチド配列が別のヌクレオチド配列を含むというとき、初めに言及されたヌクレオチド配列は、発現産物（例えばポリペプチド）で発現する場合、後者のヌクレオチド配列でコードされるアミノ酸配列が当該発現産物の一部を形成するようなもの（言い換えれば後者のヌクレオチド配列が、初めに言及されたより大きなヌクレオチド配列と同じリーディングフレーム内にあるようなもの）であるのが好ましい。
ｊ）核酸配列又はアミノ酸配列は、通常当該供給源又は媒体に関連がある少なくとも１つの他の成分（例えば別の核酸、別のタンパク質／ポリペプチド、別の生物学的成分、又は巨大分子）、又は少なくとも１つの汚染物質、不純物若しくは微量成分から単離されている場合、（例えばその天然の生物学的供給源及び／又はそれから得られる反応媒体又は培養媒体に比べて）「本質的な単離（形態）」であると見なされる。特に、核酸配列又はアミノ酸配列は、少なくとも２倍、具体的に少なくとも１０倍、より具体的に少なくとも１００倍、及び最大１０００倍以上精製されている場合に、「本質的に単離」すると考えられる。「本質的に単離形態である」核酸配列又はアミノ酸配列は、好適な技法、例えば好適なクロマトグラフィ技法（例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動法）を使用して求められるように、本質的に相同であるのが好ましい。
ｋ）本明細書で使用される用語「ドメイン」は概して、抗体鎖の球状領域、特に重鎖抗体の球状領域、又は本質的にこのような球状領域から成るポリペプチドを表す。通常、このようなドメインは、例えばシートとして、又はジスルフィド結合によって安定化したペプチドループ（例えば３つ又は４つのペプチドループ）を含む。
ｌ）用語「抗原決定基」は、抗原結合分子（例えば本発明のナノボディ又はポリペプチド）によって、及びより具体的には当該分子の抗原結合部位によって認識される抗原上のエピトープを表す。用語「抗原決定基」及び「エピトープ」は、本明細書で区別なく使用することもできる。
ｍ）特定の抗原決定基、エピトープ、抗原又はタンパク質と（特異的に）結合することができる、特定の抗原決定基、エピトープ、抗原又はタンパク質に対する親和性を有する、及び／又は特定の抗原決定基、エピトープ、抗原又はタンパク質に対する特異性を有するアミノ酸配列（例えば本発明のナノボディ、抗体、ポリペプチド、又は概して抗原結合タンパク質若しくはポリペプチド、又はその断片）は、当該抗原決定基、当該エピトープ、当該抗原又は当該タンパク質「に対する」、又は「に指向性を有する」と言われる。特に、抗原決定基、エピトープ、抗原若しくはタンパク質（又はその少なくとも一部、断片若しくはエピトープ）「に対する」又は「に指向性を有する」、及び／又は特定の抗原決定基、エピトープ、抗原又はタンパク質（又はその少なくとも一部、断片若しくはエピトープ）と特異的に結合することができる、特定の抗原決定基、エピトープ、抗原又はタンパク質に対する親和性を有する、及び／又は特定の抗原決定基、エピトープ、抗原又はタンパク質に対する特異性を有するアミノ酸配列は、１０−５モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及び好ましくは１０−７モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及びより好ましくは１０−８モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌの解離定数（ＫＤ）で（即ち１０５Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モル以上、及び好ましくは１０７Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モル以上、及びより好ましくは１０８Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モルの結合定数（ＫＡ）で）、上記抗原決定基、上記エピトープ、上記抗原又は上記タンパク質（又はその少なくとも一部、断片若しくはエピトープ）と結合することができるアミノ酸配列と本明細書で定義される。
ｎ）用語「特異性」は、特定の抗原結合分子又は抗原結合タンパク質（例えば本発明のナノボディ又はポリペプチド）分子が結合することができる、様々な種類の抗原又は抗原結合基の数を表す。抗原結合タンパク質の特異性は、親和性及び／又は結合活性に基づき決定することができる。親和性（抗原と抗原結合タンパク質との解離に関する平衡定数（ＫＤ）によって表される）は、抗原結合タンパク質上の抗原決定基と抗原結合部位との間の結合力に関する評価基準であり、ＫＤ値が小さくなれば、抗原決定基と抗原結合分子との間の結合力が大きくなる（代替的に、親和性は、１／ＫＤである親和定数（ＫＡ）としても表すことができる）。（例えば本明細書中のさらなる開示に基づき）当業者にとって明らかなように、対象となる特異的な抗原に応じて、それ自体が既知の方法で親和性を決定することができる。結合活性は、抗原結合分子（例えば本発明のナノボディ又はポリペプチド）と関連抗原との間の結合力の測定基準である。結合活性は、抗原結合分子上での抗原決定基とその抗原結合部位との間の親和性、及び抗原結合分子に存在する関連結合部位の数の両方に関係する。典型的には、抗原結合タンパク質（例えば本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及び／又はポリペプチド）は、１０−５モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及び好ましくは１０−７モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及びより好ましくは１０−８モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌの解離定数（ＫＤ）で（即ち１０５Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モル以上、及び好ましくは１０７Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モル以上、及びより好ましくは１０８Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モルの結合定数（ＫＡ）で）これらの抗原と結合する。１０４モル／Ｌより大きい任意のＫＤ値（即ち１０４Ｍ−１（Ｌ／モル）よりも小さい任意のＫＡ値）は一般的に非特異的な結合を示すと考えられる。好ましくは、本発明の一価の免疫グロブリン配列は、５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、５００ｐＭ未満等の親和性で所望の血清タンパク質と結合する。抗原結合タンパク質と抗原又は抗原決定基との特異的な結合は、それ自体が既知の任意の好適な方法（例えばスキャッチャード解析及び／又は競合的結合アッセイ（例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）及びサンドイッチ競合アッセイ）を含む）及び当該技術分野でそれ自体が既知の様々なその変更方法、並びに本明細書で言及される他の技法で求めることができる。
当業者にとって明らかなように、解離定数は実際又は見掛けの解離定数であってもよい。解離定数を決定する方法は、当業者にとって明らかであり、例えば本明細書で言及される技法が含まれる。これに関して、１０−４モル／Ｌ又は１０−３モル／Ｌより大きい（例えば１０−２モル／Ｌの）解離定数を測定することが不可能であり得ることも明らかである。任意で、また当業者にとって明らかなように、（実際又は見掛けの）解離定数は、その関係性（ＫＤ＝１／ＫＡ）から（実際又は見掛けの）結合定数（ＫＡ）に基づき算出することができる。
親和性は、分子相互作用の強さ又は安定性を示す。一般的に親和性はＫＤ即ち解離定数として与えられ、その単位はモル／Ｌ（又はＭ）である。親和性は、１／ＫＤに等しい結合定数ＫＡとも表すことができ、その単位は（モル／Ｌ）−１（又はＭ−１）である。本明細書では、２つの分子（例えば本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドと、その目的標的との）間の相互作用の安定性は主に、これらの相互作用のＫＤ値で表され、ＫＡ＝１／ＫＤの関係性を考慮して、ＫＤ値で分子相互作用の強さを特定することを、対応するＫＡ値を算出するのに利用することもできることは、当業者にとって明らかである。ＫＤ値は、ＤＧ＝ＲＴ．ｌｎ（ＫＤ）（等しくはＤＧ＝−ＲＴ．ｌｎ（ＫＡ））（式中、Ｒは気体定数に等しく、Ｔは絶対温度に等しく、ｌｎは自然対数を示す）の既知の関係性から、結合の自由エネルギー（ＤＧ）と関連するので、熱力学的意味でも分子相互作用の強さを特徴付ける。
有意（例えば特異的）と見なされる、生物学的相互作用に関するＫＤは典型的に、１０−１０Ｍ（０．１ｎＭ）〜１０−５Ｍ（１００００ｎＭ）の範囲内である。相互作用が強くなれば、ＫＤは低くなる。
ＫＤは、（ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ及びＫＡ＝ｋｏｎ／ｋｏｆｆのように）複合体の解離速度定数（ｋｏｆｆと称される）と、その結合速度（ｋｏｎと称される）との比としても表すことができる。解離速度（off-rate）ｋｏｆｆの単位は、ｓ−１（ｓは秒のＳＩ単位表記である）である。結合速度ｋｏｎの単位は、Ｍ−１ｓ−１である。結合速度は、１０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１の間で変化し、二分子相互作用によって拡散律速結合速度定数に近づき得る。解離速度は、ｔ１／２＝ｌｎ（２）／ｋｏｆｆの関係性から所定の分子相互作用の半減期に関連する。解離速度は、１０−６ｓ−１（ｔ１／２が数日である略不可逆的な複合体）〜１ｓ−１（ｔ１／２＝０．６９ｓ）の間で変化し得る。
２つの分子間の分子相互作用の親和性は、それ自体が既知の様々な技法（例えば既知の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサ技法（例えばOber et al., Intern. Immunology, 13, 1551-1559, 2001を参照されたい）（ここで、１つの分子がバイオセンサチップ上に固定され、もう１つの分子が、ｋｏｎ、ｋｏｆｆ測定値、及びしたがってＫＤ（又はＫＡ）値が得られるフロー条件下で固定分子上を通る）で測定することができる。例えば、既知のBIACOREの機器を使用してこれを実施することができる。
測定プロセスが、例えば１つの分子のバイオセンサ上でのコーティングに関するアーチファクト（artifact：人工産物）によって、示唆分子の固有の結合親和性に幾らか影響を与える場合、測定されたＫＤは見掛けのＫＤに対応し得ることも、当業者にとって明らかである。また、１つの分子が、もう１つの分子に対して２つ以上の認識部位を含有する場合、見掛けのＫＤを測定することができる。このような状況下で、測定された親和性は、２つの分子による相互作用の結合活性に影響を与え得る。
親和性を評価するのに使用することができる別のアプローチは、Friguet et al.（J. Immunol. Methods, 77, 305-19, 1985）の２段階ＥＬＩＳＡ（酵素免疫吸着アッセイ）法である。この方法によって、溶液相の結合平衡測定が確立され、プラスチック等の支持体上での分子の１つの吸着に関連すると考えられ得るアーチファクトが避けられる。
しかし、ＫＤの正確な測定値はかなりの労働集約型である可能性があり、結果として２つの分子の結合力を評価するのに、見掛けのＫＤ値を求めることが多い。全ての測定値が一貫して（例えばアッセイ条件を一定にして）行われていれば、見掛けのＫＤ測定値は真のＫＤの近似値として使用することができ、したがって本明細書で、ＫＤ及び見掛けのＫＤは、等しい重要性又は関連性があるとして処理されるべきであることに留意すべきである。
最後に、多くの状況下で経験豊かな科学者は、幾つかの参照分子に関して結合親和性を決定するのに都合がいいと判断することができることに留意すべきである。例えば、分子Ａと分子Ｂとの間の結合力を評価するために、例えば分子Ｂと結合することが知られており、且つＥＬＩＳＡ又はＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）での検出を容易にするために、フルオロフォア若しくはクロモフォア群、又は他の化学部分（例えばビオチン）、或いは他のフォーマット（蛍光検出用フルオロフォア、吸光検出用クロモフォア、ストレプトアビジン媒介性ＥＬＩＳＡ検出用ビオチン）で好適に標識される参照分子Ｃを使用することができる。典型的に、参照分子Ｃは固定濃度に維持し、分子Ａの濃度は、分子Ｂの所定の濃度又は量に対して変化する。結果として、分子Ａの非存在下で分子Ｃで測定されたシグナルが半分になる分子Ａの濃度に対応して、ＩＣ５０値が得られる。参照分子のＫＤであるＫＤｒｅｆ及び参照分子の総濃度ｃｒｅｆが既知であれば、以下の式：ＫＤ＝ＩＣ５０／（１＋ｃｒｅｆ／ＫＤｒｅｆからＡ−Ｂ相互作用に対する見掛けのＫＤを得ることができる。ｃｒｅｆ＜＜ＫＤｒｅｆの場合、ＫＤ≒ＩＣ５０であることに留意されたい。ＩＣ５０の測定が、比較用の結合因子に関して一貫して（例えばｃｒｅｆを一定にして）実施されれば、ＩＣ５０によって分子相互作用の強さ又は安定性を評価することができ、この測定値は、本明細書を通してＫＤ又は見掛けのＫＤと同等であると判断される。
ｏ）本発明のアミノ酸配列、化合物又はポリペプチドの半減期は一般的に、例えば自然機構による配列若しくは化合物の分解及び／又は配列若しくは化合物のクリアランス（clearance）若しくは捕捉（sequestration）のために、ｉｎ ｖｉｖｏでアミノ酸配列、化合物又はポリペプチドの血清濃度が５０％まで低減するのにかかる時間と定義することができる。本発明のアミノ酸配列、化合物又はポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ半減期は、それ自体が既知の任意の方法（例えば薬物動態解析）で求めることができる。好適な技法は当業者にとって明らかであり、例えば好適な用量の本発明のアミノ酸配列、化合物又はポリペプチドを温血動物（即ち、ヒト又は別の好適な哺乳動物、例えばマウス、ウサギ、ラット、ブタ、イヌ又は霊長類（例えばマカク属のサル（例えば特にカニクイザル（マカク・ファシクラリス）及び／又はアカゲザル（マカク・ムラット））及びヒヒ（パピオ・ウルジヌス））に好適に投与する工程と、血液サンプル又は他のサンプルを当該動物から採取する工程と、当該血液サンプル中の本発明のアミノ酸配列、化合物又はポリペプチドのレベル又は濃度を求める工程と、このようにして得られたデータ（のプロット）から、本発明のアミノ酸配列、化合物又はポリペプチドのレベル又は濃度が投与時の最初のレベルに比べて５０％に低減するまでの時間を算出する工程とを伴い得る。例えば、以下の実験部部分、及び標準的なハンドブック（例えばKenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists及びPeters et al, Pharmacokinete analysis: A Practical Approach（1996））を参照する。"Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2nd Rev. edition（1982）も参照する。
また当業者にとって明らかなように（例えば国際公開第０４／００３０１９号パンフレットの６頁及び７頁とそこに言及されたさらなる参考文献とを参照されたい）、半減期は、ｔ１／２−α、ｔ１／２−β及び曲線下面積（ＡＵＣ）等のパラメータを利用して表すことができる。本明細書において、「半減期の増大」は、これらのパラメータのいずれか１つ、例えばこれらのパラメータのいずれか２つ、又は本質的に３つ全てのこれらのパラメータの増大を表す。本明細書で使用される「半減期の増大」又は「増大した半減期」は特にｔ１／２−βの増大を表し、ｔ１／２−α及び／又はＡＵＣのいずれか又は両方は増大しても或いは増大しなくてもよい。
ｐ）また本明細書でさらに記載されるように、ナノボディにおけるアミノ酸残基の総数は、１１０〜１２０、好ましくは１１２〜１１５の範囲内、及び最も好ましくは１１３であり得る。しかし、ナノボディの一部、断片、類似体又は誘導体（本明細書中に記載）は、本明細書に概説されるさらなる要求を満たし、また好ましくは本明細書に記載の目的に好適であれば、その長さ及び／又はサイズに特に限定されないことに留意すべきである。
ｑ）ナノボディのアミノ酸残基は、Riechmann and Muyldermans, J. Immunol. Methods 2000 Jun 23; 240 （1-2）:185-195の論文（例えば当該論文の、又は本明細書で言及される図２を参照されたい）においてラクダ由来のＶＨＨドメインに適用されるように、Kabat et al. （"Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91）によって与えられたＶＨドメインに関する一般的なナンバリングに従って数字が付けられる。このナンバリングに従うと、ナノボディのＦＲ１は１位〜３０位のアミノ酸残基を含み、ナノボディのＣＤＲ１は３１位〜３５位のアミノ酸残基を含み、ナノボディのＦＲ２は３６位〜４９位のアミノ酸残基を含み、ナノボディのＣＤＲ２は５０位〜６５位のアミノ酸残基を含み、ナノボディのＦＲ３は６６位〜９４位のアミノ酸残基を含み、ナノボディのＣＤＲ３は９５位〜１０２位のアミノ酸残基を含み、ナノボディのＦＲ４は１０３位〜１１３位のアミノ酸残基を含む。［これに関して、ＶＨドメイン及びＶＨＨドメインに関して当該技術分野で既知のように、ＣＤＲそれぞれにおけるアミノ酸残基の総数は変わる可能性があり、カバットナンバリングで示されるアミノ酸残基の総数に対応していなくてもよい（即ちカバットナンバリングによる１つ又は複数の位置が実際の配列で占められていなくてもよく、又は実際の配列が、カバットナンバリングが可能な数より多くのアミノ酸残基を含んでいてもよい）ことに留意すべきである。このことは、概してカバットによるナンバリングは、実際の配列におけるアミノ酸残基の実際のナンバリングに対応していても、又は対応していなくてもよいことを意味する。しかし一般的に、ＣＤＲにおけるアミノ酸残基の数に関係なく、カバットナンバリングに従うと、カバットナンバリングによる１位は、ＦＲ１の出発点に対応し（逆もまた同様）、カバットナンバリングによる３６位は、ＦＲ２の出発点に対応し（逆もまた同様）、カバットナンバリングによる６６位は、ＦＲ３の出発点に対応し（逆もまた同様）、カバットナンバリングによる１０３位は、ＦＲ４の出発点に対応する（逆もまた同様）］。ＶＨドメインのアミノ酸残基の数字を付ける代替方法（この方法は、類似の方法でラクダ由来のＶＨＨドメイン及びナノボディに適用することができる）は、Chothia et al.（Nature 342, 877-883（1989））によって説明される方法、いわゆる「ＡｂＭ定義」及びいわゆる「接触定義」である。しかし本明細書、特許請求の範囲及び図面では、特に他に指示がなければ、Riechmann and MuyldermansによってＶＨＨドメインに適用されるようなカバットによるナンバリングに従う。
ｒ）図面、配列表及び実験部部分／実施例は、本発明をさらに説明するためだけに与えられ、特に他にはっきりと本明細書中に指示がなければ、本発明の範囲及び／又は添付の特許請求の範囲を限定するものとしては決して解釈すべきではない。
重鎖抗体及びその可変ドメインの概要に関しては、特に本明細書で言及される従来技術、Reviews in Molecular Biotechnology 74（2001）, 277-302におけるMuyldermansによる総説、及び一般的な背景技術として言及される以下の特許出願：Vrije Universiteit Brusselの国際公開第９４／０４６７８号パンフレット、国際公開第９５／０４０７９号パンフレット、及び国際公開第９６／３４１０３号パンフレット；Unileverの国際公開第９４／２５５９１号パンフレット、国際公開第９９／３７６８１号パンフレット、国際公開第００／４０９６８号パンフレット、国際公開第００／４３５０７号パンフレット、国際公開第００／６５０５７号パンフレット、国際公開第０１／４０３１０号パンフレット、国際公開第０１／４４３０１号パンフレット、欧州特許第１１３４２３１号明細書及び国際公開第０２／４８１９３号パンフレット；Vlaams Instituut voor Biotechnologie（VIB）の国際公開第９７／４９８０５号パンフレット、国際公開第０１／２１８１７号パンフレット、国際公開第０３／０３５６９４号パンフレット、国際公開第０３／０５４０１６号パンフレット及び国際公開第０３／０５５５２７；Algonomics N.V.及びAblynx N. V.の国際公開第０３／０５０５３１号パンフレット；カナダのNational Research Councilによる国際公開第０１／９０１９０号パンフレット；Institute of Antibodiesによる国際公開第０３／０２５０２０号パンフレット（＝欧州特許第１４３３７９３号明細書）；並びにAblynx N.V.による国際公開第０４／０４１８６７号パンフレット、国際公開第０４／０４１８６２号パンフレット、国際公開第０４／０４１８６５号パンフレット、国際公開第０４／０４１８６３号パンフレット、国際公開第０４／０６２５５１号パンフレット、国際公開第０５／０４４８５８号パンフレット、国際公開第０６／４０１５３号パンフレット、国際公開第０６／０７９３７２号パンフレット、国際公開第０６／１２２７８６号パンフレット、国際公開第０６／１２２７８７号パンフレット及び国際公開第０６／１２２８２５号パンフレット、並びにAblynx N.V.によってさらに公開された特許出願を参照する。これらの出願で言及されるさらなる従来技術、特に国際出願の国際公開第０６／０４０１５３号パンフレットの４１頁〜４３頁で言及される参考リストも参照する（このリスト及び参考文献は参照により本明細書に援用される）。
また上記の参考文献で使用される専門用語に従って、天然重鎖抗体に存在する可変ドメインは、この可変ドメインを従来の４鎖抗体に存在する重鎖可変ドメイン（以下「ＶＨドメイン」と表す）と、及び従来の４鎖抗体に存在する軽鎖可変ドメイン（以下、「ＶＬドメイン」と表す）と区別するために、「ＶＨＨドメイン」とも表される。
上記で表された従来技術で言及されるように、ＶＨＨドメインは、単離ＶＨＨドメイン（並びにこれに基づくナノボディ、これは天然ＶＨＨドメインと、これらの構造的特徴及び機能的性質を共有する）及び機能的な抗原結合ドメイン又はタンパク質としての使用に非常に有利である、これを含有するタンパク質を作製する、多くの特有の構造的特徴及び機能的性質を有する。特に、これらに限定されないが、（軽鎖可変ドメインの非存在下で、及びこれとの相互作用が全くなく、自然に抗原と機能的に結合するように「設計」された）ＶＨＨドメイン及びナノボディは、単一で比較的低分子の機能的な抗原結合構造単位、ドメイン又はタンパク質としても機能することができる。このことは、ＶＨＨドメインを従来の４鎖抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインと区別し、概してこれら自体は単一抗原結合タンパク質又はドメインとしての実際の適用に適しておらず、幾つかの形態又は機能的な抗原結合単位を与えるような別の形態で（例えばＦａｂ断片等の従来の抗体断片、ＶＬドメインと共有結合するＶＨドメインから成るＳｃＦｖ断片等で）組合せる必要がある。
これらの特有の性質のために、単一抗原結合タンパク質又は抗原結合ドメインとして（即ちより大きなタンパク質又はポリペプチド部分として）のＶＨＨドメイン及びナノボディの使用によって、従来のＶＨドメイン及びＶＬドメイン、ｓｃＦｖ又はその従来の抗体断片（例えばＦａｂ断片又はＦ（ａｂ'）２断片）の使用に対する多くの有意な利点が与えられる：
単一ドメインだけでは、高い親和性及び高い選択性で抗原と結合することが要求されるので、２つの分離ドメインを存在させる必要もなく、これらの２つのドメインが正しい空間配置及び構造で存在することを（即ち特別に設計されたリンカー（ｓｃＦｖ等）の使用によって）確認する必要もない。
ＶＨＨドメイン及びナノボディは単一遺伝子から発現することができ、翻訳後フォールディング又は修飾の必要はない。
ＶＨＨドメイン及びナノボディは、（本明細書でさらに考察されるように）容易に多価及び多重特異性のフォーマットに容易に遺伝子組み換えすることができる。
ＶＨＨドメイン及びナノボディは、高溶解性であり、凝集しにくい（Ward et al., Nature, Vol. 341, 1989, p. 544で記載されるマウス由来の抗原結合ドメイン等）。
ＶＨＨドメイン及びナノボディは、熱、ｐＨ、プロテアーゼ及び他の変性剤又は条件に対する安定性が高い（例えば上記のEwert et alを参照されたい）。
ＶＨＨドメイン及びナノボディは、製造で要求される規模であっても調製するのが容易であり、且つ比較的安価である。例えば、ＶＨＨドメイン、ナノボディ、及びこれを含有するタンパク質／ポリペプチドは、微生物発酵を使用して（例えば以下でさらに記載されるように）製造することができ、哺乳動物の発現系（例えば従来の抗体断片）を使用する必要がない。
ＶＨＨドメイン及びナノボディは、従来の４鎖抗体及びその抗原結合断片に比べて比較的低分子（約１５ｋＤａ、即ち従来のＩｇＧの１０分の１）であるため、このような従来の４鎖抗体及びその抗原結合断片よりも高い組織（充実性腫瘍及び他の高密度組織を含むが、これらに限定されない）への浸透性を示す。
ＶＨＨドメイン及びナノボディは、（特に従来のＶＨドメインに比べてＣＤＲ３ループが伸長するため）いわゆるキャビティ結合性を示すことができ、したがって従来の４鎖抗体及びその抗原結合断片には接近することができない標的及びエピトープに接近することもできる。例えば、ＶＨＨドメイン及びナノボディは酵素を阻害することができることが分かっている（例えば国際公開第９７／４９８０５号パンフレット、Transue et al.,（1998）（上記）、Lauwereys et al.,（1998）（上記）を参照されたい）。
上記のように本発明は、ＩＬ−６受容体に指向性を有するナノボディと、本明細書に記載の予防目的、治療目的及び／又は診断目的に使用することができる、１つ又は複数のこのようなナノボディを含む、又は本質的にこれから成るポリペプチドとに関する。
また本明細書にさらに記載されるように、本発明はさらに、このようなナノボディ及びポリペプチドをコードする核酸と、このようなナノボディ及びポリペプチドを製造する方法と、このようなナノボディ若しくはポリペプチドを発現する、又は発現することができる宿主細胞と、このようなナノボディ、ポリペプチド、核酸又は宿主細胞を含む組成物と、このようなナノボディ、ポリペプチド、核酸、宿主細胞又は組成物の使用とに関する。
概して、広義で本明細書で使用される用語ナノボディは、特定の生物学的供給源又は特定の製造方法に限定されないことに留意すべきである。例えば、以下でより詳細に考察されるように、本発明のナノボディは概して、（１）天然の重鎖抗体のＶＨＨドメインを単離すること、（２）天然のＶＨＨドメインをコードするヌクレオチド配列の発現、（３）天然ＶＨＨドメインの（本明細書に記載の）「ヒト化」、又はこのようなヒト化ＶＨＨドメインをコードする核酸の発現、（４）任意の動物種、特に哺乳動物種（例えばヒト）由来の天然ＶＨドメインの（本明細書に記載の）「ラクダ化」、又はこのようなラクダ化ＶＨドメインをコードする核酸の発現、（５）Ward et al（上記）によって記載されるような「ドメイン抗体」若しくは「Ｄａｂ」の「ラクダ化」、又はこのようなラクダ化ＶＨドメインをコードする核酸の発現、（６）それ自体が既知である、タンパク質、ポリペプチド又は他のアミノ酸配列を調製するのに合成技法又は半合成技法を使用すること、（７）それ自体が既知である核酸合成技法を使用して、ナノボディをコードする核酸を調製した後、このようにして得られた核酸を発現すること、及び／又は（８）上記の１つ又は複数の任意の組合せによって得ることができることに留意すべきである。上記を実施するのに好適な方法及び技法は、本明細書中の開示に基づいて当業者にとって明らかであり、例えば本明細書でより詳細に記載される方法及び技法が含まれる。
１つの好ましいクラスのナノボディは、ＩＬ−６受容体に指向性を有する天然重鎖抗体のＶＨＨドメインに対応する。本明細書にさらに記載されるように、このようなＶＨＨ配列は概して、（即ち免疫応答及び／又はＩＬ−６受容体に指向性を有する重鎖抗体を生じるように）ＩＬ−６受容体をラクダ種に好適に免疫付与すること、当該ラクダ由来の好適な生体サンプル（例えば血液サンプル、血清サンプル又はＢ細胞のサンプル）を得ること、及びそれ自体が既知の任意の好適な技法を使用して、当該サンプルからＩＬ−６受容体に指向性を有するＶＨＨ配列を生成することによって、生成又は入手することができる。このような技法は、当業者にとって明らかであり、及び／又は本明細書でさらに記載される。
代替的に、ＩＬ−６受容体に対するこのような天然ＶＨＨドメインは、例えばそれ自体が既知の１つ又は複数のスクリーニング技法を用いて、ＩＬ−６受容体、又は少なくとも１つのその一部、断片、抗原決定基若しくはエピトープを使用して、このようなライブラリをスクリーニングすることによってラクダＶＨＨ配列のナイーブライブラリから得ることができる。このようなライブラリ及び技法は例えば、国際公開第９９／３７６８１号パンフレット、国際公開第０１／９０１９０号パンフレット、国際公開第０３／０２５０２０号パンフレット及び国際公開第０３／０３５６９４号パンフレットに記載されている。代替的に、ナイーブＶＨＨライブラリ由来の改良型の合成ライブラリ又は半合成ライブラリ（例えばランダム突然変異法及び／又はＣＤＲシャッフリング（例えば国際公開第００／４３５０７号パンフレットに記載されているようなもの）等の技法によって、ナイーブＶＨＨライブラリから得られるＶＨＨライブラリ）を使用してもよい。
ＩＬ−６受容体に指向性を有するＶＨＨ配列を得るためのさらに別の技法は、（即ち免疫応答及び／又はＩＬ−６受容体に指向性を有する重鎖抗体を生じるように）重鎖抗体を発現することができるトランスジェニック哺乳動物に好適に免疫付与すること、当該トランスジェニック哺乳動物由来の好適な生体サンプル（例えば血液サンプル、血清サンプル又はＢ細胞のサンプル）を得ること、及びそれからそれ自体が既知の任意の好適な技法を使用して、当該サンプルからＩＬ−６受容体に指向性を有するＶＨＨ配列を生成することを伴う。例えばこのために、国際公開第０２／０８５９４５号パンフレット、国際公開第０４／０４９７９４号パンフレット、国際公開第０６／００８５４８号パンフレット及びJanssens et al., Proc. Natl. Acad. Sci .USA. 2006 Oct 10;103（41）:15130-5に記載されている重鎖抗体発現マウス、並びにさらなる方法及び技法を使用することができる。
特に好ましいクラスの本発明のナノボディは、天然ＶＨＨドメインのアミノ酸配列に対応するが、即ち当該天然ＶＨＨ配列（特にフレームワーク配列）のアミノ酸配列における１つ又は複数のアミノ酸残基を、（例えば上記の）ヒトの従来の４鎖抗体由来のＶＨドメインの対応する位置（複数可）で発生する１つ又は複数のアミノ酸残基に置き換えることによって「ヒト化」したアミノ鎖配列を有するナノボディを含む。例えば本明細書中のさらなる記載及び本明細書で言及されたヒト化に関する従来技術に基づいて、当業者にとってあきらかなそれ自体が既知の方法で、これを実施することができる。また、このような本発明のヒト化ナノボディは、それ自体が既知の任意の好適な方法で（即ち上記の（１）〜（８）で示されたように）得ることができ、このため出発材料として天然ＶＨＨドメインを含むポリペプチドを使用して得られたポリペプチドに厳密に限定されないことに留意すべきである。
別の特に好ましいクラスの本発明のナノボディは、天然ＶＨドメインのアミノ酸配列に対応するが、即ち従来の４鎖抗体由来の天然ＶＨドメインのアミノ酸配列における１つ又は複数のアミノ酸残基を、重鎖抗体のＶＨＨドメインの対応する位置（複数可）で発生する１つ又は複数のアミノ酸残基に置き換えることによって「ラクダ化」したアミノ鎖配列を有するナノボディを含む。例えば本明細書中のさらなる記載に基づいて、当業者にとってあきらかなそれ自体が既知の方法で、これを実施することができる。このような「ラクダ化」置換は、本明細書に規定のように、ＶＨ−ＶＬ界面（及び／又はいわゆるラクダ科の特徴的な残基）を形成し、及び／又はこれに存在するアミノ酸位置に挿入するのが好ましい（例えば国際公開第９４／０４６７８号パンフレット及びDavies and Riechmann（1994 and 1996）（上記）を参照されたい）。好ましくは、出発材料又はラクダ化ナノボディを生成若しくは設計するための出発点として使用されるＶＨ配列は、好ましくは哺乳動物由来のＶＨ配列、より好ましくはヒトのＶＨ配列（例えばＶＨ３）である。しかし、このような本発明のラクダ化ナノボディは、それ自体が既知の任意の好適な方法で（即ち上記の（１）〜（８）で示されたように）得ることができ、このため出発材料として天然ＶＨドメインを含むポリペプチドを使用して得られたポリペプチドに厳密に限定されないことに留意すべきである。
例えばまた、本明細書にさらに記載されるように、それぞれ天然のＶＨＨドメイン又はＶＨドメインをコードするヌクレオチド配列を準備した後、それ自体が既知の方法で、新規のヌクレオチド配列がそれぞれ、本発明の「ヒト化」又は「ラクダ化」ナノボディをコードするように、当該ヌクレオチド配列における１つ又は複数のコドンを変えることによって、「ヒト化」及び「ラクダ化」の両方を行うことができる。次にこの核酸は、所望の本発明のナノボディを提供するようにそれ自体が既知の方法で発現することができる。代替的に、それぞれ天然のＶＨＨドメイン又はＶＨドメインのアミノ酸配列に基づき、それぞれ所望の本発明のヒト化又はラクダ化ナノボディのアミノ酸配列を設計した後、それ自体が既知のペプチド合成技法を使用してｄｅ ｎｏｖｏで合成することができる。また、それぞれ天然のＶＨＨドメイン又はＶＨドメインのアミノ酸配列又はヌクレオチド配列に基づき、それぞれ所望の本発明のヒト化又はラクダ化ナノボディをコードするヌクレオチド配列を設計した後、それ自体が既知のペプチド合成技法を使用してｄｅ ｎｏｖｏで合成することができ、その後所望の本発明のナノボディを提供するように、それ自体が既知の方法で、このようにして得られた核酸を発現することができる。
天然ＶＨ配列又は好ましくはＶＨＨ配列から、本発明のナノボディ及び／又はこれをコードする核酸を得るのに好適な他の方法及び技法は、当業者にとって明らかであり、例えば本発明のナノボディ、又はこれをコードするヌクレオチド配列若しくは核酸を提供するように好適な方法で、１つ又は複数の天然ＶＨ配列（例えば１つ又は複数のＦＲ配列及び／又はＣＤＲ配列）の一部分又は複数部分、１つ又は複数の天然ＶＨＨ配列（例えば１つ又は複数のＦＲ配列及び／又はＣＤＲ配列）の一部分又は複数部分、及び／又は１つ又は複数の合成又は半合成の配列を組み合わせることを含み得る。
任意で、本発明のナノボディはまた、ＩＬ−６Ｒと結合するための少なくとも１つの結合部位の他に、他の抗原、タンパク質又は標的と結合するための１つ又は複数のさらなる結合部位を含有し得る。このような第２の結合部位を導入する方法及び位置に関しては、例えばKeck and Huston, Biophysical Journal, 71, October 1996, 2002-2011、欧州特許第０６４０１３０号明細書、国際公開第０６／０７２６０号パンフレット、及び２００６年１１月２７日にAblynx N.V.により出願された表題"Immunoglobulin domains with multiple binding sites"の米国仮特許出願を参照する。
好ましいが、本発明の１つの非限定的な態様によれば、ナノボディは概して、広義で
ａ）３つの相補性決定領域／配列が間に挿入された４つのフレームワーク領域／配列から成るアミノ酸配列（カバットナンバリングによる１０８位のアミノ酸残基はＱである）、及び／又は
ｂ）３つの相補性決定領域／配列が間に挿入された４つのフレームワーク領域／配列から成るアミノ酸配列（カバットナンバリングによる４５位のアミノ酸残基は、（本明細書に規定の）荷電アミノ酸又はシステイン残基であり、４４位のアミノ酸残基はＥであるのが好ましい）、及び／又は
ｃ）３つの相補性決定領域／配列が間に挿入された４つのフレームワーク領域／配列から成るアミノ酸配列（カバットナンバリングによる１０３位のアミノ酸残基はＰ、Ｒ及びＳから成る群から選択され、特にＲ及びＳから成る群から選択される）を含む、ポリペプチドと定義することができる。
したがって好ましいが、非限定的な第１の態様において、本発明のナノボディは、構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれ、フレームワーク領域１〜フレームワーク領域４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ、相補性決定領域１〜相補性決定領域３を指す）を有し得る；ここで
ａ）カバットナンバリングによる１０８位のアミノ酸残基はＱであり、及び／又は
ｂ）カバットナンバリングによる４５位のアミノ酸残基は、荷電アミノ酸又はシステイン残基であり、カバットナンバリングによる４４位のアミノ酸残基はＥであるのが好ましく、及び／又は
ｃ）カバットナンバリングによる１０３位のアミノ酸残基はＰ、Ｒ及びＳから成る群から選択され、特にＲ及びＳから成る群から選択され、
ｄ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は本明細書で規定されるようなものであり、好ましくは本明細書中の好ましい実施の形態の１つに従って規定されるようなものであり、より好ましくは本明細書中のより好ましい実施の形態の１つに従って規定されるようなものである。
特に、ナノボディは概して、広義で
ａ）３つの相補性決定領域／配列が間に挿入された４つのフレームワーク領域／配列から成るアミノ酸配列（カバットナンバリングによる１０８位のアミノ酸残基はＱである）、及び／又は
ｂ）３つの相補性決定領域／配列が間に挿入された４つのフレームワーク領域／配列から成るアミノ酸配列（カバットナンバリングによる４４位のアミノ酸残基はＥであり、カバットナンバリングによる４５位のアミノ酸残基はＲである）、及び／又は
ｃ）３つの相補性決定領域／配列が間に挿入された４つのフレームワーク領域／配列から成るアミノ酸配列（カバットナンバリングによる１０３位のアミノ酸残基はＰ、Ｒ及びＳから成る群から選択され、特にＲ及びＳから成る群から選択される）を含む、ポリペプチドと定義することができる。
したがって好ましいが、非限定的な態様によれば、本発明のナノボディは、構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれ、フレームワーク領域１〜フレームワーク領域４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ、相補性決定領域１〜相補性決定領域３を指す）を有し得る；ここで
ａ）カバットナンバリングによる１０８位のアミノ酸残基はＱであり、及び／又は
ｂ）カバットナンバリングによる４４位のアミノ酸残基はＥであり、カバットナンバリングによる４５位のアミノ酸残基はＲであり、及び／又は
ｃ）カバットナンバリングによる１０３位のアミノ酸残基はＰ、Ｒ及びＳから成る群から選択され、特にＲ及びＳから成る群から選択され、
ｄ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は本明細書で規定されるようなものであり、好ましくは本明細書中の好ましい実施の形態の１つに従って規定されるようなものであり、より好ましくは本明細書中のより好ましい実施の形態の１つに従って規定されるようなものである。
特に本発明によるＩＬ−６受容体に対するナノボディは、構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれ、フレームワーク領域１〜フレームワーク領域４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ、相補性決定領域１〜相補性決定領域３を指す）を有し得る；ここで
ａ）カバットナンバリングによる１０８位のアミノ酸残基はＱであり、及び／又は
ｂ）カバットナンバリングによる４４位のアミノ酸残基はＥであり、カバットナンバリングによる４５位のアミノ酸残基はＲであり、及び／又は
ｃ）カバットナンバリングによる１０３位のアミノ酸残基はＰ、Ｒ及びＳから成る群から選択され、特にＲ及びＳから成る群から選択され、
ｄ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は本明細書で規定されるようなものであり、好ましくは本明細書中の好ましい実施の形態の１つに従って規定されるようなものであり、より好ましくは本明細書中のより好ましい実施の形態の１つに従って規定されるようなものである。
特に、好ましいが、本発明の１つの非限定的な態様によれば、ナノボディは、３つの相補性決定領域／配列が間に挿入された４つのフレームワーク領域／配列から成るアミノ酸配列を含むポリペプチドと定義することができ、
ａ−１）カバットナンバリングによる４４位のアミノ酸残基は、Ａ、Ｇ、Ｅ、Ｄ、Ｇ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｌから成る群から選択され、好ましくはＧ、Ｅ若しくはＱから成る群から選択され、
ａ−２）カバットナンバリングによる４５位のアミノ酸残基は、Ｌ、Ｒ若しくはＣから成る群から選択され、好ましくはＬ若しくはＲから成る群から選択され、
ａ−３）カバットナンバリングによる１０３位のアミノ酸残基は、Ｗ、Ｒ若しくはＳから成る群から選択され、好ましくはＷ若しくはＲであり、最も好ましくはＷであり、
ａ−４）カバットナンバリングによる１０８位のアミノ酸残基はＱであるか、又は
ｂ−１）カバットナンバリングによる４４位のアミノ酸残基は、Ｅ及びＱから成る群から選択され、
ｂ−２）カバットナンバリングによる４５位のアミノ酸残基はＲであり、
ｂ−３）カバットナンバリングによる１０３位のアミノ酸残基は、Ｗ、Ｒ及びＳから成る群から選択され、好ましくはＷであり、
ｂ−４）カバットナンバリングによる１０８位のアミノ酸残基はＱ及びＬから成る群から選択され、好ましくはＱであるか、又は
ｃ−１）カバットナンバリングによる４４位のアミノ酸残基は、Ａ、Ｇ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ｒ、Ｓ及びＬから成る群から選択され、好ましくはＧ、Ｅ及びＱから成る群から選択され、
ｃ−２）カバットナンバリングによる４５位のアミノ酸残基は、Ｌ、Ｒ及びＣから成る群から選択され、好ましくはＬ及びＲから成る群から選択され、
ｃ−３）カバットナンバリングによる１０３位のアミノ酸残基は、Ｐ、Ｒ及びＳから成る群から選択され、特にＲ及びＳから成る群から選択され、
ｃ−４）カバットナンバリングによる１０８位のアミノ酸残基はＱ及びＬから成る群から選択され、好ましくはＱであり、且つ
ｄ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は本明細書で規定されるようなものであり、好ましくは本明細書中の好ましい実施の形態の１つに従って規定されるようなものであり、より好ましくは本明細書中のより好ましい実施の形態の１つに従って規定されるようなものである。
したがって、別の好ましいが、本発明の非限定的な態様において、本発明のナノボディは、構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれ、フレームワーク領域１〜フレームワーク領域４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ、相補性決定領域１〜相補性決定領域３を指す）を有し得る；ここで
ａ−１）カバットナンバリングによる４４位のアミノ酸残基は、Ａ、Ｇ、Ｅ、Ｄ、Ｇ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｌから成る群から選択され、好ましくはＧ、Ｅ若しくはＱから成る群から選択され、
ａ−２）カバットナンバリングによる４５位のアミノ酸残基は、Ｌ、Ｒ若しくはＣから成る群から選択され、好ましくはＬ若しくはＲから成る群から選択され、
ａ−３）カバットナンバリングによる１０３位のアミノ酸残基は、Ｗ、Ｒ若しくはＳから成る群から選択され、好ましくはＷ若しくはＲであり、最も好ましくはＷであり、
ａ−４）カバットナンバリングによる１０８位のアミノ酸残基はＱであり、且つ
ｄ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は本明細書で規定されるようなものであり、好ましくは本明細書中の好ましい実施の形態の１つに従って規定されるようなものであり、より好ましくは本明細書中のより好ましい実施の形態の１つに従って規定されるようなものである。
別の好ましいが、非限定的な態様において、本発明のナノボディは、構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれ、フレームワーク領域１〜フレームワーク領域４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ、相補性決定領域１〜相補性決定領域３を指す）を有し得る；ここで
ｂ−１）カバットナンバリングによる４４位のアミノ酸残基は、Ｅ及びＱから成る群から選択され、
ｂ−２）カバットナンバリングによる４５位のアミノ酸残基はＲであり、
ｂ−３）カバットナンバリングによる１０３位のアミノ酸残基は、Ｗ、Ｒ及びＳから成る群から選択され、好ましくはＷであり、
ｂ−４）カバットナンバリングによる１０８位のアミノ酸残基はＱ及びＬから成る群から選択され、好ましくはＱであり、且つ
ｄ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は本明細書で規定されるようなものであり、好ましくは本明細書中の好ましい実施の形態の１つに従って規定されるようなものであり、より好ましくは本明細書中のより好ましい実施の形態の１つに従って規定されるようなものである。
別の好ましいが、非限定的な態様において、本発明のナノボディは、構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれ、フレームワーク領域１〜フレームワーク領域４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ、相補性決定領域１〜相補性決定領域３を指す）を有し得る；ここで
ｃ−１）カバットナンバリングによる４４位のアミノ酸残基は、Ａ、Ｇ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ｒ、Ｓ及びＬから成る群から選択され、好ましくはＧ、Ｅ及びＱから成る群から選択され、
ｃ−２）カバットナンバリングによる４５位のアミノ酸残基は、Ｌ、Ｒ及びＣから成る群から選択され、好ましくはＬ及びＲから成る群から選択され、
ｃ−３）カバットナンバリングによる１０３位のアミノ酸残基は、Ｐ、Ｒ及びＳから成る群から選択され、特にＲ及びＳから成る群から選択され、
ｃ−４）カバットナンバリングによる１０８位のアミノ酸残基はＱ及びＬから成る群から選択され、好ましくはＱであり、且つ
ｄ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は本明細書で規定されるようなものであり、好ましくは本明細書中の好ましい実施の形態の１つに従って規定されるようなものであり、より好ましくは本明細書中のより好ましい実施の形態の１つに従って規定されるようなものである。
２つの特に好ましいが、本発明の非限定的なナノボディ群は、上記のａ）、上記の（ａ−１）〜（ａ−５）、上記のｂ）、上記の（ｂ−１）〜（ｂ−４）、上記の（ｃ）、上記の（ｃ−１）〜（ｃ−４）によるものであり、
ａ）カバットナンバリングによる４４位〜４７位のアミノ酸残基は、配列ＧＬＥＷ（又は本明細書に記載のＧＬＥＷ様配列）を形成し、１０８位のアミノ酸残基はＱであるか、又は
ｂ）カバットナンバリングによる４３位〜４６位のアミノ酸残基は、配列ＫＥＲＥ又はＫＱＲＥ（又はＫＥＲＥ様配列）を形成し、１０８位のアミノ酸残基はＱ又はＬであり、好ましくはＱである。
したがって、別の好ましいが、非限定的な態様において、本発明のナノボディは、構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれ、フレームワーク領域１〜フレームワーク領域４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ、相補性決定領域１〜相補性決定領域３を指す）を有し得る；ここで
ａ）カバットナンバリングによる４４位〜４７位のアミノ酸残基は、配列ＧＬＥＷ（又は本明細書に記載のＧＬＥＷ様配列）を形成し、１０８位のアミノ酸残基はＱであり、且つ
ｂ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は本明細書で規定されるようなものであり、好ましくは本明細書中の好ましい実施の形態の１つに従って規定されるようなものであり、より好ましくは本明細書中のより好ましい実施の形態の１つに従って規定されるようなものである。
別の好ましいが、非限定的な態様において、本発明のナノボディは、構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれ、フレームワーク領域１〜フレームワーク領域４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ、相補性決定領域１〜相補性決定領域３を指す）を有し得る；ここで
ａ）カバットナンバリングによる４３位〜４６位のアミノ酸残基は、配列ＫＥＲＥ又はＫＱＲＥ（又はＫＥＲＥ様配列）を形成し、１０８位のアミノ酸残基はＱ又はＬであり、好ましくはＱであり、且つ
ｂ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は本明細書で規定されるようなものであり、好ましくは本明細書中の好ましい実施の形態の１つに従って規定されるようなものであり、より好ましくは本明細書中のより好ましい実施の形態の１つに従って規定されるようなものである。
カバットナンバリングによる４３位〜４６位のアミノ酸残基が、配列ＫＥＲＥ又はＫＱＲＥを形成する、本発明のナノボディにおいて、３７位のアミノ酸残基がＦであるのが最も好ましい。カバットナンバリングによる４４位〜４７位のアミノ酸残基が、配列ＧＬＥＷを形成する、本発明のナノボディにおいて、３７位のアミノ酸残基は、Ｙ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｖ又はＦから成る群から選択され、Ｖであるのが最も好ましい。
したがって、決してこれらには限定されないが、上記で言及された位置に存在するアミノ酸残基に基づき、概して本発明のナノボディを以下の３つの群に分類することができる：
ａ）「ＧＬＥＷ群」：カバットナンバリングによる４４位〜４７位にアミノ酸配列ＧＬＥＷ、及びカバットナンバリングによる１０８位にＱを有するナノボディ。本明細書でさらに記載されるように、この群内のナノボディは通常、３７位にＶを有し、１０３位にＷ、Ｐ、Ｒ又はＳを有することができ、好ましくは１０３位にＷを有する。ＧＬＥＷ群は、以下の表Ａ−３で言及されるもののような幾つかのＧＬＥＷ様配列も含む。
ｂ）「ＫＥＲＥ群」：カバットナンバリングによる４３位〜４６位にアミノ酸配列ＫＥＲＥ又はＫＱＲＥ（又は別のＫＥＲＥ様配列）、及びカバットナンバリングによる１０８位にＱ又はＬを有するナノボディ。本明細書でさらに記載されるように、この群内のナノボディは通常、３７位にＦ、及び４７位にＬ又はＦを有し、１０３位にＷ、Ｐ、Ｒ又はＳを有することができ、好ましくは１０３位にＷを有する。
ｃ）「１０３Ｐ、Ｒ、Ｓ群」：１０３位にＰ、Ｒ又はＳを有するナノボディ。これらのナノボディは、カバットナンバリングによる４４位〜４７位にアミノ酸配列ＧＬＥＷ、又はカバットナンバリングによる４３位〜４６位にアミノ酸配列ＫＥＲＥ又はＫＱＲＥのいずれかを有することができ（後者は、（ＫＥＲＥ群に関して規定のように）３７位のＦと、４７位のＬ又はＦと組合せるのが最も好ましい）、カバットナンバリングによる１０８位にＱ又はＬを有することができ、Ｑを有するのが好ましい。
また必要に応じて、ナノボディは、２つ以上のこれらの群に属し得る（即ちこれらの特徴を有し得る）。例えば、１つの特に好ましいナノボディ群は、４４位〜４７位にＧＬＥＷ又はＧＬＥＷ様配列、１０３位にＰ、Ｒ又はＳ（特にＲ）、及び１０８位にＱを有する（１０８Ｌへとヒト化してもよい）。
したがって、別の好ましいが、非限定的な態様において、本発明のナノボディは、（本明細書に規定のように）ＧＬＥＷ群に属するナノボディであってもよく、その中のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は本明細書で規定されるようなものであり、好ましくは本明細書中の好ましい実施の形態の１つに従って規定されるようなものであり、より好ましくは本明細書中のより好ましい実施の形態の１つに従って規定されるようなものである。
別の好ましいが、非限定的な態様において、本発明のナノボディは、（本明細書に規定のように）ＫＥＲＥ群に属するナノボディであってもよく、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は本明細書で規定されるようなものであり、好ましくは本明細書中の好ましい実施の形態の１つに従って規定されるようなものであり、より好ましくは本明細書中のより好ましい実施の形態の１つに従って規定されるようなものである。
したがって、別の好ましいが、非限定的な態様において、本発明のナノボディは、（本明細書に規定のように）１０３Ｐ、Ｒ、Ｓ群に属するナノボディであってもよく、その中のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は本明細書で規定されるようなものであり、好ましくは本明細書中の好ましい実施の形態の１つに従って規定されるようなものであり、より好ましくは本明細書中のより好ましい実施の形態の１つに従って規定されるようなものである。
また、より一般的には、上記で言及された１０８Ｑ、４３Ｅ／４４Ｒ及び１０３Ｐ、Ｒ、Ｓ残基の他に、本発明のナノボディは、従来のＶＨドメインでＶＨ／ＶＬ界面（の一部）が形成される１つ又は複数の位置で、対応する天然ＶＨ配列における同じ位置（複数可）で自然発生するアミノ酸残基よりも強く荷電する、１つ又は複数のアミノ酸残基、特に（表Ａ−２で言及される）１つ又は複数の荷電アミノ酸残基を含有することができる。このような置換としては、これらに限定されないが、以下の表Ａ−３で言及されるＧＬＥＷ様配列、及び４４位〜４７位のＫＬＥＷと共に１０８位にＱを有するナノボディを得るために、いわゆる「ミクロボディ」に関して国際出願の国際公開第００／２９００４号パンフレットで説明される置換が挙げられる。これらの位置での他の可能性のある置換は、本明細書中の開示に基づいて当業者にとって明らかである。
本発明のナノボディの一実施の形態において、８３位のアミノ酸残基は、Ｌ、Ｍ、Ｓ、Ｖ及びＷから成る群から選択され、Ｌであるのが好ましい。
また、本発明のナノボディの一実施の形態において、８３位のアミノ酸残基は、Ｒ、Ｋ、Ｎ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｔ及びＱから成る群から選択され、（天然ＶＨＨドメインに対応するナノボディに関しては）Ｋ若しくはＥ、又は（本明細書に記載の「ヒト化」ナノボディに関しては）Ｒのいずれかであるのが最も好ましい。一実施の形態では、８４位のアミノ酸残基は、Ｐ、Ａ、Ｒ、Ｓ、Ｄ、Ｔ及びＶから成る群から選択され、（天然ＶＨＨドメインに対応するナノボディに関しては）Ｐ、又は（本明細書に記載の「ヒト化」ナノボディに関しては）Ｒのいずれかであるのが最も好ましい。
さらに本発明のナノボディの一実施の形態において、１０４位のアミノ酸残基は、Ｇ及びＤから成る群から選択され、Ｇであるのが最も好ましい。
まとめると、ナノボディにおいて上記で言及される、１１位、３７位、４４位、４５位、４７位、８３位、８４位、１０３位、１０４位及び１０８位のアミノ酸残基は、本明細書で「特徴的な残基」とも称される。特徴的な残基及び最も密接に関連したヒトＶＨドメイン（ＶＨ３）の対応する位置のアミノ酸残基を表Ａ−３に要約する。
幾つかの特に好ましいが、非限定的な天然ＶＨＨドメインで生じるこれらの特徴的な残基の組合せを表Ａ−４で言及する。比較のために、ＤＰ−４７と呼ばれるヒトＶＨ３の対応するアミノ酸残基をイタリック体で示している。
表Ａ−３：ナノボディにおける特徴的な残基
表Ａ−４：幾つかの好ましいが、非限定的な天然ナノボディにおける特徴的な残基の組合せ
これらの組合せのヒト化に関しては、明細書を参照する。
ナノボディにおいて、特徴的な残基以外の任意の位置の各アミノ酸残基は、天然ＶＨＨドメインの（カバットナンバリングによる）対応する位置で自然発生する任意のアミノ酸残基であり得る。
このようなアミノ酸残基は当業者にとって明らかである。表Ａ−５〜表Ａ−８は、天然ＶＨＨドメインのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４の（カバットナンバリングによる）それぞれの位置に存在し得る幾つかの非限定的な残基を表す。それぞれの位置に関しては、天然ＶＨＨドメインのそれぞれの位置で最も頻繁に発生する（ナノボディにおける当該位置に最も好ましいアミノ酸残基である）アミノ酸残基を太字で示し、それぞれの位置に好ましい他のアミノ酸残基を下線処理する（備考：天然ＶＨＨドメインの２６位〜３０位で見られるアミノ酸残基の数字は、これらの位置の残基が既にＣＤＲ１部分を形成するというChothia（上記）によるナンバリングに基づく仮説を支持する）。
表Ａ−５〜表Ａ−８では、ヒトＶＨ３ドメインのそれぞれの位置に存在し得る非限定的な残基の幾つかも表している。また、それぞれの位置に関しては、天然ヒトＶＨ３ドメインのそれぞれの位置で最も頻繁に発生するアミノ酸残基を太字で示し、他の好ましいアミノ酸残基を下線処理する。
参考のみのために、表Ａ−５〜表Ａ−８は、１１１８ＶＨＨ配列の代表的なサンプルにおけるそれぞれのアミノ酸位置でＶＨＨエントロピー（「ＶＨＨ Ｅｎｔ．」）及びＶＨＨ変動（「ＶＨＨ Ｖａｒ．」）に関するデータ（David Lutje Hulsing and Prof. Theo Verrips of Utrecht Universityによって無償（kindly）提供されたデータ）も含有する。ＶＨＨエントロピー及びＶＨＨ変動の値は、解析する１１１８ＶＨＨ配列間のアミノ酸残基の変動及び保存度に対する評価基準を与え、低い値（即ち１未満、例えば０．５未満）は、アミノ酸残基が、ＶＨＨ配列間で強く保存される（即ちほとんど変動性がない）ことを示す。例えば、８位のＧ及び９位のＧはそれぞれ、０．１及び０のＶＨＨエントロピー値を有し、これは（解析する全ての１１１８配列において９位がＧである場合）これらの残基が強く保存され、ほとんど変動しないことを示す一方で、ＣＤＲ部分を形成する残基に関しては概して、１．５以上の値が見られる（データ図示せず）。（１）表Ａ−５〜表Ａ−８の２列目に列挙されるアミノ酸残基は、後の２列で言及されるＶＨＨエントロピー及びＶＨＨ変動性を決定するのに解析された１１１８ＶＨＨ配列よりも大きいサンプルに基づいており、（２）以下で表すデータは、２７位〜３０位のアミノ酸残基、並びにおそらく９３位及び９４位のアミノ酸残基でさえも既にＣＤＲ部分を形成しているという仮説を支持することに留意されたい（しかしながら、本発明は任意の特定の仮説又は説明に限定されず、上記のように、本明細書ではカバットによるナンバリングを使用する）。配列エントロピー、配列変動及びこれを決定する方法の一般的説明に関しては、Oliveira et al., PROTEINS: Structure, Function and Genetics, 52: 544-552（2003）を参照されたい。
したがって、別の好ましいが非限定的な態様では、本発明のナノボディは構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１〜フレームワーク領域４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１〜相補性決定領域３を指す）を有し得る；ここで、
ａ）特徴的な残基は本明細書で規定されるようなものであり、
ｂ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、本明細書で規定されるようなものであり、好ましくは本明細書中の好適な実施の形態の１つにより規定されるようなものであり、より好ましくは本明細書中のより好適な実施の形態の１つにより規定されるようなものである。
別の好ましいが非限定的な態様では、本発明のナノボディは構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１〜フレームワーク領域４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１〜相補性決定領域３を指す）を有し得る；ここで、
ａ）ＦＲ１はアミノ酸配列：
［１］ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＸＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧ［２６］ ［配列番号１］
から成る群、又は、
上記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定される）を有するアミノ酸配列から成る群（ここで、
ｉ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で規定される）か、及び／又は表Ａ−５で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｉｉ）当該アミノ酸配列は好ましくは、上記アミノ酸配列（複数可）と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有しない）及び／又は
上記アミノ酸配列の１つとの、３つ、２つ若しくは１つだけの「アミノ酸差異（複数可）」（本明細書で規定される）を有するアミノ酸配列から成る群（ここで、
ｉ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で規定される）か、及び／又は表Ａ−５で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｉｉ）当該アミノ酸配列は好ましくは、上記アミノ酸配列（複数可）と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有しない）から選択され、
ｂ）ＦＲ２はアミノ酸配列：
［３６］ＷＸＲＱＡＰＧＫＸＸＥＸＶＡ［４９］ ［配列番号２］
から成る群、又は、
上記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定される）を有するアミノ酸配列から成る群（ここで、
ｉ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で規定される）か、及び／又は表Ａ−６で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｉｉ）当該アミノ酸配列は好ましくは、上記アミノ酸配列（複数可）と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有しない）及び／又は
上記アミノ酸配列の１つとの、３つ、２つ若しくは１つだけの「アミノ酸差異（複数可）」（本明細書で規定される）を有するアミノ酸配列から成る群（ここで、
ｉ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で規定される）か、及び／又は表Ａ−６で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｉｉ）当該アミノ酸配列は好ましくは、上記アミノ酸配列（複数可）と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有しない）から選択され、
ｃ）ＦＲ３はアミノ酸配列：
［６６］ＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＸＸＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡ［９４］ ［配列番号３］
から成る群、又は、
上記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定される）を有するアミノ酸配列から成る群（ここで、
ｉ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で規定される）か、及び／又は表Ａ−７で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｉｉ）当該アミノ酸配列は好ましくは、上記アミノ酸配列（複数可）と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有しない）及び／又は
上記アミノ酸配列の１つとの、３つ、２つ若しくは１つだけの「アミノ酸差異（複数可）」（本明細書で規定される）を有するアミノ酸配列から成る群（ここで、
ｉ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で規定される）か、及び／又は表Ａ−７で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｉｉ）当該アミノ酸配列は好ましくは、上記アミノ酸配列（複数可）と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有しない）から選択され、
ｄ）ＦＲ４はアミノ酸配列：
［１０３］ＸＸＱＧＴＸＶＴＶＳＳ［１１３］ ［配列番号４］
から成る群、又は、
上記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定される）を有するアミノ酸配列から成る群（ここで、
ｉ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で規定される）か、及び／又は表Ａ−８で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｉｉ）当該アミノ酸配列は好ましくは、上記アミノ酸配列（複数可）と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有しない）及び／又は
上記アミノ酸配列の１つと比較して３つ、２つ若しくは１つだけの「アミノ酸差異（複数可）」（本明細書で規定される）を有するアミノ酸配列から成る群（ここで、
ｉ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で規定される）か、及び／又は表Ａ−８で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｉｉ）当該アミノ酸配列は好ましくは、上記アミノ酸配列（複数可）と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有しない）から選択され、
ｅ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、本明細書で規定されるようなものであり、好ましくは本明細書中の好適な実施の形態の１つにより規定されるようなものであり、より好ましくは本明細書中のより好適な実施の形態の１つにより規定されるようなものである；ここで特徴的な残基は「Ｘ」で示され、且つ以上に規定されるようなものであり、括弧の間の数字はカバットナンバリングによるアミノ酸位置を指す。
別の好ましいが非限定的な態様では、本発明のナノボディは構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１〜フレームワーク領域４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１〜相補性決定領域３を指す）を有し得る；ここで、
ａ）ＦＲ１はアミノ酸配列：
［１］ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧ［２６］ ［配列番号５］
から成る群、又は、
上記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定される）を有するアミノ酸配列から成る群（ここで、
ｉ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で規定される）か、及び／又は表Ａ−５で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｉｉ）当該アミノ酸配列は好ましくは、上記アミノ酸配列（複数可）と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有せず、及び、
ｉｉｉ）所定位の特徴的な残基は上記の配列に示されるようなものである）及び／又は
上記アミノ酸配列の１つと比較して３つ、２つ若しくは１つだけの「アミノ酸差異（複数可）」（本明細書で規定される）を有するアミノ酸配列から成る群（ここで、
ｉ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で規定される）か、及び／又は表Ａ−５で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｉｉ）当該アミノ酸配列は好ましくは、上記アミノ酸配列（複数可）と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有せず、及び、
ｉｉｉ）所定位の特徴的な残基は上記の配列に示されるようなものである）から選択され、
ｂ）ＦＲ２はアミノ酸配列：
［３６］ＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＬＶＡ［４９］ ［配列番号６］
［３６］ＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡ［４９］ ［配列番号７］
［３６］ＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＡ［４９］ ［配列番号８］
［３６］ＷＦＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡ［４９］ ［配列番号９］
［３６］ＷＦＲＱＡＰＧＫＱＲＥＦＶＡ［４９］ ［配列番号１０］
［３６］ＷＹＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＡ［４９］ ［配列番号１１］
から成る群、又は、
上記アミノ酸配列の１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定される）を有するアミノ酸配列から成る群（ここで、
ｉ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で規定される）か、及び／又は表Ａ−６で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｉｉ）当該アミノ酸配列は好ましくは、上記アミノ酸配列（複数可）と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有せず、
ｉｉｉ）３７位、４４位、４５位及び４７位の特徴的な残基は上記の各配列に示されるようなものである）、及び／又は
上記アミノ酸配列の１つとの、３つ、２つ若しくは１つだけの「アミノ酸差異（複数可）」（本明細書で規定される）を有するアミノ酸配列から成る群（ここで、
ｉ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で規定される）か、及び／又は表Ａ−６で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｉｉ）当該アミノ酸配列は好ましくは、上記アミノ酸配列（複数可）と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有せず、
ｉｉｉ）３７位、４４位、４５位及び４７位の特徴的な残基は上記の各配列に示されるようなものである）から選択され、
ｃ）ＦＲ３はアミノ酸配列：
［６６］ＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡ［９４］ ［配列番号１２］
から成る群、又は、
上記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定される）を有するアミノ酸配列から成る群（ここで、
ｉ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で規定される）か、及び／又は表Ａ−７で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｉｉ）当該アミノ酸配列は好ましくは、上記アミノ酸配列（複数可）と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有せず、及び、
ｉｉｉ）８３位及び８４位の特徴的な残基は上記の各配列に示されるようなものである）、及び／又は
上記アミノ酸配列の１つとの、３つ、２つ若しくは１つだけの「アミノ酸差異（複数可）」（本明細書で規定される）を有するアミノ酸配列から成る群（ここで、
ｉ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で規定される）か、及び／又は表Ａ−７で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｉｉ）当該アミノ酸配列は好ましくは、上記アミノ酸配列（複数可）と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有せず、及び、
ｉｉｉ）８３位及び８４位の特徴的な残基は上記の各配列に示されるようなものである）から選択され、
ｄ）ＦＲ４はアミノ酸配列：
［１０３］ＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ［１１３］ ［配列番号１３］
［１０３］ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ［１１３］ ［配列番号１４］
から成る群、又は、
上記アミノ酸配列の１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定される）を有するアミノ酸配列から成る群（ここで、
ｉ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で規定される）か、及び／又は表Ａ−８で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｉｉ）当該アミノ酸配列は好ましくは、上記アミノ酸配列（複数可）と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有せず、及び、
ｉｉｉ）１０３位、１０４位及び１０８位の特徴的な残基は上記の各配列に示されるようなものである）、及び／又は
上記アミノ酸配列の１つとの、３つ、２つ若しくは１つだけの「アミノ酸差異（複数可）」（本明細書で規定される）を有するアミノ酸配列から成る群（ここで、
ｉ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で規定される）か、及び／又は表Ａ−８で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｉｉ）当該アミノ酸配列は好ましくは、上記アミノ酸配列（複数可）と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有せず、
ｉｉｉ）１０３位、１０４位及び１０８位の特徴的な残基は上記の各配列に示されるようなものである）から選択され、
ｅ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、本明細書で規定されるようなものであり、好ましくは本明細書中の好適な実施の形態の１つにより規定されるようなものであり、より好ましくは本明細書中のより好適な実施の形態の１つにより規定されるようなものである。
別の好ましいが非限定的な態様では、本発明のナノボディは構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１〜フレームワーク領域４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１〜相補性決定領域３を指す）を有し得る；ここで、
ａ）ＦＲ１はアミノ酸配列：
［１］ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧ［２６］ ［配列番号５］
から成る群、及び／又は
上記アミノ酸配列の１つとの、３つ、２つ若しくは１つだけの「アミノ酸差異（複数可）」（本明細書で規定される）を有するアミノ酸配列から成る群（ここで、
ｉ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で規定される）か、及び／又は表Ａ−５で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｉｉ）当該アミノ酸配列は好ましくは、上記アミノ酸配列（複数可）と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有せず、及び、
ｉｉｉ）所定位の特徴的な残基は上記の配列に示されるようなものである）から選択され、
ｂ）ＦＲ２はアミノ酸配列：
［３６］ＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＬＶＡ［４９］ ［配列番号６］
［３６］ＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡ［４９］ ［配列番号７］
［３６］ＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＡ［４９］ ［配列番号８］
［３６］ＷＦＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡ［４９］ ［配列番号９］
［３６］ＷＦＲＱＡＰＧＫＱＲＥＦＶＡ［４９］ ［配列番号１０］
から成る群、及び／又は
上記アミノ酸配列の１つとの、２つ若しくは１つだけの「アミノ酸差異（複数可）」（本明細書で規定される）を有するアミノ酸配列から成る群（ここで、
ｉ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で規定される）か、及び／又は表Ａ−６で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｉｉ）当該アミノ酸配列は好ましくは、上記アミノ酸配列（複数可）と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有せず、及び、
ｉｉｉ）３７位、４４位、４５位及び４７位の特徴的な残基は上記の各配列に示されるようなものである）から選択され、
ｃ）ＦＲ３はアミノ酸配列：
［６６］ＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡ［９４］ ［配列番号１２］
から成る群、及び／又は
上記アミノ酸配列の１つとの、３つ、２つ若しくは１つだけの「アミノ酸差異（複数可）」（本明細書で規定される）を有するアミノ酸配列から成る群（ここで、
ｉ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で規定される）か、及び／又は表Ａ−７で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｉｉ）当該アミノ酸配列は好ましくは、上記アミノ酸配列（複数可）と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有せず、及び、
ｉｉｉ）８３位及び８４位の特徴的な残基は上記の各配列に示されるようなものである）から選択され、
ｄ）ＦＲ４はアミノ酸配列：
［１０３］ＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ［１１３］ ［配列番号１３］
［１０３］ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ［１１３］ ［配列番号１４］
から成る群、及び／又は
上記アミノ酸配列の１つとの、３つ、２つ若しくは１つだけの「アミノ酸差異（複数可）」（本明細書で規定される）を有するアミノ酸配列から成る群（ここで、
ｉ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で規定される）か、及び／又は表Ａ−８で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｉｉ）当該アミノ酸配列は好ましくは、上記アミノ酸配列（複数可）と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有せず、
ｉｉｉ）１０３位、１０４位及び１０８位の特徴的な残基は上記の各配列に示されるようなものである）から選択され、
ｅ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、本明細書で規定されるようなものであり、好ましくは本明細書中の好適な実施の形態の１つにより規定されるようなものであり、より好ましくは本明細書中のより好適な実施の形態の１つにより規定されるようなものである。
別の好ましいが非限定的な態様では、本発明のナノボディは構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１〜フレームワーク領域４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１〜相補性決定領域３を指す）を有し得る；ここで、
ａ）ＦＲ１はアミノ酸配列：
［１］ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧ［２６］ ［配列番号５］
から成る群、及び／又は
上記アミノ酸配列の１つとの、３つ、２つ若しくは１つだけの「アミノ酸差異（複数可）」（本明細書で規定される）を有するアミノ酸配列から成る群（ここで、
ｉ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で規定される）か、及び／又は表Ａ−５で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｉｉ）当該アミノ酸配列は好ましくは、上記アミノ酸配列（複数可）と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有せず、
ｉｉｉ）所定位の特徴的な残基は上記の配列に示されるようなものである）から選択され、
ｂ）ＦＲ２はアミノ酸配列：
［３６］ＷＹＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＡ［４９］ ［配列番号１１］
から成る群、及び／又は
上記アミノ酸配列の１つとの、２つ若しくは１つだけの「アミノ酸差異（複数可）」（本明細書で規定される）を有するアミノ酸配列から成る群（ここで、
ｉ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で規定される）か、及び／又は表Ａ−６で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｉｉ）当該アミノ酸配列は好ましくは、上記アミノ酸配列（複数可）と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有せず、及び、
ｉｉｉ）３７位、４４位、４５位及び４７位の特徴的な残基は上記の各配列に示されるようなものである）から選択され、
ｃ）ＦＲ３はアミノ酸配列：
［６６］ＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡ［９４］ ［配列番号１２］
から成る群、及び／又は
上記アミノ酸配列の１つとの、３つ、２つ若しくは１つだけの「アミノ酸差異（複数可）」（本明細書で規定される）を有するアミノ酸配列から成る群（ここで、
ｉ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で規定される）か、及び／又は表Ａ−７で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｉｉ）当該アミノ酸配列は好ましくは、上記アミノ酸配列（複数可）と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有せず、
ｉｉｉ）８３位及び８４位の特徴的な残基は上記の各配列に示されるようなものである）から選択され、
ｄ）ＦＲ４はアミノ酸配列：
［１０３］ＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ［１１３］ ［配列番号１３］
から成る群、及び／又は
上記アミノ酸配列の１つとの、３つ、２つ若しくは１つだけの「アミノ酸差異（複数可）」（本明細書で規定される）を有するアミノ酸配列から成る群（ここで、
ｉ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で規定される）か、及び／又は表Ａ−８で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｉｉ）当該アミノ酸配列は好ましくは、上記アミノ酸配列（複数可）と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有せず、及び、
ｉｉｉ）１０３位、１０４位及び１０８位の特徴的な残基は上記の各配列に示されるようなものである）から選択され、
ｅ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、本明細書で規定されるようなものであり、好ましくは本明細書中の好適な実施の形態の１つにより規定されるようなものであり、より好ましくは本明細書中のより好適な実施の形態の１つにより規定されるようなものである。
本発明のナノボディ中に存在し得る幾つかの他のフレームワーク配列は、上述の欧州特許第６５６９４６号明細書（例えば同様に、登録済みの同等特許である米国特許第５，７５９，８０８号を参照）に記載されている。
別の好ましいが非限定的な態様では、本発明のナノボディは構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１〜フレームワーク領域４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１〜相補性決定領域３を指す）を有し得る；ここで、
ａ）ＦＲ１は配列番号４２〜配列番号９２のアミノ酸配列から成る群、又は、
当該ＦＲ１配列の少なくとも１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定される）を有するアミノ酸配列から成る群（ここで、
ｉ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で規定される）か、及び／又は表Ａ−５で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｉｉ）当該アミノ酸配列は好ましくは、上記ＦＲ１配列と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有せず、及び、
ｉｉｉ）所定位の特徴的な残基は上記ＦＲ１配列に示されるようなものである、及び／又は
上記ＦＲ１配列の少なくとも１つと比較して３つ、２つ若しくは１つだけの「アミノ酸差異（複数可）」（本明細書で規定される）を有するアミノ酸配列から成る群（ここで、
ｉ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で規定される）か、及び／又は表Ａ−５で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｉｉ）当該アミノ酸配列は好ましくは、上記ＦＲ１配列と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有せず、
ｉｉｉ）所定位の特徴的な残基は上記ＦＲ１配列に示されるようなものである）から選択され、
ｂ）ＦＲ２は配列番号１４４〜配列番号１９４のアミノ酸配列から成る群、又は、
当該ＦＲ２配列の少なくとも１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定される）を有するアミノ酸配列から成る群（ここで、
ｉ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で規定される）か、及び／又は表Ａ−６で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｉｉ）当該アミノ酸配列は好ましくは、上記ＦＲ２配列と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有せず、及び、
ｉｉｉ）３７位、４４位、４５位及び４７位の特徴的な残基は上記ＦＲ２配列に示されるようなものである）、及び／又は
上記ＦＲ２配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つだけの「アミノ酸差異（複数可）」（本明細書で規定される）を有するアミノ酸配列から成る群（ここで、
ｉ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で規定される）か、及び／又は表Ａ−６で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｉｉ）当該アミノ酸配列は好ましくは、上記ＦＲ２配列と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有せず、
ｉｉｉ）３７位、４４位、４５位及び４７位の特徴的な残基は上記ＦＲ２配列に示されるようなものである）から選択され、
ｃ）ＦＲ３は配列番号２４６〜配列番号２９６のアミノ酸配列から成る群、又は、
当該ＦＲ３配列の少なくとも１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定される）を有するアミノ酸配列から成る群（ここで、
ｉ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で規定される）か、及び／又は表Ａ−７で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｉｉ）当該アミノ酸配列は好ましくは、上記ＦＲ３配列と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有せず、及び、
ｉｉｉ）８３位及び８４位の特徴的な残基は上記ＦＲ３配列に示されるようなものである）、及び／又は
上記ＦＲ３酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つだけの「アミノ酸差異（複数可）」（本明細書で規定される）を有するアミノ酸配列から成る群（ここで、
ｉ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で規定される）か、及び／又は表Ａ−７で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｉｉ）当該アミノ酸配列は好ましくは、上記ＦＲ３配列と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有せず、
ｉｉｉ）８３位及び８４位の特徴的な残基は上記ＦＲ３配列に示されるようなものである）から選択され、
ｄ）ＦＲ４は配列番号３４８〜配列番号３９８のアミノ酸配列から成る群、又は、
当該ＦＲ４配列の少なくとも１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定される）を有するアミノ酸配列から成る群（ここで、
ｉ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で規定される）か、及び／又は表Ａ−８で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｉｉ）当該アミノ酸配列は好ましくは、上記ＦＲ４配列と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有せず、
ｉｉｉ）１０３位、１０４位及び１０８位の特徴的な残基は上記ＦＲ３配列に示されるようなものである）、及び／又は
上記ＦＲ４配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つだけの「アミノ酸差異（複数可）」（本明細書で規定される）を有するアミノ酸配列から成る群（ここで、
ｉ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で規定される）か、及び／又は表Ａ−８で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｉｉ）当該アミノ酸配列は好ましくは、上記ＦＲ４配列と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有せず、
ｉｉｉ）１０３位、１０４位及び１０８位の特徴的な残基は上記ＦＲ４配列に示されるようなものである）から選択され、
ｅ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、本明細書で規定されるようなものであり、好ましくは本明細書中の好適な実施の形態の１つにより規定されるようなものであり、より好ましくは本明細書中のより好適な実施の形態の１つにより規定されるようなものである。
本発明の特に好適なナノボディの幾つかは、配列番号３９９〜配列番号４４９のアミノ酸配列から成る群、又は当該アミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定される）を有するアミノ酸配列から成る群から選択され得る；ここで、
ａ）特徴的な残基は上記の表Ａ−３に示され得るようなものであってもよく、
ｂ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で規定される）か、及び／又は表Ａ−５〜表Ａ−８で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｃ）当該アミノ酸配列は好ましくは、上記アミノ酸配列（複数可）と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有しない。
本発明のさらに特に好適なナノボディの幾つかは、配列番号３９９〜配列番号４４９のアミノ酸配列から成る群、又は当該アミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定される）を有するアミノ酸配列から成る群から選択され得る；ここで、
ａ）特徴的な残基は配列番号３９９〜配列番号４４９のアミノ酸配列から選択される適切なアミノ酸配列中に示されるようなものであり、
ｂ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で規定される）か、及び／又は表Ａ−５〜表Ａ−８で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｃ）当該アミノ酸配列は好ましくは、配列番号３９９〜配列番号４４９のアミノ酸配列から選択される適切なアミノ酸配列と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有しない。
ＩＬ−６受容体に対する本発明の最も好適なナノボディの幾つかは、配列番号３９９〜配列番号４４９のアミノ酸配列から成る群から選択され得る。
好ましくは、本発明のナノボディ中のＣＤＲ配列及びＦＲ配列は、本発明のナノボディが、本明細書で規定されるような親和性（本明細書中でさらに説明されるように、（実際又は見掛けの）ＫＤ値、（実際又は見掛けの）ＫＡ値、ｋｏｎ速度及び／又はｋｏｆｆ速度として、又は代替的にはＩＣ５０値として適切に測定されるか、及び／又は表される）をもってＩＬ−６受容体、並びに少なくとも１つのこのようなアミノ酸配列を含む化合物及び構築物、特にタンパク質及びポリペプチドに結合するものである。
特に、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは好ましくは、
１０−５モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、好ましくは１０−７モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、より好ましくは１０−８モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌの解離定数（ＫＤ）で（すなわち、１０５Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モル以上、好ましくは１０７Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モル以上、より好ましくは１０８Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モルの結合定数（ＫＡ）で）ＩＬ−６Ｒに結合する、及び／又は
１０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０３Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは１０４Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、例えば１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１のｋｏｎ速度でＩＬ−６Ｒに結合する、及び／又は
１ｓ−１（ｔ１／２＝０．６９秒）〜１０−６ｓ−１（ｔ１／２が数日のほぼ非可逆的な複合体の場合）、好ましくは１０−２ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−３ｓ−１〜１０−６ｓ−１、例えば１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１のｋｏｆｆ速度でＩＬ−６Ｒに結合するものである。
好ましくは、本発明の一価アミノ酸配列（又は本発明のアミノ酸配列を１つだけ含有するポリペプチド）は好ましくは、５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、例えば５００ｐＭ未満の親和性でＩＬ−６Ｒに結合するものである。
本発明のアミノ酸配列又はポリペプチドのＩＬ−６Ｒへの結合に関する幾つかの好適なＩＣ５０値は、本明細書中のさらなる記載及び実施例から明らかとなる。
本発明の非限定的な一態様によれば、ナノボディは、天然のヒトＶＨドメインの対応するフレームワーク領域と比較して、特にＤＰ−４７の対応するフレームワーク領域と比較して、フレームワーク領域の少なくとも１つに少なくとも「１つのアミノ酸差異」（本明細書で規定される）を有するという条件で、本明細書で規定されるようなものであり得る。より詳細には、本発明の非限定的な一態様によれば、ナノボディは、天然のヒトＶＨドメインの対応するフレームワーク領域と比較して、特にＤＰ−４７の対応するフレームワーク領域と比較して、特徴的な残基（例えば１０８位、１０３位及び／又は４５位のもの）の少なくとも１つに少なくとも「１つのアミノ酸差異」（本明細書で規定される）を有するという条件で、本明細書で規定されるようなものであり得る。通常、ナノボディは、天然のＶＨドメインと比較してＦＲ２及び／又はＦＲ４の少なくとも１つに、特にＦＲ２及び／又はＦＲ４の特徴的な残基の少なくとも１つ（同様に、（例えば１０８位、１０３位及び／又は４５位のもの）に、少なくとも１つのこのようなアミノ酸差異を有する。
また、本発明のヒト化ナノボディは、天然のＶＨＨドメインの対応するフレームワーク領域と比較して、フレームワーク領域の少なくとも１つに少なくとも「１つのアミノ酸差異」（本明細書で規定される）を有するという条件で、本明細書で規定されるようなものであり得る。より詳細には、本発明の非限定的な一態様によれば、ヒト化ナノボディは、天然のＶＨＨドメインの対応するフレームワーク領域と比較して、特徴的な残基（例えば１０８位、１０３位及び／又は４５位のもの）の少なくとも１つに少なくとも「１つのアミノ酸差異」（本明細書で規定される）を有するという条件で、本明細書で規定されるようなものであり得る。通常、ヒト化ナノボディは、天然のＶＨＨドメインと比較してＦＲ２及び／又はＦＲ４の少なくとも１つに、特にＦＲ２及び／又はＦＲ４の特徴的な残基の少なくとも１つ（同様に、例えば１０８位、１０３位及び／又は４５位のもの）に、少なくとも１つのこのようなアミノ酸差異を有する。
本明細書における開示より明らかなように、本明細書で規定されるような本発明のナノボディの天然又は合成の類似体、突然変異体、変異体、対立遺伝子、ホモログ及びオーソログ（本明細書中で集合的に「類似体」と称される）、特に配列番号３９９〜配列番号４４９のナノボディの類似体の使用も本発明の範囲内である。したがって、本発明の一実施の形態によれば、用語「本発明のナノボディ」は広義ではこのような類似体も包含する。
一般に、このような類似体では、本明細書で規定されるような本発明のナノボディと比較して、１つ又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されていてもよい。このような置換、挿入又は欠失はフレームワーク領域の１つ又は複数、及び／又はＣＤＲの１つ又は複数において起こってもよい。このような置換、挿入又は欠失がフレームワーク領域の１つ又は複数において起こる場合、特徴的な残基の１つ又は複数、及び／又はフレームワーク残基中の他の位置の１つ又は複数において起こってもよいが、特徴的な残基での置換、挿入又は欠失は（それが本明細書中で説明されるような適切なヒト化置換であっても）一般にあまり好適ではない。
非限定的な例によると、置換は例えば保存的置換（本明細書中で説明される）であってもよく、及び／又はアミノ酸残基は、別のＶＨＨドメインの同じ位置に自然発生する別のアミノ酸残基により置換されてもよいが（このような置換の幾つかの非限定的な例については表Ａ−５〜表Ａ−８を参照）、本発明は一般にそれに限定されない。したがって、本発明のナノボディの特性を改善するか、又は少なくとも本発明のナノボディの所望の特性又は所望の特性のバランス又は組合せを過度に損なわない（すなわち、ナノボディがもはやその使用目的に適さなくなる程度までの）任意の１つ又は複数の置換、欠失又は挿入、又はその任意の組合せは本発明の範囲内に含まれる。当業者は一般に、本明細書における開示に基づいて、また任意に、例えば限られた数の可能な置換を導入すること、及びそのようにして得られるナノボディの特性に対するその影響を求めることを含み得る限られた日常実験の後、適切な置換、欠失又は挿入、又はその適切な組合せを決定及び選択することが可能である。
例えば、本発明のナノボディ又はポリペプチドを発現するために使用される宿主生物に応じて、このような欠失及び／又は置換を、翻訳後修飾される１つ又は複数の部位（例えば１つ又は複数のグリコシル化部位）を除去し、当業者の能力の範囲内となるように設計してもよい。代替的には、置換又は挿入を官能基（本明細書中で説明される）が結合する１つ又は複数の部位を導入する、例えば部位特異的ペグ化（同様に本明細書中で説明される）を可能にするように設計してもよい。
上記の表Ａ−５〜Ａ−８に示すＶＨＨエントロピー及びＶＨＨ変動に関するデータから明らかなように、フレームワーク領域内の幾つかのアミノ酸残基は他よりも保存されている。一般に、任意の置換、欠失又は挿入は好ましくは保存されにくい位置で起こるが、本発明は広義ではそれに限定されない。また、一般に、アミノ酸置換はアミノ酸欠失又はアミノ酸挿入よりも好適である。
類似体は好ましくは、本明細書で規定されるような親和性（本明細書中でさらに説明されるように、（実際又は見掛けの）ＫＤ値、（実際又は見掛けの）ＫＡ値、ｋｏｎ速度及び／又はｋｏｆｆ速度として、又は代替的にはＩＣ５０値として適切に測定されるか、及び／又は表される）をもってＩＬ−６受容体、並びに少なくとも１つのこのようなアミノ酸配列を含む化合物及び構築物、特にタンパク質及びポリペプチドに結合することができるものである。
特に、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは好ましくは、
１０−５モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、好ましくは１０−７モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、より好ましくは１０−８モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌの解離定数（ＫＤ）で（すなわち、１０５Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モル以上、好ましくは１０７Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モル以上、より好ましくは１０８Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モルの結合定数（ＫＡ）で）ＩＬ−６Ｒに結合する、及び／又は
１０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０３Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは１０４Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、例えば１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１のｋｏｎ速度でＩＬ−６Ｒに結合する、及び／又は
１ｓ−１（ｔ１／２＝０．６９秒）〜１０−６ｓ−１（ｔ１／２が数日のほぼ非可逆的な複合体の場合）、好ましくは１０−２ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−３ｓ−１〜１０−６ｓ−１、例えば１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１のｋｏｆｆ速度でＩＬ−６Ｒに結合するものである。
好ましくは、本発明の一価アミノ酸配列（又は本発明のアミノ酸配列を１つだけ含有するポリペプチド）は好ましくは、５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、例えば５００ｐＭ未満の親和性でＩＬ−６Ｒに結合するものである。
本発明のアミノ酸配列又はポリペプチドのＩＬ−６Ｒへの結合に関する幾つかの好適なＩＣ５０値は、本明細書中のさらなる記載及び実施例から明らかとなる。
類似体は好ましくは、本明細書中で説明されるようなナノボディの有利な特性を保持するものでもある。
また、好適な一実施の形態によれば、類似体は、配列番号３９９〜配列番号４４９のナノボディの１つと少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％又は９９％以上の程度の配列同一性を有し、及び／又は好ましくは多くても２０個、好ましくは多くても１０個、さらにより好ましくは多くても５個、例えば４個、３個、２個又はただ１個のアミノ酸差異（本明細書で規定される）を有する。
また、類似体のフレームワーク配列及びＣＤＲは好ましくは、本明細書で規定される好適な実施の形態に従うものである。より一般には、本明細書中で説明されるように、類似体は（ａ）１０８位にＱ、及び／又は（ｂ）４５位に荷電アミノ酸又はシステイン残基、好ましくは４４位にＥ、より好ましくは４４位にＥ且つ４５位にＲ、及び／又は（ｃ）１０３位にＰ、Ｒ又はＳを有する。
本発明のナノボディの１つの好適な種類の類似体は、ヒト化された（すなわち、本発明の天然のナノボディの配列と比較して）ナノボディを含む。本明細書中で引用される背景技術で述べられたように、このようなヒト化は一般に、ヒトＶＨドメインでの同じ位置、例えばヒトＶＨ３ドメインに起こる、天然のＶＨＨの配列における１つ又は複数のアミノ酸残基のアミノ酸残基での置換を含む。可能なヒト化置換又はヒト化置換の組合せの例は、例えば本明細書中の表から、本明細書中で引用される背景技術で述べられた可能なヒト化置換から、及び／又はナノボディの配列と天然のヒトＶＨドメインの配列との比較から当業者に明らかである。
ヒト化置換は、得られるヒト化ナノボディが、本明細書で規定されるようなナノボディの有利な特性を依然として保持するように、より好ましくは類似体に関して前述の段落に説明されるようなものであるように選択されるべきである。当業者は一般に、本明細書における開示に基づいて、また任意に、例えば限られた数の可能なヒト化置換を導入すること、及びそのようにして得られるナノボディの特性に対するその影響を求めることを含み得る限られた日常実験の後、適切なヒト化置換又は適切なヒト化置換の組合せを決定及び選択することが可能である。
一般に、ヒト化の結果として、本発明のナノボディは、本明細書中で説明されるような本発明のナノボディの有利な特性を依然として保持すると同時に、より「ヒト様」となり得る。結果として、このようなヒト化ナノボディは幾つかの利点、例えば対応する天然のＶＨＨドメインと比較して低減された免疫原性を有し得る。また、当業者は一般に、本明細書における開示に基づいて、また任意に限られた日常実験の後、一方ではヒト化置換によりもたらされる有利な特性、他方では天然のＶＨＨドメインの有利な特性の間の所望の又は適切なバランスを最適化又は達成するヒト化置換又は適切なヒト化置換の組合せを選択することが可能である。
本発明のナノボディは任意のフレームワーク残基（複数可）、例えば１つ又は複数の特徴的な残基（本明細書で規定される）又は１つ又は複数の他のフレームワーク残基（すなわち、非特徴的な残基）又はそれらの任意の適切な組合せで適切にヒト化され得る。「Ｐ，Ｒ，Ｓ−１０３群」又は「ＫＥＲＥ群」のナノボディに関する１つの好適なヒト化置換は、Ｑ１０８からＬ１０８への置換である。「ＧＬＥＷクラス」のナノボディもまた、他の特徴的な残基の少なくとも１つがラクダ化（camelid／camelizing）置換（本明細書で規定される）を含有するという条件で、Ｑ１０８からＬ１０８への置換によりヒト化され得る。例えば、上述したように、１つの特に好適な種類のヒト化ナノボディは、ＧＬＥＷ又はＧＬＥＷ様配列を４４位〜４７位に、Ｐ、Ｒ又はＳ（特にＲ）を１０３位に、Ｌを１０８位に有する。
ヒト化及び他の類似体、並びにそれをコードする核酸配列は、それ自体が既知の任意の方法で準備することができる。例えば、類似体は、天然のＶＨＨドメインをコードする核酸を準備すること、（例えば部位特異的突然変異誘発法、又は適切なミスマッチプライマーを使用するＰＣＲによって）置換を受ける１つ又は複数のアミノ酸残基に対するコドンを、対応する所望のアミノ酸残基に対するコドンに変えること、得られる核酸／ヌクレオチド配列を適切な宿主又は発現システムにおいて発現させること、及び任意に、得られる類似体を（例えば本明細書中でさらに説明されるように）単離及び／又は精製して、本質的に単離された形の当該類似体を提供する、単離及び／又は精製することにより得ることができる。これは一般に、例えば本明細書中で引用されるハンドブック及び参考文献、本明細書中で引用される背景技術及び／又は本明細書中のさらなる記載から当業者に明らかな、それ自体が既知の方法及び技法を用いて実行することができる。代替的には、所望の類似体をコードする核酸は、それ自体が既知の方法で（例えば所定のアミノ酸配列を有する核酸配列を合成する自動装置を用いて）合成することができ、次に本明細書中で説明されるように発現させることができる。さらに別の技法は、各々が所望の類似体の一部をコードする１つ又は複数の天然及び／又は合成の核酸配列を組み合わせること、及び次に組み合わせた核酸配列を本明細書中で説明されるように発現させることを含み得る。また、類似体は、例えば本明細書中で述べたような、それ自体が既知のペプチド合成技法を用いた関連アミノ酸配列の化学合成を利用して準備することができる。
この点において、本発明のナノボディの配列を提供するため及び／又は得られる配列にナノボディの有利な特性を付与するために、本発明のナノボディ（例えばその類似体）を、例えばヒトＶＨ３配列、例えばＤＰ−４７、ＤＰ−５１又はＤＰ−２９等のヒトＶＨ配列（すなわち、アミノ酸配列又は対応するヌクレオチド配列）から設計及び／又は準備すること、すなわち、１つ又は複数のラクダ化置換を導入する（すなわち、当該ヒトＶＨドメインのアミノ酸配列中の１つ又は複数のアミノ酸残基を、ＶＨＨドメインの対応する位置で生じるアミノ酸残基に変化させる）ことが可能であることも、当業者には明らかである。また、これは一般に、開始点としてヒトＶＨドメインに対するアミノ酸配列及び／又はヌクレオチド配列を使用し、前の段落で言及される多様な方法及び技法を用いて実行することができる。
幾つかの好ましいが非限定的なラクダ化置換は、表Ａ−５〜表Ａ−８から導くことができる。特徴的な残基の１つ又は複数でのラクダ化置換は一般に、所望の特性に他のアミノ酸位置の１つ又は複数での置換よりも大きな影響を与えるが、その両方及び任意の適切な組合せが本発明の範囲内に含まれることも明らかである。例えば、既に少なくとも幾つかの所望の特性を付与している１つ又は複数のラクダ化置換を導入すること、及び次に当該特性をさらに改善するか、及び／又はさらなる有利な特性を付与するさらなるラクダ化置換を導入することが可能である。また、当業者は一般に、本明細書における開示に基づいて、また任意に、例えば限られた数の可能なラクダ化置換を導入すること、及びナノボディの有利な特性が得られたか又は改善されたか否かを求める（すなわち、本来のＶＨドメインと比較する）ことを含み得る限られた日常実験の後、適切なラクダ化置換又は適切なラクダ化置換の組合せを決定及び選択することが可能である。
しかしながら、一般にこのようなラクダ化置換は好ましくは、得られるアミノ酸配列が少なくとも（ａ）１０８位にＱ、及び／又は（ｂ）４５位に荷電アミノ酸又はシステイン残基、好ましくは４４位にＥ、より好ましくは４４位にＥ且つ４５位にＲ、及び／又は（ｃ）１０３位にＰ、Ｒ又はＳ、並びに任意に１つ又は複数のさらなるラクダ化置換を含有するものである。より好ましくは、ラクダ化置換は、本発明のナノボディ及び／又はその類似体（本明細書で規定される）、例えばヒト化類似体及び／又は好ましくは前述の段落に規定されるような類似体をもたらすものである。
本明細書における開示から同様に明らかなように、本明細書で規定されるような本発明のナノボディの一部又は断片、又は２つ以上の一部又は断片の組合せ、特に配列番号３９９〜配列番号４４９のナノボディの一部又は断片の使用もまた本発明の範囲内である。したがって、本発明の一実施の形態によれば、用語「本発明のナノボディ」は広義ではこのような一部又は断片も包含する。
一般に、本発明のナノボディ（例えばその類似体）のこのような一部又は断片は、対応する本発明の全長ナノボディ（又はその類似体）のアミノ酸配列と比較して、Ｎ末端の１つ又は複数のアミノ酸残基、Ｃ末端の１つ又は複数のアミノ酸残基、１つ又は複数の連続内部アミノ酸残基、又はその任意の組合せが欠失しているか、及び／又は除去されたアミノ酸配列を有する。
一部又は断片は好ましくは、本明細書で規定されるような親和性（本明細書中でさらに説明されるように、（実際又は見掛けの）ＫＤ値、（実際又は見掛けの）ＫＡ値、ｋｏｎ速度及び／又はｋｏｆｆ速度として、又は代替的にはＩＣ５０値として適切に測定されるか、及び／又は表される）をもってＩＬ−６受容体、並びに少なくとも１つのこのようなアミノ酸配列を含む化合物及び構築物、特にタンパク質及びポリペプチドに結合することができるものである。
特に、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは好ましくは、
１０−５モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、好ましくは１０−７モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、より好ましくは１０−８モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌの解離定数（ＫＤ）で（すなわち、１０５Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モル以上、好ましくは１０７Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モル以上、より好ましくは１０８Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モルの結合定数（ＫＡ）で）ＩＬ−６Ｒに結合する、及び／又は
１０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０３Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは１０４Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、例えば１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１のｋｏｎ速度でＩＬ−６Ｒに結合する、及び／又は
１ｓ−１（ｔ１／２＝０．６９秒）〜１０−６ｓ−１（ｔ１／２が数日のほぼ非可逆的な複合体の場合）、好ましくは１０−２ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−３ｓ−１〜１０−４ｓ−１、例えば１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１のｋｏｆｆ速度でＩＬ−６Ｒに結合するものである。
好ましくは、本発明の一価アミノ酸配列（又は本発明のアミノ酸配列を１つだけ含有するポリペプチド）は好ましくは、５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、例えば５００ｐＭ未満の親和性でＩＬ−６Ｒに結合するものである。
本発明のアミノ酸配列又はポリペプチドのＩＬ−６Ｒへの結合に関する幾つかの好適なＩＣ５０値は、本明細書中のさらなる記載及び実施例から明らかとなる。
ＩＬ−６受容体に対する類似体の親和性は、それ自体が既知の方法、例えば本明細書中で説明される分析を用いて求めることができる。
任意の一部又は断片は好ましくは、対応する本発明の全長ナノボディのアミノ酸配列の少なくとも１０個の連続アミノ酸残基、好ましくは少なくとも２０個の連続アミノ酸残基、より好ましくは少なくとも３０個の連続アミノ酸残基、例えば少なくとも４０個の連続アミノ酸残基を含むものである。
また、任意の一部又は断片は好ましくは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３の少なくとも１つ又は少なくともその一部（特に少なくともＣＤＲ３又は少なくともその一部）を含むものである。より好ましくは、任意の一部又は断片は、好ましくは適切なフレームワーク配列（複数可）又は少なくともその一部により連結した、ＣＤＲの少なくとも１つ（好ましくは少なくともＣＤＲ３又はその一部）及び少なくとも１つの他のＣＤＲ（すなわち、ＣＤＲ１又はＣＤＲ２）又は少なくともその一部を含むものである。より好ましくは、任意の一部又は断片は、好ましくは同様に適切なフレームワーク配列（複数可）又は少なくともその一部により連結した、ＣＤＲの少なくとも１つ（好ましくは少なくともＣＤＲ３又はその一部）及び残り２つのＣＤＲの少なくとも一部を含むものである。
別の特に好ましいが非限定的な実施の形態によれば、このような一部又は断片は、対応する本発明の全長ナノボディの少なくともＣＤＲ３、例えばＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４を含む（すなわち、例えば国際出願の国際公開第０３／０５０５３１号パンフレット（Lasters et al.）に説明される）。
上記で既に述べたように、２つ以上のこのような一部又は断片（すなわち、同一又は別個の本発明のナノボディに由来する）を組み合わせる、すなわち、本発明のナノボディの類似体（本明細書で規定される）及び／又はさらなる一部又は断片（本明細書で規定される）を提供することも可能である。例えば、本発明のナノボディの１つ又は複数の一部又は断片を、ヒトＶＨドメインの１つ又は複数の一部又は断片と組み合わせることもまた可能である。
好適な一実施の形態によれば、一部又は断片は、配列番号３９９〜配列番号４４９のナノボディの１つと少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、９５％又は９９％以上の程度の配列同一性を有する。
一部及び断片、並びにそれをコードする核酸配列は、任意のそれ自体が既知の方法で準備して任意に組み合わせることができる。例えば、このような一部又は断片は、完全長の本発明のナノボディをコードする核酸中に終止コドンを挿入すること、及び次に得られる核酸をそれ自体が既知の方法（例えば本明細書中で説明される）で発現させることで得ることができる。代替的には、このような一部又は断片をコードする核酸は、完全長の本発明のナノボディをコードする核酸を適切に制限すること、又はこのような核酸をそれ自体が既知の方法で合成することにより得ることができる。一部又は断片はまた、それ自体が既知のペプチド合成技法を用いて準備してもよい。
本発明は広義では本発明のナノボディの誘導体も含む。このような誘導体は一般に、本発明のナノボディ及び／又は本発明のナノボディを形成するアミノ酸残基の１つ又は複数の修飾、特に化学的及び／又は生物学的（例えば酵素的）修飾により得ることができる。
このような修飾の例、並びにこのような形（すなわち、タンパク質骨格、又は好ましくは側鎖のいずれか）で修飾することができるナノボディ配列中のアミノ酸残基の例、このような修飾の導入のために使用することができる方法及び技法、並びにこのような修飾の潜在的使用及び利点は当業者に明らかである。
例えば、このような修飾は、１つ又は複数の官能基、残基又は部分、特に１つ又は複数の所望の特性又は官能性を本発明のナノボディに付与する１つ又は複数の官能基、残基又は部分を本発明のナノボディ中又はナノボディ上に（例えば共有結合によるか、又は他の適切な形で）導入することを含み得る。このような官能基の例は当業者に明らかである。
例えば、このような修飾は、本発明のナノボディの半減期、溶解性及び／又は吸収性を増大させる、本発明のナノボディの免疫原性及び／又は毒性を低減する、本発明のナノボディの任意の望ましくない副作用を排除又は減衰する、及び／又は本発明のナノボディ及び／又はポリペプチドに他の有益なな特性を付与するか、及び／又は本発明のナノボディ及び／又はポリペプチドの不要な特性を減らす、又は上記の２つ以上の任意の組合せである１つ又は複数の官能基を（例えば共有結合によるか、又は他の適切な形で）導入することを含み得る。このような官能基及びそれらを導入する技法の例は当業者に明らかであり、一般に、以上で引用される一般的背景技術で述べた全ての官能基及び技法、並びに医薬用タンパク質の修飾、特に抗体又は抗体断片（例えばＳｃＦｖ及び単一ドメイン抗体）の修飾に関するそれ自体が既知の官能基及び技法を含み得る；これに関しては例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA （1980）を参照する。同様に当業者に明らかなように、このような官能基は、例えば本発明のナノボディに直接（例えば共有結合的に）結合するか、又は任意に適切なリンカー又はスペーサーを介して結合する。
半減期を増大するか、及び／又は医薬用タンパク質の免疫原性を低減するために最も広く使用される技法の１つは、適切な薬学的に許容可能なポリマー、例えばポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）又はその誘導体（例えばメトキシポリ（エチレングリコール）又はｍＰＥＧ）の結合を含む。一般に、任意の適切な形のペグ化、例えば当該技術分野で抗体及び抗体断片（例えば、限定されるものではないが、（単一）ドメイン抗体及びＳｃＦｖ）に対して使用されるペグ化を使用することができる；例えばChapman, Nat. Biotechnol., 54, 531-545 （2002）、Veronese and Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 453-456 （2003）、Harris and Chess, Nat. Rev. Drug. Discov., 2, （2003）及び国際公開第０４／０６０９６５号パンフレットを参照する。タンパク質のペグ化に関する多様な試薬も、例えばNektar Therapeutics, USAより市販されている。
好ましくは、特にシステイン残基を介した部位特異的ペグ化を使用する（例えばYang et al., Protein Engineering, 16, 10, 761-770 （2003）を参照）。例えば、そのために、本発明のナノボディにおいて自然発生するシステイン残基にＰＥＧを結合してもよく、本発明のナノボディを、ＰＥＧに結合する１つ又は複数のシステイン残基を適切に導入するように修飾してもよく、又はＰＥＧに結合する１つ又は複数のシステイン残基を含むアミノ酸配列を、本発明のナノボディのＮ末端及び／又はＣ末端と融合してもよい（全て、それ自体が当業者に既知であるタンパク質工学の技法を使用する）。
好ましくは、ＰＥＧは、本発明のナノボディ及びタンパク質に対して５０００を超える（例えば１００００を超える）且つ２０００００未満（例えば１０００００未満）の分子量、例えば２００００〜８００００の範囲の分子量で使用する。
さらに、通常あまり好ましくない修飾は、一般的に翻訳時及び／又は翻訳後の修飾の一部として、本発明のナノボディ又はポリペプチドを発現するのに用いられる宿主細胞に応
じてＮ結合型又はＯ結合型のグリコシル化を含む。
さらに別の修飾は、標識したナノボディの用途に応じて、１つ又は複数の検出可能な標識、又は他のシグナル生成基若しくはシグナル生成部分の導入を含んでいてもよい。それらを結合、使用及び検出するのに好適な標識及び技法は当業者にとって明らかであり、例としては、蛍光標識（例えば、フルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタアルデヒド、及びフルオレサミン、並びに１５２Ｅｕ等の蛍光金属、又はランタニド種からの他の金属）、リン光標識、化学発光標識又は生物発光標識（例えば、ルミナール、イソルミナール、セロマティックアクリジニウムエステル（theromatic acridinium ester）、イミダゾール、アクリジニウム塩、シュウ酸エステル、及びジオキセタン又はＧＦＰ、並びにその類似体）、放射性同位体（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ、５１Ｃｒ、３６Ｃｌ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、及び７５Ｓｅ）、金属、金属キレート又は金属カチオン（例えば、９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、１３１Ｉ、９７Ｒｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、及び６８Ｇａ等の金属カチオン、又はｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｓｉｔｕ診断及びイメージングに特に適す他の金属若しくは金属カチオン、例えば（１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、１６２Ｄｙ、５２Ｃｒ、及び５６Ｆｅ）、並びに、発色団及び酵素（例えば、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、デルタ−Ｖ−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ビオチンアビジンペルオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase）、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−ＶＩ−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、及びアセチルコリンエステラーゼ）が挙げられるが、これらに限定されない。他の好適な標識は当業者にとって明らかであり、例としては、ＮＭＲ分光法又はＥＳＲ分光法を用いて検出することができる部分が挙げられる。
本発明のこのような標識したナノボディ及びポリペプチドは、例えば、特異的標識の選択に応じて、（ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＩＡ及び他の「サンドイッチアッセイ」等の既知のイムノアッセイを含む）ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｓｉｔｕアッセイに、並びにｉｎ ｖｉｖｏ診断及びイメージングの目的で使用され得る。
当業者にとって明らかであるように、別の修飾は、例えば、上記の金属又は金属カチオンの１つをキレート化するキレート官能基（chelating group）の導入を含んでいてもよい。例えば好適なキレート官能基としては、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）又はエチレンジアミン五酢酸（ＥＤＴＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
さらに別の修飾は、ビオチン−（ストレプト）アビジン結合対等の特異的結合対の一部である官能基の導入を含んでいてもよい。このような官能基は、本発明のナノボディを別のタンパク質、ポリペプチド、又は結合対の残り半分と結合する化合物に連結させるのに（即ち、結合対の形成を介して）使用され得る。例えば、本発明のナノボディは、ビオチンと結合し、別のタンパク質、ポリペプチド、アビジン又はストレプトアビジンと結合する化合物又は担体に連結し得る。例えば、このような結合ナノボディは、例えば、検出可能なシグナル生成剤がアビジン又はストレプトアビジンに結合する診断系のレポーターとして使用され得る。このような結合対は、例えば、本発明のナノボディを、医薬目的に好適な担体を含む担体に結合させるのにも使用することができる。非限定的な一例は、Cao and Suresh, Journal of Drug Targetting, 8, 4, 257 （2000）によって記載のリポソーム製剤である。このような結合対はまた、本発明のナノボディに治療に有効な作用物質を連結させるのに使用することができる。
用途によっては、特に、（例えば、癌の治療において）本発明のナノボディが指向性を有する標的を発現する細胞を死滅させること、又はこのような細胞の成長及び／又は増殖を低減するか若しくは遅延させることを意図する用途では、本発明のナノボディは、毒素又は毒素残基又は毒素部分にも連結し得る。本発明のナノボディに連結して、例えば細胞毒性化合物をもたらし得る毒素部分、化合物又は残基の例は当業者にとって明らかであり、例えば、上記の従来技術に及び／又は本明細書中のさらなる説明に見ることができる。一例はいわゆるＡＤＥＰＴ（商標）技術である（国際公開第０３／０５５５２７号パンフレット）。
他の可能な化学修飾及び酵素修飾は当業者にとって明らかであろう。このような修飾を、（例えば、機能−活性関係を研究するために）調査目的で導入してもよい。例えば、Lundblad and Bradshaw, Biotechnol. Appl. Biochem., 26, 143-151 （1997）を参照する。
好ましくは、この誘導体は、（（実際又は見掛けの）ＫＤ値、（実際又は見掛けの）ＫＡ値、ｋｏｎ速度及び／又はｋｏｆｆ速度として、又は代替的に本明細書中にさらに記載のＩＣ５０値として好適に測定及び／又は表される）本明細書中に規定される親和性を有して、ＩＬ−６受容体と結合するような誘導体、並びに、少なくとも１つのこのようなアミノ酸配列を含む、化合物及び構築物、特にタンパク質及びポリペプチドである。
特に、本発明のアミノ酸配列又はポリペプチドは、
１０−５モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及び好ましくは１０−７モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及びより好ましくは１０−８モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌの解離定数（ＫＤ）で（即ち１０５Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モル以上、及び好ましくは１０７Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モル以上、及びより好ましくは１０８Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モルの結合定数（ＫＡ）で）ＩＬ−６Ｒと結合するようなもの、及び／又は
１０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０３Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは１０４Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、例えば１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１のｋｏｎ速度でＩＬ−６Ｒと結合することができるようなもの、及び／又は
１ｓ−１（ｔ１／２＝０．６９ｓ）〜１０−６ｓ−１（ｔ１／２が数日である略不可逆的な複合体の場合）、好ましくは１０−２ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−３ｓ−１〜１０−６ｓ−１、例えば１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１のｋｏｆｆ速度でＩＬ−６Ｒと結合するようなものであるのが好ましい。
好ましくは、本発明の一価のアミノ酸配列（又は１つだけの本発明のアミノ酸配列を含有するポリペプチド）は、５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、例えば５００ｐＭ未満の親和性でＩＬ−６Ｒと結合するようなものが好ましい。
本発明のアミノ酸配列又はポリペプチドとＩＬ−６Ｒとの結合に関する幾つかの好ましいＩＣ５０値は、本明細書のさらなる記載及び実施例から明らかになる。
ＩＬ−６受容体に対する本発明のナノボディの誘導体の親和性は、例えば、本明細書中に記載のアッセイを用いてそれ自体が既知の方法で求めることができる。
上述のように、本発明はまた、少なくとも１つの本発明のナノボディから本質的に成るか又はこれを含む、タンパク質又はポリペプチドに関する。「から本質的に成る」とは、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列のいずれかが、本発明のナノボディのアミノ酸配列と厳密に同じであるか、又は、１個〜２０個のアミノ酸残基、例えば、１個〜１０個のアミノ酸残基、及び好ましくは１個〜６個のアミノ酸残基（例えば、１個、２個、３個、４個、５個又は６個のアミノ酸残基）である限定数のアミノ酸残基をナノボディのアミノ酸配列のアミノ末端、カルボキシ末端、又はアミノ末端及びカルボキシ末端の両方に付加させた本発明のナノボディのアミノ酸配列に対応することを意味する。
上記のアミノ酸残基は、ナノボディの（生物学的）特性を変更するか、改質するか、さもなければこれに影響を与えることもあり又は与えない場合もあり、ナノボディにさらなる官能基を付加することもあり又は付加しない場合もある。例えば、このようなアミノ酸残基は、
ａ）例えば、異種宿主細胞又は異種宿主生物において発現した結果得られるＮ末端Ｍｅｔ残基を含み得る。
ｂ）合成の際に宿主細胞からのナノボディの分泌を導く、シグナル配列又はリーダー配列を形成してもよい。好適な分泌リーダーペプチドは当業者にとって明らかであり、本明細書中にさらに記載される通りであり得る。通常、発明は広義では、限定されるものではないが、このようなリーダー配列は、ナノボディのＮ末端に連結されるであろう。
ｃ）ナノボディが、特定の器官、組織、細胞、又は細胞の一部若しくはコンパートメントに指向性を有し、及び／又はそれらに侵入するか若しくは入り込み、及び／又はナノボディが、細胞膜、上皮細胞の層等の細胞層、固形腫瘍を含む腫瘍、又は血液脳関門のような生物学的障壁に侵入するか若しくはそれらを横断する、配列又はシグナルを形成し得る。このようなアミノ酸配列の例は当業者にとって明らかであろう。幾つかの非限定的な例は、国際公開第０３／０２６７００号パンフレット、並びにTemsamani et al., Expert Opin. Biol. Ther., 1, 773 （2001）、Temsamani and Vidal, Drug Discov. Today, 9, 1012 （004）及びRousselle, J. Pharmacol. Exp. Ther., 296, 124-131 （2001）に記載されている小さいペプチドベクター（「Ｐｅｐ−トランスベクター」）、並びにZhao et al., Apoptosis, 8, 631-637 （2003）によって記載されている膜輸送体配列である。抗体断片の細胞内標的のためのＣ末端アミノ酸配列及びＮ末端アミノ酸配列は、例えば、Cardinale et al., Methods, 34, 171 （2004）によって記載されている。細胞内標的の他の好適な技法は、以下に記述されるような、本発明のナノボディを含むいわゆる「細胞内抗体」の発現及び／又は使用を伴う。
ｄ）「タグ」、例えば、例えば上記の配列又は残基を対象とする親和性技法を用いてナノボディの精製を可能にするか又は容易にする、アミノ酸配列又は残基を形成し得る。その後、（例えば、化学的又は酵素学的な開裂によって）上記の配列又は残基を除去して、ナノボディ配列をもたらし得る（この目的のために、タグは任意で、開裂可能なリンカー配列を介してナノボディ配列に連結されてもよく、又は開裂可能なモチーフを含有していてもよい）。このような残基の好ましいが非限定的な幾つかの例は、複数のヒスチジン残基、グルタチオン残基、及びＡＡＡＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＧＡＡ（配列番号３１）等のｍｙｃタグであり、
ｅ）官能基の結合のために官能化し及び／又は部位として機能することができる１つ又は複数のアミノ酸残基であり得る。好適なアミノ酸残基及び官能基は当業者にとって明らかであり、本発明のナノボディの誘導体について本明細書中に記述されたアミノ酸残基及び官能基が挙げられるが、これらに限定されない。
別の実施の形態によれば、本発明のポリペプチドは、そのアミノ末端、そのカルボキシ末端、又はそのアミノ末端及びカルボキシ末端の両方で、少なくとも１つのさらなるアミノ酸配列に融合する本発明のナノボディを含み、この結果、本発明の当該ナノボディと１つ又は複数のさらなるアミノ酸配列とを含む融合タンパク質がもたらされる。このような融合は本明細書中で「ナノボディ融合」とも呼ばれる。
１つ又は複数のさらなるアミノ酸配列は、任意の好適及び／又は所望のアミノ酸配列であり得る。さらなるアミノ酸配列は、ナノボディの（生物学的）特性を変更するか、改質するか、さもなければこれに影響を与えることもあり又は与えない場合もあり、ナノボディにさらなる官能基を付加することもあり又は付加しない場合もある。好ましくは、さらなるアミノ酸配列は、本発明のナノボディ又はポリペプチドに、１つ又は複数の所望の特性又は官能性を付与する。
このようなアミノ酸配列の例は当業者にとって明らかであり、一般に、従来の抗体及びその断片に基づきペプチド融合に用いられる全てのアミノ酸配列を含み得る（ＳｃＦｖ抗体及び単一ドメイン抗体が挙げられるが、これらに限定されない）。例えば、Holliger and Hudson, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136 （2005）による総説を参照する。
例えば、このようなアミノ酸配列は、本発明のナノボディ自体に比べて、半減期、溶解性又は吸着を増大させる、免疫原性又は毒性を低減する、望ましくない副作用を排除又は減衰する、及び／又は他の有益な特性を本発明のポリペプチドに付与するか、及び／又は本発明のポリペプチドの望ましくない特性を減らすアミノ酸配列であり得る。このようなアミノ酸配列の幾つかの非限定的な例は、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン（例えば国際公開第００／２７４３５号パンフレットを参照）又はハプテン分子（例えば、循環抗体として認識されるハプテン（例えば国際公開第９８／２２１４１号パンフレットを参照））である。
さらなるアミノ酸配列はまた、任意の所望のタンパク質、ポリペプチド、抗原、抗原決定基又はエピトープ（本発明のナノボディが対象とする同様のタンパク質、ポリペプチド、抗原、抗原決定基若しくはエピトープ、又は異なるタンパク質、ポリペプチド、抗原、抗原決定基若しくはエピトープが挙げられるが、これらに限定されない）のいずれかを対象とし得る第２の結合部位をもたらし得る。例えば、さらなるアミノ酸配列は、血清タンパク質（例えば、ＩｇＧ等のヒト血清アルブミン又は別の血清タンパク質等）に指向性を有する第２の結合部位をもたらして、血清中の半減期の増大をもたらし得る。例えば、欧州特許第０３６８６８４号明細書、国際公開第９１／０１７４３号パンフレット、国際公開第０１／４５７４６号パンフレット、及び国際公開第０４／００３０１９号パンフレット（様々な血清タンパク質が言及されている）に言及されており、"Nanobodies against amyloid-beta and polypeptides comprising the same for the treatment of degenerative neural diseases such as Alzheimer's disease"と題されたAblynx N.V.による国際出願（様々な他のタンパク質が言及されている）、並びにHarmsen et al., Vaccine, 23 （41）; 4926-42, 2005に言及されている。
別の実施の形態によれば、１つ又は複数のさらなるアミノ酸配列は、従来の４本鎖抗体（及び、特にヒト抗体）及び／又は重鎖抗体の１つ又は複数の部分、断片、又はドメインを含み得る。例えば、本発明の通常好ましくないナノボディは、従来の（好ましくはヒト）ＶＨドメイン若しくはＶＬドメイン、又はＶＨドメイン若しくはＶＬドメインの天然型類似体若しくは合成類似体に、任意でリンカー配列（Ward et al.によって記載されているｄＡｂ抗体等の他の（単一）ドメイン抗体が挙げられるが、これらに限定されない）を介して再度、連結され得る。
本発明の具体的な一態様において、本発明のナノボディ又は化合物、構築物、又は少なくとも１つの本発明のナノボディを含む本発明のポリペプチドは、対応する本発明のアミノ酸配列に比べて増大した半減期を有し得る。このようなナノボディ、化合物及びポリペプチドの好ましいが非限定的な幾つかの例は、本明細書中のさらなる開示に基づき当業者にとって明らかであり、例えば、（例えば、ペグ化によって）半減期を増大させるように化学修飾されたナノボディ配列又は本発明のポリペプチド；血清タンパク質に結合する少なくとも１つのさらなる結合部位を含む本発明のアミノ酸配列（例えば、血清アルブミン。例えば、"Immunoglobulin domains with multiple bindings sites"と題されたAblynx N.V.による米国仮特許出願（２００６年１１月２７日出願）に言及されている）；又は、本発明のナノボディの半減期を増大させる少なくとも１つの部分（及び特に少なくとも１つのアミノ酸配列）に連結する少なくとも１つの本発明のナノボディを含む本発明のポリペプチドを含む。このような半減期を延長させる部分又はアミノ酸配列を含む本発明のポリペプチドの例は、本明細書中のさらなる開示に基づき当業者にとって明らかになり、例えば、１つ又は複数の本発明のナノボディが、１つ又は複数の血清タンパク質又はその断片（例えば、血清アルブミン又はその好適な断片）に、又は血清タンパク質と結合し得る１つ又は複数の結合単位に好適に連結する（例えば、血清アルブミン、ＩｇＧ等の血清免疫グロブリン、又はトランスフェリン等の血清タンパク質と結合し得る、ナノボディ又は（シングル）ドメイン抗体）、ポリペプチド；本発明のナノボディが、Ｆｃ部分（例えば、ヒトＦｃ）、又はその好適な部分若しくは断片に連結するポリペプチド；又は、１つ又は複数の本発明のナノボディが、血清タンパク質と結合し得る、１つ又は複数の低分子タンパク質又はペプチド（例えば、限定されるものではないが、国際公開第９１／０１７４３号パンフレット、国際公開第０１／４５７４６号パンフレット、国際公開第０２／０７６４８９号パンフレットに記載のタンパク質及びペプチド）に好適に連結するポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
一般に、好ましくは半減期が増大した本発明のナノボディ（又は、当該ナノボディを含む化合物、構築物又はポリペプチド）は、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、例えば、少なくとも５倍、例えば少なくとも１０倍又は２０倍を超え、対応する本発明のアミノ酸配列自体の半減期よりも長い半減期を有する。例えば、半減期が増大した本発明のナノボディ、化合物、構築物又はポリペプチドは、対応する本発明のアミノ酸配列自体に比べて１時間超、好ましくは２時間超、より好ましくは６時間超、例えば１２時間超、又はさらに２４時間超、４８時間超、７２時間超増大する半減期を有する。
好ましいが非限定的な本発明の態様において、このような本発明のナノボディ、化合物、構築物又はポリペプチドは、ヒトにおいて、少なくとも約１２時間、好ましくは少なくとも２４時間、より好ましくは少なくとも４８時間、さらに好ましくは少なくとも７２時間以上の血清半減期を示す。例えば、本発明の化合物又はポリペプチドは、少なくとも５日（例えば、約５日〜１０日）、好ましくは少なくとも９日（例えば、約９日〜１４日）、より好ましくは少なくとも約１０日（例えば、約１０日〜１５日）、又は少なくとも約１１日（例えば、約１１日〜１６日）、より好ましくは少なくとも約１２日（例えば、約１２日〜１８日以上）、又は１４日超（例えば、約１４日〜１９日）の半減期を有し得る。
本発明の別の一態様では、本発明のポリペプチドは、得られた本発明のポリペプチドが血液脳関門を横断するのを可能にする、（任意で１つ又は複数の好適なリンカー配列を介して）１つ又は複数の（例えば、２つ、好ましくは１つの）アミノ酸配列に連結する、１つ又は複数の（例えば、２つ、好ましくは１つの）本発明のナノボディを含む。特に、得られた本発明のポリペプチドが血液脳関門を横断するのを可能にする上記１つ又は複数のアミノ酸配列は、１つ又は複数の（例えば、２つ、好ましくは１つの）ナノボディ、例えば、国際公開第０２／０５７４４５号パンフレットに記載のナノボディ（好ましい例は、ＦＣ４４（国際公開第０６／０４０１５３号パンフレットの配列番号１８９）及びＦＣ５（国際公開第０６／０４０１５４号パンフレットの配列番号１９０）である）であり得る。
特に、血清アルブミン又はその断片に対する免疫グロブリンの連結断片（例えば、ＶＨドメイン）を使用して半減期を増大させることができることは、当該技術分野において記載されている。例えば、国際公開第００／２７４３５号パンフレット及び国際公開第０１／０７７１３７号パンフレットを参照する）。本発明によれば、本発明のナノボディは好ましくは、血清アルブミン（又はその好適な断片）に直接連結するか、又は好適なリンカーを介して、特に好適なペプチドを介して連結することにより、本発明のポリペプチドを遺伝子融合（タンパク質）として発現することができる。具体的な一態様によれば、本発明のナノボディは、少なくとも血清アルブミンのドメインＩＩＩ又はその一部を含む、血清アルブミンの断片に連結し得る。例えば、"Albumin derived amino acid sequence, use thereof for increasing the half-life of therapeutic proteins and of other therapeutic proteins and entities, and constructs comprising the same"と題されたAblynx N.V.の米国仮特許出願第６０／７８８，２５６号明細書（２００６年３月３１日出願）を参照する。
ヒト血清アルブミンに対する抗ＩＬ−６Ｒナノボディの融合の好ましいが非限定的な幾つかの例は、配列番号６０３〜配列番号６０８で示される。
代替的に、さらなるアミノ酸配列は、血清中の半減期を増大させるように、血清タンパク質（例えば、ＩｇＧ等のヒト血清アルブミン又は別の血清タンパク質等）に指向性を有する、第２の結合部位又は結合単位を付与する。このようなアミノ酸配列は例えば、下記のナノボディ、並びに、国際公開第９１／０１７４３号パンフレット、国際公開第０１／４５７４６号パンフレット及び国際公開第０２／０７６４８９号パンフレットに記載の小さいペプチド及び結合タンパク質、及び国際公開第０３／００２６０９号パンフレット及び国際公開第０４／００３０１９号パンフレットに記載のｄＡｂを含む。Harmsen et al., Vaccine, 23 （41）; 4926-42、並びに欧州特許第０，３６８，６８４号明細書、並びに、本明細書中に記載のAblynx N.Vによる以下の米国仮特許出願第６０／８４３，３４９号明細書、同第６０／８５０，７７４号明細書、同第６０／８５０，７７５号明細書にも言及されている。
このようなアミノ酸配列は特に、血清アルブミン（及びより詳細にはヒト血清アルブミン）及び／又はＩｇＧ（及びより詳細にはヒトＩｇＧ）に指向性を有し得る。例えば、このようなアミノ酸配列は、（ヒト）血清アルブミンに指向性を有するアミノ酸配列、及びＦｃＲｎへの血清アルブミンの結合に関与しない（ヒト）血清アルブミン上のアミノ酸残基に結合し得るアミノ酸配列（例えば、国際公開第０６／０１２２７８７号パンフレットを参照）、及び／又は血清アルブミンのドメインＩＩＩの一部を形成しない血清アルブミン上のアミノ酸残基に結合し得るアミノ酸配列（例えば、同様に国際公開第０６／０１２２７８７号パンフレットを参照）；増大した半減期を有するか又は半減期を増大させ得るアミノ酸配列（例えば、"Serum albumin binding proteins with long half-lives"と題されたAblynx N.V.による米国仮特許出願第６０／８４３，３４９号明細書を参照（２００６年９月８日出願）；哺乳類の少なくとも１種及び特に霊長類の少なくとも１種（例えば、限定されるものではないが、マカク属のサル（例えば、及び特に、カニクイザル（Macaca fascicularis）及び／又はアカゲサル（Macaca mulatta））、並びにヒヒ（Papio ursinus））に由来の血清アルブミンと交差反応性であるヒト血清アルブミンに対するアミノ酸配列（同様に米国仮特許出願第６０／８４３，３４９号明細書を参照する）；ｐＨ非依存的に血清アルブミンに結合し得るアミノ酸配列（例えば、"Amino acid sequences that bind to serum proteins in a manner that is essentially independent of the pH, compounds comprising the same, and uses thereof"と題されたAblynx N.V.による米国仮特許出願第６０／８５０，７７４号明細書（２００６年１０月１１日出願）を参照）、及び／又は条件付き結合剤であるアミノ酸配列（例えば、"Amino acid sequences that bind to a desired molecule in a conditional manner"と題されたAblynx N.V.による米国仮特許出願第６０／８５０，７７５号明細書（２００６年１０月１１日出願）を参照）であり得る。
また、少なくとも１つのナノボディは、任意でリンカー配列を介して、１つ又は複数の（好ましくはヒト）ＣＨ１、ＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインと連結してもよい。例えば、好適なＣＨ１ドメインと連結するナノボディは、例えば従来のＦａｂ断片又はＦ（ａｂ'）２断片に類似する抗体断片／構築物を生成するように（好適な軽鎖と共に）使用することができるが、従来のＶＨドメインの１つ、又は（Ｆ（ａｂ'）２断片の場合）１つ若しくは両方を本発明のナノボディで置換した。また、２つのナノボディは、（任意でリンカーを介して）ＣＨ３ドメインと連結してｉｎ ｖｉｖｏで半減期が増大した構築物をもたらすことができる。
本発明のポリペプチドの具体的な一実施の形態によれば、１つ又は複数の本発明のナノボディは、１つ又は複数のエフェクタ機能を本発明のポリペプチドに付与し及び／又は１つ又は複数のＦｃ受容体に結合する能力を付与し得る、１つ又は複数の抗体対、断片又はドメインと連結する。例えば、この目的で、及びこれらに限定されるものではないが、１つ又は複数のさらなるアミノ酸配列は、重鎖抗体（本明細書中に記載）及びより好ましくは従来のヒト４本鎖抗体等に由来する抗体の１つ又は複数のＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインを含んでいてもよく、及び／又は例えばＩｇＧ、ＩｇＥ又は別のヒトＩｇに由来するＦｃ領域（の一部）を形成してもよい。例えば、国際公開第９４／０４６７８号パンフレットは、ラクダＶＨＨドメイン又はそのヒト化誘導体（即ち、ナノボディ）を含む重鎖抗体を記載しており、ここでは、ラクダＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインが、ヒトＣＨ２及びＣＨ３ドメインで置換されている。それによりナノボディと（ＣＨ１ドメインは含まないが）ヒトＣＨ２及びＣＨ３ドメインとをそれぞれ含む２つの重鎖から成る免疫グロブリンをもたらされるが、その免疫グロブリンは、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインによって付与されるエフェクタ機能を有し、如何なる軽鎖も存在することなく機能する。本発明のナノボディと好適に連結してエフェクタ機能を付与し得る他のアミノ酸配列は当業者にとって明らかであり、所望のエフェクタ機能（複数可）に基づき選択され得る。例えば、国際公開第０４／０５８８２０号パンフレット、国際公開第９９／４２０７７号パンフレット、及び国際公開第０５／０１７１４８号パンフレット、並びに上記のHolliger and Hudsonの概説を参照する。本発明のナノボディとＦｃ部分とのカップリングによっても、対応する本発明のナノボディに比べて半減期の増大が生じる。用途によっては、如何なる生物学的に重要なエフェクタ機能も含まない半減期が増大したＦｃ部分及び／又は定常ドメイン（即ち、ＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメイン）も好適であるか、又は一層好ましい。１つ又は複数のナノボディと、ｉｎ ｖｉｖｏで半減期が増大した１つ又は複数の定常ドメインとを含む他の好適な構築物は当業者にとって明らかであり、例えば、任意でリンカー配列を介してＣＨ３ドメインに連結する２つのナノボディを含み得る。一般に、半減期が増大した任意の融合タンパク質又は誘導体は好ましくは、５０ｋＤを超える分子量、即ち腎臓吸収のカットオフ値を有する。
また、さらなるアミノ酸配列は、（例えば、本発明のポリペプチドを発現するのに用いられる宿主細胞に応じて、本発明のポリペプチドのプレフォーム、プロフォーム又はプレプロフォームをもたらすように）合成の際に宿主細胞から本発明のナノボディ又はポリペプチドの分泌を導くシグナル配列又はリーダー配列を形成する。
また、さらなるアミノ酸配列は、本発明のナノボディ又はポリペプチドが、特定の器官、組織、細胞、又は細胞の一部若しくはコンパートメントに誘導され、及び／又はそれらに侵入するか若しくは入り込み、及び／又は本発明のナノボディ又はポリペプチドが、細胞膜、上皮細胞の層等の細胞層、固形腫瘍等の腫瘍、又は血液脳関門のような生物学的障壁に侵入するか若しくはそれらを横断する配列又はシグナルを形成し得る。このようなアミノ酸配列の好適な例は当業者にとって明らかであり、例えば、例えば、国際公開第９４／０２６１０号パンフレット、国際公開第９５／２２６１８号パンフレット、米国特許第７００４９４０号明細書、国際公開第０３／０１４９６０号パンフレット、国際公開第９９／０７４１４号パンフレット；国際公開第０５／０１６９０号パンフレット；欧州特許第１，５１２，６９６号明細書；及び、Cattaneo, A. & Biocca, S. （1997） Intracellular Antibodies：Development and Applications. Landes and Springer-Verlag；及びKontermann, Methods 34, （2004）, 163-170、並びに本明細書中に記載のさらなる参照文献に記載されるような、上記の「Peptrans」のベクター、即ち、Cardinale et al.によって記載される配列、並びにいわゆる「細胞内抗体」である本発明のナノボディ及びポリペプチドを発現又は製造するのに使用することができる、自体が既知のアミノ酸配列及び抗体断片が挙げられるが、これらに限定されない。
用途によっては、特に（例えば癌の治療において）本発明のナノボディが指向性を有する標的を発現する細胞を死滅させること、又はこのような細胞の成長及び／又は増殖を抑えるか若しくは遅延させることを意図する用途では、本発明のナノボディはまた、（細胞）毒性タンパク質又はポリペプチドと連結し得る。本発明のナノボディと連結して、例えば、本発明の細胞毒性をもたらし得るこのような毒性タンパク質及びポリペプチドの例は当業者にとって明らかであり、例えば、上記従来技術及び／又は本明細書中のさらなる開示に見出すことができる。一例は、国際公開第０３／０５５５２７号パンフレットに記載のいわゆるＡＤＥＰＴ（商標）技術である。
好ましいが非限定的な一実施の形態によれば、上記１つ又は複数のさらなるアミノ酸配列は、少なくとも１つのさらなるナノボディを含み、これにより、少なくとも２つ、例えば３つ、４つ、５つ以上のナノボディを含む本発明のポリペプチドをもたらし、当該ナノボディは任意で、１つ又は複数のリンカー配列（本明細書中に規定）を介して連結される。少なくとも１つが本発明のナノボディである２つ以上のナノボディを含む本発明のポリペプチドは、本明細書中で本発明の「多価」ポリペプチドとも呼ばれ、このようなポリペプチド中に存在するナノボディは、本明細書中で「多価フォーマット」であるとも称される。例えば、本発明の「二価」ポリペプチドは、任意でリンカー配列を介して連結される２つのナノボディを含み、本発明の「三価」ポリペプチドは、任意で２つのリンカー配列を介して連結される３つのナノボディを含む。例えば、ポリペプチド中に存在するナノボディの少なくとも１つ、及び最高でポリペプチド中に存在するナノボディの全てが、本発明のナノボディである。
本発明の多価ポリペプチドでは、２つ以上のナノボディは、同じであっても異なっていてもよく、同じ抗原又は抗原決定基（例えば、同じ部分（複数可）若しくはエピトープ（複数可）、又は異なる部分若しくはエピトープ）に指向性を有するものであってもよく、代替的に異なる抗原若しくは抗原決定基、又はそれらの任意の好適な組合せに指向性を有するものであってもよい。例えば、本発明の二価ポリペプチドは、（ａ）２つの同一のナノボディ、（ｂ）タンパク質若しくは抗原の第１の抗原決定基に指向性を有する第１のナノボディ、及び第１のナノボディと異なる上記タンパク質若しくは抗原の同一抗原決定基に指向性を有する第２のナノボディ、（ｃ）タンパク質若しくは抗原の第１の抗原決定基に指向性を有する第１のナノボディ、及び上記タンパク質若しくは抗原の別の抗原決定基に指向性を有する第２のナノボディ、又は（ｄ）第１のタンパク質若しくは抗原に指向性を有する第１のナノボディ、及び第２のタンパク質若しくは抗原（即ち、上記第１の抗原と異なる）に指向性を有する第２のナノボディを含み得る。同様に、本発明の三価ポリペプチドは例えば、これらに限定されるものではないが、（ａ）３つの同一のナノボディ、（ｂ）抗原の第１の抗原決定基に対する２つの同一のナノボディ、及び同一抗原の異なる抗原決定基に指向性を有する第３のナノボディ、（ｃ）抗原の第１の抗原決定基に対する２つの同一のナノボディ、及び上記第１の抗原と異なる第２の抗原に指向性を有する第３のナノボディ、（ｄ）第１の抗原の第１の抗原決定基に指向性を有する第１のナノボディ、上記第１の抗原の第２の抗原決定基に指向性を有する第２のナノボディ、及び上記第１の抗原と異なる第２の抗原に指向性を有する第３のナノボディ、又は（ｅ）第１の抗原に指向性を有する第１のナノボディ、上記第１の抗原と異なる第２の抗原に指向性を有する第２のナノボディ、及び上記第１の抗原及び上記第２の抗原と異なる第３の抗原に指向性を有する第３のナノボディを含み得る。
少なくとも２つのナノボディを含有する本発明のポリペプチドは、少なくとも１つのナノボディは第１の抗原に指向性を有する（即ち、ＩＬ−６受容体に対する）ものであり、少なくとも１つのナノボディは第２の（即ち、ＩＬ−６受容体と異なる）抗原に指向性を有するものであり、本発明の「多重特異性」ポリペプチドとも呼ばれており、このようなポリペプチド中に存在するナノボディは、本明細書中で「多重特異性フォーマット」であるとも称される。このため例えば、本発明の「二重特異性」ポリペプチドは、第１の抗原（即ちＩＬ−６受容体）に指向性を有する少なくとも１つのナノボディ及び第２の抗原（即ち、ＩＬ−６受容体と異なる）に指向性を有する少なくとも１つのさらなるナノボディを含むポリペプチドであり、本発明の「三重特異性」ポリペプチドは、第１の抗原（即ち、ＩＬ−６受容体）に指向性を有する少なくとも１つのナノボディ、第２の抗原（即ち、ＩＬ−６受容体と異なる）に指向性を有する少なくとも１つのさらなるナノボディ、及び第３の抗原（即ち、ＩＬ−６受容体及び第２の抗原の両方と異なる）に指向性を有する少なくとも１つのさらなるナノボディを含むポリペプチド等である。
したがって、その最も単純な形態において、本発明の二重特異性ポリペプチドは、ＩＬ−６受容体に指向性を有する第１のナノボディと、第２の抗原に指向性を有する第２のナノボディとを含み、当該第１のナノボディ及び当該第２のナノボディが任意でリンカー配列（本明細書中に規定）を介して連結され得る本発明の二価ポリペプチド（本明細書中に規定）であるのに対し、その最も単純な形態の本発明の三重特異性ポリペプチドは、ＩＬ−６受容体に指向性を有する第１のナノボディと、第２の抗原に指向性を有する第２のナノボディと、第３の抗原に指向性を有する第３のナノボディとを含み、当該第１のナノボディ、第２のナノボディ及び第３のナノボディが、任意で１つ又は複数、特に１つ及び複数、特に２つのリンカー配列を介して連結され得る本発明の三価ポリペプチド（本明細書中に規定）である。
本発明の二価の二重特異性ポリペプチドの好ましいが非限定的な幾つかの例は、配列番号４５０〜配列番号４７１及び配列番号５５９〜配列番号６０２で示される。本発明の三価の二重特異性ポリペプチドの好ましいが非限定的な幾つかの例は、配列番号４７８〜配列番号５５８で示される。
しかしながら、上述から明らかであるように、本発明は、本発明の多重特異性ポリペプチドが、ＩＬ−６受容体に対する少なくとも１つのナノボディと、ＩＬ−６受容体と異なる１つ又は複数の抗原に指向性を有する幾つかのナノボディとを含み得るという意味において、これらに限定されない。
さらに、本発明のポリペプチド中における種々のナノボディの特定の順序又は配置が、最終的に得られる本発明のポリペプチドの性質（ＩＬ−６に関する、又は１つ若しくは複数の他の抗原に対する、親和性、特異性、又は結合活性が挙げられるが、これらに限定されない）に何らかの影響を及ぼし得る点は、本発明の範囲内に包含されるが、通常、上記順序又は配置は重要なものでなく、場合によっては本明細書中の開示に基づく限定された日常実験を幾つか実施した後に、当業者であれば好適に選択することができるであろう。したがって、特定の本発明の多価又は多重特異性のポリペプチドについて述べられる場合、明示的に指示がない限り、これは関連するナノボディの任意の順序又は配置を包含するものであることに留意されたい。
最終的に、本発明のポリペプチドが、２つ以上のナノボディと、１つ又は複数のさらなるアミノ酸配列（本明細書中に記述）とを含有することも、本発明の範囲内である。
１つ又は複数のＶＨＨドメインを含有する多価の多重特異性のポリペプチド、及びそれらの調製に関して、Conrath et al., J. Biol. Chem., Vol. 276, 10. 7346-7350, 2001; Muyldermans, Reviews in Molecular Biotechnology 74 （2001）, 277-302、並びに、例えば国際公開第９６／３４１０３号パンフレット及び国際公開第９９／２３２２１号パンフレットにも述べられている。本発明の幾つかの特定の多重特異性及び／又は多価のポリペプチド（polypeptidee）の幾つかの他の例は、本明細書中で参照されるAblynx N.V.による出願に記述されている。
本発明の多重特異性ポリペプチドの好ましいが非限定的な一例は、少なくとも１つの本発明のナノボディと、半減期の増大をもたらす少なくとも１つのナノボディとを含む。このようなナノボディの好ましいが非限定的な幾つかの例としては、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン、チロキシン結合タンパク質、（ヒト）トランスフェリン、フィブリノゲン、ＩｇＧ、ＩｇＥ若しくはＩｇＭ等の免疫グロブリン、又は国際公開第０４／００３０１９号パンフレットに列挙された別の血清タンパク質の１つに指向性を有するナノボディが挙げられる。
例えば、マウスにおける実験のためには、マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）に対するナノボディを用いることができ、医薬用途のためには、ヒト血清アルブミンに対するナノボディを用いることができる。
本発明の別の実施の形態は、少なくとも１つの（ヒト）血清タンパク質が、（ヒト）血清アルブミン、（ヒト）血清免疫グロブリン、（ヒト）チロキシン結合タンパク質、（ヒト）トランスフェリン、（ヒト）フィブリノゲン等のいずれかである、上記のポリペプチド構築物である。
具体的であるが非限定的な本発明の態様によれば、本発明のポリペプチドは、１つ又は複数の本発明のナノボディ以外に、少なくとも１つのヒト血清アルブミンに対するナノボディを含有する。ヒト血清アルブミンに対するこれらのナノボディは、上記で引用したAblynx N. V.による出願（例えば、国際公開第０４／０６２５５１号パンフレットを参照）に包括的に記載されているものであってもよいが、特に好ましいが非限定的な実施の形態によれば、ヒト血清アルブミンに対する当該ナノボディは、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから成り、
ｉ）ＣＤＲ１は、
ＳＦＧＭＳ ［配列番号１５］
ＬＮＬＭＧ ［配列番号１６］
ＩＮＬＬＧ ［配列番号１７］
ＮＹＷＭＹ ［配列番号１８］
から成る群から選択されるアミノ酸配列であり、及び／又は上記アミノ酸配列の１つとの、２つ又は１つだけの「アミノ酸差異」（本明細書中に規定）を有するアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列であり、
（１）任意のアミノ酸の置換が好ましくは、保存アミノ酸の置換（本明細書中に規定）であり、及び／又は
（２）当該アミノ酸配列が、上記アミノ酸配列と比べて、好ましくはアミノ酸の置換のみを含有し、アミノ酸の欠失又は挿入を含まず、且つ
ｉｉ）ＣＤＲ２は、
ＳＩＳＧＳＧＳＤＴＬＹＡＤＳＶＫＧ ［配列番号１９］
ＴＩＴＶＧＤＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ ［配列番号２０］
ＴＩＴＶＧＤＳＴＳＹＡＤＳＶＫＧ ［配列番号２１］
ＳＩＮＧＲＧＤＤＴＲＹＡＤＳＶＫＧ ［配列番号２２］
ＡＩＳＡＤＳＳＴＫＮＹＡＤＳＶＫＧ ［配列番号２３］
ＡＩＳＡＤＳＳＤＫＲＹＡＤＳＶＫＧ ［配列番号２４］
ＲＩＳＴＧＧＧＹＳＹＹＡＤＳＶＫＧ ［配列番号２５］
から成る群から選択されるアミノ酸配列であり、又は、上記アミノ酸配列の１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書中に規定）を有するアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列であり、
（１）任意のアミノ酸の置換が好ましくは、保存アミノ酸の置換（本明細書中に規定）であり、及び／又は
（２）当該アミノ酸配列が、上記アミノ酸配列と比べて、好ましくはアミノ酸の置換のみを含有し、アミノ酸の欠失又は挿入を含まず、及び／又は上記アミノ酸配列の１つとの、３つ、２つ又は１つだけの「アミノ酸差異」（本明細書中に規定）を有するアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列であり、
（１）任意のアミノ酸の置換が好ましくは、保存アミノ酸の置換（本明細書中に規定）であり、及び／又は
（２）当該アミノ酸配列が、上記アミノ酸配列と比べて、好ましくはアミノ酸の置換のみを含有し、アミノ酸の欠失又は挿入を含まず、且つ
ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、
ＤＲＥＡＱＶＤＴＬＤＦＤＹ ［配列番号２６］
から成る群から選択されるアミノ酸配列であり、又は、上記アミノ酸配列の１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書中に規定）を有するアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列であり、
（１）任意のアミノ酸の置換が好ましくは、保存アミノ酸の置換（本明細書中に規定）であり、及び／又は
（２）当該アミノ酸配列が、上記アミノ酸配列と比べて、好ましくはアミノ酸の置換のみを含有し、アミノ酸の欠失又は挿入を含まず、及び／又は上記アミノ酸配列の１つとの、３つ、２つ又は１つだけの「アミノ酸差異」（本明細書中に規定）を有するアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列であり、
（１）任意のアミノ酸の置換が好ましくは、保存アミノ酸の置換（本明細書中に規定）であり、及び／又は
（２）当該アミノ酸配列が、上記アミノ酸配列と比べて、好ましくはアミノ酸の置換のみを含有し、アミノ酸の欠失又は挿入を含まず、且つ、
ＧＧＳＬＳＲ ［配列番号２７］
ＲＲＴＷＨＳＥＬ ［配列番号２８］
ＧＲＳＶＳＲＳ ［配列番号２９］
ＧＲＧＳＰ ［配列番号３０］
から成る群から選択されるアミノ酸配列であり、及び／又は上記アミノ酸配列の１つとの、３つ、２つ又は１つだけの「アミノ酸差異」（本明細書中に規定）を有するアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列であり、
（１）任意のアミノ酸の置換が好ましくは、保存アミノ酸の置換（本明細書中に規定）であり、及び／又は
（２）当該アミノ酸配列が、上記アミノ酸配列と比べて、好ましくはアミノ酸の置換のみを含有し、アミノ酸の欠失又は挿入を含まない。
別の態様において、本発明は、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから成り、以下のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３それぞれの組合せの１つを有するナノボディから成る群から選択される、ヒト血清アルブミンに対するナノボディに関する：
ＣＤＲ１：ＳＦＧＭＳ；ＣＤＲ２：ＳＩＳＧＳＧＳＤＴＬＹＡＤＳＶＫＧ；ＣＤＲ３：ＧＧＳＬＳＲ；
ＣＤＲ１：ＬＮＬＭＧ；ＣＤＲ２：ＴＩＴＶＧＤＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ；ＣＤＲ３：ＲＲＴＷＨＳＥＬ；
ＣＤＲ１：ＩＮＬＬＧ；ＣＤＲ２：ＴＩＴＶＧＤＳＴＳＹＡＤＳＶＫＧ；ＣＤＲ３：ＲＲＴＷＨＳＥＬ；
ＣＤＲ１：ＳＦＧＭＳ；ＣＤＲ２：ＳＩＮＧＲＧＤＤＴＲＹＡＤＳＶＫＧ；ＣＤＲ３：ＧＲＳＶＳＲＳ；
ＣＤＲ１：ＳＦＧＭＳ；ＣＤＲ２：ＡＩＳＡＤＳＳＤＫＲＹＡＤＳＶＫＧ；ＣＤＲ３：ＧＲＧＳＰ；
ＣＤＲ１：ＳＦＧＭＳ；ＣＤＲ２：ＡＩＳＡＤＳＳＤＫＲＹＡＤＳＶＫＧ；ＣＤＲ３：ＧＲＧＳＰ；
ＣＤＲ１：ＮＹＷＭＹ；ＣＤＲ２：ＲＩＳＴＧＧＧＹＳＹＹＡＤＳＶＫＧ；ＣＤＲ３：ＤＲＥＡＱＶＤＴＬＤＦＤＹ。
上記ＣＤＲの組合せを含む本発明のナノボディにおいて、それぞれのＣＤＲは、上記ＣＤＲと、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有する、アミノ酸配列から成る群から選択されるＣＤＲにより置換可能であり、
（１）任意のアミノ酸の置換が好ましくは、保存アミノ酸の置換（本明細書中に規定）であり、及び／又は
（２）当該アミノ酸配列が、上記アミノ酸配列と比べて、好ましくはアミノ酸の置換のみを含有し、アミノ酸の欠失又は挿入を含まず、及び／又は上記アミノ酸配列の１つの上記ＣＤＲ（複数可）との、３つ、２つ又は１つだけの（先行する段落に示されている）「アミノ酸差異」（本明細書中に規定）を有するアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列であり、
（１）任意のアミノ酸の置換が好ましくは、保存アミノ酸の置換（本明細書中に規定）であり、及び／又は
（２）当該アミノ酸配列が、上記アミノ酸配列と比べて、好ましくはアミノ酸の置換のみを含有し、アミノ酸の欠失又は挿入を含まない。
しかしながら、上記ＣＤＲの組合せを含む本発明のナノボディのうち、上記に列挙した１つ以上のＣＤＲを含むナノボディが特に好ましく、上記に列挙した２つ以上のＣＤＲを含むナノボディが特により好ましく、上記に列挙した３つのＣＤＲを含むナノボディが特に最も好ましい。
これらのヒト血清アルブミンに対するナノボディにおいて、フレームワーク領域ＦＲ１〜ＦＲ４は好ましくは、本発明のナノボディについて上記で規定した通りである。
本発明のポリペプチドに使用することができるヒト血清アルブミンに指向性を有するナノボディの好ましいが非限定的な幾つかの例を以下の表Ａ−９に列挙する。ＡＬＢ−８は、ヒト化したＡＬＢ−１である。
表Ａ−９：アルブミン結合ナノボディの好ましいが非限定的な例
ＩＬ−６Ｒに対する少なくとも１つのナノボディと、半減期が増大した少なくとも１つのナノボディとを含む、本発明のポリペプチドの好ましいが非限定的な幾つかの例は、配列番号４７８〜配列番号６０２で示される。
一般に、半減期が増大した任意の本発明の誘導体及び／又はポリペプチド（例えば、全て本明細書中に記載した通りである、ペグ化された本発明のナノボディ又はポリペプチド、ＩＬ−６受容体及び（ヒト）血清アルブミンに指向性を有する多重特異性ナノボディ、又はＦｃ部分に融合したナノボディ）は、対応する本発明のナノボディの少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、例えば、少なくとも５倍、例えば、少なくとも１０倍又は２０倍を超える半減期を有する。
また、半減期が増大した任意の本発明の誘導体又はポリペプチドは好ましくは、１時間よりも長い、好ましくは２時間よりも長い、より好ましくは６時間よりも長い、例えば、１２時間よりも長い、例えば約１日、２日、１週間、２週間又は３週間、及び好ましくは２ヶ月に満たない半減期を有するが、後の方のものはあまり重要ではないと考えられる。
半減期は、一般に、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、例えば、リガンドの分解及び／又は自然発生メカニズムによるリガンドのクリアランス若しくは捕捉により、ポリペプチドの血清濃度が５０％に減少するのに要する時間として規定される。薬物動態解析及び半減期の決定は当業者によく知られている。詳細については、Kenneth, A et al, Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists及びPeters et al, Pharmacokinete analysis: A Practical Approach （1996）に記載されている。"Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2 nd Rev. ex edition （1982）も参照する。
本発明の一態様によれば、ポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてポリペプチドの半減期を増大させる１又は複数の分子と結合することができる。
本発明のポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて安定化され、それらの半減期は、分解耐性及び／又はクリアランス耐性若しくは捕捉耐性のある分子への結合により増大する。通常、このような分子は、それ自体がｉｎ ｖｉｖｏにおいて長い半減期を有する天然タンパク質である。
本発明の多重特異性ポリペプチドの別の好ましいが非限定的な例は、少なくとも１つの本発明のナノボディ、及び本発明のポリペプチドを特定の器官、組織、細胞、又は細胞の一部若しくはコンパートメントに誘導し、及び／又は本発明のポリペプチドを特定の器官、組織、細胞、又は細胞の一部若しくはコンパートメントに侵入させるか若しくは入り込ませ、及び／又はナノボディを細胞膜、上皮細胞層等の細胞層、固形腫瘍を含む腫瘍、又は血液脳関門のような生物学的障壁に侵入させるか若しくはそれらを横断する、少なくとも１つのナノボディを含む。このようなナノボディの例としては、所望の器官、組織又は細胞（例えば、腫瘍細胞に関連する細胞表面マーカー）に特有の細胞表面タンパク質、マーカー又はエピトープ、及び国際公開第０２／０５７４４５号パンフレットに記載の単一ドメインの脳に誘導して抗体断片を標的とするナノボディが挙げられ、このうち、ＦＣ４４（配列番号３５）及びＦＣ５（配列番号３６）が好ましい例である。
表Ａ−１０：ＦＣ４４及びＦＣ５の配列リスト
本発明のポリペプチドにおいて、１つ又は複数のナノボディ、及び１つ又は複数のポリペプチドは、（例えば、国際公開第９９／２３２２１号パンフレットに記載のように）互いに直接連結していてもよく、及び／又は１つ又は複数の好適なスペーサー若しくはリンカー、又はこれらの任意の組合せを介して互いに連結していてもよい。
多価及び多重特異性のポリペプチドに使用するのに好適なスペーサー又はリンカーは当業者にとって明らかであり、一般に、アミノ酸配列を連結させる当該技術分野で使用する任意のリンカー又はスペーサーであってよい。好ましくは、上記リンカー又はスペーサーは、医薬用途で意図されるタンパク質又はポリペプチドを構築する上での使用に好適である。
幾つかの特に好ましいスペーサーとしては、抗体断片又は抗体ドメインを連結させるのに当該技術分野で使用されるスペーサー及びリンカーが挙げられる。これらは、上記で引用した包括的な背景技術に記載したリンカーと共に、例えば、ダイアボディ又はＳｃＦｖ断片を構築するのに当該技術分野で使用するリンカーを含む（しかし、この点で、ダイアボディ及びＳｃＦｖ断片では、使用するリンカー配列が、関連するＶＨドメイン及びＶＬドメインが一体となって、完全な抗原結合部位を形成することができるような長さ、柔軟性の程度、及び他の性質を有している必要があるが、それぞれのナノボディは単独で完全な抗原結合部位を形成するため、本発明のポリペプチドに使用するリンカーの長さ又は柔軟性に関しては特に制限が存在しないことに留意されたい）。
例えば、リンカーは、好適なアミノ酸配列、具体的には１個〜５０個、好ましくは１個〜３０個、例えば１個〜１０個のアミノ酸残基のアミノ酸配列であってもよい。このようなアミノ酸配列の幾つかの好ましい例としては、（国際公開第９９／４２０７７号パンフレットに記載の（ｇｌｙ４ｓｅｒ）３又は（ｇｌｙ３ｓｅｒ２）３）等の例えば、（ｇｌｙｘｓｅｒｙ）ｚ型のｇｌｙ−ｓｅｒリンカー、天然型重鎖抗体のヒンジ領域等のヒンジ類似領域、又は（国際公開第９４／０４６７８号パンフレットに記載のもの等の）同様の配列が挙げられる。
幾つかの他の特に好ましいリンカーは、ポリアラニン（ＡＡＡ等）、及び表Ａ−１１に記載したリンカーであり、これらのうち、ＡＡＡ、ＧＳ−７及びＧＳ−９が特に好ましい。
表Ａ−１１：リンカーの配列リスト
他の好適なリンカーは一般に、有機化合物又はポリマー、特に医薬用途のタンパク質に使用するのに好適な有機化合物又はポリマーを含む。例えば、ポリ（エチレングリコール）部分が、抗体ドメインを連結させるのに使用されており、例えば、国際公開第０４／０８１０２６号パンフレットを参照されたい。
使用するリンカー（複数可）の長さ、柔軟性の程度及び／又は他の性質（重要ではないが、ＳｃＦｖ断片に使用されるリンカーにおいて一般的なもの）は、ＩＬ−６受容体又は１つ又は複数の他の抗原に対する親和性、特異性又は結合活性を含むがこれらに限定されない、最終的に得られる本発明のポリペプチドの性質に何らかの影響を及ぼし得る点は、本発明の範囲内に包含される。本明細書中での開示に基づき、場合によっては限定された日常実験を幾つか実施した後に、当業者であれば本発明の特定のポリペプチドに使用するために適切なリンカー（複数可）を決定することができるであろう。
例えば、（多量体受容体又は他のタンパク質等の）多量体抗原に指向性を有するナノボディを含む本発明の多価のポリペプチドにおいて、リンカーは、好ましくは、ポリペプチド中に存在する本発明のそれぞれのナノボディを、多量体のそれぞれのサブユニット上の抗原決定基に結合させるような長さ及び柔軟性を有している。同様に、同一の抗原上の２つ以上の異なる抗原決定基（例えば、抗原の異なるエピトープ、及び／又は多量体受容体、チャネル若しくはタンパク質の異なるサブユニット）に指向性を有するナノボディを含む本発明の多重特異性ポリペプチドにおいて、リンカーは、好ましくは、それぞれのナノボディを、目的の抗原決定基に結合させるような長さ及び柔軟性を有している。この場合にも、本明細書中での開示に基づき、場合によっては限定された日常実験を幾つか実施した後に、当業者であれば本発明の特定のポリペプチドに使用するために適切なリンカー（複数可）を決定することができるであろう。
使用するリンカー（複数可）が、本発明のポリペプチドに、１つ又は複数の他の望ましい性質又は機能を付与し、及び／又は（例えば本発明のナノボディの誘導体について本明細書中に記載の）誘導体の形成及び／又は官能基の結合のための１つ又は複数の部位をもたらすことも本発明の範囲内に包含される。例えば、１つ又は複数の荷電アミノ酸残基（上記の表Ａ−２を参照）を含有するリンカーは、優れた親水性をもたらすのに対し、低分子量のエピトープ又はタグを形成するか又はそれらを含有するリンカーは、検出、同定及び／又は精製の目的で使用することができる。この場合でも、本明細書中での開示に基づき、場合によっては限定された通常実験を幾つか実施した後に、当業者であれば本発明の特定のポリペプチドに使用するために適切なリンカーを決定することができるであろう。
最終的に、本発明のポリペプチドに２つ以上のリンカーを使用する場合、これらのリンカーは同一であっても異なっていてもよい。この場合でも、本明細書中での開示に基づき、場合によっては限定された日常実験を幾つか実施した後に、当業者であれば本発明の特定のポリペプチドに使用するのに適切なリンカーを決定することができるであろう。
通常、発現及び産生を容易にするため、本発明のポリペプチドは直鎖ポリペプチドである。しかしながら、本発明は、広義ではこれらに限定されない。例えば、本発明のポリペプチドが３つ以上のナノボディを含む場合、「星型」の構築物を得るために、各「アーム」がナノボディに結合する３つ以上の「アーム」を有するリンカーを使用することによってこれらを結合させることも可能である。通常あまり好ましくないが、環状の構築物を使用することも可能である。
また、本発明には、本発明のポリペプチドの誘導体が含まれ、これは本発明の、即ち本明細書中に記載のナノボディの誘導体に本質的に類似するものであり得る。
また、本発明には、本発明のポリペプチドから「本質的に成る」タンパク質又はポリペプチドが含まれる（「から本質的になる」という語句は、上記で示したものと本質的に同じ意味を有する）。
本発明の一実施の形態によれば、本発明のポリペプチドは、本明細書中に規定したように、本質的に単離形態である。
本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド及び核酸は、それ自体が既知であり、本明細書中のさらなる説明により当業者にとって明らかである方法で調製することができる。例えば、本発明のナノボディ及びポリペプチドは、抗体の調製、特に抗体断片（（単一）ドメイン抗体及びＳｃＦｖ断片が挙げられるが、これらに限定されない）の調製のためのそれ自体が既知の任意の方法で調製することができる。アミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド及び核酸を調製するための、好ましいが非限定的な幾つかの方法としては、本明細書中に記載の方法及び技法が挙げられる。
当業者にとって明らかであるように、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及び／又はポリペプチドの調製に特に有用な一方法は通常、
好適な宿主細胞又は宿主生物（本明細書中では「本発明の宿主」とも呼ぶ）において、又は本発明の上記アミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドをコードする核酸（本明細書中では「本発明の核酸」とも呼ぶ）に適切な別の発現系において、発現する工程と、場合によってはその後、
このようにして得られる本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドを単離及び／又は精製する工程とを含む。
特に、このような方法は、
本発明の宿主が少なくとも１つの本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及び／又はポリペプチドを発現及び／又は産生するような条件下で、本発明の宿主を培養及び／又は維持する工程と、場合によってはその後、
このようにして得られる本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドを単離及び／又は精製する工程とを含み得る。
本発明の核酸は、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡの形態を取ることができ、好ましくは二本鎖ＤＮＡの形態をとる。例えば、本発明のヌクレオチド配列はゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ又は合成ＤＮＡ（目的とする宿主細胞又は宿主生物内の発現に特異的に適合するコドンの使用によるＤＮＡ等）であってもよい。
本発明の一実施の形態によれば、本発明の核酸は、本明細書中に記載したように、本質的に単離形態である。
本発明の核酸は、例えば、プラスミド、コスミド又はＹＡＣ等のベクターの形態をとり、その一部に存在し、及び／又はその一部であってもよく、また本質的に単離形態であってもよい。
本発明の核酸は、本明細書中に記載の本発明のポリペプチドのアミノ酸配列に関する情報に基づき、それ自体が既知の方法で調製されるか又は得ることができ、及び／又は好適な天然資源から単離することができる。類似体を得るためには、天然型ＶＨＨドメインをコードするヌクレオチド配列に、例えば、部位特異的な突然変異誘発を起こして、当該類似体をコードする本発明の核酸を得ることができる。また、当業者にとって明らかであるように、本発明の核酸を調製するために、例えば、ナノボディをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列、及び例えば、１つ又は複数のリンカーをコードする核酸等の幾つかのヌクレオチド配列を好適な方法で連結することができる。
本発明の核酸を生成するための技法は当業者にとって明らかであり、例えば、自動ＤＮＡ合成、部位特異的突然変異誘発、２つ以上の天然型配列及び／又は合成型配列（又はこれらの２つ以上の部分）の結合（combining）、切断された遺伝子産物を発現させる変異の導入、（例えば、好適な制限酵素を用いて容易に消化及び／又はライゲーションすることができるカセット及び／又は領域を生成するための）１つ又は複数の制限部位の導入、及び／又は１つ又は複数の「ミスマッチ」プライマーを使用し、天然型ＧＰＣＲ？？？？の配列をテンプレートとして使用するＰＣＲ反応による変異の導入が挙げられるが、これらに限定されない。これらの技法及び他の技法は当業者にとって明らかであり、同様に上記のSambrook et al.及びAusubel et al.の文献等の標準的なハンドブック、及び以下の実施例を参照する。
本発明の核酸はまた、当業者にとって明らかであるように、遺伝子構築物の形態をとり、その一部に存在し、及び／又はその一部であってもよい。このような遺伝子構築物は一般に、例えば、１つ又は複数の好適な制御要素（好適なプロモーター（複数可）、エンハンサー（複数可）、ターミネーター（複数可）等）、及び本明細書中に述べられている遺伝子構築物のさらなる要素等）といった、１つ又は複数のそれ自体が既知の遺伝子構築物の要素に、場合によっては連結する少なくとも１つの本発明の核酸を含む。少なくとも１つの本発明の核酸を含むこのような遺伝子構築物は、本明細書中において「本発明の遺伝子構築物」とも呼ばれる。
本発明の遺伝子構築物は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。また、本発明の遺伝子構築物は、目的とする宿主細胞又は宿主生物の形質転換に好適な形態、目的とする宿主細胞のゲノムＤＮＡへの組込みに好適な形態、又は目的とする宿主生物における単独での複製、保持及び／又は継代に好適な形態をとり得る。例えば、本発明の遺伝子構築物は、例えば、プラスミド、コスミド、ＹＡＣ、ウイルスベクター又はトランスポゾン等のベクターの形態をとることができる。特に、ベクターは、発現ベクター、即ち、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏ（例えば、好適な宿主細胞、宿主生物及び／又は発現系）での発現を提供し得るベクターであってもよい。
好ましいが非限定的な一実施の形態では、本発明の遺伝子構築物は、
ａ）ｂ）と作用可能に結合している少なくとも１つの本発明の核酸と、
ｂ）プロモーター、及び場合によっては好適なターミネーター等の、１つ又は複数の制御要素と、場合によってはさらに
ｃ）それ自体が既知の遺伝子構築物の１つ又は複数のさらなる要素とを含み、ここで、用語「制御要素」、「プロモーター」、「ターミネーター」、及び「作用可能に結合した」は、当該技術分野における（本明細書中に詳述するような）通常の意味を有しており、遺伝子構築物中に存在する上記「さらなる要素」とは、例えば、３'−又は５'−ＵＴＲ配列、リーダー配列、選択マーカー、発現マーカー／レポーター遺伝子、及び／又は形質転換若しくは組込み（の効率）を促進又は増大させ得る要素であってもよい。このような遺伝子構築物に好適なこれら及び他の要素は当業者にとって明らかであり、例えば、使用する構築物の種類、目的とする宿主細胞又は宿主生物、対象となる本発明のヌクレオチド配列を発現させる方法（例えば、構成的発現、一時的発現、又は誘導性発現等を介するもの）、及び／又は使用する形質転換法に応じて決定することができる。例えば、抗体及び抗体断片（（単一）ドメイン抗体及びＳｃＦｖ断片が挙げられるが、これらに限定されない）の発現及び産生のための、それ自体が既知の制御配列、プロモーター、及びターミネーターを、ほぼ同様の方法で使用してもよい。
好ましくは、本発明の遺伝子構築物において、上記少なくとも１つの本発明の核酸、及び上記制御要素、及び場合によっては上記１つ又は複数のさらなる要素は、互いに「作用可能に連結」しており、これにより、これらは通常互いに機能的な関係にあることが意図されている。例えば、プロモーターが、コーディング配列の転写及び／又は発現を、開始又は他の方法により制御／調節することができる場合（上記コーディング配列は、上記プロモーター「に制御されている」ことを理解されたい）、コーディング配列に「作用可能に連結」していると考えられる。一般に、２つのヌクレオチド配列が作用可能に連結している場合、これらは同一の配向を有し、通常同一リーディングフレーム内にある。必ずしも必要ではないが、通常、それらは本質的に隣接している。
好ましくは、本発明の遺伝子構築物の制御要素及びさらなる要素は、目的とする宿主細胞又は宿主生物において意図される生物学的機能を付与することができるほどのものである。
例えば、プロモーター、エンハンサー又はターミネーターは、目的とする宿主細胞又は宿主生物において「作用可能」でなければならず、このため（例えば）、上記プロモーターは、（上記で規定したように）作用可能に連結したヌクレオチド配列（例えばコーディング配列）の転写及び／又は発現を、開始、又は他の方法により制御／調節することができるものであると意図される。
特に好ましい幾つかのプロモーターとしては、本明細書中に述べた宿主細胞における発現のためのそれ自体が既知のプロモーター、特に、本明細書中に述べたもの及び／又は実施例において使用されるもの等の、細菌細胞における発現のためのプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
選択マーカーは、（即ち、適切な選択条件下で）本発明のヌクレオチド配列による形質転換が（首尾良く）起こった宿主細胞及び／又は宿主生物を、形質転換が（首尾良く）起こらなかった宿主細胞及び／又は宿主生物と区別できるようなものでなければならない。このようなマーカーの好ましいが非限定的な幾つかの例は、抗生物質（カナマイシン又はアンピシリン等）に対する耐性を付与する遺伝子、温度耐性を付与する遺伝子、形質転換されていない細胞又は生物が生存する上で不可欠な、培地中の或る種の因子、化合物及び／又は（食品）成分がない状態で宿主細胞又は宿主生物を維持させる遺伝子である。
リーダー配列は、（目的とする宿主細胞又は宿主生物において）所望の翻訳後修飾を可能にし、及び／又は転写されたｍＲＮＡを細胞の所望の部分又はオルガネラに配向させるような配列であるものとする。また、リーダー配列は、上記細胞から発現生成物を分泌させてもよい。そのようなものとして、リーダー配列は、宿主細胞又は宿主生物中で作用可能な任意のプロ配列、プレ配列、又はプレプロ配列であってもよい。リーダー配列は、細菌細胞中で発現する必要はない。例えば、抗体及び抗体断片（単一ドメイン抗体及びＳｃＦｖ断片が挙げられるが、これらに限定されない）の発現及び産生のための、それ自体が既知であるリーダー配列を、ほぼ同様の方法で使用することができる。
発現マーカー又はレポーター遺伝子は、（宿主細胞又は宿主生物中で）遺伝子構築物の発現（遺伝子又はヌクレオチド配列の存在）を検出できるようなものでなければならない。発現マーカーは、場合によっては、発現産物を、例えば、細胞の特定の部分又はオルガネラ、及び／又は多細胞生物の特定の細胞（複数可）、組織（複数可）、器官（複数可）、又は部分（複数可）に局在化させてもよい。このようなレポーター遺伝子は、本発明のアミノ酸配列とのタンパク質融合として発現されてもよい。好ましいが非限定的な幾つかの例としては、ＧＦＰ等の蛍光性タンパク質が挙げられる。
好適なプロモーター、ターミネーター、及びさらなる要素の好ましいが非限定的な幾つかの例としては、本明細書中に記載した宿主細胞における発現に使用することができるもの、及び具体的には本明細書中に論じ、及び／又は下記の実施例で用いられているもの等の細菌細胞における発現に好適であるものが挙げられる。ターミネーター、転写及び／又は翻訳エンハンサー、及び／又は組込み因子等の、本発明の遺伝子構築物中に存在／使用し得るプロモーター、選択マーカー、リーダー配列、発現マーカー、及びさらなる要素についての（さらなる）非限定的な幾つかの例については、上記Sambrook et al.、及びAusubel et al.による概説ハンドブック、並びに国際公開第９５／０７４６３号パンフレット、国際公開第９６／２３８１０号パンフレット、国際公開第９５／０７４６３号パンフレット、国際公開第９５／２１１９１号パンフレット、国際公開第９７／１１０９４号パンフレット、国際公開第９７／４２３２０号パンフレット、国際公開第９８／０６７３７号パンフレット、国際公開第９８／２１３５５号パンフレット、米国特許第７，２０７，４１０号明細書、米国特許第５，６９３，４９２号明細書、及び欧州特許第１，０８５，０８９号明細書に示されたものを参照する。他の例は当業者にとって明らかであろう。上記の包括的な背景技術に関する参考文献及び本明細書中にさらに引用した参考文献も参照する。
本発明の遺伝子構築物は、通常、例えば、上記Sambrook et al.、及びAusubel et al.による概説ハンドブックに記載の技法を用いて、本発明のヌクレオチド配列（複数可）を、１つ又は複数の上記さらなる要素と適切に連結させることにより得ることができる。
多くの場合、本発明の遺伝子構築物は、本発明のヌクレオチド配列を、それ自体が既知の好適な（発現）ベクターに挿入することによって得られる。好適な発現ベクターの好ましいが非限定的な幾つかの例は、以下の実施例において使用されるもの、及び本明細書中に記載したものである。
本発明の核酸及び／又は本発明の遺伝子構築物は、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドを発現及び／又は産生させるための、宿主細胞又は宿主生物の形質転換に使用することができる。好適な宿主又は宿主細胞は当業者にとって明らかであり、例えば、任意の好適な真菌、原核、又は真核細胞若しくは細胞株、例えば：
大腸菌の菌株、ミラビリス変形菌等のプロテウス属の菌株、蛍光菌等のシュードモナス属の菌株等のグラム陰性菌株、及び、枯草菌又はブレビス菌等のバチルス属の菌株、ストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）等のストレプトミセス属の菌株、スタフィロコッカス・カルノサス（Staphylococcus carnosus）等のブドウ球菌の菌株、及び乳酸連鎖球菌等のラクトコッカス属の菌株等のグラム陽性菌株が挙げられるがこれらに限定されない細菌株、
トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）等のトリコデルマ属、アカパンカビ等のニューロスポラ属、ソルダリア・マクロスポラ（Sordaria macrospora）等のソルダリア属、アスペルギルス・ニゲル（Aspergillus niger）又はショウユコウジカビ等のアスペルギルス属、又は別の糸状菌由来の細胞が挙げられるがこれらに限定されない真菌細胞
出芽酵母等のサッカロミセス属、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等のシゾサッカロミセス属、ピキア・パストリス又はピキア・メタノリカ等のピキア属、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）等のハンセヌラ属、クルイベロミセス・ラクティス等のクルイベロミセス属、アークスラ・アデニニボランス（Arxula adeninivorans）等のアークスラ属、ヤロウィア・リポリチカ（Yarrowia lipolytica）等のヤロウィア属由来の細胞が挙げられるがこれらに限定されない酵母細胞、
アフリカツメガエル卵母細胞等の両生類細胞又は細胞株、
シロイチモンジヨトウＳＦ９及びＳｆ２１細胞を含むがこれらに限定されない鱗翅目に由来する細胞／細胞株、又はシュナイダー細胞及びＫｃ細胞等のショウジョウバエに由来する細胞／細胞株等の昆虫に由来する細胞又は細胞株、
タバコ植物等の植物又は植物細胞、及び／又は
ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞（ＢＨＫ−２１細胞等）、及びＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞（ＣＯＳ−７細胞等）、及びＰＥＲ．Ｃ６細胞等のヒト細胞又は細胞株が挙げられるがこれらに限定されない、ヒトに由来する細胞又は細胞株、哺乳類に由来する細胞又は細胞株等の哺乳類細胞又は細胞株、及び、
抗体及び抗体断片（（単一）ドメイン抗体及びＳｃＦｖ断片が挙げられるがこれらに限定されない）を発現及び産生することでそれ自体が既知の他の全ての宿主又は宿主細胞であってもよく、これらは当業者に明らかであろう。上記で引用した包括的な背景技術に関する文献及び、例えば、国際公開第９４／２９４５７号パンフレット、国際公開第９６／３４１０３号パンフレット、国際公開第９９／４２０７７号パンフレット、Frenken et al.（1998）（上記）、Riechmann及びMuyldermans （1999）（上記）、van der Linden （2000）（上記）、Thomassen et al.（2002）（上記）、Joosten et al.（2003）（上記）、Joosten et al.（2005）（上記）及び本明細書中にさらに引用した文献を参照する。
本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドは、予防及び／又は治療（遺伝子治療等）のために、多細胞生物の１つ又は複数の細胞、組織、又は器官に導入し、発現させることができる。このために、本発明のヌクレオチド配列を、例えば、このように（例えば、リポソームを用いて）、又は好適な（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等のパルボウイルス等のレトロウイルスに由来する）遺伝子治療用ベクターに挿入後、任意の好適な方法を用いて細胞又は組織に導入することができる。当業者にとって明らかであるように、このような遺伝子治療は、本発明の核酸又は本発明の核酸をコードする好適な遺伝子治療用ベクターを、患者又は患者の特定の細胞又は特定の組織若しくは器官に投与することにより患者の体内において、ｉｎ ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ ｓｉｔｕで行うことができ、又は好適な（多くの場合、外植リンパ球、骨髄吸引物又は組織生検試料等の、治療対象となる患者より採取された）細胞は、本発明のヌクレオチド配列を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで治療した後、患者の体内に好適に（再）導入することができる。これらは全て、Culver, K. W., "Gene Therapy", 1994, p. xii, Mary Ann Liebert, Inc., Publishers, New York, N.Y）、Giordano, Nature F Medicine 2 （1996）, 534-539、Schaper, Circ. Res. 79 （1996）, 911-919、Anderson, Science 256 （1992）, 808-813、Verma, Nature 389 （1994）, 239、Isner, Lancet 348 （1996）, 370-374、Muhlhauser, Circ. Res. 77 （1995）, 1077-1086、Onodera, Blood 91; （1998）, 30-36、Verma, Gene Ther. 5 （1998）, 692-699、Nabel, Ann. N.Y. Acad. Sci.: 811 （1997）, 289-292、Verzeletti, Hum. Gene Ther. 9 （1998）, 2243-51、Wang, Nature Medicine 2 （1996）, 714-716、国際公開第９４／２９４６９号パンフレット、国際公開第９７／００９５７号パンフレット、米国特許第５，５８０，８５９号明細書、米国特許第５，５８９５４６６号明細書、又はSchaper, Current Opinion in Biotechnology 7 （1996）, 635-640に記載の当業者に既知の遺伝子治療用ベクター、技法、及びデリバリーシステムを用いて行うことができる。例えば、ＳｃＦｖ断片（Afanasieva et al., Gene Ther., 10, 1850-1859 （2003））及びダイアボディ（Blanco et al., J. Immunol, 171, 1070-1077 （2003））のｉｎ ｓｉｔｕ発現は当該技術分野に記述されている。
細胞中でのナノボディの発現のために、これらは、例えば、国際公開第９４／０２６１０号パンフレット、国際公開第９５／２２６１８号パンフレット、及び米国特許第７００４９４０号明細書、国際公開第０３／０１４９６０号パンフレット、Cattaneo, A.及びBiocca, S. （1997） Intracellular Antibodies: Development and Applications. Landes and Springer-Verlag、Kontermann, Methods 34, （2004）, 163-170に記載の、いわゆる「細胞内抗体」として発現させることができる。
本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドを、例えば、ウサギ、ウシ、ヤギ又はヒツジの母乳等のトランスジェニック哺乳動物の母乳中（トランス遺伝子を哺乳類に導入する一般的な技法については、例えば、米国特許第６，７４１，９５７号明細書、米国特許第６，３０４，４８９号明細書、及び米国特許第６，８４９，９９２号明細書を参照）、植物、又は葉、花、果実、種、根、塊茎を含むがこれらに限定されない植物の一部中（例えば、タバコ、トウモロコシ、大豆、又はアルファルファ）、又は、例えば、カイコガの蛹中で産生することもできる。
さらに、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドを、細胞を含まない発現系で発現及び／又は産生してもよく、このような系の好適な例は当業者にとって明らかであろう。好ましいが非限定的な幾つかの例としては、小麦麦芽系、ウサギ網状赤血球溶解物、又はZubayの方法による大腸菌を用いた系での発現が挙げられる。
上記のように、ナノボディを使用する利点の１つは、それに基づくポリペプチドを、好適な細菌系における発現によって調製することができる点であり、及び好適な細菌発現系、ベクター、宿主細胞、調節要素等は、例えば上述した参考文献によって当業者にとって明らかであろう。しかしながら、本発明は、広義では細菌系における発現に限定されないことに留意されたい。
好ましくは、本発明では、本発明のポリペプチドを医薬用途に適した形態で提供する細菌発現系等の（ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏ）発現系を使用し、このような発現系も当業者にとって明らかであろう。当業者にとって明らかであるように、医薬用途に適した本発明のポリペプチドは、ペプチド合成法を用いて調製することもできる。
工業的スケールでの製造において、ナノボディ又はナノボディを含有するタンパク質治療剤の（工業的）製造のために好ましい異種宿主としては、大規模スケールでの発現／産生／培養、特に大規模スケールでの医薬用途発現／産生／培養に適した大腸菌、ピキア・パストリス、出芽酵母の菌株が挙げられる。このような菌株の好適な例は、当業者とって明らかであろう。このような菌株及び産生／発現系は、Biovitrum社（スウェーデン、ウプサラ）等の企業から入手可能である。
或いは、哺乳類細胞株、特にチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、大規模スケールでの発現／産生／培養、特に大規模スケールでの医薬用途発現／産生／培養のために用いることができる。このような発現／産生系も、上記幾つかの企業から入手可能である。
特定の発現系の選択は、或る特定の翻訳後修飾、より具体的にはグリコシル化の必要条件に一部依存している。グリコシル化が望ましいか又は必要とされるナノボディを含有する組換えタンパク質の産生には、発現したタンパク質をグリコシル化する能力を有する哺乳類発現用宿主の使用が必要である。これに関連して、得られるグリコシル化パターン（即ち、種類、数、及び残基が結合する位置）が、発現に用いられる細胞又は細胞株に依存することは、当業者にとって明らかであろう。好ましくは、ヒト（即ち、本質的にヒトのグリコシル化パターンを有するタンパク質を与える）細胞若しくは細胞株、又は、本質的に及び／又は機能的にヒトのグリコシル化と同一であるか、又は少なくともヒトのグリコシル化を模倣したグリコシル化パターンを与えることができる別の哺乳類の細胞株が用いられる。一般に、大腸菌等の原核宿主はタンパク質をグリコシル化する能力を有しておらず、酵母等の下等原核細胞を使用すると、通常、ヒトのグリコシル化と異なるグリコシル化パターンがもたらされる。それにもかかわらず、上記宿主細胞及び発現系の全てを、得ようとする所望のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドに応じて、本発明に用いることができることを理解されたい。
したがって、本発明の非限定的な一実施の形態によれば、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドはグリコシル化される。本発明の別の非限定的な実施の形態によれば、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドはグリコシル化されない。
本発明の好ましいが非限定的な一実施の形態によれば、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドは、細菌細胞中、具体的には大規模スケールでの医薬品製造に適した上記の株の細胞等の細菌細胞中で産生する。
本発明の別の好ましいが非限定的な実施の形態によれば、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドは、酵母細胞中、具体的には大規模スケールでの医薬品製造に適した上記の種の細胞等の酵母細胞中で産生する。
本発明のさらに別の好ましいが非限定的な実施の形態によれば、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドは、哺乳類細胞中、具体的にはヒト細胞又はヒト細胞株の細胞中で、さらに具体的には大規模スケールでの医薬品製造に適した上記の細胞株等のヒト細胞又はヒト細胞株の細胞中で産生する。
宿主細胞中での発現が、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドの製造に用いられる場合、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドは、細胞内（例えば、細胞質中、ペリプラズム中、又は封入体中）で産生し、次いで宿主細胞から単離し、場合によってはさらに精製してもよく、又は細胞外（例えば、宿主細胞を培養する培地中）で産生し、次いで培地から単離し、場合によってはさらに精製してもよい。真核宿主細胞を使用する場合、得られるナノボディ及びタンパク質のさらなる単離及び下流工程での処理が大幅に容易になるため、通常、細胞外で産生されることが好ましい。通常、大腸菌の菌株等の上記細菌細胞は、毒素及び血液毒等の数種のタンパク質を除き、タンパク質を細胞外に分泌せず、大腸菌において分泌物を産生することは、内膜を通してペリプラズム空間へタンパク質を転移させることを意味する。ペリプラズムでの産生は、細胞質での産生に対して、幾つかの利点がある。例えば、分泌産物のＮ末端のアミノ酸配列は、特異的シグナルペプチダーゼによる分泌シグナル配列の切断後の天然遺伝子産物と同一であってもよい。また、ペリプラズム中では、細胞質中よりもプロテアーゼ活性がはるかに低いと思われる。さらに、ペリプラズム中では、混入するタンパク質が少ないため、タンパク質の精製がより容易である。別の利点は、ペリプラズムが細胞質よりも酸化的な環境をもたらすため、正しい位置にジスルフィド結合が形成される可能性があるという点である。大腸菌中で過剰発現されたタンパク質は、封入体と呼ばれる不溶性の凝集物中に見られることが多い。これらの封入体は、細胞質中にもペリプラズム中にも存在させることができ、これらの封入体からの生理活性タンパク質の回収は、変性／リフォールディングプロセスを必要とする。治療効果を有するタンパク質を含む多くの組換えタンパク質は、封入体から回収される。代替的には、当業者に明らかであるように、所望のタンパク質、特に本発明のアミノ酸配列ナノボディ又はポリペプチドを分泌するように遺伝的に修飾された細菌の組換え菌株を用いることができる。
したがって、本発明の非限定的な一実施の形態によれば、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドは、細胞内で産生され、宿主細胞から、特に細菌細胞又は細菌細胞中の封入体から単離したアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドである。本発明の別の非限定的な実施の形態によれば、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドは、細胞外で産生され、宿主細胞を培養する培地から単離されたアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドである。
好ましいが非限定的な幾つかの、これらの宿主細胞で用いるためのプロモーターとしては、
大腸菌における発現のための：ｌａｃプロモーター（及び、ｌａｃＵＶ５プロモーター等のこれらの誘導体）、アラビノースプロモーター、λファージの左側（ＰＬ）及び右側（ＰＲ）プロモーター、ｔｒｐオペロンのプロモーター、ハイブリッドｌａｃ／ｔｒｐプロモーター（ｔａｃ及びｔｒｃ）、Ｔ７−プロモーター（より具体的にはＴ７−ファージ遺伝子１０のプロモーター）、及び他のＴ−ファージプロモーター；Ｔｎ１０テトラサイクリン耐性遺伝子のプロモーター、１つ又は複数の外来制御オペレーター配列を含む上記プロモーターの組換え変異体；
出芽酵母における発現のための：ＡＤＨ１（アルコール脱水素酵素１）、ＥＮＯ（エノラーゼ）、ＣＹＣ１（チトクロームｃ異性化酵素１）、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素）、ＰＧＫ１（ホスホグリセリン酸キナーゼ）、ＰＹＫ１（ピルビン酸キナーゼ）の構成的プロモーター；ＧＡＬ１，１０，７（ガラクトース代謝酵素）、ＡＤＨ２（アルコール脱水素酵素２）、ＰＨＯ５（酸ホスファターゼ）、ＣＵＰ１（銅メタロチオネイン）の制御的プロモーター、ＣａＭＶ（カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター）の外来プロモーター；
ピキア・パストリスにおける発現のための：ＡＯＸ１プロモーター（アルコール酸化酵素Ｉ）；
哺乳類細胞における発現のための：ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）前初期エンハンサー／プロモーター、プロモーターがＴｅｔリプレッサーによって制御可能なように２個のテトラサイクリンオペレーター配列を含有するヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）前初期プロモーター変異体、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルスの長末端反復配列（ＲＳＶ ＬＴＲ）エンハンサー／プロモーター、ヒト、チンパンジー、マウス、又はラット由来の伸長因子１α（ｈＥＦ−１α）プロモーター；ＳＶ４０初期プロモーター；ＨＩＶ−１の長末端反復配列プロモーター；βアクチンプロモーターが挙げられる。
好ましいが非限定的な幾つかの、これらの宿主細胞で用いるためのベクターとしては、
哺乳類細胞における発現のためのベクター：ｐＭＡＭｎｅｏ（Clontech）、ｐｃＤＮＡ３（Invitrogen）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Stratagene）、ｐＳＧ５（Stratagene）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ ３７４６０）及びｌＺＤ３５（ＡＴＣＣ ３７５６５）、並びにアデノウイルスに基づくもの等のウイルスに基づく発現系；
細菌細胞における発現のためのベクター：ｐＥＴベクター（Novagen）及びｐＱＥベクター（Qiagen）；
酵母又は別の真菌細胞における発現のためのベクター：ｐＹＥＳ２（Invitrogen）及びピキア発現ベクター（Invitrogen）；
昆虫細胞における発現のためのベクター：ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩ（Invitrogen）及び他のバキュロウイルスベクター；
植物又は植物細胞における発現のためのベクター：例えば、カリフラワーモザイクウイルス又はタバコモザイクウイルス、アグロバクテリウムの好適な菌株又はＴｉ-プラスミドベースのベクターが挙げられる。
好ましいが非限定的な幾つかの、これらの宿主細胞で使用するための分泌配列としては、
大腸菌等の細菌細胞における使用のための：ＰｅｌＢ、Ｂｌａ、ＯｍｐＡ、ＯｍｐＣ、ＯｍｐＦ、ＯｍｐＴ、ＳｔＩＩ、ＰｈｏＡ、ＰｈｏＥ、ＭａｌＥ、Ｌｐｐ、ＬａｍＢ等；ＴＡＴシグナルペプチド、ヘモリシンＣ−末端分泌シグナル；
酵母における使用のための：α−接合因子プレプロ配列、ホスファターゼ（ｐｈｏ１）、インベルターゼ（Ｓｕｃ）等；
哺乳類細胞における使用のための：標的タンパク質が真核細胞由来である場合には、固有シグナル、マウスＩｇκ鎖Ｖ−Ｊ２−Ｃシグナルペプチド等が挙げられる。
本発明の宿主又は宿主細胞を形質転換するのに好適な技法は、当業者にとって明らかであり、目的とする宿主細胞／宿主生物及び使用する遺伝子構築物に依存することもある。同様に、上記ハンドブック及び特許出願を参照する。
形質転換後、本発明のヌクレオチド配列／遺伝子構築物によってうまく形質転換された宿主細胞又は宿主生物を検出及び選択する工程を実行することができる。この工程は、例えば、本発明の遺伝子構築物に含まれる選択可能なマーカーに基づいて選択する工程、又は、例えば、特異的抗体を使用する本発明のアミノ酸配列の検出を含む工程であってもよい。
形質転換された宿主細胞（安定な細胞株の形態を取ることができる）又は宿主生物（安定な変異体系列又は株の形態を取ることができる）は、本発明の他の態様をなす。
好ましくは、これらの宿主細胞又は宿主生物は、（宿主生物の場合には、その少なくとも１つの細胞、部分、組織又は器官において）本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドを発現し、又は（少なくとも）（例えば、好適な条件下で）発現することができるようなものである。本発明はまた、本発明の宿主細胞又は宿主生物のさらなる世代、後代及び／又は子孫を含んでおり、それらは、例えば、細胞分裂又は有性若しくは無性生殖により得られるものであってよい。
本発明のアミノ酸配列を発現させ／その発現を得るために、形質転換された宿主細胞又は形質転換された宿主生物は一般に、（所望の）本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドが発現／産生されるような条件下で飼育、維持及び／又は培養される。好適な条件は当業者にとって明らかであり、通常、使用する宿主細胞／宿主生物、及び（関連する）本発明のヌクレオチド配列の発現を制御する制御因子に依存する。この場合にも、本発明の遺伝子構築物に関する上記の段落に記載したハンドブック及び特許出願を参照する。
一般に、好適な条件には、好適な培地の使用、好適な食餌及び／又は好適な栄養源の存在、好適な温度の使用、及び場合によっては好適な誘導因子又は化合物の存在（例えば、本発明のヌクレオチド配列が誘導性プロモーターにより制御される場合）が含まれ、これらは全て当業者が選択することができる。この場合にも、このような条件下で、本発明のアミノ酸配列は、連続的、一時的、又は適切に誘導された場合にのみ発現することができる。
本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドは、（まず）未成熟型（上記）で産生され、次いで、使用する宿主細胞／宿主生物に応じて翻訳後修飾されてもよいことも、当業者にとって明らかであろう。また、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドは、この場合にも、使用する宿主細胞／宿主生物に応じてグリコシル化されてもよい。
本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドは、次いで、宿主細胞／宿主生物から、及び／又は当該宿主細胞若しくは宿主生物を培養した培地から、（分取）クロマトグラフィ法、及び／又は電気泳動法、分別沈殿法、アフィニティ法（例えば、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドに融合した特定の切断可能なアミノ酸配列を用いる）、及び／又は分取免疫法（単離対象のアミノ酸配列に対する抗体を用いる）等の、それ自体が既知のタンパク質の単離技法及び／又は精製技法を用いて単離することができる。
通常、医薬用途のために、本発明のポリペプチドは、少なくとも１つの本発明のポリペプチドと、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤、及び／又はアジュバントとを含み、１つ又は複数のさらなる薬理活性ポリペプチド及び／又は化合物を場合によっては含む薬学的調製剤又は薬学的組成物として製剤化することができる。非限定的な例により、このような製剤は、経口投与のため、非経口投与（静脈内、筋内若しくは皮下注射、又は静脈内点滴等による）のため、全身投与のため、吸入、経皮パッチ、インプラント、座剤等による投与のために適した形態を取ることができる。このような好適な投与形態は、投与の方法、及びその調製剤で用いるための方法及び担体に応じて、固体、半固体又は液体であってよく、当業者にとって明らかであり、本明細書でさらに記述する。
したがって、他の態様において、本発明は、少なくとも１つの本発明のアミノ酸配列、少なくとも１つの本発明のナノボディ又は少なくとも１つの本発明のポリペプチド、及び少なくとも１つの好適な（医薬用途に好適な）担体、希釈剤又は賦形剤を含み、場合によっては１つ又は複数のさらなる活性物質を含有する薬学的組成物に関する。
一般に、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドは、それ自体が既知の任意の好適な方法により製剤化及び投与することができ、これらについては、例えば、上記で引用した包括的な背景技術（特に、国際公開第０４／０４１８６２号パンフレット、国際公開第０４／０４１８６３号パンフレット、国際公開第０４／０４１８６５号パンフレット及び国際公開第０４／０４１８６７号パンフレット）、及びRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Company, USA （1990）、又はRemington, the Science and Practice of Pharmacy, 21th Edition, Lippincott Williams and Wilkins （2005）等の標準的なハンドブックを参照する。
例えば、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドは、従来の抗体及び抗体断片（ＳｃＦｖ及びダイアボディ等）及び他の薬理活性タンパク質のための、それ自体が既知の任意の方法で製剤化及び投与することができる。このような製剤及びそれを調製する方法は当業者にとって明らかであり、例えば、非経口（例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋内、管腔内、動脈内又は髄腔内投与）又は局所（経皮又は皮内）投与に好適な調製剤が挙げられる。
非経口投与のための調製剤は、例えば、点滴又は注射に好適な滅菌液剤、懸濁剤、分散剤又は乳化剤であってもよい。このような調製剤に好適な担体又は希釈剤としては、例えば、限定するものではないが、滅菌水及び緩衝水溶液、並びにリン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、及びハンクス液等の溶液、水性油、グリセロール、エタノール、プロピレングリコール等のグリコール、又は鉱物油、動物油、及び植物油、例えば、落花生油、大豆油、並びに好適なこれらの混合物が挙げられる。通常、水溶液剤又は懸濁剤が好ましい。
本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドは、遺伝子治療の送達方法を使用して投与することもできる。例えば、その全文が参照により本明細書中に援用される米国特許第５，３９９，３４６号明細書を参照されたい。遺伝子治療の送達方法を使用して、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドをコードする遺伝子によりトランスフェクトされた初代細胞を、特定の器官、組織、移植片、腫瘍又は細胞を標的とするための組織特異的プロモーターによりさらにトランスフェクトすることができ、細胞内に局在化した発現のためのシグナル及び安定化配列によりさらにトランスフェクトすることもできる。
このように、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドは、不活性希釈剤又は吸収可能な食用の担体等の薬学的に許容される溶媒と組み合わせて、例えば、経口的に全身投与することができる。それらを、ハード又はソフトシェルゼラチンカプセルに封入してもよく、錠剤として打錠してもよく、又は患者の食事中の食品に直接加えてもよい。経口治療用の投与のために、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドを１つ又は複数の賦形剤と組み合わせ、摂取可能な錠剤、口腔錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁液剤、シロップ剤、ウェハー剤等の形態で使用することができる。このような組成物及び調製剤は、少なくとも０．１％の本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドを含有していなければならない。組成物及び調製剤中のそれらの割合は、当然ながら変えることができ、所定の単位投薬形態の重量の約２％〜約６０％であることが適切である。このような治療上有用な組成物中の本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドの量は、有効な用量レベルが得られるような量である。
また、錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤等は、トラガカントガム、アラビアゴム、コーンスターチ又はゼラチン等の結着剤；リン酸二カルシウム等の賦形剤；コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤；及びスクロース、フルクトース、ラクトース又はアスパルテーム等の甘味料を含有していてもよく、又はペパーミント、冬緑油、チェリー香料等の香料を加えてもよい。単位投薬形態がカプセル剤である場合、上記のような種類の物質以外に、植物油又はポリエチレングリコール等の液体担体を含有していてもよい。種々の他の物質が、コーティングとして、又は固体状の単位投薬形態の物理的形態を他の方法により変化させるために存在していてもよい。例えば、錠剤、丸剤又はカプセル剤は、ゼラチン、ロウ、シェラック又は砂糖等でコーティングされていてもよい。シロップ剤又はエリキシル剤は、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチド、甘味料としてのスクロース又はフルクトース、保存料としてのメチルパラベン又はプロピルパラベン、色素、及びチェリー又はオレンジ香料等の香料を含有していてもよい。当然ながら、単位投薬形態の調製に使用される全ての物質は、薬学的に許容され、使用する量において実質的に無毒でなければならない。さらに、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドは、徐放剤及び装置中に封入されていてもよい。
経口投与のための調製剤及び製剤にはまた、本発明の構築物が胃内環境に耐性を有し且つ腸内を通過することを可能にする腸溶コーティングが付与される。より包括的には、経口投与のための調製剤及び製剤は、消化管のいずれかの所望部分に送達するのに好適に製剤化され得る。また、消化管に送達するのに用いられ得る好適な坐薬を使用してもよい。
本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドはまた、点滴又は注射によって静脈内投与又は腹腔内投与してもよい。本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドの溶液、又はそれらの塩は、水中で調製することがき、任意で無毒性界面活性剤と混合することができる。分散剤液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチン、及びそれらの混合物中、並びに油中で調製することができる。通常の保存及び使用条件下において、これらの調製剤は、微生物の繁殖を防ぐための保存料を含有している。
注射又は点滴に好適な薬剤投薬形態としては、滅菌注射又は滅菌点滴可能な溶液剤又は分散液剤の即時調製に適合し、場合によってはリポソームに封入された活性成分を含む、滅菌水溶液剤又は分散液剤又は滅菌粉末が挙げられ得る。全ての場合において、最終的な投薬形態は、滅菌されており、流体であり、製造及び保存条件下で安定でなければならない。液体の担体又は溶媒は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、植物油、非毒性グリセリルエステル、及びこれらの好適な混合物を含む溶媒又は液体の分散媒であってもよい。例えば、リポソームの形成により、分散液剤の場合には必要な粒子サイズを維持することにより、又は界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持することができる。例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等の種々の抗菌剤及び抗真菌剤により微生物の作用を妨害することができる。多くの場合において、等張剤、例えば、砂糖、緩衝剤、又は塩化ナトリウムを含んでいることが好ましい。組成物において、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを使用することにより、注射可能な組成物の長時間にわたる吸収をもたらすことができる。
滅菌注射可能な溶液剤は、所望の量の本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドを、必要に応じて、上記に列挙した種々の他の成分を含む適切な溶媒中に混合させた後、滅菌濾過することにより調製される。滅菌注射可能な溶液剤を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、減圧乾燥法及び凍結乾燥法であり、活性成分の粉末、及び滅菌濾過された溶液剤中に存在する任意のさらなる望ましい成分が得られる。
局所投与のためには、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドが液体の場合には、純粋な形態で適用することができる。しかし、一般に、それらは、固体であっても液体であってもよい皮膚科学的に許容される担体と共に、組成物又は製剤として皮膚に投与されることが望ましい。
有用な固体担体としては、タルク、粘土、微結晶セルロース、シリカ、アルミナ等の微粉砕された固体が挙げられる。有用な液体担体としては、水、ヒドロキシアルキル又はグリコール又は水−アルコール／グリコール混合物が挙げられ、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドは、場合によっては非毒性の界面活性剤の作用により、有効な濃度で溶解又は分散することができる。所定用途のための性質を最適化するために、芳香剤及び他の抗菌剤等のアジュバントを加えてもよい。得られる液体組成物は、ばんそうこう及び他の包帯に薬剤を含浸させるのに用いられる吸収パッドによって塗布することができ、又はポンプ型又はエアロゾルスプレーを使用して患部の上に噴霧することができる。
使用者の皮膚に直接塗布するための塗布用ペースト、ゲル、軟膏及び石鹸等を形成するために、合成ポリマー、脂肪酸、脂肪酸塩及びエステル、脂肪アルコール、修飾セルロース又は修飾無機物質等の増粘剤を液体担体と共に使用することができる。
本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドを皮膚に送達するために使用することができる有用な皮膚科用組成物の例は既知であり、例えば、Jacquet et al.（米国特許第４，６０８，３９２号明細書）、Geria（米国特許第４，９９２，４７８号明細書）、Smith et al.（米国特許第４，５５９，１５７号明細書）及びWortzman（米国特許第４，８２０，５０８号明細書）を参照されたい。
本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドの有用な用量は、それらのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性、及び動物モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ活性を比較することにより決定することができる。マウス及び他の動物における有効用量をヒトに外挿するための方法は既知であり、例えば、米国特許第４，９３８，９４９号明細書を参照されたい。
一般に、ローション等の液体組成物中の本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドの濃度は、約０．１重量％〜２５重量％、好ましくは、約０．５重量％〜１０重量％である。ゲル又は粉末等の半固形又は固形組成物中の濃度は、約０．１重量％〜５重量％、好ましくは約０．５重量％〜２．５重量％である。
治療における使用に必要な本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドの量は、選択される特定のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドだけでなく、投与経路、治療する症状の性質、並びに患者の年齢及び状態によっても変動し、最終的には担当する医師又は臨床医の判断に委ねられる。また、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドの用量は、標的となる細胞、腫瘍、組織、移植片又は器官によっても変動する。
望ましい用量は便宜上、単回用量で、又は例えば、１日２回、３回、４回以上の部分用量として、適切な間隔での分割投与で示され得る。部分用量自体を、例えば、吸入器からの複数回の吸入又は複数滴の点眼投与等の、個別で、大まかな間隔の数多くの投与にさらに分割してもよい。
投与計画には、長期間の１日処置が含まれ得る。「長期間」とは、少なくとも２週間、好ましくは数週間、数ヶ月、又は数年の期間を意味する。この用量範囲における必要な改変は、本明細書中で教示される通常の実験のみを使用して当業者によって決定され得る。Remington's Pharmaceutical Sciences （Martin, E. W., ed. 4）, Mack Publishing Co., Easton, PAを参照されたい。用量は、何らかの合併症が発症した場合には、個々の医師が調節することもできる。
別の態様において、本発明は、少なくとも１つのＩＬ−６Ｒに関連する疾患を予防及び／又は治療する方法であって、それが必要な被験者に薬学的に有効な量の本発明のアミノ酸配列、本発明のポリペプチド、及び／又はこれらを含む薬学的組成物を投与することを含む、方法に関する。
本発明の文脈において、用語「予防及び／又は治療」とは、疾患を予防及び／又は治療することを含むだけでなく、概して、疾患の発症を予防すること、疾患の進行を遅延又は退行させること、疾患に関連する１つ又は複数の症状の発症を予防又は遅延させること、疾患に関連する１つ又は複数の症状を低減及び／又は軽減すること、疾患及び／又はそれに関連するあらゆる症状の重傷度及び／又は期間を低減すること、及び／又は疾患及び／又はそれに関連するあらゆる症状の重症度のさらなる増大を予防すること、疾患によって生じるあらゆる生理学的損傷を予防、低減又は退行させること、及び概して治療すべき患者に有益なあらゆる薬理作用も含む。
治療すべき被験者とは、任意の温血動物であり得るが、具体的には哺乳類、より具体的にはヒトである。当業者にとって明らかであるように、治療すべき被験者は、特に本明細書中に記載の疾患及び障害をわずらっているか又はそれらの危険性のあるヒトであり得る。
本発明は、ＩＬ−６Ｒに、その生物活性若しくは薬理活性に、及び／又はＩＬ−６Ｒが関与する生物学的経路若しくはシグナル伝達に関連がある少なくとも１つの疾患及び障害を予防及び／又は治療する方法であって、それが必要な被験者に薬学的に有効な量の本発明のアミノ酸配列、本発明のナノボディ、本発明のポリペプチド、及び／又はこれらを含む薬学的組成物を投与することを含む、方法に関する。特に、本発明は、ＩＬ−６Ｒ、その生物活性若しくは薬理活性、及び／又はＩＬ−６Ｒが関与する生物学的経路若しくはシグナル伝達を調節することによって治療することができる少なくとも１つの疾患及び障害を予防及び／又は治療する方法であって、それが必要な被験者に薬学的に有効な量の本発明のアミノ酸配列、本発明のナノボディ、本発明のポリペプチド、及び／又はこれらを含む薬学的組成物を投与することを含む、方法に関する。特に、上記の薬学的に有効な量とは、ＩＬ−６Ｒ、その生物活性若しくは薬理活性、及び／又はＩＬ−６Ｒが関与する生物学的経路又はシグナル伝達を調節するのに十分な量である。
本発明はまた、本発明のアミノ酸配列、又は本発明のポリペプチドを患者に投与することによって予防及び／又は治療することができる少なくとも１つの疾患及び障害を予防及び／又は治療する方法であって、それが必要な被験者に薬学的に有効な量の本発明のアミノ酸配列、本発明のポリペプチド、及び／又はこれらを含む薬学的組成物を投与することを含む、方法に関する。
より具体的には、本発明は、本明細書中に列挙される疾患及び障害から成る群から選択される少なくとも１つの疾患及び障害を予防及び／又は治療する方法であって、それが必要な被験者に薬学的に有効な量の本発明のアミノ酸配列、本発明のアミノ酸配列、本発明のポリペプチド、及び／又はこれらを含む薬学的組成物を投与することを含む、方法に関する。
別の実施の形態では、本発明は、免疫療法、及び特に受動免疫療法に関する方法であって、本明細書中に記載の疾患及び障害をわずらっているか又はそれらの危険性のある被験者に、 薬学的に有効な量の本発明のアミノ酸配列、本発明のアミノ酸配列、本発明のポリペプチド、及び／又はこれらを含む薬学的組成物を投与することを含む、方法に関する。
上記の方法において、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及び／又はポリペプチド、及び／又はこれらを含む組成物は、使用される特定の薬学的製剤又は薬学的組成物に応じて任意の好適な方法で投与することができる。したがって、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及び／又はポリペプチド、及び／又はこれらを含む組成物は、例えば、この場合にも使用される特定の薬学的製剤又は薬学的組成物に応じて経口的、腹腔内（例えば、静脈内、皮下、筋内、又は消化管を回避した投与の任意の他の経路を介して）、鼻腔内、経皮、局所的に、座薬を用いて、吸入によって投与することができる。臨床医は、予防又は治療すべき疾患又は障害、及び臨床医に既知の他の因子（factorse）に応じて、好適な投与経路、及びこのような投与に使用される好適な薬学的製剤又は薬学的組成物を選択することができるであろう。
本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及び／又はポリペプチド、及び／又はこれらを含む組成物は、予防又は治療すべき疾患又は障害の予防及び／又は治療に好適な治療計画に従って投与される。臨床医は一般的に、予防又は治療すべき疾患又は障害、治療すべき疾患の重症度及び／又はその症状の重症度、使用される本発明の特定のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチド、特定の投与経路、及び使用される薬学的製剤又は薬学的組成物、患者の年齢、性別、体重、食事、全身状態、並びに臨床医に既知の同様の因子に応じて、好適な治療計画を決定することができるであろう。
通常、治療計画には、１つ又は複数の薬学的に有効な量又は用量における１つ又は複数の本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及び／又はポリペプチド、又はこれらを含む１つ又は複数の組成物の投与が含まれるであろう。投与される具体的な量（複数可）又は用量はこの場合でも上記の因子に基づき臨床医によって決定することができる。
通常、本明細書中に記載した疾患及び障害の予防及び／又は治療に関して、また治療すべき特定の疾患又は障害、使用される本発明の特定のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドの効力、特定の投与経路、及び使用される特定の薬学的製剤又は薬学的組成物に応じて、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドは概して、１ｇ／ｋｇ（体重）／日〜０．０１μｇ／ｋｇ（体重）／日、好ましくは、０．１ｇ／ｋｇ（体重）／日〜０．１μｇ／ｋｇ（体重）／日、例えば、約１μｇ／ｋｇ（体重）／日、１０μｇ／ｋｇ（体重）／日、１００μｇ／ｋｇ（体重）／日又は１０００μｇ／ｋｇ（体重）／日の量で、連続して（例えば、点滴によって）、日々の単回用量として、又は１日の中の複数回の分割用量として投与されるであろう。臨床医は一般的に、本明細書中に記載の因子に応じて好適な日用量を決定することができるであろう。特定の場合には、例えば、上記の因子及び臨床医の専門的判断に基づきこれらの量から外れるように臨床医が選択することもあることが明らかである。一般的に、親和性／結合活性、有効性、体内分布、半減期及び当業者に既知の同様の因子の差異は考慮するものの、本質的に同様の経路を介して投与される、同様の標的に対する比較可能な従来の抗体又は抗体断片に関して通常投与される量から、投与量に関する指針は幾らか得ることができる。
通常上記の方法では、本発明の単一のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドを使用している。しかしながら、２つ以上の本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及び／又はポリペプチドを組み合わせて使用することも本発明の範囲内である。
本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドは、１つ又は複数のさらなる薬学的に有効な化合物又は成分と組み合わせて、即ち、相乗効果をもたらすことも又はもたらさないこともある複合治療計画として使用することもできる。この場合でも、臨床医は、上記の因子及び臨床医の専門的判断に基づき、このようなさらなる化合物又は成分、並びに好適な複合治療計画を選択することができるであろう。
特に、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドは、本明細書中に記載の疾患及び障害の予防及び／又は治療に用いられるか又は用いることができる他の薬学的に有用な化合物又は成分と組み合わせて使用してもよく、その結果、相乗効果が得られることも又は得られないこともある。このような化合物及び成分、並びにそれらを投与するための経路、方法及び薬学的製剤又は薬学的組成物は臨床医にとって明らかであろう。
２つ以上の物質又は成分を複合治療計画の一環として使用する場合、それらは、同様の投与経路を介して又は種々の投与経路を介して、本質的に同じ時間で又は種々の時間で（例えば、本質的に同時に、連続して、又は交互に）投与することができる。物質又は成分を、同様の投与経路を介して同時に投与しようとする場合、当業者にとって明らかであるような、種々の薬学的製剤又は薬学的組成物、又は併せた薬学的製剤又は薬学的組成物の一部として投与してもよい。
また、２つ以上の有効な物質又は成分を複合治療計画の一環として使用しようとする場合、化合物又は成分を単独で使用する場合に用いられるものと同様の量で、また同様の計画に従って、物質又は成分の各々を投与してもよく、このような併用によって、相乗効果がもたらされることも又はもたらされないこともある。しかしながら、２つ以上の有効な物質又は成分の併用によって相乗効果がもたらされる場合には、所望の治療作用を達成すると共に、投与される物質又は成分の１つ、複数又は全ての量を低減することができる可能性がある。これは、例えば、所望の薬学的効果又は治療効果を依然として得ると共に、一般的な量で使用される場合の物質又は成分の１つ又は複数の使用に関連するあらゆる望ましくない副作用を回避、制限又は低減するのに有用であり得る。
本発明に従って使用される治療計画の有効性は、臨床医にとって明らかであるように、関与する疾患又は障害についてそれ自体が既知の任意の方法で決定及び／又は追及され得る。臨床医はまた、必要に応じて及びケースバイケースに基づき、特定の治療計画を変更又は改変し、それにより、所望の治療効果を達成し、望ましくない副作用を回避、制限又は低減し、及び／又は一方で所望の治療効果を達成することと、他方で望ましくない副作用を回避、制限又は低減することとの適切な均衡を達成することができる。
通常、所望の治療効果が達成されるまで、及び／又は所望の治療効果を維持する必要がある以上、治療計画は続けられる。また、これは臨床医が決定することができるものである。
別の態様において、本発明は、少なくとも１つのＩＬ−６Ｒに関連する障害を予防及び／又は治療するための薬学的組成物の調製における本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドの使用に関する。
治療すべき被験者とは、任意の温血動物であり得るが、具体的には哺乳類、より具体的にはヒトである。当業者にとって明らかであるように、治療すべき被験者は、特に本明細書中に記載の疾患及び障害をわずらっているか又はそれらの危険性のあるヒトであり得る。
本発明はまた、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドを患者に投与することによって予防及び／又は治療することができる少なくとも１つの疾患又は障害を予防及び／又は治療するための薬学的組成物の調製における本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドの使用に関する。
より具体的には、本発明は、ＩＬ−６Ｒに関連する障害を予防及び／又は治療するための、並びに特に本明細書中に列挙した疾患及び障害の１つ又は複数を予防及び治療するための薬学的組成物の調製における本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドの使用に関する。
また、このような薬学的組成物では、１つ又は複数の本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドを、本明細書中に記載したもの等の１つ又は複数の他の有効な成分と好適に組み合わせてもよい。
最終的に、本発明のナノボディ（本明細書中に規定）及び本発明のポリペプチドの使用がはるかに好ましいが、本明細書中の記載に基づき、当業者であれば、同様の方法で、ＩＬ−６受容体に対する他の（単一）ドメイン抗体、及びこのような（単一）ドメイン抗体を含むポリペプチドを設計及び／又は生成することもできることは明らかであろう（ここで、用語「ドメイン抗体」及び「単一ドメイン抗体」とは当該技術分野における通常の意味を有する）。
したがって、本発明のさらなる一態様は、ＩＬ−６受容体に対するドメイン抗体又は単一ドメイン抗体、及び少なくとも１つのこのような（単一）ドメイン抗体を含み、及び／又はこのような（単一）ドメイン抗体から本質的に成るポリペプチドに関する。
特に、ＩＬ−６受容体に対するこのような（単一）ドメイン抗体は、３つのＣＤＲを含んでいてもよく、当該ＣＤＲは、本発明のナノボディについて上記で規定したようなものである。例えば、このような（単一）ドメイン抗体は、「ｄＡｂ」として知られている単一ドメイン抗体であってもよく、例えば、Ward et al.（上記）に記載されているものであるが、本発明のナノボディについて上記で規定したようなＣＤＲを有する。しかしながら、上述したように、このような「ｄＡｂ」の使用は、対応する本発明のナノボディの使用と比較して、通常幾つかの欠点を有している。したがって、本発明の本態様によるＩＬ−６受容体に対する任意の（単一）ドメイン抗体は好ましくは、それらの性質を本発明のナノボディとほぼ同等とする、ＩＬ−６受容体に対する（単一）ドメイン抗体を提供するフレームワーク領域を有する。
したがって、広義では、本発明は、本質的に４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから成り、且つ（本明細書中に規定したように）ＩＬ−６受容体に指向性を有するアミノ酸配列に関する。このようなアミノ酸配列は好ましくは、８０個〜２００個のアミノ酸残基、例えば、９０個〜１５０個のアミノ酸残基、例えば、約１００個〜１３０個のアミノ酸残基（このようなアミノ酸配列の好適な断片（即ち、本発明のナノボディ又はそれらの等価物に関して本質的に本明細書中に記載）を使用してもよい）を含有し、好ましくは、免疫グロブリンフォールドを形成するか、又は好適な条件下で免疫グロブリンフォールドを形成することができるような（即ち、好適なフォールディングによる）ものである。アミノ酸配列は好ましくは、本明細書中に記載のナノボディ、ドメイン抗体、単一ドメイン抗体又は「ｄＡｂ」、及び最も好ましくはナノボディから選択される。ＣＤＲは、任意の好適なＣＤＲ（本明細書中の開示を参照）であり得るが、好ましくは本明細書中に規定したものである。
さらなる態様において、本発明はまた、少なくとも１つのこのようなアミノ酸配列を含むタンパク質及びポリペプチドと、このようなアミノ酸配列、タンパク質及びポリペプチドをコードする核酸と、このようなアミノ酸配列、タンパク質及びポリペプチドを調製する方法と、このようなアミノ酸配列、タンパク質又はポリペプチドを発現するか又はこれらを発現することができる宿主細胞と、このようなアミノ酸配列、タンパク質、ポリペプチド、核酸及び／又は宿主細胞を含む組成物、特に薬学的組成物と、特に予防目的、治療目的又は診断目的（例えば、本明細書で言及される予防目的、治療目的又は診断目的）のためのこのようなアミノ酸配列、タンパク質、ポリペプチド、核酸、宿主細胞及び／又は組成物の使用とに関する。全てのこれらの態様は、本明細書中の開示に基づき当業者にとって明らかであり、また本質的に本発明のナノボディに関する本明細書中に記載の実施の形態と同様又は等価であり得る。
このようなアミノ酸配列は好ましくは、８０個〜２００個のアミノ酸残基、例えば、９０個〜１５０個のアミノ酸残基、例えば約１００個〜１３０個のアミノ酸残基を含有するが、このようなアミノ酸配列の好適な断片（即ち、本質的に本発明のナノボディに関して本明細書中に記載されるもの、又はこれと等価なもの）を使用してもよい。
さらに、本発明のナノボディに関して上記で記載されるＣＤＲの１つ又は複数をヒトの足場又は非免疫グロブリンの足場を含むがこれらに限定されない他の「足場」上に「グラフト化」することが可能であり得ることは、当業者にとって明らかであろう。このようなＣＤＲグラフト化の好適な足場及び技法は当業者にとって明らかであり、当該技術分野において既知である。例えば、米国特許第７，１８０，３７０号明細書、国際公開第０１／２７１６０号パンフレット、欧州特許第０，６０５，５２２号明細書、欧州特許第０，４６０，１６７号明細書、米国特許第７，０５４，２９７号明細書、Nicaise et al., Protein Science （2004）, 13: 1882-1891、Ewert et al., Methods, 2004 Oct; 34 （2）: 184-199、Kettleborough et al., Protein Eng. 1991 Oct; 4（7）: 773-783、O'Brien and Jones, Methods Mol. Biol. 2003: 207: 81-100、及びSkerra, J. Mol. Recognit. 2000: 13: 167-187、及びSaerens et al., J. Mol. Biol. 2005 Sep 23; 352（3）: 597-607、及び本明細書中に引用したさらなる参考文献を参照されたい。例えば、マウス又はラットのＣＤＲをヒトのフレームワーク及び足場上にグラフト化するそれ自体が既知の技法は、本発明のナノボディのＣＤＲの１つ又は複数と、１つ又は複数のヒトフレームワーク領域又は配列とを含むキメラタンパク質をもたらすのと同様に使用することができる。
したがって、別の実施の形態において、本発明は、本発明のナノボディについて本明細書中に記載のＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列から成る群から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列を含むキメラポリペプチドを含む。好ましくは、このようなキメラポリペプチドには、本発明のナノボディについて本明細書中に記載のＣＤＲ３配列から成る群から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列、任意でまた、本発明のナノボディについて本明細書中に記載のＣＤＲ１配列及びＣＤＲ２配列から成る群から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列が含まれる。例えば、このようなキメラポリペプチドには、本発明のナノボディについて本明細書中に記載のＣＤＲ３配列から成る群から選択される１つのＣＤＲ配列、本発明のナノボディについて本明細書中に記載のＣＤＲ１配列から成る群から選択される１つのＣＤＲ配列、及び本発明のナノボディについて本明細書中に記載のＣＤＲ１配列及びＣＤＲ２配列から成る群から選択される１つのＣＤＲ配列が含まれ得る。本発明のナノボディについて好ましいとされる本明細書中に記載のＣＤＲの組合せは通常、これらのキメラポリペプチドにも好ましい。
上記キメラポリペプチドでは、ＣＤＲをさらなるアミノ酸配列に連結してもよく、及び／又はアミノ酸配列を介して互いに連結してもよい。当該アミノ酸配列は好ましくは、フレームワーク配列であるか、又はフレームワーク配列として機能するアミノ酸配列であるか、又はＣＤＲを示す足場を共に形成する。再度、最後の段落に記載の従来技術を参照する。好ましい実施の形態によれば、アミノ酸配列は、ヒトフレームワーク配列、例えば、ＶＨ３フレームワーク配列である。しかしながら、非ヒト、合成、半合成又は非免疫グロブリンフレームワーク配列も使用される。好ましくは、使用されるフレームワーク配列は、（１）キメラポリペプチドが、ＩＬ−６受容体と結合することができる、言い換えれば、対応する本発明のナノボディの親和性の少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％、例えば、少なくとも２５％、及び最大５０％又は９０％以上である親和性を有し、（２）キメラポリペプチドが、医薬用途に好適であり、且つ（３）キメラポリペプチドが好ましくは、（本発明のナノボディの使用について本明細書中に記載の条件に本質的に類似であり得る）医薬用途に意図される条件（即ち、効能、投与方式、用量及び治療計画）下で本質的に非免疫原性である。
１つの非限定的な実施の形態によれば、キメラポリペプチドは、少なくとも１つのフレームワーク配列を介して連結する少なくとも２つのＣＤＲ配列（上記）を含み、ここで、２つのＣＤＲ配列の少なくとも１つが好ましくはＣＤＲ３配列であり、他のＣＤＲ配列がＣＤＲ１配列又はＣＤＲ２配列である。好ましいが非限定的な実施の形態によれば、キメラポリペプチドは、少なくとも２つのフレームワーク配列を介して連結する少なくとも２つのＣＤＲ配列（上記）を含み、ここで、好ましくは３つのＣＤＲ配列の少なくとも１つがＣＤＲ３配列であり、他の２つのＣＤＲ配列がＣＤＲ１配列又はＣＤＲ２配列であり、且つ好ましくはＣＤＲ１配列が１つ及びＣＤＲ２配列が１つである。１つの特に好ましいが非限定的な実施の形態によれば、キメラポリペプチドは、構造ＦＲ１'−ＣＤＲ１−ＦＲ２'−ＣＤＲ２−ＦＲ３'−ＣＤＲ３−ＦＲ４'を有し、ここで、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、本発明のナノボディのＣＤＲについて本明細書中に規定されており、ＦＲ１'、ＦＲ２'、ＦＲ３'及びＦＲ４'はフレームワーク配列である。ＦＲ１'、ＦＲ２'、ＦＲ３'及びＦＲ４'は特に、それぞれ、ヒト抗体（例えば、ＶＨ３配列）のフレームワーク１配列、フレームワーク２配列、フレームワーク３配列及びフレームワーク４配列、及び／又はこのようなフレームワーク配列の一部又は断片であり得る。構造ＦＲ１'−ＣＤＲ１−ＦＲ２'−ＣＤＲ２−ＦＲ３'−ＣＤＲ３−ＦＲ４を有するキメラポリペプチドの一部又は断片を使用することも可能である。このような一部又は断片とは、先行する段落に記載の規準を満たすようなものであることが好ましい。
本発明はまた、このようなキメラポリペプチドを含み、及び／又はこれらから本質的に成るタンパク質及びポリペプチド、このようなタンパク質又はポリペプチドをコードする核酸、このようなタンパク質及びポリペプチドを調製する方法、このようなタンパク質又はポリペプチドを発現するか又は発現することができる宿主細胞、このようなタンパク質又はポリペプチド、核酸、又は宿主細胞を含む組成物、特に薬学的組成物、並びに、特に予防、治療又は診断を目的とする、例えば、本明細書中に記載の予防、治療又は診断を目的とする、このようなタンパク質又はポリペプチド、このような核酸、このような宿主細胞、及び／又はこのような組成物の使用に関する。例えば、このようなタンパク質、ポリペプチド、核酸、方法、宿主細胞、組成物及び使用は、本発明のナノボディについて本明細書中に記載のタンパク質、ポリペプチド、核酸、方法、宿主細胞、組成物及び使用と同様である。
本発明のナノボディが、上記の好ましいＣＤＲ配列以外の１つ又は複数のＣＤＲ配列を含有する場合、これらのＣＤＲ配列は、自体が既知の任意の方法で、例えば、（好ましい）ナノボディ、従来の抗体に由来の（及び特にヒト抗体に由来の）ＶＨドメイン、重鎖抗体、従来の４本鎖抗体（例えば、従来のヒト４本鎖抗体）、又はＩＬ−６受容体に指向性を有する他の免疫グロブリン配列から得ることができる。ＩＬ−６受容体に指向性を有するこのような免疫グロブリン配列は、自体が既知の任意の方法で、当業者にとって明らかであるように、即ち、ＩＬ−６受容体による免疫化によって、又はＩＬ−６受容体を有する免疫グロブリン配列の好適なライブラリをスクリーニングすることによって、又は任意の好適なそれらの組合せによって生成することができる。任意で、この後、ランダム又は部位特異的突然変異のような技法、及び／又はそれ自体が既知の親和性成熟のような他の技法を続けてもよい。このような免疫グロブリン配列を生成する好適な技法は当業者にとって明らかであり、例えば、Hoogenboom, Nature Biotechnology, 23, 9, 1105-1116 （2005）に概説されるスクリーニング法が挙げられる。特定の標的に対する免疫グロブリンを生成する他の技法としては、例えば、ナノクローン（登録商標）技術（例えば、公開済み米国特許出願第２００６−０２１１０８８号明細書に記載）、いわゆるＳＬＡＭ技術（例えば、欧州特許出願第０，５４２，８１０号明細書に記載）、ヒト免疫グロブリンを発現するトランスジェニックマウスの使用、又は既知のハイブリドーマ技法（例えば、Larrick et al., Biotechnology, Vol.7, 1989, p.934を参照）が挙げられる。全てのこれらの技法は、ＩＬ−６受容体に対する免疫グロブリンを生成するのに使用することができ、且つこのような免疫グロブリンのＣＤＲは、即ち上記で概説されるように、本発明のナノボディにおいて使用することができる。例えば、このようなＣＤＲの配列は、本明細書中に記載されるもの等のそれ自体が既知の技法を全て用いて、測定、合成及び／又は単離して、本発明のナノボディの配列（例えば、対応する従来のＣＤＲに取って代わるように）に挿入することができ、又は、本明細書中に記載の技法を同様に用いて、このようなＣＤＲ（又はこのようなＣＤＲをコードする核酸）を含有する本発明のナノボディを新たに合成することができる。
本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド、核酸、遺伝的構築物、並びに宿主及び宿主細胞のさらなる使用は、本明細書中の開示に基づき当業者にとって明らかであろう。例えば、限定するものではないが、本発明のアミノ酸配列は、好適な担体又は固体支持体と連結することができ、組成物及び組成物を含む調製剤からＩＬ−６Ｒを精製するそれ自体が既知の方法で使用することができる培地をもたらす。好適な検出可能な標識を含む本発明のアミノ酸配列の誘導体はまた、組成物又は調製剤中のＩＬ−６Ｒの存在を（定性的に又は定量的に）測定するマーカーとして、又は（例えば、好適な細胞分取技法と組み合わせて）細胞又は組織の表面上のＩＬ−６Ｒの存在を選択的に検出するマーカーとして使用することができる。
ここで、以下の非限定的な例及び図面を用いて本発明をさらに説明する。
ＥＬＩＳＡによるラマ８１及びラマ８２における免疫応答の分析を示す図である。 ラマ０８１及びラマ０８２における免疫応答のＦＡＣＳ分析を示すである。 ラマ０８１及びラマ０８２における免疫応答のＦＡＣＳ分析を示すである。 ラマ０８１及びラマ０８２における免疫応答のＦＡＣＳ分析を示すである。 ラマ０８１及びラマ０８２における免疫応答のＦＡＣＳ分析を示すである。 ラマ０８１及びラマ０８２における免疫応答のＦＡＣＳ分析を示すである。 ラマ０８１及びラマ０８２における免疫応答のＦＡＣＳ分析を示すである。 ＩＬ−６Ｒ上のＩＬ−６結合部位に対するナノボディを同定するのに用いられるアルファスクリーンアッセイの概略図である。 精製した一価の抗ＩＬ−６ＲナノボディのＳＤＳ−ＰＡＧＥである。Ｍ＝分子量マーカー。ナノボディの同定はゲルの上部により示される。 抗ＩＬ−６Ｒナノボディのタンパク質配列である。 抗ＩＬ−６Ｒナノボディのタンパク質配列である。 阻害性抗ＩＬ−６Ｒナノボディの選択されたサブセットのタンパク質配列である。 Ｕ２６６細胞上のＩＬ−６Ｒへの一価の阻害性抗ＩＬ−６Ｒナノボディの結合を示す図である。蛍光強度をＸ軸に、事象の数をＹ軸にプロットする。精製した抗ＩＬ−６Ｒ抗体ＢＲ−６も１つとして記載する。 Ｕ２６６細胞上のＩＬ−６Ｒへの一価の阻害性抗ＩＬ−６Ｒナノボディの結合を示す図である。蛍光強度をＸ軸に、事象の数をＹ軸にプロットする。精製した抗ＩＬ−６Ｒ抗体ＢＲ−６も１つとして記載する。 ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ相互作用を阻害する、アルファスクリーンにおける１４つの一価の抗ＩＬ−６Ｒナノボディの拮抗活性を示す図である。 ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ相互作用を阻害する、アルファスクリーンにおける１４つの一価の抗ＩＬ−６Ｒナノボディの拮抗活性を示す図である。 ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ相互作用を阻害する、アルファスクリーンにおける１４つの一価の抗ＩＬ−６Ｒナノボディの拮抗活性を示す図である。 ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ相互作用を阻害する、アルファスクリーンにおける１４つの一価の抗ＩＬ−６Ｒナノボディの拮抗活性を示す図である。 ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ相互作用を阻害する、アルファスクリーンにおける１４つの一価の抗ＩＬ−６Ｒナノボディの拮抗活性を示す図である。 ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ相互作用を阻害する、アルファスクリーンにおける１４つの一価の抗ＩＬ−６Ｒナノボディの拮抗活性を示す図である。 細胞ベースのアッセイ（ＸＧ−１）における１４つの一価の抗ＩＬ−６Ｒナノボディの拮抗活性を示す図である。ＢＲ−６、ＢＮ−１２及び参照Ｆａｂは参照として記載した。 細胞ベースのアッセイ（ＸＧ−１）における１４つの一価の抗ＩＬ−６Ｒナノボディの拮抗活性を示す図である。ＢＲ−６、ＢＮ−１２及び参照Ｆａｂは参照として記載した。 ヒト血漿中のｓＩＬ−６Ｒへの一価の抗ＩＬ−６Ｒナノボディの競合的結合を示す図である。 ヒト血漿中のｓＩＬ−６Ｒへの一価の抗ＩＬ−６Ｒナノボディの競合的結合を示す図である。 カニクイザル血漿中のｓＩＬ−６Ｒへの一価の抗ＩＬ−６Ｒナノボディの競合的結合を示す図である。 カニクイザル血漿中のｓＩＬ−６Ｒへの一価の抗ＩＬ−６Ｒナノボディの競合的結合を示す図である。 精製した二重特異性抗ＩＬ−６Ｒ／抗ＳＡナノボディのＳＤＳ−ＰＡＧＥである。Ｍ＝分子量マーカーである。ナノボディの同定はゲルの上部により示される。 Ｕ２６６細胞上のＩＬ−６Ｒへの二重特異性抗ＩＬ−６Ｒ／抗ＳＡナノボディの結合を示す図である。蛍光強度をＸ軸に、事象の数をＹ軸にプロットする。精製した抗ＩＬ−６Ｒ抗体ＢＲ−６も１つとして記載する。 Ｕ２６６細胞上のＩＬ−６Ｒへの二重特異性抗ＩＬ−６Ｒ／抗ＳＡナノボディの結合を示す図である。蛍光強度をＸ軸に、事象の数をＹ軸にプロットする。精製した抗ＩＬ−６Ｒ抗体ＢＲ−６も１つとして記載する。 ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ相互作用を阻害する、アルファスクリーン中の二重特異性抗ＩＬ−６Ｒ／抗ＳＡナノボディの拮抗活性を示す図である。 ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ相互作用を阻害する、アルファスクリーン中の二重特異性抗ＩＬ−６Ｒ／抗ＳＡナノボディの拮抗活性を示す図である。 ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ相互作用を阻害する、アルファスクリーン中の二重特異性抗ＩＬ−６Ｒ／抗ＳＡナノボディの拮抗活性を示す図である。 ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ相互作用を阻害する、アルファスクリーン中の二重特異性抗ＩＬ−６Ｒ／抗ＳＡナノボディの拮抗活性を示す図である。 細胞ベースのアッセイ（ＸＧ−１）における二重特異性抗ＩＬ−６Ｒ／抗ＳＡナノボディの拮抗活性を示す図である。ＢＲ−６、ＢＮ−１２及び参照Ｆａｂは参照として記載した。 細胞ベースのアッセイ（ＸＧ−１）における二重特異性抗ＩＬ−６Ｒ／抗ＳＡナノボディの拮抗活性を示す図である。ＢＲ−６、ＢＮ−１２及び参照Ｆａｂは参照として記載した。 細胞ベースのアッセイ（ＸＧ−１）における二重特異性抗ＩＬ−６Ｒ／抗ＳＡナノボディの拮抗活性を示す図である。ＢＲ−６、ＢＮ−１２及び参照Ｆａｂは参照として記載した。 細胞ベースのアッセイ（ＸＧ−１）における二重特異性抗ＩＬ−６Ｒ／抗ＳＡナノボディの拮抗活性を示す図である。ＢＲ−６、ＢＮ−１２及び参照Ｆａｂは参照として記載した。 細胞ベースのアッセイ（ＸＧ−１）における二重特異性抗ＩＬ−６Ｒ／抗ＳＡナノボディの拮抗活性を示す図である。ＢＲ−６、ＢＮ−１２及び参照Ｆａｂは参照として記載した。 細胞ベースのアッセイ（ＸＧ−１）における１ｍｇ／ｍＬのヒト血清アルブミンの存在下での二重特異性抗ＩＬ−６Ｒ／抗ＳＡナノボディの拮抗活性を示す図である。ＢＲ−６、ＢＮ−１２及び参照Ｆａｂは参照として記載した。 細胞ベースのアッセイ（ＸＧ−１）における１ｍｇ／ｍＬのヒト血清アルブミンの存在下での二重特異性抗ＩＬ−６Ｒ／抗ＳＡナノボディの拮抗活性を示す図である。ＢＲ−６、ＢＮ−１２及び参照Ｆａｂは参照として記載した。 細胞ベースのアッセイ（ＸＧ−１）における１ｍｇ／ｍＬのヒト血清アルブミンの存在下での二重特異性抗ＩＬ−６Ｒ／抗ＳＡナノボディの拮抗活性を示す図である。ＢＲ−６、ＢＮ−１２及び参照Ｆａｂは参照として記載した。 精製した三価の抗ＩＬ−６Ｒ／抗ＳＡナノボディのＳＤＳ−ＰＡＧＥである。Ｍ＝分子量マーカーである。ナノボディの同定はゲルの上部により示される。 ビアコアにおけるＩＬ−６Ｒへの三価の抗ＩＬ−６Ｒ／抗ＳＡナノボディの結合を示す図である。 Ｕ２６６細胞上のＩＬ−６Ｒへの三価の抗ＩＬ−６Ｒ／抗ＳＡナノボディの結合を示す図である。蛍光強度をＸ軸に、事象の数をＹ軸にプロットする。精製した抗ＩＬ−６Ｒ抗体ＢＲ−６も１つとして記載する。 細胞ベースのアッセイ（ＸＧ−１）における１ｍｇ／ｍＬのヒト血清アルブミンの非存在下及び存在下での三価の抗ＩＬ−６Ｒ／抗ＳＡナノボディの拮抗活性を示す図である。 ＩＬ−６Ｒ０３、ＩＬ−６Ｒ０４及びＩＬ−６Ｒ１３の異なるヒト変異体の配列である。 ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ相互作用を阻害する、アルファスクリーンにおけるＩＬ−６Ｒ０３、ＩＬ−６Ｒ０４及びＩＬ−６Ｒ１３抗ＩＬ−６Ｒナノボディのヒト変異体の拮抗活性を示す図である。 ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ相互作用を阻害する、アルファスクリーンにおけるＩＬ−６Ｒ０３、ＩＬ−６Ｒ０４及びＩＬ−６Ｒ１３抗ＩＬ−６Ｒナノボディのヒト変異体の拮抗活性を示す図である。 ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ相互作用を阻害する、アルファスクリーンにおけるＩＬ−６Ｒ０３、ＩＬ−６Ｒ０４及びＩＬ−６Ｒ１３抗ＩＬ−６Ｒナノボディのヒト変異体の拮抗活性を示す図である。 ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ相互作用を阻害する、アルファスクリーンにおけるＩＬ−６Ｒ０３、ＩＬ−６Ｒ０４及びＩＬ−６Ｒ１３抗ＩＬ−６Ｒナノボディのヒト変異体の拮抗活性を示す図である。 種々の温度におけるインキュベーション後のＩＬ−６Ｒ０３、ＩＬ−６Ｒ０４及びＩＬ−６Ｒ１３抗ＩＬ−６Ｒナノボディのヒト変異体の濃度を示す図である。 種々の温度におけるインキュベーション後のＩＬ−６Ｒ０３、ＩＬ−６Ｒ０４及びＩＬ−６Ｒ１３抗ＩＬ−６Ｒナノボディのヒト変異体の濃度を示す図である。 ヒト化したナノボディの細胞ベースのアッセイ（ＸＧ−１）における拮抗活性を示す図である。 選択されたクローン由来のＩＭＡＣ精製したナノボディのフローサイトメトリー分析を示す図である。ＩＭＡＣ精製したナノボディＩＬ−６Ｒ２４、ＩＬ−６Ｒ４４、ＩＬ−６Ｒ２０２及びＩＬ−６Ｒ２０３をイヌＩＬ−６Ｒ陽性ＣＨＯ細胞に添加した。ＰＥ標識ウサギポリクローナル抗ナノボディ血清（Ｒ２３）を用いて検出を行った。細胞と結合するナノボディでは、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋１０％ＦＢＳ）、その後ＰＥ標識Ｒ２３抗血清でインキュベートした細胞と比べて蛍光強度の増大が測定された。蛍光強度をＸ軸に、事象の数をＹ軸にプロットする。 非標識hＩＬ−６、ナノボディＩＬ−６Ｒ２０２及びナノボディＩＬ−６Ｒ２０３と競合するＡＬＥＸＡ６４７標識hＩＬ−６（６２５ｐＭ（最終））の結合阻害曲線である。非標識競合因子の濃度に対して平均蛍光性及び標準偏差をプロットする。ＩＣ５０値はｇｒａｐｈ ｐａｄ Ｐｒｉｓｍで算出した。 非標識hＩＬ−６、ナノボディＩＬ−６Ｒ２０２及びナノボディＩＬ−６Ｒ２０３と競合するＡＬＥＸＡ６４７標識hＩＬ−６（６２５ｐＭ（最終））の結合阻害曲線である。非標識競合因子の濃度に対して平均蛍光性及び標準偏差をプロットする。ＩＣ５０値はｇｒａｐｈ ｐａｄ Ｐｒｉｓｍで算出した。 精製したＩＬ−６Ｒ０４−ＨＳＡ及びＨＳＡ−ＩＬ−６Ｒ０４の融合タンパク質、並びにＩＬ−６Ｒ０４のフローサイトメトリー分析を示す図である。精製したナノボディ構築物をＵ２６６細胞に添加した。ＰＥ標識ウサギポリクローナル抗ナノボディ血清（Ｒ２３）を用いて検出を行った。ナノボディ−ＨＳＡ融合タンパク質、及び細胞と結合するナノボディでは、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋１０％ＦＢＳ）、続いてＰＥ標識Ｒ２３抗血清とインキュベートした細胞と比べて蛍光強度の増大が測定された。蛍光強度をＸ軸に、事象の数をＹ軸にプロットする。精製した抗ＩＬ−６Ｒ抗体ＢＲ−６及びＢＮ−１２を陽性対照としてインキュベートした。 精製したＩＬ−６Ｒ０４−ＨＳＡ及びＨＳＡ−ＩＬ−６Ｒ０４の融合タンパク質、並びにＩＬ−６Ｒ０４のフローサイトメトリー分析を示す図である。精製したナノボディ構築物をＵ２６６細胞に添加した。ＰＥ標識ウサギポリクローナル抗ナノボディ血清（Ｒ２３）を用いて検出を行った。ナノボディ−ＨＳＡ融合タンパク質、及び細胞と結合するナノボディでは、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋１０％ＦＢＳ）、続いてＰＥ標識Ｒ２３抗血清とインキュベートした細胞と比べて蛍光強度の増大が測定された。蛍光強度をＸ軸に、事象の数をＹ軸にプロットする。精製した抗ＩＬ−６Ｒ抗体ＢＲ−６及びＢＮ−１２を陽性対照としてインキュベートした。 ナノボディ−ＨＳＡフォーマットに対するＴＦ１細胞株の増殖応答を示す図である。２００ｐｇ／ｍＬ ＩＬ−６、及びナノボディ−ＨＳＡフォーマット又は対照抗体ＢＲ−６若しくはＢＮ−１２の既定の希釈物の存在下で１．２５×１０４個の細胞を三重反復で接種した。７２時間の培養時間の最後の６時間に細胞を０．５μＣｉ［３Ｈ］チミジンでパルス標識し、その後、取り込まれた放射活性を求めた。 Ｂａｌｂ／ｃマウス中のナノボディＩＬ−６Ｒ０４−ＨＳＡのＰＫ分析を示す図である。ナノボディＩＬ−６Ｒ０４−ＨＳＡの平均半減期は１．１０日である。 ２．００ｍｇ／ｋｇの（Ａ、Ｂ）ＩＬ−６Ｒ０４−ＨＳＡ、（Ｃ、Ｄ）ＩＬ−６Ｒ２０２及び（Ｅ、Ｆ）ＩＬ−６Ｒ２０３の静脈内投与後の平均実測（±ＳＤ）血漿濃度−時間プロファイルである。 抗ＩＬ−６Ｒナノボディのｉｎ ｖｉｖｏ効能の評価に関するカニクイザル内のＣＲＰのレベルである。 ＥＬＩＳＡを用いて、参照Ｆａｂ及び参照ＩｇＧ（参考例１及び配列番号６２９〜配列番号６３２を参照）と比較したナノボディのパネルのエピトープ特異性の分析を示す図である。 ＥＬＩＳＡを用いて、参照Ｆａｂ及び参照ＩｇＧ（参考例１及び配列番号６２９〜配列番号６３２を参照）と比較したナノボディのパネルのエピトープ特異性の分析を示す図である。 ＥＬＩＳＡを用いて、参照Ｆａｂ及び参照ＩｇＧ（参考例１及び配列番号６２９〜配列番号６３２を参照）と比較したナノボディのパネルのエピトープ特異性の分析を示す図である。 ビアコアを用いて、参照Ｆａｂ（実施例２９の初めの段落を参照）と比較したナノボディのパネルのエピトープ特異性の分析を示す図である。 プラズマ中に存在する、ヒト、アカゲザル及びカニクイザルの可溶性ＩＬ−６ＲへのヒトＩＬ−６の結合を阻害する抗ＩＬ−６Ｒナノボディの効力を示す図である。 プラズマ中に存在する、ヒト、アカゲザル及びカニクイザルの可溶性ＩＬ−６ＲへのヒトＩＬ−６の結合を阻害する抗ＩＬ−６Ｒナノボディの効力を示す図である。 プラズマ中に存在する、ヒト、アカゲザル及びカニクイザルの可溶性ＩＬ−６ＲへのヒトＩＬ−６の結合を阻害する抗ＩＬ−６Ｒナノボディの効力を示す図である。 プラズマ中に存在する、ヒト、アカゲザル及びカニクイザルの可溶性ＩＬ−６ＲへのヒトＩＬ−６の結合を阻害する抗ＩＬ−６Ｒナノボディの効力を示す図である。
実験部
インターロイキン−６（ＩＬ−６）は、炎症、免疫応答及び造血の調節を含む多くの生理的プロセスに関与する多面的サイトカインである。ＩＬ−６は２つの膜分子、すなわち８０ｋＤａのリガンド結合鎖（ＩＬ−６Ｒ）及び非リガンド結合シグナル伝達物質ｇｐ１３０を介してその生物活性を発揮する。ＩＬ−６−ＩＬ−６Ｒ−ｇｐ１３０情報伝達複合体の形成は、順次に起こる。まずＩＬ−６が、相互作用部位Ｉを介してＩＬ−６Ｒに結合する（Ｋｄ：約１０ｎＭ）。次の段階では、この複合体が相互作用部位ＩＩ及びＩＩＩを介してｇｐ１３０に結合する（Ｋｄ：０．８ｎＭ）。相互作用部位ＩＩ及びＩＩＩは、ＩＬ−６及びＩＬ−６Ｒの両方の残基を含む複合部位である。ＩＬ−６及びＩＬ−６Ｒは単独ではｇｐ１３０に対する検出可能な親和性を有しない。ＩＬ−６−ＩＬ−６Ｒ−ｇｐ１３０複合体の正確な化学量論比及び組成は未だ論争中である。ＩＬ−６−ＩＬ−６Ｒ−ｇｐ１３０複合体の結晶構造は解明されており（Boulanger （2003） Science 300, 2101-2104）、２：２：２の化学量論比が示唆されている。膜結合ＩＬ−６Ｒに加えて、可溶型（ｓＩＬ−６Ｒ）がタンパク質分解的切断（ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７）又は選択的スプライシングにより生成され得る。ＩＬ−６とｓＩＬ−６Ｒとの複合体もｇｐ１３０に結合することができる。興味深いことに、これは内因性ＩＬ−６Ｒを発現しない細胞においても起こる。結果として、ｓＩＬ−６Ｒタンパク質を放出する細胞は、ｇｐ１３０のみを発現する細胞をサイトカインＩＬ−６に対して反応性にする。この機構はトランスシグナル伝達と呼ばれている。
ＩＬ−６の過剰発現は幾つかの臨床的疾患、例えば慢性自己免疫疾患、多発性骨髄腫、キャッスルマン病、閉経後骨粗しょう症及び腎細胞癌の発症に関わっている。今日まで、多数のＩＬ−６シグナル伝達経路阻害剤、例えばＣＮＴＯ−３２８（抗ＩＬ−６ ＭＡｂ、Centocor）、Ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ（抗ＩＬ−６Ｒ ＭＡｂ、Chugai/Roche）及びＣ３２６（抗ＩＬ−６アビマー、Avidia）が開発されている。ＣＮＴＯ−３２８及びＴｏｃｉｌｉｚｕｍａｂは現在、ＭＭ、ＲＣＣ、ＲＡ、ｓｏＪＩＡ、ＣＤ及びＳＬＥに関する臨床試験中である。Ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂはキャッスルマン病の治療用として、２００５年より日本市場で入手可能である（Actemra）。
材料
ヒトＩＬ−６は、大腸菌で産生された組換えタンパク質としてDiacloneから入手した。
ヒトｂｉｏ−ＩＬ−６は、ＰＥによりビオチン化されたヒトＩＬ−６（６ビオチン／分子）としてDiacloneから入手した。
ヒト可溶性ＩＬ−６Ｒは、ＨＥＫ２９３細胞で産生された組換えタンパク質としてPeprotechから、またＳｆ２１細胞で産生された組換えタンパク質としてR&D Systemsから入手した。
ＭＡｂ ＢＲ−６は、Diacloneから入手した抗ＩＬ−６Ｒ中和モノクローナル抗体である。
ＭＡｂ ＢＮ−１２は、Diacloneから入手した抗ＩＬ−６Ｒ非中和モノクローナル抗体である。
ＭＡｂ Ｍ１８２は、BD Biosciencesから入手したビオチン化抗ＩＬ−６Ｒモノクローナル抗体である。
ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）共役ラマＩｇＧ（h&I）抗体は、Bethyl Labsから入手したヤギに生じるラマＩｇＧに対するポリクローナル抗体である。
参照Ｆａｂ及び参照ＩｇＧは下記の参考例に記載のように生成した。
免疫化
２頭のラマ（０８１及び０８２）を表Ｃ−１に概説されるスキームに従って、ヒトＩＬ−６Ｒ（Peprotech）で免疫化した。
プロトコルの終了後、各動物における免疫応答をＥＬＩＳＡにより分析した。そのために、ビオチン化ＩＬ−６Ｒ（２μｇ／ｍＬ）をニュートラアビジン（neutravidin）コートマイクロタイタープレートに捕捉させた。０日、２８日、３９日及び４３日目に採取した血清試料の段階希釈物（開始希釈率：１／５００）を添加し、結合したラマＩｇＧをＨＲＰで標識したヤギ抗ラマＩｇＧの添加により検出した。ＴＭＢを基質として使用した。結果を図１に示す。
免疫応答はＦＡＣＳによっても分析した：０日、２８日及び３９日目に採取した血清試料の段階希釈物（開始希釈率：１／１００）を、Ｕ２６６Ｂ１細胞（ヒト骨髄腫）とインキュベートした。結合したラマＩｇＧをＦＩＴＣで標識したヤギ抗ラマＩｇＧにより検出した。結果を図２に示す。
ライブラリ構築
ラマ０８１及びラマ０８２から得た末梢血リンパ球及びリンパ節から抽出したＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲの出発物質として使用して、遺伝子断片をコードするナノボディを増幅した。これらの断片をファージミドベクターｐＡＸ５０にクローニングした。ファージは標準方法（例えば、従来技術、及び本明細書中に引用されるAblynx N.V.により出願された出願を参照）に従って調製し、濾過滅菌の後、さらなる使用のために４℃で保管する。構築されたライブラリの特性を表Ｃ−２に示す。
セレクション
表Ｃ−３に要約されるような様々な条件を用いて、上記ライブラリによりセレクションを実行した。
全条件についてセレクションを１ラウンドだけ行なった。各々のセレクションのアウトプットを濃縮係数（対照と比較した溶出液中に存在するファージの数）、多様性（ＨｉｎｆＩプロファイリング）及びＩＬ−６Ｒ陽性クローンの割合（ＥＬＩＳＡ）について分析した。これらのパラメータに基づき、さらなる分析のために最良のセレクションを選択した。そのために、各々のセレクションからのアウトプットをプールとして発現ベクターｐＡＸ５１に再クローニングした。コロニーを採取して９６ディープウェルプレート（１ｍＬ容）で培養し、ＩＰＴＧを添加することによりナノボディ発現を誘導した。ペリプラズム抽出液（容量：約８０μＬ）は、標準方法（例えば、従来技術、及び本明細書中に引用されるAblynx N.V.により出願された出願を参照）に従って調製した。
スクリーニング
ペリプラズム抽出液はまず、ＩＬ−６−ＩＬ−６Ｒ相互作用を阻害する能力について分析した。そのために、図３に概略的に示される２つの独立したアルファスクリーンアッセイを設定した。アッセイ１では、ペリプラズム抽出液をビオチン化ＩＬ−６（３ｎＭ）、可溶性ＩＬ−６受容体（１ｎＭ）、ストレプトアビジンコートドナービーズ及びＭＡｂ ＢＮ−１２コートアクセプタービーズ（２０μｇ／ｍＬ）とインキュベートした。このアッセイで陽性のナノボディはＩＬ−６−ＩＬ−６Ｒ相互作用か、ＩＬ−６Ｒ−ＭＡｂ ＢＮ−１２相互作用のいずれかを阻害することができた。これら２つの可能性を区別するために、第２のアッセイを設定した（アッセイ２）。このアッセイでは、ペリプラズム抽出液をｂｉｏ−ＩＬ−６Ｒ（０．３ｎＭ）、ストレプトアビジンコートドナービーズ及びＭＡｂ ＢＮ−１２コートアクセプタービーズ（１０μｇ／ｍＬ）とインキュベートした。アッセイ１では陽性であるがアッセイ２では陰性のナノボディは、ＩＬ−６−ＩＬ−６Ｒ阻害剤であると考えられた。両アッセイではペリプラズム抽出液を、最終濃度の４０ｎＭにほぼ一致する２５倍に希釈した。
これにより抗ＩＬ−６Ｒナノボディの２つの異なるサブクラス、すなわち、
ａ）ＩＬ−６のＩＬ−６Ｒへの結合を調整可能な（例えば部分的に又は完全に低減又は阻止する）ＩＬ−６Ｒに対するナノボディ。本実施例では、これらはＩＬ−６ＲをＭＡｂ ＢＮ−１２に固定化させるセレクションにおいて得られた（このようなナノボディを得る他の方法が当業者には明らかである）。
ｂ）ＩＬ−６ＲのＭＡｂ ＢＮ−１２への結合を調整可能な（例えば部分的に又は完全に低減又は阻止する）ＩＬ−６Ｒに対するナノボディが生じた。本実施例では、これらはＩＬ−６ＲをＭＡｂ ＢＮ−１２に固定化させない代替的なセレクション戦略において得られた（このようなナノボディを得る他の方法が当業者には明らかである）。
スクリーニング努力の統計的概要を表Ｃ−４に示す。最も強い阻害を示すナノボディを、さらなる特性化のために選択した。
ナノボディの発現及び精製
選択されたナノボディを大腸菌において、ｃ−ｍｙｃ、Ｈｉｓ６標識タンパク質として５０ｍＬの培養物量で発現させた。発現を１ｍＭのＩＰＴＧの添加により誘導し、３７℃で４時間継続させた。細胞培養物の回転（spinning）後、ペリプラズム抽出液を沈殿を凍結融解することにより調製した。この抽出液を出発物質として固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）に使用した。ナノボディを１５０ｍＭのイミダゾールでカラムから溶出させ、続いてＰＢＳに対して透析した。全収率及び細胞培養物１リットル当たりの収率を表Ｃ−５に記載する。
精製ナノボディのＳＤＳ−ＰＡＧＥを図４に示す。
一価ナノボディの特性化
便宜上、一価クローンの名前を変更した。概要を下記の表Ｃ−６に示す。
ａ）ビアコアにおけるＩＬ−６Ｒへの結合
最も強い阻害を示すナノボディを、ビアコア上での解離速度分析及びＤＮＡシークエンシングのために選択した（図５及び表Ｃ−７）。
１４個の抑制性ナノボディ及び（ＩＬ−６とＩＬ−６Ｒとの相互作用を阻害しない）３個の対照ナノボディのサブセットを、細胞ベースのアッセイにおけるさらなる分析のために選択した。この選択されたナノボディサブセットのタンパク質配列を図６に示す。
これら１４個の抑制性ナノボディの個々の親和定数（Ｋｄ）を、ビアコア３０００機器上で表面プラズモン共鳴により求めた。要するに、ＩＬ−６ＲをＣＭ５センサーチップに８００ＲＵ〜１０００ＲＵの濃度でアミンカップリングする。残存する反応基を不活化する。ナノボディ結合を０．５ｎＭ〜５０ｎＭの範囲の様々な濃度で評価する。各々の試料を４５μＬ／分の流速で４分間投入して、チップに結合した抗原に結合させる。次に、ナノボディを含まない結合バッファーを同じ流速でチップに送り、結合したナノボディを解離させる。１０分後、残存する結合した分析物を、再生溶液（グリシン／ＨＣｌ、ｐＨ１．５）を投入することにより除去する。異なる濃度のナノボディについて得られる結合曲線を用いてＫｄ値を算出する。表Ｃ−８には、１４個のナノボディから成る選択されたサブセットに関するｋｄ／ｋｏｆｆ値、ｋａ値、及びＫｄ値の概要を示す。
表Ｃ−７ 抗ＩＬ−６Ｒナノボディの解離速度（ビアコア分析から得た）
表Ｃ−８
１４個の抑制性抗ＩＬ−６Ｒナノボディから成る選択されたサブセットに関するｋｄ／ｋｏｆｆ値、ｋａ値、及びＫｄ値の概要
ｂ）Ｕ２６６細胞上のＩＬ−６Ｒへの結合
Ｕ２６６細胞上で発現させた膜結合ＩＬ−６Ｒへの結合をＦＡＣＳで分析した。選択されたクローン（ＩＬ−６Ｒ０４、ＩＬ−６Ｒ０９、ＩＬ−６Ｒ１１、ＩＬ−６Ｒ１３、ＩＬ−６Ｒ１４）由来のＩＭＡＣ精製ナノボディについてフローサイトメトリー分析を行なった。ＩＭＡＣ精製ナノボディをＩＬ−６Ｒ陽性Ｕ２６６細胞に添加した。モノクローナル抗ｍｙｃ抗体、続いてＰＥ標識ポリクローナル抗マウス抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories、１１５−１１５−１６４、ロット番号６９８５４）により検出を行った。細胞に結合したナノボディを、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋１０％ＦＢＳ）、続いてモノクローナル抗ｍｙｃ抗体及び／又はＰＥ標識ポリクローナル抗マウス抗体とインキュベートした細胞と比べて蛍光強度の増加が測定された。結果を図７に示す。蛍光強度をＸ軸上に、事象の数はＹ軸上にプロットした。精製した抗ＩＬ−６Ｒ抗体ＢＲ−６が含まれていた。
ｃ）エピトープマッピング
ナノボディをＴｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ−Ｆａｂとの競合に関して分析した。１４個の精製ナノボディを、参照Ｆａｂ／ＩＬ−６Ｒ相互作用の阻害に関してアルファスクリーンで試験した。固定濃度（１００ｎＭ）の精製タンパク質をビオチン化ＩＬ−６Ｒ（１ｎＭ）に添加し、１５分間インキュベートした。続いて、参照Ｆａｂコートアクセプタービーズを添加し、この混合物を１時間インキュベートした。最後に、ストレプトアビジンドナービーズを添加し、１時間のインキュベート（incubator）後、プレートをＥｎｖｉｓｉｏｎマイクロプレートリーダー上で読み取った。ＢＲ−６、ＢＮ−１２及び参照Ｆａｂは基準として含まれていた。表Ｃ−９に示す結果は、参照Ｆａｂと競合して保持される結合（％）として表している。数字が低いほど、競合が大きくなり、エピトープの重複が高度になる。
表Ｃ−９ １４個の選択された抑制性抗ＩＬ−６Ｒナノボディによる参照Ｆａｂ／ＩＬ−６Ｒ相互作用の阻害
ｄ）競合アッセイ／アルファスクリーンにおける拮抗作用
１４個の精製ナノボディを、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ相互作用の阻害に関してアルファスクリーンで試験した。精製タンパク質の段階希釈物（濃度範囲：５００ｎＭ〜１０ｐＭ）をＩＬ−６Ｒ（０．３ｎＭ）に添加し、１５分間インキュベートした。続いて、３ｎＭのｂｉｏ−ＩＬ−６及びＢＮ−１２コートアクセプタービーズを添加し、この混合物を１時間インキュベートした。最後に、ストレプトアビジンドナービーズを添加し、１時間のインキュベート後、プレートをＥｎｖｉｓｉｏｎマイクロプレートリーダー上で読み取った。ＢＲ−６及び参照Ｆａｂは基準として含まれていた。結果を図８、図９及び図１０に示す。用量反応曲線を、４８ｐＭ〜１．７ｎＭの範囲のＩＣ５０値で１４個の全ナノボディについて観察した。図８、図９及び図１０から分かるように、本発明は、このアッセイの条件下で、ＩＬ−６−ＩＬ−６Ｒ相互作用の本質的に完全な（すなわち９０％を超える、好ましくは９５％を超える）阻害を示すナノボディ、又は代替的には、アッセイの条件下で、ＩＬ−６−ＩＬ−６Ｒ相互作用の部分的な（すなわち２５％〜９０％、好ましくは４０％〜７５％の）阻害をもたらすナノボディ（例えばＩＬ−６Ｒ０７）を提供する。
ｅ）細胞ベースのアッセイ（ＸＧ−１）における拮抗作用
精製ナノボディ全てをＸＧ−１アッセイで試験した。ＸＧ−１はＩＬ−６依存性ヒト骨髄腫細胞株である。最大半量の増殖は、約２０ｐｇ／ｍＬのＩＬ−６で達成される。アッセイは基本的に、Zhang et al.（Blood 83: 3654-3663）による記載のように行なった。ＢＲ−６、ＢＮ−１２及び参照Ｆａｂは基準として含まれていた。結果を図１１に概説する。ＩＣ５０値は５０ｎＭ〜９０ｐＭの範囲であり、表Ｃ−１０に示される。
表Ｃ−１０ ＸＧ−１細胞ベースアッセイで測定した１４個の選択された抑制性抗ＩＬ−６ＲナノボディのＩＣ５０値
ｆ）細胞ベースアッセイ（ＴＦ−１）における一価野生型ナノボディの効力
ＴＦ−１細胞（ECACC）株を、２ｍＭのグルタミン、１％ピルビン酸ナトリウム、３ｎｇ／ｍＬのヒトＧＭ−ＣＳＦ（eBiosciences）及び１０％ウシ胎仔血清（Gibco）で補充したＲＰＭＩ １６４０を用いて２〜９×１０００００細胞数／ｍＬに維持した。細胞を週に３回二次培養し、３７％及び５％のＣＯ２雰囲気に維持した。同じバッチのＧＭ−ＣＳＦ（ロット番号Ｅ０１９９９１）及びウシ胎仔血清（ロット番号４１Ｑ４５５６Ｋ）を使用した。
細胞ベースアッセイは、de Hon, F. D., Ehlers, M., Rose-John, S., Ebeling, S. B., Bos, H. K., Aarden, L. A., and Brakenhoff, J. P. （1994） J Exp Med 180, 2395-2400の記載と同様に行なった。細胞懸濁液を２００ｇで５分間遠心分離し、上清を除去した。細胞を２ｍＭのグルタミン、１％ピルビン酸ナトリウム及び１０％ウシ胎仔血清で補充したＲＰＭＩ １６４０に再懸濁し、１２５００細胞数／ウェルの濃度で９６ウェルプレートに播種し、異なる希釈率のナノボディ（登録商標）及び一定量の５００ｐｇ／ｍＬのＩＬ−６と７２時間インキュベートした。９６ウェルプレートを湿潤チャンバにおいてインキュベートした。全試料を三重反復で分析した。ウェル当たりの総容量は２００μＬであった。インキュベーションの最後の６時間、細胞を総容量が２０μＬの０．２μＣｉ／ウェルの３Ｈチミジン（GE Healthcare）でパルス標識した。細胞を半自動セルハーベスター（Ｆｉｌｔｅｒｍａｔｅハーベスター、PerkinElmer）を用いて採取し、Ｔｏｐｃｏｕｎｔ ＮＸＴカウンター（PerkinElmer）を用いて３Hチミジン混入を測定した。結果は１ウェル当たりのカウント毎分（ｃｐｍ）の平均として表す。ＩＣ５０値を表Ｃ−１１に要約する。
表Ｃ−１１ 一価野生型ナノボディのＴＦ−１アッセイにおいて得られるＩＣ５０値
ｇ）ヒト血漿におけるｓＩＬ−６Ｒへの結合
可溶性ヒトＩＬ−６Ｒは、８０ｎｇ／ｍＬ〜４００ｎｇ／ｍＬの範囲で血漿中に存在する（Jones et al, 2001, FASEB Journal 15:43-58）。ナノボディが天然のｓＩＬ−６Ｒに結合するか否かを分析するために、ヒト血漿の存在下で一価ナノボディのＵ２６６細胞への結合を行なった。分析されるナノボディが可溶性ＩＬ−６Ｒに結合することを示す、競合的結合を実証することができた。ヒト血漿の存在下における選択されたクローン（ＩＬ−６Ｒ０３、ＩＬ−６Ｒ０４、ＩＬ−６Ｒ１３）に由来する、一価ＩＭＡＣ精製ナノボディのＵ２６６細胞への結合の阻害を測定した。ヒト血漿の存在下でＩＭＡＣ精製ナノボディをＩＬ−６Ｒ陽性Ｕ２６６細胞に添加した。モノクローナル抗ｍｙｃ抗体、続いてＰＥ標識ポリクローナル抗マウス抗体により検出を行なった。ヒト血漿存在下におけるナノボディの細胞への結合の阻害を、ヒト血漿の非存在下で細胞に結合するナノボディの蛍光強度と比較した蛍光強度の減少により測定した。結果を図１２に示す。蛍光強度をＸ軸上に、事象数をＹ軸上にプロットした。精製された抗ＩＬ−６Ｒ抗体ＢＲ−６が含まれていた。ヒト血漿の存在／非存在下でモノクローナル抗ｍｙｃ抗体、続いてＰＥ標識ポリクローナル抗マウス抗体とインキュベートしたＵ２６６細胞は、バックグラウンド染色対照となった。
ｈ）カニクイザル血漿におけるｓＩＬ−６Ｒへの結合
可溶性ヒトＩＬ−６Ｒは、８０ｎｇ／ｍＬ〜４００ｎｇ／ｍＬの範囲で血漿中に存在する（Jones et al, 2001, FASEB Journal 15:43-58）。ナノボディが天然のｓＩＬ−６Ｒに結合するか否かを分析するために、カニクイザル血漿の存在下で一価ナノボディのＵ２６６細胞への結合を行なった。分析されるナノボディが可溶性ＩＬ−６Ｒに結合することを示す、競合的結合を実証することができた。カニクイザル血漿の存在下における選択されたクローン（ＩＬ−６Ｒ０４、ＩＬ−６Ｒ１３）に由来する、一価ＩＭＡＣ精製ナノボディのＵ２６６細胞への結合の阻害を測定した。カニクイザル血漿の存在下でＩＭＡＣ精製ナノボディをＩＬ−６Ｒ陽性Ｕ２６６細胞に添加した。モノクローナル抗ｍｙｃ抗体、続いてＰＥ標識ポリクローナル抗マウス抗体により検出を行なった。カニクイザル血漿存在下におけるナノボディの細胞への結合の阻害を、カニクイザル血漿の非存在下で細胞に結合するナノボディの蛍光強度と比較した蛍光強度の減少により測定した。結果を図１３に示す。蛍光強度をＸ軸上に、事象数をＹ軸上にプロットした。精製された抗ＩＬ−６Ｒ抗体ＢＲ−６が含まれていた。カニクイザル血漿の存在／非存在下でモノクローナル抗ｍｙｃ抗体、続いてＰＥ標識ポリクローナル抗マウス抗体とインキュベートしたＵ２６６細胞は、バックグラウンド染色対照となった。
ｉ）マウスＩＬ−６Ｒへの交差反応性
マウスＩＬ−６Ｒ（R&D systems、カタログ番号１８３０−ＳＲ／ＣＦ）への結合をＥＬＩＳＡで分析した。ｍａｘｉｓｏｒｐ９６ウェルプレートをマウスＩＬ−６Ｒ（１μｇ／ｍＬ）でコートし、ブロッキングし、ナノボディの希釈系列（５００ｎＭ〜０．１６ｎＭ）とインキュベートした。結合したナノボディをＴＭＢ基質を用いて、抗Ｍｙｃ及び抗マウスホースラディッシュペルオキシダーゼを使用して検出した。結合は全く観察することができなかった。
二重特異性抗ＩＬ−６Ｒナノボディの構築及び発現
１４個の選択されたナノボディは全て、Ｃ末端抗ＨＳＡナノボディ（ＡＬＢ−１）、９つのアミノ酸Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカー及びＮ末端抗ＩＬ−６Ｒナノボディから成る二重特異体（bispecifics）としても発現させた。これらの構築物を、大腸菌においてｃ−ｍｙｃ、Ｈｉｓ６標識タンパク質として発現させ、続いて固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）及びサイズ排除クロマトグラフィー（chromotagraphy）（ＳＥＣ）により培地から精製した。全収率及び細胞培養物１リットル当たりの収率を表Ｃ−１２に記載する。精製ナノボディのＳＤＳ−ＰＡＧＥを図１４に示す。
表Ｃ−１２ 大腸菌における二重特異性抗ＩＬ−６Ｒナノボディの発現収率
二重特異性抗ＩＬ−６Ｒナノボディの特性化
便宜上、二重特異性クローンの名前を変更した。概要を下記の表Ｃ−１３に示す。
表Ｃ−１３ 二重特異性抗ＩＬ−６Ｒナノボディの命名の概要
ａ）ビアコアにおけるＩＬ−６Ｒへの結合
１４個の二重特異性（抗ＩＬ−６Ｒ／抗ＨＳＡ）ナノボディ（表Ｃ−１４）の親和定数（Ｋｄ）を、ビアコア３０００機器上で表面プラズモン共鳴により求めた。要するに、ＩＬ−６ＲをＣＭ５センサーチップに８００ＲＵ〜１０００ＲＵの濃度でアミンカップリングする。残存する反応基を不活化する。ナノボディ結合を０．５ｎＭ〜５０ｎＭの範囲の様々な濃度で評価する。各々の試料を４５μＬ／分の流速で４分間投入して、チップに結合した抗原に結合させる。次に、ナノボディを含まない結合バッファーを同じ流速でチップに送り、結合したナノボディを解離させる。１０分後、残存する結合した分析物を、再生溶液（グリシン／ＨＣｌ、ｐＨ１．５）を投入することにより除去する。異なる濃度のナノボディについて得られる結合曲線を用いてＫｄ値を算出する。表Ｃ−１４には、１４個の二重特異性ナノボディに関するｋｄ／ｋｏｆｆ値、ｋａ値、及びＫｄ値の概要を示す。
表Ｃ−１４ １４個の二重特異性（抗ＩＬ−６Ｒ／抗ＨＳＡ）ナノボディのＩＬ−６Ｒへの結合に関するｋｄ／ｋｏｆｆ値、ｋａ値、及びＫｄ値の概要
ｂ）ビアコアにおけるヒト及びマウス血清アルブミンへの結合
ナノボディ（登録商標）の血清アルブミンへの結合を、ビアコア３０００機器において表面プラズモン共鳴により特性化し、平衡定数ＫＤを求めた。要するに、異なる種に由来する血清アルブミンを、アミンカップリングによりＣＭ５センサーチップ表面に５００個の反応単位の増加が達成されるまで共有結合させた。残存する反応基を不活化した。一連の異なる濃度を用いてナノボディ（登録商標）結合を評価した。各濃度の各ナノボディ（登録商標）を４５μＬ／分の流速で４分間投入し、チップに結合した抗原に結合させた。次に、ナノボディ（登録商標）を含まない結合バッファーを同じ流速でチップに送り、結合したナノボディ（登録商標）を解離させる。１５分後、残存する結合した分析物を、再生溶液（５０ｍＭのＮａＯＨ）を投入することにより除去する。
異なる濃度の各分析物に関して得られたセンサーグラムから、動的データ分析によりＫＤ値を算出した。結果を下記の表Ｃ−１５に示す。
ｃ）Ｕ２６６細胞上でのＩＬ−６Ｒへの結合
選択されたクローン（ＩＬ−６Ｒ２３、ＩＬ−６Ｒ２４、ＩＬ−６Ｒ２９、ＩＬ−６Ｒ３３）由来の二重特異性ＩＭＡＣ精製ナノボディのフローサイトメトリー分析を行なった。ＩＭＡＣ精製ナノボディをＩＬ−６Ｒ陽性Ｕ２６６細胞に添加した。検出はモノクローナル抗ｍｙｃ抗体、続いてＰＥ標識ポリクローナル抗マウス抗体により行なった。細胞へのナノボディの結合を、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋１０％ＦＢＳ）、続いてモノクローナル抗ｍｙｃ抗体及び／又はＰＥ標識ポリクローナル抗マウス抗体とインキュベートした細胞と比較した蛍光強度の増加により測定した。結果を図１５に示す。蛍光強度をＸ軸上に、事象数をＹ軸上にプロットした。精製された抗ＩＬ−６Ｒ抗体ＢＲ−６が含まれていた。
表Ｃ−１５ １４個の二重特異性（抗ＩＬ−６Ｒ／抗ＨＳＡ）ナノボディ（登録商標）のヒト、マウス、カニクイザル、アカゲザル及びヒヒの血清アルブミンへの結合に関するｋｄ／ｋｏｆｆ値、ｋａ値、及びＫｄ値の概要
ｄ）エピトープマッピング
二重特異性ナノボディを参照Ｆａｂとの競合に関して分析した。１４個の精製された二重特異性ナノボディを、参照Ｆａｂ／ＩＬ−６Ｒ相互作用の阻害に関してアルファスクリーンで試験した。固定濃度の精製タンパク質（１００ｎＭ）をビオチン化ＩＬ−６Ｒ（１ｎＭ）に添加し、１５分間インキュベートした。続いて、参照Ｆａｂコートアクセプタービーズを添加し、この混合物を１時間インキュベートした。最後に、ストレプトアビジンドナービーズを添加し、１時間のインキュベート後、プレートをＥｎｖｉｓｉｏｎマイクロプレートリーダー上で読み取った。ＢＲ−６、ＢＮ−１２及び参照Ｆａｂは基準として含まれていた。表Ｃ−１６に示す結果は、参照Ｆａｂと競合して保持される結合（％）として表している。数字が低いほど、競合が大きくなり、エピトープの重複が高度になる。
表Ｃ−１６ 参照Ｆａｂ／ＩＬ−６Ｒ相互作用の１４個の二重特異性（抗ＩＬ−６Ｒ／抗ＨＳＡ）ナノボディによる阻害
ｅ）アルファスクリーンにおける拮抗作用
１４個の精製された二重特異性ナノボディを、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ相互作用の阻害に関してアルファスクリーンで試験した。精製タンパク質の段階希釈物（濃度範囲：５００ｎＭ〜１０ｐＭ）をＩＬ−６Ｒ（０．３ｎＭ）に添加し、１５分間インキュベートした。続いて、３ｎＭのｂｉｏ−ＩＬ−６及びＢＮ−１２コートアクセプタービーズを添加し、この混合物を１時間インキュベートした。最後に、ストレプトアビジンドナービーズを添加し、１時間のインキュベート後、プレートをＥｎｖｉｓｉｏｎマイクロプレートリーダー上で読み取った。ＢＲ−６及び参照Ｆａｂ断片は基準として含まれていた。図１６及び図１７に示す用量反応曲線を、５５ｐＭ〜１．７ｎＭの範囲のＩＣ５０値でナノボディについて観察した（表Ｃ−１７）。
表Ｃ−１７ １４個の二重特異性（抗ＩＬ−６Ｒ／抗ＨＳＡ）ナノボディのＩＣ５０値
ｆ）細胞ベースアッセイ（ＸＧ−１）における拮抗作用
１４個の二重特異性ナノボディ全てをＸＧ−１アッセイで試験した。ＸＧ−１はＩＬ−６依存性ヒト骨髄腫細胞株である。最大半量の増殖は、約２０ｐｇ／ｍＬのＩＬ−６で達成される。アッセイは基本的に、Zhang et al. （Blood 83: 3654-3663）による記載のように行なった。ＢＲ−６、ＢＮ−１２及び参照Ｆａｂは基準として含まれていた。結果を図１８、図１９及び図２０に概説する。ＩＣ５０値は５０ｎＭ〜９０ｐＭの範囲であり、表Ｃ−１８に示される。
表Ｃ−１８ ＸＧ−１細胞ベースアッセイで測定した１４個の二重特異性（抗ＩＬ−６Ｒ／抗ＨＳＡ）ナノボディのＩＣ５０値
ナノボディを１ｍｇ／ｍＬのヒト血清アルブミンの存在下でも分析した。ＩＣ５０値は一価ナノボディについては１７ｎＭ〜１００ｐＭ、二重特異性ナノボディについては３７ｎＭ〜６７０ｐＭの範囲である。結果を図２１及び図２２及び表Ｃ−１９に示す。
表Ｃ−１９ ＸＧ−１細胞ベースアッセイで測定した一価（抗ＩＬ−６Ｒ）ナノボディ及び二重特異性（抗ＩＬ−６Ｒ／抗ＨＳＡ）ナノボディのＩＣ５０値
三価抗ＩＬ−６Ｒナノボディの構築、発現及び精製
ナノボディは中央に９個のアミノ酸Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーを有する異なる構成要素を接合するＮ末端抗ＩＬ−６Ｒナノボディ、Ｃ末端抗ＩＬ−６Ｒナノボディ及び抗ＨＳＡナノボディ（ＡＬＢ−１）から成る三価二重特異体としても発現させた（配列番号４７８〜配列番号４９２）。これらの構成を、大腸菌においてｃ−ｍｙｃ、Ｈｉｓ６標識タンパク質として発現させ、続いて固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により培地から精製した。精製ナノボディのＳＤＳ−ＰＡＧＥを図２３に示す。
三価抗ＩＬ−６Ｒナノボディの特性化
ａ）ビアコア上でのＩＬ−６Ｒへの結合
３個の三価ナノボディの親和定数（Ｋｄ）を、ビアコア３０００機器上で表面プラズモン共鳴により求めた。要するに、ＩＬ−６ＲをＣＭ５センサーチップに８００ＲＵ〜１０００ＲＵの濃度でアミンカップリングする。残存する反応基を不活化する。ナノボディ結合を０．５ｎＭ〜５０ｎＭの範囲の様々な濃度で評価する。各々の試料を４５μＬ／分の流速で４分間投入して、チップに結合した抗原に結合させる。次に、ナノボディを含まない結合バッファーを同じ流速でチップに送り、結合したナノボディを解離させる。１０分後、残存する結合した分析物を、再生溶液（グリシン／ＨＣｌ、ｐＨ１．５）を投入することにより除去する。対応する一価ナノボディＩＬ−６Ｒ０９又は二重特異性ナノボディＩＬ−６Ｒ２９と比較した三価ナノボディＩＬ−６Ｒ４９（配列番号４８０）について、アビジン（Avid）結合を実証することができた（図２４）。
ｂ）Ｕ２６６細胞上のＩＬ−６Ｒへの結合
選択されたクローン（ＩＬ−６Ｒ４４（配列番号４７９）、ＩＬ−６Ｒ５３（配列番号４８１））由来の二重特異性三価ＩＭＡＣ精製ナノボディのフローサイトメトリー分析。ＩＭＡＣ精製ナノボディをＩＬ−６Ｒ陽性Ｕ２６６細胞に添加した。モノクローナル抗ｍｙｃ抗体、続いてＰＥ標識ポリクローナル抗マウス抗体により検出を行った。細胞に結合したナノボディを、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋１０％ＦＢＳ）、続いてモノクローナル抗ｍｙｃ抗体及び／又はＰＥ標識ポリクローナル抗マウス抗体とインキュベートした細胞と比較した蛍光強度の増加により測定した。結果を図２５に示す。蛍光強度をＸ軸上に、事象数はＹ軸上にプロットした。精製された抗ＩＬ−６Ｒ抗体ＢＲ−６が含まれていた。
ｃ）細胞ベースアッセイ（ＸＧ−１）における拮抗作用
精製された三価ナノボディＩＬ−６Ｒ４４、ＩＬ−６Ｒ４９及びＩＬ−６Ｒ５３（配列番号４７９、配列番号４８０及び配列番号４８１）をＸＧ−１アッセイにおいて試験した。ＸＧ−１はＩＬ−６依存性ヒト骨髄腫細胞株である。最大半量の増殖は、約２０ｐｇ／ｍＬのＩＬ−６で達成される。アッセイは基本的に、Zhang et al. （Blood 83: 3654-3663）による記載のように行なった。ＢＲ−６、ＢＮ−１２及び参照Ｆａｂは基準として含まれていた。結果を図２６に概説する。
野生型三価ナノボディ（登録商標）構築物のビアコアにおけるヒト、カニクイザル及びマウスの血清アルブミンへの結合
ナノボディ（登録商標）の血清アルブミンへの結合を、ビアコア３０００機器において表面プラズモン共鳴により特性化し、平衡定数ＫＤを求めた。要するに、異なる種に由来する血清アルブミンを、アミンカップリングによりＣＭ５センサーチップ表面に５００個の反応単位の増加が達成されるまで共有結合させた。残存する反応基を不活化した。一連の異なる濃度を用いてナノボディ（登録商標）結合を評価した。各濃度の各ナノボディ（登録商標）を４５μＬ／分の流速で４分間投入し、チップに結合した抗原に結合させた。次に、ナノボディ（登録商標）を含まない結合バッファーを同じ流速でチップに送り、結合したナノボディ（登録商標）を解離させる。１５分後、残存する結合した分析物を、再生溶液（５０ｍＭのＮａＯＨ）を投入することにより除去した。
異なる濃度の各分析物に関して得られたセンサーグラムから、動的データ分析によりＫＤ値を算出した。結果を下記の表Ｃ−２０に示す。
表Ｃ−２０ 異なる種に由来する血清アルブミンに対する三価二重特異性ナノボディのＫｄ値
ヒト化
ナノボディ（登録商標）ＩＬ−６Ｒ０３、ＩＬ−６Ｒ０４及びＩＬ−６Ｒ１３のヒト化型をコードするＤＮＡ断片を、ＰＣＲ重複伸長法（Stemmer et al., 1995）を用いてオリゴヌクレオチドから組み立てた。異なる変異体の配列を図２７に示す。
ａ）アルファスクリーンにおける拮抗作用
ＩＬ−６Ｒ０３（ＩＬ−６Ｒ６１、ＩＬ−６Ｒ６２、ＩＬ−６Ｒ６３、ＩＬ−６Ｒ６４及びＩＬ−６Ｒ６５；配列番号６０９〜配列番号６１３）、ＩＬ−６Ｒ０４（ＩＬ−６Ｒ７１、ＩＬ−６Ｒ７２、ＩＬ−６Ｒ７３、ＩＬ−６Ｒ７４及びＩＬ−６Ｒ７５；配列番号６１４〜配列番号６１８）及びＩＬ−６Ｒ１３（ＩＬ−６Ｒ８１、ＩＬ−６Ｒ８２、ＩＬ−６Ｒ８３、ＩＬ−６Ｒ８４及びＩＬ−６Ｒ８８；それぞれ配列番号６１９、配列番号６２０、配列番号６２１、配列番号６２２及び配列番号６２６）のヒト化クローンを、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ相互作用の阻害に関してアルファスクリーンで試験した。精製タンパク質の段階希釈物（濃度範囲：５００ｎＭ〜１０ｐＭ）をＩＬ−６Ｒ（０．３ｎＭ）に添加し、１５分間インキュベートした。続いて、３ｎＭ ｂｉｏ−ＩＬ−６及びＢＮ−１２コートアクセプタービーズを添加し、この混合物を１時間インキュベートした。最後に、ストレプトアビジンドナービーズを添加し、１時間のインキュベート後、プレートをＥｎｖｉｓｉｏｎマイクロプレートリーダー上で読み取った。ＢＲ−６及び参照Ｆａｂ断片は基準として含まれていた。用量反応曲線を図２８、図２９、図３０及び図３１に示す。最終の異なるヒト化クローン（ＩＬ−６Ｒ６５、ＩＬ−６Ｒ７５及びＩＬ−６Ｒ８８）とその対応する非ヒト化型（それぞれＩＬ−６Ｒ０３、ＩＬ−６Ｒ０４及びＩＬ−６Ｒ１３）との間に有意な差異は観察されなかった。
ｂ）温度安定性試験
ＩＬ−６Ｒ０３（ＩＬ−６Ｒ６５）、ＩＬ−６Ｒ０４（ＩＬ−６Ｒ７５）及びＩＬ−６Ｒ１３（ＩＬ−６Ｒ８１、ＩＬ−６Ｒ８２、ＩＬ−６Ｒ８３及びＩＬ−６Ｒ８４）のヒト化クローンについて温度安定性試験を行なった。試料を２００μｇ／ｍＬで希釈し、６０μＬを含有する５*２アリコートに分割した。異なるバイアルを各々、３７℃〜９０℃の範囲の所与の温度（３７℃、５０℃、７０℃及び９０℃）で１時間にわたってインキュベートした（蓋の温度：１０５℃）（対照は４℃で保管した）。その後、試料を２５℃に２時間保ち（ランピング速度（ramping rate）：０．０５）、４℃で一晩保管した。１４０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離により沈殿を除去した。上清を慎重に除去し、さらに分析した。２８０ｎｍでのＯＤを測定し、吸光係数に基づいて濃度を算出した。結果を図３２及び図３３に示す。
ｃ）ビアコアにおけるＩＬ−６Ｒへの結合
ＩＬ−６Ｒ０３（ＩＬ−６Ｒ６１、ＩＬ−６Ｒ６２、ＩＬ−６Ｒ６３、ＩＬ−６Ｒ６４及びＩＬ−６Ｒ６５）、ＩＬ−６Ｒ０４（ＩＬ−６Ｒ７１、ＩＬ−６Ｒ７２、ＩＬ−６Ｒ７３、ＩＬ−６Ｒ７４及びＩＬ−６Ｒ７５）及びＩＬ−６Ｒ１３（ＩＬ−６Ｒ８１、ＩＬ−６Ｒ８２、ＩＬ−６Ｒ８３、ＩＬ−６Ｒ８４及びＩＬ−６Ｒ８８）のヒト化クローンを、ビアコア上での解離速度分析及びＤＮＡシークエンシング（表Ｃ−２１及び図２７）のために選択した。
これらのナノボディの親和定数（Ｋｄ）を、ビアコア３０００機器上で表面プラズモン共鳴により求めた。要するに、ＩＬ−６ＲをＣＭ５センサーチップに８００ＲＵ〜１０００ＲＵの濃度でアミンカップリングする。残存する反応基を不活化する。ナノボディ結合を０．５ｎＭ〜５０ｎＭの範囲の様々な濃度で評価した。各々の試料を４５μＬ／分の流速で４分間投入して、チップに結合した抗原に結合させた。次に、ナノボディを含まない結合バッファーを同じ流速でチップに送り、結合したナノボディを解離させた。１０分後、残存する結合した分析物を、再生溶液（グリシン／ＨＣｌ、ｐＨ１．５）を投入することにより除去した。異なる濃度のナノボディについて得られる結合曲線を用いてＫｄ値を算出した。表Ｃ−２１には、ヒト化ナノボディに関するｋｄ値、ｋａ値、及びＫｄ値の概要を示す。
表Ｃ−２１
ヒト化抗ＩＬ−６受容体ナノボディ（登録商標）のヒトＩＬ−６受容体への結合に関するＫＤ値、ｋａ値及びｋｄ値
ヒト化ナノボディの細胞ベースアッセイ（ＸＧ−１）における拮抗作用
ヒト化ナノボディをＸＧ−１アッセイで分析した。ＸＧ−１はＩＬ−６依存性ヒト骨髄腫細胞株である。最大半量の増殖は、約２０ｐｇ／ｍＬのＩＬ−６を用いて達成される。アッセイはZhang et al. （Blood 83: 3654-3663）による記載のように行なった。ＢＲ−６及びＢＮ−１２は基準として含まれていた。結果を図３４に示す。
二価ヒト化ナノボディ及び三価ヒト化ナノボディの構築
ヒト化抗ＩＬ−６Ｒ構成要素及びヒト化抗血清アルブミン構成要素を用いて、ナノボディを二価（配列番号５５９〜配列番号６０２）及び三価（配列番号４９３〜配列番号５５８）構築物に構築した。９個のアミノ酸Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーを使用して、異なる構成要素を連結した。これらの構築物を大腸菌において発現させ、ＰｒｏｔＡ、続いてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により精製した。
ヒト化二価ナノボディ及びヒト化三価ナノボディのビアコアにおけるＩＬ−６Ｒへの結合
二重特異性二価ヒト化ナノボディ及び二重特異性三価ヒト化ナノボディの親和定数（Ｋｄ）、ビアコア３０００機器上で表面プラズモン共鳴により求めた。要するに、ＩＬ−６ＲをＣＭ５センサーチップに８００ＲＵ〜１０００ＲＵの濃度でアミンカップリングした。残存する反応基を不活化した。ナノボディ結合を０．５ｎＭ〜５０ｎＭの範囲の様々な濃度で評価した。各々の試料を４５μＬ／分の流速で４分間投入して、チップに結合した抗原に結合させた。次に、ナノボディを含まない結合バッファーを同じ流速でチップに送り、結合したナノボディを解離させた。１０分後、残存する結合した分析物を、再生溶液（グリシン／ＨＣｌ、ｐＨ１．５）を投入することにより除去した。異なる濃度のナノボディについて得られる結合曲線を用いてＫｄ値を算出した。表Ｃ−２２には、二重特異性ナノボディに関するｋｄ／ｋｏｆｆ値、ｋａ値、及びＫｄ値の概要を示す。
表Ｃ−２２ 二重特異性ヒト化二価ナノボディ及び二重特異性ヒト化三価ナノボディのＩＬ−６Ｒへの結合に関するｋｄ／ｋｏｆｆ値、ｋａ値及びＫｄ値の概要
ヒト化二価ナノボディ及びヒト化三価ナノボディの異なる種に由来する血清アルブミンへの結合
ナノボディ（登録商標）の血清アルブミンへの結合を、ビアコア３０００機器において表面プラズモン共鳴により特性化し、平衡定数ＫＤを求めた。要するに、異なる種に由来する血清アルブミンを、アミンカップリングによりＣＭ５センサーチップ表面に５００個の反応単位の増加が達成されるまで共有結合させた。残存する反応基を不活化した。一連の異なる濃度を用いてナノボディ（登録商標）結合を評価した。各濃度の各ナノボディ（登録商標）を４５μＬ／分の流速で４分間投入し、チップに結合した抗原に結合させた。次に、ナノボディ（登録商標）を含まない結合バッファーを同じ流速でチップに送り、結合したナノボディ（登録商標）を解離させた。１５分後、残存する結合した分析物を、再生溶液（５０ｍＭのＮａＯＨ）を投入することにより除去した。
異なる濃度の各分析物に関して得られたセンサーグラムから、動的データ分析によりＫＤ値を算出した。結果を下記の表Ｃ−２３に示す。
表Ｃ−２３ ヒト化二価ナノボディ及びヒト化三価ナノボディの異なる種に由来する血清アルブミンへの結合に関するｋｄ／ｋｏｆｆ値、ｋａ値及びＫｄ値の概要
細胞ベースアッセイ（ＴＦ−１）における拮抗作用
ＴＦ−１細胞（ECACC）株を、２ｍＭのグルタミン、１％ピルビン酸ナトリウム、３ｎｇ／ｍＬのヒトＧＭ−ＣＳＦ（eBiosciences）及び１０％ウシ胎仔血清（Gibco）で補充したＲＰＭＩ １６４０を用いて２〜９×１０００００細胞数／ｍＬに維持する。細胞を週に３回二次培養し、３７％及び５％のＣＯ２雰囲気に維持する。同じバッチのＧＭ−ＣＳＦ（ロット番号Ｅ０１９９９１）及びウシ胎仔血清（ロット番号４１Ｑ４５５６Ｋ）を使用した。
細胞ベースアッセイは、de Hon, F. D., Ehlers, M., Rose-John, S., Ebeling, S. B., Bos, H. K., Aarden, L. A., and Brakenhoff, J. P. （1994） J Exp Med 180, 2395-2400の記載と同様に行なった。細胞懸濁液を２００ｇで５分間遠心分離し、上清を除去した。細胞を２ｍＭのグルタミン、１％ピルビン酸ナトリウム及び１０％ウシ胎仔血清で補充したＲＰＭＩ １６４０に再懸濁し、１２５００細胞数／ウェルの濃度で９６ウェルプレートに播種し、異なる希釈率のナノボディ（登録商標）及び一定量の５００ｐｇ／ｍＬのＩＬ−６と７２時間インキュベートした。９６ウェルプレートを湿潤チャンバにおいてインキュベートした。全試料を三重反復で分析した。ウェル当たりの総容量は２００μＬであった。インキュベーションの最後の６時間、細胞を総容量が２０μＬの０．２μＣｉ／ウェルの３Ｈチミジン（GE Healthcare）でパルス標識した。細胞を半自動セルハーベスター（Ｆｉｌｔｅｒｍａｔｅハーベスター、PerkinElmer）を用いて採取し、Ｔｏｐｃｏｕｎｔ ＮＸＴカウンター（PerkinElmer）を用いて３Ｈチミジン混入を測定した。結果は１ウェル当たりのカウント毎分（ｃｐｍ）の平均として表す。ＩＣ５０値を表Ｃ−２４に要約する。
表Ｃ−２４ ヒト化二価ナノボディ及びヒト化三価ナノボディのＴＦ−１アッセイにおいて得られるＩＣ５０値
血清アルブミンの存在下の細胞ベースＴＦ−１アッセイにおける拮抗作用
二価及び三価ナノボディのＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ相互作用を遮断する可能性を試験するために、ＩＬ−６感受性ＴＦ１赤白血病細胞株を用いて増殖アッセイを行なった。要するに、（１％血清アルブミンでプレインキュベートした）ナノボディの段階希釈物を、固定濃度のＩＬ−６（２００ｐｇ／ｍＬ）の存在下で、１．２５×１０４個のＴＦ−１細胞に三重反復で添加した。７２時間のインキュベーション後、細胞を０．５μＣｉの［３Ｈ］チミジンでパルス標識し、さらに６時間インキュベートした後−８０℃で凍結させた。細胞を続いて融解し、セルハーベスター（Perkin Elmer Life Sciences, Wellesley, MA, USＡ）を用いてガラス繊維膜に包埋した。水で数回洗浄した後、フィルタを風乾し、γ−カウンター（Perkin Elmer Life Sciences）を用いてカウントした。ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ相互作用を中和すると知られているモノクローナル抗体ＢＲ−６を陽性対照として使用した。非中和モノクローナル抗体ＢＮ−１２を陰性対照として使用した。結果を表Ｃ−２５に要約した。
表Ｃ−２５ 二価抗ＩＬ−６Ｒナノボディ及び三価抗ＩＬ−６ＲナノボディによるＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ相互作用の阻害のＩＣ５０値
抗ｈＩＬ−６ＲナノボディのカニクイザルＩＬ−６Ｒ陽性細胞への結合
抗ヒトＩＬ−６ＲナノボディがカニクイザルＩＬ−６Ｒを認識可能か否か検証するために、カニクイザルＩＬ−６Ｒで安定してトランスフェクトされるＣＨＯ−Ｋ１細胞への結合を、フローサイトメトリーにより評価した。
細胞結合アッセイは、初めに２０００００個の細胞を精製ナノボディとインキュベートすることにより実行した。インキュベーション後、細胞をＦＡＣＳバッファーで洗浄した。続いて、細胞をフィコエリトリン標識したウサギ抗ＶＨＨ抗血清とインキュベートした。死細胞から生じるシグナルを除外するために、ＴＯＰＲＯ−３（Invitrogen）染色を実行した。最後に、細胞をＢＤ ＦＡＣＳＡｒｒａｙバイオアナライザーシステム（BD Biosciences）上で分析した。
図３５はフローサイトメトリー分析で測定された、ナノボディ構築物のカニクイザルＩＬ−６ＲトランスフェクトＣＨＯ−Ｋ１細胞への結合を示している。構築物ＩＬ−６Ｒ２４、ＩＬ−６Ｒ４４、ＩＬ−６Ｒ２０２及びＩＬ−６Ｒ２０３が、任意の構築物の非存在下でＦＡＣＳバッファーのみだけでなく、ナノボディ構築物の検出に使用される全ての適切な検出剤とインキュベートした細胞の蛍光強度と比較して、明らかに識別できる蛍光強度のシフトを示すことが分かる。
カニクイザルＩＬ−６Ｒへの結合に関してヒトＩＬ−６と競合する抗ヒトＩＬ−６Ｒナノボディ
発現されたナノボディの、ヒトＩＬ−６のカニクイザルＩＬ−６Ｒへの結合を遮断する能力を評価するために、ヒトＩＬ−６競合的均一系（homogeneous）細胞ベースアッセイを行なった。ＦＭＡＴ ８２００ ＨＴＳシステム（Applied Biosystems）アッセイを以下のように行なった：カニクイザルＩＬ−６Ｒを安定して発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を、０．２５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）トリプシンを用いて分離し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、グルタミン、及びペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩに懸濁した。６０μＬアリコート（４×１０３個の細胞）をＦＭＡＴシステム３８４ウェルプレート（PE Biosystems, CA）にプレーティングし、２４時間接着させた。一晩の接着後、プレートを軽く叩いて培養上清を除去した。競合的スクリーニングを開始するために、細胞含有ＦＭＡＴシステム３８４ウェルプレート（PE Biosystems, CＡ）に２０μＬのＡＬＥＸＡ６４７標識ヒトＩＬ−６（最終濃度：６２５ｐＭ）及び２０μＬのナノボディ又は冷（cold）ｈＩＬ−６希釈物を添加した。１０時間のインキュベーション後、プレートをスキャンした。ウェルは５０カウントを超える事象を有する場合、陽性と見なされた。図３６及び図３７は、競合的ＦＭＡＴにより測定された、抗ｈＩＬ−６ＲナノボディのｈＩＬ−６のカニクイザルＩＬ−６Ｒへの結合を遮断する能力を測定する実験の結果を示している。構築物ＩＬ−６Ｒ２０２及びＩＬ−６Ｒ２０３が、ｈＩＬ−６のカニクイザルＩＬ−６Ｒへの結合と明らかに競合することが分かる。陽性対照の冷ｈＩＬ−６は、予想されるように、明らかに識別できるＡＬＥＸＡ６４７標識ｈＩＬ−６との競合を示す。
抗ＩＬ−６Ｒナノボディ−ヒト血清アルブミン融合タンパク質の構築
ＨＳＡを遺伝子集積により構築し、ＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ断片としてｐＰＩＣＺαＡにクローニングした。
ＮＢ０４−ＨＳＡ融合タンパク質を生成するために、ＮＢ０４をプライマー対：５'−ＧＧＧＴＡＴＣＴＣＴＣＧＡＧＡＡＡＡＧＡＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧ−３'及び５'−ＴＣＴＣＴＴＣＴＣＣＴＡＧＧＴＣＴＴＴＧＡＡＴＣＴＧＴＧＧＧＣＧＡＣＴＴＣＡＧＡＴＴＴＡＴＧＡＧＣＡＴＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＴＧ−３'を用いてＰＣＲにより増幅した。
得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ４ＴＯＰＯにクローニングし、ＨＳＡのＮ末端でＩＬ−６Ｒ０４をクローニングにするのに使用した。これに、ｐＰＩＣＺαＡ ＨＳＡ及びＴＯＰＯ ＮＢ０４−ＮをＸｈｏＩ及びＡｖｒＩＩで消化し、ライゲーションした。
リンカーを間に介在させてＮＢ０４をＨＳＡのＣ末端に接合するために、以下のｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲを行なった：ＮＢ０４をまず、プライマー対：５'−ＧＴＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＣＡＧＴＧＧＡＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＧＧＴＣＡＧＧＡＧＧＴＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧ−３'及び５'−ＴＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＴＡＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＴＧ−３'を用いたＰＣＲにより増幅した。
Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーを挿入するために、プライマー対５'−ＴＴＧＧＴＴＧＣＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＧＣＣＧＣＡＣＴＴＧＧＴＴＴＧＧＧＴＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＣＡＧＴＧ−３'及び５'−ＴＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＴＡＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＴＧ−３'を使用して、得られた産物で第２のＰＣＲを行った。
得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ４ＴＯＰＯにクローニングし、ＨＳＡのＣ末端でＮＢ０４をクローニングするのに使用した。これに、ｐＰＩＣＺαＡ ＨＳＡ及びＴＯＰＯ ＮＢ０４−ＣをＮｏｔＩ及びＳｆｉＩで消化し、互いにライゲーションした。
フローサイトメトリー分析におけるＩＬ−６Ｒ０４−ＨＳＡ及びＨＳＡ−ＩＬ−６Ｒ０４のＩＬ−６Ｒ陽性細胞株への結合
ＩＬ−６Ｒ陽性ヒト多発性骨髄腫細胞株Ｕ２６６の結合に関する試験を、陽性対照として市販のマウス抗ヒトＩＬ−６Ｒ抗体ＢＲ−６及びＢＮ−１２を使用し、精製されたＩＬ−６Ｒ０４−ＨＳＡ（配列番号６０４）、ＨＳＡ−ＩＬ−６Ｒ０４（配列番号６０３）及びＩＬ−６Ｒ０４（配列番号４４０）を用いて実行した。
細胞結合アッセイは、初めに２０００００個の細胞を５ｎＭの精製ナノボディ−ＨＳＡ融合タンパク質とインキュベートすることにより実行した。インキュベーション後、細胞をＦＡＣＳバッファーで洗浄した。続いて、細胞をフィコエリトリン標識したウサギ抗ＶＨＨ抗血清とインキュベートした。死細胞から生じるシグナルを除外するために、ＴＯＰＲＯ−３（Invitrogen）染色を実行した。最後に、細胞をＢＤ ＦＡＣＳＡｒｒａｙバイオアナライザーシステム（BD Biosciences）上で分析した。
図３８はフローサイトメトリー分析で測定された、ナノボディ−ＨＳＡ融合構築物のＵ２６６細胞への結合を示している。陽性対照のＢＲ−６及びＢＮ−１２は、予想されるように、それぞれの対照（抗ＩｇＧＰＥ）と比較して、蛍光強度の明らかに識別できるシフトを示す。試験されたＩＬ−６Ｒ０４−ＨＳＡ及びＨＳＡ−ＩＬ−６Ｒ０４は、任意の構築物の非存在下でＦＡＣＳバッファーのみだけでなく、ナノボディ構築物の検出に使用される全ての適切な検出剤とインキュベートした細胞の蛍光強度と比較して、蛍光強度のシフトから示唆されるようにＩＬ−６Ｒ−陽性Ｕ２６６細胞への結合を示す。ＩＬ−６Ｒ０４−ＨＳＡ、ＨＳＡ−ＩＬ−６Ｒ０４及び一価ＩＬ−６Ｒ０４ナノボディの間ではＵ２６６細胞への結合に明らかな差異は観察されかった。
表面プラズモン共鳴（ビアコア）による動的解離速度定数のスクリーニング
抗ＩＬ−６Ｒナノボディ−ＨＳＡ構築物の親和定数（Ｋｄ）を、ビアコア３０００機器上で表面プラズモン共鳴により求めた。要するに、ＩＬ−６ＲをＣＭ５センサーチップに８００ＲＵ〜１０００ＲＵの濃度でアミンカップリングする。残存する反応基を不活化する。ナノボディ結合を０．５ｎＭ〜５０ｎＭの範囲の様々な濃度で評価する。各々の試料を４５μＬ／分の流速で４分間投入して、チップに結合した抗原に結合させる。次に、ナノボディを含まない結合バッファーを同じ流速でチップに送り、結合したナノボディを解離させる。１０分後、残存する結合した分析物を、再生溶液（グリシン／ＨＣｌ、ｐＨ１．５）を投入することにより除去する。異なる濃度のナノボディについて得られる結合曲線を用いてＫｄ値を算出する。結合特性を表Ｃ−２６に要約する。
表Ｃ−２６ ｈＩＬ−６Ｒと抗ＩＬ−６Ｒナノボディ−ＨＳＡ構築物との相互作用の表面プラズモン共鳴測定
抗ＩＬ−６Ｒナノボディ−アルブミン融合体（fusion）は赤白血病細胞株ＴＦ１のｈＩＬ−６誘導増殖を遮断することができる
抗ＩＬ−６Ｒナノボディ−アルブミン融合体のＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ相互作用を遮断する可能性を試験するために、ＩＬ−６感受性ＴＦ１赤白血病細胞株を用いて増殖アッセイを行なった。要するに、抗ＩＬ−６Ｒナノボディ−アルブミン融合体の段階希釈物を、固定濃度のＩＬ−６（２００ｐｇ／ｍＬ）の存在下で、１．２５×１０４個のＴＦ−１細胞に三重反復で添加した。７２時間のインキュベーション後、細胞を０．５μＣｉの［３Ｈ］チミジンでパルス標識し、さらに６時間インキュベートした後−８０℃で凍結させた。細胞を続いて融解し、セルハーベスター（Perkin Elmer Life Sciences, Wellesley, MA, USＡ）を用いてガラス繊維膜に包埋した。水で数回洗浄した後、フィルタを風乾し、γ−カウンター（Perkin Elmer Life Sciences）を用いてカウントした。ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ相互作用を中和すると知られているモノクローナル抗体ＢＲ−６を陽性対照として使用した。非中和モノクローナル抗体ＢＮ−１２を陰性対照として使用した。
図３９に示すように、ＩＬ−６Ｒ０４−ＨＳＡ及びＨＳＡ−ＩＬ−６Ｒ０４の両方が、ＴＦ１細胞のＩＬ−６依存性増殖を効率的に遮断することができる。予想されるように、抗体ＢＲ−６はＴＦ１細胞のＩＬ−６依存性増殖を効率的に遮断したが、ＢＮ−１２は全く効果を有しなかった。
多価ナノボディ−アルブミン融合タンパク質型の生成
ナノボディ−アルブミン分子の生物学的効果を潜在的に増加するために、二価融合体をを生成し、それにより血清アルブミンのＮ末端側で２つのナノボディを融合する。異なる長さのアミノ酸リンカーペプチドを用いてナノボディを頭尾融合する。
ここで、３ Ａｌａ、９（ＧＳ）又は２０（ＧＳ）アミノ酸リンカーペプチドにより隔てられる２つの同一抗ＩＬ−６Ｒナノボディから成る、二価ナノボディ−アルブミン融合タンパク質の構築及び特性化を説明する。ナノボディＩＬ−６Ｒ２０１をコードするＤＮＡ断片を頭尾遺伝子連結し、そのＮ末端側でヒト血清アルブミンと融合することで、構築物ＩＬ−６Ｒ２０１−ＨＳＡ（配列番号６０５）、ＩＬ−６Ｒ２０１−ＡＡＡ−ＩＬ−６Ｒ２０１−ＨＳＡ（配列番号６０８）、ＩＬ−６Ｒ２０１−９ＧＳ−ＩＬ−６Ｒ２０１−ＨＳＡ（配列番号６０６）、ＩＬ−６Ｒ２０１−２０ＧＳ−ＩＬ−６Ｒ２０１−ＨＳＡ（配列番号６０７）を生じた。全てのナノボディ−アルブミン融合タンパク質を振盪フラスコ又は発酵槽内で、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）において発現させた。５０ｍｇ／Ｌを超える産生レベルが得られた。
ナノボディのアルブミンへの融合はその血中半減期を増大させる
ＨＳＡ融合ナノボディの薬物動態学的研究をＢａｌｂ／ｃマウスにおいて実施した。マウスは好ましくは８週齢〜１２週齢である。ナノボディＩＬ−６Ｒ０４−ＨＳＡ及びナノボディＨＳＡ−ＩＬ−６Ｒ０４から薬物動態プロファイルを試験した。ナノボディを３匹のマウスに注射した。マウスに２００μｇ／２００μＬを静脈内注入により投与した。血液試料を注入の開始後１５分、１時間、２時間、４時間、８時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、８日及び１５日目に採取した。１回のサンプリングにつき１００μＬの全血を採取し、血清を３７℃で１時間のインキュベーション後単離した。血漿試料は−２０℃で保管する。
半減期延長ナノボディの血漿レベルを求めるために血清試料を試験した。
マイクロタイタープレート（Maxisorb）にＰＢＳ中０．５μｇ／ｍＬのｓＩＬ−６Ｒ（Prepotech）を、１００μｌ／ウェルで４℃で一晩コートする。プレートを０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳで洗浄し、１％カゼインを含有するＰＢＳで室温で２時間ブロッキングする。次に、血漿試料を非コートプレートにおいて希釈し、３０分間室温でインキュベートする。その後、全希釈物１００μＬをコートプレートに移し、室温で１時間結合させる。１時間後、プレートを洗浄し、１％カゼインを含有するＰＢＳで１／２０００に希釈したビオチン化ヤギ抗ヒトアルブミンを１ウェル当たり１００μＬ添加する。室温で３０分のさらなるインキュベーション後、ウェルを洗浄し、１％カゼインを含有するＰＢＳで１／２０００に希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ共役ストレプトアビジンを１００μＬ添加する。この酵素は基質のｓｌｏｗ ＴＭＢとの化学反応を触媒し、比色の変化をもたらす。この反応をＨＣｌで停止した後、色の強度を分光光度計により測定して、４５０ｎｍの光波長を用いて反応産物の光学濃度を求めることができる。
血漿試料中の半減期延長ナノボディ濃度を標準曲線に関して求める。濃度決定は可変勾配（variable slope）を有するＳ字型用量反応曲線により求められる。
図４０はアルブミン融合体が一価ナノボディ標的ＩＬ−６Ｒ（ＩＬ−６Ｒ−ＨＳＡ）の半減期を延長することを示し、当該半減期は１．１０日であると求められた。
ＨＳＡ−ＩＬ−６Ｒ０４に対する半減期は１．０日であると求められた。
非フォーマット化ナノボディは最初の１時間以内に消失し、ヒトアルブミンとの融合による半減期の増大は２５倍を超える。
カニクイザルにおける薬物動態プロファイル
ＩＬ−６Ｒ２０２、ＩＬ−６Ｒ２０３及びＩＬ−６Ｒ０４−ＨＳＡの薬物動態学的研究をカニクイザルにおいて実施した。ナノボディを左腕又は右腕の橈側皮静脈にボーラス注射（１．０ｍＬ／ｋｇ、およそ３０秒）で静脈内投与し、２．０ｍｇ／ｋｇの投与量とした。表Ｃ−２７は全てのサルに対する投与計画の要約である。
表Ｃ−２７ 全動物の投与計画
血漿試料における抗ＩＬ−６Ｒナノボディ濃度を以下のように求める。
ａ）血漿試料におけるＩＬ−６Ｒ０４−ＨＳＡの免疫検出
Ｍａｘｉｓｏｒｂマイクロタイタープレート（Nunc、商品番号４３０３４１）を０．５μｇ／ｍＬのｓＩＬ−６Ｒ（Peprotech、商品番号２０００６Ｒ）のＤＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）１００μＬで４℃で一晩コートした。コート後、プレートを３回洗浄し（０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）、１％カゼインを含有するＰＢＳ（２５０μＬ／ウェル）で室温（ＲＴ）で２時間ブロッキングした。血漿試料及びナノボディ標準の段階希釈物（１００％プールブランクカニクイザル血漿中でスパイクした）を（別個の非コートプレートにおいて）ＰＢＳで希釈し、ＰＢＳ中１０％プールカニクイザル血漿から成る最終試料マトリクスにおいて所望の濃度／希釈率を得た。全ての前希釈物を非コートプレートにおいて室温で３０分間インキュベートした。ブロッキング工程後、コートプレートを３回洗浄し（０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）、及びアリコートの各試料希釈物（１００μＬ）をコートプレートに移し、室温で１時間結合させる。試料のインキュベーション後、プレートを３回洗浄し（０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）、（０．１％カゼインを含有するＰＢＳで）１／２０００に希釈したポリクローナルヤギ抗ヒト血清アルブミン（Nordic Immunology、商品番号５１８４）１００μＬとインキュベートした。室温で１時間後、プレートを３回洗浄し（０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）、（１％カゼインを含有するＰＢＳで）１／２０００に希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ共役ストレプトアビジン（DaktoCytomation、商品番号Ｐ０３９７）１００μＬとインキュベートした。３０分後、プレートを３回洗浄し（０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）、１００μＬのｓｌｏｗ ＴＭＢ（Pierce、商品番号３４０２４）とインキュベートした。２０分後、反応を１００μＬのＨＣｌ（１Ｎ）で停止した。各ウェルの吸光度を４５０ｎｍ（Ｔｅｃａｎ Ｓｕｎｒｉｓｅ分光光度計）で測定し、６２０ｎｍで吸光度を補正した。このアッセイにより遊離ナノボディ及びｓＩＬ−６Ｒに結合したＩＬ−６Ｒ０４−ＨＳＡナノボディを測定する。それぞれのナノボディの可変勾配を有するＳ字型標準曲線に基づき、各々の血漿試料における濃度を求めた。ＩＬ−６Ｒ０４−ＨＳＡのＬＬＯＱ及びＵＬＯＱはそれぞれ、２．００ｎｇ／ｍＬ及び１００ｎｇ／ｍＬであった。個々の血漿試料を各々、３つの独立したアッセイで分析し、薬物動態データ分析に関して平均血漿濃度を算出した。
ｂ）血漿試料におけるＩＬ−６Ｒ２０２及びＩＬ−６Ｒ２０３の免疫検出
Ｍａｘｉｓｏｒｂマイクロタイタープレート（Nunc、商品番号４３０３４１）を５μｇ／ｍＬの１２Ｂ２−ＧＳ９−１２Ｂ２（Ｂ２＃１３０２ｎｒ４．３．９）重炭酸イオン緩衝溶液（５０ｍＭ、ｐＨ９．６）１００μＬで４℃で一晩コートした。コート後、プレートを０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳで３回洗浄し、１％カゼインを含有するＰＢＳ（２５０μＬ／ウェル）で室温（ＲＴ）で２時間ブロッキングした。血漿試料及びナノボディ標準の段階希釈物（１００％プールブランクカニクイザル血漿中でスパイクした）を別個の非コートプレート（Nunc、商品番号２４９９４４）においてＰＢＳで希釈し、ＰＢＳ中１０％プールカニクイザル血漿から成る最終試料マトリクスにおいて所望の濃度／希釈率を得た。全ての前希釈物を非コートプレートにおいて室温で３０分間インキュベートした。ブロッキング工程後、コートプレートを３回洗浄し（０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）、及びアリコートの各試料希釈物（１００μＬ）をコートプレートに移し、室温で１時間結合させた。試料のインキュベーション後、プレートを３回洗浄し（０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）、１００ｎｇ／ｍＬのｓＩＬ−６のＰＢＳ溶液（Peprotech、商品番号２０００６Ｒ）１００μＬと室温で１時間インキュベートした。室温で１時間後、プレートを３回洗浄し（０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）、１％カゼインを含有するＰＢＳ中２５０ｎｇ／ｍＬのビオチン化ポリクローナル抗ＩＬ−６Ｒ抗体の溶液（R&D systems、商品番号ＢＡＦ２２７）１００μＬとインキュベートした。３０分のインキュベーション（室温）後、プレートを３回洗浄し（０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）、（１％カゼインを含有するＰＢＳで）１／５０００に希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ共役ストレプトアビジン（DaktoCytomation、商品番号Ｐ０３９７）１００μＬと３０分間インキュベートした（室温）。３０分後、プレートを３回洗浄し（０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）、１００μＬのｓｌｏｗ ＴＭＢ（Pierce、商品番号３４０２４）とインキュベートした。２０分後、反応を１００μＬのＨＣｌ（１Ｎ）で停止した。各ウェルの吸光度を４５０ｎｍ（Ｔｅｃａｎ Ｓｕｎｒｉｓｅ分光光度計）で測定し、６２０ｎｍで吸光度を補正した。このアッセイにより遊離ナノボディ及びｓＩＬ−６Ｒ及び／又はカニクイザル血清アルブミンに結合したナノボディを測定する。それぞれのナノボディの可変勾配（variable slope）を有するＳ字型標準曲線に基づき、各々の血漿試料における濃度を求めた。ＩＬ−６Ｒ２０２のＬＬＯＱ及びＵＬＯＱはそれぞれ、７．００ｎｇ／ｍＬ及び３００ｎｇ／ｍＬであった。ＩＬ−６Ｒ２０３のＬＬＯＱ及びＵＬＯＱはそれぞれ、２．００ｎｇ／ｍＬ及び７０．０ｎｇ／ｍＬであった。
個々の血漿試料を各々、２つの独立したアッセイで分析し、薬物動態データ分析に関して平均血漿濃度を算出した。
ＩＬ−６Ｒ０４−ＨＳＡ（２．０ｍｇ／ｋｇ）、ＩＬ−６Ｒ２０２又はＩＬ−６Ｒ２０３の静脈内投与後に観察された平均血漿濃度−時間プロファイル（±ＳＤ）を図４１に示す。
オス及びメスのカニクイザルにおける２．００ｍｇ／ｋｇでの単回静脈内投与後のＩＬ−６Ｒ０４−ＨＳＡ、ＩＬ−６Ｒ２０２及びＩＬ−６Ｒ２０３の基本薬物動態パラメータをそれぞれ表Ｃ−２８、表Ｃ−２９及び表Ｃ−３０に記載する。全てのパラメータを、中央コンパートメントからの消失を含む２コンパートメントモデリング（two-compartmental modeling）により算出した。
表Ｃ−２８ オス及びメスのカニクイザルにおける２．００ｍｇ／ｋｇでの単回静脈内投与後のＩＬ−６Ｒ０４−ＨＳＡの基本薬物動態パラメータ１
１全てのパラメータは２コンパートメントモデリングにより算出した
２算出方法では中和抗体による免疫クリアランスは無視されるため、ＰＫパラメータの推定値は注意して解釈しなければならない
表Ｃ−２９ オス及びメスのカニクイザルにおける２．００ｍｇ／ｋｇでの単回静脈内投与後のＩＬ−６Ｒ２０２の基本薬物動態パラメータ１
１全てのパラメータは２コンパートメントモデリングにより算出した
表Ｃ−３０ オス及びメスのカニクイザルにおける２．００ｍｇ／ｋｇでの単回静脈内投与後のＩＬ−６Ｒ２０３の基本薬物動態パラメータ１
１全てのパラメータは２コンパートメントモデリングにより算出した
カニクイザルにおける効果
ヒト及び非ヒト霊長類において、ヒトＩＬ−６（ｈＩＬ−６）は急性期タンパク質合成を誘導すると報告されている（Gauldi et al., 1987、Asano et al., 1990）。急性期タンパク質は、主に肝細胞によるその産生における変化に起因して、炎症性疾患において濃度が少なくとも２５％増大又は減少する一連の血漿タンパク質と定義され、例えばＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、血清アミロイドＡ、ハプトグロビン、フィブリノゲン、アルブミン、トランスフェリン及びＣ３である（Gabay & Kushner, 1999）。サイトカイン産生及び急性期反応のパターンは炎症状態によって異なる。したがって、急性期変化は炎症の存在及び強さを反映するため、診断的に適切である。
この研究では、ＩＬ−６Ｒ２０２及びＩＬ−６Ｒ２０３のｉｎ ｖｉｖｏでＩＬ−６誘導反応を遮断する能力が霊長類で調べられた。
３歳〜４歳齢で３ｋｇ未満の成体カニクイザル（Macaca fascicularis）を、室温の人工気象室（environment controlled room：環境制御室）に個々に収容した。全個体の体重を最初の投与時及びそれから毎週記録した。動物に番号を付け、ほぼ等しい平均体重になるように２個体の群（１匹のオス及び１匹のメス）に組み合わせた。
凍結乾燥ｈＩＬ−６（Gentaur）を０．５Ｍの酢酸に１００μｇ／ｍＬの最終濃度まで溶解した。５００μｇのＩＬ−６を含有する１つのバイアルを、０．５Ｍの酢酸５ｍＬに溶解した。まず、０．５Ｍの酢酸３ｍＬをバイアルに添加し、全ての凍結乾燥物（lyophilisate）が溶解するまで溶液をかき混ぜた。溶液を滅菌ポリスチレン試験管に移した。バイアルを０．５Ｍの酢酸２ｍＬですすぎ、この溶液も同様にポリスチレン試験管に移し、続いて溶液を静かに混合した。
ヒトＩＬ−６は、１％カニクイザル熱不活化自己血清中で、背部に１ｍＬ／ｋｇ体重の皮下ボーラス注射により投与した。
８つの群（群４〜１１、表Ｃ−３１）の動物に、４個の異なる投与量；すなわちＤ−ＰＢＳ中０．６ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ又は２０ｍｇ／ｋｇ体重ＩＬ−６Ｒ２０２又はＩＬ−６Ｒ２０３の単回静脈内注射を受けさせた。ナノボディ（登録商標）をＤ−ＰＢＳ中１ｍＬ／ｋｇ体重の静脈内ボーラス注射により左腕又は右腕の橈側皮静脈に投与した。続いて１時間後、全ての動物に最初の７日間、ｈＩＬ−６（５μｇ／ｋｇ体重）の皮下注射をした。１つの群の２個体（群１２、２３ｍ及び２４ｆ、表Ｃ−３１）には、ナノボディ（登録商標）前投与を受けさせず、陰性対照とした。
試験日０及びそれから毎日（試験日１〜試験日１４）及び試験日２１に、血液試料を注射前に採取した。
炎症パラメータＣＲＰ（血清Ｃ反応性タンパク質レベル）は、この動物モデルにおける急性期反応に関する効果を評価する最も重要なパラメータの１つである（当該研究に使用した動物モデルはAsano et al. （1990） Blood 8, 1602-1605に詳述されている）。さらに、ＣＲＰは、臨床試験の一環としてヒト被験者における抗炎症反応化合物の効果の評価に使用される最も重要な非主観的パラメータの１つであり、これは以下の参考文献で十分に立証されている：Choy et al. （2002） Arthritis and Rheumatism 46 （12） 3143-50、Nishimoto et al. （2004） Arthritis and Rheumatism 50 （6） 1761-69、Maini et al. （2006） Arthritis and Rheumatism 54 （9） 2817-29。ＣＲＰのレベルの増大は、炎症の最重要の指標の１つである。
当該動物モデルでは、ＣＲＰレベル及び多数の他のパラメータが測定された（後者の結果は示さない）；炎症パラメータＥＳＲ（赤血球沈降速度）は、このモデルを用いて定量的に求める（すなわち用量反応曲線を提供する）ことができなかった。
表Ｃ−３１ ｈＩＬ−６及び試験項目の投与の経時的スケジュール
ＣＲＰのレベルに対するデータを図４２に示す。試験日２では、全ての群（対照群及び試験群）におけるＣＲＰの血清濃度は、最大で基準レベルの１３倍の最大値に達していた。ナノボディ（登録商標）の投与量とＣＲＰの増大レベルとの間に明らかな相関関係が観察された。
参照ＩｇＧとの競合ＥＬＩＳＡ
参照ＩｇＧと比較したナノボディパネルのエピトープ特異性を分析するために、ＥＬＩＳＡ実験を設計した。参照ＩｇＧ MＲＡをウェルにコートし、一定量のＩＬ−６Ｒとプレインキュベートしたナノボディの希釈系列を続いてウェルに移した。
ビオチン化抗ＩＬ−６Ｒ Ｍａｂ M１８２（Pharmingen）及びストレプトアビジン−ＨＲＰを用いて検出を行なった。データにより参照Ｆａｂ、ＩＬ−６Ｒ−０３、ＩＬ−６Ｒ６５、ＩＬ−６Ｒ１３及びＩＬ−６Ｒ８８についてのみ、参照ＩｇＧに対する競合的結合が観察されたことが示唆される。
データを図４３、図４４及び図４５に示す。
ビアコア参照Ｆａｂ
参照Ｆａｂと比較したナノボディパネルのエピトープ特異性を分析するために、ビアコア実験を設計した。酢酸ナトリウム（ｐＨ４）中でＢＮ１２、非中和抗ヒトＩＬ−６Ｒ ＭＡｂ（Diaclone）をチップに連結させた。次に、１００ｎＭのＩＬ−６Ｒをチップに投入した。その後、１００ｎＭの抗ＩＬ−６Ｒナノボディを投入した。最後に、１００ｎＭの参照Ｆａｂと１００ｎＭのナノボディとの混合物を投入した。
結果（図４６）は、試験された全てのナノボディについて、参照ＦａｂはナノボディがＩＬ−６Ｒに既に結合した場合でも依然としてＩＬ−６Ｒに結合することを示した。これにより、抗ＩＬ−６ＲナノボディがＩＬ−６Ｒ上の異なるエピトープを認識する可能性があることが示唆された。ナノボディＩＬ−６Ｒ−０３、ＩＬ−６Ｒ６５、ＩＬ−６Ｒ０６、ＩＬ−６Ｒ１３及びＩＬ−６Ｒ８８についてのみ結合減少が観察された。
ヒトＩＬ−６のヒト、アカゲザル及びカニクイザルの血漿由来の可溶性ＩＬ−６Ｒへの結合を阻害する効力
ヒトＩＬ−６のヒト、アカゲザル及びカニクイザルの血漿に存在する可溶性ＩＬ−６Ｒへの結合を阻害する効力を、ナノボディパネルに関して分析した。非中和抗ＩＬ−６Ｒ Ｍａｂ ＢＮ１２（Diaclone）をマイクロタイターウェルプレートにコートした。続いて、ヒト、アカゲザル又はカニクイザルの血漿をヒトＩＬ−６とプレインキュベートし、ナノボディの希釈系列をプレートに適用した。抗ＩＬ−６−ビオチン、続いてストレプトアビジン−ＨＲＰ試薬を用いて検出を行なった。データを図４７、図４８、図４９及び図５０に示す。
参考例１：欧州特許第０６２８６３９号明細書（国際公開第９２／１９７５９号パンフレット）による参照Ｆａｂ及び参照ＩｇＧの調製
欧州特許第０６２８６３９号明細書による２つの代表的な抗ヒトＩＬ−６Ｒ免疫グロブリン（Ｆａｂ断片及び完全長ＩｇＧ）を生成し、本明細書中で基準化合物として使用した。
Ｆａｂ断片及び完全長ＩｇＧを、「ＲＶＬａ」と呼ばれるＬ鎖（欧州特許第０６２８６３９号明細書、表２、バージョン（ａ）を参照）及び「ＲＶＨｆ」と呼ばれるＨ鎖（欧州特許第０６２８６３９号明細書、表３、バージョン（ｆ）を参照）を基に構築した。欧州特許第０２６８６３９号明細書によると（例えば［００７４］段落を参照）、これらの特定のＬ鎖及びＨ鎖を基準化合物を構成する目的で選択したが、その理由は、当該Ｌ鎖及び当該Ｈ鎖を含む再構成ヒト抗体は、ヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナル抗体であるＰＭ１と同じレベルでヒトＩＬ−６Ｒに結合する能力を示すためである（同様に欧州特許第０６２８６３９号明細書、［００９］段落及び本明細書中にさらに引用される参考文献を参照）。
全長参照ＩｇＧは、配列番号６２９（重鎖）及び配列番号６３０（軽鎖）のアミノ酸配列から成っていた。Ｆａｂ断片は、配列番号６３１（ヒトＩｇＧ１のＣＨ１領域に融合した重鎖領域ＶＬｂ及びＶＨｆ）及び配列番号６３２（ヒトＣｋａｐｐａに融合した再構成ヒトＰＭ−１可変軽鎖）のアミノ酸配列から成っていた。
部分的に重複したオリゴヌクレオチドを用いた集積ＰＣＲによって、コード化ＤＮＡ断片を生成した。ＰＣＲ産物を、大腸菌ペリプラズムにおいて機能的なジスルフィド結合Ｆａｂ断片を発現可能な単一のバイシストロニックベクターにクローニングした。軽鎖及び重鎖の遺伝子を含有する２つの発現ベクターでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞において、全長ＩｇＧを産生させた。ＶＨｆをヒトＩｇＧ１の定常領域に融合することにより、重鎖をコードする遺伝子を作製した。軽鎖は欧州特許第０２６８６３９号明細書に記載されるようなものである。
表Ｂ−１ ＩＬ−６受容体に対するナノボディ及びポリペプチド
「（ｔ）」は翻訳されたタンパク質を指す。リーダー配列及びＮ末端配列は、配列番号４７２〜配列番号４７７として与えられる。
採用された用語及び表現は、限定ではなく説明のための用語として使用されるものであり、このような用語及び表現の使用においては、提示及び記載される特徴の任意の均等物又はその一部を排除することは意図されず、本発明の範囲内で様々な変形形態が可能であることが認識される。
本明細書中に記載の参考文献は全て、特に以上に参照される教示は参照により援用される。

Claims (191)

  1. ＩＬ−６Ｒに指向性を有し、及び／又はＩＬ−６Ｒと特異的に結合することができるアミノ酸配列。
  2. ＩＬ−６ＲとＩＬ−６との間の相互作用を調節するように、ＩＬ−６Ｒのエピトープと結合する、請求項１に記載のアミノ酸配列。
  3. ＩＬ−６Ｒの前記エピトープと結合するためにＩＬ−６と競合する、請求項１又は２に記載のアミノ酸配列。
  4. 前記エピトープが、ＩＬ−６Ｒの細胞外ドメインに位置する、請求項２又は３に記載のアミノ酸配列。
  5. 前記エピトープが、ＩＬ−６Ｒの細胞外Ｄ３ドメインに位置する、請求項４に記載のアミノ酸配列。
  6. 前記エピトープが、ＩＬ−６Ｒの細胞外Ｄ３ドメインの１８接触残基ストレッチの少なくとも一断片を含み、ＩＬ−６とＩＬ−６Ｒとの間の相互作用に関与する、請求項４又は５に記載のアミノ酸配列。
  7. 前記エプトープが、ＩＬ−６Ｒの細胞外Ｄ３ドメインのアミノ酸残基Ｐｈｅ２２９及び／又はアミノ酸残基Ｐｈｅ２７９を含む、請求項４〜６のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  8. ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体とｇｐ１３０との間の相互作用を調節するように、ＩＬ−６Ｒのエピトープと結合する、請求項１に記載のアミノ酸配列。
  9. ＩＬ−６Ｒの前記エピトープと結合するためにｇｐ１３０と競合する、請求項１又は８に記載のアミノ酸配列。
  10. 本質的に単離形態である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  11. 被験者に投与するためのものであり、該被験者内で自然発生するものではない、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  12. １０−５モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及び好ましくは１０−７モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及びより好ましくは１０−８モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌの解離定数（ＫＤ）でＩＬ−６Ｒと特異的に結合することができる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  13. １０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０３Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは１０４Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、例えば１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１の結合速度（ｋｏｎ速度）でＩＬ−６Ｒと特異的に結合することができる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  14. １ｓ−１〜１０−６ｓ−１、好ましくは１０−２ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−３ｓ−１〜１０−６ｓ−１、例えば１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１の解離速度（ｋｏｆｆ速度）でＩＬ−６Ｒと特異的に結合することができる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  15. ５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、例えば５００ｐＭ未満の親和性でＩＬ−６Ｒと特異的に結合することができる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  16. （任意の好適な種由来の）天然アミノ酸配列、又は合成若しくは半合成のアミノ酸配列である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  17. 免疫グロブリンフォールドを含むか、又は好適な条件下で免疫グロブリンフォールドを形成することができる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  18. 本質的に４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから成る、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  19. 免疫グロブリン配列である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  20. （任意の好適な種由来の）天然免疫グロブリン配列、又は合成若しくは半合成の免疫グロブリン配列である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  21. ヒト化免疫グロブリン配列、ラクダ化免疫グロブリン配列、又は親和性成熟等の技法によって得られる免疫グロブリン配列である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  22. 本質的に軽鎖可変ドメイン配列（例えばＶＬ配列）又は重鎖可変ドメイン配列（例えばＶＨ配列）から成る、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  23. 本質的に従来の４鎖抗体由来の重鎖可変ドメイン配列から成るか、又は本質的に重鎖抗体由来の重鎖可変ドメイン配列から成る、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  24. 本質的にドメイン抗体（又はドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列）、単一ドメイン抗体（又は単一ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列）、「ｄＡｂ」（又はｄＡｂとしての使用に好適なアミノ酸配列）、又はナノボディ（登録商標）（ＶＨＨ配列を含むが、これに限定されない）から成る、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  25. 本質的にナノボディ（登録商標）から成る、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  26. 本質的に
    ａ）配列番号３９９〜配列番号４７１のアミノ酸配列の少なくとも１つと８０％のアミノ酸同一性を有し（アミノ酸同一性の程度を決定するためにＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基は無視する）、且つ
    ｂ）好ましくはカバットナンバリング（Kabat numbering）に従った、１１位、３７位、４４位、４５位、４７位、８３位、８４位、１０３位、１０４位及び１０８位の１つ又は複数のアミノ酸残基が、表Ａ−３で言及される特徴的な残基から選択される、ナノボディ（登録商標）から成る、請求項１〜２５のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  27. 本質的にヒト化ナノボディ（登録商標）から成る、請求項１〜２６のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  28. ＩＬ−６Ｒとの結合のための少なくとも１つの結合部位の他に、他の抗原、タンパク質又は標的との結合のための１つ又は複数のさらなる結合部位を含有する、請求項１〜２７のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  29. ＩＬ−６Ｒに関するアミノ酸配列であって、
    ａ）配列番号９３〜配列番号１４３のアミノ酸配列、
    ｂ）配列番号９３〜配列番号１４３のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
    ｃ）配列番号９３〜配列番号１４３のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、
    ｄ）配列番号１９５〜配列番号２４５のアミノ酸配列、
    ｅ）配列番号１９５〜配列番号２４５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
    ｆ）配列番号１９５〜配列番号２４５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、
    ｇ）配列番号２９７〜配列番号３４７のアミノ酸配列、
    ｈ）配列番号２９７〜配列番号３４７のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
    ｉ）配列番号２９７〜配列番号３４７のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、又は
    任意の好適なこれらの組合せから成る群から選択される１つ又は複数のアミノ酸残基のストレッチを含む、ＩＬ−６Ｒに関するアミノ酸配列。
  30. 前記アミノ酸残基のストレッチの少なくとも１つが、ＩＬ−６Ｒと結合するための抗原結合部位の一部を形成する、請求項２９に記載のアミノ酸配列。
  31. ａ）配列番号９３〜配列番号１４３のアミノ酸配列、
    ｂ）配列番号９３〜配列番号１４３のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
    ｃ）配列番号９３〜配列番号１４３のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、
    ｄ）配列番号１９５〜配列番号２４５のアミノ酸配列、
    ｅ）配列番号１９５〜配列番号２４５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
    ｆ）配列番号１９５〜配列番号２４５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、
    ｇ）配列番号２９７〜配列番号３４７のアミノ酸配列、
    ｈ）配列番号２９７〜配列番号３４７のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
    ｉ）配列番号２９７〜配列番号３４７のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択される２つ以上のアミノ酸残基のストレッチを含み、このため、（ｉ）アミノ酸残基の第１のストレッチがａ）、ｂ）又はｃ）によるアミノ酸配列の１つに対応する場合、アミノ酸残基の第２のストレッチは、ｄ）、ｅ）、ｆ）、ｇ）、ｈ）又はｉ）によるアミノ酸配列の１つに対応し、（ｉｉ）アミノ酸残基の第１のストレッチがｄ）、ｅ）又はｆ）によるアミノ酸配列の１つに対応する場合、アミノ酸残基の第２のストレッチは、ａ）、ｂ）、ｃ）、ｇ）、ｈ）又はｉ）によるアミノ酸配列の１つに対応し、或いは（ｉｉｉ）アミノ酸残基の第１のストレッチがｇ）、ｈ）又はｉ）によるアミノ酸配列の１つに対応する場合、アミノ酸残基の第２のストレッチは、ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）又はｆ）によるアミノ酸配列の１つに対応する、請求項２９に記載のアミノ酸配列。
  32. 少なくとも２つのアミノ酸残基のストレッチが、ＩＬ−６Ｒと結合するための抗原結合部位の一部を形成する、請求項３１に記載のアミノ酸配列。
  33. ３つ以上のアミノ酸残基のストレッチを含み、アミノ酸残基の第１のストレッチが、
    ａ）配列番号９３〜配列番号１４３のアミノ酸配列、
    ｂ）配列番号９３〜配列番号１４３のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
    ｃ）配列番号９３〜配列番号１４３のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、
    アミノ酸残基の第２のストレッチが、
    ｄ）配列番号１９５〜配列番号２４５のアミノ酸配列、
    ｅ）配列番号１９５〜配列番号２４５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
    ｆ）配列番号１９５〜配列番号２４５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、且つ
    アミノ酸残基の第３のストレッチが、
    ｇ）配列番号２９７〜配列番号３４７のアミノ酸配列、
    ｈ）配列番号２９７〜配列番号３４７のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
    ｉ）配列番号２９７〜配列番号３４７のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択される、請求項２９又は３２に記載のアミノ酸配列。
  34. 少なくとも３つのアミノ酸残基のストレッチが、ＩＬ−６Ｒと結合するための抗原結合部位の一部を形成する、請求項３３に記載のアミノ酸配列。
  35. 前記アミノ酸配列のＣＤＲ配列が、少なくとも１つの配列番号３９９〜配列番号４７１のアミノ酸配列のＣＤＲ配列と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性（例えば９５％以上のアミノ酸同一性）、又はさらに本質的に１００％のアミノ酸同一性を有する、請求項２９〜３４のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  36. 本質的に単離形態である、請求項２９〜３５のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  37. 被験者に投与するためのものであり、該被験者内で自然発生するものではない、請求項２９〜３６のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  38. １０−５モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及び好ましくは１０−７モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及びより好ましくは１０−８モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌの解離定数（ＫＤ）でＩＬ−６Ｒと特異的に結合することができる、請求項２９〜３７のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  39. １０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０３Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは１０４Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、例えば１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１の結合速度（ｋｏｎ速度）でＩＬ−６Ｒと特異的に結合することができる、請求項２９〜３８のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  40. １ｓ−１〜１０−６ｓ−１、好ましくは１０−２ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−３ｓ−１〜１０−６ｓ−１、例えば１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１の解離速度（ｋｏｆｆ速度）でＩＬ−６Ｒと特異的に結合することができる、請求項２９〜３９のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  41. ５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、例えば５００ｐＭ未満の親和性でＩＬ−６Ｒと特異的に結合することができる、請求項２９〜４０のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  42. （任意の好適な種由来の）天然アミノ酸配列、又は合成若しくは半合成のアミノ酸配列である、請求項２９〜４１のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  43. 免疫グロブリンフォールドを含むか、又は好適な条件下で免疫グロブリンフォールドを形成することができる、請求項２９〜４２のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  44. 免疫グロブリン配列である、請求項２９〜４３のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  45. （任意の好適な種由来の）天然免疫グロブリン配列、又は合成若しくは半合成の免疫グロブリン配列である、請求項２９〜４４のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  46. ヒト化免疫グロブリン配列、ラクダ化免疫グロブリン配列、又は親和性成熟等の技法によって得られる免疫グロブリン配列である、請求項２９〜４５のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  47. 本質的に軽鎖可変ドメイン配列（例えばＶＬ配列）又は重鎖可変ドメイン配列（例えばＶＨ配列）から成る、請求項２９〜４６のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  48. 本質的に従来の４鎖抗体由来の重鎖可変ドメイン配列から成るか、又は本質的に重鎖抗体由来の重鎖可変ドメイン配列から成る、請求項２９〜４７のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  49. 本質的にドメイン抗体（又はドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列）、単一ドメイン抗体（又は単一ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列）、「ｄＡｂ」（又はｄＡｂとしての使用に好適なアミノ酸配列）、又はナノボディ（登録商標）（ＶＨＨ配列を含むが、これに限定されない）から成る、請求項２９〜４８のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  50. 本質的にナノボディ（登録商標）から成る、請求項２９〜４９のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  51. 本質的に
    ａ）配列番号３９９〜配列番号４７１のアミノ酸配列の少なくとも１つと８０％のアミノ酸同一性を有し（アミノ酸同一性の程度を決定するためにＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基は無視する）、且つ
    ｂ）好ましくはカバットナンバリングに従った、１１位、３７位、４４位、４５位、４７位、８３位、８４位、１０３位、１０４位及び１０８位の１つ又は複数のアミノ酸残基が、表Ａ−３で言及される特徴的な残基から選択される、ナノボディ（登録商標）から成る、請求項２９〜５０のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  52. 本質的にヒト化ナノボディ（登録商標）から成る、請求項２９〜５１のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  53. 前記ＣＤＲ配列によって形成される結合のための少なくとも１つの結合部位の他に、他の抗原、タンパク質又は標的との結合のための１つ又は複数のさらなる結合部位を含有する、請求項２９〜５２のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  54. 本質的に４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから成るアミノ酸配列であって、
    ＣＤＲ１が、
    ａ）配列番号９３〜配列番号１４３のアミノ酸配列、
    ｂ）配列番号９３〜配列番号１４３のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
    ｃ）配列番号９３〜配列番号１４３のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、及び／又は
    ＣＤＲ２が、
    ｄ）配列番号１９５〜配列番号２４５のアミノ酸配列、
    ｅ）配列番号１９５〜配列番号２４５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
    ｆ）配列番号１９５〜配列番号２４５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、及び／又は
    ＣＤＲ３が、
    ｇ）配列番号２９７〜配列番号３４７のアミノ酸配列、
    ｈ）配列番号２９７〜配列番号３４７のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
    ｉ）配列番号２９７〜配列番号３４７のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択される、アミノ酸配列。
  55. 本質的に４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから成るアミノ酸配列であって、
    ＣＤＲ１が、
    ａ）配列番号９３〜配列番号１４３のアミノ酸配列、
    ｂ）配列番号９３〜配列番号１４３のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
    ｃ）配列番号９３〜配列番号１４３のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、且つ
    ＣＤＲ２が、
    ｄ）配列番号１９５〜配列番号２４５のアミノ酸配列、
    ｅ）配列番号１９５〜配列番号２４５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
    ｆ）配列番号１９５〜配列番号２４５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、且つ
    ＣＤＲ３が、
    ｇ）配列番号２９７〜配列番号３４７のアミノ酸配列、
    ｈ）配列番号２９７〜配列番号３４７のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
    ｉ）配列番号２９７〜配列番号３４７のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択される、アミノ酸配列。
  56. 前記アミノ酸配列のＣＤＲ配列が、少なくとも１つの配列番号３９９〜配列番号４７１のアミノ酸配列のＣＤＲ配列と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性（例えば９５％以上のアミノ酸同一性）、又はさらに本質的に１００％のアミノ酸同一性を有する、請求項５４又は５５に記載のアミノ酸配列。
  57. 本質的に単離形態である、請求項５４〜５６のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  58. 被験者に投与するためのものであり、該被験者内で自然発生するものではない、請求項５４〜５７のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  59. １０−５モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及び好ましくは１０−７モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及びより好ましくは１０−８モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌの解離定数（ＫＤ）でＩＬ−６Ｒと特異的に結合することができる、請求項５４〜５８のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  60. １０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０３Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは１０４Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、例えば１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１の結合速度（ｋｏｎ速度）でＩＬ−６Ｒと特異的に結合することができる、請求項５４〜５９のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  61. １ｓ−１〜１０−６ｓ−１、好ましくは１０−２ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−３ｓ−１〜１０−６ｓ−１、例えば１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１の解離速度（ｋｏｆｆ速度）でＩＬ−６Ｒと特異的に結合することができる、請求項５４〜６０のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  62. ５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、例えば５００ｐＭ未満の親和性でＩＬ−６Ｒと特異的に結合することができる、請求項５４〜６１のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  63. （任意の好適な種由来の）天然アミノ酸配列、又は合成若しくは半合成のアミノ酸配列である、請求項５４〜６２のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  64. 免疫グロブリンフォールドを含むか、又は好適な条件下で免疫グロブリンフォールドを形成することができる、請求項５４〜６３のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  65. 免疫グロブリン配列である、請求項５４〜６４のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  66. （任意の好適な種由来の）天然免疫グロブリン配列、又は合成若しくは半合成の免疫グロブリン配列である、請求項５４〜６５のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  67. ヒト化免疫グロブリン配列、ラクダ化免疫グロブリン配列、又は親和性成熟等の技法によって得られる免疫グロブリン配列である、請求項５４〜６６のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  68. 本質的に軽鎖可変ドメイン配列（例えばＶＬ配列）又は重鎖可変ドメイン配列（例えばＶＨ配列）から成る、請求項５４〜６７のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  69. 本質的に従来の４鎖抗体由来の重鎖可変ドメイン配列から成るか、又は本質的に重鎖抗体由来の重鎖可変ドメイン配列から成る、請求項５４〜６８のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  70. 本質的にドメイン抗体（又はドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列）、単一ドメイン抗体（又は単一ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列）、「ｄＡｂ」（又はｄＡｂとしての使用に好適なアミノ酸配列）、又はナノボディ（登録商標）（ＶＨＨ配列を含むが、これに限定されない）から成る、請求項５４〜６９のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  71. 本質的にナノボディ（登録商標）から成る、請求項５４〜７０のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  72. 本質的に
    ａ）配列番号３９９〜配列番号４７１のアミノ酸配列の少なくとも１つと８０％のアミノ酸同一性を有し（アミノ酸同一性の程度を決定するためにＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基は無視する）、且つ
    ｂ）好ましくはカバットナンバリングに従った、１１位、３７位、４４位、４５位、４７位、８３位、８４位、１０３位、１０４位及び１０８位の１つ又は複数のアミノ酸残基が、表Ａ−３で言及される特徴的な残基から選択される、ナノボディ（登録商標）から成る、請求項５４〜７１のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  73. 本質的にヒト化ナノボディ（登録商標）から成る、請求項５４〜７２のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  74. 前記ＣＤＲ配列によって形成される結合のための少なくとも１つの結合部位の他に、他の抗原、タンパク質又は標的との結合のための１つ又は複数のさらなる結合部位を含有する、請求項５４〜７３のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  75. ＩＬ−６Ｒに指向性を有し、及び／又はＩＬ−６Ｒと特異的に結合することができるナノボディ。
  76. ＩＬ−６ＲとＩＬ−６との間の相互作用を調節するように、ＩＬ−６Ｒのエピトープと結合する、請求項７５に記載のナノボディ。
  77. ＩＬ−６Ｒの前記エピトープと結合するためにＩＬ−６と競合する、請求項７５又は７６に記載のナノボディ。
  78. 前記エピトープが、ＩＬ−６Ｒの細胞外ドメインに位置する、請求項７６又は７７に記載のナノボディ。
  79. 前記エピトープが、ＩＬ−６Ｒの細胞外Ｄ３ドメインに位置する、請求項７８に記載のナノボディ。
  80. 前記エピトープが、ＩＬ−６Ｒの細胞外Ｄ３ドメインの１８接触残基ストレッチの少なくとも一断片を含み、ＩＬ−６とＩＬ−６Ｒとの間の相互作用に関与する、請求項７８又は７９に記載のナノボディ。
  81. 前記エプトープが、ＩＬ−６Ｒの細胞外Ｄ３ドメインのアミノ酸残基Ｐｈｅ２２９及び／又はアミノ酸残基Ｐｈｅ２７９を含む、請求項７８〜８０のいずれか一項に記載のナノボディ。
  82. ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体とｇｐ１３０との間の相互作用を調節するように、ＩＬ−６Ｒのエピトープと結合する、請求項７５に記載のナノボディ。
  83. ＩＬ−６Ｒの前記エピトープと結合するためにｇｐ１３０と競合する、請求項７５又は８２に記載のナノボディ。
  84. 本質的に単離形態である、請求項７５〜８３のいずれか一項に記載のナノボディ。
  85. １０−５モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及び好ましくは１０−７モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及びより好ましくは１０−８モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌの解離定数（ＫＤ）でＩＬ−６Ｒと特異的に結合することができる、請求項７５又は８４に記載のナノボディ。
  86. １０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０３Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは１０４Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、例えば１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１の結合速度（ｋｏｎ速度）でＩＬ−６Ｒと特異的に結合することができる、請求項７５〜８５のいずれか一項に記載のナノボディ。
  87. １ｓ−１〜１０−６ｓ−１、好ましくは１０−２ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−３ｓ−１〜１０−６ｓ−１、例えば１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１の解離速度（ｋｏｆｆ速度）でＩＬ−６Ｒと特異的に結合することができる、請求項７５〜８６のいずれか一項に記載のナノボディ。
  88. ５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、例えば５００ｐＭ未満の親和性でＩＬ−６Ｒと特異的に結合することができる、請求項７５〜８７のいずれか一項に記載のナノボディ。
  89. （任意の好適な種由来の）天然ナノボディ、又は合成若しくは半合成のナノボディである、請求項７５〜８８のいずれか一項に記載のナノボディ。
  90. ＶＨＨ配列、部分ヒト化ＶＨＨ配列、完全ヒト化ＶＨＨ配列、ラクダ化重鎖可変ドメイン又は親和性成熟等の技法によって得られるナノボディである、請求項７５〜８９のいずれか一項に記載のナノボディ。
  91. ａ）配列番号３９９〜配列番号４７１のアミノ酸配列の少なくとも１つと８０％のアミノ酸同一性を有し（アミノ酸同一性の程度を決定するためにＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基は無視する）、且つ
    ｂ）好ましくはカバットナンバリングに従った、１１位、３７位、４４位、４５位、４７位、８３位、８４位、１０３位、１０４位及び１０８位の１つ又は複数のアミノ酸残基が、表Ａ−３で言及される特徴的な残基から選択される、請求項７５〜９０のいずれか一項に記載のナノボディ。
  92. ＣＤＲ１が、
    ａ）配列番号９３〜配列番号１４３のアミノ酸配列、
    ｂ）配列番号９３〜配列番号１４３のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
    ｃ）配列番号９３〜配列番号１４３のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、及び／又は
    ＣＤＲ２が、
    ｄ）配列番号１９５〜配列番号２４５のアミノ酸配列、
    ｅ）配列番号１９５〜配列番号２４５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
    ｆ）配列番号１９５〜配列番号２４５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、及び／又は
    ＣＤＲ３が、
    ｇ）配列番号２９７〜配列番号３４７のアミノ酸配列、
    ｈ）配列番号２９７〜配列番号３４７のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
    ｉ）配列番号２９７〜配列番号３４７のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択される、請求項７５〜９１のいずれか一項に記載のナノボディ。
  93. ＣＤＲ１が、
    ａ）配列番号９３〜配列番号１４３のアミノ酸配列、
    ｂ）配列番号９３〜配列番号１４３のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
    ｃ）配列番号９３〜配列番号１４３のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、且つ
    ＣＤＲ２が、
    ｄ）配列番号１９５〜配列番号２４５のアミノ酸配列、
    ｅ）配列番号１９５〜配列番号２４５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
    ｆ）配列番号１９５〜配列番号２４５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、且つ
    ＣＤＲ３が、
    ｇ）配列番号２９７〜配列番号３４７のアミノ酸配列、
    ｈ）配列番号２９７〜配列番号３４７のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
    ｉ）配列番号２９７〜配列番号３４７のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択される、請求項７５〜９２のいずれか一項に記載のナノボディ。
  94. 前記ＣＤＲ配列が、少なくとも１つの配列番号３９９〜配列番号４７１のアミノ酸配列のＣＤＲ配列と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性（例えば９５％以上のアミノ酸同一性）、又はさらに本質的に１００％のアミノ酸同一性を有する、請求項７５〜９３のいずれか一項に記載のナノボディ。
  95. 部分ヒト化ナノボディである、請求項７５〜９４のいずれか一項に記載のナノボディ。
  96. 完全ヒト化ナノボディである、請求項７５〜９５のいずれか一項に記載のナノボディ。
  97. 配列番号３９９〜配列番号４７１から成る群から、又は配列番号３９９〜配列番号４７１のアミノ酸配列の少なくとも１つと８０％超、好ましくは９０％超、より好ましくは９５％超（例えば９９％以上）の配列同一性（本明細書中に規定）を有するアミノ酸配列から成る群から選択される、請求項７５〜９６のいずれか一項に記載のナノボディ。
  98. ヒト化ナノボディである、請求項７５〜９７のいずれか一項に記載のナノボディ。
  99. 配列番号３９９〜配列番号４７１から成る群から選択される、請求項７５〜９８のいずれか一項に記載のナノボディ。
  100. 化合物又は構築物であって、１つ又は複数の請求項１〜７４のいずれか一項に記載のアミノ酸配列及び／又は１つ又は複数の請求項７５〜９９のいずれか一項に記載のナノボディを含むか、又は本質的にこれから成り、任意で１つ又は複数のリンカーを介して連結した、１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位を任意でさらに含む、化合物又は構築物。
  101. 前記１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位がアミノ酸配列である、請求項１００に記載の化合物又は構築物。
  102. 存在する場合、前記１つ又は複数のリンカーが１つ又は複数のアミノ酸配列である、請求項１００又は１０１に記載の化合物又は構築物。
  103. 前記１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位が免疫グロブリン配列である、請求項１００〜１０２のいずれか一項に記載の化合物又は構築物。
  104. 前記１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位が、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列、「ｄＡｂ」、ｄＡｂとしての使用に好適なアミノ酸配列、又はナノボディから成る群から選択される、請求項１００〜１０３のいずれか一項に記載の化合物又は構築物。
  105. 前記１つ又は複数の本発明のアミノ酸配列が免疫グロブリン配列である、請求項１００〜１０４のいずれか一項に記載の化合物又は構築物。
  106. 前記１つ又は複数の本発明のアミノ酸配列が、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列、「ｄＡｂ」、ｄＡｂとしての使用に好適なアミノ酸配列、又はナノボディから成る群から選択される、請求項１００〜１０５のいずれか一項に記載の化合物又は構築物。
  107. 化合物又は構築物であって、１つ又は複数の請求項７５〜９９のいずれか一項に記載のナノボディを含むか、又は本質的にこれから成り、前記１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位がナノボディである、化合物又は構築物。
  108. 多価構築物である、請求項１００〜１０７のいずれか一項に記載の化合物又は構築物。
  109. 多重特異的な構築物である、請求項１００〜１０８のいずれか一項に記載の化合物又は構築物。
  110. それぞれ対応する請求項１〜７４のいずれか一項に記載のアミノ酸配列自体、又は請求項７５〜９９のいずれか一項に記載のナノボディ自体に比べて半減期が増大する、請求項１００〜１０９のいずれか一項に記載の化合物又は構築物。
  111. 前記１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位が、それぞれ対応する請求項１〜７４のいずれか一項に記載のアミノ酸配列自体、又は請求項７５〜９９のいずれか一項に記載のナノボディ自体に比べて半減期が増大した化合物又は構築物を提供する、請求項１００〜１１０のいずれか一項に記載の化合物又は構築物。
  112. 半減期が増大した化合物又は構築物を提供する、前記１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位が、血清タンパク質又はその断片、血清タンパク質と結合することができる結合単位、Ｆｃ部分、及び血清タンパク質と結合することができる低分子タンパク質又はペプチドから成る群から選択される、請求項１１１に記載の化合物又は構築物。
  113. 半減期が増大した化合物又は構築物を提供する、前記１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位が、ヒト血清アルブミン又はその断片から成る群から選択される、請求項１１１又は１１２に記載の化合物又は構築物。
  114. 半減期が増大した化合物又は構築物を提供する、前記１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位が、血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）又は血清免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）と結合することができる結合単位から成る群から選択される、請求項１１１又は１１２に記載の化合物又は構築物。
  115. 半減期が増大した化合物又は構築物を提供する、前記１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位が、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列、「ｄＡｂ」、ｄＡｂとしての使用に好適なアミノ酸配列、又は血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）若しくは血清免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）と結合することができるナノボディから成る群から選択される、請求項１１４に記載の化合物又は構築物。
  116. 半減期が増大した化合物又は構築物を提供する、前記１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位が、血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）又は血清免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）と結合することができるナノボディである、請求項１１５に記載の化合物又は構築物。
  117. それぞれ対応する請求項１〜７４のいずれか一項に記載のアミノ酸配列自体、又は請求項７５〜９９のいずれか一項に記載のナノボディ自体の半減期よりも少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、例えば少なくとも５倍、例えば少なくとも１０倍、又は２０倍を超えて大きい血清半減期を有する、請求項１１１〜１１６のいずれか一項に記載の化合物又は構築物。
  118. それぞれ対応する請求項１〜７４のいずれか一項に記載のアミノ酸配列自体、又は請求項７５〜９９のいずれか一項に記載のナノボディ自体に比べて、１時間を超えて、好ましくは２時間を超えて、より好ましくは６時間を超えて、例えば１２時間を超えて、又はさらに２４時間、４８時間若しくは７２時間を超えて増大する血清半減期を有する、請求項１００〜１１７のいずれか一項に記載の化合物又は構築物。
  119. 少なくとも約１２時間、好ましくは少なくとも２４時間、より好ましくは少なくとも４８時間、さらにより好ましくは少なくとも７２時間以上のヒトにおける血清半減期を有し、例えば本発明の化合物又はポリペプチドが、少なくとも５日（例えば約５日〜１０日）、好ましくは少なくとも９日（例えば約９日〜１４日）、より好ましくは少なくとも約１０日（例えば約１０日〜１５日）、若しくは少なくとも約１１日（例えば約１１日〜１６日）、より好ましくは少なくとも約１２日（例えば約１２日〜１８日以上）、又は１４日超（例えば約１４日〜１９日）の半減期を有し得る、請求項１００〜１１８のいずれか一項に記載の化合物又は構築物。
  120. １つの請求項１〜７４のいずれか一項に記載のアミノ酸配列、及び／又は１つの請求項７５〜９９のいずれか一項に記載のナノボディを含むか、又は本質的にこれから成る一価の構築物。
  121. 前記本発明のアミノ酸配列が、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列、「ｄＡｂ」、ｄＡｂとしての使用に好適なアミノ酸配列、又はナノボディから成る群から選択される、請求項１２０に記載の一価の構築物。
  122. 請求項７５〜９９のいずれか一項に記載のナノボディを含むか、又は本質的にこれから成る一価の構築物。
  123. 核酸又はヌクレオチド配列であって、請求項１〜７４のいずれか一項に記載のアミノ酸配列、請求項７５〜９９のいずれか一項に記載のナノボディ、請求項１００〜１１９のいずれか一項に記載の化合物又は構築物、或いは請求項１２０〜１２２のいずれか一項に記載の一価の構築物をコードする、核酸又はヌクレオチド配列。
  124. 遺伝的構築物の形態である、請求項１２３に記載の核酸又はヌクレオチド配列。
  125. 宿主又は宿主細胞であって、請求項１〜７４のいずれか一項に記載のアミノ酸配列、請求項７５〜９９のいずれか一項に記載のナノボディ、請求項１００〜１１９のいずれか一項に記載の化合物若しくは構築物、又は請求項１２０〜１２２のいずれか一項に記載の一価の構築物を発現する、或いは好適な環境下で発現することができ、及び／又は請求項１２３又は１２４に記載の核酸又はヌクレオチド配列を含む、宿主又は宿主細胞。
  126. 請求項１〜７４のいずれか一項に記載のアミノ酸配列、請求項７５〜９９のいずれか一項に記載のナノボディ、請求項１００〜１１９のいずれか一項に記載の化合物又は構築物、或いは請求項１２０〜１２２のいずれか一項に記載の一価の構築物を製造する方法であって、少なくとも
    ａ）好適な宿主細胞若しくは宿主生物において、又は別の好適な発現系において、請求項１２３又は１２４に記載の核酸又はヌクレオチド配列を発現する工程と、任意でその後に
    ｂ）このようにして得られる、請求項１〜７４のいずれか一項に記載のアミノ酸配列、請求項７５〜９９のいずれか一項に記載のナノボディ、請求項１００〜１１９のいずれか一項に記載の化合物又は構築物、或いは請求項１２０〜１２２のいずれか一項に記載の一価の構築物を単離及び／又は精製する工程とを含む、方法。
  127. 請求項１〜７４のいずれか一項に記載のアミノ酸配列、請求項７５〜９９のいずれか一項に記載のナノボディ、請求項１００〜１１９のいずれか一項に記載の化合物又は構築物、或いは請求項１２０〜１２２のいずれか一項に記載の一価の構築物を製造する方法であって、少なくとも
    ａ）請求項１２５に記載の宿主又は宿主細胞が、少なくとも１つの請求項１〜７４のいずれか一項に記載のアミノ酸配列、請求項７５〜９９のいずれか一項に記載のナノボディ、請求項１００〜１１９のいずれか一項に記載の化合物又は構築物、或いは請求項１２０〜１２２のいずれか一項に記載の一価の構築物を発現及び／又は産生するような条件下で、該宿主又は該宿主細胞を培養及び／又は維持する工程と、任意でその後に
    ｂ）このようにして得られる、請求項１〜７４のいずれか一項に記載のアミノ酸配列、請求項７５〜９９のいずれか一項に記載のナノボディ、請求項１００〜１１９のいずれか一項に記載の化合物又は構築物、或いは請求項１２０〜１２２のいずれか一項に記載の一価の構築物を単離及び／又は精製する工程とを含む、方法。
  128. 組成物であって、少なくとも１つの請求項１〜７４のいずれか一項に記載のアミノ酸配列、請求項７５〜９９のいずれか一項に記載のナノボディ、請求項１００〜１１９のいずれか一項に記載の化合物又は構築物、請求項１２０〜１２２のいずれか一項に記載の一価の構築物、或いは請求項１２３又は１２４に記載の核酸又はヌクレオチド配列を含む、組成物。
  129. 薬学的組成物である、請求項１２８に記載の組成物。
  130. 少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体、希釈剤、又は賦形剤及び／又はアジュバントをさらに含み、且つ任意で１つ又は複数のさらなる薬学的に有効なポリペプチド及び／又は化合物を含む、薬学的組成物である、請求項１２８又は１２９に記載の組成物。
  131. ＩＬ−６Ｒに、及び／又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に、及び／又はＩＬ−６及び／又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体が関与する、シグナル伝達経路及び／又は生物学的機能及び応答に関連がある疾患及び障害の少なくとも１つを予防及び／又は治療する方法であって、それが必要な被験者に薬学的に有効な量の少なくとも１つの請求項１〜７４のいずれか一項に記載のアミノ酸配列、請求項７５〜９９のいずれか一項に記載のナノボディ、請求項１００〜１１９のいずれか一項に記載の化合物又は構築物、請求項１２０〜１２２のいずれか一項に記載の一価の構築物、或いは請求項１２８〜１３０のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
  132. 前記ＩＬ−６Ｒに、及び／又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に、及び／又はＩＬ−６及び／又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体が関与する、シグナル伝達経路及び／又は生物学的機能及び応答に関連がある疾患及び障害が、敗血症、様々な形態の癌、骨吸収、骨粗鬆症、悪液質、乾癬、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、カポジ肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫及び炎症性疾患から成る群から選択される、請求項１３１に記載の方法。
  133. 前記様々な形態の癌が、多発性骨髄腫疾患（ＭＭ）、腎細胞癌（ＲＣＣ）、形質細胞性白血病、リンパ腫、Ｂ−リンパ増殖性障害（ＢＬＰＤ）及び前立腺癌から成る群から選択される、請求項１３２に記載の方法。
  134. 前記炎症性疾患が、リウマチ性関節炎、全身性発症若年性特発性関節炎、高ガンマグロブリン血症、クローン病、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症、キャッスルマン病、ＩｇＭ免疫グロブリン血症、心臓粘液腫、喘息、アレルギー性喘息及び自己免疫インスリン依存性糖尿病から成る群から選択される、請求項１３２に記載の方法。
  135. ＩＬ−６Ｒに、その生物活性又は薬理活性に、及び／又はＩＬ−６Ｒが関与する生物学的経路又はシグナル伝達に関連がある、少なくとも１つの疾患又は障害を予防及び／又は治療する方法であって、それが必要な被験者に薬学的に有効な量の少なくとも１つの請求項１〜７４のいずれか一項に記載のアミノ酸配列、請求項７５〜９９のいずれか一項に記載のナノボディ、請求項１００〜１１９のいずれか一項に記載の化合物又は構築物、請求項１２０〜１２２のいずれか一項に記載の一価の構築物、或いは請求項１２８〜１３０のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
  136. それが必要な被験者に請求項１〜７４のいずれか一項に記載のアミノ酸配列、請求項７５〜９９のいずれか一項に記載のナノボディ、請求項１００〜１１９のいずれか一項に記載の化合物又は構築物、或いは請求項１２０〜１２２のいずれか一項に記載の一価の構築物を投与することによって予防及び／又は治療することができる、少なくとも１つの疾患又は障害を予防及び／又は治療する方法であって、それが必要な被験者に薬学的に有効な量の少なくとも１つの請求項１〜７４のいずれか一項に記載のアミノ酸配列、請求項７５〜９９のいずれか一項に記載のナノボディ、請求項１００〜１１９のいずれか一項に記載の化合物又は構築物、請求項１２０〜１２２のいずれか一項に記載の一価の構築物、或いは請求項１２８〜１３０のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
  137. 免疫療法に関する方法であって、それが必要な被験者に薬学的に有効な量の少なくとも１つの請求項１〜７４のいずれか一項に記載のアミノ酸配列、請求項７５〜９９のいずれか一項に記載のナノボディ、請求項１００〜１１９のいずれか一項に記載の化合物又は構築物、請求項１２０〜１２２のいずれか一項に記載の一価の構築物、或いは請求項１２８〜１３０のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、免疫療法に関する方法。
  138. ＩＬ−６Ｒに、及び／又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に、及び／又はＩＬ−６及び／又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体が関与する、シグナル伝達経路及び／又は生物学的機能及び応答に関連がある疾患及び障害の少なくとも１つを予防及び／又は治療するため、及び／又は１つ又は複数の請求項１３１〜１３７のいずれか一項に記載の方法に使用するための薬学的組成物の調製における請求項１〜７４のいずれか一項に記載のアミノ酸配列、請求項７５〜９９のいずれか一項に記載のナノボディ、請求項１００〜１１９のいずれか一項に記載の化合物又は構築物、或いは請求項１２０〜１２２のいずれか一項に記載の一価の構築物の使用。
  139. 請求項１〜７４のいずれか一項に記載のアミノ酸配列又は請求項７５〜９９に記載のナノボディの一部又は断片。
  140. ＩＬ−６Ｒと特異的に結合することができる、請求項１３９に記載の一部又は断片。
  141. ＩＬ−６ＲとＩＬ−６との間の相互作用を調節するように、ＩＬ−６Ｒのエピトープと結合する、請求項１４０に記載の一部又は断片。
  142. ＩＬ−６Ｒの前記エピトープと結合するためにＩＬ−６と競合する、請求項１４０又は１４１に記載の一部又は断片。
  143. 前記エピトープが、ＩＬ−６Ｒの細胞外ドメインに位置する、請求項１４１又は１４２に記載の一部又は断片。
  144. 前記エピトープが、ＩＬ−６Ｒの細胞外Ｄ３ドメインに位置する、請求項１４３に記載の一部又は断片。
  145. 前記エピトープが、ＩＬ−６Ｒの細胞外Ｄ３ドメインの１８接触残基ストレッチの少なくとも一断片を含み、ＩＬ−６とＩＬ−６Ｒとの間の相互作用に関与する、請求項１４３又は１４４に記載の一部又は断片。
  146. 前記エプトープが、ＩＬ−６Ｒの細胞外Ｄ３ドメインのアミノ酸残基Ｐｈｅ２２９及び／又はアミノ酸残基Ｐｈｅ２７９を含む、請求項１４３〜１４５のいずれか一項に記載の一部又は断片。
  147. ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体とｇｐ１３０との間の相互作用を調節するように、ＩＬ−６Ｒのエピトープと結合する、請求項１４０に記載の一部又は断片。
  148. ＩＬ−６Ｒの前記エピトープと結合するためにｇｐ１３０と競合する、請求項１４０又は１４７に記載の一部又は断片。
  149. １０−５モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及び好ましくは１０−７モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及びより好ましくは１０−８モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌの解離定数（ＫＤ）でＩＬ−６Ｒと特異的に結合することができる、請求項１３９〜１４８のいずれか一項に記載の一部又は断片。
  150. １０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０３Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは１０４Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、例えば１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１の結合速度（ｋｏｎ速度）でＩＬ−６Ｒと特異的に結合することができる、請求項１３９〜１４９のいずれか一項に記載の一部又は断片。
  151. １ｓ−１〜１０−６ｓ−１、好ましくは１０−２ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−３ｓ−１〜１０−６ｓ−１、例えば１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１の解離速度（ｋｏｆｆ速度）でＩＬ−６Ｒと特異的に結合することができる、請求項１３９〜１５０のいずれか一項に記載の一部又は断片。
  152. 化合物又は構築物であって、１つ又は複数の請求項１３９〜１５１のいずれか一項に記載の一部又は断片を含むか、又は本質的にこれから成り、任意で１つ又は複数のリンカーを介して連結した、１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位を任意でさらに含む、化合物又は構築物。
  153. 前記１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位がアミノ酸配列である、請求項１５２に記載の化合物又は構築物。
  154. 存在する場合、前記１つ又は複数のリンカーが１つ又は複数のアミノ酸配列である、請求項１５２又は１５３に記載の化合物又は構築物。
  155. 核酸又はヌクレオチド配列であって、請求項１３９〜１５１のいずれか一項に記載の一部又は断片、或いは請求項１５２〜１５４のいずれか一項に記載の化合物又は構築物をコードする、核酸又はヌクレオチド配列。
  156. 組成物であって、少なくとも１つの請求項１３９〜１５１のいずれか一項に記載の一部又は断片、請求項１５２〜１５４のいずれか一項に記載の化合物又は構築物、或いは請求項１５５に記載の核酸又はヌクレオチド配列を含む、組成物。
  157. 請求項１〜７４のいずれか一項に記載のアミノ酸配列、又は請求項７５〜９９のいずれか一項に記載のナノボディの誘導体。
  158. ＩＬ−６Ｒと特異的に結合することができる、請求項１５７に記載の誘導体。
  159. ＩＬ−６ＲとＩＬ−６との間の相互作用を調節するように、ＩＬ−６Ｒのエピトープと結合する、請求項１５８に記載の誘導体。
  160. ＩＬ−６Ｒの前記エピトープと結合するためにＩＬ−６と競合する、請求項１５８又は１５９に記載の誘導体。
  161. 前記エピトープが、ＩＬ−６Ｒの細胞外ドメインに位置する、請求項１５９又は１６０に記載の誘導体。
  162. 前記エピトープが、ＩＬ−６Ｒの細胞外Ｄ３ドメインに位置する、請求項１６１に記載の誘導体。
  163. 前記エピトープが、ＩＬ−６Ｒの細胞外Ｄ３ドメインの１８接触残基ストレッチの少なくとも一断片を含み、ＩＬ−６とＩＬ−６Ｒとの間の相互作用に関与する、請求項１６１又は１６２に記載の誘導体。
  164. 前記エプトープが、ＩＬ−６Ｒの細胞外Ｄ３ドメインのアミノ酸残基Ｐｈｅ２２９及び／又はアミノ酸残基Ｐｈｅ２７９を含む、請求項１６１〜１６３のいずれか一項に記載の誘導体。
  165. ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体とｇｐ１３０との間の相互作用を調節するように、ＩＬ−６Ｒのエピトープと結合する、請求項１５８に記載の誘導体。
  166. ＩＬ−６Ｒの前記エピトープと結合するためにｇｐ１３０と競合する、請求項１５８又は１６５に記載の誘導体。
  167. １０−５モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及び好ましくは１０−７モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及びより好ましくは１０−８モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌの解離定数（ＫＤ）でＩＬ−６Ｒと特異的に結合することができる、請求項１５８〜１６６のいずれか一項に記載の誘導体。
  168. １０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０３Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは１０４Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、例えば１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１の結合速度（ｋｏｎ速度）でＩＬ−６Ｒと特異的に結合することができる、請求項１５８〜１６７のいずれか一項に記載の誘導体。
  169. １ｓ−１〜１０−６ｓ−１、好ましくは１０−２ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−３ｓ−１〜１０−６ｓ−１、例えば１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１の解離速度（ｋｏｆｆ速度）でＩＬ−６Ｒと特異的に結合することができる、請求項１５８〜１６８のいずれか一項に記載の誘導体。
  170. 請求項１０８〜１２７又は請求項１５２〜１５４のいずれか一項に記載の化合物又は構築物の誘導体。
  171. ＩＬ−６Ｒと特異的に結合することができる、請求項１７０に記載の誘導体。
  172. ＩＬ−６ＲとＩＬ−６との間の相互作用を調節するように、ＩＬ−６Ｒのエピトープと結合する、請求項１７１に記載の誘導体。
  173. ＩＬ−６Ｒの前記エピトープと結合するためにＩＬ−６と競合する、請求項１７１又は１７２に記載の誘導体。
  174. 前記エピトープが、ＩＬ−６Ｒの細胞外ドメインに位置する、請求項１７２又は１７３に記載の誘導体。
  175. 前記エピトープが、ＩＬ−６Ｒの細胞外Ｄ３ドメインに位置する、請求項１７４に記載の誘導体。
  176. 前記エピトープが、ＩＬ−６Ｒの細胞外Ｄ３ドメインの１８接触残基ストレッチの少なくとも一断片を含み、ＩＬ−６とＩＬ−６Ｒとの間の相互作用に関与する、請求項１７４又は１７５に記載の誘導体。
  177. 前記エプトープが、ＩＬ−６Ｒの細胞外Ｄ３ドメインのアミノ酸残基Ｐｈｅ２２９及び／又はアミノ酸残基Ｐｈｅ２７９を含む、請求項１７４〜１７６のいずれか一項に記載の誘導体。
  178. ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体とｇｐ１３０との間の相互作用を調節するように、ＩＬ−６Ｒのエピトープと結合する、請求項１７１に記載の誘導体。
  179. ＩＬ−６Ｒの前記エピトープと結合するためにｇｐ１３０と競合する、請求項１７１又は１７８に記載の誘導体。
  180. １０−５モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及び好ましくは１０−７モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及びより好ましくは１０−８モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌの解離定数（ＫＤ）でＩＬ−６Ｒと特異的に結合することができる、請求項１７１〜１７９のいずれか一項に記載の誘導体。
  181. １０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０３Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは１０４Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、例えば１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１の結合速度（ｋｏｎ速度）でＩＬ−６Ｒと特異的に結合することができる、請求項１７１〜１８０のいずれか一項に記載の誘導体。
  182. １ｓ−１〜１０−６ｓ−１、好ましくは１０−２ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−３ｓ−１〜１０−６ｓ−１、例えば１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１の解離速度（ｋｏｆｆ速度）でＩＬ−６Ｒと特異的に結合することができる、請求項１７１〜１８１のいずれか一項に記載の誘導体。
  183. それぞれ対応する請求項１〜７４のいずれか一項に記載のアミノ酸配列自体、又は請求項７５〜９９のいずれか一項に記載のナノボディ自体の半減期よりも少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、例えば少なくとも５倍、例えば少なくとも１０倍、又は２０倍を超えて大きい血清半減期を有する、請求項１５７〜１８２のいずれか一項に記載の誘導体。
  184. それぞれ対応する請求項１〜７４のいずれか一項に記載のアミノ酸配列自体、又は請求項７５〜９９のいずれか一項に記載のナノボディ自体に比べて、１時間を超えて、好ましくは２時間を超えて、より好ましくは６時間を超えて、例えば１２時間を超えて、又はさらに２４時間、４８時間若しくは７２時間を超えて増大する血清半減期を有する、請求項１５７〜１８３のいずれか一項に記載の誘導体。
  185. 少なくとも約１２時間、好ましくは少なくとも２４時間、より好ましくは少なくとも４８時間、さらにより好ましくは少なくとも７２時間以上のヒトにおける血清半減期を有し、例えば本発明の化合物又はポリペプチドが、少なくとも５日（例えば約５日〜１０日）、好ましくは少なくとも９日（例えば約９日〜１４日）、より好ましくは少なくとも約１０日（例えば約１０日〜１５日）、若しくは少なくとも約１１日（例えば約１１日〜１６日）、より好ましくは少なくとも約１２日（例えば約１２日〜１８日以上）、又は１４日超（例えば約１４日〜１９日）の半減期を有し得る、請求項１５７〜１８４のいずれか一項に記載の誘導体。
  186. ペグ化誘導体である、請求項１５７〜１８５のいずれか一項に記載の誘導体。
  187. 化合物又は構築物であって、１つ又は複数の請求項１５７〜１８６のいずれか一項に記載の誘導体を含むか、又は本質的にこれから成り、任意で１つ又は複数のリンカーを介して連結した、１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位を任意でさらに含む、化合物又は構築物。
  188. 前記１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位がアミノ酸配列である、請求項１８７に記載の化合物又は構築物。
  189. 存在する場合、前記１つ又は複数のリンカーが１つ又は複数のアミノ酸配列である、請求項１８７又は１８８に記載の化合物又は構築物。
  190. 核酸又はヌクレオチド配列であって、請求項１５７〜１８６のいずれか一項に記載の誘導体（のアミノ酸配列）、或いは請求項１８７〜１８９のいずれか一項に記載の化合物又は構築物（のアミノ酸配列）をコードする、核酸又はヌクレオチド配列。
  191. 組成物であって、少なくとも１つの請求項１５７〜１８６のいずれか一項に記載の誘導体、請求項１８７〜１８９のいずれか一項に記載の化合物又は構築物、或いは請求項１９０に記載の核酸又はヌクレオチド配列を含む、組成物。
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