KR20060034650A - 룩-스루 돌연변이 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 폴리펩티드 유사체들의 라이브러리를 생산하기 위하여 폴리펩티드의 미리-선택된 영역 (또는 몇몇 서로 다른 영역들) 내에서 선택된 한 세트의 위치들의 각각 및 모든 위치에 미리-지정된 아미노산이 도입됨에 의한 돌연변이 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 특정 아미노산들이 단백질들의 구조 및 기능에 결정적인 역할을 한다는 전제를 기초로 한다. 바람직한 폴리펩티드 유사체들만을 포함하고 스크리닝을 위한 합리적인 크기를 갖는 라이브러리들이 제조될 수 있다. 상기 라이브러리들은 폴리펩티드 구조 및 기능 내에서 특정 아미노산의 역할을 연구하고, 항체들, 항체 단편들, 단쇄 항체들, 효소들, 및 리간드들과 같은 새로운 또는 향상된 폴리펩티드들을 개발하기 위해 사용될 수 있다.

Description

룩-스루 돌연변이{LOOK-THROUGH MUTAGENESIS}
[우선권주장]
본 출원은 2003년 6월 27일자로 출원되고, 그의 전체 내용이 본 명세서에 참고문헌으로 도입된 미국 가출원 제60/483282호를 우선권 주장한다. 하기 명세서 전체에 인용된 모든 다른 특허들, 특허 출원들 및 참고문헌들 또한 온전히 본 명세서에 도입된다.
본 발명은 신규하거나 향상된 단백질들 (또는 폴리펩티드들)의 제조를 위한 돌연변이 방법 및 상기 방법들에 의해 제조된 폴리펩티드 유사체들 및 특이적인 폴리펩티드들의 라이브러리들에 관한 것이다. 돌연변이의 표적이 되는 폴리펩티드는 그의 단편들, 유사체들 및 변이체들을 포함하는 천연의, 합성된 또는 가공된 폴리펩티드일 수 있다.
하나의 실시양태에서, 상기 방법은 미리-결정된 아미노산을 폴리펩티드의 아미노산 서열의 지정된 영역 (또는 몇몇 다른 영역들) 내에 필수적으로 모든 위치에 도입하는 것을 포함한다. 개별적으로 단 한 개의 미리-결정된 아미노산을 포함하지만 종합적으로는 지정된 영역(들) 내 모든 위치에 미리-결정된 아미노산을 갖는 폴리펩티드 유사체들을 포함하는 폴리펩티드 라이브러리가 생성된다. 상기 방법은, 실제로, 단일의, 미리-결정된 아미노산 (및 오직 미리-결정된 아미노산만)이 폴리펩티드의 하나 이상의 지정된 영역(들) 전체에 대해 각각의 위치 (position-by-position)가 치환되기 때문에, "룩-스루" 돌연변이로서 언급된다. 따라서, 본 발명은 상기 폴리펩티드의 지정된 영역 내에서 각각의 아미노산 위치에 개별적으로 미리-결정된 아미노산을 치환하는 구조적 및 기능적 결과들을 "훑어보는 (look-through)" 것을 허용하고, 그로 인해 원하지 않는 폴리펩티드 유사체들 (즉, "룩-스루" 모식도에 수반하는 것들 이외의 다른 아미노산 치환들을 포함하는 유사체들)의 형성으로 야기되는 어떠한 방해 또는 "잡음" 없이 상기 지정된 영역에 대해 특이적인 단백질 화학적 성질을 분리하는 것을 허용한다 (예를 들면, 실시예 및 도 6 참조).
따라서, 본 발명은 폴리펩티드의 한 개 이상의 지정된 영역에서 특이적인 아미노산 변화의 역할에 대한 매우 효율적이고 정확한 체계적인 평가를 가능케한다. 이는 두 개 이상의 지정된 영역들을 평가하고자 할 때, 그로 인해 요구되는 폴리펩티드 유사체들의 수는 점점 증가하고, 따라서, 바람직하지 않은 유사체들의 존재 또한 증가하는 경우에 특히 중요하다. 본 발명은 바람직하지 않은 유사체들을 완전히 해결함으로써 이러한 문제점을 제거하고, 따라서, 단백질 구조 또는 기능에 있어서 관찰된 임의의 변화가 결코 미리-결정된 아미노산의 치환의 결과가 아닐 가능성을 제거한 것이다. 따라서, 단백질을 이용하여 심지어 다중 부위들에 대해 서로 다른 특이적인 단백질 화학적 성질을 분리하는 효과는 높은 정확성과 효율성으 로 연구될 수 있다. 중요하게, 이는 어떻게 돌연변이가 이러한 영역들간의 상호작용에 영향을 미치는지에 대한 연구를 포함하고, 그로 인해 상기 단백질의 전체적인 구조 및 기능을 향상시킨다.
본 발명의 특정한 실시양태에서, 폴리펩티드 유사체들의 라이브러리는 먼저 폴리펩티드의 지정된 영역 또는 영역들을 암호화하는 개별적인 올리고뉴클레오티드들을 합성함에 의해 제조되고 스크리닝되는데, 종합적으로는, 상기 폴리뉴클레오티드들은 본 명세서에서 기술된 룩-스루 기준에 따라 모든 가능한 변이 폴리뉴클레오티드들을 나타낸다. 상기 변이 폴리뉴클레오티드들은 예를 들면, 생체 외 전사 및 번역을 이용하여 및/또는 리보솜 디스플레이, 파아지 디스플레이, 세균 디스플레이, 효모 디스플레이, 배열된 디스플레이 또는 당분야에 공지된 다른 모든 적당한 디스플레이 시스템과 같은 디스플레이 기술을 이용하여 발현된다.
발현된 폴리펩티드들은 그리고 나서 기능적 분석들, 예컨대 결합 분석들 또는 효소/촉매 분석들을 이용하여 스크리닝되고 선별된다. 하나의 실시양태에서, 상기 폴리펩티드들은 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 연관되어 발현되고, 그로 인해 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 동정을 가능케한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 폴리펩티드들은 단백질 화학적 성질을 이용하여 직접적으로 합성된다.
따라서, 상기 라이브러리들은 바람직하지 못한 유사체 폴리펩티드들 또는 소위 잡음을 포함하지 않기 때문에, 본 발명은 부분적으로는 스크리닝을 위한 실용적 크기를 갖는 폴리펩티드 유사체들의 라이브러리들을 생성하기 위해 사용될 수 있는 돌연변이 방법을 제공한다. 상기 방법은 폴리펩티드 구조 및 기능에 있어서 특이적인 아미노산의 역할을 연구하고 항체들, 그의 결합 단편들 또는 유사체들, 단쇄 항체들, 촉매 항체들, 효소들 및 리간드들과 같이 새롭거나 향상된 폴리펩티드들을 개발하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 상기 방법은 "룩-스루" 돌연변이를 이용하여 생산되고 연구되는 폴리펩티드 유사체들의 아집단을 선별하기 위해 사용될 수 있는 선험적 정보, 예컨대 컴퓨터 모델링을 통한 정보의 유용성을 이용하여 수행될 수 있다.
본원 발명의 다른 장점들 및 관점들은 하기 서술 및 실시예들로부터 쉽게 명백하질 것이다.
돌연변이 (mutagenesis)는 단백질 구조 및 기능 연구에 있어서 강력한 도구이다. 돌연변이는 목적하는 단백질을 암호화하는 클로닝된 유전자의 염기서열 내에서 이루어질 수 있고, 상기 변형된 유전자는 상기 단백질의 변이체들을 생산하기 위하여 발현될 수 있다.
야생형 단백질과 제조된 변이체들의 특성들을 비교함으로써, 그의 결합 및/또는 촉매 활성과 같은, 상기 단백질의 구조적 통합 및/또는 생화학적 기능에 필수적인 개별적 아미노산들 또는 아미노산들의 도메인들을 규명하는 것이 종종 가능하다. 그러나, 상기 돌연변이들을 포함하는 선발된 돌연변이체들이 단백질의 잠정적으로 중요한 영역들 (예를 들면, 단백질의 활성부위를 형성하는 영역들) 내에서 유 일하다고 할지라도, 단일 단백질로부터 제조될 수 있는 변이체들의 수는 유익하거나 바람직한 특성을 갖게 될 변이체들을 선발하는 것을 어렵게 만든다. 예를 들면, 특정 아미노산의 치환, 결실 또는 삽입은 상기 단백질에 국소적이거나 포괄적인 효과를 나타낼 수 있다.
폴리펩티드들을 돌연변이시키는 이전의 방법들은 너무 제한적이고, 너무 포괄적이거나, 기능을 획득하거나 향상시키기보다는 단백질 기능을 넉아웃 (knocking out)시키기 위한 것이었다. 예를 들면, 매우 제한적인 접근법으로 특정한 기능성 부위의 존재를 규명하거나 상기 기능성 부위 내 매우 특정화된 변형을 만드는 결과를 이해하기 위해 사용되는 선택적 또는 부위-지정 돌연변이가 있다. 부위-지정 돌연변이는 보통 인산화되어 있어 폴리펩티드가 그의 기능을 수행하는 것을 허용하는, 아미노산 잔기가 인산화와 기능적 활성간의 관계를 확인하기 위해 변형되는 인단백질들 (phosphoproteins)의 연구에 일반적으로 적용된다. 이러한 접근법은 연구 대상이 되는 상기 폴리펩티드 및 잔기에 매우 특이적이다.
한편, 매우 포괄적인 접근법으로는 유전자 또는 단백질의 지정된 영역 내 모든 가능한 변형들을 포함하는 수많은 돌연변이들을 생산하도록 고안된 포화 또는 무작위 돌연변이가 있다. 이 방법은 관련 단백질 도메인의 모든 가능한 변이체들을 필수적으로 생산함에 의해, 아미노산들의 적절한 배열이 무작위적으로 생성된 돌연변이체들 중의 하나로서 생산될 수 있다는 원리를 기초로 한다. 그러나, 실제로는, 생성된 돌연변이들의 굉장히 많은 무작위 조합들은 그렇게 많은 바람직하지 못한 후보물질들의 소위 "잡음 (noise)"의 존재로 인해 바람직한 후보물질을 유의 미하게 선택하는 능력을 제한할 수 있다.
"워크-스루 (Walk-Through)" 돌연변이 (예컨대, 미국 특허 제5,830,650호 및 제5,798,208호)라고 불리는, 또 다른 접근법은 바람직한 돌연변이 세트를 통계학적으로 포함하는 퇴화 올리고뉴클레오티드들의 혼합물을 합성함에 의해 폴리펩티드의 지정된 영역을 돌연변이시키는데 사용되어 왔다. 그러나, 퇴화 폴리펩티드 합성이 이용되기 때문에, 워크-스루 돌연변이는 바람직한 돌연변이 세트뿐만 아니라 바람직하지 못한 많은 변형들도 야기한다. 예를 들면, 오직 5개 아미노산 위치들의 지정된 영역을 가로질러 연속적으로 돌연변이를 도입하기 위해서는, 100개 이상의 올리고뉴클레오티드 한 세트가 만들어져야만 한다 (그리고 스크리닝되어야 한다) (예컨대, 도 6 참조). 따라서, 예를 들면, 두 개 또는 세 개의 영역들을 제조 및 스크리닝하는 것은 점점 복잡해지는데, 즉 단지 10개 내지 15개 돌연변이들만의 존재를 위하여, 각각 200개 내지 300개 이상의 올리고뉴클레오티드들의 제조 및 스크리닝을 요구하게 된다.
단백질들을 돌연변이시키기 위해 사용되고 있는 또 다른 접근법은 알라닌 스캐닝 돌연변이로, 단백질의 기능이 차단된 위치들을 동정하기 위하여 알라닌 잔기가 단백질의 일부분에 대해서 "스캐닝"되어진다. 그러나, 이 접근법은 기능의 획득 또는 향상이라기 보다는, 주어진 위치에서 중성 알라닌 잔기를 치환하기 위하여 단지 단백질 기능의 상실만을 관찰하는 것이다. 따라서, 이는 향상된 구조 및 기능을 갖는 단백질들의 생성을 위해 유용한 접근법이 아니다.
따라서, 새로운 또는 향상된 기능을 위해 단백질을 돌연변이시키는 체계적인 방법의 개발이 요구되고 있다.
도 1은 예컨대 D 영역들로부터 바람직한 폴리펩티드 유사체들을 동정하기 위해서 룩-스루 돌연변이 (Look-Through mutagenesis, LTM) 및 기능적 분석을 이용하여 조사될 수 있는 예시적인 지정된 영역들 (또는 D 영역들)을 나타낸 것이다.
도 2는 항체 가변 영역 (즉, 항체 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3) 내 세 개의 지정된 영역들 내에서 LTM의 사용을 나타낸 것이다. 경쇄 가변 영역이, 단독으로 또는 중쇄 가변 영역과 함께, 이와 유사하게 조사될 수 있다. 연속적인 스크리닝 분석의 편의를 위하여, 상기 중쇄 가변 영역은 나타낸 바와 같이 단쇄 항체 (sFv)의 구조 내에서 조사될 수 있다.
도 3은 중쇄 가변 영역의 지정된 영역 (즉, CDR1의 31-25 위치) 내에서 LTM의 사용을 나타낸 것이다.
도 4는 중쇄 가변 영역의 지정된 영역 (즉, CDR2의 55-68 위치) 내에서 LTM의 사용을 나타낸 것이다.
도 5는 중쇄 가변 영역의 지정된 영역 (즉, CDR3의 101-111 위치) 내에서 LTM의 사용을 나타낸 것이다.
도 6은 워크-스루 돌연변이와 비교하여 LTM의 장점을 나타낸 것이다. 대표적인 지정된 영역, 즉 항체 중쇄 가변 영역의 CDR1의 LTM은 어떠한 바람직하지 못한 아미노산 또는 소위 잡음의 도입 없이, 상기 지정된 영역 전체에 대해, 각각의 아미노산 위치의 연속적인 변형을 야기한다.
도 7은 워크-스루 돌연변이 후에 전체 단백질 구조 내로 회복된 단백질의 세 개의 지정된 영역의 통합을 나타내는 것으로, 특히 워크-스루 돌연변이 후에 항체 중쇄 가변 영역의 모든 세 개의 CDRs의 단쇄 항체 형태로의 통합을 나타낸 것이다.
도 8은 LTM에 적용된 항체 중쇄 및 경쇄의 지정된 영역들을 보다 큰 유전자 구조로 만들기 위한 중합효소 연쇄반응 (PCR)의 사용을 나타낸 것이다.
도 9는 예컨대, 세린, 히스티딘, 및/또는 아스파르트산을 포함하는 촉매부위를 획득하기 위한, 그리고 이들이 어떻게 배열될 수 있는지를 조사하기 위한 항체 가변 영역 내 CDRs 각각의 예시적인 다양성 형식들을 나타낸 것이다.
도 10은 하나의 미리-결정된 아미노산 잔기 또는 12개의 서로 다른 미리-결정된 아미노산 잔기들이 사용된 경우에, LTM에 적용되는 항체의 결합 영역의 모든 여섯 개의 CDRs의 통합 및 그 결과로 얻어진 다양성을 나타낸 것이다.
도 11은 하나의 미리-결정된 아미노산 잔기 또는 12개의 서로 다른 미리-결정된 아미노산 잔기들이 사용된 경우에, LTM에 적용되는 항-TNF 단쇄 항체 (sFv)의 결합 영역의 모든 여섯 개의 CDRs의 통합 및 그 결과로 얻어진 다양성을 나타낸 것이다.
도 12는 LTM을 사용하여 획득될 수 있는 항체 결합 영역의 여섯 개 CDRs의 가능한 폴리펩티드 유사체들의 일부를 나타내는 배열된 라이브러리를 나타낸 것이다.
도 13은 무세포 리보솜 디스플레이를 이용한 배열된 발현 라이브러리의 스크 리닝을 나타낸 것이다.
도 14는 항체 가변 영역의 결합 영역 (즉, 모든 여섯 개의 CDRs)이 LTM에 적용될 때, 조사된 복합 화학적 성질을 나타낸 것이다.
도 15는 LTM에 적용될 수 있는 몇몇 대표적인 항-TNF 결합 분자들의 (단쇄 형태 내) 가변 영역의 서열을 나타낸 것이다.
도 16은 LTM의 촉매 후보물질들을 스크리닝하기 위한 프로테아제 선별 분석을 수행하는 모식도를 나타낸 것이다.
도 17은 세균 세포에서 수행되었을 때 프로테아제 선별 분석의 기작 (및 장점들)을 묘사한 모식도를 나타낸 것이다.
도 18은 리보솜 또는 효모 디스플레이를 이용하여 촉매 활성, 예를 들면 촉매 항체 활성에 대해 유전자 라이브러리를 스크리닝하는 기작을 묘사한 공정도를 나타낸 것이다.
도 19는 선험적 정보 (예컨대, 컴퓨터 모델링 정보) 및 경험적 정보 (분석 결과들)가 보다 효율적인 분자 고안 및 개발을 위해 조화될 수 있는 곳에서 LTM을 수행하기 위한 모식도를 나타낸 것이다. LTM의 이러한 안내된 접근법은 "가이드-스루 (guide through)" 돌연변이로 언급된다.
도 20은 가상의 VH-CDR3 야생형 서열 (맨 위의 그늘진 타원형) 및 LTM His 치환 라이브러리 멤버들의 최종 결과 서열 (개방된 타원형)을 나타낸 것이다. 상기 개별적인 LTM His 치환들은 개별적인 올리고뉴클레오티드들, 예컨대 고효율 방 식으로 합성된 올리고뉴클레오티드들에 의해 암호화된다. 이 CDR 도메인에서 다른 (LTM) 아미노산 치환들에 대한 LTM 아집단 라이브러리들이 유사한 방식으로 구축된다.
도 21은 scFv 라이브러리들의 제조를 나타낸 것이다. x 축의 맨 위 화살표 및 y 축의 가장 왼쪽 컬럼에서, 세 개의 숫자들은 경쇄 및 중쇄 각각에 대한 3개의 CDRs를 나타낸다. "0"는 야생형 CDR 서열을 나타내는 반면, "1"은 LTM 돌연변이된 CDR을 나타낸다. 눈금 상의 숫자는 아집단 라이브러리의 복잡성을 나타낸다. 예를 들면, 맨 위에서, 매트릭스의 좌측 코너는 각각 상응하는 x 및 y 축들이 "000" 및 "000"인 "0"으로, "000"은 VH 및 VL 어느 쪽의 CDR에서도 LTM이 돌연변이되지 않은 것을 나타낸다. 한 열을 "0" 코너로부터 이웃하는 "1" 눈금 위치로 이동하는 것은 VH CDR1은 돌연변이된 반면 모든 VL CDR은 야생형으로 남아있음을 나타내는 x 축 "100" 및 y 축 "000"으로 표시될 것이다. 따라서, 이러한 방식으로, "4"라는 눈금 숫자는 네 개의 CDRs가 동시에 돌연변이된 것을 의미한다. 초기에, 7개의 VH 및 7개의 VL 사슬들 (화살표로 표시됨)이 SOE-PCR을 이용하여 만들어진다. 상기 VH 및 VL 사슬들은 그리고 나서 하나의 단계에서 모든 잔존하는 VL-VH 조합들을 형성하기 위하여 증폭되고 혼합되고 메가 프라이머 (mega primer)에 의해 짝지어진다.
명세서 및 청구범위의 명백한 이해를 제공하기 위하여, 다음과 같은 용어정의가 하기에 제공된다.
용어정의
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "유사체"는 하나 이상의 치환들을 갖는 변형체 또는 변이체 폴리펩티드 (또는 그러한 폴리펩티드를 암호화하는 핵산)을 말한다. 용어 "결합 분자"는 기질 또는 표적에 결합하는 단백질들, 폴리펩티드들, 및 소분자들을 포함하는 모든 결합 분자를 말한다. 하나의 실시양태에서, 상기 결합 분자는 항체 또는 그의 결합 단편 (예컨대, Fab 단편), 단일 도메인 항체, 단쇄 항체 (예컨대, sFv), 또는 리간드에 결합할 수 있는 펩티드이다.
용어 "지정된 영역"은 폴리펩티드의 선택된 영역을 말한다. 전형적으로, 지정된 영역은 예컨대 리간드의 결합 부위, 결합 분자 또는 수용체의 결합 부위, 또는 촉매 부위와 같은 기능적 부위의 전체 또는 일부를 포함한다. 상기 지정된 영역은 또한 기능적 부위의 복합적인 일부분들을 포함한다. 예를 들면, 상기 지정된 영역은 항체의 상보성 결정부위 (complementarity determining region, CDR) 또는 완전한 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 (VR)의 전체, 일부, 또는 복합적인 일부분들을 포함할 수 있다. 따라서, 기능적 부위는 상기 분자의 기능적 활성에 기여하는 단일 또는 다중의 지정된 영역들을 포함할 수 있다.
용어 "라이브러리"는 본 발명의 방법에 따라 돌연변이된 두 개 이상의 분자들을 말한다. 상기 라이브러리의 분자들은 폴리뉴클레오티드들, 폴리펩티드들, 폴리뉴클레오티드들 및 폴리펩티드들, 무세포 추출액 내 폴리뉴클레오티드들 및 폴리펩티드들의 형태로, 또는 파아지, 원핵세포들, 또는 진핵세포들의 구조 내에서 폴리뉴클레오티드들 및 폴리펩티드들일 수 있다.
용어 "돌연변이화"는 아미노산 서열의 변경을 말한다. 이는 변경된 아미노산 서열을 암호화할 수 있는 핵산 (폴리뉴클레오티드)을 변경하거나 생산함에 의해 또는 단백질 화학적 성질을 이용하여 변경된 폴리펩티드를 직접 합성함에 의해 달성될 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오티드(들)"은 DNA 분자들 및 RNA 분자들과 같은 핵산들 및 이들의 유사체 (예컨대, 뉴클레오티드 유사체들을 이용하거나 핵산 화학적 성질을 이용하여 형성된 DNA 또는 RNA)를 말한다. 목적한 대로, 상기 폴리뉴클레오티드들은, 예컨대 당분야에 공지된 (art-recognized) 핵산 화학적 성질을 이용하여 인공적으로, 또는 예컨대 중합효소를 이용하여 효소적으로 만들어질 수 있다. 전형적인 변형들은 메틸화 (methylation), 바이오틴화 (biotinylation), 및 당분야에 공지된 다른 변형들을 포함한다. 또한, 상기 핵산 분자는 단일 가닥이거나 이중 가닥일 수 있고, 목적에 따라 검출가능한 잔기에 연결되거나 연관 (예컨대, 공유적으로 또는 비-공유적으로)될 수 있다.
용어 "변이체 폴리뉴클레오티드"는 본 발명의 상응하는 폴리펩티드 유사체 (또는 그의 일부분)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 말한다. 따라서, 변이체 폴리뉴클레오티드들은 서로 다른 아미노산의 발현으로 인해 변화된 하나 이상의 코돈을 포함한다.
용어 "폴리펩티드(들)"은, 예컨대 전형적으로 50개 정도의 적은 아미노산 잔기들에서부터 1,000개 이상의 아미노산 잔기들을 포함하는 단백질 서열들과 같은 보다 큰 펩티드 서열뿐만 아니라, 펩티드 결합에 의해 연결된 두 개 이상의 아미노산들, 예컨대 폡티드들 (예컨대, 2 내지 50개 아미노산 잔기들)을 말한다.
용어 "풀화 (pooling)"는 전체 폴리펩티드 영역의 룩-스루 돌연변이를 나타내는 라이브러리를 형성하기 위한 폴리뉴클레오티드 변형체들 또는 폴리펩티드 유사체들의 조합을 말한다. 상기 분자들은 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드의 형태일 수 있고, 고체 지지체 상의 분자들로서, 용액 내 분자들로서, 및/또는 하나 이상의 유기체들 (예컨대, 파아지, 원핵세포들, 또는 진핵세포들)의 분자들로서 서브-라이브러리의 형태로 공존할 수 있다.
용어 "미리-결정된 아미노산"은 돌연변이될 폴리펩티드의 지정된 영역 내 각 위치에서의 치환을 위해 선택된 아미노산 잔기를 말한다. 이는 이미 (예컨대, 자연적으로) 상기 미리-결정된 아미노산을 포함함으로 인해 미리-결정된 아미노산으로 치환될 필요가 없는 부위 내 위치(들)은 포함하지 않는다. 따라서, 본 발명에 따라 생성된 각각의 폴리펩티드 유사체는 주어진 지정된 영역 내에 단 한 개의 "미리-결정된 아미노산" 잔기만을 포함한다. 그러나, 종합적으로는, 상기 형성된 폴리펩티드 유사체들의 라이브러리는 돌연변이된 영역 내 각 위치에 미리-결정된 아미노산을 포함한다. 통상적으로, 미리-결정된 아미노산은 보통 상기 아미노산의 측면 작용기 (side group)와 관련하여 특정한 크기 또는 화학적 성질에 대해 선택된다. 적절하게 미리-결정된 아미노산들은, 예를 들면 글리신 및 알라닌 (입체적으로 작은); 세린, 쓰레오닌 및 시스테인 (친핵성); 발린, 류신, 아이소류신, 메티오닌, 및 프롤린 (소수성); 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판 (방향족); 아스파르테이트 및 글루타메이트 (산성); 아스파라긴, 글루타민, 및 히스티딘 (아마이드); 및 라이신 및 아르기닌 (염기성)을 포함한다.
상세한 설명
단백질 연구는 특정 아미노산들이 그들의 구조 및 기능에 결정적인 역할을 함을 나타내고 있다. 예를 들면, 오직 불연속적인 다수의 아미노산들만이 항원에 대한 항체의 결합에 참여하거나 효소의 촉매과정에 관여하는 것으로 보인다.
특정 아미노산들이 단백질들의 활성 또는 기능에 결정적임이 명백하다고 하더라도, 어느 아미노산들이 관여하는지, 이들이 어떻게 관여하는지, 그리고 어떤 치환들이 상기 단백질의 구조 또는 기능을 향상시킬 수 있는지를 규명하는 것은 어려운 일이다. 실제로, 이는 폴리펩티드들 내 아미노산 곁사슬들의 공간적 형상의 복잡성 및 기능적 부위를 형성하는데 기여하는 상기 폴리펩티드의 서로 다른 단백질들간의 상호관계에 기인한다. 예를 들면, 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역들의 6개 CDRs간의 상호관계는 상기 항원 또는 리간드-결합 포켓 (pocket)에 기여한다.
선택적 (부위-지정) 돌연변이 및 포화 돌연변이와 같은 이전의 돌연변이 방법들은 복잡한 폴리펩티드들 내에서 엄청난 수의 변형들이 가능하다는 측면에서 단백질 구조 및 기능의 연구를 위한 유용성이 제한적이다. 이는 특히 바람직한 조합들이 거대한 양의 바람직하지 못한 조합들 또는 소위 잡음의 존재를 수반하는 경우에 종종 그렇다.
본 발명의 방법은 폴리펩티드의 구조 또는 기능에서, 폴리펩티드의 지정된 영역 내 특정 아미노산들의 역할 및 이들의 위치를 평가하고, 따라서, 향상된 폴리펩티드들을 생산하는데 체계적이고, 실용적이고, 매우 정확한 접근법을 제공한다.
1. 지정된 영역의 선택
본 발명에 따라, 단백질 내 지정된 영역 또는 영역들이 돌연변이를 위해 선택된다. 통상적으로, 상기 영역들은 단백질의 구조 또는 기능에 중요하다고 여겨진다 (예컨대, 도 1 참조). 이는, 예를 들면, 어떠한 구조적 및/또는 기능적 측면들이 알려져 있는가로부터 추론될 수 있거나 다른 단백질들의 연구로부터 알려진 것과 상기 지정된 영역(들)의 비교를 통해 추론될 수 있고, 정보의 모델링에 의해 보조될 수 있다. 예를 들면, 상기 지정된 영역은 기능적 부위, 예컨대 결합 촉매 또는 다른 기능에 있어서 역할을 하는 것일 수 있다. 하나의 실시양태에서, 상기 지정된 영역은 항원 결합분자의 과변이 부위 또는 상보성 결정부위 (CDR)이다. 다른 실시양태에서, 상기 지정된 영역은 상보성 결정부위 (CDR)의 일부분이다. 또 다른 실시양태에서, 두 개 이상의 지정된 영역들, 예컨대 CDRs 또는 그의 일부분들이 돌연변이를 위해 선택될 수 있다.
2. 미리-결정된 아미노산 잔기의 선택
상기 지정된 영역(들) 내에서 치환을 위해 선택된 아미노산 잔기는 일반적으로 목적하는 구조 또는 기능에 관여하는 것으로 알려진 아미노산들로부터 선택된다. 20종의 자연 발생적인 아미노산들은 그들의 곁사슬과 관련하여 달라진다. 각각의 곁사슬은 각각의 아미노산을 특별하게 만드는 화학적 특성들을 담당한다. 결합을 변경하거나 새로운 결합 친화력을 생성하기 위하여, 일반적으로 20종의 자연 발생적인 아미노산들 중의 어떠한 것도 선택될 수 있다. 따라서, 모든 치환들에 대해 엄청난 수의 유사체들을 생성하는 이전의 돌연변이 방법들은 20종 아미노산들 각각의 치환이 단백질 결합에 미치는 효과를 평가하는데 비실용적이다. 반면, 본 발명의 방법들은 각각의 아미노산 치환에 대해서 실용적인 수의 유사체들을 생성시키고, 따라서, 단백질의 분리된 지역 또는 지역들 내에서 보다 다양한 단백질 화학적 성질을 평가하는 것을 가능케한다.
단백질 결합과는 달리, 오직 아미노산 잔기들의 아집단만이 통상적으로 효소 또는 촉매 과정에 참여한다. 예를 들면, 곁사슬들의 화학적 특성들로부터, 오직 선택된 수의 천연 아미노산들만이 우선적으로 촉매 과정에 참여한다. 이들 아미노산들은 Ser, Thr, Asn, Gln, Tyr, 및 Cys와 같은 극성 및 중성 아미노산들의 그룹, Asp 및 Glu, Lys 및 Arg와 같은 전하를 띤 아미노산들의 그룹에 속하는데, 특히 아미노산 His이 바람직하다. 다른 극성 및 중성 곁사슬들은 Cys, Ser, Thr, Asn, Gln 및 Tyr의 곁사슬들이다. Gly 역시 상기 그룹의 경계 구성원인 것으로 간주된다. Ser 및 Thr은 수소결합을 형성하는데 중요한 역할을 담당한다. Thr은 beta-탄소에 부가적인 비대칭을 갖는데, 그로 인해 유일하게 입체이성질체들의 하나로 사용된다. 아미노산 Gln 및 Asn 역시 수소결합을 형성할 수 있는데, 상기 아미도 작용기들은 수소 공여자로서 작용하고 카보닐 작용기들은 수용체로서 작용한다. Gln은 극성 작용기를 보다 유연하게 만들어 주요 사슬과의 상호작용을 감소시키는 CH2 작용기를 Asn보다 하나 더 갖는다. Tyr은 높은 pH 값들에서 해리될 수 있는 매우 극성인 하이드록실 작용기 (페놀성 OH)를 갖는다. Tyr은 어느 정도는 전하를 띤 사슬처럼 행동하는데, 그의 수소결합들은 상당히 강하다.
중성 극성 아미노산들은 단백질 분자들의 내부뿐만 아니라 표면에서도 발견된다. 내부 잔기들로서, 이들은 보통 서로 또는 폴리펩티드 골격과 수소결합들을 형성한다. Cys는 이황화 가교를 형성할 수 있다.
히스티딘 (His)은 6.0의 pK 값을 갖는 헤테로고리 방향족 곁사슬을 갖는다. 생리학적 pH 범위 내에서, 그의 이미다졸 고리는 용액으로부터 수소이온을 흡수한 후에 변경되지 않거나 변경될 수 있다. 이러한 두 가지 상태는 쉽게 이용가능하기 때문에, His는 화학반응들을 촉매하는데 매우 적당하다. His는 효소들의 활성 중추들, 예컨대 세린 프로테아제에서 발견된다.
Asp 및 Glu는 생리학적 pH에서 음성 전하를 띤다. 이들의 짧은 곁사슬 때문에, Asp의 카르복실 작용기는 주요 사슬에 대하여 훨씬 더 단단하다. 이는 왜 많은 촉매 부위들 중에서 상기 카르복실 작용기가 Glu가 아닌 Asp에 의해 제공되는가에 대한 이유이다. 전하를 띤 아미노산들은 일반적으로 폴리펩티드의 표면에서 발견된다.
또한, Lys 및 Arg는 표면에서 발견된다. 이들은 유사한 에너지를 갖는 다중 회전 이성질체를 나타내는 길고 유연한 곁사슬들을 갖는다. 몇몇 경우들에서, Lys 및 Arg는 내부 염 가교들을 형성하는데 참여하거나 촉매작용을 보조한다. 상기 폴리펩티드의 표면에서 이들의 노출로 인해, Lys는 곁사슬을 변형하거나 Lys 잔기들의 카보닐 말단에서 펩티드 결합을 절단하는 효소들에 의해 훨씬 더 빈번하게 인식되는 잔기이다.
아미노산의 상기 곁 작용기 화학적 성질은 미리-결정된 아미노산 잔기의 선택을 안내할 수 있는 반면, 바람직한 곁 작용기 화학적 성질의 부재는 미리-결정된 아미노산으로서의 사용을 위해 아미노산 잔기를 배제시키는 기준이 될 수 있다. 예를 들면, 입체적으로 작고 화학적으로 중성인 아미노산들, 예컨대 알라닌은 목적하는 화학적 성질을 결실시키기 위한 룩-스루 돌연변이로부터 배제될 수 있다.
3. 폴리펩티드 유사체 라이브러리의 합성
하나의 실시양태에서, 폴리펩티드 유사체들의 라이브러리는 상기 폴리펩티드의 지정된 영역을 암호화하고 미리-결정된 아미노산에 대한 단 한 개의 코돈만을 포함하는 개별적인 올리고뉴클레오티드들을 합성함에 의해 스크리닝을 위해 제조된다. 이는 상기 올리고뉴클레오티드 내 각각의 코돈 위치에 야생형 올리고펩티드의 합성을 위해 요구되는 코돈 또는 미리-결정된 아미노산에 대한 코돈을 도입함에 의해 달성된다. 이는 각각의 올리고뉴클레오티드에 대해 다중 돌연변이가 아닌 단 한 개의 돌연변이가 만들어진다는 점에서 포화 돌연변이, 무작위 돌연변이, 또는 워크-스루 돌연변이와 다르다.
상기 올리고뉴클레오티드들은 개별적으로 생산될 수 있고, 그리고 나서 목적한 대로 혼합되거나 집단화될 수 있다. 야생형 서열의 코돈 및 미리-결정된 아미노산에 대한 코돈이 동일한 경우에는, 어떠한 치환도 이루어지지 않는다.
따라서, 상기 지정된 영역 내 아미노산 위치들의 숫자가 생성된 올리고뉴클레오티드들의 최대 숫자를 결정할 것이다. 예를 들면, 만약 5개 코돈 위치들이 미리-결정된 아미노산으로 변경된다면, 5개 올리고뉴클레오티드들과 야생형 아미노산 서열을 나타내는 한 개의 폴리뉴클레오티드가 합성된다. 두 개 이상의 영역들이 동시에 변경될 수 있다.
라이브러리의 생성을 위한 올리고뉴클레오티드들의 혼합물은 DNA 합성을 위해 공지된 방법들에 의해 용이하게 합성될 수 있다. 바람직한 방법은 고체상 베타-사이아노에틸 포스포로아미다이트 (solid phase beta-cyanoethyl phosphoramidite) 화학적 성질의 사용을 포함한다. 미국 특허 제4,725,677호를 참조하라. 편의를 위하여, 뉴클레오티드들의 특정화된 시약 용기들을 포함하는 자동화된 DNA 합성 장치가 사용될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드들은 또한, 예컨대 지정된 영역을 나타내는 폴리뉴클레오티드들의 보다 큰 유전자 조직 내로의 도입 또는 재조립을 용이하게 하기 위하여 제한효소 부위들 또는 시발체 혼성화 부위들을 포함하도록 합성될 수 있다.
합성된 올리고뉴클레오티드들은 표준 유전공학 기술들을 이용하여 돌연변이된 폴리펩티드의 보다 큰 유전자 구조 내로 삽입될 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드들은 제한효소들에 대한 인접한 인식부위들을 포함하도록 제조될 수 있다. Crea, R., 미국 특허 제4,888,286호를 참조하라. 상기 인식부위들은 자연적으로 존재하거나 상기 영역을 암호화하는 DNA에 인접한 유전자 내에 도입된 인식부위들에 상응하도록 고안된다. 이중 가닥 형태로 전환시킨 후, 상기 폴리뉴클레오티드들은 표준 기술들에 의해 상기 유전자 내로 연결된다. 적절한 벡터 (예컨대, 파아지 벡터들, 플라스미드들을 포함)에 의해, 상기 유전자들은 돌연변이 폴리펩티드들의 발현에 적당한 무세포 추출액, 파아지, 원핵세포 또는 진핵세포 내로 도입될 수 있다.
돌연변이되는 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열이 공지되거나 상기 DNA 서열이 공지된 경우에, 유전자 합성은 가능한 접근법이다. 예를 들면, 부분적으로 중복되지는 폴리뉴클레오티드들, 통상적으로 약 20 내지 60개 뉴클레오티드들 길이로 고안될 수 있다. 그리고 나서, 내부 폴리뉴클레오티드들은 인산화되고 이후의 어닐링에 유용한 단일가닥 확장들과 함께 이중가닥 DNA 분자를 제공하기 위해 이들의 상보적인 파트너에 어닐링된다. 상기 어닐링된 짝들은 그리고 나서 함께 혼합되고 전장의 이중가닥 분자를 형성하기 위해 연결된다 (예컨대, 도 8 참조). 편리한 제한효소 부위들이 적당한 벡터로의 클로닝을 위해 합성 유전자의 양 말단 근처에 고안될 수 있다. 상기 전장의 분자들은 이러한 제한효소들로 절단된 후 적당한 벡터 내로 연결된다. 편리한 제한효소 부위들은 또한 돌연변이 카세트들의 도입을 용이하게 하기 위하여 상기 합성 유전자 내로 도입될 수 있다.
전장의 이중가닥 유전자를 나타내는 폴리뉴클레오티드들을 합성하기 위한 대안으로서, 그들의 3'-말단들이 부분적으로 중복되는 (즉, 상보적인 3'-말단들을 갖는) 폴리뉴클레오티드들은 틈이 난 구조 내로 재조립될 수 있고, 그리고 나서 전장의 이중가닥 유전자를 만들기 위하여 적절한 중합효소를 이용하여 그 틈이 채워질 수 있다. 통상적으로, 상기 중복된 폴리뉴클레오티드들은 40 내지 90개 뉴클레오티드 길이이다. 그리고 나서, 상기 연장된 폴리뉴클레오티드들은 연결된다. 편리한 제한효소 부위들이 클로닝 과정을 위해 양 말단 및/또는 내부에 도입될 수 있다. 적절한 제한효소 또는 효소들을 이용한 절단 이후에, 유전자 절편을 적당한 벡터 내로 연결시킨다. 다르게는, 상기 유전자 절편은 둔단말단이 되어 적절한 벡터 내로 연결될 수 있다.
이들 접근법에 있어서, 만약 편리한 제한효소 부위들이 아후의 유전자 조립에 이용가능하다면 (자연적으로 또는 인공적으로), 상기 퇴화 폴리뉴클레오티드들은 상기 카세트를 적절한 벡터 내로 클로닝함에 의해 연속적으로 도입될 수 있다. 다르게는, 상기 퇴화 폴리뉴클레오티드들은 유전자 조립의 단계에서 도입될 수 있다. 예를 들면, 상기 유전자의 두 가닥 모두 완전히 화학적으로 합성되었을 때, 중복되고 상보적인 퇴화 폴리뉴클레오티드들이 생산될 수 있다. 상보적인 쌍들은 서로 어닐링될 것이다.
부분적으로 중복되는 폴리뉴클레오티드들이 유전자 조립에 사용될 때, 한 세트의 퇴화 뉴클레오티드들이 상기 폴리뉴클레오티드들 중의 하나 대신에 직접적으로 도입될 수도 있다. 적절한 상보적 가닥은 중합효소를 이용한 효소적 확장에 의해 다른 가닥 유래의 부분적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드로부터 확장 반응 동안에 합성된다. 합성 단계에서 상기 퇴화된 폴리뉴클레오티드들의 도입은 또한 유전자의 하나 이상의 도메인 또는 지정된 영역이 돌연변이되는 클로닝을 단순화시킨다.
다른 접근법에서, 목적하는 유전자는 단일가닥 플라스미드 상에 존재한다. 예를 들면, 상기 유전자는 파아지 벡터 또는 헬퍼 파아지의 사용에 의해 단일-가닥 분자들의 증식을 허용하는 선형의 파아지 복제 기원을 갖는 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 상기 단일-가닥 주형은 목적하는 돌연변이들을 나타내는 한 세트의 퇴화 폴리뉴클레오티드들에 어닐링된 후 연장되고 연결될 수 있고, 그렇게 해서 각각의 유사체 가닥을 적절한 숙주 내로 도입될 수 있는 분자들의 집단 내로 도입시킬 수 있다 (Sayers, J. R. et al., Nucleic Acids Res. 16: 791-802 (1988)). 이러한 접근법은 다중 도메인들이 돌연변이를 위해 선택된 경우에 다중 클로닝 단계의 문제점들을 해결할 수 있다.
중합효소 연쇄반응 (PCR) 방법 역시 폴리뉴클레오티드들을 유전자 내로 도입하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드들은 그 자체로 확장을 위한 시발체들로 사용될 수 있다. 이 접근법에서, 지정된 영역 (또는 그의 일부분)에 상응하는 돌연변이 카세트들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드들은, 적어도 부분적으로는, 서로 상보적이고, 중합효소를 이용하여, 예컨대 PCR 증폭을 이용하여 큰 유전자 카세트를 형성하기 위해 확장될 수 있다.
상기 라이브러리의 크기는 돌연변이되는 영역들의 길이 및 수와 그 영역 내 아미노산들에 따라 달라질 것이다. 바람직하게는, 상기 라이브러리는 1015, 1014, 1013, 1012, 1011, 1010, 109, 108, 107 미만의, 더욱 바람직하게는 106 폴리펩티드 유사체들 또는 그 미만을 포함하도록 고안될 것이다.
상기 설명은 상응하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 변경함에 의한 폴리펩티드들의 돌연변이 및 폴리펩티드들의 라이브러리에 집중되어 있다. 그러나, 본 발명의 범위는 또한 단백질 화학적 성질을 이용하여 목적하는 폴리펩티드 유사체들의 직접적인 합성에 의해 폴리펩티드들을 돌연변이시키는 방법들을 포함하는 것으로 이해되어져야 한다. 이러한 접근법을 수행하는데 있어서, 결과 폴리펩티드들은 폴리펩티드 중간체의 사용이 제거된 것을 제외하고는 본 발명의 특징들을 여전히 포함한다.
상기에 기술된 라이브러리를 위하여, 폴리뉴클레오티드들 및/또는 상응하는 폴리펩티드들의 형태에서, 상기 라이브러리들은 당분야에 인식된 기술들을 이용하여, 마이크로칩과 같은 고체 지지체에 부착되고 바람직하게는 배열될 수도 있는 것으로 이해되어져야 한다.
4. 발현 및 스크리닝 시스템
상기 기술들 또는 다른 적당한 기술들 중의 하나에 의해 제조된 폴리뉴클레오티드들의 라이브러리들은 목적하는 구조 및/또는 활성을 갖는 폴리펩티드 유사체들을 동정하기 위하여 발현되고 스크리닝될 수 있다. 상기 폴리펩티드 유사체들의 발현은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 무세포 디스플레이 시스템들 (예컨대, 리보솜 디스플레이 및 배열된 (예컨대, 미세배열된 또는 거대배열된) 디스플레이 시스템들), 세균성 디스플레이 시스템들, 파아지 디스플레이 시스템들, 원핵세포들, 및/또는 진핵세포들 (예컨대, 효모 디스플레이 시스템들)을 포함하는 모든 적당한 발현 디스플레이 시스템을 이용하여 수행될 수 있다.
하나의 실시양태에서, 상기 폴리뉴클레오티드들은 무세포 추출액 내에서 발현될 수 있는 주형들로 제공되기 위해 조작된다. 예를 들면, 미국 특허 제5,324,637호; 제5,492,817호; 제5,665,563호에 기술된 바와 같은 벡터들 및 추출물들이 사용될 수 있고, 많은 것들이 상업적으로 이용가능하다. 폴리펩티드 (즉, 표현형)에 대한 폴리뉴클레오티드 (즉, 유전형)를 연결하기 위한 리보솜 디스플레이 및 다른 무세포 기술들, 예컨대 프로퓨전 (ProfusionTM)(미국 특허 제6,348,315호; 제6,261,804호; 제6,258,558호; 및 제6,214,553호 참조)이 사용될 수 있다.
다르게는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드들은 플럭천 및 스케라 (Pluckthun, A. and Skerra, A., Meth. Enzymol. 178: 476-515 (1989); Skerra A. et al., Biotechnology 9: 273-278 (1991))에 의해 기술된 바와 같은 편리한 대장균 발현 시스템 내에서 발현될 수 있다. 상기 돌연변이 단백질들은, 베터 및 호르위츠에 의해 기술된 바와 같이 (M. Better and A. Horwitz, Meth. Enzymol. 178: 476 (1989)) 배지 내 및/또는 세균의 세포질 내로 분비되기 위해 발현될 수 있다. 하나의 실시양태에서, VH 및 VL을 암호화하는 단일 도메인들은 각각 ompA, phoA 또는 pelB와 같은 시그널 서열을 암호화하는 서열의 3'-말단에 부착된다 (Lei, S. P. et al., J. Bacteriol. 169: 4379 (1987)). 이러한 유전자 융합들은 다이시스트로닉 (dicistronic) 구조물 내에서 조립되어 단일 벡터로부터 발현될 수 있고, 재중첩되고 활성형태로 회수될 수 있는 대장균의 원형질막 주위공간으로 분비된다 (Skerra, A. et al., Biotechnology 9: 273-278 (1991)). 예를 들면, 항체 중쇄 유전자들은 항체 또는 항체 절편들을 생산하기 위하여 항체 경쇄 유전자들과 동시에 발현될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 상기 폴리뉴클레오티드들은 예를 들면, 미국 특허 제6,423,538호; 제6,331,391호; 및 제6,300,065호에 기술된 바와 같은 효모 디스플레이를 이용하여 효모와 같은 진핵세포들 내에서 발현될 수 있다. 이러한 접근법에서, 상기 라이브러리의 폴리펩티드 유사체들은 발현되어 효모의 표면에 표시된 폴리펩티드에 융합된다. 본 발명의 폴리펩티드들의 발현을 위한 다른 진핵세포들로 포유동물 세포들, 예를 들면 골수종 세포들, 하이브리도마 세포들, 또는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포들 역시 사용될 수 있다. 전형적으로, 상기 폴리펩티드 유사체들은 포유동물 세포들에서 발현될 때 배양 배지 내로 발현되거나 그러한 세포의 표면에 발현되도록 고안된다. 상기 항체 또는 항체 절편들은, 예를 들면 전체 항체 분자들 또는 개별적인 VH 및 VL 절편들, Fab 절편들, 단일 도메인들, 또는 단쇄들 (sFv)로서 생산될 수 있다 (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 (1988) 참조).
상기 발현된 폴리펩티드 유사체들 (또는 직접 합성에 의해 생산된 폴리펩티드들)의 스크리닝은 임의의 적절한 방법들에 의해 수행될 수 있다. 예를 들면, 결합 친화력은 표준 면역분석 및/또는 친화 크로마토그래피에 의해 평가될 수 있고, 촉매 활성은 기질 전환을 위한 적당한 분석들에 의해 확인될 수 있다. 단백질분해 기능에 대한 본 발명의 폴리펩티드 유사체들의 스크리닝은, 예를 들면 미국 특허 제5,798,208호에 기재된 바와 같은 표준 헤모글로빈 플라크 분석을 이용하여 달성될 수 있다.
5. 컴퓨터 모델링-보조 룩 스루 돌연변이
본 발명의 룩-스루 돌연변이는 또한 제조되는 폴리펩티드 유사체들에 관한 구조적 혹은 모델링 정보의 이점을 이용하여 수행될 수도 있으며, 그렇게 하면 목적하는 향상된 기능을 갖는 유사체들을 제조하는 가능성은 증가된다. 상기 구조적 또는 모델링 정보는 또한 지정된 영역들 내로 도입하기 위하여 미리-결정된 아미노산들의 선택을 지시하는데 사용될 수도 있다. 나아가, 본 발명의 폴리펩티드 유사체들을 이용하여 얻은 실제 결과들은 반복적인 방법으로 제조되고 스크리닝되는 연속적인 폴리펩티드들의 선택 (또는 배제)을 지시할 수 있다. 따라서, 구조적 또는 모델링 정보는 본 발명에서의 사용을 위해 폴리펩티드 유사체들의 초기 아집단을 형성하기 위해 사용될 수 있고, 그로 인해 향상된 폴리펩티드들을 제조하는 효율을 추가로 증가시킨다.
특정 실시양태에서, 조잡하거나 바람직하지 못한 구조 및/또는 기능을 갖는 것으로 예상되는 모든 폴리펩티드 유사체의 생산을 제거하기 위해 가상 (in silico) 모델링이 사용된다. 이러한 방식에서는, 생산되는 폴리펩티드 유사체들의 숫자는 급격하게 감소되고, 그로 인해 연속되는 스크리닝 분석들에서 잡음-대비 신호 (signal-to-noise)가 증가한다. 또 다른 특정 실시양태에서, 상기 가상 모델링은 임의의 관련된 공급원, 예컨대 유전자 및 단백질 서열 및 이전에 조사된 유사체들로부터 얻은 3차원 데이터베이스 및/또는 결과들로부터 얻은 부가적인 모델링 정보가 계속적으로 업데이트되어 가상 데이터베이스는 그의 예측력에 있어서 점점 정확해진다 (도 19).
또 다른 실시양태에서, 상기 가상 데이터베이스는 이전에 조사된 폴리펩티드 유사체들의 분석 결과와 함께 제공되고 분석 기준 또는 기준들에 근거하여 상기 유사체들을 반응자들 또는 무반응자들, 예컨대 잘 결합하거나 결합하지 않는 폴리펩티드 유사체들로, 혹은 효소적/촉매적이거나 효소적/촉매적이지 않은 폴리펩티드 유사체들로 분류된다. 이러한 방식에서, 본 발명의 가이드-스루 돌연변이는 특정한 구조적 정보를 이용하여 기능적 반응의 범위를 평균화시킬 수 있고, 조사되는 추가적인 폴리펩티드 유사체들의 생산을 지시하기 위하여 그러한 정보를 사용할 수 있다. 따라서, 상기 방법은 결합 친화력 (예컨대, 특이성), 안정성 (예컨대, 반감기) 및/또는 효과기 기능 (예컨대, 보체 활성 및 ADCC)과 같은 특정한 기능에 대해 항체 또는 항체 절편들을 스크리닝하기에 특히 적합하다. 따라서, 만약 지정된 영역 내 특정 잔기들이 목적하는 기능에 관여하지 않을 것임이 예컨대 가상 모델링을 통해 알려진다면, 지정된 영역 내 인접하지 않는 잔기들의 돌연변이가 바람직할 수 있다. 지정된 영역들, 예컨대 상기 폴리펩티드의 지정된 영역 내 기능성 아미노산 잔기들, 예컨대 도입되어지는 미리-결정된 아미노산 잔기들간의 등위 구조 및 공간적 상호관계는 고려되고 모델링될 수 있다. 이러한 모델링 기준은, 예컨대 아미노산 잔기 곁 작용기 화학적 성질, 원자간 거리, 결정학 데이터 등을 포함한다. 따라서, 생산되는 폴리펩티드 유사체들의 숫자는 합리적으로 최소화될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 상기 단계들의 하나 이상이 컴퓨터에 의해 보조된다 (computer-assisted). 상기 방법은 또한, 부분적으로 또는 전체적으로, 예컨대 컴퓨터 구동 장치와 같은 장치에 의해 수행되기 위해 순응된다. 따라서, 상기 방법을 수행하기 위한 지시들은, 부분적으로 또는 전체적으로, 상기 지시들을 수행하기 위한 전자적 장치 내에서의 사용에 적합한 매질에 부여될 수 있다. 결론적으로, 본 발명의 방법들은 소프트웨어 (예컨대, 컴퓨터-판독가능 지시들) 및 하드웨어 (예컨대, 컴퓨터들, 로봇공학 및 칩들)을 포함하는 고효율 접근법에 순응된다.
6. 다중 지정된 영역들의 복합 화학적 성질의 탐구
본 발명은 폴리펩티드의 서로 다른 영역들 또는 도메인들의 동시 돌연변이에 의한 평가를 허용하는 중요한 장점을 동시에 제공한다. 이는 각각의 영역 내에 동일한 또는 서로 다른 미리-결정된 아미노산을 이용하여 달성될 수 있고, 형태적으로 관련된 영역들 내 아미노산 치환들의 평가를 가능케 하는데, 그러한 부위들은 폴리펩티드의 중첩시 기능적 부위 (예컨대, 항체의 결합부위 또는 효소의 촉매부위)를 형성하기 위해 연계된다. 차례로, 이는 새롭거나 향상된 기능적 부위들을 생성하기 위한 효과적인 방식을 제공한다.
예를 들면, 도 14에 나타난 바와 같이, 항원 결합부위 (Fv 부위)의 독특한 특징들을 형성하는 항체의 6개 CDRs는 이 부위에서 선택된 아미노산들의 3차원적 상호관계를 연구하기 위하여, VH 또는 VL 사슬들 내에서 동시에 혹은 개별적으로 돌연변이될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 3개 이상의 지정된 영역들의 복합적인 화학적 성질은 룩-스루 돌연변이를 이용하여 체계적으로 조사되고, 바람직하게는 6개 부위들, 예를 들면 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 6개 CDRs에 대해 조사된다. CDR에 대한 룩-스루 돌연변이를 수행하기 위하여, 통상적으로 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 또는 그 이상의 아미노산 위치들이 변경된다.
따라서, 본 발명은 신규하고 향상된 폴리펩티드들의 많은 다른 형태들의 고안을 위해 새로운 가능성들을 제시한다. 본 발명은 단백질의 기존 구조 또는 기능을 향상시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 항체 또는 항체 절편의 결합부위가 도입될 수 있거나, 기존에 존재하는 항원에 대한 친화력, 효과기 기능 및/또는 안정성이 향상될 수 있다. 다르게는, 부가적인 "촉매적으로 중요한" 아미노산들의 효소의 촉매 도메인 내로의 도입은 기질에 대해 변형된 또는 증가된 촉매 활성을 야기하기 위해 수행될 수 있다. 다르게는, 완전히 새로운 구조들, 특이성들 또는 활성들이 폴리펩티드 내로 도입될 수 있다. 효소적 활성의 드 노보 (de novo) 합성 역시 달성될 수 있다. 새로운 구조들은 본 발명의 방법에 의해 관련된 영역들만을 변이시킴에 의해 기존 단백질의 천연의 또는 보존적인 "골격 (scaffold)" 위에 형성될 수 있다.
7. 새롭거나 향상된 항체들의 제조를 위한 룩-스루 돌연변이
본 발명의 방법은 특히 항체 분자들을 변형하는데 유용하다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 항체 분자들 또는 항체들은 전장의 항체들, Fv 분자들, 또는 다른 항체 단편들, 그의 개별적 사슬들 또는 단편들 (예컨대, Fv의 단쇄), 단쇄 항체들, 및 키메라 항체들과 같은 항체들 또는 그의 일부분들을 말한다. 변형들은 항체의 가변 영역 및/또는 기본골격 (불변) 영역 내로 도입될 수 있다.
가변 영역의 변형은 보다 나은 항원 결합 특성들 및, 만약 원한다면, 촉매적 특성들을 갖는 항체들을 생산할 수 있다. 기본골격 영역의 변형은 또한, 예를 들면 상업적 생산에 특히 유용한 용해도 또는 안정성 (예컨대, 반감기), 생체이용률, 효과기 기능 (예컨대, 보체 활성 및/또는 ADCC) 및 항원에 대한 결합 친화력 (예컨대, 특이성)과 같은 화학적-물리학적 특성들의 향상을 유도할 수 있다. 전형적으로, 상기 돌연변이는 항체 분자의 Fv 영역, 즉 하나는 중쇄 (VH)로부터 유도되고 다른 하나는 경쇄 (VL)로부터 유도된 두 개 사슬들의 가변 영역들로 이루어진 항원-결합 활성을 담당하는 구조를 표적할 것이다. 일단 목적하는 항원-결합 특성들이 규명되면, 상기 가변 영역(들)은 IgG, IgM, IgA, IgD, 또는 IgE와 같은 적절한 항체 클래스 내로 조작될 수 있다.
8. 촉매적/효소적 폴리펩티드들의 제조/향상을 위한 룩-스루 돌연변이
본 발명의 방법은 또한 촉매 단백질들, 특히 촉매 항체들의 고안에 특히 적합하다. 현재, 촉매 항체들은 표준 체세포 융합 기술들의 적용에 의해 제조될 수 있다. 이 과정에서, 전이상태에 결합하여 반응을 촉매할 수 있는 항체의 생산을 유도하기 위하여 목적하는 기질의 전이상태를 닮은 항원으로 동물을 면역화시킨다. 항체-생산 세포들을 상기 동물로부터 회수하고 하이브리드 세포들을 생산하기 위하여 무한증식 세포와 융합시킨다. 이들 세포들은 그리고 나서 상기 반응을 촉매하는 항체의 분비에 대해서 스크리닝된다. 이 과정은 기질의 전이상태의 유사물질들의 이용가능성에 의존적이다. 상기 과정은 대부분의 경우에 이러한 유사물질들을 동정하거나 합성하는 것이 어려울 것 같기 때문에 제한적일 수 있다.
본 발명의 방법은 전이상태 유사물질에 대한 요구를 제거하는 다른 접근법을 제공한다. 본 발명의 방법에 의해, 항체는 면역글로불린 (Fv 영역)의 결합부위 내로 적당한 아미노산들의 도입에 의해 촉매적으로 제조될 수 있다. 항원-결합부위 (Fv) 영역은 3개는 면역글로불린 중쇄 (H)로부터 유도되고 나머지 3개는 경쇄 (L)로부터 유도된 6개의 과변이 (CDR) 루프들로 구성되는데, 이들은 각각의 소단위 내에서 베타-가닥들을 연결한다. 상기 CDR 루프들의 아미노산 잔기들은 각각의 특이적인 단일클론 항체의 결합 특성들에 거의 완전하게 기여한다. 예를 들면, 세린 프로테아제 처리 후에 설계된 촉매적 삼징후들 (triads)(세린, 히스티딘 및 아스파르트산 아미노산 잔기들을 포함하는)은 기질 분자에 대해 공지된 친화력을 갖는 항체의 Fv 영역의 과변이 분절들 내에서 생성될 수 있고 상기 기질의 단백질 분해 활성에 대해 스크리닝될 수 있다.
특히, 본 발명의 방법은 산화환원효소들 (oxidoreductases), 전이효소들 (transferases), 가수분해효소들 (hydrolases), 절단효소들 (lyases), 이성화효소들 (isomerases) 및 연결효소들 (ligases)을 포함하는 많은 효소들 또는 촉매 항체들을 생산하는데 사용될 수 있다. 이들 클래스들 중에서, 향상된 프로테아제, 카보하이드라제 (carbohydrase), 리파제, 다이옥시게나제 (dioxygenase) 및 퍼옥시다제의 생산이 특히 중요할 것이다. 본 발명의 방법에 의해 제조될 수 있는 이들 및 다른 효소들은 건강 관리, 화장품, 식품, 양조, 세제, 환경 (예컨대, 폐수 처리), 농업, 무두질, 섬유, 및 다른 화학적 공정들에서 효소적 전환들에 대해 중요한 상업적 적용성을 갖는다. 이들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 진단 및 치료학적 적용들, 지방, 탄수화물 및 단백질의 전환들, 유기 오염물질들의 분해. 및 화학물질들의 합성을 포함한다. 예를 들면, 섬유소용해 (fibrolytic) 활성, 또는 바이러스 외피 단백질들과 같이 감염력에 요구되는 바이러스 구조에 대해 활성을 갖는 치료학적으로 효과적인 프로테아제들이 조작될 수 있다. 이러한 프로테아제들은 예를 들면, HIV, 라이노바이러스 (rhinoviruses), 인플루엔자, 또는 간염 바이러스와 같은 바이러스들에 대한 유용한 항-혈전제 또는 항-바이러스제일 수 있다. 옥시게나제 (예컨대, 다이옥시게나제)의 경우에, 방향족 고리들 및 다른 이중 결합들의 산화, 생물펄핑 (biopulping) 공정에 있어서 산업적 적용들, 생물량 (biomass)의 연료 또는 다른 화학물질들로의 전환, 폐수 오염물질들의 전환, 석탄의 생물공정, 및 유해한 유기화합물들의 해독을 위해 보조인자를 요구하는 한 그룹의 효소들이 신규 단백질들의 가능한 적용들이다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 더욱 상세하게 설명되는데, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 전반적으로, 다른 진술이 없는 한 하기 물질들 및 방법들이 사용되었다:
물질들 및 방법들
일반적으로, 본 발명의 실행은, 다른 지시가 없는 한, 당분야의 기술수준 내에서, 그리고 문헌에 설명된 화학, 분자 생물학, 재조합 DNA 기술, PCR 기술, 면역학 (특히, 예컨대 항체 기술), 발현 시스템들 (예컨대, 무세포 발현, 파아지 디스플레이, 리보솜 디스플레이, 및 프로퓨젼TM) 및 임의의 모든 필요한 세포 배양을 이용한다. 예컨대, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); DNA Cloning, Vols. 1 and 2, (D.N. Glover, Ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, Ed. 1984); PCR Handbook Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, Beaucage, Ed. John Wiley & Sons (1999) (Editor); Oxford Handbook of Nucleic Acid Structure, Neidle, Ed., Oxford Univ Press (1999); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al., Academic Press (1990); PCR Essential Techniques: Essential Techniques, Burke, Ed., John Wiley & Son Ltd (1996); The PCR Technique: RT-PCR, Siebert, Ed., Eaton Pub. Co. (1998); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., C.S.H.L. Press, Pub. (1999); Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992); Large-Scale Mammalian Cell Culture Technology, Lubiniecki, A., Ed., Marcel Dekker, Pub., (1990). Phage Display: A Laboratory Manual, C. Barbas (Ed.), CSHL Press, (2001); Antibody Phage Display, P O'Brien (Ed.), Humana Press (2001); Border et al., 복합적 폴리펩티드 라이브러리들의 스크리닝을 위한 효모 세포 디스플레이, Nature Biotechnology, 15(6):553-7 (1997); Border et al., 단백질 발현, 친화력 및 안정성의 유도 진화를 위한 효모 표면 디스플레이, Methods Enzymol., 328:430-44 (2000); Pluckthun 등에 의해 미국 특허 제6,348,315호에서 기술된 리보솜 디스플레이, 및 스조스탁 등에 의해 미국 특허 제6,258,558호; 제6,261,804호; 및 제6,214,553호에 기술된 프로퓨전TM을 참조하라.
실시예 1: 항원 결합 분자 내 3개의 지정된 영역들의 룩-스루 돌연변이
본 실시예에서는, 기질에 대한 결합 및 단백질 분해를 향상시키기 위하여 항체의 3개 CDRs의 룩-스루 돌연변이가 기술된다. 구체적으로, 단일클론 항체의 3개의 상보성 결정부위들 (CDRs)의 "룩-스루 (look-through)" 돌연변이가 수행된다. 경쇄 가변 영역 (VH)의 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 룩-스루 돌연변이를 위해 선택된 지정된 영역들이다. 이 실시양태를 위하여, 선택된 미리-결정된 아미노산들은 세린 프로테아제들의 촉매 삼징후의 세 잔기들인 Asp, His 및 Ser이다. Asp는 VH CDR1에 대해 선택되었고, His는 VL CDR2에 대해 선택되었고, Ser은 VH CDR3에 대해 선택되었다. 이들 3개의 미리-결정된 아미노산들의 선택은 상기 3개 잔기들이 기능적 활성, 즉 시험 기질의 단백질 분해를 발휘하기 위해 정확히 배치된 시기를 검출하기 위하여 편리한 프로테아제 분석의 사용을 허용한다.
예시적인 항체, MCPC 603은 항체 결합영역의 특징이 잘 알려져 있기 때문에 결합 및 촉매작용을 조사하기 위한 훌륭한 모델로 인식된다. MCPC 603 VH 및 VL 영역들의 아미노산 서열 및 DNA 서열은 공개적으로 이용가능하다 (예컨대, Rudikoff, S. and Potter, M., Biochemistry 13: 4033 (1974); Pluckthun, A. et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., Vol. LII: 105-112 (1987) 참조하라). MCPC 603 항체에 대한 CDRs는 도 2에 나타난 바와 같이 규명되었다. 중쇄에서는, CDR1은 아미노산 잔기 31-35 위치에 걸치고, CDR2는 아미노산 잔기 50-69 위치에 걸치고, CDR3은 아미노산 잔기 101-111 위치에 걸친다. 경쇄에서는, CDR1의 아미노산 잔기들은 24-40이고, CDR2는 아미노산 잔기 55-62 위치에 걸치고, CDR3은 아미노산 잔기 95-103 위치에 걸친다.
MCPC 603의 CDRs에서 룩-스루 돌연변이를 위한 올리고뉴클레오티드들은 폴리펩티드 유사체들이 도 3 내지 도 5에 나타난 바와 같이 CDR1, CDR2, 및 CDR3에 대한 아미노산 서열을 갖도록 고안된다. 합성된 올리고뉴클레오티드들은 도 7에 나타난 바와 같이 표적 구조물 내로 용이하게 삽입되도록 변형되기 위하여 CDR 영역들보다 커질 수 있다. 단쇄 항체 형식이 연속적인 발현 및 스크리닝 단계들에 있어서의 편의를 위하여 선택된다. 상기 올리고뉴클레오티드들은 효소적 기술들 (예컨대, Oliphant, A. R. et al., 1986, 상동 참조하라)에 의해 이중-가닥 사슬들로 전환될 수 있고, 그리고 나서 도 8에 나타난 바와 같이 제한효소 처리된 플라스미드 내로 연결될 수 있다. 상기 제한효소 부위들은 자연적으로 발생한 부위들 혹은 조작된 제한효소 부위들일 수 있다.
상응하는 폴리펩티드 유사체들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드들은 본 명세서에서 기술된 편리한 발현 시스템들 중의 어느 하나에서 발현될 수 있고, 예컨대 미국 특허 제5,798,208호 (또한, 도 16 및 도 17 참조)에 기재된 바와 같은 세린 프로테아제 분석을 이용하여 스크리닝될 수 있다.
간략하게, 발현된 폴리펩티드 유사체들은 시험 기질에 노출되고 상기 시험 기질의 단백질 분해에 대해 조사된다. 상기 기질의 소거 구역에 의해 드러난, 단백질 분해의 양은 목적하는 기능적 활성을 갖는 폴리펩티드 유사체를 나타낸다.
실시예 2: 항원 결합 분자 내 6개의 지정된 영역들의 룩-스루 돌연변이
본 실시예에서는, 기질의 결합 및 단백질 분해를 향상시키기 위하여 항체의 모든 6개 CDRs의 룩-스루 돌연변이가 기술된다. 구체적으로, 상기에 언급된 모델 항체 (MCPC 603)의 모든 6개의 과변이 영역들 또는 상보성 결정부위들 (CDRs)의 "룩-스루" 돌연변이가 수행된다. 본 실시예에서, "룩-스루" 돌연변이는 주어진 영역 또는 도메인 내에서 다른 아미노산을 가지고 2회 내지 3회 수행된다. 예를 들면, Asp, Ser 및 His는 도 10에 나타난 바와 같이 중쇄 및 경쇄 전체에 대해서 연속적으로 훑어진다 (worked through).
영역 내 비연속적인 잔기들의 돌연변이는, 만약 상기 영역 내 특정 잔기들이 목적하는 기능에 참여하지 않을 것임이 공지되어 있다면, 혹은 이를 누구나 추론할 수 있다면, 바람직할 수 있다. 또한, 유사체들의 숫자는 최소화될 수 있다. 미리-결정된 아미노산 및 변형되는 특정 위치들을 선택하는데 있어서의 다른 고려사항들은 상기 잔기들이 다른 잔기와 수소결합을 형성할 수 있어야만 한다는 것이다. 이러한 고려는 형성된 변이체들에게 근접 제약을 부과할 수 있다. 따라서, 상기 CDRs 내 오직 특정 위치들만이 적절하게 상호작용하는 촉매 삼징후의 아미노산들을 허용할 것이다. 따라서, 분자 모델링 또는 다른 구조적 정보는 기능적 변이체들을 강화하기 위해 사용될 수 있다.
이러한 경우에, 공지된 구조적 정보는 돌연변이되는 잔기들의 범위뿐만 아니라, Asp, His 및 Ser간의 수소 결합을 허용하기에 충분할 정도로 근접하는 영역들 내의 잔기들을 규명하기 위해 사용되었다. 로버트 등은 CDRs의 일부분들간에 밀접한 접촉 영역들을 규명하였다 (Roberts, V. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6654-6658 (1990)). 상기 정보는 MCPC 603의 x-선 구조로부터 얻은 데이터와 함께 돌연변이의 표적이 되는 CDRs간의 밀접한 접촉의 가능한 지역들을 선택하기 위해 사용된다. 구조적/모델링 정보에 의해 지시되는 룩-스루 돌연변이의 이러한 유형은 "가이드-스루" 돌연변이로 언급될 수 있다.
룩-스루 돌연변이는 도 10에 나타낸 바와 같이 수행되는데, 각각의 CDR이 하나의 미리-결졍된 아미노산에 적용되어 8×105개의 폴리펩티드 유사체들을 만들고, 만약 모든 20종의 아미노산들이 조사된다면, 5×1013개의 폴리펩티드 유사체들이 만들어진다.
폴리뉴클레오티드들은 본 명세서에서 기술된 통상적인 발현 시스템들 중의 하나에서 발현될 수 있고 예컨대, 미국 특허 제5,798,208호에 기술된 세린 프로테아제를 이용하여 스크리닝될 수 있다. 간략하게, 발현된 폴리펩티드 유사체들은 시험 기질에 노출되고 상기 시험 기질의 단백질 분해에 대해 조사된다. 상기 기질의 소거 지역에 의해 나타나는, 단백질 분해의 양은 목적하는 기능적 활성을 갖는 폴리펩티드 유사체를 나타낸다.
실시예 3: 항-TNF 결합 분자들의 기능을 향상시키기 위한 룩-스루 돌연변이
본 실시예에서는, 그의 결합력을 향상시키기 위하여 항-TNF 항체의 룩-스루 돌연변이가 기술된다.
구체적으로, 두 개의 서로 다른 항-TNF 항체들의 모든 6개의 과변이 영역들 또는 상보성 결정부위들 (CDRs)의 "룩-스루 돌연변이"가 수행된다. 항-TNF 항체들은 리간드 TNF (종양괴사인자)의 비정상적인 수준을 갖는 환자들의 면역 질환을 치료하는데 일반적으로 적용되어 왔다. 두 개의 상업적으로 이용가능한 항-TNF 항체들이 존재한다. 룩-스루 돌연변이 및 연속되는 스크리닝 과정의 편의를 위하여, 이들 항체들의 중쇄 및 경쇄 가변 영역들 (서열번호: 2 내지 4 참조)을 폴리 Gly-Ser 링커를 이용하여 단쇄 형식으로 전환시켰다 (도 15 참조). 미리-결정된 아미노산을 이용한 룩-스루 돌연변이를 위해 선택된 상기 지정된 영역들은 도 15에 나타난 바와 같이 검정 막대의 존재에 의해 표시된다. 이들 지정된 영역들은 단쇄 항체들의 CDRs에 상응한다.
6개의 CDR 영역들, 및 폴리뉴클레오티드들의 도 15에 나타낸 완벽한 단쇄 서열로의 조립을 허용하기에 충분한 인접영역들을 나타내는 폴리뉴클레오티드들을 본 명세서에 기술한 바와 같이 합성하였다. 미리-결정된 아미노산 잔기들이 각각의 CDR 영역에 대해 선택되고, 6개의 CDR 영역들 전체에서 독립적이면서 연속적으로 각각의 아미노산 위치로 도입된다. 상기 폴리뉴클레오티드들은 리보솜 디스플레이를 이용하여 폴리펩티드 내로 번역될 수 있는 상응하는 RNA 전사체의 전사를 뒷받침할 수 있는 주형들로서 제공되기 위해 추가로 조작된다.
상응하는 폴리펩티드 유사체들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드들은 무세포 전사 및 번역 추출물들을 이용하여 발현된다. 상기 RNA 전사체들은 형광 잔기와 같이 검출가능한 잔기에 공유적으로 연결된다. 다르게는, 목적하는 서열은 발현의 편리한 검출 및 비결합체에 대한 결합체의 표준화를 허용하기 위해 녹색 형광 단백질 (GFP)과 같은 형광 잔기에 골격 내에서 융합될 수 있다. 바람직하게는, 상기 폴리펩티드 유사체들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드들은 적어도 부분적으로 배열되는데, 예컨대 다중 폴리뉴클레오티드 유사체들은 포함하지만 용이하게 디콘볼류티드(deconvoluted)될 수 있는 웰 내에서 발현된다. 따라서, 각 웰은 리보솜 디스플레이를 이용하여 형광 잔기에 연결된 상응하는 전사체에 연결된 폴리펩티드 유사체들의 아집단을 포함한다. 상기 웰은 표적 리간드, 즉 TNF로 표지되고, 야생형 폴리펩티드와 비교하여 결합하는 폴리펩티드 유사체들과 이들이 어떠한 결합 친화력을 갖는지에 대해 조사된다.
야생형 폴리펩티드에 비해 더 잘 결합하는 폴리펩티드 유사체들은 그 후에 표준 기술들을 이용하여 향상된 결합력에 대해 유사한 상업적 항체를 이용한 평행 조사를 위한 전장의 IgG 항체 형식으로 재-조작된다.
실시예 4: 보툴리늄 신경독소 혈청형 B (BoNT/B) 및 보툴리늄 신경독소 혈청형 A (BoNT/A)에 대한 항체들의 기능을 향상시키기 위한 룩-스루 돌연변이
본 실시예예서는, 보툴리늄 신경독소 혈청형 B (BoNT/B) 및 보툴리늄 신경독소 혈청형 A (BoNT/A)에 대해 향상된 항체들이 기능을 향상시키기 위하여 룩-스루 돌연변이 (LTM)를 이용하여 제조된다. 상기 LTM 접근법은 크기, 전하, 소수성, 및 수소 결합 특성들을 조사하는 20종의 아미노산들의 아집단 (LTM 세트)에 근거하여 결합 포켓 전체에 대해서 각각의 CDR 당 단일 돌연변이들의 생성을 기초로 한다. 상기 LTM 세트에서 아미노산들을 선택하는 기준은 하기에 기술된다.
1. 항체 정제, 유전자 서열분석 및 단쇄 (scFv) 고안
BoNT/B에 대한 결합 친화력을 갖는 해양 항체 단편들 (Fab)은 엠마뉴엘 등에 의해 기술된 방법에 따라 획득할 수 있다 (Emaneul et al. (1996) Journal oflmmunological Methods 193: 189-197). BotFab 5 (서열번호: 10 및 11, 각각 경쇄 및 중쇄 폴리펩티드들), BotFab 20 (서열번호: 12 및 13, 각각 경쇄 및 중쇄 폴리펩티드들) 또는 BotFab 22 (서열번호: 14 및 15, 각각 경쇄 및 중쇄 폴리펩티드들) 항체들이 사용될 수 있다. 상기 서열들은 미국 특허 제5,932,449호에 기재되어 있는데, 그의 내용은 참고문헌으로서 본 명세서에 포함된다. 상기 해양 BoNT/B 항체 (전장의 독소, 경쇄 및/또는 중쇄)는 메타바이올로직스사 (Metabiologics, Inc., WI)로부터 입수될 수 있다.
플레스 등에 의해 기술된 항-BoNT/A 항체들 (Pless et al. (2001) Infect. Immun. 69: 570)은 그들의 친화력을 적어도 10배는 향상시키고자 하는 목적으로 사용될 수 있다. BoNT/A 중쇄 결합 도메인 (BoNT/A He) 항원은 메타바이올로직스사 (Metabiologics, Inc., WI)로부터 입수될 수 있다.
항체(들)의 VL 및 VH 절편들은 클로닝된 후 표준 분자생물학 기술들을 이용하여 서열분석된다. 상기 분자들의 가변 영역들은 중합효소 연쇄반응 (PCR)에 의해 증폭되고, 단쇄 항체들 (scFv)을 형성하기 위하여 폴리 Gly-Ser 링커 (통상적으로, SGGGGSGGGGSGGGGS (서열번호: 7))에 연결된다. 폴리-His 태그 (tag)(HHHHHH (서열번호: 8)) 및 myc 태그 (EQKLISEEDL (서열번호: 9))는 또한 정제 및 검출을 용이하게 하기 위하여 상기 유전자들의 C-말단에 추가된다. 이러한 분자들은 공지된 기술들 중의 하나 (예컨대, 효모, 세균 또는 파아지-기반 기술들)를 이용하여 표시되고 BoNT/B 또는 BoNT/A에 결합하는 이들의 능력에 대해 조사된다.
전제 항체들의 일가 scFv 버전은 돌연변이 연구들을 수행하기에 우수한 형태를 제공하고, 다가 분자들에 의해 표시되는 결합활성 (avidity) 효과들을 제외하고는, 전체 분자의 결합 기작을 일반적으로 제현하는 것으로 알려져 있다.
2. 룩-스루 돌연변이 (LTM) 및 유전자 고안을 이용한 항체 향상
룩-스루 돌연변이 (LTM)를 위하여, 하기의 9개 아미노산들 및 이들의 대표적인 기능적 특징들이 선택된다: 알라닌 및 류우신 (지방족), 세린 (수산화기), 아스파르트산 (산성) 및 글루타민 (아마이드), 라이신 및 히스티딘 (염기성), 티로신 (방향족), 프롤린 (소수성). 이들 아미노산들은 항체 특성들을 향상시키기 위해 요구되는 화학적 기능성에 대한 유의미한 초기 정보를 제공하기 위하여 크기, 전하, 소수성 및 수소결합 능력에 있어서서 적절한 화학적 다양성을 나타낸다. 상기 선택들은 또한 항체들의 CDRs 내에서 이들 아미노산들의 발생빈도에 근거한다. 예를 들면, 방향족 곁사슬들을 갖는 아미노산들을 나타내기 위하여 티로신 및 페닐알라닌이 주어진다면, 항체 CDRs 내 현저히 높은 우의성 (preponderance) 및 수소결합에 대한 능력으로 인해 전자가 선택된다. LTM은 최종 항체에서 목적하는 결합, 중성화, 및/또는 임의의 부가적인 특성들에 유용한 특정 아미노산들 및 화학적 특성들을 규명하기 위하여 처음에 사용된다. 그러나, LTM이 이러한 9개 아미노산들 또는 9개의 총 아미노산들에 국한되는 것은 아니다. LTM 분석은 아미노산들의 임의의 모든 조합을 가지고 수행될 수 있고, 상기 LTM 아집단은 18개 아미노산들 (포화 돌연변이보다 1개 부족)까지일 수 있다.
2.1 LTM 올리고뉴클레오티드 합성
일차 LTM 분석에서, 각각의 CDR 내에서 전체적인 결합 친화력에 기여하는 각각의 아미노산들의 곁사슬을 조사하는 것이 목표이다. 유의미한 다양성을 효과적으로 형성하기 위하여, LTM 아집단 아미노산 각각은 CDR당 오직 한 개의 치환만을 갖는 CDR 서열 내 모든 단일 위치에서 표적된다. 따라서, 각각의 개별적인 올리고뉴클레오티드는 오직 단일 CDR 돌연변이만을 암호화한다. 예를 들면, 가상의 11개 아미노산 VH CDR3 도메인 상에서 LTM 히스티딘 돌연변이를 수행하기 위하여, 모든 11개 가능한 단일 히스티딘 돌연변이들을 암호화하는 11개 올리고뉴클레오티드들이 합성된다 (도 20 참조). 이러한 분석은 상기 CDR 내 각각의 위치에서 거대한 아마이드를 갖는 것의 효과를 조사한다. 그러므로, VH CDR3 LTM 라이브러리를 제조하기 위하여, 단 99개의 올리고뉴클레오티드들이 상기 LTM 분석을 위해 합성된다 (9개의 LTM 아미노산들 × 11개의 VH CDR3 위치들). 올리고뉴클레오티드 서열들은 공개된 이용가능한 소프트웨어를 이용하여 의도되지 않은 종결코돈들, 야생형 중복, 불충분한 코돈 사용, 헤어핀들, 루프들, 및 다른 이차 구조들에 대해서 조사된다.
2.2 유용한 LTM 돌연변이들의 조합을 위한 퇴화 올리고뉴클레오티드 합성
CDR 내에서 개별적인 아미노산들의 체계적인 LTM 치환을 이용하는데 있어서, 각 위치에서 화학적 기능성들의 선호는 알려져 있다. LTM 선택들로부터 모든 돌연변이들을 조합하고 가능한 부가력 (additivity) 및 이들간의 에너지 상승효과를 조사하기 위하여, 이들 돌연변이들과 야생형 서열을 암호화하는 퇴화 올리고뉴클레오티드들을 합성한다. 1.6×104개의 변이체들을 갖는 이러한 올리고뉴클레오티드들의 퇴화 풀 (pool)은 이들 치환들의 부가적인 특성을 조사하는 제2 세대의 라이브러리를 형성하기 위해 연속적으로 사용된다.
2.3 컴퓨터-보조 올리고뉴클레오티드 고안, 라이브러리 및 결과 데이터베이스
자동화된 주문형 (custom-built)의 DNA 합성기와 연결된 소프트웨어가 올리고뉴클레오티드 신속한 합성을 가능케한다. 첫 번째 단계는 어떠한 표적 아미노산을 상기 CDRs 내로 도입시킬 것인지를 결정하는 것을 포함한다. 상기 소프트웨어는 표적된 아미노산을 도입하기 위해 요구되는 코돈 선호도 (예컨대, 선택된 코돈 시스템에 의존적인, 효모, 세균성 또는 파아지 코돈 선호도)를 결정하고, 또한 이러한 고안 과정에 의해 형성될 수 있는 야생형 서열의 모든 중복을 제거한다. 그리고 나서, 잠재적인 종결 코돈들, 헤어핀들 및 루프 구조들 또는 합성 전에 연속적으로 수정되는 다른 문제가 될 만한 서열들에 대해 분석한다. 이와 같이 완료된 LTM 고안 계획은 그 후에 DNA 합성기에 보내지고, DNA 합성기는 상기 올리고뉴클레오티드들의 자동화된 합성을 수행한다. 이러한 방식으로, 상기 라이브러리를 형성하는데 요구되는 올리고뉴클레오티들이 신속하게 생성될 수 있다.
전자 데이터베이스는 합성된 모든 LTM 올리고뉴클레오티드 서열들, scFv 라이브러리 CDR 치환들의 정보들, 및 표적 항원에 대한 결합 분석 결과들을 저장할 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드 데이터의 기록보관은 상기 고안 전략들의 합리적인 반복들 및 시료 올리고뉴클레오티드들의 재-사용을 가능케 한다.
3. 전반적인 LTM 전략
LTM은 최종 항체에서 목적하는 결합, 중성화 및/또는 임의의 부가적인 특성들에 유용한 특정 아미노산들 및 화학적 특성들을 규명하기 위해 초기에 사용된다. 이는 또한 친화력 (또는 선택되는 임의의 물리적 특성)에 있어서 현저한 손실 없이 임의의 돌연변이를 허용하지 않는 영역들을 신속하게 규명한다. 그러므로, LTM 분석은 항체의 모든 CDRs 내 각 위치에서의 화학적 요건들을 조사하는데 뿐만 아니라 항원 결합에 절대적으로 요구되는 아미노산들을 신속하게 결정하는데 유용한 방법이다. LTM에 의해 유용한 돌연변이들을 동정한 후에, 돌연변이된 CDRs를 다중으로 형성하기 위하여 모든 이러한 상이한 돌연변이들을 우선적으로 도입하는 복합적인 돌연변이 계획들이 사용될 수 있다. 부가적으로 또는 다르게는, "워크-스루 (walk-through)" 돌연변이 (WTM)가 CDR 내 동일한 아미노산의 다중 돌연변이들의 효과를 추적하기 위해 (예를 들면, 미국 특허 제5,830,650호; 제5,798,208호에 기술된 바와 같이) 사용될 수 있다.
4. LTM scFv 라이브러리들
상기에 기술된 LTM 기술들은 경쇄 또는 중쇄의 단일 CDR 내에서 돌연변이들을 갖는 올리고뉴클레오티드들의 풀들을 형성하기 위해 사용된다. 이러한 올리고뉴클레오티드들은 PCR 동안에 중복과 혼성화를 용이하게 하기 위하여 주변 기본골격의 일부분을 포함하도록 합성된다. 이들 올리고뉴클레오티드들의 풀들은 단일 중복 확장 PCR (SOE-PCR)(Horton et al. (1989) Gene 77: 61-68)을 이용하여 단일, 이중, 및 삼중 CDRs (CDR1, 2, 및 3의 단일, 이중, 및 삼중 조합들) 내에 돌연변이들이 존재하는 모든 가능한 VL 및 VII 사슬들을 형성하기 위해 사용된다. SOE-PCR은 제한효소 부위들, 제한효소 엔도뉴클리아제 (endonuclease); 또는 DNA 리가아제를 요구하지 않는 DMA 절편들을 조합하기 위한 신속하고 간단한 방법이다. SOE-PCR에서, 상기 유전자 내 두 영역들은 PCR 산물들이 한쪽 말단에 상보적인 서열을 공유하도록 고안된 시발체들을 이용한 PCR에 의해 증폭된다. PCR 조건 하에서, 상기 상보적인 서열들은 혼성화되어 중복을 형성한다. 상기 상보적인 서열들은 그 후에 시발체로 작용하여 재조합 분자를 생산하기 위하여 DNA 중합효소에 의한 확장을 가능케 한다.
예를 들면, "110" (1은 돌연변이 CDR을 나타내고 0은 야생형 CDR을 나타낸다)으로 표시되는, CDR-H1 및 CDR25-H2 모두는 돌연변이되고 CDR-H3은 야생형인 VH 사슬들의 풀을 형성하기 위하여, 상기 CDR-Hl 돌연변이 유전자들을 주형으로 사용하고 이중으로 돌연변이이된 풀을 형성하도록 상기 CDR-H2 올리고뉴클레오티드들에 연결하기 위해 SOE-PCR이 수행된다 (도 21). 각각의 CDR이 야생형이거나 돌연변이일 것을 고려하면, (야생형 분자 "000"을 포함하지 않는) VL 및 VH 사슬들의 상기 풀들의 각각에 대해 7개의 가능한 조합들 (도 21에서 화살표로 표시됨)이 존재한다. 상기 7개의 VL 및 8개의 VH 풀들을 조합하는 것은 63개의 VL-VH 비-야생형 조합들 (scFvs)을 생성한다 (도 21). (야생형 서열을 포함하는) 상기 64개의 VL-VH 조합들 각각은 전체 LTM scFv 라이브러리 앙상블 (ensemble)의 "아집단"으로 불려진다. scFv 라이브러리 앙상블은 치환을 위해 선택된 각각의 아미노산에 대해 생성된다. 각각의 아집단 라이브러리 내에서 표시되는 아미노산 서열들의 숫자는 CDR의 길이, 상기 CDR 내 아미노산 서열, 및 LTM 올리고뉴클레오티드 고안 전력에 의존한다.
5. 고효율 라이브러리 스크리닝 및 향상된 항체 선발
다양한 방법들이 항체 발현 및 디스플레이에 유용하다. 이들은 박테리오파아지, 대장균 및 효모를 포함한다. 이러한 방법들 각각은 항체 향상을 위해 사용되는데, 효모 디스플레이 시스템은 몇몇 장점들을 제공한다 (Boder 및 Wittrup (1997) Nat. Biotechnol. 15: 553-557). 효모는 각각의 세포 표면에 표현되는 각 항체의 103 내지 105 복제수를 갖는, 107까지 크기의 라이브러리를 용이하게 수용할 수 있다. 효모 세포들은 유세포 분석기 및 형광-활성화된 세포 분류 (FACS) 또는 자기 비드를 이용하여 용이하게 스크리닝되고 분리된다. 효모는 또한 신속한 선발 및 재-성장을 제공한다. 효모의 진핵세포 분비 시스템 및 당화 경로들은 원핵세포 디스플레이 시스템들에 비하여 세포 표면에 정확하게 중첩되고 표시되기 위하여 scFv 분자들의 훨씬 더 큰 아집단을 허용한다. 유도 진화와 관련된 효모 디스플레이는 48 fM에서 형광에 대한 scFv 항체의 KD를 이전에 보고된 모든 단가 리간드보다 20배 강한 결합으로 증가시키는데 사용되어 왔다 (Boder et al. (2000) PNAS 97: 10701-10705). 상기 디스플레이 시스템은 세포 표면상에 단백질들을 표시하기 위하여 a-응집소 (a-agglutinin) 효모 부착 수용체를 이용한다. 이 경우에, 목적하는 단백질들인 항-BoNT/B scFv LTM 라이브러리들 또는 항-BoNT/A scFv LTM 라이브러리들은 Aga2 단백질과의 융합 단백질들로서 발현된다. 이들 융합 단백질들은 상기 세포로부터 분비되고 Aga1 단백질에 연결된 이황화 가교를 형성하여, 효모 세포 벽에 부착된다 (인비트로젠사 pYD1 효모 디스플레이 제품 설명서 참조). 또한, 발현 수준을 관찰하고/하거나 결합 친화력 측정값들을 표준화하기 위해 사용될 수 있는 카르복시 말단 태그들 (carboxyl terminal tags)이 포함된다.
자기 비드들로 코팅된 스트렙타비딘들 (Spherotech)이 높은 친화력으로 BoNT/B 또는 BoNT/A에 결합하는 항체들을 스크리닝하고 선발하기 위하여 사용된다. 이 방법은 효모 클론들을 선발하기 위하여, 스트렙타비딘 코팅된 비드들에 결합한 바이오틴화된 항원에 대한 높은 친화력 항원 결합을 이용한다 (Yeung 및 Wittrup (2002) Biotechnol. Prog 18: 212-220; 및 Feldhaus et al. (2003) Nature Biotech. 21: 163-170). 상기 BoNT/B 또는 BoNT/A 폴리펩티드 (Metabiologics)는 표준 방법들 (Pierce)을 이용하여 바이오틴화되고 스크리닝은 당업계에 공지된 방법들을 이용하여 수행된다. 평형 및 역학 기반 선택을 이용하여, 향상된 친화력을 갖는 항체들이 이들 라이브로리들로부터 선택된다. 선택의 각 회차의 효율은 분석적 FACE (FACScan)에 의해 관찰된다. 또한, 효모 표면에 표시된 개별적 분자들의 상대적 결합 친화력들은 상기 항원의 적정에 의해 측정된다. 이는 향상된 친화력을 갖는 분자들의 신속한 동정을 허용한다. 상기 scFv 클론들은 그 후에 유용한 돌연변이들을 동정하기 위해 서열 분석된다.
6. BIAcore 친화력 측정을 위한 수용성 항체들의 형성
목적하는 항체들은 수용성 발현 시스템 (피키아 파스토리스 및/또는 대장균) 내로 서브-클로닝되고 수용성 단백질이 제조된다. 인비트로젠사 (예컨대, P. 파스토리스를 위한 pPIC9) 및 노바젠사 (대장균에서 원형질막 발현을 위한 pET20b)로부터 입수가능한 것들을 포함하여, 수용성 항체 발현을 위해 여러 가지 상업적으로 이용가능한 벡터들 및 세포주들이 있다. 이들 시스템들은 수용성 단쇄 또는 전장의 항체들을 제조하기 위해 통상적으로 사용된다. 상기 P. 파스토리스 발현 시스템 (Invitrogen)은 리터 당 1 ㎎의 정제된 수용성 scFv를 생산한다. 단백질들의 정제는 단쇄들의 경우에는 상기 분자의 C-말단에 His-태그의 존재에 의해서, 또는 전장의 항체들에 대해서는 단백질 A 또는 단백질 G 컬럼들에 의해 용이해진다. 수용성 단쇄 및 전장의 항체들이 BIAcore 친화력 역학 비율 측정값들을 얻기 위하여 제조된다. 이 단계는 효모 클론 세포의 표면상에서 높은 친화력의 scFv 분자들이 무세포 수용성 분자로서 확인되어져야만 하기 때문에 필수적이다.
전술한 방법으로 제조된 수용성 단쇄 및 전장의 항체들은 하기에 기술된 신경돌기 생성 분석 (neurite outgrowth assay) 또는 마우스 치사율 분석뿐만 아니라 BIAcore 친화력 측정값들을 얻기 위해서 사용될 수 있다.
7. 생체 외 및 생체 내 중화를 위한 선발된 항체들의 스크리닝
BoNT 중독의 지시자로서, 그리고, 그로 인해 독소 중화를 정량하기 위한 수단으로서, 일차 병아리 신경세포들의 신경돌기 생성을 이용한 세포-기반 분석이 선발된 항체들을 스크리닝하기 위하여 사용될 수 있다. 수정된 닭의 달걀로부터 후근절 체외이식조직 배양을 이용한 예비 실험들은 대조군보다 BoNT/A로 처리된 이식조직들로부터 감소된 축삭 생성을을 나타내었다. 다르게는, 닭 섬모체신경절-홍채 근육 신경근육이음부 분석 (chick ciliary ganglion-iris muscle neuromuscular junction assay)(Lomneth et al. (1990) Neuroscience Letters 113: 211-216)이 사용될 수 있다.
상기 마우스 치사율 분석 (MLA, 예를 들면, Schantz and Kautter (1978) J. Assoc. Off. Anal. Chem. 61: 96-99에 기술됨)은 BoNT 중화를 조사하기 위한 생체 내 방법으로 알려져 있고 받아들여진다. 상기 조사는 ICR 백서에 20 내지 30 gm의 항체와 함께 또는 항체 없이 BoNTB 또는 BoNT/A의 시료액 약 0.5 ㎖을 복막내로 주사하는 것을 포함한다. 호흡 이상에 의한 치사율은 1 내지 4일 이상 관찰된다. 중화의 정량은 마우스 BoNTB 또는 BoNT/A LD50의 수준을 달리하면서 상기 MAbs의 연속적인 희석액들을 요구한다. 상기 MLA는 생체 외 스크리닝에 의해 동정된 최적화된 항체들의 중화 능력을 결정하는데 사용될 수 있다.
항체들의 중화 능력은 또한 마우스 방어 분석 (mouse protection assay)에 의해 측정될 수도 있다 (MPA, Goeschel et al. (1997) Exp. Neurol. 147: 96-102). 상기 MPA에서, 왼쪽의 반가로막과 함께, 왼쪽의 가로막 신경이 마우스로부터 절개된다. 상기 가로막 신경은 그 후에 조직 배양기 내에서 계속적으로 전기자극을 받게 된다. 정제된 항체들을 BoNT/B 또는 BoNT/A와 함께 배양한 후 상기 조직 배양기에 첨가한다. 독소 유도성 마비는 초기 근육 단일수축에서의 50% 감소로 정의된다.
등가물들
당분야의 통상적인 지식을 가진 자는 본 명세서에 기술된 발명의 특정 실시양태들에 대한 많은 등가물들을 인식할 것이고, 또는 일상적인 실험만을 이용하여 이를 확인할 수 있다. 이러한 등가물들은 하기 청구범위에 의해 포함될 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> R. Crea & Co., et al. <120> LOOK-THROUGH MUTAGENESIS <130> BRI-001PC <140> PCT/US2004/020306 <141> 2004-06-25 <150> 60/483282 <151> 2003-06-27 <160> 13 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Asn Val Asp Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Gly Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Ala Phe Tyr Asn Asn Tyr Glu Tyr Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 2 Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn His 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ser Ile Asn Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ala 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Thr Asp Leu Arg Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ser Arg Asn Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser 115 <210> 3 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 3 Asp Ile Met Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Asn Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Ser Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Asp Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg <210> 4 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 4 Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Phe Val Gly Ser Ser 20 25 30 Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Met Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Thr Val Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Ser Trp Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Leu Glu Val Lys 100 105 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 5 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 6 His His His His His His 1 5 <210> 7 <211> 10 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Pro Tyr 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro 130 135 140 Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser 145 150 155 160 Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val 165 170 175 Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe 180 185 190 Pro Ala Val Leu Gln Phe Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr 195 200 205 Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala 210 215 220 His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp 225 230 235 240 Cys Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser His His His His His His 245 250 <210> 10 <211> 236 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 10 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Gln Pro Ala Met Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Gly Asn Ile His Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys 50 55 60 Ser Pro Gln Leu Leu Val Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys 85 90 95 Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His 100 105 110 Phe Trp Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 115 120 125 Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser 130 135 140 Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn 145 150 155 160 Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu 165 170 175 Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp 180 185 190 Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr 195 200 205 Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr 210 215 220 Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 225 230 235 <210> 11 <211> 254 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 11 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Val Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 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Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp 225 230 235 240 Cys Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser His His His His His His 245 250 <210> 12 <211> 236 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 12 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Gln Pro Ala Met Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Gly Asn Ile His Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys 50 55 60 Ser Pro Gln Leu Leu Val Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys 85 90 95 Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His 100 105 110 Phe Trp Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 115 120 125 Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser 130 135 140 Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn 145 150 155 160 Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu 165 170 175 Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp 180 185 190 Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr 195 200 205 Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr 210 215 220 Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 225 230 235 <210> 13 <211> 254 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 13 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Gln Pro Ala Met Ala Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu 20 25 30 Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly 35 40 45 Phe Asn Ile Lys Asp Thr Phe Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu 50 55 60 Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr 65 70 75 80 Glu Tyr Asp Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr 85 90 95 Ser Ser Asn Thr Val Asn Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp 100 105 110 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Gly Gly Glu Leu Gly Phe Pro Tyr 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro 130 135 140 Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser 145 150 155 160 Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val 165 170 175 Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe 180 185 190 Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr 195 200 205 Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala 210 215 220 His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp 225 230 235 240 Cys Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser His His His His His His 245 250

Claims (65)

  1. 하기 단계를 포함하는 미리-결정된 아미노산이 폴리펩티드의 지정된 영역 내 각각의 위치에 나타나는 폴리펩티드 유사체들의 라이브러리를 형성하는 방법:
    상기 폴리펩티드의 아미노산 서열의 지정된 영역을 선택하는 단계;
    상기 지정된 영역 내 각각의 아미노산 위치에서 치환될 아미노산 잔기를 결정하는 단계;
    하기 기준에 따라 가능한 변이체 폴리뉴클레오티드들을 종합적으로 나타내는 폴리뉴클레오티드들로서, 상기 지정된 영역을 암호화하는 개별적인 폴리뉴클레오티드들을 합성하는 단계:
    i) 상기 지정된 영역 내 각 코돈 위치에 상기 폴리펩티드의 아미노산 잔기에 요구되는 코돈 또는 미리-결정된 아미노산 잔기에 대한 코돈을 포함하는 각각의 폴리뉴클레오티드, 및
    ii) 미리-결정된 아미노산 잔기에 대해 단 하나의 코돈만을 포함하는 각각의 폴리뉴클레오티드,
    그로 인해 미리-결정된 아미노산 잔기가 상기 지정된 영역 내 각각의 아미노산 위치에 나타나는 폴리뉴클레오티드들의 라이브러리를 형성하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드들이 함께 풀 (pool)을 형성하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드 내 두 개 이상의 지정된 영역들이 돌연변이화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    동일한 미리-결정된 아미노산이 두 개 이상의 지정된 영역들 내 각각에서의 치환을 위해 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 3 항에 있어서,
    서로 다른 미리-결정된 아미노산들이 두 개 이상의 지정된 영역들 내 각각에서의 치환을 각각 위해 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 지정된 영역 또는 지정된 영역들이 상기 폴리펩티드의 기능적 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 기능적 도메인이 항체 결합 영역, 항체 골격 영역, 항체 효과기 영역, 수용체 결합 부위, 및 촉매 부위로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 항체 결합 영역 또는 그의 일부가 CDR1, CDR2, CDR3, CDR4, CDR5, CDR6 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 CDR 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 7 항에 있어서,
    상기 항체 골격 영역이 FRl, FR2, FR3, FR4 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 7 항에 있어서,
    상기 항체 효과기 영역이 보체 결합 영역 및 Fe 결합 영역으로 구성된 군으로부터 선택된 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서,
    상기 미리-결정된 아미노산 잔기가 Ser, Thr, Asn, Gln, Tyr, Cys, His, Glu, Asp, Lys Arg, Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Tip 및 Val으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 지정된 영역이 적어도 3 내지 40개 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드들이 발현 라이브러리로서 합성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드들이 효소적인 수단들을 이용하여 합성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드들이 중합효소 연쇄반응을 이용하여 합성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 발현 라이브러리가 파아지 디스플레이 라이브러리, 리보솜/폴리솜 디스플레이 라이브러리, 효모 디스플레이 라이브러리, 세균 디스플레이 라이브러리 및 배열된 라이브러리로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1 항의 방법에 의해 제조된 폴리펩티드 유사체들의 라이브러리.
  18. 하기 단계를 포함하는 목적하는 구조 또는 기능을 갖는 폴리펩티드를 동정하는 방법:
    상기 폴리펩티드의 아미노산 서열의 지정된 영역을 선택하는 단계;
    상기 지정된 영역 내 각 아미노산 위치에 치환될 아미노산을 결정하는 단계;
    하기 기준에 따라 가능한 변이체 폴리뉴클레오티드들을 종합적으로 나타내는 폴리뉴클레오티드들로서, 상기 지정된 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오디드들을 합성하는 단계:
    i) 상기 지정된 영역 내 각 코돈 위치에 상기 폴리펩티드의 아미노산 잔기에 요구되는 코돈 또는 미리-결정된 아미노산 잔기에 대한 코돈을 포함하는 각각의 폴리뉴클레오티드, 및
    ii) 미리-결정된 아미노산 잔기에 대해 단 하나의 코돈만을 포함하는 각각의 폴리뉴클레오티드,
    그로 인해 상기 폴리뉴클레오티드들을 포함하는 발현 라이브러리를 생성하는 단계;
    폴리펩티드 유사체들을 생산하기 위하여 상기 발현 라이브러리를 발현시키는 단계; 및
    목적하는 구조 또는 기능을 갖는 폴리펩티드를 선택하기 위하여 상기 폴리펩티드 유사체들을 스크리닝하는 단계.
  19. 제 18 항에 있어서,
    상기 방법이 선택된 폴리펩티드 유사체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 동정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 18 항에 있어서,
    상기 스크리닝이, 폴리펩티드가 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 연관되어 있고, 상기 폴리뉴클레오티드는 검출가능한 잔기 (moiety)를 추가로 포함하고, 그렇게 해서 표적 기질에 결합할 수 있는 변이체 폴리펩티드가 검출되고, 그로 인해 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 것으로서 동정되는, 폴리펩티드를 표적 기질과 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 20 항에 있어서,
    상기 검출가능한 잔기가 형광 잔기, UV 잔기 및 가시광선 흡수 잔기로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 20 항에 있어서,
    검출가능한 잔기가 바이오틴 잔기, GST 잔기 및 His 태그 (tag) 잔기로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 20 항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드가 리보솜 디스플레이를 이용하여 폴리펩티드 유사체와 연관되는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 18 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드 내 두 개 이상의 지정된 영역들이 돌연변이화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 24 항에 있어서,
    동일한 미리-결정된 아미노산이 상기 두 개 이상의 지정된 영역들 내 각각에서의 치환을 위해 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 24 항에 있어서,
    서로 다른 미리-결정된 아미노산들이 상기 두 개 이상의 지정된 영역들 내 각각에서의 치환을 위해 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 18 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드가 단쇄 항체 (sFVs)인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 18 항에 있어서,
    상기 지정된 영역이 상기 폴리펩티드의 기능적 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 18 항에 있어서,
    상기 지정된 영역이 CDR1, CDR2, CDR3, CDR4, CDR5, CDR6 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 CDR 또는 그의 일부를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 18 항에 있어서,
    상기 지정된 영역이 FR1, FR2, FR3, FR4 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 도메인을 포함하는 항체 골격 영역인 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 18 항에 있어서,
    상기 지정된 영역이 보체 결합 영역 및 Fc 결합 영역으로 구성된 군으로부터 선택되는 도메인을 포함하는 항체 효과기 영역인 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 18 항에 있어서,
    상기 미리-결정된 아미노산이 Ser, Thr, Asn, Gln, Tyr, Cys, His, Glu, Asp, Lys Arg, Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp 및 Val로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 미리-결정된 아미노산 잔기가 상기 지정된 영역 내 각각의 아미노산 위치에서 치환 되고, 상기 폴리뉴클레오티드들이 하기 기준에 따라 모든 가능한 변이체들을 종합적으로 나타내는, 하나 이상의 지정된 영역들을 포함하는 폴리펩티드 유사체들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드들의 라이브러리:
    i) 상기 지정된 영역 내 각 코돈 위치에 상기 폴리펩티드의 아미노산 잔기에 요구되는 코돈 또는 미리-결정된 아미노산 잔기에 대한 코돈을 포함하는 각각의 폴리뉴클레오티드, 및
    ii) 미리-결정된 아미노산 잔기에 대해 단 하나의 코돈만을 포함하는 각각의 폴리뉴클레오티드.
  34. 제 33 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드 내 두 개 이상의 지정된 영역들이 돌연변이화되는 것을 특징으로 하는 라이브러리.
  35. 제 33 항에 있어서,
    동일한 미리-결정된 아미노산이 상기 두 개 이상의 지정된 영역들 내 각각에서의 치환을 위해 선택되는 것을 특징으로 하는 라이브러리.
  36. 제 33 항에 있어서,
    서로 다른 미리-결정된 아미노산들이 상기 두 개 이상의 지정된 영역들 내 각각에서의 치환을 위해 선택되는 것을 특징으로 하는 라이브러리.
  37. 제 33 항에 있어서,
    상기 라이브러리가 발현 라이브러리인 것을 특징으로 하는 라이브러리.
  38. 제 33 항에 있어서,
    발현 라이브러리가 파아지 디스플레이 라이브러리, 리보솜/폴리솜 디스플레이 라이브러리, 효모 디스플레이 라이브러리, 세균 디스플레이 라이브러리 및 배열된 라이브러리로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 라이브러리.
  39. 제 33 항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드가 하나 이상의 전사 조절요소들을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 라이브러리.
  40. 제 39 항에 있어서,
    생체 외에서 전사되고 번역될 때, 상기 폴리뉴클레오티드들이 상응하는 폴리뉴클레오티드들에 의해 암호화되는 폴리펩티드와 연관되는 것을 특징으로 하는 라이브러리.
  41. 제 40 항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드들이 리보솜/폴리솜 디스플레이를 이용하여 상기 폴리펩티드 와 연관되는 것을 특징으로 하는 라이브러리.
  42. 제 41 항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드들이 RNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 라이브러리.
  43. 제 42 항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드들이 추가로 검출가능한 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 라이브러리.
  44. 제 43 항에 있어서,
    상기 검출가능한 잔기가 형광 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 라이브러리.
  45. 제 33 항에 있어서,
    상기 라이브러리가 적어도 106개의 서로 다른 폴리뉴클레오티드들을 포함하는 것을 특징으로 하는 라이브러리.
  46. 제 33 항에 있어서,
    상기 라이브러리가 적어도 45-1012개의 서로 다른 폴리뉴클레오티드들을 포함하는 것을 특징으로 하는 라이브러리.
  47. 제 33 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드가 결합 폴리펩티드를 암호화하는 것을 특징으로 하는 라이브러리.
  48. 제 47 항에 있어서,
    상기 결합 폴리펩티드가 중쇄 가변 영역 (VH), 경쇄 가변 영역 (VL), 및 단쇄 항체 (sFv)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 라이브러리.
  49. 제 33 항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드가 효소를 암호화하는 것을 특징으로 하는 라이브러리.
  50. 제 33 항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드가 효소 억제제를 암호화하는 것을 특징으로 하는 라이브러리.
  51. 제 33 항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드가 촉매 폴리펩티드를 암호화하는 것을 특징으로 하는 라이브러리.
  52. 제 33 항에 있어서,
    상기 라이브러리가 고체 지지체에 고정되는 것을 특징으로 하는 라이브러리.
  53. 제 33 항에 있어서,
    상기 고체 지지체가 마이크로칩인 것을 특징으로 하는 라이브러리.
  54. 제 33 항에 있어서,
    상기 라이브러리가 배열된 라이브러리인 것을 특징으로 하는 라이브러리.
  55. 제 33 항의 라이브러리에 따라 고정된 폴리뉴클레오티드들의 배열을 포함하는 마이크로칩.
  56. 폴리펩티드가 표적 분자에 결합하고 중쇄 가변 영역 (VH), 경쇄 가변 영역 (VL), 및 단쇄 항체 (sFv)로 구성된 군으로부터 선택된 결합 영역을 포함하는, 제 33항의 라이브러리에 따라 동정된 폴리펩티드 유사체.
  57. 제 56 항에 있어서,
    상기 특정화된 표적 분자가 TNFα인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 유사체.
  58. 제 56 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드가 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 아미노산 서열에 적어도 70%의 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 유사체.
  59. 하기 단계를 포함하는 목적하는 구조 또는 기능을 갖는 폴리펩티드 유사체들의 아집단을 동정하는 방법:
    상기 폴리펩핍티드의 아미노산 서열의 지정된 영역을 선택하는 단계;
    상기 지정된 영역 내 각각의 아미노산 위치에 치환될 아미노산 잔기를 결정하는 단계;
    하기 기준에 따라 가능한 변이체 폴리뉴클레오티드들을 종합적으로 나타내는 폴리뉴클레오티드들로서, 상기 지정된 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오티드들을 합성하는 단계:
    i) 상기 지정된 영역 내 각 코돈 위치에 상기 폴리펩티드의 아미노산 잔기에 요구되는 코돈 또는 미리-결정된 아미노산 잔기에 대한 코돈을 포함하는 각각의 폴리뉴클레오티드, 및
    ii) 미리-결정된 아미노산 잔기에 대해 단 하나의 코돈만을 포함하는 각각의 폴리뉴클레오티드,
    그로 인해 상기 폴리뉴클레오티드들을 포함하는 발현 라이브러리를 생성하는 단계;
    상기 발현 라이브러리를 이 라이브러리가 발현되는 조건들에 노출시키는 단계;
    목적하는 구조 또는 기능을 갖는 폴리펩티드를 동정하기 위하여 발현된 라이브러리 를 스크리닝하는 단계;
    대조군 기준과 비교해서 상기 폴리펩티드의 구조 또는 기능을 비교하는 단계로, 대조군 기준에 상응하거나 이를 능가하는 폴리펩티드를 반응자 (responder)로 분류하고, 대조군 기준에 미치지 못하는 폴리펩티드는 무반응자 (nonresponder)로 구분하는 단계;
    반응자들 및 무반응자들을 데이터베이스로 구분하는 단계; 및
    합성된 아집단 폴리펩티드들의 서열을 결정하기 위하여 상기 데이터베이스를 조사하는 단계.
  60. 제 59 항에 있어서,
    상기 단계들의 하나 이상이 컴퓨터에 의해 보조되는 (computer-assisted) 것을 특징으로 하는 방법.
  61. 제 59 항에 있어서,
    상기 대조군 기준이 결합 친화력, 안정성 및 효과기 기능으로 구성된 군으로부터 선텍되는 것을 특징으로 하는 방법.
  62. 제 59 항에 있어서,
    상기 대조군 기준이 특정화된 기질 상에서의 촉매 활성인 것을 특징으로 하는 방법.
  63. 제 59 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드가 중쇄 가변 영역 (VH), 경쇄 가변 영역 (VL), 및 단쇄 항체 (sFv)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  64. 제 59 항의 방법의 하나 이상의 단계들을 실행하기 위한 지시들을 포함하는 전기적 장치 내 사용에 적당한 기질.
  65. 제 59 항의 방법의 하나 이상의 단계들을 실행하기 위한 장치.
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