ES2372503T3 - Mutagénesis revisada para desarrollar polipéptidos alterados con propiedades potenciadas. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para distinguir uno o más residuos de aminoácidos funcionales de residuos de aminoácidos no funcionales en una región definida dentro de un polipéptido que comprende, seleccionar uno o más residuos de aminoácidos dentro de la secuencia de aminoácidos del polipéptido; determinar un residuo de aminoácido para sustituirse por los uno o más residuos de aminoácidos seleccionados; sintetizar los polinucleótidos que codifican el polipéptido o parte del mismo comprendiendo los residuos de aminoácidos seleccionados, representando los polinucleótidos colectivamente sustituciones aminoacídicas variantes de acuerdo con los siguientes criterios: i) conteniendo cada polinucleótido en cada posición de codón en la región definida, bien un codón requerido por la síntesis del resto de aminoácido o bien un codón para uno de los restos de aminoácido predeterminados y ii) conteniendo cada polinucleótido no más de un codón para el residuo de aminoácido predeterminado, generando por lo tanto una biblioteca de expresión que contiene los polinucleótidos de acuerdo con (i) e (ii) expresando la biblioteca de expresión para producir análogos de polipéptidos; y rastreando los equivalentes de polipéptido para una alteración en una propiedad medible tal que se identifiquen uno o más residuo(s) de aminoácido(s) dentro del polipéptido, o de parte del mismo, según contribuyan a la propiedad medible y por lo tanto se distingan de un residuo de aminoácido no funcional, en el que el/los resto(s) de aminoácido(s) identificado(s) según contribuya(n) a una propiedad medible se determina(n) que es/son adecuado(s) para mutagénesis y el/los residuo(s) no funcional(es) se determina(n) que es/son inadecuado(s) para mutagénesis y en el que uno o más aminoácido(s) funcional(es) está(n) exclusivamente mutagenizado(s).

Description

Mutagénesis revisada para desarrollar polipéptidos alterados con propiedades potenciadas

Información relacionada

Todo el contenido de todas las otras patentes, solicitudes de patente y referencias citadas en la siguiente memoria descriptiva está también incorporado en el presente documento por referencia en sus totalidades.

Antecedentes de la invención

La mutagénesis es una herramienta potente en el estudio de estructura y función de las proteínas. Las mutaciones pueden fabricarse en la secuencia de nucleótidos de un gen clonado que codifica una proteína de interés y el gen modificado puede expresarse para producir mutantes de la proteína. Comparando las propiedades de una proteína de tipo salvaje y los mutantes generados, es a menudo posible identificar aminoácidos individuales o dominios de aminoácidos que son esenciales para la integridad estructural y/o para la función bioquímica de la proteína, tal como su actividad de unión y/o su actividad catalítica. El número de mutantes que puede ser generarse a partir de una sola proteína, sin embargo, vuelve difícil seleccionar mutantes que sean informativos o que tengan una propiedad deseada, incluso si los mutantes seleccionados que abarcan la mutación están solamente en regiones teóricamente importantes de una proteína (por ejemplo, regiones que regiones que componen un sitio activo de una proteína). Por ejemplo, la sustitución, deleción, o la inserción de un aminoácido particular puede tener un efecto local o global en la proteína.

Los procedimientos anteriores para mutagenizar los polipéptidos bien han sido demasiado restrictivos, bien demasiado inclusivos, o bien han estado limitados a desactivar la función de la proteína más que a ganar o a mejorar función. Por ejemplo, un enfoque altamente restrictivo es mutagénesis selectiva o dirigida a sitio que se usa para identificar la presencia de un sitio funcional particular o para entender las consecuencias de hacer una alteración muy específica dentro del sitio funcional. Una solicitud común de mutagénesis dirigida a sitio es el estudio de fosfoproteínas donde un residuo aminoacídico, que normalmente estaría fosforilado y permitiría al polipéptido llevar a cabo su función, se altera para confirmar el vínculo entre fosforilación y actividad funcional. Este enfoque es muy específico para el polipéptido y el residuo que se están estudiando.

Por el contrario, un enfoque altamente inclusivo es la saturación o la mutagénesis al azar que se diseña para producir un gran número de mutaciones que comprenden todas las alteraciones posibles dentro de una región definida de un gen o una proteína. Esto está basado en el principio de que, generando esencialmente todas las variaciones posibles de un dominio de proteína relevante, la disposición apropiada de aminoácidos es probable que se produzca como uno de los mutantes generados al azar. Sin embargo, en la práctica, el gran número de combinaciones al azar de mutaciones generadas puede evitar la capacidad de seleccionar significativamente un candidato deseado debido a la presencia del así llamado "ruido", de muchos candidatos indeseados.

Otro enfoque, referida como mutagénesis "de Guía" (véase, por ejemplo, Patentes de los EE.UU. Nºs: 5,830,650; 5,798,208) se ha usado para mutagenizar una región definida de un polipéptido sintetizando una mezcla de oligonucleótidos degenerados que, estadísticamente, contienen un grupo degradado de mutaciones. Sin embargo, debido a que se emplea síntesis de polinucleótidos degenerada, la mutagénesis de guía proporciona un número de alteraciones indeseadas además del grupo deseado de mutaciones. Por ejemplo, para introducir secuencialmente una mutación a través de una región definida de sólo cinco posiciones aminoacídicas, se debe fabricar (y rastrear) un grupo de más de 100 polinucleótidos (véase, por ejemplo, Fig. 6). De acuerdo con ello, fabricar y rastrear, por ejemplo dos o tres regiones se va haciendo crecientemente complejo, es decir, requiriendo la fabricación y el rastreo de 200 a más de 300 polinucleótidos, respectivamente, para la presencia de sólo 10 a 15 mutaciones.

En aún otro enfoque lo que se ha usado para mutagenizar proteínas es mutagénesis por escaneo de alanina, donde un residuo de alanina se "escanea" a través de una parte de una proteína para identificar las posiciones donde la función de la proteína está interrumpida. Sin embargo, este enfoque sólo mira a la pérdida de función proteica por medio de sustituir un resto de alanina neutral en una posición dada, más que a la ganancia o a la mejora de función. Así, no es un enfoque útil para generar proteínas que tengan estructura y función mejoradas.

De acuerdo con ello, permanece una necesidad de una forma sistemática para mutagenizar una proteína para función nueva o incrementada.

La técnica anterior incluye lo siguiente: el documento W02005/003345, se refiere a un procedimiento de mutagénesis de revisión para producir una biblioteca de análogos de polipéptidos, el documento WO03/023032 se refiere a un procedimiento de evolución de péptidos y proteínas dirigida de alto rendimiento y Schultz y col., Proc. Natl. Acad. Sci EE.UU. 83, 6, (1986), páginas 1588-1592, se refiere a una técnica mutagénica en la que un sitio de aminoácido diana en una proteína sujeto está sustituido sistemáticamente por todos los aminoácidos. El documento WO03/089671 se refiere a un procedimiento de mutagénesis de guía de un ácido nucleico que codifica un polipéptido prototipo, el documento WO03/088911 se refiere a bibliotecas que contienen inmunoglobulinas mutadas y el documento WO01/44463 se refiere a procedimientos que usan análisis estadísticos y análisis de secuencia de ADN para evaluar rápidamente la importancia funcional y estructural de cadenas laterales de proteína individual para interacciones de unión.

Sumario de la invención

La invención concierne a un procedimiento de mutagénesis para la generación de proteínas (o polipéptidos) novedosas o mejoradas y a bibliotecas de equivalentes de polipéptido y a los polipéptidos específicos generados por los procedimientos. El polipéptido marcado como diana para mutagénesis puede ser un polipéptido natural, sintético

o manipulado, incluyendo fragmentos, análogos y formas mutantes de los mismos.

En una realización, el procedimiento comprende introducir un aminoácido predeterminado en esencialmente cada posición dentro de una región definida (o en diversas regiones diferentes) de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido. Una biblioteca de polipéptido se genera conteniendo análogos polipeptídicos que no tienen más de un aminoácido predeterminado, pero que tienen colectivamente el aminoácido predeterminado en cada posición dentro de la(s) región/regiones definida(s). Solo, este procedimiento puede ser referido como mutagénesis "de revisión" debido a que, en efecto, un aminoácido individual, predeterminado (y sólo el aminoácido predeterminado) está sustituido posición-por-posición por toda una región definida o por más regiones definidas de un polipéptido.

Sin embargo, en una realización preferida, el procedimiento de LTM está mejorado usándolo para identificar aminoácidos funcionales (o así llamados "puntos calientes") de entre los aminoácidos no funcionales (o así llamados "puntos fríos") dentro de un polipéptido, o parte del mismo, para reducir adicionalmente el número de residuos a alterarse con el fin de rastrear y obtener una propiedad deseada en un polipéptido. De acuerdo con ello, el procedimiento mejorado de mutagénesis "de revisión" (LTM) (de ahora en adelante la LTM mejorada se referirá como LTM2) tiene en cuenta la identificación y construcción de un subgrupo de moléculas candidatas que representan sólo las alteraciones funcionales más relevantes en el polipéptido que después se rastrean eficientemente libres de cualquier "ruido". De forma importante, LTM2 también tiene en cuenta la construcción de una biblioteca de LTM2 que tiene ventajas superiores sobre las bibliotecas tradicionales debido a que se ha diseñado para incluir sólo alteraciones en los residuos aminoacídicos del polipéptido que es más probable que tengan un efecto sobre la función del polipéptido y por lo tanto, tras rastrear, más probables para producir una propiedad potenciada. Así, LTM2 permite a alguien "revisar" las consecuencias estructurales y funcionales de sustituir por separado un aminoácido predeterminado en cada posición aminoacídica funcional dentro de una región definida del polipéptido, segregando de este modo un producto químico de proteínas específico a la región definida sin interferencia o "ruido" algunos a partir de la generación de análogos polipeptídicos no deseados (es decir, análogos que contienen sustituciones aminoacídicas distintas de aquellas que siguen el esquema de LTM2) (véase, por ejemplo, Fig. 1).

De acuerdo con ello, la presente invención tiene en cuenta evaluación sistémica altamente eficiente y exacta del papel de un cambio de aminoácidos específicos en una o más regiones definidas de un polipéptido. Esto llega a ser particularmente importante cuándo se evalúan (por mutación) dos o más regiones definidas, de tal forma que el número de análogos polipeptídicos se incrementa grandemente, y, así, también se incrementa la presencia de análogos indeseados. La presente invención obvia este problema eliminando completamente análogos indeseados y, así, las posibilidades de que cualesquiera cambios en estructura o función proteicas observadas sean el resultado de cualquier cosa menos sustitución del aminoácido predeterminado. Así, el efecto de segregar un producto químico proteico específico para incluso regiones múltiples con una proteína se puede estudiar con exactitud y eficiencia altas. De forma importante, esto incluye estudiar cómo mutagénesis puede efectuar la interacción de tales regiones, mejorando de este modo la estructura general y la función de la proteína.

En un montaje particular de la invención, los procedimientos de la invención son adecuados para identificar un resto químico en particular que mapea en uno o más residuos o posiciones aminoacídicos funcionales. El/los residuo(s) aminoacídico(s) que contribuyen a un resto químico tal pueden aparecer en una o más posiciones que son contiguas, no contiguas, dentro de una o más regiones CDR, y/o dentro de uno o más polipéptidos, por ejemplo, cadenas pesadas o ligeras de anticuerpos. Los procedimientos de la invención tienen en cuenta la explotación adicional de un resto químico porque tienen en cuenta la realización de pruebas sistemáticas (o realización de un perfil químico) de productos químicos aminoacídicos relacionados en posición/posiciones o en región definida/regiones definidas aminoacídica(s) selecionada(s). De acuerdo con ello, en una realización, la invención proporciona un procedimiento para identificar un producto químico deseado y después examinar las consecuencias de incorporar productos químicos deseados o indeseados bien para lograr una propiedad potenciada o bien para eliminar una propiedad deletérea. Los productos químicos de cadenas laterales aminoacídicas típicas adecuadas para la realización de perfiles por los procedimientos de la invención son productos químicos de cadenas laterales aminoacídicas polares, cargadas positivamente, cargadas negativamente e hidrófobas. En una realización, un producto químico cargado se identifica como residente en un residuo/en residuos aminoacídico(s) seleccionado(s), en una posición aminoacídica seleccionada, o en una región/en regiones aminoacídica(s) seleccionada(s) y otros aminoácidos cargados están sustituidos por el aminoácido parental de tal forma que se logra una alteración en una propiedad medible. En una realización preferida, la alteración en una propiedad medible es una propiedad potenciada en un anticuerpo, por ejemplo, unión a antígeno mejorada o función efectora mejorada.

De acuerdo con ello, la invención también proporciona bibliotecas de anticuerpos que comprenden productos químicos de grupos laterales aminoacídicos relacionados introducidos en posición/posiciones aminoacídica(s) seleccionada(s)/regiones definidas que tienen, por ejemplo, química relacionada, para el rastreo eficiente de anticuerpos con propiedades mejoradas.

En otra realización de la invención, la biblioteca de análogos polipeptídicos se genera y rastrea por polinucleótidos individuales sintetizados primero que codifican una región definida o regiones definidas de un polipéptido donde, colectivamente, los polinucleótidos representan todas las variantes polinucleotídicas posibles de acuerdo con los criterios de revisión descritos en el presente documento. El procedimiento se usa para identificar y distinguir residuo(s) (posiciones) aminoacídico(s) funcional(es) de residuo(s) (posiciones) aminoacídico(s) no funcional(es). Un subgrupo de polinucleótidos variantes se expresan, por ejemplo, usando transcripción y traducción in vitro y/o usando una tecnología de despliegue, tal como despliegue de ribosomas, despliegue de fagos, despliegue de bacterias, despliegue de levaduras, despliegue de disposiciones ordenadas, o cualquier otro sistema de despliegue adecuado conocido en la técnica.

Los polipéptidos expresados son los rastreados y seleccionados después usando ensayos funcionales, tales como ensayos de unión o ensayos catalíticos/enzimáticos. En una realización, los polipéptidos se expresan en asociación con el polinucleótido que codifica el polipéptido, teniendo en cuenta por lo tanto la identificación de la secuencia polinucleotídica que codifica el polipéptido. En aún otra realización, los polipéptidos se sintetizan directamente usando química de proteínas.

En otra realización más de la invención, se construye una biblioteca beneficiosa combinatoria de las variaciones en secuencia de aminoácidos CDR de VL y VH. Esta segunda biblioteca está construida generando secuencias codificantes que tienen, en cada posición de variación de aminoácidos, codones para el aminoácido de tipo silvestre y para cada uno de los aminoácidos variantes beneficiosos identificados anteriormente en esa posición.

Así, la presente invención proporciona un procedimiento de mutagénesis inteligente que se puede para generar bibliotecas de análogos polipeptídicos que son de un tamaño práctico para rastreo, en parte, debido a que las bibliotecas están desprovistas de cualesquiera polipéptidos análogos indeseados o del así llamado ruido. El procedimiento se puede usar para estudiar el papel de aminoácidos específicos en estructura y función de polipéptidos y para desarrollar polipéptidos nuevos o mejorados tales como anticuerpos, fragmentos de unión de los mismos o análogos de los mismos, anticuerpos de cadena simple, anticuerpos catalíticos, enzimas y ligandos. Además, el procedimiento puede llevarse a cabo con el beneficio de información a priori, por ejemplo, por medio de realización de modelos por ordenador, que se pueden usar para seleccionar un subgrupo inicial de análogos polipeptídicos a producirse y estudiarse usando LTM2.

Otras ventajas y aspectos de la presente invención serán fácilmente patentes a partir de la siguiente descripción y de los siguientes Ejemplos.

Breve Descripción de las Figuras

Figura 1 ilustra las ventajas de LTM mejorada (LTM2) sobre LTM en que los aminoácidos funcionales se distinguen de los no funcionales de tal forma que se obtiene y rastrea un subgrupo más beneficioso de moléculas candidatas.

Figura 2 ilustra un enfoque general para el uso de reacción de cadena de la polimerasa (PCR) para construir regiones definidas de una cadena pesada y ligera de anticuerpo para identificar residuos aminoacídicos funcionales, en un contexto de gen más grande.

Figura 3 ilustra el ordenamiento de CDR de cadena ligera variable (VL) y cadena pesada variable (VH) en un contexto de gen de anticuerpo de cadena única sintético (scFv) anti-ovoalbúmina. En la aplicación de LTM, se introduce un aminoácido de leucina dentro de cada uno de los catorce residuos 56-69 en CDR2 de VH del anticuerpo. Para la aplicación de LTM2, sólo aquellos residuos identificados como funcionales se exploran adicionalmente por mutagénesis.

Figura 4 ilustra la reacción en cadena de la polimerasa de extensión de solapamiento único (SOE-PCR) para la producción de una biblioteca de CDR2 de VH de LTM; la producción de múltiples bibliotecas de CDR2 de VH de LTM; y una ordenación de combinaciones de bibliotecas de LTM que contienen tanto CDR de VH como CDR de VL

Figura 5 ilustra la diversidad de las bibliotecas de la invención con los ejes x e y de la matriz representando los CDR de cada una de las cadenas ligeras y pesadas en las que un "0" indica CDR de tipo silvestre y un "1" indica un CDR mutado y el número intersectado representando la complejidad de la biblioteca del subgrupo resultante (por ejemplo, 4 significa que cuatro CDR están simultáneamente mutados).

Figura 6 muestra una representación esquemática de un vector de expresión de levadura para mostrar proteínas de interés, por ejemplo, análogos de polipéptidos de la invención, en la superficie de levadura para identificación eficiente de función (fenotipo) y secuencia codificante correspondiente (genotipo).

Figura 7 representa un trazado de Clasificador Celular Activado por Fluorescencia (FACS™) de la unión de ovoalbúmina biotinilada y estreptavidina FITC a scFv anti-ovoalbúmina de tipo silvestre (línea gris); vector pYD1 solo (área gris rellenada); y control scFv (línea negra).

Figura 8 representa trazados de Clasificador Celular Activado por Fluorescencia (FACS™) que muestran un umbral de selección (el trapezoide R1) para identificar sólo aquellos clones de LTM que expresan la fusión de scFv con una alta afinidad de fusión a ovoalbúmina de forma que el anticuerpo de tipo silvestre anti-ovoalbúmina (panel izquierdo), la distribución de afinidades de unión de la biblioteca de LTM total (panel central) y los análisis de FACS tras la clasificación (panel derecho) confirman que > 80 % de los clones de scFv anti-ovoalbúmina están dentro de los criterios predeterminados.

Figura 9 ilustra etapas en el rastreo de anticuerpos scFv (por ejemplo, anti-ovoalbúmina) formados de acuerdo con la presente invención para afinidad de unión mejorada en base a cinéticas de unión en el equilibrio (por ejemplo, a ovoalbúmina).

Figura 10 muestra curvas de unión en el equilibrio para células que expresan scFv anti-ovoalbúmina antes de selección (círculos), después de una ronda de selección (triángulos claros), después de dos rondas de selección (triángulos oscuros) y para anticuerpo de referencia de tipo silvestre anti-ovoalbúmina (cuadrados negros).

Figura 11 ilustra etapas típicas para el rastreo de anticuerpos formados de acuerdo con la presente invención para afinidad de unión alta en base a cinéticas de unión particulares, por ejemplo, constantes Koff de anticuerpos, usando el antígeno de prueba ovoalbúmina.

Figura 12 muestra la identificación de proteínas potenciadas en dos clones (es decir, Koff relativa más alta comparada con un anticuerpo de referencia (cuadrado)) usando los procedimientos de la invención.

Figura 13 representa las propiedades potenciadas (véase el pliegue mejor que el de tipo silvestre) de un subgrupo de clones mejorados que tienen valores de CE50 con respecto al control de anticuerpo de referencia de tipo silvestre anti-ovoalbúmina (cuadrado).

Figura 14 muestra una matriz que representa las posiciones de aminoácidos funcionales (puntos calientes) y no funcionales (puntos fríos) de un anticuerpo ejemplar. Las mutaciones asociadas con afinidad potenciada (en relación al anticuerpo de tipo silvestre de referencia) en base a la unión en el equilibrio (CE50) y/o los experimentos de unión sobre cinética están mostrando más adelante cada posición de CDR de VH y VL.

Descripción detallada de la invención

Con el fin de proporcionar una comprensión clara de la memoria descriptiva y de las reivindicaciones, se proporcionan más adelante las siguientes definiciones.

Definiciones

Como se usa en el presente documento el término "análogo" hace referencia a polipéptido variante o mutante (o a un ácido nucleico que codifica un polipéptido tal) que tiene una o más sustituciones aminoacídicas.

La expresión "molécula de unión" se refiere a cualquier molécula de unión, incluyendo proteínas, polipéptidos y péptidos que se unen a un sustrato u objetivo. En una realización, la molécula obligatoria es un anticuerpo o un fragmento de unión del mismo (por ejemplo, un fragmento de Fab), anticuerpo de dominio único, anticuerpo de cadena cadena única o péptido capaz de unir un ligando. En otra realización, la molécula de unión, en particular, las moléculas de unión que comprenden región/regiones de CDR, pueden comprender regiones de andamiajes o armazones no tradicionales derivadas de otros anticuerpos, inmunoglobulinas, o moléculas similares a inmunoglobulinas (por ejemplo, fibronectina), o ser en parte o en su totalidad, de origen sintético.

La expresión "región definida" se refiere a una región seleccionada de un polipéptido. Típicamente, la región definida incluye todo o una parte de un sitio funcional, por ejemplo, el sitio de unión de un ligando, el sitio de unión de una molécula de unión o receptor, o un sitio catalítico. La región definida puede también incluir partes múltiples de un sitio funcional. Por ejemplo, la región definida puede incluir todo, una parte, o partes múltiples de una región determinante complementaria (CDR), por ejemplo, una región de unión a dominio individual, o una región variable (Fv) de cadena pesada y/o de cadena ligera completa de un anticuerpo. Así, un sitio funcional puede incluir una sola

o múltiples regiones definidas que contribuyen a la actividad funcional de la molécula.

Los términos "aminoácido(s) funcional(es)" y "aminoácido(s) no funcional(es)" se refieren a, respectivamente, los residuos de aminoácidos (o posición de residuo de aminoácido correspondiente) dentro de un polipéptido (o parte del mismo) que se determinen (usando, por ejemplo, los procedimientos de la invención) para contribuir a una propiedad medible o actividad del polipéptido. De acuerdo con ello, un residuo/residuos de aminoácido funcionale(s) (o posición/posiciones correspondiente(s)) se refiere(n) como "un punto caliente/puntos calientes" si es/son un residuo/residuos que influencia(n) la actividad del polipéptido según se compara con un residuo/con residuos o con posición/posiciones que no influencia(n) la actividad del polipéptido y por lo tanto se refiere(n) como "un punto frío/puntos fríos". Un residuo (o posición) de aminoácido funcional se distingue de un residuo (o posición) de aminoácido no funcional según es adecuado para mutágénesis. Típicamente, cuándo se aplican los procedimientos de la invención a la investigación de una molécula de anticuerpo, residuos aminoacídicos que alteran, por ejemplo, unión de antígeno, se consideran residuos/posiciones funcionales (es decir, puntos calientes) mientras que los residuos que no alteran tal unión se refieren como residuos/posiciones no funcionales (es decir, puntos fríos).

El término "propiedad medible" se refiere a una propiedad o actividad funcional de un polipéptido (o una parte del mismo) que puede medirse, determinarse, o ensayarse, usando técnicas estándar e incluyen, afinidad de unión, actividad cinasa, actividad catalítica, actividad térmica, o actividad enzimática. Propiedades medibles de polipéptidos que son polipéptidos de unión a antígenos, por ejemplo, anticuerpos, incluyen típicamente especificidad de unión, avidez de unión, afinidad de unión, unión a receptor de Fc, glicosilación, unión de complemento, estabilidad de semivida, solubilidad, estabilidad térmica, actividad catalítica y actividad enzimática.

La expresión "mutagénesis de revisión" o "LTM" se refiere a un procedimiento para introducir un aminoácido predeterminado en esencialmente cada posición dentro de una región definida (o de varias regiones diferentes) de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido. Se genera una biblioteca de polipéptidos que contiene análogos de polipéptidos que individualmente no tienen más de un aminoácido predeterminado, pero que tienen colectivamente el aminoácido predeterminado en cada posición dentro de la(s) región/regiones definida(s).

La expresión "mutagénesis de revisión mejorada" o "LTM2" se refiere a LTM conducido tal como para identificar o distinguir residuos aminoacídicos funcionales (puntos calientes) de residuos aminoacídicos no funcionales (puntos fríos). De acuerdo con ello, el procedimiento de LTM2 tiene en cuenta introducir selectivamente un aminoácido predeterminado dentro de las posiciones de residuos de aminoácidos funcionales dentro de un polipéptido (o parte del mismo). Las bibliotecas de LTM2 correspondientes se enriquecen por lo tanto por análogos polipétídicos que tienen las alteraciones aminoacídicas más probables para conferir una propiedad alterada o potenciada. LTM2 puede llevarse a cabo de forma subsiguiente a LTM o basada en una información a priori como a la funcionalidad de un residuo de aminoácido dado o de posición de residuo.

El término "biblioteca" se refiere a dos o más moléculas mutagenizadas de acuerdo con el procedimiento de la invención. Las moléculas de la biblioteca pueden estar en la forma de polinucleótidos, polipéptidos, polinucleótidos y polipéptidos, polinucleótidos y polipéptidos en un extracto libre de células, o como polinucleótidos y/o polipéptidos en el contexto de un fago, de células procariotas, o en células eucariotas: Las bibliotecas de la invención pueden contener 2 ó más moléculas o análogos de polipéptido, por ejemplo aproximadamente 2 a 10, aproximadamente 10 a 50, aproximadamente 50 a 102, aproximadamente 103, aproximadamente 104, aproximadamente 105, aproximadamente 106, aproximadamente 107, aproximadamente 108, aproximadamente 109, aproximadamente 1010, aproximadamente 1011, aproximadamente 1012, aproximadamente 1013, o más, o cualquier intervalo o rango de lo precedente.

El término "mutagenizar" se refiere a la alteración de una secuencia de aminoácidos. Esto puede lograrse alterando

o produciendo un ácido nucleico (polinucleótido) capaz de codificar la secuencia de aminoácidos alterada, o por la síntesis directa de un polipéptido alterado que usa química de proteínas.

El término "mutagénesis" se refiere a, a no ser que se especifique lo contrario, cualquier técnica reconocida en la técnica para alterar una secuencia polinucleotídica o polipeptídica. Los tipos preferidos de mutagénesis incluyen mutagénesis de guía (WTM), mutagénesis de guía beneficiosa, mutagénesis de revisión (LTM), mutagénesis de revisión incrementada (LTM2), o combinaciones de las mismas.

La expresión "mutagénesis beneficiosa combinatoria" se refiere a una biblioteca de combinación de secuencias codificantes que codifican mezclas degeneradas de variaciones de secuencia aminoacídica de CDR de VL y/o VH identificadas inicialmente a partir del rastreo de la mutagénesis aminoacídica LTM predeterminada que tiene una alteración en una propiedad medible. En el enfoque de mutación beneficiosa combinatoria, se generan secuencias codificantes de oligonucleótidos que representan combinaciones de estas mutaciones beneficiosas identificadas por LTM. Estas combinaciones pueden ser combinaciones de mutaciones beneficiosas diferentes dentro de una CDR individual, mutaciones dentro de dos o más CDR, o mutaciones dentro de las CDR de diferentes cadenas de anticuerpos.

El término "polinucleótido(s)" se refiere a ácidos nucleicos tales como moléculas de ADN y moléculas de ARN y análogos de las mismas (por ejemplo, ADN o ARN generados usando análogos de nucleótidos o usando química de ácidos nucleicos). Según se desee, los polinucleótidos pueden elaborarse sintéticamente, por ejemplo, usando química de ácidos nucleicos reconocida en la técnica o usando enzimáticamente, por ejemplo, una polimerasa. Las modificaciones típicas incluyen metilación, biotinilación y otras modificaciones conocidas en la técnica. Además, la molécula de ácido nucleico puede ser de hebra simple o de hebra doble y, donde se desee, puede estar engarzada

o asociada (por ejemplo, covalentemente o no covalentemente) a un resto detectable.

El término "polinucleótido variante" se refiere a un polinucleótido que codifica un análogo polipeptídico correspondiente (o parte del mismo) de la invención. Así, los polinucleótidos variantes contienen uno o más codones que se han cambiado para dar como resultado expresión de un aminoácido diferente.

El término "polipéptido(s)" se refiere a dos o más aminoácidos unidos por un enlace peptídico, por ejemplo, péptidos (por ejemplo, de 2 a 50 residuos de aminoácido), así como a secuencias peptídicas más largas por ejemplo, secuencias de proteínas que comprenden típicamente secuencias desde tan pocos como 50 residuos de aminoácidos hasta más de 1.000 residuos de aminoácidos.

El término "acumular" se refiere a la combinación de variantes polinucleotídicas o análogos polipeptídicos para formar bibliotecas que representan la mutagénesis de revisión (LTM) o la mutagénesis de guía (LTM2) de una región polipéptídica completa. Las moléculas pueden estar en forma de un polinucleótido y/o polipéptido y pueden coexistir en la forma de una sub-biblioteca, como moléculas en un soporte sólido, como moléculas en solución y/o como moléculas en uno o más organismos (por ejemplo, fago, células procariotas, o células eucariotas).

El término "aminoácido predeterminado" se refiere a un residuo de aminoácido seleccionado por sustitución en cada posición dentro de una región definida de un polipéptido a mutagenizarse. Esto no incluye posición/posiciones dentro de la región que ya (por ejemplo, de forma natural) contiene el aminoácido predeterminado y así, no necesita estar sustituida con el aminoácido predeterminado. De acuerdo con ello, cada análogo de polipéptido generado de acuerdo con la presente invención no contiene más de un residuo de "aminoácidos predeterminados" en una región definida dada. Sin embargo, colectivamente, la biblioteca de análogos de polipéptidos generados contiene el aminoácido predeterminado en cada posición dentro de la región que está mutagenizada y en una realización preferida, en posiciones aminoacídicas que se determina que son funcionales (puntos calientes). Típicamente, un aminoácido predeterminado está seleccionado por un tamaño particular o por un producto químico usualmente asociado con el grupo lateral del aminoácido. Los aminoácidos predeterminados adecuados incluyen, por ejemplo, glicina y alanina (estéricamente pequeñas), serina, treonina y cisteína (nucleófilas); valina, leucina, isoleucina, metionina y prolina (hidrófobos); fenilalanina, tirosina, y triptófano (aromáticos); aspartato y glutamato (ácidos); asparragina, glutamina e histidina (amidas); y lisina y arginina (básicas). El uso de residuos aminoacídicos no tradicionales (por ejemplo, homocisteína) está también dentro del alcance de la invención y puede ser introducido usando cualesquiera técnicas reconocidas en la técnica.

Descripción detallada

El estudio de proteínas ha revelado que ciertos aminoácidos juegan un papel crucial en su estructura y función. Por ejemplo, parece que sólo un número discreto de aminoácidos participa en la unión de un anticuerpo a un antígeno o está implicado en el evento catalítico de una enzima.

Aunque está claro que ciertos aminoácidos son críticos para la actividad o función de proteínas, es difícil identificar qué aminoácidos están implicados, cómo están implicados y que sustituciones pueden mejorar la estructura o la función de la proteína. En parte, esto se debe a la complejidad de la configuración espacial de cadenas laterales de aminoácidos en polipéptidos y a la interrelación de diferentes partes del polipéptido que contribuyen a formar un sitio funcional. Por ejemplo, la interrelación entre las seis CDR de las regiones de cadena pesada y de cadena ligera de un anticuerpo contribuyen al bolsillo de unión a antígeno o de unión a ligando.

Los procedimientos de mutagénesis anteriores, tales como mutagénesis selectiva (dirigida a sitio) y mutagénesis por saturación, son de utilidad limitada para el estudio de la estructura y función de las proteínas en vista del enorme número de variaciones posibles en polipéptidos complejos. Esto es especialmente cierto dado que las combinaciones deseables están acompañadas a menudo por la presencia de grandes cantidades de combinaciones indeseables o del así llamado ruido.

El procedimiento de esta invención proporciona un enfoque sistemático, práctico, y altamente exacto para evaluar el papel de los aminoácidos particulares y su posición, dentro de una región definida de un polipéptido, en la estructura y función del polipéptido y, así, para producir polipéptidos mejorados.

1. Seleccionar una región definida

De acuerdo con la presente invención, una región o regiones definidas dentro de una proteína se seleccionan para mutagénesis. Típicamente, se cree que las regiones son importantes para la estructura o función de la proteína. Esto se puede deducir, por ejemplo, de que aspectos estructurales y/o funcionales se conocen o pueden deducirse de comparar la(s) región/regiones definida(s) con lo que se conoce a partir del estudio de otras proteínas y puede ayudarse con información de realización de modelos. Por ejemplo, la región definida puede ser una que tenga un papel en un sitio funcional, por ejemplo, en unión, catálisis, u otra función. En una realización, la región definida es una región hipervariable o región de determinación de complementariedad (CDR) de una molécula de unión a antígeno (véase, por ejemplo, Fig. 1). En otra realización, la región definida es una parte de una región de determinación de complementariedad (CDR). En otras realizaciones, se selecciona para mutagénesis dos o más regiones definidas, por ejemplo, CDR o partes de las mismas.

2. Seleccionar un residuo aminoacídico determinado

El residuo de aminoácido elegido para sustitución dentro de la(s) región/regiones definida(s) se selecciona generalmente a partir de aquellos implicados en la estructura o función de interés. Los veinte aminoácidos que se dan en la naturaleza difieren con respecto a su cadena lateral. Cada cadena lateral es responsable de propiedades químicas que hacen a cada aminoácido único. Con el propósito de alterar afinidades de unión o de crear nuevas afinidades de unión, se puede seleccionar generalmente cualquiera de todos los veinte aminoácidos que se dan en la naturaleza, así como residuos aminoacídicos no tradicionales (por ejemplo, homocisteína). Así, los procedimientos anteriores de mutagénesis, que crearon números grandes de análogos para cada sustitución, fueron poco prácticos para evaluar el efecto sobre unión de proteína de la sustitución de cada uno de los veinte aminoácidos. En contraste, los procedimientos de la presente invención crean un número práctico de análogos de cada sustitución aminoacídica y así, permiten la evaluación de una variedad mayor de productos químicos de proteínas dentro de una región o regiones segregadas de una proteína.

En contraste a la unión a proteínas, solo un subgrupo de residuos de aminoácidos participa típicamente en eventos enzimáticos o catalíticos. Por ejemplo, a partir de las propiedades químicas de las cadenas laterales, sólo un número seleccionado de aminoácidos naturales participa preferencialmente en eventos catalíticos. Tales agrupaciones de productos químicos de cadenas laterales de aminoácidos son útiles para seleccionar un residuo de aminoácidos apropiado para usar en la realización de perfiles de un residuo o posición de aminoácido en particular. Estos aminoácidos pertenecen al grupo de aminoácidos polares y neutros como Ser, Thr, Asn, Gln, Tyr y Cys, el grupo de aminoácidos cargados Asp y Glu, Lys y Arg y especialmente el aminoácido His. Otras cadenas laterales polares y neutrales son aquellas de Cys, Ser, Thr, Asn, Gln y Tyr. Gly se considera también que es un miembro dudoso de este grupo. Ser y Thr juegan un papel importante en formar enlaces de hidrógeno. Thr tiene una asimetría adicional en el carbono beta, por lo tanto sólo se usa uno de los estereoisómeros. La amida de ácido Gln y la Asn pueden formar también enlaces de hidrógeno, funcionando los grupos amido como donantes de hidrógeno y los grupos carbonilo como aceptores. Gln tiene un grupo CH2 más que Asn lo que vuelve al grupo polar más flexible y reduce su interacción con la cadena principal. Tyr tiene un grupo hidroxilo muy polar (OH fenólico) que puede disociarse a altos valores de pH. Tyr se comporta un poco como una cadena lateral cargada; sus enlaces de hidrógeno son bastante fuertes.

Los ácidos polares neutros se encuentran en la superficie así como dentro de las moléculas proteicas. Como residuos internos, normalmente forman vínculos de hidrógeno unos con otros o con la columna vertebral del polipéptido. Cys puede formar puentes disulfuro.

Histidina (His) tiene una cadena lateral aromática heterocíclica con un valor de pK de 6,0. En el intervalo de pH fisiológico, su anillo imidazol puede bien estar descargado o bien estar cargado, después de asumir un ión de hidrógeno de la solución. Dado que estos dos estados están fácilmente disponibles, His es bastante adecuado para catalizar reacciones químicas. Se encuentra en la mayoría de los centros activos de enzimas, por ejemplo, serina proteasas.

Asp y Glu están cargados negativamente a pH fisiológico. Debido a su cadena lateral corta, el grupo carbonilo de Asp es bastante rígido con respecto a la cadena principal. Esta puede ser la razón por la que el grupo carboxílico en muchos sitios catalíticos se proporciona por Asp y no por Glu. Los ácidos cargados se encuentran generalmente en la superficie de un polipéptido.

Además, Lys y Arg se encuentran en la superficie. Tienen cadenas laterales muy largas y flexibles que presentan rotámeros múltiples de energías similares. En varios casos, Lys y Arg toman parte en formar puentes salinos internos o ayudan en la catálisis. Debido a su exposición en la superficie del polipéptido, Lys es un residuo más frecuentemente reconocido por enzimas que bien modifica la cadena lateral o bien escinde la cadena peptídica en el extremo carbonilo de residuos de Lys.

Mientras el producto químico del grupo lateral de un aminoácido puede guiar la selección de un residuo aminoacídico predeterminado, la falta de un grupo lateral deseado puede ser un criterio para excluir un residuo de aminoácidos parea usar como el aminoácido predeterminado. Por ejemplo, los aminoácidos estéricamente pequeños y químicamente neutros, tales como alanina, pueden estar excluidos de mutagénesis de revisión por carecer de un producto químico deseado.

3. Sintetizar bibliotecas de análogos de polipéptidos

En una realización, una biblioteca de análogos de polipéptidos está generada por rastreo sintetizando oligonucleótidos individuales que codifican la región definida del polipéptido y no tienen más de un codón para el aminoácido predeterminado. Esto se logra incorporando, en cada posición de codón con el oligonucleótido bien el codón requerido para síntesis del polipéptido de tipo silvestre o bien un codón para el aminoácido predeterminado. Esto difiere del oligonucleótido producido en mutagénesis de saturación, mutagénesis al azar, o mutagénesis guía porque, para cada oligonucleótido se hace sólo una mutación,a diferencia de múltiples mutaciones.

Los oligonucleótidos pueden producirse individualmente y después mezclarse o acumularse como se desee. Cuando el codón de la secuencia de tipo salvaje y el codón para el aminoácido predeterminado son el mismo, no se hace ninguna sustitución.

De acuerdo con ello, el número de posiciones aminoacídicas dentro de la región definida determinará el número máximo de oligonucleótidos fabricados. Por ejemplo, si las posiciones de cinco codones se alteran con el aminoácido predeterminado, después cinco polinucleótidos más un polinucleótido que representan la secuencia de tipo silvestre se sintetizan. Dos o más regiones pueden alterarse simultáneamente. En una realización, los residuos de aminoácidos (posiciones) dentro de la región definida que se mutagenizan son residuos de aminoácidos funcionales (posiciones). En otra realización, los residuos de aminoácidos funcionales (posiciones) están exclusivamente mutagenizados.

La mezcla de oligonucleótidos para la generación de la biblioteca puede sintetizarse fácilmente por procedimientos conocidos por síntesis de ADN. El procedimiento preferido implica el uso de producto químico de betacianoetilfosforamidita en fase sólida. Véase Patente de los EE.UU. N.º 4.725.677. Por conveniencia, se puede usar un instrumento para síntesis de ADN automatizada que contiene recipientes de reactivos especificados de nucleótidos. Los polinucleótidos también pueden sintetizarse para contener sitios de restricción o sitios de hibridación de cebador para facilitar la introducción o ensamblaje de los polinucleótidos representando, por ejemplo, una región definida, dentro de un contexto de gen más grande.

Los polinucleótidos sintetizados pueden insertarse dentro de un contexto de gen más grande del polipéptido que se está mutagenizando usando técnicas de ingeniería genética estándar. Por ejemplo, los polinucleótidos puede fabricarse para contener sitios de reconocimiento flanqueantes para enzimas de restricción. Véase Crea, R., Patente de los EE.UU. N.º 4.888.286. Los sitios de reconocimiento están diseñados para corresponder a sitios de reconocimiento que bien existen en la naturaleza o bien se introducen en el gen próximos al ADN que codifica la región. Después de la conversión en una forma de doble hebra, los polinucleótidos están ligados dentro del gen por técnicas estándar. Por medio de un vector apropiado (incluyendo, por ejemplo, vectores de fagos, plásmidos) los genes se pueden introducir dentro de un extracto libre de células, de un fago, de una célula procariota, o de una célula eucariota adecuada para expresión de los polipéptidos mutantes.

En casos donde la secuencia de aminoácidos del polipéptido a mutagenizarse se conoce o donde la secuencia de ADN se conoce, la síntesis de genes es un posible enfoque. Por ejemplo, pueden diseñarse polinucleótidos parcialmente solapantes, típicamente de aproximadamente 20-60 nucleótidos de longitud. Los polinucleótidos internos se fosforilan después fusionados a su compañero complementario para dar una molécula de ADN de hebra doble con extensiones de hebra simple útiles para fusión adicional. Los pares fusionados se pueden después mezclar y ligar conjuntamente para formar una molécula de hebra doble de longitud total (véase, por ejemplo, Fig. 8). Los sitios de restricción convenientes pueden diseñarse cerca de los extremos del gen sintético para clonar dentro de un vector adecuado. Las moléculas de longitud total pueden escindirse con aquellas enzimas de restricción y ligarse dentro de un vector adecuado. Los sitios de restricción conveniente también pueden incorporarse dentro de la secuencia del gen sintético para facilitar la introducción de casetes mutagénicas.

Como una alternativa a sintetizar polinucleótidos que representan el gen de doble hebra de longitud total, se pueden ensamblar los polinucleótidos que se solapan parcialmente en sus extremos 3' (es decir, con extremos 3' complementarios) en una estructura discontinua y después pueden cargarse con una polimerasa adecuada para hacer un gen de doble hebra de longitud total. Típicamente, los polinucleótidos son de 40-90 nucleótidos de longitud. Los polinucleótidos prolongados se ligan después. Se pueden introducir sitios de restricción convenientes en los extremos y/o internamente para propósitos de clonación. Tras digestión con una enzima o enzimas de restricción apropiadas, el fragmento génico se liga en un vector adecuado. Alternativamente, el fragmento de gen puede ligarse por unión de extremos romos dentro de un vector apropiado.

En estos enfoques, si están disponibles sitios de restricción convenientes (naturales o manipulados) tras en ensamblaje génico, los polinucleótidos degenerados se pueden introducir subsiguientemente clonando la casete dentro de un vector apropiado. Alternativamente, los polinucleótidos degenerados pueden incorporarse en la fase de ensamblaje génico. Por ejemplo, cuando ambas hebras del gen se sintetizan químicamente totalmente, se pueden producir polinucleótidos degenerados solapantes y complementarios. Los pares complementarios se fusionarán entre sí.

Cuando los polinucleótidos que solapan parcialmente se usan en el ensamblaje génico, se puede incorporar también directamente un grupo de nucleótidos degenerados en lugar de uno de los polinucleótidos. La hebra complementaria apropiada se sintetiza durante la reacción de extensión a partir de un polinucleótido parcialmente complementario a partir de la otra hebra por prolongación enzimática con una polimerasa. La incorporación de los polinucleótidos degenerados en la fase de síntesis simplifica también la clonación donde más de un dominio de región definida de un gen se mutageniza.

En otro enfoque, el gen de interés está presente en un plásmido de una sola hebra. Por ejemplo, el gen puede clonarse dentro de un vector de fagos o de un vector con un origen de replicación de fago filamentoso que permite propagación de moléculas de hebra simple con el uso de un fago coadyuvante. La plantilla de hebra simple puede fusionarse con un grupo de polinucleótidos degenerados que representan las mutaciones deseadas y se elongan y se ligan, incorporando así cada hebra análoga en una población de moléculas que se pueden introducir dentro de un huésped apropiado (Sayers, J. R. y col., Nucleic Acids Res. 16: 791-802 (1988)). Este enfoque puede eludir múltiples etapas de clonación donde se seleccionan múltiples dominios para mutagénesis.

La metodología de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) puede usarse también para incorporar polinucleótidos a un gen. Por ejemplo, los polinucleótidos por sí mismos pueden usarse como cebadores para prolongación. En este enfoque los polinucleótidos que codifican las casetes mutagénicas que corresponden a la región definida (o a parte de la misma) son complementarias entre sí, al menos en parte y pueden extenderse para formar un casete génico grande usando una polimerasa, por ejemplo, usando amplificación por PCR (véase, por ejemplo, Fig. 2).

La medida de la biblioteca variará dependiendo de la longitud y número de regiones y aminoácidos dentro de una región que se mutageniza. Preferentemente, la biblioteca será diseñará para contener menos de 1015, 1014, 1013, 1012, 1011, 1010, 109, 108, 107 y más preferentemente, 106 equivalentes de polipéptido o menos.

La descripción anterior se ha centrado en la mutagénesis de polipéptidos y bibliotecas de polipéptidos alterando el polinucleótido que codifica el polipéptido correspondiente. Se entiende, sin embargo, que el alcance de la invención comprende también procedimientos de mutagenizar polipéptidos por síntesis directa de los análogos de polipéptidos deseados usando química de proteínas. En llevar a cabo este enfoque, los polipéptidos resultantes aún incorporan las características de la invención salvo porque el uso de un intermedio polinucleotídico se elimina.

Para las bibliotecas anteriormente descritas, si están en la forma de polinucleótidos y/o polipéptidos correspondientes, se entiende que las bibliotecas pueden estar también unidas a un soporte sólido, tal como un microchip y preferentemente ordenadas, usando técnicas reconocidas en la técnica.

4. Sistema de expresión y de rastreo

Las bibliotecas de polinucleótidos generados por cualquiera de las técnicas anteriores u otras técnicas adecuadas pueden expresarse y escanearse para identificar polipéptidos análogos que tienen la estructura y/o actividad deseada. La expresión de los análogos de polipéptido puede llevarse cabo usando cualquier sistema de presentación de expresión adecuado conocido en la técnica que incluye, pero no se limita a, sistemas de presentación de extracto libres de células (por ejemplo, sistemas de presentación ribosómicos y sistemas de presentación de disposición ordenada (por ejemplo, de disposición ordenada en micromatrices o de disposición ordenada en macromatrices)), sistemas de presentación bacterianos, sistemas de presentación de fagos, células procariotas y/o células eucariotas (por ejemplo, sistemas de presentación de la levadura).

En una realización, los polinucleótidos están manipulados para servir como plantillas que se pueden expresar en un extracto libre de células. Los vectores y extractos se describen, por ejemplo en la Patente de los EE.UU. N.ºs 5.324.637; 5.492.817; 5.665.563, pueden usarse y muchos están comercialmente disponibles. La presentación ribosómica y otras técnicas libres de células para engarzar polinucleótido (es decir, un genotipo) a un polipéptido (es decir, un fenotipo) se pueden usar, por ejemplo, Profusion™ (véase, por ejemplo, Patentes de los EE.UU. N.ºs 6.348.315; 6.261.804; 6.258.558; y 6.214.553).

Alternativamente, los polinucleótidos de la invención se pueden expresar en sistemas de expresión procariotas convenientes tales como el sistema de expresión bacteriano E. coli, tal como aquel descrito por Pluckthun y Skerra. (Pluckthun, A. y Skerra, A., Meth. Enzymol. 178: 476-515 (1989); Skerra, A. y cols., Biotechnology 9: 273-278 (1991)). Las proteínas mutantes pueden expresarse para secreción en el medio y/o en el citoplasma de las bacterias, cuando se describe por M. Better y A. Horwitz, Meth. Enzymol. 178: 476 (1989). En una realización, los dominios individuales que codifican VH y VL están unidos cada uno al extremo 3' de una secuencia que codifica una secuencia señal, como la secuencia señal ompA, phoA o pelB (Lei, S. P. y cols, J. Bacteriol. 169: 4379 (1987)). Estas fusiones génicas están ensambladas en una construcción dicistrónica, de tal forma que pueden expresarse a partir de un vector individual y segregarse dentro del espacio periplásmico de E. coli donde se repliegan y pueden recuperarse en forma activa (Skerra, A. y col., Biotechnology 9: 273-278 (1991)). Por ejemplo, los genes de cadena pesada de anticuerpos se pueden expresar concurrentemente con genes de cadena ligera para producir anticuerpo

o fragmentos de anticuerpo.

En aún otra realización, los polinucleótidos puede expresarse en células eucariotas como levadura usando, por ejemplo, presentación de levadura como se describe, por ejemplo, en Patentes de EE.UU. N.ºs 6.423.538; 6.331.391; y 6.300.065. En este enfoque, los análogos de polipéptidos de la biblioteca están fusionados a un polipéptido que se expresa y muestra en la superficie de la levadura. Otras células eucariotas para expresión de los polipéptidos de la invención también puede usarse como células de mamíferos, por ejemplo células de mieloma, células de hibridoma, o células de ovario de hámster chino (CHO). Típicamente, los equivalentes de polipéptido cuándo se expresan en células de mamíferos se diseñan para expresarse dentro del medio de cultivo, o para expresarse en la superficie de una célula tal. El anticuerpo o los fragmentos de anticuerpo pueden producirse, por ejemplo, como moléculas de anticuerpos enteras o como fragmentos individuales VH y VL, fragmentos Fab, dominios individuales, o como anticuerpos de cadena simple (scFv) (véase Huston, J. S. y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 85: 5879-5883 (1988)).

El rastreo de los análogos de polipéptidos expresados (o los polipéptidos producidos por síntesis directa) se pueden hacer por cualquier medio apropiado. Por ejemplo, la actividad de unión puede evaluarse por inmunoensayos estándar y/o por cromatografía de afinidad y la actividad catalítica puede establecerse por ensayos adecuados para conversión de sustrato. El rastreo de los análogos polipeptídicos de la invención para función proteolítica se pueden llevar a cabo usando un ensayo de placa de hemoglobina como se describe, por ejemplo, en la Patente de los EE.UU. 5.798.208.

5. Mutagénesis de evaluación mejorada asistida por realización de modelos por ordenador

La mutagénesis de evaluación de la invención también puede llevarse a cabo con el beneficio de la información estructural o de modelización relativa a los análogos polipeptídicos a generarse, de tal forma que el potencial para generar análogos que tienen la función mejorada deseada se incrementa. La información estructural o la información de modelización también se puede puede usar para dirigir la selección de aminoácido predeterminado para introducir dentro de las regiones definidas. Aún adicionalmente, los resultados reales obtenidos con los análogos polipeptídicos de la invención pueden dirigir la selección (o exclusión) de los polipéptidos subsiguientes para fabricarse y rastrearse en una forma iterativa. De acuerdo con ello, la información o modelización estructural puede usarse para generar subgrupos iniciales de análogos polipeptídicos para usar en la invención, incrementando adicionalmente por lo tanto la eficiencia o generando polipéptidos mejorados.

En una realización particular, la modelización in silico se usa para eliminar la producción de cualquier análogo polipeptídico que se prediga que tiene estructura y/o función pobre e indeseada. De este modo, el número de análogos polipéptídicos a producirse puede reducirse de forma aguda incrementando de este modo la señal para ruido en ensayos de rastreo subsiguientes. En una realización particular, los residuos de aminoácidos funcionales (posiciones) o los puntos calientes están identificados como adecuados para mutagénesis mientras que los residuos aminoacídicos no funcionales (posiciones) o puntos fríos, están excluidos. En otra realización particular, la modelización in silico se actualiza continuamente con información de modelización adicional, de cualquier fuente relevante, por ejemplo, de secuencia de genes y proteínas y de bases de datos tridimensionales y/o de análogos anteriormente probados, de modo que la base de datos in silico llega a ser más precisa en su capacidad predictiva.

En aún otra realización, la base de datos in silico se proporciona con los resultados de ensayo de análogos polipeptídicos anteriormente puestos a prueba y clasifica los análogos, en base a criterio o criterios de ensayo, como capaces de responder o incapaces de responder, por ejemplo, como los análogos polipeptídicos que se unen bien o no tan bien o como los que son enzimáticos/catalíticos o no tan enzimáticos/catalíticos. De este modo, la mutagénesis de la invención puede identificar un intervalo de respuesta funcional con información estructural particular y usar tal información para guiar la producción de análogos de polipéptidos futuros para probarse. De acuerdo con ello, el procedimiento es especialmente adecuado para rastrear anticuerpos o fragmentos de anticuerpo para una función particular, tal como afinidad de unión (por ejemplo, especificidad), estabilidad (por ejemplo, semivida) y/o función efectora (por ejemplo, activación complementaria y ADCC) señalando como diana puntos calientes para mutagénesis. De acuerdo con ello, la mutagénesis de residuos no contiguos dentro de una región pueden ser deseable si se conoce, por ejemplo, por modelización in silico, que ciertos residuos en la región no participarán en la función deseada. La estructura coordinada y la interrelación espacial entre las regiones definidas, por ejemplo, los residuos aminoacídicos funcionales en las regiones definidas del polipéptido, por ejemplo, el/los aminoácido(s) predeterminado(s) que se puede(n) introducir, pueden considerarse y modelarse. Tales criterios de modelización incluyen, por ejemplo, producto químico de grupo lateral de residuo de aminoácidos, distancias atómicas, datos cristalográficos, etc. Por consiguiente, el número de análogos de polipéptidos a producirse puede minimizarse inteligentemente.

En una realización preferida, una o más de las etapas anteriores está asistida por computadora. El procedimiento también es susceptible de llevarse a cabo, en parte o en todo, por un dispositivo, por ejemplo, un dispositivo dirigido por ordenador. De acuerdo con ello, las instrucciones para llevar a cabo procedimiento, en parte o en todo, pueden conferirse a un medio adecuado para usar en un dispositivo electrónico para llevar a cabo las instrucciones. En suma, los procedimientos de la invención son susceptibles a un enfoque de alto rendimiento que comprende software (por ejemplo, instrucciones legibles por computadora) y hardware (por ejemplo, ordenadores, dispositivos robóticos y chips).

6. Explorar la química combinatoria de regiones definidas múltiples

La presente invención proporciona la ventaja importante de tener en cuenta la evaluación por mutagénesis de varias regiones diferentes o dominios de un polipéptido simultáneamente. Esto puede hacerse usando el mismo aminoácido o un aminoácido diferente predeterminado para cada región, permitiendo la evaluación de aminoácidos en regiones conformacionalmente relacionadas, tales como las regiones que tras plegamiento del polipéptido, se asocian para elaborar un sitio funcional (por ejemplo, el sitio de unión de un anticuerpo o el sitio catalítico de una enzima). Esto, a su vez, proporciona una manera eficaz de crear sitios funcionales nuevos o mejorados.

Por ejemplo, las seis CDR de un anticuerpo que componen los aspectos únicos del sitio de unión a antígenos (región Fv) se pueden mutagenizar simultáneamente, o separadamente en las cadenas VH o VL, para estudiar la interrelación tridimensional de aminoácidos seleccionados en este sitio. En una realización, la química combinatoria de tres o más regiones definidas se explora sistemáticamente usando mutagénesis de evaluación y preferentemente seis regiones definidas, por ejemplo, las seis CDR de una región variable de cadenas ligera y pesada de un anticuerpo. Para llevar a cabo mutagénesis de evaluación en un CDR, típicamente 3, 4, 5. 6, 7, 8, 9, 10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, o más posiciones de aminoácido están alteradas. Los residuos de aminoácidos funcionales se distinguen después de los residuos de aminoácidos no funcionales y se identifican ya que son adecuados para mutagénesis adicional.

De acuerdo con ello, la presente invención abre nuevas posibilidades para el diseño de muchos tipos diferentes de polipéptidos novedosos y mejorados. El procedimiento puede usarse para perfeccionar una estructura o función existente de una proteína. Por ejemplo, un sitio de unión para un anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede introducirse o puede mejorarse la afinidad para un antígeno preexistente, la función efectora y/o la estabilidad. Alternativamente, la introducción de aminoácidos "catalíticamente importantes" adicionales dentro de un dominio catalítico de una enzima se pueden llevar a cabo dando como resultado una actividad catalítica para un sustrato modificada o potenciada. Alternativamente, se pueden introducir dentro de un polipéptido estructuras, especificidades o actividades enteramente nuevas. La síntesis de novo de la actividad enzimática se puede lograr también. Las estructuras nuevas pueden construirse sobre el "andamiaje" natural o consenso de una proteína existente mutando sólo regiones relevantes (por ejemplo, residuos aminoacídicos funcionales (posiciones)) por el procedimiento de la invención.

7. Mutagénesis de evaluación mejorada (LTM2) para fabricar anticuerpos nuevos o mejorados

El procedimiento de esta invención es especialmente útil para modificar moléculas de anticuerpos. Como se usa en el presente documento, moléculas de anticuerpo o anticuerpos hacen referencia a anticuerpos o partes de los mismos, tales como anticuerpos de longitud total, moléculas Fv, u otros fragmentos de anticuerpos, cadenas individuales o fragmentos de las mismas (por ejemplo, una cadena única de Fv), anticuerpos de cadena simple (por ejemplo, scFv) y anticuerpos quiméricos. Las alteraciones se pueden introducir dentro de la región variable y/o dentro de la región de armazón (constante) de un anticuerpo. La modificación de la región variable puede producir anticuerpos con mejores propiedades de unión a antígeno y si se desea, con mejores propiedades catalíticas. La modificación de la región de armazón también puede conducir a la mejora de propiedades químico-físicas, tales como solubilidad o estabilidad (por ejemplo, semivida), que son especialmente útiles, por ejemplo, en producción comercial, biodisponibilidad, función efectora (por ejemplo, activación del complemento y/o ADCC) y afinidad de unión (por ejemplo, especificidad) por el antígeno. Típicamente, la mutagénesis toma como diana la región Fv de la molécula de anticuerpo, es decir, la estructura responsable de actividad de unión a antígeno que está compuesta de regiones variables de dos cadenas, una de la cadena pesada (VH) y otra de la cadena ligera (VL). En particular, la mutagénesis toma como dianas residuos aminoacídicos funcionales (posiciones) que se ha determinado que contribuyen a una propiedad medible del anticuerpo (por ejemplo, unión a antígeno, unión a receptor de Fc, etc.). Una vez se identifican las características de unión a antígeno deseadas, la(s) región/regiones variable(s) puede(n) manipularse dentro de una clase de anticuerpo deseada tal como IgG, IgM, IgA, IgD, o IgE.

8. Mutagénesis de evaluación mejorada (LTM2) para fabricar/mejorar polipéptidos catalíticos/enzimáticos

El procedimiento de la invención es también particularmente adecuado para el diseño de proteínas catalíticas, particularmente anticuerpos catalíticos. Actualmente, los anticuerpos catalíticos se puede preparar por una adaptación de técnicas de fusión celular somáticas estándar. En este proceso, un animal está inmunizado con un antígeno que se parece al estado de transición del sustrato deseado para inducir producción de un anticuerpo que une el estado de transición y cataliza la reacción. Las células que producen anticuerpo se cosechan del animal y se fusionan con una célula inmortalizada para producir células híbridas. Estas células se rastrean entonces en busca de secreción de un anticuerpo que cataliza la reacción. Este procedimiento es dependiente de la disponibilidad de análogos del estado de transición de un sustrato. El procedimiento puede estar limitado debido a que tales análogos es probable que sean difíciles de identificar o sintetizar en la mayoría de los casos.

El procedimiento de la invención proporciona un enfoque diferente que elimina la necesidad de un análogo de estado de transición. Por el procedimiento de la invención, un anticuerpo puede hacerse catalítico por la introducción de aminoácidos adecuados dentro del sitio de unión de una inmunoglobulina (región Fv). La región de unión a antígeno (Fv) está compuesta de seis bucles hipervariables (CDR), tres derivados de la cadena pesada (H) de inmunoglobulina y tres de la cadena ligera (L) de inmunoglobulina, que conectan hebras beta dentro de cada subunidad. Los residuos de aminoácidos de los bucles de CDR contribuyen casi enteramente a las características de unión de cada anticuerpo monoclonal específico. Por ejemplo, las tríadas catalíticas (que constan de los residuos de aminoácidos serina, histidina y ácido aspártico) se modelaron después de que las serina proteasas se pudieran crear en los segmentos hipervariables de la región Fv de un anticuerpo con afinidad conocida por la molécula de sustrato y se pueden rastrear en busca de actividad proteolítica del sustrato. En una realización preferida, los residuos de aminoácido funcionales (posiciones) que se ha determinado que contribuyen a una propiedad medible del anticuerpo, por ejemplo, actividad catalítica, están marcados como diana.

En particular, el procedimiento de la invención se puede usar para producir muchas enzimas diferentes o anticuerpos catalíticos diferentes, incluyendo oxidorreductasas, transferasas, hidrolasas, liasas, isomerasas y ligasas. Entre estas clases, será de particular importancia la producción de proteasas, carbohidrasas, lipasas, dioxigenasas y peroxidasas mejoradas. Estas y otras enzimas que se pueden preparar por el procedimiento de la invención tienen aplicaciones comerciales importantes para conversiones enzimáticas en cuidado de la salud, cosméticos, alimentos, elaboración de cerveza, detergentes, medio ambiente (por ejemplo, tratamiento de aguasresiduales), agricultura, elaboración de curtidos, tejidos y otros procedimientos químicos. Éstos incluyen, pero se limitan a, aplicaciones diagnósticas y terapéuticas, conversiones de grasas, carbohidratos y proteína, degradación de contaminantes orgánicos y síntesis de productos químicos. Por ejemplo, se pueden manipular proteasas terapéuticamente efectivas con actividad fibrinolíticas, o actividad contra estructuras víricas necesarias para infectividad, como proteínas de revestimiento vírico. Tales proteasas podrían ser agentes antitrombóticos útiles o agentes antivirales útiles contra virus tales como, por ejemplo, VIH, rinovirus, virus influenza, o virus de las hepatitis. En el caso de oxigenasas (por ejemplo, dioxigenasas), una clase de enzimas que requieren un co-factor para oxidación de anillos aromáticos y otros enlaces dobles, aplicaciones industriales en procedimientos de elaboración de pulpa, conversión de biomasa en combustibles u otros productos químicos, conversión de contaminantes de aguas residuales, bioprocesamiento de carbón y detoxificación de compuestos orgánicos peligrosos son aplicaciones posibles de proteínas novedosas. La identificación de mejoras para las precedentes se facilita por los procedimientos de la invención marcando como dianas preferencialmente residuos de aminoácidos (posiciones) que es más probable que contribuyan a la actividad deseada o a la propiedad deseada por la que se ven mejoras.

9. Procedimientos de mutagénesis combinatoria

En el enfoque de mutación beneficiosa combinatoria, se generan secuencias de codificación que representan combinaciones de las mutaciones beneficiosas identificadas por LTM. Estas combinaciones pueden ser combinaciones de mutaciones beneficiosas diferentes en un sola CDR, mutaciones dentro de dos o más CDR dentro de una cadena de anticuerpo individual, o mutaciones dentro de las CDR de cadenas de anticuerpo diferentes.

Un enfoque combinatorio se parece al procedimiento de WTM salvo porque las sustituciones de codones seleccionadas dentro de las CDR son las diferentes sustituciones aminoacídicas beneficiosas diferentes identificadas por LTM. Así, no contendrá una mutación cada posición de residuo en una CDR de anticuerpo y algunas posiciones tendrán los aminoácidos diferentes múltiples sustituidos en esa posición. En general, muchas si no todas, las combinaciones de mutaciones beneficiosas dentro de una CDR o una cadena de anticuerpo estarán representadas por al menos una de las secuencias codificantes en la biblioteca. Como se muestra en la Tabla 1, esta biblioteca de codificación de secuencia se puede preparar por una modificación del procedimiento WTM, salvo porque en vez de colocar codones para un aminoácido individual en la región codificante variable, los codones que se introducen son aquellos correspondientes a todas las mutaciones beneficiosas detectadas en el procedimiento de LTM. Con el fin de mantener el tamaño de esta biblioteca manejable, las mutaciones pueden estar confinadas a una de las dos cadenas pesada o ligera sólo.

En un segundo enfoque, los fragmentos de genes individuales que contienen una región CDR individual y que tienen una variación de codón que codifica todas las combinaciones de mutaciones beneficiosas dentro de CDR se reconstruyen, por ejemplo, por procedimientos de reordenamiento génico, para producir secuencias codificantes de cadenas VL y VH que tienen combinaciones de mutaciones beneficiosas en todas las CDR de una cadena dada o en todas las CDR en ambas cadenas.

Una biblioteca combinatoria de las mutaciones se puede generar también por procedimientos de reordenamiento de genes conocidos, tales como se detallan en la solicitud de Patente de los Estados Unidos 2003/005439A1 y en la Patente de los EE.UU. N.º 6.368.861 y (Stemmer WP (1994) Proc Natl Acad Sci 91 (22): 10747-51), todos los cuales se incorporan en el presente documento mediante referencia. El procedimiento implica digestión con ADNasa I de los clones de mutación mezclados recogidos para producir un grupo de fragmentos génicos al azar de diversos tamaños predeterminados (por ejemplo 50-250 pares de base). Los fragmentos se desnaturalizan primero y los diversos fragmentos separados se dejan reasociar después en base a regiones complementarias homólogas. De esta manera, los fragmentos renaturalizados pueden incorporar CDR de mutación mezclada diferentemente en los segmentos reensamblados que se prolongan después por SOE-PCR como anteriormente y una quimera reensamblada puede incorporar después, como mínimo, al menos dos grupos de mutaciones mezcladas de CDR beneficiosas de cada donante de fuente de ADN parental.

La presente invención se ilustra adicionalmente en los ejemplos siguientes, que no deberían interpretarse como limitación.

Ejemplificación

En los ejemplos, los materiales y procedimientos siguientes se usaron a no ser que se indique lo contrario.

Materiales y procedimientos

En general, la práctica de la presente invención emplea, a no ser que se indique otra cosa, técnicas convencionales de química, biología molecular, tecnología recombinante de ADN, tecnología de PCR, inmunología (especialmente, por ejemplo, tecnología de anticuerpos), sistemas de expresión (por ejemplo, expresión libre de células, presentación de fagos, presentación de ribosomas, y Profusion™), y cualquier cultivo celular necesario que esté dentro de la capacidad en la técnica y que se explique en la bibliografía. Véanse, por ejemplo, Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); DNA Cloning, vols. 1 y 2, (D.N. Glover, Ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, Ed. 1984); PCR Handbook Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, Beaucage, Ed. John Wiley & Sons (1999) (Editor); Oxford Handbook of Nucleic Acid Structure, Neidle, Ed., Oxford Univ Press (1999); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis y cols., Academic Press (1990); PCR Essential Techniques: Essential Techniques, Burke, Ed., John Wiley & Son Ltd (1996); The PCR Technique: RT-PCR, Siebert, Ed., Eaton Pub. Co. (1998); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., C.S.H.L. Press, Pub. (1999); Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel y cols., John Wiley & Sons (1992); Large-Scale Mammalian Cell Culture Technology, Lubiniecki, A., Ed., Marcel Dekker, Pub., (1990). Phage Display: A Laboratory Manual, C. Barbas (Ed.), CSHL Press, (2001); Antibody Phage Display, P O'Brien (Ed.), Humana Press (2001); Border y cols., Yeast surface display for screening combinatoria polypeptide libraries, Nature Biotechnology, 15 (6): 553-7 (1997); Border y cols., Yeast surface display for directed evolution of protein expression, affinity, and stability, Methods Enzymol., 328: 430-44 (2000); presentación de ribosomas como se describe por Pluckthun y cols. en la Patente de los EE.UU. N.º 6.348.315 y Profusion™ como se describe por Szostak y cols. en las Patentes de los EE.UU. N.ºs 6.258.558; 6.261.804 y 6.214.553.

Construcción del gen de prueba

Las secuencias de Fab de tipo silvestre de ovoalbúmina se usaron como plantillas para las partes de VL y de VH (SEC ID N.ºs: 1 y 2 respectivamente) para la construcción de scFv usando PCR y cebadores apropiados (SEC ID N.ºs:11 y 12) y oligonucleótidos deVH (SEC ID Nºs: 13-14). Las reacciones de PCR constaron de 2 1l cada una de reserva de oligonucleótidos 101M, 0,5 1l de ADN polimerasa Pfx (2,5 U/1l)" 5 1l de tampón de Pfx, 1 1l de dNTP 10 mM, 1 1l de MgS04 50 mM y aquí se llevan a cabo en 37,5 1l de dH20 e n 94 ºC durante 2 min, seguidas por 24 ciclos de 30 segundos en 94 C, 30 segundos en 50 C y 1 minuto en 68 C seguidos por incubación a 68 ºC durante 5 min. Los oligonucleótidos se sintetizaron en el 3900 Oligosynthesizer por Syngen Inc. (San Carlos, CA).

Las reacciones anteriores de PCR de VL y VH se extrajeron y purificaron por separado (Kit de purificación de PCR de Qiagen de acuerdo con las instrucciones de fabricante) y una alícuota (1 1l) de cada reacción se combino en un tubo nuevo. Por medio de la secuencia de engarce en el extremo 3' del oligonucleótido reverso de VH (SEC ID N.º: 14) y del extremo 5' del oligonucleótido delantero de VL (SEC ID N.º: 11), se tiene en cuenta unión complementaria para reacción de ensamblaje de PCR de extensión de solapamiento individual (SOE-PCR) para generar la ovoalbúmina scFv de longitud total. La reacción de PCR de ovoalbúmina scFv se extrajo y purificó (Qiagen) para la subsiguiente digestión con endonucleasas EcoR I y Not I (New England Biolab de acuerdo con las direcciones del fabricante). La ovoalbúmina scFv de longitud total está subclonada en un vector de pYD1 y está secuenciada para confirmar que no se introducen mutaciones, deleciones o inserciones (SEC ID N.º: 18) de las PCR anteriores. Una vez se verificó la secuencia, la ovoalbúmina de VH y VL de longitud total sirve como la plantilla de tipo silvestre para las estrategias subsiguientes de construir bibliotecas de LTM.

Condiciones de PCR adicionales y diseño de cebador

Las condiciones de reacción para PCR de T1 y de T2 son: 5 1l de mezcla de oligonucleótidos 10 1M, 0,5 1l de ADN polimerasa Pfx (2,5 U/1l), 5 1l de tampón de Pfx (Invitrogen), 1 1l dNTP 10 mM, 1 1l MgS04 50 mM y 37,5 1l de dH2O en 94 C durante 2 minutos, seguidas por 24 ciclos de 30 segundos en 94 C, 30 segundos en 50 C y 1 minuto en 68 C y después se incubó a 68 C durante para 5 minutos. Las reacciones se llevan a cabo usando un termociclador programable (MJ Research). Las reacciones de PCR de T1 y de T2 se purificaron en gel (Qiagen) y se combinaron alícuotas equimolares para SOE-PCR.

SOE-PCR es un procedimiento rápido y simple para combinar fragmentos de ADN que no requiere sitios de restricción, endonucleasas de restricción, o ADN ligasa. Los productos de PCR T1 y T2 están diseñados para compartir secuencias complementarias de extremos solapantes (Fig. 4) que hibridarán y permitirán prolongación de PCR para producir un gen de scFV de ovoalbúmina LTM de longitud total (Figuras 2 y 4). La reacción de extensión de PCR de scFv usó alícuotas de T1 y T2 (aproximadamente 2 1l cada una) con 0,5 1l de ADN polimerasa Pfx (2,5 U/1l), 5 1l tampón Pfx (Invitrogen), 1 1l de dNTP 10 mM, 1 1l de MgS04 50 mM y 37,5 1l dH20 en 94 C durante 2 min, seguido por 20 ciclos de 30 segundos en 94 C, 30 segundos en 50 C y 1 min a 68 C y entonces se incubó a 68 C durante 5 min.

Un grupo de cebadores de 5' EcoR I en sentido correcto (SEC ID N.º: 18) y de cebadores de ovoalbúmina 3' Not I antisentido (SEC ID N.º: 19) se añadieron para facilitar amplificación de ovoalbúmina de LTM e incorporación de los sitios de enzimas de restricción en los amplicones de PCR (Figura 4). La reacción de prolongación de PCR consistió en 4 1l de reserva de oligonucleón de Pfx

ótidos 101M, 0,5 1l de ADN polimerasa Pfx (2,5 U/1l), 5 1l de tamp(Invitrogen), 1 1l de dNTP 10 mM, 1 1l de MgS04 50 mM y 37,5 1 1l de dH20 en 94 C para 2 minutos, seguido por 24 ciclos de 30 segundos en 94 C, 30 segundos en 50 C y 1 minuto en 68 C y después se incubó a 68 C durante 5 minutos.

Clonación de producto de PCR en un vector de expresión de células de levadura pYD1

El plásmido receptor pYD1 (Figura 6) para expresión de anti-ovoalbúmina scFv, se preparó a partir de un huésped de E. coli por purificación de plásmidos (Qiagen), digiriendo con las enzimas de restricción, EcoRI y NotI, y defosforilando terminalmente con fosfatasa alcalina intestinal de ternero. La ligazón del vector pYD1 y los productos anteriores de SOE-PCR (digeridos por EcoRI y Not), se llevó a cabo antes de la subsiguiente transformación de E. coli (DH5a) usando técnicas estándar.

Sistema de expresión de células de levadura

El pYD1 (Fig. 6) es un vector de expresión diseñado para presentar proteínas de interés sobre la superficie extracelular de Saccharomyces cerevisiae. Subclonado el gen scFv dentro de pYD1, scFvs llega a ser proteína de condensación fusión con receptor de aglutinina AGA2 permitiendo la secreción y presentación de superficie celular.

Transformación de células huésped de levadura con construcciones de pYD1 AGA2-scFv

Se prepararon células huésped competentes de levadura (500 1l) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Kit de Zymo Research Frozen-EZ Yeast). Brevemente, se mezclaron 500 1l de las células competentes con 10 -15 1g de ADN de biblioteca de pYPD1 de scFv después de lo que se añadieron 5 ml de solución de EZ3. La mezcla de células se incubó después durante 45 minutos a 30° C con mezclados ocasionales (tres veces). Las células transformadas se centrifugaron y se resuspendieron en medios de selección de glucosa (Invitrogen).

Inducción de AGA2-scFv

Las células se indujeron después del crecimiento en medios de selección de glucosa a 30° C con agitación y en condiciones de aireación durante 48 horas que la D.O.600 = 7 (D.O.600 = 1 representa 107 células/ml). En particular, las células se recogieron y resuspendieron en medios de selección/inducción de galactosa (Invitrogen), hasta una

D.O.600 = 0,9 se logró después de 48 horas a 20 °C. La expresión de la proteína de fusión Aga2-scFv de pYD1 se reguló estrechamente por el promotor GAL1 y dependió de la galactosa disponible en el medio para inducción de promotor por GAL1.

Preparación de ovoalbúmina biotinilada

La biotinilación del antígeno diana ovoalbúmina se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Kit marcado con Biotina-XX de Molecular Probes FluoReporter (n.º de catálogo F-2610)). Brevemente, se añadieron 300 1l de ovoalbúmina de reserva de 1 mg/ml (Sigma), a 30 1l de tampón de bicarbonato de sodio 1 M a pH 8,3 y 5,8 1l de solución de Biotina -XX (solución de 20 mg/ml de Biotina-XX en DMSO). La mezcla se incubó después durante 1 hora a 25°C transferida a un tubo de filtro micrométrico, se centrifugó y la concentración de proteína se determinó por absorbancia de luz a D.O.280.

Monitorización de FACS de expresión de AGA2-scFv y unión de ovoalbúmina

Para monitorizar la inducción y la expresión de la construcción de scFv, se recogió por centrifugación durante 5 minutos a 2300 rpm una alícuota de células de levadura (8 x 105 células en 40 1l). El fluido del sobrenadante se aspiró y después el sedimento celular se lavó con 200 1l de tampón de PBS/PBA enfriado con hielo (PBS/BSA al 0,5% p/v). Las células se resedimentaron y el sobrenadante se retiró antes de resuspensión en 100 1l de tampón conteniendo la ovoalbúmina biotinilada (200 nM). Las células se dejaron unirse a la ovoalbúmina a 20 °C durante 45 minutos después los que se lavaron dos veces con tampón de PBS/PBA antes de la adición e incubación con estreptavidina-FITC (2 mg/l) durante 30 minutos en hielo. Se llevó a cabo otra ronda de lavar en tampón antes de resuspensión final en un volumen de 400 1l en PBS/BSA. Las células se analizaron después en FACSscan (Becton Dickinson) usando el paquete de sofware CellQuest.

Ejemplo 1

Mutagénesis de revisión mejorada para el desarrollo de anticuerpos de alta afinidad

En este ejemplo, se describe la mutagénesis de revisión de un anticuerpo de scFv ejemplar.

Brevemente, se usó mutagénesis de revisión mejorada (LTM2) para identificar las mutaciones de CDR de VH y VL en las regiones de CDR de VH y VL de un anticuerpo que potencia la afinidad de unión a un antígeno elegido, es decir, para identificar los residuos de aminoácidos funcionales (posiciones) o los puntos calientes que confieren actividad de unión. El propósito de mutagénesis de revisión mejorada (LTM2) es introducir una sustitución

5 seleccionada en posiciones marcadas como diana en una región de un polipéptido, por ejemplo, las regiones de CDR de la cadena de anticuerpo variable. Inicialmente, las bibliotecas de codificación tanto para la VH como para la VL se construyeron. Las secuencias de aminoácidos de las cadenas cVL y VHdel anticuerpo anti-ovoalbúmina de referencia se identificaron (véanse SEC ID N.ºs: 3-4) y una biblioteca de secuencias iniciadoras para regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena de anti-ovoalbúmina VH identificada por las SEC ID N.ºs: 5, 6 y 7, respectivamente y aquellas para regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena VL identificada por SEC ID N.ºs: 8, 9, y 10, se seleccionaron. Adicionalmente, cada biblioteca de secuencias codificantes de VH o VL contiene mutaciones para un aminoácido funcional representativo seleccionado en uno, dos, o todas las tres CDR en la cadena seleccionada.

Los aminoácidos predeterminados de segmento de CDR2 de VH DINPSNGYTIYNQKFKG) (posiciones 56 a 69) a

15 partir de la sección de ovoalbúmina de VH de tipo silvestre SLEWIG-DINPSNGYTIYNQKFKG -FKGKATL, se seleccionaron para análisis. Las secuencias polipeptídicas SLEWIG y KATLTVD son partes de los armazones de VH 2 y 3 respectivamente flanqueando CDR2 de VH. En el diseño y síntesis de oligonucleótidos de LTM de CDR de VH y VL, las longitudes de las secuencias de armazón flanqueantes de aproximadamente 21 pares de base tienen en cuenta solapamiento complementario y SOE-PCR. Un oligonucleótido de referencia que codifica para la secuencia de tipo silvestre de CDR-H2 anterior (en negrita) (SEC ID N.º: 16) conteniendo las 3 partes de VH2 y VH flanqueantes (letras minúsculas abajo) se muestra a continuación:

La LTM de leucina de CDR2 de VH implica sustitución en serie sólo de una leucina cada vez, en cada una o en una pluralidad de posiciones de CDR2. Fig. 3 ilustra la aplicación de LTM para introducir un aminoácido de leucina

25 dentro de cada uno de los catorce residuos (posiciones 56-69) en la región de CDR2 de VH de anti-ovoalbúmina scFv. En llevar a cabo LTM de leucina, se sintetizaron catorce oligonucleótidos separados que codifican todas las variantes posicionales de leucina de CDR2 de VH posibles (SEC ID Nºs: 17-33) con cada una teniendo sólo un codón de reemplazamiento de leucina (en negrita) bordeado por una secuencia de tipo silvestre anti-ovoalbúmina. Un total de catorce péptidos diferentes se generaron después, y no se produjeron secuencias "indeseadas" o de sustitución múltiple.

En una alternativa para introducir leucina en una "pluralidad de posiciones", alguien puede escoger no incluir uno o más de los oligonucleótidos de LTM de CDR2 anteriores. Así, por ejemplo, los oligonucleótidos de LTM (SEC ID N.ºs: 20 y 21) para posiciones 59 y 60 respectivamente puede excluirse y así la mutagénesis de revisión mejorada (LTM2) sólo se llevaría a cabo en posiciones 56-58 y 61 a 69. En base a las diferentes combinaciones de usar una

35 "pluralidad de posiciones", las permutaciones de LTM2 pueden llevarse a cabo sin restringir necesariamente a todas y cada una de las posiciones dentro de una CDR.

El enfoque en fabricar la biblioteca de CDR2 de LTM se resume en las Figuras 2 y 4. Las reacciones de PCR separadas, T1 y T2, se llevan a cabo usando pares de cebador en sentido correcto de FR1 (SEC ID N.º: 34) y antisentido FR2 (SEC ID N.º: 35) y los oligonucleótidos de leucina de LTM de CDR-2 combinados anteriormente (SEC ID N.ºs: 18 - 33) con cebador anti-sentido FR4 (SEC ID N.º: 36), respectivamente. El cebador FR1 de sentido correcto contiene secuencias a partir del extremo 5' terminal del gen de ovoalbúmina y el FR2 antisentido contiene la secuencia antisentido del extremo 3' del armazón de ovoalbúmina 2 de tal forma que la CDR1 de ovoalbúmina, las regiones marco 1 y 2 se amplificaron en la reacción de PCR T1 (Figuras 2A y 2B). El cebador FR4 AS contiene secuencia anti-sentido del extremo 3' del gen de ovoalbúmina, los oligonucleótidos de LTM de CDR2 contienen

45 secuencias del extremo 5' de la región CDR2 con las mutaciones del codón de LTM de CDR2 incorporadas para amplificar la parte que queda de ovoalbúmina (fragmento CDR2, FR3, CDR3, FR4 y el segmento VL entero) incorporando mientras al mismo tiempo el/los codón(es) mutagénico(s).

Las mutaciones de CDR dobles y triples (en combinaciones diferentes de CDR1, 2, y 3) se crearon como anteriormente pero en lugar de usar el gen de ovoalbúmina de tipo silvestre como una plantilla de PCR, se seleccionó una biblioteca de ovoalbúmina de LTM generada anteriormente. Por ejemplo, para crear cadenas de VH en las que tanto CDR1 como CDR2 están mutadas con CDR3 de tipo silvestre y segmentos VL , los genes mutantes de CDR2 de LTM anteriormente construidos se usaron como plantillas y después SOE-PCR se llevó a cabo incorporando los oligonucleótidos de CDR1 generando las mutaciones de LTM dobles (resumidas en Figuras 2 y 4).

En este ejemplo, la reacción de PCR T3 usó pares de cebador FR1 en sentido correcto (SEC ID N.º: 34) y FR5

55 antisentido (SEC ID N.º: 37) para amplificar la región de armazón 1 (FR 1). La reacción de PCR T4 usó los oligonucleótidos de histidina de LTM combinados (SEC ID N.ºs: 38-41) con cebador anti-sentido FR4 (SEC ID N.º: 36) para amplificar las partes FR2, CDR2 LTM, FR3, CDR3, FR4 y VL que quedan de ovoalbúmina (Figura 4). Las reacciones de PCR de T3 y T4 se purificaron después y se combinaron cantidades equimoleculares de ambas para SOE-PCR (Figura 4) para producir una biblioteca doble de LTM de CDR1 His de ovoalbúmina scFv y de CDR2 Leu de ovoalbúmina scFv. Un grupo de cebadores en sentido correcto 5' de Eco R1 específicos de extremo de ovoalbúmina (SEC ID N.º: 13) y de cebadores antisentido de ovoalbúmina 3' de Not (SEC ID N.º: 12) se añadieron después facilitando la amplificación de ovoalbúmina de LTM y el clonado dentro del vector de expresión pYPD1.

La biblioteca de LTM doble de CDR1 His y de CDR2 Leu se usó después como plantillas para incorporar adicionalmente oligonucleótidos de CD3 LTM para hacer las bibliotecas triples de LTM de CDR. Utilizando progresivamente las bibliotecas de LTM simples y dobles de partida, se desarrolló una disposición más compleja de combinaciones de biblioteca de LTM tanto en VH como en VL. Por ejemplo, una vez se construyó la biblioteca de la CDR1, CDR2 y CDR3 de LTM triple de VH, se designó como la plantilla de biblioteca 111 en la fila superior de la Figura 5, la introducción de CDR1 de VL de LTM en las 111 plantillas de VH produce una biblioteca de CDR de 4 LTM (Figura 5).

El trazado de FACS mostrado en la Figura 7 ilustra que las moléculas de unión de ovoalbúmina scFv se generaron en la construcción de de la biblioteca precedente. En particular, las moléculas de ovoalbúmina biotinilada y estreptavidina FITC (la línea "verde") produjeron una respuesta a señal de pico de una magnitud más alta comparada con la señal a partir del vector vacío pYD1 con ovoalbúmina biotinilada y estreptavidina FITC (área sombreada oscura).

Ejemplo 2

Rastreo de biblioteca de alto rendimiento para el desarrollo de anticuerpos con propiedades potenciadas

En este ejemplo, el rastreo de alto rendimiento de anticuerpos de cadena simple con propiedades potenciada, se describe.

La Figura 9 representa un esquema generalizado para enriquecer los clones de unión de alta afinidad específicos a la biblioteca de scFv de LTM2 heterogénea. Después de la inducción en medios de galactosa, la biblioteca de células de levadura (107) se resuspendió en tampón de PBS/PBA (volumen total de 500 úmina

1l). La ovoalbbiotinilada se añadió a la suspensión de levaduras para una concentración final de 50 nM y se incubó a 25 ºC durante 2-3 horas con agitación. Las células de levadura se sedimentaron, se lavaron 3 veces y se resuspendieron en 300 1l de tampón de PBS/BSA enfriado en hielo con 1 x 10 8 perlas magnéticas revestidas con estreptavidina añadidas. La mezcla de células y perlas se incubó sobre hielo durante 2 minutos con mezclado suave por inversión para formar un complejo de unión constituido por células que expresan scFv de alta afinidad, ovoalbúmina biotinilada y perlas magnéticas revestidas con estreptavidina.

La columna (tubos) conteniendo complejos unidos se aplicó después a la agarradera de la columna magnética durante 2 minutos después de los que el sobrenadante se retiró por aspiración. La columna se retiró de la agarradera magnética y se añadieron 300 1l de PBS/BSA enfriado en hielo para resuspender lo unido. Los complejos unidos se lavaron de nuevo con el fin de retirar aquellos clones de scFv de baja afinidad y otras células unidas no específicamente.

La columna se sacó después de la agarradera magnética con lo que se añadió 1 ml de medios de selección de glucosa a las células de levadura recuperadas para una incubación de 4 horas a 30 ºC. La agarradera magnética se reaplicó al tubo de cultivo para retirar cualesquiera perlas magnéticas que queden. El cultivo de levadura se cultivó después en medios de selección de glucosa a 30 °C durante 48 horas antes de inducción de scFv en medios de selección de galactosa. En la segunda ronda de selección, la concentración de ovoalbúmina se bajó después desde 10 nM hasta 0,5 nM. La unión de ovoalbúmina, formación de complejos y enriquecimiento y re-cultivo de levaduras se llevaron a cabo como se describe anteriormente. Para la tercera ronda de selección final, la concentración de ovoalbúmina se redujo adicionalmente a 0,1 nM.

La CE50 de unión de ovoalbúmina, o "idoneidad" de cada una de las anteriores rondas de enriquecimiento progresivo se evaluó por FACS (véase Figura 8). Los resultados mostrados en la Figura 8 ilustran la biblioteca de levaduras de CDR2 de LTM de VH inicialmente transformada, sin selección anterior (círculos cerrados), así como la idoneidad general en términos de enlazadores en porcentaje (eje de las y). Los clones que expresan scFv antiovoalbúmina funcionales y su afinidad, según se miden por la ovoalbúmina CE50 (eje de las x), fueron inferiores comparados con el anticuerpo de tipo salvaje anti-ovoalbúmina. Aun así, después de una ronda de selección (10 nM), la curva de "idoneidad" (triángulos claros) mejoró en enlazadores en porcentaje y la CE50 para enlazar ovoalbúmina estuvo en el mismo intervalo de nM que la ovoalbúmina de tipo silvestre. Después de la segunda ronda de selección (0,1 nM), la población enriquecida (triángulos oscuros) presentó una "idoneidad" general que se aproximó a aquella del tipo silvestre de ovoalbúmina (cuadrados sólidos) (Figura 10). Las células de levadura recuperadas de la segunda ronda de enriquecimiento se plaquearon después sobre medios sólidos con el fin de aislar clones individuales para análisis de unión individual y determinación de secuencia.

En una metodología alternativa, las bibliotecas de células de levadura de LTM2 se enriquecieron por clones de scFv antiovoalbúmina de alta afinidad por FACS. Se llevaron a cabo construcción de bibliotecas, propagación de medios líquidos e inducción de medios líquidos, como anteriormente. Después de inducción de scFv, las células se incubaron con ovoalbúmina biotinilada en concentraciones saturantes (400 nM) durante 3 horas a 25°C. Después de lavar las células, se llevó a cabo una segunda incubación de 40 horas usando ovoalbúmina no marcada (1 1M) a 25 °C. Las células se lavaron después dos veces con tampón PBS/BSA, se marcaron con estreptavidina PE (2 mg/ml) anti-HIS-FITC (25 nM) durante 30 minutos sobre hielo, se lavaron y se resuspendieron como se describe anteriormente por análisis de FACS.

Se analizó inicialmente con FACS la anti-ovoalbúmina de tipo salvaje proporcionando un patrón de señal de referencia para clasificación de FACS de la biblioteca de LTM de levadura (Figura 8, panel izquierdo). Del trazado de FACS de ovoalbúmina, se dibujó una puerta de selección (el trapezoide R1) para obtener sólo aquellos clones que expresaron la fusión de scFv (como se detectó por anti-HIS-FITC) y mostraría concomitántemente una afinidad de unión más alta a ovoalbúmina (una señal de PE más fuerte) comparada con antiovoalbúmina de tipo silvestre. La Figura 8 (tablero medio) demuestra que aproximadamente el 5% de la biblioteca de LTM total rastreada se seleccionó por el umbral de R1. Después de la recolección de FACS de estos clones de scFcv antiovoalbúmina altos, se llevó a cabo un análisis de FACS tras clasificar (Figura 8, panel derecho) para confirmar que > 80 % de los clones de scFv anti-ovoalbúmina pre-rastreo estuvieron dentro de los criterios predeterminados. Los clones de scFv clasificados por FACS se cultivaron después en medios de selección de glucosa a 30 °C durante 48 horas y se plaquearon en medios sólidos para aislar los clones individuales. Los clones se cultivaron después en medios de selección de glucosa, se reintrodujeron en medios de selección de galactosa y se analizaron por su características de CE50 y/o de koff.

Ejemplo 3

Rastreo de bibliotecas de alto rendimiento para el desarrollo de anticuerpos con tasas de koff

En este ejemplo, el rastreo de alto rendimiento de anticuerpos de cadena simple ejemplares con tasas de Koff potenciadas, se describe.

Brevemente, los clones pre-clasificados del ejemplo anterior se crecieron durante toda una noche en medios de selección de glucosa y se plaquearon en medios sólidos para aislar colonias individuales. A partir de colonias aisladas, los cultivos líquidos de clones se cultivaron en medios de selección de glucosa a 30 °C con agitación durante 48 horas antes de sedimentar y resuspender en medios de selección de galactosa durante el periodo de tiempo de D.O. apropiado. Debido a que la preclasificación por FACS enriquece (en aproximadamente el 80 %) pero no elimina todos los clones indeseables, la CE50 de los clones aislados se caracterizó por eliminar aquellos que presentan valores de unión inferiores a anticuerpo de referencia de tipo silvestre (como se detalla anteriormente). Sólo aquellos aislados con valores de CE50 comparables o superiores se seleccionaron después para análisis de Koff adicionalmente.

Un esquema para analizar las cinéticas de moléculas candidatas se muestra en la Figura 11. Específicamente, las células de levadura (aproximadamente 5 x 106) después de inducción en medios de selección de galactosa, se sedimentaron y resuspendieron en tampón PBS/BSA (1 ml). Se añadió después ovoalbúmina biotinilada (concentración final de 400 nM) a las células resuspendidas y se dejaron incubar o 2 horas a 25 °C con mezclados suaves continuos. El complejo de ovoalbúmina biotinilada y células de levadura se lavaron y se resuspendieron en tampón de PBS/PBA después y la ovoalbúmina no marcada se añadió después (a una concentración final de 1 1M) a la mezcla de células de levadura que se incubaron adicionalmente durante 24 horas a 25 °C. Las alícuotas de muestras tomadas en momentos determinados se tomaron después cada dos horas durante las siguientes 24 horas. Las mezclas de células se lavaron y resuspendieron después en tampón de PBS/PBA enfriado y anticuerpo a-SA PE (2 1g/ml) de tinción. Después de incubación durante 30 minutos en hielo con mezcla periódica, la mezcla celular se lavó dos veces y se analizó por FACS como anteriormente.

Resultados de los ensayos de Koff (Figura 12) mostraron dos clones (es decir, 3ss-35; 3ss-30) que tienen una Koff relativamente más alta comparada con el anticuerpo antiovoalbúmina de tipo silvestre. En otras palabras, cuando se intercambia la ovoalbúmina biotinilada unida por la ovoalbúmina no marcada durante el periodo de toma de muestras de 24 horas, 3ss -35 y 3ss-30 liberaron la ovoalbúmina biotinilada previamente unida a una velocidad mucho menor (círculos y triángulos respectivamente en la Figura 12) comparada con antiovoalbúmina de tipo silvestre (cuadrados de Figura 12) que presentaron un decrecimiento muy agudo en MFI (intensidad de fluorescencia promedio) durante las primeras 8 horas.

Ejemplo 4

Rastreo de alto rendimiento para el desarrollo de anticuerpos con unión de CE50 mejorada

En este ejemplo, se describe el rastreo de alto rendimiento de anticuerpos de cadena simple con actividad de unión de CE50 potenciada.

Brevemente, una cantidad predeterminada de células de levadura (8 x 105 en 40 1l) con scFv anti-ovoalbúmina (tipo silvestre y biblioteca de LTM) se incubó con diluciones seriadas 1:4 de ovoalbúmina biotinilada (concentraciones finales de 200 nM, 50 nM, 12,5 nM, 3,1 nM, 0,78 nM y 0,19 nM en un volumen total de 80 1l) a 20 °C durante 45 minutos seguidos por 5-10 minutos en hielo. Las células de levadura se lavaron y se resuspendieron después en 5 ml de tampón de PBS/BSA después de lo que se añadieron estreptavidina-PE (2 mg/ml) y aHIS-FITC (25 nM) para marcar durante una incubación de 30 minutos en hielo. Se llevó a cabo otra ronda de lavado antes de resuspender en 400 1l de tampón PBS/BSA y de análisis en FACSscan utilizando software de CellQuest.

La Figura 13 ejemplifica un subconjunto de clones mejorados, relativos a anti-ovoalbúmina, que tienen valores más bajos de CE50 (las curvas de unión han cambiado a la izquierda con respecto al tipo silvestre). Se muestran estos valores de CE50 y el incremento en veces comparados con tipo silvestre de anti-ovoalbúmina. Por ejemplo, el clon H3 S101Q presentó una mejora de 2,1 veces en unión de ovoalbúmina. La identificación de nomenclatura de este clon H3 S101Q, indica que fue a partir de una biblioteca individual de LTM de glutamina de CDR3 de VH.

Los anticuerpos de afinidad potenciada resultantes produjeron proporcionar un mapa de mutaciones de aminoácidos beneficiosas en las CDR de VH y VL del anticuerpo anti-ovoalbúmina que estuvo asociado con actividad de unión potenciada. Las mutaciones de CDR de VH y VL de aminoácidos individuales teóricas asociadas con los anticuerpos de scFv de afinidad potenciada se muestran en la Figura 13. Las mutaciones se encontraron en cada CDR de VH y VL e incluyen mutaciones simples, dobles y triples e incluyen cada uno de los nueve aminoácidos probados. La Figura 13 ejemplifica que cuatro clones de CDR-H3 H3 G102K de VH independientes identificados a partir del rastreo de CE50 anterior y/o del rastreo de cinéticas (Koff), se pueden recuperar. El mutante L1L2 S166H S193H de VL de LTM doble del rastreo de CE50 (Figura 14) ilustra también que la unión de ovoalbúmina potenciada tiene lugar donde hay una interacción sinérgica entre estas dos sustituciones CDR1 S166H y CDR2 S193H.

Los resultados indican también que (véase Figura 14) se pueden obtener secuencias únicas para anticuerpos antiovoalbúmina scFv seleccionados de acuerdo con el procedimiento anterior de CE50 y/o de Koff usando secuencias codificantes que contienen mutaciones individuales en una, dos o todas las tres CDR bien en las cadenas de VH o bien en las cadenas de VL. Algunas de las sustituciones aminoacídicas se encontró que se recuperaban en una preponderancia más alta en ciertas CDR. Por ejemplo en CDR1 de VH, había siete sustituciones de Lys individuales independientes en las posiciones de D30K, Y31K, M33K y W35K. La alta preponderancia de Lys en CDR1 indica que la unión de ovoalbúmina potenciada tiene lugar cuando hay un incremento neto de cargas positivas contribuidas por CDR1 durante el contacto antigénico. El examen de las sustituciones de aminoácidos recuperadas también reveló que tuvo lugar una sustitución favorable para CDR2 y CDR3 de VH. Por ejemplo, se observó que los reemplazamientos de Lys dispersos múltiples tienen lugar en CDR2 mientras que CDR3 muestra reemplazamientos G102K y G104K. Los resultados también revelan que adicionalmente, había múltiples sustituciones de Gln, otro aminoácido polar, en CDR3 en posiciones 107, 108, 109 y 111. Estos resultados indican que hay un único "resto químico" o cargas correspondientes negativas y/o hidrófilas en ovoalbúmina que se ponen en contacto por estos residuos de CDR reemplazados.

De acuerdo con ello, las mutaciones de unión de antígenos potenciadas recuperadas en cada CDR después de mutagénesis de todas las CDR por cada uno de los nueve aminoácidos diferentes se dispusieron y los resultados se mostraron en la Fig. 14. Cada CDR se determinó que mostró también al menos una posición en la que no se encontraron mutaciones, por ejemplo, posiciones Ile57, Asn58, y Gly62 de CDR2 de VH, posiciones Tyr103, Ser105, Arg106 y Ala121 de región de CDR3 de VH. Para posiciones de VL; se encontró que R164, Un165, V169 y N174 de CDR1, N194 de CDR2, E208 y D209 de CDR3 no se reemplazan después de rastreo extensivo. Estos resultados indican que además de las posiciones de reemplazamiento de "puntos calientes" y de cualquier tipo de aminoácido preferido recuperado anteriormente, hay también posiciones de CDR de "puntos fríos". Las posiciones de "puntos fríos" indican que cualquiera de las sustituciones bien no confiere ninguna ventaja de unión a antígenos o bien confiere propiedades de unión inferiores.

Ejemplo 5

Procedimientos para llevar a cabo mutagénesis beneficiosa combinatoria

En este ejemplo, procedimientos para llevar a cabo mutagénesis beneficiosa combinatoria, se describen.

Brevemente, el procedimiento incorpora las mutaciones beneficiosas encontradas usando LTM y las combina conjuntamente en una biblioteca individual. Por lo tanto, los efectos sinérgicos de mutaciones múltiples se pueden explorar en este procedimiento. Este enfoque combinatoria se parece al procedimiento WTM salvo porque las sustituciones de codones seleccionadas dentro de las CDR son las diferentes sustituciones aminoacídicas beneficiosas diferentes identificadas por LTM. Así, no contendrá una mutación cada posición de residuo en una CDR de anticuerpo y algunas posiciones tendrán aminoácidos diferentes múltiples sustituidos en esa posición. En general, muchas si no todas, las combinaciones de mutaciones beneficiosas dentro de una CDR o de una cadena de anticuerpo estarán representadas por al menos una de las secuencias codificantes en la biblioteca. Como se verá más adelante, esta biblioteca de codificación de secuencia se puede preparar por una modificación del procedimiento WTM, salvo porque en vez de colocar codones para un aminoácido individual en la región codificante variable, los codones que se introducen son aquellos correspondientes a todas las mutaciones beneficiosas detectadas en el procedimiento de LTM.

En este ejemplo, una biblioteca de CDR1 de cadena pesada beneficiosa combinatoria se construye usando las variantes antiovoalbúmina mejoradas descritas en la Figura 14. La primera posición de aminoácido 30, codifica (como mínimo) Asp (tipo silvestre) y Lys; posición 31, Tyr y Lys; posición 32 Asn y Tyr; posición 33 Met, His y Lys; posición 34 Asp y Pro; posición 35 Trp y Lys. La secuencia de ADN está representada por un oligonucleótido de CDR1 degenerado que incorpora las mutaciones beneficiosas combinatorias identificadas a partir del análisis de LTM (Tabla 1).

Tabla 1 Posibilidades de bases nucleotídicas desde 5' hasta 3'

5'

G A C T A C A A C A T G G A C T G G 3'

A

G A G T C A C C C A A G

Se puede llevar a cabo un procedimiento similar con todos los bucles de CDR produciendo una biblioteca

10 beneficiosa de 6-CDR, o se pueden producir sub-bibliotecas y rastrearse en combinación. Por ejemplo, si el tamaño de la biblioteca es demasiado grande para rastrearse en una biblioteca individual, después se pueden producir subbibliotecas más pequeñas. Por ejemplo, se pueden producir una biblioteca de cadena pesada de 3-CDR y una biblioteca de cadena ligera de 3-CDR para eficacias más grandes. Después de rastrear, las mutaciones benéficas de las bibliotecas de cadenas pesadas y ligeras se pueden combinar adicionalmente en una biblioteca que incorpora

15 mutaciones en los bucles apropiados.

Equivalentes

Aquellos expertos en la técnica reconocerán o serán capaces de comprobar, usando no más experimentación que la de rutina, muchos equivalentes a las realizaciones específicas de la invención descritas en el presente documento. Se desea que tales equivalentes estén comprendidos por las siguientes reivindicaciones.

20 Listado de secuencias

SEC ID N.º: 1

secuencia de nucleótidos de VL de anticuerpo antiovoalbúmina

SEC ID N.º: 2 secuencias de nucleótidos de VH de anticuerpo antiovoalbúmina SEC ID N.º: 3

secuencias de aminoácidos de la cadena VL del anticuerpo de ovoalbúmina. Las CDR de la ovoalbúmina VL se identifican en negrita.

SEC ID N.º: 4

10 secuencias de aminoácidos de la cadena VH del anticuerpo de ovoalbúmina. Las CDR de la ovoalbúmina VH se identifican en negrita.

SEC ID N.º: 5 secuencia de aminoácidos de la región CDR1 de la cadena VL de antiovoalbúmina RASESVDSYGNSFMH SEC ID N.º: 6 secuencia de aminoácidos de la región CDR2 de la cadena VL de antiovoalbúmina LASNLES SEC ID N.º: 7 secuencia de aminoácidos de la región CDR3 de la cadena VL de antiovoalbúmina QQNNEDPFT SEC ID N.º: 8 secuencia de aminoácidos de la región CDR1 de la cadena VH de antiovoalbúmina DYNMD SEC ID N.º: 9 secuencia de aminoácidos de la región CDR2 de la cadena VH de antiovoalbúmina DINPSNGYTIYNQKFKG SEC ID N.º: 10 secuencia de aminoácidos de la región CDR3 de la cadena VH de antiovoalbúmina SGYGSRHPPGFAY SEC ID N.º: 11 oligonucleótido directo para clonar cadena VL de antiovoalbúmina y región de engarce en scFv

SEC ID N.º: 12 oligonucleótido específico de extremo reverso de Not I para clonación de scFv antiovoalbúmina en pYD1

5’-TTT TCC TTT TGC GGC CGC TTT TAT TC CAA CTT TGT CCC-3’

SEC ID N.º: 13 oligonucleótidos directos de Eco RI para clonar cadena de VH de antiovoalbúmina en scFv 5’-CCG GAA TTC ATG GTG AAA AGC ACT ATT GCA CTG-3’ SEC ID N.º: 14 oligonucleótidos reversos para cadena de VH de antiovoalbúmina que incluyen engarce para scFv

SEC ID N.: 15 secuencia de aminoácidos para construcción de scFv de tipo salvaje de antiovoalbúmina (incluye engarce)

SEC ID N.: 16

oligonucleótido de referencia que codifica para la secuencia de tipo silvestre CDR2 anterior (en negrita) que contiene las partes de VH2 y VH3 flanqueantes (letras minúsculas a continuación)

SEC ID N.º: 17 oligonucleótido de leucina de LTM de CDR2 de VH

SEC ID N.º 18: oligonucleótido de leucina de LTM de CDR2 de VH

SEC ID N.º 19: oligonucleótido de leucina de LTM de CDR2 de VH

SEC ID N.º: 20 oligonucleótido de leucina de LTM de CDR2 de VH

SEC ID N.º: 21

oligonucleótido de leucina de LTM de CDR2 de VH

SEC ID N.º: 22 oligonucleótido de leucina de LTM de CDR2 de VH

SEC ID N.º: 23 oligonucleótido de leucina de LTM de CDR2 de VH

SEC ID N.º: 24 oligonucleótido de leucina de LTM de CDR2 de VH

SEC ID N.º: 25 oligonucleótido de leucina de LTM de CDR2 de VH

SEC ID N.º: 26 oligonucleótido de leucina de LTM de CDR2 de VH

SEC ID N.º: 27

oligonucleótido de leucina de LTM de CDR2 de VH

SEC ID N.º: 28 oligonucleótido de leucina de LTM de CDR2 de VH

SEC ID N.º: 29 oligonucleótido de leucina de LTM de CDR2 de VH

SEC ID N.º: 30 oligonucleótido de leucina de LTM de CDR2 de VH

SEC ID N.º: 31 oligonucleótido de leucina de LTM de CDR2 de VH

SEC ID N.º: 32 oligonucleótido de leucina de LTM de CDR2 de VH

SEC ID N.º: 33 oligonucleótido de leucina de LTM de CDR2 de VH SEC ID N.º: 34 oligonucleótido en sentido correcto de FR1 5’-ATG AAA CAA AGC ACT ATT GCA CTG GCA CTC TTA CCG TTA-3’ SEC ID N.º: 35 oligonucleótido antisentido de FR2 5’-TCC ATT CCA CTC AAG GCT TCC ATG GCT CTG CTT CAC CAA-3’ SEC ID N.º: 36 oligonucleótido antisentido de FR4 5’-TTT TAT TTC CAA CTT TGT CCC CGC GCC-3’ SEC ID N.º: 37 oligonucleótido antisentido de FR5 5’-GTC AGT GAA TGT GTA TCC AGA AGC CTT GCA GGG TAT SEC ID N.º 38: oligonucleótido de histidina de LTM de CDR1 de VH

SEC ID N.º: 39 oligonucleótido de histidina de LTM de CDR1 de VH

SEC ID N.º: 40 oligonucleótido de histidina de LTM de CDR1 de VH

SEC ID N.º: 40 oligonucleótido de histidina de LTM de CDR1 de VH

SEC ID N.º: 41 oligonucleótido de histidina de LTM de CDR1 de VH

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento para distinguir uno o más residuos de aminoácidos funcionales de residuos de aminoácidos no funcionales en una región definida dentro de un polipéptido que comprende, seleccionar uno o más residuos de aminoácidos dentro de la secuencia de aminoácidos del polipéptido; determinar un residuo de aminoácido para sustituirse por los uno o más residuos de aminoácidos seleccionados; sintetizar los polinucleótidos que codifican el polipéptido o parte del mismo comprendiendo los residuos de aminoácidos seleccionados, representando los polinucleótidos colectivamente sustituciones aminoacídicas variantes de acuerdo con los siguientes criterios:

   i) conteniendo cada polinucleótido en cada posición de codón en la región definida, bien un codón requerido por la síntesis del resto de aminoácido o bien un codón para uno de los restos de aminoácido predeterminados y

   ii) conteniendo cada polinucleótido no más de un codón para el residuo de aminoácido predeterminado,

   generando por lo tanto una biblioteca de expresión que contiene los polinucleótidos de acuerdo con (i) e (ii) expresando la biblioteca de expresión para producir análogos de polipéptidos; y rastreando los equivalentes de polipéptido para una alteración en una propiedad medible tal que se identifiquen uno o más residuo(s) de aminoácido(s) dentro del polipéptido, o de parte del mismo, según contribuyan a la propiedad medible y por lo tanto se distingan de un residuo de aminoácido no funcional,

   en el que el/los resto(s) de aminoácido(s) identificado(s) según contribuya(n) a una propiedad medible se determina(n) que es/son adecuado(s) para mutagénesis y el/los residuo(s) no funcional(es) se determina(n) que es/son inadecuado(s) para mutagénesis y en el que uno o más aminoácido(s) funcional(es) está(n) exclusivamente mutagenizado(s).

2. 2.

   Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la mutagénesis se selecciona del grupo que consiste en mutagénesis de evaluación (LTM), mutagénesis de guía (WTM), o una combinación de las mismas.

3. 3.

   Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el polipéptido es un anticuerpo o fragmento del mismo.

4. 4.

   Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el polipéptido es un anticuerpo de cadena simple (sFVs).

5. 5.

   Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el procedimiento comprende adicionalmente la etapa de identificar un polinucleótido que codifica un análogo de polipéptido que tiene una alteración en una propiedad medible.

6. 6.

   Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la alteración en una propiedad medible es una propiedad potenciada tal como un antígeno de unión de alta afinidad o una función efectora mejorada.

7. 7.

   Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el antígeno es una diana terapéutica en una enfermedad o trastorno humano.

8. 8.

   Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el rastreo comprende, poner el contacto un polipéptido con un sustrato diana, estando el polipéptido asociado con el polinucleótido que codifica el polipéptido, estando asociado el polinucleótido o polipéptido con un resto asociado, de tal forma que se detecta un polipéptido variante capaz de unir un sustrato diana y por lo tanto se identifica como codificado por el polinucleótido.

9. 9.

   Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el polinucleótido está asociado con un análogo polipeptídico usando presentación de expresión seleccionada del grupo que consiste en presentación ribosómica, presentación polisómica, presentación de fagos, presentación procariótica (de bacterias), presentación de levaduras, presentación de células eucariotas y presentación de bibliotecas dispuestas ordenadamente.

10. 10.

    Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la(s) región/regiones definida(s) comprende(n) un dominio funcional del polipéptido seleccionado del grupo que consiste en sitio de unión a anticuerpos o parte del mismo, una región de armazón de anticuerpos, una región efectora de anticuerpos, un sitio de unión a receptor y un sitio catalítico.

11. 11.

    Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, en la que el sitio de unión a anticuerpos o parte del mismo comprende un dominio de CDR o parte del mismo seleccionado del grupo que consiste en CDR1, CDR2, CDR3, CDR4, CDR5, CDR6 y una combinación de las mismas, la región de armazón del anticuerpo

    comprende un dominio seleccionado del grupo que consiste en FR1, FR2, FR3, FR4 y una combinación del mismo y la región efectora de anticuerpo comprende un dominio seleccionado del grupo constituido por un sitio de unión al complemento y una región de unión al receptor Fc.

12. 12.

    Un procedimiento de generar una biblioteca de análogos polipeptídicos en los que un aminoácido predeterminado aparece en una o más posiciones aminoacídicas funcionales en una región definida del polipéptido que comprende: una o más posiciones aminoacídicas funcionales seleccionadas de acuerdo con la reivindicación 1 en una región definida de la secuencia de aminoácidos del polipéptido; determinar un residuo de aminoácidos para sustituirse en cada posición de aminoácidos funcionales dentro de la región definida; sintetizar polinucleótidos individuales que codifican la región definida, representando los polinucleótidos colectivamente polinucleótidos variantes posibles de acuerdo con los siguientes criterios:

    (i)

    contener cada polinucleótido en cada posición de codón de aminoácido funcional en la región definida, bien un codón requerido por el residuo de aminoácido del polipéptido o bien un codón para el residuo de aminoácido predeterminado y

    (ii)

    contener cada polinucleótido no más de un codón para el residuo de aminoácido predeterminado,

    generaro de este modo una biblioteca de polinucleótidos en la que los aminoácidos predeterminados aparecen en cada posición de aminoácidos funcionales dentro de la región definida.
13. 13. Un procedimiento de identificar un subgrupo de análogos de polipéptidos que tienen una propiedad deseada comprendiendo: seleccionar uno o más aminoácidos funcionales de acuerdo con la reivindicación 1 dentro de una región definida de la secuencia de aminoácidos del polipéptido, determinar un residuo de aminoácidos para sustituirse en cada posición aminoacídica en la región definida; sintetizar polinucleótidos que codifican la región definida, representar dichos polinucleótidos colectivamente polinucleótidos variantes posibles de acuerdo con los siguientes criterios:

    (i)

    contener cada polinucleótido en cada posición de codón en la región definida, bien un codón requerido por la síntesis del residuo de aminoácido del polipéptido o bien un codón para el residuo de aminoácido predeterminado, y

    (ii)

    contener cada polinucleótido no más de un codón para el residuo de aminoácido predeterminado,

    generar por lo tanto una biblioteca de expresión que contiene los polinucleótidos; exponiendo la biblioteca de expresión a las condiciones en las que se expresa la biblioteca;

    rastrear la biblioteca expresada para identificar un polipéptido que tiene una propiedad deseada;

    comparar la propiedad del polipéptido según se compara con un criterio de control, en el que un polipéptido que corresponde o excede el criterio de control se categoriza como un elemento de respuesta y un polipéptido que falla el criterio de control se categoriza como un elemento de no respuesta;

    categorizar elementos de respuesta y elementos de no respuesta en una base de datos; y

    consultar la base de datos para determinar la secuencia de un subconjunto de polipéptidos a sintetizarse.

14. 14.

    Un procedimiento según la reivindicación 13, en el que una o más de las etapas está asistida por ordenador.

15. 15.

    Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14 en el que la propiedad está seleccionada del grupo que consiste en una especificidad de unión alterada, una velocidad de asociación (kon) alterada, una velocidad de disociación (koff) alterada y combinaciones de las mismas.