MX2007000105A - Mutagenesis look-through para crear polipeptidos alterados con propiedades mejoradas. - Google Patents

Abstract

Se describe un metodo de mutagenesis por medio del cual se introduce un aminoacido predeterminado en todas y cada una de las posiciones de una serie DE posiciones seleccionada en una region preseleccionada (o varias regiones diferentes) de un polipeptido para producir una biblioteca de analogos de polipeptidos; el metodo se basa en la premisa de que ciertos aminoacidos juegan un papel fundamental en la estructura y funcion de las proteinas y, de esta manera, puede identificar y distinguir restos aminoacidos funcionales ("puntos calientes") de restos aminoacidicos no funcionales ("puntos frios") dentro de un polipeptido o una porcion del mismo; pueden generarse bibliotecas que contengan solo analogos de polipeptidos deseados y que tengan un tamano razonable para la seleccion; las bibliotecas pueden usarse para estudiar el papel de aminoacidos especificos en la estructura y funcion de polipeptidos y para desarrollar polipeptidos nuevos o mejorados tales como anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, anticuerpos monocatenarios, enzimas y ligandos.

Description

MUTAGÉNESIS OOK-THROUGH PARA CREAR POLIPÉPTIDOS ALTERADOS CON PROPIEDADES MEJORADAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La mutagénesis es una herramienta poderosa en el estudio de la estructura y la función de las proteínas. Pueden realizarse mutaciones en la secuencia de nucleótidos de un gen clonado que codifica una proteína de interés y el gen modificado puede expresarse para producir mutantes de la proteína. Comparando las propiedades de una proteína de tipo silvestre y los mutantes generados, a menudo es posible identificar aminoácidos o dominios de aminoácidos individuales que sean esenciales para la integridad estructural y/o función bioquímica de la proteína, tal como su unión y/o su actividad catalítica. El número de mutantes que pueden generarse a partir de una sola proteína, sin embargo, hace que sea difícil seleccionar mutantes que sean informativos o tengan una propiedad deseada, aunque los mutantes seleccionados que ¡ncluyen las mutaciones estén únicamente en regiones supuestamente importantes de una proteína (por ejemplo, regiones que forman un sitio activo de una proteína). Por ejemplo, la sustitución, deleción o inserción de un aminoácido particular puede tener un efecto local o global sobre la proteína.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los métodos previos para mutagenizar polipéptidos han sido demasiado restrictivos, demasiado inclusivos o se han limitado a eliminar la función de la proteína en lugar de adquirir o mejorar una función. Por ejemplo, una estrategia muy restrictiva es la mutagénesis selectiva o de localización dirigida que se usa para identificar la presencia de un sitio funcional particular o comprender las consecuencias de realizar una alteración muy específica dentro del sitio funcional. Una aplicación común de la mutagénesis de localización dirigida es en el estudio de fosfoproteínas donde un resto aminoacídico, que normalmente estaría fosforilado y permitiría que el polipéptido realizara su función, se altera para confirmar la asociación entre la fosforilación y la actividad funcional. Esta estrategia es muy específica para el polipéptido y el resto que se están estudiando. Por el contrario, una estrategia muy inclusiva es la mutagénesis de saturación o aleatoria que está diseñada para producir un gran número de mutaciones que incluyen todas las posibles alteraciones dentro de una región definida de un gen o proteína. Se basa en el principio de que, generando esencialmente todas las variantes posibles de un dominio de proteína relevante, es probable que se produzca la disposición apropiada de aminoácidos como uno de los mutantes generados aleatoriamente. Sin embargo, en la práctica, el amplio número de combinaciones aleatorias de mutaciones generadas puede afectar negativamente a la capacidad de seleccionar de forma significativa un candidato deseado debido a la presencia de las denominadas "interferencias" de los muchos candidatos indeseados. Otra estrategia, denominada mutagénesis "Walk Through" (véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N°: 5.830.650; 5.798.208) se ha usado para mutagenizar una región definida de un polipéptido sintetizando una mezcla de oligonucleótidos degenerados que, estadísticamente, contienen una serie deseada de mutaciones. Sin embargo, como se emplea una síntesis de polinucleótidos degenerados, la mutagénesis Walk-Through produce varias alteraciones indeseadas además de la serie deseada de mutaciones. Por ejemplo, para introducir secuencialmente una mutación a través de una región definida de únicamente cinco posiciones de aminoácidos, debe realizarse (y seleccionarse) una serie de más de 100 polinucleótidos (véase, por ejemplo, la Fig. 6). Por consiguiente, la preparación y selección, por ejemplo, de 2 ó 3 regiones se vuelve cada vez más compleja, es decir, requiriendo la fabricación y selección de 200 a más de 300 polinucleótidos, respectivamente, con respecto a la presencia de sólo 10 a 15 mutaciones. Otra estrategia que se ha usado para mutagenizar proteínas es la mutagénesis exploratoria de alanina, donde se "explora" un resto de alanina a lo largo de una porción de una proteína para identificar posiciones en las que se interrumpe la función de la proteína. Sin embargo, esta estrategia sólo examina la pérdida de la función de la proteína por medio de la sustitución de un resto de alanina neutro en una posición dada, en lugar de adquirir o mejorar una función. De esta manera, no es una estrategia útil para generar proteínas con mejor estructura y función. Por consiguiente, sigue existiendo la necesidad de una forma sistemática de mutagenizar una proteína para conseguir una función nueva o mejorada. SUMARIO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a un método de mutagénesis para la generación de proteínas (o polipéptidos) nuevas o mejoradas y a bibliotecas de análogos de polipéptidos y polipéptidos específicos generados por los métodos. El polipéptido al que se dirige la mutagénesís puede ser un polipéptido natural, sintético o modificado por ingeniería genética, incluyendo fragmentos, análogos y formas mutantes de los mismos. En una modalidad, el método comprende introducir un aminoácido predeterminado en esencialmente todas las posiciones dentro de una región definida (o varias regiones diferentes) de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido. Se genera una biblioteca de polipéptidos que contiene análogos de polipéptidos que individualmente no tienen más de un aminoácido predeterminado, pero que colectivamente tienen el aminoácido predeterminado en todas las posiciones dentro de la región o regiones definidas. Individualmente, este método puede denominarse mutagénesis "look-through" porque, en efecto, un solo aminoácido predeterminado (y sólo el aminoácido predeterminado) se sustituye posición por posición a lo largo de una o más regiones definidas de un polipéptido. Sin embargo, en una modalidad preferida, el método LTM se mejora usándolo para distinguir aminoácidos funcionales (o denominados "puntos calientes") de aminoácidos no funcionales (o denominados "puntos fríos") dentro de un polipéptido, o una porción del mismo, para reducir adicionalmente el número de restos a alterar para seleccionar y obtener una propiedad deseada en un polipéptido. Por consiguiente, el método mejorado de mutagénesis look-through (LTM) (denominándose la LTM mejorada LTM2 en lo sucesivo) permite la identificación y construcción de una subserie de moléculas candidatas que representan sólo las alteraciones funcionales más relevantes en el polipéptido, que después pueden seleccionarse eficazmente para eliminar las "interferencias". De manera importante, la LTM2 también permite la construcción de una biblioteca LTM2 con más ventajas con respecto a las bibliotecas tradicionales porque se ha diseñado para incluir únicamente alteraciones en los restos aminoacídicos del polipéptido con más probabilidad de tener un efecto sobre la función del polipéptido y, por lo tanto, tras las selección, con más probabilidad de producir un polipéptido alterado con una propiedad mejorada. De esta manera, la LTM2 permite "registrar" las consecuencias estructurales y funcionales de sustituir por separado un aminoácido predeterminado en cada posición de aminoácido funcional dentro de una región definida del polipéptido, segregando de esta manera una química de proteínas específica en la región definida sin ninguna interferencia o "perturbación" por la generación de análogos de polipéptidos indeseados (es decir, análogos que contienen sustituciones de aminoácidos distintas de las que siguen el esquema de LTM2) (véase, por ejemplo, la Fig. 1 ). Por consiguiente, la presente invención permite la evaluación sistemática muy eficaz y precisa del papel del cambio de un aminoácido específico en una o más regiones definidas de un polipéptido. Esto es particularmente importante cuando se evalúan (por mutación) dos o más regiones definidas, de tal forma que aumenta en gran medida el número de análogos de polipéptidos necesarios y, de esta manera, también aumenta la presencia de análogos indeseados. La presente invención evita este problema eliminando completamente los análogos indeseados y, de esta manera, la posibilidad de que cualquier cambio en la estructura o función de la proteína observada sea el resultado de todas menos la sustitución del aminoácido predeterminado. De esta manera, el efecto de segregar una química de proteínas específica incluso en múltiples regiones con una proteína puede estudiarse con una gran exactitud y eficacia. De manera importante, esto incluye el estudio de cómo puede afectar la mutagénesis a la interacción de estas regiones, mejorando de esta manera la estructura global y la función de la proteína. En una modalidad particular de la invención, los métodos de la invención son adecuados para identificar un motivo químico particular que caracteriza uno o más restos o posiciones de aminoácidos funcionales. El resto o restos aminoacídicos que contribuyen a dicho motivo químico pueden aparecer en una o más posiciones contiguas, no contiguas, dentro de una o más regiones CDR y/o dentro de uno o más polipéptidos, por ejemplo, cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos. Los métodos de la invención permiten la exploración adicional de un motivo químico, ya que permiten el ensayo sistemático (o perfilado químico) de químicas de aminoácidos relacionadas en una o más posiciones de aminoácidos seleccionadas o en una o más regiones definidas. Por consiguiente, en una modalidad, la invención proporciona un método para identificar una química deseada y después explorar las consecuencias de incorporar químicas relacionadas o no relacionadas para conseguir una propiedad mejorada o para eliminar una propiedad perjudicial. Las químicas de cadenas laterales de aminoácidos típicas adecuadas para el perfilado por los métodos de la invención son químicas de cadenas laterales de aminoácidos polares, cargados positivamente, cagados negativamente e hidrófobos. En una modalidad, una química cargada se identifica como residente en uno o más restos aminoacídicos, seleccionados, posiciones o regiones definidas y otros aminoácidos cargados sustituyen al aminoácido parental de tal forma que se consiga una alteración en una propiedad medible. En una modalidad preferida, la alteración en una propiedad medible es una propiedad mejorada de un anticuerpo, por ejemplo, una mejor unión a un antígeno o una mejor función efectora. Por consiguiente, la invención también proporciona bibliotecas de anticuerpos que comprenden químicas de grupos laterales de aminoácidos relacionadas introducidas en posiciones de aminoácidos selecciona-das/regiones definidas que tienen, por ejemplo, química relacionada, para la selección eficaz de anticuerpos con mejores propiedades. En otra modalidad de la invención, la biblioteca de análogos de polipéptidos se genera y selecciona sintetizando primero polinucleótidos individuales que codifican una región o regiones definidas de un polipéptido donde, colectivamente, los polipéptidos representan todos los polinucleótidos variantes posibles de acuerdo con el criterio de registro (look-through) descrito en este documento. El método se usa para identificar y distinguir uno o más restos (posiciones) de aminoácidos funcionales de uno o más restos (posiciones) de aminoácidos no funcionales. Una subserie de polinucleótidos variantes se expresa, por ejemplo, usando transcripción y traducción in vitro y/o usando una tecnología de presentación, tal como presentación en ribosomas, presentación en fagos, presentación bacteriana, presentación en levadura, presentación ordenada o cualquier otro sistema de presentación adecuado conocido en la técnica. Los polipéptidos espesados después se estudian y seleccionan usando ensayos funcionales tales como ensayos de unión o ensayos enzimáticos/catalíticos. En una modalidad, los polipéptidos se expresan en asociación con el polinucleótido que codifica el polipéptido, permitiendo de esta manera la identificación de la secuencia polinucleotídica que codifica el polipéptido. En otra modalidad, los polipéptidos se sintetizan directamente usando química de proteínas. En otra modalidad de la invención, se construye una biblioteca combinatoria beneficiosa de las variaciones de secuencias de aminoácidos de CDR de V y VH. Esta segunda biblioteca se construye generando secuencias codificantes que tienen, en cada posición de variación de aminoácido, codones para el aminoácido de tipo silvestre y para cada uno de los aminoácidos variantes beneficiosos identificados previamente en esa posición. De esta manera, la presente invención proporciona un método de mutagénesis inteligente que puede usarse para generar bibliotecas de análogos de polipéptidos que tengan un tamaño práctico para la selección, en parte porque las bibliotecas carecen de cualquier polipéptido análogo indeseado o de las denominadas interferencias. El método puede usarse para estudiar el papel de aminoácidos específicos en la estructura y función de polipéptidos y para crear polipéptidos nuevos o mejorados tales como anticuerpos, fragmentos de unión o análogos de los mismos, anticuerpos monocatenarios, anticuerpos catalíticos, enzimas y ligandos. Además, el método puede realizarse con el beneficio de una información a priori, por ejemplo, por medio de la creación de modelos informáticos, que puede usarse para seleccionar una subserie inicial de análogos de polipéptidos a producir y estudiar usando LTM2. Otras ventajas y aspectos de la presente invención serán evidentes tras la siguiente descripción y ejemplos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 ilustra las ventajas de la LTM mejorada (LTM2) con respecto a la LTM ya que se distinguen aminoácidos funcionales de aminoácidos no funcionales, de manera que se obtiene y selecciona una subserie más beneficiosa de moléculas candidatas. La Figura 2 ilustra una estrategia general para el uso de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para construir regiones definidas de una cadena pesada y ligera de anticuerpo para identificar restos aminoacídicos funcionales, en un contexto génico mayor. La Figura 3 ilustra la disposición de CDR de cadena ligera variable (VL) y cadena pesada variable (VH) en un contexto de gen sintético de anticuerpo anti-ovalbúmina monocatenario (scFv). En la aplicación de LTM, se introduce un aminoácido leucina en cada uno de los catorce restos 56-69 en la CDR2 de VH del anticuerpo. Para la aplicación de LTM2, sólo se exploran adicionalmente por mutagénesis los restos identificados como funcionales. La Figura 4 ilustra la reacción en cadena de la polimerasa de extensión solapante única (SOE-PCR) para la producción de una biblioteca LTM de CDR2 de VH; la producción de múltiples bibliotecas LTM de CDR de VH; y una serie de combinaciones de bibliotecas LTM que contienen tanto CDR de VH como CDR de VL. La Figura 5 ilustra la diversidad de las bibliotecas de la invención, representando los ejes x e y de la matriz las CDR de la cadena ligera y de la cadena pesada, donde un "0" indica una CDR de tipo silvestre y un "1" indica una CDR mutada, y representando el número de intersección la complejidad de la biblioteca de subseries resultante (por ejemplo, 4 significa que cuatro CDR se han mutado simultáneamente). La Figura 6 muestra un esquema de un vector de expresión de levadura para presentar proteínas de interés, por ejemplo, análogos de polípéptidos de la invención, en la superficie de una levadura para la identificación eficaz de la función (genotipo) y la correspondiente secuencia codificante (genotipo). La Figura 7 representa un gráfico de un clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS™) de la unión de ovalbúmina biotinilada y estreptavidina FITC a scFv anti-ovalbúmina de tipo silvestre (línea gris); vector pYD1 solo (área gris sólida); y scFv de control (línea negra). La Figura 8 representa gráficos de un clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS™) que muestra una entrada de selección (el trapezoide R1 ) para identificar sólo los clones LTM que expresaban la fusión de scFv con una mayor afinidad de unión a ovalbúmina que el anticuerpo anti-ovalbúmina de tipo silvestre (panel de la izquierda), la distribución de afinidades de unión de la biblioteca LTM total (panel central) y un análisis FACS después de la clasificación (panel de la derecha) para confirmar que >80% de los clones de scFv anti-ovalbúmina previos a la selección estaban dentro de los criterios predeterminados. La Figura 9 ilustra etapas en la selección de anticuerpos scFv (por ejemplo, anti-ovalbúmina) formados de acuerdo con la presente invención para mejorar la afinidad de unión basándose en la cinética de unión en equilibrio (por ejemplo, a ovalbúmina). La Figura 10 muestra las curvas de unión en equilibrio para células que expresan scFv anti-ovalbúmina (círculos) después de una vuelta de selección (triángulos claros), después de dos vueltas de selección (triángulos oscuros) y para el anticuerpo de referencia anti-ovalbúmina de tipo silvestre (cuadrados negros). La Figura 11 ilustra las etapas típicas para la selección de anticuerpos formados de acuerdo con la presente invención con respecto a una alta afinidad de unión basándose en cinéticas de unión particulares, por ejemplo, constantes K0ff de anticuerpo, usando la ovalbúmina como antígeno de ensayo. La Figura 12 muestra la identificación de mejores propiedades en dos clones (es decir, mayor K0f. relativa en comparación con un anticuerpo de referencia (cuadrado)) usando los métodos de la invención. La Figura 13 representa las propiedades mejoradas (véase las veces que es mejor que el tipo silvestre) de una subserie de clones mejorados que tienen menores valores de CE5o con respecto a un control de anticuerpo de referencia anti-ovalbúmina de tipo silvestre (cuadrado). La Figura 14 muestra una matriz que representa las posiciones de aminoácidos funcionales (puntos calientes) y no funcionales (puntos fríos) de un anticuerpo ejemplar. Debajo de cada posición de CDR de VH y VL se muestran las mutaciones asociadas con la mejor afinidad (con respecto al anticuerpo de tipo silvestre de referencia) basándose en experimentos de unión en equilibrio (CE50) y/o unión cinética.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Para proporcionar una comprensión clara de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, a continuación se proporcionan las siguientes definiciones.

Definiciones Como se usa en este documento, el término "análogo" se refiere a un polipéptido variante o mutante (o un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido) que tiene una o más sustituciones de aminoácidos. La expresión "molécula de unión" se refiere a cualquier molécula de unión, incluyendo proteínas, polipéptidos y péptidos que se unen a un sustrato o diana. En una modalidad, la molécula de unión es un anticuerpo o fragmento de unión del mismo (por ejemplo, un fragmento Fab), un anticuerpo de un solo dominio, un anticuerpo monocatenario (por ejemplo, scFv) o un péptido capaz de unirse a un ligando. En otra modalidad, la molécula de unión, en particular, moléculas de unión que comprenden regiones CDR, puede comprender regiones de soporte o flanqueantes no tradicionales procedentes de otros anticuerpos, inmunoglobulinas o moléculas de tipo inmunoglobulina (por ejemplo, fibronectina), o ser en su totalidad o en parte de origen sintético. La expresión "región definida" se refiere a una región seleccionada de un polipéptido. Típicamente, la región definida incluye todo o una parte de un sitio funcional, por ejemplo, el sitio de unión de un ligando, el sitio de unión de una molécula de unión o receptor o un sitio catalítico. La región definida también puede incluir múltiples partes de un sitio funcional. Por ejemplo, la región definida puede incluir todo, una parte o múltiples partes de una región determinante de complementariedad (CDR), por ejemplo, una región de unión de un solo dominio o una región variable (Fv) completa de cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo. De esta manera, un sitio funcional puede incluir una o múltiples regiones definidas que contribuyen a la actividad funcional de la molécula. Las expresiones "aminoácidos funcionales" y "aminoácidos no funcionales" se refieren, respectivamente, a los restos aminoacídicos (o a las posiciones de los restos aminoacídicos correspondientes) dentro de un polipéptido (o porción del mismo) que, según se determina (por ejemplo, usando los métodos de la invención), aportan una propiedad o actividad medible del polipéptido. Por consiguiente, uno o más restos aminoacídicos funcionales (o la posición o posiciones correspondientes) se denominan "puntos calientes" cuando es un resto o una posición de resto que influye en la actividad del polipéptido en comparación con un resto o posición no funcional que no influye en la actividad del polipéptido y, por lo tanto, se denomina "punto frío". Un resto (o posición) de aminoácido funcional se distingue de un resto (o posición) de aminoácido no funcional porque es adecuado para la mutagénesis. Típicamente, cuando se aplican los métodos de la invención a la investigación de una molécula de anticuerpo, los restos aminoacídicos que alteran, por ejemplo, la unión al antígeno se consideran restos/posiciones funcionales (es decir, puntos calientes) mientras que los restos que no alteran dicha unión se consideran restos/posiciones no funcionales (es decir, puntos fríos).

La expresión "propiedad medible" se refiere a una propiedad funcional o actividad de un polipéptido (o porción del mismo) que puede medirse, determinarse o ensayarse usando técnicas convencionales e incluye actividad de unión, actividad quinasa, actividad catalítica, estabilidad térmica o actividad enzimática. Las propiedades medibles de polipéptidos que son polipéptidos de unión a antígenos, por ejemplo, anticuerpos, típicamente incluyen especificidad de unión, avidez de unión, afinidad de unión, unión a receptor Fc, glicosilación, unión al complemento, estabilidad de la vida media, solubilidad, estabilidad térmica, actividad catalítica y actividad enzimática. La expresión "mutagénesis look-through" o "LTM" se refiere a un método para introducir un aminoácido predeterminado dentro de esencialmente todas las posiciones dentro de una región definida (o varias regiones diferentes) de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido. Se genera una biblioteca de polipéptidos que contiene análogos de polipéptidos que tienen individualmente no más de un aminoácido predeterminado, pero que colectivamente tienen el aminoácido predeterminado en cada posición dentro de la región o regiones definidas. La expresión "mutagénesis look-through" o "LTM2" se refiere a una LTM realizada para identificar o distinguir restos aminoacídicos funcionales (puntos calientes) de restos aminoacídicos no funcionales (puntos fríos). Por consiguiente, el método LTM2 permite introducir de forma selectiva un aminoácido predeterminado en las posiciones de restos aminoacídicos funcionales dentro de un polipéptido (o porción del mismo). Por lo tanto, las bibliotecas LTM2 correspondientes se enriquecen en análogos de polipéptidos que tienen alteraciones de aminoácidos con mayor probabilidad de conferir una propiedad alterada o mejorada. La LTM2 puede realizarse después de una LTM o basarse en una información a priori en cuanto a la funcionalidad de un resto o posición de resto aminoacídico dado. El término "biblioteca" se refiere a dos o más moléculas mutagenizadas de acuerdo con el método de la invención. Las moléculas de la biblioteca pueden estar en forma de polinucleótidos, polipéptidos, polinucleótidos y polipéptidos, polinucleótidos y polipéptidos en un extracto sin células, o como polinucleótidos y/o polipéptidos en el contexto de un fago, células procariotas o en células eucariotas. Las bibliotecas de la invención pueden contener dos o más moléculas o análogos de polipéptidos, por ejemplo, de aproximadamente 2 a 10, de aproximadamente 10 a 50, de aproximadamente 50 a 102, aproximadamente 103, aproximadamente 104, aproximadamente 105, aproximadamente 106, aproximadamente 107, aproximadamente 108, aproximadamente 109, aproximadamente 1010, aproximadamente 1011, aproximadamente 1012, aproximadamente 103 o más, o cualquier intervalo o serie de los valores anteriores. El término "mutagenizar" se refiere a la alteración de una secuencia de aminoácidos. Esto puede conseguirse alterando o produciendo un ácido nucleico (polinucleótido) capaz de codificar la secuencia de aminoácidos alterada, o por síntesis directa de un polipéptido alterado usando química de proteínas.

El término "mutagénesis" se refiere, a menos que se especifique otra cosa, a cualquier método reconocido en la técnica para alterar una secuencia polinucleotídica o polipeptídica. Los tipos preferidos de mutagénesis incluyen mutagénesis walk-through (WTM), mutagénesis walk-through beneficiosa, mutagénesis look-through (LTM), mutagénesis look-through mejorada (LTM2) o combinaciones de las mismas. La expresión "mutagénesis combinatoria beneficiosa" se refiere a una biblioteca de combinación de secuencias codificantes que codifican mezclas degeneradas de variaciones de secuencias de aminoácidos de CDR de VL y/o VH identificadas inicialmente a partir de la selección de mutagénesis de aminoácidos LTM predeterminada como que tienen una alteración en una propiedad medible. En la estrategia de mutación combinatoria beneficiosa, se generan secuencias codificantes de oligonucleótidos que representan combinaciones de estas mutaciones beneficiosas identificadas por LTM. Estas combinaciones pueden ser combinaciones de diferentes mutaciones beneficiosas dentro de una sola CDR, mutaciones dentro de dos o más CDR dentro de una sola cadena de anticuerpo o mutaciones dentro de las CDR de diferentes cadenas de anticuerpo. El término "polinucleótido" se refiere a ácidos nucleicos tales como moléculas de ADN y moléculas de ARN y análogos de las mismas (por ejemplo, ADN o ARN generado usando análogos de nucleótidos o usando química de ácidos nucleicos). Cuando se desea, los polinucleótidos pueden obtenerse de forma sintética, por ejemplo, usando la química de ácidos nucleicos reconocida en la técnica o enzimáticamente usando, por ejemplo, una polimerasa. Las modificaciones típicas incluyen metilación, biotinilación y otras modificaciones conocidas en la técnica. Además, la molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria y, cuando se desee, puede unirse o asociarse (por ejemplo, de forma covalente o no covalente) a un resto detectable. La expresión "polinucleótido variante" se refiere a un polinucleótido que codifica un análogo de polipéptido correspondiente (o porción del mismo) de la invención. De esta manera, los polinucleótidos variantes contienen uno o más codones que se han cambiado para dar como resultado la expresión de un aminoácido diferente. La expresión "polipéptido o polipéptidos" se refiere a dos o más aminoácidos unidos por un enlace peptídico, por ejemplo péptidos (por ejemplo, de 2 a ~-50 restos aminoacídicos), así como a secuencias peptídicas mayores, por ejemplo, secuencias de proteína que típicamente comprenden secuencias de aminoácidos de tan sólo 50 restos aminoacídicos a más de 1000 restos aminoacídicos. El término "reunión" se refiere a la combinación de variantes de polinucleótidos o análogos de polipéptidos para formar bibliotecas que representan la mutagénesis look-through (LTM) o la mutagénesis look-through mejorada (LTM2) de una región polipeptídica entera. Las moléculas pueden estar en forma de un polinucleótido y/o polipéptido y pueden coexistir en forma de una sub-biblioteca, como moléculas en un soporte sólido, como moléculas en solución y/o como moléculas en uno o más organismos (por ejemplo, fagos, células procariotas o células eucariotas). La expresión "aminoácido predeterminado" se refiere a un resto aminoacídico seleccionado para sustitución en cada posición dentro de una región definida de un polinucleótido a mutagenizar. Esto no incluye las posiciones dentro de la región que ya contienen (por ejemplo, de forma natural) el aminoácido predeterminado y, de esta manera, que no necesitan sustituirse con el aminoácido predeterminado. Por consiguiente, cada análogo de polipéptido generado de acuerdo con la presente invención no contiene más de un resto "aminoacídico predeterminado" en una región definida dada. Sin embargo, colectivamente, la biblioteca de análogos de polipéptidos generada contiene el aminoácido predeterminado en cada posición dentro de la región que se está mutagenizando y, en una modalidad preferida, en posiciones de aminoácidos consideradas funcionales (puntos calientes). Típicamente, un aminoácido predeterminado se selecciona para un tamaño o química particular normalmente asociado con el grupo lateral del aminoácido. Los aminoácidos predeterminados adecuados incluyen, por ejemplo, glicina y alanina (estéricamente pequeños); serina, treonina y cisteína (nucleófilos); valina, leucina, isoleucina, metionina y prolina (hidrófobos); fenilalanina, tirosina y triptófano (aromáticos); aspartato y glutamato (ácidos); asparagina, glutamina e histidina (amida); y lisina y arginina (básicos). También está dentro del alcance de la invención el uso de restos aminoacídicos no tradicionales (por ejemplo, homocisteína) y pueden introducirse usando cualquier método reconocido en la técnica.

Descripción Detallada El estudio de las proteínas ha revelado que ciertos aminoácidos juegan un papel importante en su estructura y función. Por ejemplo, parece ser que sólo un número discreto de aminoácidos participan en la unión de un anticuerpo a un antígeno o están implicados en el suceso catalítico de una enzima. Aunque está claro que ciertos aminoácidos son críticos para la actividad o función de las proteínas, es difícil identificar los aminoácidos que están implicados, cómo están implicados y las sustituciones que pueden mejorar la estructura o la función de la proteína. En parte, esto se debe a la complejidad de la configuración espacial de las cadenas laterales de aminoácidos en los polipéptidos y la interrelación de las diferentes porciones del polipéptido que contribuyen a la formación de un sitio funcional. Por ejemplo, la interrelación entre las seis CDR de las regiones de cadena pesada y ligera variable de un anticuerpo contribuyen al sitio de unión al antígeno o al ligando. Los métodos de mutagénesis previos, tales como mutagénesis selectiva (de localización dirigida) y mutagénesis de saturación, tienen una utilidad limitada para el estudio de la estructura y función de las proteínas en vista del enorme número de posibles variaciones en los polipéptidos complejos. Esto es especialmente cierto dado que las combinaciones deseables a menudo van acompañadas por la presencia de enormes cantidades de combinaciones indeseables o de las denominadas "interferencias". El método de esta invención proporciona una estrategia sistemática, práctica y muy precisa para evaluar el papel de aminoácidos particulares y su posición, dentro de una región definida de un polipéptido, en la estructura o función del polipéptido y, de esta manera, para producir polipéptidos mejorados. 1. Selección de una Región Definida De acuerdo con la presente invención, se selecciona una región o regiones definidas dentro de una proteína para mutagénesis. Típicamente, se cree que las regiones son importantes para la estructura o la función de la proteína. Esto puede deducirse, por ejemplo, a partir de los aspectos estructurales y/o funcionales que se conocen o puede deducirse por la comparación de la región o regiones definidas con lo que se sabe por el estudio de otras proteínas, y puede aprovechar la información procedente de modelos. Por ejemplo, la región definida puede ser una que tenga un papel en un sitio funcional, por ejemplo, en la unión, catálisis u otra función. En una modalidad, la región definida es una región hipervariable o región determinante de complementariedad (CDR) de una molécula de unión a antígeno (véase, por ejemplo, la Fig. 1). En otra modalidad, la región definida es una porción de una región determinante de complementariedad (CDR). En otras modalidades, se seleccionan para mutagénesis dos o más regiones definidas, por ejemplo CDR, o porciones de las mismas. 2. Selección de un Resto Aminoacídico Predeterminado El resto aminoacídico elegido para la sustitución dentro de la región o regiones definidas generalmente se selecciona entre los que se sabe que están implicados en la estructura o función de interés. Los veinte aminoácidos naturales difieren con respecto a su cadena lateral. Cada cadena lateral es responsable de las propiedades químicas que hacen que cada aminoácido sea único. Para alterar la unión o crear nuevas afinidades de unión, generalmente puede seleccionarse todos y cada uno de los veinte aminoácidos naturales, así como restos aminoacídicos no tradicionales (por ejemplo, homocisteína). De esta manera, los métodos previos de mutagénesis, que creaban grandes números de análogos para cada sustitución, eran poco prácticos para evaluar el efecto sobre la unión de proteínas de la sustitución de cada uno de los veinte aminoácidos. Por el contrario, los métodos de la presente invención crean un número práctico de análogos para cada sustitución de aminoácido y, de esta manera, permiten la evaluación de una mayor diversidad de químicas de proteínas dentro de una región o regiones segregadas de una proteína. A diferencia de la unión de proteínas, sólo una subserie de restos aminoacídicos típicamente participa en sucesos enzimáticos o catalíticos. Por ejemplo, según las propiedades químicas de las cadenas laterales, sólo un número seleccionado de aminoácidos naturales participan preferentemente en sucesos catalíticos. Estos agrupamientos de químicas de cadena lateral de aminoácidos son útiles para seleccionar un resto aminoacídico apropiado para uso en el perfilado químico de un resto o posición de aminoácido particular. Estos aminoácidos pertenecen al grupo de aminoácidos polares y neutros tales como Ser, Thr, Asn, Gln, Tyr y Cys, el grupo de aminoácidos cargados, Asp y Glu, Lys y Arg, y especialmente el aminoácido His. Otras cadenas laterales polares y neutras son las de Cys, Ser, Thr, Asn, Gln y Tyr. Gly también se considera un miembro límite de este grupo. Ser y Thr juegan un papel importante en la formación de enlaces de hidrógeno. Thr tiene una simetría adicional en el carbono beta, por lo que sólo se usa uno de los estereoisómeros. La amida acida Gln y Asn también puede formar enlaces de hidrógeno, funcionando los grupos amido como donadores de hidrógeno y funcionando los grupos carbonilo como aceptores. Gln tiene un grupo CH2 más que Asn que hace que el grupo polar sea más flexible y reduce su interacción con la cadena principal. Tyr tiene un grupo hidroxilo muy polar (OH fenólico) que puede disociarse a mayores valores de pH. Tyr se comporta en alguna medida como una cadena lateral cargada; sus enlaces de hidrógeno son bastante fuertes. Los ácidos polares neutros se encuentran en la superficie así como en el interior de las moléculas de proteínas. Como restos internos, normalmente forman enlaces de hidrógeno entre sí o con el esqueleto polipeptídico. Cys puede formar enlaces disulfuro. La histidina (His) tiene una cadena lateral aromática heterocíclica con un valor de pK de 6.0. En el intervalo de pH fisiológico, su anillo de imidazol puede estar no cargado o cargado, después de coger un ion hidrógeno de la solución. Como estos dos estados están disponibles fácilmente, His es bastante adecuada para catalizar reacciones químicas. Se encuentra en la mayoría de los centros activos de enzimas, por ejemplo, serina proteasas. Asp y Glu están cargados negativamente a pH fisiológico. Debido a su cadena lateral corta, el grupo carboxilo de Asp es bastante rígido con respecto a la cadena principal. Esta puede ser la razón por la que el grupo carboxilo en muchos sitios catalíticos se proporcione por Asp y no por Glu. Los aminoácidos cargados generalmente se encuentran en la superficie de un polipéptido. Además, Lys y Arg se encuentran en la superficie. Tienen cadenas laterales largas y flexibles que presentan múltiples rotámeros de energías similares. En varios casos, Lys y Arg toman parte en la formación de enlaces de sal internos o ayudan en la catálisis. Debido a su exposición en la superficie del polipéptido, Lys es un resto reconocido con más frecuencia por enzimas que modifican la cadena lateral o escinden la cadena peptídica en el extremo carbonilo de restos de Lys. Aunque la química del grupo lateral de un aminoácido puede guiar la selección de un resto aminoacídico predeterminado, la ausencia de una química de grupo lateral deseada puede ser un criterio para excluir un resto aminoacídico para uso como aminoácido predeterminado. Por ejemplo, pueden excluirse aminoácidos estéricamente pequeños y químicamente neutros, tales como alanina, de la mutagénesis Look-Through por ausencia de una química deseada. 3. Síntesis de Bibliotecas de Análogos de Polipéptidos En una modalidad, se genera una biblioteca de análogos de polipéptidos para la selección por medio de la síntesis de oligonucleótidos individuales que codifican la región definida del polipéptido y que no tienen más que un codón para el aminoácido predeterminado. Esto se consigue incorporando, en cada posición de codón dentro del oligonucleótido, el codón requerido para la síntesis del polipéptido de tipo silvestre o un codón para el aminoácido predeterminado. Esto difiere de los oligonucleótidos producidos cuando se usa mutagénesis de saturación, mutagénesis aleatoria o mutagénesis walk-through ya que, para cada oligonucleótido, sólo se realiza una mutación en lugar de múltiples mutaciones. Los oligonucleótidos pueden producirse individualmente y después mezclarse o reunirse cuando se desee. Cuando el codón de la secuencia de tipo silvestre y el codón para el aminoácido predeterminado son iguales, no se realiza sustitución. Por consiguiente, el número de posiciones de aminoácidos dentro de la región definida determinará el número máximo de oligonucleótidos realizados. Por ejemplo, si cinco posiciones de codones se alteran con el aminoácido predeterminado, entonces se sintetizan cinco polinucleótidos más un polinucleótido que representa la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre. Pueden alterarse simultáneamente dos o más regiones. En una modalidad, los restos (posiciones) de aminoácidos dentro de la región definida que se mutagenizan son restos (posiciones) de aminoácidos funcionales. En otra modalidad, se mutagenizan exclusivamente los restos (posiciones) de aminoácidos funcionales. La mezcla de oligonucleótidos para la generación de la biblioteca puede sintetizarse fácilmente por métodos conocidos para la síntesis de ADN. El método preferido implica el uso de la química de beta-cianoetil fosforamidita en fase sólida. Véase la Patente de Estados Unidos N° 4.725.677. Por conveniencia, puede usarse un instrumento para la síntesis automática de ADN que contiene recipientes de reactivo específico de nucleótidos. Los polinucleótidos también pueden sintetizarse de manera que contengan sitios de restpcción o sitios de hibridación con cebadores para facilitar la introducción o el ensamblaje de los polinucleótidos que representan, por ejemplo, una región definida, en un contexto génico mayor. Los polinucleótidos sintetizados pueden insertarse en un contexto génico mayor del polipéptido que se va a mutagenizar usando técnicas de ingeniería genética convencionales. Por ejemplo, los polinucleótidos pueden prepararse de manera que contengan sitios de reconocimiento flanqueantes para enzimas de restricción. Véase Crea, R., Patente de Estados Unidos N° 4.888.286. Los sitios de reconocimiento se diseñan para que correspondan a sitios de reconocimiento que existen en la naturaleza o se introducen en el gen próximo al ADN que codifica la región. Después de la conversión en forma bicatenaria, los polinucleótidos se unen al gen por técnicas convencionales. Por medio de un vector apropiado (incluyendo, por ejemplo, vectores de fagos, plásmidos) los genes pueden introducirse en un extracto sin células, fago, célula procariota o célula eucariota adecuada para la expresión de los polipéptidos mutantes. En casos en los que se conoce la secuencia de aminoácidos del polipéptido a mutagenizar o cuando se conoce la secuencia de ADN, una estrategia posible es la síntesis de genes. Por ejemplo, pueden diseñarse polinucleótidos parcialmente solapantes, típicamente de aproximadamente 20-60 nucleótidos de longitud. Los polinucleótidos internos después se hibridan fosforilados con su molécula complementaria para dar una molécula de ADN bicatenaria con extensiones monocatenarias útil para una hibridación adicional. Los pares hibridados después pueden mezclarse entre sí y ligarse para formar una molécula bicatenaria de longitud completa (véase, por ejemplo, la Fig. 8). Pueden diseñarse sitios de restricción convenientes cerca de los extremos del gen sintético para la clonación en un vector adecuado. Las moléculas de longitud completa pueden escindirse con esas enzimas de restricción y unirse a un vector adecuado. En la secuencia del gen sintético también pueden incorporarse sitios de restricción convenientes para facilitar la introducción de casetes mutagénicos. Como alternativa a la síntesis de polinucleótidos que representan el gen bicatenario de longitud completa, pueden ensamblarse polinucleótidos que solapan parcialmente en sus extremos 3' (es decir, con extremos 3' complementarios) en una estructura con huecos y después rellenarse con una polimerasa adecuada para obtener un gen bicatenario de longitud completa. Típicamente, los polinucleótidos solapantes tienen una longitud de 40-90 nucleótidos. Los polinucleótidos extendidos después se unen. Pueden introducirse sitios de restricción convenientes en los extremos y/o internamente para la clonación. Después de la digestión con una enzima o enzimas de restricción apropiadas, el fragmento del gen se une a un vector adecuado. Como alternativa, el fragmento del gen puede unirse con extremos romos en un vector apropiado. En estas estrategias, si se dispone de sitios de restricción convenientes (naturales o introducidos por ingeniería genética) después del ensamblaje del gen, pueden introducirse los polinucleótidos degenerados posteriormente por clonación del cásete en un vector apropiado. Como alternativa, los polinucleótidos degenerados pueden incorporarse en la fase de ensamblaje del gen. Por ejemplo, cuando las dos cadenas del gen se sintetizan químicamente en su totalidad, pueden producirse polinucleótidos solapantes y degenerados complementarios. Los pares complementarios hibridarán entre sí. Cuando se usan polinucleótidos parcialmente solapantes en el ensamblaje del gen, también puede incorporarse directamente una serie de nucleótidos degenerados en lugar de uno de los polinucleótidos. La cadena complementaria apropiada se sintetiza durante la reacción de extensión de un polinucleótido parcialmente complementario a partir de la otra cadena por extensión enzimática con una polimerasa. La incorporación de los polinucleótidos degenerados en la fase de síntesis también simplifica la clonación cuando se mutageniza más de un dominio o región definida de un gen. En otra estrategia, el gen de interés está presente en un plásmido monocatenario. Por ejemplo, el gen puede clonarse en un vector de fago o un vector con un origen de replicación de fago filamentoso que permite la propagación de moléculas monocatenarias con el uso de un fago adyuvante. La plantilla bicatenaria puede hibridarse con una serie de polinucleótidos degenerados que representan las mutaciones deseadas, y posteriormente alargarse y unirse, incorporando de esta manera cada cadena análoga en una población de moléculas que pueden introducirse en un hospedador apropiado (Sayers, J. R. et al., Nucleic Acids, Res. 16: 791-802 (1988)). Esta estrategia puede evitar múltiples etapas de clonación cuando se seleccionan múltiples dominios para la mutagénesis. También puede usarse la metodología de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para incorporar polinucleótidos en un gen. Por ejemplo, los propios polinucleótidos pueden usarse como cebadores para la extensión. En esta estrategia, los polinucleótidos que codifican los casetes mutagénicos correspondientes a la región definida (o porción de la misma) son complementarios entre sí, al menos en parte, y pueden extenderse para formar un cásete génico grande usando una polimerasa, por ejemplo, usando amplificación por PCR (véase, por ejemplo, la Fig. 2). El tamaño de la biblioteca variará dependiendo de la longitud y del número de regiones y aminoácidos dentro de una región que se mutagenizan. Preferiblemente, la biblioteca se diseñará para que contenga menos de 1015, 1014, 1013, 1012, 1011, 1010, 109, 108, 107 y, más preferiblemente, 106 análogos de polipéptidos o menos. La descripción anterior se ha centrado en la mutagénesis de polipéptidos y bibliotecas de polipéptidos por medio de la alteración del polinucleótido que codifica el polipéptido correspondiente. Sin embargo, se entiende que el alcance de la invención también incluye métodos para mutagenizar polipéptidos por síntesis directa de análogos de polipéptidos deseados usando química de proteínas. Para realizar esta estrategia, los polipéptidos resultantes incorporan las características de la invención con la excepción de que se elimina el uso de un intermedio polinucleotídico. Para las bibliotecas descritas anteriormente, estén en forma de polinucleótidos y/o en forma de los polipéptidos correspondientes, se entiende que las bibliotecas también pueden unirse a un soporte sólido, tal como un microchip, y preferiblemente ordenarse usando métodos reconocidos en la técnica. 4. Sistemas de Expresión y Selección Las bibliotecas de polinucleótidos generadas por cualquiera de las técnicas anteriores u otras técnicas adecuadas pueden expresarse y seleccionarse para identificar análogos de polipéptidos que tengan la estructura y/o actividad deseada. La expresión de los análogos de polipéptidos puede realizarse usando cualquier sistema de presentación de expresión adecuado conocido en la técnica incluyendo, pero sin limitación, sistemas de presentación en extractos sin células (por ejemplo, sistemas de presentación en ribosomas y sistemas de presentación ordenados (por ejemplo, micromatrices (microarray) o macromatrices (macroarrray))), sistemas de presentación bacterianos, sistemas de presentación en fagos, células procariotas y/o células eucariotas (por ejemplo, sistemas de presentación en levadura). En una modalidad, los polinucleótidos se modifican por ingeniería genética para servir como plantillas que pueden expresarse en un extracto sin células. Pueden usarse vectores y extractos como los descritos, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos N° 5.324.637; 5.492.817; 5.665.563 y muchos están disponibles en el mercado. Puede usarse presentación en ribosomas y otras técnicas sin células para asociar un polinucleótido (es decir, un genotipo) a un polipéptido (es decir, un fenotipo), por ejemplo, Profusión™ (véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N° 6.348.315; 6.261.804; 6.258.558; y 6.214.553). Como alternativa, los polinucleótidos de la invención pueden expresarse en sistemas de expresión procarióticos convenientes tales como el sistema de expresión bacteriano de E. coli, tal como el descrito por Pluckthun y Skerra. (Pluckthun, A. y Skerra, A., Meth. Enzymol. 178: 476-515 (1989); Skerra, A. eí ai, Biotechnology 9: 273-278 (1991 )). Las proteínas mutantes pueden expresarse para secreción en el medio y/o en el citoplasma de la bacteria, como se describe por M. Better y A. Horwitz, Meth. Enzymol. 178: 476 (1989). En una modalidad, los dominios individuales que codifican VH y VL se unen al extremo 3' de una secuencia que codifica una secuencia señal, tal como la secuencia señal ompA, phoA o pelB (Lei, S. P. et al., J. Bacteriol. 169: 4379 (1987)). Estas fusiones de genes se ensamblan en una construcción dicistrónica, de forma que puedan expresarse a partir de un solo vector, y secretarse al espacio periplásmico de E. coli donde se replegarán y pueden recuperarse en forma activa. (Skerra, A. et al., Biotechnology 9: 273-278 (1991)). Por ejemplo, pueden expresarse conjuntamente genes de cadena pesada de anticuerpo con genes de cadena ligera de anticuerpo para producir un anticuerpo o fragmentos de anticuerpo. En otra modalidad, los polinucleótidos pueden expresarse en células eucariotas tales como levadura, usando, por ejemplo, presentación en levadura como se describe, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos N° 6.423.538; 6.331.391 ; y 6.300.065. En esta estrategia, los análogos de polipéptidos de la biblioteca se fusionan a un polipéptido que se expresa y representa en la superficie de la levadura. También pueden usarse otras células eucariotas para la expresión de los polipéptidos de la invención tales como células de mamífero, por ejemplo, células de mieloma, células de hibridoma o células de ovario de hámster chino (CHO). Típicamente, los análogos de polipéptidos, cuando se expresan en células de mamífero, se diseñan para expresarse en el medio de cultivo o para expresarse en la superficie de dicha célula. El anticuerpo o fragmentos de anticuerpo pueden producirse, por ejemplo, como moléculas de anticuerpo enteras o como fragmentos de VH y VL individuales, fragmentos Fab, dominios individuales o anticuerpos monocatenarios (scFv) (véase Huston, J. S. eí al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 (1988)). La selección de los análogos de polipéptidos expresados (o polipéptidos producidos por síntesis directa) puede realizarse por cualquier medio apropiado. Por ejemplo, la actividad de unión puede evaluarse por cromatografía de inmunoensayo y/o afinidad convencional y la actividad catalítica puede averiguarse por ensayos adecuados para la conversión del sustrato. La selección de los análogos de polipéptidos de la invención para la función proteolítica puede realizarse usando un ensayo en placas de hemoglobina convencional como se describe, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos N° 5.798.208. 5. Mutagénesis Look-Through Mejorada Asistida por Creación de Modelos Informáticos La mutagénesis look-through de la invención también puede realizarse aprovechándose de la información estructural o de modelos en relación con los análogos de polipéptidos a generar, de tal forma que aumente la posibilidad de generar análogos con la función mejorada deseada. La información estructural o de modelos también puede usarse para guiar la selección de aminoácidos predeterminados a introducir en las regiones definidas. Además, los resultados reales obtenidos con los análogos de polipéptidos de la invención pueden guiar la selección (o exclusión) de polipéptidos posteriores a realizar y seleccionar de una manera iterativa. Por consiguiente, la información estructural o de modelos puede usarse para generar subseries iniciales de análogos de polipéptidos para uso en la invención, aumentando de esta manera adicionalmente la eficacia de la generación de polipéptidos mejorados. En una modalidad particular, se usa la creación de modelos virtuales para eliminar la producción de cualquier análogo de polipéptido, que según se ha previsto, tiene una estructura y/o función deficiente o indeseada. De esta manera, el número de análogos de polipéptidos a producir puede reducirse rápidamente aumentando de esta manera la relación entre señal e interferencias en los ensayos de selección posteriores. En una modalidad particular, se identifican restos (posiciones) de aminoácidos funcionales o puntos calientes como adecuados para mutagénesis mientras que se excluyen los restos (posiciones) de aminoácidos no funcionales o puntos fríos. En otra modalidad particular, la creación de modelos virtuales se actualiza continuamente con información de modelos adicionales, procedentes de cualquier fuente relevante, por ejemplo, de secuencias génicas y proteicas y bases de datos tridimensionales y/o resultados de análogos ensayados previamente, de forma que las bases de datos virtuales sean más precisas en esta capacidad predictiva. En otra modalidad, la base de datos virtual se proporciona con los resultados de ensayo de análogos de polipéptidos ensayados previamente y clasifica a los análogos, basándose en el criterio o criterios de ensayo, como respondedores o no respondedores, por ejemplo, como análogos de polipéptidos que se unen bien o que no se unen tan bien o como que tienen actividad enzimática/catalítica o sin esta actividad enzimática/catalítica. De esta manera, la mutagénesis de la invención puede equiparar una serie de respuestas funcionales con una información estructural particular y usar esta información para guiar la producción de análogos de polipéptidos futuros a ensayar. Por consiguiente, el método es especialmente adecuado para seleccionar anticuerpos o fragmentos de anticuerpo con respecto a una función particular, tal como la afinidad de unión (por ejemplo, especificidad); estabilidad (por ejemplo, vida media) y/o función efectora (por ejemplo, activación del complemento y ADCC) por medio de la fijación como objetivo de puntos calientes para la mutagénesis. Por consiguiente, la mutagénesis de restos no contiguos dentro de una región puede ser deseable si se sabe, por ejemplo, por medio de la creación de modelos virtuales, que ciertos restos de la región no participarán en la función deseada. Pueden considerarse y modelarse la estructura coordinada y la interrelación espacial entre las regiones definidas, por ejemplo, los restos aminoacídicos funcionales en las regiones definidas del polipéptido, por ejemplo, los aminoácidos predeterminados que se han introducido. Estos criterios de modelado incluyen, por ejemplo, la química del grupo lateral del resto aminoacídico, distancias entre átomos, datos cristalográficos, etc. Por consiguiente, el número de análogos de polipéptidos a producir puede minimizarse de forma inteligente. En una modalidad preferida, una o más de las etapas anteriores se asisten por ordenador. El método también puede realizarse, en parte o en su totalidad, por un dispositivo, por ejemplo, un dispositivo accionado por un ordenador. Por consiguiente, pueden conferirse instrucciones para realizar el método, en su totalidad o en parte, a un medio adecuado para uso en un dispositivo electrónico para cumplir las instrucciones. En resumen, los métodos de la invención son susceptibles de una estrategia de alto rendimiento que comprende un software (por ejemplo, instrucciones legibles por ordenador) y un hardware (por ejemplo, ordenadores, robots y chips). 6. Exploración de la Quimica Combinatoria de Múltiples Regiones Definidas La presente invención proporciona la ventaja importante de permitir la evaluación por mutagénesis de varias regiones o dominios diferentes de un polipéptido simultáneamente. Esto puede realizarse usando el mismo aminoácido o un aminoácido predeterminado diferente dentro de cada región, permitiendo la evaluación de sustituciones de aminoácidos en regiones relacionadas conformacionalmente, tales como las regiones que tras el replegamiento del polipéptido se asocian para constituir un sitio funcional (por ejemplo, el sitio de unión de un anticuerpo o el sitio catalítico de una enzima). Esto, a su vez, proporciona una forma eficaz para crear nuevos sitios ó sitios funcionales mejorados. Por ejemplo, las seis CDR de un anticuerpo que constituyen los aspectos característicos del sitio de unión a antígeno (región Fv) pueden mutagenizarse simultáneamente o por separado dentro de las cadenas VH o VL, para estudiar la interrelación tridimensional de aminoácidos seleccionados en este sitio. En una modalidad, se explora sistemáticamente la química combinatoria de tres o más regiones definidas usando mutagénesis look-through, y preferiblemente seis regiones definidas, por ejemplo, las seis CDR de una región variable de cadena pesada y ligera de anticuerpo. Para realizar mutagénesis look-through en una CDR, típicamente se alteran 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25 o más posiciones de aminoácidos. Después, los restos aminoacídicos funcionales se distinguen de los restos aminoacídicos no funcionales y se identifican como adecuados para una mutagénesis adicional. Por consiguiente, la presente invención abre nuevas posibilidades para el diseño de muchos tipos diferentes de polipéptidos nuevos y mejorados. El método puede usarse para mejorar una estructura o función existente de una proteína. Por ejemplo, puede introducirse un sitio de unión para un anticuerpo o fragmento de anticuerpo o puede mejorarse la afinidad para un antígeno preexistente, la función efectora y/o la estabilidad. Como alternativa, puede realizarse la introducción de aminoácidos "catalíticamente importantes" adicionales en un domino catalítico de una enzima dando como resultado la modificación o mejora de la actividad catalítica hacia un sustrato. Como alternativa, pueden introducirse en un polipéptido estructuras, especificidades o actividades completamente nuevas. También puede conseguirse la síntesis e novo de la actividad enzimática. Las nuevas estructuras pueden construirse en el "soporte" natural o consenso de una proteína existente por mutagénesis sólo de regiones relevantes (por ejemplo, restos (posiciones) de aminoácidos funcionales) por el método de la invención. 7. Mutagénesis Look-Through Mejorada (LTM 2) para Obtener Anticuerpos Nuevos o Mejorados El método de esta invención es especialmente útil para modificar moléculas de anticuerpo. Como se usan en este documento, las moléculas de anticuerpo o los anticuerpos se refieren a anticuerpos o porciones de los mismos, tales como anticuerpos de longitud completa, moléculas Fv u otros fragmentos de anticuerpo, cadenas individuales o fragmentos de las mismas (por ejemplo, una sola cadena de Fv), anticuerpos monocatenarios (por ejemplo, scFv) y anticuerpos quiméricos. Pueden introducirse alteraciones en la región variable y/o en la región flanqueante (constante) de un anticuerpo. La modificación de la región variable puede producir anticuerpos con mejores propiedades de unión a antígenos y, si se desea, mejores propiedades catalíticas. La modificación de la región flanqueante también puede conducir a la mejora de propiedades fisicoquímicas, tales como solubilidad o estabilidad (por ejemplo, vida media), que son especialmente útiles, por ejemplo, en la producción comercial, biodisponibilidad, función efectora (por ejemplo, activación del complemento y/o ADCC) y afinidad de unión (por ejemplo, especificidad) para el antígeno). Típicamente, la mutagénesis se dirige a la región Fv de la molécula de anticuerpo, es decir, la estructura responsable de la actividad de unión al antígeno que está formada por regiones variables de dos cadenas, una de la cadena pesada (VH) y otra de la cadena ligera (VL). En particular, la mutagénesis se dirige a restos (posiciones) de aminoácidos funcionales que, según se ha determinado, contribuyen a una propiedad medible del anticuerpo (por ejemplo, unión al antígeno, unión al receptor Fc, etc.). Una vez identificadas las características de unión a antígeno deseadas, la región o regiones variables pueden introducirse por ingeniería genética en una clase de anticuerpo apropiada tal como IgG, IgM, IgA, IgD o IgE. 8. Mutagénesis Look-Throuoh Mejorada (LTM 2) para Realizar/Mejorar Polipéptidos Catalíticos/Enzimáticos El método de la invención también es particularmente adecuado para el diseño de proteínas catalíticas, particularmente anticuerpos catalíticos. En el momento actual, los anticuerpos catalíticos pueden prepararse por una adaptación de técnicas de fusión de células somáticas convencionales. En este proceso, un animal se inmuniza con un antígeno que se parece al estado de transición del sustrato deseado para inducir la producción de un anticuerpo que se una al estado de transición y catalice la reacción. Se recogen células productoras de anticuerpo del animal y se fusionan con una célula de inmortalización para producir células híbridas. Estas células después se seleccionan con respecto a la secreción del anticuerpo que cataliza la reacción. Este proceso depende de la disponibilidad de análogos del estado de transición de un sustrato. El proceso puede estar limitado porque estos análogos probablemente son difíciles de identificar o sintetizar en la mayoría de los casos.

El método de la invención proporciona una estrategia diferente que elimina la necesidad de un análogo de estado de transición. Por medio del método de la invención, un anticuerpo puede hacerse catalítico por la introducción de aminoácidos adecuados en el sitio de unión de una inmunoglobulina (región Fv). La región del sitio de unión a antígeno (Fv) consta de seis bucles hipervariables (CDR), tres derivados de la cadena pesada de inmunoglobulina (H) y tres de la cadena ligera (L), que conectan cadenas beta dentro de cada subunidad. Los restos aminoacídicos de los bucles de CDR contribuyen casi totalmente a las características de unión de cada anticuerpo monoclonal específico. Por ejemplo, pueden crearse tríadas catalíticas (que comprenden los restos aminoacídicos serina, histidina y ácido aspártico) modeladas después de serina proteasas en los segmentos hipervariables de la región Fv de un anticuerpo con afinidad conocida por la molécula de sustrato y seleccionarse con respecto a la actividad proteolítica del sustrato. En una modalidad preferida, se fijan como objetivo restos (posiciones) de aminoácidos funcionales que, según se ha determinado, contribuyen a una propiedad medible del anticuerpo, por ejemplo, actividad catalítica. En particular, el método de la invención puede usarse para producir muchas enzimas o anticuerpos catalíticos diferentes, incluyendo oxidorreductasas, transferasas, hidrolasas, liasas, isomerasas y ligasas. Entre estas clases, tendrá una importancia particular la producción de proteasas, carbohidrasas, lipasas, dioxigenasas y peroxidasas mejoradas. Estas y otras enzimas que pueden prepararse por el método de la invención tienen importantes aplicaciones comerciales para conversiones enzimáticas en cuidado sanitario, cosméticos, alimentos, fermentación, detergentes, medio ambiente (por ejemplo, el tratamiento de aguas residuales), agricultura, curtido, textiles y otros procesos químicos. Éstos incluyen, pero sin limitación, aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas, conversiones de grasas, carbohidratos y proteínas, degradación de contaminantes orgánicos y síntesis de agentes químicos. Por ejemplo, pueden obtenerse por ingeniería genética proteasas terapéuticamente eficaces con actividad fibrinolítica, o actividad contra estructuras virales necesarias para la infectividad, tales como proteínas de la cubierta viral. Estas proteasas podrían ser agentes anti-trombóticos útiles o agentes antivirales contra virus tales como, por ejemplo, VIH, rinovirus, influenza o hepatitis. En el caso de oxigenasas (por ejemplo, dioxigenasas), una clase de enzimas que requieren un cofactor para la oxidación de anillos aromáticos y otros dobles enlaces, son posibles aplicaciones de las nuevas proteínas aplicaciones industriales en procesos de biodegradación, conversión de biomasa en combustibles u otros agentes químicos, conversión de contaminantes de aguas residuales, bioprocesamiento de carbón y destoxificación de compuestos orgánicos peligrosos. La identificación de mejoras en las aplicaciones anteriores se facilita por los métodos de la invención por medio de la fijación preferente como objetivos de restos (posiciones) de aminoácidos funcionales que tienen más probabilidad de contribuir a la actividad o propiedad deseada para la que se buscan las mejoras. 9. Métodos de Mutagénesis Combinatoria En la estrategia de mutación combinatoria beneficiosa, se generan secuencias codificantes que representan combinaciones de las mutaciones beneficiosas identificadas por LTM. Estas combinaciones pueden ser combinaciones de diferentes mutaciones beneficiosas dentro de una sola CDR, mutaciones dentro de dos o más CDR dentro de una sola cadena de anticuerpo o mutaciones dentro de las CDR de diferentes cadenas de anticuerpo. Una estrategia combinatoria se parece al método WTM con la excepción de que las sustituciones de codones seleccionados dentro de las CDR son las diferentes sustituciones de aminoácidos beneficiosas identificadas por LTM. De esta manera, no todas las posiciones de los restos en una CDR de anticuerpo contendrán una mutación, y algunas posiciones tendrán múltiples aminoácidos diferentes sustituidos en esa posición. En general, muchas, si no todas las combinaciones de mutaciones beneficiosas dentro de una CDR o una cadena de anticuerpo se representarán por al menos una de las secuencias codificantes de la biblioteca. Como se muestra en la Tabla 1 , esta biblioteca de secuencias codificantes puede prepararse por una modificación del método WTM, con la excepción de que en lugar de poner codones para un solo aminoácido en cada posición diferente en la región codificante variable, los codones que se introducen son los correspondientes a todas las mutaciones beneficiosas detectadas en el método LTM. Para mantener un tamaño manejable de esta biblioteca, las mutaciones pueden limitarse únicamente a una de las dos cadenas: pesada o ligera. En una segunda estrategia, se utilizan fragmentos de genes individuales que contienen una sola región CDR y que tienen una variación de codones que codifica todas las combinaciones de mutaciones beneficiosas dentro de la CDR reconstruida, por ejemplo, por métodos de transposición de genes, para producir secuencias codificantes de cadenas VL y VH que tienen combinaciones de mutaciones beneficiosas en todas las CDR de una cadena dada o en todas las CDR de las dos cadenas. También puede generarse una biblioteca combinatoria de mutaciones por métodos de transposición de genes conocidos, tales como los detallados en la solicitud de patente de Estados Unidos 2003/005439A1 y en la Patente de Estados Unidos N° 6.368.861 y (Stemmer WP (1994) Proc Nati Acad Sci 91 (22): 10747-51), incorporándose todas ellas en este documento como referencia. El método implica la digestión por DNasa I limitada de los clones de mutación mixtos recogidos para producir una serie de fragmentos génicos aleatorios de diversos tamaños predeterminados (por ejemplo, 50-250 pares de bases). Posteriormente, los fragmentos primero se desnaturalizan y después se deja que los diversos fragmentos separados se vuelvan a asociar basándose en regiones complementarias homologas. De esta manera, los fragmentos renaturalizados pueden incorporar diferentes CDR de mutación mixtas en los segmentos re-ensamblados que después se extienden por SOE-PCR como se ha indicado anteriormente, y entonces una quimera re- ensamblada puede incorporar, como mínimo, al menos dos series de mutaciones mixtas de CDR beneficiosas de cada donante fuente de ADN parental. La presente invención se ilustra adicionalmente en los siguientes ejemplos, que no deben considerarse limitantes.

EJEMPLOS A lo largo de los ejemplos se usaron los siguientes materiales y métodos a menos que se indique otra cosa. Materiales y Métodos En general, la practica de la presente invención emplea, a menos que se indique otra cosa, técnicas convencionales de química, biología molecular, tecnología de ADN recombinante, tecnología de PCR, inmunología (especialmente, por ejemplo, tecnología de anticuerpos), sistemas de expresión (por ejemplo, expresión sin células, presentación en fagos, presentación en ribosomas y Profusión™), y cualquier cultivo celular necesario que esté dentro de la experiencia de la técnica y se explique en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); DNA Cloning, Vols. 1 y 2. (D.N. Glover, Ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, Ed. 1984); PCR Handbook Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, Beaucage, Ed. John Wiley & Sons (1999) (Editor); Oxford Handbook of Nucleic Acid Structure, Neidle, Ed., Oxford Univ Press (1999); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis eí al., Academic Press (1990); PCR Essential Techniques: Essential Techniques, Burke, Ed., John Wiley & Son Ltd (1996); The PCR Technique: RT-PCR, Siebert, Ed., Eaton Pub. Co. (1998); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow eí al., C.S H.L. Press, Pub. (1999); Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel eí al., John Wiley & Sons (1992); Large-Scale Mammalian Cell Culture Technology, Lubiniecki, A., Ed., Marcel Dekker, Pub., (1990). Phage Display: A Laboratory Manual, C. Barbas (Ed.), CSHL Press, (2001 ); Antibody Phage Display, P O'Brien (Ed.), Humana Press (2001); Border eí al., presentación en la superficie de levaduras para la selección de bibliotecas de polipéptidos combinatorios, Nature Biotechnology, 15(6):553-7 (1997); Border eí al., presentación en la superficie de levaduras para la evolución dirigida de la expresión de proteínas, afinidad y estabilidad, Methods Enzymol., 328:430-44 (2000); presentación en ribosomas como se describe por Pluckthun eí al. en la Patente de Estados Unidos N° 6.348.315, y Profusión™ como se describe por Szostak eí al. en las Patentes de Estados Unidos N° 6.258.558; 6.261.804; y 6.214.553; Construcción del Gen de Ensayo Como plantillas para las porciones VL y VH (SEC ID N°: 1 y 2, respectivamente) se usaron secuencias Fab de ovalbúmina de tipo silvestre para la construcción de scFv usando PCR y cebadores apropiados (SEC ID N°: 11 y 12) y oligonucleótidos de VH (SEC ID N°: 13-14). Las reacciones de PCR consistían en 2 µl de cada solución madre de oligonucleótido 10 µM, 0,5 µl de ADN polimerasa Pfx (2,5 U/µl), 5 µl de tampón Pfx, 1 µl de dNTP 10 mM, 1 µl de MgSO4 50 mM y 37,5 µl de dH2O y se realizaron a 94°C durante 2 minutos, seguido de 24 ciclos de 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 50°C y 1 minuto a 68°C, seguido de incubación a 68°C durante 5 minutos. Los oligonucleótidos se sintetizaron en el 3900 Oligosynthesizer de Syngen Inc. (San Carlos, CA). Las reacciones PCR de VL y V anteriores después se extrajeron por separado y se purificaron (kit de purificación de PCR Qiagen según las instrucciones del fabricante) y se combinó una alícuota (1 µl) de cada reacción en un tubo nuevo. Por medio de la secuencia enlazadora en el extremo 3' del oligonucleótido inverso de VH (SEC ID N°: 14) y el extremo 5' del oligonucleótido directo de VL (SEC ID N°: 11), la unión complementaria permitió una reacción de ensamblaje por PCR de extensión solapante única (SOE-PCR) para generar el scFv de ovalbúmina de longitud completa. La reacción PCR de scFv de ovalbúmina se extrajo y se purificó (Qiagen) para la posterior digestión con endonucleasas EcoR I y Not I (New England Biolabs según las instrucciones del fabricante). El scFv de ovalbúmina de longitud completa se subclonó en el vector pYD1 y se secuenció para confirmar que no se habían introducido mutaciones, deleciones o inserciones (SEC ID N°: 18) de las PCR anteriores. Una vez verificada la secuencia, la ovalbúmina de VH y V de longitud completa sirve como plantilla de tipo silvestre para las estrategias posteriores de construcción de bibliotecas LTM. Condiciones de PCR Adicionales y Diseño de Cebadores Las condiciones de reacción para las PCR T1 y T2 son: 5 µl de mezcla de oligonucleótidos 10 µM, 0,5 µl de ADN polimerasa Pfx (2,5 U/µl), 5 µl de tampón Pfx (Invitrogen), 1 µl de dNTP 10 mM, 1 µl de MgSO4 50 mM y 37,5 µl de dH2O a 94°C durante 2 minutos, seguido de 24 ciclos de 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 50°C y 1 minuto a 68°C y después incubación a 68°C durante 5 minutos. Las reacciones se realizan usando un aparato de ciclos térmicos programable (MJ Research). Las reacciones de PCR T1 y T2 se purificaron en gel (Qiagen) y se combinaron alícuotas equimolares de las dos para SOE-PCR. SOE-PCR es un método rápido y sencillo para combinar fragmentos de ADN que no requiere sitios de restricción, endonucleasas de restricción ni ADN ligasa. Los productos de las PCR T1 y T2 se diseñan para compartir secuencias complementarias solapantes terminales (Fig. 4) que hibridarían y permitirían la extensión por PCR para producir un gen de scFv de ovalbúmina LTM de longitud completa (Figs. 2 y 4). La reacción de extensión de PCR de scFv usó alícuotas de T1 y T2 (aproximadamente 2 µl de cada uno) con 0,5 µl de ADN polimerasa Pfx (2,5 U/µl), 5 µl de tampón Pfx (Invitrogen), 1 µl de dNTP 10 mM, 1 µl de MgSO4 50 mM y 37,5 µl de dH2O a 94°C durante 2 minutos, seguido de 20 ciclos de 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 50°C y 1 minuto a 68°C y después incubación a 68°C durante 5 minutos.

Se añadió una serie de cebadores con sentido EcoR I 5' específico para el extremo de ovalbúmina (SEC ID N°: 8) y antisentido Not 1 3' de ovalbúmina (SEC ID N° 19) para facilitar la amplificación de ovalbúmina LTM y la incorporación de los sitios de enzimas de restricción en los amplicones de PCR (Figura 4). La reacción de extensión de PCR consistía en 4 µl de solución madre de oligonucleótidos 10 µM, 0,5 µl de ADN polimerasa Pfx (2,5 U/µl), 5 µl de tampón Pfx (Invitrogen), 1 µl de dNTP 10 mM, 1 µl de MgSO4 50 mM y 37,5 µl de dH2O a 94°C durante 2 minutos, seguido de 24 ciclos de 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 50°C y 1 minuto a 68°C y después incubación a 68°C durante 5 minutos. Clonación del Producto de PCR en un Vector de Expresión pYD1 de Células de Levadura El plásmido receptor pYD1 (Figura 6) para la expresión de scFv anti-ovalbúmina se preparó a partir de un hospedador E coli por purificación de plásmidos (Qiagen), digestión con las enzimas de restricción EcoRI y Notl, y se desfosforiló terminalmente con fosfatasa alcalina intestinal de ternero. La unión del vector pYD1 y los productos de SOE-PCR anteriores (digeridos con EcoRl y Notl) antes de la posterior transformación de E. coli (DH5a) se realiza usando técnicas convencionales. Sistema de Expresión en Células de Levadura El pYD1 (Fig. 6) es un vector de expresión diseñado para presentar proteínas de interés en la superficie extracelular de Saccharomyces cerevisiae. Por medio de la subclonación del gen scFv en pYD1 , los scFv se convierten en proteínas de fusión, permitiendo el receptor de aglutinina AGA2 la secreción y presentación en la superficie celular. Transformación de Células Hospedadoras de Levadura con Construcciones AGA2-scFv de pYD1 Se prepararon células hospedadoras de levadura competentes (500 µl) según las instrucciones del fabricante (Zymo Research Frozen-EZ Yeast Kit). En resumen, se mezclaron 500 µl de células competentes con 10-15 µg de ADN de biblioteca de scFv de pYPD1 , después de lo cual se añadieron 5 ml de solución EZ3. La mezcla de células después se incubó durante 45 minutos a 30°C con mezcla ocasional (tres veces). Las células transformadas se centrifugaron y resuspendieron en medio de selección con glucosa (Invitrogen). Inducción de AGA2-scFv Las células se indujeron después del crecimiento en medio de selección con glucosa a 30°C con agitación y condiciones de aireación durante 48 horas hasta DO60o = 7 (DO6oo = 1 representa 107 células/ml). En particular, las células se recogieron y resuspendieron en medio de selección/inducción con galactosa (Invitrogen) hasta que se alcanzó un valor de DO6oo = 0,9 después de 48 horas a 20°C. La expresión de la proteína de fusión Aga2-scFv de pYD1 estaba bien regulada por el promotor GAL1 y dependía de la galactosa disponible en el medio para la inducción del promotor GAL1.

Preparación de Ovalbúmina Biotinilada La biotinilación del antígeno diana ovalbúmina se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Kit de Mareaje Molecular Probes FluoReporter Biotin-XX (n° de catálogo F-2610)). En resumen, se añadieron 300 µl de una solución madre de 1 mg/ml de ovalbúmina (Sigma) a 30 µl de Tampón Bicarbonato Sódico 1 M a pH 8,3 y 5,8 µl de solución de Biotin-XX (solución Biotin-XX 20 mg/ml en DMSO). La mezcla después se incubó durante 1 hora a 25°C, se transfirió a un tubo con filtro micrométrico, se centrifugó y la concentración de proteínas se determinó por absorbancia de la luz a DO28o. Control con FACS de Expresión de AGA2-scFv v Unión de Ovalbúmina Para controlar la inducción y expresión de la construcción de scFv, se recogió una alícuota de células de levadura (8 x 105 células en 40 µl) del medio de cultivo por centrifugación durante 5 minutos a 2300 rpm. Se aspiró el fluido sobrenadante y después el sedimento celular se lavó con 200 µl de tampón PBS/BSA enfriado con hielo (PBS/BSA al 0,5% p/v). Las células se volvieron a sedimentar y el sobrenadante se eliminó antes de la resuspensión en 100 µl de tampón que contenía la ovalbúmina biotinilada (200 nM). Se dejó que las células se unieran a la ovalbúmina a 20°C durante 45 minutos, después de lo cual se lavaron dos veces con tampón PBS/BSA antes de la adición e incubación con estreptavidina-FITC (2 mg/l) durante 30 minutos en hielo. Se realizó otra vuelta de lavado en tampón antes de la resuspensión final en un volumen de 400 µl en PBS/BSA. Las células después se analizaron en FACScan (Becton Dickinson) usando el paquete de software CelIQuest.

EJEMPLO 1 MUTAGÉNESIS LOOK-THROUGH MEJORADA PARA EL DESARROLLO DE ANTICUERPOS DE ALTA AFINIDAD En este ejemplo, se describe la mutagénesis look-through mejorada de un anticuerpo scFv ejemplar. En resumen, se usó mutagénesis look-through mejorada (LTM) para identificar mutaciones de CDR de VH y VL en las regiones CDR de VH y VL de un anticuerpo que mejoran la afinidad de unión a un antígeno elegido, es decir, para identificar los restos (posiciones) de aminoácidos funcionales o puntos calientes que confieren la actividad de unión. El objetivo de la mutagénesis look-through mejorada (LTM2) es introducir una sustitución seleccionada en posiciones diana en una región de un polipéptido, por ejemplo, las regiones CDR de la cadena de anticuerpo variable. Inicialmente, se construyeron bibliotecas codificantes tanto para la cadena VH como para la cadena V . Se identificaron secuencias de aminoácidos de las cadenas de VL y VH de anticuerpo anti-ovalbúmina de referencia (véanse las SEC ID N°: 3-4) y se seleccionó una biblioteca de secuencias de partida para las regiones CDR1 , CDR2 y CDR3 de la cadena de VH del anticuerpo anti-ovalbúmina identificadas por las SEC ID N°: 5, 6 y 7, respectivamente, y las de las CDR1 , CDR2 y CDR3 de la cadena V identificadas por la SEC ID N°: 8, 9 y 10. Además, cada biblioteca de secuencias codificantes de VH O V contiene mutaciones para un aminoácido funcional representativo seleccionado en una, dos o las tres CDR en la cadena seleccionada. Para el análisis se seleccionaron aminoácidos predeterminados del segmento CDR2 de VH (DINPSNGYTIYNQKFKG) (posiciones 56 a 69) de la sección de VH del anticuerpo anti-ovalbúmina de tipo silvestre SLEWIG-DINPSNGYTIYNQKFKG-FKGKATL. Las secuencias polipeptídicas SLEWIG y KATLTVD son porciones de las regiones flanqueantes de V 2 y 3 que flanquean respectivamente CDR2 de VH. En el diseño y la síntesis de oligonucleótidos LTM de CDR de VH y V , las longitudes de secuencia flanqueante de aproximadamente 21 pares de bases permiten el solapamiento complementario y la SOE-PCR. A continuación se muestra un oligonucleótido de referencia que codifica la secuencia de tipo silvestre CDR-H2 anterior (en negrita) (SEC ID N°: 16) que contiene las porciones VH2 y VH3 flanqueantes (letras minúsculas en la secuencia mostrada a continuación): La LTM de leucina de la CDR2 de VH implica la sustitución seriada sólo de una leucina cada vez, en todas o en una pluralidad de posiciones de CDR2. La Fig. 3 ilustra la aplicación de LTM para introducir un aminoácido leucina en cada uno de los catorce restos (posiciones 56-69) de la región CDR2 de VH del scFv anti-ovalbúmina. Para realizar la LTM de leucina, se sintetizaron catorce oligonucleótidos distintos que codificaban todas las posibles variantes posicionales de leucina de CDR2 de VH (SEC ID N°: 17-33), teniendo cada una sólo un codón de reemplazo de leucina (en negrita) bordeado por la secuencia de tipo silvestre anti-ovalbúmina. Entonces se genera un total de catorce péptidos diferentes y no se produce ninguna secuencia de sustitución múltiple o "indeseada". En una alternativa a la introducción de leucina en una "pluralidad de posiciones", se puede elegir no incluir uno o más de los oligonucleótidos LTM de CDR2 anteriores. Por lo tanto, por ejemplo, pueden excluirse los oligonucleótidos LTM (SEC ID N°: 20 y 21) para las posiciones 59 y 60 respectivamente y de esta manera podría realizarse una mutagénesis look-through mejorada (LTM2) en las posiciones 56-58 y 61 a 69. Basándose en las diferentes combinaciones del uso de una "pluralidad de posiciones", pueden realizarse permutaciones de LTM2 sin restringirse necesariamente a todas y cada una de las posiciones dentro de una CDR. La estrategia para fabricar la biblioteca LTM de CDR2 se resume en las Figs. 2 y 4. Se realizan reacciones PCR separadas, T1 y T2, usando pares de cebadores de FR1 con sentido (SEC ID N°: 34) y FR2 antisentido (SEC ID N°: 35) y los oligonucleótidos de leucina LTM de CDR-2 reunidos anteriores (SEC ID N°: 18-33) con el cebador antisentido de FR4 (SEC ID N°: 36) respectivamente. El cebador de FR1 con sentido contiene secuencias del extremo 5' del gen de ovalbúmina y FR2 antisentido contiene la secuencia antisentido del extremo 3' de la región flanqueante 2 de ovalbúmina, de forma que la CDR1 de ovalbúmina y las regiones flanqueantes 1 y 2 se amplificaron en la reacción PCR T1 (Figs. 2A y 2B). El cebador FR4 AS contiene una secuencia antisentido del extremo 3' del gen de ovalbúmina, los oligonucleótidos LTM CDR2 contienen secuencias del extremo 5' de la región CDR2 de ovalbúmina con las mutaciones LTM de codones de CDR2 incorporadas para amplificar la porción restante de ovalbúmina (fragmento CDR2, FR3, CDR3, FR4 y el segmento VL entero) al mismo tiempo que incorpora el codón o condones mutagénicos. Se crearon mutaciones de CDR dobles y triples (en diferentes combinaciones de CDR1 , 2 y 3) como se ha indicado anteriormente, pero en lugar de usar el gen de ovalbúmina de tipo silvestre como plantilla de PCR, se seleccionó una biblioteca de ovalbúmina LTM generada previamente. Por ejemplo, para crear cadenas VH en las que tanto CDR1 como CDR2 están mutadas con CDR3 de tipo silvestre y segmentos VL de tipo silvestre, se usaron los genes mutantes LTM de CDR2 previamente construidos como plantillas y después se realizó SOE-PCR para incorporar los oligonucleótidos de CDR1 para generar las mutaciones LTM dobles (resumido en las Figuras 2 y 4). En este ejemplo, la reacción PCR T3 usó los pares de cebadores FR1 con sentido (SEC ID N°: 34) y FR5 antisentido (SEC I D N°: 37) para amplificar la región flanqueante 1 (FR1 ). La reacción PCR T4 usó los oligonucleótidos LTM de histidina de CDR1 reunidos (SEC ID N°: 38-41 ) con el cebador FR4 antisentido (SEC ID N°: 36) par amplificar las porciones restantes FR2, CDR2 LTM, FR3, CDR3, FR4 y VL de ovalbúmina (Fig. 4). Después, las reacciones PCR T3 y T4 se purificaron y se combinaron alícuotas equimolares de ambas para SOE-PCR (Fig. 4) para producir una biblioteca LTM doble scFv His CDR1 y Leu CDR2. Después se añadió una serie de cebadores con sentido Eco Rl 5' específico de extremo de ovalbúmina (SEC ID N° 13) y antisentido Not\ 3' de ovalbúmina (SEC ID N°: 12) para facilitar la amplificación de ovalbúmina LTM y la clonación en el vector de expresión pYPD1. La biblioteca LTM doble His CDR1 y Leu CDR2 después se usó como plantilla para incorporar adicionalmente oligonucleótidos LTM de CDR3 para obtener las bibliotecas LTM de CDR triples. Por medio de la utilización progresiva de las bibliotecas LTM individual y doble, se creó una serie más compleja de combinaciones de bibliotecas LTM en las CDR de VH y V . Por ejemplo, una vez construida la biblioteca LTM Triple de VH CDR1 , CDR2 y CDR3, diseñada como la plantilla de biblioteca 111 en la fila superior de la Fig. 5, la introducción de LTM VL CDR1 en las plantillas VH 111 produce una biblioteca de 4 LTM CDR (Fig. 5). El gráfico FACS mostrado en la Fig. 7 ilustra que se generaron moléculas de unión scFv a ovalbúmina en la construcción de la biblioteca anterior. En particular, las moléculas de ovalbúmina biotinilada y FITC-estreptavidina (la línea "verde") produjeron una respuesta señal máxima de una magnitud mayor en comparación con la señal procedente del vector pYD1 vacío con ovalbúmina biotinilada y FITC-estreptavidina (área sombreada oscura).

EJEMPLO 2 SELECCIÓN DE BIBLIOTECA DE ALTO RENDIMIENTO PARA EL DESARROLLO DE ANTICUERPOS CON MEJORES PROPIEDADES En este ejemplo se describe la selección de alto rendimiento de anticuerpos monocatenarios ejemplares con mejores propiedades. La Figura 9 representa un esquema generalizado para enriquecer los clones de unión de alta afinidad específicos de ovalbúmina de la biblioteca LTM2 scFv heterogénea. Después de la inducción en medio con galactosa, la biblioteca de células de levadura (107) se resuspendió en tampón PBS/BSA (volumen total de 500 µl). Se añadió ovalbúmina biotinilada a la suspensión de levadura para una concentración final de 50 nM y se incubó a 25°C durante 2-3 horas con agitación. Las células de levadura se sedimentaron, se lavaron 3 veces y se resuspendieron en 300 µl de tampón PBS/BSA enfriado con hielo o tampón al que se habían añadido 1 x 108 perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina. La mezcla de células y perlas se incubó en hielo durante 2 minutos con mezcla suave por inversión para formar un complejo de unión que consistía en células que expresaban scFv de alta afinidad en levadura, ovalbúmina biotinilada y perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina. La columna (tubos) que contenía los complejos unidos después se aplicó al soporte de columna magnética durante 2 minutos, después de lo cual el sobrenadante se retiró por aspiración. La columna se retiró del soporte magnético y se añadieron 300 µl de PBS/BSA enfriado con hielo para resuspender el material unido. Los complejos unidos se lavaron de nuevo para retirar los clones de scFv de baja afinidad y otras células unidas de manera no específica. La columna después se retiró del soporte magnético, después de lo cual se añadió 1 ml de medio de selección de glucosa a las células de levadura recuperadas durante una incubación de 4 h a 30°C. El soporte magnético después se volvió a aplicar al tubo de cultivo para retirar todas las perlas magnéticas restantes. El cultivo de levadura después se dejó crecer en medio de selección de glucosa a 30°C durante 48 horas antes de la inducción de scFv en medio de selección con galactosa. En la segunda vuelta de selección, la concentración de ovalbúmina se redujo de 10 nM a 0,5 nM. La unión de ovalbúmina, la formación de complejos y el enriquecimiento de las células de levadura y el segundo cultivo se realizaron como se ha descrito anteriormente. Para la tercera vuelta de selección final, la concentración de ovalbúmina se redujo adicionalmente a 0J nM. La CE50 de unión a ovalbúmina o "capacidad" de cada una de las vueltas anteriores de enriquecimiento progresivo se evaluó por FACS (véase la Fig. 8). Los resultados mostrados en la Fig. 8 ilustran la biblioteca de levadura LTM de CDR2 de VH transformada inicialmente, sin selección previa (círculos negros), así como la capacidad global en términos de porcentaje de moléculas que se unen (eje y). Los clones que expresaban scFv anti-ovalbúmina funcionales y su afinidad, medida por la CE50 de ovalbúmina (eje x), fueron inferiores en comparación con el anticuerpo anti-ovalbúmina de tipo silvestre. Sin embargo, después de una vuelta de selección (10 nM), la curva de "capacidad" (triángulos claros) mejoró en el porcentaje de moléculas que se unían y el valor de CE50 para la unión de ovalbúmina estaba en el mismo intervalo nanomolar que la ovalbúmina de tipo silvestre. Después de la segunda vuelta de selección (OJ nM), la población enriquecida (triángulos negros) presentó una "capacidad" global que se aproximaba a la de la ovalbúmina de tipo silvestre (cuadrados negros) (Fig. 10). Las células de levadura recuperadas de la segunda vuelta de enriquecimiento después se cultivaron en medio sólido para aislar clones individuales para el análisis de unión individual y la determinación de la secuencia. En una metodología alternativa, las bibliotecas de células de levadura LTM2 se enriquecieron para clones de scFv anti-ovalbúmina de alta afinidad por FACS. La construcción de la biblioteca, la transformación, la propagación del medio líquido y la inducción se realizaron como se ha indicado anteriormente. Después de la inducción de scFv, las células se incubaron con ovalbúmina biotinilada a concentraciones de saturación (400 nM) durante 3 horas a 25°C. Después de lavar las células, se realizó un seguimiento frío de 40 horas usando ovalbúmina no marcada (1 µM) a 25°C. Las células después se lavaron dos veces con tampón PBS/BSA, se marcaron con Estreptavidina-PE (2 mg/ml) anti-HIS-FITC (25 nM) durante 30 minutos en hielo, se lavaron y se resuspendieron como se ha descrito anteriormente para el análisis FACS.

La anti-ovalbúmina de tipo silvestre se analizó por FACS ¡nicialmente para proporcionar un patrón de señales de referencia para la clasificación por FACS de la biblioteca LTM de levadura (Figura 8, panel de la izquierda). A partir del gráfico FACS de ovalbúmina, se trazó una entrada de selección (el trapezoide R1 ) para obtener sólo los clones que expresaban la fusión de scFv (como se detecta por anti-HIS-FITC) y que presentarían concomitantemente una mayor afinidad de unión a ovalbúmina (una señal PE más fuerte) en comparación con la anti-ovalbúmina de tipo silvestre. La Figura 8 (panel central) demuestra que aproximadamente 5% de la biblioteca LTM total investigada se seleccionó por la entrada R1. Después de la recogida por FACS de estos clones de scFv anti-ovalbúmina, se realizó un análisis FACS posterior a la clasificación (Figura 8, panel de la derecha) para confirmar que >80% de los clones de scFv anti-ovalbúmina previos a la selección estaban dentro de los criterios predeterminados. Los clones de scFv clasificados por FACS después se cultivaron en medio de selección con glucosa a 30°C durante 48 horas y se cultivaron en medio sólido para aislar los clones individuales. Los clones después se cultivaron en medio de selección con glucosa, se volvieron a inducir en medio de selección con galactosa y se analizaron con respecto a sus valores de CE50 y/o características Koff.

EJEMPLO 3 SELECCIÓN DE BIBLIOTECAS DE ALTO RENDIMIENTO PARA EL DESARROLLO DE ANTICUERPOS CON VELOCIDADES Koff MEJORADAS En este ejemplo, se describe la selección de alto rendimiento de anticuerpos monocatenarios ejemplares con velocidades K0f. mejoradas. En resumen, se cultivaron clones preclasificados del ejemplo anterior durante una noche en medio de selección con glucosa y después se colocaron en placas en medio sólido para aislar colonias individuales. A partir de las colonias individuales, se desarrollaron cultivos líquidos de clones en medio de selección con glucosa a 30°C con agitación durante 48 horas antes de la sedimentación y resuspensión en medio de selección con galactosa durante el periodo de tiempo DO aproximado. Como la preclasificación FACS enriquece (aproximadamente en 80%) pero no elimina todos los clones indeseables, el valor de CE50 de los clones aislados se caracterizó para eliminar los que presentaban valores de unión inferiores al anticuerpo de referencia anti-ovalbúmina de tipo silvestre (como se ha detallado anteriormente). Sólo los aislados con valores de CE50 comparables o superiores se seleccionaron para un análisis de K0ff adicional. En la Fig. 11 se muestra un esquema para analizar la cinética de moléculas candidatas. Específicamente, se sedimentaron células de levadura (aproximadamente 5 x 106) después de la inducción en medio de selección con galactosa y se resuspendieron en tampón PBS/BSA (1 ml). Después se añadió ovalbúmina biotinilada (concentración final 400 nM) a las células resuspendidas y se dejaron incubar durante 2 horas a 25°C con mezcla suave continua. El complejo de ovalbúmina biotinilada y células de levadura después se lavó y resuspendió en tampón PBS/BSA y después se añadió ovalbúmina no marcada (a una concentración final de 1 µM) a la mezcla de células de levadura que se incubó adicionalmente durante 24 horas a 25°C. Después se tomaron alícuotas de muestra a intervalos regulares cada 2 horas durante las siguientes 24 horas. Las mezclas de células después se lavaron y resuspendieron en tampón PBS/BSA enfriado y anticuerpo de tinción a-SA PE (2 µg/ml). Después de la incubación durante 30 minutos en hielo con mezcla periódica, la mezcla de células después se lavó dos veces y se analizó por FACS como se ha indicado anteriormente. Los resultados de los ensayos K0ff (Fig. 12) demostraron que dos clones (es decir, 3ss-35; 3ss-30) tenían una mayor K0ff relativa en comparación con el anticuerpo anti-ovalbúmina de tipo silvestre. En otras palabras, cuando se cambió la ovalbúmina biotinilada unida por la ovalbúmina no marcada durante el periodo de muestreo de 24 horas, 3ss-35 y 3ss-30 liberaron la ovalbúmina biotinilada unida previamente a una velocidad mucho menor (círculos y triángulos respectivamente en la Fig. 12) en comparación con el anticuerpo anti-ovalbúmina de tipo silvestre (cuadrados Fig. 12) que presentó una reducción mucho más rápida en MFI (intensidad media de fluorescencia) durante las primeras 8 horas.

EJEMPLO 4 SELECCIÓN DE BIBLIOTECA DE ALTO RENDIMIENTO PARA EL DESARROLLO DE ANTICUERPOS CON MEJOR CE50 DE UNIÓN En este ejemplo, se describe la selección de alto rendimiento de anticuerpos monocatenarios ejemplares con mejor actividad de unión CE50. En resumen, una cantidad predeterminada de scFv anti-ovalbúmina en células de levadura (8 x 105 células en 40 µl) (biblioteca de tipo silvestre y LTM) se incubó con diluciones en serie 1 :4 de ovalbúmina biotinilada (concentraciones finales 200 nM, 50 nM, 12,5 nM, 3J nM, 0,78 nM y 0J9 nM en un volumen total de 80 µl) a 20°C durante 45 minutos, seguido de 5-10 minutos en hielo. Las células de levadura después se lavaron y resuspendieron en 5 ml de tampón PBS/BSA, después de lo cual se añadió estreptavidina-PE (2 mg/ml) y aHIS-FITC (25 nM) para marcar las células durante una incubación de 30 minutos en hielo. Se realizó otra vuelta de lavado antes de la resuspensión en 400 µl de tampón PBS/BSA y análisis en FACScan usando el software CelIQuest. La Figura13 ejemplifica una subserie de clones mejorados, con respecto a anti-ovalbúmina, con menores valores de CE50 (las curvas de unión se han desplazado a la izquierda con respecto al tipo silvestre). Se muestran estos valores de CE50 relativos en comparación con la anti-ovalbúmina de tipo silvestre y el aumento relativo en veces. Por ejemplo, el clon H3 S101Q presentó una mejora de 2,1 veces en la unión a ovalbúmina. La identificación de nomenclatura de este clon H3 S101Q indica que procedía de una biblioteca individual LTM de glutamina de CDR de VH. Los anticuerpos de mejor afinidad de unión resultantes producidos proporcionan un mapa de mutaciones de aminoácidos beneficiosas en las CDR de VH y VL del anticuerpo anti-ovalbúmina que estaban asociadas con una actividad de unión mejorada. En la Fig. 13 se muestran las supuestas mutaciones de CDR de VH y VL de aminoácidos individuales asociadas con anticuerpos scFv con afinidad mejorada. Se encontraron mutaciones en cada CDR de VH y V y mutaciones de CDR individuales, dobles y triples, e incluyen cada uno de los nueve aminoácidos diferentes ensayados. La Figura 13 ejemplifica que pueden recuperarse cuatro clones VH CDR-H3 H3 G102K independientes identificados a partir de la selección de CE50 y/o cinética (K0f.) anterior. El mutante doble LTM VL L1 L2 S166H S193H de la selección de CE50 (Fig. 14) también ilustra que se mejora la unión a ovalbúmina cuando hay una interacción sinérgica entre estas dos sustituciones CDR1 S166H y CDR2 S193H. Los resultados también indican que (véase la Fig. 14) pueden obtenerse secuencias únicas para anticuerpos scFv anti-ovalbúmina seleccionados de acuerdo con el método de CE50 y/o K0ff anterior usando secuencias codificantes que contienen mutaciones individuales en una, dos o las tres CDR en las cadenas VH O VL. Se descubrió que algunas de las sustituciones de aminoácidos se recuperaban en una mayor preponderancia en ciertas CDR. Por ejemplo, en la CDR1 de VH había siete sustituciones de Lys individuales independientes en las posiciones D30K, Y31K, M33K y W35K. La alta preponderancia de Lys en CDR1 indica que se produce una mejor unión a ovalbúmina cuando hay un aumento neto de cargas positivas aportadas por CDR1 durante el contacto con el antígeno. El examen de las sustituciones de aminoácidos recuperadas también reveló que se produce una sustitución favorable para CDR2 y CDR3 de VH. Por ejemplo, se observó que se producen múltiples reemplazos de Lys dispersas en CDR2, mientras que CDR3 presenta reemplazos G102K y G104K concentrados. Los resultados también revelan que, además, había múltiples reemplazos de Gln, otro aminoácido polar, en CDR3 en las posiciones 107, 108, 109 y 111. Estos resultados indican que hay un único "motivo químico" de cargas negativas y/o hidrófilas correspondientes sobre la ovalbúmina que entra en contacto con estos restos de CDR reemplazados. Por consiguiente, se ordenaron las mutaciones de unión a antígeno mejorada recuperadas en cada CDR después de la mutagénesis de todas las CDR por cada uno de los nueve aminoácidos diferentes ensayados y los resultados se muestran en la Fig. 14. Se determinó que cada CDR también presentaba al menos una posición en la que no se encontraron mutaciones, por ejemplo, las posiciones Ile57, Asn58 y Gly62 de CDR2 de V , las posiciones Tyr103, Ser105, Arg106 y Alai 21 de la región CDR3 de VH. Para las posiciones de VL, se descubrió que R164, A165, V169 y N174 de CDR1 , N 194 de CDR2, E208 y D209 de CDR3 no se reemplazaban después de una selección extensiva. Estos resultados indican que además de las posiciones de reemplazo de "puntos calientes" y cualquier tipo de aminoácido preferido recuperado como se ha descrito anteriormente, también hay posiciones de CDR de "puntos fríos". Las posiciones de "puntos fríos" indican que cualquiera de las sustituciones no confiere una ventaja de unión al antígeno o perjudica a las propiedades de unión.

EJEMPLO 5 MÉTODOS PARA REALIZAR MUTAGÉNESIS COMBINATORIAS BENEFICIOSAS En este ejemplo, se describen métodos para realizar mutagénesis combinatorias beneficiosas. En resumen, el método incorpora las mutaciones beneficiosas encontradas usando LTM y las combina en una sola biblioteca. Por lo tanto, en este proceso pueden explorarse efectos sinérgicos de múltiples mutaciones. Esta estrategia combinatoria se parece al método WTM con la excepción de que las sustituciones de codones seleccionados dentro de las CDR son las sustituciones de aminoácidos beneficiosas diferentes identificadas por LTM. De esta manera, no todas las posiciones de restos en una CDR de anticuerpo contendrán una mutación y algunas posiciones tendrán múltiples aminoácidos diferentes sustituidos en esa posición. En general, muchas, si no todas las combinaciones de mutaciones beneficiosas dentro de una CDR o una cadena de anticuerpo se representarán por al menos una de las secuencias codificantes de la biblioteca. Como se verá más adelante, esta biblioteca de secuencias codificantes puede prepararse por una modificación del método WTM, con la excepción de que en lugar de poner codones para un solo aminoácido en cada posición diferente en la región codificante variable, los codones que se introducen son los correspondientes a todas las mutaciones beneficiosas detectadas en el método LTM. En este ejemplo, se construye una biblioteca de CDR1 de cadena pesada combinatoria beneficiosa usando las variantes anti-ovalbúmina mejoradas descritas en la Figura 14. La primera posición de aminoácido 30, codifica (como mínimo) Asp (tipo silvestre) y Lys; la posición 31 , Tyr y Lys; la posición 32 Asn y Tyr; la posición 33 Met, His y Lys; la posición 34 Asp y Pro; la posición 35 Trp y Lys. La secuencia de ADN se representa por un oligonucleótido de CDR1 degenerado que incorpora las mutaciones combinatorias beneficiosas identificadas a partir del análisis LTM (Tabla 1). Tabla 1 Posibilidades de bases de nucleótidos de 5' a 3' Puede realizarse un proceso similar con todos los bucles de CDR para producir una biblioteca beneficiosa 6-CDR, o pueden producirse sub-bibliotecas y seleccionarse en combinación. Por ejemplo, si el tamaño de la biblioteca es demasiado grande como para seleccionarse en una sola biblioteca, entonces pueden producirse sub-bibliotecas más pequeñas. Por ejemplo, puede producirse una biblioteca de cadena pesada 3-CDR y una biblioteca de cadena ligera 3-CDR para conseguir mayores eficacias. Después de la selección, las mutaciones beneficiosas de las bibliotecas de cadena pesada y ligera pueden combinarse adicionalmente en una sola biblioteca que incorpore mutaciones en los bucles apropiados.

Equivalentes Los especialistas en la técnica reconocerán, o podrán averiguar usando sólo la experimentación rutinaria, muchos equivalentes de las modalidades específicas de la invención descritas en este documento. Se entiende que estos equivalentes están incluidos en las siguientes reivindicaciones.

Claims (66)

REIVINDICACIONES

1.- Un método para distinguir uno o más restos aminoacídicos funcionales de restos aminoacídicos no funcionales dentro de un polipéptido, que comprende: seleccionar uno o más restos aminoacídicos dentro de la secuencia de aminoácidos del polipéptido; determinar un resto aminoacídico para sustituir a uno o más de los restos aminoacídicos seleccionados; sintetizar polinucleótidos que codifican el polipéptido o una porción del mismo que comprende los restos aminoacídicos seleccionados, representado colectivamente los polinucleótidos posibles sustituciones de aminoácidos variantes de acuerdo con los siguientes criterios: i) conteniendo cada polinucleótido en cada posición de codón en la región definida un codón necesario para la síntesis del resto aminoacídico del polipéptido o un codón para uno de los restos aminoacídicos predeterminados, y ii) sin que contenga ningún polinucleótido más de un codón para el resto aminoacídico predeterminado, generando de esta manera una biblioteca de expresión que contiene los polinucleótidos; expresar la biblioteca de expresión para producir análogos de polipéptidos; y seleccionar los análogos de polipéptidos con respecto a una alteración en una propiedad medible de tal forma que uno o más restos aminoacídicos dentro del polipéptido, o la porción del mismo, se identifiquen como aminoácidos que contribuyen a la propiedad medible y, por lo tanto, se distingan de un resto aminoacídico no funcional.

2.- El método de la reivindicación 1 , donde el resto o restos aminoacídicos que se identifican como restos que contribuyen a una propiedad medible se considera adecuado para mutagénesis.

3.- El método de la reivindicación 1 , donde el resto o restos no funcionales se consideran no adecuados para mutagénesis.

4.- El método de la reivindicación 11 , donde se mutagenizan exclusivamente uno o más restos aminoacídicos funcionales.

5.- El método de la reivindicación 2, donde la mutagénesis se selecciona entre el grupo consistente en mutagénesis look-through (LTM), mutagénesis walk-through (WTM) o una combinación de las mismas.

6.- El método de la reivindicación 1, donde el polipéptido es un anticuerpo o un fragmento del mismo.

7.- El método de la reivindicación 6, donde la propiedad medible se selecciona entre el grupo consistente en especificidad de unión, avidez de unión, afinidad de unión, unión a receptor Fc, glicosilación, unión al complemento, estabilidad de la vida media, solubilidad, estabilidad térmica, actividad catalítica y actividad enzimática.

8.- El método de la reivindicación 1 , donde el método comprende además la etapa de identificar un polinucleótido que codifica un análogo de polipéptido seleccionado que tiene una alteración en una propiedad medible.

9.- El método de la reivindicación 8, donde la alteración en una propiedad medible es una propiedad mejorada.

10.- El método de la reivindicación 9, donde la propiedad mejorada es la unión a un antígeno con alta afinidad.

11.- El método de la reivindicación 9, donde la propiedad mejorada es una función efectora mejorada.

12.- El método de la reivindicación 10, donde el antígeno es un agente terapéutico en una enfermedad o trastorno humano.

13.- El método de la reivindicación 1, donde la selección comprende, poner en contacto un polipéptido con un sustrato diana, estando asociado el polipéptido con el polinucleótido que codifica el polipéptido, estando asociado el polinucleótido o polipéptido con un resto detectable, de tal forma que se detecte un polipéptido variante capaz de unirse a un sustrato diana y de esta manera se identifique como el polipéptido codificado por el polinucleótido.

14.- El método de la reivindicación 13, donde el resto detectable se selecciona entre el grupo consistente en un resto fluorescente, un resto UV y un resto de absorción de luz visible.

15.- El método de la reivindicación 13, donde el resto detectable se selecciona entre el grupo consistente en un resto de biotina, un resto GST, un resto de señalización inmunológica myc y un resto de señal His.

16.- El método de la reivindicación 13, donde el polinucleótido se asocia con el análogo de polipéptido usando presentación de expresión seleccionada entre el grupo consistente en presentación en ribosomas, presentación en polisomas, presentación en fagos, presentación en procariotas (bacteriana), presentación en levadura, presentación en células eucariotas y presentación de bibliotecas ordenadas.

17.- El método de la reivindicación 1 , donde el polipéptido es un anticuerpo monocatenario (scFV).

18.- El método de la reivindicación 1 , donde la región definida comprende un dominio funcional del polipéptido.

19.- El método de la reivindicación 1 , donde la región definida comprende una CDR o una porción de la misma seleccionada entre el grupo consistente en CDR1 , CDR2, CDR3, CDR4, CDR5, CDR6 y una combinación de las mismas.

20.- El método de la reivindicación 1 , donde la región definida es una región flanqueante de anticuerpo que comprende un domino seleccionado entre el grupo consistente en FR1, FR2, FR3, FR4 y una combinación de las mismas.

21.- El método de la reivindicación 1 , donde la región definida es una región efectora de anticuerpo que comprende un dominio seleccionado entre el grupo consistente en un sitio de unión al complemento y una región de unión al receptor Fc.

22.- El método de la reivindicación 1 , donde el resto aminoacídico predeterminado se selecciona entre el grupo consistente en Ser, Thr, Asn, Gln, Tyr, Cys, His, Glu, Asp, Lys, Arg, Ala, Gly, lie, Leu, Met, Phe, Pro, Trp y Val.

23.- Un método para generar una biblioteca de análogos de polipéptidos en la que aparece un aminoácido predeterminado en una o más posiciones de aminoácidos funcionales en una región definida del polipéptido, que comprende: seleccionar una o más posiciones de aminoácidos funcionales en una región definida de la secuencia de aminoácidos del polipéptido; determinar un resto aminoacídico para sustituir en cada posición de aminoácido funcional dentro de la región definida; sintetizar polinucleótidos individuales que codifican la región definida, representando colectivamente los polinucleótidos posibles polinucleótidos variantes de acuerdo con los siguientes criterios: i) conteniendo cada polinucleótido en cada posición de codón de aminoácido funcional en la región definida un codón necesario para la síntesis del resto aminoacídico del polipéptido o un codón para el resto aminoacídico predeterminado, y ii) sin que contenga ningún polinucleótido más de un codón para el resto aminoacídico predeterminado, generando de esta manera una biblioteca de polinucleótidos en la que el resto aminoacídico predeterminado aparece en cada posición de aminoácido funcional dentro de la región definida.

24.- El método de la reivindicación 23, donde los polinucleótidos se reúnen.

25.- El método de la reivindicación 23, donde se mutagenizan dos o más posiciones de aminoácidos funcionales dentro de una región o regiones definidas dentro del polipéptido.

26.- El método de la reivindicación 25, donde se selecciona el mismo aminoácido predeterminado para la sustitución dentro de cada una de las dos o más posiciones de aminoácidos funcionales.

27.- El método de la reivindicación 23, donde se seleccionan diferentes aminoácidos predeterminados para la sustitución dentro de cada una de las dos o más posiciones de aminoácidos funcionales, respectivamente.

28.- El método de la reivindicación 27, donde la región definida o las regiones definidas comprenden un dominio funcional del polipéptido.

29.- El método de la reivindicación 28, donde el dominio funcional se selecciona entre el grupo consistente en un sitio de unión de anticuerpo, una región flanqueante de anticuerpo, una región efectora de anticuerpo, un sitio de unión a receptor y un sitio catalítico.

30.- El método de la reivindicación 28, donde el sitio de unión de anticuerpo o la porción del mismo comprende un domino de CDR seleccionado entre el grupo consistente en CDR1 , CDR2, CDR3, CDR4, CDR5, CDR6 o una combinación de las mismas.

31.- El método de la reivindicación 28, donde la región flanqueante de anticuerpo comprende un domino seleccionado entre el grupo consistente en FR1 , FR2, FR3, FR4 y una combinación de las mismas.

32.- El método de la reivindicación 28, donde la región efectora de anticuerpo comprende un dominio seleccionado entre el grupo consistente en un sitio de unión al complemento y una región de unión a Fc.

33.- El método de la reivindicación 23, donde el resto aminoacídico predeterminado se selecciona entre el grupo consistente en Ser, Thr, Asn, Gln, Tyr, Cys, His, Glu, Asp, Lys, Arg, Ala, Gly, lie, Leu, Met, Phe, Pro, Trp y Val.

34.- El método de la reivindicación 23, donde la región definida comprende al menos de aproximadamente 3 a 60 aminoácidos.

35.- El método de la reivindicación 23, donde los polinucleótidos se sintetizan como bibliotecas de expresión.

36.- El método de la reivindicación 23, donde los polinucleótidos se sintetizan usando medios enzimáticos.

37.- El método de la reivindicación 23, donde los polinucleótidos se sintetizan usando reacción en cadena de la polimerasa.

38.- El método de la reivindicación 23, donde la biblioteca es una biblioteca de expresión seleccionada entre el grupo consistente en una biblioteca de presentación en ribosomas, una biblioteca de presentación en polisomas, una biblioteca de presentación procariótica (bacteriana), una biblioteca de presentación en levadura, una biblioteca de presentación en células eucariotas y una biblioteca de presentación ordenada.

39.- El método de la reivindicación 23, donde uno o más restos aminoacídicos funcionales se mutagenizan exclusivamente.

40.- Una biblioteca de análogos de polipéptidos preparados por el método de la reivindicación 23.

41.- Una biblioteca de polinucleótidos que codifican análogos de polipéptidos que comprenden uno o más restos aminoacídicos funcionales dentro de una región definida donde un resto aminoacídico predeterminado se sustituye en cada posición de aminoácido funcional dentro de la región definida, representando colectivamente los polinucleótidos todas las variantes posibles de acuerdo con los siguientes criterios: i) cada polinucleótido contiene en cada posición de codón en la región definida un codón requerido para el resto aminoacídico del polipéptido o un codón para el resto aminoacídico predeterminado, y ii) ningún polinucleótido contiene más de un codón para el resto aminoacídico predeterminado.

42.- La biblioteca de la reivindicación 41 , donde se mutagenizan exclusivamente uno o más restos aminoacídicos funcionales.

43.- La biblioteca de la reivindicación 41 , donde la biblioteca es una biblioteca de expresión seleccionada entre el grupo consistente en una biblioteca de presentación de fagos, una biblioteca de presentación en ribosomas/polisomas, una biblioteca de presentación en levaduras, una biblioteca de presentación procariótica (bacteriana) y una biblioteca ordenada.

44.- La biblioteca de la reivindicación 41 , donde los polinucleótidos además comprenden uno o más elementos reguladores de la transcripción.

45.- La biblioteca de la reivindicación 44, donde los polinucleótidos, cuando se transcriben y traducen in vitro, se asocian con los polípéptidos codificados por los polinucleótidos correspondientes.

46.- La biblioteca de la reivindicación 45, donde los polinucleótidos se asocian con el polipéptido usando una biblioteca de presentación seleccionada entre el grupo consistente en una biblioteca de presentación en ribosomas, una biblioteca de presentación en polisomas, una biblioteca de presentación procariótica (bacteriana), una biblioteca de presentación en levadura, una biblioteca de presentación en células eucariotas y una biblioteca de presentación ordenada.

47.- La biblioteca de la reivindicación 46, donde los polinucleótidos comprenden ARN.

48.- La biblioteca de la reivindicación 47, donde los polinucleótidos comprenden además un resto detectable.

49.- La biblioteca de la reivindicación 48, donde el resto detectable comprende un resto fluorescente.

50.- La biblioteca de la reivindicación 41 , donde la biblioteca comprende al menos de 45 a 1012 polinucleótidos diferentes.

51- La biblioteca de la reivindicación 41 , donde el polipéptido codifica un polipéptido de unión.

52.- La biblioteca de la reivindicación 41 , donde el polipéptido de unión se selecciona entre el grupo consistente en una región variable de cadena pesada (VH), una región variable de cadena ligera (VL) y un anticuerpo monocatenario (scFv).

53.- La biblioteca de la reivindicación 41, donde la biblioteca se inmoviliza en un soporte sólido.

54.- La biblioteca de la reivindicación 41 , donde el soporte sólido es un microchip.

55.- La biblioteca de la reivindicación 41, donde la biblioteca es una biblioteca ordenada.

56.- Un microchip que comprende una serie ordenada de polinucleótidos inmovilizados de acuerdo con la biblioteca de la reivindicación 41

57.- Un análogo de polipéptido identificado usando la biblioteca de la reivindicación 41 , donde el polipéptido se une a una molécula diana y comprende una región de unión seleccionada entre el grupo consistente en una región variable de cadena pesada (VH), una región variable de cadena ligera (V ) y un anticuerpo monocatenario (scFv).

58.- Un método para identificar una subserie de análogos de polipéptidos que tienen una propiedad deseada, que comprende: seleccionar uno o más aminoácidos funcionales dentro de una región definida de la secuencia de aminoácidos del polipéptido; determinar un resto aminoacídico para sustituir en cada posición de aminoácido funcional dentro de la región definida; sintetizar polinucleótidos que codifican la región definida, representando dichos polinucleótidos colectivamente posibles polinucleótidos variantes de acuerdo con los siguientes criterios: i) conteniendo cada polinucleótido en cada posición de codón en la región definida un codón necesario para la síntesis del resto aminoacídico del polipéptido o un codón para el resto aminoacídico predeterminado, y ii) sin que contenga ningún polinucleótido más de un codón para el resto aminoacídico predeterminado, generando de esta manera una biblioteca de expresión que contiene los polinucleótidos; exponer la biblioteca de expresión a condiciones en las que se expresa la biblioteca; seleccionar la biblioteca expresada para identificar un polipéptido con una propiedad deseada; comparar la propiedad del polipéptido con un criterio de control, donde un polipéptido que corresponde o excede el criterio de control se clasifica como respondedor y un polipéptido que falla el criterio de control se clasifica como no respondedor; clasificar los respondedores y no respondedores en una base de datos; e investigar la base de datos para determinar la secuencia de una subserie de polipéptidos a sintetizar.

59.- El método de la reivindicación 58, donde una o más de las etapas anteriores se realiza con la ayuda de un ordenador.

60.- El método de la reivindicación 58, donde la propiedad se selecciona entre el grupo compuesto por una especificidad de unión alterada, una velocidad de unión alterada (Kon), una velocidad de disociación alterada (K0ff) y combinaciones de las mismas.

61- El método de la reivindicación 58, donde el criterio de control se selecciona entre el grupo consistente en especificidad de unión, avidez de unión, afinidad de unión, función efectora, unión al receptor Fc, glicosilación, unión al complemento, estabilidad de la vida media, solubilidad, estabilidad térmica, actividad catalítica y actividad enzimática.

62.- El método de la reivindicación 58, donde el polipéptido se selecciona entre el grupo consistente en una región variable de cadena pesada (VH), una región variable de cadena ligera (VL) y un anticuerpo monocatenario (scFv).

63.- Un medio adecuado para uso en un dispositivo electrónico que tiene instrucciones para realizar una o más etapas del método de la reivindicación 59.

64.- Un dispositivo para realizar una o más etapas del método de la reivindicación 59.

65.- Una biblioteca de polinucleótidos que codifican anticuerpos o porciones de unión de los mismos que comprende, polinucleótidos que codifican una sustitución de aminoácidos predeterminada en uno o más restos aminoacídicos funcionales, representando colectivamente los polinucleótidos todas las posibles variantes adecuada para mutagénesis para mejorar una propiedad seleccionada entre el grupo consistente en una especificidad de unión alterada, una avidez de unión alterada, una afinidad de unión alterada, una actividad de unión a Fc alterada, una velocidad de unión (K0n) alterada, una velocidad de disociación alterada (K0ff) y combinaciones de las mismas.

66.- Un anticuerpo o porción de unión del mismo derivada de la biblioteca de la reivindicación 65.