ES2609102T3

ES2609102T3 - Mutagénesis por revisión

Info

Publication number: ES2609102T3
Application number: ES04756045.3T
Authority: ES
Inventors: Roberto Crea
Original assignee: Bioren LLC
Current assignee: Bioren LLC
Priority date: 2003-06-27
Filing date: 2004-06-25
Publication date: 2017-04-18
Anticipated expiration: 2024-06-25
Also published as: JP2011182794A; WO2005003345A2; ZA200510460B; NO20060108L; EP1660655B1; AU2004254352A1; CA2542192A1; EP1660655A2; JP4791960B2; BRPI0412007A; RU2005140664A; KR20060034650A; IL172736A0; JP2007524390A; JP5358604B2; US20050136428A1; WO2005003345A3; CN1836041A; CA2542192C

Abstract

Una biblioteca de polipéptidos de expresión de presentación de levaduras que comprende polinucleótidos que codifican análogos de fragmentos variables monocatenarios (scFv) de anticuerpos de serotipo B (BoNT/B) anti toxina nerviosa botulínica, en la que cada scFv comprende (a) un engarce poli-Gly-Ser de SEQ ID NO: 7, (b) una etiqueta poli-His de SEQ ID N.º: 8, (c) una etiqueta myc de SEQ ID N.º: 9 (d) una VH de SEQ ID N.º: 10 y VL de SEQ ID N.º: 11 en la que los residuos de regiones determinantes de complementariedad (CDR) están sustituidas en cada posición de aminoácido dentro de las seis CDR, presentando los polinucleótidos colectivamente todas las posibles combinaciones de variantes de acuerdo con los siguientes criterios: i) cada polinucleótido contiene en cada posición de codón en cada una de las CDR, bien un codón requerido para el residuo de aminoácido de tipo silvestre del polipéptido o bien un codón para el residuo de aminoácido predeterminado y ii) cada polinucleótido contiene no más de un codón para el residuo de aminoácido predeterminado en cada CDR; en la que el residuo de aminoácido predeterminado está seleccionado del grupo que consiste en alanina, leucina, serina, ácido aspártico, glutamina, lisina, histidina, tirosina y prolina y en el que el scFv anti-BoNT/B se expresa como una pareja de fusión con la proteína Aga2.

Description

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Enzymol. 178: 476-515 (1989); Skerra, A. y col., Biotechnology 9: 273-178 (1991)). Las proteínas mutantes se pueden expresar para la secreción en el medio y/o en el citoplasma de la bacteria, como describen M. Better y A. Horwitz, Meth. Enzymol. 178: 476 (1989). En una realización, los dominios individuales que codifican VH y VL están cada uno unidos al extremo 3’ de una secuencia que codifica una secuencia señal, tal como la secuencia señal ompA, phoA o pelB (Lei, S. P. y col., J. Bacterial. 169: 4379 (1987)). Estas fusiones de genes se ensamblan en una construcción dicistrónica, de manera que se pueden expresar a partir de un vector individual y secretarse en el espacio periplásmico de E. coli donde se replegarán y se pueden recuperar en una forma activa. (Skerra, A. y col., Biotechnology 9: 273-278 (1991)). Por ejemplo, los genes de cadena pesada de anticuerpos se pueden expresar simultáneamente con los genes de las cadenas ligeras de anticuerpos que producen anticuerpos o fragmentos de anticuerpos.

Todavía en otra realización de la invención, los polinucleótidos se pueden expresar en células eucariotas tales como levaduras, usando, por ejemplo, presentación en levaduras como se describe, v.g., en las patentes de Estados Unidos números 6.423.538; 6.331.391; y 6.300.065: En este enfoque, los análogos de polipéptidos de la biblioteca se fusionan a un polipéptido que se expresa y se presenta sobre la superficie de la levadura. También se pueden usar otras células eucariotas para la expresión de los polipéptidos de la divulgación tales como células de mamíferos, por ejemplo células de mieloma, células de hibridoma, o célulasde ovarios de hámster chino (CHO). Típicamente, los análogos de polipéptidos cuando se expresan en células de mamíferos se diseñan para que se expresen en el medio de cultivo, o para que se expresen sobre la superficie de tal célula. El anticuerpo o fragmento de anticuerpos se puede producir, por ejemplo, como moléculas de anticuerpo enteras o como fragmentos VH y VL individuales, fragmentos Fab, dominios simples,

o como cadenas simples (sFv) (véase, Huston, J. S. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 (1988)).

La selección de los análogos de polipéptidos expresados (o polipéptidos producidos mediante síntesis directa) se pueden hacer mediante cualquier medio apropiado. Por ejemplo, la actividad de unión se puede evaluar mediante inmunoensayo convencional y/o cromatografía de afinidad y la actividad catalítica se puede determinar mediante ensayos adecuados para la conversión de sustratos. La selección de los análogos de polipéptidos de la divulgación para la función proteolítica se puede llevar a cabo usando un ensayo en placa de hemoglobina convencional como se describe, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos N.º:

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5. Mutagénesis por revisión asistida por modelado por ordenación

La mutagénesis por revisión de la divulgación también se puede llevar a cabo con el beneficio de información estructural o de modelado concerniente a los análogos de polipéptidos a generarse, de manera que el potencial para generar análogos que tienen la función deseada mejorada se incrementa. La información estructural o de modelado se pueda también usar para guiar la selección de aminoácido predeterminado para introducir en las regiones definidas. Todavía adicionalmente, los resultados reales obtenidos con los análogospolipeptídicos de la invención pueden guiar la selección (o exclusión) de polipéptidos posteriores a prepararse y seleccionarse de una manera iterativa. De acuerdo con ello, la información estructural o de modelado se puede usar para generar subconjuntos iniciales de análogos de polipéptidos para uso en la divulgación, por lo tanto incrementando adicionalmente la eficacia de generación de polipéptidos mejorados.

En una divulgación particular, el modelado por ordenador se usa eliminar la producción de cualquier análogo de polipéptido que se predice que tiene una estructura y/o función pobre o indeseada. De esta forma, el número de análogos de polipéptidos a producirse se puede reducir notablemente incrementando por lo tanto la relación señal-ruido en ensayos de selección posteriores. En otra divulgación particular, el modelado por ordenador se actualiza continuamente con información modelado adicional, a partir de cualquier fuente relevante, por ejemplo, a partir de una secuencia de genes y de proteínas y de bases de datos de tres dimensiones y/o de resultados de los análogos ensayados previamente, de manera que la base de datos por ordenador se hace más precisa en su capacidad predictiva (figura 19).

Todavía en otra divulgación la base de datos por ordenador se proporciona con los resultados de ensayo de los análogos de polipéptidos previamente ensayados y clasifica los análogos, basándose en el criterio o criterios de ensayo, como efectores o no efectores, por ejemplo, como análogos de polipéptidos que se unen bien o no tan bien o que son enzimáticos/catalíticos o no tan enzimáticos/catalíticos. De esta forma la mutagénesis mediante guía de la divulgación puede igualar un intervalo de respuesta funcional con información estructural particular y usar tal información para guiar la producción de análogos de polipéptidos futuros a ensayarse. De acuerdo con ello, el procedimiento es especialmente adecuado para seleccionar anticuerpos o fragmentos de anticuerpos para una función particular, tal como afinidad de unión (por ejemplo, especificidad), estabilidad (por ejemplo, vida media) y/o función efectora (por ejemplo, activación de complementos y ADCC). De acuerdo con ello, la mutagénesis de residuos no contiguos dentro de una región puede ser deseable si se conoce, por ejemplo, por un modelado por ordenador que ciertos residuos en la región no participarán en la función deseada. La estructura coordinada y la interrelación espacial entre las regiones deseadas, v.g., los residuos de aminoácidos funcionales en las regiones definidas del polipéptido, por ejemplo, el/los aminoácido(s) predeterminado(s) que se han introducido, se pueden considerar y modelar. Tales criterios de modelado incluyen, por ejemplo, química de grupos secundarios de aminoácidos, distancias atómicas, datos de cristalografía, etc. De acuerdo con ello, el número de análogos polipeptídicos a producir se puede minimizar de manera inteligente.

En una divulgación preferida una o más de las etapas anteriores están asistidas por ordenador. El procedimiento también es capaz de llevarse a cabo, en parte o en conjunto, mediante un dispositivo, v.g., un dispositivo dirigido por ordenador. De acuerdo con ello, las instrucciones para llevar a cabo el procedimiento, en parte o en conjunto, se pueden conferir a un medio adecuado para uso en un dispositivo electrónico para llevar a cabo las instrucciones. En total, los procedimientos de la divulgación son capaces de un enfoque de alto rendimiento que comprende software (por ejemplo, instrucciones legibles de ordenador) y hardware (por

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ejemplo, los ordenadores, robots y chips).

6. Explorar la química combinatoria de regiones múltiples definidas

La presente divulgación proporciona la importante ventaja de permitir la evaluación por mutagénesis de varias regiones o dominios diferentes de un polipéptido simultáneamente. Esto se puede hacer usando el mismo aminoácido o un aminoácido diferente predeterminado dentro de cada región, permitiendo la evaluación de sustituciones de aminoácidos en regiones relacionadas de manera conformacional, de forma que las regiones tras el plegamiento del polipéptido, están asociadas para preparar un sitio funcional (por ejemplo, el sitio de unión de un anticuerpo o el sitio catalítico de una enzima). Esto, a su vez, proporciona una forma eficaz de crear sitios funcionales nuevos o mejorados.

Por ejemplo, como se muestra en la figura 14, las seis CDR de un anticuerpo que preparan los aspectos únicos del sitio de unión de antígeno (región Fv), se puede mutagenizar simultáneamente, o separadamente en las cadenas VH o VL, para estudiar las interrelaciones tridimensionales de aminoácidos seleccionados en este sitio. En una divulgación, la química combinatoria de las tres o más regiones definidas se explora de manera sistemática usando mutagénesis por revisión y preferiblemente seis regiones definidas, por ejemplo las seis CDR de una región variable de la cadena pesada y la cadena ligera de anticuerpo. Para realizar mutagénesis por revisión sobre una CDR, típicamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, o más posiciones de aminoácidos se alteran.

De acuerdo con ello, la presente divulgación abre nuevas posibilidades para el diseño de tipos muy diferentes de polipéptidos nuevos y mejorados. El procedimiento se puede usar para mejorar una estructura o función existente de una proteína. Por ejemplo, se puede introducir un sitio de unión para un anticuerpo o fragmento de anticuerpo o afinidad para un antígeno preexistente, función efectora y/o estabilidad mejorada. Como alternativa, la introducción de aminoácidos “catalíticamente importantes” adicionales en un dominio catalítico de una enzima se puede realizar dando como resultado una actividad modificada o potenciada hacia un sustrato. Como alternativa, las estructuras, las especificidades o actividades enteramente nuevas se puedenintroducir en un polipéptido. La síntesis de novo de actividad enzimática se puede lograr también. Las nuevas estructuras se pueden edificar sobre el “armazón” natural o de consenso de una proteína existente mediante mutación de regiones relevantes solamente mediante el procedimiento de la invención.

7. Mutagénesis por revisión para preparar anticuerpos nuevos o mejorados

El procedimiento de esta divulgación se usa específicamente para modificar moléculas de anticuerpos. Como se usa en la presente memoria, las moléculas de anticuerpos o anticuerpos se refieren a anticuerpos o porciones de los mismos, tales como anticuerpos de longitud completa, moléculas Fv, u otros fragmentos de anticuerpos, cadenas individuales o fragmentos de los mismos (por ejemplo, una cadena individual de Fv), anticuerpos monocatenarios y anticuerpos quiméricos. Se pueden introducir alteraciones en la región variable y/o en la región marco conservada (constante) de un anticuerpo. La modificación de la región variable puede producir anticuerpos con mejores propiedades de unión de antígeno y si se desea, con propiedadescatalíticas. La modificación de la región marco también puede conducir a la mejora de las propiedades físicoquímicas, tales como solubilidad o estabilidad (por ejemplo, vida media), que son especialmente útiles, por ejemplo, en producción comercial, biodisponibilidad, función efectora (por ejemplo, activación de complementos y/o ADCC) y afinidad de unión (por ejemplo, especificidad) para el antígeno. Típicamente, lamutagénesis se dirigirá a la región Fv de la molécula de anticuerpo, es decir, la estructura responsable de la actividad de unión a antígeno que se compone de regiones variables de dos cadenas, una de la cadena pesada (VH) y una de la cadena ligera (VL). Una vez que las características de unión de antígeno se identifican, la(s) región/regiones variable(s) se pueden modificar por ingeniaría genética en una clase deanticuerpo apropiada tal como IgG, IgM, IgA, IgD, o IgE.

8. Mutagénesis por revisión para preparar/mejorar polipéptidos catalíticos/enzimáticos

El procedimiento de la invención también es particularmente adecuado para el diseño de proteínas catalíticas, particularmente anticuerpos catalíticos. Actualmente, los anticuerpos catalíticos se pueden preparar mediante una adaptación de técnicas de fusión de células somáticas convencionales. En este procedimiento, un animal se inmuniza con un antígeno que se parece al estado de transición del sustrato deseado para inducir la producción de un anticuerpo que une el estado de transición y cataliza la reacción. Las células que producen anticuerpos se recogen a partir del animal y se fusionan con una célula de inmortalización para producir células híbridas. Después las células se seleccionan para la secreción de un anticuerpo que cataliza la reacción. Este procedimiento depende de la disponibilidad de análogos del estado de transición de un sustrato. El procedimiento puede estar limitado debido a que tales análogos es probable que sean difíciles de identificar o de sintetizar en la mayoría de los casos.

El procedimiento de la invención proporciona un enfoque diferente que elimina la necesidad de un análogo deestado de transición. Mediante el procedimiento de la divulgación, un anticuerpo se puede hacer catalítico mediante la introducción de aminoácidos adecuados en el sitio de unión de una inmunoglobulina (región Fv).La región del sitio de unión de antígeno (Fv) se compone de seis bucles hipervariables (CDR), tres derivados de la cadena pesada de inmunoglobulina (H) y tres de la cadena ligera (L), que conecta cadenas beta con cada subunidad. Los residuos de aminoácidos de los bucles CDR contribuyen casi enteramente a las características de cada anticuerpo monoclonal específico. Por ejemplo, las triadas catalíticas (constituidas porresiduos de aminoácidos serina, histidina y ácido aspártico) modeladas después de serina proteasas se pueden crear en los segmentos hipervariables de la región Fv de un anticuerpo con afinidad conocida para la molécula de sustrato y se pueden seleccionar para actividad proteolítica del sustrato.

En particular, el procedimiento de la divulgación se puede usar para producir muchas enzimas diferentes o

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95-103.

El diseño de los oligonucleótidos para la mutagénesis por revisión en las CDR de MCPC 603 es tal que los análogos de polipéptidos resultan tener la secuencia de aminoácidos para CDR1, CDR2 y CDR3 como se muestra en las figuras 3-5. Se entiende que los oligonucleótidos sintetizados pueden ser mayores que las regiones CDR para alterar para facilitar la inserción en la construcción diana como se muestra en la figura 7. Un formato de anticuerpo monocatenario se elige por conveniencia en la expresión posterior y etapas de selección. Los oligonucleótidos se pueden convertir en cadenas bicatenarias mediante técnicas enzimáticas (véase, por ejemplo, Oliphant, A. R. y col., 1986, al principio) y después se ligan dentro de un plásmido restringido como se muestra en la figura 8. Los sitios de restricción pueden ser sitios de origen natural o sitiosde restricción modificados por ingeniería genética.

Los polinucleótidos que codifican los análogos de polipéptidos se pueden expresar en cualesquiera de sistemas de expresión convenientes descritos en la presente memoria y se pueden seleccionar usando el ensayo de la serina proteasa descrito, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos N.º: 5.798.208 (véanse también, las figuras 16-17). En resumen, los análogos de polipéptidos expresados se exponen a un sustrato de ensayo y se examinan para proteolisis del sustrato de ensayo. La cantidad de proteolisis, revelada por una zona de eliminación del sustrato, indica un análogo de polipéptido que tiene la actividad funcional deseada.

Ejemplo 2

MUTAGÉNESIS POR REVISIÓN DE SEIS REGIONES DEFINIDAS EN UNA MOLÉCULA DE UNIÓN A ANTÍGENOS

En este ejemplo, se describe la mutagénesis por revisión de los seis CDR de un anticuerpo para mejorar la unión y proteolisis de un sustrato. En particular, se realiza una mutagénesis “por revisión” de todas las seis regiones hipervariables o regiones determinantes de complementariedad (CDR) del anticuerpo de modelo mencionado anteriormente (MCPC 603), en este ejemplo, la mutagénesis por “revisión” se lleva a cabo a partir de dos a tres veces con un aminoácido diferente en una región o dominio dado. Por ejemplo, Asp, Ser e His se recorren secuencialmente en las cadenas pesadas y ligeras como se muestra en la figura 10.

La mutagénesis de los residuos continuos dentro de una región puede ser deseable si se conoce, o si se puede deducir, que ciertos residuos en la región no participarán en la función deseada. Además, el número de análogos se puede minimizar. Otras consideraciones en la selección del aminoácido predeterminado y las posiciones particulares a alterar son que los residuos pueden ser capaces de hidrogenar enlaces entre sí. Esta consideración puede imponer una restricción de proximidad sobre las variantes deseadas. De este modo, solamente ciertas posiciones dentro de las CDR pueden permitir que los aminoácidos de la triada catalítica interaccionen de manera apropiada. De este modo, el modelo molecular u otra información estructural se puede usar para enriquecer variantes funcionales.

En este caso, la información estructural conocida se usó para identificar restos en las regiones que pueden estar suficientemente cerca para permitir la formación de enlaces de hidrógeno entre Asp, His y Ser, así como el intervalo de residuos a mutagenizar. Roberts y col., han identificado regiones de estrecho contacto entre porciones de las CDR (Roberts, V. A. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6654-6658 (1990)). Esta información junto con los datos de la estructura de rayos x de MCPC 603 se usa para seleccionar áreas prometedoras de estrecho contacto entre las CDR dirigidas para mutagénesis. Este tipo de mutagénesis por revisión guiada por información estructural/de modelo se puede denominar como mutagénesis “a través de guía”.

La mutagénesis por revisión se lleva a cabo como se ilustra en la figura 10 en la que cada CDR se somete a un aminoácido predeterminado dando como resultado 8 x 105 y si se exploran todos los veinte aminoácidos, 5 x 1013 análogos de polipéptidos. Los polinucleótidos se pueden expresar en cualesquiera de los sistemas de expresión convenientes descritos en la presente memoria y se pueden seleccionar usando la serina proteasa descrita, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos N.º: 5.798.208. En resumen, los análogos de polipéptidos expresados se exponen a un sustrato de ensayo y se examinan para evaluar proteolisis del sustrato de ensayo. La cantidad de proteolisis, revelada mediante una zona de eliminación del sustrato, indica un análogo de polipéptidos que tiene la actividad funcional deseada.

Ejemplo 3

MUTAGÉNESIS POR REVISIÓN DE MOLÉCULAS DE UNIÓN A ANTI-TNF PARA MEJORAR LA FUNCIÓN

En este ejemplo, se describe la mutagénesis por revisión de un anticuerpo anti-TNF para mejorar la unión.

En particular, se realiza la mutagénesis “por revisión” de todas las seis regiones hipervariables o regiones determinantes de complementariedad (CDR) de dos anticuerpos anti-TNF diferentes. Los anticuerpos anti-TNF tienen aplicación general en el tratamiento de enfermedad inmune en pacientes que tienen niveles inapropiados del ligando TNF (factor de necrosis tumoral). Existen dos anticuerpos anti-TNF disponibles comercialmente. Por conveniencia en la realización de mutagénesis por revisión y posterior selección, las regiones variables de cadena ligera y pesada (véanse las SEQ ID números 2-4) de estos anticuerpos se convirtieron a un formato monocatenario usando un engarce poli Gly-Ser (véase la figura 15). Las regiones definidas seleccionadas por mutagénesis por revisión con un aminoácido predeterminado se identifican mediante la presencia de una barra negra como se muestra en la figura 15. Estas regiones definidas corresponden a las CDR de los anticuerpos de las cadenas individuales.

Los polinucleótidos que presentan las seis regiones CDR y regiones flanqueantes suficientes para permitir el

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anticuerpo final. Sin embargo, LTM no se limita a estos nueve aminoácidos o a nueve aminoácidos totales. El análisis de LTM se puede realizar con cualquier combinación de aminoácidos y el subconjunto de LTM puede ser tan alto como 18 aminoácidos (1 corto de mutagénesis por saturación).

2.1 Síntesis de oligonucleótidos de LTM

En el análisis primario de LTM, el objetivo es explorar cada contribución de la cadena de aminoácidos a la afinidad de unión global dentro de cada CDR. Para generar eficazmente diversidad significativa, cada uno delos aminoácidos del subconjunto de LTM se dirige en cada posición individual dentro de la secuencia de CDR con una sustitución solamente por CDR. De este modo, cada oligonucleótido individual codifica solamente una mutación de CDR individual. Por ejemplo, con el fin de realizar la mutagénesis de histidina de LTM sobre un dominio VH CDR3 de once aminoácidos hipotético, se sintetizan 11 oligonucleótidos que codifican para todas las 11 mutaciones de histidina individuales posibles (véase la figura 20). Un análisis tal ensaya los efectos de tener una amida voluminosa en cada posición en la CDR. Por lo tanto para generar una bibliotecade VH CDR3 LTM, solamente se sintetizan 99 oligonucleótidos para el análisis de LTM (9 aminoácidos de LTM x 11 posiciones de VH CDR3). Las secuencias de oligonucleótidos se ensayan para codones de parada accidentales, duplicación de tipo silvestre, uso de codón ineficaz, horquillas, bucles y otras estructuras secundarias que usan software disponible públicamente.

2.2 Síntesis de oligonucleótidos degenerados para las combinaciones de mutaciones de LTM beneficiosas

Al emplear el reemplazo de LTM sistemático de aminoácidos individuales dentro de un CDR, la preferenciade las funcionalidades químicas en cada posición está sin cubrir. Con el fin de combinar todas las mutaciones de las selecciones de LTM y explorar la posible aditividad y sinergia energética entre estas, se sintetizan los oligonucleótidos degenerados que codifican estas mutaciones y la secuencia de tipo silvestre. La combinación degenerada de oligonucleótidos con 1,6 x 104 variantes se usa posteriormente para generar una biblioteca de segunda generación que explora la naturaleza aditiva de estas sustituciones.

2.3 Diseño de oligonucleótidos asistido por ordenador, biblioteca y base de datos de los resultados.

El software acoplado con sintetizadores de ADN realizados a medida automatizados permite la síntesis rápida de oligonucleótidos. La primera etapa implica decidir qué aminoácidos diana se incorporarán en las CDR. El software determina la preferencia de codón (por ejemplo, preferencia de codón de levadura, bacteriano o de fago, dependiendo del sistema elegido) necesario para introducir los aminoácidos diana y también elimina cualquier duplicación de la secuencia de tipo silvestre que se puede generar mediante este procedimiento de diseño. Después analiza para evaluar las estructuras de los codones de parada potenciales, horquillas y otros bucles o para secuencias problemáticas que se corrigen posteriormente antes de la síntesis. El plan de diseño de LTM completado se envía después al sintetizador de ADN, que realiza una síntesis automática de los oligonucleótidos. De esta manera, los oligonucleótidos necesarios para crear las bibliotecas se pueden generar rápidamente.

Una base de datos electrónica puede almacenar información de todas las secuencias de oligonucleótidos de LTM, detalles de las sustituciones de las CDR de las bibliotecas de scFv y resultados de los ensayos de unión para un antígeno diana. El archivo de los datos de los oligonucleótidos permite las iteraciones racionales de las estrategias del diseño y la reutilización de los oligonucleótidos de reactivos.

3. Estrategia de LTM global

LTM se emplea inicialmente para identificar aminoácidos específicos y propiedades químicas que son beneficiosas para propiedades de unión, neutralización y/o cualesquiera propiedades adicionales deseadasen el anticuerpo final. También rápidamente identifica las regiones que no toleran ninguna mutagénesis sin pérdida significativa de afinidad (o cualquier propiedad física que se seleccione). Por lo tanto, no solamente es el análisis de LTM una buena metodología para explorar los requerimientos químicos en cada posición en todas las CDR de un anticuerpo, sino que también determina rápidamente los aminoácidos absolutamente requeridos para la unión a anticuerpo. Después de la identificación de las mutaciones beneficiosas mediante LTM, los esquemas de mutagénesis combinatoria se pueden emplear para que en primer lugar incorporen todas estas mutaciones de aminoácidos dispares para generar CDR múltiplemente mutadas. Adicionalmente

o como alternativa, la mutagénesis “de recorrido” (WTM) se puede usar para sondar los efectos de mutaciones múltiples del mismo aminoácido en una CDR (como se describe, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos números 5.830.650; 5.798.208).

4. Bibliotecas LTM scFv

Las técnicas de LTM descritas anteriormente se usan para crear agrupaciones de oligonucleótidos con mutaciones en una CDR individual de la cadena ligera o pesada. Estos oligonucleótidos se sintetizan para que incluyan algunos de los marcos circundantes para facilitar el solapamiento y la hibridación durante PCR. Estas combinaciones de oligonucleótidos se utilizan para generar todas las posibles cadenas VL y VH en las que existen mutaciones en CDR individuales, dobles y triples (combinaciones individuales, dobles y triples deCDR1, 2 y 3) usando PCR de extensión de solapamiento individual (SOE-PCR) (como se describe en Horton y col., (1989) Gene 77: 61-68). SOE-PCR es un procedimiento rápido y sencillo para combinar los fragmentos de ADN que no requieren sitios de restricción, endonucleasas de restricción, o ligasa de ADN. En dos regiones SOE-PCR en el gen se amplifican primero mediante PCR usando cebadores diseñados de manera que los productos de PCR compartan una secuencia complementaria en un extremo. En las condiciones de PCR, las secuencias complementarias se hibridan, formando un solapamiento. Las secuencias complementarias actúan después como cebadores, permitiendo la extensión mediante la ADN polimerasa para producir una molécula recombinante.

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Por ejemplo, para crear la combinación de las cadenas VH en las que tanto CDR-H1 como CDR-H2 están mutadas y la CDR-H3 es de tipo silvestre, que se llama “110” (1 significa una CDR mutante y 0 significa una CDR de tipo silvestre), los genes mutantes de CDR-H1 se usan como moldes y SOE-PCR se lleva a cabo para unir los oligonucleótidos de CDR-H2 para generar la combinación doblemente mutada (figura 21). Considerando que cada CDR puede ser bien de tipo silvestre o bien mutante, existen siete posibles combinaciones (mostradas mediante flechas en la figura 21) para cada una de las agrupaciones de las cadenas VL y VH (no incluyendo la molécula de tipo silvestre “000”). La combinación de las siete agrupaciones de VL y de las ocho agrupaciones de VH crea 63 combinaciones VL-VH de tipo no silvestre (scFv), (figura 21). Cada una de las 64 combinaciones VL-VH (incluyendo la secuencia de tipo silvestre) se denomina un “subconjunto” del agrupamiento de bibliotecas de LTM scFv entero. Un agrupamiento de bibliotecas de scFv se crea para cada aminoácido seleccionado para sustitución. El número de secuencias de aminoácidos presentadas dentro de cada biblioteca de subconjunto depende de la longitud de la CDR, la secuencia de aminoácidos dentro de la CDR y la estrategia de diseño de oligonucleótidos de LTM.

5. Revisión de bibliotecas de alto rendimiento y selección de anticuerpos mejorados

Está disponible una diversidad de procedimientos para la expresión y presentación de anticuerpos. Estos incluyen bacteriófago, Escherichia coli y levadura. Aunque cada uno de estos procedimientos se ha usado para mejora de anticuerpos, el sistema de presentación en levaduras permite varias ventajas (Poder y Wittrup (1997) Nat. Biotechnol. 15: 553-557). La levadura puede acomodar fácilmente tamaños de bibliotecas de hasta 107, con 103-105 copias de cada anticuerpo mostrándose en cada superficie celular. Las células de levaduras se pueden seleccionar fácilmente y separarse fácilmente usando citometría de flujo y separación de células activadas por fluorescencia (FACS) o perlas magnéticas. Las levaduras también permitenselección rápida y re-crecimiento rápido. El sistema de secreción eucariótico y las rutas de glucosilación de levadura permiten un subconjunto mucho mayor de moléculas scFv para plegarse y mostrarse correctamente sobre la superficie celular que los sistemas de presentación procarióticos. La presentación en levaduras acoplada con la evolución dirigida se ha usado para incrementar la KD de un fragmento de anticuerpo scFv para fluoresceína a 48 fM, unión dos órdenes de magnitud más fuerte que cualquier ligando monovalente reseñado previamente (Boder y col., (2000) PNAS 97: 10701-10705). El sistema de presentación utiliza el receptor de adhesión de levaduras de aglutinina-a para presentar proteínas sobre la superficie celular. Las proteínas de interés, en el caso presente, bibliotecas de anti-BoNT/B scFv LTM o bibliotecas de anti-BoNT/A scFv LTM, se expresan como parejas de fusión con la proteína Aga2. Estas proteínas de fusión se seleccionan a partir de la célula y llegan a unirse por puentes disulfuro a la proteína Aga1, que se une a la pared de las células de levaduras (véase Invitrogen, bibliografía del producto de presentación de levaduraspYD1). Además, existen marcas carboxi terminales incluidas que se pueden utilizar para controlar los niveles de expresión y/o normalizar mediciones de afinidad de unión.

Las perlas magnéticas revestidas con estreptavidina (Spherotech) se usan para rastrear y seleccionar anticuerpos que se unen a BoNT/B o BoNT/A con alta afinidad. Esta metodología emplea unión de anticuerpos de alta afinidad a antígeno biotinilado que se une después a perlas revestidas con estreptavidinacon el fin de seleccionar los clones de levaduras (Yeung y Wittrup (2002) Biotechnol. Prog 18: 212-220) y Feldhaus y col., (2003) Nature Biotech. 21: 163-170). El polipéptido BoNT/A o BoNT/A (Metabiologics) se biotinila usando protocolos convencionales (Pierce) y la selección se realiza usando procedimientos bien conocidos en la técnica. Usando selección basada en equilibrio y cinética, los anticuerpos con afinidades mejoradas se seleccionan a partir de estas bibliotecas. La eficacia de cada ronda de selección se controla mediante FACS analítica (FACScan). Además, las afinidades de unión relativa de las moléculas individuales presentadas sobre la superficie de levaduras se miden mediante valoración del antígeno. Esto permite una rápida identificación de moléculas con afinidad mejorada. Los clones de scFv se secuencian después para identificar mutaciones beneficiosas.

6. Generación de anticuerpos solubles para mediciones de afinidad BIAcore

Los anticuerpos de interés se subclonan en sistemas de expresión solubles (Picchia pastoris y/o E. coli) y segenera proteína soluble. Existen varios vectores comercialmente disponibles y líneas celulares paraexpresión de anticuerpos solubles, que incluyen los de Invitrogen (por ejemplo, pPIC9 para P. pastoris) y Novagen (pET20b para expresión periplásmica en E. coli). Estos sistemas se usan de manera rutinaria para generar anticuerpos monocatenarios o de longitud completa solubles. El sistema de expresión de P. pastoris(Invitrogen) produce de manera rutinaria 1-5 mg por litro de scFv purificado soluble. La purificación deproteínas está facilitada por la presencia de cola de polihistidina en el extremo C de la molécula, en el caso de cadenas individuales o mediante columnas de proteína A o proteína G para anticuerpos de longitud completa. Los anticuerpos monocatenarios y de longitud completa solubles se generan para obtener mediciones de velocidad cinética de afinidad BIAcore. Esta etapa es necesaria ya que moléculas de scFv de alta afinidad sobre la superficie celular de clones de levaduras se debe verificar como una molécula soluble libre de células. Los anticuerpos solubles monocatenarios y de longitud completa generados de la manera anterior se puede usar para obtener mediciones de afinidad BIAcore, así como en el ensayo de crecimiento hacia fuera de neuritas o en el ensayo de letalidad de ratón descrito más adelante.

7. Selección de anticuerpos seleccionados para neutralización in vivo o in vitro

Un ensayo basado en células que usa el crecimiento hacia fuera de neuritas de neuronas primaras de pollo como un indicador de intoxicación de BoNT y de esta manera, como un medio para cuantificar la neutralización de toxinas se puede usar para seleccionar los anticuerpos seleccionados. Los experimentos preliminares que usan cultivos de explantes de ganglios de la raíz dorsal de huevos de pollos fertilizados han indicado que existía menos crecimiento hacia fuera axonal de explantes tratados con BoNT/A que de los controles. Como alternativa, se puede usar un ensayo de unión neuromuscular de ganglio ciliar-músculo del iris de pollo (como se describe en Lomneth y col., (1990) Neuroscience Letters 113: 211-216).

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Claims

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