JP2007524390A - ルックスルー突然変異誘発 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、米国特許仮出願60/483282号(2003年1月27日提出)(この全記載内容は、参照により本明細書中で援用される)に対する優先権を主張する。以下の明細書全体を通して引用されるその他の特許、特許出願および参考文献すべての全記載内容も、参照により本明細書中で援用される。
突然変異誘導は、タンパク質の構造および機能の研究における強力なツールである。突然変異は、当該タンパク質をコードするクローン化遺伝子のヌクレオチド配列中に作られ、修飾遺伝子はタンパク質の突然変異体を産生するために発現され得る。野生型タンパク質および生成された突然変異体の特性を比較することにより、タンパク質の構造無欠性および/または生化学的機能、例えばその結合および/または触媒活性に不可欠である個々のアミノ酸またはアミノ酸のドメインをしばしば同定し得る。しかしながら単一タンパク質から生成され得る突然変異体の数は、突然変異を包含する選定突然変異体が単にタンパク質の推定的重量領域(例えばタンパク質の活性部位を作り上げる領域)中にある場合でさえ、情報提供するかまたは所望の特性を有する突然変異体を選択するのを困難にする。例えば特定のアミノ酸の置換、欠失または挿入は、タンパク質に及ぼす局所的または全体的作用を有し得る。
本発明は、新規のまたは改善されたタンパク質(またはポリペプチド)の生成のための突然変異誘発方法に、ならびに当該方法により生成されるポリペプチド類似体および特定ポリペプチドのライブラリーに関する。突然変異誘発のために標的化されるポリペプチドは、天然、合成または工学処理ポリペプチド(薗断片、類似体および突然変異形態を含む)であり得る。
本明細書および特許請求の範囲を明確に理解するために、以下の定義を下記に提示する。
本明細書中で用いる場合、「類似体」という用語は、1つまたは複数のアミノ酸置換を有する変異体または突然変異体ポリペプチド(またはこのようなポリペプチドをコードする核酸)を指す。
タンパク質の研究は、ある種のアミノ酸がそれらの構造および機能において重要な役割を演じる、ということを明示した。例えば、離散数のアミノ酸のみが抗体と抗原の結合に参加し、あるいは酵素の触媒的事象に関与する、と思われる。
本発明に従って、限定領域またはタンパク質内の領域が突然変異誘発のために選択される。典型的には、当該領域は、タンパク質の構造または機能にとって重要であると思われる(例えば図1参照)。これは、例えばどんな構造および/または機能的態様が既知であるかということから推定され得るし、あるいは限定領域(単数または複数)を他のタンパク質の試験から既知であるものまたはモデリング情報により手助けされ得るモノとを比較することから推定され得る。例えば限定領域は、機能的部位において、例えば結合、触媒またはその他の機能においてある役割を有するものであり得る。一実施形態では、限定領域は、抗原結合分子の超可変部または相補性決定領域(CDR)である。別の実施形態では、限定領域は相補性決定領域(CDR)の一部である。他の実施形態では、2またはそれ以上の限定領域、例えばCDRまたはその部分が突然変異誘発のために選択される。
限定領域(単数または複数)内の置換のために選択されるアミノ酸残基は一般に、当該構造または機能に関与することが既知であるものから選択される。20の天然アミノ酸は、それらの側鎖に関して異なる。各側鎖は、各アミノ酸を独特にする化学的特性に関与する。結合を変更し、または新規の結合親和性を作製する目的のために、20の天然アミノ酸のうちのいずれかが一般に選択され得る。したがって全ての置換のための膨大な数の類似体を作製した従来の突然変異誘発方法は、20のアミノ酸の各々の置換のタンパク質結合に及ぼす作用を評価するためには実用的でなかった。これに対比して、本発明の方法は、各アミノ酸置換のための実用数の類似体を作製し、したがって一タンパク質の分離された単数または複数の領域内のより多数の種々のタンパク質の化学的性質の評価を可能にする。
一実施形態では、ポリペプチド類似体のライブラリーは、ポリペプチドの限定領域をコードし、そして予定アミノ酸に関する1つ以下のコドンを有する個々のオリゴヌクレオチドを合成することによりスクリーニングのために生成される。これは、オリゴヌクレオチド内の各コドン位置で、野生型ポリペプチドの合成に必要とされるコドンまたは予定アミノ酸に関するコドンを組入れることにより成し遂げられる。これは、飽和突然変異誘発、ランダム突然変異誘発またはウォーク・スルー突然変異誘発で産生されるオリゴヌクレオチドとは異なる。即ち各オリゴヌクレオチドに関して、多突然変異とは対照的に、唯一の突然変異が作製される。
上記の技法またはその他の適切な技法のいずれかにより生成されるポリヌクレオチドのライブラリーが発現され、スクリーニングされて、所望の構造および/または活性を有するポリペプチド類似体を同定し得る。ポリペプチド類似体の発現は、当該技術分野で既知の任意の適切な発現ディスプレー系、例えば無細胞抽出ディスプレー系(例えばリボソームディスプレーおよびアレイ化(例えばマイクロアレイ化またはマクロアレイ化)ディスプレー系)、細菌ディスプレー系、ファージディスプレー系、原核生物細胞および/または真核生物細胞(例えば酵母ディスプレー系)(これらに限定されない)を用いて実行され得る。
本発明のルック・スルー突然変異誘発はまた、所望の改善機能を有する類似体を生成するための能力が増大されるよう、生成されるべきポリペプチド類似体に関する構造またはモデリング情報の利点を用いて実行され得る。構造またはモデリング情報は、限定領域中に導入するよう予定アミノ酸の選択を誘導するためにも用いられ得る。さらに、本発明のポリペプチド類似体を用いて得られる実際的結果は、反復方式で作製され、スクリーニングされるべきその後のポリペプチドの選択(または除外)を誘導し得る。したがって構造またはモデリング情報を用いて、本発明に用いるためのポリペプチドの最初のサブセットを生成し、それにより改善ポリペプチドを生成する効率をさらに増大し得る。
本発明は、同時的に、ポリペプチドのいくつかの異なる領域またはドメインの突然変異誘発による評価を可能にするという重要な利点を提供する。これは、各領域内の同一のまたは異なる予定アミノ酸を用いて実行されて、立体配座的に関連する領域、例えばポリペプチドのフォールディング時に機能性部位(例えば抗体の結合部位または酵素の触媒部位)を作り上げるために会合される領域におけるアミノ酸置換の評価を可能にする。これは次に、新規のまたは改善された機能性部位を作製する効率的方法を提供する。
本発明の方法は、抗体分子を修飾するために特に有用である。本明細書中で用いる場合、抗体分子または抗体とは、抗体またはその部分、例えば全長抗体、Fv分子、またはその他の抗体断片、その個々の鎖または断片(例えばFvの一本鎖)、一本鎖抗体、ならびにキメラ抗体を指す。変更は、抗体の可変部におよび/またはフレームワーク(定常)部に導入される。可変部の修飾は、良好な抗原結合特性を、そして所望により触媒特性を有する抗体を産生し得る。フレームワーク領域の修飾も、化学−物理的特性、例えば溶解度または安定性(例えば半減期)(これは例えば商業的生産において特に有用である)、生物学的利用能、エフェクター機能(例えば補体活性化および/またはADCC)ならびに抗原に対する結合親和性(例えば特異性)の改善をもたらし得る。典型的には突然変異誘発は、抗体分子のFv領域、即ち2つの鎖(一方は重鎖(VH)から、もう一方は軽鎖(VL)から)の可変部を作り上げる抗原結合活性に関与する構造を標的にする。所望の抗原結合特質が一旦同定されれば、可変部(単数または複数)は適切な種類の抗体、例えばIgG、IgM、IgA、IgDまたはIgEに工学処理され得る。
本発明の方法はまた、触媒タンパク質、特に触媒抗体の設計に特に適している。目下、触媒抗体は、標準体細胞融合技法の適合により調製され得る。この方法では、動物は、遷移状態の所望の基質に類似する抗原で免疫感作されて、遷移状態と結合し、反応を触媒する抗体の産生を誘導する。抗体産生細胞は動物から採取され、不死化細胞と融合されて、ハイブリッド細胞を産生する。次にこれらの細胞は、反応を触媒する抗体の分泌に関してスクリーニングされる。この工程は、遷移状態の基質の類似体の利用可能性によっている。本工程は、このような類似体がほとんどの場合において同定または合成するのが難しいと思われるため、制限され得る。
材料および方法
概して、本発明の実行は、別記しない限り、化学、分子生物学、組換えDNA技術、PCR技術、免疫学(特に例えば抗体技術)、発現系(例えば無細胞発現、ファージディスプレー、リボソームディスプレーおよびプロヒュージョンTM)、ならびに当該技術分野技術の範囲内であり、そして文献中に説明されている任意の必要な細胞培養の慣用的技法を用いる。例えばSambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989);DNA Cloning, Vols. 1 and 2, (D.N. Glover, Ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis(M.J. Gait, Ed. 1984); PCR Handbook Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, Beaucage, Ed. John Wiley & Sons (1999)(Editor); Oxford Handbook of Nucleic Acid Structure, Neidle, Ed., Oxford Univ Press (1999); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al., Academic Press (1990); PCR Essential Techniques: Essential Techniques, Burke, Ed., John Wiley & Son Ltd (1996); The PCR Technique: RT-PCR Siebert, Ed., Eaton Pub. Co. (1998); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1999); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., C.S.H.L. Press, Pub. (1999); Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992); Large-Scale Mammalian Cell Culture Technology, Lubiniecki, A., Ed., Marcel Dekker, Pub., (1990). Phage Display: A Laboratory Manual, C. Barbas (Ed.), CSHL Press, (2001); Antibody Phage Display, P O’Brien (Ed.), Humana Press (2001); Border et al., Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries, Nature Biotechnology, 15(6): 553-7 (1997); Border et al., Yeast surface display for directed evolution of protein expression, affinity, and stability, Methods Enzymol., 328: 430-44 (2000);米国特許第6,348,315号(Pluckthun等)に記載されたようなリボソーム ディスプレー、ならびに米国特許第6,258,558号;第6,261,804号および第6,214,553号(Szostak等)に記載されたようなプロヒュージョンTMを参照されたい。
抗原結合分子における3つの限定領域のルック・スルー突然変異誘発
本実施例では、基質の結合およびタンパク質分解を改善するための抗体の3つのCDRのルック・スルー突然変異誘発を記載する。
抗原結合分子における6つの限定領域のルック・スルー突然変異誘発
本実施例では、基質の結合およびタンパク質分解を改善するための抗体の6つのCDR全てのルック・スルー突然変異誘発を記載する。
ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載された便利な発現系のいずれかで発現され、そして例えば米国特許第5,798,208号に記載されたセリンプロテアーゼを用いてスクリーニングされ得る。要するに、発現ポリペプチド類似体を試験基質に曝露し、そして試験基質のタンパク質分解に関して検査する。基質のクリアランスの区域により明示されるタンパク質分解の量は、所望の機能活性を有するポリペプチド類似体を示す。
機能を改善するための抗TNF結合分子のルック・スルー突然変異誘発
本実施例では、結合を改善するための抗TNF抗体のルック・スルー突然変異誘発を記載する。
特に2つの異なる抗TNF抗体の6つの超可変部または相補性決定領域(CDR)全ての「ルック・スルー」突然変異誘発を実施する。抗TNF抗体は、不適切なレベルのリガンドTNF(腫瘍壊死因子)を有する患者における免疫疾患の治療に一般的用途を有する。2つの市販抗TNF抗体が存在する。ルック・突然変異誘発およびその後のスクリーニングを実施する際の便利のために、これらの抗体の軽鎖および重鎖可変部(配列番号2〜4参照)を、ポリGly−Serリンカーを用いて一本鎖フォーマットに転換した(図15参照)。予定アミノ酸を有するルック・スルー突然変異誘発のために選択される限定領域を、図15に示したように黒色バーの存在により同定する。これらの限定領域は、一本鎖抗体のCDRに対応する。
機能を改善するためのボツリヌス神経毒血清型B(BoNT/B)およびボツリヌス神経毒血清型A(BoNT/A)に対する抗体のルック・スルー突然変異誘発
本実施例では、機能を改善するためにルック・スルー突然変異誘発(LTM)を用いて、ボツリヌス神経毒血清型B(BoNT/B)およびボツリヌス神経毒血清型A(BoNT/A)に対する改善された抗体を生成する。LTMアプローチは、サイズ、電荷、疎水性および水素結合特質を探究する20のアミノ酸のサブセット(LTM組)を基礎にした結合ポケット全体を通してCDR当たり単一突然変異を作製することを基礎にする。LTM組におけるアミノ酸の選択のための判定基準を以下で考察する。
BoNT/Bに対する結合親和性を有するネズミ抗体断片(Fab)を、Emaneul et al. (1996) Journal of Immunological Methods 193: 189-197に記載されているのと同様にして得た。BotFab5(配列番号10および11、それぞれ軽鎖および重鎖ポリペプチド)、BotFab20(配列番号12および13、それぞれ軽鎖および重鎖ポリペプチド)またはBotFab22(配列番号14および15、それぞれ軽鎖および重鎖ポリペプチド)抗体を用い得る。上記の配列は、米国特許第5,932,449号に記載されている(この記載内容は、参照により本明細書中で援用される)。ネズミBoNT/B抗原(全長毒素、軽鎖および/または重鎖)は、Metabiologics, Inc., WIから入手し得る。
ルック・スルー突然変異誘発(LTM)のために、以下の9つのアミノ酸およびそれらの代表的機能特質を選択する:アラニンおよびロイシン(脂肪族)、セリン(ヒドロキシル基)、アスパラギン酸(酸性)およびグルタミン(アミド)、リシンおよびヒスチジン(塩基性)、チロシン(芳香族)、プロリン(疎水性)。これらのアミノ酸は、サイズ、電荷、疎水性および水素結合能力における適切な化学的多様性を表示して、抗体特性を改善するために必要とされる化学的機能性に関する有意の初期情報を提供する。選択は、抗体のCDR中のこれらのアミノ酸の出現頻度にも基づいている。例えばチロシンおよびフェニルアラニン間で芳香族側鎖を有するアミノ酸を表示すると仮定すると、抗体CDR中のその有意に高い優勢性および水素結合するその能力のために、前者が選択される。LTMを最初に用いて、最終抗体において望まれる結合、中和および/または任意の付加的特性に有益である特定のアミノ酸および化学特性を同定する。しかしながらLTMは、これらの9つのアミノ酸または9つの総アミノ酸に限定されない。LTM分析は、アミノ酸の任意の組合せを用いて実施し得るし、LTMサブセットは18アミノ酸という高い数値でもあり得る〈飽和突然変異誘発の1 short〉。
一次LTM分析では、目標は、各CDR内の全体的結合親和性への各アミノ酸の側鎖の寄与を調べることである。有意の多様性を効率的に生成するために、LTMサブセットアミノ酸の各々を、CDR当たり1つだけの置換を有するCDR配列内の全ての単一位置で標的化する。したがって各個々のオリゴヌクレオチドは、単一CDR突然変異のみをコードする。例えば仮定的11アミノ酸VH CDR3ドメイン上でのLTMヒスチジン突然変異誘発を実行するために、11の考え得る単一ヒスチジン突然変異をコードする11個のオリゴヌクレオチドを合成する〈図20参照〉。このような分析は、CDR中の各位置に嵩高いアミドを有するという作用を試験する。したがってVHCDR3 LTMライブラリーを生成するためには、LTM分析のために99個のオリゴヌクレオチドだけを合成する(9LTMアミノ酸×11VHCDR3位置)。公的に利用可能なソフトウエアを用いて、不適切な停止コドン、野生型重複、非効率的コドン使用、ヘアピン、ループおよびその他の二次的構造に関して、オリゴヌクレオチド配列を試験する。
CDR内の個々のアミノ酸の体系的LTM置換を用いる場合、各位置での化学的機能性の選択が明らかにされる。LTM選択からの全ての突然変異を組合せ、そしてこれらの間の考え得る付加性およびエネルギー相乗作用を調べるために、これらの突然変異および野生型配列をコードする縮重オリゴクレオチドを合成する。1.6×104の変異体を有するオリゴヌクレオチドのこの縮重プールをその後に用いて、これらの置換の付加的性質を調べる第二世代ライブラリーを生成する。
自動注文作製DNA合成機と接続したソフトウエアは、迅速オリゴヌクレオチド合成を可能にする。第一段階は、標的アミノ酸がCDRに組入れられるか否かを決定することを包含する。ソフトウエアは、標的化アミノ酸配列を導入するために必要とされるコドン選択(例えば円卓される系によって、酵母、細菌またはファージコドン選択)を確定し、そしてさらにまたこの設計工程により生成され得る野生型配列の任意の重複を排除する。それは次に、停止コドン、ヘアピンおよびループ構造に関する、あるいはその後、合成前に矯正されるその他の問題の配列に関して分析する。次に完成LTM設計計画をDNA合成機に送ると、これがオリゴヌクレオチドの自動合成を実施する。このようにして、ライブラリーを作製するために必要とされるオリゴヌクレオチドを迅速に生成し得る。
LTMを最初に用いて、最終抗体において望まれる結合、中和および/または任意の付加的特性に有益である特定のアミノ酸および化学特性を同定する。それは、親和性における有意の損失を伴わない(または任意の物理的特性が選択される)任意の突然変異誘発を耐容しない領域も迅速に同定する。したがってLTM分析は、抗体の全てのCDR中の各位置での化学的要件を調べるための良好な方法であるだけでなく、それは抗原結合に絶対に必要とされるアミノ酸をも迅速に確定する。LTMによる有益な突然変異の同定後、これらの本質的に異なるアミノ酸突然変異の全てを最初に組入れる組合せ突然変異誘発スキームを用いて、多数の突然変異化CDRを生成し得る。さらにまたはあるいは、「ウォーク・スルー」突然変異誘発(WTM)を用いて、CDR中の同一アミノ酸の多突然変異の作用をプローブし得る(例えば米国特許第5,830,650号;第5,798,208号に記載)。
上記のLTM技法を用いて、軽鎖または重鎖の単一CDR中に突然変異を有するオリゴヌクレオチドのプールを作製する。PCR中の重複およびハイブリダイゼーションを促すために周囲フレームワークのいくつかを含むよう、これらのオリゴヌクレオチドを合成する。オリゴヌクレオチドのこれらのプールを利用して、単一重複伸長PCR〈SOE−PCR〉を用いて、単一、二重および三重CDR(CDR1、2および3の単一、二重および三重組合せ)中に突然変異が存在する全ての考え得るVLおよびVH鎖を生成する(Horton et al. (1989) Gene 77: 61-68に記載)。SOE−PCRは、制限部位、制限エンドヌクレアーゼまたはDNAリガーゼを必要としないDNA断片を併合するための迅速且つ簡単な方法である。SOE−PCRでは、idennsi中の2つの領域を、PCR産物がその一端で相補的配列を共有するよう設計されたプライマーを用いて、PCRにより先ず増幅する。PCR条件下では、相補的配列はハイブリダイズして、重複を生成する。次に相補的配列はプライマーとして作用して、DNAポリメラーゼによる伸長を可能にして、組換え分子を産生する。
抗体発現および表示のためには、種々の方法が利用可能である。これらは、バクテリオファージ、大腸菌および酵母を包含する。これらの方法の各々は抗体改善のために用いられてきたが、しかし酵母ディスプレー系はいくつかの利点を提供する(Boder and Wittrup (1997) Nat. Biotechnol. 15: 553-557)。酵母は107までのライブラリサイズを容易に収容し、各々の103〜105コピーが各細胞表面に表示される。酵母は、フローサイトメトリーおよび蛍光活性化細胞選別(FACS)または磁気ビーズを用いて、容易にスクリーニングされ、分離される。酵母は、迅速選択および再増殖も提供する。真核生物分泌系および酵母の解糖経路は、原核生物ディスプレー系よりはるかに大きいscFv分子のサブセットを正確にフォールディングさせ、細胞表面に表示させる。定向進化と結び付けられた酵母ディスプレーを用いて、フルオレセインに関するscFc抗体断片のKDを48 fM(従来報告された一価リガンドより結合が2等級強力である)に増大した(Boder et al. (2000) PNAS 97: 10701-10705)。ディスプレー系は、a−アグルチニン酵母接着受容体を利用して、細胞表面にタンパク質を表示する。当該タンパク質は、本発明の場合、抗BoTN/BscFv LTMライブラリーまたは抗BoTN/AscFv LTMライブラリーを、Aga2タンパク質との融合相手として発現する。これらの融合タンパク質は、細胞から分泌され、そしてAga1タンパク質とジスルフィド結合されるようになり、これが酵母細胞壁に付着される(Invitrogen、pYD1酵母ディスプレー産物文献参照)。さらに包含されるカルボキシル末端タグが存在し、これを用いて、発現レベルをモニタリングし、および/または結合親和性測定値を正規化し得る。
当該抗体を、可溶性発現系(メタノール資化性酵母Pichia pastorisおよび/または大腸菌)中でサブクローニングして、可溶性タンパク質を生成する。可溶性抗体発現のためのいくつかの市販ベクターおよび細胞株が存在し、例としては、Invitrogen(例えばP. pastorisに関するpPIC9)およびNovagen(大腸菌におけるペリブラズム発現のためのpET20b)からのものが挙げられる。これらの系をルーチンに用いて、可溶性一本鎖または全長抗体を生成する。P. pastoris発現系(Invitrogen)は、1〜5 mg/リットルの可溶性精製scFvをルーチンに産生する。一本鎖の場合には分子のC末端のHis−タグの存在により、または全長抗体に関してはプロテインAまたはプロテインGカラムにより、タンパク質の精製を促進する。可溶性一本鎖および全長抗体を生成して、BIAcore親和性動態速度測定値を得る。酵母クローン細胞表面の高親和性scFv分子が無細胞可溶性分子として立証されねばならない場合、この段階が必要である。
BoNT中毒の指標として、したがって毒素中和を低了するための手段として、一次ニワトリニューロンの神経突起伸長を用いた細胞ベースの検定を用いて、選定抗体をスクリーニングし得る。ニワトリ受精卵からの後根神経節外植片培養を用いた予備実験は、BoNT/Aで処理した外植片からの、対照より低い神経突起伸長が認められることを示した。あるいはニワトリ毛様体神経節−虹彩筋肉神経筋肉連結検定(Lomneth et al. (1990) Neuroscience Letters 113: 211-216に記載)を用い得る。
本明細書中に記載した本発明の特定の実施形態に対する多数の均等物を、当業者は認識しているし、あるいはごく慣例的な実験を用いて確かめ得る。このような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されるよう意図される。
Claims (65)
- 予定アミノ酸がポリペプチドの限定領域中の各位置に出現するポリペプチド類似体のライブラリーの生成方法であって、以下の:
ポリペプチドのアミノ酸配列の限定領域を選択し;
限定領域内の各アミノ酸位置で置換されるべきアミノ酸残基を確定し;
限定領域をコードする個々のポリヌクレオチドを合成し、ポリヌクレオチドは集合的に以下の判定基準に従って考え得る変異体ポリヌクレオチドを表し:
i)各ポリヌクレオチドが、限定領域中の各コドン位置に、ポリペプチドのアミノ酸残基に必要なコドンまたは予定アミノ酸残基に関するコドンを含有し、
ii)各ポリヌクレオチドが予定アミノ酸残基に関する1つ以下のコドンを含有する;
それにより、予定アミノ酸残基が限定領域内の各アミノ酸位置に出現するポリヌクレオチドのライブラリーを生成する
ことを包含する方法。 - ポリヌクレオチドが一緒にプールされる、請求項1記載の方法。
- ポリペプチド内の2またはそれ以上の限定領域が突然変異化される、請求項1記載の方法。
- 同一予定アミノ酸が2またはそれ以上の各限定領域内での置換のために選択される、請求項3記載の方法。
- 異なる予定アミノ酸がそれぞれ2またはそれ以上の各限定領域内での置換のために選択される、請求項3記載の方法。
- 単数または複数の限定領域がポリペプチドの機能性ドメインを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 機能性ドメインが抗体結合部位、抗体フレームワーク領域、抗体エフェクター領域、受容体結合部位および触媒部位からなる群から選択される、請求項6記載の方法。
- 抗体結合部位またはその部分がCDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5、CDR6およびその組合せからなる群から選択されるCDRドメインを含む、請求項7記載の方法。
- 抗体フレームワーク領域がFR1、FR2、FR3、FR4およびその組合せからなる群から選択されるドメインを含む、請求項7記載の方法。
- 抗体エフェクター領域が補体結合部位およびFc結合領域からなる群から選択されるドメインを含む、請求項7記載の方法。
- 予定アミノ酸残基がSer、Thr、Asn、Gln、Tyr、Cys、His、Glu、Asp、Lys、Arg、Ala、Gly、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、TrpおよびValからなる群から選択される、請求項1記載の方法。
- 限定領域が少なくとも3〜40のアミノ酸を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- ポリヌクレオチドが発現ライブラリーとして合成される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- ポリヌクレオチドが酵素的手段を用いて合成される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- ポリヌクレオチドがポリメラーゼ連鎖反応を用いて合成される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 発現ライブラリーがファージディスプレーライブラリー、リボソーム/ポリソームディスプレーライブラリー、酵母ディスプレーライブラリー、細菌ディスプレーライブラリーおよびアレイ化ライブラリーからなる群から選択される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1記載の方法により調製されるポリペプチド類似体のライブラリー。
- 所望の構造または性能を有するポリペプチドの同定方法であって、以下の:
ポリペプチドのアミノ酸配列の限定領域を選択し;
限定領域内の各アミノ酸位置で置換されるべきアミノ酸残基を確定し;
限定領域をコードする個々のポリヌクレオチドを合成し、ポリヌクレオチドは集合的に以下の判定基準に従って考え得る変異体ポリヌクレオチドを表し:
i)各ポリヌクレオチドが、限定領域中の各コドン位置に、ポリペプチドのアミノ酸残基に必要なコドンまたは予定アミノ酸残基に関するコドンを含有し、
ii)各ポリヌクレオチドが予定アミノ酸残基に関する1つ以下のコドンを含有する;
それにより、ポリヌクレオチドを含有する発現ライブラリーを生成し;
ポリペプチド類似体を生成するために発現ライブラリーを発現し;そして
所望の構造または機能を有するポリペプチドに関して選択されるポリペプチド類似体をスクリーニングする
ことを包含する方法。 - 選定ポリペプチド類似体をコードするポリヌクレオチドを同定する過程をさらに包含する、請求項18記載の方法。
- スクリーニングがポリペプチドを標的基質と接触することを包含し、ポリペプチドがポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと関連づけられ、ポリヌクレオチドが検出可能部分をさらに含み、したがって標的基質を結合し得る変異体ポリペプチドが検出され、それによりポリヌクレオチドによりコードされると同定される、請求項18記載の方法。
- 検出可能部分が蛍光部分、UV部分および可視光吸収部分からなる群から選択される、請求項20記載の方法。
- 検出可能部分がビオチン部分、GST部分およびHisタグ部分からなる群から選択される、請求項20記載の方法。
- ポリヌクレオチドがリボソームディスプレーを用いてポリペプチド類似体と関連づけられる、請求項20記載の方法。
- ポリペプチド内の2つまたはそれ以上の限定領域が突然変異化される、請求項18記載の方法。
- 同一予定アミノ酸が2またはそれ以上の各限定領域内での置換のために選択される、請求項24記載の方法。
- 異なる予定アミノ酸がそれぞれ2またはそれ以上の各限定領域内での置換のために選択される、請求項24記載の方法。
- ポリペプチドが一本鎖抗体(sFV)である、請求項18記載の方法。
- 限定領域がポリペプチドの機能性ドメインを含む、請求項18記載の方法。
- 限定領域がCDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5、CDR6およびその組合せからなる群から選択されるCDRまたはその部分を含む、請求項18記載の方法。
- 限定領域がFR1、FR2、FR3、FR4およびその組合せからなる群から選択されるドメインを含む抗体フレームワーク領域である、請求項18記載の方法。
- 限定領域が補体結合部位およびFc結合領域からなる群から選択されるドメインを含む抗体エフェクター領域である、請求項18記載の方法。
- 予定アミノ酸残基がSer、Thr、Asn、Gln、Tyr、Cys、His、Glu、Asp、Lys、Arg、Ala、Gly、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、TrpおよびValからなる群から選択される、請求項18記載の方法。
- 1つまたは複数の限定領域を含むポリペプチド類似体をコードするポリヌクレオチドのライブラリーであって、予定アミノ酸残基が限定領域内の各アミノ酸位置で置換され、ポリヌクレオチドが集合的に以下の判定基準:
i)各ポリヌクレオチドが、限定領域中の各コドン位置に、ポリペプチドのアミノ酸残基に必要なコドンまたは予定アミノ酸残基に関するコドンを含有し、そして
ii)各ポリヌクレオチドが予定アミノ酸残基に関する1つ以下のコドンを含有する
に従って考え得る全ての変異体を表すライブラリー。 - ポリペプチド内の2つまたはそれ以上の限定領域が突然変異化される、請求項33記載のライブラリー。
- 同一予定アミノ酸が2またはそれ以上の各限定領域内での置換のために選択される、請求項33記載のライブラリー。
- 異なる予定アミノ酸がそれぞれ2またはそれ以上の各限定領域内での置換のために選択される、請求項33記載のライブラリー。
- 発現ライブラリーである、請求項33記載のライブラリー。
- 発現ライブラリーがファージディスプレーライブラリー、リボソーム/ポリソームディスプレーライブラリー、酵母ディスプレーライブラリー、細菌ディスプレーライブラリーおよびアレイ化ライブラリーからなる群から選択される、請求項33記載のライブラリー。
- ポリヌクレオチドが1つまたは複数の転写調節素子をさらに含む、請求項33記載のライブラリー。
- ポリヌクレオチドが、in vitroで転写および翻訳される場合、対応するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと関連づけられる、請求項39記載のライブラリー。
- ポリヌクレオチドがリボソーム/ポリソームディスプレーを用いてポリペプチドと関係づけられる、請求項40記載のライブラリー。
- ポリヌクレオチドがRNAを含む、請求項41記載のライブラリー。
- ポリヌクレオチドが検出可能部分をさらに含む、請求項42記載のライブラリー。
- 検出可能部分が蛍光部分を含む、請求項43記載のライブラリー。
- 少なくとも106の異なるポリヌクレオチドを含む、請求項33記載のライブラリー。
- 少なくとも45〜1012の異なるポリヌクレオチドを含む、請求項33記載のライブラリー。
- ポリペプチドが結合ポリペプチドをコードする、請求項33記載のライブラリー。
- 結合ポリペプチドが重鎖可変部(VH)、軽鎖可変部(VL)および一本鎖抗体(sFv)からなる群から選択される、請求項47記載のライブラリー。
- ポリヌクレオチドが酵素をコードする、請求項33記載のライブラリー。
- ポリヌクレオチドが酵素阻害剤をコードする、請求項33記載のライブラリー。
- ポリヌクレオチドが触媒ポリペプチドをコードする、請求項33記載のライブラリー。
- 固体支持体上に固定される、請求項33記載のライブラリー。
- 固体支持体がマイクロチップである、請求項33記載のライブラリー。
- アレイ化ライブラリーである、請求項33記載のライブラリー。
- 請求項33記載のライブラリーによる固定化ポリヌクレオチドのアレイを含むマイクロチップ。
- 標的分子と結合し、そして重鎖可変部(VH)、軽鎖可変部(VL)および一本鎖抗体(sFv)からなる群から選択される結合領域を含む、請求項33記載のライブラリーにより同定されるポリペプチド類似体。
- 特定標的分子がTNFαである、請求項56記載の分子。
- ポリペプチドが配列番号1、2、3、4、5または6のアミノ酸配列と少なくとも70%の同一性を有する、請求項56記載の分子。
- 所望の構造または性能を有するポリペプチドのサブセットの同定方法であって、以下の:
ポリペプチドのアミノ酸配列の限定領域を選択し;
限定領域内の各アミノ酸位置で置換されるべきアミノ酸残基を確定し;
限定領域をコードする個々のポリヌクレオチドを合成し、ポリヌクレオチドは集合的に以下の判定基準に従って考え得る変異体ポリヌクレオチドを表し:
i)各ポリヌクレオチドが、限定領域中の各コドン位置に、ポリペプチドのアミノ酸残基に必要なコドンまたは予定アミノ酸残基に関するコドンを含有し、
ii)各ポリヌクレオチドが予定アミノ酸残基に関する1つ以下のコドンを含有する;
それにより、ポリヌクレオチドを含有する発現ライブラリーを生成し;
ライブラリーが発現される条件下に発現ライブラリーを曝露し;
所望の構造または機能を有するポリペプチドを同定するための発現ライブラリーをスクリーニングし;
制御判定基準と比較した場合のポリペプチドの構造または機能を比較するが、この場合、対照判定基準に対応するかまたは上回るポリペプチドが応答体として分類され、そして対照判定基準内に入るポリペプチドが非応答体として分類され;
データベース中の応答体および非応答体を分類し;そして
データベースに照会して、合成されるべきサブセットポリペプチドの配列を確定する
ことを包含する方法。 - 1つまたは複数の前記過程がコンピューター援用される、請求項59記載の方法。
- 対照判定基準が結合親和性、安定性およびエフェクター機能からなる群から選択される、請求項59記載の方法。
- 対照判定基準が特定基質上の触媒活性である、請求項59記載の方法。
- ポリペプチドが重鎖可変部(VH)、軽鎖可変部(VL)および一本鎖抗体(sFv)からなる群から選択される、請求項59記載の方法。
- 請求項59記載の方法の1つまたは複数の過程を実行するための使用説明書を有する電子装置で用いるのに適した媒体。
- 請求項59記載の方法の1つまたは複数の過程を実行するための装置。
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