JP5647222B2 - Il−6r関連疾患及び障害の治療のためのil−6rに指向性を有する改善されたアミノ酸配列及びこれを含むポリペプチド - Google Patents
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Description
a)配列番号80〜配列番号82、若しくは
b)配列番号80〜配列番号82のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、2つ又は1つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ、及び/又は
c)配列番号84〜配列番号91、若しくは
d)配列番号84〜配列番号91のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、2つ又は1つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ、及び/又は
e)配列番号93〜配列番号95、若しくは
f)配列番号93〜配列番号95のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、2つ又は1つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
から選択されるアミノ酸残基ストレッチを1つ又は複数含む、アミノ酸配列を提供する。
1nM〜1pM以下、好ましくは500pM〜1pM以下、より好ましくは100pM〜1pM以下、又はさらにより好ましくは約50pM〜1pM以下の解離定数(KD)でhIL−6Rと結合するように、及び/又は
1nM〜1pM以下、好ましくは500pM〜1pM以下、より好ましくは100pM〜1pM以下、又はさらにより好ましくは約50pM〜1pM以下の解離定数(KD)でカニクイザル(cyno)IL−6Rと結合するように、及び/又は
104M−1s−1〜約107M−1s−1、好ましくは105M−1s−1〜107M−1s−1、より好ましくは約106M−1s−1以上のkon速度でhIL−6Rと結合するように、及び/又は
104M−1s−1〜約107M−1s−1、好ましくは105M−1s−1〜107M−1s−1、より好ましくは約106M−1s−1以上のkon速度でカニクイザルIL−6Rと結合するように、及び/又は
10−3s−1(t1/2=0.69s)〜10−6s−1(t1/2が数日である略不可逆的な複合体の場合)、好ましくは10−4s−1〜10−6s−1、より好ましくは10−5s−1〜10−6s−1、例えば約10−5s−1以下のkoff速度でhIL−6Rと結合するように、及び/又は
10−3s−1(t1/2=0.69s)〜10−6s−1(t1/2が数日である略不可逆的な複合体の場合)、好ましくは10−4s−1〜10−6s−1、より好ましくは10−5s−1〜10−6s−1、例えば約10−5s−1以下のkoff速度でカニクイザルIL−6Rと結合するように、
(さらに本明細書に記載されるような(実際又は見掛けの)KD値、(実際又は見掛けの)KA値、kon速度及び/又はkoff速度、又は代替的にIC50値として好適に測定される、及び/又は表される)或る親和性でIL−6Rと結合することができる。
a)配列番号80〜配列番号82、若しくは
b)配列番号80〜配列番号82のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、2つ又は1つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ、及び/又は
c)配列番号84〜配列番号91、若しくは
d)配列番号84〜配列番号91のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、2つ又は1つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ、及び/又は
e)配列番号93〜配列番号95、若しくは
f)配列番号93〜配列番号95のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、2つ又は1つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
から選択されるアミノ酸残基ストレッチを2つ以上含み得る。
a)配列番号80〜配列番号82、又は
b)配列番号80〜配列番号82のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、2つ又は1つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
からなる群から選択され、かつ
第2のアミノ酸残基ストレッチが
c)配列番号84〜配列番号91、又は
d)配列番号84〜配列番号91のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、2つ又は1つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
からなる群から選択され、かつ
第3のアミノ酸残基ストレッチが
e)配列番号93〜配列番号95、又は
f)配列番号93〜配列番号95のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、2つ又は1つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
からなる群から選択される、アミノ酸残基ストレッチを3つ以上含む。
FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4
(ここで、FR1〜FR4はそれぞれフレームワーク領域1〜フレームワーク領域4を表し、CDR1〜CDR3はそれぞれ相補性決定領域1〜相補性決定領域3を表し、1つ又は複数の特徴的な(Hallmark:ホールマーク)残基は特許文献7(表A−3〜表A−8)に規定されるようなものである)を有するアミノ酸配列として定義することができる。
a)配列番号80〜配列番号82、若しくは
b)配列番号80〜配列番号82のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、2つ又は1つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
からなる群から選択され、及び/又は
CDR2が、
c)配列番号84〜配列番号91、若しくは
d)配列番号84〜配列番号91のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、2つ又は1つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
からなる群から選択され、及び/又は
CDR3が、
e)配列番号93〜配列番号95、若しくは
f)配列番号93〜配列番号95のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、2つ又は1つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
からなる群から選択される。
a)配列番号80〜配列番号82、又は
b)配列番号80〜配列番号82のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、2つ又は1つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
からなる群から選択され、
CDR2が、
c)配列番号84〜配列番号91、又は
d)配列番号84〜配列番号91のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、2つ又は1つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
からなる群から選択され、かつ
CDR3が、
e)配列番号93〜配列番号95、又は
f)配列番号93〜配列番号95のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、2つ又は1つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
からなる群から選択される。
a)配列番号70〜配列番号72、
b)本発明のそのCDRの1つ、2つ又は全てにおいて配列番号70〜配列番号72のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するポリペプチド配列であって、本発明のそのCDRの1つ、2つ又は全てにおいてわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するポリペプチド配列は、配列番号70〜配列番号72のうちの1つによる結合と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、ポリペプチド配列、
c)配列番号70〜配列番号72のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するポリペプチド配列であって、配列番号70〜配列番号72のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するポリペプチド配列は、配列番号70〜配列番号72のうちの1つによる結合と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、ポリペプチド配列。
1nM〜1pM(モル/L)以下、好ましくは500pM〜1pM(モル/L)以下、より好ましくは100pM〜1pM(モル/L)以下、又はさらにより好ましくは約50pM〜1pM以下の解離定数(KD)でhIL−6Rと結合するように、及び/又は
1nM〜1pM(モル/L)以下、好ましくは500pM〜1pM(モル/L)以下、より好ましくは100pM〜1pM(モル/L)以下、又はさらにより好ましくは約50pM〜1pM以下の解離定数(KD)でカニクイザルIL−6Rと結合するように、及び/又は
104M−1s−1〜約107M−1s−1、好ましくは105M−1s−1〜107M−1s−1、より好ましくは約106M−1s−1以上のkon速度でhIL−6Rと結合するように、及び/又は
104M−1s−1〜約107M−1s−1、好ましくは105M−1s−1〜107M−1s−1、より好ましくは約106M−1s−1以上のkon速度でカニクイザルIL−6Rと結合するように、及び/又は
10−3s−1(t1/2=0.69s)〜10−6s−1(t1/2が数日である略不可逆的な複合体の場合)、好ましくは10−4s−1〜10−6s−1、より好ましくは10−5s−1〜10−6s−1、例えば約10−5s−1以下のkoff速度でhIL−6Rと結合するように、及び/又は
10−3s−1(t1/2=0.69s)〜10−6s−1(t1/2が数日である略不可逆的な複合体の場合)、好ましくは10−4s−1〜10−6s−1、より好ましくは10−5s−1〜10−6s−1、例えば約10−5s−1以下のkoff速度でカニクイザルIL−6Rと結合するように、
(さらに本明細書に記載されるような(実際又は見掛けの)KD値、(実際又は見掛けの)KA値、kon速度及び/又はkoff速度、又は代替的にIC50値として好適に測定される、及び/又は表される)或る親和性でIL−6Rと結合することができる。
a)好適な宿主細胞若しくは宿主生物において又は別の好適な発現系において、本発明の核酸若しくはヌクレオチド配列、又は本発明の遺伝子構築物を発現する工程、任意でその後
b)このようにして得られた、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド又は一価構築物を単離及び/又は精製する工程
を含み得る。
a)本発明の宿主又は宿主細胞が、少なくとも1つの本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド又は一価構築物を発現及び/又は産生するような条件下で、上記宿主又は宿主細胞を培養及び/又は維持する工程、任意でその後
b)このようにして得られた、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド又は一価構築物を単離及び/又は精製する工程
を含み得る。
a)特に他に指示又は規定がなければ、使用される全ての用語は、当業者にとって明らかな、当該技術分野における通常の意味を有する。例えば標準的なハンドブック(例えばSambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual"(2ndEd.), Vols. 1-3, Cold SpringHarbor Laboratory Press(1989)、F.Ausubel et al., eds., "Current protocols in molecular biology", GreenPublishing and Wiley Interscience, New York(1987)、Lewin, "Genes II", John Wiley & Sons, New York, N.Y.,(1985)、Old et al., "Principles of GeneManipulation: An Introduction to Genetic Engineering", 2nd edition,University of California Press, Berkeley, CA(1981)、Roitt et al., "Immunology"(6th.Ed.), Mosby/Elsevier, Edinburgh(2001)、Roitt et al., Roitt's EssentialImmunology, 10th Ed. Blackwell Publishing, UK(2001)、及びJaneway et al.,"Immunobiology"(6th Ed.), Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York(2005))、並びに本明細書で言及される一般的な背景技術を参照する。
CDR1配列:
a)配列番号80〜配列番号82、又は
b)配列番号80〜配列番号82のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、2つ又は1つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ、及び/又は
CDR2配列:
c)配列番号84〜配列番号91、又は
d)配列番号84〜配列番号91のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、2つ又は1つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ、及び/又は
CDR3配列:
e)配列番号93〜配列番号95、又は
f)配列番号93〜配列番号95のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、2つ又は1つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
からなる群から選択されるアミノ酸残基ストレッチを少なくとも1つ含み得る。
CDR1配列:
a)配列番号80〜配列番号82、又は
b)配列番号80〜配列番号82のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、2つ又は1つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ、及び/又は
CDR2配列:
c)配列番号84〜配列番号91、又は
d)配列番号84〜配列番号91のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、2つ又は1つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ、及び/又は
CDR3配列:
e)配列番号93〜配列番号95、又は
f)配列番号93〜配列番号95のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、2つ又は1つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
から選択されるアミノ酸残基ストレッチを2つ以上含むアミノ酸配列にも関する。
a)配列番号80〜配列番号82、又は
b)配列番号80〜配列番号82のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、2つ又は1つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
から選択され、
第2のアミノ酸残基ストレッチが以下のCDR2配列:
c)配列番号84〜配列番号91、又は
d)配列番号84〜配列番号91のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、2つ又は1つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
から選択され、かつ
第3のアミノ酸残基ストレッチが以下のCDR3配列:
e)配列番号93〜配列番号95、又は
f)配列番号93〜配列番号95のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、2つ又は1つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
から選択される、アミノ酸残基ストレッチを3つ以上含むアミノ酸配列にも関する。
KをRに置換し、
RをKに置換し、
AをS又はTに置換し、
SをA又はTに置換し、
TをA又はSに置換し、
IをL又はVに置換し、
LをI又はVに置換し、
VをI又はLに置換し、
FをYに置換し、
YをFに置換し、
NをDに置換し、
DをNに置換し、
QをEに置換し、
EをQに置換し、
GをAに置換し、
MをLに置換し、
H、C、W及びPは一定に保つ。
27位〜35位に関しては、
27位(カバットナンバリングを使用する)の元のアミノ酸残基をF;G;R;S;F、G、R、Sのうちの2つ;F、G、R、Sのうちの3つ;又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てに置換し、
28位(カバットナンバリングを使用する)の元のアミノ酸残基をA;I;S;T;A、I、S、Tのうちの2つ;A、I、S、Tのうちの3つ;又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てに置換し、
29位(カバットナンバリングを使用する)の元のアミノ酸残基をF;G;L;S;F、G、L、Sのうちの2つ;F、G、L、Sのうちの3つ;又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てに置換し、
30位(カバットナンバリングを使用する)の元のアミノ酸残基をD;G;S;T;D、G、S、Tのうちの2つ;D、G、S、Tのうちの3つ;又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てに置換し、
31位(カバットナンバリングを使用する)の元のアミノ酸残基をD;I;N;S;T;D、I、N、S、Tのうちの2つ;D、I、N、S、Tのうちの3つ;又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てに置換し、
32位(カバットナンバリングを使用する)の元のアミノ酸残基をD;N;Y;D、N、Yのうちの2つ;又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てに置換し、
33位(カバットナンバリングを使用する)の元のアミノ酸残基をA;G;T;V;A、G、T、Vのうちの2つ;A、G、T、Vのうちの3つ;又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てに置換し、
34位(カバットナンバリングを使用する)の元のアミノ酸残基をI;M;又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てに置換し、
35位(カバットナンバリングを使用する)の元のアミノ酸残基をA;G;S;A、G、Sのうちの2つ;又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てに置換し、
元のアミノ酸配列が52a位(カバットナンバリングを使用する)にアミノ酸配列を有する場合、50位〜58位に関しては、
50位(カバットナンバリングを使用する)の元のアミノ酸残基をA;C;G;S;T;A、C、G、S、Tのうちの2つ;A、C、G、S、Tのうちの3つ;A、C、G、S、Tのうちの4つ;又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てに置換し、
51位(カバットナンバリングを使用する)の元のアミノ酸残基をIに置換し、
52位(カバットナンバリングを使用する)の元のアミノ酸残基をN;R;S;T;N、R、S、Tのうちの2つ;N、R、S、Tのうちの3つ;又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てに置換し、
52a位(カバットナンバリングを使用する)の元のアミノ酸残基をR;S;T;W;R、S、T、Wのうちの2つ;R、S、T、Wのうちの3つ;又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てに置換し、
53位(カバットナンバリングを使用する)の元のアミノ酸残基をD;G;N;S;T;D、G、N、S、Tのうちの2つ;D、G、N、S、Tのうちの3つ;D、G、N、S、Tのうちの4つ;又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てに置換し、
54位(カバットナンバリングを使用する)の元のアミノ酸残基をD;G;又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てに置換し、
55位(カバットナンバリングを使用する)の元のアミノ酸残基をD;G;S;D、G、Sのうちの2つ;又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てに置換し、
56位(カバットナンバリングを使用する)の元のアミノ酸残基をI;N;R;S;T;I、N、R、S、Tのうちの2つ;I、N、R、S、Tのうちの3つ;I、N、R、S、Tのうちの4つ;又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てに置換し、
57位(カバットナンバリングを使用する)の元のアミノ酸残基をTに置換し、
58位(カバットナンバリングを使用する)の元のアミノ酸残基をD;H;N;S;Y;D、H、N、S、Yのうちの2つ;D、H、N、S、Yのうちの3つ;D、H、N、S、Yのうちの4つ;又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てに置換し、
元のアミノ酸配列が52a位(カバットナンバリングを使用する)にアミノ酸配列を有しない場合、50位〜58位に関しては、
50位(カバットナンバリングを使用する)の元のアミノ酸残基をA;G;R;S;T;A、G、R、S、Tのうちの2つ;A、G、R、S、Tのうちの3つ;A、G、R、S、Tのうちの4つ;又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てに置換し、
51位(カバットナンバリングを使用する)の元のアミノ酸残基をIに置換し、
52位(カバットナンバリングを使用する)の元のアミノ酸残基をN;S;T;N、S、Tのうちの2つ;又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てに置換し、
53位(カバットナンバリングを使用する)の元のアミノ酸残基をN;R;S;T;Y;N、R、S、T、Yのうちの2つ;N、R、S、T、Yのうちの3つ;N、R、S、T、Yのうちの4つ;又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てに置換し、
54位(カバットナンバリングを使用する)の元のアミノ酸残基をD;G;R;S;D、G、R、Sのうちの2つ;D、G、R、Sのうちの3つ;又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てに置換し、
55位(カバットナンバリングを使用する)の元のアミノ酸残基をGに置換し、
56位(カバットナンバリングを使用する)の元のアミノ酸残基をG;N;R;S;T;D、N、R、S、Tのうちの2つ;D、N、R、S、Tのうちの3つ;D、N、R、S、Tのうちの4つ;又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てに置換し、
57位(カバットナンバリングを使用する)の元のアミノ酸残基をTに置換し、
58位(カバットナンバリングを使用する)の元のアミノ酸残基をD;N;T;Y;D、N、T、Yのうちの2つ;D、N、T、Yのうちの3つ;又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てに置換し、
その後(本明細書中にさらに記載のように、それ自体が既知の任意の方法で)このようにして求めた、潜在的に有用な置換(又はその組合せ)の1つ又は複数を上記CDR配列に導入することができ、IL−6Rに対する親和性、及び/又はIL−6/IL−6R相互作用を(一部又は好ましくは完全に)遮断する、及び/又はIL−6、IL−6R及び/又はIL−6/IL−6R複合体を介したシグナル伝達を阻害する能力等の他の所望の特性に関して、得られたアミノ酸配列(複数可)を試験することができる。このようにして、当業者は本明細書中の開示に基づき限定的な試行錯誤によって、CDRにおける他の好適な置換(又はその好適な組合せ)を求めることができる。
FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4
の構造を有する。
a)配列番号80〜配列番号82、又は
b)配列番号80〜配列番号82のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、2つ又は1つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
からなる群から選択され、及び/又は
CDR2が、
c)配列番号84〜配列番号91、又は
d)配列番号84〜配列番号91のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、2つ又は1つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
からなる群から選択され、及び/又は
CDR3が、
e)配列番号93〜配列番号95、又は
f)配列番号93〜配列番号95のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、2つ又は1つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
からなる群から選択される、アミノ酸配列にも関する。
a)配列番号80〜配列番号82、又は
b)配列番号80〜配列番号82のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、2つ又は1つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
からなる群から選択され、かつ
CDR2が、
c)配列番号84〜配列番号91、又は
d)配列番号84〜配列番号91のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、2つ又は1つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
からなる群から選択され、かつ
CDR3が、
e)配列番号93〜配列番号95、又は
f)配列番号93〜配列番号95のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、2つ又は1つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
からなる群から選択される、アミノ酸配列にも関する。
a)配列番号60〜配列番号69;
b)そのCDR配列の1つ、2つ又は全てにおいて配列番号60〜配列番号69のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であって、そのCDR配列の1つ、2つ又は全てにおいてわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列は、配列番号60〜配列番号69のうちの1つによる結合と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、アミノ酸配列;並びに
c)配列番号60〜配列番号69のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有する配列であって、配列番号60〜配列番号69のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列は、配列番号60〜配列番号69のうちの1つによる結合と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、配列からなる群から選択される。
a)配列番号65〜配列番号69;
b)そのCDR配列の1つ、2つ又は全てにおいて配列番号65〜配列番号69のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であって、そのCDR配列の1つ、2つ又は全てにおいてわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列は、配列番号65〜配列番号69のうちの1つによる結合と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、アミノ酸配列;並びに
c)配列番号65〜配列番号69のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有する配列であって、配列番号65〜配列番号69のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列は、配列番号65〜配列番号69のうちの1つによる結合と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、配列からなる群から選択される。
a)配列番号66、
b)そのCDR配列の1つ、2つ又は全てにおいて配列番号66とわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であって、そのCDR配列の1つ、2つ又は全てにおいてわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列は、配列番号66による結合と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、アミノ酸配列、並びに
c)配列番号66とわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有する配列であって、わずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列は、配列番号66による結合と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、配列
からなる群から選択される。
1nM〜1pM(モル/L)以下、好ましくは500pM〜1pM(モル/L)以下、より好ましくは100pM〜1pM(モル/L)以下、又はさらにより好ましくは約50pM〜1pM以下の解離定数(KD)でhIL−6Rと結合するように、及び/又は
1nM〜1pM(モル/L)以下、好ましくは500pM〜1pM(モル/L)以下、より好ましくは100pM〜1pM(モル/L)以下、又はさらにより好ましくは約50pM〜1pM以下の解離定数(KD)でカニクイザルIL−6Rと結合するように、及び/又は
104M−1s−1〜約107M−1s−1、好ましくは105M−1s−1〜107M−1s−1、より好ましくは約106M−1s−1以上のkon速度でhIL−6Rと結合するように、及び/又は
104M−1s−1〜約107M−1s−1、好ましくは105M−1s−1〜107M−1s−1、より好ましくは約106M−1s−1以上のkon速度でカニクイザルIL−6Rと結合するように、及び/又は
10−3s−1(t1/2=0.69s)〜10−6s−1(t1/2が数日である略不可逆的な複合体の場合)、好ましくは10−4s−1〜10−6s−1、より好ましくは10−5s−1〜10−6s−1、例えば約10−5s−1以下のkoff速度でhIL−6Rと結合するように、及び/又は
10−3s−1(t1/2=0.69s)〜10−6s−1(t1/2が数日である略不可逆的な複合体の場合)、好ましくは10−4s−1〜10−6s−1、より好ましくは10−5s−1〜10−6s−1、例えば約10−5s−1以下のkoff速度でカニクイザルIL−6Rと結合するように、
(さらに本明細書に記載されるような(実際又は見掛けの)KD値、(実際又は見掛けの)KA値、kon速度及び/又はkoff速度、又は代替的にIC50値として好適に測定される、及び/又は表される)或る親和性でIL−6Rと結合するものとする。
1nM〜1pM(モル/L)以下、好ましくは500pM〜1pM(モル/L)以下、より好ましくは100pM〜1pM(モル/L)以下、又はさらにより好ましくは約50pM〜1pM以下の解離定数(KD)でhIL−6Rと結合するように、及び/又は
1nM〜1pM(モル/L)以下、好ましくは500pM〜1pM(モル/L)以下、より好ましくは100pM〜1pM(モル/L)以下、又はさらにより好ましくは約50pM〜1pM以下の解離定数(KD)でカニクイザルIL−6Rと結合するように、及び/又は
104M−1s−1〜約107M−1s−1、好ましくは105M−1s−1〜107M−1s−1、より好ましくは約106M−1s−1以上のkon速度でhIL−6Rと結合するように、及び/又は
104M−1s−1〜約107M−1s−1、好ましくは105M−1s−1〜107M−1s−1、より好ましくは約106M−1s−1以上のkon速度でカニクイザルIL−6Rと結合するように、及び/又は
10−3s−1(t1/2=0.69s)〜10−6s−1(t1/2が数日である略不可逆的な複合体の場合)、好ましくは10−4s−1〜10−6s−1、より好ましくは10−5s−1〜10−6s−1、例えば約10−5s−1以下のkoff速度でhIL−6Rと結合するように、及び/又は
10−3s−1(t1/2=0.69s)〜10−6s−1(t1/2が数日である略不可逆的な複合体の場合)、好ましくは10−4s−1〜10−6s−1、より好ましくは10−5s−1〜10−6s−1、例えば約10−5s−1以下のkoff速度でカニクイザルIL−6Rと結合するようなものであるのが好ましい。
a)配列番号70〜配列番号72、
b)本発明のそのCDRの1つ、2つ又は全てにおいて配列番号70〜配列番号72のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するポリペプチド配列であって、本発明のそのCDRの1つ、2つ又は全てにおいてわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するポリペプチド配列は、配列番号70〜配列番号72のうちの1つによる結合と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、ポリペプチド配列、並びに
c)配列番号70〜配列番号72のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するポリペプチド配列であって、配列番号70〜配列番号72のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列は、配列番号70〜配列番号72のうちの1つによる結合と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、ポリペプチド配列。
a)配列番号71〜配列番号72、
b)本発明のそのCDRの1つ、2つ又は全てにおいて配列番号71〜配列番号72のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するポリペプチド配列であって、本発明のそのCDRの1つ、2つ又は全てにおいてわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するポリペプチド配列は、配列番号71〜配列番号72のうちの1つによる結合と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、ポリペプチド配列、並びに
c)配列番号71〜配列番号72のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するポリペプチド配列であって、配列番号71〜配列番号72のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列は、配列番号71〜配列番号72のうちの1つによる結合と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、ポリペプチド配列。
a)配列番号70、
b)本発明のそのCDRの1つ、2つ又は全てにおいて配列番号70とわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するポリペプチド配列であって、本発明のそのCDRの1つ、2つ又は全てにおいてわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するポリペプチド配列は、配列番号70による結合と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、ポリペプチド配列、並びに
c)配列番号70とわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するポリペプチド配列であって、配列番号70とわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列は、配列番号70による結合と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、ポリペプチド配列。
1nM〜1pM(モル/L)以下、好ましくは500pM〜1pM(モル/L)以下、より好ましくは100pM〜1pM(モル/L)以下、又はさらにより好ましくは約50pM〜1pM以下の解離定数(KD)でhIL−6Rと結合するように、及び/又は
1nM〜1pM(モル/L)以下、好ましくは500pM〜1pM(モル/L)以下、より好ましくは100pM〜1pM(モル/L)以下、又はさらにより好ましくは約50pM〜1pM以下の解離定数(KD)でカニクイザルIL−6Rと結合するように、及び/又は
104M−1s−1〜約107M−1s−1、好ましくは105M−1s−1〜107M−1s−1、より好ましくは約106M−1s−1以上のkon速度でhIL−6Rと結合するように、及び/又は
104M−1s−1〜約107M−1s−1、好ましくは105M−1s−1〜107M−1s−1、より好ましくは約106M−1s−1以上のkon速度でカニクイザルIL−6Rと結合するように、及び/又は
10−3s−1(t1/2=0.69s)〜10−6s−1(t1/2が数日である略不可逆的な複合体の場合)、好ましくは10−4s−1〜10−6s−1、より好ましくは10−5s−1〜10−6s−1、例えば約10−5s−1以下のkoff速度でhIL−6Rと結合するように、及び/又は
10−3s−1(t1/2=0.69s)〜10−6s−1(t1/2が数日である略不可逆的な複合体の場合)、好ましくは10−4s−1〜10−6s−1、より好ましくは10−5s−1〜10−6s−1、例えば約10−5s−1以下のkoff速度でカニクイザルIL−6Rと結合するように、
(さらに本明細書に記載されるような(実際又は見掛けの)KD値、(実際又は見掛けの)KA値、kon速度及び/又はkoff速度、又は代替的にIC50値として好適に測定される、及び/又は表される)或る親和性でIL−6Rと結合するものとする。
1nM〜1pM(モル/L)以下、好ましくは500pM〜1pM(モル/L)以下、より好ましくは100pM〜1pM(モル/L)以下、又はさらにより好ましくは約50pM〜1pM以下の解離定数(KD)でhIL−6Rと結合する、及び/又は
1nM〜1pM(モル/L)以下、好ましくは500pM〜1pM(モル/L)以下、より好ましくは100pM〜1pM(モル/L)以下、又はさらにより好ましくは約50pM〜1pM以下の解離定数(KD)でカニクイザルIL−6Rと結合する、及び/又は
104M−1s−1〜約107M−1s−1、好ましくは105M−1s−1〜107M−1s−1、より好ましくは約106M−1s−1以上のkon速度でhIL−6Rと結合する、及び/又は
104M−1s−1〜約107M−1s−1、好ましくは105M−1s−1〜107M−1s−1、より好ましくは約106M−1s−1以上のkon速度でカニクイザルIL−6Rと結合する、及び/又は
10−3s−1(t1/2=0.69s)〜10−6s−1(t1/2が数日である略不可逆的な複合体の場合)、好ましくは10−4s−1〜10−6s−1、より好ましくは10−5s−1〜10−6s−1、例えば約10−5s−1以下のkoff速度でhIL−6Rと結合する、及び/又は
10−3s−1(t1/2=0.69s)〜10−6s−1(t1/2が数日である略不可逆的な複合体の場合)、好ましくは10−4s−1〜10−6s−1、より好ましくは10−5s−1〜10−6s−1、例えば約10−5s−1以下のkoff速度でカニクイザルIL−6Rと結合するようなものであるのが好ましい。
a)例えば異種宿主細胞又は異種宿主生物において発現した結果得られるN末端Met残基を含み得る。
b)合成の際に宿主細胞からのアミノ酸配列、ナノボディ、化合物又はポリペプチドの分泌を導く、シグナル配列又はリーダー配列を形成してもよい。好適な分泌リーダーペプチドは当業者にとって明らかであり、本明細書中にさらに記載される通りであり得る。通常、このようなリーダー配列は、アミノ酸配列、ナノボディ、化合物又はポリペプチドのN末端に連結されるが、本発明は最も広い意味では、これに限定されるものではない。
c)アミノ酸配列、ナノボディ、化合物又はポリペプチドが、特定の器官、組織、細胞、又は細胞の一部若しくはコンパートメントに指向性を有し、及び/又はそれらに浸透するか若しくは侵入することを可能にし、及び/又はアミノ酸配列、ナノボディ、化合物又はポリペプチドが、細胞膜、上皮細胞の層等の細胞層、固形腫瘍を含む腫瘍、又は血液脳関門のような生物学的障壁に浸透するか若しくはそれらを横断することを可能にする、配列又はシグナルを形成し得る。このようなアミノ酸配列の例は当業者にとって明らかであろう。幾つかの非限定的な例は、国際公開第03/026700号、並びにTemsamani et al., Expert Opin. Biol. Ther., 1, 773 (2001)、Temsamani and Vidal, Drug Discov.Today, 9, 1012 (004)及びRousselle,J. Pharmacol. Exp. Ther., 296, 124-131 (2001)に記載されている小さいペプチドベクター(「Pep−transベクター」)、並びにZhao et al., Apoptosis, 8, 631-637 (2003)によって記載されている膜輸送体配列である。抗体断片の細胞内標的のためのC末端アミノ酸配列及びN末端アミノ酸配列は、例えばCardinale et al., Methods, 34, 171 (2004)によって記載されている。細胞内標的化の他の好適な技法は、以下に記述されるような、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、化合物又はポリペプチドを含むいわゆる「細胞内抗体」の発現及び/又は使用を伴う。
d)「タグ」、例えばアミノ酸配列、ナノボディ、化合物若しくはポリペプチドの精製を、例えばその配列又は残基を対象とする親和性技法を用いて可能にするか又は容易にする、アミノ酸配列又は残基を形成し得る。その後、(例えば化学的又は酵素学的な切断によって)上記の配列又は残基を除去して、アミノ酸配列、ナノボディ、化合物又はポリペプチド配列をもたらし得る(この目的のために、タグは任意で、切断可能なリンカー配列を介してアミノ酸配列、ナノボディ、化合物若しくはポリペプチドに連結されてもよく、又は切断可能なモチーフを含有していてもよい)。このような残基の好ましいが非限定的な幾つかの例は、複数のヒスチジン残基、グルタチオン残基、及びAAAEQKLISEEDLNGAA(配列番号100)等のmycタグである。
e)官能基化した及び/又は官能基の結合部位として機能することができる1つ又は複数のアミノ酸残基であり得る。好適なアミノ酸残基及び官能基は当業者にとって明らかであり、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、化合物又はポリペプチド配列の誘導体について本明細書中に記述されたアミノ酸残基及び官能基が挙げられるが、これらに限定されない。
好適な宿主細胞又は宿主生物(本明細書中では「本発明の宿主」とも称される)において、又は上記の本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドをコードする核酸(本明細書中では「本発明の核酸」とも称される)に別の適切な発現系において、発現する工程と、場合によってはその後、
このようにして得られる本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドを単離及び/又は精製する工程とを含む。
本発明の宿主が少なくとも1つの本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及び/又はポリペプチドを発現及び/又は産生するような条件下で、上記の本発明の宿主を培養及び/又は維持する工程と、場合によってはその後、
このようにして得られる本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドを単離及び/又は精製する工程とを含み得る。
a)b)と作用可能に結合している少なくとも1つの本発明の核酸と、
b)プロモーター、及び場合によっては好適なターミネーター等の1つ又は複数の調節要素と、場合によってはさらに
c)それ自体が既知の遺伝子構築物の1つ又は複数のさらなる要素とを含み、ここで、用語「調節要素」、「プロモーター」、「ターミネーター」、及び「作用可能に結合した」は、当該技術分野における(本明細書中に詳述するような)通常の意味を有しており、遺伝子構築物中に存在する上記「さらなる要素」とは、例えば3’−又は5’−UTR配列、リーダー配列、選択マーカー、発現マーカー/レポーター遺伝子、及び/又は形質転換若しくは組込み(の効率)を促進又は増大させ得る要素であってもよい。このような遺伝子構築物に好適なこれら及び他の要素は当業者にとって明らかであり、例えば使用する構築物の種類、対象となる宿主細胞又は宿主生物、対象の本発明のヌクレオチド配列を発現させる方法(例えば構成的発現、一時的発現、又は誘導性発現等を介するもの)、及び/又は使用する形質転換法に応じて決定することができる。例えば抗体及び抗体断片((単一)ドメイン抗体及びScFv断片が挙げられるが、これらに限定されない)の発現及び産生のための、それ自体が既知の調節配列、プロモーター、及びターミネーターを、本質的に類似の方法で使用してもよい。
細菌株(大腸菌の株、ミラビリス変形菌等のプロテウス属の株、蛍光菌等のシュードモナス属の株等のグラム陰性株;及び枯草菌又はブレビス菌等のバチルス属の株、ストレプトミセス・リビダンス(Streptomyces lividans)等のストレプトミセス属の株、スタフィロコッカス・カルノサス(Staphylococcus carnosus)等のブドウ球菌の株、及び乳酸連鎖球菌等のラクトコッカス属の株等のグラム陽性株が挙げられるがこれらに限定されない)、
真菌細胞(トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)等のトリコデルマ属、アカパンカビ等のニューロスポラ属、ソルダリア・マクロスポラ(Sordaria macrospora)等のソルダリア属、アスペルギルス・ニガー(Aspergillusniger)又はショウユコウジカビ等のアスペルギルス属、又は他の糸状菌由来の細胞が挙げられるがこれらに限定されない)、
酵母細胞(出芽酵母等のサッカロミセス属、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)等のシゾサッカロミセス属、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)又はピキア・メタノリカ(Pichiamethanolica)等のピキア属、ハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)等のハンセヌラ属、クルイベロミセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)等のクルイベロミセス属、アークスラ・アデニニボランス(Arxula adeninivorans)等のアークスラ属、ヤロウィア・リポリチカ(Yarrowialipolytica)等のヤロウィア属由来の細胞が挙げられるがこれらに限定されない)、
アフリカツメガエル卵母細胞等の両生類細胞又は細胞株、
昆虫に由来する細胞又は細胞株、例えばシロイチモンジヨトウSF9及びSf21細胞を含むがこれらに限定されない鱗翅目に由来する細胞/細胞株、又はシュナイダー細胞及びKc細胞等のショウジョウバエに由来する細胞/細胞株、
植物又は植物細胞、例えばタバコ植物、及び/又は
哺乳類細胞又は細胞株、例えばCHO細胞、BHK細胞(例えばBHK−21細胞)、並びにHeLa細胞、COS細胞(例えばCOS−7細胞)、及びPER.C6細胞等のヒト細胞又は細胞株が挙げられるがこれらに限定されない、ヒトに由来する細胞又は細胞株、哺乳動物に由来する細胞又は細胞株、並びに
抗体及び抗体断片((単一)ドメイン抗体及びScFv断片が挙げられるがこれらに限定されない)の発現及び産生に関してそれ自体が既知の他の全ての宿主又は宿主細胞であってもよく、これらは当業者に明らかであろう。上記で引用した一般的な背景技術に関する文献、及び例えば国際公開第94/29457号、国際公開第96/34103号、国際公開第99/42077号、Frenken et al.(1998, Res. Immunol. 149(6): 589-99)、Riechmannand Muyldermans (1999, J. Immunol. Methods, 231(1-2): 25-38)、van derLinden (2000, J. Biotechnol. 80(3): 261-70)、Joostenet al.(2003, Microb. Cell Fact. 2(1): 1)、Joosten et al.(2005, Appl. Microbiol. Biotechnol. 66(4): 384-92)及び本明細書中に引用したさらなる文献を参照する。
大腸菌における発現のための、lacプロモーター(及びlacUV5プロモーター等のこれらの誘導体)、アラビノースプロモーター、λファージの左側(PL)及び右側(PR)プロモーター、trpオペロンのプロモーター、ハイブリッドlac/trpプロモーター(tac及びtrc)、T7−プロモーター(より具体的にはT7−ファージ遺伝子10のプロモーター)、及び他のT−ファージプロモーター、Tn10テトラサイクリン耐性遺伝子のプロモーター、外来制御オペレーター配列の1つ又は複数を含む上記プロモーターの組換え変異体;
出芽酵母における発現のための、ADH1(アルコール脱水素酵素1)、ENO(エノラーゼ)、CYC1(チトクロームc iso−1)、GAPDH(グリセルアルデヒド−3−リン酸脱水素酵素)、PGK1(ホスホグリセリン酸キナーゼ)、PYK1(ピルビン酸キナーゼ)の構成的プロモーター;GAL1,10,7(ガラクトース代謝酵素)、ADH2(アルコール脱水素酵素2)、PHO5(酸ホスファターゼ)、CUP1(銅メタロチオネイン)の制御的プロモーター、CaMV(カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター)の外来プロモーター;
ピキア・パストリスにおける発現のための、AOX1プロモーター(アルコール酸化酵素I);
哺乳動物細胞における発現のための、ヒトサイトメガロウイルス(hCMV)前初期エンハンサー/プロモーター、プロモーターがTetリプレッサーによって制御可能なように2個のテトラサイクリンオペレーター配列を含有するヒトサイトメガロウイルス(hCMV)前初期プロモーター変異体、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(TK)プロモーター、ラウス肉腫ウイルスの長末端反復配列(RSV LTR)エンハンサー/プロモーター、ヒト、チンパンジー、マウス、又はラット由来の伸長因子1α(hEF−1α)プロモーター、SV40初期プロモーター、HIV−1の長末端反復配列プロモーター、βアクチンプロモーターが挙げられる。
哺乳動物細胞における発現のためのベクター:pMAMneo(Clontech)、pcDNA3(Invitrogen)、pMC1neo(Stratagene)、pSG5(Stratagene)、EBO−pSV2−neo(ATCC 37593)、pBPV−1(8−2)(ATCC 37110)、pdBPV−MMTneo(342−12)(ATCC 37224)、pRSVgpt(ATCC 37199)、pRSVneo(ATCC 37198)、pSV2−dhfr(ATCC 37146)、pUCTag(ATCC 37460)及び1ZD35(ATCC 37565)、並びにアデノウイルスに基づくもの等のウイルスに基づく発現系;
細菌細胞における発現のためのベクター:pETベクター(Novagen)及びpQEベクター(Qiagen);
酵母又は別の真菌細胞における発現のためのベクター:pYES2(Invitrogen)及びピキア発現ベクター(Invitrogen);
昆虫細胞における発現のためのベクター:pBlueBacII(Invitrogen)及び他のバキュロウイルスベクター;
植物又は植物細胞における発現のためのベクター:例えばカリフラワーモザイクウイルス又はタバコモザイクウイルス、アグロバクテリウムの好適な株に基づくベクター、又はTi−プラスミドベースのベクターが挙げられる。
大腸菌等の細菌細胞における使用のため、PelB、Bla、OmpA、OmpC、OmpF、OmpT、StII、PhoA、PhoE、MalE、Lpp、LamB等;TATシグナルペプチド、ヘモリシンC−末端分泌シグナル;
酵母における使用のため、α−接合因子プレプロ配列、ホスファターゼ(pho1)、インベルターゼ(Suc)等;
哺乳動物細胞における使用のため、標的タンパク質が真核細胞起源である場合には、固有シグナル、マウスIgκ鎖V−J2−Cシグナルペプチド等が挙げられる。
態様1. IL−6Rに指向性を有するアミノ酸配列であって、
a)配列番号80〜配列番号82、若しくは
b)配列番号80〜配列番号82のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、2つ又は1つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ、及び/又は
c)配列番号84〜配列番号91、若しくは
d)配列番号84〜配列番号91のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、2つ又は1つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ、及び/又は
e)配列番号93〜配列番号95、若しくは
f)配列番号93〜配列番号95のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、1つ又は2つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
から選択されるアミノ酸残基ストレッチを1つ又は複数含む、アミノ酸配列。
態様2. (i)第1のアミノ酸残基ストレッチがa)若しくはb)によるアミノ酸配列のうちの1つに対応する場合、第2のアミノ酸残基ストレッチは、c)、d)、e)若しくはf)によるアミノ酸配列のうちの1つに対応し、(ii)第1のアミノ酸残基ストレッチがc)若しくはd)によるアミノ酸配列のうちの1つに対応する場合、第2のアミノ酸残基ストレッチは、a)、b)、e)若しくはf)によるアミノ酸配列のうちの1つに対応し、又は(iii)第1のアミノ酸残基ストレッチがe)若しくはf)によるアミノ酸配列のうちの1つに対応する場合、第2のアミノ酸残基ストレッチは、a)、b)、c)若しくはd)によるアミノ酸配列のうちの1つに対応するように、
a)配列番号80〜配列番号82、若しくは
b)配列番号80〜配列番号82のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、2つ又は1つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ、及び/又は
c)配列番号84〜配列番号91、若しくは
d)配列番号84〜配列番号91のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、2つ又は1つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ、及び/又は
e)配列番号93〜配列番号95、若しくは
f)配列番号93〜配列番号95のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、1つ又は2つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
から選択されるアミノ酸残基ストレッチを2つ以上含む、態様1に記載のアミノ酸配列。
態様3. 第1のアミノ酸残基ストレッチが
a)配列番号80〜配列番号82、又は
b)配列番号80〜配列番号82のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、2つ又は1つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
からなる群から選択され、
第2のアミノ酸残基ストレッチが
c)配列番号84〜配列番号91、又は
d)配列番号84〜配列番号91のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、2つ又は1つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
からなる群から選択され、かつ
第3のアミノ酸残基ストレッチが
e)配列番号93〜配列番号95、又は
f)配列番号93〜配列番号95のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、1つ又は2つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
からなる群から選択される、アミノ酸残基ストレッチを3つ以上含む、態様1又は2に記載のアミノ酸配列。
態様4. 免疫グロブリンフォールドを含むか、又は好適な条件下で免疫グロブリンフォールドを形成することが可能である、態様1〜3のいずれか一つに記載のアミノ酸配列。
態様5. 免疫グロブリン配列である、態様1〜4のいずれか一つに記載のアミノ酸配列。
態様6. 4つのフレームワーク領域(それぞれ、FR1〜FR4)と、3つの相補性決定領域(それぞれ、CDR1〜CDR3)とから本質的になり、ここでCDR1が、
a)配列番号80〜配列番号82、又は
b)配列番号80〜配列番号82のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、2つ又は1つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
からなる群から選択され、及び/又は
CDR2が、
c)配列番号84〜配列番号91、又は
d)配列番号84〜配列番号91のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、2つ又は1つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
からなる群から選択され、及び/又は
CDR3が、
e)配列番号93〜配列番号95、又は
f)配列番号93〜配列番号95のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、1つ又は2つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
からなる群から選択される、態様1〜5のいずれか一つに記載のアミノ酸配列。
態様7. 4つのフレームワーク領域(それぞれ、FR1〜FR4)と、3つの相補性決定領域(それぞれ、CDR1〜CDR3)とから本質的になり、ここでCDR1が、
a)配列番号80〜配列番号82、又は
b)配列番号80〜配列番号82のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、2つ又は1つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
からなる群から選択され、かつ
CDR2が、
c)配列番号84〜配列番号91、又は
d)配列番号84〜配列番号91のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、2つ又は1つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
からなる群から選択され、かつ
CDR3が、
e)配列番号93〜配列番号95、又は
f)配列番号93〜配列番号95のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、1つ又は2つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
からなる群から選択される、態様6に記載のアミノ酸配列。
態様8. 少なくとも、
a)配列番号80、又は
b)配列番号80とわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、2つ又は1つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
を含む、態様1〜7のいずれか一つに記載のアミノ酸配列。
態様9.少なくとも、
a)配列番号84、配列番号89若しくは配列番号91、又は
b)配列番号84、配列番号89若しくは配列番号91のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、1つ又は2つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
から選択されるアミノ酸残基ストレッチを含む、態様1〜8のいずれか一つに記載のアミノ酸配列。
態様10. 少なくとも、
a)配列番号84、又は
b)配列番号84とわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、2つ又は1つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
を含む、態様1〜9のいずれか一つに記載のアミノ酸配列。
態様11. 少なくとも、
a)配列番号93〜配列番号94、又は
b)配列番号93〜配列番号94のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、1つ又は2つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
から選択されるアミノ酸残基ストレッチを含む、態様1〜10のいずれか一つに記載のアミノ酸配列。
態様12. 少なくとも、
a)配列番号93、又は
b)配列番号93とわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、2つ又は1つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
を含む、態様1〜11のいずれか一つに記載のアミノ酸配列。
態様13.
a)配列番号80及び配列番号84、
b)配列番号80及び配列番号93、又は
c)配列番号84及び配列番号93
から選択されるアミノ酸残基ストレッチを少なくとも2つ含む、態様1〜12のいずれか一つに記載のアミノ酸配列。
態様14. 配列番号80、配列番号84及び配列番号93を含む、態様1〜13のいずれか一つに記載のアミノ酸配列。
態様15. 従来の4鎖抗体由来の重鎖可変ドメイン配列から本質的になるか、又は重鎖抗体由来の重鎖可変ドメイン配列から本質的になる、態様1〜14のいずれか一つに記載のアミノ酸配列。
態様16. ドメイン抗体(又はドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列)、単一ドメイン抗体(又は単一ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列)、「dAb」(又はdAbとしての使用に好適なアミノ酸配列)又はナノボディから本質的になる、態様1〜15のいずれか一つに記載のアミノ酸配列。
態様17.
a)配列番号60〜配列番号69、
b)そのCDRの1つ、2つ又は全てにおいて配列番号60〜配列番号69のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有する配列であって、そのCDRの1つ、2つ又は全てにおいてわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列は、配列番号60〜配列番号69のうちの1つによる結合と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、配列、
c)配列番号60〜配列番号69のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有する配列であって、配列番号60〜配列番号69のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列は、配列番号60〜配列番号69のうちの1つによる結合と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、配列
からなる群から選択される、態様1〜16のいずれか一つに記載のアミノ酸配列。
態様18.
a)配列番号65〜配列番号69、
b)そのCDRの1つ、2つ又は全てにおいて配列番号65〜配列番号69のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有する配列であって、そのCDRの1つ、2つ又は全てにおいてわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列は、配列番号65〜配列番号69のうちの1つによる結合と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、配列、
c)配列番号65〜配列番号69のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有する配列であって、配列番号65〜配列番号69のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列は、配列番号65〜配列番号69のうちの1つによる結合と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、配列
からなる群から選択される、態様17に記載のアミノ酸配列。
態様19.
a)配列番号66、
b)そのCDRの1つ、2つ又は全てにおいて配列番号66とわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有する配列であって、そのCDRの1つ、2つ又は全てにおいてわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列は、配列番号66による結合と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、配列、
c)配列番号66とわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有する配列であって、配列番号66とわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列は、配列番号66による結合と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、配列
からなる群から選択される、態様18に記載のアミノ酸配列。
態様20. 1nM〜1pM(モル/L)以下、好ましくは500pM〜1pM(モル/L)以下、より好ましくは100pM〜1pM(モル/L)以下、又はさらにより好ましくは約50pM〜1pM以下の解離定数(KD)でhIL−6Rと特異的に結合する、態様1〜19のいずれか一つに記載のアミノ酸配列。
態様21. 1nM〜1pM以下、好ましくは500pM〜1pM以下、より好ましくは100pM〜1pM以下、又はさらにより好ましくは約50pM〜1pM以下の解離定数(KD)でカニクイザルIL−6Rと特異的に結合する、態様1〜20のいずれか一つに記載のアミノ酸配列。
態様22. 104M−1s−1〜約107M−1s−1、好ましくは105M−1s−1〜107M−1s−1、より好ましくは約106M−1s−1以上のkon速度でhIL−6Rと特異的に結合する、態様1〜21のいずれか一つに記載のアミノ酸配列。
態様23. 104M−1s−1〜約107M−1s−1、好ましくは105M−1s−1〜107M−1s−1、より好ましくは約106M−1s−1以上のkon速度でカニクイザルIL−6Rと特異的に結合する、態様1〜22のいずれか一つに記載のアミノ酸配列。
態様24. 10−3s−1(t1/2=0.69s)〜10−6s−1(t1/2が数日である略不可逆的な複合体の場合)、好ましくは10−4s−1〜10−6s−1、より好ましくは10−5s−1〜10−6s−1、例えば約10−5s−1以下のkoff速度でhIL−6Rと特異的に結合する、態様1〜23のいずれか一つに記載のアミノ酸配列。
態様25. 10−3s−1(t1/2=0.69s)〜10−6s−1(t1/2が数日である略不可逆的な複合体の場合)、好ましくは10−4s−1〜10−6s−1、より好ましくは10−5s−1〜10−6s−1、例えば約10−5s−1以下のkoff速度でカニクイザルIL−6Rと特異的に結合する、態様1〜24のいずれか一つに記載のアミノ酸配列。
態様26. TF−1アッセイにおいて10nM〜50pM、好ましくは5nM〜50pM、より好ましくは1nM〜50pM以下、例えば約750pM又は500pM以下のIC50値(100IU/mLのIL−6で)を有する、態様1〜25のいずれか一つに記載のアミノ酸配列。
態様27. TF−1アッセイにおいて50nM〜1nM、好ましくは25nM〜1nM、より好ましくは10nM〜1nM以下、例えば約8nM以下のIC50(5000IU/mLのIL−6で)を有する、態様1〜26のいずれか一つに記載のアミノ酸配列。
態様28. TF−1アッセイにおいて配列番号1及び配列番号2に規定のような参照IgG又は配列番号3及び配列番号4に規定のような参照Fabに関して得られたIC50値と比較して少なくとも同じ、好ましくはより良好な、少なくとも2倍、好ましくは3倍、より好ましくは4倍、さらにより好ましくは5倍、7倍又は7倍超良好なIC50値を有する、態様1〜27のいずれか一つに記載のアミノ酸配列。
態様29. TF−1アッセイにおいてトシリズマブ(MRA)に関して得られたIC50値と比較して少なくとも同じ、好ましくはより良好な、少なくとも2倍、好ましくは3倍、より好ましくは4倍、さらにより好ましくは5倍、7倍又は7倍超良好なIC50値を有する、態様1〜28のいずれか一つに記載のアミノ酸配列。
態様30. IL−6のEC50値での血漿効力アッセイにおいて500pM〜50pM、好ましくは250pM〜50pM、より好ましくは200pM〜50pM以下、例えば150pM以下のIC50値を有する、態様1〜29のいずれか一つに記載のアミノ酸配列。
態様31. IL−6のEC95値での血漿効力アッセイにおいて1000pM〜100pM、好ましくは750pM〜100pM、より好ましくは500pM〜100pM以下、例えば400pM以下のIC50値を有する、態様1〜30のいずれか一つに記載のアミノ酸配列。
態様32. 態様30又は31の血漿効力アッセイにおいて配列番号1及び配列番号2に規定のような参照IgG又は配列番号3及び配列番号4に規定のような参照Fabに関して得られたIC50値と比較して少なくとも同じ、好ましくはより良好な、少なくとも2倍、好ましくは3倍、より好ましくは4倍、さらにより好ましくは5倍、7倍又は7倍超良好なIC50値を有する、態様1〜31のいずれか一つに記載のアミノ酸配列。
態様33. 態様30又は31の血漿効力アッセイにおいてトシリズマブ(MRA)に関して得られたIC50値と比較して少なくとも同じ、好ましくはより良好な、少なくとも2倍、好ましくは3倍、より好ましくは4倍、さらにより好ましくは5倍、7倍又は7倍超良好なIC50値を有する、態様1〜32のいずれか一つに記載のアミノ酸配列。
態様34. CHO細胞上での膜IL−6Rとの結合に関して10nM〜100pM、好ましくは5nM〜100pM、より好ましくは2nM〜10pM以下、例えば2nM以下のIC50値を有する、態様1〜33のいずれか一つに記載のアミノ酸配列。
態様35. 化合物又は構築物であって、1つ又は複数の態様1〜34のいずれか一つに記載のアミノ酸配列を含むか、又はこれから本質的になり、任意で1つ又は複数のリンカーを介して連結した、1つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位を任意でさらに含む、化合物又は構築物。
態様36. 上記1つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位が、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列、「dAb」、dAbとしての使用に好適なアミノ酸配列又はナノボディからなる群から選択される、態様35に記載の化合物又は構築物。
態様37. 多価構築物、例えば二価又は三価の構築物である、態様35又は36に記載の化合物又は構築物。
態様38. 多重特異性構築物、例えば二重特異性又は三重特異性の構築物である、態様35〜37のいずれか一つに記載の化合物又は構築物。
態様39. 態様1〜34のいずれか一つに記載の対応するアミノ酸配列自体と比較して増大した半減期を有する、態様35〜38のいずれか一つに記載の化合物又は構築物。
態様40. 上記1つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位が、態様1〜20のいずれか一つに記載の対応するアミノ酸配列と比較して増大した半減期を有する化合物又は構築物を提供する、態様39に記載の化合物又は構築物。
態様41. 増大した半減期を有する化合物又は構築物を提供する上記1つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位が、血清タンパク質又はその断片、血清タンパク質と結合することができる結合単位、Fc部分、及び血清タンパク質と結合することができる小タンパク質又は小ペプチドからなる群から選択される、態様39に記載の化合物又は構築物。
態様42. 増大した半減期を有する化合物又は構築物を提供する上記1つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位が、ヒト血清アルブミン又はその断片からなる群から選択される、態様39に記載の化合物又は構築物。
態様43. 増大した半減期を有する化合物又は構築物を提供する上記1つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位が、血清アルブミン(例えばヒト血清アルブミン)又は血清免疫グロブリン(例えばIgG)と結合することができる結合単位からなる群から選択される、態様39に記載の化合物又は構築物。
態様44. 増大した半減期を有する化合物又は構築物を提供する上記1つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位が、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列、「dAb」、dAbとしての使用に好適なアミノ酸配列、又は血清アルブミン(例えばヒト血清アルブミン)若しくは血清免疫グロブリン(例えばIgG)と結合することができるナノボディからなる群から選択される、態様39に記載の化合物又は構築物。
態様45. 増大した半減期を有する化合物又は構築物を提供する上記1つ又は複数の他の結合単位が、配列番号97〜配列番号99から選択される、態様39に記載の化合物又は構築物。
態様46. 以下のポリペプチド配列:
a)配列番号70〜配列番号72、
b)本発明のそのCDRの1つ、2つ又は全てにおいて配列番号70〜配列番号72のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するポリペプチド配列であって、本発明のそのCDRの1つ、2つ又は全てにおいてわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するポリペプチド配列は、配列番号70〜配列番号72のうちの1つによる結合と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、ポリペプチド配列、
c)配列番号70〜配列番号72のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するポリペプチド配列であって、配列番号70〜配列番号72のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列は、配列番号70〜配列番号72のうちの1つによる結合と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、ポリペプチド配列
から選択される、態様35〜45のいずれか一つに記載の化合物又は構築物。
態様47. 以下のポリペプチド配列:
a)配列番号70〜配列番号71、
b)本発明のそのCDRの1つ、2つ又は全てにおいて配列番号70〜配列番号71のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するポリペプチド配列であって、本発明のそのCDRの1つ、2つ又は全てにおいてわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するポリペプチド配列は、配列番号70〜配列番号71のうちの1つによる結合と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、ポリペプチド配列、
c)配列番号70〜配列番号71のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するポリペプチド配列であって、配列番号70〜配列番号71のうちの1つとわずか2つ、好ましくはわずか1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列は、配列番号70〜配列番号71のうちの1つによる結合と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性(上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである)でIL−6Rと結合するものとする、ポリペプチド配列
から選択される、態様35〜46のいずれか一つに記載の化合物又は構築物。
態様48. 配列番号70のアミノ酸配列を有するか、又はこれから本質的になる、態様35〜47のいずれか一つに記載の化合物又は構築物。
態様49. 配列番号71のアミノ酸配列を有するか、又はこれから本質的になる、態様35〜47のいずれか一つに記載の化合物又は構築物。
態様50. 1nM〜1pM(モル/L)以下、好ましくは500pM〜1pM(モル/L)以下、より好ましくは100pM〜1pM(モル/L)以下、又はさらにより好ましくは約50pM〜1pM以下の解離定数(KD)でhIL−6Rと特異的に結合する、態様35〜49のいずれか一つに記載の化合物又は構築物。
態様51. 1nM〜1pM以下、好ましくは500pM〜1pM以下、より好ましくは100pM〜1pM以下、又はさらにより好ましくは約50pM〜1pM以下の解離定数(KD)でカニクイザルIL−6Rと特異的に結合する、態様35〜50のいずれか一つに記載の化合物又は構築物。
態様52. 104M−1s−1〜約107M−1s−1、好ましくは105M−1s−1〜107M−1s−1、より好ましくは約106M−1s−1以上のkon速度でhIL−6Rと特異的に結合する、態様35〜51のいずれか一つに記載の化合物又は構築物。
態様53. 104M−1s−1〜約107M−1s−1、好ましくは105M−1s−1〜107M−1s−1、より好ましくは約106M−1s−1以上のkon速度でカニクイザルIL−6Rと特異的に結合する、態様35〜52のいずれか一つに記載の化合物又は構築物。
態様54. 10−3s−1(t1/2=0.69s)〜10−6s−1(t1/2が数日である略不可逆的な複合体の場合)、好ましくは10−4s−1〜10−6s−1、より好ましくは10−5s−1〜10−6s−1、例えば約10−5s−1以下のkoff速度でhIL−6Rと特異的に結合する、態様35〜53のいずれか一つに記載の化合物又は構築物。
態様55. 10−3s−1(t1/2=0.69s)〜10−6s−1(t1/2が数日である略不可逆的な複合体の場合)、好ましくは10−4s−1〜10−6s−1、より好ましくは10−5s−1〜10−6s−1、例えば約10−5s−1以下のkoff速度でカニクイザルIL−6Rと特異的に結合する、態様35〜54のいずれか一つに記載の化合物又は構築物。
態様56. TF−1アッセイにおいて10nM〜50pM、好ましくは5nM〜50pM、より好ましくは1nM〜50pM以下、例えば約750pM又は500pM以下のIC50値(100IU/mLのIL−6で)を有する、態様35〜55のいずれか一つに記載の化合物又は構築物。
態様57. TF−1アッセイにおいて50nM〜1nM、好ましくは25nM〜1nM、より好ましくは10nM〜1nM以下、例えば約8nM以下のIC50(5000IU/mLのIL−6で)を有する、態様35〜56のいずれか一つに記載の化合物又は構築物。
態様58. TF−1アッセイにおいて配列番号1及び配列番号2に規定のような参照IgG又は配列番号3及び配列番号4に規定のような参照Fabに関して得られたIC50値と比較して少なくとも同じ、好ましくはより良好な、少なくとも2倍、好ましくは3倍、より好ましくは4倍、さらにより好ましくは5倍、7倍又は7倍超良好なIC50値を有する、態様35〜57のいずれか一つに記載の化合物又は構築物。
態様59. TF−1アッセイにおいてトシリズマブ(MRA)に関して得られたIC50値と比較して少なくとも同じ、好ましくはより良好な、少なくとも2倍、好ましくは3倍、より好ましくは4倍、さらにより好ましくは5倍、7倍又は7倍超良好なIC50値を有する、態様35〜58のいずれか一つに記載の化合物又は構築物。
態様60. IL−6のEC50値での血漿効力アッセイにおいて500pM〜50pM、好ましくは250pM〜50pM、より好ましくは200pM〜50pM以下、例えば150pM以下のIC50値を有する、態様35〜59のいずれか一つに記載の化合物又は構築物。
態様61. IL−6のEC95値での血漿効力アッセイにおいて1000pM〜100pM、好ましくは750pM〜100pM、より好ましくは500pM〜100pM以下、例えば400pM以下のIC50値を有する、態様35〜60のいずれか一つに記載の化合物又は構築物。
態様62. 態様60又は61の血漿効力アッセイにおいて配列番号1及び配列番号2に規定のような参照IgG又は配列番号3及び配列番号4に規定のような参照Fabに関して得られたIC50値と比較して少なくとも同じ、好ましくはより良好な、少なくとも2倍、好ましくは3倍、より好ましくは4倍、さらにより好ましくは5倍、7倍又は7倍超良好なIC50値を有する、態様35〜61のいずれか一つに記載の化合物又は構築物。
態様63. 態様60又は61の血漿効力アッセイにおいてトシリズマブ(MRA)に関して得られたIC50値と比較して少なくとも同じ、好ましくはより良好な、少なくとも2倍、好ましくは3倍、より好ましくは4倍、さらにより好ましくは5倍、7倍又は7倍超良好なIC50値を有する、態様35〜62のいずれか一つに記載の化合物又は構築物。
態様64. CHO細胞上での膜IL−6Rとの結合に関して10nM〜100pM、好ましくは5nM〜100pM、より好ましくは2nM〜10pM以下、例えば2nM以下のIC50値を有する、態様35〜63のいずれか一つに記載の化合物又は構築物。
態様65. 1つの態様1〜34のいずれか一つに記載のアミノ酸配列を含むか、又はこれから本質的になる一価構築物。
態様66. 態様37〜64のいずれか一つに記載の多価の化合物又は構築物の調製における態様1〜34のいずれか一つに記載のアミノ酸配列又は態様65に記載の一価構築物の使用。
態様67. 態様37〜64のいずれか一つに記載の多価の化合物又は構築物を調製する方法であって、態様1〜34のいずれか一つに記載のアミノ酸配列又は態様65に記載の一価構築物と、1つ又は複数の基、残基、部分又は結合単位とを連結することを含む、方法。
態様68. 1つ又は複数のリンカーを介して、態様1〜34のいずれか一つに記載のアミノ酸配列又は態様65に記載の一価構築物と、他の基、残基、部分又は結合単位とを連結することを含む、態様67に記載の、態様37〜64のいずれか一つに記載の多価の化合物又は構築物を調製する方法。
態様69. 態様1〜34のいずれか一つに記載のアミノ酸配列、これをコードする核酸若しくはヌクレオチド配列の発現により得ることができるような態様35〜64のいずれか一つに記載の化合物若しくは構築物、又は態様65に記載の一価構築物をコードする核酸又はヌクレオチド配列。
態様70. 遺伝子構築物の形態である、態様69に記載の核酸又はヌクレオチド配列。
態様71. 態様1〜34のいずれか一つに記載のアミノ酸配列、これをコードする核酸若しくはヌクレオチド配列の発現により得ることができるような態様35〜64のいずれか一つに記載の化合物若しくは構築物、又は態様65に記載の一価構築物を発現し、又は好適な環境下で発現することができ;及び/又は態様69に記載の核酸若しくはヌクレオチド配列又は態様70に記載の遺伝子構築物を含む、宿主又は宿主細胞。
態様72. 態様1〜34のいずれか一つに記載のアミノ酸配列、これをコードする核酸若しくはヌクレオチド配列の発現により得ることができるような態様35〜64のいずれか一つに記載の化合物若しくは構築物、又は態様65に記載の一価構築物を産生する方法であって、
a)好適な宿主細胞若しくは宿主生物において又は別の好適な発現系において、態様69に記載の核酸若しくはヌクレオチド配列又は態様70に記載の遺伝子構築物を発現する工程、任意でその後に
b)このようにして得られた、態様1〜34のいずれか一つに記載のアミノ酸配列、これをコードする核酸若しくはヌクレオチド配列の発現により得ることができるような態様35〜64のいずれか一つに記載の化合物若しくは構築物、又は態様65に記載の一価構築物を単離及び/又は精製する工程
を少なくとも含む、方法。
態様73. 態様1〜34のいずれか一つに記載のアミノ酸配列、これをコードする核酸若しくはヌクレオチド配列の発現により得ることができるような態様35〜64のいずれか一つに記載の化合物若しくは構築物、又は態様65に記載の一価構築物を産生する方法であって、
a)態様71に記載の宿主又は宿主細胞が、少なくとも1つの態様1〜34のいずれか一つに記載のアミノ酸配列、これをコードする核酸若しくはヌクレオチド配列の発現により得ることができるような態様35〜64のいずれか一つに記載の化合物若しくは構築物、又は態様65に記載の一価構築物を発現及び/又は産生するような条件下で、上記宿主又は宿主細胞を培養及び/又は維持する工程、任意でその後に
b)このようにして得られた、態様1〜34のいずれか一つに記載のアミノ酸配列、これをコードする核酸若しくはヌクレオチド配列の発現により得ることができるような態様35〜64のいずれか一つに記載の化合物若しくは構築物、又は態様65に記載の一価構築物を単離及び/又は精製する工程
を少なくとも含む、方法。
態様74. 少なくとも1つの態様1〜34のいずれか一つに記載のアミノ酸配列、態様35〜64のいずれか一つに記載の化合物若しくは構築物、態様65に記載の一価構築物、又は態様69若しくは70に記載の核酸若しくはヌクレオチド配列を含む、組成物。
態様75. 薬学的組成物である、態様74に記載の組成物。
態様76. 少なくとも1つの薬学的に許容可能な担体、希釈剤、又は賦形剤及び/又はアジュバントをさらに含み、かつ任意で1つ又は複数のさらなる薬学的に活性のあるポリペプチド及び/又は化合物を含む薬学的組成物である、態様74に記載の組成物。
態様77. IL−6に、IL−6Rに、IL−6/IL−6R複合体に、及び/又はIL−6、IL−6R及び/又はIL−6/IL−6R複合体が関与する、シグナル伝達経路及び/又は生物学的機能及び応答に関連がある疾患及び障害のうちの少なくとも1つを予防及び/又は治療する方法であって、薬学的に活性のある量の少なくとも1つの態様1〜34のいずれか一つに記載のアミノ酸配列、態様35〜64のいずれか一つに記載の化合物若しくは構築物、態様65に記載の一価構築物、又は態様75若しくは76に記載の組成物をこれを必要とする被験体に投与することを含む、方法。
態様78. IL−6Rに及び/又はIL−6/IL−6R複合体に、及び/又はIL−6及び/又はIL−6/IL−6R複合体が関与する、シグナル伝達経路及び/又は生物学的機能及び応答に関連がある上記の疾患及び障害が、敗血症、様々な形態のがん、骨吸収、骨粗鬆症、悪液質、乾癬、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、カポジ肉腫、AIDS関連リンパ腫及び炎症性疾患からなる群から選択される、態様77に記載の方法。
態様79. 上記様々な形態のがんが、多発性骨髄腫疾患(MM)、腎細胞癌(RCC)、形質細胞性白血病、リンパ腫、Bリンパ増殖性障害(BLPD)及び前立腺がんからなる群から選択される、態様78に記載の方法。
態様80. 上記炎症性疾患が、関節リウマチ、全身性発症若年性特発性関節炎、高ガンマグロブリン血症、クローン病、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス(SLE)、多発性硬化症、キャッスルマン病、IgM免疫グロブリン血症、心臓粘液腫、喘息、アレルギー性喘息及び自己免疫インスリン依存性糖尿病からなる群から選択される、態様78に記載の方法。
態様81. 態様1〜34のいずれか一つに記載のアミノ酸配列、態様35〜64のいずれか一つに記載の化合物若しくは構築物、又は態様65に記載の一価構築物をこれを必要とする被験体に投与することにより予防及び/又は治療することができる少なくとも1つの疾患又は障害を予防及び/又は治療する方法であって、薬学的に活性のある量の少なくとも1つの態様1〜34のいずれか一つに記載のアミノ酸配列、態様35〜64のいずれか一つに記載の化合物若しくは構築物、態様65に記載の一価構築物、又は態様75若しくは76に記載の組成物をこれを必要とする被験体に投与することを含む、方法。
態様82. IL−6に、IL−6Rに、IL−6/IL−6R複合体に、及び/又はIL−6、IL−6R及び/又はIL−6/IL−6R複合体が関与する、シグナル伝達経路及び/又は生物学的機能及び応答に関連がある疾患及び障害のうちの少なくとも1つを予防及び/又は治療するための、及び/又は1つ又は複数の態様77〜81に記載の方法における使用のための薬学的組成物の調製における態様1〜34のいずれか一つに記載のアミノ酸配列、態様35〜64のいずれか一つに記載の化合物若しくは構築物、又は態様65に記載の一価構築物の使用。
態様83. IL−6に、IL−6Rに、IL−6/IL−6R複合体に、及び/又はIL−6、IL−6R及び/又はIL−6/IL−6R複合体が関与する、シグナル伝達経路及び/又は生物学的機能及び応答に関連がある疾患及び障害のうちの少なくとも1つの予防及び/又は治療における使用のための、及び/又は1つ又は複数の態様77〜81に記載の方法における使用のための態様1〜34のいずれか一つに記載のアミノ酸配列、態様35〜64のいずれか一つに記載の化合物若しくは構築物、又は態様65に記載の一価構築物。
態様84. 態様1〜34のいずれか一つに記載のアミノ酸配列、態様35〜64のいずれか一つに記載の化合物若しくは構築物、又は態様65に記載の一価構築物の誘導体。
態様85. IL−6Rと特異的に結合することができる、態様84に記載の誘導体。
態様86. 態様1〜34のいずれか一つに記載のアミノ酸配列自体、態様35〜64のいずれか一つに記載の化合物若しくは構築物自体、又は態様65に記載の一価構築物自体の半減期よりも少なくとも1.5倍、好ましくは少なくとも2倍(例えば少なくとも5倍)、例えば少なくとも10倍、又は20倍超大きい血清半減期を有する、態様84又は85に記載の誘導体。
態様87. 対応する態様1〜34のいずれか一つに記載のアミノ酸配列自体、態様35〜64のいずれか一つに記載の化合物若しくは構築物自体、又は態様65に記載の一価構築物自体と比較して、1時間超、好ましくは2時間超、より好ましくは6時間超(例えば12時間超)、又はさらに24時間、48時間若しくは72時間超増大した血清半減期を有する、態様84〜86のいずれか一つに記載の誘導体。
態様88. 少なくとも約12時間、好ましくは少なくとも24時間、より好ましくは少なくとも48時間、さらにより好ましくは少なくとも72時間以上;例えば少なくとも5日(例えば約5日〜10日)、好ましくは少なくとも9日(例えば約9日〜14日)、より好ましくは少なくとも約10日(例えば約10日〜15日)、若しくは少なくとも約11日(例えば約11日〜16日)、より好ましくは少なくとも約12日(例えば約12日〜18日以上)、又は14日超(例えば約14日〜19日)のヒトにおける血清半減期を有する、態様84〜87のいずれか一つに記載の誘導体。
態様89. ペグ化誘導体である、態様84〜88のいずれか一つに記載の誘導体。
態様90. 態様84〜89のいずれか一つに記載の誘導体を少なくとも1つ含む組成物。
実施例1:材料
IL−6Rと結合するナノボディの単離に用いられる材料を表C−1に示す。
2頭のラマ(81及び82)を表C−2に記載の免疫付与スケジュールに従って、ヒトIL−6R(Peprotech)で免疫付与した。
PBL及びリンパ節から抽出したRNAを、RT−PCRの出発物質として使用して、ナノボディをコードする遺伝子断片を増幅した。これらの断片をLacZプロモーター、大腸菌ファージpIIIタンパク質コード配列、アンピシリン又はカルベニシリンに対する耐性遺伝子、マルチクローニング部位及びgen3リーダー配列を含有するpUC119に由来する発現ベクターにクローニングした。ナノボディコード配列とインフレームで、ベクターはC末端c−mycタグ及び(His)6タグをコードしていた。ファージは標準的プロトコルに従って調製し、滅菌濾過の後、さらなる使用のために4℃で保管した。構築されたライブラリの特徴を表C−3に示す。
表C−4に要約されるような様々な条件を用いて、上記ライブラリにより選別を実行した。
ペリプラズム抽出液はまず、IL−6−IL−6R相互作用を阻害する能力について分析した。そのために、図3に概略的に示される2つの独立したアルファスクリーンアッセイを設定した。アッセイ1では、ペリプラズム抽出液を可溶性IL−6受容体(1nM)、ビオチン化IL−6(3nM)、ストレプトアビジンコーティングドナービーズ及びモノクローナル抗体BN−12コーティングアクセプタービーズ(20μg/ml)とインキュベートした。このアッセイで陽性のナノボディはIL−6/IL−6R相互作用、又はIL−6R−モノクローナル抗体BN−12相互作用のいずれかを阻害することができた。これら2つの可能性を区別するために、第2のアッセイを設定した(アッセイ2)。このアッセイでは、ペリプラズム抽出液をbio−IL−6R(0.3nM)、ストレプトアビジンコーティングドナービーズ及びモノクローナル抗体BN−12コーティングアクセプタービーズ(10μg/ml)とインキュベートした。アッセイ1では陽性であるがアッセイ2では陰性のナノボディは、IL−6−IL−6R阻害因子であると考えられた。
選択されたナノボディを大腸菌において、c−myc、(His)6タグ付けタンパク質として50ml又は250mlの培養物量で発現させた。発現を1mMのIPTGの添加により誘導し、37℃で4時間継続させた。細胞培養物の遠沈(spinning)後、ペリプラズム抽出液を沈殿物を凍結融解することにより調製した。これらの抽出液を出発物質として固定化金属アフィニティークロマトグラフィ(IMAC)に使用した。ナノボディを150mMのイミダゾールでカラムから溶出させ、続いてPBSに対して透析した。全収率及び細胞培養物1リットル当たりの収率を表C−7に挙げる。精製ナノボディ(PMP28E11を除く)のSDS−PAGEを図5に示す。
14個の精製ナノボディを、IL−6/IL−6R相互作用の阻害に関してアルファスクリーンで試験した。精製タンパク質の段階希釈物(濃度範囲:500nM〜10pM)をIL−6R(0.3nM)に添加し、15分間インキュベートした。続いて、3nMのbio−IL−6及びBN−12コーティングアクセプタービーズを添加し、この混合物を1時間インキュベートした。最後に、ストレプトアビジンドナービーズを添加し、1時間のインキュベート後、プレートをEnvisionマイクロプレートリーダーで読み取った。BR−6及び実施例1に記載のFab断片は参照として含まれていた。結果を図6に示す。
個々のナノボディ及び実施例1に記載の参照Fab断片の親和定数(Kd)をBiacore 3000機器による表面プラズモン共鳴(SPR)により求めた。簡潔に述べると、IL−6Rを800RU〜1000RUの密度でCM5センサーチップにアミンカップリングさせた。ナノボディを1nM〜50nMの5つの種々の濃度で注入した。流速は全ての実験で45μl/分であった。結合期及び解離期はそれぞれ3分及び10分であった。チップをグリシン/HCl(pH1.5)を用いて再生させた。種々の濃度のナノボディでの結合曲線を、動態パラメータkon、koff及びKdを算出するのに使用した(表C−9)。
全ての精製ナノボディをXG1アッセイで試験した。XG1はIL−6依存性のヒト骨髄腫細胞株である。最大半減増殖は約20pg/mlのIL−6で達成される。アッセイは原則的にZhang et al.(1994, Blood 83: 3654-3663)により記載のように行った。実施例1に記載のような参照Fab断片は参照として含まれていた。IC50値は表C−10に挙げられるように90pM〜50nMの範囲であった。ナノボディの小さいサブセットをこのアッセイにおいて1mg/mlのHSAの存在下でも試験した。
ナノボディを細胞表面上でのIL−6RとのIL−6の結合の遮断によるTF−1細胞(ECACC番号93022307;1989, J. Cell Physiol., 140: 323; 1993, Exp. Cell Res., 208: 35)のIL−6依存性の増殖を阻害する能力に関しても試験した。このため、ナノボディの段階希釈物を固定量のTF−1細胞と37℃で2時間プレインキュベートした。続いてIL−6を最終濃度が2ng/mlになるまで添加した。IL−6依存性の細胞増殖を72時間継続させ、トリチウムで標識されたチミジンの取り込みにより測定した。IC50値を表C−11に挙げている。
14個のナノボディ全てを、アルファスクリーンをベースにしたアッセイにおいて実施例1に記載のような参照FabとIL−6Rとの結合を阻害する能力に関して分析した。このアッセイでは、100nMの精製ナノボディを0.4nMのビオチン化IL−6とインキュベートした。参照Fabコーティングアクセプタービーズ及びストレプトアビジンコーティングドナービーズを添加し、参照Fab/IL−6R複合体の濃度を測定した。ナノボディの存在下で得られた値をナノボディを加えなかった対照と比較し、%で表される2つの値の間の比を表C−12に挙げている。IL6R03を除く全てのナノボディは、IL−6Rと参照Fabとの結合の阻害を全く又は一部だけしか示さず、これによりそれらのエピトープが参照Fabのエピトープと全く又は一部だけしか重複しないことが示唆される。
ナノボディとU266細胞上で発現する膜結合IL−6Rとの結合をFACSで分析した。この分析は選別されたクローン由来の精製ナノボディ(IL6R04、IL6R09、IL6R11、IL6R13及びIL6R14)に対して行った。結果を図7に示す。全てのナノボディが細胞表面で発現するヒトIL−6Rと結合することが可能であった。
可溶性のIL−6Rが80ng/ml〜400ng/mlの濃度でヒト血漿に存在する。ナノボディIL6R03、IL6R04及びIL6R13が血漿由来のIL−6Rと結合することが可能であるかを決定するために、U266細胞に結合するナノボディに対するヒト血漿の影響を評価した。ヒト血漿はU266細胞との結合を阻害したが、これは3つのナノボディ全てが血漿由来のヒトIL−6Rと結合することが可能であることを示している(図8を参照されたい)。
ナノボディとマウスIL−6Rとの交差反応性をELISAで分析した。このため、500nMのナノボディを1μg/mlのマウス及びヒトのIL−6Rでコーティングしたマイクロタイタープレートに適用した。一次抗体及び二次抗体としてそれぞれ抗myc及び抗マウスHRPを用いて検出を行った。光学密度を図10に示す。マウスIL−6Rとの結合は試験したナノボディのいずれでも観察されなかった。
組換えIL−6Rによる2匹のラマの免疫付与によりIL−6とIL−6Rとの相互作用を遮断することができた14個の特有のナノボディのパネルが得られた。このパネルを詳細に分析し、全ての実験データに基づき、ナノボディIL6R03、IL6R04及びIL6R13をさらなる開発のために選別した。最も重要なナノボディ特性を表C−13に要約する。
実施例16:多価構築物の調製
先の段落に記載の抗IL−6RナノボディはC末端の抗SAナノボディ(ALB1)、9アミノ酸のGly/Serリンカー及びN末端の抗IL−6Rナノボディからなる二重特異性構築物としても発現された。さらに、C末端及びN末端の抗IL−6Rナノボディ、中央の抗SAナノボディ(ALB1)(全て9アミノ酸のGly/Serリンカーを介して連結した)からなる4個の三価の二重特異性ナノボディを構築した。これらのナノボディ番号を表C−14に挙げている。
二重特異性ナノボディ構築物は大腸菌においてc−myc、(His)6タグ付けタンパク質として発現し、続いて固定化金属アフィニティークロマトグラフィ(IMAC)及びサイズ排除クロマトグラフィ(SEC)により培養培地から精製した。全収率及び細胞培養物1リットル当たりの収率を表C−15に挙げている。精製ナノボディのSDS−PAGEを図11に示す。
精製した二重特異性ナノボディを、IL−6/IL−6R相互作用の阻害に関してアルファスクリーンで試験した。精製タンパク質の段階希釈物(濃度範囲:250nM〜5pM)をIL−6R(0.3nM)に添加し、15分間インキュベートした。続いて、3nMのbio−IL−6及びBN−12コーティングアクセプタービーズを添加し、この混合物を1時間インキュベートした。最後に、ストレプトアビジンドナービーズを添加し、1時間のインキュベート後、プレートをEnvisionマイクロプレートリーダーで読み取った。BR−6及び実施例1に記載のFab断片は参照として含まれていた。結果を図12に示す。
二重特異性ナノボディをXG1増殖アッセイで試験した。IC50値は60pM〜65nMの範囲であった。ナノボディをこのアッセイにおいて1mg/mLのヒト血清アルブミンの存在下でも分析した。二重特異性ナノボディに関しては、IC50値は190pM〜90nMの範囲である。実施例1に記載のような参照IgGは参照として含まれていた。IC50値を表C−17に挙げている。
二重特異性ナノボディとIL−6Rとの結合を表面プラズモン共鳴により分析した。動態パラメータを求め、表C−18に挙げている。IL−6Rに対する親和性の顕著な喪失は二価フォーマットのナノボディ(IL6R23、IL6R24、IL6R33)では観察されなかった。
フォーマットされたナノボディと血清アルブミンとの結合を表面プラズモン共鳴により分析した。親和定数(Kd)を求め、表C−19に挙げている。アルブミンと結合するナノボディAlb−1(配列番号97)は比較用に含まれていた。親和性は同じ抗血清アルブミン構成要素を含有するこれまでにフォーマットされたナノボディの範囲内であったが、概ねより低い親和性が観察された。このことは特にマウス血清アルブミンの親和性の場合で顕著であった。
選択されたクローン由来のフォーマットされたナノボディ(IL6R23、IL6R24、IL6R29、IL6R33、IL6R44及びIL6R53)とU266細胞との結合をFACSにより分析した。結果を図13及び図14に示す。二価ナノボディIL6R23、IL6R24、IL6R29及びIL6R33は一価構成要素と比較して結合の低減を示すが、同様の結合は三価ナノボディIL6R44及びIL6R53で観察された。
実施例23:配列最適化戦略
ナノボディIL6R03、IL6R04及びIL6R13のタンパク質配列を各々、最大の相同性を共有する5つの最も近縁なヒト生殖系列とアラインメントした(図15)。ヒト生殖系列のコンセンサス配列と比べたフレームワーク領域のアミノ酸差異を色分けする。薄灰色で強調したアミノ酸差異はヒトの対応物(counterpart)に変換するために選択したが、暗灰色で強調したアミノ酸はそのままにした(untouched)。初めに配列を最適化した4つの変異体のパネルを3つのナノボディそれぞれで作製した(段階1)。これらの変異体を多くのパラメータに関して分析し、得られた結果を、第2のセットのナノボディを設計するのに使用した(段階2)。配列を最適化した全ての変異体のタンパク質配列を図16に示す。
配列最適化プロセスの段階1では、以下の12個の変異体を作製し、分析した:
IL6R03:IL6R61、IL6R62、IL6R63及びIL6R64
IL6R04:IL6R71、IL6R72、IL6R73及びIL6R74
IL6R13:IL6R81、IL6R82、IL6R83及びIL6R84
これらの様々な変異体のアミノ酸配列を図16に示す。
IL6R03、IL6R04及びIL6R13の配列を最適化したクローンをアルファスクリーンにおいてIL−6/IL−6R相互作用の阻害に関して試験した。精製ナノボディの段階希釈物をIL−6R(0.3nM)に添加し、15分間インキュベートした。続いて3nMのbio−IL−6及びBN−12コーティングアクセプタービーズを添加し、この混合物を1時間インキュベートした。最後にストレプトアビジンドナービーズを添加し、1時間のインキュベーション後、プレートをEnvisionマイクロプレートリーダーで読み取った。親クローンは参照として含まれていた。結果を図17、図18及び図19に示す。
IL6R03、IL6R04及びIL6R13の配列を最適化した変異体をBiacoreでもIL−6Rとの結合に関して分析した。動態パラメータを表C−20に挙げている。
段階1の親和性及び効力データに基づき、以下のセットの変異体を作製することを決めた。
IL6R03に関しては、変異体IL6R61、IL6R62、IL6R63及びIL6R64に存在する全ての突然変異を組み合わせて、ILR65を得た。
IL6R04に関しては、変異体IL6R71、IL6R72、IL6R73及びIL6R74に存在する全ての突然変異を組み合わせて、ILR75を得た。
IL6R13に関しては、FR2においてRAT配列で異なる突然変異(の組合せ)を保有する6つの新規の変異体セット(IL6R85〜IL6R90)を作製した。この配列を最適化した変異体は親和性及び効力のどちらでもIL6R13とは区別することはできなかったため、これらの突然変異はIL6R83バックグラウンドに導入された。
配列を最適化した変異体IL6R85〜IL6R90をBiacoreでペリプラズム抽出液として分析した。解離曲線をkoff値を算出するのに用いた(表C−21)。ナノボディIL6R87〜IL6R89の解離速度はIL6R13のものと同様であったが、ナノボディIL6R85、IL6R86及びIL6R90は10倍高い解離速度を有していた。
配列を最適化した変異体IL6R85〜IL6R90をアルファスクリーンにおいてIL−6/IL−6R相互作用を遮断する能力に関してペリプラズム抽出液として試験した。結果を図20に示す。
IL6R65、IL6R75及びIL6R88の配列を最適化したクローンのヒトIL−6Rに関する親和定数(Kd)を、Biacore3000機器で表面プラズモン共鳴により求めた。簡潔に述べると、ヒトIL−6RをCM5センサーチップに800RU〜1000RUの密度でアミンカップリングを行った。残存する反応基を不活化した。ナノボディ結合を0.5nM〜50nMの範囲の様々な濃度で評価した。各々の試料を45μl/分の流速で4分間注入して、チップに結合した抗原に結合させた。次に、ナノボディを含まない結合バッファーを同じ流速でチップに送り、結合したナノボディを解離させた。IL6R03、IL6R04及びIL6R13の配列を最適化した変異体の動態パラメータを表C−22に示す。
配列を最適化したナノボディをXG−1アッセイで分析した。結果を図22に示す。IC50値を表C−23に要約する。配列最適化は、細胞ベースのアッセイにおいてIL−6誘導性の増殖を中和する効力に対して有意な効果を有していなかった。
実施例26:カニクイザルIL−6Rに対する親和性決定
IL6R03−IL6R65、IL6R04−IL6R75及びIL6R13−IL−6R88のカニクイザルIL−6Rに対する親和性を、Biacore3000機器でSPRにより求めた。簡潔に述べると、カニクイザルIL−6RをCM5センサーチップに760RUの密度でアミンカップリングを行った。残存する反応基を不活化した。ナノボディ結合を1.25nM〜100nMの範囲の様々な濃度で評価した。各々の試料を45μl/分の流速で4分間注入して、チップに結合した抗原に結合させた。次に、ナノボディを含まない結合バッファーを同じ流速でチップに送り、結合したナノボディを解離させた。動態パラメータを表C−24に要約する。
カニクイザルIL−6RとのIL6R65及びIL6R75の交差反応性を評価するために、sIL−6Rの供給源としてヒト又はカニクイザルの血漿のいずれかを用いて血漿効力ELISAを行った。このアッセイでは、希釈系列のナノボディを血漿及びヒトIL−6(50ng/mL)とプレインキュベートした。続いて、血漿sIL−6RをBN−12コーティングプレート上で捕捉し、ビオチン化ポリクローナル抗体及びストレプトアビジン−HRPを用いて結合したIL−6を検出した。
ヒト血漿における血漿効力アッセイを、ナノボディが高濃度のIL−6を遮断する能力を試験するのにも使用した。IL6R04、IL6R65及び実施例1に記載の参照FabをIL−6のEC50(50ng/mL)で及びIL−6のEC95(885ng/mL)で試験した。結果を図24に示す。明らかに、IL6R04はIL−6のEC50で最も強力な化合物であると思われた。EC95では、参照Fab及びIL6R65はより高濃度ではあるものの依然として血漿sIL−6Rを完全に遮断することができ、このことはこれら2つの分子がIL−6結合部位と重複するエピトープと結合することを示している。参照FabのIC50は0.55nMから8.47nMへと増大し、IL6R65のIC50は2.61nMから66.25nMへと増大した。
IL−6及びIL6R65がIL−6Rと同時に結合することができるかを調べるためにBiacore実験を行った。参照Fab(図25A)、IL6R201/75(図25B)又はIL6R65(図25C)をIL−6R上で捕捉し、その後IL−6を複合体に結合させた。参照Fab及びIL6R65では、IL−6の結合をほとんど観察することはできなかった。IL−6をIL−6R上で捕捉し、ナノボディを注入した場合、3つのナノボディ全てが複合体と結合することができたようであった。しかしながら、参照Fab及びIL−6R65の場合、このことはおそらくIL−6Rに対してIL−6の親和性がより低いことによりIL−6が取って代わられたためであった。
実施例30:親和性成熟のための多様化戦略
ナノボディIL6R65のCDR領域を2つの以下の戦略を用いてランダム化した:
1.各CDR残基を類似の側鎖化学構造を有する残基のセットに置き換えた。
K⇔R
A⇔S⇔T
I⇔L⇔V
F⇔Y
N⇔D
Q⇔E
G→A
M→L
H、C、W、Pは一定に保つ。
2.各CDR残基をその位置で自然発生するアミノ酸のパネルに置き換えた。1つの位置当たりの多様性を制限するために、各位置で最も高い頻度で発生するアミノ酸だけを導入した。このアプローチはCDR1及びCDR2のランダム化だけに使用した。
親和性成熟を行ったナノボディを大腸菌において、c−myc、(His)6タグ付けタンパク質として250mlの培養物量で発現させた。発現を1mMのIPTGの添加により誘導し、37℃で4時間継続させた。細胞培養物の遠沈後、ペリプラズム抽出液を沈殿物を凍結融解することにより調製した。これらの抽出液を出発物質として固定化金属アフィニティークロマトグラフィ(IMAC)に使用した。ナノボディを150mMのイミダゾールでカラムから溶出させ、続いてHiprep26/10カラムで脱塩した。
ナノボディIL6R65(配列を最適化した)及び5つの親和性成熟を行った変異体をBiacoreで分析した。種々の濃度の精製ナノボディの結合曲線を記録し、親和定数を算出するのに用いた。これらの5つのクローンに関するKd値は0.34nM〜0.95nMであったが、これは最良の変異体でのIL6R65(親ナノボディ)と比べて13倍の改善に相当する(図27)。
5つ全ての親和性成熟を行ったナノボディ及び配列を最適化したナノボディを血漿効力アッセイでも試験した。このアッセイでは、様々な濃度のナノボディをヒト又はカニクイザルのいずれかに由来する血漿を含有する可溶性のIL−6R及び固定濃度のヒトIL−6(2.4nM又は42nM)と混合した。1時間のインキュベーション後、混合物を抗IL−6Rモノクローナル抗体BN−12(Diaclone)でコーティングしたMaxisorpプレートに移した。結合したIL−6の量を続くビオチン化抗IL−6ポリクローナル抗体(R&D Systems)及びストレプトアビジン−HRPの添加により求めた。TMBは基質として用いた。基質変換は450nmで測定した(図28)。
親和性成熟を行ったナノボディを、細胞表面上のIL−6RとのIL−6結合の遮断によるTF−1細胞(ECACC番号93022307;1989, J. Cell Physiol. 140: 323; 1993, Exp. Cell Res. 208: 35)のIL−6依存性の増殖を阻害する能力に関しても試験した。このため、ナノボディの段階希釈物を固定量のTF−1細胞と37℃で2時間プレインキュベートした。続いてIL−6を2ng/mlの最終濃度まで添加した。IL−6依存性の細胞増殖を72時間継続させ、トリチウムで標識したチミジンの取り込みにより測定した(図29)。
IL−6がIL6R65及びその親和性成熟を行った変異体のうちの2つ(7D6及び7C4)と同時にIL−6Rと結合することができるかを調べるために、Biacore実験を行った。これらの実験では、IL−6RをBN−12コーティングチップ上で捕捉し、ナノボディIL6R65(図30A)、7D6(図30B)又は7C4(図30C)を用いて飽和状態にした。次に、IL−6とIL−6R−ナノボディ複合体との結合を100nMの濃度でサイトカインを注入することにより評価した。さらに、3つのナノボディとIL−6と複合体形成したIL−6Rとの結合も求めた。
次に、CDR1/CDR2及びCDR3における有益な突然変異の様々な組合せを含有する47個のナノボディのパネルを作製した。これらの突然変異をCDRランダム化ライブラリから単離された全てのナノボディクローンのタンパク質配列及び解離速度の徹底分析により同定した。これらの第2世代のクローンの解離速度は4.2E−04s−1〜4.5E−05s−1の範囲であった。最も緩やかな解離速度を示す5つのクローンをさらなる分析のために選択した(20F6、20A11、20E10、21A10、21D11)。配列を図31に挙げている。
親和性成熟を行ったナノボディを大腸菌において、c−myc、(His)6タグ付けタンパク質として250mlの培養物量で発現させた。発現を1mMのIPTGの添加により誘導し、37℃で4時間継続させた。細胞培養物の遠沈後、ペリプラズム抽出液を沈殿物を凍結融解することにより調製した。これらの抽出液を出発物質として固定化金属アフィニティークロマトグラフィ(IMAC)に使用した。ナノボディを150mMのイミダゾールでカラムから溶出させ、続いてHiprep26/10カラムで脱塩した。
ナノボディの温度安定性を熱転移アッセイで分析した。Tm値は全ての親和性成熟を行ったナノボディで同程度であり、IL6R65と比較してわずかに高かった。Tm値は表C−25に挙げられている。
ナノボディIL6R65(配列を最適化した)及び5つの親和性成熟を行った変異体に関する動態パラメータをBiacore T100で求めた。結合速度(ka)を2つの異なる濃度の精製ナノボディ及びモノクローナル抗体BN−12を介してチップ上で捕捉された固定濃度のIL−6Rでの結合曲線から求めた。解離速度をチップと共有結合したIL−6Rを用いて単一のナノボディ濃度で求めた。ka、kd及びKdに関する値を表C−26に挙げている。
2回親和性成熟を行った変異体の生物学的活性をTF1アッセイで評価し、データを図32に提示する。2回親和性成熟を行ったクローンは1回親和性成熟を行ったクローン7C4よりも5倍〜8倍高い効力を有しており、実施例1に記載のベンチマーク(benchmark)参照IgGよりも2.5倍〜4倍強力であった。最良のクローンはIC50が0.4nMである(ベンチマークと比較して4倍強力な)20A11であった。
可溶性IL−6Rの阻害を血漿効力アッセイにおいて高い及び低いIL−6濃度で分析した。2回親和性成熟を行った変異体は血漿効力アッセイにおいて参照IgGと少なくとも同じくらい強力であり(0.1nM〜0.2nM)、これはこのアッセイの感度限界であった。高いIL−6濃度(EC95)では、親和性突然変異体は依然としてIL−6とsIL−6Rとの結合を遮断することができ、参照IgGより3倍〜4倍強力であると考えられた。このアッセイで1回親和性成熟を行った変異体と2回親和性成熟を行った変異体との間で差異は観察することができなかった。予想通り、試験したクローンは全てカニクイザル交差反応性であった(図33)。
精製ナノボディIL6R65及びPMP20A11をヒトPBMCとの結合に関してFACSで試験した。ビオチン化抗Hisモノクローナル抗体及びPE標識したストレプトアビジンを用いて細胞結合を検出した(図34)。IL6R65及び親和性成熟を行った変異体PMP20A11の両方が好中球、単球及びリンパ球の亜集団と結合することができた。これはIL−6Rの発現プロファイルに一致する。
実施例43:多価構築物の調製
PMP20A11をアルブミンと結合するナノボディALB8を有する二価及び三価のナノボディとしてフォーマットした。様々なナノボディの概要を表C−27に提示する。
第1の実験において、モデル系としてTF−1細胞株を用いて、フォーマットされたナノボディがIL−6Rによるシグナル伝達を阻害するかを検証した。ナノボディ20A11、IL6R304、IL6R305及びIL6R306は膜IL−6Rにより媒介されるTF−1細胞のIL−6誘導性の増殖を用量依存的にかつ完全に遮断する(図35、表C−28)。
構成要素IL6R20A11及びそのフォーマットされた変異体がヒトIL−6と血漿sIL−6Rとの結合を阻止する能力を血漿効力ELISAで分析した。血漿sIL−6Rの濃度は変化し得るので、ナノボディの効力を比較するために異なるアッセイ全体にわたり同じ血漿を使用する必要があった。また初めに、滴定したIL−6(titration of IL-6)を血漿中でインキュベートし、ナノボディと共に使用するIL−6の濃度を求めた。ヒト血漿におけるIL−6のEC50値及びEC95値をそれぞれ27.29ng/mL及び885ng/mLと求めた。続いてこれらの濃度を通常濃度及び高濃度のIL−6でのナノボディの効力を試験するのに用いた。
IL−6のシグナル伝達を遮断するために、可溶性IL−6R及び膜IL−6Rの両方をナノボディにより中和する必要がある。そのため、様々なフォーマットされたナノボディとIL−6Rを発現する細胞との結合をフローサイトメトリにより分析した。
ヒトIL−6Rを発現する安定にトランスフェクトされたCHO細胞を、抗IL−6Rナノボディと膜IL−6Rとの結合を分析するのに使用した(図39A)。IL−6R陰性CHO細胞を陰性対照として使用した(図39B)。4つ全てのナノボディがIL−6Rを発現する細胞との結合の飽和を示したが、IL−6R陰性細胞では高いナノボディ濃度でも非常に低いシグナルしか検出されなかった。
ヒトPBLを、生理的条件下でのナノボディと膜IL−6Rとの結合を実証するのに使用した。このマトリクスはHSA(約50mg/mL)、sIL−6R(約30ng/mL)、膜IL−6Rを発現する細胞(CD4+T細胞、単球、顆粒球)及びIL−6R陰性細胞(ほとんどが循環性B細胞、CD8+T細胞)を含有しているため、in vivo状況と関連性が高い。ナノボディを2つのドナー由来のEDTAで処理した血液中でインキュベートし、結合したナノボディをフローサイトメトリにより検出した。リンパ球、単球及び顆粒球をFSC/SSC特性に基づきゲーティングし(図40)、結合したナノボディをPEチャネルで検出した。
ヒト及びカニクイザルの血清アルブミンに対する二重特異性、二価及び三価のナノボディIL6R304、IL6R305及びIL6R306の動態分析をBiacore 3000機器でSPRにより行った。結果を図42に示し、表C−33に要約した。ナノボディIL6R304、IL6R305及びIL6R306はヒト及びカニクイザルのSAに対して同程度の動態速度定数及び親和性(17nM〜23nM)を示した。SAに対するフォーマットされたIL−6Rナノボディの親和性は、結合速度の2.5倍の低減及び解離速度の2.5倍の増大により一価抗SAナノボディALB11と比較して6.5倍低かった。
ヒト及びカニクイザルのIL−6Rに対する動態分析をBiacore T100機器でSPRにより行った。チップに直接固定化した場合のIL−6Rの立体構造変化の示唆により、結合速度をBN−12により捕捉されたIL−6Rで測定した。ナノボディ−IL−6R相互作用より解離速度が低いために捕捉ツールの可用性が喪失するので、解離速度を直接固定化したIL−6Rで測定した。結果を表C−34及び図43に示す。
IL6R20A11及びそのフォーマットされた変異体とカニクイザルsIL−6Rとの交差反応性をカニクイザル血漿を用いた血漿効力ELISAで分析した。また、競合ELISAを用いて、IL6R20A11とカニクイザル及びマウスのsIL−6Rとの交差反応性を求めた。
初めに、滴定したIL−6をカニクイザル血漿中でインキュベートし、IL−6のEC50値を50.11ng/mLと求めた。続いてこの濃度のIL−6をナノボディとカニクイザル血漿sIL−6Rとの交差反応性を試験するのに使用した。図44で観察することができるように、IL6R20A11及びフォーマットされた変異体は明らかにカニクイザルsIL−6Rと交差反応性であった。同じ傾向(ranking)をヒト血漿でも見ることができ、ヒト血漿対カニクイザル血漿のIC50値の比率は全ての化合物で同様であった(表C−35)。
血漿効力ELISAはBN−12がこの特定の種由来の血漿sIL−6Rを捕捉することができ、かつIL−6とsIL−6Rとの結合を検出することができる場合にしか使用することができない。そのため、より包括的な(generic)競合ELISAを開発した。このアッセイはIL6R20A11とニュートラアビジンで捕捉されたIL−6R−bioとの結合に基づいていた。簡単に言うと、0.4nMのIL6R20A11を内因性のsIL−6Rを含有する様々な種由来の滴定系列の血漿とプレインキュベートし、その後遊離IL6R20A11をニュートラアビジンコーティングプレート上で固定化されたビオチン化ヒトsIL−6Rで捕捉し、抗VHHモノクローナル抗体:FITC及び抗FITC−HRPにより検出した。0.4nMのIL6R20A11濃度は最大シグナルの50%をもたらす濃度に相当する(0.35±0.021nMのEC50;n=4)。
IL−6RはI型サイトカイン受容体ファミリーに属する。これらの受容体のサイトカイン結合領域は保存されているので、IL−6Rに対するIL6R20A11の特異性をIL−6Rに関連する受容体との結合を分析することにより分析した。IL6R20A11とLIF−R、CNTF−R、OSM−R及びIL−11R/Fcとの結合を競合結合ELISAで分析した。図46で観察することができるように、陽性対照sIL−6RはIL6R20A11とプレートとの結合を阻害した。sIL−6Rに対するIC50(0.03nM)は用いられたIL6R20A11の量に基づき予測されたIC50に一致していた(0.025nM対0.05nM)。IL−6R関連タンパク質は、100倍モル過剰(5nM)であってもIL6R20A11とsIL−6Rとの結合に競合しないと考えられた。同様の設定で、CLF−1/CLC、IL12−p40、IL−27B及びgp130/Fcも、100nMと高濃度であっても0.05nMのIL6R20A11と相互作用しないことが示された(結果は示さない)。
この研究の目的は単回静脈内ボーラス投与後のカニクイザルにおける配列を最適化した親和性成熟を行った2つの抗インターロイキン6受容体(IL−6R)ナノボディ、すなわちIL6R304及びIL6R305の血漿薬物動態(PK)、薬効(pharmacodynamics)(PD)及び免疫原性を分析することであった。ナノボディの投与後に、ナノボディ投与の24時間後から始めて7日間毎日組換えヒト(h)IL−6を皮下注射した。このin vivo有効性研究の最終的な目的はこれらの抗IL−6RナノボディがhIL−6誘導性のパラメータを阻害する能力を評価し、互いに及び実施例1のベンチマーク参照とそれらの有効性を比較することであった。
この研究では、2〜3匹の動物の6つの群(群6〜群11、表C−36)にIL6R304又はIL6R305の単回静脈内注射を行った。両方のナノボディで、3つの異なる用量、すなわち0.4mg/kg、2mg/kg又は10mg/kgを試験した。さらに、群12の動物(n=3)はビヒクルを投与され、陰性対照の役割を果たすが、群13の動物(n=3)には5mg/kgの参照IgGを注射した(表C−36)。
hIL−6の7日間連続した毎日の注射により急性期応答の誘導に対するナノボディ及び陽性参照IgGの効果を分析した。読み取り項目(Read-outs)はCRPレベル、フィブリノゲンレベル及び血小板数であった。
血漿薬物動態(PK)分析、ELISA試料分析のための血液試料をIL6R304又はIL6R305の投与前、及び以下の投与後の時点で採取した:5分及び30分、3時間及び8時間、1日目、2日目、3日目、4日目、5日目、6日目、7日目、8日目、14日目、21日目及び29日目。
カニクイザルにおけるIL6R304(0.4mg/kg、2mg/kg、10mg/kg)及びIL6R305(0.4mg/kg、2mg/kg、10mg/kg)の非コンパートメントPK分析により得られた基礎PKパラメータの概要を表C−38、表C−39、表C−40、表C−41、表C−42及び表C−43に示す。本明細書で論じられているPKパラメータはWinNonlin Professional Software Version 5.1(Pharsight Corp)を用いた非コンパートメント分析(NCA)により得られる。幾つかの動物に関する最終的なパラメータは2つのデータ点のみで算出した(デフォルト設定でR2は1である)。
IL6R304又はIL6R305の投与前及び投与後様々な日数で採取された一連の血漿試料を、ナノボディ又はその1つ又は複数の構成要素と結合することが可能であるサル抗体(IgGアイソタイプ)の存在に関してスクリーニングした。IL6R304を投与した動物由来の試料を、IL6R304(図57)、IL6R300(図58)又はALB8(図59)のいずれかでコーティングしたプレート上で分析した。IL6R305を投与した動物由来の試料を、IL6R305(図60)、IL6R300(図61)又はALB8(図62)のいずれかでコーティングしたプレート上で分析した。
公的に利用可能なデータ(Nishimoto etal., 2008, Blood 112(10):3959-64)に基づき予想されるように、参照IgGによる処理により血漿sIL−6Rの増大がもたらされるが、ビヒクルによる処理では増大しなかった(図63A)。同様に、低用量のIL6R304は3匹のサル全てでsIL−6Rレベルの迅速な増大を誘導した(図63B)。IL6R305で処理した動物では、血漿sIL−6Rも増大したが、他の処理群ほど顕著ではなかった(図63C)。
実施例57:有効性研究におけるsIL−6Rレベルに対するナノボディの効果
血漿における総sIL−6Rレベル(遊離型、ナノボディ結合型及びIL−6結合型)をELISAで測定した。公開データ(Nishimoto et al., 2008, Blood 112(10): 3959-64)に基づき予想されるように、参照IgGによる処理により血漿sIL−6Rの増大がもたらされたが、ビヒクルによる処理では増大しなかった(図64A)。同様に、ナノボディで処理した動物全てがsIL−6Rレベルの迅速な増大を示した。これは遊離sIL−6Rと比較した参照IgG−sIL−6R複合体又はナノボディ−sIL−6R複合体のより緩やかなクリアランスにより説明することができる。
血漿における総IL−6レベル(遊離型、sIL−6R結合型)をGyrolabプラットフォームにより測定した。このアッセイでは、ビオチン化ラット抗ヒトIL−6モノクローナル抗体をIL−6を捕捉するのに使用し、Alexaで標識したマウス抗ヒトIL−6モノクローナル抗体を検出するのに使用した。このアッセイは、内因性カニクイザルIL−6及び1日目〜8日目に毎日注射した組換えヒトIL−6の両方を測定する。このため、1日目までに測定することができるIL−6(=内因性のカニクイザルIL−6のみ)と2日目〜29日目のIL−6(=投与されたヒトIL−6+内因性のカニクイザルIL−6)とを区別する必要がある。
実施例59:カニクイザルにおける単回投与後の薬力学的効果
sIL6R血漿濃度の変化を、健常な(すなわち非刺激)カニクイザルにおけるIL6R304の単回静脈内投与後でも測定した。この単回投与PK/PD研究では、用量は1mg/kg〜100mg/kgの範囲であった。血液サンプリングを薬力学的分析、免疫原性分析及び薬効分析のために行った。ELISAベースのアッセイを総sIL6Rレベルを測定するのに使用し、Gyrolab(商標)プラットフォームを用いたリガンド結合アッセイを遊離sIL6Rレベルを測定するのに使用した。総sIL6Rアッセイのために、非中和抗IL6Rモノクローナル抗体をsIL6R(遊離型+複合体)を捕捉するのに、ストレプトアビジン−HRPと組み合せたビオチン化ポリクローナル抗IL6Rツールを検出のために使用した。遊離sIL6Rアッセイのために、ビオチン化20A11構成要素を遊離sIL6Rを捕捉するのに、Alexaで標識した非中和抗IL6Rモノクローナル抗体を検出のために使用した。
総sIL6Rレベルに対するIL6R304投与の影響はIL6R304と受容体との直接結合により説明することができ、複合体はIL6R304の半減期延長部分(すなわちアルブミン結合)を介して循環血液中に留まる。総sIL6R濃度の測定可能な変化は時間遅延動態に従うので、間接的な応答モデルは、PK/PD関係性を最も良く説明しており、sIL6R−IL6R304複合体レベルの集積に対する静脈内投与したIL6R304の効果を説明するのに使用された。このモデルは、IL6R304と結合する場合のsIL6Rの排除の阻害に起因する薬物応答を説明している。この間接的な応答モデルでは、総sIL6R−IL6R304複合体の変化速度(応答R)は、
実施例61:カニクイザルにおける薬物動態
この項は1つの交差反応種(カニクイザル)における静脈内投与したIL6R304の薬物動態挙動を特性決定するデータを要約する。
Claims (12)
- 配列番号65〜配列番号69のうちの1つからなるポリペプチド
からなる群から選択される、IL−6Rに指向性を有するポリペプチド。 - 化合物又は構築物であって、1つ又は複数の請求項1に記載のポリペプチドを含むか、又はこれから本質的になり、任意で1つ又は複数のリンカーを介して連結した、1つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位を任意でさらに含む、化合物又は構築物。
- 前記1つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位は半減期が増大した化合物又は構築物を提供し、かつ前記1つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位が、血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、血清免疫グロブリン又はIgGと結合することができる、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用に好適なポリペプチド、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用に好適なポリペプチド、「dAb」、dAbとしての使用に好適なポリペプチド、又はナノボディからなる群から選択される、請求項2に記載の化合物又は構築物。
- 配列番号70〜配列番号72のうちの1つからなるポリペプチド
から選択される、請求項2又は3に記載の化合物又は構築物。 - 配列番号70のアミノ酸配列又は配列番号71のアミノ酸配列を有するか、又はこれから本質的になる、請求項2〜4のいずれか一項に記載の化合物又は構築物。
- 請求項1に記載のうちの1つのポリペプチドを含むか、又はこれから本質的になる一価構築物。
- 請求項2〜5のいずれか一項に記載の多価の化合物又は構築物を調製する方法であって、請求項1に記載のポリペプチド又は請求項6に記載の一価構築物と、1つ又は複数の基、残基、部分又は結合単位とを連結することを含む、方法。
- 請求項1に記載のポリペプチド、該ポリペプチドをコードする核酸若しくはヌクレオチドの発現により得ることができる請求項2〜5のいずれか一項に記載の化合物若しくは構築物、又は請求項6に記載の一価構築物をコードする核酸又はヌクレオチドであって、前記核酸が任意で遺伝子構築物の形態である、核酸又はヌクレオチド。
- 請求項1に記載のポリペプチド、該ポリペプチドをコードする核酸若しくはヌクレオチドの発現により得ることができる請求項2〜5のいずれか一項に記載の化合物若しくは構築物、又は請求項6に記載の一価構築物を好適な環境下で発現することができる非ヒト宿主又は宿主細胞、及び/又は請求項8に記載の核酸若しくはヌクレオチド又は遺伝子構築物を含む、非ヒト宿主又は宿主細胞。
- 請求項1に記載のポリペプチド、該ポリペプチドをコードする核酸若しくはヌクレオチドの発現により得ることができる請求項2〜5のいずれか一項に記載の化合物若しくは構築物、又は請求項6に記載の一価構築物を産生する方法であって、
a)好適な宿主細胞若しくは非ヒト宿主生物において又は別の好適な発現系において、請求項8に記載の核酸若しくはヌクレオチド又は遺伝子構築物を発現する工程、又は
請求項9に記載の非ヒト宿主又は宿主細胞が、少なくとも1つの請求項1に記載のポリペプチド、該ポリペプチドをコードする核酸若しくはヌクレオチドの発現により得ることができる請求項2〜5のいずれか一項に記載の化合物若しくは構築物、又は請求項6に記載の一価構築物を発現及び/又は産生するような条件下で、前記宿主又は宿主細胞を培養及び/又は維持する工程、任意でその後に
b)a)の工程で得られた、請求項1に記載のポリペプチド、該ポリペプチドをコードする核酸若しくはヌクレオチドの発現により得ることができる請求項2〜5のいずれか一項に記載の化合物若しくは構築物、又は請求項6に記載の一価構築物を単離及び/又は精製する工程
を少なくとも含む、方法。 - 少なくとも請求項1に記載の1つのポリペプチド、請求項2〜5のいずれか一項に記載の化合物若しくは構築物、請求項6に記載の一価構築物、又は請求項8に記載の核酸若しくはヌクレオチドを含む、薬学的組成物。
- 請求項1に記載の1つのポリペプチド、請求項2〜5のいずれか一項に記載の化合物若しくは構築物、又は請求項6に記載の一価構築物、又は請求項11に記載の組成物を有効成分とする、敗血症、様々な形態のがん、骨吸収、骨粗鬆症、悪液質、乾癬、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、カポジ肉腫、AIDS関連リンパ腫及び炎症性疾患からなる群から選択される、IL−6に、IL−6Rに、IL−6/IL−6R複合体に関連がある疾患及び障害、並びに/又は、IL−6、IL−6R及び/若しくはIL−6/IL−6R複合体が関与するシグナル伝達経路及び/又は生物学的機能及び応答に関連がある疾患及び障害のうちの少なくとも1つを予防及び/又は治療するための薬剤。
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