CN105399828A - 用于治疗il-6r相关疾病和病症的改进的针对il-6r的氨基酸序列和包含其的多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及针对和/或可以改善的亲和性和/或抗体亲抗原性特异性结合白介素-6受体(IL-6R)的氨基酸序列，和/或该氨基酸序列具有改善的功效和/或效力，并且其能够(部分，或优选完全)阻断IL-6/IL-6R相互作用和/或抑制通过IL-6、IL-6R和/或IL-6/IL-6R复合物的信号传导。本发明还涉及化合物或构建体，特别是蛋白质和多肽，它们包含一种或多种这样的氨基酸序列，或者基本上由一种或多种这样的氨基酸序列组成。本发明还涉及编码这些氨基酸序列和多肽的核酸，制备这些氨基酸序列和多肽的方法，表达或能够表达这些氨基酸序列或多肽的宿主细胞，包含这些氨基酸序列、多肽、核酸和/或宿主细胞的组合物，特别是药物组合物，和这些氨基酸序列或多肽、核酸、宿主细胞和/或组合物特别用于预防、治疗或诊断目的的应用。

Description

用于治疗IL-6R相关疾病和病症的改进的针对IL-6R的氨基酸序列和包含其的多肽
本申请是国际申请号PCT/EP2010/054764，国际申请日为2010年4月12日，中国申请号“201080016107.5”，发明名称为“用于治疗IL-6R相关疾病和病症的改进的针对IL-6R的氨基酸序列和包含其的多肽”的分案申请。
发明领域
本发明涉及针对和/或可以特异性结合(如本文所定义)白介素-6受体(IL-6R)的氨基酸序列，以及包含一种或多种所述氨基酸序列或基本上由一种或多种所述氨基酸序列组成的化合物或构建体且特别是蛋白质和多肽(在本发明还分别称为“本发明的氨基酸序列”，“本发明的化合物”，“本发明的构建体”和“本发明的多肽”)。
本发明还涉及编码所述氨基酸序列和多肽的核酸(在本文中还称为“本发明的核酸”或“本发明的核苷酸序列”)；涉及制备所述氨基酸序列和多肽的方法；涉及表达或能够表达所述氨基酸序列或多肽的宿主细胞；涉及包含所述氨基酸序列、多肽、核酸和/或宿主细胞的组合物特别是药物组合物；并且涉及所述氨基酸序列或多肽、核酸、宿主细胞和/或组合物的应用，特别是用于预防、治疗或诊断目的如本发明所提及的预防、治疗或诊断目的的应用。
本发明的其它方面、实施方案、优点和应用将从本发明的进一步描述中变得清楚。
背景技术
IL-6为一种初始鉴定为B细胞分化因子的蛋白(Hirano等，1985，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，82：5490-4；EP0257406)，其与IL-6R(Yamasaki等，1988，科学(Science)，241：825-8；EP0325474)的相互作用导致形成IL-6/IL-6R复合物。该复合物与gp130结合(Taga等，1989，细胞(Cell)，58：573-81；EP0411946)，gp130是靶细胞上的一种膜蛋白，其传送IL-6的各种生理作用。除此之外，目前已知IL-6参与免疫反应、造血作用、急性期反应、骨骼新陈代谢、血管发生和炎症的调节。IL-6生产的脱调节(deregulation)参与一些自体免疫和慢性炎性增殖性疾病过程的病理学(Ishihara和Hirano，2002，生物化学生物物理学报(Biochim.Biophys.Acta)，1592：281-96)。结果，对IL-6诱导的信号传导的抑制剂在过去已经吸引了太多的注意(Hirano等，1990，今日免疫学(Immunol.Today)，11：443-9)。证明与IL-6(Klein等，1991，血液(Blood)，78：1198-204；EP0312996)特异性结合的多肽，IL-6R(EP0409607)或gp130(Saito等，1993，免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)，163：217-223；EP0572118)表现出对IL-6功能的有效抑制作用。
IL-6的过量生产和信号传导(以及特别是所谓的反式-信号传导)涉及各种疾病和病症，诸如脓毒症(sepsis)(Starnes等，1999，免疫学杂志(J.Immunol.)，148：1968)，以及各种形式的癌症，如多发性骨髓瘤病(multiplemyelomadisease，MM)、肾细胞癌(RCC)、浆细胞白血病(plasmacellleukaemia)(Klein等，1991)、淋巴瘤、B-淋巴组织增生病症(B-lymphoproliferativedisorder，BLPD)和前列腺癌。由过量的IL-6生产或信号传导引起的其它疾病的非限制性实例包括骨吸收(骨质疏松症(osteoporosis))(Roodman等，1992，骨矿物质研究杂志(J.BoneMiner.Res.)，7：475-8；Jilka等，1992，科学(Science)，257：88-91)，恶病质(cachexia)(Strassman等，1992，临床研究杂志(J.Clin.Invest.)89：1681-1684)，银屑病，系膜增生性肾小球肾炎(mesangialproliferativeglomerulonephritis)，卡波西肉瘤(Kaposi’ssarcoma)，艾滋病相关的淋巴瘤(Emilie等，1994，国际免疫药理学杂志(Int.J.Immunopharmacol.)16：391-6)，炎性疾病和病症如类风湿性关节炎、全身发作的青少年特发性关节炎(systemiconsetjuvenileidiopathicarthritis)、高丙球蛋白血症(hypergammaglobulinemia)(Grau等，1990，实验医学杂志(J.Exp.Med.)172：1505-8)；局限性回肠炎，溃疡性大肠炎，系统性红斑狼疮(SLE)，多发性硬化病，卡斯尔曼病(Castleman’sdisease)，IgMγ-球蛋白病(IgMgammopathy)，心脏粘液瘤(cardiacmyxoma)，哮喘(特别是变应性哮喘)以及自体免疫性胰岛素-依赖型糖尿病(Campbell等，1991，临床研究杂志(J.Clin.Invest.)87：739-742)。其它IL-6相关的病症对于熟练的技术人员是清楚的。
例如，由于可以从上述参考文献中看出，现有技术描述了用于预防和治疗IL-6相关病症的针对人IL-6、针对人IL-6R和针对人gp130蛋白的抗体和抗体片段。实例是托珠单抗(Tocilizumab)(参见Woo等，2005，关节炎研究与治疗(ArthritisResTher.)7：1281-8；Nishimoto等，2005，血液(Blood)106：2627-32；Ito等，2004，肠胃病学(Gastroenterology)，126：989-96；Choy等，2002，类风湿性关节炎(ArthritisRheum.)46：3143-50)，BE8(参见Bataille等，1995，血液(Blood)86：685-91；Emilie等，1994，血液(Blood)84；2472-9；Beck等，1994，新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.)330：602-5；Wendling等，1993，风湿病学杂志(J.Rheumatol.)20：259-62)和Centocor的CNTO-328(参见临床肿瘤学杂志(JournalofClinicalOncology)，2004，22/14S：2560；临床肿瘤学杂志(JournalofClinicalOncology)，2004，22/14S：2608；国际癌症杂志(Int.J.Cancer)，2004，111：592-5)。本领域内关于预防和治疗IL-6相关的病症的另一种有效成分是可溶gp130的Fc融合物(参见Becker等2004，免疫学(Immunity)，21：491-501；Doganci等，2005，临床研究杂志(J.Clin.Invest.)115：313-25；Nowell等，2003，免疫学杂志(J.Immunol.)171：3202-9；Atreya等，2000，自然医学(Nat.Med.)6：583-8)。针对IL-6R的氨基酸序列和纳米抗体和包含其的多肽在WO08/020079中描述。
发明内容
本发明一个具体的但是非限制性的目的是提供氨基酸序列，多肽和治疗性化合物和组合物，除了其它有利性质(诸如，例如，改善制备容易性和/或降低商品成本)以外，与现有技术的氨基酸序列、抗体和纳米抗体相比，它们具有改进的治疗和/或药理学性质。这些改进的和有利的性质将从本文中的进一步描述中变得清楚。非限制性地，本发明提供的氨基酸序列、多肽和治疗性化合物和组合物可以具有改善的结合和/或亲和性，改善的抗体亲抗原性(avidity)，改善的功效和/或效力，增加的选择性和/或它们可以能够部分或优选完全阻断IL-6/IL-6R相互作用，和/或抑制通过IL-6、IL-6R和/或IL-6/IL-6R复合物的信号传导。
一般地，本发明的一个目的是提供药理学活性剂，以及包含其的组合物，它们可以用于诊断、预防和/或治疗一种或多种IL-6R相关病症(如本文定义)；和提供用于诊断、预防和/或治疗这些疾病和/或病症的方法，所述方法包括施用和/或使用这些药剂和组合物。
本发明涉及氨基酸序列(也称作“本发明的氨基酸序列”)，其针对和/或可以以改善的亲和性和/或抗体亲抗原性特异性结合(如本文定义)白介素-6受体(IL-6R)，和/或具有改善的功效和/或效力，并且其能够(部分，或优选完全)阻断IL-6/IL-6R相互作用和/或抑制通过IL-6、IL-6R和/或IL-6/IL-6R复合物的信号传导。更具体地，本发明提供氨基酸序列，其包含一个或多个选自以下的氨基酸残基片段：
a)SEQIDNO’s：80-82；或
b)与SEQIDNO’s：80-82之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量；
和/或
c)SEQIDNO’s：84-91；或
d)与SEQIDNO’s：84-91之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量；
和/或
e)SEQIDNO’s：93-95；或
f)与SEQIDNO’s：93-95之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量。
对于与其在IL-6R上的表位的结合，氨基酸序列通常将在其氨基酸序列内包含一个或多个氨基酸残基或一个或多个氨基酸残基片段(如本文进一步定义；即，每个“片段”包括彼此相邻或彼此紧邻的(即，在该氨基酸序列的一级或三级结构上)两个或多个氨基酸残基)，通过其本发明的氨基酸序列可以与IL-6R上的表位结合。这些氨基酸残基或氨基酸残基片段因此形成用于结合IL-6R上的表位的“位点”(本文中还称为“抗原结合位点”，如本文进一步定义)。
本发明提供许多氨基酸残基片段(如本文定义)，它们特别适合于结合IL-6R上的特定表位。这些氨基酸残基片段可以存在于和/或可以结合到本发明的氨基酸序列中，特别是以这样的方式，即使得它们形成本发明氨基酸序列的抗原结合位点(的一部分)。因此，获得的氨基酸序列与IL-6R上的特定表位结合，所述特定表位位于IL-6R上的IL-6结合位点中，形成IL-6R上的IL-6结合位点的一部分，或与IL-6R上的IL-6结合位点重叠(即在一级结构或三级结构中)或与IL-6R上的IL-6结合位点紧邻(即在一级结构或三级结构中)(例如，与IL-6竞争)；并且因此，获得的氨基酸序列能够部分或优选完全阻断IL-6/IL-6R相互作用和/或抑制通过IL-6、IL-6R和/或IL-6/IL-6R复合物的信号传导。关于这点，本发明的氨基酸序列和多肽优选是这样的，以致它们可以与IL-6竞争来结合IL-6受体。本发明的氨基酸序列和多肽优选是这样的，以致例如，在实施例11中所述的测定中，它们可以与可商购的人-小鼠重构嵌合单克隆抗-IL-6R抗体托珠单抗(MRA)(Chugai/罗氏(Roche))或其抗原结合片段竞争性结合IL-6受体(参见，例如，WO92/19759和相对应的欧洲专利EP0628639，以及Shinkura等，1998，抗癌研究(AnticancerResearch)18，1217-1222)；和/或是这样的，以致它们可以与托珠单抗结合在IL-6R上的相同表位或结合位点，或者结合邻近所述结合位点的表位和/或与所述结合位点重合的表位。
此外，本发明的氨基酸残基优选是这样的，以致它们可以与由SEQIDNO’s：1和2定义的参照IgG和/或由SEQIDNO’s：3和4定义的参照Fab(参见实施例1)竞争结合IL-6受体；和/或是这样的，以致它们可以与所述参照IgG或所述参照Fab结合IL-6R上的相同表位或结合位点，或结合与所述结合位点邻近和/或与所述结合位点重叠的表位。为了制备和测序所述参照IgG和参照Fab，参考以下实施例1，以及SEQIDNO’s：1-4。
应当注意，本发明在其最广泛意义上不限于这些氨基酸残基片段在本发明的氨基酸序列中可能具有的特定结构作用或功能，只要这些氨基酸残基片段允许本发明的氨基酸序列以特定亲和性和/或效力(如本文定义)结合IL-6R上的特定表位。因此，通常，本发明在其最广泛意义上包括任何这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列能够与IL-6R上的特定表位结合，并且包括一个或多个本文所述的氨基酸残基片段(并且特别地两个或更多个所述氨基酸残基片段的适当组合)，其通过一个或多个其它氨基酸序列彼此适当连接，以致整个氨基酸序列形成能够结合IL-6R上的特定表位的结合结构域和/或结合单元。然而，还应该注意到，在本发明的氨基酸序列中仅存在一个所述氨基酸残基片段可以本身已经足以提供能够结合IL-6R上的特定表位的本发明的氨基酸序列(例如，同样参考WO03/050531中描述的所谓的“派遣片段(Expeditefragments)”)。
除了它们部分或完全阻断IL-6/IL-6R相互作用和/或抑制经由IL-6，IL-6R和/或IL-6/IL-6R复合物的信号传导的能力，包括一个或多个这些特定的氨基酸残基片段的氨基酸序列显示了改善的性质，诸如例如改善的结合和/或亲和性，改善的抗体亲抗原性，改善的功效和效力，和/或增加的选择性。
更具体地，包括一个或多个这些特定氨基酸残基片段的本发明的氨基酸序列可以以这样的亲和性(适当测量和/或表示为KD-值(实际的或表观的)，KA-值(实际的或表观的)，kon-速率和/或koff-速率，或备选地作为IC50值，如本发明进一步所述)与IL-6R结合，优选是这样的，以致它们：
-以1nM至1pM以下，优选500pM至1pM以下，更优选100pM至1pM以下，或还更优选约50pM至1pM以下的解离常数(KD)结合hIL-6R；
和/或是这样的，以致它们：
-以1nM至1pM以下，优选500pM至1pM以下，更优选100pM至1pM以下，或还更优选约50pM至1pM以下的解离常数(KD)结合食蟹猴(cyno)IL-6R；
和/或是这样的，以致它们：
-以104M-1s-1至约107M-1s-1，优选105M-1s-1至107M-1s-1，更优选约106M-1s-1以上的kon-速率结合hIL-6R；
和/或是这样的，以致它们：
-以104M-1s-1至约107M-1s-1，优选105M-1s-1至107M-1s-1，更优选约106M-1s-1以上的kon-速率结合食蟹猴IL-6R；
和/或是这样的，以致它们：
-以10-3s-1(t1/2＝0.69s)至10-6s-1(假定具有多天的t1/2的几乎不可逆的复合物)，优选10-4s-1至10-6s-1，更优选10-5s-1至10-6s-1，诸如约10-5s-1以下的koff速率结合hIL-6R；
和/或是这样的，以致它们：
-以10-3s-1(t1/2＝0.69s)至10-6s-1(假定具有多天的t1/2的几乎不可逆的复合物)，优选10-4s-1至10-6s-1，更优选10-5s-1至10-6s-1，诸如约10-5s-1以下的koff速率结合食蟹猴IL-6R。
对于本发明的氨基酸序列与IL-6R结合的一些优选的IC50值将从本发明的进一步描述和实施例中变得清楚。
例如，在Kitamura等(1989，细胞生理学杂志(J.CellPhysiol.)，140：323)描述的TF-1测定中，本发明的氨基酸序列可以具有10nM至50pM，优选5nM至50pM，更优选1nM至50pM以下，诸如约750或500pM以下的IC50值(在100IU/mLIL-6时)。在该TF-1测定中，本发明的氨基酸序列可以具有50nM至1nM，优选25nM至1nM，更优选10nM至1nM以下，诸如约8nM以下的IC50值(在5000IU/mLIL-6时)。在该TF-1测定中，与由SEQIDNO’s：1和2定义的参照IgG或由SEQIDNO’s：3和4定义的参照Fab(参见实施例1)获得的IC50值相比，本发明的氨基酸序列可以具有至少相同和优选更好，至少2倍，优选3倍，更优选4倍，还更优选5倍，7倍或多于7倍更好的IC50值。在该TF-1测定中，与托珠单抗(MRA)获得的IC50值相比，本发明的氨基酸序列可以具有至少相同和优选更好，至少2倍，优选3倍，更优选4倍，还更优选5倍，7倍或多于7倍更好的IC50值。
在IL-6的EC50值下的血浆效力测定中(例如，在存在27.29ng/mLIL-6下，如实施例45所述)，本发明的氨基酸序列可以具有500pM至50pM，优选250pM至50pM，更优选200pM至50pM以下，诸如150pM以下的IC50值。在IL-6的EC95值下的血浆效力测定中(例如，在存在885ng/mLIL-6下，如实施例45所述)，本发明的氨基酸序列可以具有1000pM至100pM，优选750pM至100pM，更优选500pM至100pM以下，诸如400pM以下的IC50值。在该血浆效力测定中，与由SEQIDNO’s：1和2定义的参照IgG或由SEQIDNO’s：3和4定义的参照Fab(参见实施例1)获得的IC50值相比，本发明的氨基酸序列可以具有至少相同和优选更好，至少2倍，优选3倍，更优选4倍，还更优选5倍，7倍或多于7倍更好的IC50值。在该血浆效力测定中，与托珠单抗(MRA)获得的IC50值相比，本发明的氨基酸序列可以具有至少相同和优选更好，至少2倍，优选3倍，更优选4倍，还更优选5倍，7倍或多于7倍更好的IC50值。
在限定与CHO细胞上的膜IL-6R结合的测定中，本发明的氨基酸序列可以具有10nM至100pM，优选5nM至100pM，更优选2nM至10pM以下，诸如2nM以下的IC50值。
在一个优选方面，本发明的氨基酸序列可以包括两个以上的选自以下的氨基酸残基片段：
a)SEQIDNO’s：80-82；或
b)与SEQIDNO’s：80-82之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量；
和/或
c)SEQIDNO’s：84-91；或
d)与SEQIDNO’s：84-91之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量；
和/或
e)SEQIDNO’s：93-95；或
f)与SEQIDNO’s：93-95之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量，
使得(i)当第一个氨基酸残基片段对应于根据a)或b)所述的氨基酸序列之一时，第二个氨基酸残基片段对应于根据c)，d)，e)或f)所述的氨基酸序列之一；(ii)当第一个氨基酸残基片段对应于根据c)或d)所述的氨基酸序列之一时，第二个氨基酸残基片段对应于根据a)，b)，e)或f)所述的氨基酸序列之一；或(iii)当第一个氨基酸残基片段对应于根据e)或f)所述的氨基酸序列之一时，第二个氨基酸残基片段对应于根据a)，b)，c)或d)所述的氨基酸序列之一。
还更优选地，本发明的氨基酸序列包括三个以上的氨基酸残基片段，其中第一个氨基酸残基片段选自以下组成的组：
a)SEQIDNO’s：80-82；或
b)与SEQIDNO’s：80-82之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量；
第二个氨基酸残基片段选自以下组成的组：
c)SEQIDNO’s：84-91；或
d)与SEQIDNO’s：84-91之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量；
并且第三个氨基酸残基片段选自以下组成的组：
e)SEQIDNO’s：93-95；或
f)与SEQIDNO’s：93-95之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以与相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量。
应该注意到，本发明不限制本发明的氨基酸序列的来源(或用于表达其的本发明的核苷酸序列的来源)，也不限制产生或获得(或已经产生或获得)本发明的氨基酸序列或核苷酸序列的方法。因此，本发明的氨基酸序列可以是天然存在的氨基酸序列(来自任何适当的物种)或合成的或半合成的氨基酸序列。
在一个具体但非限制性的方面中，本发明的氨基酸序列可以是包括免疫球蛋白折叠的氨基酸序列，或可以是在适当条件(诸如生理条件)下能够形成免疫球蛋白折叠(即，通过折叠)的氨基酸序列。其中特别参考Halaby等(1999，蛋白质工程杂志(J.ProteinEng.)12：563-71)的综述。优选地，当正确折叠以形成免疫球蛋白折叠时，所述氨基酸残基片段可以能够适当地形成用于结合IL-6R上的特定表位的抗原结合位点；并且更优选地能够以如本发明所定义的亲和性(适当地测量和/或表示为KD-值(实际的或表观的)，KA-值(实际的或表观的)，kon-速率和/或koff-速率，或备选地作为IC50值，如本发明进一步所述)结合它们在IL-6R上的表位。
在另一个具体但非限制性的方面，本发明的氨基酸序列是免疫球蛋白序列。具体地，但非限制性地，本发明的氨基酸序列可以是基本上由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补性决定区(分别为CDR1-CDR3)组成的氨基酸序列；或是所述氨基酸序列的任何适当的仍结合IL-6R上特定表位的片段。
在本发明的这种氨基酸序列中，构架序列可以是任何适当的构架序列，适当的构架序列的实例对于本领域技术人员是清楚的(例如基于标准手册以及进一步描述和本发明提及的现有技术)。
所述构架序列优选是免疫球蛋白构架序列或(例如，通过序列优化，诸如人源化或骆驼源化)已经从免疫球蛋白构架序列衍生的构架序列(的适当组合)。例如，该构架序列可以是衍生于轻链可变结构域(例如，VL-序列)和/或衍生于重链可变结构域(例如，VH-序列)的构架序列。当本发明的氨基酸序列是重链可变结构域序列时，它可以是来源于常规四链抗体的重链可变结构域序列(诸如，不限于，来源于人抗体的VH序列)，或是来源于所谓的“重链抗体”(如本发明所定义)的所谓的VHH-序列(如本发明所定义)。在一个特别优选的方面，所述构架序列是衍生于VHH-序列的构架序列(其中所述构架序列可以任选地已被部分或完全人源化)或者是已经骆驼源化的(如本发明所定义)常规VH序列。
关于重链抗体及其可变结构域的一般描述，特别参考本文引用的现有技术，以及在WO08/020079的第59页上提及的现有技术和国际申请WO06/040153的第41-43页上提及的参考文献列表，所述现有技术和参考文献通过参考结合于此。
本发明的氨基酸序列可以特别地是结构域抗体(或适合用作结构域抗体的氨基酸序列)，单结构域抗体(或适合用作单结构域抗体的氨基酸序列)，″dAb″(或适合用作dAb的氨基酸序列)或纳米抗体(如本文定义，并且包括和不限于VHH序列)；其它单可变结构域，或其中任一的任何适当片段。
特别地，本发明的氨基酸序列可以是(如本发明所定义)或其适当的片段。[注意：和为埃博灵克斯股份有限公司(AblynxN.V.)的注册商标。]所述针对IL-6R的纳米抗体在本发明也称为“本发明的纳米抗体”。
通常，纳米抗体可以定义为具有下述(通用)结构的氨基酸序列：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补性决定区1-3，并且其中一个或多个标志残基如WO08/020079(表A-3至A-8)所定义。
通常，纳米抗体(特别是VHH序列和部分人源化的纳米抗体)可以特别地通过在一个或多个构架序列中存在一个或多个“标志残基”来表征(如例如在WO08/020079，第61页第24行至第98页第3行中进一步描述)。
在这方面，本发明的氨基酸序列可以基本上由4个构架区(分别地FR1至FR4)和3个互补性决定区(分别地CDR1至CDR3)组成，其中：
-CDR1选自以下组成的组：
a)SEQIDNO’s：80-82；或
b)与SEQIDNO’s：80-82之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量；
和/或
-CDR2选自以下组成的组：
c)SEQIDNO’s：84-91；或
d)与SEQIDNO’s：84-91之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量；
和/或
-CDR3选自以下组成的组：
e)SEQIDNO’s：93-95；或
f)与SEQIDNO’s：93-95之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量。
这些优选的互补性决定区(分别为CDR1至CDR3)还称为“本发明的CDR”。
优选地，本发明的氨基酸序列基本上由4个构架区(分别为FR1至FR4)和3个互补性决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中：
-CDR1选自以下组成的组：
a)SEQIDNO’s：80-82；或
b)与SEQIDNO’s：80-82之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量；
和
-CDR2选自以下组成的组：
c)SEQIDNO’s：84-91；或
d)与SEQIDNO’s：84-91之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量；
和
-CDR3选自以下组成的组：
e)SEQIDNO’s：93-95；或
f)与SEQIDNO’s：93-95之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量。
所述纳米抗体可以以任何适当的方式获得，并且来源于任何适当的来源，并且例如，可以是天然存在的VHH序列(即，来自于适当的骆驼(Camelid)物种)或合成的或半合成的氨基酸序列。
在一个具体方面，本发明的氨基酸序列或纳米抗体包括至少SEQIDNO：80；或与SEQIDNO：80具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列或纳米抗体相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列或纳米抗体以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量。
在另一个具体方面，本发明的氨基酸序列或纳米抗体包括至少选自SEQIDNO’s：84，89或91的氨基酸残基片段；或与SEQIDNO’s：84，89或91之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列或纳米抗体相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列或纳米抗体以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量。
在还有的另一个具体方面，本发明的氨基酸序列或纳米抗体包括至少SEQIDNO：84；或与SEQIDNO：84具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列或纳米抗体相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列或纳米抗体以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量。
在还有的另一个具体方面，本发明的氨基酸序列或纳米抗体包括至少选自SEQIDNO’s：93-94的氨基酸残基片段；或与SEQIDNO’s：93-94之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列或纳米抗体相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列或纳米抗体以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量。
在还有的另一个具体方面，本发明的氨基酸序列或纳米抗体包括至少SEQIDNO：93；或与SEQIDNO：93具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列或纳米抗体相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列或纳米抗体以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量。
在还有的另一个具体方面，本发明的氨基酸序列或纳米抗体包括至少SEQIDNO：80和SEQIDNO：84。
在还有的另一个具体方面，本发明的氨基酸序列或纳米抗体包括至少SEQIDNO：80和SEQIDNO：93。
在还有的另一个具体方面，本发明的氨基酸序列或纳米抗体包括至少SEQIDNO：84和SEQIDNO：93。
在还有的另一个具体方面，本发明的氨基酸序列或纳米抗体包括至少SEQIDNO：80，SEQIDNO：84和SEQIDNO：93。
CDR1，CDR2，和CDR3序列的其它优选组合还显示在表A-1中。
本发明的优选氨基酸序列可以选自由以下组成的组：SEQIDNO’s：60-69；这样的序列，所述序列在其CDR中的一个、两个或全部之中与SEQIDNO’s：60-69之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异，条件是与所述SEQIDNO’s：60-69之一的结合相比，所述在其CDR中的一个、两个或全部之中具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量；和与SEQIDNO’s：60-69之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的序列，条件是与所述SEQIDNO’s：60-69之一的结合相比，与SEQIDNO’s：60-69之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量。
本发明的该氨基酸序列应当优选能够特异性结合IL-6R上的特定表位，还更优选能够以如本文定义的亲和性(适当测量的和/或表示为KD-值(实际的或表观的)，KA-值(实际的或表观的)，kon-速率和/或koff-速率，或备选地作为IC50值，如本发明进一步所述)结合IL-6R上的特定表位。本发明的该氨基酸序列应当优选还具有如本文定义的基于细胞的效力和血浆效力。
本发明提供的氨基酸序列和纳米抗体优选是基本上分离的形式(如本文定义)，或形成本发明蛋白质或多肽(也称为“本发明的多肽”或“本发明的蛋白质”)的一部分，所述本发明蛋白质或多肽可以包括一个以上的本发明的氨基酸序列或纳米抗体或基本上由一个以上的本发明的氨基酸序列或纳米抗体组成，并且其可以任选地另外包括一个或多个另外的氨基酸序列或纳米抗体(全部任选地通过一个或多个适当的接头连接)。
因此，在另一个方面中，本发明涉及一种化合物或构建体，并且特别是一种蛋白或多肽(在本发明中还分别称为“本发明的化合物”或“本发明的多肽”)，其包括一个或多个本发明的氨基酸序列或纳米抗体(或其适当的片段)或基本上由一个或多个本发明的氨基酸序列或纳米抗体(或其适当的片段)组成，并且任选地还包括一个或多个其它基团、残基、结构部分或结合单元。如通过本发明进一步的公开内容，对于熟练的技术人员将变得清楚的，所述其它基团、残基、结构部分、结合单元或氨基酸序列可以为或可以不为本发明的氨基酸序列(和/或为其中存在本发明的氨基酸序列的化合物或构建体)提供其它的官能性，并且可以修饰或可以不修饰本发明的氨基酸序列或纳米抗体的特性。
例如，所述其它基团、残基、结构部分或结合单元可以是一个或多个额外的氨基酸序列，以致所述化合物、构建体或多肽是一种(融合)蛋白或(融合)多肽。在一个优选而非限制性的方面中，所述一个或多个其它基团、残基、结构部分或结合单元是免疫球蛋白序列。甚至更优选地，所述一个或多个其它基团、残基、结构部分或结合单元选自由下列各项组成的组：结构域抗体、适合用作结构域抗体的氨基酸序列、单结构域抗体、适合用作单结构域抗体的氨基酸序列、“dAb”、适合用作dAb的氨基酸序列、或纳米抗体。
备选地，例如，所述基团、残基、结构部分或结合单元可以是化学基团、残基、结构部分，其自身可以是或可以不是生物学和/或药理学活性的。例如，并且不限于，所述基团可以连接到一个或多个本发明的氨基酸序列或纳米抗体上，以提供本发明的氨基酸序列或多肽的“衍生物”，如本发明进一步所述。
也在本发明范围内的是这样的化合物、构建体或多肽，其包括一个或多个本发明所述的衍生物或基本上由其组成，并且任选地还包括任选地通过一个或多个接头连接的一个或多个其它基团、残基、结构部分或结合单元。优选地，所述一个或多个其它基团、残基、结构部分或结合单元是氨基酸序列。
在上述化合物、构建体或多肽中，所述一个或多个本发明的氨基酸序列或纳米抗体以及所述一个或多个基团、残基、结构部分或结合单元可以彼此直接连接和/或通过一个或多个适当的接头或间隔体连接。例如，当所述一个或多个基团、残基、结构部分或结合单元是氨基酸序列时，所述接头可以也是氨基酸序列，以致所得到的化合物、构建体或多肽是融合(蛋白)或融合(多肽)。
由本发明的氨基酸序列或纳米抗体起始，设计/选择和/或制备本发明的化合物或多肽的方法在本发明中还称为“格式化”所述的本发明的氨基酸序列或纳米抗体；并且组成本发明的化合物或多肽的一部分的本发明的氨基酸被或纳米抗体认为是“格式化的”或采用所述的本发明的化合物或多肽的“格式”。基于本发明的公开内容，熟练的技术人员将清楚本发明的氨基酸序列或纳米抗体可以被格式化的方法实例以及所述格式的实例；并且所述格式化的氨基酸序列或纳米抗体形成本发明的另一个方面。
例如，和非限制性地，所述一个或多个本发明的氨基酸序列或纳米抗体可以用作该蛋白质或多肽中的结合单元，所述蛋白质或多肽可以任选地含有一个或多个另外的可以用作结合单元的氨基酸序列(即，针对IL-6R上的另一个表位和/或针对一个或多个不同于IL-6R的其它抗原，蛋白质或靶标)，以便分别提供单价、多价、多互补位(multiparatopic)或多特异性的本发明的多肽，全如本发明所述。本发明因此还涉及一种化合物、构建体或多肽，其为包含本发明的氨基酸序列或纳米抗体或基本上由本发明的氨基酸序列或纳米抗体组成的单价构建体。本发明因此还涉及一种化合物、构建体或多肽，其为多价构建体，诸如，例如，二价或三价构建体。本发明还涉及一种化合物、构建体或多肽，其为多价构建体，例如，二价或三价构建体。本发明因此还涉及一种化合物、构建体或多肽，其为多互补位构建体，诸如，例如，双互补位或三互补位构建体。
在本发明的一个具体方面中，与相对应的本发明的氨基酸序列或纳米抗体相比，本发明的化合物或本发明的多肽可以具有增加的半衰期。基于本发明进一步的公开内容，所述化合物和多肽的一些优选而非限制性实例对于熟练的技术人员将变得清楚，并且例如包括下列各项：已经被化学修饰以增加其半衰期(例如，通过聚乙二醇化方式)的本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽；包括至少一个用于结合血清蛋白(诸如血清白蛋白)的另外的结合位点的本发明的氨基酸序列或纳米抗体；或包括至少一个与增加本发明的氨基酸序列或纳米抗体的半衰期的至少一个部分(并且特别是至少一个氨基酸序列)连接的本发明的氨基酸序列的本发明的多肽。基于本发明进一步的公开内容，包括延长半衰期的结构部分的本发明的多肽、氨基酸序列或纳米抗体的实例对于熟练的技术人员将变得清楚；并且例如，包括，但不限于，这样的多肽，其中所述一个或多个本发明的氨基酸序列或纳米抗体适当地连接一个或多个血清蛋白或其片段(诸如(人)血清白蛋白或其适当的片段)或连接一个或多个可以结合血清蛋白的结合单元(诸如，例如，结构域抗体，适合用作结构域抗体的氨基酸序列，单结构域抗体，适合用作单结构域抗体的氨基酸序列，“dAb”’，适合用作dAb的氨基酸序列，或纳米抗体，其可以结合血清蛋白如血清白蛋白(诸如人血清白蛋白)、血清免疫球蛋白如IgG、或运铁蛋白；参考进一步的描述和本发明提及的参考文献)；这样的多肽，其中本发明的氨基酸序列或纳米抗体连接至Fc部分(诸如人Fc)或其适当的部分或片段；或这样的多肽，其中所述一个或多个本发明的氨基酸序列或纳米抗体适当连接一个或多个可以结合血清蛋白的小蛋白或肽(诸如，但不限于，记述在WO91/01743，WO01/45746，WO02/076489中的蛋白和肽)。
通常，具有增加的半衰期的本发明的化合物或多肽优选地具有是相对应的本发明的氨基酸序列或纳米抗体本身的半衰期至少1.5倍、优选地至少2倍，如至少5倍，例如至少10倍或超过20倍高的半衰期。
在一个优选但非限制性的方面，与相对应的本发明的氨基酸序列或纳米抗体本身相比，所述本发明的化合物或多肽具有增加超过1小时，优选超过2小时，更优选超过6小时，诸如超过12小时，或甚至超过24、48或72小时的血清半衰期。
在本发明的另一个优选而非限制性方面中，所述本发明的化合物或多肽在人中表现出至少约12小时、优选至少24小时、更优选至少48小时、甚至更优选至少72小时或更多的血清半衰期。例如，本发明的化合物或多肽可以具有至少5天(诸如约5-10天)、优选至少9天(诸如约9-14天)、更优选至少约10天(诸如约10-15天)、或至少约11天(诸如约11-16天)、更优选至少约12天(诸如约12-18天或更多)、或超过14天(诸如约14-19天)的半衰期。
所述蛋白、多肽、化合物或构建体可以也是基本上分离的形式(如本文定义)。
一些优选的本发明的化合物、构建体或多肽包括下列多肽序列：
a)SEQIDNO’s：70-72；
b)本发明这样的多肽序列，所述多肽序列在其CDR中的一个、两个或全部之中与SEQIDNO’s：70-72之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异，条件是与所述SEQIDNO’s：70-72之一的结合相比，本发明的在其CDR中的一个、两个或全部之中具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的多肽序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量；
c)与SEQIDNO’s：70-72之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的多肽序列，条件是与所述SEQIDNO’s：70-72之一的结合相比，与SEQIDNO’s：70-72之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量。
具有这些序列的多肽显示用作药理学活性剂的有利的性质，诸如，例如，除它们(部分或完全)阻断IL-6/IL-6R相互作用和/或抑制经由IL-6、IL-6R和/或IL-6/IL-6R复合物信号传导的能力之外，良好的结合特性(高亲和性和/或抗体亲抗原性)，高功效和/或效力。
更具体地，本发明的这些多肽和化合物可以以这样的亲和性(适当测量和/或表示为KD-值(实际的或表观的)，KA-值(实际的或表观的)，kon-速率和/或koff-速率，或备选地为IC50值，如本发明进一步所述)结合IL-6R，优选是这样的，以致它们：
-以1nM至1pM摩尔/升以下，优选500pM至1pM摩尔/升以下，更优选100pM至1pM摩尔/升以下，或还更优选约50pM至1pM以下的解离常数(KD)结合hIL-6R；
和/或是这样的，以致它们：
-以1nM至1pM摩尔/升以下，优选500pM至1pM摩尔/升以下，更优选100pM至1pM摩尔/升以下，或还更优选约50pM至1pM以下的解离常数(KD)结合食蟹猴IL-6R；
和/或是这样的，以致它们：
-以104M-1s-1至约107M-1s-1，优选105M-1s-1至107M-1s-1，更优选约106M-1s-1以上的kon-速率结合hIL-6R；
和/或是这样的，以致于它们：
-以104M-1s-1至约107M-1s-1，优选105M-1s-1至107M-1s-1，更优选约106M-1s-1以上的kon-速率结合食蟹猴IL-6R；
和/或是这样的，以致它们：
-以10-3s-1(t1/2＝0.69s)至10-6s-1(假定具有多天的t1/2的几乎不可逆的复合物)，优选10-4s-1至10-6s-1，更优选10-5s-1至10-6s-1，诸如约10-5s-1以下的koff速率结合hIL-6R；
和/或是这样的，以致它们：
-以10-3s-1(t1/2＝0.69s)至10-6s-1(假定具有多天的t1/2的几乎不可逆的复合物)，优选10-4s-1至10-6s-1，更优选10-5s-1至10-6s-1，诸如约10-5s-1以下的koff速率结合食蟹猴IL-6R。
对于本发明的多肽和化合物与IL-6R结合的一些优选的IC50值将从本发明的进一步描述和实施例中变得清楚。
例如，在Kitamura等(细胞生理学杂志(J.CellPhysiol.)1989；140：323)描述的TF-1测定中，本发明的多肽和化合物可以具有10nM至50pM，优选5nM至50pM，更优选1nM至50pM以下，诸如约750或500pM以下的IC50值(在100IU/mLIL-6时)。在该TF-1测定中，本发明的多肽和化合物可以具有50nM至1nM，优选25nM至1nM，更优选10nM至1nM以下，诸如约8nM以下的IC50值(在5000IU/mLIL-6时)。在该TF-1测定中，与由SEQIDNO’s：1和2定义的参照IgG或由SEQIDNO’s：3和4定义的参照Fab(参见实施例1)获得的IC50值相比，本发明的多肽和化合物可以具有至少相同和优选更好，至少2倍，优选3倍，更优选4倍，还更优选5倍，7倍或多于7倍更好的IC50值。在该TF-1测定中，与托珠单抗(MRA)获得的IC50值相比，本发明的氨基酸序列可以具有至少相同和优选更好，至少2倍，优选3倍，更优选4倍，还更优选5倍，7倍或多于7倍更好的IC50值。
在IL-6的EC50值下的血浆效力测定中(例如，在存在27.29ng/mLIL-6下，如实施例45所述)，本发明的多肽和化合物可以具有500pM至50pM，优选250pM至50pM，更优选200pM至50pM以下，诸如150pM以下的IC50值。在IL-6的EC95值下的血浆效力测定中(例如，在存在885ng/mLIL-6下，如实施例45所述)，本发明的多肽和化合物可以具有1000pM至100pM，优选750pM至100pM，更优选500pM至100pM以下，诸如400pM以下的IC50值。在该血浆效力测定中，与由SEQIDNO’s：1和2定义的参照IgG或由SEQIDNO’s：3和4定义的参照Fab(参见实施例1)获得的IC50值相比，本发明的多肽和化合物可以具有至少相同和优选更好，至少2倍，优选3倍，更优选4倍，还更优选5倍，7倍或多于7倍更好的IC50值。在该血浆效力测定中，与托珠单抗(MRA)获得的IC50值相比，本发明的氨基酸序列可以具有至少相同和优选更好，至少2倍，优选3倍，更优选4倍，还更优选5倍，7倍或多于7倍更好的IC50值。
在限定与CHO细胞上的膜IL-6R结合的测定中，本发明的多肽和化合物可以具有10nM至100pM，优选5nM至100pM，更优选2nM至10pM以下，诸如2nM以下的IC50值。
在另一个具体方面，本发明的多肽、化合物或构建体基本上由SEQIDNO：70的氨基酸序列组成。
在另一个具体方面，本发明的多肽、化合物或构建体基本上由SEQIDNO：71的氨基酸序列组成。
本发明的化合物或多肽通常可以通过这样的方法制备，所述方法包括将所述一个或多个本发明的氨基酸序列、纳米抗体或单价构建体任选地通过一个或多个适当的接头适当地连接到所述一个或多个其它基团、残基、结构部分或结合单元上的至少一个步骤，以提供本发明的化合物或多肽。本发明的多肽还可以通过这样的方法制备，所述方法通常至少包括下述步骤：提供编码本发明的多肽的核酸，以适当方式表达所述核酸，和回收所表达的本发明的多肽。这样的方法可以例如，基于本发明进一步所述的方法和技术，以本身已知的方式进行，这对于熟练的技术人员将是清楚的。
因此，本发明还涉及本发明的氨基酸序列、纳米抗体或单价构建体在制备多价化合物、构建体或多肽中的应用。制备多价化合物、构建体或多肽的方法包括将本发明的氨基酸序列、纳米抗体或单价构建体任选地通过一个或多个接头连接至至少一个其它基团、残基、结构部分或结合单元。
通常，当本发明的氨基酸序列或纳米抗体(或包含其的化合物、构建体或多肽)意欲施用于受试者(例如，用于治疗和/或诊断目的，如本文所述)时，优选不天然存在于所述受试者中的氨基酸序列或纳米抗体；或，当其的确天然存在于所述受试者中时，它是基本上分离的形式(如本文定义)。
本发明的氨基酸序列、纳米抗体、多肽和化合物针对来自人的IL-6R。然而，它们应当优选也与来自食蟹猴(CynomolgusMonkey)(食蟹猴(Macacafascicularis))的IL-6R交叉反应，这意味着这些氨基酸序列、纳米抗体、多肽和化合物也“针对”(如本文定义)和/或能够特异性结合(如本文定义)来自食蟹猴(食蟹猴(Macacafascicularis))的IL-6R。该交叉反应性，从药物开发的角度来看可以具有优势，因为它允许针对人IL-6R的氨基酸序列、纳米抗体、多肽和化合物能够在食蟹猴疾病模型中检测。
本发明的氨基酸序列或纳米抗体(以及包含其的化合物、构建体和多肽)是与来自人和来自食蟹猴的IL-6R“交叉反应”，意味着本发明的氨基酸序列或纳米抗体(以及包含其的化合物、构建体和多肽)以这样的亲和性(适当测量和/或表示为KD-值(实际的或表观的)，KA-值(实际的或表观的)，kon-速率和/或koff-速率，或备选地作为IC50值，如本发明进一步所述)结合来自食蟹猴的IL-6R，所述亲和性与所述本发明的氨基酸序列或纳米抗体(以及包含其的化合物、构建体和多肽)结合来自人的IL-6R的亲和性相同或是其至少70％(优选至少80％，更优选至少90％，还更优选至少95％)。关于食蟹猴的IL-6R序列和相应的cDNA序列，还参考由埃博灵克斯股份有限公司(AblynxN.V)于2008年7月16日提交的题目为“来自食蟹猴的白介素-6(IL-6)的受体(Receptorforinterleukin-6(IL-6)fromMacacafascicularis)”的WO09/010539，参见关于cDNA序列的SEQIDNO：3和图1B和关于氨基酸序列的SEQIDNO：4和图3B。
还包括在本发明范围内的是使用本发明的氨基酸序列和多肽的部分、片段、类似物、突变体、变体、等位基因和/或衍生物，和/或使用包括一个或多个这些部分、片段、类似物、突变体、变体、等位基因和/或衍生物的蛋白质或多肽，或基本上由一个或多个这些部分、片段、类似物、突变体、变体、等位基因和/或衍生物组成的蛋白质或多肽，只要这些适合于本文设想的用途。所述部分、片段、类似物、突变体、变体、等位基因和/或衍生物通常含有用于结合IL-6R上的特定表位的功能性抗原结合位点(的至少一部分)；和更优选地将能够特异性结合IL-6R上的特定表位；和更优选地将能够特异性结合至IL-6R上的特定表位，还更优选能够以本文定义的亲和性(适当测量和/或表示为KD-值(实际的或表观的)，KA-值(实际的或表观的)，kon-速率和/或koff-速率，或备选地作为IC50值，如本发明进一步所述)结合至IL-6R上的特定表位。该部分、片段、类似物、突变体、变体、等位基因和/或衍生物将通常还具有基于细胞的功效和血浆效力，如本文定义。该部分、片段、类似物、突变体、变体、等位基因、蛋白质和/或多肽的一些非限制性实例将从本文进一步描述中变得清楚。通过适当组合(即通过连接或基因融合)一个或多个如本文所述的(小的)部分或片段，也可以提供另外的本发明的片段或多肽。
在另一方面，本发明还涉及编码本发明的氨基酸序列、本发明的纳米抗体或本发明的多肽(或其适当片段)的核酸或核苷酸序列。该核酸在本文中也称为“本发明的核酸”，并且可以例如是遗传构建体形式，如本文进一步描述。因此，本发明还涉及遗传构建体形式的核酸或核苷酸序列。
本发明的核苷酸序列可以是天然存在的核苷酸序列或合成的或半合成的序列，并且例如，可以是通过PCR从适当的天然存在的模板(例如，从细胞分离的DNA或RNA)分离的序列，已经从文库(并且特别是表达文库)分离的核苷酸序列，已经通过向天然存在的核苷酸序列中引入突变(利用任何适当的本身已知的技术，诸如错配PCR)而制备的核苷酸序列，已经使用重叠的引物通过PCR制备的核苷酸序列，或已经利用本身已知的DNA合成技术制备的核苷酸序列。
在另一个方面中，本发明涉及表达(或在适当的环境下能够表达)本发明的氨基酸序列、本发明的纳米抗体和/或本发明的多肽的宿主或宿主细胞；和/或包含本发明的核酸的宿主或宿主细胞。通过本发明进一步的描述，所述宿主或宿主细胞的一些优选而非限制性的实例将变得清楚。
本发明还涉及一种产品或组合物，所述产品或组合物包含或包括至少一种本发明的氨基酸序列(或其适当的片段)、至少一种本发明的纳米抗体、至少一种本发明的多肽、至少一种本发明的化合物或构建体、至少一种本发明的单价构建体和/或至少一种本发明的核酸、以及任选地一种或多种所述组合物本身已知的其它成分，即，这取决于所述组合物的目的用途。例如，这样的产品或组合物可以是药物组合物(如本发明所述)、兽医用组合物或用于诊断用途的产品或组合物(同样如本发明所述)。通过本发明进一步的描述，所述产品或组合物的一些优选而非限制性的实例将变得清楚。
本发明还涉及用于制备本发明所述的氨基酸序列、纳米抗体、多肽、核酸、宿主细胞、产品和组合物的方法。所述用于制备本发明的氨基酸序列、本发明的纳米抗体、本发明的多肽、或本发明的单价构建体的方法可以包括下列步骤：
a)在适当的宿主细胞或宿主生物体中或在另一个适当的表达系统中，表达本发明的核酸或核苷酸序列、或本发明的遗传构建体；
任选地接着：
b)分离和/或纯化由此获得的本发明的氨基酸序列、纳米抗体、多肽、或单价构建体。
用于生产本发明的氨基酸序列、纳米抗体、多肽、或单价构建体的方法可以包括下列步骤：
a)在这样的条件下培养和/或维持本发明的宿主或宿主细胞，使得所述宿主或宿主细胞表达和/或生产至少一种本发明的氨基酸序列、纳米抗体、多肽或单价构建体，
任选地接着：
b)分离和/或纯化由此获得的本发明的氨基酸序列、纳米抗体、多肽、或单价构建体。
本发明还涉及本文所述的氨基酸序列、多肽、化合物、构建体、核酸、宿主细胞、产品和组合物用于预防和/或治疗与IL-6R相关的疾病和病症的应用和用途，以及用于预防和/或治疗与IL-6R相关的疾病和病症的方法。从本文的进一步描述，一些优选但非限制性的应用和用途将变得清楚。
本发明的氨基酸序列、纳米抗体、多肽、化合物、构建体和组合物通常可以用于调节，并且特别是抑制和/或预防IL-6R与IL-6的结合和随后IL-6/IL-6R复合物与gp130的结合，并且因此调节且特别是抑制和/或防止由IL-6R、IL-6、IL6/IL-6R复合物和/或gp130介导的信号传导，从而调节IL-6R、IL-6、IL6/IL-6R复合物和/或gp130参与的生物学途径，和/或调节与这样的信号传导或这些途径相关的生物学机制、反应和作用。
在一个方面，本发明提供这样的氨基酸序列、纳米抗体、多肽、构建体和化合物，其是和/或其可以用作IL-6R的、IL-6R-介导的信号传导的拮抗剂，和/或其中涉及IL-6R和/或IL-6R介导的信号传导的生物学途径机制、反应和/或作用的拮抗剂。
在这方面，本发明所述的氨基酸序列、纳米抗体、多肽、化合物、构建体和组合物是这样的，以致它们(a)特异性结合(如本发明所定义)所述IL-6受体；并且(b)能够下调所述IL-6受体和/或能够抑制、减少或下调IL-6受体的信号传导和/或其中涉及IL-6或IL-6R的途径、机制、或信号传导。如对于熟练的技术人员应该清楚的，这样的氨基酸序列、纳米抗体、多肽、化合物或构建体通常可以用作IL-6、IL-6受体和/或其中涉及IL-6、IL-6R和/或Il-6/IL-6R复合物介导的信号传导的生物学途径、机制或作用的拮抗剂。任何这样的减少或下调(与在所述氨基酸序列、纳米抗体、多肽、化合物或构建体不结合IL-6受体的条件下的相同参数相比，其可以是相关参数的至少1％，诸如至少5％，至少10％，或超过10％，或多至50％或100％或更多)，可以以本身已知的任何适当方式测量，例如，使用上述和/或在实验部分所用的和/或本发明提及的一种测定进行。
更特别地，并且除了上述(a)和(b)之外，所述拮抗性氨基酸序列、纳米抗体、多肽、化合物或构建体以这样的方式结合IL-6R，以致(c)与在不存在本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽的条件下IL-6与其受体的结合相比，所述方式阻断、抑制或减少IL-6与IL-6R的结合。
非限制性地，该拮抗性的氨基酸序列、纳米抗体、多肽、化合物和构建体可以结合IL-6R上的特定表位，该特定表位与IL-6R上IL-6相互作用侧邻近。
此外，除了上述(a)和(b)之外，并且任选地除了上述(c)之外，所述拮抗性氨基酸序列和多肽可以以这样的方式结合IL-6R(即，象这样或当如存在于IL-6/IL-6R复合物中时)，即，(d)与在不存在本发明的氨基酸序列、纳米抗体、多肽、化合物或构建体的条件下，IL-6/IL-6R复合物的形成和其与gp130的结合相比较，所述方式抑制或影响(例如，完全或部分破坏)IL-6/IL-6R复合物的形成，所述抑制或影响IL-6/IL-6R复合物的形成是以减少所述复合物与gp130的结合例如其对gp130的亲和性(或者相反，减少gp130与所述复合物的结合例如其对所述复合物的亲和性)的方式进行的，以致由所述复合物与gp130的结合所诱导/介导的信号传导得到调节(例如，减少)。
本发明的氨基酸序列、纳米抗体、多肽、化合物、构建体和组合物还优选地(但不限于)是这样的，以致当它们以治疗相关的量施用给哺乳动物时，与不接受本发明的氨基酸序列、纳米抗体、多肽、化合物、构建体或组合物的哺乳动物相比，它们在所述哺乳动物中(诸如人受试者或在适当的关于炎症的动物模型中，如在食蟹猴中)使C-反应蛋白(CRP)的诱导减少(即，减少至少1％，如减少至少10％，优选至少30％，更优选至少50％，还更优选至少75％以上)或完全抑制。
本发明的氨基酸序列、纳米抗体、多肽、化合物、构建体和组合物还优选地(但不限于)是这样的，以致当它们以治疗相关的量施用给哺乳动物时，与不接受本发明的氨基酸序列、纳米抗体、多肽、化合物、构建体或组合物的哺乳动物相比，它们在所述哺乳动物中(诸如人受试者或在适当的关于炎症的动物模型中，如在食蟹猴中)使血小板的诱导量减少(即，减少至少1％，如减少至少10％，优选至少30％，更优选至少50％，还更优选至少75％以上)或完全抑制。
本发明的氨基酸序列、纳米抗体、多肽、化合物、构建体和组合物还优选地(但不限于)是这样的，以致当它们以治疗相关的量施用给哺乳动物时，与不接受本发明的氨基酸序列、纳米抗体、多肽、化合物、构建体或组合物的哺乳动物相比，它们在所述哺乳动物中(诸如人受试者或在适当的关于炎症的动物模型中，如在食蟹猴中)使血纤蛋白原的诱导减少(即，减少至少1％，如减少至少10％，优选至少30％，更优选至少50％，还更优选至少75％以上)或完全抑制。
因此，本发明的氨基酸序列、多肽、化合物、构建体和组合物可以用于预防和/或治疗与IL-6R、IL-6、IL-6/IL-6R复合物(任选地在与gp130的进一步复合物中)相关的、和/或与其中涉及IL-6、IL-6R和/或IL-6/IL-6R复合物(任选地在与gp130的进一步复合物中)的信号传导途径和/或生物学功能和反应相关的疾病和病症，并且特别用于预防和治疗与IL-6R相关的、与IL-6相关的、与IL-6/IL-6R复合物(任选地在与gp130的进一步复合物中)相关的、和/或与其中涉及IL-6R、IL-6和/或IL-6/IL-6R复合物(任选地在与gp130的进一步复合物中)的信号传导途径和/或生物学功能和反应相关的疾病和病症，所述疾病和病症的特征在于由IL-6R或由其中涉及IL-6R的途径介导的过量的和/或不需要的信号传导。基于本发明公开的内容，所述与IL-6R相关的、与IL-6相关的、与IL-6/IL-6R复合物相关的、和/或与其中涉及IL-6，IL-6R和/或IL-6/IL-6R复合物的信号传导途径和/或生物学功能和反应相关的疾病和病症的实例，对于熟练的技术人员将是清楚的，并且例如包括下述疾病和病症：脓毒症(Starnes等，1999，免疫学杂志(J.Immunol.)，148：1968)和各种形式的癌症，诸如多发性骨髓瘤病(MM)，肾细胞癌(RCC)，浆细胞白血病(Klein等，1991，血液(Blood)，78：1198-1204)，淋巴瘤，B-淋巴组织增生病症(BLPD)和前列腺癌。由过量的IL-6生产或信号传导引起的其它疾病的非限制性实例包括骨吸收(骨质疏松症)(Roodman等，1992，临床研究杂志(J.Clin.Invest.)89：45-52；Jilka等，1992，科学(Science)，257：88-91)，恶病质(Strassman等，1992，临床研究杂志(J.Clin.Invest.)，89：1681-1684)，银屑病，系膜增生性肾小球肾炎，卡波西肉瘤，艾滋病相关的淋巴瘤(Emilie等，1994，血液(Blood)，84：2472-2479)，炎性病和病症，诸如类风湿性关节炎、全身发作的青少年特发性关节炎、高丙球蛋白血症(Grau等，1990，实验医学杂志(J.Exp.Med.)，172：1505-1508)；局限性回肠炎，溃疡性大肠炎，系统性红斑狼疮(SLE)，多发性硬化病，卡斯尔曼病，IgMγ-球蛋白病，心脏粘液瘤，哮喘(特别是变应性哮喘)以及自体免疫性胰岛素-依赖型糖尿病(Campbell等，1991，临床研究杂志(J.Clin.Invest.)87：739-742)。其它IL-6R、IL-6和/或IL-6/IL-6R复合物相关的病症对于熟练的技术人员将是清楚的。所述疾病和病症在本文通常还称为“IL-6R相关的疾病和病症”。
因此，但不限于此，例如，本发明的氨基酸序列、纳米抗体、多肽、化合物、构建体和组合物可以用于预防和/或治疗目前用可以调节IL-6R-介导的信号传导的活性成分(principle)预防或治疗的所有疾病和病症，诸如在上述现有技术中提及的那些。还考虑本发明的氨基酸序列、纳米抗体、多肽、化合物、构建体和组合物可以用于预防和/或治疗用目前正在开发的、已经提议的、或将在将来被提议或开发的这样的活性成分治疗的所有疾病和病症。另外，考虑到，因为它们如在本发明中进一步描述的有利特性，本发明的氨基酸序列、纳米抗体、多肽、化合物、构建体和组合物可以用于预防和治疗除了对其正在应用或将要提议或开发应用这些已知活性成分的那些疾病和病症之外的其它疾病和病症；和/或本发明的氨基酸序列、纳米抗体、多肽、化合物、构建体和组合物可以提供治疗本发明所述的疾病和病症的新方法和方案。
因此，本发明还涉及预防和/或治疗至少一种疾病或病症的方法，所述疾病或病症可以通过向需要其的受试者施用本发明的氨基酸序列、本发明的纳米抗体、本发明的多肽、或本发明的单价构建体来治疗和/或预防，所述方法包括向需要其的受试者施用药物活性量的至少一种本发明的氨基酸序列，本发明的纳米抗体，本发明的多肽，本发明的化合物，或本发明的(单价)构建体，或本发明的组合物。
本发明还涉及本发明的氨基酸序列、本发明的纳米抗体、本发明的多肽、本发明的化合物、或本发明的(单价)构建体在制备药物组合物中的应用，所述药物组合物用于预防和/或治疗与IL-6相关的、与IL-6R相关的、与IL-6/IL-6R复合物相关的、和/或与其中涉及IL-6、IL-6R和/或IL-6/IL-6R复合物的信号传导途径和/或生物学功能和反应相关的疾病和病症；和/或用于一种或多种本文所述方法。
本发明还涉及本发明的氨基酸序列、本发明的纳米抗体、本发明的多肽、本发明的化合物、或本发明的(单价)构建体，其用于预防和/或治疗至少一种与IL-6相关的、与IL-6R相关的、与IL-6/IL-6R复合物相关的、和/或与其中涉及IL-6、IL-6R和/或IL-6/IL-6R复合物的信号传导途径和/或生物学功能和反应相关的疾病和病症；和/或用于一种或多种本文所述方法。
具体地，本发明提供适合于在温血动物中，特别是在哺乳动物中，更特别是在人中，预防、治疗和/或诊断应用的氨基酸序列、纳米抗体、蛋白质、多肽、化合物和/或构建体。
更具体地，本发明提供这样的氨基酸序列、纳米抗体、蛋白质、多肽、化合物和/或构建体，其可以用于在温血动物中，特别是在哺乳动物中，更特别是在人中，预防、治疗、缓解和/或诊断一种或多种IL-6R相关病症(如本文定义)。
从本文进一步的公开内容，本发明氨基酸序列、纳米抗体、多肽和化合物的其它应用和用途将对于本领域技术人员变得清楚。
附图简述
图1：如实施例2所述，通过ELISA分析美洲驼81和82的免疫反应。
图2：如实施例2所述，通过FACS分析在美洲驼81和82中的免疫反应。图例：L181pre：来自美洲驼81的免疫前血清；L181PBL1：在第28天从美洲驼81收集的血清；L182pre：来自美洲驼82的免疫前血清；L182PBL2：在第43天从美洲驼82收集的血清。
图3：用于鉴定针对IL-6R上的IL6结合位点的纳米抗体的α筛选(Alphascreen)测定的示意图。
图4：抗-IL-6R纳米抗体的氨基酸序列。
图5：如实施例6所述获得的纯化的纳米抗体的SDS-PAGE。
图6：如在α筛选中测量，所选择的纳米抗体对IL-6/IL-6R相互作用的抑制。激昂MAbBR-6和参照Fab片段(如实施例1所述)用作对照。
图7：通过FACS分析抗-IL-6R抗体与U266细胞的结合。
图8：在缺少(上部)和存在(底部)人血浆的情况下抗-IL-6R纳米抗体与U266细胞的结合。
图9：在静脉内给药1mg/kg(○)，5mg/kg(△)，10mg/kg(+)，25mg/kg(×)和100mg/kg(◇)后，个体观察的(符号)和模型预测的(实线)食蟹猴中IL6R304的血浆浓度-时间曲线。
图10：纳米抗体与小鼠和人IL-6R的结合。在每组三个条形中，左边条形表示人IL6R，中间条形表示小鼠IL6R，右边条形表示空白。
图11：纯化的双特异性纳米抗体的SDS-PAGE。
图12：如通过α筛选测量，双特异性纳米抗体抑制IL-6/IL-6R相互作用。
图13：二价纳米抗体与U266细胞结合的FACS分析。
图14：三价纳米抗体与U266细胞结合的FACS分析。
图15：IL6R03，IL6R04和IL6R13序列与5个最同源的人种系的比对。关于进一步的解释，参见实施例23。
图16A和B：IL6R03，IL6R04和IL6R13的序列优化的变体的氨基酸序列。关于进一步的解释，参见实施例23。
图17：IL6R03的序列优化的变体抑制IL-6/IL-6R相互作用。
图18：IL6R04的序列优化的变体抑制IL-6/IL-6R相互作用。
图19：IL6R13的序列优化的变体抑制IL-6/IL-6R相互作用。
图20：IL6R13的序列优化的变体抑制IL-6/IL-6R相互作用。
图21：野生型和序列优化的抗-IL-6R纳米抗体抑制IL-6/IL-6R相互作用。
图22：序列优化的纳米抗体与野生型纳米抗体相比的基于细胞的效力。
图23：在人(A)和食蟹猴(B)血浆中序列优化的纳米抗体的血浆效力ELISA。
图24：序列优化的纳米抗体在IL-6的EC50(左)和EC95(右)下的血浆效力ELISA。
图25：如实施例29所述，IL-6R纳米抗体的表位作图：在IL-6R-包被的(A-C)或IL-6-包被的芯片上的竞争测定。
图26：亲和性成熟的IL6R65变体的氨基酸序列。
图27：纳米抗体IL6R65(称为亲代纳米抗体)及其亲和性成熟的变体的结合曲线。
图28：在人和食蟹猴血浆效力测定中评估IL6R65和5种亲和性成熟的变体。
图29：通过亲和性成熟的纳米抗体抑制TF-1细胞的IL-6-依赖性增殖。在2ng/ml人IL-6和各种浓度的纳米抗体的存在下培养细胞。通过3H-胸苷掺入测量增殖。
图30：如在Biacore中测量，将IL-6与两种亲和性成熟的纳米抗体(B-C)的竞争和IL-6与IL6R65(A)的竞争进行比较。
图31：在第2轮亲和性成熟(组合文库CDR1/2+CDR3)后，对结合IL-6R的纳米抗体进行测序。
图32：抑制TF-1细胞的IL-6-依赖性增殖。在2ng/ml人IL-6和各种浓度的纳米抗体的存在下，培养细胞。通过3H-胸苷掺入测量增殖。
图33：在人和食蟹猴血浆效力测定中，评估IL6R65和第2轮亲和性成熟的变体。亲代＝IL6R65。
图34：IL6R65和PMP20A11与全血中人PBMC的结合。
图35：格式化纳米抗体和参照IgG抑制膜IL-6R活性。将TF-1细胞与一系列稀释度的IL6R304(■)，IL6R305(▲)，IL6R306或参照IgG(●)预温育，之后用100IU/mLIL-6诱导增殖。在72小时温育后，通过3H胸苷的掺入评估细胞增殖。显示了一式三份测量的平均值±s.e.。
图36：在高水平的IL-6下，通过格式化纳米抗体和参照IgG抑制膜IL-6R。将TF-1细胞与一系列稀释度的20A11(◆)，IL6R304(■)，IL6R305(▲)，或参照IgG(●)预温育，之后用5000IU/mLIL-6诱导增殖。在72小时温育后，通过3H胸苷的掺入评估细胞增殖。显示了一式三份测量的平均值±s.e.。
图37：IL6R304和IL6R305对TF-1细胞增殖的影响。将TF-1细胞以12500细胞/孔的密度接种，并且与或不与50nMIL6R304或IL6R305一起温育。用100IU/mLIL-6诱导增殖，或者在缺少生长因子的条件下将细胞温育。在72小时后，通过3H胸苷的掺入评估细胞增殖。每个数据点测量30次。显示了平均值±s.e。
图38：在人血浆中的血浆效力ELISA。通过参照IgG(●)，IL6R20A11(◆)，IL6R304(■)，IL6R305(▲)，IL6R306或不相关的NB(x)中和人IL-6与血浆sIL-6R的结合。显示了一式两份测量的平均值±s.e。A，B：与25ng/mL的IL-6(EC50)竞争。C，D：与885ng/mL的IL-6(EC95)竞争。
图39：IL6R20A11和格式化的变体与CHO细胞的结合。将表达IL-6R的CHO细胞(A)或阴性CHO细胞(B)与IL6R20A11(◆)，IL6R304(■)，IL6R305(▲)或IL6R306温育。使用MAbcl.5.3.1和抗-小鼠-PE检测结合的纳米抗体。
图40：IL-6R纳米抗体与全血中人PBL的结合。左：基于FSC/SSC性质，门控(gate)淋巴细胞(L，黑色)，单核细胞(M，暗灰色)和粒细胞(G，浅灰色)。中间：三种门控群体的背景PE荧光。右：在与1μM的IL6R305温育后的PE荧光。
图41：IL-6R纳米抗体与人PBL的结合。将来自2名捐献者的EDTA-处理的血液与IL6R20A11(◆)，IL6R304(■)，IL6R305(▲)或IL6R306温育。使用MAbcl.5.3.1和抗-小鼠-PE检测结合的纳米抗体。A：淋巴细胞；B：单核细胞；C：粒细胞。
图42：格式化的亲和性成熟的纳米抗体对于人和食蟹猴血清白蛋白的结合曲线。
图43：格式化的亲和性成熟的纳米抗体与人和食蟹猴IL-6R的结合曲线。
图44：在食蟹猴血浆中的血浆效力ELISA。通过参照IgG(●)，IL6R20A11(◆)，IL6R304(■)，IL6R305(▲)，IL6R306或不相关的NB(x)中和人IL-6与食蟹猴血浆sIL-6R结合。
图45：IL6R20A11与来自其它物种的sIL-6R的交叉反应性。左：在与来自人(●)，食蟹猴(■)或小鼠(▲)的重组sIL-6R预温育后，在平板上IL6R20A11与人sIL-6R的结合。右：在与人(●)，食蟹猴(■)，小鼠(▲)或豚鼠血浆预温育后，IL6R20A11与人sIL-6R的结合。
图46：竞争性结合ELISA。将IL6R20A11(0.05nM)与不同浓度的IL-6R(●)，LIF-R(■)，CNTF-R(▲)，OSM-R或IL-11R/Fc(◆)预温育。将游离的IL6R20A11捕获在sIL-6R上并通过抗-His检测。
图47：关于体内PK/PD分析IL6R304和IL6R305的研究设计。
图48：参照IgG，IL6R304和IL6R305对CRP水平的影响在个体食蟹猴中通过hIL-6增加。(A)动物27，28和29用作阴性对照并且仅接受hIL-6。静脉内施用参照IgG(B，闭合黑色符号)，不同剂量的IL6R304(C，蓝色符号)和不同剂量的IL6R305(D，红色符号)，接着以5μg/kg的剂量皮下注射hIL-6，每天一次，共7天。
图49：在使用IL6R304和IL6R305的体内PK/PD研究中获得的所有组的平均CRP水平。
图50：参照IgG，IL6R304和IL6R305对于个体食蟹猴中通过hIL-6增加的血纤蛋白原水平的影响。(A)动物27，28和29用作阴性对照并且仅接受hIL-6。静脉内施用参照IgG(B，闭合黑色符号)，不同剂量的IL6R304(C，蓝色符号)和不同剂量的IL6R305(D，红色符号)，接着以5μg/kg的剂量皮下注射hIL-6，每天一次，共7天。将结果针对基底水平标准化。
图51：在使用IL6R304和IL6R305的体内PK/PD研究中获得的所有组的平均血纤蛋白原水平。
图52：参照IgG，IL6R304和IL6R305对于个体食蟹猴中hIL-6增加的血小板量的影响。(A)动物27，28和29用作阴性对照并且仅接受hIL-6。静脉内施用参照IgG(A，闭合黑色符号)，不同剂量的IL6R304(B，蓝色符号)和不同剂量的IL6R305(C，红色符号)，接着以5μg/kg的剂量皮下注射hIL-6，每天一次，共7天。将结果针对基底水平标准化。
图53：在使用IL6R304和IL6R305的体内PK/PD研究中获得的所有组的血小板的平均量。
图54：在静脉内推注给药IL6R304(0.4-2-10mg/kg)后食蟹猴中个体观察到的血浆浓度-时间曲线。11m，12m和13f是左手侧的三个图表；17m，18f和14m是中间图表，并且15m和16f是右手侧的图表。
图55：在静脉内推注给药IL6R305(0.4-2-10mg/kg)后食蟹猴中个体观察到的血浆浓度-时间曲线。19m，20f和21f是左手侧的三个图表；25m，26f和22m是中间图表，并且23m和24f是右手侧的图表。
图56：在静脉内推注给药IL6R304(0.4-2-10mg/kg)和IL6R202(2mg/kg，剂量正规化至0.4-10mg/kg)后食蟹猴中个体观察到的平均血浆浓度vs.时间的曲线。
图57：在给药前和静脉内给药IL6R304后不同天数抗-IL6R304抗体的免疫检测。将ELISA平板用IL6R304包被。每个图中的图例对应于从左至右开始分组的条形图。
图58：在给药前和静脉内给药IL6R304后不同天数抗-IL6R304抗体的免疫检测。将ELISA平板用IL6R300包被。每个图中的图例对应于从左至右开始分组的条形图。
图59：在给药前和静脉内给药IL6R304后不同天数抗-IL6R304抗体的免疫检测。将ELISA平板用ALB8包被。每个图中的图例对应于从左至右开始分组的条形图。
图60：在给药前和静脉内给药IL6R305后不同天数抗-IL6R305抗体的免疫检测。将ELISA平板用IL6R305包被。每个图中的图例对应于从左至右开始分组的条形图。
图61：在给药前和静脉内给药IL6R305后不同天数抗-IL6R305抗体的免疫检测。将ELISA平板用IL6R300包被。每个图中的图例对应于从左至右开始分组的条形图。
图62：在给药前和静脉内给药IL6R305后不同天数抗-IL6R305抗体的免疫检测。将ELISA平板用ALB8包被。每个图中的图例对应于从左至右开始分组的条形图。
图63：在单次IV推注给药IL6R纳米抗体后食蟹猴中的血浆sIL-6R水平。A：用5mg/kg的RefIgG(■，●)或载体(vehicle)(▲)处理的2只动物，B：用0.04mg/kg的IL6R304处理的3只动物，C：用0.04mg/kg的IL6R305处理的3只动物。
图64：在单次IV推注给药IL6R纳米抗体后在食蟹猴中的总血浆sIL-6R水平。A：用IL6R304(▲，■，●)，参照IgG或载体(◇)处理的动物；B：用IL6R305(▲，■，●)，参照IgG或载体(◇)处理的动物。显示了每组的平均值±s.e.。
图65：在单次IV推注给药IL6R纳米抗体后在食蟹猴中的总血浆IL-6水平。内源食蟹猴和注射的人IL-6两者的总血浆IL-6浓度是通过Gyrolab平台测量的。将低于定量范围的样品描述为9.6pg/mL。A：IL6R304；B：IL6R305；C：阳性(RefIgG)和阴性(缓冲)对照。描述了每个处理组的平均值±s.e.(对于0.4和2mg/kg，n＝3；对于10mg/kg，n＝2)。D：在IV推注注射10mg/kgIL6R304(■，●)，IL6R305或不相关的纳米抗体(◇，●)后在个体动物中的内源性食蟹猴血浆IL-6浓度。显示了2次测量的平均值±s.e.。
图66：在单次静脉内给药不同剂量的IL6R304后食蟹猴中的总sIL6R血浆水平(A)和游离sIL6R血浆水平(B)。显示了每组任一生物标记的平均值血浆浓度±SD。在时间点0施用给定剂量的载体或IL6R304。关于图例，参见图66B。
图67：在单次静脉内给药25mg/kgIL6R304后在食蟹猴中总的和游离的sIL6R血浆水平和IL6R304浓度。显示了对于特定剂量组的平均值±SD。将总sIL6R(实线，正方形符号)，游离sIL6R(实线，圆形符号)和IL6R304浓度(虚线，△)对时间(天)作图。
图68：在静脉内给药1mg/kg(○)，5mg/kg(△)，10mg/kg(+)，25mg/kg(×)和100mg/kg(◇)IL6R304后，将个体观察到的(符号)和模型预测的(实线)总sIL6R浓度-时间作图。
图69：在静脉内推注注射1，5，10，25或100mg/kg的IL6R304之后，在食蟹猴中IL6R304的平均值血浆浓度-时间曲线。
图70：开放式三隔室药理动力学模型，其具有从中央隔室的线性或非线性清除。CLNON-IL6R是线性非-IL6R介导的清除，Vc是中央隔室的体积，Vd是深部外周隔室(deepperipheralcompartment)的体积，CEd是在中央和深部隔室之间的隔室间流量，Vs是浅部外周隔室的体积，CLs是在中央和浅部隔室之间的隔室间流量，并且CLIL6R是非线性IL6R-介导的清除(Vmax是最大代谢速率，Km是对应于50％Vmax的IL6R304的浓度)。
发明详述
在本说明书、实施例和权利要求中：
a)除非另外指明或限定，所用的所有术语具有它们在本领域内的通用意思，其对于熟练的技术人员应该是清楚的。例如，参考标准手册，如Sambrook等，″分子克隆：实验室手册(MolecularCloning：ALaboratoryManual)″(第2版)，卷1-3，冷泉港实验室出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress)(1989)；F.Ausubel等，编，″现代分子生物学方法(Currentprotocolsinmolecularbiology)″，GreenPublishing和WileyInterscience，纽约(1987)；Lewin，“基因II(GenesII)”，JohnWiley&Sons，NewYork，纽约，(1985)；Old等，“基因操作原理：基因工程导言(PrinciplesofGeneManipulation：AnIntroductiontoGeneticEngineering)”，第2版，加利福尼亚大学出版社(UniversityofCaliforniaPress)，伯克利，CA(1981)；Roitt等，“免疫学(Immunology)”(第6版)，Mosby/Elsevier，Edinburgh(2001)；Roitt等，Roitt基础免疫学(Roitt’sEssentialImmunology)，第10版.BlackwellPublishing，英国(2001)；和Janeway等，“免疫生物学(Immunobiology)”(第6版)，GarlandSciencePublishing/ChurchillLivingstone，纽约(2005)，以及本发明所引用的公知背景技术；
b)除非另外指明，术语“免疫球蛋白序列”——不管其在本文中用来指重链抗体或常规的4-链抗体——用作一般术语，包括完整大小的抗体、其单独的链、以及其所有部分、结构域或片段(包括但不限于抗原-结合结构域或片段，分别诸如VHH结构域或VH/VL结构域)。另外，术语“序列”用于本文时(例如在类似“免疫球蛋白序列”、“抗体序列”、“可变结构域序列”、“VHH序列”或“蛋白序列”的术语中)通常应该理解为包括相关的氨基酸序列、以及编码所述氨基酸序列的核酸序列或核苷酸序列，除非上下文需要更狭义的解释。此外，本文所用的术语“核苷酸序列”还包括具有所述核苷酸序列的核酸分子，因此术语“核苷酸序列”和“核酸”在本文中应当被认为是等价的和可以互换使用的；
c)除非另外指明，所有没有具体详细描述的方法、步骤、技术和操作可以以本身已知的方式进行并且已经进行，这对于熟练的技术人员是清楚的。例如，仍旧参考标准手册，参考本发明所提及的公知背景技术，和参考其中所引用的其它参考文献；以及例如参考下列综述：Presta，2006，高级药物递送综述(Adv.DrugDeliv.Rev.)，58(5-6)：640-56；Levin和Weiss，2006，分子生物系统学(Mol.Biosyst.)，2(1)：49-57；Irving等，2001，免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)，248(1-2)：31-45；Schmitz等，2000，胎盘(Placenta)，21增刊A，S106-12；Gonzales等，2005，肿瘤生物学(TumourBiol.)，26(1)：31-43，它们描述了关于蛋白质工程的技术，诸如亲和性成熟和用于改善蛋白质如免疫球蛋白的特异性和其它理想性质的其它技术。
d)氨基酸残基按照标准的三字母或一字母的氨基酸密码显示，如在表A-2提及的；
表A-2：一字母和三字母氨基酸密码
e)出于比较两种或更多种核苷酸序列的目的，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列之间的“序列同一性”百分数可以通过用[第一核苷酸序列中与第二核苷酸序列中相应位置的核苷酸相同的核苷酸数目]除以[第一核苷酸序列中的核苷酸总数]并且乘以[100％]而计算，其中在第二核苷酸序列中核苷酸的每一缺失、插入、置换或添加——与第一核苷酸序列相比——都视作在单一核苷酸(位置)的差异。
备选地，两种或更多种核苷酸序列之间的序列同一性程度可以使用已知的用于序列比对的使用标准设置的计算机算法进行计算，诸如NCBIBlastv2.0。
例如，在WO04/037999，EP0967284，EP1085089，WO00/55318，WO00/78972，WO98/49185和GB2357768-A中描述了用于确定序列同一性程度的一些其它的技术、计算机算法和设置。
通常，出于按照上文列出的计算方法来确定两种核苷酸序列之间的“序列同一性”的百分数的目的，将具有最大核苷酸数目的核苷酸序列视作“第一”核苷酸序列，并且将另一种核苷酸序列视作“第二”核苷酸序列；
f)出于比较两种或更多种氨基酸序列的目的，第一氨基酸序列和第二氨基酸序列之间的“序列同一性”百分数(在本文称为“氨基酸同一性”)可以通过用[第一氨基酸序列中与第二氨基酸序列中相应位置的氨基酸残基相同的氨基酸残基数目]除以[第一氨基酸序列中的氨基酸残基总数]并且乘以[100％]而计算，其中第二氨基酸序列中氨基酸残基的每一缺失、插入、置换或添加——与第一氨基酸序列相比——都视作在单一氨基酸残基(位置)上的差异，即，视作本发明所定义的“氨基酸差异”。
备选地，两种氨基酸序列之间的序列同一性程度可以使用已知的计算机算法进行计算，诸如上文提及的用于确定核苷酸序列的序列同一性程度的那些，其仍旧使用标准设置。
通常，出于按照上文列出的计算方法来确定两种氨基酸序列之间的“序列同一性”的百分数的目的，将具有最大氨基酸残基数目的氨基酸序列视作“第一”氨基酸序列，并且将另一种氨基酸序列视作“第二”氨基酸序列。
此外，在确定两种氨基酸序列之间的序列同一性程度时，熟练的技术人员可以考虑所谓的“保守”氨基酸置换，其通常可以描述为这样的氨基酸置换，即，其中氨基酸残基被具有相似化学结构的另一种氨基酸残基取代，并且其对所述多肽的功能、活性或其它生物学特性几乎没有或者基本上没有影响。这种保守氨基酸置换是本领域内公知的，例如，从WO04/037999，GB335768-A，WO98/49185，WO00/46383和WO01/09300中可知；并且可以基于WO04/037999以及WO98/49185和其中所引用的其它参考文献的相关教导而选择这种置换的(优选)类型和/或结合。
所述保守取代优选地是这样的置换，即，其中下列组(a)-(e)内的一个氨基酸被同组内的另一氨基酸残基置换：(a)小的脂肪族、非极性或弱极性的残基：Ala，Ser，Thr，Pro和Gly；(b)极性、带负电荷的残基及其(不带电荷的)酰胺：Asp，Asn，Glu和Gln；(c)极性、带正电荷的残基：His，Arg和Lys；(d)大的脂肪族、非极性残基：Met，Leu，Ile，Val和Cys；以及(e)芳族残基：Phe，Tyr和Trp。
特别优选的保守置换如下：Ala置换成Gly或置换成Ser；Arg置换成Lys；Asn置换成Gln或置换成His；Asp置换成Glu；Cys置换成Ser；Gln置换成Asn；Glu置换成Asp；Gly置换成Ala或置换成Pro；His置换成Asn或置换成Gln；Ile置换成Leu或置换成Val；Leu置换成Ile或置换成Val；Lys置换成Arg，置换成Gln或置换成Glu；Met置换成Leu，置换成Tyr或置换成Ile；Phe置换成Met，置换成Leu或置换成Tyr；Ser置换成Thr；Thr置换成Ser；Trp置换成Tyr；Tyr置换成Trp；和/或Phe置换成Val，置换成Ile或置换成Leu。
用于本文所述的多肽的任何氨基酸置换还可以基于Schulz等(1978，蛋白质结构原理(；“PrinciplesofProteinStructure”)，Springer-Verlag)研究的不同物种的同源蛋白之间的氨基酸变异频率的分析，基于Chou和Fasman(1974，生物化学(Biochemistry)13：211，和1978，高级酶学(Adv.Enzymol.)，47：45-149)研究的结构形成电势的分析，和基于Eisenberg等(1984，美国国家科学院学报(Proc.Nad.AcadSci.USA)81：140-144)，Kyte和Doolittle(1981，分子生物学杂志(J.Molec.Biol.)157：105-132)，以及Goldman等1986，物理化学综述年刊(Ann.Rev.Biophys.Chem.)15：321-353)研究的蛋白中疏水模式的分析，所有这些通过引用完全结合于此。在本文描述和上文引用的公知背景技术中给出关于纳米抗体的一级、二级和三级结构的信息。此外，出于这一目的，例如，Desmyter等(1996，自然结构生物学(NatureStructuralBiology)，3(9)：803)，Spinelli等(1996，自然结构生物学(NaturalStructuralBiology)，3：752-757)和Decanniere等(，1999，结构(Structure)，7(4)：361)给出来自美洲驼(llama)的VHH结构域的晶体结构。关于在常规VH结构域中形成VH/VL界面的一些氨基酸残基和在这些位置的潜在的骆驼源化(camelizing)置换的其它信息可以在上文引用的现有技术中找到。
g)如果在它们的全长有100％的序列同一性(如本发明所定义)，那么认为氨基酸序列和核酸序列“完全相同”；
h)当比较两种氨基酸序列时，术语“氨基酸差异”是指与第二序列相比，在第一序列位置上的单个氨基酸残基的插入、缺失或置换；应该理解两种氨基酸序列可以包含1个、2个或多个这样的氨基酸差异；
i)当认为核苷酸序列或氨基酸序列分别“包含”另一个核苷酸序列或氨基酸序列，或“基本由”另一个核苷酸序列或氨基酸序列“组成”时，这可以意指后一个核苷酸序列或氨基酸序列已经分别结合在最先提及的核苷酸序列或氨基酸序列中，但是更通常地，这一般意指最先提及的核苷酸序列或氨基酸序列在其序列内分别包括核苷酸或氨基酸残基的片段，其分别与后一个序列具有相同的核苷酸序列或氨基酸序列，而不管实际上已经怎样产生或获得最先提及的序列(例如，其可以通过本发明所述的任何适当的方法进行)。通过非限制性实例的方式，当认为本发明的氨基酸序列包含氨基酸残基片段时，这可以意指所述氨基酸残基片段已经结合在本发明的氨基酸序列内，但是更通常地，这一般意指本发明的氨基酸序列在其序列内包含所述氨基酸残基片段，而不管已经怎样产生或获得所述本发明的氨基酸序列。当认为本发明的纳米抗体包含CDR序列时，这可以意指所述CDR序列已经结合在本发明的纳米抗体内，但是更通常地，这一般意指本发明的纳米抗体在其序列内包含具有与所述CDR序列相同的氨基酸序列的氨基酸残基片段，而不管已经怎样产生或获得所述本发明的纳米抗体。还应该注意到，当后一个氨基酸序列具有特异性生物学或结构功能时，它优选地具有在最先提及的氨基酸序列中基本相同、相似或等价的生物学或结构功能(换言之，最先提及的氨基酸序列优选是这样的，以致后一个序列能够实施基本上相同的、相似的或等价的生物学或结构功能)。例如，当认为本发明的纳米抗体分别包括CDR序列或构架序列时，在所述纳米抗体中的所述CDR序列和构架优选地分别能够作为CDR序列或构架序列行使作用。此外，当认为核苷酸序列包括另一个核苷酸序列时，最先提及的核苷酸序列优选是这样的，以致当它被表达成表达产物(例如，多肽)时，由后一个核苷酸序列编码的氨基酸序列形成所述表达产物的一部分(换言之，后一个核苷酸序列处在与所述最先提及的、较大的核苷酸序列相同的阅读框内)。
j)核酸序列或氨基酸序列视作“(以)基本上分离的(形式)”——例如，与其天然生物来源和/或其从中获得的反应介质或培养介质相比——此时其已经与其通常在所述来源或介质中与之缔合的至少一种其它成分(诸如另一种核酸，另一种蛋白/多肽，另一种生物成分或高分子或至少一种污染物、杂质或微量组分)分离。特别地，当它已被纯化至少2倍，特别是至少10倍，更特别地至少100倍，并且达到1000倍或更多时，认为核酸序列或氨基酸序列“基本上分离”。当使用适当技术确定时，诸如适当的层析技术，诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，“以基本上分离形式”的核酸序列或氨基酸序列优选地基本上是均相的；
k)当用于本文时，术语“结构域”通常是指氨基酸序列的球状区域(诸如抗体链，和特别是重链抗体的球状区域)，或者指基本上由所述球状区域组成的多肽。通常，例如，这样的结构域包括作为片层或通过二硫键而稳定的肽环(例如3或4个肽环)。术语“结合结构域”是指针对抗原决定簇(如本文定义)的这种结构域；
l)术语‘抗原决定簇’是指抗原上由抗原-结合分子(诸如本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽)并且更特别是所述分子的抗原-结合位点而识别的表位。术语“抗原决定簇”和“表位”在本文中还可以互换地使用；
m)对于特定的抗原决定簇、表位、抗原或蛋白(或对于至少其的一部分、片段或表位)可以(特异性)结合、具有亲和性和/或具有特异性的氨基酸序列(诸如本发明的纳米抗体、抗体、多肽，或通常为抗原结合蛋白或多肽或其片段)认为是“针对(“against”或“directedagainst”)”所述抗原决定簇、表位、抗原或蛋白。
n)术语“特异性”是指特定的抗原-结合分子或抗原-结合蛋白(诸如本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽)分子可以结合的不同类型的抗原或抗原决定簇的数目。一种抗原-结合蛋白的特异性可以依据亲和性和/或抗体亲抗原性(avidity)而确定。亲和性，表示为抗原与抗原-结合蛋白的解离平衡常数(KD)，是抗原决定簇和所述抗原-结合蛋白上抗原-结合位点之间的结合强度的测量：KD值越小，抗原决定簇和抗原-结合分子之间的结合强度越强(备选地，亲和性还可以表示为亲和常数(KA)，其为1/KD)。熟练的技术人员应该清楚(例如，基于本发明进一步的公开内容)，亲和性可以以本身已知的方式确定，其取决于目的特异性抗原。抗体亲抗原性是抗原-结合分子(诸如本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽)和相关抗原之间的结合强度的测量。抗体亲抗原性与抗原决定簇及其在抗原-结合分子上的抗原结合位点之间的亲和性以及在所述抗原-结合分子上存在的相关结合位点的数目相关。典型地，抗原-结合蛋白将以10-5-10-12摩尔/升(M)或更小、并且优选地10-7-10-12摩尔/升或更小并且更优选地10-8-10-12摩尔/升的解离常数(KD)(即，以105-1012升/摩尔或更大、并且优选地107-1012升/摩尔或更大、且更优选地108-1012升/摩尔的缔合常数(KA))而结合它们的抗原。任何大于104摩尔/升的KD值(或任何小于104M-1的KA值)升/摩尔通常认为指示非特异性结合。优选地，本发明的单价免疫球蛋白序列将以小于500nM、优选地小于200nM、更优选地小于10nM诸如小于500pM的亲和性与理想的抗原结合。抗原-结合蛋白与抗原或抗原决定簇的特异性结合可以以本身已知的任何适当的方法确定，其包括，例如，斯卡查德分析和/或竞争结合检测，诸如放射性免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)和夹心式(sandwich)竞争测定，和本领域本身已知的其不同的变化；以及本发明提及的其它技术。
熟练的技术人员应该清楚，解离常数可以是实际的或表观解离常数。确定解离常数的方法对于熟练的技术人员应该是清楚的，并且例如，包括本发明提及的技术。在这一点上，还应该清楚，不可能测量大于10-4摩尔/升或10-3摩尔/升(例如，10-2摩尔/升)的解离常数。任选地，熟练的技术人员应该清楚，可以根据(实际或表观)缔合常数(KA)利用[KD＝1/KA]的关系计算所述(实际或表观)解离常数。
亲和性表示分子相互作用的强度或稳定性。亲和性通常作为KD或解离常数给出，其具有摩尔/升(或M)的单位。亲和性还可以表示为缔合常数KA，其等于1/KD，并且具有(摩尔/升)-1(或M-1)的单位。在本说明书中，两个分子(诸如本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽及其目的靶标)之间的相互作用的稳定性将主要以它们相互作用的KD值表示；熟练的技术人员应该清楚，考虑到KA＝1/KD的关系，通过其KD值表示分子相互作用的强度也可以用于计算相对应的KA值。由于KD-值通过公知的关系式DG＝RT.ln(KD)(等价于DG＝-RT.ln(KA))与结合的自由能(DG)相关，KD-值还在热力学意义上表征分子相互作用的强度，在所述关系式中，R等于气体常数，T等于绝对温度，并且ln表示自然对数。
关于认为是有意义的(例如，特异性的)生物学相互作用的KD典型地在10-10M(0.1nM)-10-5M(10000nM)范围内。相互作用越强，其KD越低。
KD也可以表示为复合物的解离速率常数(表示为koff)与其缔合速率(表示为kon)的比例(以致KD＝koff/kon和KA＝kon/koff)。解离速率koff具有单位s-1(其中s是秒的SI单位符号)。缔合速率kon具有单位M-1s-1。缔合速率可以在102M-1s-1-约107M-1s-1之间变化，对于两分子相互作用达到扩散-极限缔合速率常数。解离速率以关系式t1/2＝ln(2)/koff与给定的分子相互作用的半衰期相关。解离速率可以在10-6s-1(接近具有数天的t1/2的不可逆复合物)到1s-1(t1/2＝0.69s)之间变化。
两个分子之间的分子相互作用的亲和性可以通过本身已知的不同技术测量，诸如公知的表面等离子共振(SPR)生物传感器技术(例如，参见Ober等，国际免疫学(Intern.Immunology)，13，1551-1559，2001)，其中将一个分子固定在生物传感器芯片上，另一个分子在流动条件下经过所固定的分子，产生kon，koff测量以及因此产生KD(或KA)值。例如，这可以使用公知的BIACORE仪器进行。
熟练的技术人员还应该清楚，如果测量过程以某种方式影响暗指的分子的内在结合亲和性，例如通过与一个分子的生物传感器上的涂层相关的假象影响，则测量的KD可以与表观KD相对应。此外，如果一个分子含有针对另一个分子的多于一个的识别位点，则可以测量表观KD。在这样的情形中，所测量的亲和性可以受到两个分子之间相互作用的抗体亲抗原性的影响。
可以用来评估亲和性的另一个方法是Friguet等(1985，免疫方法杂志(J.Immunol.Methods)，77：305-19)的2步ELISA(酶联免疫吸附测定)方法。该方法建立溶液相结合平衡测量，并且避免与在支持物如塑料上的一个分子的吸附相关的可能的假象。
然而，KD的准确测量可能是非常费力的，并且作为结果，通常确定表观KD值来评估两个分子的结合强度。应该注意到，只要所有的测量以一致的方式(例如，保持测定条件不变)进行，表观KD测量可以用作真实KD的近似值，并且因此在现有文献中，应该以同等的重要性或相关性对待KD和表观KD。
最后，应该注意到，在许多情形中，有经验的科学家可以判断相对于一些参照分子确定结合亲和性是便利的。例如，为了评估分子A和B之间的结合强度，例如，人们可以使用已知与B结合且适合用荧光团或生色团或其它化学结构部分标记的参照分子C，诸如在ELISA或FACS(荧光活化的细胞分选)中容易检测的生物素、或其它形式(用于荧光检测的荧光团，用于光吸收检测的生色团，用于链霉抗生物素蛋白-介导的ELISA检测的生物素)。典型地，参照分子C保持在固定的浓度，并且A的浓度关于B的给定的浓度或量变化。结果，获得IC50值，其对应于将在不存在A的条件下关于C所测量的信号减半的A的浓度。假定已知参照分子的KD，即KDref，以及参照分子的总浓度cref，则可以通过下式获得关于A-B相互作用的表观KD：KD＝IC50/(1+cref/KDref)。注意，如果cref＜＜KDref，则KD≈IC50。假定以一致的方式(例如，保持cref不变)针对比较的结合剂进行IC50测量，则分子相互作用的强度或稳定性可以通过IC50进行评估，并且在本发明的整个内容中，认为该测量等价于KD或等价于表观KD。
o)本发明的氨基酸序列、纳米抗体、化合物或多肽的半衰期通常可以定义为所述氨基酸序列、纳米抗体、化合物或多肽的血清浓度在体内减少50％所花费的时间，例如，由于所述序列或化合物的降解和/或通过天然机制对所述序列或化合物的清除或隔离(sequestration)。本发明的氨基酸序列、纳米抗体、化合物或多肽的体内半衰期可以以本身已知的任何方式确定，诸如通过药物动力学分析。适当的技术对于本领域熟练的技术人员应该是清楚的，并且例如，通常可以包括下列步骤：将适当剂量的本发明的氨基酸序列、纳米抗体、化合物或多肽适当施用给温血动物(即，施用给人或另一种适当的哺乳动物，诸如小鼠、兔、大鼠、猪、狗或灵长类动物，例如来自猕猴属(Macaca)的猴子(诸如，并且特别是食蟹猴(食蟹猴(Macacafascicularis))和/或恒河猴(恒河猴(Macacamulatta)))和狒狒(豚尾狒狒(Papioursinus)))；从所述动物收集血液样品或其它样品；确定在所述血液样品中的本发明的氨基酸序列、纳米抗体、化合物或多肽的水平或浓度；并且从这样获得的数据(的图表)计算与在给药时的初始水平相比较直到本发明的氨基酸序列、纳米抗体、化合物或多肽的水平或浓度已经减少50％的时间。例如，参考下述实验部分，以及标准手册，诸如Kenneth，A等(药物的化学稳定性：药剂师手册(ChemicalStabilityofPharmaceuticals：AHandbookforPharmacists))和Peters等(1996，药物动力学分析：实践方法(Pharmacokineteanalysis：APracticalApproach))。还参考GibaldiM和PerronD(1982，″药物动力学(Pharmacokinetics)″，MarcelDekker出版，第2综述版(2ndRev.edition))。
熟练的技术人员还应该清楚(例如，参见WO04/003019的第6和7页以及其中引用的其它参考文献)，半衰期可以用参数如t1/2-α，t1/2-β和曲线下面积(AUC)表示。在本说明书中，“半衰期增加”是指在这些参数的任何一种的增加，诸如这些参数的任何两种，或基本上所有这三种参数。当用于本发明时，“半衰期增加”或“增加的半衰期”特别是指t1/2-β的增加，具有或不具有t1/2-α和/或AUC或二者的增加。
p)在本发明的上下文中，“调节(modulating)”或“以调节(tomodulate)”通常意指降低或抑制靶标或抗原的活性，或备选地增加靶标或抗原的活性，如使用适当的体外、细胞或体内测定所测量。特别地，“调节(modulating)”或“以调节(tomodulate)”可以意指：与在相同条件但不存在本发明的氨基酸序列、纳米抗体、多肽、化合物或构建体的条件下，在相同测定中的靶标或抗原的活性相比较，降低或抑制靶标或抗原的活性或备选地增加靶标或抗原的(相关或目的)活性至少1％，优选至少5％，诸如至少10％或至少25％，例如至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，或90％或更多，如使用适当的体外、细胞或体内测定(其将通常取决于有关靶标或抗原)所测量的。
本领域技术人员清楚，“调节”也可以包括与相同条件但不存在本发明的氨基酸序列、纳米抗体、多肽、化合物或构建体相比较，实现靶标或抗原与其一个或多个配体、结合配对物、缔合成同型多聚体或异型多聚体形式的配对物、或底物的亲和性、抗体亲抗原性、特异性和/或选择性的改变(其可以是增加或减少)；和/或导致靶标或抗原关于靶标或抗原存在于其中的介质或周围的一个或多个条件(如pH，离子强度，辅助因子的存在等)的敏感性变化(其可以是增加或减小)。如本领域技术人员所清楚，这再次可以以本身已知的任何适当方式和/或使用任何适当测定(取决于涉及的靶标或抗原)来确定。
“调节”也可以是指对涉及其中涉及靶标或抗原(或其中涉及它的底物、配体或途径，诸如它的信号传导途径或代谢途径和它们相关的生物学或生理学作用)的一种或多种生物学或生理学机制、作用、反应、功能、途径或活性实现改变(即，分别作为激动剂的活性，作为拮抗剂或逆激动剂，这取决于所述靶标或抗原和期望的生物学或生理学作用)。再次，如本领域技术人员所清楚，这种作为激动剂或拮抗剂的作用可以以本身已知的任何适当方式和/或使用任何适当(体外和通常细胞或体内测定)测定(取决于涉及的靶标或抗原)来确定。具体地，作为激动剂或拮抗剂的作用可以是这样的，以致与不存在本发明的氨基酸序列、纳米抗体、多肽、化合物或构建体的相同条件下在相同测定中的生物学或生理学活性相比，所述目的生物学或生理学活性分别增加或降低至少1％，优选至少5％，诸如至少10％或至少25％，例如至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，或90％以上。
调节例如也可以涉及别构调节靶标或抗原；和/或降低或抑制靶标或抗原与其底物或配体之一的结合和/或与天然配体、底物竞争结合靶标或抗原。调节也可以涉及激活靶标或抗原或其中涉及它的机制或途径。调节可以例如还涉及导致靶标或抗原的折叠或构象的变化，或靶标或抗原折叠、改变其构象(例如，在配体结合后)、与其它(亚)单元缔合或解离的能力的变化。调节也可以例如涉及导致靶标或抗原转运其它化合物或用作其它化合物(诸如离子)的通道的能力的变化。
调节可以是可逆的或不可逆的，但是为了药物学和药理学目的通常是可逆的方式。
在本发明上下文中，“调节(modulating)”或“以调节(tomodulate)”通常分别是指发挥关于IL-6，IL-6R和/或其中涉及IL-6和/或IL-6R的生物学途径、反应、信号传导、机制或作用的激动或拮抗作用。特别是，“调节(modulating)”或“以调节(tomodulate)”可以是指激动或拮抗作用(即，分别地完全或部分激动或拮抗作用)，如使用适当的体外、细胞或体内测定(如本文提到的那些)所测量，与在相同条件下但不存在本发明的氨基酸序列、纳米抗体、多肽、化合物或构建体的相同测定中的相同参数相比，所述激动或拮抗作用导致相关参数变化至少1％，优选至少5％，诸如至少10％或至少25％，例如至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，或90％以上。
在本发明上下文中，“调节、抑制和/或防止IL-6/IL-6R复合物与gp130结合”是指本发明的氨基酸序列、纳米抗体、多肽、化合物或构建体以这样的方式结合IL6-R上的特定表位(即原样或存在于IL-6/IL-6R复合物中)，即使得影响、抑制和/或防止(完全或部分破坏)IL-6/IL-6R复合物的形成，以这样的方式使得复合物与gp130的结合，例如其与gp130的亲和性，被减少、抑制和/或防止(或相反，gp130与复合物的结合，例如其与复合物的亲和性，被减少、抑制和/或防止)，以致与在不存在本发明的氨基酸序列、纳米抗体、多肽、化合物或构建体的情况下复合物的形成及其与gp130的结合相比，调节(例如，减少、抑制和/或防止)通过复合物与gp130的结合诱导/介导的信号传导。
q)关于靶标或抗原，术语靶标或抗原上的“相互作用位点”是指靶标或抗原上的位点、表位、抗原决定簇、部分、结构域或氨基酸残基片段、其是靶标或抗原的用于结合配体、受体或其它结合配对物的位点、催化位点、切割位点、变构相互作用位点、参与靶标或抗原的多聚化(诸如同型多聚化或异型多聚化)的位点；或靶标或抗原上的参与靶标或抗原的生物学作用或机制的任何其它位点、表位、抗原决定簇、部分、结构域或氨基酸残基片段。更一般地，“相互作用位点”可以是靶标或抗原上的任何位点、表位、抗原决定簇、部分、结构域或氨基酸残基片段，在其上本发明的氨基酸序列、纳米抗体、多肽、化合物或构建体可以结合以致调节(如本文定义)所述靶标或抗原(和/或其中涉及所述靶标或抗原的任何途径、相互作用、信号传导、生物学机制或生物学作用)。
r)“氨基酸残基片段”是指(即在氨基酸序列的一级或三级结构上)彼此邻近或彼此紧邻的两个以上的氨基酸残基。在本发明的上下文中，“氨基酸残基片段”将(至少部分)负责本发明的氨基酸序列、纳米抗体、多肽、化合物或构建体与其在IL-6R上的特定表位的结合。
s)当氨基酸序列、纳米抗体、多肽、化合物或构建体以亲和性(如上所述，和适当地表示为KD值，KA值，Koff速率和/或Kon速率)(所述亲和性是所述氨基酸序列、纳米抗体、多肽、化合物或构建体与第二靶标或多肽结合的亲和性的至少10倍，诸如至少100倍，和优选至少1000倍，和多至10.000倍以上)结合第一抗原时，其被认为是与第二靶标或抗原相比对于第一靶标或抗原是“特异性的”。例如，第一氨基酸序列、纳米抗体、多肽、化合物或构建体可以以KD值结合靶标或抗原，所述KD值是所述氨基酸序列、纳米抗体、多肽、化合物或构建体结合第二靶标或多肽的KD的至少10倍小，诸如至少100倍小，和优选至少1000倍小，诸如10.000倍小，或甚至比其更小。优选地，当氨基酸序列、纳米抗体、多肽、化合物或构建体对于第一靶标或抗原与第二靶标或抗原相比是“特异性的”时，它针对(如本文定义)所述第一靶标或抗原，但是不针对所述第二靶标或抗原。
t)本发明的氨基酸序列或纳米抗体(以及包含其的化合物、构建体和多肽)与来自两种不同物种(即，第一物种和第二物种)的IL-6R是“交叉反应性的”，这是指本发明的氨基酸序列或纳米抗体(以及包含其的化合物、构建体和多肽)以亲和性(适当测量和/或表示为KD-值(实际的或表观的)，KA-值(实际的或表观的)，kon-速率和/或koff-速率，或备选地作为IC50值，如本发明进一步所述)结合来自第二物种的IL-6R，所述亲和性与本发明的所述氨基酸序列或纳米抗体(以及包含其的化合物，构建体和多肽)结合来自第一物种的IL-6R的亲和性相同或者是其至少70％(优选至少80％，更优选至少90％，或还更优选至少95％)。
u)如本文进一步描述，纳米抗体中的氨基酸残基的总数目可以是110-120、优选112-115的区域内，最优选113。然而应当注意，纳米抗体的部分、片段、类似物或衍生物(如本文进一步描述)不具体限制它们的长度和/或尺寸，只要这些部分、片段、类似物或衍生物满足本文概述的进一步的要求，并且还优选适合于本文所述的目的；
v)纳米抗体的氨基酸残基按照Kabat等(“免疫学目的蛋白的序列(Sequenceofproteinsofimmunologicalinterest)”，美国公众健康服务中心(USPublicHealthServices)，NIHBethesda，MD，PublicationNo.91)给出的关于VH结构域的通用编号方式进行编号，这种编号方式在Riechmann和Muyldermans的文章(2000，免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)240(1-2)：185-195；参见例如该出版物的图2)中用于来自骆驼科动物的VHH结构域；或参见本文。按照这种编号方式，纳米抗体的FR1包括位置1-30的氨基酸残基，纳米抗体的CDR1包括位置31-35的氨基酸残基，纳米抗体的FR2包括位置36-49的氨基酸，纳米抗体的CDR2包括位置50-65的氨基酸残基，纳米抗体的FR3包括位置66-94的氨基酸残基，纳米抗体的CDR3包括位置95-102的氨基酸残基，以及，纳米抗体的FR4包括位置103-113的氨基酸残基。[在这一方面，应该注意——如在本领域内关于VH结构域和关于VHH结构域公知的——在每一CDR中的氨基酸残基的总数可以不同，并且可以不与由Kabat编号方式指示的氨基酸残基的总数相对应(即，按照Kabat编号方式的一个或多个位置可能不占据在实际序列中，或者实际序列可能包含比由Kabat编号方式允许的数目更多的氨基酸残基)。这意味着，通常，按照Kabat的编号方式可能或可能不与实际序列中的氨基酸残基的实际编号方式相对应。然而，通常可以认为，按照Kabat的编号方式并且不考虑CDR中的氨基酸残基的数目，按照Kabat编号方式的位置1对应FR1的起点，并且反之亦然，按照Kabat编号方式的位置36对应FR2的起点，并且反之亦然，按照Kabat编号方式的位置66对应FR3的起点，并且反之亦然，以及按照Kabat编号方式的位置103对应FR4的起点，并且反之亦然。]。
用于将VH结构域的氨基酸残基编号的备选方法是由Chothia等(1989，自然(Nature)342：877-883)所述的方法，即所谓的“AbM定义”和所谓的“联系定义”，所述方法还可以以类似的方式用于来自骆驼科动物的VHH结构域以及用于纳米抗体。然而，在本说明书、权利要求和附图中，遵循由Riechmann和Muyldermans用于VHH结构域的按照Kabat的编号方式，除非另外指明；并且
w)给出附图、序列表和实验部分/实施例只是进一步举例说明本发明，并且不应该被以任何方式解释为或者认为限制本发明和/或附上的权利要求的范围，除非本文中另外明确指明。
本发明提供氨基酸残基片段(SEQIDNO’s：80-82，SEQIDNO’s：84-91和SEQIDNO’s：93-95)，其特别适合于结合IL-6R。这些氨基酸残基片段可以存在于和/或可以结合到本发明的氨基酸序列中，特别是以这种方式，以致它们形成本发明氨基酸序列的(一部分)抗原结合位点。这些氨基酸残基片段已经作为重链抗体或VHH序列的CDR序列产生，所述重链抗体或VHH序列针对IL-6R生成并且进一步进行亲和性成熟(参见实施例部分)以进一步增加它们结合IL-6R的亲和性以及其它性质，诸如它们的功效和/或效力，和/或它们的选择性，以及它们部分或完全阻断IL-6/IL-6R相互作用的能力，和/或抑制经由IL-6，IL-6R和/或IL-6/IL-6R复合物的信号传导。这些氨基酸残基片段在本文中也称为“本发明的CDR序列”(即，分别作为“本发明的CDR1序列”，“本发明的CDR2序列”和“本发明的CDR3序列”)。
然而，应当注意，本发明在其最广泛意义上不限于这些氨基酸残基片段可能在本发明的氨基酸序列中具有的特定的结构作用或功能，只要这些氨基酸残基片段允许本发明的氨基酸序列结合IL-6R。因此，通常，本发明在其最广泛意义上提供以下氨基酸序列：除了它们部分或完全阻断IL-6/IL-6R相互作用的能力，和/或抑制经由IL-6，IL-6R和/或IL-6/IL-6R复合物的信号传导以外，所述氨基酸序列能够以特定具体的亲和性、抗体亲抗原性、功效和/或效力结合IL-6R，并且包括一个或多个本文所述的CDR序列，和特别是两个以上所述CDR序列的适当组合，其适当地通过一个或多个另外的氨基酸序列彼此连接，以致整个氨基酸序列形成能够结合IL-6R的结合结构域和/或结合单元。然而，还应当注意，在本发明的氨基酸序列中仅存在一个这种CDR序列可能本身已经足以为本发明的氨基酸序列提供结合IL-6R的能力；例如再次参见WO03/050531中描述的所谓的“派遣片段(Expeditefragments)”。
因此，在一个具体但非限制的方面，本发明的氨基酸序列可以包括至少一个选自以下组成的组的氨基酸残基片段：
-CDR1序列：
a)SEQIDNO’s：80-82；或
b)与SEQIDNO’s：80-82之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以与相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量；
和/或
-CDR2序列：
c)SEQIDNO’s：84-91；或
d)与SEQIDNO’s：84-91之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量；
和/或
-CDR3序列：
e)SEQIDNO’s：93-95；或
f)与SEQIDNO’s：93-95之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量。
特别地，本发明的氨基酸序列可以是包括至少一个抗原结合位点的氨基酸序列，其中所述抗原结合位点包括选自由如上所述的CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列(或它们的任何适当的组合)组成的组的至少一个氨基酸残基片段。然而，在一个优选方面，本发明的氨基酸序列包括超过一个、诸如两个以上的氨基酸残基片段，所述氨基酸残基片段选自以下组成的组：本发明的CDR1序列，本发明的CDR2序列和/或本发明的CDR3序列。
因此，本发明还涉及包括两个以上选自以下的氨基酸残基片段的氨基酸序列：
-CDR1序列
a)SEQIDNO’s：80-82；或
b)与SEQIDNO’s：80-82之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量；
和/或
-CDR2序列
c)SEQIDNO’s：84-91；或
d)与SEQIDNO’s：84-91之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量；
和/或
-CDR3序列
e)SEQIDNO’s：93-95；或
f)与SEQIDNO’s：93-95之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量。
使得(i)当第一个氨基酸残基片段对应于根据a)或b)所述的氨基酸序列之一时，第二个氨基酸残基片段对应于根据c)，d)，e)或f)所述的氨基酸序列之一；(ii)当第一个氨基酸残基片段对应于根据c)或d)所述的氨基酸序列之一时，第二个氨基酸残基片段对应于根据a)，b)，e)或f)所述的氨基酸序列之一；或(iii)当第一个氨基酸残基片段对应于根据e)或f)所述的氨基酸序列之一时，第二个氨基酸残基片段对应于根据a)，b)，c)或d)所述的氨基酸序列之一。
在一个具体方面，本发明还涉及包括三个以上的氨基酸残基片段的氨基酸序列，其中第一个氨基酸残基片段选自以下CDR1序列：
a)SEQIDNO’s：80-82；或
b)与SEQIDNO’s：80-82之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量；
第二个氨基酸残基片段选自以下CDR2序列：
c)SEQIDNO’s：84-91；或
d)与SEQIDNO’s：84-91之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量；
且第三个氨基酸残基片段选自以下CDR3序列：
e)SEQIDNO’s：93-95；或
f)与SEQIDNO’s：93-95之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量。
如本文所述，本发明还涵盖包括一个或多个氨基酸残基片段的氨基酸序列，所述氨基酸残基片段与a)，c)和/或e)中指定的氨基酸残基片段之一，即，与指定的CDR1序列之一(即，与SEQIDNO’s：80-82之一)，与指定的CDR2序列之一(即，与SEQIDNO’s：84-91之一)和/或与指定的CDR3序列(即与SEQIDNO’s：93-95之一)具有不超过2个、优选不超过1个的氨基酸差异。
术语“氨基酸差异”是指分别与a)，c)或e)的氨基酸残基片段(或CDR序列)相比，在b)，d)或f)中指定的氨基酸残基片段(或CDR序列)的一个位置插入、缺失或置换单个氨基酸残基；应当理解，分别与a)，c)或e)的氨基酸残基片段相比，b)，d)和f)的氨基酸残基片段(或CDR序列)可以含有一个或最多两个这样的氨基酸差异。
“氨基酸差异”可以是任何或最多两个置换、缺失或插入，或它们的任何组合，其改善本发明的氨基酸序列的性质，或至少不将本发明的氨基酸序列的所需性质或所需性质的平衡或组合损伤过多。在这方面，与包括所述一个或多个氨基酸残基片段但没有所述一个或最多两个置换、缺失或插入的氨基酸序列相比，所获得的本发明的氨基酸序列应当至少以相同、大约相同或更高的亲和性结合IL-6R，所述亲和性通过表面等离子共振测量。
例如，并且取决于用于表达本发明的氨基酸序列的宿主生物体，这种缺失和/或置换可以以这种方式设计，以致去除一个或多个用于翻译后修饰的位点(诸如一个或多个糖基化位点)，这是在本领域技术人员能力范围之内的。
在本发明的一个优选方面，“氨基酸差异”是氨基酸置换。氨基酸置换可以是任何一个或最多两个置换，它们改善本发明的氨基酸序列的性质，或至少不将本发明的氨基酸序列的所需性质或所需性质的平衡或组合损伤过多。在这方面，与包括所述一个或多个氨基酸残基片段但没有所述一个或最多两个置换的氨基酸序列相比，所获得的本发明的氨基酸序列应当至少以相同、大约相同或更高的亲和性结合IL-6R，所述亲和性通过表面等离子共振测量。
在所述一个或多个氨基酸残基片段中的氨基酸置换可以是保守氨基酸置换。“保守”氨基酸置换通常是其中氨基酸残基被另一个具有类似化学结构的氨基酸置换并且对获得的氨基酸序列的功能、活性或其它生物学性质几乎没有或者基本上没有影响的氨基酸置换。这种保守氨基酸置换是本领域内公知的，例如，从WO04/037999，GB3357768-A，WO98/49185，WO00/46383和WO01/09300中可知；并且可以基于WO04/037999以及WO98/49185和其中所引用的其它参考文献的相关教导而选择这种置换的(优选)类型和/或组合。
所述保守置换优选地是这样的置换，即，其中下列组(a)-(e)内的一个氨基酸被同组内的另一氨基酸残基置换：(a)小的脂肪族、非极性或弱极性的残基：Ala，Ser，Thr，Pro和Gly；(b)极性、带负电荷的残基及其(不带电荷的)酰胺：Asp，Asn，Glu和Gln；(c)极性、带正电荷的残基：His，Arg和Lys；(d)大的脂肪族、非极性残基：Met，Leu，Ile，Val和Cys；以及(e)芳族残基：Phe，Tyr和Trp。
特别优选的保守置换如下：Ala置换成Gly或置换成Ser；Arg置换成Lys；Asn置换成Gln或置换成His；Asp置换成Glu；Cys置换成Ser；Gln置换成Asn；Glu置换成Asp；Gly置换成Ala或置换成Pro；His置换成Asn或置换成Gln；Ile置换成Leu或置换成Val；Leu置换成Ile或置换成Val；Lys置换成Arg，置换成Gln或置换成Glu；Met置换成Leu，置换成Tyr或置换成Ile；Phe置换成Met，置换成Leu或置换成Tyr；Ser置换成Thr；Thr置换成Ser；Trp置换成Tyr；Tyr置换成Trp；和/或Phe置换成Val，置换成Ile或置换成Leu。
在本发明的另一方面，在一个或多个氨基酸残基片段中的氨基酸置换可以为氨基酸序列提供增加的对IL-6R的亲和性。这可以通过诸如随机诱变或定点诱变和/或其它亲和性成熟技术的本身已知的技术来完成，诸如例如在WO09/004065，WO2009/004066，WO05/003345，WO06/023144，EP527809，EP397834中描述。
非限制性地，用于置换CDRs中的氨基酸残基的规则(部分或完全遵循的规则)可以如下所示(即用具有类似侧链化学性质的氨基酸置换)：
-K被以下置换：R；
-R被以下置换：K；
-A被以下置换：S或T；
-S被以下置换：A或T；
-T被以下置换：A或S；
-I被以下置换：L或V；
-L被以下置换：I或V；
-V被以下置换：I或L；
-F被以下置换：Y；
-Y被以下置换：F；
-N被以下置换：D；
-D被以下置换：N；
-Q被以下置换：E；
-E被以下置换：Q；
-G被以下置换：A；
-M被以下置换：L；
-H，C，W和P保持不变。
此外，也是非限制性的，用于置换CDRs中的氨基酸残基的规则(部分或完全遵循的规则)可以备选地如下所示用于置换位置27至35和位置50至58(使用Kabat编号系统)，
其中对于位置27至35：
-位置27的原始氨基酸残基(使用Kabat编号)被以下置换：F；G；R；S；F，G，R，S中的2个；F，G，R，S中的3个；或它们全部，优选它们全部；
-位置28的原始氨基酸残基(使用Kabat编号)被以下置换：A；I；S；T；A，I，S，T中的2个；A，I，S，T中的3个；或它们全部，优选它们全部；
-位置29的原始氨基酸残基(使用Kabat编号)被以下置换：F；G；L；S；F，G，L，S中的2个；F，G，L，S中的3个；或它们全部，优选它们全部；
-位置30的原始氨基酸残基(使用Kabat编号)被以下置换：D；G；S；T；D，G，S，T中的2个；D，G，S，T中的3个；或它们全部，优选它们全部；
-位置31的原始氨基酸残基(使用Kabat编号)被以下置换：D；I；N；S；T；D，I，N，S，T中的2个；D，I，N，S，T中的3个；或它们全部，优选它们全部；
-位置32的原始氨基酸残基(使用Kabat编号)被以下置换：D；N；Y；D，n，Y中的2个；或它们全部，优选它们全部；
-位置33的原始氨基酸残基(使用Kabat编号)被以下置换：A；G；T；V；A，G，T，V中的2个；A，G，T，V中的3个；或它们全部，优选它们全部；
-位置34的原始氨基酸残基(使用Kabat编号)被以下置换：I；M；或它们全部，优选它们全部；
-位置35的原始氨基酸残基(使用Kabat编号)被以下置换：A；G；S；A，G，S中的2个；或它们全部，优选它们全部；
和位置50至58(如果原始氨基酸序列在位置52a(使用Kabat编号)具有氨基酸序列)，
-位置50的原始氨基酸残基(使用Kabat编号)被以下置换：A；C；G；S；T；A，C，G，S，T中的2个；A，C，G，S，T中的3个；A，C，G，S，T中的4个；或它们全部，优选它们全部；
-位置51的原始氨基酸残基(使用Kabat编号)被以下置换：I；
-位置52的原始氨基酸残基(使用Kabat编号)被以下置换：N；R；S；T；N，R，S，T中的2个；N，R，S，T中的3个；或它们全部，优选它们全部；
-位置52a(使用Kabat编号)的原始氨基酸残基被以下置换：R；S；T；W；R，S，T，W中的2个；R，S，T，W中的3个；或它们全部，优选它们全部；
-位置53(使用Kabat编号)的原始氨基酸残基被以下置换：D；G；N；S；T；D，G，N，S，T中的2个；D，G，N，S，T中的3个；D，G，N，S，T中的4个；或它们全部，优选它们全部；
-位置54(使用Kabat编号)的原始氨基酸残基被以下置换：D；G；或它们全部，优选它们全部；
-位置55(使用Kabat编号)的原始氨基酸残基被以下置换：D；G；S；D，G，S中的2个；或它们全部，优选它们全部；
-位置56(使用Kabat编号)的原始氨基酸残基被以下置换：I；N；R；S；T；I，N，R，S，T中的2个；I，N，R，S，T中的3个；I，N，R，S，T中的4个；或它们全部，优选它们全部；
-位置57(使用Kabat编号)的原始氨基酸残基被以下置换：T；
-位置58(使用Kabat编号)的原始氨基酸残基被以下置换：D；H；N；S；Y；D，H，N，S，Y中的2个；D，H，N，S，Y中的3个；D，H，N，S，Y中的4个；或它们全部，优选它们全部；
并且其中对于位置50至58(如果原始氨基酸序列在位置52a(使用Kabat编号)不具有氨基酸序列)，
-位置50(使用Kabat编号)的原始氨基酸残基被以下置换：A；G；R；S；T；A，G，R，S，T中的2个；A，G，R，S，T中的3个；A，G，R，S，T中的4个；或它们全部，优选它们全部；
-位置51(使用Kabat编号)的原始氨基酸残基被以下置换：I；
-位置52(使用Kabat编号)的原始氨基酸残基被以下置换：N；S；T；N，S，T中的2个；或它们全部，优选它们全部；
-位置53(使用Kabat编号)的原始氨基酸残基被以下置换：N；R；S；T；Y；N，R，S，T，Y中的2个；N，R，S，T，Y中的3个；N，R，S，T，Y中的4个；或它们全部，优选它们全部；
-位置54(使用Kabat编号)的原始氨基酸残基被以下置换：D；G；R；S；D，G，R，S中的2个；D，G，R，S中的3个；或它们全部，优选它们全部；
-位置55(使用Kabat编号)的原始氨基酸残基被以下置换：G；
-位置56(使用Kabat编号)的原始氨基酸残基被以下置换：G；N；R；S；T；D，N，R，S，T中的2个；D，N，R，S，T中的3个；D，N，R，S，T中的4个；或它们全部，优选它们全部；
-位置57(使用Kabat编号)的原始氨基酸残基被以下置换：T；
-位置58(使用Kabat编号)的原始氨基酸残基被以下置换：D；N；T；Y；D，N，T，Y中的2个；D，N，T，Y中的3个；或它们全部，优选它们全部。
之后可以将这样确定的一个或多个潜在有效的置换(或其组合)引入所述CDR序列(以任何本身已知的方式，如本文进一步描述)，并且可以检测获得的氨基酸序列对IL-6R的亲和性，和/或其它所需性质，诸如(部分或优选完全)阻断IL-6/IL-6R相互作用和/或抑制经由IL-6，IL-6R和/或IL-6/IL-6R复合物的信号传导的能力。如此，通过有限程度的试错，基于本文的公开内容，本领域技术人员可以确定CDRs中其它适当的置换(或其适当组合)。
本发明的氨基酸序列可以是包括至少一个氨基酸残基片段的任何氨基酸序列，其中所述氨基酸残基片段具有与本发明所述的至少一个CDR序列的序列相对应的氨基酸序列。这样的氨基酸序列可以包括或可以不包括免疫球蛋白折叠。例如，并且不限于，这样的氨基酸序列可以是适当的免疫球蛋白序列片段，所述片段包括至少一个所述CDR序列(如上定义)，但是其不够大，不足以形成(完整)的免疫球蛋白折叠(例如，同样参考WO03/050531中所述的“派遣片段”)。备选地，这样的氨基酸序列可以是适当的“蛋白支架”，所述蛋白支架包括与如本文关于本发明的氨基酸序列定义的CDR序列相对应(即，作为其抗原结合位点的一部分)的至少一个氨基酸残基片段。用于呈递氨基酸序列的适当的支架对于熟练的技术人员将是清楚的，并且例如，包括，但不限于，基于或来源于免疫球蛋白的结合支架(即，除了本发明已经描述的免疫球蛋白序列之外)，来源于蛋白质A结构域的蛋白支架(诸如AffibodiesTM)，淀粉酶抑肽(tendamistat)，纤连蛋白，脂笼蛋白，CTLA-4，T-细胞受体，设计的锚蛋白重复序列，avimers和PDZ结构域(Binz等，2005，自然生物技术(Nat.Biotech.)，23：1257)，和基于DNA或RNA的结合结构部分，包括但不限于DNA或RNA适体(Ulrich等，2006，组合化学高通量筛选(Comb.Chem.HighThroughputScreen)9(8)：619-32)。
同样地，包括一个或多个如本文关于本发明的氨基酸序列定义的CDR序列(即，“本发明的CDR”)的任何本发明的氨基酸序列优选是这样的，以致其可以特异性结合(如本文定义)IL-6R，并且更特别地是这样的，以致其可以以如本文定义的亲和性(适当测量和/或表示为KD-值(实际的或表观的)，KA-值(实际的或表观的)，kon-速率和/或koff-速率，或备选地作为IC50值，如本发明进一步所述)与IL-6R结合。包括一个或多个如本文关于本发明的氨基酸序列定义的CDR序列的任何本发明的氨基酸序列优选是这样的，以致其具有如本文定义的基于细胞的效力和血浆效力。
此外，本领域技术人员还清楚，可以将关于本发明的氨基酸序列定义的一个或多个CDR(即“本发明的CDR”)“嫁接”到其它“支架”上，包括但不限于人支架或非免疫球蛋白支架。关于该CDR嫁接的适当支架和技术对于本领域技术人员是清楚的，并且在本领域公知，参见例如US7,180,370，WO01/27160，EP0605522，EP0460167，US7,054,297，Nicaise等(2004，蛋白质科学(ProteinScience)，13：1882-1891)，Ewert等(2004，方法(Methods)，34(2)：184-199)，Kettleborough等(1991，蛋白质工程(ProteinEng.)4(7)：773-783)，O’Brien和Jones(2003，分子生物学方法(MethodsMol.Biol.)207：81-100)，Skerra(2000，分子识别杂志(J.Mol.Recognit.)13：167-187)，和Saerens等(2005，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)352(3)：597-607)，和本文引用的其它参考文献。例如，本身已知的用于将小鼠或大鼠CDR嫁接到人构架和支架上的技术可以以类似的方式使用，以提供包括一个或多个关于本发明的氨基酸序列本文定义的CDR序列和一个或多个人构架区域或序列的嵌合蛋白。
因此，在一个具体方面，本发明还包括嵌合氨基酸序列，其包括至少一个选自以下组成的组的CDR序列：本发明的CDR1序列，本发明的CDR2序列和本发明的CDR3序列(在本文中关于本发明的氨基酸序列定义)。优选地，这样的嵌合氨基酸序列包括至少一个选自以下组成的组的CDR序列：本发明的CDR1序列(在本文中关于本发明的氨基酸序列定义)，和还有至少一个选自以下组成的组的CDR序列：本发明的CDR2序列(在本文中关于本发明的氨基酸序列定义)；或至少一个选自由本发明的CDR1序列(在本文中关于本发明的氨基酸序列定义)组成的组的CDR序列和至少一个选自由本发明的CDR3序列(在本文中关于本发明的氨基酸序列定义)组成的组的CDR序列；或这样的嵌合多肽可以包括至少一个选自由本发明的CDR2序列(在本文中关于本发明的氨基酸序列定义)组成的组的CDR序列和还有至少一个选自由本发明的CDR3序列(在本文中关于本发明的氨基酸序列定义)组成的组的CDR序列。例如，该嵌合多肽可以包括一个选自由本发明的CDR3序列(在本文中关于本发明的氨基酸序列定义)组成的组的CDR序列，一个选自由本发明的CDR1序列(在本文中关于本发明的氨基酸序列定义)组成的组的CDR序列和一个选自由本发明的CDR2序列(在本文中关于本发明的氨基酸序列定义)组成的组的CDR序列。在本文中关于本发明的氨基酸序列作为优选提及的CDR’s(参见表A-1)的组合也通常是关于这些嵌合多肽优选的。
在所述嵌合多肽中，CDR’s可以连接至另外的氨基酸序列和/或可以通过氨基酸序列彼此连接，其中所述氨基酸序列优选是构架序列或用作构架序列的氨基酸序列，或一起形成用于呈递CDR’s的支架。
按照一个非限制性实施方案，所述嵌合多肽包括通过至少一个构架序列连接的至少两个CDR序列(在本文中关于本发明的氨基酸序列定义)，其中优选地所述两个CDR序列中的至少一个是CDR3序列，另一CDR序列为CDR1或CDR2序列。按照一个优选的但非限制性的实施方案，所述嵌合多肽包括与至少两个构架序列连接的至少三个CDR序列(在本文中关于本发明的氨基酸序列定义)，其中优选地所述三个CDR序列中的至少一个是CDR3序列，其余两个CDR序列是CDR1或CDR2序列，并且优选地是一个CDR1序列和一个CDR2序列。按照一个特别优选的但非限制性的实施方案，所述嵌合氨基酸序列具有结构FR1’-CDR1-FR2’-CDR2-FR3’-CDR3-FR4’，其中CDR1，CDR2和CDR3如本文关于本发明的氨基酸序列所定义，而FR1’，FR2’，FR3’和FR4’是构架序列。特别地，FR1’，FR2’，FR3’和FR4’可以分别是人抗体(诸如VH3序列)的构架1，构架2，构架3和构架4序列，和/或所述构架序列的部分或片段。还可以使用具有结构FR1’-CDR1-FR2’-CDR2-FR3’-CDR3-FR4；的嵌合多肽的部分或片段。优选地，这样的部分或片段是这样的，以致它们满足关于本发明的氨基酸序列列出的标准。
在本发明的这种氨基酸序列中，构架序列可以是任何适当的构架序列，适当构架序列的实例对于本领域技术人员是清楚的，例如基于标准手册和本文提及的进一步的公开内容和现有技术。
构架序列优选是免疫球蛋白构架序列或已经从免疫球蛋白构架序列衍生(例如通过序列优化，诸如人源化或骆驼源化)的构架序列(的适当组合)。例如，构架序列可以是衍生于轻链可变结构域(例如，VL-序列)的构架序列和/或来自重链可变结构域(例如VH-序列)。在一个特别优选的方面，构架序列是已经从VHH-序列(其中所述构架序列可以任选地已经被部分或完全人源化)衍生的构架序列或者是已经骆驼源化的(如本文定义)常规VH序列。
构架序列可以优选是这样的，以致本发明的氨基酸序列是结构域抗体(或适合用作结构域抗体的氨基酸序列)；是单结构域抗体(或适合用作单结构域抗体的氨基酸序列)；是″dAb″(或适合用作dAb的氨基酸序列)；是纳米抗体(包括但不限于VHH序列)。再次，适当的构架序列对于本领域技术人员是清楚的，例如，基于标准手册和本文提及的更多的公开内容现有技术。
具体地，本发明氨基酸序列中存在的构架序列可以含有一个或多个标志残基(如在WO08/020079(表A-3至A-8)中定义)，以使本发明的氨基酸序列是纳米抗体。这些构架序列(的适当组合)的一些优选但非限制性的实例将从本文进一步的公开内容(参见例如表A-1)中变得清楚。通常，纳米抗体(特别是VHH序列和(部分)人源化VHH序列)可以特别地通过在一个或多个构架序列中存在一个或多个“标志残基”来表征(如例如在WO08/020079中第61页第24行至第98页第3行进一步描述)。
在一个优选方面，本发明的氨基酸序列包括免疫球蛋白折叠，或者能够在适当条件下形成免疫球蛋白折叠。优选本发明的氨基酸序列是免疫球蛋白序列；还更优选本发明的氨基酸序列具有以下结构：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
因此，本发明还涉及基本上由4个构架区(分别地FR1至FR4)和3互补性决定区(分别地CDR1至CDR3)组成的氨基酸序列，其中：
-CDR1选自以下组成的组：
f)SEQIDNO’s：80-82；或
g)与SEQIDNO’s：80-82之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量；
和/或
-CDR2选自以下组成的组：
h)SEQIDNO’s：84-91；或
i)与SEQIDNO’s：84-91之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量；
和/或
-CDR3选自以下组成的组：
j)SEQIDNO’s：93-95；或
k)与SEQIDNO’s：93-95之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量。
在该实施方案中，氨基酸序列包括至少一个CDR序列，所述CDR序列选自由以下组成的组：本发明的CDR1序列(在本文中关于本发明的氨基酸序列定义)，本发明的CDR2序列(在本文中关于本发明的氨基酸序列定义)，或本发明的CDR3序列(在本文中关于本发明的氨基酸序列定义)。优选地，氨基酸序列包括至少两个选自以下组成的组的CDR序列：本发明的CDR1序列(在本文中关于本发明的氨基酸序列定义)，本发明的CDR2序列(在本文中关于本发明的氨基酸序列定义)，或本发明的CDR3序列(在本文中关于本发明的氨基酸序列定义)，诸如至少一个选自由本发明的CDR1序列(在本文中关于本发明的氨基酸序列定义)组成的组的CDR序列和至少一个选自由本发明的CDR2序列(在本文中关于本发明的氨基酸序列定义)组成的组的CDR序列；或至少一个选自由本发明的CDR1序列(在本文中关于本发明的氨基酸序列定义)组成的组的CDR序列和至少一个选自由本发明的CDR3序列(在本文中关于本发明的氨基酸序列定义)组成的组的CDR序列；或至少一个选自由本发明的CDR2序列(在本文中关于本发明的氨基酸序列定义)组成的组的CDR序列和至少一个选自由本发明的CDR3序列(在本文中关于本发明的氨基酸序列定义)组成的组的CDR序列；或该氨基酸序列可以包括选自以下组成的组的三个CDR序列：本发明的CDR1序列(在本文中关于本发明的氨基酸序列定义)，本发明的CDR2序列(在本文中关于本发明的氨基酸序列定义)，和本发明的CDR3序列(在本文中关于本发明的氨基酸序列定义)。本发明还涉及基本上由4个构架区(分别地FRI至FR4)和3互补性决定区(分别地CDR1至CDR3)组成的氨基酸序列，其中
-CDR1选自以下组成的组：
a)SEQIDNO’s：80-82；或
b)与SEQIDNO’s：80-82之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量；
和
-CDR2选自以下组成的组：
c)SEQIDNO’s：84-91；或
d)与SEQIDNO’s：84-91之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量；
和
-CDR3选自以下组成的组：
e)SEQIDNO’s：93-95；或
f)与SEQIDNO’s：93-95之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量。
关于本发明的氨基酸序列的CDR序列的优选组合显示在表A-1中。
本发明的氨基酸序列可以基本上由衍生于常规四链抗体的重链可变结构域序列组成，或者可以基本上由衍生于重链抗体的重链可变结构域序列组成。本发明的氨基酸序列可以基本上由结构域抗体(或适合用作结构域抗体的氨基酸序列)，单结构域抗体(或适合用作单结构域抗体的氨基酸序列)，″dAb″(或适合用作dAb的氨基酸序列)或纳米抗体组成。
关于(单)结构域抗体的一般描述，还参考以上引用的现有技术，以及EP0368684。关于术语“dAb’s”，参考例如Ward等(1989，自然(Nature)341：544-6)，Holt等(2003，生物技术趋势(TrendsBiotechnol.)21：484-490)；以及例如WO06/030220，WO06/003388和DomantisLtd.其它公开的专利申请。还应当注意，尽管因为它们不是哺乳动物来源而在本发明上下文中较不优选，单结构域抗体或单可变结构域可以衍生于某些鲨鱼种类(例如，所谓的“IgNAR结构域”，参见例如WO05/18629)。
特别地，本发明的氨基酸序列基本上由(如本文定义)或其适当片段组成或者可以是(如本文定义)或其适当片段。[注意：和 为埃博灵克斯股份有限公司(AblynxN.V.)的注册商标。]所述针对IL-6R的纳米抗体在本发明中也称为“本发明的纳米抗体”。
关于纳米抗体的一般描述，参见以下的进一步描述，以及本文中引用的现有技术，诸如例如在WO08/020079中(第16页)所述。
在特定方面，本发明的氨基酸序列或纳米抗体包括至少SEQIDNO：80；或与SEQIDNO：80具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量。
在另一个特定方面，本发明的氨基酸序列或纳米抗体包括：至少选自SEQIDNO’s：84，89或91的氨基酸残基片段；或与SEQIDNO’s：84，89或91之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量。
在还有的另一个具体方面，本发明的氨基酸序列或纳米抗体包括至少SEQIDNO：84；或与SEQIDNO：84具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量。
在还有的另一个具体方面，本发明的氨基酸序列或纳米抗体包括：至少选自SEQIDNO’s：93-94的氨基酸残基片段；或与SEQIDNO’s：93-94之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是包括与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量。
在还有的另一个具体方面，本发明的氨基酸序列或纳米抗体包括至少SEQIDNO：93；或与SEQIDNO：93具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量。
在还有的另一个具体方面，本发明的氨基酸序列或纳米抗体包括至少SEQIDNO：80；或与SEQIDNO：80具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段；和至少选自SEQIDNO’s：84，89或91的氨基酸残基片段；或与SEQIDNO’s：84，89或91之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量
在还有的另一个具体方面，本发明的氨基酸序列或纳米抗体包括至少SEQIDNO：80；或与SEQIDNO：80具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段；和至少SEQIDNO：84；或与SEQIDNO：84具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量。
在还有的另一个具体方面，本发明的氨基酸序列或纳米抗体包括至少SEQIDNO：80；或与SEQIDNO：80具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段；和至少选自SEQIDNO’s：93-94的氨基酸残基片段；或与SEQIDNO’s：93-94之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量。
在还有的另一个具体方面，本发明的氨基酸序列或纳米抗体包括至少SEQIDNO：80；或与SEQIDNO：80具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段；和至少SEQIDNO：93；或与SEQIDNO：93具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量。
在还有的另一个具体方面，本发明的氨基酸序列或纳米抗体包括至少选自SEQIDNO’s：84，89或91的氨基酸残基片段；或与SEQIDNO’s：84，89或91之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段；和至少选自SEQIDNO’s：93-94的氨基酸残基片段；或与SEQIDNO’s：93-94之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量。
在还有的另一个具体方面，本发明的氨基酸序列或纳米抗体包括至少选自SEQIDNO’s：84，89或91的氨基酸残基片段；或与SEQIDNO’s：84，89或91之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段；和至少SEQIDNO：93；或与SEQIDNO：93具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量。
在还有的另一个具体方面，本发明的氨基酸序列或纳米抗体包括至少SEQIDNO：84；或与SEQIDNO：84具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段；和至少选自SEQIDNO’s：93-94的氨基酸残基片段；或与SEQIDNO’s：93-94之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量。
在还有的另一个具体方面，本发明的氨基酸序列或纳米抗体包括至少SEQIDNO：84；或与SEQIDNO：84具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段；和至少SEQIDNO：93；或与SEQIDNO：93具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量。
在还有的另一个具体方面，本发明的氨基酸序列或纳米抗体包括至少SEQIDNO：80和SEQIDNO：84。
在还有的另一个具体方面，本发明的氨基酸序列或纳米抗体包括至少SEQIDNO：80和SEQIDNO：93。
在还有的另一个具体方面，本发明的氨基酸序列或纳米抗体包括至少SEQIDNO：84和SEQIDNO：93。
在还有的另一个具体方面，本发明的氨基酸序列或纳米抗体包括至少SEQIDNO：80；或与SEQIDNO：80具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段；和至少选自SEQIDNO’s：84，89或91的氨基酸残基片段；或与SEQIDNO’s：84，89或91之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段；和至少选自SEQIDNO’s：93-94的氨基酸残基片段；或与SEQIDNO’s：93-94之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量。
在还有的另一个具体方面，本发明的氨基酸序列或纳米抗体包括至少SEQIDNO：80；或与SEQIDNO：80具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段；和至少选自SEQIDNO’s：84，89或91的氨基酸残基片段；或与SEQIDNO’s：84，89或91之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段；和SEQIDNO：93；或与SEQIDNO：93具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量。
在还有的另一个具体方面，本发明的氨基酸序列或纳米抗体包括至少SEQIDNO：80；或与SEQIDNO：80具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段；和至少SEQIDNO：84；或与SEQIDNO：84具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段；和至少选自SEQIDNO’s：93-94的氨基酸残基片段；或与SEQIDNO’s：93-94之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量。
在还有的另一个具体方面，本发明的氨基酸序列或纳米抗体包括至少SEQIDNO：80；或与SEQIDNO：80具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段；和至少SEQIDNO：84；或与SEQIDNO：84具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段；和至少SEQIDNO：93；或与SEQIDNO：93具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量。
在还有的另一个具体方面，本发明的氨基酸序列或纳米抗体包括至少SEQIDNO：80，SEQIDNO：84和SEQIDNO：93。
在本文中关于本发明的氨基酸序列定义的CDR1，CDR2，和CDR3序列的优选组合也显示在表A-1中。
在一个优选方面，本发明的氨基酸序列选自以下组成的组：
a)SEQIDNO’s：60-69；
b)这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列在其CDR中的一个、两个或全部之中与SEQIDNO’s：60-69之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异，条件是与所述SEQIDNO’s：60-69之一的结合相比，所述在其CDR中的一个、两个或全部之中具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量；和
c)与SEQIDNO’s：60-69之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的序列，条件是与所述SEQIDNO’s：60-69之一的结合相比，与SEQIDNO’s：60-69之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量。
在另一个优选方面，本发明的氨基酸序列选自以下组成的组：
a)SEQIDNO’s：65-69；
b)这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列在其CDR中的一个、两个或全部之中与SEQIDNO’s：65-69之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异，条件是与所述SEQIDNO’s：65-69之一的结合相比，所述在其CDR中的一个、两个或全部之中具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量；和
c)与SEQIDNO’s：65-69之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的序列，条件是与所述SEQIDNO’s：65-69之一的结合相比，与SEQIDNO’s：65-69之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量。
在还有的另一个优选方面，本发明的氨基酸序列选自以下组成的组：
a)SEQIDNO：66；
b)这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列在其CDR中的一个、两个或全部之中与SEQIDNO：66具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异，条件是与所述SEQIDNO：66的结合相比，所述在其CDR中的一个、两个或全部之中具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量；和
c)与SEQIDNO：66具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的序列，条件是与所述SEQIDNO：66的结合相比，所述具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量。
当比较两个氨基酸残基片段(或两个CDR序列)时，术语“其CDR中的一个、两个或全部中的氨基酸差异”是指与a)中指定的本发明的氨基酸序列中包括的氨基酸残基片段(或CDR序列)相比，在b)中指定的本发明的氨基酸序列中包括的氨基酸残基片段(或CDR序列)的一个位置上插入、缺失或置换单个氨基酸残基；应当理解，两个氨基酸残基片段(或CDR序列)可以含有一个或最多两个这样的氨基酸差异。
“其CDR中的一个、两个或全部中的氨基酸差异”是指本发明的氨基酸序列与a)的氨基酸序列之一(即，SEQIDNO’s：60-69之一)中的CDR1，CDR2和/或CDR3相比，可以在其CDR1中具有不超过2个，优选不超过1个氨基酸差异，和/或在其CDR2中具有不超过2个，优选不超过1个氨基酸差异，和/或在其CDR3中具有不超过2个，优选不超过1个氨基酸差异；诸如与a)的氨基酸序列之一(即，SEQIDNO’s：60-69之一)中的CDR1相比，在其CDR1中具有不超过2个，优选不超过1个氨基酸差异；或与a)的氨基酸序列之一(即，SEQIDNO’s：60-69之一)中的CDR2相比，在其CDR2中具有不超过2个，优选不超过1个氨基酸差异；或与a)的氨基酸序列之一(即，SEQIDNO’s：60-69之一)中的CDR3相比，在其CDR3中具有不超过2个，优选不超过1个氨基酸差异；或与a)的氨基酸序列之一(即，SEQIDNO’s：60-69之一)中的CDR1相比，在其CDR1中具有不超过2个，优选不超过1个氨基酸差异，和与a)的氨基酸序列之一(即，SEQIDNO’s：60-69之一)中的CDR2相比，在其CDR2中具有不超过2个，优选不超过1个氨基酸差异；或与a)的氨基酸序列之一(即，SEQIDNO’s：60-69之一)中的CDR1相比，在其CDR1中具有不超过2个，优选不超过1个氨基酸差异，和与a)的氨基酸序列之一(即，SEQIDNO’s：60-69之一)中的CDR3相比，在其CDR3中具有不超过2个，优选不超过1个氨基酸差异；或与a)的氨基酸序列之一(即，SEQIDNO’s：60-69之一)中的CDR2相比，在其CDR2中具有不超过2个，优选不超过1个氨基酸差异，和与a)的氨基酸序列之一(即，SEQIDNO’s：60-69之一)中的CDR3相比，在其CDR3中具有不超过2个，优选不超过1个氨基酸差异；或与a)的氨基酸序列之一(即，SEQIDNO’s：60-69之一)中的CDR1相比，在其CDR1中具有不超过2个，优选不超过1个氨基酸差异，与a)的氨基酸序列之一(即，SEQIDNO’s：60-69之一)中的CDR2相比，在其CDR2中具有不超过2个，优选不超过1个氨基酸差异，和与a)的氨基酸序列之一(即，SEQIDNO’s：60-69之一)中的CDR3相比，在其CDR3中具有不超过2个，优选不超过1个氨基酸差异。
“其CDR中的一个、两个或全部中的氨基酸差异”可以是在一个或多个CDR中的任何一个或最多两个置换、缺失或插入，或其任何组合，其改善本发明的氨基酸序列的性质，或至少不将本发明的氨基酸序列的所需性质或所需性质的平衡或组合损伤过多。在这方面，与包括所述一个或多个氨基酸残基片段但没有所述一个或最多两个置换、缺失或插入的氨基酸序列相比，所获得的本发明的氨基酸序列应当至少以相同、大约相同或更高的亲和性结合IL-6R，所述亲和性通过表面等离子共振测量。获得的氨基酸序列优选是这样的，以致它们可以以如本文定义的亲和性(适当测量和/或表示为KD-值(实际的或表观的)，KA-值(实际的或表观的)，kon-速率和/或koff-速率，或备选地作为IC50值，如本发明进一步所述)结合IL-6受体上的特定表位。获得的氨基酸序列还优选具有如本文定义的基于细胞的效力和血浆效力。
在本发明的一方面，“其CDR中的一个、两个或全部中的氨基酸差异”是氨基酸置换。氨基酸置换可以是在一个或多个CDR中的任何一个或最多两个置换，其改善本发明的氨基酸序列的性质，或至少不将本发明的氨基酸序列的所需性质或所需性质的平衡或组合损伤过多。在这方面，与包括所述一个或多个氨基酸残基片段但没有所述一个或最多两个置换的氨基酸序列相比，所获得的本发明的氨基酸序列应当至少以相同、大约相同或更高的亲和性结合IL-6R，所述亲和性通过表面等离子共振测量。获得的氨基酸序列优选是这样的，以致它们可以以如本文定义的亲和性(适当测量和/或表示为KD-值(实际的或表观的)，KA-值(实际的或表观的)，kon-速率和/或koff-速率，或备选地作为IC50值，如本发明进一步所述)结合IL-6受体上的特定表位。获得的氨基酸序列还优选具有如本文定义的基于细胞的效力和血浆效力。
如以上所述，CDRs中的氨基酸取代可以是任何可能的置换，诸如“保守置换”(如本文定义)，其可以由某些规则推动(如本文定义)，和/或它可以将改善的性质引入所获得的氨基酸序列。
本发明还涉及与SEQIDNO’s：60-69(全序列)之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列。
当比较两个氨基酸序列时，术语“氨基酸差异”是指与第二个氨基酸序列相比较，在第一个氨基酸序列的一个位置上插入、缺失或置换单个氨基酸残基；应当理解，两个氨基酸序列可以含有一个或最多两个这样的氨基酸差异。
“氨基酸差异”可以是氨基酸序列中，即在一个或多个构架区中或在一个或多个CDRs中，或它们的任何组合中的任何一个或最多任何两个置换、缺失或插入，其改善本发明的氨基酸序列的性质，或至少不将本发明的氨基酸序列的所需性质或所需性质的平衡或组合损伤过多。在这方面，与包括所述一个或多个氨基酸残基片段但没有所述一个或最多两个置换、缺失或插入的氨基酸序列相比，所获得的本发明的氨基酸序列应当至少以相同、大约相同或更高的亲和性结合IL-6R，所述亲和性通过表面等离子共振测量。获得的氨基酸序列优选是这样的，以致于它们可以以如本文定义的亲和性(适当测量和/或表示为KD-值(实际的或表观的)，KA-值(实际的或表观的)，kon-速率和/或koff-速率，或备选地作为IC50值，如本发明进一步所述)结合IL-6受体上的特定表位。获得的氨基酸序列还优选具有如本文定义的基于细胞的效力和血浆效力。本领域技术人员通常能够确定和选择适当的置换、缺失或插入，或它们的任何组合，并且确定它们对如此获得的氨基酸序列的性质的影响。
在本发明的一个方面，“氨基酸差异”是氨基酸置换。氨基酸置换可以是在一个或多个构架区中或一个或多个CDRs中或它们的任何组合中的任何一个或最多两个置换，其改善本发明的氨基酸序列的性质，或至少不将本发明的氨基酸序列的所需性质或所需性质的平衡或组合损伤过多。在这方面，与包括所述一个或多个氨基酸残基片段但没有所述一个或最多两个置换的氨基酸序列相比，所获得的本发明的氨基酸序列应当与以下氨基酸序列相比至少以相同、约相同或更高的亲和性结合IL-6R，所述亲和性通过表面等离子共振测量。获得的氨基酸序列优选是这样的，以致它们可以以如本文定义的亲和性(适当测量和/或表示为KD-值(实际的或表观的)，KA-值(实际的或表观的)，kon-速率和/或koff-速率，或备选地作为IC50值，如本发明进一步所述)结合IL-6受体上的特定表位。获得的氨基酸序列还优选具有如本文定义的基于细胞的效力和血浆效力。本领域技术人员通常能够确定和选择适当的置换，并且确定它们对如此获得的氨基酸序列的性质的影响。
如上所述，所述置换、插入或缺失可以在一个或多个构架区中和/或在一个或多个CDR中。如上所讨论，在一个或多个CDR中的氨基酸置换可以是任何置换，诸如“保守置换”(如本文定义)，其可以由特定规则推动(如本文定义)，和/或它可以将改善的性质引入所获得的氨基酸序列。
当这些置换、插入或缺失是在一个或多个构架区中进行的时候，它们可以在一个或多个标志残基(如例如在WO08/020079中所述；表A-3至A-8)处和在构架残基中一个或多个其它位置处进行，尽管在标志残基处的置换、插入或缺失通常是较不优选的(除非这些是如本文所述的适当的人源化置换)。作为非限制性的实例，置换例如可以是保守置换(如本文所述)和/或氨基酸残基可以被天然存在于另一个VHH结构域中相同位置的另一个氨基酸残基替换(参见WO08/020079，表A-5至A-8)，尽管本发明通常不限于此。
在一个或多个构架区中的置换、插入或缺失可以是用于构架区的序列优化的置换，诸如例如人源化置换。基于本文公开的内容，一些优选但是非限制性的人源化置换(及其适当组合)对于本领域技术人员是清楚的。通过将在a)中定义的本发明的氨基酸序列之一的构架区序列和一个或多个紧密相关的人VH序列的相应构架序列进行比较，可以确定潜在有效的人源化置换，之后将如此确定的一个或多个潜在有效的人源化置换(或其组合)引入在a)中定义的本发明的所述氨基酸序列(以本身已知的任何方式，如本文进一步描述)，并且检测获得的人源化氨基酸序列与IL-6R的亲和性、稳定性、表达容易性和水平、和/或本文定义的其它理想性质。如此，通过有限程度的试错，基于本文的公开内容，本领域技术人员可以确定其它适当的人源化置换(或其适当组合)。
取决于用于表达本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽的宿主生物体，也可以以这种方式设计这些缺失和/或置换，所述方式使得去除用于翻译后修饰的一个或多个位点(诸如一个或多个糖基化位点)，这是属于本领域技术人员能力范围之内。备选地，可以设计置换或插入，以使引入一个或多个连接官能团的位点(如本文所述)，例如，允许位点特异性聚乙二醇化(如本文定义)。
从WO08/020079的表A-5-A-8中提供的关于VHH熵和VHH可变性的数据可以看出，在构架区中的一些氨基酸残基比其它的更保守。通常，尽管本发明在其最广泛意义上不限于此，优选在较不保守的位置进行任何置换、缺失或插入。此外，通常，氨基酸置换优于氨基酸缺失或插入。
获得的本发明的氨基酸序列或本发明的纳米抗体应当优选以亲和性(适当测量的和/或表示为KD-值(实际的或表观的)，KA-值(实际的或表观的)，kon-速率和/或koff-速率，或备选地表示为IC50值，如本发明进一步所述)结合IL-6受体，优选是这样的，以致它们：
-以1nM至1pM摩尔/升以下，优选500pM至1pM摩尔/升以下，更优选100pM至1pM摩尔/升以下，或还更优选约50pM至1pM以下的解离常数(KD)结合hIL-6R；
和/或是这样的，以致它们：
-以1nM至1pM摩尔/升以下，优选500pM至1pM摩尔/升以下，更优选100pM至1pM摩尔/升以下，或还更优选约50pM至1pM以下的解离常数(KD)结合食蟹猴IL-6R；
和/或是这样的，以致它们：
-以104M-1s-1至约107M-1s-1，优选105M-1s-1至107M-1s-1，更优选约106M-1s-1以上的kon-速率结合hIL-6R；
和/或是这样的，以致它们：
-以104M-1s-1至约107M-1s-1，优选105M-1s-1至107M-1s-1，更优选约106M-1s-1以上的kon-速率结合食蟹猴IL-6R；
和/或是这样的，以致它们：
-以10-3s-1(t1/2＝0.69s)至10-6s-1(假定具有多天的t1/2的几乎不可逆的复合物)，优选10-4s-1至10-6s-1，更优选10-5s-1至10-6s-1，诸如约10-5s-1以下的koff速率结合hIL-6R；
和/或是这样的，以致它们：
-以10-3s-1(t1/2＝0.69s)至10-6s-1(假定具有多天的t1/2的几乎不可逆的复合物)，优选10-4s-1至10-6s-1，更优选10-5s-1至10-6s-1，诸如约10-5s-1以下的koff速率结合食蟹猴IL-6R。
对于本发明的氨基酸序列与IL-6R结合的一些优选的IC50值将从本发明的进一步描述和实施例中变得清楚。
本发明的氨基酸序列和纳米抗体和包含其的组合物的效力和/或功效可以使用本身已知的任何适当的体外测定、基于细胞的测定、体内测定和/或动物模型或它们的任何组合来检测，这取决于涉及的具体的疾病或病症。适当的测定和动物模型对于本领域技术人员是清楚的，并且例如包括：使用IL-6-依赖性细胞(包括TF-1，XG1和7TD1)的增殖测定，胶原蛋白诱导的关节炎模型，在SCID小鼠内的滑液组织移植模型，各种人癌症的异种移植模型，所述人癌症包括淋巴瘤、骨髓瘤、前列腺癌和肾细胞癌，包括TNBS的IBD模型，灵长类动物模型(诸如例如在Shinkura等，1998，抗癌研究(AnticancerResearch)18：1217-1222中描述)，非人灵长类动物关节病模型(诸如例如在Vierboom等，2008，今日药物开发(DrugDiscov.Today)：DisModeldoi：10.1016/j.ddmod.2008.06.003中描述)以及在下述实验部分和在本发明引用的现有技术中所用的测定和动物模型(Peake等，2006，风湿病学(Rheumatology)45：1485-9；Wahid等，2000，免疫学临床实验(Clin.Exp.Immunol.)，122：133-142；Matsuno等，1998，关节炎和风湿病(Arthritisandrheumatism)41：2014-2021；WO08/020079)。
例如，在Kitamura等(1989，细胞生理学杂志(J.CellPhysiol.)140：323)描述的TF-1测定中，本发明的氨基酸序列或本发明的纳米抗体可以具有10nM和50pM之间，优选5nM和50pM之间，更优选1nM至50pM以下，诸如约750或500pM以下的IC50值(在100IU/mLIL-6时)。在该TF-1测定中，本发明的氨基酸序列或本发明的纳米抗体可以具有50nM至1nM，优选25nM至1nM，更优选10nM至1nM以下，诸如约8nM以下的IC50值(在5000IU/mLIL-6时)。在该TF-1测定中，本发明的氨基酸序列或本发明的纳米抗体可以具有与由SEQIDNO’s：1和2定义的参照IgG或由SEQIDNO’s：3和4定义的参照Fab(参见实施例1)获得的IC50值相比至少相同和优选更好，至少2倍，优选3倍，更优选4倍，还更优选5倍，7倍或大于7倍更好的IC50值。在该TF-1测定中，本发明的氨基酸序列或本发明的纳米抗体可以具有与托珠单抗(MRA)获得的IC50值相比至少相同和优选更好，至少2倍，优选3倍，更优选4倍，还更优选5倍，7倍或大于7倍更好的IC50值。
在IL-6的EC50值下的血浆效力测定中(例如，在存在27.29ng/mLIL-6下，如实施例45所述)，本发明的氨基酸序列或本发明的纳米抗体可以具有500pM至50pM，优选250pM至50pM，更优选200pM至50pM以下，诸如150pM以下的IC50值。在IL-6的EC95值下的血浆效力测定中(例如，在存在885ng/mLIL-6下，如实施例45所述)，本发明的氨基酸序列或本发明的纳米抗体可以具有1000pM至100pM，优选750pM至100pM，更优选500pM至100pM以下，诸如400pM以下的IC50值。在该血浆效力测定中，本发明的氨基酸序列或本发明的纳米抗体可以具有与由SEQIDNO’s：1和2定义的参照IgG或由SEQIDNO’s：3和4定义的参照Fab(参见实施例1)获得的IC50值相比至少相同和优选更好，至少2倍，优选3倍，更优选4倍，还更优选5倍，7倍或大于7倍更好的IC50值。在该血浆效力测定中，本发明的氨基酸序列或本发明的纳米抗体可以具有与托珠单抗(MRA)获得的IC50值相比至少相同和优选更好，至少2倍，优选3倍，更优选4倍，还更优选5倍，7倍或大于7倍更好的IC50值。
在限定与CHO细胞上的膜IL-6R结合的测定中，本发明的氨基酸序列或本发明的纳米抗体可以具有10nM至100pM，优选5nM至100pM，更优选2nM至10pM以下，诸如2nM以下的IC50值。
从本文的公开内容清楚的是，本发明还包括使用如本文定义的本发明的氨基酸序列或纳米抗体的部分或片段，或两个以上部分或片段的组合，并且特别是SEQIDNO’s：60-69的氨基酸序列的部分或片段。因此，根据本发明的一个实施方案，术语“本发明的氨基酸序列”或“本发明的纳米抗体”在其最广泛意义上还涵盖这些部分或片段。
通常，本发明的氨基酸序列或纳米抗体(包括其类似物)的这些部分或片段具有与本发明相应的全长氨基酸序列或纳米抗体的氨基酸序列相比在N末端的一个或多个氨基酸残基、在C末端的一个或多个氨基酸残基、一个或多个连续的内部氨基酸残基、或它们的任何组合已经被缺失和/或去除的氨基酸序列。
所述部分或片段优选是这样的，以致它们可以以如本文定义的亲和性(适当测量和/或表示为KD-值(实际的或表观的)，KA-值(实际的或表观的)，kon-速率和/或koff-速率，或备选地作为IC50值，如本发明进一步所述)结合IL-6受体上的特定表位。
具体地，氨基酸序列、纳米抗体、和部分或片段优选是这样的，以致它们：
-以1nM至1pM摩尔/升以下，优选500pM至1pM摩尔/升以下，更优选100pM至1pM摩尔/升以下，或还更优选约50pM至1pM以下的解离常数(KD)结合hIL-6R；
和/或是这样的，以致它们：
-以1nM至1pM摩尔/升以下，优选500pM至1pM摩尔/升以下，更优选100pM至1pM摩尔/升以下，或还更优选约50pM至1pM以下的解离常数(KD)结合食蟹猴IL-6R；
和/或是这样的，以致它们：
-以104M-1s-1至约107M-1s-1，优选105M-1s-1至107M-1s-1，更优选约106M-1s-1以上的kon-速率结合hIL-6R；
和/或是这样的，以致它们：
-以104M-1s-1至约107M-1s-1，优选105M-1s-1至107M-1s-1，更优选约106M-1s-1以上的kon-速率结合食蟹猴IL-6R；
和/或是这样的，以致它们：
-以10-3s-1(t1/2＝0.69s)至10-6s-1(假定具有多天的t1/2的几乎不可逆的复合物)，优选10-4s-1至10-6s-1，更优选10-5s-1至10-6s-1，诸如约10-5s-1以下的koff速率结合hIL-6R；
和/或是这样的，以致它们：
-以10-3s-1(t1/2＝0.69s)至10-6s-1(假定具有多天的t1/2的几乎不可逆的复合物)，优选10-4s-1至10-6s-1，更优选10-5s-1至10-6s-1，诸如约10-5s-1以下的koff速率结合食蟹猴IL-6R。
所述部分或片段针对IL-6受体的亲和性可以以本身已知的方式(例如使用本文中描述的测定)确定。
任何部分或片段优选是这样的，以使其包含相应的本发明的全长氨基酸序列或纳米抗体的至少10个连续氨基酸残基，优选至少20个连续氨基酸残基，更优选至少30个连续氨基酸残基，诸如至少40个连续氨基酸残基。
此外，任何部分或片段是这样的，以使它包含CDR1，CDR2和/或CDR3中的至少一个或其至少一部分(和特别是至少CDR3或至少其部分)。更优选地，任何部分或片段是这样的，以致其包含CDR’s中至少一个(并且优选至少CDR3或其部分)和至少一个其它CDR(即，CDR1或CDR2)或至少其部分，它们优选通过适当的构架序列或至少其部分连接。更优选地，任何部分或片段是这样的，以致它包含CDR’s中至少一个(并且优选至少CDR3或其部分)和其余两个CDR的至少一部分，它们同样优选通过适当构架序列或至少其部分连接。
根据另一个特别优选但非限制性的实施方案，该部分或片段包括相应的本发明全长纳米抗体的至少CDR3，诸如FR3，CDR3和FR4，即如例如国际申请WO03/050531(Lasters等)中所述。
如以上已经提及，可以将两个或更多个这些部分或片段(即，来自相同或不同的本发明的氨基酸序列或纳米抗体)组合，即以提供本发明氨基酸序列或纳米抗体的更多部分或片段(如本文定义)。还例如可以将本发明的氨基酸序列或纳米抗体的一个或多个部分或片段与人VH结构域的一个或多个部分或片段组合。
根据一个优选的实施方案，所述部分或片段与SEQIDNO’s：60-69的氨基酸序列或纳米抗体之一具有至少50％，优选至少60％，更优选至少70％，还更优选至少80％，诸如至少90％，95％或99％以上的序列同一性程度。
所述部分和片段和编码它们的核酸序列可以以本身已知的任何方式提供和任选组合。例如，这些部分或片段可以通过将终止密码子插入编码全长的本发明的氨基酸序列或纳米抗体的核酸，然后以本身已知的方式(例如，如本文所述)表达如此获得的核酸来获得。备选地，编码这些部分或片段的核酸可以如下获得：适当地限制性酶切编码全长的本发明的氨基酸序列或纳米抗体的核酸，或以本身已知的方式合成该核酸。使用本身已知的用于肽合成的技术也可以提供部分或片段。
本发明进一步涉及化合物或构建体，其包含一个或多个本发明的氨基酸序列或纳米抗体，或者基本上由一个或多个本发明的氨基酸序列或纳米抗体组成，和任选地进一步包括一个或多个其它基团、残基、结构部分或结合单元，其任选地通过一个或多个接头连接。在一个优选方面，所述一个或多个其它基团、残基、结构部分或结合单元是氨基酸。在另一个优选方面，所述一个或多个接头是一个或多个氨基酸序列。该化合物或构建体也称为“本发明的多肽”。
本发明的多肽可以包括本发明的氨基酸序列或纳米抗体，所述氨基酸序列或纳米抗体在其氨基末端、在其羧基末端、或者在其氨基末端和其羧基末端两端融合至少一个其它氨基酸序列，即，以提供包括所述本发明的氨基酸序列或纳米抗体和一个或多个其它氨基酸序列的融合蛋白。
所述一个或多个其它氨基酸序列可以是任何适宜的和/或理想的氨基酸序列。所述其它氨基酸序列可以或可以不变化、改变或另外影响所述本发明的氨基酸序列或纳米抗体的(生物学)特性，并且可以或可以不为本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽加入其它的官能性。优选地，所述其它氨基酸序列是这样的，以致它赋予本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽一种或多种理想的特性或官能性。
这样的氨基酸序列的实例是熟练的技术人员所清楚的，并且通常可以包括基于常规抗体及其片段(包括但不限于ScFv’s和单结构域抗体)的用于肽融合的所有氨基酸序列。例如，参考Holliger和Hudson，自然生物技术(NatureBiotechnology)，23，9，1126-1136(2005)的综述。
例如，与本发明的氨基酸序列或纳米抗体本身相比，所述氨基酸序列可以是这样的氨基酸序列，即，其增加本发明的多肽的半衰期、溶解性、或吸收，减少本发明的多肽的免疫原性或毒性，消除或减弱本发明的多肽的不理想的副作用，和/或赋予本发明的多肽其它有利的特性和/或减少本发明的多肽的不理想特性。所述氨基酸序列的一些非限制性实例为血清蛋白，诸如人血清白蛋白(参见，例如WO00/27435)或半抗原分子(例如被循环抗体识别的半抗原，参见例如WO98/22141)。
所述其它的氨基酸序列还可以提供第二结合位点，所述结合位点可以针对任何理想的蛋白、多肽、抗原、抗原决定簇或表位(包括但不限于针对本发明的氨基酸序列或纳米抗体的相同的蛋白、多肽、抗原、抗原决定簇或表位，或者不同的蛋白、多肽、抗原、抗原决定簇或表位)。例如，所述其它氨基酸序列可以提供针对血清蛋白(诸如例如，人血清白蛋白或另一种血清蛋白，诸如IgG)的第二结合位点，以提供增加的血清半衰期。这样的氨基酸序列例如包括在WO91/01743，WO01/45746和WO02/076489中描述的纳米抗体，以及小肽和结合蛋白，和在WO03/002609和WO04/003019中描述的dAb’s。还参考Harmsen等(2005，疫苗(Vaccine)，23(41)：4926-42)，以及AblynxN.V的EP0368684，以及WO08/028977，WO08/043821，WO08/043822和WO08/068280。
可以为本发明的氨基酸序列或纳米抗体提供增加的半衰期的优选的氨基酸序列可以选自SEQIDNO’s：97-99。
这样的氨基酸序列可以特别针对血清白蛋白(和更具体地人血清白蛋白)和/或针对IgG(和更具体地人IgG)。例如，该氨基酸序列可以是针对(人)血清白蛋白的氨基酸序列和可以结合(人)血清白蛋白上的氨基酸残基(其不参与血清白蛋白与FcRn的结合(参见例如WO06/0122787))的氨基酸序列和/或能够结合血清白蛋白上的不形成血清白蛋白的结构域III的一部分的氨基酸残基(再次参见例如WO06/0122787)的氨基酸序列；具有或可以提供增加的半衰期的氨基酸序列(例如，参见WO08/028977)；与来自至少一个哺乳动物物种的、并且特别是与至少一个灵长类物种的血清白蛋白交叉反应的针对人血清白蛋白的氨基酸序列(诸如但不限于，来自猕猴属(Macaca)的猴子(诸如，并且特别地，食蟹猴(食蟹猴(Macacafascicularis))和/或恒河猴(恒河猴(Macacamulatta)))和狒狒(豚尾狒狒(Papioursinus))，同样参考WO08/028977)；可以以pH依赖方式结合血清白蛋白的氨基酸序列(参见，例如WO08/043821)，和/或是条件粘合剂的氨基酸序列(例如，参见WO08/043822)。
根据另一个实施方案，所述一个或多个其它氨基酸序列可以包括常规4-链抗体(和特别是人抗体)和/或重链抗体的一个或多个部分、片段或结构域。例如，尽管通常较不优选，本发明的氨基酸序列或纳米抗体可以再次任选地通过接头序列(包括但不限于其它(单)结构域抗体，诸如Ward等描述的dAb’s)连接至常规(优选人)VH或VL结构域或VH或VL结构域的天然或合成类似物。
因此，在本发明的化合物或构建体中，所述一个或多个其它基团、残基、结构部分或结合单元可以选自以下组成的组：结构域抗体，适合用作结构域抗体的氨基酸序列，单结构域抗体，适合用作单结构域抗体的氨基酸序列，″dAb″’s，适合用作dAb的氨基酸序列，或纳米抗体。
在本发明的一个具体方面，与相对应的本发明的氨基酸序列或纳米抗体相比，包括至少一个本发明的氨基酸序列或纳米抗体的本发明的化合物、构建体或多肽可以具有增加的半衰期。基于本文进一步的公开内容，这些化合物、构建体和多肽的一些优选但不限制性的实例对于本领域技术人员将变得清楚，并且例如可以是：包括已经被化学修饰以增加其半衰期(例如，通过聚乙二醇化方式)的本发明的氨基酸、纳米抗体或多肽的化合物、构建体和多肽；或包括至少一个与增加本发明的纳米抗体的半衰期的至少一个结构部分(并且特别是至少一个氨基酸序列)连接的本发明的氨基酸序列或纳米抗体的本发明的多肽。基于本发明进一步的公开内容，包括所述半衰期延长结构部分或氨基酸序列的本发明的化合物、构建体或多肽的实例对于熟练的技术人员将变得清楚；并且例如，包括，但不限于，这样的多肽，其中所述一个或多个本发明的氨基酸序列或纳米抗体适当地连接一个或多个血清蛋白或其片段(诸如血清白蛋白或其适当的片段)或连接一个或多个可以结合血清蛋白的结合单元(诸如，例如，纳米抗体或(单)结构域抗体，其可以结合血清蛋白诸如血清白蛋白，血清免疫球蛋白，诸如IgG，或转铁蛋白)；其中本发明的氨基酸序列或纳米抗体连接至Fc部分(诸如人Fc)或其适当部分或其片段的多肽；或其中一个或多个本发明的氨基酸序列或纳米抗体适当地连接至一个或多个可以结合血清蛋白的小蛋白或肽的多肽(诸如，非限制性地，在WO91/01743，WO01/45746，WO02/076489中描述的蛋白和肽)。
所述至少一个氨基酸序列或纳米抗体也可以任选地通过接头序列连接至一个或多个(优选人)CH1，CH2和/或CH3结构域。例如，也例如可以使用连接至适当CH1结构域的氨基酸序列或纳米抗体-与适当的轻链一起-以产生类似于常规Fab片段或F(ab’)2片段的抗体片段/结构，但是其中一个或(在F(ab’)2片段的情况下)两个常规VH结构域已经被本发明的氨基酸序列或纳米抗体替代。此外，两个氨基酸序列或纳米抗体可以(任选地通过接头)连接至CH3结构域以提供具有增加的体内半衰期的构建体。
根据本发明多肽的一个特定方面，一个或多个本发明的氨基酸序列或纳米抗体可以(任选地通过适当接头或铰链区)连接至一个或多个恒定结构域(例如，2或3个恒定结构域，其可以用作Fc部分的一部分/形成Fc部分)，连接至Fc部分和/或连接至赋予本发明的多肽一种或多种效应子功能和/或可以赋予结合一个或多个Fc受体的能力的一个或多个抗体部分、片段或结构域。例如，为此目的，并且不限于此，所述一个或多个另外的氨基酸序列可以包括抗体的一个或多个CH2和/或CH3结构域，其诸如来自重链抗体(如本文所述)和更优选来自常规人4-链抗体；和/或可以形成Fc区域(的一部分)，其例如来自IgG(例如来自IgG1，IgG2，IgG3或IgG4)，来自IgE或来自另一种人Ig诸如IgA，IgD或IgM。例如，WO94/04678描述了包括骆驼VHH结构域或其人源化衍生物的重链抗体(即，纳米抗体)的重链抗体，其中骆驼科动物(Camelidae)CH2和/或CH3结构域已经被人CH2和CH3结构域替换，以便提供由2个重链组成的免疫球蛋白，所述重链各自包含纳米抗体和人CH2和CH3结构域(但是无CH1结构域)，所述免疫球蛋白具有由CH2和CH3结构域提供的效应子功能，并且所述免疫球蛋白可以在不存在任何轻链的情况下发挥作用。可以适当地连接至本发明的氨基酸序列或纳米抗体以便提供效应子功能的其它氨基酸序列对于本领域技术人员是清楚的，并且可以给予所需的效应子功能进行选择。例如，参考WO04/058820，WO99/42077，WO02/056910和WO05/017148以及Holliger和Hudson，同前所述的综述；和WO09/068628)。与相对应的本发明的氨基酸序列或纳米抗体相比，本发明的氨基酸序列或纳米抗体与Fc部分偶联也可以导致增加的半衰期。对于一些应用，使用赋予增加的半衰期而无任何生物学显著效应子功能的Fc部分和/或恒定结构域(即，CH2和/或CH3结构域)也可以是适当的或者甚至是优选的。熟练的技术人员应该清楚包括具有增加的体内半衰期的一个或多个氨基酸序列或纳米抗体和一个或多个恒定结构域的其它适当的构建体，并且例如，其可以包括与CH3结构域连接的两个氨基酸序列或纳米抗体，任选地通过接头序列连接。通常，具有增加的半衰期的任何融合蛋白或衍生物将优选具有大于50kD的分子量，50kD是肾吸收的截留值。
在另一个具体但非限制性方面，为了形成本发明的多肽，一个或多个本发明的氨基酸序列可以连接(任选地通过适当的接头或铰链区)至天然存在、合成或半合成的恒定结构域(或类似物，变体，突变体，其部分或片段)，其具有降低的(或基本上无)自缔合成二聚体的趋势(即，与天然存在于常规4-链抗体中的恒定结构区相比)。该单体(即，非自缔合的)Fc链变体或其片段对于本领域技术人员是清楚的。例如，Helm等(1996，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271：7494)描述可以用于本发明的多肽链的单体Fc链变体。
此外，这种单体Fc链变体优选是这样的，以致它们仍能够结合补体或相关的Fc受体(取决于衍生它们的Fc部分)，和/或是这样的，以致它们仍具有衍生它们的Fc部分的一些或所有效应子功能(或以仍适合于目的用途的降低的水平)。备选地，在本发明的这种多肽链中，单体Fc链可以用于赋予多肽链以增加的半衰期，在该情形中单体Fc链也可以不具有或基本上不具有效应子功能。
通常，具有增加的半衰期的本发明的氨基酸序列或纳米抗体(或包含其的化合物，构建体或多肽)优选具有的半衰期是相对应的本发明的氨基酸序列或纳米抗体本身的半衰期的至少1.5倍，优选至少2倍，诸如至少5倍，例如至少10倍或大于20倍。例如，与相对应的本发明的氨基酸序列或纳米抗体本身的半衰期相比较，具有增加的半衰期的本发明的氨基酸序列、纳米抗体、化合物、构建体或多肽可以具有增加多于1小时、优选多于2小时、更优选多于6小时、诸如多于12小时、或还更优选多于24、48或72小时的半衰期。
在本发明一个优选但非限制性的方面，本发明的这种氨基酸序列、纳米抗体、化合物、构建体或多肽在人中显示至少约12小时，优选至少24小时，更优选至少48小时，还更优选至少72小时以上的血清半衰期。例如，本发明的化合物或多肽可以具有至少5天(诸如约5至10天)，优选至少9天(诸如约9至14天)，更优选至少约10天(诸如约10至15天)，或至少约11天(诸如约11至16天)，更优选至少约12天(诸如约12至18天以上)，或超过14天(诸如约14至19天)的半衰期。
所述其它氨基酸序列还可以形成信号序列或前导序列，其引导本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽在合成后从宿主细胞中分泌(例如，以提供本发明的多肽的前体-(pre-)、原-(pro-)或前原-(prepro-)形式，这取决于用来表达本发明的多肽的宿主细胞)。
所述其它氨基酸序列还可以形成这样的序列或信号，即，所述序列或信号允许本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽导向和/或透过或进入特定的器官、组织、细胞、或者细胞的部分或区室，和/或所述序列或信号允许本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽透过或穿过生物屏障诸如细胞膜、细胞层诸如上皮细胞层、肿瘤(包括实体瘤)、或血脑屏障。所述氨基酸序列的适当的实例对于熟练的技术人员是清楚的，并且例如包括但不限于，上文提及的“Peptrans”载体，Cardinale等描述的序列，以及本身已知的可以用来将本发明的纳米抗体和多肽表达或生产为所谓的“细胞内抗体”的氨基酸序列和抗体片段，例如，如在WO94/02610，WO95/22618，US7,004,940，WO03/014960，WO99/07414；WO05/01690；EP1512696；和CattaneoA.和BioccaS.(1997，细胞内抗体：开发和应用(IntracellularAntibodies：DevelopmentandApplications).Landes和Springer-Verlag)和在Kontermann，(2004，方法(Methods)34：163-170)，以及本发明所述的其它参考文献中所述。
按照一个优选但非限制性的实施方案，本发明的氨基酸序列或纳米抗体包括至少一个其它的氨基酸序列或纳米抗体，以提供包括至少两个、诸如两个、三个、四个、五个或更多个氨基酸序列或纳米抗体的本发明的多肽，其中所述氨基酸序列或纳米抗体可以任选地通过一个或多个接头序列(如本发明所定义)连接。包括两个或更多个氨基酸序列或纳米抗体的本发明的多肽(其中至少一个是本发明的氨基酸序列或纳米抗体)，在本发明中还将称为本发明的“多价”多肽，并且在所述多肽中存在的氨基酸序列或纳米抗体还将在本发明中称为处于“多价形式”。例如，本发明的“二价”多肽包括2个氨基酸序列和/或纳米抗体，任选地通过一个接头序列连接，而本发明的“三价”多肽包括3个氨基酸序列和/或纳米抗体，任选地通过两个接头序列连接；等等；其中在所述多肽中存在的至少一个氨基酸序列和/或纳米抗体，并且多至在所述多肽中存在的所有氨基酸序列和/或纳米抗体，是本发明的氨基酸序列和/或纳米抗体。
在本发明的多价多肽中，所述两个或更多个氨基酸序列或纳米抗体可以是相同的或不同的，并且可以针对同一抗原或抗原决定簇(例如，针对相同部分或表位或者针对不同部分或表位)，或可以备选地针对不同的抗原或抗原决定簇；或它们的任何适当的组合。例如，本发明的二价多肽可以包括：(a)两个相同的氨基酸序列或纳米抗体；(b)针对蛋白或抗原的第一抗原决定簇的第一氨基酸序列或纳米抗体，和针对所述蛋白或抗原的同一抗原决定簇的第二氨基酸序列或纳米抗体，所述第二氨基酸序列或纳米抗体不同于所述第一氨基酸序列或纳米抗体；(c)针对所述蛋白或抗原的第一抗原决定簇的第一氨基酸序列或纳米抗体，和针对所述蛋白或抗原的另一个抗原决定簇的第二氨基酸序列或纳米抗体；或(d)针对第一蛋白或抗原的第一氨基酸序列或纳米抗体，和针对第二蛋白或抗原(即，与所述第一抗原不同)的第二氨基酸序列或纳米抗体。类似地，本发明的三价多肽可以，例如但不限于此，包括(a)三个相同的氨基酸序列或纳米抗体；(b)针对抗原的第一抗原决定簇的两个相同的氨基酸序列或纳米抗体，和针对同一抗原的不同抗原决定簇的第三氨基酸序列或纳米抗体；(c)针对抗原的第一抗原决定簇的两个相同的氨基酸序列或纳米抗体，和针对不同于所述第一抗原的第二抗原的第三氨基酸序列或纳米抗体；(d)针对第一抗原的第一抗原决定簇的第一氨基酸序列或纳米抗体，针对所述第一抗原的第二抗原决定簇的第二氨基酸序列或纳米抗体，和针对不同于所述第一抗原的第二抗原的第三氨基酸序列或纳米抗体；或(e)针对第一抗原的第一氨基酸序列或纳米抗体，针对不同于所述第一抗原的第二抗原的第二氨基酸序列或纳米抗体，和针对不同于所述第一和第二抗原的第三抗原的第三氨基酸序列或纳米抗体。
包含至少两个氨基酸序列和/或纳米抗体的本发明的多肽，其中至少一个氨基酸序列或纳米抗体针对第一抗原(即，针对IL-6受体)，并且至少一个氨基酸序列或纳米抗体针对第二抗原(即，不同于IL-6受体)，还叫作本发明的“多特异性”多肽，并且存在于所述多肽中的氨基酸序列或纳米抗体还叫作处于“多特异性形式”。因此，例如，本发明的“双特异性”多肽是包括至少一个针对第一抗原(即IL-6受体)的氨基酸序列或纳米抗体和至少一个针对第二抗原(即，不同于IL-6受体)的其它氨基酸序列或纳米抗体的多肽，而本发明的“三特异性”多肽是这样的多肽，即，其包括至少一个针对第一抗原(即IL-6受体)的氨基酸序列或纳米抗体，至少一个针对第二抗原(即，不同于IL-6受体)的其它氨基酸序列或纳米抗体，和至少一个针对第三抗原(即，不同于IL-6受体和所述第二抗原二者)的氨基酸序列或纳米抗体；等等。
因此，以其最简单的形式，本发明的双特异性多肽是本发明的二价多肽(如本文所定义)，其包括针对IL-6受体的第一氨基酸序列或纳米抗体，和针对第二抗原的第二氨基酸序列或纳米抗体，其中所述第一和第二氨基酸序列或纳米抗体可以任选地通过接头序列(如本文所定义)而连接；而以其最简单形式存在的本发明的三特异性多肽是本发明的三价多肽(如本文所定义)，其包括针对IL-6受体的第一氨基酸序列或纳米抗体，针对第二抗原的第二氨基酸序列或纳米抗体，和针对第三抗原的第三氨基酸序列或纳米抗体，其中所述第一、第二和第三氨基酸序列或纳米抗体可以任选地通过一个或多个，并且特别是一个或多个特别是两个接头序列连接。
在一个特定方面，本发明的多肽是三价、双特异性多肽。以其最简单形式存在的本发明的三价、双特异性多肽可以是本发明的三价多肽(如本文定义)，其包括两个相同的针对IL-6受体的氨基酸序列或纳米抗体和针对另一个抗原的第三氨基酸序列或纳米抗体，其中所述第一、第二和第三氨基酸序列或纳米抗体可以任性地通过一个或多个、和特别是一个或多个、特别是两个接头序列连接。
在另一个特定方面，本发明的多肽是双特异性多肽。以其最简单形式存在的本发明的二价多肽可以是本发明的二价多肽(如本文定义)，其包括针对IL-6受体的第一氨基酸序列或纳米抗体和针对另一个抗原的第二氨基酸序列或纳米抗体，其中所述第一和第二氨基酸序列或纳米抗体可以任性地通过接头序列连接。
在一个优选而非限制性的实例中，本发明的多特异性多肽包括至少一个本发明的氨基酸序列或纳米抗体和至少一个提供增加的半衰期的纳米抗体。所述纳米抗体的一些优选而非限制性的实例包括针对血清蛋白的纳米抗体，所述血清蛋白诸如人血清白蛋白、甲状腺素结合蛋白、(人)转铁蛋白、血纤蛋白原、免疫球蛋白如IgG、IgE或IgM、或WO04/003019中列出的一种其它血清蛋白。
例如，对于在小鼠中的实验，可以使用针对小鼠血清白蛋白(MSA)的纳米抗体，而对于药物应用，可以使用针对人血清白蛋白的纳米抗体。
本发明的另一个实施方案是如上文所述的多肽构建体，其中所述至少一个(人)血清蛋白是(人)血清白蛋白、(人)血清免疫球蛋白、(人)甲状腺素结合蛋白、(人)转铁蛋白、(人)血纤蛋白原等中的任一种。
因此，在一个特定方面，本发明的多肽是三价、双特异性多肽，其包括两个相同的针对IL-6受体的氨基酸序列或纳米抗体和针对(人)血清白蛋白的第三氨基酸序列或纳米抗体，其中所述第一、第二和第三氨基酸序列或纳米抗体可以任性地通过一个或多个、和特别是一个或多个、特别是两个接头序列连接。
在另一个特定方面，本发明的多肽是双特异性多肽，其包括针对IL-6受体的第一氨基酸序列或纳米抗体和针对(人)血清白蛋白的第二氨基酸序列或纳米抗体，其中所述第一和第二氨基酸序列或纳米抗体可以任性地通过接头序列连接。
按照本发明的一个具体而非限制性的方面，除了一个或多个本发明的氨基酸序列或纳米抗体之外，本发明的多肽可以包含至少一个针对人血清白蛋白的纳米抗体。尽管这些针对人血清白蛋白的纳米抗体可以如在上文引用的埃博灵克斯股份有限公司(AblynxN.V)的申请中(参见例如W04/062551)概括描述，但是按照一个特别优选而非限制性的实施方案，所述针对人血清白蛋白的纳米抗体基本上由选自SEQIDNO’s：97-99的氨基酸序列组成。
本发明多肽的一些优选但非限制性的实例，其包括至少一个针对IL-6R的氨基酸序列或纳米抗体和至少一个提供增加的半衰期的氨基酸序列或纳米抗体，其为：
a)SEQIDNO’s：70-72；
b)本发明这样的多肽序列，所述多肽序列在其CDR中的一个、两个或全部之中与SEQIDNO’s：70-72之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异，条件是与所述SEQIDNO’s：70-72之一的结合相比，本发明所述在其CDR中的一个、两个或全部之中具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的多肽序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量；和
c)与SEQIDNO’s：70-72之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的多肽序列，条件是与所述SEQIDNO’s：70-72之一的结合相比，与SEQIDNO’s：70-72之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量。
本发明的三价双特异性多肽的一些优选但非限制性的实例是：
a)SEQIDNO’s：71-72；
b)本发明这样的多肽序列，所述多肽序列在其CDR中的一个、两个或全部之中与SEQIDNO’s：71-72之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异，条件是与所述SEQIDNO’s：71-72之一的结合相比，本发明所述在其CDR中的一个、两个或全部之中具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的多肽序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量；和
c)与SEQIDNO’s：71-72之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的多肽序列，条件是与所述SEQIDNO’s：71-72之一的结合相比，与SEQIDNO’s：71-72之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量。
本发明的双特异性多肽的一些优选但非限制性的实例，其包括针对IL-6R的氨基酸序列或纳米抗体和提供增加的半衰期的氨基酸序列或纳米抗体，其为：
a)SEQIDNO：70；
b)本发明这样的多肽序列，所述多肽序列在其CDR中的一个、两个或全部之中与SEQIDNO：70具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异，条件是与所述SEQIDNO：70的结合相比，本发明所述在其CDR中的一个、两个或全部之中具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的多肽序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量；和
c)与SEQIDNO：70具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的多肽序列，条件是与所述SEQIDNO：70的结合相比，与SEQIDNO：70具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列以相同、大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量。
当比较两个氨基酸残基片段(或两个CDR序列)时，术语“其CDR中的一个、两个或全部中的氨基酸差异”是指与a)中指定的本发明的多肽中包括的氨基酸残基片段(或CDR序列)相比，在b)中指定的本发明的多肽中包括的氨基酸残基片段(或CDR序列)的一个位置上插入、缺失或置换单个氨基酸残基；应当理解，两个氨基酸残基片段(或CDR序列)可以含有一个或最多两个这样的氨基酸差异。
“其CDR中的一个、两个或全部中的氨基酸差异”是指在本发明的多肽中包含的本发明的氨基酸序列或纳米抗体与a)的多肽之一中包含的氨基酸序列或纳米抗体(即，SEQIDNO’s：60-69之一)中的CDR1，CDR2和/或CDR3相比，可以在其CDR1中具有不超过2个，优选不超过1个氨基酸差异，和/或在其CDR2中具有不超过2个，优选不超过1个氨基酸差异，和/或在其CDR3中具有不超过2个，优选不超过1个氨基酸差异(即在形成抗原结合位点的CDR1，CDR2和/或CDR3中，所述抗原结合位点用于本发明的化合物或多肽与IL-6R上的特定表位的结合)；诸如与包含在a)的多肽之一中的本发明的氨基酸序列或纳米抗体中的CDR1(即，SEQIDNO’s：60-69之一的CDR1)相比，在其CDR1(即，形成抗原结合位点的CDR1，所述抗原结合位点用于本发明的化合物或多肽与IL-6R上的特定表位的结合)中不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异；或与包含在a)的多肽之一中的本发明的氨基酸序列或纳米抗体中的CDR2(即，SEQIDNO’s：60-69之一的CDR2)相比，在其CDR2(即，形成抗原结合位点的CDR2，所述抗原结合位点用于本发明的化合物或多肽与IL-6R上的特定表位的结合)中不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异；或与包含在a)的多肽之一中的本发明的氨基酸序列或纳米抗体中的CDR3(即，SEQIDNO’s：60-69之一的CDR3)相比，在其CDR3(即，形成抗原结合位点的CDR3，所述抗原结合位点用于本发明的化合物或多肽与IL-6R上的特定表位的结合)中不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异；与包含在a)的多肽之一中的本发明的氨基酸序列或纳米抗体中的CDR1(即，SEQIDNO’s：60-69之一的CDR1)相比，在其CDR1(即，形成抗原结合位点的CDR1，所述抗原结合位点用于本发明的化合物或多肽与IL-6R上的特定表位的结合)中不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异和与包含在a)的多肽之一中的本发明的氨基酸序列或纳米抗体中的CDR2(即，SEQIDNO’s：60-69之一的CDR2)相比，在其CDR2(即，形成抗原结合位点的CDR2，所述抗原结合位点用于本发明的化合物或多肽与IL-6R上的特定表位的结合)中不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异；或与包含在a)的多肽之一中的本发明的氨基酸序列或纳米抗体中的CDR1(即，SEQIDNO’s：60-69之一的CDR1)相比，在其CDR1(即，形成抗原结合位点的CDR1，所述抗原结合位点用于本发明的化合物或多肽与IL-6R上的特定表位的结合)中不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异和与包含在a)的多肽之一中的本发明的氨基酸序列或纳米抗体中的CDR3(即，SEQIDNO’s：60-69之一的CDR3)相比，在其CDR3(即，形成抗原结合位点的CDR3，所述抗原结合位点用于本发明的化合物或多肽与IL-6R上的特定表位的结合)中不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异；或与包含在a)的多肽之一中的本发明的氨基酸序列或纳米抗体中的CDR2(即，SEQIDNO’s：60-69之一的CDR2)相比，在其CDR2(即，形成抗原结合位点的CDR2，所述抗原结合位点用于本发明的化合物或多肽与IL-6R上的特定表位的结合)中不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异和与包含在a)的多肽之一中的本发明的氨基酸序列或纳米抗体中的CDR3(即，SEQIDNO’s：60-69之一的CDR3)相比，在其CDR3(即，形成抗原结合位点的CDR3，所述抗原结合位点用于本发明的化合物或多肽与IL-6R上的特定表位的结合)中不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异；与包含在a)的多肽之一中的本发明的氨基酸序列或纳米抗体中的CDR1(即，SEQIDNO’s：60-69之一的CDR1)相比，在其CDR1(即，形成抗原结合位点的CDR1，所述抗原结合位点用于本发明的化合物或多肽与IL-6R上的特定表位的结合)中不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异和与包含在a)的多肽之一中的本发明的氨基酸序列或纳米抗体中的CDR2(即，SEQIDNO’s：60-69之一的CDR2)相比，在其CDR2(即，形成抗原结合位点的CDR2，所述抗原结合位点用于本发明的化合物或多肽与IL-6R上的特定表位的结合)中不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异和与包含在a)的多肽之一中的本发明的氨基酸序列或纳米抗体中的CDR3(即，SEQIDNO’s：60-69之一的CDR3)相比，在其CDR3(即，形成抗原结合位点的CDR3，所述抗原结合位点用于本发明的化合物或多肽与IL-6R上的特定表位的结合)中不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异。
“其CDR中的一个、两个或全部中的氨基酸差异”可以是在本发明的一个或多个CDR中的任何一个或最多任何两个置换、缺失或插入，或其任何组合，其改善本发明的化合物或多肽的性质，或至少不将本发明的化合物或多肽的所需性质或所需性质的平衡或组合损伤过多。在这方面，与包括所述一个或多个CDRs但没有所述一个或最多两个置换、缺失或插入的本发明的化合物或多肽相比，所获得的本发明的化合物或多肽应当至少以相同、大约相同或更高的亲和性结合IL-6R，所述亲和性通过表面等离子共振测量。获得的化合物或多肽优选是这样的，以致它们可以以如本文定义的亲和性(适当测量和/或表示为KD-值(实际的或表观的)，KA-值(实际的或表观的)，kon-速率和/或koff-速率，或备选地作为IC50值，如本发明进一步所述)结合IL-6受体上的特定表位。获得的化合物或多肽还优选具有如本文定义的基于细胞的效力和血浆效力。
在本发明的一方面，“其CDR中的一个、两个或全部中的氨基酸差异”是氨基酸置换。氨基酸置换可以是在本发明的一个或多个CDR中的任何一个或最多两个置换，其改善本发明的化合物或多肽的性质，或至少不将本发明的化合物或多肽的所需性质或所需性质的平衡或组合损伤过多。在这方面，与包括所述一个或多个CDRs但没有所述一个或最多两个置换的本发明的化合物或多肽相比，所获得的本发明的化合物或多肽应当至少以相同、大约相同或更高的亲和性结合IL-6R，所述亲和性通过表面等离子共振测量。获得的化合物或多肽优选是这样的，以致它们可以以如本文定义的亲和性(适当测量和/或表示为KD-值(实际的或表观的)，KA-值(实际的或表观的)，kon-速率和/或koff-速率，或备选地作为IC50值，如本发明进一步所述)结合IL-6受体上的特定表位。获得的化合物或多肽还优选具有如本文定义的基于细胞的效力和血浆效力。基于本文的公开内容和任选地在有限程度的常规实验后，本领域技术人员通常能够确定和选择适当的置换，其可以例如包括引入有限数量的可能的置换和确定它们对如此获得的化合物或多肽的性质的影响。
在本发明的一个或多个CDR中的氨基酸取代可以是任何可能的置换，诸如“保守置换”(如本文定义)，其可以被某些规则推动(如本文定义)，和/或它可以将改善的性质引入至所获得的化合物或多肽(如本文进一步定义)。
本发明还涉及与SEQIDNO’s：70-72(的全长序列)之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的化合物或多肽。
当比较两个化合物或多肽时，术语“氨基酸差异”是指与第二个化合物或多肽相比较，在第一个化合物或多肽的一个位置上插入、缺失或置换单个氨基酸残基；应当理解，两个化合物或多肽可以含有一个或最多两个这样的氨基酸差异。
“氨基酸差异”可以是化合物或多肽中，即在一个或多个构架区中或在一个或多个CDRs(其可以在本发明的CDR中(即存在于本发明的氨基酸序列或纳米抗体中)或在另一个CDR中(即存在于SEQIDNO：98中))中，在接头序列中，或它们的任何组合中的任何一个或最多两个置换、缺失或插入，其改善本发明的化合物或多肽的性质，或至少不将本发明的化合物或多肽的所需性质或所需性质的平衡或组合损伤过多。在这方面，与没有所述一个或最多两个置换、缺失或插入的化合物或多肽相比，所获得的本发明的化合物或多肽应当至少以相同、大约相同或更高的亲和性结合IL-6R，所述亲和性通过表面等离子共振测量。获得的化合物或多肽优选是这样的，以致它们可以以如本文定义的亲和性(适当测量和/或表示为KD-值(实际的或表观的)，KA-值(实际的或表观的)，kon-速率和/或koff-速率，或备选地作为IC50值，如本发明进一步所述)结合IL-6受体上的特定表位。获得的化合物或多肽还优选具有如本文定义的基于细胞的效力和血浆效力。
在本发明的一个方面，“氨基酸差异”是氨基酸置换。氨基酸置换可以是在构架区中，在一个或多个CDRs(其可以在本发明的CDR中(即存在于本发明的氨基酸序列或纳米抗体中)或在另一个CDR中(即存在于SEQIDNO：98中))中，在接头序列中，或它们的任何组合中的任何一个或最多任何两个取代，其改善本发明的化合物或多肽的性质，或至少不将本发明的化合物或多肽的所需性质或所需性质的平衡或组合损伤过多。在这方面，与没有所述一个或最多两个置换的化合物或多肽相比，所获得的本发明的化合物或多肽应当至少以相同、大约相同或更高的亲和性结合IL-6R，所述亲和性通过表面等离子共振测量。获得的化合物或多肽优选是这样的，以致它们可以以如本文定义的亲和性(适当测量和/或表示为KD-值(实际的或表观的)，KA-值(实际的或表观的)，kon-速率和/或koff-速率，或备选地作为IC50值，如本发明进一步所述)结合IL-6受体上的特定表位。获得的化合物或多肽还优选具有如本文定义的基于细胞的效力和血浆效力。
如上所示，所述置换、插入或缺失可以在一个或多个构架区中，在一个或多个CDR’s中，和/或在一个或多个接头序列中。所述CDR’s中的置换、插入或缺失可以是任何可能的置换、插入或缺失，诸如“保守置换”(如本文定义)，其可以由某些规则(如本文定义)推动，和/或它可以将改善的性质引入到获得的化合物或多肽。
当该置换、插入或缺失是在一个或多个构架区中进行时，它们可以是任何可能的置换、插入或缺失。它们可以在一个或多个标志残基(如例如在WO08/020079；表A-3至A-8中定义)处和/或在构架残基中一个或多个其它位置处进行，尽管在标志残基处的置换、插入或缺失通常是较不优选的(除非这些是如本文所述的适当的人源化置换)。作为非限制性的实例，置换例如可以是保守置换(如本文所述)和/或氨基酸残基可以被天然存在于另一个VHH结构域中相同位置的另一个氨基酸残基替换(参见WO08/020079，表A-5至A-8)，尽管本发明通常不限于此。
(优选)在一个或多个构架区中进行的置换、插入或缺失可以是序列优化的置换，诸如例如人源化置换。基于本文公开的内容，一些优选但是非限制性的人源化置换(及其适当组合)对于本领域技术人员是清楚的。通过将在a)中定义的本发明的多肽之一中包括的氨基酸序列或纳米抗体之一的构架区序列和一个或多个紧密相关的人VH序列的相应构架序列进行比较，可以确定潜在有效的人源化置换，之后将如此确定的一个或多个潜在有效的人源化置换(或其组合)引入在a)中定义的本发明的所述多肽之一中包括的所述氨基酸序列或纳米抗体中(以本身已知的任何方式，如本文进一步描述)，并且检测获得的人源化多肽与IL-6R的亲和性，稳定性，表达容易性和水平，和/或本文定义的其它理想性质。如此，通过有限程度的试错，基于本文的公开内容，本领域技术人员可以确定其它适当的人源化置换(或其适当组合)。
取决于用于表达本发明的化合物或多肽的宿主生物体，也可以以这种方式设计这些缺失和/或置换，所述方式使得去除用于翻译后修饰的一个或多个位点(诸如一个或多个糖基化位点)，这是属于本领域技术人员能力范围之内。备选地，可以设计置换或插入，以使引入一个或多个连接官能团的位点(如本文所述)，例如，允许位点特异性聚乙二醇化(如本文定义)。
从WO08/020079的表A-5-A-8中提供的关于VHH熵和VHH可变性的数据可以看出，在构架区中的一些氨基酸残基比其它的更保守。通常，尽管本发明在其最广泛意义上不限于此，优选在较不保守的位置进行任何置换、缺失或插入。此外，通常，氨基酸置换优于氨基酸缺失或插入。
获得的本发明的化合物或本发明的多肽应当优选以亲和性(适当测量的和/或表示为KD-值(实际的或表观的)，KA-值(实际的或表观的)，kon-速率和/或koff-速率，或备选地表示为IC50值，如本发明进一步所述)结合IL-6R，优选是这样的，以致它们：
-以1nM至1pM摩尔/升以下，优选500pM至1pM摩尔/升以下，更优选100pM至1pM摩尔/升以下，或还更优选约50pM至1pM以下的解离常数(KD)结合hIL-6R；
和/或是这样的，以致它们：
-以1nM至1pM摩尔/升以下，优选500pM至1pM摩尔/升以下，更优选100pM至1pM摩尔/升以下，或还更优选约50pM至1pM以下的解离常数(KD)结合食蟹猴IL-6R；
和/或是这样的，以致它们：
-以104M-1s-1至约107M-1s-1，优选105M-1s-1至107M-1s-1，更优选约106M-1s-1以上的kon-速率结合hIL-6R；
和/或是这样的，以致它们：
-以104M-1s-1至约107M-1s-1，优选105M-1s-1至107M-1 s -1，更优选约106M-1s-1以上的kon-速率结合食蟹猴IL-6R；
和/或是这样的，以致它们：
-以10-3s-1(t1/2＝0.69s)至10-6s-1(假定具有多天的t1/2的几乎不可逆的复合物)，优选10-4s-1至10-6s-1，更优选10-5s-1至10-6s-1，诸如约10-5s-1以下的koff速率结合hIL-6R；
和/或是这样的，以致它们：
-以10-3s-1(t1/2＝0.69s)至10-6s-1(假定具有多天的t1/2的几乎不可逆的复合物)，优选10-4s-1至10-6s-1，更优选10-5s-1至10-6s-1，诸如约10-5s-1以下的koff速率结合食蟹猴IL-6R。
对于本发明的化合物或多肽与IL-6R结合的一些优选的IC50值将从本发明的进一步描述和实施例中变得清楚。
本发明的多肽和化合物和包含其的组合物的效力和/或功效可以使用本身已知的任何适当的体外测定、基于细胞的测定、体内测定和/或动物模型或它们的任何组合来检测，这取决于涉及的具体的疾病或病症。适当的测定和动物模型对于本领域技术人员是清楚的，并且例如包括使用IL-6-依赖性细胞系(包括TF-1，XG1和7TD1)的增殖测定，胶原蛋白诱导的关节炎模型，在SCID小鼠内的滑液组织移植模型，各种人癌症的异种移植模型，所述人癌症包括淋巴瘤、骨髓瘤、前列腺癌和肾细胞癌，包括TNBS的IBD模型，灵长类动物模型(诸如例如在Shinkura等，1998，抗癌研究(AnticancerResearch)18：1217-1222中描述)，非人灵长类动物关节病模型(诸如例如在Vierboom等，2008，今日药物开发(DrugDiscov.Today)：DisModeldoi：10.1016/j.ddmod.2008.06.003中描述)以及在下述实验部分和在本发明引用的现有技术中所用的测定和动物模型(Peake等，2006，风湿病学(Rheumatology)45：1485-9；Wahid等，2000，免疫学临床实验(Clin.Exp.Immunol.)，122：133-142；Matsuno等，1998，关节炎和风湿病(Arthritisandrheumatism)41：2014-2021；WO08/020079)。
例如，在Kitamura等(1989，细胞生理学杂志(J.CellPhysiol.)140：323)描述的TF-1测定中，本发明的化合物或本发明的多肽可以具有10nM和50pM之间，优选5nM和50pM之间，更优选1nM至50pM以下，诸如约750或500pM以下的IC50值(在100IU/mLIL-6时)。在该TF-1测定中，本发明的化合物或本发明的多肽可以具有50nM至1nM，优选25nM至1nM，更优选10nM至1nM以下，诸如约8nM以下的IC50值(在5000IU/mLIL-6时)。在该TF-1测定中，本发明的化合物或本发明的多肽可以具有与由SEQIDNO’s：1和2定义的参照IgG或由SEQIDNO’s：3和4定义的参照Fab(参见实施例1)获得的IC50值相比至少相同和优选更好，至少2倍，优选3倍，更优选4倍，还更优选5倍，7倍或多于7倍更好的IC50值。在该TF-1测定中，本发明的化合物或本发明的多肽可以具有与托珠单抗(MRA)获得的IC50值相比至少相同和优选更好，至少2倍，优选3倍，更优选4倍，还更优选5倍，7倍或多于7倍更好的IC50值。
在IL-6的EC50值下的血浆效力测定中(例如，在存在27.29ng/mLIL-6下，如实施例45所述)，本发明的化合物或本发明的多肽可以具有500pM至50pM，优选250pM至50pM，更优选200pM至50pM以下，诸如150pM以下的IC50值。在IL-6的EC95值下的血浆效力测定中(例如，在存在885ng/mLIL-6下，如实施例45所述)，本发明的化合物或本发明的多肽可以具有1000pM至100pM，优选750pM至100pM，更优选500pM至100pM以下，诸如400pM以下的IC50值。在该血浆效力测定中，本发明的化合物或本发明的多肽可以具有与由SEQIDNO’s：1和2定义的参照IgG或由SEQIDNO’s：3和4定义的参照Fab(参见实施例1)获得的IC50值相比至少相同和优选更好，至少2倍，优选3倍，更优选4倍，还更优选5倍，7倍或大于7倍更好的IC50值。在该血浆效力测定中，本发明的化合物或本发明的多肽可以具有与托珠单抗(MRA)获得的IC50值相比至少相同和优选更好，至少2倍，优选3倍，更优选4倍，还更优选5倍，7倍或大于7倍更好的IC50值。
在限定与CHO细胞上的膜IL-6R结合的测定中，本发明的化合物或本发明的多肽可以具有10nM至100pM，优选5nM至100pM，更优选2nM至10pM以下，诸如2nM以下的IC50值。
在一个优选方面，本发明的化合物或多肽具有SEQIDNO：70的氨基酸序列，或基本上由SEQIDNO：70的氨基酸序列组成。在另一个优选方面，本发明的化合物或多肽具有SEQIDNO：71的氨基酸序列，或基本上由SEQIDNO：71的氨基酸序列组成。具有这些氨基酸序列的多肽除了它们部分或完全阻断IL-6/IL-6R相互作用和/或抑制经由IL-6、IL-6R和/或IL-6/IL-6R复合物的信号传导能力，还具有改善的性质，诸如例如改善的结合和/或亲和性，改善的抗体亲抗原性，改善的功效和效力，和/或增加的选择性。
本发明还涉及单价构建体(也称为“本发明的单价构建体”)，其包括一个本发明的氨基酸序列或纳米抗体，或基本上由一个本发明的氨基酸序列或纳米抗体组成。优选的本发明的单价构建体包括SEQIDNO’s：60-69，诸如SEQIDNO’s：65-69，诸如例如SEQIDNO：66，或基本上由SEQIDNO’s：60-69，诸如SEQIDNO’s：65-69，诸如例如SEQIDNO：66组成。这样的单价构建体，以及本发明的氨基酸序列和纳米抗体，可以用于制备本发明的化合物或多肽，诸如例如本发明的多价和/或多特异性化合物或多肽。
因此，本发明还涉及本发明的氨基酸序列、纳米抗体或单价构建体用于制备本发明的化合物、构建体或多肽的应用。本发明还涉及一种制备本发明的化合物、构建体或多肽的方法，其包括将本发明的氨基酸序列、纳米抗体或单价构建体与一个或多个其它基团、残基、结构部分或结合单元连接。该方法可以包括将本发明的氨基酸序列、纳米抗体或单价构建体与一个或多个其它基团、残基、结构部分或结合单元通过一个或多个接头连接。
在一个优选方面，所述一个或多个其它基团、残基、结构部分或结合单元是结合单元，诸如氨基酸序列或纳米抗体。因此，本发明还涉及本发明的氨基酸序列、纳米抗体或单价构建体用于制备本发明的多价和/或多特异性化合物、构建体或多肽的用途。本发明还涉及一种制备本发明的多价和/或多特异性化合物、构建体或多肽的方法，所述方法包括将本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多价构建体与一个或多个其它结合单元(诸如氨基酸序列或纳米抗体)连接。这种方法可以包括将本发明的氨基酸序列、纳米抗体或单价构建体与一个或多个结合单元通过一个或多个接头连接。
在一个特定方面，本发明还涉及单价构建体用于制备本发明的多价和/或多特异性化合物、构建体或多肽的用途，所述单价构建体包括SEQIDNO’s：60-69(优选SEQIDNO’s：65-69，更优选SEQIDNO：66)之一或基本上由SEQIDNO’s：60-69(优选SEQIDNO’s：65-69，更优选SEQIDNO：66)之一组成。本发明还涉及一种用于制备本发明的多价和/或多特异性化合物、构建体或多肽的方法，所述方法包括将单价构建体与一个或多个其它结合单元(诸如氨基酸序列或纳米抗体)连接，所述单价构建体包括SEQIDNO’s：60-69(优选SEQIDNO’s：65-69，更优选SEQIDNO：66)之一或基本上由SEQIDNO’s：60-69(优选SEQIDNO’s：65-69，更优选SEQIDNO：66)之一组成。该方法可以包括将单价构建体与一个或多个结合单元通过一个或多个接头连接，所述单价构建体包括SEQIDNO’s：60-69(优选SEQIDNO’s：65-69，更优选SEQIDNO：66)之一或基本上由SEQIDNO’s：60-69(优选SEQIDNO’s：65-69，更优选SEQIDNO：66)之一组成。
在另一个特定方面，本发明涉及单价构建体用于制备多价和/或多特异性化合物、构建体或多肽的用途，所述单价构建体包括SEQIDNO’s：60-69(优选SEQIDNO’s：65-69，更优选SEQIDNO：66)之一或基本上由SEQIDNO’s：60-69(优选SEQIDNO’s：65-69，更优选SEQIDNO：66)之一组成，所述多价和/或多特异性化合物、构建体或多肽包括SEQIDNO’s：70-72(优选SEQIDNO’s：70-71，更优选SEQIDNO：70或SEQIDNO：71)或基本上由SEQIDNO’s：70-72(优选SEQIDNO’s：70-71，更优选SEQIDNO：70或SEQIDNO：71)组成。本发明还涉及一种用于制备多价和/或多特异性化合物、构建体或多肽的方法，所述多价和/或多特异性化合物、构建体或多肽包括SEQIDNO’s：70-72(优选SEQIDNO’s：70-71，更优选SEQIDNO：70或SEQIDNO：71)或基本上由SEQIDNO’s：70-72(优选SEQIDNO’s：70-71，更优选SEQIDNO：70或SEQIDNO：71)组成，所述方法包括将单价构建体与包括SEQIDNO：98或基本上由SEQIDNO：98组成的氨基酸序列通过一个或多个接头连接，所述单价构建体包括SEQIDNO’s：60-69(优选SEQIDNO’s：65-69，更优选SEQIDNO：66)之一或基本上由SEQIDNO’s：60-69(优选SEQIDNO’s：65-69，更优选SEQIDNO：66)之一组成。
用于多价和/或多特异性多肽的适当的间隔臂或接头对于本领域技术人员是清楚的，并且可以通常是本领域用于连接氨基酸序列的任何接头或间隔臂。优选地，所述接头或间隔臂适合用于构建意欲用于药物用途的蛋白质或多肽。
一些特别优选的间隔臂包括本领域中用于连接抗体片段或抗体结构域的间隔臂和接头。这些包括上文所引用的公知背景技术中提及的接头，以及例如在本领域中用于构建双抗体或ScFv片段的接头(在这一方面，然而，应该注意，尽管在双抗体和在ScFv片段中，所用的接头序列应该具有某种长度、某种程度的柔性以及允许相关的VH和VL结构域靠近在一起形成完整的抗原-结合位点的其它特性，但是，由于每一氨基酸序列或纳米抗体本身形成完整的抗原-结合位点，所以对于用于本发明的多肽的接头的长度和柔性没有特别的限制)。
例如，接头可以是适当的氨基酸序列，并且特别是1-50、优选1-30、诸如1-20或1-10个氨基酸残基的氨基酸序列。所述氨基酸序列的一些优选实例包括gly-ser接头，例如，(glyxsery)z型的，诸如(例如(gly4ser)3或(gly3ser2)3，如在WO99/42077中所述，铰链样区域如天然存在的重链抗体的铰链区或类似的序列(如在WO94/04678中所述)。
一些其他特别优选的接头是聚丙氨酸(如AAA)，以及在表B-8中提及的接头，其中AAA，GS-7和GS-9是特别优选的。
其它适宜的接头通常包括有机化合物或聚合物，特别是适用于药用蛋白的那些。例如，聚(乙二醇)结构部分已经用来连接抗体结构域，参见例如WO04/081026。
下列情形包括在本发明范围内，所用的接头的长度、柔性程度和/或其他特性(尽管不是关键的，由于它通常是用在ScFv片段中的接头)可以对本发明最终的多肽的特性具有一些影响，包括但不限于针对IL-6受体、或针对一种或多种其他抗原的亲和性、特异性或抗体亲抗原性。基于本文的公开内容，任选地在一些有限的常规实验之后，熟练的技术人员应该能够确定用于本发明的特异性多肽的最佳接头。
下列情形也在本发明范围内：所用接头赋予本发明的多肽一种或多种其它有利特性或官能性，和/或提供用于形成衍生物和/或用于官能团附着的一个或多个位点(例如，如本文关于本发明的氨基酸序列、纳米抗体、化合物和多肽的衍生物的描述)。例如，包含一个或多个带电荷氨基酸残基的接头可以提供提高的亲水特性，而形成或包含小的表位或标记的接头可以用于检测、鉴定和/或纯化目的。并且，基于本文的公开内容，任选地在一些有限的常规实验之后，熟练的技术人员应该能够确定用于本发明的特异性多肽的最佳接头。
最后，当两个或更多个接头用于本发明的多肽时，这些接头可以相同或不同。并且，基于本文的公开内容，任选地在一些有限的常规实验之后，熟练的技术人员应该能够确定用于本发明的特异性多肽的最佳接头。
通常，为了使表达和生产容易，本发明的多肽将是线性多肽。然而，本发明在其最广泛意义上不限于此。例如，当本发明的多肽包括三个或多个氨基酸序列或纳米抗体时，可以利用具有三个或更多个“臂”的接头连接它们，所述每个“臂”与氨基酸序列或纳米抗体连接，以提供“星形”的构建体。尽管通常较不优选，但是还可以使用环形的构建体。
本发明在其最广泛意义上还包括本发明的氨基酸序列、纳米抗体、化合物或多肽的衍生物。这样的衍生物通常可以通过本发明的氨基酸序列、纳米抗体、化合物或多肽和/或形成本发明的氨基酸序列、纳米抗体、化合物或多肽的一个或多个氨基酸残基的修饰而获得，并且特别是通过化学和/或生物(例如，酶促)修饰获得。
熟练的技术人员应该清楚这样的修饰的实例，以及氨基酸序列、纳米抗体序列、化合物或多肽序列中可以以这样的方式修饰的氨基酸残基的实例(即，在蛋白骨架上但是优选地在侧链上)，可以用来引入所述修饰的方法和技术以及所述修饰的潜在用途和优点。
例如，这样的修饰可以包括向本发明的氨基酸序列，纳米抗体，化合物或多肽内或向本发明的氨基酸序列、纳米抗体、化合物或多肽上引入(例如，通过共价连接或以其它适当的方式)一个或多个官能团、残基或结构部分，并且特别是赋予本发明的氨基酸序列、纳米抗体、化合物或多肽一种或多种理想的特性或官能性的一个或多个官能团、残基或结构部分。熟练的技术人员应该清楚所述官能团的实例。
例如，所述修饰可以包括引入(例如，通过共价结合或以任何其它适当的方式)一个或多个这样的官能团，即，所述官能团增加本发明的氨基酸序列、纳米抗体、化合物或多肽的半衰期、溶解性和/或吸收，减少本发明的氨基酸序列、纳米抗体、化合物或多肽的免疫原性和/或毒性，消除或减弱本发明的氨基酸序列、纳米抗体、化合物或多肽的任何不理想的副作用，和/或赋予本发明的氨基酸序列、纳米抗体、化合物或多肽其它的有利特性和/或减少本发明的氨基酸序列、纳米抗体、化合物或多肽的不理想特性；或者两种或多种上述的任何组合。所述官能团的实例以及引入所述官能团的技术的实例应该为熟练的技术人员清楚，并且通常可以包括上文引用的综合背景技术中提及的所有官能团和技术，以及本身已知的用于修饰药物蛋白并且特别用于修饰抗体或抗体片段(包括ScFv’s和单结构域抗体)的官能团和技术，关于其的参考文献例如参考雷明顿药物科学(Remington′sPharmaceuticalSciences)(1980，第16版，MackPublishingCo.，Easton，PA)。例如，所述官能团可以直接连接(例如共价地)到本发明的氨基酸序列、纳米抗体、化合物或多肽上，或者任选地通过适当的接头或间隔臂(spacer)连接，这也为熟练的技术人员所清楚。
关于增加半衰期和/或减少药物蛋白的免疫原性最广泛应用的一种技术包括适当的药用聚合物诸如聚(乙二醇)(PEG)或其衍生物(诸如甲氧基聚(乙二醇)或mPEG)的附着。一般地，可以应用聚乙二醇化作用的任何适当的形式，诸如本领域中用于抗体和抗体片段(包括但不限于(单)结构域抗体和ScFv’s)的聚乙二醇化作用；例如，参考Chapman(2002，自然生物技术(Nat.Biotechnol.)，54：531-545)；Veronese和Harris(2003，高级药物递送综述(Adv.DrugDeliv.Rev.)54：453-456)，Harris和Chess(2003，自然药物发现综述(Nat.Rev.Drug.Discov.)，2：214-21)以及在WO04/060965中。用于蛋白聚乙二醇化的各种试剂还可以商购，例如从美国Nektar治疗公司(NektarTherapeutics)购得。
优选地，应用定向聚乙二醇化，特别是通过半胱氨酸-残基(参见例如Yang等(2003，蛋白质工程(ProteinEngineering)，16(10)：761-770)。例如，为了这一目的，PEG可以附着到在本发明的氨基酸序列、纳米抗体、化合物或多肽中天然存在的半胱氨酸残基上，本发明的氨基酸序列、纳米抗体、化合物或多肽可以这样进行修饰，以适当地引入一个或多个用于PEG附着的半胱氨酸残基，或者可以将包括一个或多个用于PEG附着的半胱氨酸残基的氨基酸序列融合到本发明的氨基酸序列、纳米抗体、化合物或多肽的N-端和/或C-端，所有均应用本身为熟练的技术人员所了解的蛋白质加工技术。
优选地，对于本发明的氨基酸序列、纳米抗体、化合物或多肽，使用具有大于5000，诸如大于10,000并且小于200,000，诸如小于100,000；例如在20,000-80,000范围内的分子量的PEG。
另一种通常较不优选的修饰包括N-连接的或O-连接的糖基化，通常作为共翻译和/或翻译后修饰的一部分，其取决于为表达本发明的氨基酸序列、纳米抗体、化合物或多肽所用的宿主细胞。
还有另一种修饰可以包括引入一种或多种可检测的标记或其它信号-产生基团或结构部分，其取决于所标记的本发明的氨基酸序列、纳米抗体、化合物或多肽的目的用途。适宜的标记以及附着、使用和检测它们的技术是熟练的技术人员所清楚的，并且例如包括但不限于，荧光标记(诸如荧光素、异硫氰酸酯、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛(o-phthaldehyde)、以及荧光胺和荧光素金属诸如152Eu或其它来自镧系的金属)，磷光性标记、化学发光标记或生物发光标记(诸如鲁米那、异鲁米诺、theromaticacridinium酯、咪唑、acridinium盐、草酸酯、二氧杂环丁烷或GFP及其类似物)，放射性-同位素(诸如3H，125I，32P，35S，15C，51Cr，36Cl，57Co，58Co，59Fe，和75Se)，金属、金属螯合物或金属阳离子(例如金属阳离子诸如99mTc，123I，111In，131I，97Ru，67Cu，67Ga，和68Ga，或其它特别适合用于体内、体外或原位诊断和成像的金属或金属阳离子，诸如(157Gd，55Mn，162Dy，52Cr，和56Fe))，以及发色团和酶(诸如苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、Δ-V-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-磷酸甘油脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、生物素-抗生物素蛋白过氧化酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-VI-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶)。其它适宜的标记为熟练的技术人员所清楚，并且例如包括可以应用NMR或ESR光谱检测的部分。
例如，这样标记的本发明的氨基酸序列、纳米抗体、化合物或多肽可以用于体外、体内或原位检测(包括本身已知的免疫检测，诸如ELISA，RIA，EIA和其它“夹心式检测”等)，以及体内诊断和成像目的，这取决于特定的标记的选择。
熟练的技术人员应该清楚，另一种修饰可以包括引入螯合基团，例如以螯合上文提到的金属或金属阳离子中的一种。例如，适当的螯合基团包括但不限于二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)。
还有另一种修饰可以包括引入作为特异性结合对诸如生物素-(链霉)抗生物素蛋白结合对的一部分的官能团。这样的官能团可以用来将本发明的氨基酸序列、纳米抗体、化合物或多肽与另一种蛋白、多肽或化学化合物结合，所述另一种蛋白、多肽或化学化合物与所述结合对的另一半结合，即，通过形成所述结合对。例如，本发明的氨基酸序列、纳米抗体、化合物或多肽可以缀合到生物素上，并且连接到与抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白缀合的另一种蛋白、多肽、化合物或载体上。例如，这样缀合的氨基酸序列、纳米抗体、化合物或多肽可以用作报道子，例如在产生可检测的信号的试剂与抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白缀合的诊断系统中用作报道子。例如，这种结合对还可以用来将本发明的氨基酸序列、纳米抗体、化合物或多肽与载体结合，所述载体包括适用于药物目的的载体。一个非限制性的实例是Cao和Suresh(2000，药物靶向杂志(JournalofDrugTargetting)，8(4)：257)所述的脂质体制剂。这种结合对还可以用来将治疗活性剂与本发明的氨基酸序列、纳米抗体、化合物或多肽结合。
熟练的技术人员应该清楚其它潜在的化学和酶促修饰。这种修饰还可以为研究目的引入(例如，为了研究功能-活性关系)。例如，参考Lundblad和Bradshaw(1997，生物技术和应用生物化学(Biotechnol.Appl.Biochem.)，26：143-151)。
优选地，所述衍生物是这样的，以致它们以如本发明所定义的亲和性(适当测量和/或表示为KD-值(实际的或表观的)，KA-值(实际的或表观的)，kon-速率和/或koff-速率，或备选地为IC50值，如本发明进一步所述)与IL-6受体上的特定表位结合。
特别地，本发明的这些衍生物优选这样，以致它们：
-以1nM至1pM摩尔/升以下，优选500pM至1pM摩尔/升以下，更优选100pM至1pM摩尔/升以下，或还更优选约50pM至1pM以下的解离常数(KD)结合hIL-6R；
和/或是这样的，以致它们：
-以1nM至1pM摩尔/升以下，优选500pM至1pM摩尔/升以下，更优选100pM至1pM摩尔/升以下，或还更优选约50pM至1pM以下的解离常数(KD)结合食蟹猴IL-6R；
和/或是这样的，以致它们：
-以104M-1s-1至约107M-1s-1，优选105M-1s-1至107M-1s-1，更优选约106M-1s-1以上的kon-速率结合hIL-6R；
和/或是这样的，以致它们：
-以104M-1s-1至约107M-1s-1，优选105M-1s-1至107M-1s-1，更优选约106M-1s-1以上的kon-速率结合食蟹猴IL-6R；
和/或是这样的，以致它们：
-以10-3s-1(t1/2＝0.69s)至10-6s-1(假定具有多天的t1/2的几乎不可逆的复合物)，优选10-4s-1至10-6s-1，更优选10-5s-1至10-6s-1，诸如约10-5s-1以下的koff速率结合hIL-6R；
和/或是这样的，以致它们：
-以10-3s-1(t1/2＝0.69s)至10-6s-1(假定具有多天的t1/2的几乎不可逆的复合物)，优选10-4s-1至10-6s-1，更优选10-5s-1至10-6s-1，诸如约10-5s-1以下的koff速率结合食蟹猴IL-6R。
如上文提及，本发明还涉及基本上由至少一个本发明的氨基酸序列、纳米抗体、化合物或多肽组成或包括至少一个本发明的氨基酸序列、纳米抗体、化合物或多肽。“基本上由……组成”意指本发明的蛋白质或多肽的氨基酸序列与本发明的氨基酸序列、纳米抗体、化合物或多肽完全相同，或者与本发明氨基酸序列、纳米抗体、化合物或多肽相对应，其将有限数目的氨基酸残基，诸如1-20个氨基酸残基，例如1-10个氨基酸残基并且优选地1-6个氨基酸残基，诸如1，2，3，4，5或6个氨基酸残基添加到所述氨基酸序列、纳米抗体、化合物或多肽的氨基末端、羧基末端或者氨基末端和羧基末端两端。
所述氨基酸残基可以变化或者可以不变化、改变或者另外影响本发明的所述氨基酸序列、纳米抗体、化合物或多肽的(生物学)特性，并且可以或者可以不为所述氨基酸序列、纳米抗体、化合物或多肽添加其它的官能性。例如，所述氨基酸残基：
a)可以包括N-端Met残基，例如，作为在异源宿主细胞或宿主生物体内表达的结果；
b)可以形成信号序列或前导序列，当合成时其引导所述氨基酸序列、纳米抗体、化合物或多肽从宿主细胞中分泌。适宜的分泌性前导肽应该是熟练的技术人员所清楚的，并且可以是本文进一步所述的。通常，这样的前导序列与所述氨基酸序列、纳米抗体、化合物或多肽的N端连接，尽管本发明在其最广泛意义上不限于此；
c)可以形成这样的序列或信号，即，所述序列或信号允许所述氨基酸序列、纳米抗体、化合物或多肽导向和/或透过或进入特异性的器官、组织、细胞、或者细胞的部分或区室，和/或所述序列或信号允许所述氨基酸序列、纳米抗体、化合物或多肽透过或穿过生物屏障诸如细胞膜、细胞层诸如上皮细胞层、肿瘤包括实体瘤、或血脑屏障。所述氨基酸序列的实例对于熟练的技术人员是清楚的。一些非限制性的实例是在WO03/026700和Temsamani等，生物学治疗的专家观点(ExpertOpin.Biol.Ther.)，1，773(2001)；Temsamani和Vidal，今日药物发现(DrugDiscov.Today)，9，1012(004)以及Rousselle，药理学和实验治疗学杂志(J.Pharmacol.Exp.Ther.)，296，124-131(2001)中所述的小肽载体(“Pep-trans载体”)，和由Zhao等，程序性细胞死亡(Apoptosis)，8，631-637(2003)所述的膜易位体序列。例如，用于抗体片段细胞内靶向的C端和N端氨基酸序列由Cardinale等，方法(Methods)，34，171(2004)所述。关于细胞内靶向的其它适宜的技术包括所谓的“细胞内抗体(intrabody)”的表达和/或应用，所述“细胞内抗体”包括本发明的氨基酸序列、纳米抗体、化合物或多肽，如下文所提及；
d)可以形成“标记”，例如允许或促进所述氨基酸序列、纳米抗体、化合物或多肽的纯化的氨基酸序列或残基，例如使用针对所述序列或残基的亲和技术进行纯化。然后，所述序列或残基可以被去除(例如，通过化学或酶促裂解)，以提供氨基酸序列、纳米抗体、化合物或多肽(为了这一目的，所述标记可以任选地通过可裂解的接头序列与所述氨基酸序列、纳米抗体、化合物或多肽序列连接或包含可裂解的基序)。这种残基的一些优选的但非限制性的实例是多组氨酸残基、谷胱甘肽(glutatione)残基以及myc-标记诸如AAAEQKLISEEDLNGAA(SEQIDNO：100)；
e)可以是已经被官能化和/或可以作为官能团附着的位点的一个或多个氨基酸残基。适宜的氨基酸残基和官能团应该是熟练的技术人员所清楚的，并且包括但不限于，本文关于本发明的氨基酸序列、纳米抗体、化合物或多肽的衍生物提及的氨基酸残基和官能团。
本发明的氨基酸序列、纳米抗体、多肽和核酸可以以本身已知的方式制备，熟练的技术人员应该从本文的进一步描述中而清楚。例如，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽可以以本身已知用于制备抗体且特别是用于制备抗体片段(包括但不限于(单)结构域抗体和ScFv片段)的任何方式制备。制备所述氨基酸序列、纳米抗体、多肽和核酸的一些优选但非限制性的方法包括本发明所述的方法和技术。
熟练的技术人员应该清楚，用于制备本发明的氨基酸序列、纳米抗体和/或多肽的一种特别有用的方法通常包括下列步骤：
-在适宜的宿主细胞或宿主生物体(本文还叫作“本发明的宿主”)中或在另一种适宜的表达系统中，表达编码所述本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽的核酸(本文还叫作“本发明的核酸”)，任选地接着进行：
-分离和/或纯化这样获得的本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽。特别地，这样的方法可以包括下列步骤：
-在某种条件下培养和/或维持本发明的宿主，所述条件是这样的，以致所述本发明的宿主表达和/或生产至少一种本发明的氨基酸序列、纳米抗体和/或多肽；任选地接着进行：
-分离和/或纯化这样获得的本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽。
因此，本发明还涉及编码本发明的氨基酸序列、纳米抗体、多肽或单价构建体的核酸或核苷酸序列(在本文中还称为“本发明的核酸”或“本发明的核苷酸序列”)。本发明的核酸可以是单链或双链DNA或RNA的形式，并且优选地是双链DNA形式。例如，本发明的核苷酸序列可以是基因组DNA、cDNA或合成的DNA(诸如具有特别适用于在要用的宿主细胞或宿主生物体中表达的密码子应用的DNA)。
按照本发明的一个实施方案，本发明的核酸是基本上分离的形式，如本发明所定义。本发明的核酸还可以是这样的形式，存在于和/或是载体的一部分，诸如例如质粒、黏端质粒或YAC，其也可以是基本上分离的形式。
基于关于本文给出的本发明的氨基酸序列、纳米抗体和/或多肽的信息，本发明的核酸可以以本身已知的方法制备或获得，和/或可以从适当的天然来源分离。并且，熟练的技术人员应该清楚，为了制备本发明的核酸，还有一些核苷酸序列，诸如至少一种编码氨基酸序列或纳米抗体的核苷酸序列，以及例如编码一种或多种接头的核酸，还可以以适当的方法连接在一起。
用于产生本发明的核酸的技术应该是熟练的技术人员所清楚的，并且例如可以包括但不限于，自动DNA合成；位点定向诱变；将两个或多个天然存在的和/和合成的序列(或者其两个或更多个部分)结合，引入引起剪截表达产物表达的突变；引入一个或多个限制性位点(例如，以产生可以使用适宜的限制性酶容易地消化和/或连接的盒和/或区)，和/或通过PCR反应的方法引入突变，所述PCR反应使用一个或多个“错配”引物。这些以及其它技术应该是熟练的技术人员所清楚的，并且参考也参见上文提及的标准手册，诸如Sambrook等和Ausubel等，以及下文的实施例。
本发明的核酸还可以是这样的形式，存在于和/或是遗传构建体的一部分，这对于本领域的技术人员应该是清楚的。这样的遗传构建体通常包括至少一种本发明的核酸，其任选地与本身已知的一个或多个遗传构建体元件连接，诸如例如一个或多个适宜的调节元件(诸如适当的启动子、增强子、终止子、等等)和本文提到的其它遗传构建体元件。包括至少一种本发明的核酸的所述遗传构建体在本文也叫作“本发明的遗传构建体”。
本发明的遗传构建体可以是DNA或RNA，并且优选地是双链DNA。本发明的遗传构建体还可以是适于要用的宿主细胞或宿主生物体的转化的形式，适于结合到要用的宿主细胞的基因组DNA中的形式，或者适于在要用的宿主生物体中独立复制、维持和/或遗传的形式。例如，本发明的遗传构建体可以是载体形式，诸如例如质粒、黏端质粒、YAC、病毒载体或转座子。特别地，所述载体可以是表达载体，即，可以提供体外和/或体内表达的载体(例如，在适宜的宿主细胞、宿主生物体和/或表达系统中)。
在一个优选的但非限制性的实施方案中，本发明的遗传构建体包括
a)至少一种本发明的核酸；其可操作性地连接
b)一个或多个调节元件，诸如启动子和任选地适宜的终止子：
并且任选地还有
c)本身已知的一个或多个其它遗传构建体元件；
其中术语“调节元件”、“启动子”、“终止子”和“可操作性地连接”具有它们在本领域中的通用意思(如本发明进一步所述)；并且其中存在于遗传构建体中的所述“其它元件”，例如，可以是3’-或5’-UTR序列、前导序列、选择标记、表达标记/报道子基因、和/或可以促进或增加转化或整合(效率)的元件。用于所述遗传构建体的这些和其它适宜的元件对于熟练的技术人员应该是清楚的，并且例如可能取决于所用的构建体、要用的宿主细胞或宿主生物体的类型；本发明的目的核苷酸序列在其中表达的方式(例如，通过组成型的、瞬时的或可诱导的表达)；和/或要用的转化技术。例如，本身已知用于抗体和抗体片段(包括但不限于(单)结构域抗体和ScFv片段)表达和生产的调节序列、启动子和终止子可以以基本上相似的方式使用。
优选地，在本发明的遗传构建体中，所述至少一种本发明的核酸和所述调节元件，以及任选地所述一个或多个其它元件，彼此“可操作性地连接”，这通常意指它们彼此是功能性关系。例如，如果所述启动子能够起始或者另外控制/调节编码序列的转录和/或表达，那么启动子被视为与编码序列“可操作性地连接”(其中所述编码序列应该理解为“受控于”所述启动子)。一般地，当两个核苷酸序列可操作性地连接时，它们应该在相同的方向，并且通常还在同一阅读框中。它们通常还应该基本上邻接，尽管这也可以不是必需的。
优选地，本发明的遗传构建体的调节以及其它元件是这样的，即，它们能够在要用的宿主细胞或宿主生物体内提供它们需要的生物学功能。
例如，在要用的宿主细胞或宿主生物体中，启动子、增强子或终止子应该是“可操作的”，这意味着(例如)所述启动子应该能够起始或者另外控制/调节与其可操作性地连接(如本文所定义)的核苷酸序列——例如，编码序列——的转录和/或表达。
一些特别优选的启动子包括但不限于，本身已知用于在本发明提及的宿主细胞中表达的启动子；并且特别是用于在细菌细胞中表达的启动子，诸如本文提及的那些和/或在实施例中所用的那些。
选择标记应该是这样的，即，其允许——即，在适当的选择条件下——已经(成功地)转化了本发明的核苷酸序列的宿主细胞和/或宿主生物体与没有(成功地)转化的宿主细胞/生物体区分开来。所述标记的一些优选的但非限制性的实例是提供针对抗生素(诸如卡那霉素或氨苄青霉素)的抗性的基因，提供温度耐受性的基因，或者在培养基中不存在某些因子、化合物和/或(食物)成分时允许所述宿主细胞或宿主生物体维持的基因，所述因子、化合物和/或(食物)成分是未转化的细胞或生物体生存所必需的。
前导序列应该是这样的，以致——在要用的宿主细胞或宿主生物体中——其允许理想的翻译后修饰和/或以致其将转录的mRNA导向细胞的理想部分或细胞器。前导序列还可以允许从所述细胞分泌表达产物。同样地，前导序列可以是在所述宿主细胞或宿主生物体中可操作的任何原-(pro-)、前-(pre-)或前原-(prepro-)序列。对于在细菌细胞中表达，前导序列可以不是必需的。例如，本身已知用于抗体和抗体片段(包括但不限于单结构域抗体和ScFv片段)表达和生产的前导序列可以以基本上相似的方式使用。
表达标记或报道子基因应该是这样的，即，——在宿主细胞或宿主生物体中——其允许检测所述遗传构建体(其上存在的基因或核苷酸序列)的表达。表达标记任选地还可以允许表达产物的定位，例如，定位在细胞的特定部分或细胞器中和/或在多细胞生物体的特定细胞、组织、器官或部分中。所述报道子基因还可以表达为与本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽融合的蛋白融合体。一些优选的但非限制性的实例包括荧光蛋白如GFP。
适宜的启动子、终止子和其它元件的一些优选的但非限制性的实例包括可以用于在本发明提及的宿主细胞中表达的那些；并且特别是适用于在细菌细胞中表达的那些，诸如本发明提及的那些和/或在下述实施例中所用的那些。关于可以存在于/用于本发明的遗传构建体的启动子、选择标记、前导序列、表达标记和其它元件的一些(其它)非限制性的实例——诸如终止子、转录和/或翻译增强子和/或结合因子——参考上文提及的通用手册，诸如Sambrook等和Ausubel等，以及WO95/07463，WO96/23810，WO95/07463，WO95/21191，WO97/11094，WO97/42320，WO98/06737，WO98/21355，US7,207,410，US5,693,492和EP1085089中给出的实例。其它实例对于熟练的技术人员应该是清楚的。参考也参见上文引用的公知背景技术和本文引用的其它参考文献。
本发明的遗传构建体通常可以通过将本发明的核苷酸序列与上文所述的一个或多个其它元件适当地连接而提供，例如应用上文提及的通用手册诸如Sambrook等和Ausubel等中所述的技术。
通常，本发明的遗传构建体通过将本发明的核苷酸序列插入到本身已知的适当的(表达)载体中而获得。适当的表达载体的一些优选的但非限制性的实例是下述实施例中所用的那些，以及本文提及的那些。
本发明的核酸和/或本发明的遗传构建体可以用于转化宿主细胞或宿主生物体，即，用于表达和/或生产本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽。适当的宿主或宿主细胞是熟练的技术人员所清楚的，并且例如可以是任何适当的真菌的、原核的或真核的细胞或细胞系，或者任何适当的真菌的、原核的或真核的生物体，例如：
-细菌菌株，其包括但不限于革兰氏-阴性菌株，诸如大肠杆菌(Escherichiacoli)菌株；变形菌属(Proteus)菌株，例如奇异变形菌(Proteusmirabilis)菌株；假单胞菌属(Pseudomonas)菌株，例如荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)菌株；以及革兰氏-阳性菌株，诸如芽孢杆菌属(Bacillus)菌株，例如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)菌株或短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)菌株；链霉菌属(Streptomyces)菌株，例如浅青紫链霉菌(Streptomyceslividans)菌株；葡萄球菌属(Staphylococcus)菌株，例如肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)菌株；以及乳球菌属(Lactococcus)菌株，例如乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)菌株；
-真菌细胞，其包括但不限于来自下列各项物种的细胞：木霉属(Trichoderma)，例如Trichodermareesei的物种；脉孢菌属(Neurospora)，例如粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)；粪壳属(Sordaria)，例如大孢粪壳(Sordariamacrospora)；曲霉菌(Aspergillus)，例如黑曲霉(Aspergillusniger)或酱油曲霉(Aspergillussojae)；或其它丝状真菌；
-酵母细胞，其包括但不限于来自下列各项物种的细胞：酵母属(Saccharomyces)，例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)；裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)；毕赤酵母属(Pichia)，例如巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)或Pichiamethanolica；汉逊酵母属(Hansenula)，例如多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，例如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)；Arxula，例如Arxulaadeninivorans；Yarrowia，例如Yarrowialipolytica；
-两栖类细胞或细胞系，诸如爪蟾卵母细胞(Xenopusoocytes)；
-来源于昆虫的细胞或细胞系，诸如衍生于鳞翅目(lepidoptera)的细胞/细胞系，包括但不限于贪夜蛾(Spodoptera)SF9和Sf21细胞，或者衍生于果蝇属(Drosophila)的细胞/细胞系，诸如Schneider和Kc细胞；
-植物或植物细胞，例如在烟草(tobacco)植物中；和/或
-哺乳动物细胞或细胞系，例如来源于人的细胞或细胞系、来源于哺乳动物的细胞或细胞系，包括但不限于CHO-细胞、BHK-细胞(例如BHK-21细胞)，以及人细胞或细胞系，诸如HeLa，COS(例如COS-7)和PER.C6细胞；
以及本身已知的用于表达和生产抗体及抗体片段(包括但不限于(单)结构域抗体和ScFv片段)的所有其它宿主或宿主细胞，这对于熟练的技术人员应该是清楚的。参考还参见上文引用的公知背景技术，以及例如WO94/29457；WO96/34103；WO99/42077；Frenken等(1998，免疫学研究(Res.Immunol.)149(6)：589-99)；Riechmann和Muyldermans(1999，免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods，)231(1-2)：25-38)，vanderLinden(2000，生物技术杂志(J.Biotechnol.)80(3)：261-70)，Joosten等(2003，Microb.CellFact.2(1)：1)，Joosten等(2005，应用微生物生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)66(4)：384-92.)；以及本文所引用的其它参考文献。
本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽还可以被引入多细胞生物体的一个或多个细胞、组织或器官中并且在其中表达，例如用于预防和/或治疗目的(例如，作为基因治疗)。为了这一目的，可以将本发明的核苷酸序列以任何适当的方式引入到细胞或组织中，例如照此(例如使用脂质体)或者在它们插入到适当的基因治疗载体(例如，衍生于反转录病毒诸如腺病毒，或者细小病毒诸如腺伴随病毒)中之后。同样对于熟练的技术人员应该是清楚的，这样的基因治疗可以在体内进行和/或在患者体内原位进行，其通过给患者或患者的特定细胞或特定组织或器官施用本发明的核酸或者编码其的适当的基因治疗载体而进行；或者适宜的细胞(通常取自要治疗的患者的身体，诸如移植的淋巴细胞、骨髓吸出物或活组织切片)可以用本发明的核苷酸序列在体外进行处理，然后适当地(重新)引入回到所述患者的身体内。所有这些可以使用熟练的技术人员公知的基因治疗载体、技术和递送系统进行，例如，在下列各项中所述：CulverK.W.(1994，“基因治疗(GeneTherapy)”，p.xii，MaryAnnLiebert，公司，出版，纽约，N.Y)，Giordano(1996，自然F医学(NatureFMedicine)2：534-539)，Schaper(1996，循环研究(Circ.Res)79：911-919)，Anderson(1992，科学(Science)256：808-813)，Verma(1994，自然(Nature)389：239)；Isner(1996，柳叶刀(Lancet)348：370-374)，Muhlhauser(1995，循环研究(Circ.Res.)77：1077-1086)；Onodera(1998，血液学(Blood)9l：30-36)；Verma(1998，基因治疗(GeneTher.)5：692-699)；Nabel(1997，纽约科学院年刊(Ann.N.YAcad.Sci.)，811：289-292)，Verzeletti(1998，人类基因治疗(Hum.GeneTher.)9：2243-51)；Wang1996，自然医学(NatureMedicine)2：714-716)，WO94/29469，WO97/00957，US5,580,859，或Schaper(1996，现代生物技术观点(CurrentOpinioninBiotechnology)7：635-640)。例如，在本领域中已描述ScFv片段(Afanasieva等(2003，基因治疗(GeneTher.)，10：1850-1859)和双抗体(Blanco等，2003，免疫学杂志(J.Immunol.)，171：1070-1077)的原位表达。
对于氨基酸序列、纳米抗体或多肽在细胞中的表达，它们还可以作为所谓的“细胞内抗体”表达，例如在WO94/02610，WO95/22618，US7,004,940，WO03/014960中所述；在Cattaneo，A.和BioccaS.(1997，细胞内抗体：开发和应用(IntracellularAntibodies：DevelopmentandApplications).Landes和Springer-Verlag)和在Kontermann(2004，方法(Methods)34：163-170)中所述。
例如，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽还可以在转基因哺乳动物的乳中产生，例如在兔、母牛、山羊或绵羊的乳中(对于将转基因引入哺乳动物的通用技术参见例如US6,741,957，US6,304,489和US6,849,992)，在植物中或植物的部分中产生，所述植物部分包括但不限于它们的叶、花、果实、种子、根或turbers(例如在烟草、玉米、大豆或苜蓿中)中，或者例如在蚕家蚕(Bombixmori)的蛹中。
此外，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽还可以在不含细胞的表达系统中表达和/或生产，并且这样的系统的适当的实例应该是熟练的技术人员所清楚的。一些优选的但非限制性的实例包括在麦芽胚系统中的表达；在兔网织红细胞裂解物中表达；或者在大肠杆菌(E.coli)Zubay系统中表达。
如上文提及，应用纳米抗体的一个优点在于，基于此的多肽可以通过在适宜的细菌系统中表达而制备，并且适宜的细菌表达系统、载体、宿主细胞、调节元件等对熟练的技术人员是清楚的，例如参考上文引用的参考文献。然而，应该注意，本发明在其最广泛意义上并不限于在细菌系统中表达。
优选地，在本发明中，应用(体内或体外)表达系统，诸如细菌表达系统，其以适于药用的形式提供本发明的多肽，并且所述表达系统也是熟练的技术人员所清楚的。熟练的技术人员还应该清楚，适于药用的本发明的多肽可以使用肽合成技术制备。
对于工业规模的生产，用于纳米抗体或包含纳米抗体的蛋白治疗物的(工业)生产的优选的异源宿主包括大肠杆菌、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、酿酒酵母(S.cerevisiae)的菌株，其适用于大规模表达/生产/发酵，并且特别适用于大规模药物表达/生产/发酵。所述菌株的适当的实例是熟练的技术人员所清楚的。所述菌株以及生产/表达系统也可从公司诸如Biovitrum(Uppsala，瑞典)获得。
备选地，哺乳动物细胞系，特别是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，可以用于大规模表达/生产/发酵，并且特别用于大规模药物表达/生产/发酵。并且，所述表达/生产系统也可从上文提及的一些公司获得。
具体的表达系统的选择部分取决于特定的翻译后修饰的需要，更具体地是糖基化的需要。生产包含纳米抗体的重组蛋白，对于所述重组蛋白糖基化是理想的或者必需的，将使得应用具有将所表达的蛋白糖基化的能力的哺乳动物表达宿主成为必要。在这一方面，熟练的技术人员应该清楚，获得的糖基化模式(即，附着的残基的种类、数量和位置)将取决于表达所用的细胞或细胞系。优选地，使用人细胞或细胞系(即，形成基本上具有人糖基化模式的蛋白)，或者使用另一种哺乳动物细胞系，其可以提供基本上和/或功能上与人糖基化作用相同的糖基化模式或者至少模拟人糖基化作用。一般地，原核宿主诸如大肠杆菌不具有将蛋白糖基化的能力，并且应用更低等真核细胞诸如酵母通常导致与人糖基化作用不同的糖基化模式。不过，应该理解，所有前述宿主细胞和表达系统可以用于本发明，这取决于要获得的理想的氨基酸序列、纳米抗体或多肽。
因此，按照本发明的一个非限制性实施方案，本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽被糖基化。按照本发明的另一个非限制性实施方案，本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽未被糖基化。
按照本发明的一个优选的但非限制性的实施方案，本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽在细菌细胞中生产，特别是在适于大规模药物生产的细菌细胞，诸如上文提及的菌株的细胞中生产。
按照本发明另一个优选的但非限制性的实施方案，本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽在酵母细胞中生产，特别是在适于大规模药物生产的酵母细胞，诸如上文提及的物种的细胞中生产。
按照本发明另一个优选的但非限制性的实施方案，本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽在哺乳动物细胞中生产，特别是在人细胞或人细胞系的细胞中，并且更特别是在适于大规模药物生产的人细胞或人细胞系的细胞中，诸如上文提及的细胞系中生产。
当应用在宿主细胞中的表达来生产本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽时，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽可以在细胞内产生(例如，在细胞溶质中，在外周胞质或在内含体中)，然后从宿主细胞分离，并且任选地进一步纯化；或者可以在细胞外产生(例如，在培养所述宿主细胞的培养基中)，然后从培养基分离，并且任选地进一步纯化。当使用真核宿主细胞时，由于极大地促进进一步的分离以及获得的氨基酸序列，纳米抗体，多肽和蛋白的下游处理，所以通常优选细胞外生产。除了少数种类的蛋白诸如毒素和溶血素之外，细菌细胞诸如上文提及的大肠杆菌的菌株一般不向细胞外分泌蛋白，并且在大肠杆菌内的分泌生产是指蛋白穿过内膜易位到外周胞质空间。外周胞质生产相对于细胞溶质生产提供一些优点。例如，在通过特异的信号肽酶将分泌信号序列裂解之后，所分泌的产物的N-端氨基酸序列可以与天然基因产物相同。此外，在外周胞质中比在细胞质中似乎存在少得多的蛋白酶活性。另外，由于在外周胞质中更少的污染蛋白，所以蛋白纯化更简单。另一个优点是，由于外周胞质提供比细胞质更加氧化性的环境，所以可以形成正确的二硫键。在大肠杆菌中过量表达的蛋白通常在不溶的聚集体，即所谓的内含体中发现。这些内含体可以位于细胞溶质中或在外周胞质中；从这些内含体回收生物活性蛋白需要变性/重折叠步骤。许多重组蛋白，包括治疗性蛋白，是从内含体回收的。备选地，熟练的技术人员应该清楚，可以使用细菌的重组菌株，其已被遗传修饰，以分泌理想的蛋白，并且特别是本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽。
因此，按照本发明的一个非限制性实施方案，本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽是在细胞内产生并且从宿主细胞分离，并且特别是从细菌细胞或者从细菌细胞中的内含体中分离的氨基酸序列、纳米抗体或多肽。按照本发明的另一个非限制性的实施方案，本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽是在细胞外产生并且从培养宿主细胞的培养基中分离的氨基酸序列、纳米抗体或多肽。
与这些宿主细胞一起使用的一些优选的但非限制性的启动子包括，
-用于在大肠杆菌中表达：lac启动子(及其衍生物，诸如lacUV5启动子)；阿拉伯糖启动子；噬菌体λ的左向-(PL)和右向(PR)启动子；trp操纵子的启动子；杂合lac/trp启动子(tac和trc)；T7-启动子(更具体地是T7-噬菌体基因10的启动子)以及其它T-噬菌体启动子；Tn10四环素抗性基因的启动子；上述启动子的工程变体，其包括一个或多个拷贝的外来调节操纵基因序列；
-用于在酿酒酵母中表达：组成型：ADH1(醇脱氢酶1)，ENO(烯醇化酶)，CYC1(异-1细胞色素c)，GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)；PGK1(磷酸甘油酸激酶)，PYK1(丙酮酸激酶)；调节型：GAL1，10，7(半乳糖代谢酶)，ADH2(醇脱氢酶2)，PHO5(酸性磷酸酶)，CUP1(铜金属硫蛋白)；异源型：CaMV(花椰菜花叶病毒35S启动子)；
-用于在毕赤酵母(Pichiapastoris)中表达：AOX1启动子(醇氧化酶I)；
-用于在哺乳动物细胞中表达：人巨细胞病毒(hCMV)即时早期增强子/启动子；人巨细胞病毒(hCMV)即时早期启动子变体，其包含两个四环素操纵基因序列，以致所述启动子可以受Tet抑制基因调节；单纯疱疹病毒胸苷激酶(TK)启动子；劳斯肉瘤病毒长末端重复(RSVLTR)增强子/启动子；来自于人、黑猩猩、小鼠或大鼠的延伸因子1α(hEF-1α)启动子；SV40早期启动子；HIV-1长末端重复启动子；β-肌动蛋白启动子；
与这些宿主细胞一起使用的一些优选的但非限制性的载体包括：
-用于在哺乳动物细胞中表达的载体：pMAMneo(Clontech)，pcDNA3(Invitrogen)，pMC1neo(Stratagene)，pSG5(Stratagene)，EBO-pSV2-neo(ATCC37593)，pBPV-1(8-2)(ATCC37110)，pdBPV-MMTneo(342-12)(ATCC37224)，pRSVgpt(ATCC37199)，pRSVneo(ATCC37198)，pSV2-dhfr(ATCC37146)，pUCTag(ATCC37460)和1ZD35(ATCC37565)，以及基于病毒的表达系统，诸如基于腺病毒的那些；
-用于在细菌细胞中表达的载体：pET载体(Novagen)和pQE载体(Qiagen)；
-用于在酵母或其它真菌细胞中表达的载体：pYES2(Invitrogen)和毕赤表达载体(Invitrogen)；
-用于在昆虫细胞中表达的载体：pBlueBacII(Invitrogen)和其它杆状病毒载体；
-用于在植物或植物细胞中表达的载体：例如基于花椰菜花叶病毒或烟草花叶病毒的载体，适宜的农杆菌(Agrobacterium)菌株，或基于Ti-质粒的载体。
与这些宿主细胞一起使用的一些优选的但非限制性的分泌序列包括：
-用于细菌细胞诸如大肠杆菌：PelB，Bla，OmpA，OmpC，OmpF，OmpT，StII，PhoA，PhoE，MalE，Lpp，LamB等；TAT信号肽，溶血素C-端分泌信号；
-用于酵母：α-交配因子前原-序列(α-matingfactorprepro-sequence)，磷酸酶(phol)，转化酶(Suc)，等；
-用于哺乳动物细胞：在靶点蛋白是真核起源的情形中固有的信号(indigenoussignal)；鼠Igκ-链V-J2-C信号肽；等。
用于转化本发明的宿主或宿主细胞的适宜的技术对熟练的技术人员是清楚的，并且可以取决于要用的宿主细胞/宿主生物体和要用的遗传构建体。参考也参见上文提及的手册和专利申请。
转化后，可以进行检测并且选择已经成功转化了本发明的核苷酸序列/遗传构建体的那些宿主细胞或宿主生物体的步骤。例如，这可以是基于存在于本发明的遗传构建体中的选择标记的选择步骤，或者是包括检测本发明的氨基酸序列的步骤，例如，使用特异的抗体进行。
转化的宿主细胞(其可以是稳定的细胞系的形式)或宿主生物体(其可以是稳定的突变系或株系的形式)形成本发明的另一方面。
优选地，这些宿主细胞或宿主生物体是这样的，以致它们表达或者(至少)能够表达(例如，在适宜的条件下)本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽(并且在宿主生物体的情形中：在它的至少一种细胞、部分、组织或器官中)。本发明还包括本发明的宿主细胞或宿主生物体的其它世代、后代和/或子代，例如，其可以通过细胞分裂或者通过有性或无性生殖获得。
为了生产/获得本发明的氨基酸序列的表达，所述转化的宿主细胞或转化的宿主生物体通常可以在本发明(理想的)氨基酸序列、纳米抗体或多肽得到表达/生产的条件下保持、维持和/或培养。适宜的条件对熟练的技术人员是清楚的，并且通常取决于所用的宿主细胞/宿主生物体，以及取决于控制本发明的(相关)核苷酸序列表达的调节元件。此外，参考参见在上文关于本发明的遗传构建体段落中提及的手册和专利申请。
一般地，适宜的条件可以包括使用适宜的培养基，存在适宜的食物来源和/或适宜的营养素，使用适当的温度，并且任选地存在适当的诱导因子或化合物(例如，在本发明的核苷酸序列在可诱导启动子的控制下的情形中)；所有这些可以由熟练的技术人员选择。此外，在这样的条件下，本发明的氨基酸序列可以以组成型方式、以瞬时方式、或者只在适当地诱导时表达。
熟练的技术人员还应该清楚，本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽可以(首先)以不成熟的形式(如上文提及)产生，其然后可以进行翻译后修饰，这取决于所用的宿主细胞/宿主生物体。并且，本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽可以被糖基化，这也取决于所用的宿主细胞/宿主生物体。
然后，本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽可以从宿主细胞/宿主生物体和/或从培养所述宿主细胞或宿主生物体的培养基中分离，这使用本身已知的蛋白分离和/或纯化技术，诸如(制备级)层析和/或电泳技术、差别沉淀技术、亲和技术(例如，使用与本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽融合的特异性的、可裂解的氨基酸序列)和/或制备级免疫学技术(即，使用针对要被分离的氨基酸序列的抗体)进行。
通常，对于药物应用，本发明的多肽可以配制成药物制剂或组合物，其包括至少一种本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽和至少一种药用载体、稀释剂或赋形剂和/或辅药，并且任选地一种或多种其它药物活性多肽和/或化合物。通过非限制性实例的方式，这样的制剂可以是适于下列各项的形式：口服给药，肠胃外给药(诸如通过静脉内、肌内或皮下注射或静脉内输注)，局部给药，通过吸入、皮肤贴片、植入物、栓剂给药，等等。所述适宜的给药形式——其可以是固体、半固体或液体，取决于给药的方式——以及制备其所用的方法和载体，对熟练的技术人员是清楚的，并且在本文中进一步描述。
因此，在另一个方面中，本发明涉及一种药物组合物，其包含至少一种本发明的氨基酸，至少一种本发明的纳米抗体或至少一种本发明的多肽，以及至少一种适当的载体、稀释剂或赋形剂(即，适于药用)，以及任选地一种或多种其它活性物质。在一个具体方面，本发明涉及药物组合物，其包含SEQIDNO：70和至少一种适当的载体、稀释剂或赋形剂(即，适合于药用)，和任选地一种或多种其它活性物质。在另一个具体方面，本发明涉及药物组合物，其包含SEQIDNO：71和至少一种适当的载体、稀释剂或赋形剂(即，适合于药用)，和任选地一种或多种其它活性物质。
通常，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽可以以本身已知的任何适当的方法配制和施用，例如，关于其的参考文献参见上文引用的公知背景技术(并且特别参见WO04/041862，WO04/041863，WO04/041865和WO04/041867)，以及参见标准手册，诸如雷明顿药物科学(Remington’sPharmaceuticalSciences)，第18版，Mack出版公司，美国(1990)或雷明顿，制药科学和实践(Remington，theScienceandPracticeofPharmacy)，第21版，LippincottWilliams和Wilkins(2005)。
例如，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽可以本身已知的用于常规抗体及抗体片段(包括ScFv’s和双抗体)和其它药物活性蛋白的任何方法配制和施用。所述制剂以及制备其的方法对于熟练的技术人员是清楚的，并且例如，包括适于肠胃外给药(例如静脉内、腹膜内、皮下、肌内、腔内、动脉内或鞘内给药)或适于局部(及透皮的或皮内)给药的制剂。
例如，用于肠胃外给药的制剂可以是适于输注或注射的无菌溶液、混悬液、分散液或乳剂。例如，用于所述制剂的适宜的载体或稀释剂包括但不限于，无菌水以及水性缓冲液和溶液，诸如生理磷酸盐缓冲液、林格溶液、葡萄糖溶液、和Hank′s溶液；水油(wateroils)；甘油；乙醇；二醇诸如丙二醇，或者以及矿物油，动物油和植物油例如花生油、豆油，及它们的适宜的混合物。通常优选水性溶液或混悬液。
本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽还可以使用递送的基因治疗方法进行施用。参见，例如，U.S.5,399,346，其完全结合作为参考。使用递送的基因治疗方法，转染了编码本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽的基因的原代细胞另外可以用组织特异性启动子转染，以靶向特异的器官、组织、移植物、肿瘤或细胞，并且另外可以使用用于亚细胞定位表达的信号和稳定序列进行转染。
因此，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽可以全身施用，例如，口服地，与药用赋形剂诸如惰性稀释剂或可同化的食用载体结合。它们可以包封在硬壳或软壳的明胶胶囊中，可以压缩成片剂，或者可以直接与患者日常饮食的食物结合。对于口服治疗性施用，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽可以与一种或多种赋形剂结合，并且以可吸收的片剂、口腔片剂、药片、胶囊、酏剂、混悬剂、糖浆、糯米纸囊剂等形式使用。所述组合物和制剂应该包含至少0.1％的本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽。当然，它们在所述组合物和制剂中的百分数可以变化，并且可以便利地在所给单位剂型重量的约2-约60重量％之间。本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽在这样的治疗有效组合物中的量是这样的，以致获得有效的剂量水平。
所述片剂、药片、丸剂、胶囊等还可以包含下列各项：粘合剂，诸如黄蓍胶、阿拉伯树胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，诸如磷酸二钙；崩解剂，诸如玉米淀粉、马铃薯淀粉、褐藻酸等；润滑剂，诸如硬脂酸镁；并且可以加入甜味剂，诸如蔗糖、果糖、乳糖或阿司帕坦，或者调味剂，诸如薄荷、冬青油、或樱桃调味剂。当单位剂型是胶囊时，除上述类型的物质之外，它还可以包含液体载体，诸如植物油或聚乙二醇。各种其它物质可以作为涂层存在，或者另外修饰所述固体单位剂型的物理形式。例如，片剂、丸剂、或胶囊可以用明胶、蜡、紫胶或糖等包被。糖浆或酏剂可以包含本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽，作为甜味剂的蔗糖或果糖，作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯类，染料和调味剂诸如樱桃或橙味调味剂。当然，在制备任何单位剂型中所用的任何物质都应该是药物可接受的，并且在所用的量上基本上无毒。另外，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽可以结合在缓释制剂和装置中。
用于口服给药的制备物和制剂还可以被提供以肠衣，所述肠衣允许本发明的构建体抵抗胃环境，并且进入肠内。更一般地，用于口服给药的制备物和制剂可以适当地配制成用于递送到胃肠道的任何理想的部分。另外，适宜的栓剂可以用于递送到胃肠道内。
本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽还可以通过输注或注射进行静脉内或腹膜内施用。本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽或者它们的盐的溶液可以在水中制备，任选地与无毒表面活性剂混合。分散剂还可以在甘油、液体聚乙二醇、三醋精及其混合物中以及在油中制备。在普通的保存和使用条件下，这些制剂包含防腐剂以防止微生物的生长。
适于注射或输注的药物剂型可以包括无菌的水溶液或分散液或者包含活性成分的无菌粉剂，其适合即时制备无菌注射或输注溶液或分散液，任选地包封在脂质体中。在所有情形中，在制备和保存条件下，最终剂型必须是无菌的、流动的和稳定的。液体载体或赋形剂可以是溶剂或液体分散介质，例如，其包括水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、植物油、无毒甘油酯及其适当的混合物。可以保持适当的流动性，例如，通过形成脂质体，在分散剂的情形中通过保持需要的颗粒大小或者通过使用表面活性剂。防止微生物作用可以通过各种抗细菌和抗真菌试剂获得，例如，对羟基苯甲酸酯类、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞(thimerosal)等。在许多情形中，优选地包括等渗剂，例如，糖、缓冲剂或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在所述组合物中使用延迟吸收剂例如单硬脂酸铝和明胶而获得。
无菌注射溶液通过将需要量的本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽结合在适当的溶剂中，当需要时，与上文列举的各种其它成分一起结合，然后进行过滤除菌而制备。在用无菌粉剂制备无菌注射溶液的情形中，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分加上在先前的无菌过滤溶液中存在的任何其它理想的成分的粉剂。
对于局部给药，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽可以以纯的形式应用，即，在它们是液体的情形中。然而，通常理想地将它们作为与皮肤病学可接受的载体结合的组合物或制剂施用到皮肤上，所述载体可以是固体或液体。
有用的固体载体包括细碎分裂的固体，诸如滑石、粘土、微晶纤维素、硅石、矾土等。有用的液体载体包括水、羟烷类或二醇类或水-醇/二醇掺合剂，其中本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽可以以有效水平溶解或分散，任选地在无毒表面活性剂的帮助下。可以添加辅药诸如香味剂和其它抗微生物剂，以将给定用途的特性最优化。得到的液体组合物可以通过吸收衬垫应用，用于浸渍的绷带及其它敷料，或者使用泵型或气溶胶喷雾器喷到感染区域。
增稠剂诸如合成的聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐及酯、脂肪醇、改性纤维素或改性的矿物质还可以与液体载体一起使用，以形成易涂开的糊剂、凝胶、药膏、皂剂等，用于直接涂覆到使用者的皮肤。
可以用于将本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽递送到皮肤的有用的皮肤病用组合物的实例是本领域已知的；例如，参见Jacquet等(US4,608,392)，Geria(US4,992,478)，Smith等(US4,559,157)和Wortzman(US4,820,508)。
本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽的有用剂量可以通过比较它们的体外活性和在动物模型中的体内活性而确定。将在小鼠和其它动物中的有效剂量外推至人的方法是本领域已知的；例如，参见美国专利号4,938,949。
通常，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽在液体组合物诸如洗液中的浓度约0.1-25重量-％，优选地约0.5-10重量-％。在半固体或固体组合物诸如凝胶或粉剂中的浓度约0.1-5重量-％，优选地约0.5-2.5重量-％。
需要用于治疗的本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽的量不但随着所选的特定的氨基酸序列、纳米抗体或多肽而变化，而且随着施用途径、要治疗的病症的性质以及患者的年龄和病症而变化，并且最终取决于随从医生或临床医生的判断力。此外，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽的剂量变化取决于靶点细胞、肿瘤、组织、移植物或器官。
理想的剂量可以便利地以单一剂量或作为在适当的时间间隔施用的分剂量而存在，例如，作为每天2、3、4次或更多的亚剂量。所述亚剂量本身可以进一步分割，例如，分割成许多次不连续的宽松间隔的施用；诸如从吸入器多次吸入，或者通过使用多滴到眼睛中。施用方案可以包括长期的、日常的治疗。“长期”意指至少2周，并且优选地数周、数月或数年的持续时间。在这一剂量范围的必要的修改可以由本领域的普通技术人员仅仅使用本文的教导所给的常规实验而确定。参见雷明顿药物科学(Remington’sPharmaceuticalSciences)(Martin，E.W.，第4版)，Mack出版公司，Easton，PA。在任何并发症情形中，剂量还可以由个别医生进行调整。
在另一方面中，本发明涉及预防和/或治疗至少一种IL-6R相关的疾病和/或病症的方法，所述方法包括，给需要所述方法的受试者施用药物活性量的本发明的氨基酸序列、本发明的纳米抗体、本发明的多肽、本发明的化合物、本发明的构建体和/或包括其的药物组合物。
在本发明的内容中，术语“预防和/或治疗”不但包括预防和/或治疗疾病，而且通常包括预防所述疾病的发作，减缓或逆转疾病进程，防止或减缓与所述疾病相关的一种或多种症状的发作，减少和/或减轻与所述疾病相关的一种或多种症状，减少所述疾病和/或与之相关的任何症状的严重性和/或持续时间，和/或防止所述疾病的严重性和/或与之相关的任何症状的进一步增加，防止、减少或逆转由所述疾病引起的任何生理损害以及通常对被治疗的患者有益的任何药理作用。
待治疗的受试者可以是任何温血动物，但是特别是哺乳动物，并且更特别是人类。熟练的技术人员应该清楚，待治疗的受试者特别是患有或者有危险患有本文提及的疾病和病症的人。
本发明还涉及预防和/或治疗至少一种与IL-6、与IL-6R、与IL-6/IL-6R复合物、与其生物学或药理学活性、和/或与其中涉及IL-6、IL-6R和/或IL-6/IL-6R复合物的生物学途径或信号传导相关的疾病和/或病症的方法，所述方法包括，给需要所述方法的受试者施用药物活性量的本发明的氨基酸序列、本发明的纳米抗体、本发明的多肽、本发明的化合物、本发明的构建体和/或包括其的药物组合物。特别地，本发明涉及一种用于预防和/或治疗可以通过调节IL-6、IL-6R、IL-6/IL-6R复合物、其生物学或药学活性、和/或其中涉及IL-6，IL-6R和/或IL-6/IL-6R复合物的生物学途径或信号传导的至少一种疾病或病症的方法，所述方法包括给需要所述方法的受试者施用药物活性量的本发明的氨基酸序列、本发明的纳米抗体、本发明的多肽、本发明的化合物、本发明的构建体和/或包括其的药物组合物。特别地，所述药用有效量可以是足以调节IL-6、IL-6R、IL-6/IL-6R复合物、其生物学或药学活性、和/或其中涉及IL-6、IL-6R和/或IL-6/IL-6R复合物的生物学途径或信号传导的量。
本发明还涉及预防和/或治疗至少一种可以通过给患者施用本发明的氨基酸序列、本发明的纳米抗体或本发明的多肽而预防和/或治疗的疾病或病症的方法，所述方法包括，给需要所述方法的受试者施用药物活性量的本发明的氨基酸序列、本发明的纳米抗体、本发明的多肽、本发明的化合物、本发明的构建体和/或包括其的药物组合物。
更特别地，本发明涉及预防和/或治疗选自由本文列出的疾病和病症组成的组的至少一种疾病和/或病症的方法，所述方法包括，给需要所述方法的受试者施用药物活性量的本发明的氨基酸序列、本发明的纳米抗体、本发明的多肽、本发明的化合物、本发明的构建体和/或包括其的药物组合物。
具体地，本发明涉及一种预防和/或治疗脓毒症、各种形式的癌症、骨吸收、骨质疏松症、恶病质、银屑病、系膜增生性肾小球肾炎、卡波西肉瘤、艾滋病相关的淋巴瘤、以及炎性病的方法，所述方法包括施用药物活性量的本发明的氨基酸序列、本发明的纳米抗体、本发明的多肽和/或包括其的药物组合物。所述各种形式的癌症可以选自由下列各项组成的组：多发性骨髓瘤病(MM)，肾细胞癌(RCC)，浆细胞白血病，淋巴瘤，B-淋巴组织增生病症(BLPD)和前列腺癌。所述炎性病可以选自由下列各项组成的组：类风湿性关节炎、全身发作的青少年特发性关节炎、高丙球蛋白血症、局限性回肠炎、溃疡性大肠炎、系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化病、卡斯尔曼病、IgMγ-球蛋白病、心脏粘液瘤、哮喘、变应性哮喘以及自体免疫性胰岛素-依赖型糖尿病。
在另一个具体方面，本发明涉及一种预防和/或治疗脓毒症、各种形式的癌症、骨吸收、骨质疏松症、恶病质、银屑病、系膜增生性肾小球肾炎、卡波西肉瘤、艾滋病相关的淋巴瘤、以及炎性病的方法，所述方法包括施用药物活性量的SEQIDNO：70，和/或包括其的药物组合物。在另一个具体方面，本发明涉及一种预防和/或治疗脓毒症、各种形式的癌症、骨吸收、骨质疏松症、恶病质、银屑病、系膜增生性肾小球肾炎、卡波西肉瘤、艾滋病相关的淋巴瘤、以及炎性病的方法，所述方法包括施用药物活性量的SEQIDNO：71，和/或包括其的药物组合物。所述各种形式的癌症可以选自由下列各项组成的组：多发性骨髓瘤病(MM)，肾细胞癌(RCC)，浆细胞白血病，淋巴瘤，B-淋巴组织增生病症(BLPD)和前列腺癌。所述炎性病可以选自由下列各项组成的组：类风湿性关节炎、全身发作的青少年特发性关节炎、高丙球蛋白血症、局限性回肠炎、溃疡性大肠炎、系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化病、卡斯尔曼病、IgMγ-球蛋白病、心脏粘液瘤、哮喘、变应性哮喘以及自体免疫性胰岛素-依赖型糖尿病。
在另一个实施方案中，本发明涉及免疫治疗的方法，并且特别涉及被动免疫治疗的方法，所述方法包括给患有或者有危险患有本文提及的疾病和病症的受试者施用药物活性量的本发明的氨基酸序列、本发明的纳米抗体、本发明的多肽、本发明的化合物、本发明的构建体和/或包括其的药物组合物。
在上述方法中，本发明的氨基酸序列、纳米抗体、多肽、化合物和/或构建体和/或包含其的组合物可以以任何适当的方式施用，这取决于要用的特定的药物制剂或组合物。因此，例如，本发明的氨基酸序列、纳米抗体、多肽、化合物和/或构建体和/或包含其的组合物可以口服、腹膜内(例如，静脉内、皮下、肌内、或者通过避开胃肠道的任何其它施用途径)、鼻内、透皮地、局部施用，通过栓剂、通过吸入方式施用，这也取决于要用的特定药物制剂或组合物。临床医生能够选择适当的施用途径和用于所述施用的适当的药物制剂或组合物，这取决于要预防或治疗的疾病和/或病症以及临床医生公知的其它因素。
本发明的氨基酸序列、纳米抗体、多肽、化合物和/或构建体和/或包含其的组合物按照治疗方案进行施用，所述治疗方案适于预防和/或治疗要被预防或治疗的疾病和/或病症。临床医生通常能够确定适宜的治疗方案，取决于下列因素，诸如要被预防或治疗的疾病或病症，要被治疗的疾病的严重性和/或其症状的严重性，要用的本发明的特定的氨基酸序列、纳米抗体、多肽、化合物或构建体，要用的特定的施用途径和药物制剂(farmaceuticalformulation)或组合物，患者的年龄、性别、体重、饮食、综合病况，以及临床医生公知的类似因素。
一般地，所述治疗方案包括以一种或多种药物有效量或剂量施用一种或多种本发明的氨基酸序列、纳米抗体、多肽、化合物和/或构建体，或者包含其的一种或多种组合物。施用的具体量或剂量由临床医生确定，同样基于上文引用的因素确定。
通常，对于预防和/或治疗本文提及的疾病和病症，并且取决于要治疗的具体疾病或病症，要用的特定的本发明的氨基酸序列、纳米抗体、多肽、化合物和构建体的功效，具体的施用途径和使用的特定的药物制剂或组合物，本发明的氨基酸序列、纳米抗体、多肽、化合物和构建体一般以每天每kg体重1克-0.01微克的量施用，优选地每天每kg体重0.1克-0.1微克，诸如每天每kg体重约1，10,100或1000微克，作为单一的每日剂量连续施用(例如，通过输注)或者在一天内作为多次分剂量施用。临床医生通常能够确定适宜的日常剂量，这取决于本文提及的因素。还应该清楚，在具体的情形中，临床医生可以选择偏离这些量，例如，基于上文引用的因素以及他的专业判断。一般地，关于施用量的一些指导可从通过基本上相同的途径通常施用的相当的针对相同施用靶点的常规抗体或抗体片段的量而获得，但是要考虑亲和性/抗体亲抗原性、功效、生物分布、半衰期以及熟练的技术人员公知的类似因素的不同。
通常，在上述方法中，将使用单一的本发明的氨基酸序列、纳米抗体、多肽、化合物或构建体。然而，使用组合的两种或更多种本发明的氨基酸序列、纳米抗体、多肽、化合物和/或构建体也在本发明范围之内。
本发明的氨基酸序列、纳米抗体、多肽、化合物和构建体还可以与一种或多种其它药物活性化合物或成分(principles)组合应用，即，作为组合治疗方案，其可以或者可以不引起增效效应。并且，基于上文所引用的因素及其专业判断，临床医生能够选择所述的其它化合物或成分，以及适宜的组合治疗方案。
特别地，本发明的氨基酸序列、纳米抗体、多肽、化合物和构建体可以与其它药物活性化合物或成分组合应用，所述其它药物活性化合物或成分是或者能够用于预防和/或治疗本文所引用的疾病和病症，其结果可以或不可以获得增效效应。所述化合物和成分的实例，以及施用其的途径、方法和药物制剂或组合物是临床医生所清楚的。
当两种或更多种物质或成分用作组合治疗方案的一部分时，它们可以通过相同的施用途径或者通过不同的施用途径在基本上相同的时间或在不同时间(例如，基本上同时地、连续地、或者按照备选方案)施用。当所述物质或成分通过相同的施用途径同时施用时，它们可以作为不同的药物制剂或组合物或者作为组合的药物制剂或组合物的一部分进行施用，这是熟练的技术人员所清楚的。
并且，当两种或更多种活性物质或成分作为组合治疗方案的一部分使用时，每一物质或成分可以以相同的量施用，并且按照与当所述化合物或成分单独使用时相同的方案施用，并且所述组合应用可以或可以不引起增效效应。然而，当所述两种或更多种活性物质或成分的组合应用引起增效效应时，还可以可能地减少要施用的一种、多种或全部物质或成分的量，同时仍旧获得理想的治疗作用。例如，这可以用于避免、限制或减少当以它们的常规用量使用时与一种或多种所述物质或成分的应用相关的任何不需要的副作用，同时仍旧获得理想的药物或治疗效果。
按照本发明所用的治疗方案的效果可以以本身已知的用于所涉及的疾病和/或病症的任何方式进行确定和/或遵循，这是临床医生所清楚的。在适当的并且基于病例/病例基础的情形中，临床医生还应该能够改变或改进特定的治疗方案，以便获得理想的治疗效果，以避免、限制或减少不需要的副作用，和/或实现一方面获得理想的治疗效果与另一方面避免、限制或减少不理想的副作用之间的适当的平衡。
通常，应该遵循所述治疗方案，直到获得理想的治疗效果和/或所述理想的治疗效果持续需要保持的那么久。并且，这可以由临床医生确定。
在另一方面中，本发明涉及本发明的氨基酸序列、纳米抗体、多肽、化合物或(单价)构建体在制备用于预防和/或治疗至少一种与IL-6R相关的病症的药物组合物中的应用。
本发明还涉及本发明的氨基酸序列、纳米抗体、多肽、化合物或(单价)构建体在制备药物组合物的应用，所述药物组合物用于预防和/或治疗至少一种与IL-6、与IL-6R、与IL-6/IL-6R复合物和/或与其中涉及IL-6、IL-6R和/或IL-6/IL-6R复合物的信号传导途径和/或生物学功能和反应相关的疾病和病症；和/或用于一种或多种本发明描述的方法中。
本发明还涉及本发明的氨基酸序列、纳米抗体、多肽、化合物或构建体在制备药物组合物的应用，所述药物组合物用于预防和/或治疗至少一种可以通过调节IL-6，IL-6R，IL-6/IL-6R复合物，它的生物学或药理学活性，和/或其中涉及IL-6，IL-6R和/或IL-6/IL-6R复合物的生物学途径或信号传导而预防和/或治疗的疾病或病症。
本发明还涉及本发明的氨基酸序列、纳米抗体、多肽、化合物或构建体在制备药物组合物中的应用，所述药物组合物用于预防和/或治疗至少一种可以通过向患者施用本发明的氨基酸序列、纳米抗体、多肽、化合物或构建体而预防和/或治疗的疾病或病症。
更具体地，本发明涉及本发明的氨基酸序列、纳米抗体、多肽、化合物或构建体在制备药物组合物中的应用，所述药物组合物用于预防和/或治疗IL-6R相关病症，并且特别用于预防和治疗脓毒症、各种形式的癌症、骨吸收、骨质疏松症、恶病质、银屑病、系膜增生性肾小球肾炎、卡波西肉瘤、艾滋病相关的淋巴瘤、以及炎性病，所述方法包括施用药物有效量的本发明的氨基酸序列、本发明的纳米抗体、本发明的多肽、和/或包含其的药物组合物。所述各种形式的癌症可以选自由下列各项组成的组：多发性骨髓瘤病(MM)，肾细胞癌(RCC)，浆细胞白血病，淋巴瘤，B-淋巴组织增生病症(BLPD)和前列腺癌。所述炎性病可以选自由下列各项组成的组：类风湿性关节炎、全身发作的青少年特发性关节炎、高丙球蛋白血症、局限性回肠炎、溃疡性大肠炎、系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化病、卡斯尔曼病、IgMγ-球蛋白病、心脏粘液瘤、哮喘、变应性哮喘以及自体免疫性胰岛素-依赖型糖尿病。
本发明还涉及本发明的氨基酸序列、纳米抗体、化合物或构建体、多肽、单价构建体或包含其的药物组合物，其用于预防和/或治疗至少一种与IL-6R相关的疾病和/或病症。
本发明还涉及本发明的氨基酸序列、纳米抗体、化合物或构建体、多肽、单价构建体或包含其的药物组合物，其用于预防和/或治疗至少一种与IL-6、与IL-6R、与IL-6/IL-6R复合物、与其生物学或药理学活性、和/或与其中涉及IL-6、IL-6R和/或IL-6/IL-6R复合物的生物学功能或信号传导相关的疾病和病症。
本发明还涉及本发明的氨基酸序列、纳米抗体、化合物或构建体、多肽、单价构建体或包含其的药物组合物，其用于预防和/或治疗至少一种可以通过调节IL-6，IL-6R，IL-6/IL-6R复合物，它的生物学或药理学活性，和/或其中涉及IL-6，IL-6R和/或IL-6/IL-6R复合物的生物学途径或信号传导而预防和/或治疗的疾病和/或病症。
本发明还涉及本发明的氨基酸序列、纳米抗体、化合物或构建体、多肽、单价构建体或包含其的药物组合物，其用于预防和/或治疗至少一种可以通过向患者施用本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽而预防和/或治疗的疾病和/或病症。
本发明还涉及本发明的氨基酸序列、纳米抗体、化合物或构建体、多肽、单价构建体或包含其的药物组合物，其用于预防和/或治疗脓毒症、各种形式的癌症、骨吸收、骨质疏松症、恶病质、银屑病、系膜增生性肾小球肾炎、卡波西肉瘤、艾滋病相关的淋巴瘤、以及炎性病，所述方法包括施用药物有效量的本发明的氨基酸序列、本发明的纳米抗体、本发明的多肽、和/或包含其的药物组合物。所述各种形式的癌症可以选自由下列各项组成的组：多发性骨髓瘤病(MM)，肾细胞癌(RCC)，浆细胞白血病，淋巴瘤，B-淋巴组织增生病症(BLPD)和前列腺癌。所述炎性病可以选自由下列各项组成的组：类风湿性关节炎、全身发作的青少年特发性关节炎、高丙球蛋白血症、局限性回肠炎、溃疡性大肠炎、系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化病、卡斯尔曼病、IgMγ-球蛋白病、心脏粘液瘤、哮喘、变应性哮喘以及自体免疫性胰岛素-依赖型糖尿病。
被治疗的受试者可以是任何温血动物，但是特别是哺乳动物，更具体地是人。如本领域技术人员所清楚的，被治疗的受试者特别是患有本发明提及的疾病和病症或处于该疾病和病症风险中的人。
再次，在该药物组合物中，本发明的一种或多种氨基酸序列、纳米抗体、多肽、化合物或构建体也可以与一种或多种其它活性成分，诸如本文提到的那些，适当地组合。
本发明进一步通过下列实施例举例说明，所述实施例绝非不应理解是进一步限制性的。在整个本申请中引用的所有参考文献(包括文献参考，授权专利，公开的专利申请，和共同待审的专利申请)的完整内容通过参考明确地结合于此，特别是关于上文引用的教导。
方面
方面1.针对IL-6R的氨基酸序列，其包含一个或多个选自以下的氨基酸残基片段：
a)SEQIDNO’s：80-82；或
b)与SEQIDNO’s：80-82之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量；
和/或
c)SEQIDNO’s：84-91；或
d)与SEQIDNO’s：84-91之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量；
和/或
e)SEQIDNO’s：93-95；或
f)与SEQIDNO’s：93-95之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述1个或2个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量。
方面2.根据方面1的氨基酸序列，其包含两个以上选自以下的氨基酸残基片段：
a)SEQIDNO’s：80-82；或
b)与SEQIDNO’s：80-82之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量；
和/或
c)SEQIDNO’s：84-91；或
d)与SEQIDNO’s：84-91之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量；
和/或
e)SEQIDNO’s：93-95；或
f)与SEQIDNO’s：93-95之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述1个或2个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量，使得(i)当第一个氨基酸残基片段对应于根据a)或b)所述的氨基酸序列之一时，第二个氨基酸残基片段对应于根据c)，d)，e)或f)所述的氨基酸序列之一；(ii)当第一个氨基酸残基片段对应于根据c)或d)所述的氨基酸序列之一时，第二个氨基酸残基片段对应于根据a)，b)，e)或f)所述的氨基酸序列之一；或(iii)当第一个氨基酸残基片段对应于根据e)或f)所述的氨基酸序列之一时，第二个氨基酸残基片段对应于根据a)，b)，c)或d)所述的氨基酸序列之一。
方面3.根据方面1或2任一项的氨基酸序列，其包含三个以上选自以下的氨基酸残基片段，其中第一个氨基酸残基片段选自以下组成的组：
a)SEQIDNO’s：80-82；或
b)与SEQIDNO’s：80-82之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量；
第二个氨基酸残基片段选自以下组成的组：
c)SEQIDNO’s：84-91；或
d)与SEQIDNO’s：84-91之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量；
并且第三个氨基酸残基片段选自以下组成的组：
e)SEQIDNO’s：93-95；或
f)与SEQIDNO’s：93-95之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述1个或2个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量。
方面4.根据方面1至3中任一项的氨基酸序列，其包括免疫球蛋白折叠或在适当条件下能够形成免疫球蛋白折叠。
方面5.根据方面1至4中任一项的氨基酸序列，其为免疫球蛋白序列。
方面6.根据方面1至5中任一项的氨基酸序列，其基本上由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补性决定区(分别为CDR1-CDR3)组成，其中：
-CDR1选自以下组成的组：
a)SEQIDNO’s：80-82；或
b)与SEQIDNO’s：80-82之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量；
和/或
-CDR2选自以下组成的组：
c)SEQIDNO’s：84-91；或
d)与SEQIDNO’s：84-91之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量；
和/或
-CDR3选自以下组成的组：
e)SEQIDNO’s：93-95；或
f)与SEQIDNO’s：93-95之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述1个或2个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量。
方面7.根据方面6的氨基酸序列，其基本上由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补性决定区(分别为CDR1-CDR3)组成，其中：
-CDR1选自以下组成的组：
a)SEQIDNO’s：80-82；或
b)与SEQIDNO’s：80-82之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量；
和
-CDR2选自以下组成的组：
c)SEQIDNO’s：84-91；或
d)与SEQIDNO’s：84-91之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量；
且
-CDR3选自以下组成的组：
e)SEQIDNO’s：93-95；或
f)与SEQIDNO’s：93-95之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述1个或2个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量。
方面8.根据方面1至7中任一项的氨基酸序列，其包含至少：
a)SEQIDNO：80；或
b)与SEQIDNO：80具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量。
方面9.根据方面1至8中任一项的氨基酸序列，其包括至少一个选自以下的氨基酸残基片段：
a)SEQIDNO’s：84，89或91；或
b)与SEQIDNO’s：84，89或91之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述1个或2个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量。
方面10.根据方面1至9中任一项的氨基酸序列，其包括至少：
a)SEQIDNO：84；或
b)与SEQIDNO：84具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量。
方面11.根据方面1至10中任一项的氨基酸序列，其包括至少选自以下的氨基酸残基片段：
a)SEQIDNO’s：93-94；或
b)与SEQIDNO’s：93-94之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述1个或2个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量。
方面12.根据方面1至11中任何一项的氨基酸序列，其包括至少：
a)SEQIDNO：93；或
b)与SEQIDNO：93具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基片段，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基片段的氨基酸序列相比，包括所述氨基酸残基片段的该氨基酸序列以大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量。
方面13.根据方面1至12中任何一项的氨基酸序列，其包括至少2个选自以下的氨基酸残基片段：
a)SEQIDNO：80和SEQIDNO：84；
b)SEQIDNO：80和SEQIDNO：93；或
c)SEQIDNO：84和SEQIDNO：93。
方面14.根据方面1至13中任何一项的氨基酸序列，其包括SEQIDNO：80，SEQIDNO：84和SEQIDNO：93。
方面15.根据方面1至14中任何一项的氨基酸序列，其基本上由衍生于常规四链抗体的重链可变结构域序列组成，或者基本上由衍生于重链抗体的重链可变结构域序列组成。
方面16.根据方面1至15中任何一项的氨基酸序列，其基本上由结构域抗体(或适合用作结构域抗体的氨基酸序列)，单结构域抗体(或适合用作单结构域抗体的氨基酸序列)，″dAb″(或适合用作dAb的氨基酸序列)或纳米抗体组成。
方面17.根据方面1至16中任何一项的氨基酸序列，其选自以下组成的组：
a)SEQIDNO’s：60-69；
b)这样的序列，所述序列在其CDR中的一个、两个或全部之中与SEQIDNO’s：60-69之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异，条件是与所述SEQIDNO’s：60-69之一的结合相比，所述在其CDR中的一个、两个或全部之中具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列以大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量；
c)与SEQIDNO’s：60-69之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的序列，条件是与所述SEQIDNO’s：60-69之一的结合相比，与SEQIDNO’s：60-69之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列以大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量。
方面18.根据方面17的氨基酸序列，其选自以下组成的组：
a)SEQIDNO’s：65-69；
b)这样的序列，所述序列在其CDR中的一个、两个或全部之中与SEQIDNO’s：65-69之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异，条件是与所述SEQIDNO’s：65-69之一的结合相比，所述在其CDR中的一个、两个或全部之中具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列以大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量；
c)与SEQIDNO’s：65-69之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的序列，条件是与所述SEQIDNO’s：65-69之一的结合相比，与SEQIDNO’s：65-69之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列以大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量。
方面19.根据方面18的氨基酸序列，选自以下组成的组：
a)SEQIDNO：66；
b)这样的序列，所述序列在其CDR中的一个、两个或全部之中与SEQIDNO：66具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的序列，条件是与所述SEQIDNO：66的结合相比，所述在其CDR中的一个、两个或全部之中具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列以大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量；
c)与SEQIDNO：66具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的序列，条件是与所述SEQIDNO：66的结合相比，与SEQIDNO：66具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列以大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量。
方面20.根据方面1至19中任一项的氨基酸序列，其以1nM至1pM摩尔/升以下，优选500pM至1pM摩尔/升以下，更优选100pM至1pM摩尔/升以下，或还更优选约50pM至1pM以下的解离常数(KD)结合hIL-6R。
方面21.根据方面1至20中任一项的氨基酸序列，其以1nM至1pM摩尔/升以下，优选500pM至1pM摩尔/升以下，更优选100pM至1pM摩尔/升以下，或还更优选约50pM至1pM以下的解离常数(KD)结合食蟹猴IL-6R。
方面22.根据方面1至21中任一项的氨基酸序列，其以104M-1s-1至约107M-1s-1，优选105M-1s-1至107M-1s-1，更优选约106M-1s-1以上的kon-速率结合hIL-6R
方面23.根据方面1至22中任一项的氨基酸序列，其以104M-1s-1至约107M-1s-1，优选105M-1s-1至107M-1s-1，更优选约106M-1s-1以上的kon-速率结合食蟹猴IL-6R。
方面24.根据方面1至23中任一项的氨基酸序列，其以10-3s-1(t1/2＝0.69s)至10-6s-1(假定具有多天的t1/2的几乎不可逆的复合物)，优选10-4s-1至10-6s-1，更优选10-5s-1至10-6s-1，诸如约10-5s-1以下的koff速率结合hIL-6R。
方面25.根据方面1至24中任一项的氨基酸序列，其以10-3s-1(t1/2＝0.69s)至10-6s-1(假定具有多天的t1/2的几乎不可逆的复合物)，优选10-4s-1至10-6s-1，更优选10-5s-1至10-6s-1，诸如约10-5s-1以下的koff速率结合食蟹猴IL-6R。
方面26.根据方面1至25中任一项的氨基酸序列，在TF-1测定中，其具有10nM和50pM之间，优选5nM和50pM之间，更优选1nM至50pM以下，诸如约750或500pM以下的IC50值(在100IU/mLIL-6时)。
方面27.根据方面1至26中任一项的氨基酸序列，在TF-1测定中，其具有50nM至1nM，优选25nM至1nM，更优选10nM至1nM以下，诸如约8nM以下的IC50值(在5000IU/mLIL-6时)。
方面28.根据方面1至27中任一项的氨基酸序列，其在TF-1测定中具有与由SEQIDNO’s：1和2定义的参照IgG或由SEQIDNO’s：3和4定义的参照Fab获得的IC50值相比至少相同和优选更好，至少2倍，优选3倍，更优选4倍，还更优选5倍，7倍或大于7倍更好的IC50值。
方面29.根据方面1至28中任一项的氨基酸序列，其在TF-1测定中具有与托珠单抗(MRA)获得的IC50值相比至少相同和优选更好，至少2倍，优选3倍，更优选4倍，还更优选5倍，7倍或大于7倍更好的IC50值。
方面30.根据方面1至29中任一项的氨基酸序列，其在IL-6的EC50值下的血浆效力测定中具有500pM至50pM，优选250pM至50pM，更优选200pM至50pM以下，诸如150pM以下的IC50值。
方面31.根据方面1至30中任一项的氨基酸序列，其在IL-6的EC95值下的血浆效力测定中具有1000pM至100pM，优选750pM至100pM，更优选500pM至100pM以下，诸如400pM以下的IC50值。
方面32.根据方面1至31中任一项的氨基酸序列，在方面30或31的血浆效力测定中，其具有与由SEQIDNO’s：1和2定义的参照IgG或由SEQIDNO’s：3和4定义的参照Fab获得的IC50值相比至少相同和优选更好，至少2倍，优选3倍，更优选4倍，还更优选5倍，7倍或大于7倍更好的IC50值。
方面33.根据方面1至32中任一项的氨基酸序列，在方面30或31的血浆效力测定中，其具有与托珠单抗(MRA)获得的IC50值相比至少相同和优选更好，至少2倍，优选3倍，更优选4倍，还更优选5倍，7倍或大于7倍更好的IC50值。
方面34.根据方面1至33中任一项的氨基酸序列，在与CHO细胞上的膜IL-6R结合的测定中，其具有10nM至100pM，优选5nM至100pM，更优选2nM至10pM以下，诸如2nM以下的IC50值。
方面35.化合物或构建体，其包含一个或多个根据方面1至34中任一项的氨基酸序列，或者基本上由其组成，和任选地进一步包括一个或多个其它基团、残基、结构部分或结合单元，其任选地通过一个或多个接头连接。
方面36.根据方面35的化合物或构建体，其中所述一个或多个其它基团、残基、结构部分或结合单元选自以下组成的组：结构域抗体，适合用作结构域抗体的氨基酸序列，单结构域抗体，适合用作单结构域抗体的氨基酸序列，″dAb″’s，适合用作dAb的氨基酸序列，或纳米抗体。
方面37.根据方面35或36的化合物或构建体，其为多价构建体，诸如例如二价或三价构建体。
方面38.根据方面35至37中任一项的化合物或构建体，其为多特异性构建体，诸如例如双特异性或三特异性构建体。
方面39.根据方面35至38中任一项的化合物或构建体，其与相应的根据方面1至34中任一项的氨基酸序列本身相比具有增加的半衰期。
方面40.根据方面39的化合物或构建体，其中与相应的根据方面1至20中任一项的氨基酸序列本身相比，所述一个或多个其它基团、残基、结构部分或结合单元为所述化合物或构建体提供增加的半衰期。
方面41.根据方面39的化合物或构建体，其中为所述化合物或构建体提供增加的半衰期的所述一个或多个其它基团、残基、结构部分或结合单元选自以下组成的组：血清蛋白或其片段，可以结合血清蛋白的结合单元，Fc部分，和可以结合血清蛋白的小蛋白或肽。
方面42.根据方面39的化合物或构建体，其中为所述化合物或构建体提供增加的半衰期的所述一个或多个其它基团、残基、结构部分或结合单元选自以下组成的组：人血清白蛋白或其片段。
方面43.根据方面39的化合物或构建体，其中为所述化合物或构建体提供增加的半衰期的所述一个或多个其它基团、残基、结构部分或结合单元选自以下组成的组：结合血清白蛋白(诸如人血清白蛋白)或血清免疫球蛋白(诸如IgG)的结合单元。
方面44.根据方面39的化合物或构建体，其中为所述化合物或构建体提供增加的半衰期的所述一个或多个其它基团、残基、结构部分或结合单元选自以下组成的组：结构域抗体，适合用作结构域抗体的氨基酸序列，单结构域抗体，适合用作单结构域抗体的氨基酸序列，″dAb″’s，适合用作dAb的氨基酸序列，或纳米抗体，它们可以结合血清白蛋白(诸如人血清白蛋白)或血清免疫球蛋白(诸如IgG)。
方面45.根据方面39的化合物或构建体，其中为所述化合物或构建体提供增加的半衰期的所述一个或多个其它基团、残基、结构部分或结合单元选自SEQIDNO’s：97-99。
方面46.根据方面35至45中任一项的化合物或构建体，其选自下列多肽序列：
a)SEQIDNO’s70-72；
b)本发明这样的多肽序列，所述多肽序列在其CDR中的一个、两个或全部之中与SEQIDNO’s：70-72之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异，条件是与所述SEQIDNO’s：70-72之一的结合相比，在本发明的其CDR中的一个、两个或全部之中具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的多肽序列以大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量；
c)与SEQIDNO’s：70-72之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的多肽序列，条件是与所述SEQIDNO’s：70-72之一的结合相比，与SEQIDNO’s：70-72之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列以大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量。
方面47.根据方面35至46中任一项的化合物或构建体，其选自下列多肽序列：
a)SEQIDNO’s70-71；
b)本发明这样的多肽序列，所述多肽序列在其CDR中的一个、两个或全部之中与SEQIDNO’s70-71之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异，条件是与所述SEQIDNO’s70-71之一的结合相比，在本发明的其CDR中的一个、两个或全部之中具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的多肽序列以大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量；
c)与SEQIDNO’s：70-71之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的多肽序列，条件是与所述SEQIDNO’s：70-71之一的结合相比，与SEQIDNO’s：70-71之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列以大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量。
方面48.根据方面35至47中任一项的化合物或构建体，其具有SEQIDNO：70的氨基酸序列，或基本上由SEQIDNO：70的氨基酸序列序列组成。
方面49.根据方面35至47中任一项的化合物或构建体，其具有SEQIDNO：71的氨基酸序列，或基本上由SEQIDNO：71的氨基酸序列序列组成。
方面50.根据方面35至49中任一项的化合物或构建体，其以1nM至1pM摩尔/升以下、优选500pM至1pM摩尔/升以下、更优选100pM至1pM摩尔/升以下、或还更优选约50pM至1pM以下的解离常数(KD)特异性结合hIL-6R。
方面51.根据方面35至50中任一项的化合物或构建体，其以1nM至1pM以下、优选500pM至1pM以下、更优选100pM至1pM以下、或还更优选约50pM至1pM以下的解离常数(KD)特异性结合食蟹猴IL-6R。
方面52.根据方面35至51中任一项的化合物或构建体，其以104M-1s-1至约107M-1s-1，优选105M-1s-1至107M-1s-1，更优选约106M-1s-1以上的kon-速率结合hIL-6R。
方面53.根据方面35至52中任一项的化合物或构建体，其以104M-1s-1至约107M-1s-1，优选105M-1s-1至107M-1s-1，更优选约106M-1s-1以上的kon-速率结合食蟹猴IL-6R。
方面54.根据方面35至53中任一项的化合物或构建体，其以10-3s-1(t1/2＝0.69s)至10-6s-1(假定具有多天的t1/2的几乎不可逆的复合物)，优选10-4s-1至10-6s-1，更优选10-5s-1至10-6s-1，诸如约10-5s-1以下的koff速率结合hIL-6R。
方面55.根据方面35至54中任一项的化合物或构建体，其以10-3s-1(t1/2＝0.69s)至10-6s-1(假定具有多天的t1/2的几乎不可逆的复合物)，优选10-4s-1至10-6s-1，更优选10-5s-1至10-6s-1，诸如约10-5s-1以下的koff速率结合食蟹猴IL-6R。
方面56.根据方面35至55中任一项的化合物或构建体，在TF-1测定中，其具有10nM和50pM之间，优选5nM和50pM之间，更优选1nM至50pM以下，诸如约750或500pM以下的IC50值(在100IU/mLIL-6时)。
方面57.根据方面35至56中任一项的化合物或构建体，在TF-1测定中，其具有50nM至1nM，优选25nM至1nM，更优选10nM至1nM以下，诸如约8nM以下的IC50值(在5000IU/mLIL-6时)。
方面58.根据方面35至57中任一项的化合物或构建体，其在TF-1测定中具有与由SEQIDNO’s：1和2定义的参照IgG或由SEQIDNO’s：3和4定义的参照Fab获得的IC50值相比至少相同和优选更好，至少2倍，优选3倍，更优选4倍，还更优选5倍，7倍或大于7倍更好的IC50值。
方面59.根据方面35至58中任一项的化合物或构建体，其在TF-1测定中具有与托珠单抗(MRA)获得的IC50值相比至少相同和优选更好，至少2倍，优选3倍，更优选4倍，还更优选5倍，7倍或大于7倍更好的IC50值。
方面60.根据方面35至59中任一项的化合物或构建体，其在IL-6的EC50值下的血浆效力测定中具有500pM至50pM，优选250pM至50pM，更优选200pM至50pM以下，诸如150pM以下的IC50值。
方面61.根据方面35至60中任一项的化合物或构建体，其在IL-6的EC95值下的血浆效力测定中具有1000pM至100pM，优选750pM至100pM，更优选500pM至100pM以下，诸如400pM以下的IC50值。
方面62.根据方面35至61中任一项的化合物或构建体，在方面60或61的血浆效力测定中，其具有与由SEQIDNO’s：1和2定义的参照IgG或由SEQIDNO’s：3和4定义的参照Fab获得的IC50值相比至少相同和优选更好，至少2倍，优选3倍，更优选4倍，还更优选5倍，7倍或大于7倍更好的IC50值。
方面63.根据方面35至62中任一项的化合物或构建体，在方面60或61的血浆效力测定中，其具有与托珠单抗(MRA)获得的IC50值相比至少相同和优选更好，至少2倍，优选3倍，更优选4倍，还更优选5倍，7倍或大于7倍更好的IC50值。
方面64.根据方面35至63中任一项的化合物或构建体，在与CHO细胞上的膜IL-6R结合的测定中，其具有10nM至100pM，优选5nM至100pM，更优选2nM至10pM以下，诸如2nM以下的IC50值。
方面65.单价构建体，其包括根据方面1至34中任一项的氨基酸序列或基本上由其组成。
方面66.根据方面1至34中任一项的氨基酸序列或根据方面65的单价构建体在制备根据方面37至64中任一项的多价化合物或构建体中的应用。
方面67.用于制备根据方面37至64中任一项的多价化合物或构建体的方法，包括将根据方面1至34中任一项的氨基酸序列或根据方面65的单价构建体与一个或多个基团、残基、结构部分或结合单元连接。
方面68.根据方面67的用于制备根据方面37至64中任一项的多价化合物或构建体的方法，包括将根据方面1至34中任一项的氨基酸序列或根据方面65的单价构建体与其它基团、残基、结构部分或结合单元通过一个或多个接头连接。
方面69.核酸或核苷酸序列，其编码根据方面1至34中任一项的氨基酸序列、根据方面35至64中任一项的化合物或构建体或根据方面65的单价构建体，所述根据方面35至64中任一项的化合物或构建体是这样的以致于其可以通过表达编码其的核酸或核苷酸序列来获得。
方面70.根据方面69的核酸或核苷酸序列，其是遗传构建体的形式。
方面71.宿主或宿主细胞，其表达或者在适当情形下能够表达根据方面1至34中任一项的氨基酸序列、根据方面35至64中任一项的化合物或构建体或根据方面65的单价构建体，所述根据方面35至64中任一项的化合物或构建体是这样的以致于其可以通过表达编码其的核酸或核苷酸序列来获得；和/或其包括根据方面69的核酸或核苷酸序列，或根据方面70的遗传构建体。
方面72.用于制备根据方面1至34中任一项的氨基酸序列、根据方面35至64中任一项的化合物或构建体或根据方面65的单价构建体的方法，所述根据方面35至64中任一项的化合物或构建体是这样的以致于其可以通过表达编码其的核酸或核苷酸序列来获得，所述方法至少包括以下步骤：
a)在适当的宿主细胞或宿主生物体中或在另一种适当表达系统中表达根据根据方面69的核酸或核苷酸序列或根据方面70的遗传构建体；
任选地接着：
b)分离和/或纯化如此获得的根据方面1至34中任一项的氨基酸序列、根据方面35至64中任一项的化合物或构建体或根据方面65的单价构建体，所述根据方面35至64中任一项的化合物或构建体是这样的以致于其可以通过表达编码其的核酸或核苷酸序列来获得。
方面73.用于制备根据方面1至34中任一项的氨基酸序列、根据方面35至64中任一项的化合物或构建体或根据方面65的单价构建体的方法，所述根据方面35至64中任一项的化合物或构建体是这样的以致于其可以通过表达编码其的核酸或核苷酸序列来获得，所述方法至少包括以下步骤：
a)在这样的条件下培养和/或维持根据方面71的宿主或宿主细胞，所述条件使得所述宿主或宿主细胞表达和/或生产至少一种根据方面1至34中任一项所述的氨基酸序列、根据方面35至64中任一项所述的化合物或构建体、或根据方面65的单价构建体，所述根据方面35至64中任一项所述的化合物或构建体是这样的以致其可以通过表达编码其的核酸或核苷酸序列来获得，
任选地接着：
b)分离和/或纯化如此获得的根据方面1至34中任一项的氨基酸序列、根据方面35至64中任一项的化合物或构建体或根据方面65的单价构建体，所述根据方面35至64中任一项的化合物或构建体是这样的以致于其可以通过表达编码其的核酸或核苷酸序列来获得。
方面74.组合物，包含至少一种根据方面1至34中任一项的氨基酸序列、根据方面35至64中任一项的化合物或构建体、根据方面65的单价构建体、或根据方面69或70的核酸或核苷酸序列。
方面75.根据方面74的组合物，其为药物组合物。
方面76.根据方面74的组合物，其为药物组合物，另外包括至少一种药用载体、稀释剂或赋形剂和/或辅药，并且任选地包括一种或多种其它药物活性多肽和/或化合物。
方面77.用于预防和/或治疗与IL-6、与IL-6R、与IL-6/IL-6R复合物和/或与其中涉及IL-6、IL-6R和/或IL-6/IL-6R复合物的信号传导途径和/或生物学功能和反应相关的至少一种疾病和病症的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用药物有效量的至少一种根据方面1至34中任一项的氨基酸序列、根据方面35至64中任一项的化合物或构建体、根据方面65的单价构建体、或根据方面75至76任一项的组合物。
方面78.根据方面77的方法，其中所述与IL-6R和/或与IL-6/IL-6R复合物和/或与其中涉及IL-6和/或IL-6/IL-6R复合物的信号传导途径和/或生物学功能和反应相关的疾病和病症选自以下组成的组：脓毒症、各种形式的癌症、骨吸收、骨质疏松症、恶病质、银屑病、系膜增生性肾小球肾炎、卡波西肉瘤、艾滋病相关的淋巴瘤、以及炎性病。
方面79.根据方面78的方法，其中所述各种形式的癌症选自由下列各项组成的组：多发性骨髓瘤病(MM)，肾细胞癌(RCC)，浆细胞白血病，淋巴瘤，B-淋巴组织增生病症(BLPD)和前列腺癌。
方面80.根据方面78的方法，其中所述炎性病选自由下列各项组成的组：类风湿性关节炎、全身发作的青少年特发性关节炎、高丙球蛋白血症、局限性回肠炎、溃疡性大肠炎、系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化病、卡斯尔曼病、IgMγ-球蛋白病、心脏粘液瘤、哮喘、变应性哮喘以及自体免疫性胰岛素-依赖型糖尿病。
方面81.用于预防和/或治疗至少一种可以通过向需要其的受试者施用根据方面1至34中任一项的氨基酸序列、根据方面35至64中任一项的化合物或构建体或根据方面65的单价构建体预防和/或治疗的疾病或病症的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用药物有效量的至少一种根据方面1至34中任一项的氨基酸序列、根据方面35至64中任一项的化合物或构建体或根据方面65的单价构建体、或根据方面75至76中任一项的组合物。
方面82.根据方面1至34中任一项的氨基酸序列、根据方面35至64中任一项的化合物或构建体或根据方面65的单价构建体在制备药物组合物中的应用，所述药物组合物用于预防和/或治疗与IL-6、与IL-6R、与IL-6/IL-6R复合物和/或与其中涉及IL-6、IL-6R和/或IL-6/IL-6R复合物的信号传导途径和/或生物学功能和反应相关的至少一种疾病和病症；和/或在一种或多种根据方面77至81中任一项的方法中的应用。
方面83.根据方面1至34中任一项的氨基酸序列、根据方面35至64中任一项的化合物或构建体或根据方面65的单价构建体，其用于预防和/或治疗与IL-6、与IL-6R、与IL-6/IL-6R复合物和/或与其中涉及IL-6、IL-6R和/或IL-6/IL-6R复合物的信号传导途径和/或生物学功能和反应相关的至少一种疾病和病症；和/或在一种或多种根据方面77至81中任一项的方法中的应用。
方面84.根据方面1至34中任一项的氨基酸序列、根据方面35至64中任一项的化合物或构建体或根据方面65的单价构建体的衍生物。
方面85.根据方面84的衍生物，其可以特异性结合IL-6R。
方面86.根据方面84至85中任一项的衍生物，其具有的血清半衰期是根据方面1至34中任一项的氨基酸序列本身、根据方面35至64中任一项的化合物或构建体本身或根据方面65的单价构建体本身的半衰期至少1.5倍，优选至少2倍，诸如至少5倍，例如至少10倍或大于20倍。
方面87.根据方面84至86中任一项的衍生物，与相应的根据方面1至34中任一项的氨基酸序列本身、根据方面35至64中任一项的化合物或构建体本身或根据方面65的单价构建体本身相比，其具有增加多于1小时、优选多于2小时、更优选多于6小时、诸如多于12小时、或还更优选多于24、48或72小时的血清半衰期。
方面88.根据方面84至87中任一项的衍生物，其在人中具有的血清半衰期是至少约12小时，优选至少24小时，更优选至少48小时，还更优选至少72小时以上；例如，至少5天(诸如约5至10天)，优选至少9天(诸如约9至14天)，更优选至少约10天(诸如约10至15天)，或至少约11天(诸如约11至16天)，更优选至少约12天(诸如约12至18天以上)，超过14天(诸如约14至19天)。
方面89.根据方面84至88中任一项的衍生物，其为聚乙二醇化衍生物。
方面90.组合物，其包含至少一种根据方面84至89中任一项的衍生物。
实施例
I.分离结合IL-6R的纳米抗体
实施例1：材料
用于分离结合IL-6R的纳米抗体的材料在表C-1中给出。
生成两种代表性的在EP0628639中描述的抗-人IL-6R免疫球蛋白(Fab片段和全长IgG)并将其用作参照化合物。该Fab片段和全长IgG是基于称为“RVLa”的L-链(参见EP0628639B1，表2，版本(a))和称为“RVHf’的H-链(参见EP0628639B1，表3，版本(f))构建的。选择这些特别的L-链和H-链是为了构建参照化合物的目的，因为根据EP0628639B1(参见例如第[0074]段)，包括所述L-链和所述H-链的改造过的人抗体显示以与PM1相同的水平结合人IL-6R的能力，PM1是针对人IL-6R的小鼠单克隆抗体(再次参见EP0628639B1，段落[009]和其中引用的其它参考文献)。
全长参照IgG由SEQIDNO：1(重链)和SEQIDNO：2(轻链)的氨基酸序列组成。Fab片段由SEQIDNO：3(与人IgG1的CH1区融合的重链区VLb和VHf)和SEQIDNO：4(与人Cκ融合的改造的人PM-1可变轻链)组成。
通过使用部分重叠寡核苷酸的组装PCR，产生编码DNA片段。将PCR产物克隆到单个双顺反子载体中，所述载体使得能够在大肠杆菌的周质中表达功能性的、二硫键连接的Fab片段。在用2个含有轻链和重链基因的表达载体转染的CHO细胞中生成全长IgG。通过将VHf与人IgG1的恒定区融合来产生编码重链的基因。轻链如EP0628639中所述。
实施例2：免疫
按照表C-2列出的免疫方案，用人IL-6R(Peprotech)免疫两头美洲驼(81和82)。
完成该免疫时间表之后，通过ELISA分析每头动物的免疫反应。为了这一目的，将生物素酰化的IL-6R(2μg/ml)捕获在中性链亲和素(neutravidin)包被的微量滴定板中。加入在第0，28，39和43天收集的血清样品的连续稀释液(起始稀释：1/500)，并且通过加入HRP标记的山羊抗-美洲驼IgG检测结合的美洲驼IgG。使用TMB作为底物。结果显示在图1中。
还通过FACS分析免疫反应：将在第0，28和43天收集的血清样品的连续稀释液(起始稀释：1/100)与U266细胞(人骨髓瘤)温育。通过FITC标记的山羊抗-美洲驼IgG检测结合的美洲驼IgG。结果显示在图2中。
这些数据一起显示两头动物都产生了良好的针对IL-6R的免疫反应，并且只是一部分美洲驼IgG识别U266细胞表面上的IL-6R。
实施例3：文库构建
将从PBLs和淋巴结中提取的RNA用作RT-PCR的起始原料，以扩增编码基因片段的纳米抗体。将这些片段克隆到从pUC119衍生的表达载体中，所述表达载体含有LacZ启动子、大肠杆菌噬菌体pIII蛋白编码序列、氨苄青霉素或羧苄青霉素抗性基因、多克隆位点和gen3前导序列。与编码纳米抗体的序列同阅读框，所述载体编码C-末端c-myc标签和(His)6标签。按照标准方法制备噬菌体，并且在过滤灭菌后保存在4℃备用。所构建的文库的特征显示在表C-3中。
实施例4：选择
使用在表C-4中总结的不同条件用上述文库进行选择。
对于所有条件，只进行一轮选择。关于富集因子(相对于对照，在洗脱物中存在的噬菌体#)、多样性(HinfI图谱)和IL-6R阳性克隆的百分数(ELISA)分析每次选择结果。基于这些参数，选择最好的选项进一步分析。为了该目的，将每次选择的结果作为一个汇合重新克隆到从pUC119衍生的表达载体中，所述表达载体含有LacZ启动子、氨苄青霉素或羧苄青霉素抗性基因、多克隆位点和gen3前导序列。与编码纳米抗体的序列同阅读框，所述载体编码C-末端c-myc标签和(His)6标签。挑取菌落，并且在96孔深平板(1ml体积)上生长，并且通过加入IPTG诱导纳米抗体表达。按照标准方法制备周质提取物。
实施例5：筛选
首先分析周质提取物，分析它们抑制IL-6-IL-6R相互作用的能力。为了该目的，建立2次独立的α筛选测定，并且在图3中示意性描述。在测定1中，将周质提取物与可溶的IL-6受体(1nM)、生物素酰化的IL-6(3nM)、链霉抗生物素蛋白包被的供体珠和MAbBN-12包被的接纳体珠(20μg/ml)一起温育。在该测定中为阳性的纳米抗体可以抑制IL-6/IL-6R相互作用或IL-6R-MAbBN-12相互作用。为了区分这两种可能性，建立第二测定(测定2)。在该测定中，将周质提取物与bio-IL-6R(0.3nM)、链霉抗生物素蛋白包被的供体珠和MAbBN-12包被的接纳体珠(10μg/ml)一起温育。将在测定1中是阳性的但在测定2中是阴性的纳米抗体视为IL-6-IL-6R抑制剂。
在两种测定中，周质提取物稀释25倍，其大概对应40nM的终浓度。筛选尝试的统计学总结显示在下表C-5中。选择显示最强的抑制的纳米抗体在Biacore上进行解离速率分析并进行DNA测序。图4显示抑制性纳米抗体的蛋白序列，将其选择用于在基于细胞的测定中的进一步分析。表C-6显示这些抑制剂纳米抗体的koff-值。
实施例6：纳米抗体表达和纯化
将所选的纳米抗体在大肠杆菌中在50或250ml的培养体积中表达为c-myc、(His)6-标记的蛋白。通过加入1mMIPTG且允许在37℃继续4小时而诱导表达。在离心细胞培养物后，通过冻融沉淀物而制备周质提取物。将这些提取物用作固定的金属亲和层析(IMAC)的起始原料。将纳米抗体用150mM咪唑从柱上洗脱下来，并且随后针对PBS透析。总产量和每升细胞培养物的产率列在表C-7中。纯化的纳米抗体(除了PMP28E11以外)的SDS-PAGE显示在图5中。
实施例7：基于蛋白的竞争测定
在α筛选中检测所述14种纯化的纳米抗体，检测对IL-6/IL-6R相互作用的抑制。将纯化的蛋白的连续稀释液(浓度范围：500nM-10pM)加入到IL-6R(0.3nM)中，并且温育15分钟。随后加入3nMbio-IL-6和BN-12-包被的接纳体珠，并且将该混合物温育1小时。最后加入链霉抗生物素蛋白供体珠，并且在1小时温育之后，在Envision微量平板读数仪上读取该平板。包括在实施例1中描述的BR-6和Fab片段作为参照。结果显示在图6中。
对于所有14种纳米抗体观察到剂量-反应曲线，IC50-值在48pM-1.7nM范围之内(表C-8)。该测定中最有效的纳米抗体是PMP32C9和PMP35H4。对于PMP33A3，可以实现对IL-6/IL-6R相互作用的仅部分(～50％)抑制。
实施例8：获得的纳米抗体的亲和性确定
在Biacore3000仪器上通过表面等离子共振(SPR)确定单个纳米抗体和实施例1中描述的参照Fab片段的亲和常数(Kd)。简言之，将IL-6R以800-1000RU的密度胺-偶联到CM5传感器芯片上。以1-50nM范围内的5个不同浓度注射纳米抗体。在所有实验中流速为45μl/min。缔合和解离阶段分别是3和10分钟。将芯片使用甘氨酸/HClpH1.5再生。使用在不同纳米抗体浓度下获得的结合曲线来计算动力学参数kon，koff和Kd(表C-9)。
实施例9：纳米抗体在XG1测定中的基于细胞的效力
在XG1测定中检测所有纯化的纳米抗体。XG1是IL6-依赖型人骨髓瘤细胞系。在～20pg/ml的IL-6获得半最大增殖。测定基本上如Zhang等(1994，血液(Blood)83：3654-3663)的描述进行。包括如实施例1所述的参照Fab片段作为参照。IC50值在90pM至50nM范围内，如在表C-10中列出。还在该测定中在存在1mg/mlHSA下检测一小子集的纳米抗体。
实施例10：在TF1测定中纳米抗体的基于细胞的效力
还检测纳米抗体它们通过阻断IL-6与细胞表面上IL-6R的结合来抑制TF-1细胞(ECACCno.93022307；1989，细胞生理学杂志(J.CellPhysiol.)，140：323；1993，实验细胞研究(Exp.CellRes.)，208：35)的IL-6-依赖性增殖的能力。为此目的，将一系列纳米抗体稀释物与固定量的TF-1细胞在37℃预温育2小时。随后，将IL-6加至2ng/ml的终浓度。使得IL-6-依赖性细胞增殖继续72小时，并且通过氚标记的胸苷的掺入来测量。IC50值在表C-11中列出。
实施例11：与参照Fab竞争结合IL-6R
分析所有14种纳米抗体，分析它们在基于α筛选的测定中抑制实施例1所述的参照Fab与IL-6R结合的能力。在该测定中，将100nM纯化的纳米抗体与0.4nM生物素酰化的IL-6R温育。将参照Fab包被的接纳体珠和链霉抗生物素蛋白包被的供体珠加入，并且测量参照-Fab/IL-6R复合物的浓度。将在纳米抗体存在下获得的值与不加入纳米抗体下的对照进行比较，并且这两个值之间的比率，表示为％，在表C-12中列出。所有的纳米抗体，除了IL6R03以外，未显示或仅显示对参照Fab与IL-6R结合的部分抑制，提示它们的表位不与参照Fab的表位重叠或仅部分重叠。
实施例12：纳米抗体与U266细胞的结合
在FACS中分析纳米抗体与在U266细胞上表达的膜结合的IL-6R的结合。对于从选择的克隆纯化的纳米抗体(IL6R04，IL6R09，IL6R11，IL6R13和IL6R14)进行了分析。结果显示在图7中。所有纳米抗体都能够结合细胞表面表达的人IL-6R。
实施例13：纳米抗体与来源于血浆的人IL-6R的结合
可溶性IL-6R在人血浆中以80-400ng/ml的浓度存在。为了确定纳米抗体IL6R03，IL6R04和IL6R13是否能够结合来源于血浆的IL-6R，评估人血浆对于与U266细胞结合的纳米抗体的影响。人血浆抑制对U266细胞的结合，这表明所有3种纳米抗体都能够结合来源于血浆的人IL-6R(参见图8)。
实施例14：纳米抗体对小鼠IL-6R的交叉反应性
在ELISA中分析纳米抗体对小鼠IL-6R的交叉反应性。为此，将500nM的纳米抗体加至用1μg/ml小鼠和人IL-6R包被的微量滴定板。用抗-myc和抗-小鼠-HRP分别作为第一和第二抗体进行检测。最适密度显示在图10中。对于任何检测的纳米抗体都没有观察到与小鼠IL-6R的结合。
实施例15：结合IL-6R的纳米抗体的分离的总结
用重组IL-6R免疫2头美洲驼获得了一组14种独特的纳米抗体，其能够阻断IL-6和IL-6R之间的相互作用。对该组进行详细分析，基于所有实验数据，选择纳米抗体IL6R03，IL6R04和IL6R13进行进一步开发。最重要的纳米抗体特性总结在表C-13中。
II.将抗-IL-6R纳米抗体格式化
实施例16：制备多价构建体
在之前段落中描述的抗-IL-6R纳米抗体也表达为双特异性构建体，其由C-末端抗-SA纳米抗体(ALB1)、9氨基酸Gly/Ser接头和N-末端抗-IL-6R纳米抗体组成。另外，构建4个三价、双特异性纳米抗体，其由C-末端和N-末端抗-IL-6R纳米抗体、中间的抗-SA纳米抗体(ALB1)组成，它们全部通过9氨基酸Gly/Ser接头连接。这些纳米抗体的IDs在表C-14中列出。
实施例17：表达双特异性抗-IL-6R纳米抗体.
双特异性纳米抗体构建体在大肠杆菌中表达为c-myc，(His)6-标记的蛋白，并且随后通过固定的金属亲和性层析(IMAC)和大小排阻层析(SEC)从培养基中纯化。总产率和每升细胞培养物的产率在表C-15中列出。纯化的纳米抗体的SDS-PAGE显示在图11中。
实施例18：基于蛋白的竞争测定
在α筛选中检测纯化的双特异性纳米抗体对IL-6/IL-6R相互作用的抑制。将纯化的蛋白的连续稀释液(浓度范围：250nM-5pM)加入到IL-6R(0.3nM)中，并且温育15分钟。随后加入3nMbio-IL-6和BN-12-包被的接纳体珠，并且将该混合物温育1小时。最后加入链霉抗生物素蛋白供体珠，并且在1小时温育之后，在Envision微量平板读数仪上读取该平板。包括在实施例1中描述的BR-6和Fab片段作为参照。结果显示在图12中。
对于所有纳米抗体观察到剂量-反应曲线，IC50-值在123pM至1.67nM范围之内(表C-16)。
实施例19：在XG1测定中纳米抗体的基于细胞的效力
在XG1增殖测定中检测双特异性纳米抗体。IC50值在60pM至65nM范围内。还在该测定中在存在1mg/mL人血清白蛋白下检测纳米抗体。对于双特异性纳米抗体，IC50值范围在190pM至90nM内。包括如实施例1所述的参照IgG作为参照。IC50值列出在表C-17中。
当格式化纳米抗体在XG1测定中在存在白蛋白下检测时，观察到效力的丧失。在血清白蛋白的存在下，格式化纳米抗体IL6R24，IL6R44和IL6R49的效力优于参照IgG或者与参照IgG在相同范围内。
实施例20：测定对IL-6R的亲和性
双特异性纳米抗体与IL-6R的结合通过表面等离子共振分析。测定动力学参数并将其列出在表C-18中。对于二价形式的纳米抗体(IL6R23，IL6R24，IL6R33)没有观察到对IL-6R的亲和性的显著丧失。
实施例21：确定对血清白蛋白的亲和性
通过表面等离子共振分析格式化纳米抗体与血清白蛋白的结合。确定亲和常数(Kd)并在表C-19中列出。包括结合白蛋白的纳米抗体Alb-1(SEQIDNO：97)用于比较。亲和性在之前格式化的含有相同抗血清白蛋白构件的纳米抗体的范围内，然而，通常观察到更低的亲和性。对于小鼠血清白蛋白亲和性特别是这样的。
实施例22：格式化纳米抗体与U266细胞的结合
通过FACS分析来自所选克隆的格式化纳米抗体(IL6R23，IL6R24，IL6R29，IL6R33，IL6R44和IL6R53)与U266细胞的结合。结果显示在图13和14中。与单价构件相比，二价纳米抗体IL6R23，IL6R24，IL6R29和IL6R33显示减少的结合，而对于三价纳米抗体IL6R44和IL6R53观察到类似的结合。
III.抗-IL-6R纳米抗体的序列优化
实施例23：序列优化策略
将纳米抗体IL6R03，IL6R04和IL6R13的蛋白序列各自与5个共享最高同源性程度的最接近的人种系进行比对(图15)。在构架区相对于人种系共有序列的氨基酸差异用颜色标记。选择浅灰色突出的氨基酸差异用于转变为人相应部分，而深灰色突出的氨基酸则不动。对于所述3种纳米抗体的每一种，最初产生一组4个序列优化的变体(阶段1)。分析这些变体的多个参数，将所获得的结果用于设计第二组纳米抗体(阶段2)。所有序列优化的变体的蛋白序列在图16中显示。
实施例24：序列优化阶段1
在序列优化方法的阶段1中，产生和分析了下列12种变体：
IL6R03：IL6R61，IL6R62，IL6R63和IL6R64
IL6R04：IL6R71，IL6R72，IL6R73和IL6R74
IL6R13：IL6R81，IL6R82，IL6R83和IL6R84
这些不同变体的氨基酸序列在图16中显示。
在IL-6/IL-6R竞争测定中评估序列优化的纳米抗体
在α筛选中检测IL6R03，IL6R04和IL6R13的序列优化的克隆对IL-6/IL-6R相互作用的抑制。将纯化的纳米抗体的连续稀释液加入到IL-6R(0.3nM)中，并且温育15分钟。随后加入3nMbio-IL-6和BN-12-包被的接纳体珠，并且将该混合物温育1小时。最后加入链霉抗生物素蛋白供体珠，并且在1小时温育之后，在Envision微量平板读数仪上读取该平板。包括亲代克隆作为参照。结果显示在图17，图18和图19中。
IL6R03的序列优化的变体(IL6R61，62和64)具有的IC50值都在IL6R03的IC50值的2-倍范围内，而IL6R63显示～4倍低的IC50值。
对于IL6R04的序列优化变体，在IL6R04和4种序列优化的变体之间没有观察到IC50值的显著差异。
对于IL6R13的序列优化变体，IL6R81和IL6R83的IC50值几乎与IL6R13的相同，而在构架2中携带RAT→KGL突变的2个变体(IL6R82和IL6R84)效力降低。
亲和性测定
还在Biacore上分析IL6R03，IL6R04和IL6R13的序列优化变体对IL-6R的结合。动力学参数在表C-20中列出。
对于IL6R03的序列优化的变体，IL6R61，62和63的Kd值都在IL6R03的Kd值的2-倍范围内。没有测定IL6R64的Kd。
对于IL6R04的序列优化的变体，在IL6R04和4种序列优化的变体之间没有观察到Kd值的显著差异。
对于IL6R13的序列优化的变体，IL6R81和IL6R83的Kd值非常类似于IL6R13的Kd，而在构架2中携带RAT→KGL突变的2个变体(IL6R82和IL6R84)显示亲和性严重降低。
总之，这些观察与基于α筛选的竞争测定中获得的结果完全一致。
实施例25：序列优化阶段2
基于阶段1的亲和性和效力数据，决定产生下列一组变体：
·对于IL6R03，将在变体IL6R61，62，63和64中存在的所有突变组合以产生ILR65。
·对于IL6R04，将存变体IL6R71，72，73和74中存存的所有突变组合以产生ILR75。
·对于IL6R13，产生一组6个存FR2的RAT序列中携带不同突变(组合)的新变体(IL6R85-90)。将这些突变引入IL6R83背景中，因为该序列优化的变体与IL6R13在亲和性和效力方面都不能区分。
序列优化的IL6R13变体的解离速率分析
在Biacore上作为周质提取物分析序列优化的变体IL6R85-90。使用解离曲线来计算koff值(表C-21)。纳米抗体IL6R87-89的解离速率与IL6R13类似，而纳米抗体IL6R85，86和90具有10倍更高的解离速率。
在IL-6/IL-6R竞争测定中评估序列优化的纳米抗体
作为周质提取物检测序列优化的变体IL6R85-90，检测它们在α筛选中阻断IL-6/IL-6R相互作用的能力。结果显示在图20中。
纳米抗体IL6R87，88和89比IL6R13变体85，86和90在阻断IL-6/IL-6R相互作用中更有效。这些结果与Biacore上观察到的完全一致。比较序列优化的IL6R13变体的氨基酸序列揭示：突变T45L负责解离速率和效力的降低。因此，选择没有T45L突变的最人样变体，即IL6R88，用于进一步表征。
将该变体与纯化的克隆IL6R65和IL6R75一起表达、纯化和分析对于IL-6/IL-6R相互作用的抑制。在不同序列优化的克隆(IL6R65，IL6R75和IL6R88)和它们相应的非序列优化的形式(分别地IL6R03，IL6R04和IL6R13)之间没有观察到显著差异(图21)。
亲和性测定
在Biacore3000仪器上通过表面等离子共振确定序列优化的克隆IL6R65，75和88对于人IL-6R的亲和常数(Kd)。简言之，将人IL-6R以800-1000RU的密度胺-偶联到CM5传感器芯片上。使其余的活性基团失活。以0.5至50nM范围内的不同浓度评估纳米抗体结合。每个样品以45μl/min的流速注射4分钟，以允许结合至芯片结合的抗原。接下来，将不含纳米抗体的结合缓冲液以相同流速递送至芯片上，以允许结合的纳米抗体的解离。IL6R03，04和13的序列优化的变体的动力学参数在表C-22中给出。
在亲代和序列优化的纳米抗体之间未观察到亲和常数的重大差异。
基于细胞的效力测定
在XG-1测定中分析序列优化的纳米抗体。结果显示在图22中。将IC50值总结在表C-23中。在基于细胞的测定中，序列优化对于中和IL-6-诱导的增殖的效力方面没有显著影响。
IV.序列优化的纳米抗体的附加表征
实施例26：对于食蟹猴IL-6R的亲和性测定
在Biacore3000仪器上通过SPR确定IL6R03-IL6R65，IL6R04-IL6R75和IL6R13-IL-6R88对于食蟹猴IL-6R的亲和性。简言之，将食蟹猴IL-6R以760RU的密度胺-偶联到CM5传感器芯片上。使其余的活性基团失活。以1.25至100nM范围内的不同浓度评估纳米抗体结合。每个样品以45μl/min的流速注射4分钟，以允许结合至芯片结合的抗原。接下来，将不含纳米抗体的结合缓冲液以相同流速递送至芯片上，以允许结合的纳米抗体的解离。动力学参数在表C-24中总结。
尽管在IL6R04和IL6R75的亲和常数上有相当一些差异，但是从该实验清楚的是，两种分子对于食蟹猴IL-6R的亲和性要显著小于对人的亲和性。与此相反，IL6R03和IL6R65对于食蟹猴IL-6R的亲和常数与对于人IL-6R的亲和常数是处于同一范围内。惊人地，IL-6/IL-6R/gp130复合物的晶体结构(Boulanger等)揭示，IL-6R上的IL-6结合位点在人和食蟹猴之间完全保守，这提示IL6R04与不同表位结合。
实施例27：使用人和食蟹猴血浆在血浆效力测定中检测序列优化的纳米抗体
为了评估IL6R65和IL6R75与食蟹猴IL-6R的交叉反应性，使用人或食蟹猴血浆作为sIL-6R来源来进行血浆效力ELISA。在该测定中，将纳米抗体的一系列稀释液与血浆和人IL-6(50ng/mL)预温育。随后，将血浆sIL-6R捕获在BN-12包被的平板上，使用生物素酰化的多克隆抗体和链霉抗生物素蛋白-HRP检测结合的IL-6。
如从图23A中可以观察到，IL6R201和IL6R65都能够完全阻断IL-6与人sIL-6R的结合，但是IL6R65似乎比IL6R201效力小，并且比在实施例1中描述的参照IgG和参照Fab效力小。如在图23B中可以观察到，IL6R65能够完全阻断IL-6与食蟹猴sIL-6R的结合，其效力与实施例1中描述的参照Fab相当。
实施例28：在高IL-6浓度下在血浆效力测定中检测序列优化的纳米抗体
还使用在人血浆中的血浆效力测定来检测纳米抗体阻断高浓度IL-6的能力。将IL6R04，IL6R65和在实施例1中描述的参照Fab在IL-6的EC50(50ng/mL)和在IL-6的EC95(885ng/mL)下检测。结果描述在图24中。清楚地，IL6R04似乎是在IL-6的EC50下最有效的化合物。在EC95下，参照Fab和IL6R65仍能完全阻断血浆sIL-6R，尽管是以更高的浓度阻断，这显示这2种分子结合与IL-6结合位点重叠的表位。参照Fab的IC50从0.55nM增加至8.47nM，并且IL6R65的IC50从2.61nM增加至66.25nM。
实施例29：Biacore竞争研究
进行Biacore实验来研究IL-6和IL6R65是否能够同时结合IL-6R。参照Fab(图25A)，IL6R201/75(图25B)或IL6R65(图25C)被捕获在IL-6R上，之后允许IL-6与复合物结合。使用参照Fab和IL6R65，几乎不能观察到IL-6的结合。当IL-6被捕获在IL-6R上并且注射纳米抗体时，所有三种纳米抗体似乎都能够结合复合物。然而，在参照Fab和IL-6R65的情况中，这可能是因为IL-6被替代，这是由于IL-6对于IL-6R的低亲和性。
最后，在存在或不存在纳米抗体的情况下使得IL-6R结合IL-6包被的芯片(图25D)。这证实了早期结果，即在参照Fab或IL6R65的存在下IL-6R不能被捕获。
总之，Biacore表位作图实验显示，参照Fab和IL6R65两者靶向的表位与IL-6相同。尽管IL6R65和参照Fab能够完全阻断IL-6与IL-6R的结合，但是当该纳米抗体与受体结合时，IL6R201不能够防止IL-6与IL-6R的结合。
V.IL6R65的亲和性成熟
实施例30：亲和性成熟的多样化策略
使用下列2个策略，将纳米抗体IL6R65的CDR区域随机化：
1.每个CDR残基被一组具有类似侧链化学的残基替换：
K ↔ R
A ↔ S ↔ T
I ↔ L ↔ V
F ↔ Y
N ↔ D
Q ↔ E
G → A
M → L
H，C，W，P保持不变。
2.每个CDR残基被一组天然存在于该位置的氨基酸替代。仅引入在每个位置上最频繁出现的氨基酸，以便限制每个位置的多样性。该方法仅用于CDR1和CDR2的随机化。
使用上述2种策略进行CDR1和2的同时随机化，CDR3单独根据策略1进行随机化，获得总共3个文库。所有3个文库是通过使用简并寡聚物通过PCR重叠延伸而内部制备的。每个文库的理论多样性约为1x10e6。将编码纳米抗体变体的片段克隆到噬菌体展示载体中。所有3个文库的确切大小约为1x10e8(100x理论多样性覆盖率)。在溶液中使用不同浓度的生物素酰化的IL-6R(0，1，10和100pM)进行一轮选择。在这些条件下对于CDR3文库未观察到富集，而对于CDR1/2文库两者观察到了剂量依赖性富集。在ELISA中作为周质提取物分析来自CDR1/2文库的输出物，并将具有最高信号的克隆随后在Biacore上检测。在ELISA中的最佳30个克隆显示在2.1x10e-3和2.6x10e-4s-1之间的解离速率。将具有最慢解离速率的5个纳米抗体测序、表达和纯化(图26)。
实施例31：纳米抗体表达和纯化
将亲和性成熟的纳米抗体在大肠杆菌中在250ml的培养体积中表达为c-myc、(His)6-标记的蛋白。通过加入1mMIPTG且允许在37℃继续4小时而诱导表达。在离心细胞培养物后，通过冻融沉淀物而制备周质提取物。将这些提取物用作固定的金属亲和层析(IMAC)的起始原料。将纳米抗体用150mM咪唑从柱上洗脱下来，并且随后在Hiprep26/10柱上脱盐。
实施例32：在Biacore上的亲和性成熟的变体的亲和性测定
将纳米抗体IL6R65(序列优化的)和5种亲和性成熟的变体在Biacore上分析。记录不同浓度的纯化纳米抗体的结合曲线，并用于计算亲和常数。这5个克隆的Kd-值在0.34和0.95nM之间，最佳变体对应于相对于IL6R65(亲代纳米抗体)的13倍提高(图27)。
实施例33：在血浆效力测定中评估亲和性成熟的变体
还将所有5种亲和性成熟的纳米抗体和序列优化的纳米抗体在血浆效力测定中检测。在该测定中，将不同浓度的纳米抗体与来自人或食蟹猴的含有可溶性IL-6R的血浆和固定浓度的人IL-6(2.4或42nM)混合。在1小时温育后，将混合物转移至用抗-IL-6RMAbBN-12(Diaclone)包被的Maxisorp平板。通过随后加入生物素酰化的抗-IL-6多克隆抗体(R&DSystems)和链霉抗生物素蛋白-HRP确定结合的IL-6的量。将TMB用作底物。在450nm测量底物转化率(图28)。
实施例34：在TF-1测定中评估亲和性成熟的变体
还检测亲和性成熟的纳米抗体，检测它们通过阻断IL-6与细胞表面上IL-6R的结合来抑制TF-1细胞(ECACCno.93022307；1989，细胞生理学杂志(J.CellPhysiol.)，140：323；1993，实验细胞研究(Exp.CellRes.)，208：35)的IL-6-依赖性增殖的能力。为此目的，将一系列纳米抗体稀释物与固定量的TF-1细胞在37℃预温育2小时。随后，将IL-6加至2ng/ml的终浓度。使得IL-6-依赖性细胞增殖继续72小时，并且通过氚标记的胸苷的掺入来测量(图29)。
亲和性成熟的纳米抗体的IC50值比IL6R65好至多17倍，但是所有变体仍比参照IgG效力低。
实施例35：Biacore竞争研究
进行Biacore实验来研究IL-6和IL6R65及其2种亲和性成熟的变体(7D6和7C4)是否能够同时结合IL-6R。在这些实验中，IL-6R被捕获在BN-12包被的芯片上，并用纳米抗体IL6R65(图30A)，7D6(图30B)或7C4(图30C)饱和。接下来，通过注射100nM浓度的细胞因子来评估IL-6与IL-6R-纳米抗体复合物的结合。此外，还测定3种纳米抗体与同IL-6复合的IL-6R的结合。
IL6R65的结果(图30A)可与之前观察到的结果相当，证实IL6R65和IL-6识别IL-6R上的相同表位。如所预期地，IL6R65亲和性成熟的变体和IL-6也识别IL-6R上的相同表位(图30B-C)。
实施例36：进一步的亲和性成熟
接下来，产生一组47种纳米抗体，其在CDR1/2和CDR3中含有不同的有益突变组合。这些突变通过对从CDR随机化文库中分离的所有纳米抗体克隆的蛋白序列和解离速率进行透彻分析来鉴定。这些第2代克隆的解离速率范围是从4.2E-04至4.5E-05s-1。选择显示最慢解离速率的5个克隆(20F6，20A11，20E10，21A10，21D11)进行进一步分析。序列在图31中列出。
实施例37：第二轮变体的纳米抗体表达和纯化
将亲和性成熟的纳米抗体在大肠杆菌中在250ml的培养体积中表达为c-myc、(His)6-标记的蛋白。通过加入1mMIPTG且允许在37℃继续4小时而诱导表达。在离心细胞培养物后，通过冻融沉淀物而制备周质提取物。将这些提取物用作固定的金属亲和层析(IMAC)的起始原料。将纳米抗体用150mM咪唑从柱上洗脱下来，并且随后在Hiprep26/10柱上脱盐。
实施例38：测定熔融温度
在热迁移测定中分析纳米抗体的热稳定性。所有亲和性成熟的纳米抗体的Tm值类似，并且与IL6R65相比稍微较高。Tm值在表C-25中列出。
实施例39：第2轮变体在Biacore上的亲和性测定
在BiacoreT100上测定纳米抗体IL6R65(序列优化的)和5种亲和性成熟的变体的动力学参数。从在2种不同浓度的纯化纳米抗体和固定浓度的IL-6R下的结合曲线确定缔合速率(ka)，所述IL-6R通过mAbBN-12被捕获在芯片上。在单个纳米抗体浓度下使用与芯片共价偶联的IL-6R来测定解离速率。在表C-26中列出了关于ka，kd和Kd的值。
实施例40：在TF-1测定中评估第2轮变体
在TF1测定中评估第2轮变体的生物学活性，并且数据在图32中显示。该第2轮亲和性成熟的克隆具有是第1轮克隆7C45-8倍高的效力，并且是在实施例1中描述的基准参照IgG效力的2.5-4倍。性能最好的克隆是20A11，其具有0.4nM的IC50(与基准相比，4-倍高的效力)。
实施例41：在血浆效力测定中评估第2轮变体
在高和低IL-6浓度下在血浆效力测定中分析可溶性IL-6R的抑制。在血浆效力测定(0.1-0.2nM)(其为该测定的敏感度范围)中第2轮变体至少与参照IgG同样有效。在高IL-6浓度(EC95)下，亲和性变体仍能够阻断IL-6与sIL-6R的结合，并且似乎是参照IgG的效力的3-4倍。在该测定中在第1轮和第2轮变体之间不能观察到差异。如所预期地，所有检测的克隆是食蟹猴交叉反应性的(图33)。
实施例42：与全血中的人PBMC的结合
在FACS中检测纯化的纳米抗体IL6R65和PMP20A11与人PBMC的结合。使用生物素酰化的抗-HismAb和PE-标记的链霉抗生物素蛋白来检测细胞结合(图34)。IL6R65和亲和性成熟的变体PMP20A11两者都可以结合嗜中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞亚群。这与IL-6R的表达图谱一致。
VI.亲和性成熟的纳米抗体的格式化
实施例43：制备多价构建体
将PMP20A11格式化为具有结合白蛋白的纳米抗体ALB8的二价和三价纳米抗体。不同纳米抗体的概述在表C-27中提供。
实施例44：在TF-1测定中中和膜IL-6R
在第一个实验中，使用TF-1细胞系作为模式系统，证实格式化纳米抗体是否抑制通过IL-6R的信号传导。纳米抗体20A11，IL6R304，IL6R305和IL6R306剂量依赖性地和完全阻断IL-6诱导的通过膜IL-6R介导的TF-1细胞的增殖(图35，表C-28)。
这些结果证明所有格式化的纳米抗体比实施例1中所述的参照IgG更有效地抑制膜IL-6R活性。与其单价等价物IL6R304相比，IL6R305以7倍更有效地抑制IL-6介导的反应，证实IL6R305与膜IL-6R的强烈(avid)相互作用。IL6R306没有IL6R305有效并且仅显示是IL6R3042倍好的效力。这证明IL6R306的格式化是较不有利的，此外指示IL6R306的强烈结合是不可能的。
接下来，证实格式化纳米抗体是否仍能完全抑制在生理浓度的IL-6下通过IL-6R的信号传导。事实上，20A11，IL6R304，IL6R305和IL6R306剂量依赖性地和完全阻断通过5000IU/mLIL-6诱导的TF-1细胞的增殖(图36，表C-29)。如所预期地，与用100IU/mL进行的实验相比，IC50没有变化。与先前结果一致，在阻断IL-6诱导的通过膜IL-6R的信号传导方面，IL6R305是最有效的。
由于纳米抗体的确与IL-6R相互作用，证实纳米抗体与该受体的结合是否可能诱导导致细胞增殖的细胞活化。将TF-1细胞与过量的纳米抗体在存在或不存在100IU/mLIL-6的情况下温育(图37)。如所期望地，IL6R304和IL6R305两者都完全防止IL-6介导的增殖。实际上，IL6R305和IL6R306将IL-6增殖抑制至背景(在缺少生长因子下测量的3H-胸苷掺入)相同的水平，证实IL6R304和IL6R305完全阻断IL-6的作用。
在缺少生长因子的情况下，IL6R304和IL6R305不诱导TF-1细胞的增殖，提示这些化合物对于TF-1细胞不具有激动作用。
实施例45：格式化亲和性成熟的纳米抗体在ELISA中中和sIL-6R
在血浆效力ELISA中分析构件IL6R20A11及其格式化变体防止人IL-6与血浆sIL-6R结合的能力。由于血浆sIL-6R的浓度可变，在不同测定中需要使用相同血浆以比较纳米抗体的效力。此外，将IL-6滴定首先在血浆中温育以确定可以与纳米抗体一起使用的IL-6的浓度。人血浆中IL-6的EC50和EC95值分别测定为27.29ng/mL和885ng/mL。这些浓度随后用于在正常和高浓度的IL-6下检测纳米抗体的效力。
将IL6R20A11和格式化变体与实施例1中描述的参照IgG比较。对于不同纳米抗体获得的IC50值总结在表C-30中。在IL-6的EC50下(图38A，B)，单价和二价IL-6R纳米抗体都在与参照IgG的相同范围内。尽管IL6R304仅具有一个结合位点，但是它具有与参照IgG相似的IC50(0.229nMvs.0.258nM)。IL6R305似乎是IL6R304效力的两倍(IC50为0.137nM)，这与其有两个结合位点一致。然而，IL6R306似乎没有IL6R304和参照IgG有效，并且具有0.412nM的IC50。
非常可能地在敏感性方面达到测定界限。事实上，血浆sIL-6R的浓度是～30ng/mL或0.6nM。因此，仅0.3nM的sIL-6R需要被纳米抗体(50％血浆)阻断，这意味着可以获得的最小IC50是0.15nM。这与所获得的IC50值相对应。然而，如果IL-6浓度增加至885ng/mL，纳米抗体将更难以与IL-6竞争并且可以检测到效力方面的更大差异。事实上，在高IL-6浓度下，IL6R20A11，IL6R304和IL6R305明显比参照IgG更有效，而IL6R306则不比参照IgG更有效(图38C，D)。高和低浓度IL-6下的IC50的比率在表C-30中显示。清楚地，参照IgG和IL6R306受增加的IL-6的影响比其它纳米抗体更大。这也在TF-1测定中观察到(参见实施例44)。
实施例46：格式化亲和性成熟的纳米抗体与膜IL-6R的结合
为了阻断IL-6的信号传导，可溶性和膜IL-6R两者都需要被纳米抗体中和。因此，通过流式细胞仪分析不同格式化的纳米抗体与表达IL-6R的细胞的结合。
与表达IL-6R的CHO细胞的结合
将表达人IL-6R的稳定转染的CHO细胞用于分析抗-IL-6R纳米抗体与膜IL-6R的结合(图39A)。将IL-6R阴性CHO细胞用作阴性对照(图39B)。所有4种纳米抗体均显示饱和的与表达IL-6R的细胞的结合，而在高纳米抗体浓度下对于IL-6R阴性细胞仅检测到非常低的信号。
将中值PE荧光输出至GraphPad并拟合4PL曲线以确定EC50值。这些总结在表C-31中。与TF-1测定相反，IL6R305似乎不受益于该设定中的抗体亲抗原性作用：它仅为IL6R304效力的两倍(0.8984vs.1.939nM)。TF-1和血浆ELISA的情形也是如此，IL6R306与IL-6R阳性细胞的结合要差一些。
与外周血白细胞的结合
将人PBL用于证明纳米抗体与膜IL-6R在生理条件下的结合。该基质与体内情形高度相关，因为它含有HSA(～50mg/mL)，sIL-6R(～30ng/mL)，表达膜IL-6R的细胞(CD4+T细胞，单核细胞，粒细胞)和IL-6R-阴性细胞(大多数循环B细胞，CD8+T细胞)。将纳米抗体在来自2名供体的EDTA处理的血液中温育，并通过流式细胞仪检测结合的纳米抗体。基于FSC/SSC性质门控(gate)淋巴细胞、单核细胞和粒细胞(图40)，并且结合的纳米抗体在PE通道中检测。
如可以在图40(右)中看到，粒细胞和单核细胞被纳米均匀地染色。与此相反，仅一部分淋巴细胞被染色。这可以观察为PE直方图中的双峰。在与不同浓度的纳米抗体温育后3个门控的群体的荧光平均值在图41中描述，获得的EC50值总结在表C-32中。
实施例47：格式化亲和性成熟的纳米抗体对于人和食蟹猴血清白蛋白的亲和性
在Biacore3000仪器上通过SPR进行双特异性、二价和三价纳米抗体IL6R304，IL6R305和IL6R306对于人和食蟹猴血清白蛋白的动力学分析。结果显示在图42中并总结在表C-33中。纳米抗体IL6R304，305和306对于人和食蟹猴SA显示了类似的动力学速率常数和亲和性(17-23nM)。格式化IL-6R纳米抗体对于SA的亲和性与单价抗-SA纳米抗体ALB11相比低6.5x，缔合速率降低2.5倍，并且解离速率增加2.5倍。
实施例48：对于人和食蟹猴IL-6R的亲和性
通过SPR在BiacoreT100仪器上进行对于人和食蟹猴IL-6R的动力学分析。由于当将IL-6R直接固定在芯片上时指示其有构象变化，故在被BN-12捕获的IL-6R上测量结合速率。在直接固定的IL-6R上测量解离速率，因为缺乏具有比纳米抗体-IL-6R相互作用更低的解离速率的捕获工具可用。结果在表C-34和图43中显示。
通过用抗-SA构件(IL6R304)格式化，20A11(IL6R300；SEQIDNO：66)的结合速率降低少于2倍。IL6R304对于人IL-6R的解离速率在Biacore仪器的检测界限或低于检测界限。对于食蟹猴IL-6R的解离速率是人IL-6R的≥2倍高，但是仍接近检测界限。关于IL6R304计算的亲和性对于人IL-6R是≤14pM，对于食蟹猴IL-6R是25pM。
实施例49：IL6R20A11的物种交叉反应性
在使用食蟹猴血浆的血浆效力ELISA中分析IL6R20A11及其格式化变体与食蟹猴sIL-6R的交叉反应性。此外，使用竞争性ELISA来确定IL6R20A11与食蟹猴和小鼠sIL-6R的交叉反应性。
血浆效力ELISA
将人IL-6滴定首先与食蟹猴血浆温育，并且测定IL-6的EC50值为50.11ng/mL。将该浓度的IL-6随后用于检测纳米抗体与食蟹猴血浆sIL-6R的交叉反应性。如在图44中可以看到，IL6R20A11和格式化变体清楚地与食蟹猴sIL-6R交叉反应。在人血浆中可以观察到相同的评分等级(ranking)，并且人vs.食蟹猴血浆的IC50值比率对于所有化合物是类似的(表C-35)。
竞争ELISA
如果BN-12能够捕获来自特定物种的血浆sIL-6R和如果可以检测IL-6与sIL-6R的结合，才可以使用血浆效力ELISA。因此，开发一种更一般的竞争ELISA。该测定是基于IL6R20A11与中性链亲和素-捕获的IL-6R-bio的结合。简而言之，将0.4nM的IL6R20A11与来自不同物种的含有内源性sIL-6R的滴定系列的血浆预温育，之后将游离IL6R20A11捕获在固定在中性链亲和素包被的平板上的生物素酰化的人sIL-6R上，并使用抗-VHHmAb：FITC和抗-FITC-HRP检测。0.4nMIL6R20A11的浓度对应于产生50％最大信号的浓度(EC50为0.35±0.021nM；n＝4)。
如可以在图45中看到，IL6R20A11明显地与食蟹猴sIL-6R交叉反应，这证实了Biacore的结果。与此相反，不能够观察到与小鼠sIL-6R的结合。人和食蟹猴血浆还与IL6R20A11竞争结合重组sIL-6R，而小鼠血浆则不。事实上，在高浓度的小鼠血浆下观察到增加的信号，这可能是由于在测定中检测到小鼠免疫球蛋白。
实施例50：IL6R20A11对IL-6R的特异性
IL-6R属于I型细胞因子受体家族。由于这些受体的细胞因子结合区域是保守的，所以通过分析和与IL-6R相关的受体的结合来分析IL6R20A11对于IL-6R的特异性。在竞争性结合ELISA中分析IL6R20A11与LIF-R，CNTF-R，OSM-R和IL-11R/Fc的结合。如可以在图46中观察到，阳性对照sIL-6R抑制IL6R20A11与平板的结合。关于sIL-6R的IC50(0.03nM)与基于所用的IL6R20A11的量预期的IC50一致(0.025nMvs.0.05nM)。没有IL-6R-相关蛋白似乎与IL6R20A11竞争结合sIL-6R，即使在100倍摩尔过量下(5nM)。在类似的设置中，显示CLF-1/CLC，IL12-p40，IL-27B和gp130/Fc也不与0.05nM的IL6R20A11相互作用，即使在高至100nM的浓度下(数据未显示)。
VII.IL6R304和IL6R305的体内PK/PD分析
本研究的目的是分析在单次静脉内推注给药后两个序列优化的、亲和性成熟的抗-白介素6受体(IL-6R)纳米抗体(即IL6R304和IL6R305)在食蟹猴中的血浆药物动力学(PK)，药效学(PD)和免疫原性。给药纳米抗体，接着从纳米抗体给药后24小时开始，进行7天每日皮下注射重组人(h)IL-6。该体内功效研究的最终目的是评估这些抗-IL-6R纳米抗体抑制hIL-6-诱导的参数的能力，并且将它们的功效彼此比较和与实施例1的基准参照比较。
在非人灵长类动物和在人中，已经报道重组hIL-6诱导急性期蛋白的合成。急性期蛋白定义为一类血浆蛋白，诸如C-反应性蛋白(CRP)，血清淀粉状蛋白A，触珠蛋白、血纤蛋白原、白蛋白、和转铁蛋白，其血浆浓度响应于炎性病症以至少25％增加或减小，这主要是由于肝细胞对它们的生产中的改变造成的。在不同的炎性病症中，细胞因子生产模式和急性期反应模式是不同的。因此，急性期变化反映炎症的存在和强度，使得它们成为诊断相关的。急性期蛋白的生产的主要刺激物是炎性相关细胞因子，其在炎性过程中生成：IL-6，IL-1β，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，干扰素-γ(INF-γ)，转化生长因子β(TGF-β)和可能的IL-8。
实施例51：研究设计
在该研究中6组(组6至11，表C-36)2-3只动物接收单次静脉内注射IL6R304或IL6R305。在这两种纳米抗体中，测试3个不同剂量，即0.4，2或10mg/kg。此外，组12(n＝3)中的动物接收载体且用作阴性对照，而组13(n＝3)的动物被注射5mg/kg参照IgG(表C-36)。
从TD1，即测试项施用后24小时开始，对所有动物注射hIL-6(5μg/kg；图47)，每天一次共7天。
在预定时刻注射hIL-6之前和之后通过头静脉或主隐静脉收集血样(参见图47)。在TD0采取额外的血样用于PK分析(参见表C-37)。
实施例52：纳米抗体对于hIL-6-诱导的急性期应答(2期)的影响
分析纳米抗体和阳性参照IgG对于7次连续每日注射hIL-6的急性期应答的诱导的影响。读出值是CRP水平、血纤蛋白原水平和血小板的量。
在阴性对照组(组12)中，在第一次注射hIL-6后CRP水平立即升高，在第2天已经达到最高水平。达到的最高水平是0.2-0.8mg/mL并且该平台保持直至第8天，这是在最后一次hIL-6注射后当天(图48A)。
这些变化通过用5mg/kg参照IgG预处理而被完全抑制(图48B)。此外用相当的剂量(2mg/kg)或5倍高剂量(10mg/kg)的纳米抗体IL6R304和IL6R305的单次预处理给出了在整个实验期间对CRP诱导的几乎完全的抑制(图48C和D)。在IL6R304的最高剂量组中仅No.18动物显示一些诱导，到达0.1mg/mL左右的最高血清CRP水平。在最低剂量组(0.4mg/kg)，两种纳米抗体都给出完全抑制达7天。CRP水平仅在第8天升高至与阴性对照组相当的水平(图48)。所有组的平均CRP水平可以在图49中看到。
血纤蛋白原水平在阴性对照组中缓慢升高至基底水平5倍的平均最大值(图50A)。该最大值在第6天达到并且再保持2天。在第14天，血纤蛋白原水平返回至基底水平。参照IgG能够完全抑制血纤蛋白原的诱导(图50B)。两种纳米抗体都显示对血纤蛋白原诱导的剂量依赖性抑制(图50C和D)。在最高剂量组，对于用IL6R304预处理的两只动物和对于用IL6R305预处理的2只动物中的1只抑制是几乎完全的。No.25动物(10mg/kgIL6R305)和两种纳米抗体的中剂量和最低剂量组的所有动物的血纤蛋白原水平上都有一些小的升高。然而，在这些动物中，血纤蛋白原水平没有超过基底水平的2-3倍。所有组的平均血纤蛋白原水平可以在图51中看到。
对于阴性对照组中的所有动物，血小板计数从第5天起缓慢增加。在第8天至第14天达到最高水平，并且在基底水平的160-190％之间。hIL-6对于血小板计数的影响通过用5mg/kg参照IgG或≥2mg/kg纳米抗体单次预处理而被完全阻断。仅在纳米抗体的最低剂量组观察到血小板计数的诱导，在所有动物中从第8天开始。对于IL6R304，最大诱导约为基底水平的约120-150％，而对于IL6R305，最大血小板计数是基底水平的160-180％之间(图52和53)。
总之，IL6R304和IL6R305显示了对所有三个急性期应答参数的类似的剂量依赖性和完全的抑制。
实施例53：在静脉内给药IL6R304或IL6R305(0.4-2-10mg/kg)后在食蟹猴中的血浆浓度
在剂量给药前和在给药IL6R304或IL6R305的下列时刻：5和30分钟，3和8小时，第1，2，3，4，5，6，7，8，14，21和29天，采取血样进行血浆药物动力学(PK)分析ELISA样品分析。
在图54和图55中分别显示在静脉内给药IL6R304(0.4-2-10mg/kg)和IL6R305(0.4-2-10mg/kg)于食蟹猴后单个观察到的血浆浓度-时间图。
实施例54：在食蟹猴中IL6R304和IL6R305(0.4-2-10mg/kg)的非隔室药物动力学分析
通过在食蟹猴中非隔室PK分析IL6R304(0.4-2-10mg/kg)和IL6R305(O.4-2-10mg/kg)获得的基本PK参数的综述在表C-38，表C-39，表C-40，表C-41，表C-42和表C-43中给出。这里讨论的PK参数是使用WinNonlinProfessionalSoftwareVersion5.1(PharsightCorp)、使用非隔室分析(NCA)获得的。仅使用两个数据点(R2缺省为1)计算一些动物的终端参数。
对于在食蟹猴中静脉内施用的两种纳米抗体，血浆浓度似乎以三阶段方式降低。在给药后最初两天，存在最初的处置阶段(dispositionphase)，接着更缓慢的显性阶段。在较低浓度下的逐渐下降导致特征在于短半衰期的末期阶段。
由于在大多数食蟹猴的血浆样品中检测到抗药抗体，所以较低浓度下的末期半衰期的变化可以与免疫介导的清除机制相关。然而，这在研究PK曲线后是不大可能的：在最低剂量下，在没有检测到免疫原性的时刻已经观察到最短半衰期。此外，尽管在较高剂量下存在可检测的效价，但是仍有趋向更长半衰期的趋势(f.e.IL6R30410mg/kgi.v.)。
基于PK曲线观察，预期两种抗体都通过至少两种机制从循环中清除。在这种情形中，线性不可饱和的清除机制将代表化合物的非特异性降解。第二种可饱和的清除机制将是靶标介导的(f.e.与膜结合的IL-6R结合的药物的内在化和随后清除)。在较高纳米抗体浓度下，预期后一种清除机制是饱和的且与不可饱和的线性清除相比是可忽略的：线性清除是占优势的(导致占优势的半衰期)。然而，对于给定纳米抗体浓度，在较低浓度下，代谢速率较高，导致末期斜率变化。
由于是靶标介导的清除，所以通过NCA分析获得的PK参数诸如清除率和半衰期似乎是剂量和时间依赖性的。总清除率在最低剂量下是最高的：在0.4mg/kgi.v.后对于IL6R304和IL6R305是24.8和35mL/天/kg，与之相比在较高剂量下对于IL6R304和IL6R305为10.4-9.00和5.93-7.76mL/天/kg。因此，剂量正规化的暴露在最低剂量下较低(剂量＝CLxAUC)。
在静脉内给药10，2和0.4mg/kg后，IL6R304的优势半衰期从6.61天降低至5.00天和1.73天。在静脉内给药10，2和0.4mg/kg后，IL6R305的优势半衰期从7.37天降低至4.29天和1.64天。由于在较早时刻可获得更多数据点，所以末期阶段在最低剂量下最佳表征：在分别静脉内给药0.4mg/kgIL6R304和IL6R305后观察到0.530天和0.470天的短末期半衰期。
基于这些PK发现，IL6R304和IL6R305的药物动力学性质被认为是相似的。
在关于猴14m和猴15f(i.v.2mg/kg)的第29个测试日，仍可检测到低IL6R304浓度水平。基于其它猴的PK曲线，这些观察是出乎预料的。可能这指示第二种类型的可饱和的靶标结合，这仅在极低浓度下变得明显。然而，这些观察也可能是PKELISA样品分析的假象。
报道的通过NCA分析计算的分布体积较低，对于两种纳米抗体范围为约40mL/kg血浆体积的一倍至两倍，提示在血管空间之外的有限分布。然而，真正的Vss可能被低估了，这是因为与NCA相关的方法学误差(f.e.纳米抗体分布和随后在周质空间中降解将不归因于分布方面，而是归因于总系统清除)。Vss似乎在不同剂量水平下相当恒定。
为了证明靶标结合对PK曲线的可能影响，图56比较了IL6R304(i.v.0.4-2-10mg/kg)和IL6R202(i.v.2mg/kg，SEQIDON：73)的平均PK图谱。为了举例说明目的，将IL6R202(i.v.2mg/kg)PK曲线相对于0.4mg/kg以及10mg/kg剂量正规化。显示IL6R304结合食蟹猴中的IL-6R，而对于IL6R202，在食蟹猴中缺乏靶标结合(WO09/010539)。因此，在线性清除占优势的高浓度下，两种纳米抗体的曲线(和相应的半衰期)是相似的。在较低浓度下，对于IL6R304观察到斜率的逐渐变化，最可能是由于靶标介导的清除，而对于IL6R202，末期斜率不存在变化。然而，较低浓度的IL6R304和IL6R305也可能稍微被低估，这是由于PKELISA中的IL-6R干扰，特别是如果存在高IL-6R水平时。
实施例55：检测抗-IL6R304和抗-IL6R305抗体
在剂量给药前和给药IL6R304或IL6R305后不同天采取一系列血浆样品，筛选能够结合纳米抗体或一个或多个其结构单元的猴抗体(IgG同种型)的存在。将来自用IL6R304剂量给药的动物的样品在用IL6R304(图57)，IL6R300(图58)或ALB8(图59)包被的平板上分析。将来自用IL6R305剂量给药的动物的样品在平板上分析，所述平板用IL6R305(图60)，IL6R300(图61)或ALB8(图62)包被。
在表C-44中给出了对于全长纳米抗体(IL6R304和IL6R305)的抗药抗体(ADA)出现的总结。对于IL6R300和Alb8观察到较低应答或无应答。总之，在静脉内注射IL6R304后，在所有猴子(除了No.16动物以外，其中由于高剂量给药前值，所以不能确定ADA测定值)中可检测到ADA。对于以0.4mg/kg剂量给药的猴子在给药后1周和对于以2mg/kg和10mg/kg剂量给药的猴子在给药后2周，抗体出现。在动物No.11和13(两者都来自0.4mg/kg剂量)中获得最高ADA滴度。在静脉内注射IL6R305后，在所有猴子(除了动物No.23以外，其中没检测到ADA)中可以检测到ADA。对于以0.4mg/kg剂量给药的猴子在给药后1周和对于以2mg/kg和10mg/kg剂量给药的猴子在给药后2周，抗体出现。在动物No.22和24(两者都来自2mg/kg剂量)中和在动物No.25和26(两者都来自10mg/kg剂量)中获得了最高ADA滴度。
实施例56：纳米抗体对sIL-6R水平的影响
如基于公开可获得的数据(Nishimoto等，2008，血液(Blood)112(10)：3959-64)所期望的，用参照IgG处理导致血浆sIL-6R增加，而用载体处理则不(图63A)。类似地，低剂量的IL6R304在所有三只猴子中诱导sIL-6R水平的快速升高(图63B)。在IL6R305-处理的动物中，血浆sIL-6R也升高，但是不如在其它处理组中显著(图63C)。
VIII.IL6R304的功效
实施例57：在功效研究中纳米抗体对sIL-6R水平的影响
通过ELISA测量血浆中总sIL-6R水平(游离的，纳米抗体结合的和IL-6-结合的)。如基于公布的数据(Nishimoto等，2008，血液(Blood)112(10)：3959-64)所期望的，用参照IgG处理导致血浆sIL-6R增加，而用载体处理则不(图64A)。类似地，所有纳米抗体处理的动物显示sIL-6R水平的快速升高。这可以通过与游离sIL-6R相比参照IgG-或NB-sIL-6R复合物的较慢清除来解释。
最大sIL-6R水平和作用持续时间明显地是剂量依赖性的。此外，纳米抗体的作用似乎对于参照IgG更显著(将2mg/kg剂量的纳米抗体与参照IgG比较，图64)。这可能通过抗体免疫复合物的较快的Fc-介导的清除来解释。然而，令人吃惊地，与IL6R305(图64B)相比，sIL-6R的升高和作用持续时间对于IL6R304(图64A)更显著。
实施例58：在功效研究中纳米抗体对IL-6水平的影响
通过Gyrolab平台测量血浆中的总IL-6水平(游离的，sIL-6R-结合的)。对于该测定，将生物素酰化的大鼠抗-人IL-6mAb用于捕获IL-6和Alexa-标记的小鼠抗-人IL-6mAb以便检测。该测定测量内源性食蟹猴IL-6和从第1-8天每天注射的重组人IL-6两者。因此，需要在直至第1天可以测量的IL-6(＝仅内源性食蟹猴IL-6)和从第2-29天可以测量的IL-6(＝施用的人IL-6+内源性食蟹猴IL-6)进行区别。
如在图65中可以看到，给药IL6R304，IL6R305，参照IgG和至最小程度的安慰剂，导致IL-6瞬时升高，其在给药后8小时达到顶峰。然而，该升高在纳米抗体处理组中显著更高。对于IL-6的作用似乎对于IL-6R靶向的纳米抗体不是特异性的，因为给药不相关的纳米抗体也导致瞬时的IL-6应答(图65D)。IL-6的早期升高最可能通过应激反应来解释，所述应激反应是因为处理动物导致，并且IL-6生产的进一步升高可能通过纳米抗体制剂中微量的内毒素来解释。
在IL-6处理阶段，在每次每日注射IL-6之前对血液采样。在接受IL-6但是不接受纳米抗体或参照IgG的安慰剂组，几乎未检测到IL-6(图65C)。这与在SC注射后人IL-6的短半衰期一致(Tsigos，等，1997，临床内分泌代谢杂志(J.Clin.Endocrinol.Metab.)82：4167-70)。然而，在用2-10mg/kg参照IgG，IL6R304或IL6R305处理的所有动物中，从第2-8天检测到IL-6。这可以通过阻断受体介导的IL-6清除、由此延长其半衰期来解释(Nishimoto等，2008，血液(Blood)112(10)：3959-64)。因此，循环的IL-6可以用作IL-6R中和的药效学生物标记。
IX.IL6R304的药效学
实施例59：在食蟹猴中在单次剂量给药后的药效学作用
在健康(即未刺激的)食蟹猴中单次静脉内给药IL6R304后也测量到sIL6R血浆浓度的变化。在该单剂量PK/PD研究中，剂量范围为1-100mg/kg。进行血液采样，用于药物动力学、免疫原性和药效分析。将基于ELISA的测定用于测量总sIL6R水平，并且将使用GyrolabTM平台的配体结合测定用于测量游离sIL6R水平。对于总sIL6R测定，将非中和抗-IL6R单克隆抗体用于捕获sIL6R(游离的+在复合物中的)和将多克隆生物素酰化抗-IL6R工具联合链霉抗生物素蛋白-HRP用于检测。对于游离sIL6R测定，将生物素化20A11构件用于捕获游离sIL6R，将Alexa-标记的非中和抗-IL6R单克隆抗体用于检测。
单剂量PK/PD研究的结果证实IL6R304对于以下的剂量依赖性影响：(i)最大总sIL6R浓度(图66A)，(ii)升高的总sIL6R(图66A))的持续时间；和(iii)游离sIL6R的抑制的持续时间(图66B)。通常，在给定时间后总的和游离的sIL6R浓度返回至基线水平(取决于剂量，最长升高和抑制在最高剂量下看到)。在施用低剂量的1mg/kgIL6R304后游离sIL6R浓度降低约8天，然后升高至高于载体处理动物的那些的浓度。
在总sIL6R水平、游离sIL6R水平(PD)和IL6R304浓度之间观察到良好的逆相关，证实sIL6R可以用作活性药物存在的生物标记。图67显示一个实施例，用于阐述3个参数之间的相互影响(选择中剂量组，因为在该组中可以显示返回至基线)：给药IL6R304导致总sIL6R浓度升高并且形成稳定化的药物-sIL6R复合物。随着IL6R304血浆浓度降低，总sIL6R浓度也平行地降低，因为大部分总sIL6R由复合受体构成。这通过低的游离sIL6R浓度证实，其在从循环中消除IL6R304后sIL6R浓度返回至基线水平。低游离sIL6R浓度证实测量的总sIL6R实际上是无活性的并且与IL6R304复合(图67)。
实施例60：通过PK/PD建模描述药效学作用
IL6R304给药对于总sIL6R水平的影响可以通过IL6R304与受体的直接结合来解释，复合物通过IL6R304半衰期延长结构部分(即白蛋白结合)保留在循环中。由于总sIL6R浓度的可测量变化遵循时间-延迟动力学，所以间接响应模型最好地描述PK/PD关系，并且用于描述静脉内施用的IL6R304对于sIL6R-IL6R304复合物水平累积的影响。该模型描述了当与IL6R304结合时由sIL6R消除的抑制导致的药物应答。在该间接响应模型中，总sIL6R-IL6R304复合物变化速率(响应R)通过以下描述：
d R d t = K i n - K o u t * [ 1 - I m a x * C n I C 50 n + C n ] * R
Kin，0级合成速率；R，总sIL6R；Imax，最大抑制；C，IL6R304血浆浓度；n，剂量反应形状因数；和Kout，sIL6R的一级消除速率常数。
使用如实施例61所述的药物动力学函数作为间接响应PK/PD模型的输入函数，来自单个剂量PK/PD研究的所有可获得的i.v.总sIL6R数据同时针对所述模型(WinNonlinProfessionalSoftwareVersion5.1，PharsightCorporation，MountainViewCalifornia，USA)拟合。
图68显示在食蟹猴中在静脉内给药1，5，10，25或100mg/kg后单个观察的和模型预测的总sIL6R浓度-时间数据。在食蟹猴中预测的IL6R304的药效学参数在表C-45中列出。用低于50％的CV％值所示的充分精确度评估所有参数。
将在静脉内给药后来自单次剂量PK/PD研究的所有数据同时针对描述sIL6R，IL6R304和sIL6R-IL6R304复合物的间接响应模型拟合。
sIL6R的平均半衰期估计约为5.8h(＝ln2/Kout，Kout＝Kin/R0)，并且估计的生产速率为2.49ng/mL/h。IL6R304能够几乎完全抑制sIL6R通过初级途径的消除(Imax＝97％)。因此，消除速率变化至新的最大降低的kout，其与食蟹猴的血清白蛋白的kout相关。随后确定了总sIL6R的新基线水平。估计IC50为125ng/mL或4.48nM，显示IL6R304是食蟹猴中未复合sIL6R消除的有效抑制剂。
X.IL6R304的药物动力学
实施例61：食蟹猴中的药物动力学
本部分总结表征静脉内施用的IL6R304在1个交叉反应性物种(食蟹猴)中的药物动力学性质的数据。
在健康(未诱导)食蟹猴中，使用定性DELFIA(解离增强的镧系元素氟-免疫测定)方法测量IL6R304的浓度。通过IL6R依赖性测定测量总活性IL6R304浓度。
在单剂量PK/PD研究中，作为单次静脉内推注0，1，5，10，25和100mg/kg，将IL6R304施用至健康雄性食蟹猴中。在剂量给药前和在剂量给药后选择的时刻从所有动物收集用于PK，ADA(抗-药物抗体)和PD分析目的的血样。分析样品的PK，PD和ADA(还参见实施例62)。
使用验证过的电化学发光(ECL)桥接(bridging)筛选和确认测定来检测抗-IL6R304抗体。简而言之，使用MSDSectorImager2400，以均相测定形式，将IL6R304用于捕获和检测抗药物抗体(ADAs)。
对于PK分析，通过生物素酰化的抗-纳米抗体工具(3E8biv-bio)在链霉抗生物素蛋白包被的平板上捕获IL6R304。在与靶标IL6R复合步骤后，将针对IL6R的铕-标记的mAb用于在增强溶液中产生荧光信号。
IL6R304的平均血浆浓度-时间曲线在图69中显示。在单次静脉内推注1，5，10，25或100mg/kg后，IL6R304的关键药物动力学参数的总结在表C-46中提供。
在静脉内给药后的药物动力学曲线显示三阶段下降。在给药后最初两天，观察到分布阶段，接着是较慢的优势阶段和较快的末期阶段。分布阶段可以进一步分成快(浅隔室)和慢分布(深隔室)。基于消除阶段，IL6R304可能通过两种机制清除，一种是线性不可饱和的(非特异性消除或CLNON-IL6R)和非线性可饱和的(靶标介导的或特异性消除或CLIL6R)清除机制。后者可以是与膜结合的IL6R结合的IL6R304内在化和随后清除IL6R304-mIL6R复合物的结果。
由于IL6R304的清除是可饱和与不可饱和的途径的组合，所以食蟹猴中的血浆动力学显示非线性性质，半衰期是剂量依赖性的且在给定剂量水平上还是时间依赖性的。
当CLIL6R被饱和并且总CL主要由CLNON-IL6R决定时，在食蟹猴中报道的IL6R304的半衰期范围是5.8至8.9天，并且类似于关于食蟹猴血清白蛋白所报道的(Nguyen等，2006，ProteinEng.Des.Sel.19：291)。这与预期一致，并且与证实的IL6R304的白蛋白结合结构部分与食蟹猴白蛋白的交叉反应性一致。
在单次剂量给药后，平均暴露在1和5mg/kg之间和在10和25mg/kg之间稍微超过与剂量成比例地增加，并且在5和10mg/kg之间为与剂量成比例地增加。100mg/kg剂量组的结果必须小心采用，因为在该剂量组中仅包括一只动物。总体上，由于每个剂量组的有限数量的猴子，所以剂量比例性评估是初步的。
IL6R304与sIL6R的结合导致测量的sIL6R总浓度的升高，该sIL6R包括sIL6R和sIL6R-IL6R304复合物；该升高被认为是由于与单独sIL6R相比所述复合物的较慢清除所导致。
基于可获得的免疫原性、PK和PD数据，得出以下结论：出现的ADA可能影响来自最高剂量组的两只动物(动物15和17)中IL6R304的PK/PD曲线。两只动物都显示与可测量的ADA出现同时的IL6R304I血浆水平出人意料的升高，并且具有降低的药效学效果。因此，在PK/PD分析中不考虑这些动物。其它动物中出现ADA似乎对于PK/PD曲线没有明显影响，因此在分析中包括这些数据。
对于1mg/kg剂量组中的一只动物(动物3)，没有观察到靶标介导的清除，尽管这对于该低剂量是预料到的。对于5mg/kg剂量组的一只动物(动物6)，尽管较高剂量和该途径的预期到的饱和，但是仍观察到靶标介导的清除。由于动物之间的内源性IL6R浓度的可变性可以较高，所以靶标介导的清除可能具有个体间高可变性。此外，当IL6R304浓度与估计的KM值(此处：0.718μg/mL)接近时，IL6R304浓度的小变化导致非线性清除的大变化。两者的组合可以导致在低剂量组中靶标或仅非靶标介导的清除的可测量证据，这反映在末期半衰期值的高可变性。动物3和6的PK参数被排除在描述统计学之外，因为生物学可变性不包括应用方法的精确度的有意义评估(表C-46)。
来自安慰剂组的动物没有一个系统地暴露于IL6R304。所有IL6R304处理动物的剂量给药前样品低于定量下限(LLOQ)。来自活性处理组的动物显示随着剂量水平增加IL6R304的血浆浓度升高。在最高剂量组(100mg/kg)中观察到最高平均总暴露(AUCinf)，并且为540612μg.h/mL。
平均剂量正规化AUCinf值在5至10mg/kg剂量范围内与剂量成比例增加，并且在1和5mg/kg之间和在10和25mg/kg之间稍微超过剂量成比例的增加(分别为1.3和1.4)。从25至100mg/kg超过剂量成比例的增加必须小心采用，因为在最高剂量组中仅包括一只动物。总体上，由于每个剂量组的有限数量的猴子，所以剂量比例性评估是初步的。
特别地，来自非隔室分析的数据显示与测试的较高剂量水平相比在1mg/kg剂量水平上半衰期的不同。这可归因于与其中不可饱和机制占优的较高剂量相比，可饱和靶标介导的清除机制的较大贡献。
基于消除阶段，IL6R304可能通过两种机制清除，一种线性的和一种非线性的清除机制。线性清除机制可能与不可饱和的和非IL6R介导的IL6R304清除相关，并且对应于IL6R304的缓慢和非特异性蛋白水解降解。非线性的和IL6R-介导的清除过程是可饱和的清除机制；非常可能代表IL6R304与膜结合的IL6R的结合和随后的内在化和清除。
通过将数据拟合至开放的三隔室药物动力学模型，获取在食蟹猴中IL6R304的非线性药物动力学性质，所述模型具有从中央隔室的线性和非线性清除。结构模型描述在图70中。
将来自单剂量PK/PD研究的所有可获得的个体i.v.血浆浓度数据同时针对模型(WinNonlinProfessionalSoftwareVersion5.1(PharsightCorporation，MountainViewCalifornia，USA)拟合，使用迭代再加权(re-weighting)拟合，其中是预期的血浆浓度。图71显示个体的观察到的和模型预测的在食蟹猴中在静脉内给药1，5，10，25或100mg/kg后IL6R304的血浆浓度-时间曲线。估计的IL6R304的药物动力学参数在表C-47中列出。
将来自单剂量PK/PD研究的所有数据同时针对开放式三隔室模型拟合，其具有从中央隔室的线性(CLNON-IL6R)和非线性(CLIL6R)清除。在低IL6R304浓度(C＜＜＜Km)下，IL6R-介导的清除的贡献(CLIL6R)占优势并且等于Vmax/Km。在高IL6R304浓度(C＞＞＞Km)下，IL6R-介导的清除途径变得饱和，并且将在最大物质周转(maximummassturnover)(即Vmax)处进行。因此，总清除(CL)由线性非IL6R介导的途径(CLNON-IL6R)决定。
清除中非线性IL6R介导的组分解释了食蟹猴中IL6R304半衰期的时间-依赖性和剂量-依赖性。
表B-1：组成参照化合物的氨基酸序列
表B-2：抗-IL-6R纳米抗体的蛋白质序列
表B-3：多价抗-IL-6R纳米抗体的蛋白序列
表B-4：序列优化的纳米抗体的蛋白序列
表B-5：亲和性成熟的纳米抗体的蛋白序列
表B-6：格式化亲和性成熟的/序列优化的纳米抗体的蛋白序列
表B-7：结合白蛋白的纳米抗体的优选但非限制性实例
表B-8：接头的序列表
表C-1：用于分离结合IL-6R的纳米抗体的材料
表C-2：免疫时间表
表C-3：从免疫的美洲驼获得的纳米抗体文库的特性
表C-4：选择纳米抗体所用的条件
表C-5：筛选统计学
测定 筛选克隆数目 抑制剂数目(％) 测序克隆数 独特序列数
IL-6-IL-6R 1536 72(4.7％) 46 14
表C-6：抑制性纳米抗体的koff-值
表C-7：纳米抗体细胞培养物的产率
表C-8：所选纳米抗体的IC50-值
纳米抗体ID 样品 IC50(M)
IL6R01 PMP28E11 7.26E-10
IL6R02 PMP30C11 1.69E-09
IL6R03 PMP31A4 7.16E-10
IL6R04 PMP32C9 9.30E-11
IL6R05 PMP32E10 6.26E-10
IL6R06 PMP32E2 1.21E-09
IL6R07 PMP33A3 1.44E-09
IL6R08 PMP34A12 1.18E-09
IL6R09 PMP34G9 2.38E-10
IL6R10 PMP35C10 5.96E-10
IL6R11 PMP35E11 1.58E-10
IL6R12 PMP35F4 5.17E-10
IL6R13 PMP35H4 4.77E-11
IL6R14 PMP40H5 2.22E-10
表C-9：关于所选14种抑制性抗-IL-6R纳米抗体子集的动力学参数
表C-10：XG-1细胞增殖的纳米抗体抑制的IC50值
纳米抗体ID IC50(nM) IC50(nM)+HSA
IL6R01 ND
IL6R02 31.0
IL6R03 16.2 17.5
IL6R04 0.1 0.1
IL6R05 7.3
IL6R06 42.1
IL6R07 50.5
IL6R08 36.6
IL6R09 2.7 3.0
IL6R10 2.5
IL6R11 5.4
IL6R12 2.8
IL6R13 1.4 1.3
IL6R14 0.6 0.8
参照Fab 6.0
表C-11：TF1细胞增殖的纳米抗体抑制的IC50值
纳米抗体ID IC50(nM)
IL6R01 ND
IL6R02 94.7
IL6R03 62.1
IL6R04 0.4
IL6R05 38.0
IL6R06 137.9
IL6R07 374.9
IL6R08 24.3
IL6R09 8.7
IL6R10 9.9
IL6R11 9.9
IL6R12 6.8
IL6R13 5.2
IL6R14 1.5
参照Fab 9.2
表C-12：如α筛选测定确定的与参照Fab竞争结合IL-6R
表C-13：总结的纳米抗体特性
表C-14：格式化纳米抗体的命名(ID)
ID 格式 SEQ ID NO
IL6R22 PMP30C11-9GS-ALB1 19
IL6R23 PMP31A4-9GS-ALB1 20
IL6R24 PMP32C9-9GS-ALB1 21
IL6R25 PMP32E10-9GS-ALB1 22
IL6R26 PMP32E2-9GS-ALB1 23
IL6R28 PMP34A12-9GS-ALB1 24
IL6R29 PMP34G9-9GS-ALB1 25
IL6R30 PMP35C10-9GS-ALB1 26
IL6R31 PMP35E11-9GS-ALB1 27
IL6R32 PMP35F4-9GS-ALB1 28
IL6R33 PMP35H4-9GS-ALB1 29
IL6R34 PMP40H5-9GS-ALB1 30
IL6R43 PMP31A4-9GS-ALB1-9GS-31A4 31
IL6R44 PMP32C9-9GS-ALB1-9GS-32C9 32
IL6R49 PMP34G9-9GS-ALB1-9GS-34G9 33
IL6R53 PMP35H4-9GS-ALB1-9GS-35H4 34
表C-15：双特异性抗-IL-6R纳米抗体的表达产率
表C-16：在α筛选竞争测定中双价纳米抗体的IC50值
纳米抗体ID IC50(M)
IL6R22 5.59E-10
IL6R24 1.45E-10
IL6R25 6.43E-10
IL6R26 1.67E-09
IL6R28 3.26E-10
IL6R29 1.23E-10
IL6R30 3.43E-10
IL6R31 1.31E-10
IL6R32 2.68E-10
IL6R33 1.39E-10
IL6R34 1.46E-10
参照-Fab 5.92E-10
表C-17：在XG-1增殖测定中格式化纳米抗体的IC50值
ID IC50(nM) IC50(nM)+HSA
IL6R22 50.2
IL6R23 16.9 90.4
IL6R24 0.2 0.5
IL6R25 8.4
IL6R26 65.3
IL6R28 4.4
IL6R29 3.6 13.4
IL6R30 27.2
IL6R31 4.6
IL6R32 1.6
IL6R33 2.6 15.4
IL6R34 0.8 2.5
IL6R44 0.07 0.17
IL6R49 0.06 0.19
IL6R53 0.13 0.61
参照-IgG 0.47
表C-18：IL-6R结合的动力学参数
纳米抗体ID kd(s-1) ka(1/Ms) Kd(nM)
IL6R22 5.7E-03 3.3E+05 16.9
IL6R23 1.5E-03 3.2E+05 4.6
IL6R24 1.1E-04 3.7E+05 0.3
IL6R25 1.2E-03 1.2E+05 10.3
IL6R26 6.9E-03 4.5E+05 15.5
IL6R28 5.3E-04 2.4E+05 2.2
IL6R29 1.5E-03 7.1E+05 2.1
IL6R30 1.2E-03 1.6E+05 7.5
IL6R31 3.8E-04 1.6E+05 2.3
IL6R32 1.3E-03 1.0E+06 1.3
IL6R33 1.25E-04 1.1E+05 1.1
IL6R34 1.1E-04 2.6E+05 0.4
表C-19：格式化纳米抗体与来自不同物种的血清白蛋白结合的Kd值
表C-20：IL6R03，04和13的序列优化的变体的动力学参数
表C-21：IL6R13的序列优化的变体的koff值
ID koff(s-1)
IL6R13 2，1E-04
IL6R85 2，1E-03
IL6R86 1，7E-03
IL6R87 1，1E-04
IL6R88 2，6E-04
IL6R89 1，9E-04
IL6R90 1，9E-03
表C-22：IL6R03，04和13的序列优化的变体的动力学参数
表C-23：在XG-1测定中序列优化的和WT纳米抗体的IC50值
表C-24：纳米抗体与食蟹猴IL-6R的动力学参数
ID ka(1/Ms) kd(1/s) KD(nM)
IL6R03 3.70E+05 1.64E-03 4.4
IL6R65 1.65E+05 1.97E-03 12
IL6R04 5.86E+04 1.00E-02 171
IL6R201＊ 2.18E+05 6.11E-03 28.1
*IL6R201是IL6R75的无标签形式
表C-25：ILR65和亲和性成熟的IL-6R纳米抗体的Tm值
表C-26：IL6R65与亲和性成熟的变体的亲和性的动力学参数
*估计的
表C-27：亲和性成熟的抗-IL6R纳米抗体的格式
表C-28：在100IU/mLIL-6下在TF-1增殖测定中格式化纳米抗体vs.参照的效力
化合物 IC50(nM) Stdev(nM) 重复
20A11 0.283 0.256 3
IL6R304 0.715 0.390 2
IL6R305 0.098 0.046 4
IL6R306 0.341 0.162 3
参照Fab 6.262 0.706 2
参照IgG 0.921 0.275 4
表C-29：在5000IU/mLIL-6下在TF-1增殖测定中格式化纳米抗体的效力
化合物 IC50(nM)
20A11 15.22
IL6R304 15.48
IL6R305 5.49
IL6R306 23.19
参照IgG 144.5
表C-30：格式化纳米抗体关于中和与人血浆中sIL-6R结合的IL-6的IC50值(nM)
化合物 正常IL-6下的IC50 在高IL-6下的IC50 比率(高/低)
参照IgG 0.258 1.69 6.54
IL6R20A11 0.198 0.356 1.80
IL6R304 0.229 0.634 2.77
IL6R305 0.137 0.335 2.44
IL6R306 0.412 2.39 5.80
表C-31：关于格式化亲和性成熟的纳米抗体与CHO4D5(4PL)的结合的EC50值(nM)
化合物 EC50(nM)
IL6R20A11 1.396
IL6R304 1.939
IL6R305 0.8984
IL6R306 6.154
表C-32：关于格式化亲和性成熟的纳米抗体与来自2名供体的PBL的结合的EC50值(nM)
化合物 L1 L2 M1 M2 G1 G2
IL6R20A11 3.65 2.924 3.621 4.777 2.415 5.614
IL6R304 9.273 20.68 8.241 14.17 5.985 17.32
IL6R305 4.282 25.79 2.906 4.262 2.434 4.927
IL6R306 60 49.59 49.38 59.34 53.99 77.68
L：淋巴细胞，M：单核细胞；G：粒细胞
表C-33：格式化亲和性成熟的纳米抗体与人和食蟹猴血清白蛋白的结合的动力学参数
表C-34：格式化亲和性成熟的纳米抗体与人和食蟹猴IL-6R的结合的动力学参数
*仪器的检测界限
表C-35：关于中和hIL-6与在食蟹猴和人血浆中的血浆sIL-6R结合的IC50值(nM)的比较
测试项目 在人中的IC50 在食蟹猴中的IC50 比率(人/食蟹猴)
参照IgG 0.258 0.166 1.55
IL6R20A11 0.198 0.117 1.69
IL6R304 0.229 0.137 1.67
IL6R305 0.137 0.0791 1.73
IL6R306 0.412 0.321 1.29
表C-36：关于IL6R304和IL6R305体内PK/PD分析的剂量组
表C-37：关于PK分析的采样时间安排
表C-38：在食蟹猴中以0.4mg/kg单次静脉内推注给药后IL6R304的基本PK参数
表C-39：在食蟹猴中以2mg/kg单次静脉内推注给药后IL6R304的基本PK参数。一些动物的末期参数仅用两个数据点计算(R2缺省为1)
表C-40：在食蟹猴中以10mg/kg单次静脉内推注给药后IL6R304的基本PK参数
表C-41：在食蟹猴中以0.4mg/kg单次静脉内推注给药后IL6R305的基本PK参数。一些动物的末期参数仅用两个数据点计算(R2缺省为1)
表C-42：在食蟹猴中以2mg/kg单次静脉内推注给药后IL6R305的基本PK参数。一些动物的末期参数仅用两个数据点计算(R2缺省为1)
表C-43：在食蟹猴中以10mg/kg单次静脉内推注给药后IL6R305的基本PK参数。一些动物的末期参数仅用两个数据点计算(R2缺省为1)
表C-44：关于全长纳米抗体的抗-IL6R304和抗-IL6R305抗体出现的总结
*＞7天：TD7阴性，≥TD14阳性；＞14天：TD14阴性，≥TD21阳性
表C-45：在食蟹猴中IL6R304的药效学参数
表C-47：食蟹猴中IL6R304的药物动力学参数

Claims (25)

1.基本上由4个构架区(分别为FR1至FR4)和3个互补性决定区(分别为CDR1至CDR3)组成的多肽，其中：
-CDR1选自由以下组成的组：
a)SEQIDNO：80；或
b)与SEQIDNO：80具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基的序列，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基的序列的多肽相比，包括所述氨基酸残基的序列的该多肽以大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量；
和
-CDR2选自由以下组成的组：
c)SEQIDNO：84；或
d)与SEQIDNO：84具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基的序列，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基的序列的多肽相比，包括所述氨基酸残基的序列的该多肽以大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量；
和/或
-CDR3选自由以下组成的组：
e)SEQIDNO：93；或
f)与SEQIDNO：93具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸残基的序列，条件是与包括不具有所述2个或1个氨基酸差异的所述氨基酸残基的序列的多肽相比，包括所述氨基酸残基的序列的该多肽以大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量。
2.根据权利要求1所述的多肽，其包含SEQIDNO：80，SEQIDNO：84和SEQIDNO：93。
3.根据权利要求1-2任一项所述的多肽，其基本上由来源于常规四链抗体的重链可变结构域序列组成，或其基本上由来源于重链抗体的重链可变结构域序列组成。
4.根据权利要求1-2任一项所述的多肽，其基本上由结构域抗体组成，基本上由单结构域抗体组成，基本上由″dAb″组成或基本上由纳米抗体组成。
5.根据权利要求1-2任一项所述的多肽，其选自由以下组成的组：
a)SEQIDNO′s：66；
b)这样的多肽，所述多肽在其CDR中的一个、两个或全部之中与SEQIDNO：66具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异，条件是与SEQIDNO：66的结合相比，所述在其CDR中的一个、两个或全部之中具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的多肽以大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量；
c)与SEQIDNO：66具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的多肽，条件是与SEQIDNO：66的结合相比，与SEQIDNO：66具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的多肽以大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量。
6.化合物或构建体，其包括一种或多种根据权利要求1-5中任一项所述的多肽或基本上由一种或多种根据权利要求1-5中任一项所述的多肽组成，并且任选地还包括一种或多种任选地通过一个或多个接头连接的其它基团、残基、结构部分或结合单元。
7.根据权利要求6所述的化合物或构建体，其中所述一种或多种其它基团、残基、结构部分或结合单元选自由结构域抗体，单结构域抗体，″dAb″或纳米抗体组成的组。
8.根据权利要求6所述的化合物或构建体，其中所述一种或多种其它基团、残基、结构部分或结合单元给所述化合物或构建体提供与根据权利要求1-5任一项的相应多肽相比增加的半衰期。
9.根据权利要求8所述的化合物或构建体，其中给所述化合物或构建体提供增加的半衰期的所述一种或多种其它基团、残基、结构部分或结合单元选自由血清蛋白或其片段，能够结合血清蛋白的结合单元，Fc部分和能够结合血清蛋白的小蛋白或肽组成的组。
10.根据权利要求9所述的化合物或构建体，其中给所述化合物或构建体提供增加的半衰期的所述一种或多种其它基团、残基、结构部分或结合单元选自由能够结合血清白蛋白(如人血清白蛋白)或血清免疫球蛋白(如IgG)的结合单元组成的组。
11.根据权利要求9所述的化合物或构建体，其中给所述化合物或构建体提供增加的半衰期的所述一种或多种其它结合单元选自SEQIDNO′s：97-99。
12.根据权利要求6-11任一项所述的化合物或构建体，其选自下列多肽序列：
a)SEQIDNO′s70-72；
b)这样的多肽序列，所述多肽序列在其CDR中的一个、两个或全部之中与SEQIDNO′s：70-72之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异，条件是与SEQIDNO′s：70-72之一的结合相比，在其CDR中的一个、两个或全部之中具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的多肽序列以大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量；
c)与SEQIDNO′s：70-72之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的多肽序列，条件是与SEQIDNO′s：70-72之一的结合相比，与SEQIDNO′s：70-72之一具有不超过2个、优选不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列以大约相同或更高的亲和力与IL-6R结合，所述亲和力通过表面等离子共振测量。
13.根据权利要求6-11中任一项所述的化合物或构建体，其包含SEQIDNO：70的氨基酸序列，或基本上由SEQIDNO：70的氨基酸序列组成。
14.根据权利要求6-11任一项所述的化合物或构建体，其包含SEQIDN0：71的氨基酸序列，或基本上由SEQIDNO：71的氨基酸序列组成。
15.单价构建体，其包括一种根据权利要求1-5中任一项所述的多肽，或基本上由一种根据权利要求1-5中任一项所述的多肽组成。
16.用于制备根据权利要求6-14中任一项所述的化合物或构建体的方法，其包括将根据权利要求1-5中任一项所述的多肽或根据权利要求15所述的单价构建体与一种或多种基团、残基、结构部分或结合单元任选地通过一个或多个接头连接。
17.核酸，其编码根据权利要求1-5中任一项所述的多肽、根据权利要求6-14中任一项所述的化合物或构建体、或根据权利要求15所述的单价构建体，所述根据权利要求6-14中任一项所述的化合物或构建体是这样的以致其可以通过表达编码其的核酸来获得。
18.根据权利要求17所述的核酸，其是遗传构建体的形式，
19.宿主或宿主细胞，其表达或者在适当情形下能够表达根据权利要求1-5中任一项所述的多肽、根据权利要求6-14中任一项所述的化合物或构建体、或根据权利要求15所述的单价构建体，所述根据权利要求6-14中任一项所述的化合物或构建体是这样的以致其可以通过表达编码其的核酸来获得；和/或所述宿主或宿主细胞包含根据权利要求17所述的核酸或根据权利要求18所述的遗传构建体。
20.用于制备根据权利要求1-5中任一项所述的多肽、根据权利要求6-14中任一项所述的化合物或构建体、或根据权利要求15所述的单价构建体的方法，所述根据权利要求6-14中任一项所述的化合物或构建体是这样的以致其可以通过表达编码其的核酸来获得，所述方法至少包括以下步骤：
a)在适当的宿主细胞或宿主生物体中或在另一种适当表达系统中表达根据权利要求17所述的核酸或根据权利要求18所述的遗传构建体；
或
在这样的条件下培养和/或维持根据权利要求19所述的宿主或宿主细胞，所述条件使得所述宿主或宿主细胞表达和/或生产至少一种根据权利要求1-5中任一项所述的多肽、根据权利要求6-14中任一项所述的化合物或构建体、或根据权利要求15所述的单价构建体，所述根据权利要求6-14中任一项所述的化合物或构建体是这样的以致其可以通过表达编码其的核酸或核苷酸序列来获得，
任选地接着进行：
b)分离和/或纯化如此获得的根据权利要求1-5中任一项所述的多肽、根据权利要求6-14中任一项所述的化合物或构建体、或根据权利要求15所述的单价构建体，所述根据权利要求6-14中任一项所述的化合物或构建体是这样的以致其可以通过表达编码其的核酸来获得。
21.组合物，其包含至少一种根据权利要求1-5中任一项所述的多肽、根据权利要求6-14中任一项所述的化合物或构建体、根据权利要求15所述的单价构建体、或根据权利要求17或18所述的核酸。
22.根据权利要求21所述的组合物，其是药物组合物。
23.根据权利要求21所述的组合物，其是药物组合物，其还包含至少一种药用载体、稀释剂或赋形剂和/或辅药，和任选地包含一种或多种其它药物活性多肽和/或化合物。
24.根据权利要求1-5中任一项所述的多肽、根据权利要求6-14中任一项所述的化合物或构建体、或根据权利要求15所述的单价构建体在制备用于预防和/或治疗与IL-6、与IL-6R、与IL-6/IL-6R复合物相关和/或与其中涉及IL-6、IL-6R和/或IL-6/IL-6R复合物的信号传导途径和/或生物学功能和反应相关的至少一种疾病和病症的药物组合物中的用途。
25.根据权利要求1-5中任一项所述的多肽、根据权利要求6-14中任一项所述的化合物或构建体、或根据权利要求15所述的单价构建体，其用于预防和/或治疗与IL-6、与IL-6R、与IL-6/IL-6R复合物相关和/或与其中涉及IL-6、IL-6R和/或IL-6/IL-6R复合物的信号传导途径和/或生物学功能和反应相关的至少一种疾病和病症。
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