CN102099378B - 针对CXCR4和其他GPCRs的氨基酸序列以及包含所述氨基酸序列的多肽 - Google Patents

针对CXCR4和其他GPCRs的氨基酸序列以及包含所述氨基酸序列的多肽 Download PDF

Info

Publication number
CN102099378B
CN102099378B CN200980127612.4A CN200980127612A CN102099378B CN 102099378 B CN102099378 B CN 102099378B CN 200980127612 A CN200980127612 A CN 200980127612A CN 102099378 B CN102099378 B CN 102099378B
Authority
CN
China
Prior art keywords
aminoacid sequence
sequence
present
seqidno
polypeptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN200980127612.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102099378A (zh
Inventor
克里斯托夫·布朗什托
马丁·斯密特
雷格留斯·勒尔
斯文·耶尼兴
迈克尔·约翰·斯科特·桑德斯
约翰内斯·约瑟夫·威廉姆斯·德哈德
彼得·万兰德舒特
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ablynx NV
Original Assignee
Ablynx NV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ablynx NV filed Critical Ablynx NV
Publication of CN102099378A publication Critical patent/CN102099378A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102099378B publication Critical patent/CN102099378B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Abstract

本发明涉及针对(如本文所定义)G蛋白偶联受体(GPCRs)和具体地针对CXCR4和CXCR7的氨基酸序列，以及涉及包含一种或多种所述氨基酸序列或基本由其组成的化合物或构建体，且特别地蛋白和多肽(本文中分别也称为“本发明的氨基酸序列”、“本发明的化合物”、和“本发明的多肽”)。此外，本发明提供制备针对跨膜蛋白，和特别地对于多次跨膜的跨膜蛋白的氨基酸序列的新方法，对于所述跨膜蛋白，不能在其他“体外”系统中复制天然构象(例如，一般GPCRs)。

Description

针对CXCR4和其他GPCRs的氨基酸序列以及包含所述氨基酸序列的多肽
本发明涉及针对(如本文所定义)G蛋白偶联受体(GPCRs)和具体地针对CXCR4和CXCR7的氨基酸序列，以及涉及包含一个或多个所述氨基酸序列或基本上由其组成的化合物或构建体，并且特别是蛋白和多肽(在本文中还分别地称为“本发明的氨基酸序列”、“本发明的化合物”和“本发明的多肽”)。此外，本发明提供一种制备针对跨膜蛋白，和具体地针对在其他″体外″系统中无法复制其天然构象的多次跨膜的跨膜蛋白(例如，一般，GPCRs)的氨基酸序列的新方法。
本发明还涉及编码所述氨基酸序列和多肽的核酸(在本文中还称为“本发明的核酸”或“本发明的核苷酸序列”)；制备所述氨基酸序列和多肽的方法；表达或能够表达所述氨基酸序列或多肽的宿主细胞；包含所述氨基酸序列、多肽、核酸和/或宿主细胞的组合物、且特别是药物组合物；以及所述氨基酸序列或多肽、核酸、宿主细胞和/或组合物的应用，特别是用于预防、治疗或诊断目的，诸如本文所提到的预防、治疗或诊断目的的应用。
本发明的其它方面、实施方案、优点和应用将从本发明的进一步描述中变得显而易见。
GPCRs是公知的受体类型。参考例如针对以下综述进行：Surgand等，Proteins(蛋白质)62：509-538(2006)；Vassilatis等，ProcNatlAcadSciUSA(美国国家科学院院报)100：4903-4908(2003)和Pierce等，NatRevMolCellBiol(分子细胞生物学自然评论)3：639-650(2002)；以及针对例如：George等，NatRevDrugDiscov(药物发现自然评论)1：808-820(2002)；Kenakin，TrendsPharmacolSci(药理学科学趋势)25：186-192(2002)；Rios等，PharmacolTher(药理学和治疗学)92：71-87(2001)；Jacoby等，ChemMedChem2006，1，760-782；以及Schlyer和Horuk，DrugDiscoveryToday(今日药物发现)，11，11/12.2006年6月，481；且还例如针对Rosenkilde，Oncogene(癌基因)(2001)，20，1582-1593和Sadee等，AAPSPharmSci(AAPS药学科学)2001；3；1-16；以及针对其中引用的其他参考文献。
G蛋白偶联受体(GPCRs)是最大的细胞表面受体类型(人基因组中存在多于1000个基因)。它们可以通过多种多样系列的刺激，例如激酶、肽、氨基酸、可见光子来激活，且这些受体在中枢神经系统和在外周中起重要作用。GPCRs是含有7个具有高度保守结构域的跨膜结构域的蛋白。
因为全部已知的药物的一半通过G蛋白偶联受体工作，因此选择针对该蛋白家族的纳米抗体在商业上非常吸引人。估计在2000年中，全部现代药物的一半和200种最畅销药物的几乎四分之一均针对或调节GPCR靶标(总共约30个)。然而，由于其7次跨膜螺旋结构和其强烈的聚集倾向，使得它是一个非常具有挑战性的靶标类型。
GPCR可以基于序列同源性分组为若干不同的家族。尽管全部GPCR都具有类似的7次跨膜α-螺旋结构，但是该受体类型中的不同家族彼此间表现出无序列同源性，由此提示它们的跨膜结构域结构的相似性可能确定共有的功能要求。根据胞外结构域的尺寸来区分三个家族。
-家族1(也称为家族A或视紫红质样家族)的成员仅具有小的胞外环且与跨膜裂沟内的残基发生配体的相互作用。这是迄今为止最大的组(＞90％的GPCRs)并包含嗅觉受体，小分子诸如儿茶酚胺和胺、(神经)肽和糖蛋白激素。属于该家族的视紫红质是其结构问题已经解决的唯一GPCR。
-家族2或家族BGPCR的特征在于参与至配体结合中的相对长的氨基末端胞外结构域。关于跨膜结构域的定位几乎毫无所知，但是它可能与视紫红质非常不同。这些GPCR的配体是激素，诸如胰高血糖素、促性腺激素释放激素和甲状旁腺激素。
-家族3成员也具有大胞外结构域，其类似“维纳斯捕蝇草(Venusflytrap)”起作用，因为它可以打开和关闭，使激动剂结合在其内部。家族成员有代谢型谷氨酸受体、Ca2+-感受受体和γ-氨基丁酸(GABA)B受体。
传统上，使用小分子来开发针对GPCR的药物，不仅因为制药公司具有对其研究的历史原因，而且更重要的是因为家族1GPCR的结构限制，所述家族1GPCR具有跨膜裂沟内的配体结合位点(NatRevDrugDiscov(药物发现自然评论)(2004)ThestateofGPCRresearchin2004(2004年GPCR研究状态).NatureReviewsDrugDiscoveryGPCRQuestionnaireParticipants(药物发现自然评论GPCR调查表参与者)3(7)：575，577-626)。由于该原因，证实很难或不可能生成针对该靶标类型的单克隆抗体。本发明的氨基酸序列(和具体地，本发明的纳米抗体)可以通过它们经由延伸至腔(cavities)内的CDR环结合的固有性质来解决该具体问题。
治疗相关GPCR的一些非限制性实例是例如以下，它们都是已经被批准或处于临床开发中的已知药物的靶标。括号之间的文字表示本发明氨基酸序列、纳米抗体或多肽的预期作用(例如，作为激动剂或拮抗剂)：
A型GPCRs
-毒蕈碱性M1受体
-肾上腺素受体
-组胺受体
-5-HTGPCR
-大麻素受体
-A型激素蛋白GPCR
-趋化因子
-甘丙肽
-黑皮质素
-神经肽Y受体
-神经降压肽受体
-阿片样物质
-促生长素抑制素
-血管升压素样受体
-前列腺素类物质受体
B型GPCRs
-ACTH释放因子受体(调节剂)；
C型GPCRs
-GABAB受体(激动剂)；
-代谢型谷氨酸受体
治疗相关GPCR的一些其他非限制性实例在表C中提及。人GPCR的更广泛列表在表D中给出。
CXCR4，(一种CXC趋化因子受体)，也称融合素，是对基质衍生因子-1(SDF-1，也称CXCL12)特异的α-趋化因子受体，所述基质衍生因子-1是赋予淋巴细胞有效趋化活性的分子。
该受体是可以被HIV分离株用来感染CD4+T细胞的若干趋化因子受体之一。传统上，使用CXCR4的HIV分离株被称为T细胞向性分离株。典型地，这些病毒感染中很晚出现。不清楚使用CXCR4的HIV的出现是免疫缺陷的结果还是原因。
CXCR4的配体SDF-1被认为在造血干细胞归巢至骨髓中和在造血干细胞静止中很重要。
通常关于趋化因子，SDF-1和CXCR4是相对″单配的″配体-受体对(其他趋化因子倾向于以相当“混杂的”方式利用若干不同趋化因子受体)。
因为SDF-1和CXCR4之间的相互作用在保持骨髓中的造血干细胞中起重要作用，所以阻断CXCR4受体的药物似乎能够使造血干细胞“移动”至血流中作为外周血干细胞。外周血干细胞动员在造血干细胞移植中非常重要(作为近年来用于手术收获的骨髓的移植的替代方案)并且目前利用药物诸如G-CSF来进行。G-CSF是嗜中性粒细胞(常见的白细胞类型)的生长因子，并可以通过增加骨髓中嗜中性粒细胞-来源的蛋白酶诸如嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的活性，由此导致SDF-1的蛋白水解性降解来发挥作用。
本发明的多肽和组合物通常可以用于调节，且具体地抑制和/或防止，GPCR介导的信号传导和/或用于调节GPCR参与的生物学途径，和/或用于调节与所述信号传导或这些途径相关的生物学机制、反应和作用。
同样地，本发明的多肽和组合物可以用于预防和治疗(如本文中定义)GPCR相关的疾病和紊乱。一般地，“GPCR相关疾病和紊乱”可以定义为可以分别通过对有此需要(即，患有所述疾病或紊乱或其至少一种症状和/或处于引起或发生所述疾病或紊乱的风险)的受试者适当地施用本发明的多肽或组合物(且具体地，其药物有效量)和/或针对GPCR或GPCR参与的生物学途径或机制的已知活性的有效成分(且具体地，其药物有效量)来预防和/或治疗的疾病和紊乱。基于本文中的公开内容，所述GPCR相关的疾病和紊乱的实例对于技术人员应该是清楚的。
因此，在不受其限制的条件下，本发明的氨基酸序列和多肽可以例如用于预防和/或治疗目前使用可以调节GPCR介导的信号传导的有效成分预防或治疗的全部疾病和紊乱，诸如以上引用的现有技术中提及的那些。还设想，本发明的多肽可以用于预防和/或治疗所有这样的疾病和紊乱，对于所述疾病和紊乱使用所述有效成分的治疗目前正在开发、已经提议、或将来应该提议或开发。另外，设想，由于其如本文中进一步所述的有利性质，本发明的多肽可以用于预防和治疗除对其正在使用或将提议或开发这些已知有效成分的疾病和紊乱以外的其他疾病和紊乱；和/或本发明的多肽可以提供用于治疗本文中所述疾病和紊乱的新方法和方案。
从本文的进一步公开内容，对于专业技术人员来说本发明的氨基酸序列和多肽的其他应用和用途将变得显而易见。
一般地，本发明的一个目的是提供药理学活性剂，以及包含其的组合物，它们可用于GPCR相关疾病和紊乱以及本文提到的其他疾病和紊乱的诊断、预防和/或治疗中；以及提供用于这些疾病和紊乱的诊断、预防和/或治疗的方法，这些方法涉及这些药剂和组合物的施用和/或应用。
特别地，本发明的一个目的是提供与本领域中目前所用的和/或所知的药剂、组合物和/或方法相比具有某些优点的此类药理学活性剂、组合物和/或方法。这些优点将从下文的进一步描述而变得显而易见。
更特别地，本发明的一个目的是提供可以用作药理学活性剂的治疗性蛋白，以及包括其的组合物，其用于诊断、预防和/或治疗GPCR相关的疾病和紊乱以及本文提及的其他的疾病和紊乱；和提供用于诊断、预防和/或治疗所述疾病和紊乱的方法，所述方法涉及所述治疗性蛋白和组合物的施用和/或应用。
因此，本发明的具体目的是提供针对(如本文所定义)GPCR、特别是针对来自温血动物的GPCR、更特别是针对来自哺乳动物的GPCR、并且尤其是针对人GPCR的氨基酸序列；并且提供包括至少一种所述氨基酸序列或基本上由其组成的蛋白和多肽。
特别地，本发明的具体目的是提供适合在温血动物、并且特别是在哺乳动物、且更特别是在人中用于预防、治疗和/或诊断应用的所述氨基酸序列和所述蛋白和/或多肽。
更特别地，本发明的具体目的是提供可以在温血动物、特别是在哺乳动物、且更特别是在人中用于预防、治疗、减轻和/或诊断一种或多种与GPCR相关和/或由GPCR介导的疾病、紊乱或病症(如本文所提及的疾病、紊乱和病症)的所述氨基酸序列和所述蛋白和/或多肽。
本发明还有一个具体目的是提供可以用于制备用于预防和/或治疗温血动物、特别是哺乳动物、且更特别是人中的一种或多种与GPCR相关的和/或由GPCR介导的疾病、紊乱或病症(如本文所提及的疾病、紊乱和病症)的药物或兽医用组合物的所述氨基酸序列和所述蛋白和/或多肽。
在本发明中，通常，这些目的通过利用本文所述的氨基酸序列、蛋白、多肽和组合物实现。
一般地，本发明提供针对(如本文所定义)和/或可以特异性结合(如本文所定义)GPCR的氨基酸序列；以及包括至少一个所述氨基酸序列的化合物和构建体、且特别是蛋白和多肽。
更特别地，本发明提供可以以如本文所定义的亲和力(适当测量和/或表示为KD-值(实际的或表观的)，KA-值(实际的或表观的)，kon-速率和/或koff-速率，或备选地为IC50值，如本文进一步所述)与GPCR结合的氨基酸序列；以及包括至少一个所述氨基酸序列的化合物和构建体、且特别是蛋白和多肽。
特别地，本发明的氨基酸序列和多肽优选是这样的，即，它们：
-以10-5-10-12摩尔/升或更小、并且优选地10-7-10-12摩尔/升或更小、并且更优选地10-8-10-12摩尔/升的解离常数(KD)(即，以105-1012升/摩尔或更大、并且优选地107-1012升/摩尔或更大、且更优选地108-1012升/摩尔的缔合常数(KA))与GPCR结合；
和/或是这样的，即，它们：
-以102M-1s-1-约107M-1s-1，优选103M-1s-1-107M-1s-1，更优选104M-1s-1-107M-1s-1，诸如105M-1s-1-107M-1s-1的kon-速率与GPCR结合；和/或是这样的，即，它们：
-以1s-1(t1/2＝0.69s)-10-6s-1(假定具有多天的t1/2的几乎不可逆的复合体)，优选10-2s-1-10-6s-1，更优选10-3s-1-10-6s-1，诸如10-4s-1-10-6s-1的koff速率与GPCR结合。
优选地，本发明的单价氨基酸序列(或包含仅一个本发明的氨基酸序列的多肽)优选是这样的，即，它将以小于500nM，优选小于200nM，更优选小于10nM，诸如小于500pM的亲和力与GPCR结合。
对于本发明的氨基酸序列或多肽与GPCR结合的一些优选的IC50值将从本发明的进一步描述和实施例中变得显而易见。
对于与GPCR合，本发明的氨基酸序列通常将在其氨基酸序列内包含一个或多个氨基酸残基、或氨基酸残基的一个或多个序列(即，每个“序列(stretch)”包括彼此相邻或彼此紧邻的两个(或多个)氨基酸残基，即，在该氨基酸序列的一级或三级结构上)，通过其本发明的氨基酸序列可以与GPCR结合，因此所述氨基酸残基或氨基酸残基的序列形成结合GPCR的“位点”(本文还称为“抗原结合位点”)。
本发明提供的氨基酸序列优选地基本上采用分离形式(如本文所定义)、或形成本发明的蛋白或多肽的一部分(如本文所定义)，其可以包括一个或多个本发明的氨基酸序列或基本上由其组成，并且其可以任选地还包括一个或多个其它的氨基酸序列(全部任选地通过一个或多个适当的接头连接)。例如，并且不限于，本发明的一个或多个氨基酸序列可以用作在这样的蛋白或多肽内的结合单位，所述蛋白或多肽可以任选地包含可以充当结合单位的一个或多个其它的氨基酸序列(即，针对除GPCR外的一个或多个其它靶标)，以便分别提供单价、多价或多特异性的本发明的多肽，全如本发明所述。这样的蛋白或多肽还可以采用基本上分离的形式(如本文所定义)。
因此，本发明的氨基酸序列和多肽优选地基本上由不通过二硫键与任一另一氨基酸序列或链连接(但是其可以或可以不包含一个或多个分子内二硫键。例如，已知纳米抗体----如本文所述----有时可以含有在CDR3和CDR1或FR2之间的二硫键)的单个氨基酸链组成。然而，应该注意，一个或多个本发明的氨基酸序列可以彼此连接和/或与其他氨基酸序列连接(例如，通过二硫键)，以提供也可以用于本发明的肽构建体(例如，Fab’片段，F(ab’)2片段，ScFv构建体，“双抗体”和其他多特异性构建体。例如，参考Holliger和Hudson，NatBiotechnol.(自然生物技术)2005年9月；23(9)：1126-36的综述)。
一般地，当本发明的氨基酸序列(或包含其的化合物、构建体或多肽)意欲施用给受试者时(例如，为了如本文所述的治疗和/或诊断目的)，优选其是在所述受试者内天然不存在的氨基酸序列；或当它在所述受试者内天然存在时，采用基本上分离的形式(如本文所定义)。
专业技术人员还应该清楚，对于药物应用，本发明的氨基酸序列(以及包含其的化合物、构建体和多肽)优选地针对GPCR；而对于兽医用目的，本发明的氨基酸序列和多肽优选地针对来自待治疗的物种的GPCR，或至少与来自待治疗的物种的GPCR交叉反应。
此外，本发明的氨基酸序列可以任选地，并且除了所述至少一个针对GPCR结合的结合位点之外，包含针对其它抗原、蛋白或靶标结合的一个或多个其它的结合位点。本发明的氨基酸序列和多肽的功效、以及包含其的组合物的功效可以使用任何适合的体外测定、基于细胞的测定、体内测定和/或本身已知的动物模型、或它们的任何组合进行检测，这取决于所涉及的具体的疾病或紊乱。适当的测定和动物模型对于专业技术人员来说将是清楚的，并且例如，包括爪蟾卵母细胞中受体的表达，其后使许多GPCR与离子通道的偶联容许通过电压钳技术在卵母细胞中监测的这些GPCR的活化或抑制。异源GPCR可以通过将外源性GPCR-编码mRNA注射到卵母细胞中而在卵母细胞中功能性表达，并然后容许20种卵母细胞内源性细胞机器将受体翻译并插入到质膜中(参见，例如，Houamed等，Science(科学)252：1318-21，1991；Dahmen等，J.Neurochem.(神经化学杂志)58：1176-79，1992.)。在受体功能性表达后，配体诱导跨膜电导变化的能力可以通过两电极电压钳系统(Dahmen等，见上)观察到，这可以检测膜电势的去极化或超极化。
用于筛选GPCR的其他技术是专业技术人员清楚的，例如，来自本文中引用的手册、综述和现有技术。这些包括例如放射性配体结合测定，如例如在Lundstrom等，JStructFunctGenomics.(结构功能遗传学杂志)2006年11月22日；[在出版前的电子公开]中使用的和如在Andre等，ProteinSci(蛋白质科学)5：1115(2006)；Hassaine等，(2006)ProtPurifExpr(蛋白质纯化表达)45：343；Nicholson等JPharmacolExpTher.(药理学实验治疗杂志)2006May；317(2)：771-7.[2006年1月25日电子公开]和Vilardaga等，JBiolChem.(生物化学杂志)2001年9月7日；276(36)：33435-43.2001年5月31日电子公开中所述的，其例如利用可以如Hovius等，(1998)JNeurochem(神经化学杂志)70：824中所述制备的膜制剂。用于筛选GPCR的一些HTS技术在由Jacoby等综述的表4中提及。
并且，根据本发明，针对来自第一温血动物物种的GPCR的氨基酸序列和多肽可以或可以不表现出与来自一种或多种其它温血动物物种的GPCR的交叉反应性。例如，针对人GPCR的氨基酸序列和多肽可以或可以不表现出与来自一种或多种其它灵长类物种(诸如，不限于，来自猕猴属(Macaca)的猴子(诸如，并且特别地，食蟹猴(食蟹猴(Macacafascicularis))和/或恒河猴(恒河猴(Macacamulatta)))和狒狒(豚尾狒狒(Papioursinus)))的GPCR的交叉反应性，和/或与来自通常用于疾病的动物模型中(例如小鼠、大鼠、兔、猪或狗)、且特别是用于与GPCR相关的疾病和紊乱的动物模型中的一种或多种动物物种(诸如本文提及的物种和动物模型)的GPCR的交叉反应性。在这一方面，对于专业技术人员应该清楚，从药物开发观点来看，所述交叉反应性，当存在时，可能具有优点，因为它允许所述针对人GPCR的氨基酸序列和多肽在所述疾病模型中被检测到。
更一般地，与来自多个哺乳动物物种的GPCR交叉反应的本发明的氨基酸序列和多肽将通常有利于用于兽医应用，原因在于它将允许在多种物种之间使用相同的氨基酸序列或多肽。因此，在本发明的范围内还包括，针对来自一个动物物种的GPCR的氨基酸序列和多肽(诸如针对人GPCR的氨基酸序列和多肽)可以用于治疗另一个动物物种，只要所述氨基酸序列和/或多肽的应用在待治疗的物种中提供所需要的作用。
本发明在其最广泛意义上也不特别限于或限定于本发明的氨基酸序列和多肽所针对的GPCR的特异性抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚单位或构象(confirmation)(在适用时)。例如，本发明的氨基酸序列可以通过用已经在合适表达系统中表达的或已经由合适细胞或细胞级分分离的GPCR适当免疫哺乳动物(诸如骆驼科动物(Camelid))产生。具体地，本发明的氨基酸序列可以(例如利用Kiefer，Biochim.Biophys.Acta，1610(2003)，57-62的综述中描述的技术)针对已经重折叠的GPCR产生，并且针对和/或已经针对重折叠的GPCR产生的氨基酸序列、纳米抗体和多肽形成本发明的另一方面。
本发明的氨基酸序列和多肽通常可以针对任何需要的GPCR，且可以具体地针对具有至少一个胞外环或胞外结构域的GPCR。所述GPCR的实例基于本文中引用的现有技术对专业技术人员应该是清楚的。
根据本发明的特殊方面，本发明的氨基酸序列和多肽可以针对(如本文所定义)在细胞表面上表达的GPCR和/或针对GPCR的至少一个胞外区、胞外结构域、胞外环或其他胞外表位。例如，这样的氨基酸序列可以通过用具有GPCR或其表面的细胞或细胞级分适当地免疫哺乳动物(诸如骆驼科动物)产生。
特别地，根据该方面，本发明的氨基酸序列和多肽针对(如本文所定义)GPCR，例如人CXCR4和/或人CXCR7的至少一个胞外区、胞外结构域、胞外环或其他胞外表位，且优选进一步是这样的，即所述本发明的氨基酸序列和多肽能够调节(如本文所定义)所述GPCR，例如人CXCR4和/或人CXCR7。更特别地，根据该方面，本发明的氨基酸序列和多肽针对(如本文所定义)GPCR，例如人CXCR4和/或人CXCR7的至少一个胞外区、胞外结构域、胞外环或其他胞外表位；且优选进一步是这样的，即所述本发明的氨基酸序列和多肽能够(完全地或部分地)阻断所述GPCR，例如人CXCR4和/或人CXCR7。
根据本发明的这个方面，本发明的氨基酸序列和多肽可以针对GPCR，例如人CXCR4和/或人CXCR7的任何合适胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他胞外表位，但优选针对跨膜结构域的一个胞外部分或更优选针对连接跨膜结构域的一个胞外环。
所述合适的胞外区、胞外结构域、胞外环或表位的氨基酸序列可以通过相关GPCR，例如人CXCR4和/或人CXCR7的氨基酸序列的Kyte-Doolittle分析；通过比对属于相同(亚)家族的GPCR和识别各种跨膜结构域和胞外部分、胞外区、胞外结构域或胞外环；通过TMAP分析；或通过其任何合适的组合获得。本发明还涉及针对所述胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或表位的和/或已经针对其产生(和/或针对所述胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或表位的合适部分或片段的和/或已经针对其和/或针对基于所述胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或表位获得的合成或半合成肽产生)的氨基酸序列(如本文中进一步所定义)。
特别地，本发明的氨基酸序列和多肽优选是这样的，即，它们：
-以10-5-10-12摩尔/升或更小、并且优选地10-7-10-12摩尔/升或更小、并且更优选地10-8-10-12摩尔/升的解离常数(KD)(即，以105-1012升/摩尔或更大、并且优选地107-1012升/摩尔或更大、且更优选地108-1012升/摩尔的缔合常数(KA))与GPCR(如本文中所述)的胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他胞外表位结合或针对由其获得的肽结合；
和/或是这样的，即，它们：
-以102M-1s-1-约107M-1s-1，优选103M-1s-1-107M-1s-1，更优选104M-1s-1-107M-1s-1，诸如105M-1s-1-107M-1s-1的kon-速率与GPCR(如本文中所述)的胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他胞外表位结合或针对由其获得的肽结合；
和/或是这样的，即，它们：
-以1s-1(t1/2＝0.69s)-10-6s-1(提供具有多天的t1/2的几乎不可逆的复合体)，优选10-2s-1-10-6s-1，更优选10-3s-1-10-6s-1，诸如10-4s-1-10-6s-1的koff速率与GPCR(如本文中所述)的胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他胞外表位结合或针对由其获得的肽结合。
优选地，本发明的单价氨基酸序列(或包含仅一个本发明的氨基酸序列的多肽)优选是这样的，即，它将以小于500nM，优选小于200nM，更优选小于10nM，诸如小于500pM的亲和力与GPCR(如本文中所述)的胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他胞外表位结合。
而且，根据该方面，本发明的任何多价或多特异性(如本文所定义)多肽也可以适当地针对同一抗原上的两个或更多不同的胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他胞外表位，例如针对两个不同的胞外环、针对跨膜结构域的两个不同的胞外部分或针对一个胞外环和一个胞外环。本发明的这样的多价或多特异性多肽还可以具有(或被改造和/或被选择为)对于所需GPCR的增加的抗体亲抗原性(avidity)和/或提高的选择性，和/或对于可以通过使用所述多价或单特异性多肽获得的任何其他所需性质或所需性质的组合。
通常，预期本发明的针对GPCR的胞外环或胞外结构域(或针对源自其或基于其的小肽)，和/或已经针对GPCR的胞外环或胞外结构域(或针对源自其或基于其的小肽)筛选、利用其选择和/或针对其产生的氨基酸序列和多肽也应该能够结合(且特别地，特异性结合，如本文中定义)所述形成存在于细胞表面上的GPCR的一部分(或其至少一个亚单位)的胞外环或胞外结构域(或源自其的肽)。因此，所述胞外环或胞外结构域(或源自其的肽)可以在用于生成本发明的氨基酸序列和多肽(如本文所定义)的方法中存在用途；且所述方法和用途形成本发明的其他方面；针对胞外环或胞外结构域或源自其的肽或针对其产生的本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽也形成本发明的其他方面。
例如，所述方法可以包括以下：
a)用包含所需胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他胞外表位的合适抗原，或用源自其或基于其的合适肽适当地免疫骆驼科动物，从而产生针对所需胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他胞外表位的免疫应答的步骤。抗原可以是能够产生针对所需胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他一个或多个胞外表位的免疫应答的任何合适抗原；诸如，例如且不限于，有生命的并以其天然构象在其表面上过表达所需胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他一个或多个胞外表位的完整细胞，其细胞壁片段或源自所述细胞的任何其他制剂，在其表面上具有所需胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他一个或多个胞外表位的囊泡，包含所需胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他一个或多个胞外表位的GPCR例如人CXCR4和/或人CXCR7亚单位或亚单位的片段，或包含和/或基于所需胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他一个或多个胞外表位(的氨基酸序列)的合成或半合成肽；更优选地，有生命的并以其天然构象在其表面上过表达所需胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他一个或多个胞外表位的完整细胞(例如HEK293)；和
b)利用过表达所述GPCR，例如人CXCR4和/或人CXCR7的不同(与免疫中使用的那种不同)和若干细胞类型的细胞膜制剂来选择用于结合所需胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他一个或多个胞外表位的步骤。这可以通过从在其表面上表达重链抗体的细胞的组、集合或文库(例如获自适当免疫的骆驼科动物的B细胞)选择和使用例如用于第一轮选择的第一类细胞诸如例如CHO和例如用于第二轮选择的第二类细胞诸如例如COS-7细胞的细胞膜制剂来实现，通过使用例如用于第一轮选择的第一类细胞诸如例如CHO和例如用于第二轮选择的第二类细胞诸如例如COS-7细胞的细胞膜制剂从VHH序列或纳米抗体序列的(幼稚或免疫)库中选择来实现，或通过使用例如用于第一轮选择的第一类细胞诸如例如CHO和例如用于第二轮选择的第二类细胞诸如例如COS-7细胞的细胞膜制剂从编码VHH序列或纳米抗体序列的核苷酸序列的(幼稚或免疫)文库中选择来实现；其都可以以本身已知的方式进行；和任选地
c)用缓冲液诸如无去污剂的PBS仅适度洗涤；且该方法可以任选地进一步包括一个或多个本身已知的其他合适步骤，诸如，例如且不限于，亲和力成熟的步骤，表达所需氨基酸序列的步骤，筛选针对所需抗原(在该情形中，GPCR)结合和/或针对所需抗原(在该情形中，GPCR)的活性的步骤，确定所需氨基酸序列或核苷酸序列的步骤，引入一个或多个人源化取代(例如如本文中进一步所述)的步骤，以合适的多价和/或多特异性形式格式化的步骤，筛选所需生物学和/或生理学性质(即利用合适的测定，诸如本文中所述的那些)的步骤；和/或一个或多个所述步骤以任何合适顺序的任何合适组合。
所述方法和通过所述方法获得的氨基酸序列，以及包含所述氨基酸序列或基本由其组成的蛋白和多肽形成本发明的其他方面。
本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽还可以在与内源性激动剂相同的位点(即正构(orthosteric)位点)处结合GPCR，由此激活或增加受体信号传导；或备选地由此减少或抑制受体信号传导。
本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽还可以以这样方式结合GPCR，所述方式是它们阻断GPCR的组成型活性。
本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽还可以以这样的方法结合GPCR，所述方式是它们介导变构调节(例如在变构位点处结合GPCR)。这样，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽可以通过结合受体中的不同区域(例如在变构位点处)来调节受体功能。参考例如针对George等，NatRevDrugDiscov(药物发现自然评论)1：808-820(2002)；Kenakin，TrendsPharmacolSci(药理学科学趋势)25：186-192(2002)和Rios等，PharmacolTher(药理学治疗)92：71-87(2001))进行。
本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽还可以以这样的方法结合GPCR，所述方式是它们抑制或增强GPCR功能性同二聚体或异二聚体的装配。
本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽还可以以这样的方法结合GPCR，所述方式是它们延长GPCR介导的信号传导的持续时间。
本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽还可以通过增加受体-配体亲和力来增强受体信号传导。
针对GPCR及其配体的本发明多肽还可以通过使配体与正构位点交联；和/或稳定配体与正构位点的结合而提供配体与GPCR增强的结合。因此，本发明的另一方面涉及本发明的多特异性多肽(如本文所定义)，其包含至少一个本发明的针对GPCR蛋白酶的氨基酸序列(诸如纳米抗体)和至少一个针对其天然配体的结合单元。所述多特异性蛋白也可以进一步如本文中所述。
而且，如由本文中进一步的公开内容应该清楚地，且取决于它们针对的GPCR和它们所需的(治疗)作用，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽可以担当GPCR(和/或GPCR的配体)和/或与其相关的生物学功能、途径、机制、作用、信号传导或反应的(完全的或部分的)激动剂，(完全的或部分的，且竞争性的或非竞争性的)拮抗剂或反向激动剂。它们可以以不可逆的方式执行这些作用，但优选以可逆的方式执行。
在优选的实施方案中，本发明的氨基酸序列和多肽是本发明GPCR的(完全的或部分的，且竞争性或非竞争性的)拮抗剂或反向激动剂，更优选地，本发明的氨基酸序列和多肽是纳米抗体，其是本发明GPCR的(完全的或部分的，且竞争性或非竞争性的)拮抗剂或反向激动剂。
我们的结果显示单价和/或多价形式的纳米抗体，和可能地，还有本发明的氨基酸序列和多肽，可以担当表现出纳米抗体平台的广阔适用性的针对组成型活性GPCR的中性拮抗剂或反向激动剂。最畅销的GPCR药物中大部分表现为反向激动剂而非中性拮抗剂(MilliganG.(2003).Mol.Pharmacol.(分子药理学)64：1271-1276)并且已经声称反向激动剂与中性拮抗剂相比，可以对若干疾病包括癌症具有特定的治疗益处(KenakinT.(2004).Mol.Pharmacol.(分子药理学)65：2-11)。此外，反向激动剂可以优于中性拮抗剂来抑制其他功能。
在优选的实施方案中，本发明的氨基酸序列和多肽是“单克隆”氨基酸序列或多肽，这意味着所述针对所述蛋白或多肽中存在的GPCR(且优选所述蛋白或多肽中存在的全部免疫球蛋白序列)的一个或多个氨基酸序列至少每一个是“单克隆”，如专业技术人员通常理解地。然而，在该方面，应该注意到，如进一步在本文中所述，本发明明确地涵盖包含两个或更多个免疫球蛋白序列(且特别地，单克隆免疫球蛋白序列)的多价或多特异性蛋白，所述两个或更多个免疫球蛋白序列针对相同GPCR的不同部分、区、结构域、环或表位，且特别地，针对相同GPCR的不同胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或表位。
在适用时，本发明的氨基酸序列可以结合于GPCR的两个以上的抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚单位或构象，这也在本发明范围内。在此情况下，本发明的氨基酸序列和/或多肽结合的GPCR的抗原决定簇、表位、部分、结构域或亚单位可以基本上是相同的(例如，如果GPCR包含重复的结构基序或以多聚体形式存在)，或可以是不同的(并且在后一种情况下，本发明的氨基酸序列和多肽可以以可能相同或不同的亲和力和/或特异性结合于GPCR的所述不同的抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚单位)。此外，例如，当GPCR以活化构象存在和以无活性构象存在时，本发明的氨基酸序列和多肽可以结合于这些构象中的任一种，或者可以结合于这两种构象(即，以可能是相同的或不同的亲和力和/或特异性)。此外，例如，本发明的氨基酸序列和多肽可以这样地结合于GPCR的构象，即，在所述构象中其与相关配体结合；可以这样地结合于GPCR的构象，即，在所述构象中其不与相关配体结合，或者可以结合于所述两种构象(同样以可能是相同的或不同的亲和力和/或特异性)。
还期望本发明的氨基酸序列和多肽通常将结合于GPCR的所有天然存在的或合成的类似物、变体、突变体、等位基因、部分和片段；或至少结合于GPCR的下面的那些类似物、变体、突变体、等位基因、部分和片段，即它们包含与在GPCR中(例如在野生型异二聚体细胞因子和/或它们的受体中)与本发明的氨基酸序列和多肽结合的(一个或多个)抗原决定簇或(一个或多个)表位基本上相同的一个或多个抗原决定簇或表位。同样地，在此情况下，本发明的氨基酸序列和多肽可以以本发明的氨基酸序列与(野生型)GPCR结合的亲和力和特异性相同或不同(即，高于或低于其)的亲和力和/或特异性结合于所述类似物、变体、突变体、等位基因、部分和片段。本发明的氨基酸序列和多肽结合于GPCR的一些类似物、变体、突变体、等位基因、部分和片段而不结合于另一些，这也包括在本发明的范围内。
当GPCR以单体形式存在和以一个或多个多聚体形式存在时，本发明的氨基酸序列和多肽只与单体形式的GPCR结合，只与多聚体形式的GPCR结合，或均与单体和多聚体形式二者结合，在本发明的范围内。同样地，在这样的情形中，本发明的氨基酸序列和多肽可以以与本发明的氨基酸序列和所述多聚体形式结合的亲和力和特异性相同，或不同(即，高于或低于其)的亲和力和/或特异性与单体形式结合。
此外，当GPCR可以与其他蛋白或多肽缔合以形成蛋白复合体(例如，具有多个亚基)时，本发明的氨基酸序列和多肽与处于其非缔合状态的GPCR结合，与处于其缔合状态的GPCR结合，或与二者均结合，这在本发明的范围内。在所有这些情形中，本发明的氨基酸序列和多肽可以以与本发明的氨基酸序列和多肽与处于其单体和非缔合状态的GPCR结合的亲和力和/或特异性可能是相同的或不同(即，高于或低于其)的亲和力和/或特异性与所述多聚体或缔合的蛋白复合体结合。
此外，对于专业技术人员应该是清楚的，包含两个或更多个针对GPCR的氨基酸序列的蛋白或多肽可以以比相对应的一个或多个单体氨基酸序列更高的亲和力与GPCR结合。例如，但不限于，包含两个或更多个针对GPCR的不同表位的氨基酸序列的蛋白或多肽可以(并且通常将)以比不同单体的每一个更高的抗体亲抗原性结合，并且包含两个或更多个针对GPCR的氨基酸序列的蛋白或多肽还可以(并且通常将)以更高的抗体亲抗原性结合GPCR的多聚体。
一般地，本发明的氨基酸序列和多肽将至少结合那些形式的GPCR(包括单体、多聚体和缔合形式)，从生物学和/或治疗观点看来，这些形式是最相关的，这对于专业技术人员将是清楚的。
使用本发明的氨基酸序列和多肽的部分、片段、类似物、突变体、变体、等位基因和/或衍生物，和/或使用包括一个或多个所述部分、片段、类似物、突变体、变体、等位基因和/或衍生物或基本上由其组成的蛋白或多肽，也在本发明的范围内，只要这些适用于本发明考虑的应用。所述部分、片段、类似物、突变体、变体、等位基因和/或衍生物通常将包含(至少部分地)针对GPCR结合的功能性抗原-结合位点；并且更优选地将能够特异性结合GPCR，并且甚至更优选地能够以如本发明所定义的亲和力(适当地测量和/或表示为KD-值(实际的或表观的)，KA-值(实际的或表观的)，kon-速率和/或koff-速率，或备选地作为IC50值，如本发明进一步所述)结合GPCR。所述部分、片段、类似物、突变体、变体、等位基因、衍生物、蛋白和/或多肽的一些非限制性实例将通过本发明的进一步描述变得清楚。还可以通过适当组合(即，通过连接或基因融合)一个或多个(更小的)本发明所述的部分或片段而提供本发明的其他片段或多肽。
在本发明的一个具体而非限制性方面中，其将在本发明中进一步描述，与它们衍生而来的氨基酸序列相比，所述类似物、突变体、变体、等位基因、衍生物具有增加的半衰期(如本发明进一步所述)。例如，可以将本发明的氨基酸序列连接到(化学或其他方式)一个或多个延长半衰期的基团或结构部分(诸如PEG)上，以提供具有增加的半衰期的本发明的氨基酸序列的衍生物。
在一个具体而非限制性的方面中，本发明的氨基酸序列可以是包括免疫球蛋白折叠的氨基酸序列，或可以是在适当条件(诸如生理条件)下能够形成免疫球蛋白折叠(即，通过折叠)的氨基酸序列。其中特别参考Halaby等，J.(1999)蛋白质工程(ProteinEng.)12，563-71的综述。优选地，当正确折叠以形成免疫球蛋白折叠时，这样的氨基酸序列能够特异性结合(如本发明所定义)GPCR；并且更优选地能够以如本发明所定义的亲和力(适当地测量和/或表示为KD-值(实际的或表观的)，KA-值(实际的或表观的)，kon-速率和/或koff-速率，或备选地作为IC50值，如本发明进一步所述)结合GPCR。此外，所述氨基酸序列的部分、片段、类似物、突变体、变体、等位基因和/或衍生物优选是这样的，以致它们包括免疫球蛋白折叠或者能够在适当的条件下形成免疫球蛋白折叠。
特别地，但不限于，本发明的氨基酸序列可以是基本上由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补性决定区(分别为CDR1-CDR3)组成的氨基酸序列；或所述氨基酸序列的任何适当的片段(那么其通常将包含至少一些形成至少一个CDR的氨基酸残基，如本文进一步所述)。
本发明的氨基酸序列可以特别是免疫球蛋白序列或其适当的片段，并且更特别地是免疫球蛋白可变结构域序列或其适当的片段，诸如轻链可变结构域序列(例如，VL-序列)或其适当的片段；或重链可变结构域序列(例如，VH-序列)或其适当的片段。当本发明的氨基酸序列是重链可变结构域序列时，它可以是来源于常规四链抗体的重链可变结构域序列(诸如，不限于，来源于人抗体的VH序列)，或是来源于所谓的“重链抗体”(如本文所定义)的所谓的VHH-序列(如本文所定义)。
然而，应该注意到，本发明不限制本发明的氨基酸序列的来源(或用于表达其的本发明的核苷酸序列的来源)，也不限制产生或获得(或已经产生或获得)本发明的氨基酸序列或核苷酸序列的方法。因此，本发明的氨基酸序列可以是天然存在的氨基酸序列(来自任何适当的物种)或合成的或半合成的氨基酸序列。在本发明的具体而非限制性方面，所述氨基酸序列是天然存在的免疫球蛋白序列(来自任何适当的物种)或合成的或半合成的免疫球蛋白序列，包括但不限于“人源化的”(如本文所定义)免疫球蛋白序列(诸如部分或完全人源化的小鼠或兔免疫球蛋白序列，并且特别是部分或完全人源化的VHH序列或纳米抗体)，“骆驼源化的(camelized)”(如本文所定义的)免疫球蛋白序列，以及已经通过下列技术获得的免疫球蛋白序列：诸如亲和力成熟(例如，起始于合成的、随机的或天然存在的免疫球蛋白序列)，CDR移植，镶盖术(veneering)，组合来源于不同的免疫球蛋白序列的片段，利用重叠的引物进行的PCR装配，以及专业技术人员公知的加工免疫球蛋白序列的相似技术；或前述任一项的任何适当的组合。例如，参考标准手册，以及进一步描述和本文提及的现有技术。
类似地，本发明的核苷酸序列可以是天然存在的核苷酸序列或合成的或半合成的序列，并且例如，可以是通过PCR从适当的天然存在的模板(例如，从细胞分离的DNA或RNA)分离的序列，已经从文库(并且特别是表达文库)分离的核苷酸序列，已经通过向天然存在的核苷酸序列中引入突变(利用任何适当的本身已知的技术，诸如错配PCR)而制备的核苷酸序列，已经使用重叠的引物通过PCR制备的核苷酸序列，或已经利用本身已知的DNA合成技术制备的核苷酸序列。
本发明的氨基酸序列可以特别是结构域抗体(或适合用作结构域抗体的氨基酸序列)，单结构域抗体(或适合用作单结构域抗体的氨基酸序列)，″dAb″(或适合用作dAb的氨基酸序列)或纳米抗体TM(NanobodyTM)(如本文所定义，并且包括但不限于VHH序列)；其它单可变结构域，或它们中任一种的任何适当的片段。对于(单)结构域抗体的概括描述，参考上文引用的现有技术，以及参考EP0368684。对于术语“dAb’s”，例如，参考Ward等(自然(Nature)1989年10月12日；341(6242)：544-6)，参考Holt等，生物技术趋势(TrendsBiotechnol.)，2003，21(11)：484-490；以及例如参考WO06/030220，WO06/003388与Domantis(DomantisLtd.)有限公司的其它公布的专利申请。还应该注意到，尽管由于它们不是哺乳动物来源的，在本发明的情形中较不优选，但是单结构域抗体或单可变结构域可以来源于某些鲨鱼(shark)物种(例如，所谓的“IgNAR结构域”，参见例如WO05/18629)。
特别地，本发明的氨基酸序列可以是纳米抗体(如本文所定义)或其适当的片段。[注意：纳米抗体TM(NanobodyTM)，纳米抗体TM(NanobodiesTM)和纳米克隆TM(NanocloneTM)为埃博灵克斯股份有限公司(AblynxN.V.)的商标。]所述针对GPCR的纳米抗体在本文也称为“本发明的纳米抗体”。
对于纳米抗体的概括描述，参考下文的进一步描述，以及参考本文所引用的现有技术。在这一方面，然而，应该注意到，本文描述和现有技术主要描述所谓“VH3种类”的纳米抗体(即，与VH3种类的人种系序列如DP-47、DP-51或DP-29具有高度序列同源性的纳米抗体)，所述纳米抗体形成本发明的优选方面。然而，应该注意到，本发明在其最广泛意义上通常涵盖任何类型的针对GPCR的纳米抗体，并且例如，还涵盖属于所谓的“VH4种类”的纳米抗体(即，与VH4种类的人种系序列如DP-78具有高度序列同源性的纳米抗体)，例如，如在埃博灵克斯股份有限公司(AblynxN.V.)于2006年4月14日提交的题目为“DP-78样纳米抗体(DP-78-likeNanobodies)”的美国临时申请60/792,279中描述。
一般地，纳米抗体(特别是VHH序列和部分人源化的纳米抗体)可以特别地特征在于，在一个或多个构架序列(同样如本文进一步所述)中存在一个或多个“标志残基(hallmarkresidues)”(如本文所述)。
因此，通常，纳米抗体可以定义为具有下述(通用)结构的氨基酸序列：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补性决定区1-3，并且其中一个或多个标志残基如本文进一步所定义。
特别地，纳米抗体可以是具有下述(通用)结构的氨基酸序列：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补性决定区1-3，并且其中所述构架序列如本文进一步所定义。
更特别地，纳米抗体可以是具有下述(通用)结构的氨基酸序列：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补性决定区1-3，并且其中：
i)优选地，在按照Kabat编号的位置11，37，44，45，47，83，84，103，104和108的氨基酸残基的一个或多个选自下表A-3中提及的标志残基；
并且其中：
ii)所述氨基酸序列与SEQIDNO’s：1-22中的至少一种氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性，其中为了确定氨基酸同一性程度的目的，忽略形成CDR序列的氨基酸残基(在序列SEQIDNO’s：1-22中表示为X)。
在这些纳米抗体中，所述CDR序列通常如本文进一步所定义。
因此，本发明还涉及这样的纳米抗体，其可以结合(如本文定义)和/或针对GPCR，涉及其适当的片段，以及涉及包含一种或多种所述纳米抗体和/或适当的片段或基本上由其组成的多肽。
SEQIDNO’s238-253给出了已经针对人CXCR4产生的许多VHH序列的氨基酸序列(表1)。
表1：针对人CXCR4(SEQIDNO：254)的纳米抗体：
表1.1：针对人CXCR4(SEOIDNO：254)的纳米抗体的CDRs：
预期本发明的针对人CXCR7(且特别地，拮抗剂)的氨基酸序列、纳米抗体和多肽，以及包含它们的组合物，可以在预防和治疗例如伤口愈合、AIDS和癌症中存在特别的用途。
因此，本发明的一些特别优选的纳米抗体是可以结合(如本文中进一步所定义)和/或针对人CXCR4的纳米抗体，且其：
i)对SEQIDNO’s：238-253，更优选SEQIDNO：238和SEQIDNO：239的至少一个氨基酸序列具有至少80％氨基酸同一性，其中为了确定氨基酸同一性程度的目的，形成CDR序列的氨基酸残基被忽略。就此而言，还参考表A-1，该表列举了SEQIDNO’s：238-253，更优选SEQIDNO：238和SEQIDNO：239的纳米抗体的构架1序列(SEQIDNO’s：126-141)，构架2序列(SEQIDNO’s：158-173)，构架3序列(SEQIDNO’s：190-205)和构架4序列(SEQIDNO’s：222-237)(就构架1序列的位置1-4和27-30处的氨基酸残基而言，还参考下面的评论。因此，为了确定氨基酸同一性程度，这些残基优选地被忽略)；
和其中：
ii)优选地，在按照Kabat编号的位置11，37，44，45，47，83，84，103，104和108处的氨基酸残基的一个或多个选自下表A-3中提及的标志残基(Hallmarkresidues)。
在这些纳米抗体中，CDR序列通常如本文进一步所述。
同样地，所述纳米抗体可以以任何适当的方式获得，并且来源于任何适当的来源，并且例如，可以是天然存在的VHH序列(即，来自于适当的骆驼(Camelid)物种)或合成的或半合成的氨基酸序列，包括但不限于“人源化的”(如本文所定义)纳米抗体，“骆驼源化的”(如本文所定义)免疫球蛋白序列(并且特别是骆驼源化的重链可变结构域序列)，以及已经通过下列技术获得的纳米抗体：诸如亲和力成熟(例如，起始于合成的、随机的或天然存在的免疫球蛋白序列)，CDR移植，镶盖术，组合来源于不同的免疫球蛋白序列的片段，利用重叠的引物进行的PCR装配，以及专业技术人员公知的加工免疫球蛋白序列的相似技术；或前述任一项的任何适当的组合，这如本文进一步描述。此外，当纳米抗体包括VHH序列时，所述纳米抗体可以适当地被人源化，如本文进一步所述，以便提供一个或多个本发明的进一步(部分或完全)人源化的纳米抗体。类似地，当纳米抗体包括合成的或半合成的序列(诸如部分人源化的序列)时，所述纳米抗体可以任选地进一步适当地被人源化，同样如本文所述，同样以便提供一个或多个其他本发明的(部分或完全)人源化的纳米抗体。
特别地，人源化的纳米抗体可以是如前述段落中关于纳米抗体概括定义的氨基酸序列，但是其中存在至少一个这样的氨基酸残基(并且特别地，在至少一个构架残基中)，所述氨基酸残基是和/或对应人源化的取代(如本文所定义)。基于本发明公开的内容，对于专业技术人员，一些优选的、而非限制性的人源化取代(及其适当的组合)将变得清楚。另外，或者备选地，通过比较天然存在的VHH序列的构架区序列与一个或多个紧密相关的人VH序列的相对应的构架序列，可以确定其它潜在有用的人源化取代，此后，可以将由此确定的一个或多个潜在有用的人源化取代(或其组合)引入到所述VHH序列中(以本身已知的任何方式，如本文进一步所述)，并且可以检测所得到的人源化的VHH序列对靶标的亲和力、稳定性、表达的容易性和水平、和/或其它需要的特性。在这种方式中，通过利用有限的试验和误差程度，专业技术人员基于本发明公开的内容可以确定其它适当的人源化取代(或其适当的组合)。此外，基于前述内容，纳米抗体(的构架区)可以是部分人源化的或完全人源化的。
本发明一些特别优选的人源化的纳米抗体是SEQIDNO’s：238-253，更优选SEQIDNO：238和SEQIDNO：239的纳米抗体的人源化变体。
因此，本发明一些其它优选的纳米抗体是这样的纳米抗体，其可以结合(如本文进一步所述)人CXCR4，并且其：
i)是SEQIDNO’s：238-253，更优选SEQIDNO：238和SEQIDNO：239的氨基酸序列之一的人源化变体；和/或
ii)与SEQIDNO’s：238-253，更优选SEQIDNO：238和SEQIDNO：239的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性，其中为了确定氨基酸同一性程度的目的，忽略形成CDR序列的氨基酸残基；
并且其中：
i)优选地，在依据Kabat编号的位置11，37，44，45，47，83，84，103，104和108的一个或多个氨基酸残基选自下表A-3中提及的标志残基。
按照本发明的另一个具体方面，本发明提供许多特别适合结合GPCR的氨基酸残基的序列(streches)(即，小肽)。这些氨基酸残基的序列可以存在于，和/或可以结合在本发明的氨基酸序列中，特别以它们形成本发明的氨基酸序列的(部分)抗原结合位点的方式存在和/或结合。由于这些氨基酸残基序列最初作为针对GPCR产生的重链抗体或VHH序列的CDR序列产生(或可以基于和/或来源于所述CDR序列，如本发明进一步所述)，在本发明中它们还将通常被称为“CDR序列”(即，分别称为CDR1序列，CDR2序列和CDR3序列)。然而，应该注意到，本发明在其最广泛意义上不限于这些氨基酸残基序列可能在本发明的氨基酸序列中具有的特有的结构作用或功能，只要这些氨基酸残基序列允许本发明的氨基酸序列与GPCR结合。因此，一般地，本发明在其最广泛意义上包括任何这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列能够与GPCR结合，并且包括一个或多个本文所述的CDR序列，并且特别地两个或更多个所述CDR序列的适当组合，其通过一个或多个其它氨基酸序列彼此适当连接，以致整个氨基酸序列形成能够结合GPCR的结合结构域和/或结合单位。然而，还应该注意到，在本发明的氨基酸序列中仅存在一个所述CDR序列可以本身已经足以提供能够结合GPCR的本发明的氨基酸序列；例如，同样参考WO03/050531中描述的所谓的“派遣片段(Expeditefragments)”。
因此，在另一个具体而非限制性的方面，本发明的氨基酸序列可以是这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包括选自由本文中所述的CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列(或它们的任何适当的组合)组成的组的至少一个氨基酸序列。特别地，本发明的氨基酸序列可以是包括至少一个抗原结合位点的氨基酸序列，其中所述抗原结合位点包括选自由本文所述的CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列(或它们的任何适当的组合)组成的组的至少一个氨基酸序列。
一般地，在本发明的这一方面中，本发明的氨基酸序列可以是包括至少一个氨基酸残基序列的任何氨基酸序列，其中所述氨基酸残基序列具有与本文所述的至少一个CDR序列的序列相对应的氨基酸序列。这样的氨基酸序列可以或可以不包括免疫球蛋白折叠。例如，并且不限于，这样的氨基酸序列可以是适当的免疫球蛋白序列片段，所述片段包括至少一个所述CDR序列，但是其不够大，不足以形成(完整)的免疫球蛋白折叠(例如，同样参考WO03/050531中所述的“派遣片段”)。备选地，这样的氨基酸序列可以是适当的“蛋白支架”，所述蛋白支架包括与这样的CDR序列相对应(即，作为其抗原结合位点的一部分)的至少一个氨基酸残基序列。用于呈递氨基酸序列的适当的支架对于专业技术人员将是清楚的，并且例如，包括，但不限于，基于或来源于免疫球蛋白的结合支架(即，除了本发明已经描述的免疫球蛋白序列之外)，来源于蛋白质A结构域的蛋白支架(诸如AffibodiesTM)，淀粉酶抑肽(tendamistat)，纤连蛋白，脂笼蛋白，CTLA-4，T-细胞受体，设计的锚蛋白重复序列，avimers和PDZ结构域(Binz等，自然生物技术(Nat.Biotech)2005，卷23：1257)，和基于DNA或RNA的结合部分，包括但不限于DNA或RNA适体(Ulrich等，组合化学高通量筛选(CombChemHighThroughputScreen)20069(8)：619-32)。
同样地，包括一个或多个这些CDR序列的任何本发明的氨基酸序列优选是这样的，以致其可以特异性结合(如本文所定义)GPCR，并且更特别地是这样的，以致其可以以如本发明所限定的亲和力(适当测量和/或表示为KD-值(实际的或表观的)，KA-值(实际的或表观的)，kon-速率和/或koff-速率，或备选地作为IC50值，如本文进一步所述)与GPCR结合。
更特别地，本发明该方面所述的氨基酸序列可以是包括至少一个抗原结合位点的任何氨基酸序列，其中所述抗原结合位点包括选自由本发明所述的CDR1序列、本发明所述的CDR2序列和本发明所述的CDR3序列组成的组的至少两个氨基酸序列，以致(i)当第一氨基酸序列选自本发明所述的CDR1序列时，第二氨基酸序列选自本发明所述的CDR2序列或本发明所述的CDR3序列；(ii)当第一氨基酸序列选自本发明所述的CDR2序列时，第二氨基酸序列选自本发明所述的CDR1序列或本发明所述的CDR3序列；或(iii)当第一氨基酸序列选自本发明所述的CDR3序列时，第二氨基酸序列选自本发明所述的CDR1序列或本发明所述的CDR3序列。
甚至更特别地，本发明的氨基酸序列可以是包括至少一个抗原结合位点的氨基酸序列，其中所述抗原结合位点包括选自由本发明所述的CDR1序列、本发明所述的CDR2序列和本发明所述的CDR3序列组成的组的至少三个氨基酸序列，以致第一氨基酸序列选自本发明所述的CDR1序列，第二氨基酸序列选自本发明所述的CDR2序列，并且第三氨基酸序列选自本发明所述的CDR3序列。优选的CDR1、CDR2和CDR3序列的组合将通过本发明的进一步描述变得清楚。对于专业技术人员将是清楚的，这样的氨基酸序列优选是免疫球蛋白序列(如本发明进一步所述)，但是例如，它也可以是包括呈递所述CDR序列的适当的支架的任何其它的氨基酸序列。
因此，在一个具体而非限制性方面中，本发明涉及针对GPCR的氨基酸序列，其包括选自由下列各项组成的组的一个或多个氨基酸残基序列：
a)SEQIDNO’s：142-157，更优选142-143的氨基酸序列；
b)与SEQIDNO’s：142-157，更优选142-143的至少一个氨基酸序列具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列；
c)与SEQIDNO’s：142-157，更优选142-143的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列
d)SEQIDNO’s：174-189，更优选174-175的氨基酸序列；
e)与SEQIDNO’s：174-189，更优选174-175的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
f)与SEQIDNO’s：174-189，更优选174-175的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
g)SEQIDNO’s：206-221，更优选206-207的氨基酸序列；
h)与SEQIDNO’s：206-221，更优选206-207的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
i)与SEQIDNO’s：206-221，更优选206-207的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
或它们的任何适当的组合。
当本发明的氨基酸序列包含b)和/或c)所述的一个或多个氨基酸序列时：
i)与a)所述的相对应氨基酸序列相比，在b)和/或c)所述的氨基酸序列中的任何氨基酸置换优选是保守氨基酸置换，(如本文所定义)；
和/或
ii)与a)所述的相对应氨基酸序列相比，b)和/或c)所述的氨基酸序列优选地仅包含氨基酸置换，并且没有氨基酸删除或插入；
和/或
iii)利用一种或多种本身已知的亲和力成熟技术通过亲和力成熟的方式，
b)和/或c)所述的氨基酸序列可以是来源于a)所述的氨基酸序列的氨基酸序列。
类似地，当本发明的氨基酸序列包含e)和/或f)所述的一个或多个氨基酸序列时：
i)与d)所述的相对应氨基酸序列相比，在e)和/或f)所述的氨基酸序列中的任何氨基酸置换优选是保守氨基酸置换，(如本文所定义)；
和/或
ii)与d)所述的相对应氨基酸序列相比，e)和/或f)所述的氨基酸序列优选地仅包含氨基酸置换，并且没有氨基酸删除或插入；
和/或
iii)利用一种或多种本身已知的亲和力成熟技术通过亲和力成熟的方式，
e)和/或f)所述的氨基酸序列可以是来源于d)所述的氨基酸序列的氨基酸序列。
此外，类似地，当本发明的氨基酸序列包含h)和/或i)所述的一个或多个氨基酸序列时：
i)与g)所述的相对应氨基酸序列相比，在h)和/或i)所述的氨基酸序列中的任何氨基酸置换优选是保守氨基酸置换，(如本文所定义)；
和/或
ii)与g)所述的相对应氨基酸序列相比，h)和/或i)所述的氨基酸序列优选地仅包含氨基酸置换，并且没有氨基酸删除或插入；
和/或
iii)利用一种或多种本身已知的亲和力成熟技术通过亲和力成熟的方式，
h)和/或i)所述的氨基酸序列可以是来源于g)所述的氨基酸序列的氨基酸序列。
应该理解，前述的最后段落通常也适用于分别包括b)，c)，e)，f)，h)或i)所述的一个或多个氨基酸序列的本发明的任何氨基酸序列。
在该具体方面中，所述氨基酸序列优选地包括选自由下列各项组成的组的一个或多个氨基酸残基序列：
i)SEQIDNO’s：142-157，更优选142-143的氨基酸序列；
ii)SEQIDNO’s：174-189，更优选174-175的氨基酸序列；和
iii)SEQIDNO’s：206-221，更优选206-207的氨基酸序列；或它们的任何适当组合。
此外，优选地，在这样的氨基酸序列中，至少一个所述氨基酸残基序列形成结合GPCR的抗原结合位点的一部分。
在一个更具体而同样非限制性方面中，本发明涉及针对GPCR的氨基酸序列，其包括选自由下列各项组成的组的两个或更多个氨基酸残基序列：
a)SEQIDNO’s：142-157，更优选142-143的氨基酸序列；
b)与SEQIDNO’s：142-157，更优选142-143的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
c)与SEQIDNO’s：142-157，更优选142-143的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
d)SEQIDNO’s：174-189，更优选174-175的氨基酸序列；
e)与SEQIDNO’s：174-189，更优选174-175的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
f)与SEQIDNO’s：174-189，更优选174-175的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
g)SEQIDNO’s：206-221，更优选206-207的氨基酸序列；
h)与SEQIDNO’s：206-221，更优选206-207的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
i)与SEQIDNO’s：206-221，更优选206-207的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
以致(i)当第一氨基酸残基序列对应于a)，b)或c)所述的氨基酸序列之一时，第二氨基酸残基序列对应于d)，e)，f)，g)，h)或i)所述的氨基酸序列之一；
(ii)当第一氨基酸残基序列对应于d)，e)或f)所述的氨基酸序列之一时，第二氨基酸残基序列对应于a)，b)，c)，g)，h)或i)所述的氨基酸序列之一；或(iii当第一氨基酸残基序列对应于g)，h)或i)所述的氨基酸序列之一时，第二氨基酸残基序列对应于a)，b)，c)，d)，e)或f)所述的氨基酸序列之一。
在该具体方面中，所述氨基酸序列优选地包括选自由下列各项组成的组的两个以上的氨基酸残基序列：
i)SEQIDNO’s：142-157，更优选142-143的氨基酸序列；
ii)SEQIDNO’s：174-189，更优选174-175的氨基酸序列；和
iii)SEQIDNO’s：206-221，更优选206-207的氨基酸序列；
以致，(i)当第一氨基酸残基序列对应于SEQIDNO’s：142-157，更优选142-143的氨基酸序列之一时，第二氨基酸残基序列对应于SEQIDNO’s：174-189，更优选174-175或SEQIDNO’s：206-221，更优选206-207的氨基酸序列之一；(ii)当第一氨基酸残基序列对应于SEQIDNO’s：174-189，更优选174-175的氨基酸序列之一时，第二氨基酸残基序列对应于SEQIDNO’s：142-157，更优选142-143或SEQIDNO’s：206-221，更优选206-207的氨基酸序列之一；或(iii)当第一氨基酸残基序列对应于SEQIDNO’s：206-221，更优选206-207的氨基酸序列之一时，第二氨基酸残基序列对应于SEQIDNO’s：142-157，更优选142-143或SEQIDNO’s：174-189，更优选174-175的氨基酸序列之一。
此外，在这样的氨基酸序列中，所述至少两个氨基酸残基序列同样优选地形成结合GPCR的抗原结合位点的一部分。
在甚至更具体而非限制性的方面中，本发明涉及针对GPCR的氨基酸序列，其包括三个或更多个氨基酸残基序列，其中第一氨基酸残基序列选自由下列各项组成的组：
a)SEQIDNO’s：142-157，更优选142-143的氨基酸序列；
b)与SEQIDNO’s：142-157，更优选142-143的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
c)与SEQIDNO’s：142-157，更优选142-143的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
第二氨基酸残基序列选自由下列各项组成的组：
d)SEQIDNO’s：174-189，更优选174-175的氨基酸序列；
e)与SEQIDNO’s：174-189，更优选174-175的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
f)与SEQIDNO’s：174-189，更优选174-175的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
并且第三氨基酸残基序列选自由下列各项组成的组：
g)SEQIDNO’s：206-221，更优选206-207的氨基酸序列；
h)与SEQIDNO’s：206-221，更优选206-207的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
i)与SEQIDNO’s：206-221，更优选206-207的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
优选地，在该具体方面中，第一氨基酸残基序列选自由SEQIDNO’s：142-157，更优选142-143的氨基酸序列组成的组；第二氨基酸残基序列选自由SEQIDNO’s：174-189，更优选174-175的氨基酸序列组成的组；并且第三氨基酸残基序列选自由SEQIDNO’s：206-221，更优选206-207的氨基酸序列组成的组。
同样地，优选地，在这样的氨基酸序列中，所述至少三个氨基酸残基序列形成结合GPCR的抗原结合位点的一部分。
所述氨基酸序列的序列的优选组合将通过本发明进一步的公开内容变得清楚。
优选地，在所述氨基酸序列中，所述CDR序列与SEQIDNO’s：238-253，更优选SEQIDNO：238和SEQIDNO：239的至少一个氨基酸序列的CDR序列具有至少70％的氨基酸同一性，优选至少80％的氨基酸同一性，更优选至少90％的氨基酸同一性，诸如95％的氨基酸同一性或更多，或甚至基本上100％的氨基酸同一性。此氨基酸同一性的程度可以例如通过确定(以本文中所述的方式)所述氨基酸序列和SEQIDNO’s：238-253，更优选SEQIDNO：238和SEQIDNO：239的一个或多个序列之间的氨基酸同一性的程度来确定，其中忽略形成构架区的氨基酸残基。此外，本发明的所述氨基酸序列可以如本文进一步所述。
此外，所述氨基酸序列优选是这样的，以致它们可以特异性结合(如本文所定义)GPCR的成员；并且更特别地以如本发明所定义的亲和力结合GPCR(适当测量和/或表示为KD-值(实际的或表观的)，KA-值(实际的或表观的)，kon-速率和/或koff-速率，或备选地为IC50值，如本文进一步所述)。
当本发明的氨基酸序列基本上由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补性决定区(分别为CDR1-CDR3)组成时，本发明的氨基酸序列优选地是这样的，以致：
-CDR1选自由下列各项组成的组：
a)SEQIDNO’s：142-157，更优选142-143的氨基酸序列；
b)与SEQIDNO’s：142-157，更优选142-143的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
c)与SEQIDNO’s：142-157，更优选142-143的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和/或
-CDR2选自由下列各项组成的组：
d)SEQIDNO’s：174-189，更优选174-175的氨基酸序列；
e)与SEQIDNO’s：174-189，更优选174-175的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
f)与SEQIDNO’s：174-189，更优选174-175的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和/或
-CDR3选自由下列各项组成的组：
g)SEQIDNO’s：206-221，更优选206-207的氨基酸序列；
h)与SEQIDNO’s：206-221，更优选206-207的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
i)与SEQIDNO’s：206-221，更优选206-207的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
特别地，这样的本发明的氨基酸序列可以是这样的，以致CDR1选自由SEQIDNO’s：142-157，更优选142-143的氨基酸序列组成的组；和/或CDR2选自由SEQIDNO’s：174-189，更优选174-175的氨基酸序列组成的组；和/或CDR3选自由SEQIDNO’s：206-221，更优选206-207的氨基酸序列组成的组。
特别地，当本发明的氨基酸序列基本上由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补性决定区(分别为CDR1-CDR3)组成时，本发明的氨基酸序列优选地是这样，以致：
-CDR1选自由下列各项组成的组：
a)SEQIDNO’s：142-157，更优选142-143的氨基酸序列；
b)与SEQIDNO’s：142-157，更优选142-143的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
c)与SEQIDNO’s：142-157，更优选142-143的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和
-CDR2选自由下列各项组成的组：
d)SEQIDNO’s：174-189，更优选174-175的氨基酸序列；
e)与SEQIDNO’s：174-189，更优选174-175的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
f)与SEQIDNO’s：174-189，更优选174-175的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和
-CDR3选自由下列各项组成的组：
g)SEQIDNO’s：206-221，更优选206-207的氨基酸序列；
h)与SEQIDNO’s：206-221，更优选206-207的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
i)与SEQIDNO’s：206-221，更优选206-207的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；或所述氨基酸序列的任何合适的片段。
特别地，这样的本发明的氨基酸序列可以是这样的，以致CDR1选自由SEQIDNO’s：142-157，更优选142-143的氨基酸序列组成的组；和CDR2选自由SEQIDNO’s：174-189，更优选174-175的氨基酸序列组成的组；和CDR3选自由SEQIDNO’s：206-221，更优选206-207的氨基酸序列组成的组。
同样地，优选的CDR序列的组合将通过本发明的进一步描述而变得清楚。
此外，所述氨基酸序列优选是这样的，以致它们可以特异性结合(如本发明所定义)GPCR的成员；并且更特别地以如本发明所定义的亲和力结合GPCR的成员(适当测量和/或表示为KD-值(实际的或表观的)，KA-值(实际的或表观的)，kon-速率和/或koff-速率，或备选地作为IC50值，如本发明进一步所述)。
在一个优选而非限制性方面中，本发明涉及基本上由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补性决定区(分别为CDR1-CDR3)组成的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列的CDR序列与SEQIDNO’s：238-253，更优选SEQIDNO：238和SEQIDNO：239的至少一个氨基酸序列的CDR序列具有至少70％的氨基酸同一性，优选至少80％的氨基酸同一性，更优选至少90％的氨基酸同一性，诸如95％的氨基酸同一性或更多，或者甚至基本上100％的氨基酸同一性。例如，这种氨基酸同一性的程度可以通过确定在所述氨基酸序列和SEQIDNO’s：238-253，更优选SEQIDNO：238和SEQIDNO：239的一个或多个序列之间的氨基酸同一性程度(以本发明所述的方式)而确定，其中忽略形成所述构架区的氨基酸残基。本发明的所述氨基酸序列可以如本文进一步所述。
在甚至更具体而非限制性的方面中，本发明涉及针对人CXCR4、能够阻断人CXCR4的CXCL12/SDF1依赖性活化的氨基酸序列(诸如本发明的纳米抗体，如本文中进一步所述)，其包括选自由下列各项组成的组中的一个或更多个氨基酸残基序列：
a)SEQIDNO’s：142-143的氨基酸序列；
b)与SEQIDNO’s：142-143的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
c)与SEQIDNO’s：142-143的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
d)SEQIDNO’s：174-175的氨基酸序列；
e)与SEQIDNO’s：174-175的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
f)与SEQIDNO’s：174-175的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
g)SEQIDNO’s：206-207的氨基酸序列；
h)与SEQIDNO’s：206-207的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
i)与SEQIDNO’s：206-207的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
或它们的任何合适组合。
当本发明的氨基酸序列包含根据b)和/或c)的一个或多个氨基酸序列时：
i)与a)所述的相对应氨基酸序列相比，在b)和/或c)所述的氨基酸序列中的任何氨基酸置换优选是保守氨基酸置换，(如本文所定义)；
和/或
ii)与a)所述的相对应氨基酸序列相比，b)和/或c)所述的氨基酸序列优选地仅包含氨基酸置换，并且没有氨基酸删除或插入；
和/或
iii)b)和/或c)所述的氨基酸序列可以是利用一种或多种本身已知的亲和力成熟技术通过亲和力成熟的方式获自a)所述的氨基酸序列的氨基酸序列。
类似地，当本发明的氨基酸序列包含e)和/或f)所述的一个或多个氨基酸序列时：
i)在e)和/或f)所述的氨基酸序列中的任何氨基酸置换优选是，并且与d)所述的相对应氨基酸序列相比，保守氨基酸置换，(如本文所定义)；
和/或
ii)与d)所述的相对应氨基酸序列相比，e)和/或f)所述的氨基酸序列优选地仅包含氨基酸置换，并且没有氨基酸删除或插入；
和/或
iii)e)和/或f)所述的氨基酸序列可以是利用一种或多种本身已知的亲和力成熟技术通过亲和力成熟的方式获自d)所述的氨基酸序列的氨基酸序列。
此外，类似地，当本发明的氨基酸序列包含h)和/或i)所述的一个或多个氨基酸序列时：
i)在h)和/或i)所述的氨基酸序列中的任何氨基酸置换优选是，并且与g)所述的相对应氨基酸序列相比，保守氨基酸置换，(如本文所定义)；
和/或
ii)与g)所述的相对应氨基酸序列相比，h)和/或i)所述的氨基酸序列优选地仅包含氨基酸置换，并且没有氨基酸删除或插入；
和/或
iii)h)和/或i)所述的氨基酸序列可以是利用一种或多种本身已知的亲和力成熟技术通过亲和力成熟的方式获自g)所述的氨基酸序列的氨基酸序列。
应该理解，前述的最后段落通常也适用于分别包括b)，c)，e)，f)，h)或i)所述的一个或多个氨基酸序列的本发明的任何氨基酸序列。
在该具体方面中，所述氨基酸序列优选地包括选自由下列各项组成的组的一个或多个氨基酸残基序列：
a)SEQIDNO’s：142-143的氨基酸序列；
b)SEQIDNO’s：174-175的氨基酸序列；和
c)SEQIDNO’s：206-207的氨基酸序列；
或它们的任何适当组合。
此外，优选地，在这样的氨基酸序列中，至少一个所述氨基酸残基序列形成结合人CXCR4的抗原结合位点的一部分。
在一个更具体而同样非限制性方面中，本发明涉及针对人CXCR4的氨基酸序列，其包括选自由下列各项组成的组的两个或更多个氨基酸残基序列：
a)SEQIDNO’s：142-143的氨基酸序列；
b)与SEQIDNO’s：142-143的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
c)与SEQIDNO’s：142-143的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
d)SEQIDNO’s：174-175的氨基酸序列；
e)与SEQIDNO’s：174-175的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
f)与SEQIDNO’s：174-175的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
g)SEQIDNO’s：206-207的氨基酸序列；
h)与SEQIDNO’s：206-207的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
i)与SEQIDNO’s：206-207的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
以致(i)当第一氨基酸残基序列对应于a)，b)或c)所述的氨基酸序列之一时，第二氨基酸残基序列对应于d)，e)，f)，g)，h)或i)所述的氨基酸序列之一；
(ii)当第一氨基酸残基序列对应于d)，e)或f)所述的氨基酸序列之一时，第二氨基酸残基序列对应于a)，b)，c)，g)，h)或i)所述的氨基酸序列之一；或(iii)当第一氨基酸残基序列对应于g)，h)或i)所述的氨基酸序列之一时，第二氨基酸残基序列对应于a)，b)，c)，d)，e)或f)所述的氨基酸序列之一。
在该具体方面中，所述氨基酸序列优选地包括选自由下列各项组成的组的两个以上的氨基酸残基序列：
a)SEQIDNO’s：142-143的氨基酸序列；
b)SEQIDNO’s：174-175的氨基酸序列；和
c)SEQIDNO’s：206-207的氨基酸序列；
以致，(i)当第一氨基酸残基序列对应于SEQIDNO’s：142-143的氨基酸序列之一时，第二氨基酸残基序列对应于SEQIDNO’s：174-175或SEQIDNO’s：206-207的氨基酸序列之一；(ii)当第一氨基酸残基序列对应于SEQIDNO’s：174-175的氨基酸序列之一时，第二氨基酸残基序列对应于SEQIDNO’s：142-143或SEQIDNO’s：206-207的氨基酸序列之一；或(iii)当第一氨基酸残基序列对应于SEQIDNO’s：206-207的氨基酸序列之一时，第二氨基酸残基序列对应于SEQIDNO’s：142-143或SEQIDNO’s：174-175的氨基酸序列之一。
此外，在这样的氨基酸序列中，所述至少两个氨基酸残基序列同样优选地形成结合人CXCR4的抗原结合位点的一部分。
在甚至更具体而非限制性的方面中，本发明涉及针对人CXCR4的氨基酸序列，其包括三个或更多个氨基酸残基序列，其中第一氨基酸残基序列选自由下列各项组成的组：
a)SEQIDNO’s：142-143的氨基酸序列；
b)与SEQIDNO’s：142-143的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
c)与SEQIDNO’s：142-143的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
第二氨基酸残基序列选自由下列各项组成的组：
d)SEQIDNO’s：174-175的氨基酸序列；
e)与SEQIDNO’s：174-175的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
f)与SEQIDNO’s：174-175的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
并且第三氨基酸残基序列选自由下列各项组成的组：
g)SEQIDNO’s：206-207的氨基酸序列；
h)与SEQIDNO’s：206-207的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
i)与SEQIDNO’s：206-207的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
优选地，在该具体方面中，第一氨基酸残基序列选自由SEQIDNO’s：142-143的氨基酸序列组成的组；第二氨基酸残基序列选自由SEQIDNO’s：174-175的氨基酸序列组成的组；并且第三氨基酸残基序列选自由SEQIDNO’s：206-207的氨基酸序列组成的组。
同样地，优选地，在这样的氨基酸序列中，所述至少三个氨基酸残基序列形成结合人CXCR4的抗原结合位点的一部分。
所述氨基酸序列的优选组合将通过本发明进一步的公开内容变得清楚。
优选地，在所述氨基酸序列中，所述CDR序列与SEQIDNO’s：238-239的至少一个氨基酸序列的CDR序列具有至少70％的氨基酸同一性，优选至少80％的氨基酸同一性，更优选至少90％的氨基酸同一性，诸如95％的氨基酸同一性或更多，或甚至基本上100％的氨基酸同一性。此氨基酸同一性的程度可以例如通过确定(以本文中所述的方式)所述氨基酸序列和SEQIDNO’s：238-239的一个或多个序列之间的氨基酸同一性的程度来确定，其中忽略形成构架区的氨基酸残基。此外，本发明的所述氨基酸序列可以如本文进一步所述。
此外，所述氨基酸序列优选是这样的，以致它们可以特异性结合(如本文所定义)人CXCR4；并且更特别地以如本发明所定义的亲和力结合人CXCR4(适当测量和/或表示为KD-值(实际的或表观的)，KA-值(实际的或表观的)，kon-速率和/或koff-速率，或备选地为IC50值，如本文进一步所述)。
当本发明的氨基酸序列基本上由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补性决定区(分别为CDR1-CDR3)组成时，本发明的氨基酸序列优选地是这样的，以致：
-CDR1选自由下列各项组成的组：
a)SEQIDNO’s：142-143的氨基酸序列；
b)与SEQIDNO’s：142-143的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
c)与SEQIDNO’s：142-143的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和/或
-CDR2选自由下列各项组成的组：
d)SEQIDNO’s：174-175的氨基酸序列；
e)与SEQIDNO’s：174-175的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
f)与SEQIDNO’s：174-175的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和/或
-CDR3选自由下列各项组成的组：
g)SEQIDNO’s：206-207的氨基酸序列；
h)与SEQIDNO’s：206-207的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
i)与SEQIDNO’s：206-207的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
特别地，这样的本发明的氨基酸序列可以是这样的，以致CDR1选自由SEQIDNO’s：142-143的氨基酸序列组成的组；和/或CDR2选自由SEQIDNO’s：174-175的氨基酸序列组成的组；和/或CDR3选自由SEQIDNO’s：206-207的氨基酸序列组成的组。
特别地，当本发明的氨基酸序列基本上由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补性决定区(分别为CDR1-CDR3)组成时，本发明的氨基酸序列优选地是这样，以致：
-CDR1选自由下列各项组成的组：
a)SEQIDNO’s：142-143的氨基酸序列；
b)与SEQIDNO’s：142-143的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
c)与SEQIDNO’s：142-143的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和
-CDR2选自由下列各项组成的组：
d)SEQIDNO’s：174-175的氨基酸序列；
e)与SEQIDNO’s：174-175的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
f)与SEQIDNO’s：174-175的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和
-CDR3选自由下列各项组成的组：
g)SEQIDNO’s：206-207的氨基酸序列；
h)与SEQIDNO’s：206-207的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
i)与SEQIDNO’s：206-207的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；或所述氨基酸序列的任何合适的片段。
特别地，这样的本发明的氨基酸序列可以是这样的，以致CDR1选自由SEQIDNO’s：142-143的氨基酸序列组成的组；和CDR2选自由SEQIDNO’s：174-175的氨基酸序列组成的组；和CDR3选自由SEQIDNO’s：206-207的氨基酸序列组成的组。
同样地，优选的CDR序列的组合将通过本发明的进一步描述而变得清楚。
此外，所述氨基酸序列优选是这样的，以致它们可以特异性结合(如本发明所定义)人CXCR4；并且更特别地以如本发明所定义的亲和力结合人CXCR4(适当测量和/或表示为KD-值(实际的或表观的)，KA-值(实际的或表观的)，kon-速率和/或koff-速率，或备选地作为IC50值，如本发明进一步所述)。
在一个优选而非限制性方面中，本发明涉及基本上由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补性决定区(分别为CDR1-CDR3)组成的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列的CDR序列与SEQIDNO’s：238-239的至少一个氨基酸序列的CDR序列具有至少70％的氨基酸同一性，优选至少80％的氨基酸同一性，更优选至少90％的氨基酸同一性，诸如95％的氨基酸同一性或更多，或者甚至基本上100％的氨基酸同一性。例如，这种氨基酸同一性的程度可以通过确定在所述氨基酸序列和SEQIDNO’s：238-239的一个或多个序列之间的氨基酸同一性程度(以本发明所述的方式)而确定，其中忽略形成所述构架区的氨基酸残基。本发明的所述氨基酸序列可以如本文进一步所述。
在这样的本发明的氨基酸序列中，所述构架序列可以是任何适当的构架序列，并且例如，基于标准手册和进一步公开的内容以及本发明引用的现有技术，适当的构架序列的实例对于专业技术人员将是清楚的。
所述构架序列优选是免疫球蛋白构架序列或已经来源于免疫球蛋白构架序列(例如，通过人源化或骆驼源化)的构架序列(的适当组合)。例如，所述构架序列可以是来源于轻链可变结构域(例如，VL-序列)和/或来源于重链可变结构域(例如，VH-序列)的构架序列。在一个特别优选的方面中，所述构架序列是已经来源于VHH-序列的构架序列(其中所述构架序列可以任选地已经被部分或完全人源化)或是已经骆驼源化(如本文所定义)的常规VH序列。
所述构架序列优选地是这样的，以致本发明的氨基酸序列是结构域抗体(或适合用作结构域抗体的氨基酸序列)；是单结构域抗体(或适合用作单结构域抗体的氨基酸序列)；是″dAb″(或适合用作dAb的氨基酸序列)；或是纳米抗体TM(包括但不限于VHH序列)。同样地，例如，基于标准手册和进一步的公开内容以及本文所提及的现有技术，适当的构架序列对于专业技术人员将是清楚的。
特别地，在本发明的氨基酸序列中存在的所述构架序列可以包含一个或多个标志残基(如本文所定义)，以致本发明的氨基酸序列是纳米抗体TM。所述构架序列(的适当的组合)的一些优选的、而非限制性的实例将通过本文进一步的公开内容变得清楚。
同样地，如本文关于本发明的氨基酸序列概括所述，还可以使用前述任一种的适当的片段(或片段组合)，诸如包含适当与一个或多个构架序列侧连和/或通过一个或多个构架序列连接的一个或多个CDR序列的片段(例如，以如这些CDR相同的顺序，并且构架序列可以以所述片段所来源的完全大小的免疫球蛋白序列存在)。所述片段还可以也是这样的，以致它们包括或可以形成免疫球蛋白折叠，或者备选地是这样的，以致它们不包括或不能形成免疫球蛋白折叠。
在一个具体的方面中，这样的片段包括如本文所述的单CDR序列(并且特别是CDR3序列)，其在每一边侧连构架序列(的一部分)(并且特别地，在所述片段所来源的免疫球蛋白序列中与所述CDR序列相邻的构架序列的一部分。例如，CDR3序列可以在FR3序列(的一部分)之后并且在FR4序列(的一部分)之前)。这样的片段还可以包含二硫键，并且特别是连接分别在所述CDR序列之前和之后的两个构架区的二硫键(为了形成这样的二硫键的目的，可以使用在所述构架区中天然存在的半胱氨酸残基，或备选地，半胱氨酸残基可以合成添加或引入到所述构架区)。对于这些“派遣片段”的进一步描述，同样参考WO03/050531，以及埃博灵克斯股份有限公司(AblynxN.V.)于2006年12月5日提交的题目为“能够结合血清蛋白的肽(Peptidescapableofbindingtoserumproteins)”的美国临时申请(发明人：Revets，HildeAdiPierrette；Kolkman，JoostAlexander；和Hoogenboom，HendricusRenerusJacobusMattheus)。
在另一个方面中，本发明涉及一种化合物或构建体，并且特别是一种蛋白或多肽(在本文中还分别称为“本发明的化合物”或“本发明的多肽”)，其包括一个或多个本发明的氨基酸序列(或其适当的片段)或基本上由其组成，并且任选地还包括一个或多个其它基团、残基、部分或结合单位。如通过本发明进一步的公开内容，对于专业技术人员将变得清楚的，所述其它基团、残基、部分、结合单位或氨基酸序列可以或可以不为本发明的氨基酸序列(和/或为其存在于其中的化合物或构建体)提供其它的官能性，并且可以或可以不修饰本发明的氨基酸序列的特性。
例如，所述其它基团、残基、部分或结合单位可以是一个或多个额外的氨基酸序列，以致所述化合物或构建体是一种(融合)蛋白或(融合)多肽。在一个优选而非限制性的方面中，所述一个或多个其它基团、残基、部分或结合单位是免疫球蛋白序列。甚至更优选地，所述一个或多个其它基团、残基、部分或结合单位选自由下列各项组成的组：结构域抗体、适合用作结构域抗体的氨基酸序列、单结构域抗体、适合用作单结构域抗体的氨基酸序列、“dAb”、适合用作dAb的氨基酸序列、或纳米抗体。
备选地，例如，所述基团、残基、部分或结合单位可以是化学基团、残基、部分，其自身可以是或可以不是生物学和/或药理学活性的。例如，并且不限于，所述基团可以连接到一个或多个本发明的氨基酸序列上，以提供本发明的氨基酸序列或多肽的“衍生物”，如本文进一步所述。
本发明的多肽包含至少一种本发明的纳米抗体或基本由其组成。本发明多肽的一些优选但非限制性实例以SEQIDNO’s：261-264，更优选SEQIDNO’s263-264给出。
表2：优选的多肽或化合物序列(本文中也称为具有特定名称或SEQIDNO：X的序列，其中X是关于相关氨基酸序列的编号)：
也在本发明范围内的是这样的化合物或构建体，其包括一个或多个本发明所述的衍生物或基本上由其组成，并且任选地还包括任选地通过一个或多个接头连接的一个或多个其它基团、残基、部分或结合单位。优选地，所述一个或多个其它基团、残基、部分或结合单位是氨基酸序列。
在上述化合物或构建体中，所述一个或多个本发明的氨基酸序列以及所述一个或多个基团、残基、部分或结合单位可以彼此直接连接和/或通过一个或多个适当的接头或间隔臂连接。例如，当所述一个或多个基团、残基、部分或结合单位是氨基酸序列时，所述接头也可以是氨基酸序列，以致所得到的化合物或构建体是融合(蛋白)或融合(多肽)。
本发明的化合物或多肽通常可以通过这样的方法制备，所述方法包括将所述一个或多个本发明的氨基酸序列任选地通过一个或多个适当的接头适当地连接到所述一个或多个其它基团、残基、部分或结合单位上的至少一个步骤，以提供本发明的化合物或多肽。本发明的多肽还可以通过这样的方法制备，所述方法通常至少包括下述步骤：提供编码本发明的多肽的核酸，以适当方式表达所述核酸，和回收所表达的本发明的多肽。这样的方法可以以本身已知的方式进行，例如，基于本发明进一步所述的方法和技术，其对于专业技术人员将是清楚的。
由本发明的氨基酸序列起始，设计/选择和/或制备本发明的化合物或多肽的方法在本发明中还称为“格式化”所述的本发明的氨基酸序列；并且组成本发明的化合物或多肽的一部分的本发明的氨基酸被认为是“格式化的”或采用所述的本发明的化合物或多肽的“格式”。基于本发明的公开内容，专业技术人员将清楚本发明的氨基酸序列可以被格式化的方法实例以及所述格式的实例；并且所述格式化的氨基酸序列形成本发明的另一个方面。
在本发明的一个具体方面中，与相对应的本发明的氨基酸序列相比，本发明的化合物或本发明的多肽可以具有增加的半衰期。基于本发明进一步的公开内容，所述化合物和多肽的一些优选而非限制性实例对于专业技术人员将变得清楚，并且例如包括下列各项：已经被化学修饰以增加其半衰期(例如，通过聚乙二醇化方式)的本发明的氨基酸序列或多肽；包括至少一个用于结合血清蛋白(诸如血清白蛋白)的另外的结合位点的本发明的氨基酸序列；或包括至少一个与增加本发明的氨基酸序列的半衰期的至少一个部分(并且特别是至少一个氨基酸序列)连接的本发明的氨基酸序列的本发明的多肽。基于本发明进一步的公开内容，包括所述半衰期延长部分或氨基酸序列的本发明的多肽的实例对于专业技术人员将变得清楚；并且例如，包括，但不限于，这样的多肽，其中所述一个或多个本发明的氨基酸序列适当地连接一个或多个血清蛋白或其片段(诸如(人)血清白蛋白或其适当的片段)或连接一个或多个可以结合血清蛋白的结合单位(诸如，例如，结构域抗体，适合用作结构域抗体的氨基酸序列，单结构域抗体，适合用作单结构域抗体的氨基酸序列，“dAb”’，适合用作dAb的氨基酸序列，或可以结合血清蛋白如血清白蛋白(诸如人血清白蛋白)、血清免疫球蛋白如IgG、或运铁蛋白的纳米抗体；参考进一步的描述和本发明提及的参考文献)；这样的多肽，其中本发明的氨基酸序列连接Fc部分(诸如人Fc)或其适当的部分或片段；或这样的多肽，其中所述一个或多个本发明的氨基酸序列适当连接一个或多个可以结合血清蛋白的小蛋白或肽(诸如，但不限于，记述在WO91/01743，WO01/45746，WO02/076489中的蛋白和肽，以及埃博灵克斯股份有限公司(AblynxN.V.)于2006年12月5日提交的题目为“能够结合血清蛋白的肽”的美国临时申请。
通常，具有增加的半衰期的本发明的化合物或多肽优选地具有是相对应的本发明的氨基酸序列本身的半衰期的至少1.5倍、优选地至少2倍，如至少5倍，例如至少10倍或超过20倍的半衰期。例如，与相对应的本发明的氨基酸序列本身相比，具有增加的半衰期的本发明的化合物或多肽可以具有增加超过1小时，优选超过2小时，更优选超过6小时，诸如超过12小时，或甚至超过24、48或72小时的半衰期。
在本发明的一个优选而非限制性方面中，与相对应的本发明的氨基酸序列本身相比，所述本发明的化合物或多肽具有增加超过1小时，优选超过2小时，更优选超过6小时，诸如超过12小时，或甚至超过24、48或72小时的血清半衰期。
在本发明的另一个优选而非限制性方面中，所述本发明的化合物或多肽在人中表现出至少约12小时、优选至少24小时、更优选至少48小时、甚至更优选至少72小时或更多的血清半衰期。例如，本发明的化合物或多肽可以具有至少5天(诸如约5-10天)、优选至少9天(诸如约9-14天)、更优选至少约10天(诸如约10-15天)、或至少约11天(诸如约11-16天)、更优选至少约12天(诸如约12-18天或更多)、或超过14天(诸如约14-19天)的半衰期。
在另一个方面中，本发明涉及编码本发明的氨基酸序列或本发明的多肽(或其适当的片段)的核酸。这样的核酸在本发明中还称为“本发明的核酸”，并且例如，可以采用基因构建体的形式，如本文进一步所述。
在另一个方面中，本发明涉及表达(或在适当的环境下能够表达)本发明的氨基酸序列和/或本发明的多肽的宿主或宿主细胞，和/或包含本发明的核酸的宿主或宿主细胞。通过本发明进一步的描述，所述宿主或宿主细胞的一些优选而非限制性的实例将变得清楚。
本发明还涉及一种产品或组合物，所述产品或组合物包含或包括至少一种本发明的氨基酸序列、至少一种本发明的多肽(或其适当的片段)和/或至少一种本发明的核酸、以及任选地本身已知的所述组合物的一种或多种其它成分，即，取决于所述组合物的目的用途。例如，这样的产品或组合物可以是药物组合物(如本文所述)、兽医用组合物或用于诊断用途的产品或组合物(同样如本文所述)。通过本文进一步的描述，所述产品或组合物的一些优选而非限制性的实例将变得清楚。
本发明还涉及本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽、或包括其的组合物在体外(例如，在体外或细胞测定法中)或体内(例如，在单细胞或在多细胞生物体中，且特别是在哺乳动物中，且更特别是在人类中，诸如在处于GPCR相关疾病或紊乱的危险中或患有GPCR相关疾病或紊乱的人中)调节GPCR(的方法或组合物)中的应用。
本发明还涉及在体外(例如，在体外或细胞测定法中)或体内(例如，在单细胞或多细胞生物体中，且特别是在哺乳动物中，且更特别是在人类中，诸如在GPCR相关疾病或紊乱的危险中或患有GPCR相关疾病或紊乱的人中)调节GPCR的方法，所述方法至少包括使GPCR与至少一种本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽、或与包括其的组合物以适于调节所述GPCR的成员与本发明的至少一种氨基酸序列、纳米抗体或多肽的方式和量相接触的步骤。
本发明还涉及一种本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽在制备用于在体外(例如，在体外或细胞测定法中)或在体内(例如，在单细胞或多细胞生物体中，且特别是在哺乳动物中，且更特别是在人类中，诸如在处于GPCR相关疾病或紊乱的危险中或患有GPCR相关疾病或紊乱的人中)调节GPCR的组合物(诸如，但不限于如本文进一步所述的药物组合物或制剂)中的应用。
因此，在本发明的上下文中，“调节(modulating)”或“以调节(tomodulate)”通常意指减少或抑制GPCR的活性，或备选地增加其活性，如使用适当的体外、细胞或体内测定(诸如本文提及的那些)测量的。具体地，“调节(modulating)”或“以调节(tomodulate)”可以意指减少或抑制GPCR的活性，或备选地增加其活性，如使用适当的体外、细胞或体内测定(诸如本发明提及的那些)测量的，与在相同条件但不存在本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽的在相同测定中的GPCR的活性相比较，达至少1％，优选至少5％，诸如至少10％或至少25％，例如至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，或90％或更多。
专业技术人员应该清楚，“调节”还可以包括与相同条件但不存在本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽相比较，实现GPCR对其靶标、配体或底物中的一种或多种的亲和力、抗体亲抗原性、特异性和/或选择性的改变(其可以是增加或减少)；和/或实现所述GPCR对于在所述GPCR存在于其中的介质或环境的一种或多种条件(诸如pH、离子强度、辅因子的存在、等等)的敏感性的改变(其可以是增加或减少)。专业技术人员应该清楚，这同样可以以适当的方式和/或使用本身已知的任何适当的测定法来确定，诸如本文或本文引用的现有技术中所述的测定法。
“调节”还可以意指对所述GPCR所涉及的(或其(多个)底物、(多个)配体、或(多个)途径所涉及的，如其信号传导途径或代谢途径以及它们相关的生物学或生理学作用)的一种或多种生物学或生理学机制、作用、反应、功能、途径或活性实现改变(即，分别作为激动剂、作为拮抗剂或作为反向激动剂的活性，这取决于GPCR和所需生物学或生理学作用)。同样，专业技术人员应该清楚，这样的作为激动剂或拮抗剂的作用可以以任何适当方式和/或使用本身已知的任何适当的(体外且通常是细胞或体内测定法)测定法确定，诸如本文或本文引用的现有技术中所述的测定法。特别地，作为激动剂或拮抗剂的作用可以是这样的，以致与在相同条件下但不存在本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽的相同测定法中的生物学或生理学活性相比，分别将目的生物学或生理学活性增加或减少至少1％，优选至少5％，诸如至少10％或至少25％，例如至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，或90％或更多。
例如，调节可以包括变构调节(参见例如George等，NatRevDrugDiscov(药物发现自然评论)1：808-820(2002)；Kenakin，TrendsPharmacolSci(药理学科学趋势)25：186-192(2002)和Rios等，PharmacolTher(药理学治疗)92：71-87(2001))和/或减少或抑制所述GPCR与其底物或配体之一的结合和/或与天然配体、底物竞争与所述GPCR的结合。调节还可以包括激活所述GPCR或所述GPCR参与其中的机制或途径。调节可以是可逆的或不可逆的，但是对于药学和药理学目的，通常应该是以可逆的方式。
本发明还涉及用于制备或产生本文所述的氨基酸序列、多肽、核酸、宿主细胞、产品和组合物的方法。通过本文进一步的描述，所述方法的一些优选而非限制性实例将变得清楚。
一般地，这些方法可以包括下列步骤：
a)提供氨基酸序列的组、集合或文库；和
b)从所述氨基酸序列的组、集合或文库中筛选可以结合和/或具有针对GPCR的亲和性的氨基酸序列；
和
c)分离所述可以结合和/或具有针对GPCR的亲和性的(多个)氨基酸序列。
特别地，在所述方法的步骤b)中，所述组、集合或文库可以筛选能够结合在合适细胞表面上表达的GPCR和/或对其具有亲和力的氨基酸序列；能够结合GPCR的胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他胞外表位(如本文中所述)和/或对其具有亲和力的氨基酸序列；和/或能够结合由或基于GPCR的胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他胞外表位的氨基酸序列获得的肽和/或对其具有亲和力的氨基酸序列。这可以利用本身已知的方法和技术进行，例如本文中提到的那些。
在这样的方法中，所述氨基酸序列的组、集合或文库可以是任何适当的氨基酸序列的组、集合或文库。例如，所述氨基酸序列的组、集合或文库可以是免疫球蛋白序列的组、集合或文库(如本文所述)，诸如免疫球蛋白序列的首次用于实验的组、集合或文库；免疫球蛋白序列的合成的或半合成的组、集合或文库；和/或已经进行了亲和力成熟的免疫球蛋白序列的组、集合或文库。
此外，在这样的方法中，所述氨基酸序列的组、集合或文库可以是重链可变结构域(诸如VH结构域或VHH结构域)或轻链可变结构域的组、集合或文库。例如，所述氨基酸序列的组、集合或文库可以是结构域抗体或单结构域抗体的组、集合或文库，或可以是能够作为结构域抗体或单结构域抗体行使功能的氨基酸序列的组、集合或文库。
在本方法的优选方面中，所述氨基酸序列的组、集合或文库可以是免疫球蛋白序列的免疫组、集合或文库，例如，来自已经用GPCR适当免疫的、或用基于其或来源于其的适当的抗原决定簇(诸如其抗原部分、片段、区域、结构域、环或其它表位)适当免疫的哺乳动物的免疫球蛋白序列的组、集合或文库。在一个特别的方面中，所述抗原决定簇可以是胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他一个或多个胞外表位、或源自其的合适肽。备选地，如本文中提及的，所述氨基酸序列的组、集合或文库可以是免疫球蛋白序列的免疫组、集合或文库，例如，来自已经用重折叠GPCR适当免疫的、或用源于其表面上具有GPCR的细胞的细胞、细胞级分或制剂适当免疫的哺乳动物的免疫球蛋白序列的组、集合或文库。
在上述方法中，所述氨基酸序列的组、集合或文库可以被展示在噬菌体、噬菌粒、核糖体、或适当的微生物(诸如酵母)上，以诸如促进筛选。用于展示和筛选氨基酸序列(的组、集合或文库)的适当的方法、技术和宿主生物体对于本领域专业技术人员将是清楚的，例如，基于本发明进一步的公开内容。同样参考Hoogenboom在自然生物技术(NatureBiotechnology)，23，9，1105-1116(2005)中的综述。
在另一个方面中，用于产生氨基酸序列的方法包括至少下列步骤：
a)提供表达氨基酸序列的细胞的集合或样品；
b)从所述细胞的集合或样品中筛选表达可以结合和/或具有针对GPCR的亲和性的氨基酸序列的细胞；
和
c)(i)分离所述氨基酸序列；或(ii)从所述细胞分离编码所述氨基酸序列的核酸序列，然后表达所述氨基酸序列。
特别地，在所述方法的步骤b)中，所述组、集合或文库可以筛选表达能够结合在合适细胞表面上表达的GPCR和/或对其具有亲和力的氨基酸序列的细胞；表达能够结合GPCR的胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他胞外表位(如本文中所述)和/或对其具有亲和力的氨基酸序列的细胞；和/或表达能够结合由或基于GPCR的胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他胞外表位的氨基酸序列获得的肽和/或对其具有亲和力的氨基酸序列的细胞。这可以利用本身已知的方法和技术进行，例如本文中提到的那些。
例如，当所需要的氨基酸序列是免疫球蛋白序列时，所述细胞的集合或样品可以是，例如，B细胞的集合或样品。此外，在该方法中，细胞样品可以来源于已经用GPCR适当免疫的、或用基于其或来源于其的适当的抗原决定簇(诸如其抗原部分、片段、区域、结构域、环或其它表位)适当免疫的哺乳动物。在一个特别的方面中，所述抗原决定簇可以是胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他一个或多个胞外表位、或源自其的合适肽。备选地，如本文中提及的，细胞的样品可以源自已经用重折叠GPCR适当免疫的、或用源于其表面上具有GPCR的细胞的细胞、细胞级分或制剂适当免疫的哺乳动物。
上述方法可以以任何适当的方式进行，这对于专业技术人员将是清楚的。例如，参考EP0542810，WO05/19824，WO04/051268和WO04/106377。步骤b)的筛选优选地使用流式细胞术技术诸如FACS进行。对于此，例如，参考Lieby等，血液(Blood)，卷97，No.12，3820(2001)。
在另一个方面中，用于产生针对GPCR的氨基酸序列的方法可以包括至少下列步骤：
a)提供编码氨基酸序列的核酸序列的组、集合或文库；
b)从所述核酸序列的组、集合或文库中筛选编码可以结合和/或具有针对GPCR的亲和性的氨基酸序列的核酸序列；
和
c)分离所述核酸序列，然后表达所述氨基酸序列。
特别地，在所述方法的步骤b)中，所述组、集合或文库可以筛选编码能够结合在合适细胞表面上表达的GPCR和/或对其具有亲和力的氨基酸序列的核苷酸序列；编码能够结合GPCR的胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他胞外表位(如本文中所述)和/或对其具有亲和力的氨基酸序列的核苷酸序列；和/或编码能够结合由或基于GPCR的胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他胞外表位的氨基酸序列获得的肽和/或对其具有亲和力的氨基酸序列的核苷酸序列。这可以利用本身已知的方法和技术进行，例如本文中提到的那些。
在这样的方法中，所述编码氨基酸序列的核酸序列的组、集合或文库可以是，例如，编码免疫球蛋白序列的首次用于实验的组、集合或文库的核酸序列的组、集合或文库；编码免疫球蛋白序列的合成的或半合成的组、集合或文库的核酸序列的组、集合或文库；和/或编码已经进行了亲和力成熟的免疫球蛋白序列的组、集合或文库的核酸序列的组、集合或文库。
此外，在这样的方法中，所述核酸序列的组、集合或文库可以编码重链可变结构域(诸如VH结构域或VHH结构域)或轻链可变结构域的组、集合或文库。例如，所述核酸序列的组、集合或文库可以编码结构域抗体或单结构域抗体的组、集合或文库，或能够作为结构域抗体或单结构域抗体行使功能的氨基酸序列的组、集合或文库。
在该方法的优选方面中，所述氨基酸序列的组、集合或文库可以是核酸序列的免疫的组、集合或文库，例如，所述核酸序列来源于已经用GPCR适当免疫的、或用基于其或来源于其的适当的抗原决定簇(诸如其抗原部分、片段、区域、结构域、环或其它表位)适当免疫的哺乳动物。在一个特别的方面中，所述抗原决定簇可以是胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他一个或多个胞外表位、或源自其的合适肽。备选地，如本文中提及的，所述核酸序列的组、集合或文库可以是源自已经用重折叠GPCR适当免疫的、或用源于其表面上具有GPCR的细胞的细胞、细胞级分或制剂适当免疫的哺乳动物的组、集合或文库。
例如，所述核酸序列的组、集合或文库可以编码重链可变结构域或轻链可变结构域的免疫的组、集合或文库。在一个具体的方面中，所述核苷酸序列的组、集合或文库可以编码VHH序列的组、集合或文库。
在上述方法中，所述核苷酸序列的组、集合或文库可以被展示在噬菌体、噬菌粒、核糖体或适当的微生物(诸如酵母)上，以诸如促进筛选。用于展示和筛选编码氨基酸序列的核苷酸序列(的组、集合或文库)的适当的方法、技术和宿主生物体对于本领域专业技术人员将是清楚的，例如，基于本发明进一步的公开内容。同样参考Hoogenboom在自然生物技术(NatureBiotechnology)，23，9，1105-1116(2005)中的综述。
本发明还涉及通过上述方法或备选地通过包括上述方法之一以及至少下列步骤的方法而获得的氨基酸序列，所述步骤为：确定所述免疫球蛋白序列的核苷酸序列或氨基酸序列；并且以本身已知的方式表达或合成所述氨基酸序列，诸如通过在适当的宿主细胞或宿主生物体内表达，或通过化学合成。
此外，在上述步骤后，一个或多个本发明的氨基酸序列可以适当地被人源化(或备选地，被骆驼源化)；和/或可以将这样获得的氨基酸序列彼此连接，或连接一个或多个其它适当的氨基酸序列(任选地，通过一个或多个适当的接头)，以提供本发明的多肽。此外，编码本发明的氨基酸序列的核酸序列可以被适当地人源化(或备选地，被骆驼源化)并且适当地表达；和/或编码本发明的氨基酸序列的一个或多个核酸序列可以彼此连接，或连接编码其它适当的氨基酸序列的一个或多个核酸序列(任选地通过编码一个或多个适当的接头的核苷酸序列)，然后，这样获得的核苷酸序列可以进行适当地表达，以提供本发明的多肽。
本发明还涉及本文所述的氨基酸序列、多肽、核酸、宿主细胞、产品和组合物的应用和用途，以及涉及用于预防和/或治疗与GPCR相关的疾病和紊乱的方法。通过本发明进一步的描述，一些优选的但非限制性的应用和用途将变得清楚。例如，如本文中提及的，预期本发明的针对嗅觉GPCR的氨基酸序列、纳米抗体和多肽可以存在作为人造调味料或甚至香料的用途。本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽还可以存在作为例如在体外(例如使用Western印迹、免疫沉淀法或免疫荧光技术)或在体内(例如使用合适的成像技术)检测表达它们针对的GPCR的细胞的标记物的用途。本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽还在关于它们所针对的GPCR(表达其的细胞)的亲和纯化技术中存在用途。
通过本发明进一步的描述，本发明的其它方面、实施方案、优点和应用也将变得清楚，其中本发明将更详细地描述和讨论本发明的纳米抗体以及包括其的本发明的多肽，其形成本发明的一些优选方面。
如通过本发明进一步的描述将变得清楚，与“dAb”或相似的(单)结构域抗体或免疫球蛋白序列相比，纳米抗体通常提供某些优点(本发明所述的)，本发明的纳米抗体也提供所述优点。然而，专业技术人员应该清楚，下述教导的更通用的方面也可以适用于(直接或类似地)本发明的其它氨基酸序列。
附图：
图1：选择步骤的图示。
图2.来自噬菌体ELISA的结果(如实施例1.5中所述)。其显示与非表达膜(-)相比，238C1，238D2，238F3针对CXCR4表达膜具有高特异性。
图3.关于结合CXCR4的纳米抗体克隆的第一次和第二次筛选。[125I]-CXCL12竞争结合实验直接使用来自瞬间表达CXCR4的HEK293T细胞的细胞膜上的周质级分(1∶10)来进行。全部第一次命中(hits)(A)在第二筛选(B)中验证。进行使用AMD3100(3μM)或载体(-)的对照实验，分别显示完全和无替代。
图4：单价纳米抗体和参考配体对CXCR4的竞争结合。A-C)在来自瞬间表达CXCR4的HEK293T细胞的细胞膜上进行使用[125I]-CXCL12，[125I]-238D2或[125I]-238D4作为放射性配体的竞争结合实验。进行使用AMD3100(3μM；AMD)，CXCL12(30nM；XL12)或载体(-)的对照替代实验。数据显示为平均值±S.E.M.(n＝2-6)。D)在来自瞬间表达CXCR4或CXCR3的HEK293T细胞的细胞膜上进行使用[125I]-238D2或[125I]-238D4作为放射性配体的总结合(载体；-)和竞争结合实验(3μMAMD3100；AMD)。数据显示为平均值±S.E.M.(n＝3)。
图5：单价抗体238D2和238D4是有效的CXCR4拮抗剂。A)肌醇磷酸(IP)累积实验在瞬间表达CXCR4和Gαqi5的HEK293T细胞中进行。激动实验(左图)显示无关于238D2和238D4的固有活性。拮抗实验(右图)在用238D2或238D4预温育1h后，在存在CXCL12(30nM)的条件下进行。进行使用载体(-)或AMD3100(3μM；AMD)的对照实验。数据显示为平均值±S.E.M.(n＝4)。B)报道基因实验在用pCRE/β-半乳糖苷酶和编码的CXCR4质粒瞬间转染的HEK293T细胞中进行。没有观察到关于238D2和238D4的激动剂活性。数据显示为平均值±S.E.M.(n＝3)。显示CXCL12-诱导的报道基因活化的竞争性拮抗的实验通过在存在渐增浓度的238D2或238D4的条件下建立CXCL12的浓度应答曲线(右图)。嵌入Schild回归分析图。数据显示为平均值±S.E.M.(n＝4-6)。C)使用ChemoTxTM平板的趋化实验使用内源性表达CXCR4的Jurkat细胞进行。激动实验(左图)显示Jurkat细胞由上隔室朝向CXCL12而非朝向趋化平板的下隔室中的238D2和238D4移动。显示抑制朝向CXCL12(0.3nM)移动的实验在这两个隔室中，在存在238D2或238D4的条件下进行。进行使用AMD3100(3μM；AMD)的对照实验。数据显示为平均值±S.E.M.(n＝4)。
图6：对单克隆测序并基于其相似性分组，以形成家族(多于2种序列)。在同一泳道上的克隆100％相同。U＝彼此不相关的独特序列。
图7：单价纳米抗体238D2和238D4不担当针对趋化因子CCR5，CCR7，CXCR1，CXCR2，CXCR3，CXCR6，β2肾上腺素受体和组胺H4受体的激动剂或拮抗剂。灵敏性筛选使用两种浓度的238D2和238D4，在存在EC50-EC80的激动剂和在缺乏(为了研究β2肾上腺素受体)或存在福司柯林(forskolin)(3μM；为了研究全部其他受体)的条件下，针对用编码提到的受体(或模拟以研究内源性表达的β2肾上腺素受体)的cDNA瞬间转染的HEK293T细胞，利用CRE/β-半乳糖苷酶报道基因测定进行。数据显示为平均值±S.E.M.(n＝2-3)。
图8：二价纳米抗体与它们的单价对应体相比，显示增加的亲和力和抑制力。A)使用[125I]-CXCL12的竞争结合实验针对来自瞬间表达CXCR4的HEK293T细胞的细胞膜进行。进行使用AMD3100(3μM；AMD)，CXCL12(30nM；XL12)或载体(-)的对照替代实验。数据显示为平均值±S.E.M.(n＝2-6)。B)使用ChemoTxTM平板的趋化实验使用内源性表达CXCR4的Jurkat细胞进行。显示抑制朝向下隔室中CXCL12(0.3nM)移动的实验在这两个隔室中，在存在纳米抗体的条件下进行。进行使用AMD3100(3μM；AMD)的对照实验。数据显示为平均值±S.E.M.(n＝3-4)。
图9：二价纳米抗体抑制CXCR4介导的信号传导。在用CXCR4和嵌合Gαqi5蛋白转染的细胞中，CXCL12-诱导的肌醇磷酸累积受到单价和二价纳米抗体的抑制。二价纳米抗体表现更有效的抑制。
图10：238D2和238D4替代组成型活性CXCR4突变体N119A的[125I]-CXCL12。进行使用CXCL12和普乐沙福的对照实验(n＝3)。
图11：在组成型活性CXCR4突变体N119A条件下，纳米抗体238D4，L3和L8是反向拮抗剂，而238D2表现为中性拮抗剂。A)由纳米抗体和参考配体引起的基础肌醇磷酸累积的配体-介导变化(n＝3-5)。B-D)238D4，L3和L8的反向拮抗作用受中性拮抗剂普乐沙福(AMD3100)的抑制(n＝2)。
发明详述
G蛋白偶联受体(GPCRs)，也称为7次跨膜受体、7TM受体、7螺旋受体、和G蛋白连接受体(GPLR)，是将胞外信号(配体结合)转导为胞内信号(G蛋白活化)的跨膜受体的蛋白家族。GPCR是具有7个膜跨越结构域或跨膜螺旋的整合膜蛋白。该受体的胞外部分可以是糖基化的。这些胞外环还包含两个高度保守的半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基构建二硫键，以稳定受体结构。
GPCR形成最大且最多样的参与信号转导的跨膜蛋白组(Howard等，TrendsPharmacol.Sci.(药理学科学趋势)22：132-40，2001)。GPCR参与多种细胞和生物学功能，诸如刺激-反应途径(从胞间通讯到生理学意义)，包括，例如，胚胎发生、神经递质释放、神经感受(例如，15种化学感受功能诸如味觉和嗅觉)(Mombaerts，Science(科学)286：707-711，1999)、神经轴突寻径(pathfinding)(Mombaerts等，Cell(细胞)87：675，1996；Mombaerts等，ColdSpringHarborSymp.Quant.Biol.(冷泉港定量生物学专题论文集)56：135，1996)、靶向炎性部位的白细胞(Tager等，J.Exp.Med.(实验医学杂志)，192：439-46，2000)、和细胞存活、增殖、和分化(Ryan等，J.BiolChem.(生物化学杂志)273：13613-24，1998)。
GPCR组库的复杂性超越在多至2,000个，或多于人基因组1.5％时评估的与GPCR超家族成员组合的免疫球蛋白和T细胞受体基因的复杂性。此外，GPCR超家族成员是多于50％的临床上用于人的现代药物的直接或间接靶标。
功能的多样性与广泛范围的由家族成员识别的配体来匹配，从光子(视紫红质，原型GPCR)到小分子(在组胺受体的情形中)到蛋白质(例如，趋化因子受体)。对于人GPCR家族和人GPCR的配体的综述，参考美国申请2002/0106739中的图1。
GPCR可以基于结构同源性和功能相似性，分为4类：A类(视紫红质-样)，B类(分泌素-样)，C类(代谢型/信息素)，和D类(真菌信息素)，其中A类受体、B类受体、和具有实质上不存在的羧基末端尾部的受体形成主要类型。GPCR可以基于它们与HEK-293细胞中的大鼠8-抑制蛋白-2的相互作用的亲和力相应地分类，并且可以基于它们羧基末端尾部中的氨基酸残基和它们羧基末端尾部的长度来预测。B类受体是具有适当地位于其羧基末端尾部中的一个或多个磷酸化位点(例如，磷酸化位点集簇)的GPCR，从而使其在如美国专利号5,891,646，Oakley，等，JournalofBiologicalChemistry(生物化学杂志)，第275卷，第22号，第17201-17210页，2000年6月2日，和Oakley等，JournalofBiologicalChemistry(生物化学杂志)，第276卷，第22号，第19452-19460页，2001中所述的条件下，在HEK-293细胞中将大鼠8-抑制蛋白-2募集到内体中。A类受体是不具有适当地位于其羧基末端尾部中的一个或多个磷酸化位点(例如，磷酸化位点集簇)的GPCR，从而使其在上述关于B类受体所述的条件下，在HEK-293细胞中不将大鼠p-抑制蛋白-2募集到内体中。具有实质上不存在的羧基末端尾部的受体包括，例如，嗅觉和味觉受体。
GPCR的生物学和生理学作用的一些实例包括：
-视觉：视蛋白使用光致异构化反应来将电磁辐射翻译为细胞信号。为了该目的，视紫红质，例如，使用11-顺式-视黄醛到全反视黄醛的转化。
-嗅觉：嗅上皮的受体结合气味物质(嗅觉受体)和信息素(犁鼻受体)。
-动作和情绪调节：哺乳动物脑中的受体结合若干不同的神经递质，包括5-羟色胺、多巴胺、GABA和谷氨酸。
-免疫系统活性和炎症调节：趋化因子受体结合介导免疫系统细胞之间的胞间通讯的配体；受体诸如组胺受体结合炎性介质并接合炎性反应中的靶细胞类型。
-自主神经系统传递：交感和副交感神经系统均受到GPCR途径的调节。这些系统负责控制身体的许多自主功能诸如血压、心率和消化过程。
一般地，关于GPCR参考标准手册，诸如G蛋白偶联受体手册(GProteinCoupledReceptrosHandbook)，L.Devi(编辑)，HumanaPress，2005，以及可用的数据库，诸如GPCRDB(参见例如http://www.gpcr.org/7tm/htmls/entries.html)。
因此，一般地，用于本文中时，术语″G蛋白偶联受体″(或″GPCR″)指这样的受体，即当通过细胞表达时，其与G蛋白(例如，由cc，P和y亚基组成并水解GTP的蛋白)缔合。优选地，GPCR是″7个跨膜片段受体″(或″7TMS受体″)，其指在结构上包括7个疏水性跨膜区的蛋白。
GPCR的一些非限制性实例包括，但不仅限于：
-作为目前市售或临床开发药物(小分子或生物制剂)的已知靶标的GPCR(例如，本文中提到的那些)；
-黄体生成素释放激素(LHRH)(也称为促性腺激素释放激素，GnRH)受体，MI毒蕈碱性受体和D2-肾上腺素能受体；
-阿片样物质受体、内皮缩血管肽受体、血管紧张素受体、神经肽Y受体和5-羟色胺K受体；
-与Gq/1IG蛋白偶联(即缔合)的GPCR，诸如LHRH(＝GnRH)，乙酰胆碱(ml，3和5亚型)，MI毒蕈碱性，腺苷1，CC-肾上腺素能(alA，alB和aIC亚型)，血管紧张素(ATIA亚型)，铃蟾肽(BBI和B132亚型)，缓激肽(132亚型)，C5a，缩胆囊肽(cholycystokinin)(CCKa和CCKb亚型)，内皮缩血管肽(Eta和Etb亚型)，谷氨酸(mGlul，5亚型)，5HT(2A，B和C亚型)，组胺(HI亚型)，神经降压肽，神经激肽(NK2，3亚型)，催产素，促甲状腺素释放激素(TRIJ)，促甲状腺激素(TSH)，血栓烷(thromoboxane)A2和血管升压素(VIa亚型)；
-与GsG-蛋白偶联的GPCR，诸如以下受体：P2-肾上腺素能，心脏P-肾上腺素能，组胺(H2亚型)，促甲状腺素，生长激素释放因子，促肾上腺皮质激素(ACTH)，5HT4，促卵泡激素(FSH)，促甲状腺激素(TSH)，GLP-1，胰高血糖素，多巴胺5(D5)，doparninel(DI)，降钙素，腺苷2p(A2p)，血管升压素2，血管活性肠肽和甲状旁腺激素；
-与GiG-蛋白偶联的GPCR，诸如以下受体：5HT(IA，IB，ID和IF亚型)，m谷氨酰胺R(2，3亚型)，多巴胺4(D4)，多巴胺-2(D2)大麻素，腺苷3(A3)，促生长素抑制素(4，3亚型)，t-阿片样物质，6-阿片样物质，K-阿片样物质，神经肽Y(1，2亚型)；
-US2002/0106739中提到的GPCR；
-Lundstrom等，J.Struct.Funct.Genomics(结构功能基因组学杂志)，2006年11月22日；[出版前电子公开]的表1中列出的GPCR；
-称为″孤儿″受体的GPCR，即结构上类似其他GPCR但是尚未知其天然配体的GPCR；
-表C中提到的GPCR；
-表D中提到的GPCR。
其他GPCR对于专业技术人员应该是清楚地，例如来自标准手册，诸如G蛋白偶联受体手册(GProteinCoupledReceptrosHandbook)，L.Devi(编辑)，HumanaPress，2005，以及来自标准数据库，诸如GPCRDB(参见例如http://www.gpcr.org/7tm/htmls/entries.html)。
在本发明说明书、实施例和方面中：
a)除非另外指明或限定，所用的所有术语具有它们在本领域内的通用意思，其对于专业技术人员应该是清楚的。例如，参考标准手册，如Sambrook等，″分子克隆：实验室手册(MolecularCloning：ALaboratoryManual)″(第2版)，卷1-3，冷泉港实验室出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress)(1989)；F.Ausubel等，编，″现代分子生物学方法(Currentprotocolsinmolecularbiology)″，GreenPublishing和WileyInterscience，纽约(1987)；Lewin，“基因II(GenesII)”，JohnWiley&Sons，纽约，纽约，(1985)；Old等，“基因操作原理：基因工程导言(PrinciplesofGeneManipulation：AnIntroductiontoGeneticEngineering)”，第2版，加利福尼亚大学出版社(UniversityofCaliforniaPress)，伯克利，CA(1981)；Roitt等，“免疫学(Immunology)”(第6版)，Mosby/Elsevier，Edinburgh(2001)；Roitt等，Roitt基础免疫学(Roitt’sEssentialImmunology)，第10版.BlackwellPublishing，英国(2001)；和Janeway等，“免疫生物学(Immunobiology)”(第6版)，GarlandSciencePublishing/ChurchillLivingstone，纽约(2005)，以及本发明所引用的公知背景技术；
b)GPCR受体分子以活性和失活生物物理状态之间的构象平衡存在。配体与受体的结合可以使该平衡朝向活性受体状态偏移。存在四种类型的配体：激动剂是使该平衡向着有利于活性状态偏移的配体；反向激动剂或拮抗剂是使该平衡向着有利于失活状态偏移的配体；和中性拮抗剂是不影响该平衡的配体。用于本文中时，“拮抗剂”是这样的配体，其在与激动剂相同的位点处竞争结合受体，但不活化由受体的活性形式启动的胞内反应，并且由此与在存在激动剂且不存在拮抗剂条件下的胞内反应相比，抑制由激动剂诱导的胞内反应至少10％，优选15-25％，更优选25-50％和最优选，50-100％。用于本文中时，“激动剂”指这样的配体，其在与GDP结合时活化胞内反应。根据本发明的激动剂可以增加由受体介导的胞内反应为，与不存在激动剂条件下的胞内反应相比，至少2倍，优选5倍，更优选10倍和最优选100倍以上(即，150倍，200倍，250倍，500倍，1000倍，10,000倍等)。用于本文中时，“反向激动剂”指在其结合受体但不与激动剂相同位点处的受体竞争结合时降低细胞表面受体组成型活性的配体。根据本发明的反向激动剂可以降低由受体介导的胞内反应为，与不存在反向激动剂条件下的胞内反应相比，至少2倍，优选5倍，更优选10倍和最优选100倍以上(即，150倍，200倍，250倍，500倍，1000倍，10,000倍等)。用于本文中时，“反向拮抗剂”指在其结合受体并与激动剂相同位点处的受体竞争结合时降低细胞表面受体组成型活性的配体。根据本发明的反向激动剂可以降低由受体介导的胞内反应为，与不存在反向拮抗剂条件下的胞内反应相比，至少2倍，优选5倍，更优选10倍和最优选100倍以上(即，150倍，200倍，250倍，500倍，1000倍，10,000倍等)。除非另外指明，所有没有具体详细描述的方法、步骤、技术和操作可以以本身已知的方式进行并且已经进行，这对于专业技术人员是清楚的。例如，仍旧参考标准手册，参考本发明所提及的公知背景技术，和参考其中所引用的其它参考文献；以及例如下列的综述：Presta，先进药物递送评论(Adv.DrugDeliv.Rev.)2006，58(5-6)：640-56；Levin和Weiss，分子生物系统(Mol.Biosyst.)2006，2(1)：49-57；Irving等，免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)，2001，248(1-2)，31-45；Schmitz等，胎盘(Placenta)，2000，21增刊A，S106-12，Gonzales等，肿瘤生物学(TumourBiol.)，2005，26(1)，31-43，它们描述了蛋白工程的技术，诸如亲和力成熟和其他用于改善蛋白诸如免疫球蛋白的特异性和其他所需特性的技术
c)氨基酸残基按照标准的三字母或一字母的氨基酸密码显示，如在表A-2提及的；
表A-2：一字母和三字母氨基酸密码
d)出于比较两种或更多种核苷酸序列的目的，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列之间的“序列同一性”百分数可以通过用[第一核苷酸序列中与第二核苷酸序列中相应位置的核苷酸相同的核苷酸数目]除以【第一核苷酸序列中的核苷酸总数]并且乘以[100％]而计算，其中在第二核苷酸序列中核苷酸的每一删除、插入、取代或添加——与第一核苷酸序列相比——都视作在单一核苷酸(位置)的差异。
备选地，两种或更多种核苷酸序列之间的序列同一性程度可以使用已知的用于序列比对的使用标准设置的计算机算法进行计算，诸如NCBI胚细胞v2.0。
例如，在WO04/037999，EP0967284，EP1085089，WO00/55318，WO00/78972，WO98/49185和GB2357768-A中描述了用于确定序列同一性程度的一些其它的技术、计算机算法和设置。
通常，出于按照上文列出的计算方法来确定两种核苷酸序列之间的“序列同一性”的百分数的目的，将具有最大核苷酸数目的核苷酸序列视作“第一”核苷酸序列，并且将另一种核苷酸序列视作“第二”核苷酸序列；
e)出于比较两种或更多种氨基酸序列的目的，第一氨基酸序列和第二氨基酸序列之间的“序列同一性”百分数(在本文也称为“氨基酸同一性”)可以通过用[第一氨基酸序列中与第二氨基酸序列中相应位置的氨基酸残基相同的氨基酸残基数目]除以[第一氨基酸序列中的氨基酸残基总数]并且乘以[100％]而计算，其中第二氨基酸序列中氨基酸残基的每一删除、插入、取代或添加——与第一氨基酸序列相比——都视作在单一氨基酸残基(位置)上的差异，即，视作本发明所定义的“氨基酸差异”。
备选地，两种氨基酸序列之间的序列同一性程度可以使用已知的计算机算法进行计算，诸如上文提及的用于确定核苷酸序列的序列同一性程度的那些，其仍旧使用标准设置。
通常，出于按照上文列出的计算方法来确定两种氨基酸序列之间的“序列同一性”的百分数的目的，将具有最大氨基酸残基数目的氨基酸序列视作“第一”氨基酸序列，并且将另一种氨基酸序列视作“第二”氨基酸序列。
此外，在确定两种氨基酸序列之间的序列同一性程度时，专业技术人员可以考虑所谓的“保守”氨基酸置换，其通常可以描述为这样的氨基酸置换，即，其中氨基酸残基被具有相似化学结构的另一种氨基酸残基取代，并且其对所述多肽的功能、活性或其它生物学特性几乎没有或者基本上没有影响。这种保守氨基酸置换是本领域内公知的，例如，从WO04/037999，GB-A-3357768，WO98/49185，WO00/46383和WO01/09300中可知；并且可以基于WO04/037999以及WO98/49185和其中所引用的其它参考文献的相关教导而选择这种取代的(优选)类型和/或结合。
所述保守取代优选地是这样的取代，即，其中下列组(a)-(e)内的一个氨基酸被同组内的另一氨基酸残基取代：(a)小的脂肪族、非极性或弱极性的残基：Ala，Ser，Thr，Pro和Gly；(b)极性、带负电荷的残基及其(不带电荷的)酰胺：Asp，Asn，Glu和Gln；(c)极性、带正电荷的残基：His，Arg和Lys；(d)大的脂肪族、非极性残基：Met，Leu，Ile，Val和Cys；以及(e)芳族残基：Phe，Tyr和Trp。
特别优选的保守取代如下：Ala取代成Gly或取代成Ser；Arg取代成Lys；Asn取代成Gln或取代成His；Asp取代成Glu；Cys取代成Ser；Gln取代成Asn；Glu取代成Asp；Gly取代成Ala或取代成Pro；His取代成Asn或取代成Gln；Ile取代成Leu或取代成Val；Leu取代成Ile或取代成Val；Lys取代成Arg，取代成Gln或取代成Glu；Met取代成Leu，取代成Tyr或取代成Ile；Phe取代成Met，取代成Leu或取代成Tyr；Ser取代成Thr；Thr取代成Ser；Trp取代成Tyr；Tyr取代成Trp；和/或Phe取代成Val，取代成Ile或取代成Leu。
适用于本文所述的多肽的任何氨基酸置换还可以基于Schulz等，蛋白质结构原理(PrinciplesofProteinStructure)，Springer-Verlag，1978研究的不同物种的同源蛋白之间的氨基酸变异频率的分析，基于Chou和Fasman，生物化学(Biochemistry)13：211，1974和高级酶学(Adv.Enzymol.)，47：45-149，1978研究的结构形成潜力的分析，和基于Eisenberg等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.AcadSci.USA)81：140-144，1984；Kyte和Doolittle；分子生物学杂志(JMolec.Biol.).157：105-132，1981，以及Goldman等，物理化学综述年刊(Ann.Rev.Biophys.Chem.).15：321-353，1986研究的蛋白中疏水模式的分析，所有这些通过引用完全结合于此。在本文描述和上文引用的公知背景技术中给出关于纳米抗体的一级、二级和三级结构的信息。此外，出于这一目的，例如，Desmyter等，自然结构生物学(NatureStructuralBiology)，卷3，9，803(1996)；Spinelli等，自然结构生物学(NaturalStructuralBiology)(1996)；3，752-757；和Decanniere等，结构(Structure)，卷7，4，361(1999)给出来自美洲驼(llama)的VHH结构域的晶体结构。关于在常规VH结构域中形成VH/VL界面的一些氨基酸残基和在这些位置的潜在的骆驼源化(camelizing)取代的其它信息可以在上文引用的现有技术中找到。
f)如果在它们的全长有100％的序列同一性(如本发明所定义)，那么认为氨基酸序列和核酸序列“完全相同”。
g)当比较两种氨基酸序列时，术语“氨基酸差异”是指与第二序列相比，在第一序列位置上的单个氨基酸残基的插入、删除或取代；应该理解两种氨基酸序列可以包含1个、2个或多个这样的氨基酸差异。
h)当认为核苷酸序列或氨基酸序列分别“包括”另一个核苷酸序列或氨基酸序列，或“基本由”另一个核苷酸序列或氨基酸序列“组成”时，这可以意指后一个核苷酸序列或氨基酸序列已经分别结合在最先提及的核苷酸序列或氨基酸序列中，但是更通常地，这一般意指最先提及的核苷酸序列或氨基酸序列在其序列内分别包括核苷酸或氨基酸残基的序列，其分别与后一个序列具有相同的核苷酸序列或氨基酸序列，而不管实际上已经怎样产生或获得最先提及的序列(例如，其可以通过本发明所述的任何适当的方法进行)。通过非限制性实例的方式，当认为本发明的纳米抗体包括CDR序列时，这可以意指所述CDR序列已经结合在本发明的纳米抗体内，但是更通常地，这一般意指本发明的纳米抗体在其序列内包含具有与所述CDR序列相同的氨基酸序列的氨基酸残基序列，而不管已经怎样产生或获得所述本发明的纳米抗体。还应该注意到，当后一个氨基酸序列具有特异性生物学或结构功能时，它优选地具有在最先提及的氨基酸序列中基本相同、相似或等价的生物学或结构功能(换言之，最先提及的氨基酸序列优选是这样的，以致后一个序列能够实施基本上相同的、相似的或等价的生物学或结构功能)。例如，当认为本发明的纳米抗体分别包括CDR序列或构架序列时，在所述纳米抗体中的所述CDR序列和构架优选地分别能够作为CDR序列或构架序列行使作用。此外，当认为核苷酸序列包括另一个核苷酸序列时，最先提及的核苷酸序列优选是这样的，以致当它被表达成表达产物(例如，多肽)时，由后一个核苷酸序列编码的氨基酸序列形成所述表达产物的一部分(换言之，后一个核苷酸序列处在与所述最先提及的、较大的核苷酸序列相同的阅读框内)。
i)核酸序列或氨基酸序列视作“(以)基本上分离的(形式)”——例如，与其天然生物来源和/或其从中获得的反应介质或培养介质相比——此时其已经与其通常在所述来源或介质中与之缔合的至少一种其它成分(诸如另一种核酸，另一种蛋白/多肽，另一种生物成分或高分子或至少一种污染物、杂质或微量组分)分离。特别地，当它已被纯化至少2倍，特别是至少10倍，更特别地至少100倍，并且达到1000倍或更多时，认为核酸序列或氨基酸序列“基本上分离”。当使用适当技术确定时，诸如适当的层析技术，诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，“以基本上分离形式”的核酸序列或氨基酸序列优选地基本上是均相的；
j)当用于本文时，术语“结构域”通常是指氨基酸序列(诸如抗体链，并且特别是指重链抗体的球状区域)的球状区域，或者指基本上由所述球状区域组成的多肽。通常，例如，这样的结构域包括作为片层或通过二硫键而稳定的肽环(例如3或4个肽环)。术语“结合结构域”是指针对抗原决定簇(如本文所定义)的结构域；
k)术语‘抗原决定簇’是指抗原上由抗原-结合分子(诸如本发明的纳米抗体或多肽)并且更特别是所述分子的抗原-结合位点而识别的表位。术语“抗原决定簇”和“表位”在本文中还可以互换地使用；
l)对于特定的抗原决定簇、表位、抗原或蛋白(或对于至少其的一部分、片段或表位)可以(特异性)结合、具有亲和性和/或具有特异性的氨基酸序列(诸如本发明的纳米抗体、抗体、多肽，或通常为抗原结合蛋白或多肽或其片段)认为是“针对(against)”或者“针对(directedagainst)”所述抗原决定簇、表位、抗原或蛋白。
m)术语“特异性”是指特定的抗原-结合分子或抗原-结合蛋白(诸如本发明的纳米抗体或多肽)分子可以结合的不同类型的抗原或抗原决定簇的数目。一种抗原-结合蛋白的特异性可以依据亲和力和/或抗体亲抗原性(avidity)而确定。亲和力，表示为抗原与抗原-结合蛋白的解离平衡常数(KD)，是抗原决定簇和所述抗原-结合蛋白上抗原-结合位点之间的结合强度的测量：KD值越小，抗原决定簇和抗原-结合分子之间的结合强度越强(备选地，亲和力还可以表示为亲和常数(KA)，其为1/KD)。专业技术人员应该清楚(例如，基于本发明进一步的公开内容)，亲和力可以以本身已知的方式确定，其取决于目的特异性抗原。抗体亲抗原性是抗原-结合分子(诸如本发明的纳米抗体或多肽)和相关抗原之间的结合强度的测量。抗体亲抗原性与抗原决定簇及其在抗原-结合分子上的抗原结合位点之间的亲和力以及在所述抗原-结合分子上存在的相关结合位点的数目相关。典型地，抗原-结合蛋白(诸如本发明的氨基酸序列、纳米抗体和/或多肽)将以10-5-10-12摩尔/升(M)或更小、并且优选地10-7-10-12摩尔/升(M)或更小并且更优选地10-8-10-12摩尔/升的解离常数(KD)(即，以105-1012升/摩尔或更大、并且优选地107-1012升/摩尔或更大、且更优选地108-1012升/摩尔的缔合常数(KA))而结合它们的抗原。任何大于104摩尔/升的KD值(或任何小于104M-1的KA值)升/摩尔通常认为指示非特异性结合。优选地，本发明的单价免疫球蛋白序列将以小于500nM、优选地小于200nM、更优选地小于10nM诸如小于500pM的亲和力与理想的抗原结合。抗原-结合蛋白与抗原或抗原决定簇的特异性结合可以以本身已知的任何适当的方法确定，其包括，例如，斯卡查德分析和/或竞争结合检测，诸如放射性免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)和夹心式(sandwich)竞争测定，和本领域本身已知的其不同的变化；以及本发明提及的其它技术。
解离常数可以是实际的或表观解离常数，专业技术人员应该清楚。确定解离常数的方法对于专业技术人员应该是清楚的，并且例如，包括本发明提及的技术。在这一点上，还应该清楚，不可能测量大于10-4摩尔/升或10-3摩尔/升(例如，10-2摩尔/升)的解离常数。任选地，专业技术人员应该清楚，可以根据(实际或表观)缔合常数(KA)利用[KD＝1/KA]的关系计算所述(实际或表观)解离常数。
亲和力表示分子相互作用的强度或稳定性。亲和力通常作为KD或解离常数给出，其具有摩尔/升(或M)的单位。亲和力还可以表示为缔合常数KA，其等于1/KD，并且具有(摩尔/升)-1(或M-1)的单位。在本说明书中，两个分子(诸如本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽及其目的靶标)之间的相互作用的稳定性将主要以它们相互作用的KD值表示；专业技术人员应该清楚，考虑到KA＝1/KD的关系，通过其KD值表示分子相互作用的强度也可以用于计算相对应的KA值。由于KD-值通过公知的关系式DG＝RT.ln(KD)(等价于DG＝-RT.ln(KA))与结合的自由能(DG)相关，KD-值还在热力学意义上表征分子相互作用的强度，在所述关系式中，R等于气体常数，T等于绝对温度，并且ln表示自然对数。
关于认为是有意义的(例如，特异性的)生物学相互作用的KD典型地在10-10M(0.1nM)-10-5M(10000nM)范围内。相互作用越强，其KD越低。
KD也可以表示为复合体的解离速率常数(表示为koff)与其缔合速率(表示为kon)的比例(以致KD＝koff/kon和KA＝kon/koff)。解离速率koff具有单位s-1(其中s是秒的SI单位符号)。缔合速率kon具有单位M-1s-1。缔合速率可以在102M-1s-1-约107M-1s-1之间变化，对于两分子相互作用达到扩散-极限缔合速率常数。解离速率以关系式t1/2＝ln(2)/koff与给定的分子相互作用的半衰期相关。解离速率可以在10-6s-1(接近具有数天的t1/2的不可逆复合体)到1s-1(t1/2＝0.69s)之间变化。
两个分子之间的分子相互作用的亲和力可以通过本身已知的不同技术测量，诸如公知的表面等离子体共振(SPR)生物传感器技术(例如，参见Ober等，国际免疫学(Intern.Immunology)，13，1551-1559，2001)，其中将一个分子固定在生物传感器芯片上，另一个分子在流动条件下经过所固定的分子，产生kon，koff测量以及因此产生KD(或KA)值。例如，这可以使用公知的BIACORE仪器进行。
专业技术人员还应该理解，如果测量过程以某种方式影响暗指的分子的内在结合亲和力，例如通过与一个分子的生物传感器上的涂层相关的人为产物影响，则测量的KD可以与表观KD相对应。此外，如果一个分子含有针对另一个分子的多于一个的识别位点，则可以测量表观KD。在这样的情形中，所测量的亲和力可以受到两个分子之间相互作用的抗体亲抗原性的影响。
可以用来评估亲和力的另一个方法是Friguet等(免疫方法杂志(J.Immunol.Methods)，77，305-19，1985)的2步ELISA(酶联免疫吸附测定)方法。该方法建立溶液相结合平衡测量，并且避免与在支持物如塑料上的一个分子的吸附相关的可能的人为产物。
然而，KD的准确测量可能是非常费力的，并且作为结果，通常确定表观KD值来评估两个分子的结合强度。应该注意到，只要所有的测量以一致的方式(例如，保持测定条件不变)进行，表观KD测量可以用作真实KD的近似值，并且因此在现有文献中，应该以同等的重要性或相关性对待KD和表观KD。
最后，应该注意到，在许多情形中，有经验的科学家可以判断相对于一些参照分子确定结合亲和力是便利的。例如，为了评估分子A和B之间的结合强度，例如，人们可以使用已知与B结合且适合用荧光团或生色团或其它化学部分标记的参照分子C，诸如在ELISA或FACS(荧光活化的细胞分选)中容易检测的生物素、或其它形式(用于荧光检测的荧光团，用于光吸收检测的生色团，用于链霉抗生物素蛋白-介导的ELISA检测的生物素)。典型地，参照分子C保持在固定的浓度，并且A的浓度关于B的给定的浓度或量变化。结果，对应于A的浓度获得IC50值，在其中将在不存在A的条件下关于C所测量的信号二等分。假定已知参照分子的KD，即KDref，以及参照分子的总浓度cref，则可以通过下式获得关于A-B相互作用的表观KD：KD＝IC50/(1+cref/KDref)。注意，如果cref＜＜KDref，则KD≈IC50。假定以一致的方式(例如，保持cref不变)针对比较的结合剂进行IC50测量，则分子相互作用的强度或稳定性可以通过IC50进行评估，并且在本发明的整个内容中，认为该测量等价于KD或等价于表观KD。
n)本发明的氨基酸序列、化合物或多肽的半衰期通常可以定义为所述氨基酸序列、化合物或多肽的血清浓度在体内减少50％所花费的时间，例如，由于所述序列或化合物的降解和/或通过天然机制对所述序列或化合物的清除或螯合(sequestration)。本发明的氨基酸序列、化合物或多肽的体内半衰期可以以本身已知的任何方式确定，诸如通过药物动力学分析。适当的技术对于本领域专业技术人员应该是清楚的，并且例如，通常可以包括下列步骤：将适当剂量的本发明的氨基酸序列、化合物或多肽适当施用给温血动物(即，施用给人或另一种适当的哺乳动物，诸如小鼠、兔、大鼠、猪、狗或灵长类动物，例如来自猕猴属的猴子(诸如，并且特别是食蟹猴(食蟹猴(Macacafascicularis))和/或恒河猴(恒河猴(Macacamulatta)))和狒狒(豚尾狒狒(Papioursinus)))；从所述动物收集血液样品或其它样品；确定在所述血液样品中的本发明的氨基酸序列、化合物或多肽的水平或浓度；并且从这样获得的数据(的图表)计算与在给药时的初始水平相比较直到本发明的氨基酸序列、化合物或多肽的水平或浓度已经减少50％的时间。例如，参考下述实验部分，以及标准手册，诸如Kenneth，A等：药物的化学稳定性：药剂师手册(ChemicalStabilityofPharmaceuticals：AHandbookforPharmacists)和Peters等，药物动力学分子：实践方法(Pharmacokineteanalysis：APracticalApproach)(1996)。还参考″药物动力学(Pharmacokinetics)″，MGibaldi和DPerron，MarcelDekker出版，第2综述版(2ndRev.edition)(1982)。
专业技术人员还应该清楚(例如，参见WO04/003019的第6和7页以及其中引用的其它参考文献)，半衰期可以用参数如t1/2-α，t1/2-β和曲线下面积(AUC)表示。在本说明书中，“半衰期增加”是指在这些参数的任何一种的增加，诸如这些参数的任何两种，或基本上所有这三种参数。当用于本发明时，“半衰期增加”或“增加的半衰期”特别是指t1/2-β的增加，具有或不具有t1/2-α和/或AUC或二者的增加。
o)如本文进一步所述，纳米抗体中氨基酸残基总数可以在110-120区间，优选112-115，并且最优选113。然而，应该注意纳米抗体的部分、片段、类似物或衍生物(如本文进一步所述)不特别局限于它们的长度和/或大小，只要这样的部分、片段、类似物或衍生物满足本发明列出的深层要求，并且还优选地适于本文所述的目的；
p)纳米抗体的氨基酸残基按照Kabat等(“免疫学目的蛋白的序列(Sequenceofproteinsofimmunologicalinterest)”，美国公众健康服务中心(USPublicHealthServices)，NIHBethesda，MD，PublicationNo.91)给出的关于VH结构域的通用编号方式进行编号，这种编号方式在Riechmann和Muyldermans，免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)2000年6月23日；240(1-2)：185-195的文章中用于来自骆驼科动物的VHH结构域，或参考本文。按照这种编号方式，纳米抗体的FR1包括位置1-30的氨基酸残基，纳米抗体的CDR1包括位置31-35的氨基酸残基，纳米抗体的FR2包括位置36-49的氨基酸，纳米抗体的CDR2包括位置50-65的氨基酸残基，纳米抗体的FR3包括位置66-94的氨基酸残基，纳米抗体的CDR3包括位置95-102的氨基酸残基，以及，纳米抗体的FR4包括位置103-113的氨基酸残基。【在这一方面，应该注意——如在本领域内关于VH结构域和关于VHH结构域公知的——在每一CDR中的氨基酸残基的总数可以不同，并且可以不与由Kabat编号方式指示的氨基酸残基的总数相对应(即，按照Kabat编号方式的一个或多个位置可能不占据在实际序列中，或者实际序列可能包含比由Kabat编号方式允许的数目更多的氨基酸残基)。这意味着，通常，按照Kabat的编号方式可能或可能不与实际序列中的氨基酸残基的实际编号方式相对应。然而，通常可以认为，按照Kabat的编号方式并且不考虑CDR中的氨基酸残基的数目，按照Kabat编号方式的位置1对应FR1的起点，并且反之亦然，按照Kabat编号方式的位置36对应FR2的起点，并且反之亦然，按照Kabat编号方式的位置66对应FR3的起点，并且反之亦然，以及按照Kabat编号方式的位置103对应FR4的起点，并且反之亦然。】。
用于编号VH结构域的氨基酸残基的备选方法是由Chothia等(自然(Nature)342，877-883(1989))所述的方法，即所谓的“AbM定义”和所谓的“联系定义”，所述方法还可以以类似的方式用于来自骆驼科动物的VHH结构域以及用于纳米抗体。然而，在本说明书、方面和附图中，遵循由Riechmann和Muyldermans用于VHH结构域的按照Kabat的编号方式，除非另外指明；并且
q)给出附图、序列表和实验部分/实施例只是进一步举例说明本发明，并且不应该被以任何方式解释为或者认为限制本发明和/或附上的方面的范围，除非本文中另外明确指明。
关于重链抗体及其可变结构域的概括描述，其中参考本发明引用的现有技术，参考Muyldermans在分子生物技术综述(ReviewsinMolecularBiotechnology)74(2001)，277-302中的综述论文；以及参考下述专利申请，其作为公知背景技术提及：VrijeUniversiteitBrussel的WO94/04678，WO95/04079和WO96/34103；Unilever的WO94/25591，WO99/37681，WO00/40968，WO00/43507，WO00/65057，WO01/40310，WO01/44301，EP1134231和WO02/48193；VlaamsInstituutvoorBiotechnologie(VIB)的WO97/49805，WO01/21817，WO03/035694，WO03/054016和WO03/055527；AlgonomicsN.V.和埃博灵克斯股份有限公司(AblynxN.V.)的WO03/050531；加拿大国家研究委员会的(theNationalResearchCouncilofCanada)WO01/90190；抗体研究所(theInstituteofAntibodies)的WO03/025020(＝EP1433793)；以及埃博灵克斯股份有限公司(AblynxN.V.)的WO04/041867，WO04/041862，WO04/041865，WO04/041863，WO04/062551，WO05/044858，WO06/40153，WO06/079372，WO06/122786，WO06/122787和WO06/122825，和埃博灵克斯股份有限公司(AblynxN.V.)的其它公布的专利申请。还参考在这些申请中提及的其它现有技术，并且特别参考在国际申请WO06/040153第41-43页提及的参考文献列表，该列表和参考文献通过引用结合于此。
按照上述本领域(参见上述的参考文献)中所用的术语学，在天然存在的重链抗体中存在的可变结构域还叫作“VHH结构域”，以将它们与在常规的4-链抗体中存在的重链可变结构域(其在下文中叫作“VH结构域”)区分，以及与在常规4-链抗体中存在的轻链可变结构域(其在下文中叫作“VL结构域”)区分。
如在上文提到的现有技术中提及，VHH结构域具有许多独特的结构特征和功能特性，这使得分离的VHH结构域(以及基于此的纳米抗体，其与天然存在的VHH结构域共享这些结构特征和功能特性)以及包含其的蛋白高度有利地用作功能性抗原-结合结构域或蛋白。特别地，并且不限于此，VHH结构域(其天然地就“设计”为功能性结合抗原，而无需存在轻链可变结构域，并且无需与轻链可变结构域的任何相互作用)和纳米抗体可以作用为单一的、相对小的、功能性抗原-结合结构单位、结构域或蛋白。这将VHH结构域与常规4-链抗体的VH和VL结构域区分开，其本身通常不适合作为单一抗原-结合蛋白或结构域用于实际应用，但是需要以某种形式或另一蛋白或结构域结合以提供功能性抗原-结合单位(例如，在常规抗体片段诸如Fab片段中；在ScFv’s片段中，其由共价连接到VL结构域上的VH结构域组成)。
由于这些独特的特性，VHH结构域和纳米抗体用作单一抗原-结合蛋白或用作抗原-结合结构域(即，作为更大的蛋白或多肽的部分)的应用提供许多优于常规VH和VL结构域、scFv’s或常规抗体片段(诸如Fab-或F(ab’)2-片段)应用的显著优点：
-只需要单结构域来以高亲和力和高选择性结合抗原，以致不需要存在两个分开的结构域，或者不需要保证这两个结构域以正确的空间构象和构型(即，通过使用专门设计的接头，如同scFv’s)存在；
-VHH结构域和纳米抗体可以从单一基因表达，并且不需要翻译后折叠或修饰；
-VHH结构域和纳米抗体可以容易地加工成多价和多特异性形式(如本文进一步所讨论)；
-VHH结构域和纳米抗体高度可溶，并且没有聚集倾向(如同Ward等，自然(Nature)，341卷，1989，第544页所述的来源于小鼠的“dAb’s”)；
-VHH结构域和纳米抗体对热、pH、蛋白酶和其它变性剂或条件高度稳定(参见，例如，Ewert等，同前所述)；
-VHH结构域和纳米抗体制备容易并且相对廉价，即使以生产需要的规模制备。例如，VHH结构域、纳米抗体和包含其的蛋白/多肽可以使用微生物发酵生产(例如，下文进一步所述)，并且不需要使用哺乳动物表达系统，如同例如常规抗体片段；
-与常规4-链抗体及其抗原-结合片段相比，VHH结构域和纳米抗体相对较小(大约15kDa，或比常规IgG小10倍)，并且因此表现出比所述常规4-链抗体及其抗原-结合片段更高的组织(包括但不限于实体瘤和其它致密组织)穿透性；
-VHH结构域和纳米抗体可以表现出所谓的洞隙-结合(cavity-binding)特性(与常规VH结构域相比，尤其由于它们延长的CDR3环)，并且因此还可以接近常规4-链抗体及其抗原-结合片段不能接近的靶标和表位。例如，已经表明VHH结构域和纳米抗体可以抑制酶(参见，例如，WO97/49805；Transue等，Proteins(蛋白)1998年9月1日；32(4)：515-22；Lauwereys等，(1998)，EMBOJ(欧洲分子生物学组织杂志).1998年7月1日；17(13)：3512-20)。
在一个具体且优选的方面中，本发明提供针对GPCR的纳米抗体，且特别是针对来自温血动物的GPCR的纳米抗体，且更特别地是针对来自哺乳动物的GPCR的纳米抗体，且尤其是针对人GPCR的纳米抗体；以及包括至少一种所述纳米抗体的蛋白和/或多肽。
特别地，本发明提供针对GPCR的纳米抗体，和包括其的蛋白和/或多肽，与针对GPCR的常规抗体或其片段相比，与可基于所述常规抗体或抗体片段的构建体(如Fab’片段，F(ab’)2片段，ScFv构建体，“二抗体”和其他多特异性构建体(参见例如Holliger和Hudson，NatBiotechnol.(自然生物技术)2005年9月；23(9)：1126-36)的综述)相比，且还与所谓的“dAb’s”或可能来源于常规抗体的可变结构域相似的(单)结构域抗体相比，其具有提高的治疗和/或药理学特性和/或其他有利特性(诸如，例如，改进的制备容易性和/或减少的商品成本)。这些提高的和有利的特性将通过本文的进一步描述变得清楚，且例如包括但不限于，下述各项的一种或多种：
-提高的针对GPCR的亲和力和/或抗体亲抗原性，不论以单价形式，以多价形式(例如，以二价形式)和/或以多特异性形式(例如，下文所述的多特异性形式之一)；
-增加的关于特定性质的效力，诸如例如通过与拮抗剂偶联、格式化例如反向拮抗剂来增加反向拮抗作用的能力(见实验部分)；
-对于以多价形式(例如，以二价形式)格式化的更好的适合性；
-对于以多特异性形式(例如，下文所述的多特异性形式之一)格式化的更好的适合性；
-提高的对“人源化”取代(如本文定义)的适合性或易感性；
-更小的免疫原性，不论以单价形式，以多价形式(例如，以二价形式)和/或以多特异性形式(例如，下文所述的多特异性形式之一)；
-增加的稳定性，不论以单价形式，以多价形式(例如，以二价形式)和/或以多特异性形式(例如，下文所述的多特异性形式之一)；
-增加的针对GPCR的特异性，不论以单价形式，以多价形式(例如，以二价形式)和/或以多特异性形式(例如，下文所述的多特异性形式之一)；
-减少或在需要时提高与来自不同物种的GPCR的交叉反应性；
和/或
-一种或多种对药学应用(包括预防应用和/或治疗应用)和/或诊断应用(包括但不限于成像目的)理想的其他改善的特性，不论以单价形式，以多价形式(例如，以二价形式)和/或以多特异性形式(例如，下文所述的多特异性形式之一)。
如本文关于本发明的氨基酸序列概括所述，本发明的纳米抗体优选以基本上分离的形式(如本文定义)存在，或形成本发明的蛋白或多肽(如本文定义)的一部分，其可以包括一个或多个本发明的纳米抗体或基本上由其组成，且其可以任选地还包括一个或多个其他氨基酸序列(所有任选地通过一个或多个适当的接头连接)。例如，且不限于，所述本发明的一个或多个氨基酸序列可以在所述蛋白或多肽中用作结合单位，其可以任选地包含一个或多个可以作为结合单位的其他氨基酸序列(即，针对除GPCR外的一个或多个其他的靶标)，以分别提供单价的、多价的或多特异性的本发明的多肽，所有均如本文所述。特别地，这样的蛋白或多肽可以包括一个或多个本发明的纳米抗体和任选地一个或多个(其他)纳米抗体或基本上由其组成(即，针对除GPCR外的其他的靶标)，所有均任选地通过一个或多个适当的接头连接，以分别提供单价的、多价的或多特异性的纳米抗体构建体，如本文进一步所述。这样的蛋白或多肽也可以以基本上分离的形式(如本文定义)存在。
在本发明的纳米抗体中，用于针对GPCR结合的结合位点优选地由CDR序列形成。任选地，本发明的纳米抗体还可以，且除了用于针对GPCR结合的至少一个结合位点之外，包含一个或多个用于针对其他抗原、蛋白或靶标结合的其他结合位点。对于引入所述第二结合位点的方法和位置，例如，参考Keck和Huston，BiophysicalJournal，(生物物理学杂志)71，1996年10月，2002-2011；EP0640130；WO06/07260和埃博灵克斯股份有限公司(AblynxN.V.)在2006年11月27日提交的标题为“Immunoglobulindomainswithmultiplebindingsites(具有多结合位点的免疫球蛋白结构域)”的美国临时申请。
如本文关于本发明的氨基酸序列概括所述，当意欲将本发明的纳米抗体(或包括其的本发明的多肽)施用给受试者时(例如，用于治疗和/或诊断目的，如本文所述)，它优选地针对人GPCR；而对于兽医用目的，它优选地针对来自被治疗的物种的GPCR。此外，如使用本发明的氨基酸序列，本发明的纳米抗体可以或可以不是交叉反应的(即，针对来自两种或多种哺乳动物物种的GPCR，如针对人GPCR和来自本文提及的哺乳动物物种中的至少一种的GPCR)。
此外，同样如本文关于本发明的氨基酸序列概括所述，本发明的纳米抗体可以通常针对GPCR的任何抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚基或构象(在适用的情形中)。然而，通常假设和优选地，本发明的纳米抗体(和包含其的多肽)针对GPCR(或源自其的合适肽)的至少一个胞外区、胞外结构域、胞外环或其他胞外表位和/或已经针对其生成。
如本文已经所述，可以认为纳米抗体的氨基酸序列和结构----然而，不限于此----包括4个构架区或“FR’s”(或有时还称为“FW’s”)，其在本领域和本文中分别称为“构架区1”或“FR1”；“构架区2”或“FR2”；“构架区3”或“FR3”；和“构架区4”或“FR4”；所述构架区由3个互补性决定区或“CDR’s”中断，其在本领域分别称为“互补性决定区1”或“CDR1”；“互补性决定区2”或“CDR2”；和“互补性决定区3”或“CDR3”。在本发明的纳米抗体中存在的一些优选的构架序列和CDR’s(及其组合)如本文所述。其他适当的CDR序列可以通过本文所述的方法获得。
按照本发明的非限制性但是优选的方面，本发明的纳米抗体(中存在的CDR序列)是这样的，以致：
-所述纳米抗体可以以10-5-10-12摩尔/升或更小、并且优选地10-7-10-12摩尔/升或更小、并且更优选地10-8-10-12摩尔/升的解离常数(KD)(即，以105-1012升/摩尔或更大、并且优选地107-1012升/摩尔或更大、且更优选地108-1012升/摩尔的缔合常数(KA))与GPCR结合；
和/或这样，以致：
-所述纳米抗体可以以102M-1s-1-约107M-1s-1，优选103M-1s-1-107M-1s-1，更优选104M-1s-1-107M-1s-1，诸如105M-1s-1-107M-1s-1的kon-速率与GPCR结合；
和/或这样，以致：
-所述纳米抗体可以以1s-1(t1/2＝0.69s)-10-6s-1(假定具有多天的t1/2的几乎不可逆的复合体)，优选10-2s-1-10-6s-1，更优选10-3s-1-10-6s-1，诸如10-4s-1-10-6s-1的koff速率与GPCR结合。
优选地，本发明的纳米抗体(中存在的CDR序列)是这样的，以致：本发明的单价纳米抗体(或包含仅一个本发明的纳米抗体的多肽)优选是这样，以致它将以小于500nM，优选小于200nM，更优选小于10nM，诸如小于500pM的亲和力与GPCR结合。
本发明的纳米抗体针对GPCR的亲和力可以以本身已知的方式确定，例如，使用本文提及的用于测量KD.KA，koff或kon的通用技术，以及本文所述的一些具体的测定法确定。
对于本发明的纳米抗体(和包括其的多肽)与GPCR结合的一些优选的IC50值将从本发明的进一步描述和实施例中变得清楚。
在一个优选而非限制性方面中，本发明涉及为针对GPCR的纳米抗体(如本文所定义)，其由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补性决定区(分别为CDR1-CDR3)组成，其中：
-CDR1选自由下列各项组成的组：
a)SEQIDNO’s：142-157，更优选142-143的氨基酸序列；
b)与SEQIDNO’s：142-157，更优选142-143的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
c)与SEQIDNO’s：142-157，更优选142-143的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和/或
-CDR2选自由下列各项组成的组：
d)SEQIDNO’s：174-189，更优选174-175的氨基酸序列；
e)与SEQIDNO’s：174-189，更优选174-175的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
f)与SEQIDNO’s：174-189，更优选174-175的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和/或
-CDR3选自由下列各项组成的组：
g)SEQIDNO’s：206-221，更优选206-207的氨基酸序列；
h)与SEQIDNO’s：206-221，更优选206-207的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
i)与SEQIDNO’s：206-221，更优选206-207的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
或所述氨基酸序列的任何适当的片段。
特别地，按照该优选而非限制性的方面，本发明涉及为针对人CXCR4的纳米抗体(如本文定义)，其由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补性决定区(分别为CDR1-CDR3)组成，其中：
-CDR1选自由下列各项组成的组：
a)SEQIDNO’s：142-157，更优选142-143的氨基酸序列；
b)与SEQIDNO’s：142-157，更优选142-143的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
c)与SEQIDNO’s：142-157，更优选142-143的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和
-CDR2选自由下列各项组成的组：
d)SEQIDNO’s：174-189，更优选174-175的氨基酸序列；
e)与SEQIDNO’s：174-189，更优选174-175的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
f)与SEQIDNO’s：174-189，更优选174-175的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和
-CDR3选自由下列各项组成的组：
g)SEQIDNO’s：206-221，更优选206-207的氨基酸序列；
h)与SEQIDNO’s：206-221，更优选206-207的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
i)与SEQIDNO’s：206-221，更优选206-207的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
或所述氨基酸序列的任何适当的片段。
如本文对本发明的氨基酸序列所概括提到的那样，当本发明的纳米抗体含有根据b)和/或c)的一个或多个CDR1序列时：
i)根据b)和/或c)的所述CDR中的任何氨基酸置换优选地，并且与根据a)的相应CDR相比，是保守氨基酸置换(如本文所定义)；
和/或
ii)与根据a)的相应CDR相比，根据b)和/或c)的CDR优选地仅含有氨基酸置换，且不含有氨基酸缺失或插入；
和/或
iii)根据b)和/或c)的所述CDR可以是这样的CDR，其通过使用本身已知的一种或多种亲和力成熟技术的亲和力成熟衍生自根据a)的CDR。
类似地，当本发明的纳米抗体包含根据e)和/或f)的一个或多个CDR2序列时：
i)根据e)和/或f)的所述CDR中的任何氨基酸置换优选地，并且与根据d)的相应CDR相比，是保守氨基酸置换(如本文所定义)；
和/或
ii)与根据d)的相应CDR相比，根据e)和/或f)的CDR优选地仅含有氨基酸置换，且不含有氨基酸缺失或插入；
和/或
iii)根据e)和/或f)的所述CDR可以是这样的CDR，其通过使用本身已知的一种或多种亲和力成熟技术的亲和力成熟衍生自根据d)的CDR。
还类似地，当本发明的纳米抗体包含根据h)和/或i)的一个或多个CDR3序列时：
i)根据h)和/或i)的所述CDR中的任何氨基酸置换优选地，并且与根据g)的相应CDR相比，是保守氨基酸置换(如本文所定义)；
和/或
ii)与根据g)的相应CDR相比，根据h)和/或i)的CDR优选地仅含有氨基酸置换，且不含有氨基酸缺失或插入；
和/或
iii)根据h)和/或i)的所述CDR可以是这样的CDR，其通过使用本身已知的一种或多种亲和力成熟技术的亲和力成熟衍生自根据g)的CDR。
应该理解最后三个段落总体上适用于分别包括根据b)，c)，e)，f)，h)或i)的一个或多个CDR1序列，CDR2序列和/或CDR3序列的本发明的任何纳米抗体。
在本发明的纳米抗体中，包括上面明确地列举的一个或多个CDR的纳米抗体是特别优选的；包括上面明确地列举的两个或多个CDR的纳米抗体是更特别优选的；和包括上面明确地列举的三个CDR的纳米抗体是最特别优选的。
一些特别优选的，但非限制性的CDR序列的组合，以及优选的CDR序列和构架序列的组合在下面的表A-1中提及，该表列举了存在于大量优选的(但非限制的)本发明的纳米抗体中的CDR序列和构架序列。如本领域专业技术人员所清楚的，在相同克隆中出现的CDR1、CDR2和CDR3序列的组合(即，在表A-1中同一行中提及的CDR1、CDR2和CDR3序列)通常将是优选的(尽管本发明在其最广泛的意义上不限于此，并且还包括表A-1中提及的CDR序列的其他适当的组合)。此外，在同一克隆中出现的CDR序列和构架序列的组合(即，在表A-1中同一行中提及的CDR序列和构架序列)通常将是优选的(尽管本发明在其最广泛的意义上不限于此，并且还包括表A-1中提及的CDR序列和构架序列的其他适当的组合，以及所述CDR序列和其他适当的构架序列的组合，例如，如本文进一步所述)。
此外，在包括表A-1中提及的CDR的组合的本发明的纳米抗体中，每个CDR可以被选自由与所提及的CDR具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少99％序列同一性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组的CDR替换；其中：
i)所述CDR中的任何氨基酸置换优选地，并且与表A-1中提及的相应CDR序列相比，是保守氨基酸置换(如本文所定义)；
和/或
ii)与表A-1中提及的相应CDR序列相比，任何所述CDR序列优选地仅含有氨基酸置换，且不含有氨基酸缺失或插入；
和/或
iii)任何所述CDR序列是这样的CDR，其通过本身已知的亲和力成熟技术衍生，并且特别地从表A-1中提及的相应CDR序列开始。
然而，如专业技术人员所清楚的，表A-1中提及的CDR序列(的组合)，以及CDR序列和构架序列(的组合)通常将是优选的。
因此，在本发明的纳米抗体中，存在的CDR1，CDR2和CDR3序列的至少一个适当地选自由表A-1中分别列举的CDR1，CDR2和CDR3序列组成的组；或选自分别与表A-1中分别列举的CDR1，CDR2和CDR3序列的至少一个具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少99％“序列同一性”(如本文所定义)的CDR1，CDR2和CDR3序列的组；和/或选自由分别与表A-1中分别列举的CDR1，CDR2和CDR3序列的至少一个具有3，2或仅1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的CDR1，CDR2和CDR3序列组成的组。
在上下文中，通过“适当地选择”是指，根据适用的情况，分别地，CDR1序列选自适当的CDR1序列(即，如本文所定义)，CDR2序列选自适当的CDR2序列(即，如本文所定义)，和CDR3序列选自适当的CDR3序列(即，如本文所定义)。更具体地，CDR序列优选地这样选择，以致本发明的纳米抗体以如本发明所定义的亲和力结合GPCR(适当测量和/或表示为KD-值(实际的或表观的)，KA-值(实际的或表观的)，kon-速率和/或koff-速率，或备选地作为IC50值，如本文进一步所述)。
具体地，在本发明的纳米抗体中，存在的至少CDR3序列适当地选自由表A-1中列举的CDR3序列组成的组或选自与表A-1中列举的CDR3序列的至少一个具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少99％序列同一性的CDR3序列的组；和/或选自由与表A-1中分别列举的CDR3序列的至少一个具有3，2或仅1个氨基酸差异的CDR3序列组成的组。
优选地，在本发明的纳米抗体中，存在的CDR1，CDR2和CDR3序列的至少两个适当地选自由表A-1中分别列举的CDR1，CDR2和CDR3序列组成的组；或选自分别与表A-1中分别列举的CDR1，CDR2和CDR3序列的至少一个具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少99％序列同一性的CDR1，CDR2和CDR3序列的组；和/或选自由分别与表A-1中分别列举的CDR1，CDR2和CDR3序列的至少一个具有3，2或仅1个“氨基酸差异”的CDR1，CDR2和CDR3序列组成的组。
具体地，在本发明的纳米抗体中，存在的至少CDR3序列适当地选自由表A-1中列举的CDR3序列组成的组或选自与表A-1中列举的CDR3序列的至少一个具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少99％序列同一性的CDR3序列的组；和存在的CDR1和CDR2序列的至少一个适当地选自由分别在表A-1中分别列举的CDR1和CDR2序列组成的组或选自分别与表A-1中分别列举的CDR1和CDR2序列的至少一个具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少99％序列同一性的CDR1和CDR2序列的组；和/或选自由分别与表A-1中分别列举的CDR1和CDR2序列的至少一个具有3，2或仅1个氨基酸差异的CDR1和CDR2序列组成的组。
最优选地，在本发明的纳米抗体中，存在的所有三个CDR1，CDR2和CDR3序列适当地选自由表A-1中分别列举的CDR1，CDR2和CDR3序列组成的组或选自分别与表A-1中分别列举的CDR1，CDR2和CDR3序列的至少一个具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少99％序列同一性的CDR1，CDR2和CDR3序列的组；和/或选自由分别与表A-1中分别列举的CDR1，CDR2和CDR3序列的至少一个具有3，2或仅1个“氨基酸差异”的CDR1，CDR2和CDR3序列组成的组。
甚至更优选地，在本发明的纳米抗体中，存在的CDR1，CDR2和CDR3序列的至少一个适当地选自由表A-1中分别列举的CDR1，CDR2和CDR3序列组成的组。优选地，在此方面，存在的其他两个CDR序列的至少一个或优选两个适当地选自与表A-1中分别列举的相应CDR序列的至少一个具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少99％序列同一性的CDR序列；和/或选自由分别与表A-1中分别列举的相应序列的至少一个具有3，2或仅1个氨基酸差异的CDR序列组成的组。
具体地，在本发明的纳米抗体中，存在的至少CDR3序列适当地选自由表A-1中列举的CDR3组成的组。优选地，在此方面，存在的CDR1和CDR2序列的至少一个和优选两个适当地选自分别与表A-1中分别列举的CDR1和CDR2序列具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少99％序列同一性的CDR1和CDR2序列的组；和/或选自由分别与表A-1中分别列举的CDR1和CDR2序列的至少一个具有3，2或仅1个氨基酸差异的CDR1和CDR2序列组成的组。
甚至更优选地，在本发明的纳米抗体中，存在的CDR1，CDR2和CDR3序列的至少两个适当地选自由表A-1中分别列举的CDR1，CDR2和CDR3序列组成的组。优选地，在此方面，存在的剩余CDR序列适当地选自与表A-1中列举的相应CDR序列的至少一个具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少99％序列同一性的CDR序列的组；和/或选自由分别与表A-1中列举的相应序列的至少一个具有3，2或仅1个氨基酸差异的CDR序列组成的组。
具体地，在本发明的纳米抗体中，至少CDR3序列适当地选自由表A-1中列举的CDR3序列组成的组，并且CDR1序列或CDR2序列适当地选自由表A-1中分别列举的CDR1和CDR2序列组成的组。优选地，在此方面，剩余的存在的CDR序列适当地选自与表A-1中列举的相应CDR序列的至少一个具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少99％序列同一性的CDR序列的组；和/或选自由与表A-1中列举的相应CDR序列具有3，2或仅1个氨基酸差异的CDR序列组成的组。
甚至更优选地，在本发明的纳米抗体中，存在的所有三个CDR1，CDR2和CDR3序列适当地选自由表A-1中分别列举的CDR1，CDR2和CDR3序列组成的组。
此外，通常，表A-1中列举的CDR的组合(即，表A-1中同一行上提及的那些)是优选的。因此，通常优选，当本发明的纳米抗体中的CDR是表A-1中提及的CDR序列或适当地选自与表A-1中列举的CDR序列具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少99％序列同一性的CDR序列的组；和/或选自由与表A-1中列举的CDR序列具有3，2或仅1个氨基酸差异的CDR序列组成的组，其他CDR的至少一个和优选两个适当地选自属于表A-1中相同组合的CDR序列(即表A-1中同一行上提及的)或适当地选自与属于同一组合的CDR序列具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少99％序列同一性的CDR序列的组和/或选自由与属于同一组合的CDR序列具有3，2或仅1个氨基酸差异的CDR序列组成的组。上述段落中指出的其他优选项也适用于表A-1中提及的CDR的组合。
因此，借助于非限制性实例，本发明的纳米抗体可以例如包括与表A-1中提及的CDR1序列之一具有超过80％序列同一性的CDR1序列，与表A-1中提及的CDR2序列之一(但属于不同的组合)具有3，2或1个氨基酸差异的CDR2序列，和CDR3序列。
本发明的一些优选的纳米抗体可以例如包括：(1)与表A-1中提及的CDR1序列之一具有超过80％序列同一性的CDR1序列；与表A-1中提及的CDR2序列之一(但属于不同的组合)具有3，2或1个氨基酸差异的CDR2序列；和与表A-1中提及的CDR3序列之一(但属于不同的组合)具有超过80％序列同一性的CDR3序列；或(2)与表A-1中提及的CDR1序列之一具有超过80％序列同一性的CDR1序列；CDR2序列，和表A-1中列举的CDR3序列之一；或(3)CDR1序列；与表A-1中列举的CDR2序列之一具有超过80％序列同一性的CDR2序列；和与表A-1中提及的CDR3序列(属于与CDR2序列相同的组合)具有3，2或1个氨基酸差异的CDR3序列。
本发明的一些特别优选的纳米抗体可以例如包括：(1)与表A-1中提及的CDR1序列之一具有超过80％序列同一性的CDR1序列；与表A-1中提及的CDR2序列(属于相同的组合)具有3，2或1个氨基酸差异的CDR2序列；和与表A-1中提及的CDR3序列(属于相同的组合)具有超过80％序列同一性的CDR3序列；(2)CDR1序列；表A-1中列举的CDR2和表A-1中列举的CDR3序列(其中CDR2序列和CDR3序列可以属于不同的组合)。
本发明的一些甚至更优选的纳米抗体可以例如包括：(1)与表A-1中提及的CDR1序列之一具有超过80％序列同一性的CDR1序列；属于同一组合成的表A-1中列举的CDR2序列；和属于不同的组合的表A-1中提及的CDR3序列；或(2)表A-1中提及的CDR1序列；与表A-1中提及的CDR2序列(属于同一组合)具有3，2或1个氨基酸差异的CDR2序列；和与表A-1中列举的CDR3序列(属于相同或不同的组合)具有超过80％序列同一性的CDR3序列。
本发明的特别优选的纳米抗体可以例如包括表A-1中提及的CDR1序列，与表A-1中提及的CDR2序列(属于相同的组合)具有超过80％序列同一性的CDR2序列；和属于相同的组合的表A-1中提及的CDR3序列。
在本发明的最优选的纳米抗体中，存在的CDR1，CDR2和CDR3序列适当地选自表A-1中分别列举的CDR1，CDR2和CDR3序列的组合之一。
根据本发明的另一优选的但非限制性的方面，(a)CDR1具有1和12个氨基酸残基之间，和通常2和9个氨基酸残基之间，诸如5，6或7个氨基酸残基的长度；和/或(b)CDR2具有13和24个氨基酸残基之间，和通常15和21个氨基酸残基之间，诸如16和17个氨基酸残基的长度；和/或(c)CDR3具有2和35个氨基酸残基，和通常3和30个氨基酸残基之间，诸如6和23个氨基酸残基之间的长度。
在另一个优选的但非限制性的方面，本发明涉及一种纳米抗体，其中CDR序列(如本文所定义)具有与SEQIDNO’s：238-253，更优选SEQIDNO：238和SEQIDNO：239的氨基酸序列的至少一个的CDR序列具有超过80％，优选超过90％，更优选超过95％，诸如99％或更多的序列同一性(如本文所定义)。
通常，具有上述CDR序列的纳米抗体可以如本文进一步所述，并且优选地具有也如本文进一步所述的构架序列。因此，例如和如本文所提及，所述纳米抗体可以是天然存在的纳米抗体(来自任何适当的物种)，天然存在的VHH序列(即，来自适当的骆驼物种)或合成的或半合成的氨基酸序列或纳米抗体，包括但不限于部分人源化的纳米抗体或VHH序列，完全人源化的纳米抗体或VHH序列，骆驼源化的重链可变结构域序列，以及已经通过本文提及的技术获得的纳米抗体。
因此，在一个具体而非限制性的方面中，本发明涉及人源化的纳米抗体，其由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补性决定区(分别为CDR1-CDR3)组成，其中CDR1-CDR3如本文所定义，且其中所述人源化的纳米抗体包括至少一个人源化取代(如本文定义)，且特别地是在其至少一个构架序列(如本文定义)中的至少一个人源化取代。
在另一个优选的但非限制性的方面，本发明涉及一种纳米抗体，其中CDR序列与SEQIDNO’s：238-253，更优选SEQIDNO：238和SEQIDNO：239的氨基酸序列的至少一个的CDR序列具有至少70％氨基酸同一性，优选至少80％氨基酸同一性，更优选至少90％氨基酸同一性，诸如95％氨基酸同一性或更多或甚至基本上100％氨基酸同一性。此氨基酸同一性程度可以例如通过确定所述纳米抗体和SEQIDNO’s：238-253，更优选SEQIDNO：238和SEQIDNO：239的序列的一个或多个之间的氨基酸同一性程度(以本文所述的方式)来确定，其中忽略形成构架区的氨基酸残基。所述纳米抗体可以如本文进一步所述。
在另一个优选的但非限制性的方面，本发明涉及具有这样的氨基酸序列的纳米抗体，所述氨基酸序列选自由SEQIDNO’s：238-253，更优选SEQIDNO：238和SEQIDNO：239组成的组或选自由与SEQIDNO’s：238-253，更优选SEQIDNO：238和SEQIDNO：239的氨基酸序列的至少一个具有超过80％，优选超过90％，更优选超过95％，诸如99％或更多序列同一性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组。
本发明的另一个优选的但非限制性的方面涉及SEQIDNO’s：238-253，更优选SEQIDNO：238和SEQIDNO：239的纳米抗体的人源化变体，其与相应的天然VHH序列相比，包括至少一个人源化置换(如本文所定义)和特别地在其构架序列(如本文所定义)的至少一个中的至少一个人源化置换。
本发明的多肽包括本发明的至少一个纳米抗体或基本上由其组成。因此，在另一个优选但非限制性方面，本发明涉及包括至少一个纳米抗体或基本由其组成，所述至少一个纳米抗体选自由SEQIDNO’s：238-253，更优选SEQIDNO：238和SEQIDNO：239组成的组，或选自由与SEQIDNO’s：238-253，更优选SEQIDNO：238和SEQIDNO：239的至少一个氨基酸序列具有大于80％，优选大于90％，更优选大于95％，诸如99％以上序列同一性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组。。因此，在另一个优选但非限制性方面，本发明涉及包括SEQIDNO’s：261-264，更优选SEQIDNO：263-264的氨基酸序列或或基本上由其组成。
专业技术人员应该清楚，本文提及为“优选的”(或“更优选的”、“甚至更优选的”、等等)纳米抗体也是优选的(或更优选的，或甚至更优选的，等等)用于本文所述的多肽中。因此，包括一个或多个“优选的”本发明的纳米抗体或基本上由其组成的多肽通常将是优选的，且包括一个或多个“更优选的”本发明的纳米抗体或基本上由其组成的多肽通常将是更优选的，等等。
一般地，包括单一纳米抗体(如本发明的单一纳米抗体)或基本上由其组成的蛋白或多肽在本文称为“单价的”蛋白或多肽或称为“单价的构建体”。包括两个或多个纳米抗体(如至少两个本发明的纳米抗体或至少一个本发明的纳米抗体和至少一个其他纳米抗体)或基本上由其组成的蛋白和多肽在本文称为“多价的”蛋白或多肽或称为“多价的构建体”，且与相对应的本发明的单价纳米抗体相比较，这些可以提供某些优点。通过本文的进一步描述，所述多价构建体的一些非限制性的实例将变得清楚。
按照一个具体而非限制性的方面，本发明的多肽包括至少两个本发明的纳米抗体、如两个或三个本发明的纳米抗体或基本上由其组成。如本文进一步所述，与包括本发明的单一纳米抗体或基本上由其组成的蛋白或多肽相比较，所述多价构建体可以提供某些优点，如提高很多的对于GPCR的抗体亲抗原性。基于本文的公开内容，对于专业技术人员来说所述多价构建体将是清楚的，并且例如是包括SEQIDNO：261-262的氨基酸序列或基本上由其组成的多肽。
按照另一个具体而非限制性的方面，本发明的多肽包括至少一个本发明的纳米抗体和至少一个其他结合单位(即，针对另一个表位、抗原、靶标、蛋白或多肽)或基本上由其组成，所述其他结合单位优选地也是纳米抗体。所述蛋白或多肽在本文还称为“多特异性”蛋白或多肽，或称为“多特异性构建体”，且与相对应的本发明的单价纳米抗体相比较，这些可以提供某些优点(如从本文对一些优选的、但非限制性的多特异性构建体的进一步讨论中将变得清楚)。基于本文的公开内容，对于专业技术人员来说所述多特异性的构建体将是清楚的，并且例如是包括SEQIDNO：263-264的氨基酸序列或基本上由其组成的多肽。
按照另一个具体的但非限制性的方面，本发明的多肽包括至少一个本发明的纳米抗体、任选地一个或多个其他纳米抗体、和至少一个赋予本发明的纳米抗体和/或赋予所得到的融合蛋白至少一种需要的特性的其他氨基酸序列(如蛋白或多肽)，或基本上由其组成。同样地，与相对应的本发明的单价纳米抗体相比较，所述融合蛋白可以提供某些的优点。所述氨基酸序列和所述融合构建体的一些非限制性的实例将通过本文的进一步描述变得清楚。
还可以组合两个或多个上述方面，例如，以提供三价双特异性构建体，其包括两个本发明的纳米抗体，和一个其他的纳米抗体，和任选地一个或多个其他的氨基酸序列。所述构建体的其他非限制性的实例，以及在本发明的情形中特别优选的一些构建体，将通过本文的进一步描述变得清楚。
在上述构建体中，所述一个或多个纳米抗体和/或其他氨基酸序列可以直接彼此连接和/或适当地通过一个或多个接头序列彼此连接。所述接头的一些适合的但非限制性的实例将通过本文的进一步所述变得清楚。
在本发明的一个具体的方面中，与本发明相对应的氨基酸序列相比较，本发明的纳米抗体或包括至少一个本发明的纳米抗体的本发明的化合物、构建体或多肽可以具有增加的半衰期。基于本文进一步公开的内容，专业技术人员应该清楚所述纳米抗体、化合物和多肽的一些优选的但非限制性的实例，且例如，包括已经进行化学修饰(例如，通过聚乙二醇化)提高其半衰期的本发明的纳米抗体序列或多肽；包括至少一个用于结合血清蛋白(如血清白蛋白，参考例如埃博灵克斯股份有限公司(AblynxN.V.)于2006年11月27日提交的题目为“Immunoglobulindomainswithmultiplebindingsites(具有多结合位点的免疫球蛋白结构域)”的美国临时申请)的额外的结合位点的本发明的氨基酸序列；或包括至少一个与至少一个增加本发明的纳米抗体的半衰期的部分(且特别是至少一个氨基酸序列)连接的本发明的纳米抗体的本发明的多肽。基于本文进一步的公开内容，专业技术人员应该清楚包括所述半衰期延长部分或氨基酸序列的本发明的多肽的实例；且例如包括，不限于，这样的多肽，其中所述一个或多个本发明的纳米抗体适当地与下列各项连接：一个或多个血清蛋白或其片段(如血清白蛋白或其适当的片段)，或一个或多个可以结合血清蛋白的结合单位(如例如，可以结合血清蛋白如血清白蛋白、血清免疫球蛋白如IgG、或运铁蛋白的纳米抗体或(单)结构域抗体)；其中本发明的纳米抗体与Fc部分(如人Fc)或其适当的部分或片段连接的多肽；或其中所述一个或多个本发明的纳米抗体适当地与可以结合血清蛋白的一个或多个小蛋白或肽连接的多肽(诸如，不限于，记载在WO91/01743，WO01/45746，WO02/076489和埃博灵克斯股份有限公司(AblynxN.V.)于2006年12月5日提交的题目为“能够结合血清蛋白的肽(Peptidescapableofbindingtoserumproteins)”的埃博灵克斯股份有限公司的美国临时申请。
同样地，如专业技术人员应该清楚的，所述纳米抗体、化合物、构建体或多肽可以包含一个或多个另外的基团、残基、部分或结合单位，如一个或多个另外的氨基酸序列且特别是一个或多个另外的纳米抗体(即，不针对GPCR)，以提供多特异性纳米抗体构建体中的三特异性纳米抗体构建体。
一般地，具有增加的半衰期的本发明的纳米抗体(或包括其的化合物、构建体或多肽)优选地具有是相对应的本发明的氨基酸序列本身的半衰期的至少1.5倍、优选地至少2倍，如至少5倍，例如至少10倍或超过20倍的半衰期。例如，与相对应的本发明的氨基酸序列本身相比，具有增加的半衰期的本发明的纳米抗体、化合物、构建体或多肽可以具有增加超过1小时，优选超过2小时，更优选超过6小时，诸如超过12小时，或甚至超过24、48或72小时的半衰期。
在本发明的一个优选而非限制性方面中，所述本发明的纳米抗体、化合物、构建体或多肽在人中表现出至少约12小时、优选至少24小时、更优选至少48小时、甚至更优选至少72小时或更多的血清半衰期。例如，本发明的化合物或多肽可以具有至少5天(诸如约5-10天)、优选至少9天(诸如约9-14天)、更优选至少约10天(诸如约10-15天)、或至少约11天(诸如约11-16天)、更优选至少约12天(诸如约12-18天或更多)、或超过14天(诸如约14-19天)的半衰期。
在本发明的另一个方面中，本发明的多肽包括与允许所得到的本发明的多肽穿过血脑屏障的一个或多个(诸如两个并且优选一个)氨基酸序列连接(任选地通过一个或多个适当的接头序列连接)的一个或多个(诸如两个或优选一个)本发明的纳米抗体。特别地，允许所得到的本发明的多肽穿过血脑屏障的所述一个或多个氨基酸序列可以是一个或多个(诸如两个并且优选一个)纳米抗体，诸如在WO02/057445中所述的纳米抗体，其中FC44(WO06/040153的SEQIDNO：189)和FC5(WO06/040154的SEQIDNO：190)是优选的实施例。
特别地，包括一个或多个本发明的纳米抗体的多肽优选是这样的，以致它们：
-以10-5-10-12摩尔/升或更小、并且优选地10-7-10-12摩尔/升或更小、并且更优选地10-8-10-12摩尔/升的解离常数(KD)(即，以105-1012升/摩尔或更大、并且优选地107-1012升/摩尔或更大、且更优选地108-1012升/摩尔的缔合常数(KA))与GPCR结合；
和/或这样，以致它们：
-以102M-1s-1-约107M-1s-1，优选103M-1s-1-107M-1s-1，更优选104M-1s-1-107M-1s-1，诸如105M-1s-1-107M-1s-1的kon-速率与GPCR结合；和/或这样，以致它们：
-以1s-1(t1/2＝0.69s)-10-6s-1(假定具有多天的t1/2的几乎不可逆的复合体)，优选10-2s-1-10-6s-1，更优选10-3s-1-10-6s-1，诸如10-4s-1-10-6s-1的koff速率与GPCR结合。
优选地，包含仅一个本发明的氨基酸序列的多肽优选是这样，以致它将以小于500nM，优选小于200nM，更优选小于10nM，诸如小于500pM的亲和力与GPCR结合。在这一方面中，专业技术人员应该清楚，与包含仅一个本发明的氨基酸序列的多肽相比较，包含两个或多个本发明的纳米抗体的多肽可以以增加的抗体亲抗原性结合GPCR。
对于使本发明的氨基酸序列或多肽与GPCR结合的一些优选的IC50值将从本发明的进一步描述和实施例中变得清楚。
本发明的另一个方面涉及编码本发明的纳米抗体或包括其的本发明的多肽的核酸。同样地，如本文关于本发明的核酸概括所述，这样的核酸可以以遗传构建体的形式存在，如本文定义。
在另一个方面中，本发明涉及表达或能够表达本发明的纳米抗体和/或包括其的本发明的多肽的宿主或宿主细胞；和/或包含本发明的核酸的宿主或宿主细胞。通过本文进一步的描述，所述宿主或宿主细胞的一些优选的但非限制性的实例将变得清楚。
本发明的另一个方面涉及包含或包括至少一个本发明的纳米抗体、至少一个本发明的多肽和/或至少一个本发明的核酸的产品或组合物，和任选地本身已知的所述组合物的一种或多种其他成分，即，取决于所述组合物的目的用途。例如，所述产品或组合物可以是药物组合物(如本文所述)，兽医用组合物或用于诊断应用(也如本文所述)的产品或组合物。通过本文进一步的描述，所述产品或组合物的一些优选的但非限制性的实例将变得清楚。
本发明还涉及用于制备或产生本文所述的纳米抗体、多肽、核酸、宿主细胞、产品和组合物的方法。通过本文进一步的描述，所述方法的一些优选的但非限制性的实例将变得清楚。
本发明还涉及本文所述的纳米抗体、多肽、核酸、宿主细胞、产品和组合物的应用和用途，以及用于预防和/或治疗与GPCR相关的疾病和紊乱的方法。通过本文进一步的描述，一些优选的但非限制性的应用和用途的实例将变得清楚。
通过下文的进一步描述，本发明的其他方面、实施方案、优点和应用也变得清楚。
一般地，应该注意，术语纳米抗体在用于本文时在其最广泛意义上不限于具体的生物来源或具体的制备方法。例如，如在下文更详细讨论的，本发明的纳米抗体通常可以这样获得：(1)通过分离天然存在的重链抗体的VHH结构域；(2)通过表达编码天然存在的VHH结构域的核苷酸序列；(3)通过将天然存在的VHH结构域“人源化”(如本文所述)或者通过表达编码这样的人源化VHH结构域的核酸；(4)通过将来自于任何动物物种且特别是哺乳动物物种诸如来自于人类的天然存在的VH结构域“骆驼源化(camelization)”(如本文所述)，或者通过表达编码这样的骆驼源化的VH结构域的核酸；(5)通过如Ward等(同前所述)所述将“结构域抗体”或“Dab”“骆驼源化”，或者通过表达编码这样的骆驼源化VH结构域的核酸；(6)应用用于制备本身已知的蛋白、多肽或其它氨基酸序列的合成或半合成技术；(7)通过应用本身已知的核酸合成技术制备编码纳米抗体的核酸，然后表达这样获得的核酸；和/或(8)通过前述一种或多种的任何结合。基于本文的公开内容，专业技术人员应该清楚实行前述的适当的方法和技术，并且例如包括本发明更详细描述的方法和技术。
一个优选的纳米抗体种类对应于针对GPCR的天然存在的重链抗体的VHH结构域。如本文进一步所述，这样的VHH序列通常可以这样产生或获得：通过用GPCR适当免疫骆驼科动物物种(即，以产生针对GPCR的免疫反应和/或重链抗体)，通过获得来自所述骆驼科动物的适当的生物样品(诸如血液样品、血清样品或B-细胞样品)，并且通过利用本身已知的任何适当技术从所述样品开始产生针对GPCR的VHH序列。所述技术对于专业技术人员应该是清楚的，和/或在本文中进一步所述。
备选地，所述针对GPCR天然存在的VHH结构域可以从首次用于实验的骆驼科动物VHH序列文库获得，例如，通过使用本身已知的一种或多种筛选技术用GPCR、或其至少一部分、片段、抗原决定簇或表位筛选这样的文库。例如，这样的文库和技术记述在WO99/37681，WO01/90190，WO03/025020和WO03/035694中。备选地，可以使用来源自首次用于实验的VHH文库的改进的合成的或半合成的文库，诸如通过诸如随机诱变和/或CDR重排的技术从首次用于实验的VHH文库获得的VHH文库，如例如记述在WO00/43507中获得。
因此，在另一个方面中，本发明涉及用于产生针对GPCR的纳米抗体的方法。在一个方面中，所述方法至少包括下列步骤：
a)提供纳米抗体序列的组、集合或文库；和
b)从所述纳米抗体序列的组、集合或文库中筛选可以结合和/或具有针对GPCR的亲和力的纳米抗体序列；
和
c)分离所述可以结合和/或具有针对GPCR的亲和力的氨基酸序列。
在这样的方法中，所述纳米抗体序列的组、集合或文库可以是纳米抗体序列的首次用于实验的组、集合或文库；纳米抗体序列的合成的或半合成的组、集合或文库；和/或已经进行了亲和力成熟的纳米抗体序列的组、集合或文库。
在本方法的优选方面中，所述纳米抗体序列的组、集合或文库可以是纳米抗体序列的免疫组、集合或文库，特别是，来自已经用GPCR适当免疫的、或用基于其或来源于其的适当的抗原决定簇(诸如其抗原部分、片段、区域、结构域、环或其它表位)适当免疫的骆驼科物种的VHH序列的免疫组、集合或文库。在一个特别的方面中，所述抗原决定簇可以是细胞外部分、区域、结构域、环或其它细胞外表位。
在上述方法中，所述纳米抗体或VHH序列的组、集合或文库可以被展示在噬菌体、噬菌粒、核糖体、或适当的微生物(诸如酵母)上，如以促进筛选。用于展示和筛选纳米抗体序列(的组、集合或文库)的适当的方法、技术和宿主生物体对于本领域专业技术人员将是清楚的，例如，基于本发明进一步的公开内容。还参考WO03/054016和Hoogenboom在NatureBiotechnology(自然生物技术)，23，9，1105-1116(2005)中的综述。
在另一个方面中，所述用于产生纳米抗体序列的方法包括至少下列步骤：
a)提供来源于骆驼科物种的表达免疫球蛋白序列的细胞的集合或样品；
b)从所述细胞集合或样品中筛选：(i)表达可以结合和/或具有针对GPCR的亲和力的免疫球蛋白序列的细胞；和(ii)表达重链抗体的细胞，其中子步骤(i)和(ii)可以基本上按照一个筛选步骤或作为两个独立的筛选步骤以任何适当的顺序进行，以提供至少一种表达可以结合和/或具有针对GPCR的亲和力的重链抗体的细胞；
和
c)(i)从所述细胞分离存在于所述重链抗体中的VHH序列；或(ii)从所述细胞分离编码存在于所述重链抗体中的VHH序列的核酸序列，然后表达所述VHH结构域
在另一个方面中，所述用于产生针对GPCR，例如人CXCR4或人CXCR7的纳米抗体序列的方法包括至少下列步骤：
a.用包括所需胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他胞外表位的合适抗原，用源自或基于其的合适的肽适当免疫骆驼科动物，从而产生针对所述胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他一个或多个胞外表位的免疫应答的步骤。所述抗原可以是能够产生针对所述胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他一个或多个胞外表位的免疫反应的任何合适抗原；诸如，例如但不限于，有生命的并以其天然构象在其表面上过表达所需胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他一个或多个胞外表位的完整细胞，其细胞壁片段或源自所述细胞的任何其他制剂，在其表面上具有所需胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他一个或多个胞外表位的囊泡，包含所需胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他胞外表位的GPCR例如人CXCR4和/或人CXCR7亚单位或亚单位的片段，或包含和/或基于所需胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他一个或多个胞外表位(的氨基酸序列)的合成或半合成肽；更优选地，有生命的并以其天然构象在其表面上过表达所需胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他一个或多个胞外表位的完整细胞(例如HEK293)；和
b.利用过表达所述GPCR，例如人CXCR4和/或人CXCR7的不同(与免疫中使用的那种不同)和若干细胞类型的细胞膜制剂来选择用于结合所需胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他一个或多个胞外表位的步骤。这可以通过从在其表面上表达重链抗体的细胞的组、集合或文库(例如获自适当免疫的骆驼科动物的B细胞)选择和使用例如用于第一轮选择的第一类细胞诸如例如CHO和例如用于第二轮选择的第二类细胞诸如例如COS-7细胞的细胞膜制剂来实现，通过使用例如用于第一轮选择的第一类细胞诸如例如CHO和例如用于第二轮选择的第二类细胞诸如例如COS-7细胞的细胞膜制剂从VHH序列或纳米抗体序列的(幼稚或免疫)库中选择来实现，或通过使用例如用于第一轮选择的第一类细胞诸如例如CHO和例如用于第二轮选择的第二类细胞诸如例如COS-7细胞的细胞膜制剂从编码VHH序列或纳米抗体序列的核苷酸序列的(幼稚或免疫)文库中选择来实现；其都可以以本身已知的方式进行；和任选地
c.用缓冲液诸如无去污剂的PBS仅适度洗涤；且该方法可以任选地进一步包括一个或多个本身已知的其他合适步骤，诸如，例如且不限于，亲和力成熟的步骤，表达所需氨基酸序列的步骤，筛选针对所需抗原(在该情形中，GPCR)结合和/或针对所需抗原(在该情形中，GPCR)的活性的步骤，确定所需氨基酸序列或核苷酸序列的步骤，引入一个或多个人源化取代(例如如本文中进一步所述)的步骤，以合适的多价和/或多特异性形式格式化的步骤，筛选所需生物学和/或生理学性质(即利用合适的测定，诸如本文中所述的那些)的步骤；和/或一个或多个所述步骤，以任何合适顺序的任何合适组合。
在另一个方面中，所述用于产生针对跨膜蛋白的纳米抗体序列的方法包括至少下列步骤：
a.用包括所需胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他一个或多个胞外表位的合适抗原，用源自或基于其的合适的肽适当免疫骆驼科动物，从而产生针对所述胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他一个或多个胞外表位的免疫应答的步骤。所述抗原可以是能够产生针对所述胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他一个或多个胞外表位的免疫反应的任何合适抗原；诸如，例如但不限于，有生命的并以其天然构象在其表面上过表达所需胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他一个或多个胞外表位的完整细胞，其细胞壁片段或源自所述细胞的任何其他制剂，在其表面上具有所需胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他一个或多个胞外表位的囊泡，包含所需胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他胞外表位的跨膜蛋白，具体是其天然构象在其他“体外”系统中无法复制(至少是在提交本申请时)的多重跨膜蛋白的亚单位或亚单位的片段，或包含和/或基于所需胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他一个或多个胞外表位(的氨基酸序列)的合成或半合成肽；更优选地，有生命的并以其天然构象在其表面上过表达所需胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他胞外表位的完整细胞(例如HEK293)；和
b.利用过表达所述跨膜蛋白，具体是其天然构象在其他“体外”系统中无法复制(至少是在提交本申请时)的多重跨膜蛋白的不同(与免疫中使用的那种不同)和若干细胞类型的细胞膜制剂来选择用于结合所需胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他一个或多个胞外表位的步骤。这可以通过从在其表面上表达重链抗体的细胞的组、集合或文库(例如获自适当免疫的骆驼科动物的B细胞)选择和使用例如用于第一轮选择的第一类细胞诸如例如CHO和例如用于第二轮选择的第二类细胞诸如例如COS-7细胞的细胞膜制剂来实现，通过使用例如用于第一轮选择的第一类细胞诸如例如CHO和例如用于第二轮选择的第二类细胞诸如例如COS-7细胞的细胞膜制剂从VHH序列或纳米抗体序列的(幼稚或免疫)库中选择来实现，或通过使用例如用于第一轮选择的第一类细胞诸如例如CHO和例如用于第二轮选择的第二类细胞诸如例如COS-7细胞的细胞膜制剂由编码VHH序列或纳米抗体序列的核苷酸序列(幼稚或免疫)文库中选择来实现；其都可以以本身已知的方式进行；和任选地
c.用缓冲液诸如无去污剂的PBS仅适度洗涤；且该方法可以任选地进一步包括一个或多个本身已知的其他合适步骤，诸如，例如且不限于，亲和力成熟的步骤，表达所需氨基酸序列的步骤，筛选针对所需抗原(在该情形中，GPCR)结合和/或针对所需抗原(在该情形中，跨膜蛋白)的活性的步骤，确定所需氨基酸序列或核苷酸序列的步骤，引入一个或多个人源化取代(例如如本文中进一步所述)的步骤，以合适的多价和/或多特异性形式格式化的步骤，筛选所需生物学和/或生理学性质(即利用合适的测定，诸如本文中所述的那些)的步骤；和/或一个或多个所述步骤，以任何合适顺序的任何合适组合。
在该方面所述的方法中，所述细胞的集合或样品可以是，例如，B细胞的集合或样品。
此外，在该方法中，细胞样品可以来源于已经用GPCR适当免疫的、或用基于其或来源于其的适当的抗原决定簇(诸如其抗原部分、片段、区域、结构域、环或其它表位)适当免疫的骆驼科动物。在一个特别的方面中，所述抗原决定簇可以是胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他胞外表位。
上述方法可以以任何适当的方式进行，这对于专业技术人员将是清楚的。例如，参考EP0542810，WO05/19824，WO04/051268和WO04/106377。步骤b)的筛选优选地使用流式细胞术技术诸如FACS进行。对于此，例如，参考Lieby等，血液(Blood)，卷97，No.12，3820。特别参考在埃博灵克斯股份有限公司(AblynxN.V.)的国际申请WO06/079372中记述的所谓的“纳米抗体TM”技术。
在另一个方面中，所述用于产生针对GPCR的氨基酸序列的方法可以包括至少下列步骤：
a)提供编码重链抗体或纳米抗体序列的核酸序列的组、集合或文库；
b)从所述核酸序列的组、集合或文库中筛选编码可以结合和/或具有针对GPCR的亲和性的重链抗体或纳米抗体序列的核酸序列；
和
c)分离所述核酸序列，然后分别表达存在于所述重链抗体中的VHH序列、或表达所述纳米抗体序列。
在这样的方法中，所述编码重链抗体或纳米抗体序列的核酸序列的组、集合或文库可以是，例如，编码重链抗体或VHH序列的首次用于实验的组、集合或文库的核酸序列的组、集合或文库；编码纳米抗体序列的合成的或半合成的组、集合或文库的核酸序列的组、集合或文库；和/或编码已经进行了亲和力成熟的纳米抗体序列的组、集合或文库的核酸序列的组、集合或文库。
在该方法的优选方面中，所述氨基酸序列的组、集合或文库可以是编码重链抗体或VHH序列的核酸序列的免疫的组、集合或文库，所述核酸序列来源于已经用GPCR适当免疫的、或用基于其或来源于其的适当的抗原决定簇(诸如其抗原部分、片段、区域、结构域、环或其它表位)适当免疫的骆驼科动物。在一个特别的方面中，所述抗原决定簇可以是细胞外部分、区域、结构域、环或其它细胞外表位。
在上述方法中，所述核苷酸序列的组、集合或文库可以被展示在噬菌体、噬菌粒、核糖体或适当的微生物(诸如酵母)上，如以促进筛选。用于展示和筛选编码氨基酸序列的核苷酸序列(的组、集合或文库)的适当的方法、技术和宿主生物体对于本领域专业技术人员将是清楚的，例如，基于本文进一步的公开内容。还参考WO03/054016和Hoogenboom在自然生物技术(NatureBiotechnology)，23，9，1105-1116(2005)中的综述。
专业技术人员应该清楚，本文所述的方法的筛选步骤也可以作为选择步骤进行。因此，术语“筛选”在用于本说明书时，可以包括选择、筛选或选择和/或筛选技术的任何适当的组合。此外，当使用序列的组、集合或文库时，它可以包含任何适当数量的序列，如1，2，3或约5，10，50，100，500，1000，5000，104，105，106，107，108或更多序列。
此外，上述氨基酸序列的组、集合或文库中的一个或多个或全部序列可以通过理性的、或半经验的方法如计算机建模技术或生物统计学或数据采掘(datamining)技术获得或定义。
此外，这样的组、集合或文库可以包括作为来自彼此的变体(例如，具有设计的点突变或具有随机的位置)的一个、两个或多个序列，包括来源于不同的天然多样性序列的组(例如，免疫文库)的多个序列，或不同序列的任何其他来源(例如，如在Hoogenboom等，NatBiotechnol(自然生物技术)23：1105，2005和Binz等，NatBiotechnol(自然生物技术)2005，23：1247中所述)。所述序列的组、集合或文库可以展示在噬菌体颗粒、核糖体、细菌、酵母细胞、哺乳动物细胞的表面上，且在这些载体内与编码所述氨基酸序列的核苷酸序列连接。这使得所述组、集合或文库易于进行选择步骤，从而分离需要的本发明的氨基酸序列。更一般地，当将序列展示在适当的宿主或宿主细胞上时，还可以(且习惯上)首先从所述宿主或宿主细胞分离编码所需要的序列的核苷酸序列，然后通过在适当的宿主生物体内适当表达所述核苷酸序列而获得所需要的序列。同样地，这可以以本身已知的任何适当的方式进行，其是专业技术人员应该清楚的。
用于获得针对GPCR的VHH序列或纳米抗体序列的另一种技术包括适当地免疫能够表达重链抗体的转基因哺乳动物(即，以产生针对GPCR的免疫应答和/或重链抗体)，从所述转基因哺乳动物获得包含所述VHH序列或纳米抗体序列(的编码核酸序列)的适当的生物样品(如血液样品、血清样品或B-细胞样品)，然后使用本身已知的任何适当的技术(如例如本文所述的任何方法或杂交瘤技术)由所述样品起始产生针对GPCR的VHH序列。例如，为了该目的，可以使用记述在WO02/085945，WO04/049794和WO06/008548和Janssens等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(美国国家科学院学报)2006年10月10日；103(41)：15130-5中的表达重链抗体的小鼠和其他方法和技术。例如，所述表达重链抗体的小鼠可以表达具有任何适当的(单)可变结构域、如来源于天然来源的(单)可变结构域(例如，人(单)可变结构域、骆驼科(单)可变结构域或鲨鱼(单)可变结构域)、以及例如合成的或半合成的(单)可变结构域的重链抗体。
本发明还涉及通过上述方法、或备选地通过包括上述方法之一和另外至少下列步骤的方法获得的VHH序列或纳米抗体序列，所述步骤为：确定所述VHH序列或纳米抗体序列的核苷酸序列或氨基酸序列；和以本身已知的方式，如通过在适当的宿主细胞或宿主生物体内表达或通过化学合成，表达或合成所述VHH序列或纳米抗体序列。
如本文提及，本发明纳米抗体的一种特别优选的种类包括具有与天然存在的VHH结构域的氨基酸序列相对应的但是已被“人源化”的氨基酸序列的纳米抗体，“人源化”即，用在来自于人类的常规4-链抗体的VH结构域中对应位置存在的一个或多个氨基酸残基替换所述天然存在的VHH序列的氨基酸序列中(并且特别是在构架序列中的)的一个或多个氨基酸残基(例如上文所示)。这可以以本身已知的方式进行，这对于专业技术人员是清楚的，例如，基于本文的进一步描述以及本文引用的关于人源化的现有技术。此外，应该注意，本发明这样的人源化纳米抗体可以以本身已知的任何适当方法获得(即，在上文(1)-(8)点下所示)，并且因此没有严格地限于使用包括天然存在的VHH结构域的多肽作为起始原料而获得的多肽。
本发明纳米抗体的另一种特别优选的种类包括具有与天然存在的VH结构域的氨基酸序列相对应但已被“骆驼源化”的氨基酸序列的纳米抗体，“骆驼源化”即，用在重链抗体的VHH结构域中对应位置存在的一个或多个氨基酸残基替换常规4-链抗体的天然存在的VH结构域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基。这可以以本身已知的方式进行，这对于专业技术人员是清楚的，例如，基于本文的进一步描述。这样的“骆驼源化”取代优选插入在形成和/或存在于VH-VL界面的氨基酸位置，和/或在所谓的骆驼科动物(Camelidae)标志残基，如本文所定义(参见例如WO94/04678和Davies与Riechmann(1994和1996)，同前所述)。优选地，用作产生或设计所述骆驼源化纳米抗体的起始原料或起点的VH序列优选地是来自哺乳动物的VH序列，更优选地是人类的VH序列，诸如VH3序列。然而，应该注意，这种骆驼源化的本发明纳米抗体可以以本身已知的任何适当方式获得(即，在上文(1)-(8)点下所示)，并且因此没有严格地限于使用包括天然存在的VH结构域的多肽作为起始原料而获得的氨基酸序列。
例如，又如本文进一步所述，“人源化”和“骆驼源化”可以这样进行：通过提供分别编码天然存在的VHH结构域或VH结构域的核苷酸序列，并且然后以本身已知的方式改变所述核苷酸序列中的一个或多个密码子，以致新核苷酸序列分别编码“人源化的”或“骆驼源化的”本发明的纳米抗体。然后以本身已知的方式表达这种核酸，以提供理想的本发明的纳米抗体。备选地，分别基于天然存在的VHH结构域或VH结构域的氨基酸序列，可以分别设计理想的人源化或骆驼源化的本发明的纳米抗体的氨基酸序列，然后应用本身已知的肽合成技术从头开始合成。此外，分别基于天然存在的VHH结构域或VH结构域的氨基酸序列或核苷酸序列，可以分别设计编码所述理想的人源化或骆驼源化的本发明的纳米抗体的核苷酸序列，然后应用本身已知的核酸合成技术从头开始合成，之后可以以本身上已知的方式表达这样获得的核酸，以提供合乎需要的本发明的纳米抗体。
专业技术人员应该清楚从天然存在的VH序列或优选的VHH序列起始而获得本发明的纳米抗体和/或编码其的核酸的其它适宜方法和技术，并且例如，可以包括以适当方式组合一个或多个天然存在的VH序列的一个或多个部分(诸如一个或多个FR序列和/或CDR序列)，一个或多个天然存在的VHH序列的一个或多个部分(诸如一个或多个FR序列或CDR序列)，和/或一个或多个合成的或半合成的序列，以提供本发明的纳米抗体或编码其的核苷酸序列或核酸(然后其可以被适当地表达)。基于本文的公开内容和/或本文引用的其他现有技术(和/或备选地可以通过由使用本文所述的方法获得的核苷酸序列起始的PCR获得)，编码VHH序列或纳米抗体的构架序列的核苷酸序列为专业技术人员所清楚，且可以适当地与编码需要的CDR’s的核苷酸序列(例如，通过利用重叠引物的PCR装配)组合，以提供编码本发明的纳米抗体的核酸。
如本文提及，纳米抗体可以特别特征在于在一个或多个构架序列中存在一个或多个“标志残基(Hallmarkresidues)”(如本文所述)。
因此，根据本发明一个优选的但非限制性的方面，纳米抗体在其最广泛意义上通常可以定义为这样的多肽，所述多肽包括：
a)包含被3个互补性决定区/序列中断的4个构架区/序列的氨基酸序列，其中在按照Kabat编号方式的位置108的氨基酸残基是Q；
和/或：
b)包含被3个互补性决定区/序列中断的4个构架区/序列的氨基酸序列，其中按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基是带电荷的氨基酸(如本文所定义)或半胱氨酸残基，并且在位置44的氨基酸残基优选是E；
和/或：
c)包含被3个互补性决定区/序列中断的4个构架区/序列的氨基酸序列，其中按照Kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由P、R和S组成的组，并且特别选自由R和S组成的组。
因此，在第一优选的但非限制性的方面，本发明的纳米抗体可以具有下述结构
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补性决定区1-3，并且其中
a)按照Kabat编号方式在位置108的氨基酸残基是Q；
和/或其中：
b)按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基是带电荷的氨基酸或半胱氨酸，并且按照Kabat编号方式在位置44的氨基酸残基优选是E；
和/或其中：
c)按照Kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由P、R和S组成的组，并且特别选自由R和S组成的组；
并且其中：
d)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，并且优选地如根据本发明的一个优选方面而定义，并且更优选地如根据本发明的一个更优选的方面而定义。
特别地，纳米抗体在其最广泛意义上可以通常定义为这样的多肽，所述多肽包括：
a)包括被3个互补性决定区/序列中断的4个构架区/序列的氨基酸序列，其中按照Kabat编号方式在位置108的氨基酸残基是Q；
和/或：
b)包括被3个互补性决定区/序列中断的4个构架区/序列的氨基酸序列，其中按照Kabat编号方式在位置44的氨基酸残基是E，并且其中按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基是R；
和/或：
c)包括被3个互补性决定区/序列中断的4个构架区/序列的氨基酸序列，其中按照Kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由P，R和S组成的组，并且特别是选自由R和S组成的组。
因此，根据一个优选的但非限制性的方面，本发明的纳米抗体可以具有下述结构
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补性决定区1-3，并且其中
a)按照Kabat编号方式在位置108的氨基酸残基是Q；
和/或其中：
b)按照Kabat编号方式在位置44的氨基酸残基是E，并且其中按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基是R；
和/或其中：
c)按照Kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由P、R和S组成的组，并且特别选自由R和S组成的组；
并且其中：
d)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，并且优选地如根据本发明的一个优选方面而定义，并且更优选地如根据本发明的一个更优选的方面而定义。
特别地，根据本发明针对GPCR的纳米抗体可以具有下述结构：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补性决定区1-3，并且其中
a)按照Kabat编号方式在位置108的氨基酸残基是Q；
和/或其中：
b)按照Kabat编号方式在位置44的氨基酸残基是E，并且其中按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基是R；
和/或其中：
c)按照Kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由P、R和S组成的组，并且特别选自由R和S组成的组；
并且其中：
d)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，并且优选地如根据本发明的一个优选方面而定义，并且更优选地如根据本发明的一个更优选的方面而定义。
特别地，根据本发明方面的一个优选的但非限制性的方面，纳米抗体通常可以定义为包括包含被3个互补性决定区/序列中断的4个构架区/序列的氨基酸序列的多肽，其中：
a-1)按照Kabat编号方式在位置44的氨基酸残基选自由A，G，E，D，G，Q，R，S，L组成的组；并且优选地选自由G，E或Q组成的组；和
a-2)按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基选自由L，R或C组成的组；并且优选地选自由L或R组成的组；和
a-3)按照Kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由W，R或S组成的组；并且优选地是W或R，并且最优选地为W；
a-4)按照Kabat编号方式在位置108的氨基酸残基是Q；
或者其中：
b-1)按照Kabat编号方式在位置44的氨基酸残基选自由E和Q组成的组；和
b-2)按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基是R；和
b-3)按照Kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由W，R和S组成的组；并且优选地为W；
b-4)按照Kabat编号方式在位置108的氨基酸残基选自由Q和L组成的组；并且优选地为Q；
或者其中：
c-1)按照Kabat编号方式在位置44的氨基酸残基选自由A，G，E，D，Q，R，S，和L组成的组；并且优选地选自由G，E和Q组成的组；和
c-2)按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基选自由L，R和C组成的组；并且优选地选自由L和R组成的组；和
c-3)按照Kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由P，R和S组成的组；并且特别选自由R和S组成的组；和
c-4)按照Kabat编号方式在位置108的氨基酸残基选自由Q和L组成的组；优选地为Q；
并且其中
d)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，并且优选地如根据本发明的一个优选方面而定义，并且更优选地如根据本发明的一个更优选的方面而定义。
因此，在另一个优选而非限制性的方面中，本发明的纳米抗体可以具有下述结构：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补性决定区1-3，并且其中：
a-1)按照Kabat编号方式在位置44的氨基酸残基选自由A，G，E，D，G，Q，R，S，L组成的组；并且优选地选自由G，E或Q组成的组；
并且其中：
a-2)按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基选自由L，R或C组成的组；
并且优选地选自由L或R组成的组；
并且其中：
a-3)按照Kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由W，R或S组成的组；并且优选地选自由W或R组成的组，并且最优选地为W；
并且其中：
a-4)按照Kabat编号方式在位置108的氨基酸残基是Q；
并且其中：
d)CDR1，CDR2和CDR3如本发明所定义，并且优选地如根据本发明的一个优选方面而定义，并且更优选地如根据本发明的一个更优选的方面而定义。
在另一个优选而非限制性的方面，本发明的纳米抗体可以具有下述结构：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补性决定区1-3，并且其中：
b-1)按照Kabat编号方式在位置44的氨基酸残基选自由E和Q组成的组；并且其中：
b-2)按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基是R；
并且其中：
b-3)按照Kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由W，R和S组成的组；并且优选地为W；
并且其中：
b-4)按照Kabat编号方式在位置108的氨基酸残基选自由Q和L组成的组；
并且优选地为Q；
并且其中：
d)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，并且优选地如根据本发明的一个优选方面而定义，并且更优选地如根据本发明的一个更优选的方面而定义。
在另一个优选的但非限制性方面中，本发明的纳米抗体可以具有下述结构
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补性决定区1-3，并且其中：
c-1)按照Kabat编号方式在位置44的氨基酸残基选自由A，G，E，D，Q，R，S，和L组成的组；并且优选地选自由G，E和Q组成的组；
并且其中：
c-2)按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基选自由L，R和C组成的组；并且优选地选自由L和R组成的组；
并且其中：
c-3)按照Kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由P，R和S组成的组；并且特别选自由R和S组成的组；
并且其中：
c-4)按照Kabat编号方式在位置108的氨基酸残基选自由Q和L组成的组；优选地为Q；
并且其中：
d)CDR1，CDR2和CDR3如本发明所定义，并且优选地如根据本发明的一个优选方面而定义，并且更优选地如根据本发明的一个更优选的方面而定义。
本发明纳米抗体的两个特别优选的但非限制性的组是按照上述a)；按照上述(a-1)到(a-4)；按照上述b)；按照上述(b-1)到(b-4)；按照上述(c)；和/或按照上述(c-1)到(c-4)的那些，其中：
i)按照Kabat编号方式在位置44-47的氨基酸残基形成序列GLEW(或如本文所述的GLEW-样序列)，并且在位置108的氨基酸残基是Q；
或其中：
ii)按照Kabat编号方式在位置43-46的氨基酸残基形成序列KERE或KQRE(或如本文所述的KERE-样序列)，并且在位置108的氨基酸残基是Q或L，并且优选地为Q。
因此，在另一个优选的但非限制性方面，本发明的纳米抗体可以具有下述结构
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补性决定区1-3，并且其中：
i)按照Kabat编号方式在位置44-47的氨基酸残基形成序列GLEW(或如本发明定义的GLEW-样序列)，并且在位置108的氨基酸残基是Q；
并且其中：
ii)CDR1，CDR2和CDR3如本发明所定义，并且优选地如根据本发明的一个优选方面而定义，并且更优选地如根据本发明的一个更优选的方面而定义。
在另一个优选而非限制性的方面，本发明的纳米抗体可以具有下述结构：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补性决定区1-3，并且其中：
i)按照Kabat编号方式在位置43-46的氨基酸残基形成序列KERE或KQRE(或KERE-样序列)，并且在位置108的氨基酸残基是Q或L，并且优选是Q；
并且其中：
ii)CDR1，CDR2和CDR3如本发明所定义，并且优选地如根据本发明的一个优选方面而定义，并且更优选地如根据本发明的一个更优选的方面而定义。
在其中按照Kabat编号方式在位置43-46的氨基酸残基形成序列KERE或KQRE的本发明的纳米抗体中，在位置37的氨基酸残基最优选是F。在其中按照Kabat编号方式在位置44-47的氨基酸残基形成序列GLEW的本发明的纳米抗体中，在位置37的氨基酸残基选自由Y，H，I，L，V或F组成的组，并且最优选是V。
因此，但不以任何方式局限于此，基于在上述位置存在的氨基酸残基，本发明的纳米抗体可以通常基于下述三组分类：
i)“GLEW-组”：按照Kabat编号方式在位置44-47具有氨基酸序列GLEW并且按照Kabat编号方式在位置108具有Q的纳米抗体。如本文进一步所述，在这一组内的纳米抗体通常在位置37具有V，并且可以在位置103具有W，P，R或S，并且优选地在位置103具有W。所述GLEW组还包括一些GLEW-样的序列，诸如下表A-3中提及的那些；
ii)“KERE-组”：按照Kabat编号方式在位置43-46具有氨基酸序列KERE或KQRE(或另一个KERE-样序列)并且按照Kabat编号方式在位置108具有Q或L的纳米抗体。如本文进一步所述，在这一组内的纳米抗体通常在位置37具有F，在位置47具有L或F；并且可以在位置103具有W，P，R或S，并且优选地在位置103具有W；
iii)“103P，R，S-组”：在位置103具有P，R或S的纳米抗体。这些纳米抗体可以在按照Kabat编号方式的位置44-47具有氨基酸序列GLEW或者在按照Kabat编号方式的位置43-46具有氨基酸序列KERE或KQRE，后者最优选地与位置37的F和位置47的L或F结合(如关于KERE-组所定义)；并且可以在按照Kabat编号方式的位置108具有Q或L，并且优选地具有Q。
此外，在适当的情形中，纳米抗体可以属于这些种类的两种或更多种(即，具有其特征)。例如，一个特别优选的纳米抗体组在位置44-47具有GLEW或GLEW-样序列；在位置103具有P，R或S(并且特别是R)；并且在位置108具有Q(其可以人源化为L)。
更一般地，应该注意，上述定义描述和应用于以天然(即，非人源化的)VHH序列的形式存在的纳米抗体，且这些纳米抗体的人源化的变体可以包含除了上述显示的那些(即，如本文定义的一个或多个人源化的取代)之外的其他氨基酸残基。例如，且不限于，在GLEW-组或103P，R，S-组的一些人源化的纳米抗体中，在位置108的Q可以被人源化为108L。如本文已经提及的，基于本文的公开内容，其他人源化的取代(及其适当的组合)将为专业技术人员所清楚。另外，或备选地，其他潜在有用的人源化取代可以通过将天然存在的VHH序列的构架区序列与一个或多个紧密相关的人VH序列的相对应的构架序列进行比较而确定，之后，可以将由此确定的一个或多个潜在有用的人源化取代(或其组合)引入到所述VHH序列中(以本身已知的任何方式，如本文进一步所述)，且由此人源化的VHH序列可以检测针对靶标的亲和力、稳定性、表达的容易性和水平、和/或其他需要的特性。以这种方式，通过有效程度的试验和误差，其他适当的人源化取代(或其适当的组合)可以由专业技术人员基于本文的公开内容确定。此外，基于前述，纳米抗体(的构架区)可以被部分人源化或完全人源化。
因此，在另一个优选的但非限制性的方面，本发明的纳米抗体可以是属于GLEW-组(如本文所定义)的纳米抗体，并且其中CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，并且优选地如根据本发明的一个优选方面而定义，并且更优选地如按照本文的一个更优选的方面而定义。
在另一个优选的但非限制性的方面，本发明的纳米抗体可以是属于KERE-组(如本文所定义)的纳米抗体，并且CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，并且优选地如根据本发明的一个优选方面而定义，并且更优选地如根据本发明的一个更优选的方面而定义。
因此，在另一个优选的但非限制性的方面，本发明的纳米抗体可以是属于103P，R，S-组(如本发明所定义)的纳米抗体，并且其中CDR1，CDR2和CDR3如本发明所定义，并且优选地如根据本发明的一个优选方面而定义，并且更优选地如根据本发明的一个更优选的方面而定义。
此外，更一般地，并且除了上文提及的108Q，43E/44R和103P，R，S残基之外，本发明的纳米抗体可以在常规VH结构域中形成(部分)VH/VL界面的一个或多个位置包含一个或多个氨基酸残基，所述氨基酸残基比在相对应的天然存在的VH序列同一位置天然存在的氨基酸残基更加高度带电荷，并且特别是一个或多个带电荷的氨基酸残基(如表A-2中提及)。这样的取代包括，但不限于下表A-3中提及的GLEW-样序列；以及国际申请WO00/29004中所述关于所谓的“微体(microbodies)”的取代，例如以获得在位置108具有Q和在位置44-47具有KLEW组合的纳米抗体。基于本发明的公开内容，在这些位置的其它可能的取代对于专业技术人员应该是清楚的。
在本发明的纳米抗体的一个方面中，在位置83的氨基酸残基选自由L，M，S，V和W组成的组；并且优选地为L。
此外，在本发明的纳米抗体的一个方面中，位置83的氨基酸残基选自由R，K，N，E，G，I，T和Q组成的组；并且最优选地为K或E(对于与天然存在的VHH结构域相对应的纳米抗体)或R(对于“人源化”纳米抗体，如本发明所述)。在一个方面中，位置84的氨基酸残基选自由P，A，R，S，DT，和V组成的组，并且最优选地是P(对于与天然存在的VHH结构域相对应的纳米抗体)或R(对于“人源化”纳米抗体，如本发明所述)。
此外，在本发明的纳米抗体的一个方面中，位置104的氨基酸残基选自由G和D组成的组；并且最优选地是G。
总而言之，在所述纳米抗体中如上文提及的在位置11，37，44，45，47，83，84，103，104和108的氨基酸残基在本文中还叫作“标志残基”。所述标志残基以及在最接近的相关的人VH结构域，即VH3的相对应的位置的氨基酸残基总结在表A-3中。
在天然存在的VHH结构域中存在的这些标志残基的一些特别优选但非限制性的组合在表A-4中提及。为了比较，将叫作DP-47的人VH3的相对应氨基酸残基以斜体显示。
表A-3：纳米抗体中的标志残基
在所述纳米抗体中，在除所述标志残基外的任何其它位置的每一氨基酸残基可以是在天然存在的VHH结构域的相应位置(按照Kabat编号方式)天然存在的任何氨基酸残基。
专业技术人员对于这样的氨基酸残基应该是清楚的。表A-5至A-8提及一些非限制性的残基，其可以存在于天然存在的VHH结构域的FR1、FR2、FR3和FR4的每一位置(按照Kabat编号方式)。对于每一位置，在天然存在的VHH结构域的每一位置最经常存在的氨基酸残基(并且其在纳米抗体中对于所述位置是最优选的氨基酸残基)以粗体显示；并且对于每一位置的其它优选的氨基酸残基已加下划线(注意：在天然存在的VHH结构域的位置26-30发现的氨基酸残基的数目支持Chothia(同前所述)的构成编号方式的基础的假说，即，在这些位置的残基已经形成CDR1的部分。)
在表A-5～A-8中，还已经提及可以在人VH3结构域的每一位置存在的一些非限制性的残基。此外，对于每一位置，在天然存在的人VH3结构域的每一位置最经常存在的氨基酸残基以粗体显示；并且其它优选的氨基酸残基加下划线。
仅是为了参考，表A-5-A-8还包含对于代表性样品1118VHH序列关于在每个氨基酸位置的VHH熵(“VHHEnt.”)和VHH可变性(“VHHVar.”)的数据(数据由乌得勒支大学(UtrechtUniversity)的DavidLutjeHulsing和TheoVerrips教授馈赠)。关于VHH熵和VHH可变性的数值提供对于被分析的1118个VHH序列之间的氨基酸残基的可变性和保守度的测量：低数值(即＜1，诸如＜0.5)表示在所述VHH序列之间氨基酸残基是高度保守的(即，几乎没有可变性)。例如，在位置8的G和在位置9的G分别具有0.1和0的VHH熵数值，这表示这些残基是高度保守的，并且具有很小的可变性(并且假设在所分析的所有1118个序列中位置9是G)，而对于形成CDR部分的残基通常发现1.5或更大的数值(数据未显示)。注意：(1)在表A-5～A-8第二栏列出的氨基酸残基是基于比最后两栏引用的为确定VHH熵和VHH可变性而分析的1118个VHH序列大的样品；并且(2)下述数据支持这样的假说：在位置27-30的氨基酸残基以及还可能甚至在位置93和94的氨基酸残基已经形成CDR的一部分(尽管本发明不限于任何具体的假说或解释，并且如上文所提及，本发明使用按照Kabat的编号方式)。对于序列熵的一般解释，序列可变性以及用于确定其的方法，参见Oliveira等，蛋白质：结构，功能和遗传(PROTEINS：Structure，FunctionandGenetics)，52：544-552(2003)。
表A-5：FR1中的氨基酸残基的非限制性实例(关于脚注，参见表A-3的脚注)
表A-5：FR1中的氨基酸残基的非限制性实例(续表)
表A-6：FR2中的氨基酸残基的非限制性实例(关于脚注，参见表A-3的脚注)
表A-7：FR3中的氨基酸残基的非限制性实例(关于脚注，参见表A-3的脚注)
表A-7：FR3中的氨基酸残基的非限制性实例(续表)
表A-8：FR4中的氨基酸残基的非限制性实例(关于脚注，参见表A-3的脚注)
因此，在另一个优选的但非限制性的方面中，本发明的纳米抗体可以定义为具有下述(通用)结构的氨基酸序列
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补性决定区1-3，并且其中：
i)在按照Kabat编号的位置11，37，44，45，47，83，84，103，104和108的一个或多个氨基酸残基选自表A-3中提及的标志残基；
并且其中：
ii)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，并且优选地如根据本发明的一个优选方面而定义，并且更优选地如本发明的一个更优选的方面而定义。
例如，上述纳米抗体可以是VHH序列或可以是人源化的纳米抗体。当上述纳米抗体序列为VHH序列时，它们可以被适当地人源化，如本文进一步所述。当所述纳米抗体是部分人源化的纳米抗体时，它们可以任选地被进一步适当地人源化，同样如本文所述。
特别地，本发明的纳米抗体可以是具有下述(通用)结构的氨基酸序列：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补性决定区1-3，并且其中：
i)(优选地)在按照Kabat编号的位置11，37，44，45，47，83，84，103，104和108的氨基酸残基的一个或多个选自下表A-3中提及的标志残基(应该理解，VHH序列应该包含一个或多个标志残基；并且部分人源化的纳米抗体应该通常，且优选地，[仍然]包含一个或多个标志残基[尽管依据本发明在适当的情形中提供部分人源化的纳米抗体也在本发明的范围内，在所述部分人源化的纳米抗体中，所有的标志残基，而不是一个或多个其余氨基酸残基，已经被人源化]；并且在完全人源化的纳米抗体中，依据本发明在适当的情形中，所有在标志残基位置上的氨基酸残基应该是在人VH3序列中存在的氨基酸残基。基于本发明公开的内容，专业技术人员应该清楚，所述VHH序列、所述具有至少一个标志残基的部分人源化的纳米抗体、所述不具有标志残基的部分人源化的纳米抗体、和所述完全人源化的纳米抗体均形成本发明的方面)；并且其中：
ii)所述氨基酸序列与SEQIDNO’s：1-22中的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性，其中为了确定氨基酸同一性的程度的目的，忽略形成CDR序列的氨基酸残基(在序列SEQIDNO’s：1-22中用X表示)；
并且其中
iii)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，并且优选地如按照本文的一个优选方面而定义，并且更优选地如按照本文的一个更优选的方面而定义。
例如，上述纳米抗体可以是VHH序列或可以是人源化的纳米抗体。当上述纳米抗体序列为VHH序列时，它们可以被适当地人源化，如本文进一步所述。当所述纳米抗体是部分人源化的纳米抗体时，它们可以任选地被进一步适当地人源化，同样如本文所述。
特别地，本发明KERE-组的纳米抗体可以是具有下述(通用)结构的氨基酸序列：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中：
i)按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基是带电荷的氨基酸(如本文定义)或半胱氨酸残基，且位置44优选地是E；
且其中：
ii)FR1是与下述氨基酸序列中的至少之一具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列：
表A-10：KERE-组纳米抗体的代表性FW1序列。
KERE FW1序列号1 SEQ ID NO：23 QVQRVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTSS
KERE FW1序列号2 SEQ ID NO：24 QVQLVESGGGLVQTGDSLSLSCSASGRTFS
KERE FW1序列号3 SEQ ID NO：25 QVKLEESGGGLVQAGDSLRLSCAATGRAFG
KERE FW1序列号4 SEQ ID NO：26 AVQLVESGGGLVQPGESLGLSCVASGRDFV
KERE FW1序列号5 SEQ ID NO：27 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCEVLGRTAG
KERE FW1序列号6 SEQ ID NO：28 QVQLVESGGGWVQPGGSLRLSCAASETILS
KERE FW1序列号7 SEQ ID NO：29 QVQLVESGGGTVQPGGSLNLSCVASGNTFN
KERE FW1序列号8 SEQ ID NO：30 EVQLVESGGGLAQPGGSLQLSCSAPGFTLD
KERE FW1序列号9 SEQ ID NO：31 AQELEESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFN
且其中：
iii)FR2是与下述氨基酸序列中的至少之一具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列：
表A-11：KERE-组纳米抗体的代表性FW2序列。
KERE FW2序列号1 SEQ ID NO：41 WFRQAPGKEREFVA
KERE FW2序列号2 SEQ ID NO：42 WFRQTPGREREFVA
KERE FW2序列号3 SEQ ID NO：43 WYRQAPGKQREMVA
KERE FW2序列号4 SEQ ID NO：44 WYRQGPGKQRELVA
KERE FW2序列号5 SEQ ID NO：45 WIRQAPGKEREGVS
KERE FW2序列号6 SEQ ID NO：46 WFREAPGKEREGIS
KERE FW2序列号7 SEQ ID NO：47 WYRQAPGKERDLVA
KERE FW2序列号8 SEQ ID NO：48 WFRQAPGKQREEVS
KERE FW2序列号9 SEQ ID NO：49 WFRQPPGKVREFVG
且其中：
iv)FR3是与下述氨基酸序列中的至少之一具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列：
表A-12：KERE-组纳米抗体的代表性FW3序列。
KERE FW3序列号1 SEQ ID NO：50 RFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYRCYF
KERE FW3序列号2 SEQ ID NO：51 RFAISRDNNKNTGYLQMNSLEPEDTAVYYCAA
KERE FW3序列号3 SEQ ID NO：52 RFTVARNNAKNTVNLEMNSLKPEDTAVYYCAA
KERE FW3序列号4 SEQ ID NO：53 RFTISRDIAKNTVDLLMNN LEPEDTAVYYCAA
KERE FW3序列号5 SEQ ID NO：54 RLTISRDNAVDTMYLQMNSLKPEDTAVYYCAA
KERE FW3序列号6 SEQ ID NO：55 RFTISRDNAKNTVYLQMDNVKPEDTAIYYCAA
KERE FW3序列号7 SEQ ID NO：56 RFTISKDSGKNTVYLQMTSLKPEDTAVYYCAT
KERE FW3序列号8 SEQ ID NO：57 RFTISRDSAKNMMYLQMNNLKPQDTAVYYCAA
KERE FW3序列号9 SEQ ID NO：58 RFTISRENDKSTVYLQLNSLKPEDTAVYYCAA
KERE FW3序列号10 SEQ ID NO：59 RFTISRDYAGNTAYLQMNSLKPEDTGVYYCAT
且其中：
v)FR4是与下述氨基酸序列中的至少之一具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列：
表A-13：KERE-组纳米抗体的代表性FW4序列。
KERE FW4序列号1 SEQ ID NO：60 WGQGTQVTVSS
KERE FW4序列号2 SEQ ID NO：61 WGKGTLVTVSS
KERE FW4序列号3 SEQ ID NO：62 RGQGTRVTVSS
KERE FW4序列号4 SEQ ID NO：63 WGLGTQVTISS
且其中：
vi)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，并且优选地如根据本发明的一个优选方面而定义，并且更优选地如根据本发明的一个更优选的方面而定义。
在上述纳米抗体中，一个或多个其他标志残基优选地如本文所述(例如，当它们为VHH序列或部分人源化的纳米抗体时。)
此外，上述纳米抗体可以，例如，是VHH序列或可以是人源化的纳米抗体。当上述纳米抗体序列为VHH序列时，它们可以被适当地人源化，如本文进一步所述。当所述纳米抗体是部分人源化的纳米抗体时，它们可以任选地被进一步适当地人源化，同样如本文所述。
关于构架1，专业技术人员应该清楚，当上述氨基酸序列通过表达核苷酸序列而产生时，前4个氨基酸序列(即，按照Kabat编号方式的氨基酸残基1-4)可以通常通过已经用来生成所述核酸的引物来确定。因此，为了确定氨基酸同一性的程度，优选忽略前4个氨基酸残基。
此外，关于构架1，且尽管按照Kabat编号方式的氨基酸位置27-30被认为是构架区的一部分(且不是CDR’s)，通过分析多于1000个VHH序列的数据库已经发现，位置27-30具有比在位置1-26的可变性高得多的可变性(以VHH熵和VHH可变性表示----参见表A-5至A-8)。因为此，为了确定氨基酸同一性的程度，优选地也忽略在位置27-30的氨基酸残基。
考虑到此，KERE种类的纳米抗体可以是包括由3个互补性决定区/序列中断的4个构架区/序列的氨基酸序列，其中：
i)按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基是带电荷的氨基酸(如本文定义)或半胱氨酸残基，且位置44优选地是E；
且其中：
ii)FR1是这样的氨基酸序列，其在按照Kabat编号方式的位置5-26与下述氨基酸序列中的至少之一具有至少80％的氨基酸同一性：
表A-14：KERE-组纳米抗体的代表性FW1序列(氨基酸残基5-26)。
KERE FW1序列号10 SEQ ID NO：32 VESGGGLVQPGGSLRLSCAASG
KERE FW1序列号11 SEQ ID NO：33 VDSGGGLVQAGDSLKLSCALTG
KERE FW1序列号12 SEQ ID NO：34 VDSGGGLVQAGDSLRLSCAASG
KERE FW1序列号13 SEQ ID NO：35 VDSGGGLVEAGGSLRLSCQVSE
KERE FW1序列号14 SEQ ID NO：36 QDSGGGSVQAGGSLKLSCAASG
KERE FW1序列号15 SEQ ID NO：37 VQSGGRLVQAGDSLRLSCAASE
KERE FW1序列号16 SEQ ID NO：38 VESGGTLVQSGDSLKLSCASST
KERE FW1序列号17 SEQ ID NO：39 MESGGDSVQSGGSLTLSCVASG
KERE FW1序列号18 SEQ ID NO：40 QASGGGLVQAGGSLRLSCSASV
且其中：
iii)FR2，FR3和FR4如本文关于KERE-种类的纳米抗体的FR2，FR3和FR4所提及的；
且其中：
iv)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，并且优选地如根据本发明的一个优选方面而定义，并且更优选地如根据本发明的一个更优选的方面而定义
上述纳米抗体可以，例如，是VHH序列或可以是人源化的纳米抗体。当上述纳米抗体序列为VHH序列时，它们可以被适当地人源化，如本文进一步所述。当所述纳米抗体是部分人源化的纳米抗体时，它们可以任选地被进一步适当地人源化，同样如本文所述。
GLEW种类的纳米抗体可以是包括由3个互补性决定区/序列中断的4个构架区/序列的氨基酸序列，其中
i)优选地，当所述GLEW-种类的纳米抗体是非人源化的纳米抗体时，在位置108的氨基酸残基是Q；
ii)FR1是与下述氨基酸序列中的至少之一具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列：
表A-15：GLEW-组的纳米抗体的代表性FW1序列
GLEW FW1序列号1 SEQ ID NO：64 QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS
GLEW FW1序列号2 SEQ ID NO：65 EVHLVESGGGLVRPGGSLRLSCAAFGFIFK
GLEW FW1序列号3 SEQ ID NO：66 QVKLEESGGGLAQPGGSLRLSCVASGFTFS
GLEW FW1序列号4 SEQ ID NO：67 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVCVSSGCT
GLEW FW1序列号5 SEQ ID NO：68 EVQLVESGGGLALPGGSLTLSCVFSGSTFS
且其中：
iii)FR2是与下述氨基酸序列中的至少之一具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列：
表A-16：GLEW-组的纳米抗体的代表性FW2序列。
GLEW FW2序列号1 SEQ ID NO：72 WVRQAPGKVLEWVS
GLEW FW2序列号2 SEQ ID NO：73 WVRRPPGKGLEWVS
GLEW FW2序列号3 SEQ ID NO：74 WVRQAPGMGLEWVS
GLEW FW2序列号4 SEQ ID NO：75 WVRQAPGKEPEWVS
GLEW FW2序列号5 SEQ ID NO：76 WVRQAPGKDQEWVS
GLEW FW2序列号6 SEQ ID NO：77 WVRQAPGKAEEWVS
GLEW FW2序列号7 SEQ ID NO：78 WVRQAPGKGLEWVA
GLEW FW2序列号8 SEQ ID NO：79 WVRQAPGRATEWVS
且其中：
iv)FR3是与下述氨基酸序列中的至少之一具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列：
表A-17：GLEW-组的纳米抗体的代表性FW3序列。
GLEW FW3序列号1 SEQ ID NO：80 RFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCVK
GLEW FW3序列号2 SEQ ID NO：81 RFTISRDNARNTLYLQMDSLIPEDTALYYCAR
GLEW FW3序列号3 SEQ ID NO：82 RFTSSRDNAKSTLYLQMNDLKPEDTALYYCAR
GLEW FW3序列号4 SEQ ID NO：83 RFIISRDNAKNTLYLQMNSLGPEDTAMYYCQR
GLEW FW3序列号5 SEQ ID NO：84 RFTASRDNAKNTLYLQMNSLKSEDTARYYCAR
GLEW FW3序列号6 SEQ ID NO：85 RFTISRDNAKNTLYLQMDDLQSEDTAMYYCGR
且其中：
v)FR4是与下述氨基酸序列中的至少之一具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列：
表A-18：GLEW-组的纳米抗体的代表性FW4序列。
GLEW FW4序列号1 SEQ ID NO：86 GSQGTQVTVSS
GLEW FW4序列号2 SEQ ID NO：87 LRGGTQVTVSS
GLEW FW4序列号3 SEQ ID NO：88 RGQGTLVTVSS
GLEW FW4序列号4 SEQ ID NO：89 RSRGIQVTVSS
GLEW FW4序列号5 SEQ ID NO：90 WGKGTQVTVSS
GLEW FW4序列号6 SEQ ID NO：91 WGQGTQVTVSS
且其中：
vi)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，并且优选地如按照本文的一个优选方面而定义，并且更优选地如根据本发明的一个更优选的方面而定义。
在上述纳米抗体中，其他标志残基中的一个或多个优选地如本文所述(例如，当它们为VHH序列或部分人源化的纳米抗体时。)
关于构架1，同样专业技术人员应该清楚，为了确定氨基酸同一性的程度，优选地忽略在位置1-4和27-30的氨基酸残基。
考虑到此，GLEW种类的纳米抗体可以是包括由3个互补性决定区/序列中断的4个构架区/序列的氨基酸序列，其中：
i)优选地，当GLEW-种类的纳米抗体是非人源化的纳米抗体时，在位置108的氨基酸残基为Q；
且其中：
ii)FR1是这样的氨基酸序列，其在按照Kabat编号方式的位置5-26与下述氨基酸序列至少之一具有至少80％的氨基酸同一性：
表A-19：KERE-组的纳米抗体的代表性FW1序列(氨基酸残基5-26)。
GLEW FW1序列号6 SEQ ID NO：69 VESGGGLVQPGGSLRLSCAASG
GLEW FW1序列号7 SEQ ID NO：70 EESGGGLAQPGGSLRLSCVASG
GLEW FW1序列号8 SEQ ID NO：71 VESGGGLALPGGSLTLSCVFSG
且其中：
iii)FR2，FR3和FR4如本文关于GLEW-种类的纳米抗体的FR2，FR3和FR4所提及的；
且其中：
iv)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，并且优选地如根据本发明的一个优选方面而定义，并且更优选地如根据本发明的一个更优选的方面而定义。
例如，上述纳米抗体可以是VHH序列或可以是人源化的纳米抗体。当上述纳米抗体序列为VHH序列时，它们可以被适当地人源化，如本文进一步所述。当所述纳米抗体是部分人源化的纳米抗体时，它们可以任选地被进一步适当地人源化，同样如本文所述。在上述纳米抗体中，其他标志残基中的一个或多个优选地如本文所述(例如，当它们是VHH序列或部分人源化的纳米抗体时)。
P，R，S103种类的纳米抗体可以是包括由3个互补性决定区/序列中断的4个构架区/序列的氨基酸序列，其中：
i)在按照Kabat编号方式的位置103的氨基酸残基不同于W；
且其中：
ii)优选地，在按照Kabat编号方式的位置103的氨基酸残基是P，R或S，且更优选是R；
且其中：
iii)FR1是与下述氨基酸序列中的至少之一具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列：
表A-20：P，R，S103-组的纳米抗体的代表性FW1序列。
P，R，S 103 FW1序列号1 SEQ ID NO：92 AVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFS
P，R，S 103 FW1序列号2 SEQ ID NO：93 QVQLQESGGGMVQPGGSLRLSCAASGFDFG
P，R，S 103 FW1序列号3 SEQ ID NO：94 EVHLVESGGGLVRPGGSLRLSCAAFGFIFK
P，R，S 103 FW1序列号4 SEQ ID NO：95 QVQLAESGGGLVQPGGSLKLSCAASRTIVS
P，R，S 103 FW1序列号5 SEQ ID NO：96 QEHLVESGGGLVDIGGSLRLSCAASERIFS
P，R，S 103 FW1序列号6 SEQ ID NO：97 QVKLEESGGGLAQPGGSLRLSCVASGFTFS
P，R，S 103 FW1序列号7 SEQ ID NO：98 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVCVSSGCT
P，R，S 103 FW1序列号8 SEQ ID NO：99 EVQLVESGGGLALPGGSLTLSCVFSGSTFS
且其中：
iv)FR2是与下述氨基酸序列中的至少之一具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列：
表A-21：P，R，S103-组的纳米抗体的代表性FW2序列。
P，R，S 103 FW2序列号1 SEQ ID NO：102 WFRQAPGKEREFVA
P，R，S 103 FW2序列号2 SEQ ID NO：103 WVRQAPGKVLEWVS
P，R，S 103 FW2序列号3 SEQ ID NO：104 WVRRPPGKGLEWVS
P，R，S 103 FW2序列号4 SEQ ID NO：105 WIRQAPGKEREGVS
P，R，S 103 FW2序列号5 SEQ ID NO：106 WVRQYPGKEPEWVS
P，R，S 103 FW2序列号6 SEQ ID NO：107 WFRQPPGKEH EFVA
P，R，S 103 FW2序列号7 SEQ ID NO：108 WYRQAPGKRTELVA
P，R，S 103 FW2序列号8 SEQ ID NO：109 WLRQAPGQGLEWVS
P，R，S 103 FW2序列号9 SEQ ID NO：110 WLRQTPGKGLEWVG
P，R，S 103 FW2序列号10 SEQ ID NO：111 WVRQAPGKAEEFVS
且其中：
v)FR3是与下述氨基酸序列中的至少之一具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列：
表A-22：P，R，S103-组的纳米抗体的代表性FW3序列。
P，R，S 103 FW3序列号1 SEQ ID NO：112 RFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA
P，R，S 103 FW3序列号2 SEQ ID NO：113 RFTISRDNARNTLYLQMDSLIPEDTALYYCAR
P，R，S 103 FW3序列号3 SEQ ID NO：114 RFTISRDNAKNEMYLQMNNLKTEDTGVYWCGA
P，R，S 103 FW3序列号4 SEQ ID NO：115 RFTISSDSNRNMIYLQMNNLKPEDTAVYYCAA
P，R，S 103 FW3序列号5 SEQ ID NO：116 RFTISRDNAKN MLYLHLNNLKSEDTAVYYCRR
P，R，S 103 FW3序列号6 SEQ ID NO：117 RFTISRDNAKKTVYLRLNSLNPEDTAVYSCNL
P，R，S 103 FW3序列号7 SEQ ID NO：118 RFKISRDNAKKTLYLQMNSLGPEDTAMYYCQR
P，R，S 103 FW3序列号8 SEQ ID NO：119 RFTVSRDNGKNTAYLRMNSLKPEDTADYYCAV
且其中：
vi)FR4是与下述氨基酸序列中的至少之一具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列：
表A-23：P，R，S103-组的纳米抗体的代表性FW4序列。
P，R，S 103 FW4序列号1 SEQ ID NO：120 RGQGTQVTVSS
P，R，S 103 FW4序列号2 SEQ ID NO：121 LRGGTQVTVSS
P，R，S 103 FW4序列号3 SEQ ID NO：122 GNKGTLVTVSS
P，R，S 103 FW4序列号4 SEQ ID NO：123 SSPGTQVTVSS
P，R，S 103 FW4序列号5 SEQ ID NO：124 SSQGTLVTVSS
P，R，S 103 FW4序列号6 SEQ ID NO：125 RSRGIQVTVSS
且其中：
vii)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，并且优选地如根据本发明的一个优选方面而定义，并且更优选地如根据本发明的一个更优选的方面而定义。
在上述纳米抗体中，其他标志残基中的一个或多个优选地如本文所述(例如，当它们为VHH序列或部分人源化的纳米抗体时。)
关于构架1，同样专业技术人员应该清楚，为了确定氨基酸同一性的程度，优选地忽略在位置1-4和27-30的氨基酸残基。
考虑到此，P，R，S103种类的纳米抗体可以是包括由3个互补性决定区/序列中断的4个构架区/序列的氨基酸序列，其中：
i)在按照Kabat编号方式的位置103的氨基酸残基不同于W；
且其中：
ii)优选地，在按照Kabat编号方式的位置103的氨基酸残基是P，R或S，且更优选是R；
且其中：
iii)FR1是这样的氨基酸序列，其在按照Kabat编号方式的位置5-26与下述氨基酸序列中的至少之一具有至少80％的氨基酸同一性：
表A-24：P，R，S103-组纳米抗体的代表性FW1序列(氨基酸残基5-26)。
P，R，S 103 FW1序列号9 SEQ ID NO：100 VESGGGLVQAGGSLRLSCAASG
P，R，S 103 FW1序列号10 SEQ ID NO：101 AESGGGLVQPGGSLKLSCAASR
且其中：
iv)FR2，FR3和FR4如本文关于P，R，S103-种类的纳米抗体的FR2，FR3和FR4所提及的；
且其中：
v)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，并且优选地如根据本发明的一个优选方面而定义，并且更优选地如根据本发明的一个更优选的方面而定义。
例如，上述纳米抗体可以是VHH序列或可以是人源化的纳米抗体。当上述纳米抗体序列为VHH序列时，它们可以被适当地人源化，如本文进一步所述。当所述纳米抗体是部分人源化的纳米抗体时，它们可以任选地被进一步适当地人源化，同样如本文所述。
在上述纳米抗体中，其他标志残基中的一个或多个优选地如本文所述(例如，当它们是VHH序列或部分人源化的纳米抗体时)。
在另一个优选的但非限制性的方面，本发明涉及如上所述的纳米抗体，其中所述CDR序列与SEQIDNO’s：238-253，更优选SEQIDNO：238和SEQIDNO：239的至少一个氨基酸序列的CDR序列具有至少70％的氨基酸同一性，优选至少80％的氨基酸同一性，更优选至少90％的氨基酸同一性，诸如95％的氨基酸同一性或更多，或甚至基本上100％的氨基酸同一性。此氨基酸同一性的程度可以例如通过确定(以本文中所述的方式)所述纳米抗体和SEQIDNO’s：238-253，更优选SEQIDNO：238和SEQIDNO：239的一个或多个序列之间的氨基酸同一性的程度来确定，其中忽略形成构架区的氨基酸残基。所述纳米抗体可以如本文进一步所述。
如本文已经提及的，本发明的另一个优选的但非限制性的方面涉及具有这样的氨基酸序列的纳米抗体，所述氨基酸序列选自由SEQIDNO’s：238-253，更优选SEQIDNO：238和SEQIDNO：239组成的组或选自由与SEQIDNO’s：238-253，更优选SEQIDNO：238和SEQIDNO：239的氨基酸序列的至少一个具有超过80％，优选超过90％，更优选超过95％，诸如99％或更多序列同一性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组。
此外，在上述纳米抗体中：
i)任何氨基酸置换(当其不是如本文所定义的人源化置换时)优选地，并且与SEQIDNO’s：238-253，更优选SEQIDNO：238和SEQIDNO：239的相应氨基酸序列相比，是保守氨基酸置换(如本文所定义)；
和/或
ii)与SEQIDNO’s：238-253，更优选SEQIDNO：238和SEQIDNO：239的相应氨基酸序列相比，其氨基酸序列优选地仅含有氨基酸置换，或优选地不超过5个，优选不超过3个，和更优选仅1或2个氨基酸缺失或插入；和/或
iii)CDR可以是这样的CDR，其通过亲和力成熟衍生，例如，从SEQIDNO’s：238-253，更优选SEQIDNO：238和SEQIDNO：239的相应氨基酸序列的CDR开始。
优选地，本发明的纳米抗体中的CDR序列和FR序列是这样的，即，本发明的纳米抗体(和包括其的本发明的多肽)：
-以10-5-10-12摩尔/升或更小、并且优选地10-7-10-12摩尔/升或更小、并且更优选地10-8-10-12摩尔/升的解离常数(KD)(即，以105-1012升/摩尔或更大、并且优选地107-1012升/摩尔或更大、且更优选地108-1012升/摩尔的缔合常数(KA))与GPCR结合；
和/或这样，以致它们：
-以102M-1s-1-约107M-1s-1，优选103M-1s-1-107M-1s-1，更优选104M-1s-1-107M-1s-1，诸如105M-1s-1-107M-1s-1的kon-速率与GPCR结合；和/或这样，以致它们：
-以1s-1(t1/2＝0.69s)-10-6s-1(假定具有多天的t1/2的几乎不可逆的复合体)，优选10-2s-1-10-6s-1，更优选10-3s-1-10-6s-1，诸如10-4s-1-10-6s-1的koff速率与GPCR结合。
优选地，在本发明的纳米抗体中存在的CDR序列和FR序列是这样的，以致本发明的纳米抗体将以小于500nM，优选小于200nM，更优选小于10nM，诸如小于500pM的亲和力与GPCR结合。
根据本发明的一个非限制性方面，纳米抗体可以是如本文所定义的，但是具有这样的限制条件：与天然存在的人VH结构域的相对应的构架区相比，并且特别是与DP-47的相对应的构架区相比，其在至少一个构架区具有至少“一个氨基酸差异”(如本文所定义)。更特别地，根据本发明的一个非限制性方面，纳米抗体可以是如本文所定义的，但是具有这样的限制条件：与天然存在的人VH结构域的相对应的构架区相比，并且特别是与DP-47的相对应的构架区相比，其在至少一个标志残基(包括在位置108，103和/或45的那些)具有至少“一个氨基酸差异”(如本文所定义)。通常，纳米抗体应该在FR2和/或FR4中的至少一种中，并且特别是在FR2和/或FR4中的至少一个标志残基(同样，(包括在位置108，103和/或45的那些))与天然存在的VH结构域具有至少一个这样的氨基酸差异。
此外，人源化的本发明的纳米抗体可以如本发明所定义，但是具有这样的限制条件：与天然存在的VHH结构域的相对应的构架区相比，其在至少一个构架区具有“至少一个氨基酸差异”(如本文所定义)。更特别地，根据本发明的一个非限制性方面，人源化的纳米抗体可以如本文所定义，但是具有下述限制条件：与天然存在的VHH结构域的相对应的构架区相比，其在至少一个标志残基(包括在位置108，103和/或45的那些)具有至少“一个氨基酸差异”(如本文所定义)。通常，人源化的纳米抗体应该在FR2和/或FR4中的至少一个、并且特别是在FR2和/或FR4中的至少一个标志残基(同样，包括在位置108，103和/或45的那些)与天然存在的VHH结构域具有至少一个所述氨基酸差异。
从本发明的公开内容应该清楚，使用如本发明所定义的本发明的纳米抗体的天然或合成的类似物、突变体、变体、等位基因、同系物和直向同源物(本发明笼统称为“类似物”)，和特别地SEQIDNO’s：238-253，更优选SEQIDNO：238和SEQIDNO：239的纳米抗体的类似物也在本发明的范围之内。因此，根据本发明的一个方面，术语“本发明的纳米抗体”在其最广泛意义上还涵盖所述类似物。
通常，在所述类似物中，与如本发明所定义的本发明纳米抗体相比，一个或多个氨基酸残基可以被取代、删除和/或添加。这样的取代、插入或删除可以在一个或多个构架区和/或在一个或多个CDR内进行。当所述取代、插入或删除在一个或多个构架区内进行时，它们可以在一个或多个标志残基处和/或在构架残基中的一个或多个其它位置进行，尽管通常较不优选在标志残基处的取代、插入或删除(除非这些是如本文所述的适当的人源化取代)。
通过非限制性实例的方式，例如，取代可以是保守取代(如本文所述)和/或氨基酸残基可以被天然存在于另一个VHH结构域中相同位置处的另一个氨基酸残基取代(关于这样的取代的一些非限制性实例参见表A-5-A-8)，尽管本发明通常不限于此。因此，在本发明的范围内包括任何一个或多个取代、删除或插入，或它们的任何组合，所述取代、删除或插入或其组合改善本发明的纳米抗体的特性，或至少没有将本发明的纳米抗体的理想特性或理想特性的平衡或组合减损太多(即，到所述纳米抗体不再适合其目的应用的程度)。基于本发明的公开内容，以及任选地在有限程度的常规实验之后，例如，常规实验可以包括引入有限数目的可能的取代并且确定它们对这样获得的纳米抗体特性的影响，专业技术人员通常应该能够确定并且选择适当的取代、删除或插入、或它们的适当的组合。
例如，并且取决于用于表达本发明的纳米抗体或多肽的宿主生物体，所述删除和/或取代可以以这样的方式设计，所述方式去除一个或多个翻译后修饰的位点(诸如一个或多个糖基化位点)，这应该在本领域技术人员的能力范围内。备选地，可以设计取代或插入，以引入一个或多个附着官能团(如本文所述)的位点，例如，以允许位点-特异性的聚乙二醇化(pegylation)(同样如本文所述)。
从在上述表A-5-A-8中提供的关于VHH熵和VHH可变性的数据可以看出，在构架区中的一些氨基酸残基比其它的更保守。通常，尽管本发明在其最广泛意义上不限于此，优选在较不保守的位置进行任何取代、删除或插入。此外，通常，氨基酸取代优于氨基酸删除或插入。
所述类似物优选是这样的，以致它们可以以如本文关于本发明的纳米抗体所定义的亲和力(适当测量的和/或表示为KD-值(实际的或表观的)，KA-值(实际的或表观的)，kon-速率和/或koff-速率，或备选地表示为IC50值，如本发明进一步所述)结合GPCR。
所述类似物优选还是这样的，以致它们保留所述纳米抗体的有利特性，如本文所述。
此外，根据一个优选的方面，所述类似物与SEQIDNO’s：238-253，更优选SEQIDNO：238和SEQIDNO：239的纳米抗体之一分别具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、如至少95％或99％或更多的序列同一性程度；和/或优选地具有至多20个、优选地至多10个、甚至更优选地至多5个、如4，3，2或仅有1个氨基酸差异(如本文定义)。
此外，所述类似物的构架序列和CDR’s优选是这样的，以致它们与本文定义的优选方面一致。更一般地，如本文所述，所述类似物具有：(a)在位置108的Q；和/或(b)在位置45的带电荷氨基酸或半胱氨酸残基，和优选地在位置44为E，更优选地在位置44为E和在位置45为R；和/或(c)在位置103的P，R或S。
本发明纳米抗体的类似物的一个优选的种类包括已经被人源化的纳米抗体(即，与天然存在的本发明的纳米抗体的序列相比较)。如在本发明引用的背景技术中提及的，这样的人源化通常包括用在人VH结构域如人VH3结构域中相同位置存在的氨基酸残基取代在天然存在的VHH序列中的一个或多个氨基酸残基。专业技术人员应该清楚可能的人源化取代或人源化取代的组合的实例，例如，从本发明的表格，从在本发明引用的背景技术中提及的可能的人源化取代，和/或从纳米抗体序列和天然存在的人VH结构域序列之间的比较获知。
所述人源化取代应该这样选择，以致所得到的人源化的纳米抗体仍然保留如本发明所定义的纳米抗体的有利特性，并且更优选这样选择，以致它们如在前段中关于类似物的描述。基于本文的公开内容，并且任选地在有限程度的常规实验之后，所述常规实验包括，例如，引入有限数量的可能的人源化取代，并且确定它们对这样获得的纳米抗体的特性的影响，专业技术人员通常能够确定并选择适当的人源化取代或适当的人源化取代的组合。
一般地，作为人源化的结果，本发明的纳米抗体可以变得更加“人-样”，同时仍然保留如本文所述的本发明的纳米抗体的有利特性。结果，与相对应的天然存在的VHH结构域相比，这样人源化的纳米抗体可以具有一些优点，诸如减小的免疫原性。同样，基于本发明的公开内容，并且任选在有限程度的常规实验之后，专业技术人员应该能够选择人源化取代或适当的人源化取代组合，其最优化或获得一方面在通过人源化取代提供的有利特性和另一方面在天然存在的VHH结构域的有利特性之间的理想的或适当的平衡。
本发明的纳米抗体可以在任何构架残基处被适当人源化，诸如在一个或多个标志残基处(如本文所定义)或在一个或多个其它构架残基处(即，非标志残基)或它们的任何适当的组合。关于“P，R，S-103组”或“KERE组”的纳米抗体的一个优选的人源化取代是将Q108取代成L108。“GLEW种类”的纳米抗体也可以通过将Q108取代成L108被人源化，条件是其它标志残基中的至少一个含有骆驼科动物(骆驼源化)取代(如本文所定义)。例如，如上文所提及，人源化的纳米抗体的一个特别优选的种类在位置44-47具有GLEW或GLEW-样序列；在位置103具有P，R或S(并且特别是R)，并且在位置108具有L。
人源化的和其它类似物，以及编码其的核酸序列，可以以本身已知的任何方式提供。例如，所述类似物可以这样获得：通过提供编码天然存在的VHH结构域的核酸，将要被取代的一个或多个氨基酸残基的密码子改变成相对应的合乎需要的氨基酸残基的密码子(例如，通过位点定向诱变或通过使用适当错配的引物进行的PCR)，在适当的宿主或表达系统中表达这样获得的核酸/核苷酸序列；并且任选地分离和/或纯化这样获得的类似物，以提供基本上分离形式(如本文进一步所述)的所述类似物。这通常可以应用本身已知的方法和技术而进行，所述方法和技术应该是专业技术人员所清楚的，例如从手册和本文所引用的参考文献、本文引用的背景技术和/或从本文的进一步描述中可知。备选地，编码所述需要的类似物的核酸可以以本身已知的方法合成(例如使用用于合成具有预先确定氨基酸序列的核酸序列的自动装置)，并且然后可以如本文所述进行表达。另一种技术可以包括组合一个或多个分别编码所述理想的类似物的一部分的天然存在的和/或合成的核酸序列，并且然后如本发明所述表达所组合的核酸序列。此外，所述类似物可以使用相关氨基酸序列的化学合成而提供，其应用本身已知的肽合成技术，诸如本发明所提及的那些技术。
在这一方面，专业技术人员还应该清楚，本发明的纳米抗体(包括它们的类似物)还可以从人VH序列(即，氨基酸序列或相对应的核苷酸序列)起始设计和/或制备，所述人VH序列诸如例如人VH3序列，诸如DP-47、DP-51、或DP-29，即，通过引入一个或多个骆驼源化的取代(即，将在所述人VH结构域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基改变成在VHH结构域相对应位置存在的氨基酸残基)，以提供本发明的纳米抗体序列，和/或将纳米抗体的有利特性赋予这样获得的序列。同样地，这通常可以应用前段中提到的各种方法和技术进行，其应用人VH结构域的氨基酸序列和/或核苷酸序列作为起点。
一些优选的而非限制性的骆驼源化取代可以来自表A-5-A-8。同样应该清楚，在一个或多个标志残基的骆驼源化取代通常将比在一个或多个其它氨基酸位置的取代对所需要的特性有更大的影响，尽管这两种取代以及它们的任何适当的组合均包括在本发明范围之内。例如，可以引入一个或多个已经赋予至少一些所需要的特性的骆驼源化取代，并且然后引入进一步的骆驼源化取代，其进一步改善所述特性和/或赋予额外的有利特性。同样地，基于本发明的公开内容，并且任选地在有限程度的常规实验之后，所述常规实验可以包括，例如，引入有限数量的可能的骆驼源化取代，并且确定是否获得或改善纳米抗体的有利特性(即，与原始VH结构域相比)，专业技术人员将通常能够确定并选择适当的骆驼源化取代或适当的骆驼源化取代的组合。然而，一般地，所述骆驼源化取代优选是这样的以致得到的氨基酸序列至少包含(a)在位置108的Q；和/或(b)在位置45的带电荷的氨基酸或半胱氨酸残基以及优选地也在位置44的E，以及更优选地在位置44的E和在位置45的R；和/或(c)在位置103的P，R或S；和任选地一种或多种其它的骆驼源化取代。更优选地，所述骆驼源化取代是这样的以致它们导致本发明的纳米抗体和/或其类似物(如本文定义)，如得到人源化的类似物和/或优选地如在前述段落中定义的类似物。
如从本文的公开内容中还要清楚的是，使用如本文所定义的本发明的纳米抗体的部分或片段，或两个或多个部分或片段的组合，并且特别是SEQIDNO’s：238-253，更优选SEQIDNO：238和SEQIDNO：239的纳米抗体的部分或片段，也包括在本发明的范围内。因此，根据本发明的一个方面，术语“本发明的纳米抗体”在其最广泛的意义上也涵盖所述部分或片段。
一般地，本发明的纳米抗体(包括其类似物)的所述部分或片段具有这样的氨基酸序列，其中，与相对应的本发明的全长纳米抗体(或其类似物)的氨基酸序列相比较，已经删除和/或去除在N末端的一个或多个氨基酸残基，在C末端的一个或多个氨基酸残基，一个或多个连续的内部氨基酸残基，或它们的任何组合。
所述部分或片段优选是这样的，以致它们可以以如本文关于本发明的纳米抗体所定义的亲和力(适当测量和/或表示为KD-值(实际的或表观的)，KA-值(实际的或表观的)，kon-速率和/或koff-速率，或备选地为IC50值，如本发明进一步所述))结合GPCR。
任何部分或片段优选地是这样，以致其包括相对应的本发明的全长纳米抗体的氨基酸序列的至少10个连续的氨基酸残基，优选地至少20个连续的氨基酸残基，更优选地至少30个连续的氨基酸残基，诸如至少40个连续的氨基酸残基。
此外，任何部分或片段优选是这样的，以致其包括CDR1、CDR2和/或CDR3中的至少一个或至少其部分(并且特别是至少CDR3或至少其部分)。更优选地，任何部分或片段是这样的，以致其包括至少一个CDR(并且优选至少CDR3或其部分)，和至少一个其它CDR(即，CDR1或CDR2)或至少其部分，优选通过适当的构架序列或至少其部分连接。更优选地，任何部分或片段是这样的，以致其包括至少一个CDR(且优选至少CDR3或其部分)，和至少两个剩余CDR的部分，同样优选通过适当的构架序列或至少其部分连接。
按照另一个特别优选的但非限制性的方面，这样的部分或片段包括至少CDR3，诸如相对应的本发明全长纳米抗体的FR3、CDR3和FR4，即，例如，如在国际申请WO03/050531(Lasters等)中所述。
如上文已经提及，还可以组合两个或更多个这样的部分或片段(即，来自相同的或不同的本发明的纳米抗体)，即，以提供本发明纳米抗体的类似物(如本文所定义)和/或以提供其它部分或片段(如本文所定义)。例如，还可以将本发明纳米抗体的一个或多个部分或片段与人VH结构域的一个或多个部分或片段组合。
根据一个优选方面，所述部分或片段与SEQIDNO’s：238-253，更优选SEQIDNO：238和SEQIDNO：239的纳米抗体之一具有至少50％、优选地至少60％、更优选地至少70％、甚至更优选地至少80％、诸如至少90％、95％或99％或更多的序列同一性程度。
所述部分和片段，以及编码其的核酸序列可以以本身已知的任何方式提供并且任选地组合。例如，所述部分或片段可以通过在编码本发明的全长纳米抗体的核酸中插入终止密码子，并且然后以本身已知的方式(例如，如本文所述)表达这样获得的核酸而获得。备选地，编码所述部分或片段的核酸可以这样获得，即，通过适当限制性酶切(restrict)编码本发明的全长纳米抗体的核酸或通过以本身已知的方式合成这样的核酸。部分或片段还可以使用本身已知的肽合成技术提供。
本发明在其最广泛意义上还包括本发明的纳米抗体的衍生物。这样的衍生物通常可以通过本发明的纳米抗体和/或形成本发明的纳米抗体的一个或多个氨基酸残基的修饰而获得，并且特别是通过化学和/或生物(例如，酶促)修饰获得。
专业技术人员应该清楚这样的修饰的实例，以及纳米抗体序列中可以以这样的方式修饰的氨基酸残基的实例(即，在蛋白骨架上但是优选地在侧链上)，可以用来引入所述修饰的方法和技术以及所述修饰的潜在用途和优点。
例如，这样的修饰可以包括向本发明的纳米抗体内或向本发明的纳米抗体上引入(例如，通过共价连接或以其它适当的方式)一个或多个官能团、残基或部分，并且特别是赋予本发明的纳米抗体一种或多种理想的特性或官能性的一个或多个官能团、残基或部分。专业技术人员应该清楚所述官能团的实例。
例如，所述修饰可以包括引入(例如，通过共价结合或以任何其它适当的方式)一个或多个这样的官能团，即，所述官能团增加本发明的纳米抗体的半衰期、溶解性和/或吸收，减少本发明的纳米抗体的免疫原性和/或毒性，消除或减弱本发明的纳米抗体的任何不理想的副作用，和/或赋予本发明的纳米抗体和/或氨基酸序列以其它的有利特性和/或减少本发明的纳米抗体和/或氨基酸序列的不理想特性；或者两种或多种上述的任何组合。所述官能团的实例以及引入所述官能团的技术的实例应该为专业技术人员清楚，并且通常可以包括上文引用的综合背景技术中提及的所有官能团和技术，以及本身已知的用于修饰药物蛋白并且特别用于修饰抗体或抗体片段(包括ScFv’s和单结构域抗体)的官能团和技术，关于其的参考文献例如参考雷明顿药物科学(Remington′sPharmaceuticalSciences)，第16版，Mack出版公司，Easton，PA(1980)。例如，所述官能团可以直接连接(例如共价地)到本发明的纳米抗体上，或者任选地通过适当的接头或间隔臂连接，这也为专业技术人员所清楚。
关于增加半衰期和/或减少药物蛋白的免疫原性最广泛应用的一种技术包括适当的药用聚合物诸如聚(乙二醇)(PEG)或其衍生物(诸如甲氧基聚(乙二醇)或mPEG)的附着。一般地，可以应用聚乙二醇化作用的任何适当的形式，诸如本领域中用于抗体和抗体片段(包括但不限于(单)结构域抗体和ScFv’s)的聚乙二醇化作用；例如，参考Chapman，自然生物技术(Nat.Biotechnol.)，54，531-545(2002)；Veronese和Harris，高级药物递送综述(Adv.DrugDeliv.Rev.)54，453-456(2003)，Harris和Chess，药物发现自然评论(Nat.Rev.Drug.Discov.)，2，(2003)以及在WO04/060965中。用于蛋白聚乙二醇化的各种试剂还可以商购，例如从美国Nektar治疗公司(NektarTherapeutics)购得。
优选地，应用定向聚乙二醇化，特别是通过半胱氨酸-残基(参见例如Yang等，蛋白质工程(ProteinEngineering)，16，10，761-770(2003))。例如，为了这一目的，PEG可以附着到在本发明的纳米抗体中天然存在的半胱氨酸残基上，本发明的纳米抗体可以这样进行修饰，以适当地引入一个或多个用于PEG附着的半胱氨酸残基，或者可以将包括一个或多个用于PEG附着的半胱氨酸残基的氨基酸序列融合到本发明的纳米抗体的N-和/或C-端，其全部使用本身为专业技术人员所了解蛋白质加工技术。
优选地，对于本发明的纳米抗体和蛋白，使用具有分子量大于5000，诸如大于10,000并且小于200,000，诸如小于100,000；例如在20,000-80,000范围内的PEG。
另一种通常较不优选的修饰包括N-连接的或O-连接的糖基化，通常作为共翻译和/或翻译后修饰的一部分，其取决于为了表达本发明的纳米抗体或多肽所用的宿主细胞。
另一种修饰可以包括引入一种或多种可检测的标记或其它信号-产生基团或结构部分，其取决于所标记纳米抗体的目的用途。适宜的标记以及附着、使用和检测它们的技术是专业技术人员所清楚的，并且例如包括但不限于，荧光标记(诸如荧光素、异硫氰酸酯、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛(o-phthaldehyde)、以及荧光胺和荧光素金属诸如152Eu或其它来自镧系的金属)、磷光性标记、化学发光标记或生物发光标记(诸如鲁米那、异鲁米诺、theromaticacridiniumester、咪唑、acridinium盐、草酸酯、二氧杂环丁烷或GFP及其类似物)、放射性-同位素(诸如3H，125I，32P，35S，14C，51Cr，36Cl，57Co，58Co，59Fe和75Se)、金属、金属螯合物或金属阳离子(例如金属阳离子诸如99mTc，123I，111In，131I，97Ru，67Cu，67Ga和68Ga，或其它特别适合用于体内、体外或原位诊断和成像的金属或金属阳离子，诸如(157Gd，55Mn，162Dy，52Cr和56Fe))，以及发色团和酶(诸如苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、Δ-V-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、-磷酸甘油脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、生物素-抗生物素蛋白过氧化酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-VI-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶)。其它适宜的标记为专业技术人员所清楚，并且例如包括可以应用NMR或ESR光谱检测的部分。
例如，这样标记的本发明的纳米抗体和多肽可以用于体外、体内或原位检测(包括本身已知的免疫检测，诸如ELISA，RIA，EIA和其它“夹心式检测”等)，以及体内诊断和成像目的，这取决于特定的标记的选择。
专业技术人员应该清楚，另一种修饰可以包括引入螯合基团，例如以螯合上文提到的金属或金属阳离子中的一种。例如，适当的螯合基团包括但不限于二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)。
另一种修饰可以包括引入作为特异性结合对诸如生物素-(链霉)抗生物素蛋白结合对的一部分的官能团。这样的官能团可以用来将本发明的纳米抗体与另一种蛋白、多肽或化学化合物结合，所述另一种蛋白、多肽或化学化合物与所述结合对的另一半结合，即，通过形成所述结合对。例如，本发明的纳米抗体可以缀合到生物素上，并且连接到与抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白缀合的另一种蛋白、多肽、化合物或载体上。例如，这样缀合的纳米抗体可以用作报道子，例如在产生可检测的信号的试剂与抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白缀合的诊断系统中用作报道子。例如，这种结合对还可以用来将本发明的纳米抗体与载体结合，所述载体包括适用于药物目的的载体。一个非限制性的实例是Cao和Suresh，药物靶向杂志(JournalofDrugTargetting)，8，4，257(2000)所述的脂质体制剂。这种结合对还可以用来将治疗活性剂与本发明的纳米抗体结合。
对于一些应用，特别是对于意欲杀死表达本发明的纳米抗体所针对的靶标的细胞(例如，在治疗癌症时)，或者意欲减少或减缓所述细胞的生长和/或增殖的那些应用中，本发明的纳米抗体还可以与毒素或者毒性残基或部分连接。例如，可以与本发明的纳米抗体连接以提供细胞毒性化合物的毒性部分、化合物或残基的实例对于专业技术人员是清楚的，并且例如，可以在上文引用的现有技术和/或本文的进一步描述中找到。一个实例是记述在WO03/055527中的所谓的ADEPTTM技术。
专业技术人员应该清楚其它潜在的化学和酶促修饰。这种修饰还可以为研究目的引入(例如，为了研究功能-活性关系)。例如，参考Lundblad和Bradshaw，生物技术和应用生物化学(Biotechnol.Appl.Biochem.)，26，143-151(1997)。
优选地，所述衍生物是这样的，以致它们以如本文关于本发明的纳米抗体所定义的亲和力(适当测量和/或表示为KD-值(实际的或表观的)，KA-值(实际的或表观的)，kon-速率和/或koff-速率，或备选地为IC50值，如本发明进一步所述)与GPCR结合。
如上文提及，本发明还涉及基本上由至少一个本发明的纳米抗体组成或包括至少一个本发明的纳米抗体的蛋白或多肽。“基本上由……组成”意指本发明的多肽的氨基酸序列与本发明纳米抗体的氨基酸序列完全相同，或者与本发明纳米抗体的氨基酸序列相对应，其将有限数目的氨基酸残基，诸如1-20个氨基酸残基，例如1-10个氨基酸残基并且优选地1-6个氨基酸残基，诸如1，2，3，4，5或6个氨基酸残基添加到所述纳米抗体的氨基酸序列的氨基末端、羧基末端或者氨基末端和羧基末端两端。
所述氨基酸残基可以或者可以不变化、改变或者另外影响所述纳米抗体的(生物学)特性，并且可以或者可以不为所述纳米抗体添加其它的官能性。例如，所述氨基酸残基：
-可以包括N-端Met残基，例如，作为在异源宿主细胞或宿主生物体内表达的结果；
-可以形成信号序列或前导序列，当合成时其引导所述纳米抗体从宿主细胞中分泌。适宜的分泌性前导肽应该是专业技术人员所清楚的，并且可以是本文进一步所述的。通常，这样的前导序列与所述纳米抗体的N端连接，尽管本发明在其最广泛意义上不限于此；
-可以形成这样的序列或信号，即，所述序列或信号允许所述纳米抗体导向和/或透过或进入特异性的器官、组织、细胞、或者细胞的部分或区室，和/或所述序列或信号允许所述纳米抗体透过或穿过生物屏障诸如细胞膜、细胞层诸如上皮细胞层、肿瘤包括实体瘤、或血脑屏障。所述氨基酸序列的实例对于专业技术人员是清楚的。一些非限制性的实例是在WO03/026700和Temsamani等，生物学治疗的专家观点(ExpertOpin.Biol.Ther.)，1，773(2001)；Temsamani和Vidal，今日药物发现(DrugDiscov.Today)，9，1012(004)以及Rousselle，药理学和实验治疗学杂志(J.Pharmacol.Exp.Ther.)，296，124-131(2001)中所述的小肽载体(“Pep-trans载体”)，和由Zhao等，凋亡(Apoptosis)，8，631-637(2003)所述的膜易位体序列。例如，用于抗体片段细胞内靶向的C端和N端氨基酸序列由Cardinale等，方法(Methods)，34，171(2004)所述。关于细胞内靶向的其它适宜的技术包括所谓的“细胞内抗体(intrabody)”的表达和/或应用，所述“细胞内抗体”包括本发明的纳米抗体，如下文所提及；
-可以形成“标记”，例如允许或促进所述纳米抗体的纯化的氨基酸序列或残基，例如使用针对所述序列或残基的亲和技术进行纯化。然后，所述序列或残基可以被去除(例如，通过化学或酶促裂解)，以提供纳米抗体序列(为了这一目的，所述标记可以任选地通过可裂解的接头序列与所述纳米抗体序列连接或包含可裂解的基序)。这种残基的一些优选的但非限制性的实例是多组氨酸残基、谷胱甘肽残基以及myc-标记(例如参见WO06/12282的SEQIDNO：31)；
-可以是已经被官能化和/或可以作为用于官能团附着的位点的一个或多个氨基酸残基。适宜的氨基酸残基和官能团应该是专业技术人员所清楚的，并且包括但不限于，本文为本发明的纳米抗体的衍生物提及的氨基酸残基和官能团。
按照另一个方面，本发明的多肽包括本发明的纳米抗体，所述多肽在其氨基末端、在其羧基末端、或者在其氨基末端和其羧基末端两端融合至少一个其它氨基酸序列，即，以提供包括所述本发明的纳米抗体和一个或多个其它氨基酸序列的融合蛋白。这种融合体在本文还叫作“纳米抗体融合体”。
所述一个或多个其它氨基酸序列可以是任何适宜的和/或理想的氨基酸序列。所述其它氨基酸序列可以或可以不变化、改变或另外影响所述纳米抗体的(生物学)特性，并且可以或可以不为本发明的纳米抗体或多肽加入其它的官能性。优选地，所述其它氨基酸序列是这样的，以致它赋予本发明的纳米抗体或多肽一种或多种理想的特性或官能性。
例如，所述其他氨基酸序列也可以提供第二结合位点，所述结合位点可以针对任何需要的蛋白、多肽、抗原、抗原决定簇或表位(包括但不限于与本发明的纳米抗体所针对的相同的蛋白、多肽、抗原、抗原决定簇或表位，或不同的蛋白、多肽、抗原、抗原决定簇或表位)。
这样的氨基酸序列的实例是专业技术人员所清楚的，并且通常可以包括基于常规抗体及其片段(包括但不限于ScFv’s和单结构域抗体)的用于肽融合的所有氨基酸序列。例如，参考Holliger和Hudson，自然生物技术(NatureBiotechnology)，23，9，1126-1136(2005)的综述。
例如，与本发明的纳米抗体本身相比，这样的氨基酸序列可以是这样的氨基酸序列，即，其增加本发明的多肽的半衰期、溶解性、或吸收，减少本发明的多肽的免疫原性或毒性，消除或减弱本发明的多肽的不理想的副作用，和/或赋予本发明的多肽以其它有利的特性和/或减少本发明的多肽的不理想特性。所述氨基酸序列的一些非限制性实例为血清蛋白，诸如人血清白蛋白(参见，例如WO00/27435)或半抗原分子(例如被循环抗体识别的半抗原，参见例如WO98/22141)。
特别地，在本领域中已经描述，免疫球蛋白(如VH结构域)与血清白蛋白或与其片段的连接片段可以用来增加半衰期。参考WO00/27435和WO01/077137。根据本发明，本发明的纳米抗体优选地与血清白蛋白(或与其适当的片段)直接连接，或通过适当的接头连接，且特别地通过适当的肽连接，以致本发明的多肽可以作为遗传融合体(蛋白)表达。按照一个具体的方面，本发明的纳米抗体可以与血清白蛋白片段连接，所述血清白蛋白片段至少包括血清白蛋白的结构域III或其部分。例如，参考埃博灵克斯股份有限公司(AblynxN.V.)的于2006年3月31日申请的题目为“白蛋白来源的氨基酸序列，其用于增加治疗性蛋白和其他治疗性蛋白和实体的半衰期的用途，以及包括其的构建体(Albuminderivedaminoacidsequence，usethereofforincreasingthehalf-lifeoftherapeuticproteinsandofothertherapeuticproteinsandentities，andconstructscomprisingthesame)”美国临时申请60/788,256。
备选地，所述其它的氨基酸序列还可以提供第二结合位点或结合单位，所述结合位点或结合单位针对血清蛋白(诸如例如，人血清白蛋白或另一种血清蛋白，诸如IgG)，以在血清中提供增加的半衰期。例如，所述氨基酸序列包括下述纳米抗体，以及在WO91/01743，WO01/45746和WO02/076489中所述的小肽和结合蛋白，和在WO03/002609和WO04/003019所述的dAb’s。还参考Harmsen等，疫苗(Vaccine)，23(41)；4926-42，2005，以及EP0368684，以及下述本文提及的埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx.N.V.)的美国临时申请60/843,349，60/850,774，60/850,775和埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx.N.V.)于2006年12月5日申请的题目为“Peptidescapableofbindingtoserumproteins(能够结合血清蛋白的肽)”的美国临时申请(也在本文中提及)。
所述氨基酸序列可以特别针对血清白蛋白(并且更特别是人血清白蛋白)和/或针对IgG(并且更特别是人IgG)。例如，所述氨基酸序列可以是下列氨基酸序列：针对(人)血清白蛋白的氨基酸序列，和可以结合在(人)血清白蛋白上不参与血清白蛋白与FcRn结合的氨基酸残基的氨基酸序列(例如，参见WO06/0122787)，和/或能够结合在血清白蛋白上不形成血清白蛋白结构域III的一部分的氨基酸残基的氨基酸序列(例如，同样参见WO06/0122787)；具有或可以提供增加的半衰期的氨基酸序列(例如，参见埃博灵克斯股份有限公司(AblynxN.V.)的于2006年9月8日申请的题目为“具有长半衰期的血清白蛋白结合蛋白(Serumalbuminbindingproteinswithlonghalf-lives)”的美国临时申请60/843,349)；与来自至少一个哺乳动物物种的、并且特别是与至少一个灵长类物种(诸如但不限于，来自猕猴属(Macaca)的猴子(诸如，并且特别地，食蟹猴(食蟹猴(Macacafascicularis))和/或恒河猴(恒河猴(Macacamulatta)))和狒狒(豚尾狒狒(Papioursinus))，同样参考美国临时申请60/843,349)的血清白蛋白交叉反应的针对人血清白蛋白的氨基酸序列；可以以不依赖pH方式结合血清白蛋白的氨基酸序列(参见，例如，埃博灵克斯股份有限公司(AblynxN.V.)于2006年10月11日申请的题目为“以基本上不依赖pH的方式结合血清白蛋白的氨基酸序列，包含其的化合物及其应用(AminoacidsequencesthatbindtoserumproteinsinamannerthatisessentiallyindependentofthepH，compoundscomprisingthesame，andusesthereof)”的美国临时申请60/850,774)，和/或是条件粘合剂的氨基酸序列(例如，参见埃博灵克斯股份有限公司(AblynxN.V.)于2006年10月11日申请的题目为“以条件方式结合需要的分子的氨基酸序列(Aminoacidsequencesthatbindtoadesiredmoleculeinaconditionalmanner)”的美国临时申请60/850,775)。
按照另一个方面，所述一个或多个其他氨基酸序列可以包括常规4-链抗体(且特别是人抗体)和/或重链抗体的一个或多个部分、片段或结构域。例如，尽管通常较不优选，本发明的纳米抗体可以与常规(优选人)VH或VL结构域连接或与VH或VL结构域的天然或合成的类似物连接，同样任选地通过接头序列(包括但不限于其他(单)结构域抗体，如Ward等所述的dAb’s)。
所述至少一个纳米抗体还可以与一个或多个(优选人的)CH1、CH2和/或CH3结构域连接，这任选地通过接头序列连接。例如，与适宜的CH1结构域连接的纳米抗体，可以例如——与适当的轻链一起——用来产生类似于常规Fab片段或F(ab’)2片段的抗体片段/结构，但是其中一个或者(F(ab’)2片段的情形中)一个或两个常规VH结构域已被本发明的纳米抗体取代。此外，两个纳米抗体可以与CH3结构域(任选通过接头)连接，以提供具有增加的体内半衰期的构建体。
根据本发明的多肽的一个具体方面，一个或多个本发明的纳米抗体可以与一个或多个抗体部分、片段或结构域连接，其赋予本发明的多肽一种或多种效应子功能，和/或可以赋予与一个或多个Fc受体结合的能力。例如，为了这一目的，并且不限于此，所述一个或多个其它氨基酸序列可以包括抗体、诸如来自重链抗体(如本文所述)并且更优选来自常规人4-链抗体的一个或多个CH2和/或CH3结构域；和/或可以形成Fc区域的(部分)和Fc区域，例如来自IgG，来自IgE或来自另一种人Ig。例如，WO94/04678描述了包括骆驼科动物VHH结构域或其人源化的衍生物的重链抗体(即，纳米抗体)，其中所述骆驼科动物CH2和/或CH3结构域已被人CH2和CH3结构域取代，以提供由2条重链组成的免疫球蛋白，其中每条重链包括纳米抗体和人CH2与CH3结构域(但是无CH1结构域)，所述免疫球蛋白具有由所述CH2和CH3结构域提供的效应子功能，并且所述免疫球蛋白可以在无需任何轻链的存在下行使功能。专业技术人员应该清楚可以适当与本发明的纳米抗体连接以提供效应子功能的其它氨基酸序列，并且可以基于所需要的效应子功能进行选择。例如，参考WO04/058820，WO99/42077和WO05/017148，以及Holliger和Hudson的综述，同前。与相对应的本发明的纳米抗体相比，本发明的纳米抗体与Fc部分偶联也可以导致增加的半衰期。对于一些应用，使用赋予增加的半衰期而无任何生物学显著效应子功能的Fc部分和/或恒定结构域(即，CH2和/或CH3结构域)也可以是适当的或者甚至是优选的。专业技术人员应该清楚包括具有增加的体内半衰期的一个或多个纳米抗体和一个或多个恒定结构域的其它适当的构建体，并且例如，其可以包括与CH3结构域连接的两个纳米抗体，任选地通过接头序列连接。通常，具有增加的半衰期的任何融合蛋白或衍生物将优选具有大于50kD的分子量，50kD是肾吸收的截留值。
所述其它氨基酸序列还可以形成信号序列或前导序列，当合成时其引导本发明的纳米抗体或多肽从宿主细胞中分泌(例如，以提供本发明的多肽的前体-(pre-)、原-(pro-)或前原-(prepro-)形式，这取决于用来表达本发明的多肽的宿主细胞)。
所述其它氨基酸序列还可以形成这样的序列或信号，即，所述序列或信号允许本发明的纳米抗体或多肽导向和/或透过或进入特异性的器官、组织、细胞、或者细胞的部分或区室，和/或所述序列或信号允许本发明的纳米抗体或多肽透过或穿过生物屏障诸如细胞膜、细胞层诸如上皮细胞层、肿瘤包括实体瘤、或血脑屏障。所述氨基酸序列的适当的实例对于专业技术人员是清楚的，并且例如包括但不限于，上文提及的“Peptrans”载体，Cardinale等描述的序列，以及本身已知的可以用来将本发明的纳米抗体和多肽表达或生产为“细胞内抗体”的氨基酸序列和抗体片段，例如，如在WO94/02610，WO95/22618，US-A-7004940，WO03/014960，WO99/07414；WO05/01690；EP1512696；和Cattaneo，A.与Biocca，S.(1997)细胞内抗体：开发和应用(IntracellularAntibodies：DevelopmentandApplications).Landes和Springer-Verlag；以及在Kontermann，方法(Methods)34，(2004)，163-170，以及本发明所述的其它参考文献中所述。
对于一些应用，特别是对于意欲杀死表达本发明的纳米抗体所针对的靶标的细胞(例如，在治疗癌症时)，或者意欲减少或减缓所述细胞的生长和/或增殖的那些应用中，本发明的纳米抗体还可以与(细胞)毒性蛋白或多肽连接。例如，可以与本发明的纳米抗体连接以提供本发明的细胞毒性多肽的所述毒性蛋白和多肽的实例对于专业技术人员是清楚的，并且例如，可以在上文引用的现有技术和/或本文的进一步描述中找到。一个实例是在WO03/055527中所述的所谓的ADEPTTM技术。
根据一个优选但非限制性的方面，所述一个或多个其它氨基酸序列包括至少一个其它的纳米抗体，以提供包括至少两个、诸如三个、四个、五个或更多个纳米抗体的本发明的多肽，其中所述纳米抗体可以任选地通过一个或多个接头序列(如本发明所定义)连接。包括两个或更多个纳米抗体的本发明的多肽，其中至少一个是本发明的纳米抗体，在本发明中还将称为本发明的“多价”多肽，并且在所述多肽中存在的纳米抗体还将在本发明中称为处于“多价形式”。例如，本发明的“二价”多肽包括2个纳米抗体，任选地通过一个接头序列连接，而本发明的“三价”多肽包括3个纳米抗体，任选地通过两个接头序列连接；等等；其中在所述多肽中存在的至少一个纳米抗体，并且多达在所述多肽中存在的所有纳米抗体，是本发明的纳米抗体。
在本发明的多价多肽中，所述两个或更多个纳米抗体可以是相同的或不同的，并且可以针对同一抗原或抗原决定簇(例如，针对相同部分或表位或者针对不同部分或表位)，或可以备选地针对不同的抗原或抗原决定簇；或它们的任何适当的组合。
例如，本发明的二价多肽可以包括：(a)两个相同的纳米抗体；(b)针对蛋白或抗原的第一抗原决定簇的第一纳米抗体，和针对所述蛋白或抗原的同一抗原决定簇的第二纳米抗体，所述第二纳米抗体不同于所述第一纳米抗体；(c)针对所述蛋白或抗原的第一抗原决定簇的第一纳米抗体，和针对所述蛋白或抗原的另一个抗原决定簇的第二纳米抗体(例如反向拮抗性CXCR4纳米抗体和拮抗剂性CXCR4纳米抗体)；或(d)针对第一蛋白或抗原的第一纳米抗体，和针对第二蛋白或抗原(即，与所述第一抗原不同)的第二纳米抗体(例如具有反向拮抗性质的CXCR4纳米抗体和具有拮抗性质的CXCR7纳米抗体或反之亦然)。类似地，本发明的三价多肽可以，例如但不限于此，包括(a)3个相同的纳米抗体；(b)针对抗原的第一抗原决定簇的两个相同的纳米抗体，和针对同一抗原的不同抗原决定簇的第三纳米抗体；(c)针对抗原的第一抗原决定簇的两个相同的纳米抗体，和针对不同于所述第一抗原的第二抗原的第三纳米抗体；(d)针对第一抗原的第一抗原决定簇的第一纳米抗体，针对所述第一抗原的第二抗原决定簇的第二纳米抗体，和针对不同于所述第一抗原的第二抗原的第三纳米抗体；或(e)针对第一抗原的第一纳米抗体，针对不同于所述第一抗原的第二抗原的第二纳米抗体，和针对不同于所述第一和第二抗原的第三抗原的第三纳米抗体。
包含至少两个纳米抗体的本发明的多肽，其中至少一个纳米抗体针对第一抗原(即，针对GPCR)，并且至少一个纳米抗体针对第二抗原(即，不同于GPCR)，还叫作本发明的“多特异性”多肽，并且存在于所述多肽中的纳米抗体还在本文中叫作处于“多特异性形式”。因此，例如，本发明的“双特异性”多肽是包括至少一个针对第一抗原(即GPCR)的纳米抗体和至少一个针对第二抗原(即，不同于GPCR)的其它纳米抗体的多肽，而本发明的“三特异性”多肽是这样的多肽，即，其包括至少一个针对第一抗原(即GPCR)的纳米抗体，至少一个针对第二抗原(即，不同于GPCR)的其它纳米抗体，和至少一个针对第三抗原(即，不同于GPCR和所述第二抗原二者)的其它纳米抗体；等等。
因此，以其最简单的形式，本发明的双特异性多肽是本发明的二价多肽(如本文所定义)，其包括针对GPCR的第一纳米抗体，和针对第二抗原的第二纳米抗体，其中所述第一和第二纳米抗体可以任选地通过接头序列(如本文所定义)而连接；而以其最简单形式存在的本发明的三特异性多肽是本发明的三价多肽(如本文所定义)，其包括针对GPCR的第一纳米抗体，针对第二抗原的第二纳米抗体，和针对第三抗原的第三纳米抗体，其中所述第一、第二和第三纳米抗体可以任选地通过一个或多个，并且特别是一个或多个特别是两个接头序列连接。
然而，从上文所述应该清楚，本发明并不限于此，在这种意义上，本发明的多特异性多肽可以包括至少一个针对GPCR的纳米抗体，和任何数目的针对一个或多个不同于GPCR的抗原的纳米抗体。
此外，尽管所述多个纳米抗体在本发明的多肽中的特定顺序或排列可能对本发明最终的多肽的特性具有一些影响(包括，但不限于针对GPCR的或针对所述一个或多个其它抗原的亲和力、特异性、效力、功能性或抗体亲抗原性)也包括在本发明的范围内，但是所述顺序或排列通常不是关键的，并且可以由专业技术人员适当选择，任选地基于本发明的公开内容在一些有限的常规实验之后选择。因此，当提及本发明的特异性多价或多特异性多肽时，应该注意到，这包括相关纳米抗体的任何顺序或排列，除非另外明确指明。
此外，本发明的多肽包含两个或更多个纳米抗体以及一个或多个其它氨基酸序列(如本文所提及)也在本发明的范围之内。
本发明还涉及双特异性免疫球蛋白序列且通常涉及双特异性配体，其中所述双特异性免疫球蛋白序列和/或配体是i)特异性的和/或具有对于表位的亲和力，该表位在结合时能够引起反向拮抗作用；且所述双特异性免疫球蛋白序列和/或配体是ii)特异性的和/或具有对于表位的亲和力，该表位在结合时能够引起拮抗作用。已经意外地发现，使中性拮抗剂与反向拮抗剂连接导致增强的反向拮抗表现(基线水平与单独的反向拮抗剂相比，出乎意料地进一步降低)。
其中术语“免疫球蛋白序列”——不管其在本文中用来指重链抗体或常规的4-链抗体——用作一般术语，包括完整大小的抗体、其单独的链、以及其所有部分、结构域或片段(包括但不限于抗原-结合结构域或片段，分别诸如VHH结构域或VH/VL结构域)。术语抗原结合分子或抗原结合蛋白可与免疫球蛋白序列交替使用，且包括纳米抗体。在本发明的一个实施方案中，免疫球蛋白序列是轻链可变结构域序列(例如VL序列)，或重链可变结构域序列(例如VH序列)；更特别地，免疫球蛋白序列可以是源自常规4-链抗体的重链可变结构域序列或源自重链抗体的重链可变结构域序列。根据本发明，免疫球蛋白序列可以是结构域抗体，或适于用作结构域抗体的氨基酸序列，单结构域抗体，或适于用作单结构域抗体的氨基酸序列，″dAbs”，或适于用作dAbs的氨基酸序列，或纳米抗体，包括但不仅限于VHH序列，且优选是纳米抗体。
关于GPCR存在四种类型的配体：激动剂是使该平衡向着有利于活性状态偏移的配体；反向激动剂或拮抗剂是使该平衡向着有利于失活状态偏移的配体；和中性拮抗剂是不影响该平衡的配体。用于本文中时，“配体”指能够缔合或结合受体的结构部分。根据本发明的方法，配体和受体具有结合常数，该结合常数足够强以容许通过适合检测配体与受体结合的测定法(例如用于检测第二信使产量响应于配体与受体结合的增加或减少的第二信使测定，用于测量蛋白-配体结合的结合测定或用于测量抗体-抗原相互作用的免疫测定)来检测结合。根据本发明的配体包括能够结合受体的核苷酸、抗体、抗原、酶、肽、多肽、小分子或核酸。根据本发明的方法，配体和受体彼此特异性结合(例如，通过共价或氢键结合或通过例如蛋白和配体、抗体和抗原或蛋白亚单位之间的相互作用)。关于含有一个或多个VHH结构域的多价和多特异性多肽及其制剂，也参考Conrath等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)，第276卷，10.7346-7350，2001；Muyldermans，ReviewsinMolecularBiotechnology(分子生物技术综述)74(2001)，277-302；以及例如WO96/34103和WO99/23221。本发明的一些特定的多特异性和/或多价多肽的一些其他实例可以在本文中提及的埃博灵克斯股份有限公司(AblynxN.V.)的申请中找到。
本发明的多特异性多肽的一个优选而非限制性的实例包括至少一个本发明的纳米抗体和至少一个提供增加的半衰期的纳米抗体。例如，所述纳米抗体可以是针对血清蛋白、且特别是人血清蛋白的纳米抗体，所述血清蛋白诸如人血清白蛋白、甲状腺素结合蛋白、(人)转铁蛋白、凝血因子I、免疫球蛋白如IgG、IgE或IgM、或WO04/003019中列出的一种血清蛋白。在这些中，可以结合血清白蛋白(且特别是人血清白蛋白)或结合IgG(且特别是人IgG，例如，参见在Muyldermans，同前所述的综述中记述的纳米抗体VH-1)的纳米抗体是特别优选的(尽管，例如，对于在小鼠或灵长类动物中的实验，可以使用分别针对小鼠血清白蛋白(MSA)或来自所述灵长类动物的血清白蛋白的纳米抗体或与之交叉反应的纳米抗体。然而，对于药物应用，通常优选针对人血清白蛋白或人IgG的纳米抗体。)提供增加的半衰期且可以用在本发明的多肽中的纳米抗体包括针对血清白蛋白的纳米抗体，其记述在埃博灵克斯股份有限公司(AblynxN.V.)的WO04/041865，WO06/122787和其他专利申请中，如上文所述的那些。
例如，提供增加的半衰期以用于本发明的所述一些优选的纳米抗体包括可以与(人)血清白蛋白上不参与血清白蛋白与FcRn结合的氨基酸残基结合的纳米抗体(例如，参见WO06/0122787)；能够与血清白蛋白上不形成血清白蛋白结构域III的一部分的氨基酸残基结合的纳米抗体(例如，参见WO06/0122787)；具有或可以提供增加的半衰期的纳米抗体(例如，参见本文提及的埃博灵克斯股份有限公司(AblynxN.V.)的美国临时申请60/843,349)；针对与来自至少一个哺乳动物物种、且特别是至少一个灵长类物种(诸如但不限于，来自猕猴属(Macaca)的猴子(诸如，并且特别地，食蟹猴(食蟹猴(Macacafascicularis))和/或恒河猴(恒河猴(Macacamulatta)))和狒狒(豚尾狒狒(Papioursinus))，例如，参见埃博灵克斯股份有限公司(AblynxN.V.)的美国临时申请60/843,349)的血清白蛋白交叉反应的针对人血清白蛋白的纳米抗体；可以以不依赖pH的方式结合血清白蛋白的纳米抗体(例如，参见本文提及的埃博灵克斯股份有限公司(AblynxN.V.)的美国临时申请60/850,774)和/或是条件粘合剂的纳米抗体(例如，参见埃博灵克斯股份有限公司(AblynxN.V.)的美国临时申请60/850,775)。
一些特别优选的提供增加的半衰期且可以用于本发明的多肽中的纳米抗体包括WO06/122787中公开的纳米抗体ALB-1至ALB-10(参见表II和III)，其中ALB-8(WO06/122787中的SEQIDNO：62)是特别优选的。
根据本发明的一个具体的但非限制性的方面，除了一个或多个本发明的纳米抗体之外，本发明的多肽还包含至少一个针对人血清白蛋白的纳米抗体。
一般地，包含一个或多个本发明的纳米抗体的具有增加的半衰期的任何本发明的多肽，和具有增加的半衰期的本发明的纳米抗体的任何衍生物或所述多肽的任何衍生物，优选地具有是相对应的本发明的纳米抗体本身半衰期的至少1.5倍、优选至少2倍、如至少5倍、例如至少10倍或多于20倍的半衰期。例如，与相对应的本发明的纳米抗体本身相比较，所述具有增加的半衰期的衍生物或多肽可以具有增加超过1小时、优选超过2小时、更优选超过6小时、如超过12小时、或甚至超过24、48或72小时的半衰期。
在本发明的一个优选的但非限制性的方面中，所述衍生物或多肽可以在人中表现出至少约12小时、优选至少24小时、更优选至少48小时、甚至更优选至少72小时或更多的血清半衰期。例如，所述衍生物或多肽可以具有至少5天(如约5-10天)、优选至少9天(如约9-14天)、更优选至少约10天(如约10-15天)、或至少约11天(如约11-16天)、更优选至少约12天(如约12-18天或更多)、或大于14天(如约14-19天)的半衰期。
根据本发明的一个方面，所述多肽能够与可以增加所述多肽的体内半衰期的一个或多个分子结合。
本发明的多肽在体内是稳定的，并且它们的半衰期通过与抗降解和/或清除或螯合的分子结合来增加。典型地，所述分子是本身具有长久的体内半衰期的天然存在的蛋白。
本发明的多特异性多肽的另一个优选而非限制性的实例包括至少一个本发明的纳米抗体和至少一个这样的纳米抗体，即，所述纳米抗体是本发明的多肽所针对的，和/或允许本发明的多肽透过或进入特异性的器官、组织、细胞、或者细胞的部分或区室，和/或允许所述纳米抗体透过或穿过生物屏障诸如细胞膜、细胞层诸如上皮细胞层、肿瘤包括实体瘤、或血脑屏障。所述的纳米抗体的实例包括针对所需要的器官、组织或细胞的特异性的细胞表面蛋白、标记或表位(例如，与肿瘤细胞相关的细胞表面标记)的纳米抗体，和在WO02/057445和WO06/040153中描述的单结构域靶向脑的抗体片段，其中FC44(WO06/040153中的SEQIDNO：189)和FC5(WO06/040154中的SEQIDNO：190)是优选的实例。
在本发明的多肽中，所述一个或多个纳米抗体和所述一个或多个多肽可以直接彼此连接(例如在WO99/23221中所述)和/或可以通过一个或多个适宜的间隔臂或接头或其任意组合而彼此连接。
用于多价和多特异性多肽的适宜的间隔臂或接头应该是专业技术人员所清楚的，并且通常可以是本领域用来连接氨基酸序列的任何接头或间隔臂。优选地，所述接头或间隔臂适合用于构建意欲药用的蛋白或多肽。
一些特别优选的间隔臂包括本领域中用于连接抗体片段或抗体结构域的间隔臂和接头。这些包括上文所引用的公知背景技术中提及的接头，以及例如在本领域中用于构建双抗体或ScFv片段的接头(在这一方面，然而，应该注意，尽管在双抗体和在ScFv片段中，所用的接头序列应该具有某种长度、某种程度的柔性以及允许相关的VH和VL结构域靠近在一起形成完整的抗原-结合位点的其它特性，但是，由于每一纳米抗体本身形成完整的抗原-结合位点，所以对于用于本发明的多肽的接头的长度或柔性没有特别的限制)。
例如，接头可以是适当的氨基酸序列，并且特别是1-50、优选1-30、诸如1-10个氨基酸残基的氨基酸序列。所述氨基酸序列的一些优选实例包括gly-ser接头，例如，(glyxsery)z型的，诸如(例如(gly4ser)3或(gly3ser2)3，如在WO99/42077中所述，和在本文提及的Ablynx的申请中描述的GS30，GS15、GS9和GS7接头(例如，参见WO06/040153和WO06/122825)，以及铰链样区域如天然存在的重链抗体的铰链区或类似的序列(如在WO94/04678中所述)。
一些其他特别优选的接头是聚丙氨酸(如AAA)，以及接头GS30(在WO06/122825中的SEQIDNO：85)和GS9(在WO06/122825中的SEQIDNO：84)。
其它适宜的接头通常包括有机化合物或聚合物，特别是适用于药用蛋白的那些。例如，聚(乙二醇)部分已经用来连接抗体结构域，参见例如WO04/081026。
下列情形也在本发明范围内，所用的接头的长度、柔性程度和/或其他特性(尽管不是关键的，由于它通常是用在ScFv片段中的接头)可以对本发明最终的多肽的特性具有一些影响，包括但不限于针对GPCR、或针对一种或多种其他抗原的亲和力、特异性或抗体亲抗原性。基于本文的公开内容，专业技术人员应该能够确定用于本发明的特异性多肽的最佳接头，任选地在一些有限的常规实验之后。
例如，在包括针对多聚体抗原(诸如多聚体受体或其他蛋白)的纳米抗体的本发明的多价多肽中，所述接头的长度和柔性优选是这样的，以致其允许在所述多肽中存在的每一个本发明的纳米抗体结合在所述多聚体每个亚基上的抗原决定簇。类似地，在包括针对在同一个抗原上的两个或更多个不同抗原决定簇(例如，针对抗原的不同表位和/或针对多聚体受体、通道或蛋白的不同亚基)的纳米抗体的本发明的多特异性多肽中，所述接头的长度和柔性优选是这样的，以致其允许每个纳米抗体与其目的抗原决定簇结合。同样地，基于本文的公开内容，专业技术人员应该能够确定用于本发明的特异性多肽的最佳接头，任选地在一些有限的常规实验之后。
下列情形也在本发明范围内：所用接头赋予本发明的多肽一种或多种其它有利特性或官能性，和/或提供用于形成衍生物和/或用于官能团附着的一个或多个位点(例如，如本文关于本发明的纳米抗体的衍生物的描述)。例如，包含一个或多个带电荷氨基酸残基(参见上表A-2)的接头可以提供提高的亲水特性，而形成或包含小的表位或标记的接头可以用于检测、鉴定和/或纯化目的。并且，基于本文的公开内容，专业技术人员应该能够确定用于本发明的特异性多肽的最佳接头，任选地在一些有限的常规实验之后。
最后，当两个或更多个接头用于本发明的多肽时，这些接头可以相同或不同。并且，基于本文的公开内容，专业技术人员应该能够确定用于本发明的特异性多肽的最佳接头，任选地在一些有限的常规实验之后。
通常，为了使表达和生产容易，本发明的多肽将是线性多肽。然而，本发明在其最广泛意义上不限于此。例如，当本发明的多肽包括三个或多个纳米抗体时，可以利用具有三个或更多个“臂”的接头连接它们，所述每个“臂”与纳米抗体连接，以提供“星形”的构建体。尽管通常较不优选，但是还可以使用环形的构建体。
本发明还包括本发明多肽的衍生物，其可以基本上类似于本发明纳米抗体的衍生物，即，如本文所述。
本发明还包括“基本上由”本发明的多肽组成的蛋白或多肽(其中措辞“基本上由……组成”具有基本如上文所示相同的意思)。
根据本发明的一个方面，本发明的多肽基本上以分离的形式存在，如本文所定义。
本发明的氨基酸序列、纳米抗体、多肽和核酸可以以本身已知的方式制备，专业技术人员应该从本文的进一步描述中而清楚。例如，本发明的纳米抗体和多肽可以以本身已知用于制备抗体且特别是用于制备抗体片段(包括但不限于(单)结构域抗体和ScFv片段)的任何方式制备。制备所述氨基酸序列、纳米抗体、多肽和核酸的一些优选但非限制性的方法包括本文所述的方法和技术。
专业技术人员应该清楚，用于制备本发明的氨基酸序列、纳米抗体和/或多肽的一种特别有用的方法通常包括下列步骤：
i)在适宜的宿主细胞或宿主生物体(本文还叫作“本发明的宿主”)中或在另一种适宜的表达系统中，表达编码所述本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽的核酸(本文还叫作“本发明的核酸”)，任选地接着进行：
ii)分离和/或纯化这样获得的本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽。特别地，这样的方法可以包括下列步骤：
i)在某种条件下培养和/或维持本发明的宿主，所述条件是这样的，以致所述本发明的宿主表达和/或生产至少一种本发明的氨基酸序列、纳米抗体和/或多肽；任选地接着进行：
ii)分离和/或纯化这样获得的本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽。
本发明的核酸可以是单链或双链DNA或RNA的形式，并且优选地是双链DNA形式。例如，本发明的核苷酸序列可以是基因组DNA、cDNA或合成的DNA(诸如具有特别适用于在要用的宿主细胞或宿主生物体中表达的密码子应用的DNA)。
根据本发明的一个方面，本发明的核酸是基本上分离的形式，如本文所定义。
本发明的核酸还可以是这样的形式，存在于和/或是载体的一部分，诸如例如质粒、黏端质粒或YAC，其也可以是基本上分离的形式。
本发明的核酸可以以本身已知的方法制备或获得，其基于关于本文给出的本发明的多肽的氨基酸序列的信息，和/或可以从适当的天然来源分离。为了提供类似物，例如，编码天然存在的VHH结构域的核苷酸序列可以进行位点定向诱变，以提供编码所述类似物的本发明的核酸。并且，专业技术人员应该清楚，为了制备本发明的核酸，一些核苷酸序列，诸如至少一种编码纳米抗体的核苷酸序列，以及例如编码一种或多种接头的核酸，还可以以适当的方法连接在一起。
用于产生本发明的核酸的技术应该是专业技术人员所清楚的，并且例如可以包括但不限于，自动DNA合成；位点定向诱变；将两个或多个天然存在的和/或合成的序列(或者其两个或更多个部分)组合，引入引起剪截表达产物表达的突变；引入一个或多个限制性位点(例如，以产生可以使用适宜的限制性酶容易地消化和/或连接的盒和/或区)，和/或通过使用一个或多个“错配”引物，使用例如GPCR的天然存在形式的序列作为模板的PCR反应的方法引入突变。这些以及其它技术应该是专业技术人员所清楚的，并且参考也参见上文提及的标准手册，诸如Sambrook等和Ausubel等，以及下文的实施例。
本发明的核酸还可以是这样的形式，存在于和/或是遗传构建体的一部分，这对于本领域的技术人员应该是清楚的。这样的遗传构建体通常包括至少一种本发明的核酸，其任选地与本身已知的一个或多个遗传构建体元件连接，诸如例如一个或多个适宜的调节元件(诸如适当的启动子、增强子、终止子、等等)和本文提到的其它遗传构建体元件。包括至少一种本发明的核酸的所述遗传构建体在本文也叫作“本发明的遗传构建体”。
本发明的遗传构建体可以是DNA或RNA，并且优选地是双链DNA。本发明的遗传构建体还可以是适于意欲的宿主细胞或宿主生物体的转化的形式，适于结合到要用的宿主细胞的基因组DNA中的形式，或者适于在要用的宿主生物体中独立复制、维持和/或遗传的形式。例如，本发明的遗传构建体可以是载体形式，诸如例如质粒、黏端质粒、YAC、病毒载体或转座子。特别地，所述载体可以是表达载体，即，可以提供体外和/或体内表达的载体(例如，在适宜的宿主细胞、宿主生物体和/或表达系统中)。
在一个优选的但非限制性的方面中，本发明的遗传构建体包括
i)至少一种本发明的核酸；其可操作性地连接于
ii)一个或多个调节元件，诸如启动子和任选地适宜的终止子；
并且任选地还有
iii)本身已知的一个或多个其它遗传构建体元件；
其中术语“调节元件”、“启动子”、“终止子”和“可操作性地连接”具有它们在本领域中的通用意思(如本文进一步所述)；并且其中存在于遗传构建体中的所述“其它元件”，例如，可以是3’-或5’-UTR序列、前导序列、选择标记、表达标记/报道基因、和/或可以促进或增加转化或整合(效率)的元件。用于所述遗传构建体的这些和其它适宜的元件对于专业技术人员应该是清楚的，并且例如可能取决于所用的构建体、要用的宿主细胞或宿主生物体的类型；本发明的目的核苷酸序列在其中表达的方式(例如，通过组成型的、瞬时的或可诱导的表达)；和/或要用的转化技术。例如，本身已知用于抗体和抗体片段(包括但不限于(单)结构域抗体和ScFv片段)表达和生产的调节序列、启动子和终止子可以以基本上相似的方式使用。
优选地，在本发明的遗传构建体中，所述至少一种本发明的核酸和所述调节元件，以及任选地所述一个或多个其它元件，彼此“可操作性地连接”，这通常意指它们彼此是功能性关系。例如，如果所述启动子能够起始或者另外控制/调节编码序列的转录和/或表达，那么启动子被视为与编码序列“可操作性地连接”(其中所述编码序列应该理解为“受控于”所述启动子)。一般地，当两个核苷酸序列可操作性地连接时，它们应该在相同的方向，并且通常还在同一阅读框中。它们通常还应该基本上邻接，尽管这也可以不是必需的。
优选地，本发明的遗传构建体的调节以及其它元件是这样的，即，它们能够在要用的宿主细胞或宿主生物体内提供它们需要的生物学功能。
例如，在要用的宿主细胞或宿主生物体中，启动子、增强子或终止子应该是“可操作的”，这意味着(例如)所述启动子应该能够起始或者另外控制/调节与其可操作性地连接(如本文所定义)的核苷酸序列——例如，编码序列——的转录和/或表达。
一些特别优选的启动子包括但不限于，本身已知用于在本文提及的宿主细胞中表达的启动子；并且特别是用于在细菌细胞中表达的启动子，诸如本文提及的那些和/或在实施例中所用的那些。
选择标记应该是这样的，即，其允许——即，在适当的选择条件下——已经(成功地)转化了本发明的核苷酸序列的宿主细胞和/或宿主生物体与没有(成功地)转化的宿主细胞/生物体区分开来。所述标记的一些优选的但非限制性的实例是提供针对抗生素(诸如卡那霉素或氨苄青霉素)的抗性的基因，提供温度抗性的基因，或者在培养基中不存在某些因子、化合物和/或(食物)成分时允许所述宿主细胞或宿主生物体维持的基因，所述因子、化合物和/或(食物)成分是未转化的细胞或生物体生存所必需的。
前导序列应该是这样的，以致——在要用的宿主细胞或宿主生物体中——其允许理想的翻译后修饰和/或以致其将转录的mRNA导向细胞的理想部分或细胞器。前导序列还可以允许从所述细胞分泌表达产物。同样地，前导序列可以是在所述宿主细胞或宿主生物体中可操作的任何原-(pro-)、前-(pre-)或前原-(prepro-)序列。对于在细菌细胞中表达，前导序列可以不是必需的。例如，本身已知用于抗体和抗体片段(包括但不限于单结构域抗体和ScFv片段)表达和生产的前导序列可以以基本上相似的方式使用。
表达标记或报道基因应该是这样的，即，——在宿主细胞或宿主生物体中——其允许检测所述遗传构建体(其上存在的基因或核苷酸序列)的表达。表达标记任选地还可以允许表达产物的定位，例如，定位在细胞的特定部分或细胞器中和/或在多细胞生物体的特定细胞、组织、器官或部分中。所述报道基因还可以表达为与本发明的氨基酸序列融合的蛋白融合体。一些优选的但非限制性的实例包括荧光蛋白如GFP。
适宜的启动子、终止子和其它元件的一些优选的但非限制性的实例包括可以用于在本文提及的宿主细胞中表达的那些；并且特别是适用于在细菌细胞中表达的那些，诸如本文提及的那些和/或在下述实施例中所用的那些。关于可以存在于/用于本发明的遗传构建体的启动子、选择标记、前导序列、表达标记和其它元件的一些(其它)非限制性的实例——诸如终止子、转录和/或翻译增强子和/或整合因子——参考上文提及的通用手册，诸如Sambrook等和Ausubel等，以及WO95/07463，WO96/23810，WO95/07463，WO95/21191，WO97/11094，WO97/42320，WO98/06737，WO98/21355，US-A-7,207,410，US-A-5,693,492和EP1085089中给出的实例。其它实例对于专业技术人员应该是清楚的。参考也参见上文引用的公知背景技术和本文引用的其它参考文献。
本发明的遗传构建体通常可以通过将本发明的核苷酸序列与上文所述的一个或多个其它元件适当地连接而提供，例如应用上文提及的通用手册诸如Sambrook等和Ausubel等中所述的技术。
通常，本发明的遗传构建体通过将本发明的核苷酸序列插入到本身已知的适当的(表达)载体中而获得。适当的表达载体的一些优选的但非限制性的实例是下述实施例中所用的那些，以及本文提及的那些。
本发明的核酸和/或本发明的遗传构建体可以用于转化宿主细胞或宿主生物体，即，用于表达和/或生产本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽。适当的宿主或宿主细胞是专业技术人员所清楚的，并且例如可以是任何适当的真菌的、原核的或真核的细胞或细胞系，或者任何适当的真菌的、原核的或真核的生物体，例如：
-细菌菌株，其包括但不限于革兰氏-阴性菌株，诸如大肠杆菌(Escherichiacoli)菌株；变形菌属(Proteus)菌株，例如奇异变形菌(Proteusmirabilis)菌株；假单胞菌属(Pseudomonas)菌株，例如荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)菌株；以及革兰氏-阳性菌株，诸如芽孢杆菌属(Bacillus)菌株，例如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)菌株或短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)菌株；链霉菌属(Streptomyces)菌株，例如浅青紫链霉菌(Streptomyceslividans)菌株；葡萄球菌属(Staphylococcus)菌株，例如肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)菌株；以及乳球菌属(Lactococcus)菌株，例如乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)菌株；
-真菌细胞，其包括但不限于来自下列各项物种的细胞：木霉属(Trichoderma)，例如Trichodermareesei的物种；脉孢菌属(Neurospora)，例如粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)；粪壳属(Sordaria)，例如大孢粪壳(Sordariamacrospora)；曲霉菌(Aspergillus)，例如黑曲霉(Aspergillusniger)或酱油曲霉(Aspergillussojae)；或其它丝状真菌；
-酵母细胞，其包括但不限于来自下列各项物种的细胞：酵母属(Saccharomyces)，例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)；裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)；毕赤酵母属(Pichia)，例如巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)或Pichiamethanolica；汉逊酵母属(Hansenula)，例如多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，例如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)；Arxula，例如Arxulaadeninivorans；Yarrowia，例如Yarrowialipolytica；
-两栖类细胞或细胞系，诸如爪蟾卵母细胞(Xenopusoocytes)；
-来源于昆虫的细胞或细胞系，诸如衍生于鳞翅目(lepidoptera)的细胞/细胞系，包括但不限于贪夜蛾(Spodoptera)SF9和Sf21细胞，或者衍生于果蝇属(Drosophila)的细胞/细胞系，诸如Schneider和Kc细胞；
-植物或植物细胞，例如在烟草(tobacco)植物中；和/或
-哺乳动物细胞或细胞系，例如来源于人的细胞或细胞系、来源于哺乳动物的细胞或细胞系，包括但不限于CHO-细胞、BHK-细胞(例如BHK-21细胞)，以及人细胞或细胞系，诸如HeLa，COS(例如COS-7)和PER.C6细胞；
以及本身已知的用于表达和生产抗体及抗体片段(包括但不限于(单)结构域抗体和ScFv片段)的所有其它宿主或宿主细胞，这对于专业技术人员应该是清楚的。参考还参见上文引用的公知背景技术，以及例如WO94/29457；WO96/34103；WO99/42077；Frenken等，(1998)，同前所述；Riechmann和Muyldermans，(1999)，同前所述；vanderLinden，(2000)，同前所述；Thomassen等，(2002)，同前所述；Joosten等，(2003)，同前所述；Joosten等，(2005)，同前所述；以及本文所引用的其它参考文献。
本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽还可以被引入多细胞生物体的一个或多个细胞、组织或器官中并且在其中表达，例如用于预防和/或治疗目的(例如，作为基因治疗)。为了这一目的，可以将本发明的核苷酸序列以任何适当的方式引入到细胞或组织中，例如照此(例如使用脂质体)或者在它们插入到适当的基因治疗载体(例如，衍生于反转录病毒诸如腺病毒，或者细小病毒诸如腺伴随病毒)中之后。同样对于专业技术人员应该是清楚的，这样的基因治疗可以在体内进行和/或在患者体内原位进行，其通过给患者或患者的特定细胞或特定组织或器官施用本发明的核酸或者编码其的适当的基因治疗载体而进行；或者适宜的细胞(通常取自要治疗的患者的身体，诸如移植的淋巴细胞、骨髓吸出物或活组织切片)可以用本发明的核苷酸序列在体外进行治疗，然后适当地(重新)引入回到所述患者的身体内。所有这些可以使用专业技术人员公知的基因治疗载体、技术和递送系统进行，例如，在下列各项中所述：Culver，K.W.，″基因治疗(GeneTherapy)″，1994，p.xii，MaryAnnLiebert公司，出版，NewYork，纽约)；Giordano，自然F医学(NatureFMedicine)2(1996)，534-539；Schaper，循环研究(Circ.Res).79(1996)，911-919；Anderson，科学(Science)256(1992)，808-813；Verma，自然(Nature)389(1994)，239；Isner，柳叶刀(Lancet)348(1996)，370-374；Muhlhauser，循环研究(Circ.Res).77(1995)，1077-1086；Onodera，血液学(Blood)91；(1998)，30-36；Verma，基因治疗(GeneTher).5(1998)，692-699；Nabel，纽约科学院年刊(Ann.N.Y.Acad.Sci.)：811(1997)，289-292；Verzeletti，人类基因治疗(Hum.GeneTher.)9(1998)，2243-51；Wang，自然医学(NatureMedicine)2(1996)，714-716；WO94/29469；WO97/00957，US5,580,859；US5,5895466；或Schaper，现代生物技术观点(CurrentOpinioninBiotechnology)7(1996)，635-640。例如，在本领域中已描述ScFv片段(Afanasieva等，基因治疗(GeneTher.)，10，1850-1859(2003))和双抗体(Blanco等，免疫学杂志(J.Immunol)，171，1070-1077(2003))的原位表达。
对于纳米抗体在细胞中的表达，它们还可以作为所谓的“细胞内抗体”表达，例如在WO94/02610，WO95/22618和US-A-7004940；WO03/014960中所述；在Cattaneo，A.和Biocca，S.(1997)细胞内抗体：开发和应用(IntracellularAntibodies：DevelopmentandApplications).Landes和Springer-Verlag；以及在Kontermann，方法(Methods)34，(2004)，163-170中所述。
例如，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽还可以在转基因哺乳动物的乳中产生，例如在兔、母牛、山羊或绵羊的乳中(对于将转基因引入哺乳动物的通用技术参见例如US-A-6,741,957，US-A-6,304,489和US-A-6,849,992)，在植物中或植物的部分中产生，所述植物部分包括但不限于它们的叶、花、果实、种子、根或块茎(例如在烟草、玉米、大豆或苜蓿中)中，或者例如在蚕家蚕(Bombixmori)的蛹中。
此外，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽还可以在不含细胞的表达系统中表达和/或生产，并且这样的系统的适当的实例应该是专业技术人员所清楚的。一些优选的但非限制性的实例包括在麦芽胚系统中的表达；在兔网织红细胞裂解物中表达；或者在大肠杆菌(E.coli)Zubay系统中表达。
如上文提及，应用纳米抗体的一个优点在于，基于此的多肽可以通过在适宜的细菌系统中表达而制备，并且适宜的细菌表达系统、载体、宿主细胞、调节元件等对专业技术人员是清楚的，例如参考上文引用的参考文献。然而，应该注意，本发明在其最广泛意义上并不限于在细菌系统中表达。
优选地，在本发明中，应用(体内或体外)表达系统，诸如细菌表达系统，其以适于药用的形式提供本发明的多肽，并且所述表达系统也是专业技术人员所清楚的。专业技术人员还应该清楚，适于药用的本发明的多肽可以使用肽合成技术制备。
对于工业规模的生产，用于纳米抗体或包含纳米抗体的蛋白治疗物的(工业)生产的优选的异源宿主包括大肠杆菌、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、酿酒酵母(S.cerevisiae)的菌株，其适用于大规模表达/生产/发酵，并且特别适用于大规模药物(即，GMP级别)表达/生产/发酵。所述菌株的适当的实例是专业技术人员所清楚的。所述菌株以及生产/表达系统也可从公司诸如Biovitrum(Uppsala，瑞典)获得。
备选地，哺乳动物细胞系，特别是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，可以用于大规模表达/生产/发酵，并且特别用于大规模药物表达/生产/发酵。并且，所述表达/生产系统也可从上文提及的一些公司获得。
具体的表达系统的选择部分取决于特定的翻译后修饰的需要，更具体地是糖基化的需要。生产包含纳米抗体的重组蛋白，对于所述重组蛋白糖基化是理想的或者必需的，将使得应用具有将所表达的蛋白糖基化的能力的哺乳动物表达宿主成为必要。在这一方面，专业技术人员应该清楚，获得的糖基化模式(即，附着的残基的种类、数量和位置)将取决于表达所用的细胞或细胞系。优选地，使用人细胞或细胞系(即，形成基本上具有人糖基化模式的蛋白)，或者使用另一种哺乳动物细胞系，其可以提供基本上和/或功能上与人糖基化作用相同的糖基化模式或者至少模拟人糖基化作用。一般地，原核宿主诸如大肠杆菌不具有将蛋白糖基化的能力，并且应用更低等真核细胞诸如酵母通常导致与人糖基化作用不同的糖基化模式。不过，应该理解，所有前述宿主细胞和表达系统可以用于本发明，这取决于要获得的理想的氨基酸序列、纳米抗体或多肽。
因此，根据本发明的一个非限制性方面，本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽被糖基化。根据本发明的另一个非限制性方面，本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽未被糖基化。
根据本发明的一个优选的但非限制性的方面，本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽在细菌细胞中生产，特别是在适于大规模药物生产的细菌细胞，诸如上文提及的菌株的细胞中生产。
根据本发明另一个优选的但非限制性的方面，本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽在酵母细胞中生产，特别是在适于大规模药物生产的酵母细胞，诸如上文提及的物种的细胞中生产。
根据本发明另一个优选的但非限制性的方面，本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽在哺乳动物细胞中生产，特别是在人细胞或人细胞系的细胞中，并且更特别是在适于大规模药物生产的人细胞或人细胞系的细胞中，诸如上文提及的细胞系中生产。
当应用在宿主细胞中的表达来生产本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽时，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽可以在细胞内产生(例如，在细胞溶质中，在周质或在内含体中)，然后从宿主细胞分离，并且任选地进一步纯化；或者可以在细胞外产生(例如，在培养所述宿主细胞的培养基中)，然后从培养基分离，并且任选地进一步纯化。当使用真核宿主细胞时，由于极大地促进进一步的分离以及获得的纳米抗体和蛋白的下游处理，所以通常优选细胞外生产。除了少数种类的蛋白诸如毒素和溶血素之外，细菌细胞诸如上文提及的大肠杆菌的菌株一般不向细胞外分泌蛋白，并且在大肠杆菌内的分泌生产是指蛋白穿过内膜易位到周质空间。周质生产相对于细胞溶质生产提供一些优点。例如，在通过特异的信号肽酶将分泌信号序列裂解之后，所分泌的产物的N-端氨基酸序列可以与天然基因产物相同。此外，在周质中比在细胞质中似乎存在少得多的蛋白酶活性。另外，由于在周质中更少的污染蛋白，所以蛋白纯化更简单。另一个优点是，由于周质提供比细胞质更加氧化性的环境，所以可以形成正确的二硫键。在大肠杆菌中过量表达的蛋白通常在不溶的聚集体，即所谓的内含体中发现。这些内含体可以位于细胞溶质中或在周质中；从这些内含体回收生物活性蛋白需要变性/重折叠步骤。许多重组蛋白，包括治疗性蛋白，是从内含体回收的。备选地，专业技术人员应该清楚，可以使用细菌的重组菌株，其已被遗传修饰，以分泌理想的蛋白，并且特别是本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽。
因此，根据本发明的一个非限制性方面，本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽是在细胞内产生并且从宿主细胞分离，并且特别是从细菌细胞或者从细菌细胞中的内含体中分离的氨基酸序列、纳米抗体或多肽。根据本发明的另一个非限制性的方面，本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽是在细胞外产生并且从培养宿主细胞的培养基中分离的氨基酸序列、纳米抗体或多肽。
与这些宿主细胞一起使用的一些优选的但非限制性的启动子包括，
-用于在大肠杆菌中表达：lac启动子(及其衍生物，诸如lacUV5启动子)；阿拉伯糖启动子；噬菌体λ的左向-(PL)和右向(PR)启动子；trp操纵子的启动子；杂合lac/trp启动子(tac和trc)；T7-启动子(更具体地是T7-噬菌体基因10的启动子)以及其它T-噬菌体启动子；Tn10四环素抗性基因的启动子；上述启动子的工程变体，其包括一个或多个拷贝的外来调节操纵基因序列；
-用于在酿酒酵母中表达：组成型：ADH1(醇脱氢酶1)，ENO(烯醇化酶)，CYC1(异-1细胞色素c)，GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)；PGK1(磷酸甘油酸激酶)，PYK1(丙酮酸激酶)；调节型：GAL1，10，7(半乳糖代谢酶)，ADH2(醇脱氢酶2)，PHO5(酸性磷酸酶)，CUP1(铜金属硫蛋白)；异源型：CaMV(花椰菜花叶病毒35S启动子)；
-用于在毕赤酵母(Pichiapastoris)中表达：AOX1启动子(醇氧化酶I)；
-用于在哺乳动物细胞中表达：人巨细胞病毒(hCMV)即时早期增强子/启动子；人巨细胞病毒(hCMV)即时早期启动子变体，其包含两个四环素操纵基因序列，以致所述启动子可以受Tet抑制剂调节；单纯疱疹病毒胸苷激酶(TK)启动子；劳斯肉瘤病毒长末端重复(RSVLTR)增强子/启动子；来自于人、黑猩猩、小鼠或大鼠的延伸因子1α(hEF-1α)启动子；SV40早期启动子；HIV-1长末端重复启动子；β-肌动蛋白启动子；
与这些宿主细胞一起使用的一些优选的但非限制性的载体包括：
-用于在哺乳动物细胞中表达的载体：pMAMneo(Clontech)，pcDNA3(Invitrogen)，pMC1neo(Stratagene)，pSG5(Stratagene)，EBO-pSV2-neo(ATCC37593)，pBPV-1(8-2)(ATCC37110)，pdBPV-MMTneo(342-12)(ATCC37224)，pRSVgpt(ATCC37199)，pRSVneo(ATCC37198)，pSV2-dhfr(ATCC37146)，pUCTag(ATCC37460)和1ZD35(ATCC37565)，以及基于病毒的表达系统，诸如基于腺病毒的那些；
-用于在细菌细胞中表达的载体：pET载体(Novagen)和pQE载体(Qiagen)；
-用于在酵母或其它真菌细胞中表达的载体：pYES2(Invitrogen)和毕赤表达载体(Invitrogen)；
-用于在昆虫细胞中表达的载体：pBlueBacII(Invitrogen)和其它杆状病毒载体；
-用于在植物或植物细胞中表达的载体：例如基于花椰菜花叶病毒或烟草花叶病毒的载体，适宜的农杆菌(Agrobacterium)菌株，或基于Ti-质粒的载体。
与这些宿主细胞一起使用的一些优选的但非限制性的分泌序列包括：
-用于细菌细胞诸如大肠杆菌：PelB，Bla，OmpA，OmpC，OmpF，OmpT，StII，PhoA，PhoE，MalE，Lpp，LamB等；TAT信号肽，溶血素C-端分泌信号；
-用于酵母：α-交配因子前原-序列(α-matingfactorprepro-sequence)，磷酸酶(pho1)，转化酶(Suc)，等；
-用于哺乳动物细胞：在靶蛋白是真核起源的情形中固有的信号(indigenoussignal)；鼠Igκ-链V-J2-C信号肽；等。
用于转化本发明的宿主或宿主细胞的适宜的技术对专业技术人员是清楚的，并且可以取决于要用的宿主细胞/宿主生物体和要用的遗传构建体。参考也参见上文提及的手册和专利申请。
转化后，可以进行检测并且选择已经成功转化了本发明的核苷酸序列/遗传构建体的那些宿主细胞或宿主生物体的步骤。例如，这可以是基于存在于本发明的遗传构建体中的选择标记的选择步骤，或者是包括检测本发明的氨基酸序列的步骤，例如，使用特异的抗体进行。
转化的宿主细胞(其可以是稳定的细胞系的形式)或宿主生物体(其可以是稳定的突变系或株系的形式)形成本发明的另一方面。
优选地，这些宿主细胞或宿主生物体是这样的，以致它们表达或者(至少)能够表达(例如，在适宜的条件下)本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽(并且在宿主生物体的情形中：在它的至少一种细胞、部分、组织或器官中)。本发明还包括本发明的宿主细胞或宿主生物体的其它世代、后代和/或子代，例如，其可以通过细胞分裂或者通过有性或无性生殖获得。
为了生产/获得本发明的氨基酸序列的表达，所述转化的宿主细胞或转化的宿主生物体通常可以在本发明(理想的)氨基酸序列、纳米抗体或多肽得到表达/生产的条件下保存、维持和/或培养。适宜的条件对专业技术人员是清楚的，并且通常取决于所用的宿主细胞/宿主生物体，以及取决于控制本发明的(相关)核苷酸序列表达的调节元件。此外，参考参见在上文关于本发明的遗传构建体段落中提及的手册和专利申请。
一般地，适宜的条件可以包括使用适宜的培养基，存在适宜的食物来源和/或适宜的营养素，使用适当的温度，并且任选地存在适当的诱导因子或化合物(例如，在本发明的核苷酸序列在可诱导启动子的控制下的情形中)；所有这些可以由专业技术人员选择。此外，在这样的条件下，本发明的氨基酸序列可以以组成型方式、以瞬时方式、或者只在适当地诱导时表达。
专业技术人员还应该清楚，本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽可以(首先)以不成熟的形式(如上文提及)产生，其然后可以进行翻译后修饰，这取决于所用的宿主细胞/宿主生物体。并且，本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽可以被糖基化，这也取决于所用的宿主细胞/宿主生物体。
然后，本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽可以从宿主细胞/宿主生物体和/或从培养所述宿主细胞或宿主生物体的培养基中分离，这使用本身已知的蛋白分离和/或纯化技术，诸如(制备级)层析和/或电泳技术、差别沉淀技术、亲和技术(例如，使用与本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽融合的特异性的、可裂解的氨基酸序列)和/或制备级免疫学技术(即，使用针对要被分离的氨基酸序列的抗体)进行。
通常，对于药物应用，本发明的多肽可以配制成药物制剂或组合物，其包括至少一种本发明的多肽和至少一种药用载体、稀释剂或赋形剂和/或佐剂，和任选地一种或多种其它药物活性多肽和/或化合物。通过非限制性实例的方式，这样的制剂可以是适于下列各项的形式：口服给药，肠胃外给药(诸如通过静脉内、肌内或皮下注射或静脉内输注)，局部给药，通过吸入、皮肤贴片、植入物、栓剂给药，等等。所述适宜的给药形式——其可以是固体、半固体或液体，取决于给药的方式——以及制备其所用的方法和载体，对专业技术人员是清楚的，并且在本文中进一步描述。
因此，在另一个方面中，本发明涉及一种药物组合物，其包含至少一种本发明的氨基酸，至少一种本发明的纳米抗体或至少一种本发明的多肽，以及至少一种适当的载体、稀释剂或赋形剂(即，适于药用)，以及任选地一种或多种其它活性物质。
通常，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽可以以本身已知的任何适当的方法配制和施用，例如，关于其的参考文献参见上文引用的公知背景技术(并且特别参见WO04/041862，WO04/041863，WO04/041865和WO04/041867)，以及参见标准手册，诸如雷明顿药物科学(Remington’sPharmaceuticalSciences)，第18版，Mack出版公司，美国(1990)或雷明顿，制药科学和实践(Remington，theScienceandPracticeofPharmacy)，第21版，LippincottWilliams和Wilkins(2005)。
例如，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽可以本身已知的用于常规抗体及抗体片段(包括ScFv’s和双抗体)和其它药物活性蛋白的任何方法配制和施用。所述制剂以及制备其的方法对于专业技术人员是清楚的，并且例如，包括适于肠胃外给药(例如静脉内、腹膜内、皮下、肌内、腔内、动脉内或鞘内给药)或适于局部(及透皮的或皮内)给药的制剂。
例如，用于肠胃外给药的制剂可以是适于输注或注射的无菌溶液、混悬液、分散液或乳剂。例如，用于所述制剂的适宜的载体或稀释剂包括但不限于，无菌水以及水性缓冲液和溶液，诸如生理磷酸盐缓冲液、林格溶液、葡萄糖溶液、和Hank′s溶液；水油(wateroils)；甘油；乙醇；二醇诸如丙二醇，或者以及矿物油，动物油和植物油例如花生油、豆油，及它们的适宜的混合物。通常优选水性溶液或混悬液。
本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽还可以使用递送的基因治疗方法进行施用。参见，例如，美国专利号5,399,346，其完全结合作为参考。使用递送的基因治疗方法，转染了编码本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽的基因的原代细胞另外可以用组织特异性启动子转染，以靶向特异的器官、组织、移植物、肿瘤或细胞，并且另外可以使用用于亚细胞定位表达的信号和稳定序列进行转染。
因此，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽可以全身施用，例如，口服地，与药用赋形剂诸如惰性稀释剂或可同化的食用载体组合。它们可以包封在硬壳或软壳的明胶胶囊中，可以压缩成片剂，或者可以直接与患者日常饮食的食物组合。对于口服治疗性施用，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽可以与一种或多种赋形剂组合，并且以可吸收的片剂、颊含片剂、药片、胶囊、酏剂、混悬剂、糖浆、糯米纸囊剂等形式使用。所述组合物和制剂应该包含至少0.1％的本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽。当然，所述组合物和制剂的百分数可以变化，并且可以便利地在所给单位剂型的约2-约60重量％之间。本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽在这样的治疗有效组合物中的量是这样的，以致获得有效的剂量水平。
所述片剂、药片、丸剂、胶囊等还可以包含下列各项：粘合剂，诸如黄蓍胶、阿拉伯树胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，诸如磷酸二钙；崩解剂，诸如玉米淀粉、马铃薯淀粉、褐藻酸等；润滑剂，诸如硬脂酸镁；并且可以加入甜味剂，诸如蔗糖、果糖、乳糖或阿司帕坦，或者调味剂，诸如薄荷、冬青油、或樱桃调味剂。当单位剂型是胶囊时，除上述类型的物质之外，它还可以包含液体载体，诸如植物油或聚乙二醇。各种其它物质可以作为涂层存在，或者另外修饰所述固体单位剂型的物理形式。例如，片剂、丸剂、或胶囊可以用胶、蜡、紫胶或糖等包被。糖浆或酏剂可以包含本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽，作为甜味剂的蔗糖或果糖，作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯类，染料和调味剂诸如樱桃或橙味调味剂。当然，在制备任何单位剂型中所用的任何物质都应该是药物可接受的，并且在所用的量上基本上无毒。另外，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽可以结合在持续释放的制剂和装置中。
用于口服给药的制备物和制剂还可以被提供以肠衣，所述肠衣允许本发明的构建体抵抗胃环境，并且进入肠内。更一般地，用于口服给药的制备物和制剂可以适当地配置成用于递送到胃肠道的任何理想的部分。另外，适宜的栓剂可以用于递送到胃肠道内。
本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽还可以通过输注或注射进行静脉内或腹膜内施用。本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽或者它们的盐的溶液可以在水中制备，任选地与无毒表面活性剂混合。分散体还可以在甘油、液体聚乙二醇、三醋精及其混合物中以及在油中制备。在普通的保存和使用条件下，这些制剂包含防腐剂以防止微生物的生长。
适于注射或输注的药物剂型可以包括包含活性成分的无菌的水溶液或分散液或者无菌粉剂，其适合即时制备无菌注射或输注溶液或分散体，任选地包封在脂质体中。在所有情形中，在制备和保存条件下，最终剂型必须是无菌的、流动的和稳定的。液体载体或赋形剂可以是溶剂或液体分散介质，例如，其包括水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、植物油、无毒甘油酯及其适当的混合物。可以保持适当的流动性，例如，通过形成脂质体，在分散剂的情形中通过保持需要的颗粒大小或者通过使用表面活性剂。防止微生物作用可以通过各种抗细菌和抗真菌试剂获得，例如，对羟基苯甲酸酯类、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞(thimerosal)等。在许多情形中，优选地包括等渗剂，例如，糖、缓冲剂或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在所述组合物中使用延迟吸收剂例如单硬脂酸铝和明胶而获得。
无菌注射溶液通过将需要量的本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽结合在适当的溶剂中，当需要时，与上文列举的各种其它成分一起结合，然后进行过滤除菌而制备。在用无菌粉剂制备无菌注射溶液的情形中，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分加上在先前的无菌过滤溶液中存在的任何其它理想的成分的粉剂。
对于局部给药，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽可以以纯的形式应用，即，在它们是液体的情形中。然而，通常理想地将它们作为与皮肤病学可接受的载体结合的组合物或制剂施用到皮肤上，所述载体可以是固体或液体。
有用的固体载体包括细碎分裂的固体，诸如滑石、粘土、微晶纤维素、硅石、矾土等。有用的液体载体包括水、羟烷类或二醇类或水-醇/二醇掺合剂，其中本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽可以以有效水平溶解或分散，任选地在无毒表面活性剂的帮助下。可以添加佐剂诸如香味剂和其它抗微生物剂，以将给定用途的特性最优化。得到的液体组合物可以通过吸收衬垫应用，用于浸渍的绷带及其它敷料，或者使用泵型或气溶胶喷雾器喷到感染区域。
增稠剂诸如合成的聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐及酯、脂肪醇、改性纤维素或改性的矿物质还可以与液体载体一起使用，以形成易涂开的糊剂、凝胶、药膏、皂剂等，用于直接涂覆到使用者的皮肤。
可以用于将本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽递送到皮肤的有用的皮肤病用组合物的实例是本领域已知的；例如，参见Jacquet等(美国专利号4,608,392)，Geria(美国专利号4,992,478)，Smith等(美国专利号4,559,157)和Wortzman(美国专利号4,820,508)。
本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽的有用剂量可以通过比较它们的体外活性和在动物模型中的体内活性而确定。将在小鼠和其它动物中的有效剂量外推至人的方法是本领域已知的；例如，参见美国专利号4,938,949。
通常，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽在液体组合物诸如洗液中的浓度约0.1-25重量-％，优选地约0.5-10重量-％。在半固体或固体组合物诸如凝胶或粉剂中的浓度约0.1-5重量-％，优选地约0.5-2.5重量-％。
需要用于治疗的本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽的量不但随着所选的特定的氨基酸序列、纳米抗体或多肽而变化，而且随着施用途径、要治疗的紊乱的性质以及患者的年龄和紊乱而变化，并且最终取决于随从医生或临床医生的判断力。此外，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽的剂量变化取决于靶细胞、肿瘤、组织、移植物或器官。
理想的剂量可以便利地以单一剂量或作为在适当的时间间隔施用的分剂量而存在，例如，作为每天2、3、4次或更多的亚剂量。所述亚剂量本身可以进一步分割，例如，分割成许多次不连续的宽松间隔的施用；诸如从吸入器多次吸入，或者通过使用多滴到眼睛中。
施用方案可以包括长期的、日常的治疗。“长期”意指至少2周，并且优选地数周、数月或数年的持续时间。在这一剂量范围的必要的修改可以由本领域的普通技术人员仅仅使用本文的教导所给的常规实验而确定。参见雷明顿药物科学(Remington’sPharmaceuticalSciences)(Martin，E.W.，第4版)，Mack出版公司，Easton，PA。在任何并发症情形中，剂量还可以由个别医生进行调整。
在另一方面中，本发明涉及预防和/或治疗至少一种GPCR相关疾病和紊乱方法，所述方法包括，给需要所述方法的受试者施用药物活性量的本发明的氨基酸序列、本发明的纳米抗体、本发明的多肽、和/或包括其的药物组合物。
在本发明的内容中，术语“预防和/或治疗”不但包括预防和/或治疗疾病，而且通常包括预防所述疾病的发作，减缓或逆转疾病进程，防止或减缓与所述疾病相关的一种或多种症状的发作，减少和/或减轻与所述疾病相关的一种或多种症状，减少所述疾病和/或与之相关的任何症状的严重性和/或持续时间，和/或防止所述疾病的严重性和/或与之相关的任何症状的进一步增加，防止、减少或逆转由所述疾病引起的任何生理损害以及通常对被治疗的患者有益的任何药理作用。
待治疗的受试者可以是任何温血动物，但是特别是哺乳动物，并且更特别是人类。专业技术人员应该清楚，待治疗的受试者特别是患有或者有危险患有本文提及的疾病和紊乱的人。
本发明还涉及预防和/或治疗至少一种与GPCR、与其生物学或药学活性、和/或与其中涉及GPCR的生物学途径或信号传导相关的疾病或紊乱的方法，所述方法包括，给需要所述方法的受试者施用药物活性量的本发明的氨基酸序列、本发明的纳米抗体、本发明的多肽、和/或包括其的药物组合物。特别地，本发明涉及一种用于预防和/或治疗可以通过调节GPCR、其生物学或药学活性、和/或其中涉及GPCR的生物学途径或信号传导的至少一种疾病或紊乱的方法，所述方法包括给需要所述方法的受试者施用药物活性量的本发明的氨基酸序列、本发明的纳米抗体、本发明的多肽、和/或包括其的药物组合物。特别地，所述药用有效量可以是足以调节GPCR、其生物学或药学活性、和/或其中涉及GPCR的生物学途径或信号传导的量；和/或在循环中提供足以调节GPCR、其生物学或药学活性、和/或其中涉及GPCR的生物学途径或信号传导的本发明的氨基酸序列、本发明的纳米抗体、本发明的多肽的水平的量。
本发明还涉及预防和/或治疗至少一种可以通过给患者施用本发明的氨基酸序列、本发明的纳米抗体或本发明的多肽而预防和/或治疗的疾病或紊乱的方法，所述方法包括，给需要所述方法的受试者施用药物活性量的本发明的氨基酸序列、本发明的纳米抗体、本发明的多肽、和/或包括其的药物组合物。
更特别地，本发明涉及预防和/或治疗选自由本文列出的疾病和紊乱组成的组的至少一种疾病或紊乱的方法，所述方法包括，给需要所述方法的受试者施用药物活性量的本发明的氨基酸序列、本发明的纳米抗体、本发明的多肽、和/或包括其的药物组合物。
在另一个方面中，本发明涉及免疫治疗的方法，并且特别涉及被动免疫治疗的方法，所述方法包括给患有或者有危险患有本文提及的疾病和紊乱的受试者施用药物活性量的本发明的氨基酸序列、本发明的纳米抗体、本发明的多肽、和/或包括其的药物组合物。
在上述方法中，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和/或多肽和/或包含其的组合物可以以任何适当的方式施用，这取决于要用的特定的药物制剂或组合物。因此，例如，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和/或多肽和/或包含其的组合物可以口服、腹膜内(例如，静脉内、皮下、肌内、或者通过避开胃肠道的任何其它施用途径)、鼻内、透皮地、局部施用，通过栓剂、通过吸入方式施用，这也取决于要用的特定药物制剂或组合物。临床医生能够选择适当的施用途径和用于所述施用的适当的药物制剂或组合物，这取决于要预防或治疗的疾病或紊乱以及临床医生公知的其它因素。
本发明的氨基酸序列、纳米抗体和/或多肽和/或包含其的组合物按照治疗方案进行施用，所述治疗方案适于预防和/或治疗要被预防或治疗的疾病或紊乱。临床医生通常能够确定适宜的治疗方案，取决于下列因素，诸如要被预防或治疗的疾病或紊乱，要被治疗的疾病的严重性和/或其症状的严重性，要用的本发明的特定的氨基酸序列、纳米抗体或多肽，要用的特定的施用途径和药物制剂或组合物，患者的年龄、性别、体重、饮食、综合病症，以及临床医生公知的类似因素。
一般地，所述治疗方案包括以一种或多种药物有效量或剂量施用一种或多种本发明的氨基酸序列、纳米抗体和/或多肽，或者包含其的一种或多种组合物。施用的具体量或剂量由临床医生确定，同样基于上文引用的因素。
通常，对于预防和/或治疗本文提及的疾病和紊乱，并且取决于要治疗的具体疾病或紊乱，要用的特定的本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽的功效，具体的施用途径和使用的特定的药物制剂或组合物，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽一般以每天每kg体重1克-0.01微克的量施用，优选地每天每kg体重0.1克-0.1微克，诸如每天每kg体重约1，10，100或1000微克，作为单一的每日剂量连续施用(例如，通过输注)或者在一天内作为多次分剂量施用。临床医生通常能够确定适宜的日常剂量，这取决于本文提及的因素。还应该清楚，在具体的情形中，临床医生可以选择偏离这些量，例如，基于上文引用的因素以及他的专业判断。一般地，关于施用量的一些指导可从通过基本上相同的途径通常施用的相当的针对相同施用靶标的常规抗体或抗体片段的量而获得，但是要考虑亲和性/抗体亲抗原性、功效、生物分布、半衰期以及专业技术人员公知的类似因素的不同。
通常，在上述方法中，将使用单一的本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽。然而，使用组合的两种或更多种本发明的氨基酸序列、纳米抗体和/或多肽也在本发明范围之内。
本发明的纳米抗体、氨基酸序列和多肽还可以与一种或多种其它药物活性化合物或成分(principles)组合应用，即，作为组合治疗方案，其可以或者可以不引起增效效应。并且，基于上文所引用的因素及其专业判断，临床医生能够选择所述的其它化合物或成分，以及适宜的组合治疗方案。
特别地，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽可以与其它药物活性化合物或成分组合应用，所述其它药物活性化合物或成分是或者能够用于预防和/或治疗本文所引用的疾病和紊乱，结果可以或不可以获得增效效应。所述化合物和成分的实例，以及施用其的途径、方法和药物制剂或组合物是临床医生所清楚的。
当两种或更多种物质或成分用作组合治疗方案的一部分时，它们可以通过相同的施用途径或者通过不同的施用途径在基本上相同的时间或在不同时间(例如，基本上同时地、连续地、或者按照交替方案)施用。当所述物质或成分通过相同的施用途径同时施用时，它们可以作为不同的药物制剂或组合物或者作为组合的药物制剂或组合物的一部分进行施用，这是专业技术人员所清楚的。
此外，当两种或更多种活性物质或成分作为组合治疗方案的一部分使用时，每一物质或成分可以以相同的量施用，并且按照与当所述化合物或成分单独使用时相同的方案施用，并且所述组合应用可以或可以不引起增效效应。然而，当所述两种或更多种活性物质或成分的组合应用引起增效效应时，还可以可能地减少要施用的一种、多种或全部物质或成分的量，同时仍旧获得理想的治疗作用。例如，这可以用于避免、限制或减少当以它们的常规用量使用时与一种或多种所述物质或成分的应用相关的任何不需要的副作用，同时仍旧获得理想的药物或治疗效果。
根据本发明所用的治疗方案的效果可以以本身已知的用于所涉及的疾病或紊乱的任何方式进行确定和/或遵循，这是临床医生所清楚的。在适当的并且基于病例/病例基础的情形中，临床医生还应该能够改变或改进特定的治疗方案，以便获得理想的治疗效果，以避免、限制或减少不需要的副作用，和/或实现一方面获得理想的治疗效果与另一方面避免、限制或减少不理想的副作用之间的适当的平衡。
通常，应该遵循所述治疗方案，直到获得理想的治疗效果和/或只要维持所述理想的治疗效果。并且，这可以由临床医生确定。
在另一方面中，本发明涉及本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽在制备用于预防和/或治疗至少一种GPCR相关疾病和紊乱的药物组合物中的应用；和/或用于一种或多种本文所提及的治疗方法中的应用。
待治疗的受试者可以是任何温血动物，但是特别是哺乳动物，并且更特别是人类。专业技术人员应该清楚，待治疗的受试者特别是患有或者有危险患有本文提及的疾病和紊乱的人。
本发明还涉及本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽在制备用于预防和/或治疗至少一种可以通过给患者施用本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽而得到预防和/或治疗的疾病或紊乱的药物组合物中的应用。
更特别地，本发明涉及本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽在制备用于预防和/或治疗GPCR相关疾病和紊乱，且特别是用于预防和治疗本发明列出的一种或多种疾病和紊乱的药物组合物的应用。
同样地，在这样的药物组合物中，所述一种或多种本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽还可以适当地与一种或多种其它活性成分如本发明提及的那些组合。
最后，尽管更优选本发明的纳米抗体(如本文所定义)和本发明的多肽的应用，但是基于本发明内容应该清楚，专业技术人员还应该能够以类似的方式设计和/或产生针对GPCR的其它氨基酸序列且特别地(单)结构域抗体，以及包括所述多肽的(单)结构域抗体。
例如，专业技术人员应该清楚，可以可能地将上文提及的用于本发明的纳米抗体的一个或多个CDR’s“移植”到所述(单)结构域抗体或其它蛋白支架上，所述支架包括但不限于人支架或非-免疫球蛋白支架。用于这种CDR移植的适宜的支架和技术是专业技术人员所清楚的，并且是本领域公知的，参见，例如US-A-7,180,370，WO01/27160，EP0605522，EP0460167，US-A-7,054,297，Nicaise等，蛋白质科学(ProteinScience)(2004)，13：1882-1891；Ewert等，方法(Methods)，2004年10月；34(2)：184-199；Kettleborough等，蛋白质工程(ProteinEng.)1991年10月；4(7)：773-783；O’Brien和Jones，分子生物学方法(MethodsMol.Biol.)2003：207：81-100；和Skerra，分子识别杂志(J.Mol.Recognit.)2000：13：167-187，和Saerens等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)2005年9月23日；352(3)：597-607，以及本文引用的其它参考文献。例如，可以以相似的方式应用本身已知的关于将小鼠或大鼠的CDR’s移植到人构架和支架上的技术，以提供包括一个或多个本发明的纳米抗体的CDR’s和一个或多个人构架区或序列的嵌合蛋白。
还应该注意，当本发明的纳米抗体包含除上文提及的优选的CDR序列之外的一个或多个其它CDR序列时，这些CDR序列可以以本身已知的任何方法获得，例如，从纳米抗体(优选)、来自常规抗体(并且特别来自人抗体)的VH结构域、重链抗体、常规4-链抗体(诸如常规的人4-链抗体)或针对GPCR的其它免疫球蛋白序列获得。针对GPCR的这种免疫球蛋白序列可以以任何本身已知的方法产生，如专业技术人员所清楚的，即，通过用GPCR免疫或通过用GPCR筛选免疫球蛋白序列的适宜的文库，或其任何适当的组合进行。任选地，这可以接着进行技术诸如随机或位点定向诱变和/或其它本身已知的用于亲和力成熟的技术。产生这样的免疫球蛋白序列的适宜的技术是专业技术人员所清楚的，并且例如包括Hoogenboom，自然生物技术(NatureBiotechnology)，23，9，1105-1116(2005)综述的筛选技术。产生针对指定的靶标的免疫球蛋白的其它技术包括，例如，Nanoclone技术(例如，在公布的美国专利申请2006-0211088中所述)，所谓的SLAM技术(例如欧洲专利申请0542810中所述)，应用表达人免疫球蛋白的转基因小鼠或者公知的杂交瘤技术(参见，例如Larrick等，生物技术(Biotechnology)，卷7，1989，第934页)。所有这些技术可以用来产生针对GPCR的免疫球蛋白，并且这种免疫球蛋白的CDR’s可以用于本发明的纳米抗体，即，如上文列出的。例如，这样的CDR序列可以被确定、合成和/或分离，并且插入到本发明的纳米抗体的序列中(例如，以便取代相对应的天然CDR)，均使用本身已知的技术，诸如本文所述的那些，或者包含所述CDR’s的本发明的纳米抗体(或编码其的核酸)可以从头合成，也应用本文提及的技术。
基于本文的公开内容，本发明的氨基酸序列、纳米抗体、多肽、核酸、遗传构建体以及宿主与宿主细胞的其它应用是专业技术人员所清楚的。例如，并且不限于，本发明的氨基酸序列可以连接在适当的载体或固体支持物上，以提供一种可以以本身已知的从包含其的组合物和制备物中纯化GPCR的方式使用的介质。包括适当的可检测标记的本发明的氨基酸序列的衍生物也可以用作(定性或定量)确定GPCR在组合物或制备物中存在的标记，或作为选择性检测GPCR在细胞或组织表面存在的标记(例如，与适当的细胞分选技术结合)。
现在，借助于下列非限制性实验部分进一步说明本发明：
实验部分
实施例1：生成CXCR4纳米抗体
方法：
细胞培养和转染-HEK293T细胞保持在37℃，湿润的5％CO2，95％空气，含有2mML-谷氨酰胺、50IU/ml青霉素、50μg/ml链霉素、和10％(v/v)胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中。Jurkat细胞培养在湿润的5％CO2，95％空气，含有2mML-谷氨酰胺，50IU/ml青霉素、50μg/ml链霉素、和10％(v/v)胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)和HamF12培养基的混合物中。用恒量总DNA，利用线性25kDa聚乙烯亚胺(Polysciences，Warrington，PA)作为载体，如前所述(Verzijl等，NoncompetitiveAntagonismandInverseAgonismasMechanismofActionofNonpeptidergicAntagonistsatPrimateandRodentCXCR3ChemokineReceptors(作为灵长类动物和啮齿动物CXCR3趋化因子受体处非肽能拮抗剂作用机制的非竞争拮抗和反向激动).JournalofPharmacologyandExperimentalTherapeutics(药理学和实验治疗杂志)(2008)325(2)：544-55)瞬间转染HEK293T细胞。编码趋化因子受体CCR5，CCR7，CXCR1，CXCR2，CXCR3和CXCR7的cDNA获自cdna.org(MissouriS&TcDNAResourceCenter(密苏里州S&TcDNA资源中心)，Rolla，MO)，通过PCR扩增并克隆到表达载体中。
[125I]-标记-用125I放射性标记纳米抗体利用Iodo-gen法(Pierce，Rockford，IL)，根据制造商的流程进行。利用SephadexG-25凝胶过滤柱(AmershamBiosciences，Piscataway，NJ)将125I-标记的纳米抗体与游离碘(＞99％)分开。碘掺入和特异性活性通过用三氯乙酸沉淀蛋白来控制。myo-[2-3H]-肌醇(10-20Ci/mmol)和[125I]-标记的CXCL12(2,200Ci/mmol)获自PerkinElmerLifeandAnalyticalSciences(PerkinElmer生命与分析科学)(波士顿，MA)。
竞争结合测定-在转染后48小时，如下制备来自瞬间表达CXCR3或CXCR4的HEK293T细胞的膜。使用含有1mmEDTA的冰冷PBS洗涤并由细胞培养皿上刮下细胞。将刮下的细胞在1500xg，4℃沉淀10min。洗涤沉淀并将其重新悬浮在冰冷的膜缓冲液(15mMTris，pH7.5，1mMEGTA，0.3mMEDTA，和2mMMgCl2)中。通过利用Teflon-玻璃匀浆器，以1200rpm，通过10次敲击，对细胞混悬液进行匀浆，并进一步利用液氮进行三次冻融循环。通过40,000g，4℃离心25min来分离膜。洗涤膜沉淀并将其重新悬浮在冰冷的Tris-蔗糖缓冲液(20mMTris，pH7.4，and250mM蔗糖)中并在液氮中冷冻。总蛋白利用Bradford测定(Bio-Rad)来确定。
在增补0.5％BSA的结合缓冲液(50mMHEPES(pH7.4)，1mMCaCl2，5mMMgCl2，100mMNaCl，0.5％牛血清白蛋白)中，在22℃，用膜预温育周质(1∶10)或配体1h，随后在22℃加入[125I]-CXCL12(40pM)或[125I]-238D2(3nM)或[125I]-238D4(3nM)另外2h。在存在AMD3100(3μM)的条件下确定非特异性结合。然后，膜通过聚乙烯亚胺(0.5％)-处理的WhatmanGF/C滤板来收获，并用含有500mMNaCl的冰冷结合缓冲液洗涤三次。通过液体闪烁对板进行计数。
肌醇磷酸累积测定-用pcDNA3.1-CXCR4和pcDNA1-HA-mG{α}qi5转染后24小时(见Verzijl等，2008见上)，将250.000个细胞接种到24孔板中并利用增补1μCimyo-[2-3H]-肌醇的无肌醇极限必需培养基标记过夜。次日，洗涤细胞一次，以去除未结合的myo-[2-3H]-肌醇。在拮抗剂实验中，在测定培养基(20mMHEPES，140mMNaCl，5mMKCl，1mMMgSO4，1mMCaCl2，10mM葡萄糖和0.05％(w/v)牛血清白蛋白，pH7.4)中细胞与测试化合物在37℃预温育1h，随后用LiCl(10mM)和CXCL12(30nM)在37℃进一步刺激2h。在激动剂实验中，在测定缓冲液中，用测试化合物和LiCl(10mM)直接在37℃刺激细胞2h。通过抽吸刺激培养基并加入冰冷的10mM甲酸来终止刺激。累积的肌醇磷酸通过阴离子交换层析法分离并通过液体闪烁计数。
CRE报道基因测定-用pCRE/β-半乳糖苷酶(ChenW，ShieldsTS，StorkPJS，ConeRD(1995)AnalBiochem(分析生物化学)226：349-354)和编码指定受体的质粒(pcDEF3或pcDNA3.1)转染HEK239T细胞。将40,000个转染细胞/孔接种到96孔板中并在增补10％胎牛血清的DMEM中生长。转染后32h，培养基更换为增补0.5％牛血清白蛋白和指定配体的无血清DMEM。配体温育16h后，除去培养基，使细胞在100μl测定缓冲液(100mM磷酸钠缓冲液，pH8.0，4mM2-硝基酚-β-D-吡喃糖苷，0.5％TritonX-100，2mMMgSO4，0.1mMMnCl2，和40mMβ-巯基乙醇)中溶解并在室温下温育。在用测定缓冲液温育后，当关于福司柯林(3μM)对照的OD420值达到0.4-0.6时，通过使用PowerwaveX340平板读数器(Bio-TekInstrumentsInc.，Winooski，VT)测量420nm处的吸光度来确定β-半乳糖苷酶活性。
趋化性测定-Jurkat3D细胞的趋化响应性利用ChemoTxTM平板(ReceptorTechnologiesLtd.(受体技术公司)，Oxon，UK)来评估，其中含有细胞的上隔室与含有化学引诱物的下隔室通过具有5-μm孔的无聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸脂滤器分开。收获、洗涤细胞并将其重新悬浮在含有0.5％牛血清白蛋白的RPMI中并然后以25μl的体积，加载到趋化室的上隔室中，达到150,000细胞/孔。为了刺激细胞经膜迁移，将CXCL12和/或测试化合物以终体积31μl，以指定浓度加载到下隔室中(激动剂实验)。为了表征拮抗性质，将AMD3100或测试化合物加载到含有CXCL12(300pM)的下隔室中并另外与上隔室中的细胞一起预温育。趋化室在37℃，100％湿度，和5％CO2温育4h。迁移至各下隔室中的细胞数通过在与钙黄绿素AM温育和用0-50,000Jurkat3D细胞/孔校正后，在535nm处的荧光测量值确定。
HIV-1感染测定-利用CXCR4(X4)的HIV-1分子克隆NL4.3获自国家健康NIAIDAIDS试剂程序研究所(NationalInstitutesofHealthNIAIDAIDSReagentprogram)(Bethesda，MD)，利用CCR5(R5)的HIV-1毒株BaL获自医学研究委员会AIDS试剂工程(MedicalResearchCouncilAIDSreagentproject)(Herts，UK)。双向性(R5/X4)HIV-1HE株最初在UniversityHospitalinLeuven从患者中分离，并已经在MT-4细胞中常规培养(PauwelsR，AndriesK，DesmyterJ，ScholsD，KuklaMJ，BreslinHJ，RaeymaeckersA，VanGelderJ，WoestenborghsR，HeykantsJ.PotentandselectiveinhibitionofHIV-1replicationinvitrobyanovelseriesofTIBOderivatives(通过新系列TIBO衍生物系列有效和选择性抑制体外HIV-1复制).Nature(自然)1990；343：470-474)。将MT-4细胞接种到96孔板中，并将U87细胞接种到24孔板中。测试化合物以不同浓度与HIV-1一起加入并将板保持在37℃，10％CO2。由病毒诱导的细胞病变效应通过每日显微镜评估病毒感染的细胞培养物来监测。感染后第4-5天时，当在阳性对照(即，未处理的HIV感染细胞)中观察到强细胞病变效应时，利用CellTiterAQueous单溶液细胞增殖测定(Promega，Madison，WI)，通过四唑化合物MTS的原位减少评估细胞存活力。然后用96孔板读数器(MolecularDevices(分子装置)，Sunnyvale，CA)，在490nm处，通过分光光度法测量吸光度，并与四个细胞对照重复孔(无病毒和药物的细胞)和四个病毒对照孔(无药物条件下，病毒感染的细胞)。由剂量-响应曲线计算各化合物的50％抑制浓度(IC50，即抑制HIV诱导的细胞死亡50％的药物浓度)。各化合物的CC50或50％细胞毒性浓度由暴露于试剂的未感染细胞的存活率减小来确定，如通过上述MTS法所测量。
来自健康供体的外周血单核细胞(PBMCs)通过密度离心(Lymphoprep；NycomedPharma，ASDiagnostics，Oslo，挪威)来分离，并用植物凝集素(PHA)(SigmaChemicalCo.(西格玛化学公司)，Bornem比利时)刺激3天。激活的细胞(PHA-刺激的胚细胞)用PBS洗涤并如前所述进行病毒感染(ScholsD，StruyfS，VanDammeJ，EsteJA，HensonG，DeClercqE.InhibitionofT-tropicHIVstrainsbyselectiveantagonizationofthechemokinereceptorCXCR4(通过选择性拮抗趋化因子受体CXCR4抑制T-向性HIV毒株).JExpMed(实验医学杂志)1997；186：1383-1388)。在开始感染后8-10天，通过酶联免疫吸附测定(PerkinElmer，Brussels，比利时)在培养物上清中检测到病毒性p24Ag。
数据分析与表示-数据表示为来自独立实验的平均值±S.E.M.。利用迭代、最小平方法，将浓度响应曲线(E/[A]曲线)拟合为Hill方程式(GraphPadPrism4.0，GraphPadSoftware，圣地亚哥，CA)，以提供最大抑制作用(Imax)、半最大有效(EC50)或抑制浓度(IC50)。利用Cheng和Prusoff方程式pKi＝IC50/(1+[激动剂]/EC50)(Cheng&Prusoff，1973)计算竞争结合亲和力和功能性拮抗亲和力(pKi)。拮抗剂亲和力任选地，利用Arunlakshana和Schild(1959)法，基于方程pKB＝-log[拮抗剂]+log(CR-1)表示为pKB值，其中CR表示激动剂EC50在存在和不存在拮抗剂条件下的比。
结果利用t-检验或单向方差分析进行比较，随后在进行多次比较时，进行Bonferroni校正的t检验以逐步比较。认为P值＜0.05是显著的。
序列靶标：
同义词：CXCR-4/基质细胞来源因子1受体(SDF-1受体)/融合素/白细胞来源的7次跨膜结构域受体(LESTR)/LCR1/FB22/NPYRL/HM89/CD184抗原
人CXCR4用于选择：
表B-1：针对人序列的同源性
与猕猴属95％，猪92％，狗93％，兔91％，小鼠88％，鸡80％
序列：
表B-1.1：序列选择的纳米抗体：
实施例1.1：免疫
为了免疫，使用瞬间表达人CXCR4的HEK293细胞(人胚肾)作为“抗原”。
两只美洲驼根据标准试验方案，在第0，7，21，32，43和56天，使用6次细胞(1*10E7细胞)加强来免疫。血液在第6次加强后4和8天，从这些动物收集。
实施例1.2：文库构建
使用Ficoll-Hypaque根据生产厂商的使用说明书从血液样品中制备外周血单核细胞。下一步，从这些细胞中以及淋巴结弓形细胞(bowcell)中提取总RNA，并用作RT-PCR的起始原料以扩增编码纳米抗体的基因片段。这些片段克隆进噬菌粒载体pAX50中。根据标准方法(参见例如本文引用的现有技术和申请人提交的各个申请)制备噬菌体并且保存在4℃以备进一步使用，得到两个噬菌体文库217和218。
实施例1.3：利用2轮胰蛋白酶洗脱选择
为了鉴定识别CXCR4的纳米抗体，在噬菌体展示选择中使用噬菌体文库(217，218)。
因为hCXCR4是整合的跨膜蛋白，需要保留hCXCR4的天然构象。因此，噬菌体展示选择针对过表达hCXCR4的CHO和COS7细胞的细胞膜制剂进行。将膜包被在Maxisorp板上，4C过夜(在100ulPBS中10ug)。
次日，在4％乳-PBS中封闭1小时后，在存在(和平行地，不存在)1％乳-PBS和表达非相关GPCR的CHO-膜制剂中，来自文库的噬菌体与包被的膜温育。2小时温育后，用PBS全面洗涤该板。洗涤后，使用胰蛋白酶(1μg/ml)，在RT下15min洗脱结合的噬菌体。
在TG1中照常拯救和再扩增噬菌体，以提供R1多克隆噬菌体。
那些R1噬菌体用于如同第一轮的第二轮选择，唯一差别在于在第一轮中在CHO-CXCR4膜上选择的噬菌体也用在COS7-CXCR4膜上，且反之亦然。这个独特的策略容许消耗非CXCR4特异性噬菌体。2小时温育后，用PBS全面洗涤该板，且结合的噬菌体利用胰蛋白酶(1μg/ml)，在RT下洗脱15min。
分析R2选择的产物，以获得富集因子(与对照相比，在洗脱液中存在的噬菌体)。基于这些参数，选择最佳选择物来进一步分析。在TG1中拯救多克隆产物，挑取单个TG1菌落并在96深孔板(1ml体积)中生长，以产生单克隆噬菌体(添加辅助噬菌体)或单克隆(添加IPTG)，以制备周质级分。根据标准方法(参见例如本文引用的现有技术和申请人提交的各个申请)制备周质提取物(体积：～90ul)。
选择的图示可以参见图1。
缩写：CHO-CXCR4：用人CXCR4瞬间转染的CHO(中国仓鼠卵巢)细胞的膜；COS7-CXCR4：用人CXCR4瞬间转染的COS7(猴细胞)细胞的膜；R1是第一轮选择；R2是第二轮选择；反选择意味着选择在存在CHO-膜(不表达CXCR4)的条件下进行；配体是CXCL12/SDF1(在100ulPBS中3ug)，拮抗剂是AMD3100(50uM)，抗体是12G5(在100ulPBS中5ug)。
实施例1.4：利用2轮特异性(竞争)洗脱选择
非特异性胰蛋白酶洗脱的备选方案是使用特异性CXCR4结合化合物来洗脱(竞争出)与化合物结合位点结合的噬菌体。在该情形中，将2.5ug膜制剂在4C，100ulPBS中进行包被并在RT下使用过量的以下各项进行洗脱30min：
-CXCL12/SDF1(在100ulPBS中3ug)，CXCR4的天然配体，
-AMD3100(50uM)，已知的化学拮抗剂(来自SigmaAldrich)
-12G5(在100ulPBS中5ug)，已知的中和抗体(来自R&DSystem)。
在TG1中照常拯救和再扩增噬菌体，以提供R1多克隆噬菌体。
那些R1噬菌体用于如同第一轮的第二轮选择，唯一差别在于在第一轮中在CHO-CXCR4膜上选择的噬菌体也用在COS7-CXCR4膜上，且反之亦然。这个独特的策略容许消耗非CXCR4特异性噬菌体(膜特异性)。2小时温育后，用PBS全面洗涤该板，并如第一轮那样洗脱结合的噬菌体。这样，完成2轮CXCL12/SDF1和2轮AMD3100。
分析R2选择的产物，以获得富集因子(与对照相比，在洗脱液中存在的噬菌体)。基于这些参数，选择最佳选择物来进一步分析。在TG1中拯救多克隆产物，挑取单个TG1菌落并在96深孔板(1ml体积)中生长，以产生单克隆噬菌体(添加辅助噬菌体)或单克隆(添加IPTG)，以制备周质级分。根据标准方法(参见例如本文引用的现有技术和申请人提交的各个申请)制备周质提取物(体积：～90ul)。
实施例1.5：结合的筛选
为了确定与纳米抗体的结合特异性，在噬菌体ELISA结合测定中检测15ul生成的噬菌体。
简言之，将处于100ulPBS中的2ug的表达CXCR4(CHO-CXCR4)或不相关GPCR(CHO)的膜，在4C在Maxisorp微滴定板(Nunc)上直接包被过夜。利用处于PBS中的4％Marvel封闭自由结合位点。其次，在100ul1％MarvelPBS中加入15ul单克隆噬菌体2小时。温育和全面PBS洗涤步骤后，利用抗M13-HRPO抗体显示噬菌体结合。结合特异性(与CHO-CXCR4结合)基于与对照(与CHO结合)相比的OD值确定。
实施例显示在图2中。
实施例1.6：通过[125I]-CXCL12的替代筛选结合CXCR4的纳米抗体
分析180个克隆，并利用CXCR4竞争结合测定筛选它们的周质级分。在使用来自瞬间表达CXCR4的HEK293T细胞的膜的第一次筛选中，发现约13％的克隆与放射性标记的内源性CXCR4配体[125I]-CXCL12竞争结合CXCR4并产生至少30％的特异性[125I]-CXCL12结合的抑制(图3)。总量的5个克隆(约3％)强烈抑制特异性[125I]-CXCL12结合达70％以上。对表达针对与CXCR4不同的膜蛋白的纳米抗体的对照噬菌体没有观察到抑制。所有第一次命中在第二次筛选中验证(图3b)并且因此对产生替代CXCL12的纳米抗体的克隆的VHH编码DNA进行测序。测序分析得到强烈替代(2个集合)或部分替代(5个集合)[125I]-CXCL12的7个相同或高度相似克隆的集合(表B-2)。对代表这些集合的纳米抗体，即237A6，237D1，237D2，237G7，238C5，238D2和238D4进行纯化并进一步通过药理学分析。
表征与CXCR4结合的纳米抗体-纯化后，针对来自瞬间表达CXCR4的HEK293T细胞的细胞膜来研究237A6，237D1，237D2，237G7，238C5，238D2和238D4的受体结合特征。纳米抗体238D2和238D4完全替代全部特异性结合的[125I]-CXCL12并在低纳米摩尔范围内显示出与CXCR4的亲和力(表2)。所有其他纳米抗体不能替代[125I]-CXCL12，即使在最高测试浓度0.5μM的条件下(237A6，237D1，237D2，237G7和238C5)(图4A；表B-3)。
为了进一步研究两种有效[125I]-CXCL12-替代的纳米抗体238D2和238D4与CXCR4的结合性质，我们生成了125I-标记的纳米抗体，以用于竞争结合研究。与表达CXCR3的那些相比，[125I]-238D2和[125I]-238D4二者选择性结合来自瞬间表达CXCR4的HEK293T细胞的膜(图4D)。这两种纳米抗体竞争结合CXCR4，如通过由238D4完全替代[125I]-238D2和通过238D2对[125I]-238D4结合的完全抑制来显示(图4B，4C)。此外，小分子配体AMD3100替代[125I]-238D2和[125I]-238D4，其亲和力与针对[125I]-CXCL12获得的那些相当(表B-3)，这说明AMD3100也与纳米抗体238D2和238D4竞争相同受体。以前已经报告标记某些CXCR4亚群(J.Virol.(病毒学杂志)Baribaud等75(19)：8957)的单克隆抗体12G5有效地但不完全地替代CXCR4特异性结合的[125I]-CXCL12，[125I]-238D2和[125I]-238D4。237A6，237D1，237D2和237G7不能抑制[125I]-238D2或[125I]-238D4与CXCR4的结合。238C5在高浓度(≥100nM)下替代[125I]-238D2和[125I]-238D4但不替代[125I]-CXCL12，这说明该纳米抗体作为低亲和力变构的CXCR4配体结合受体(图4B，4C)。
表B-2：
筛选和测序替代[125I]-CXCL12的纳米抗体克隆。结合效率通过在来自瞬间表达CXCR4的HEK293T细胞的膜上与[125I]-CXCL12的竞争结合来确定。
a-＝0-29％；+＝30-69％；++＝70-100％.
表B-3：
[125I]-CXCL12，[125I]-238D2和[125I]-238D4对单价纳米抗体和CXCR4参考配体的受体亲和力(pKi)和最大替代。实验在来自瞬间表达CXCR4的HEK293T细胞的膜上进行。数据显示为平均值±S.E.M.。实验次数以n给出。
a在0.5μM无显著替代。
b在最高测试浓度0.5μM下，在0.5μM替代时未达到最大值。
c与100％显著不同。
实施例1.7：抑制CXCR4介导的信号转导
为了功能性表征纳米抗体238D2和238D4，我们测量它们在用编码CXCR4和Gαqi5的cDNA瞬间共转染的HEK293T细胞中活化G蛋白信号传导或抑制CXCL12-诱导的G蛋白信号传导的能力。该测定基于含有Gαq主链的嵌合Gαqi5-蛋白的应用，所述Gαq主链的5C-端氨基酸被来自Gαi的那些替换。该嵌合G蛋白被CXCR4如Gαi亚单位活化而类似于Gαq蛋白转导信号(Coward，P.，等，ChimericGProteinsAllowaHigh-ThroughputSignalingAssayofG1-CoupledReceptors(嵌合G蛋白容许G1偶联受体的高通量信号传导测定)，AnalyticalBiochemistry(分析生物化学)(1999)270：242-248)。因此，Gαqi5的活化可以通过测量累积的肌醇磷酸来量化。CXCL12刺激肌醇磷酸累积，其pEC50为7.89±0.21(n＝4)。高至100nM浓度，对纳米抗体238D2或238D4未观察到激动剂活性。然而，238D2和238D4以浓度依赖性方式完全抑制CXCL12-诱导的肌醇磷酸的累积(图5A)。
另外，我研究238D2和238D4在用pcDNA3.1-CXCR4和β-半乳糖苷酶报道基因在cAMP反应元件(CRE)的控制下瞬间转染的HEK293T细胞中，在信号转导的较晚步骤中抑制CXCL12-诱导的活化的能力。Gi-蛋白偶联受体如CXCR4的刺激可以导致抑制福司柯林-诱导的CRE活化。实际上，CXCL12有效抑制福司柯林(3μM)-诱导的β-半乳糖苷酶的CRE-依赖性转录的活化，其pEC50为9.78±0.09(n＝11)，而纳米抗体238D2和238D4在缺乏CXCL12的条件下不显示任何激动剂活性(图5B)。然而，这两种纳米抗体在增加纳米抗体浓度时通过使CXCL12浓度响应曲线平行右移来抑制CXCL12应答，但不影响其最大作用。Schild分析显示log(CR-1)和-log[纳米抗体](M)之间的线性，其关于238D2和238D4二者的斜率分别为0.91±0.20和0.71±0.17(与整体无显著差异)(图5B)。这些结果说明这两种纳米抗体对CXCL12-诱导的信号转导的活化的竞争性拮抗作用。基于Schild绘图数据，分别关于238D2和238D4计算pKB值7.64±0.16和7.70±0.16。
为了证明纳米抗体关于CXCR4的特异性，我们还通过使用CRE/β-半乳糖苷酶报道基因研究了238D2和238D4对其他趋化因子和非趋化因子受体信号传导的作用。在缺乏或存在3μM福司柯林的条件下，使用次最大有效激动剂浓度(50-80％Emax)来刺激细胞。浓度甚至高达2.5μM的纳米抗体238D2和238D4不改变HEK293T细胞中激动剂-诱导的对福司柯林(3μM)-诱导的CRE活化的抑制，所述HEK293T细胞分别是用编码CXCR1，CXCR2，CXCR3，CXCR6，CCR5，CCR7或组胺H4受体瞬间转染的(图7)。此外，238D2和238D4(2.5μM)不抑制由β2-肾上腺素受体激动剂舒喘灵(salbutamol)(100nM)引起的内源性表达的β2-肾上腺素受体的活化。这些结果证明238D2和238D4对CXCR4的选择性为测试的所有其他受体的100倍以上。
在内源性表达CXCR4的Jurkat白血病T细胞中研究CXCL12和纳米抗体的化学引诱物或抗-化学引诱物作用。CXCL12诱导Jurkat细胞的迁移，其浓度响应曲线的第一阶段具有典型的钟形特征，pEC50为9.41±0.26(n＝5)。238D2和238D4不能通过其自身诱导Jurkat细胞的任何显著迁移(图5C)。相反，238D2和238D4二者浓度依赖性抑制Jurkat细胞朝向300pMCXCL12迁移(图5C)。
表B-4：纳米抗体238D2和238D4的最大抑制(Imax)和功能抑制效力(pKi或pIC50)。数据显示为平均值±S.E.M.。实验次数以n给出。
实施例2：生成针对人CXCR7的纳米抗体。
与针对人CXCR4的纳米抗体相同的方法。特别地，该方法使用至少以下步骤：
a)用过表达人CXCR7的完整活细胞(例如HEK293)免疫。
b)利用不同细胞类型免疫和选择(例如HEK293用于免疫，富含人CXCR7的CHO-膜用于第一轮选择，富含人CXCR7的COS7膜用于第二轮选择)。
c)任选地，用温和缓冲液，例如PBS(无去污剂)洗涤。
还参考可以在例如Swissprot数据库中以“P25106”存在的人CXCR7蛋白序列。
实施例3：HIV测定的实例
实施例3.1：单轮假病毒中和测定：
参考JamesM.Binley，1’TerriWrin，2BetteKorber，3MichaelB.Zwick，1MengWang，1ColombeChappey，2GabrielaStiegler，4RenateKunert，4SusanZolla-Pazner，5HermannKatinger，4ChristosJ.Petropoulos，2和DennisR.BurtonComprehensiveCross-CladeNeutralizationAnalysisofaPanelofAnti-HumanImmunodeficiencyVirusType1MonoclonalAntibodies(一组抗人免疫缺陷病毒1型单克隆抗体的伯顿综合交叉进化枝中和分析)JournalofVirology(病毒学杂志)，2004年12月，第13232-13252页，第78卷，第23号。
使用包括单轮病毒感染的重组病毒测定来测量中和。重组荧光素酶假病毒用Mab或加热灭活血浆的10个连续4倍稀释物在37℃温育1h，通常由50μg/ml(MAbs)或1∶20稀释物(血浆)开始。在不同的试验流程中，病毒用抗体温育18h，随后将混合物加入至靶细胞。表达CD4加上CCR5和CXCR4共受体的U87细胞与病毒-抗体(Ab)稀释物，在缺乏外加阳离子的条件下温育。筛选病毒储液，以确保它们具有功能并在靶细胞溶解产物中产生高荧光素酶报道基因光信号。各实验中使用的输入病毒不进行标准化。病毒感染性在接种后72h，通过测量感染细胞中表达的荧光素酶活性量来确定。中和活性报告为达到50％(IC50)或90％(IC90)感染抑制所需的各Mab或血浆的浓度或稀释度(百分比抑制＝{1-[荧光素酶+Ab/荧光素酶-Ab]}x100)。为了消除非特异性中和，真正中和的标准为滴度针对HIV-1必须为其针对双向性对照MuLV的至少2.5倍。由于该研究量大，每种单个病毒-Ab组合通常仅测试一次。为了确保结果的可再现性，对照病毒JR-CSF(R5-向性)和NL4-3(X4-向性)在所有测定中操作至少6次。该测定在各次操作之内和之间的可再现性通过观察这些对照来评估。
实施例3.2：GHOST测定
参考Steyaert等，2007.InhibitionofreplicationofprimaryHIV-1isolatesinhuPBL-NOD/ScidmicebyantibodiesfromHIV-1infectedpatients(通过来自HIV-1感染患者的抗体抑制huPBL-NOD/Scid小鼠中原代HIV-1分离株的复制).AntiviralRes.(抗病毒研究)2007年8月；75(2)：129-38.2007年3月6日电子公开。关于中和活性使用高度灵敏的基于GHOST细胞的测定筛选人血浆和纯化的免疫球蛋白(Donners等，2003)。这些细胞源自人骨肉瘤细胞并用编码人CD4，即HIV共-受体(CCR5或CXCR4)之一的基因和绿色荧光蛋白，在HIV-2LTR启动子的控制下转染。感染细胞的数量通过FACS测量。血浆样品稀释1/20并加入纯化IgGs到浓度500ug/ml。中和测定的形式为24/24/48，其中24/x/x是预温育抗体和病毒的时间，单位为小时，x/24/x是细胞暴露于这些混合物的时间，单位为小时，且x/x/48是开始病毒接种和FACS分析之间的时间，单位为小时。百分比中和如下计算：100-[(#测试样品的感染细胞/#血清反应阴性对照的感染细胞)×100]。
实施例3.3：PBMC测定
参考Beirnaert等，2000。病毒中和测定如前所述进行，仅有微小改动[Nyambi等，1996]。简言之，病毒感染的PBMCs(50TCID50/孔)的培养物上清和加热灭活的血清(30min，56℃)的两倍连续稀释物(1/10-1/1,280)在96孔盘中混合，并在37℃，5％CO2大气中温育1hr。在各实验中，HIV(-)血清在与样品血清相同的条件下测定，以起阴性对照作用。随后，加入7.5×104/孔PHA刺激的，IL-2维持的PBMC。2hr温育后，将细胞洗涤三次并温育在增补20U/mlIL-2，15％FCS，0.03％L-谷氨酰胺，2mg/ml1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物(polybrene)，5mg/ml氢化可的松(hydrocortisone)和抗生素的RPMI1640培养基中。为了每个中和实验，病毒再次滴定，以比较不同供体PBMCs中病毒储液的感染性。如果病毒滴度与输入病毒滴度差多于3倍，则认为中和实验无效。病毒复制在7天后，利用非商购抗原捕获ELISA来评估，所述ELISA捕获属于M组以及属于O组的HIV-1的抗原[Beirnaert等，1998，IdentificationandcharacterizationofserafromHIV-infectedindividualswithbroadcross-neutralizingactivityagainstgroupM(envcladeA-H)andgroupOprimaryHIV-1isolates(鉴别和表征来自具有针对M组(envcladeA-H)和O组原代HIV-1分离株的广泛交叉中和活性的HIV感染个体的血清).JMedVirol.(医学病毒学杂志)2000年9月；62(1)：14-24]。50％抑制剂量(ID50)定义为与阴性血清对照相比在抗原捕获测定中产生50％吸光度值减小的最高血清稀释度的倒数。血清中和滴度＜1/10认为是阴性。血清重复测定两次，且测试进行至少三次。
实施例3.4：HIV体内中和模型
实施例3.4.1：Hu-PBL(NOD/SCID)
参考Gauduin，M.C.，Parren，P.W.，Weir，R.，Barbas，C.F.，Burton，D.R.，Koup，R.A.，1997.Passiveimmunizationwithahumanmonoclonalantibodyprotectshu-PBL-SCIDmiceagainstchallengebyprimaryisolatesofHIV-1(用人单克隆抗体被动免疫保护hu-PBL-SCID小鼠免受原代HIV-1分离株的攻击).Nat.Med.(自然医学)3，1389-1393，Steyaert等，2007。
为了在体内评估病毒抑制活性，在重配后6天且病毒攻击前1天，将人多克隆免疫球蛋白施用于huPBL-NOD/Scidmice小鼠。所有的注射都经腹膜内(i.p.)给药。每个实验组可以由四只小鼠组成。感染全部小鼠所需的最少病毒接种量在初步滴定中确定。在移植物抗宿主反应中存活的嵌合小鼠(82％)在攻击后14天处死，并利用COBASAmplicorHIV-1监测器TM1.5版(Roche(罗氏))，根据生产商说明书测量其血浆中的病毒载量。由于小鼠血浆量有限，可以将其稀释1/100，并因此该测定检测的下限为约3.70logequiv/ml。
实施例3.4.2：SHIV短尾猿(macaque)模型
对于抗体输注，阴道攻击发，以及血液和粘膜收集，用盐酸氯胺酮(ketamineHCl)浅麻醉短尾猿。SHIV89.9PD攻击储液生长并在恒河猴(rhesus)PBMC中滴定。在病毒攻击前24h，静脉内输注抗体。阴道SHIV攻击通过利用1-ml注射器将1ml病毒储液(600TCID50)的1∶5稀释物轻轻地引入短尾猿阴道腔中完成。攻击后，将短尾猿保持俯卧位至少15min。阴道攻击前30天，短尾猿可以已经通过肌肉注射接受了30mg醋酸甲羟孕酮(medroxyprogesteroneacetate)(Depo-Provera，Upjohn，Kalamazoo，密歇根)。近期在孕酮(progesterone)处理的短尾猿中的滴定实验证明该猴暴露于10-50个动物感染剂量的SHIV89.6PD。阴道攻击后，临床并通过常规血液学、淋巴细胞亚群、和血液化学测量来对追踪猴。关于病毒共培养物的腹股沟淋巴结活检和关于病毒DNA的PCR在病毒攻击后3周针对所有猴进行。
实施例4：优化针对hCXCR4的功能性纳米抗体特征
实施例4.1：生成二价纳米抗体：
为了通过改造改进功能性抑制特征，生成一系列基于238D2和238D4的二价纳米抗体(表B-5)。
表B-5：选择的二价纳米抗体的序列
实施例4.2：二价纳米抗体的效力：
利用具有不同大块小的重复GGGGS序列的氨基酸接头使238D2与238D2和使238D4与238D4重组连接分别导致与CXCR4的亲和力的14和4.4倍的增高(表B-6，表B-6)。当238D2与238D4连接时，也观察到表观亲和力的显著增加。在获得的杂二价纳米抗体238D2-20GS-238D4的情形中，与CXCR4的亲和力增加至各自单价对应体238D2和238D4的27和17倍。接头大小在15个氨基酸和20个氨基酸之间的变化不显示任何关于受体亲和力的影响。然而，238D2与失活的纳米抗体238B10或与低亲和力纳米抗体238C5的连接不导致受体亲和力的增加，而是甚至降低受体亲和力。这些结果排除了接头通过其自身增加受体亲和力的可能性。此外，通过等摩尔混合238D2和238D4引起的238D2和238D4之间结合的竞争(图4B，4C)和缺乏[125I]-CXCL12替代效力的增加不支持阳性协同作用，这归因于相同受体分子上的变构结合。
表B-6：与其单价对应体相比，由二价纳米抗体引起的[125I]-CXCL12的受体亲和力(pKi)，相对效力和最大替代。实验针对来自瞬间表达CXCR4的HEK293T细胞的膜进行。数据显示为平均值±S.E.M.。实验次数以n给出。
a相对于单价238D2的那些的效力。
b相对于单价238D4的那些的效力238D4。
c在最高测试浓度0.5μM时在0.5μM时替代未达到最大值。
表B-7：趋化性
化合物238D2-15GS-238D4和化合物238D2-20GS-238D4的最大抑制(Imax)和功能性抑制效力(pKi或pIC50)。数据显示为平均值±S.E.M.。实验次数以n给出。
进一步功能性表征最有效的二价纳米抗体238D2-15GS-238D4和238D2-20GS-238D4。这二者，即238D2-15GS-238D4和238D2-20GS-238D4完全拮抗低于纳摩尔浓度的CXCL12的化学引诱作用(分别地，pKi＝9.86±0.04和10.19±0.27；n＝3)。总之，纳米抗体238D2和238D4与单链分子的连接通过封闭CXCR4导致抗趋化效力显著增加甚至1-2个数量级(见表B-7和表B-4)。
实施例4.3：比较12G5vs单价238D2，238D4和二价纳米抗体的功效
在膜结合实验中，12G5似乎仅替代50％的125I-CXCL12。我们因此对测试12G5是否有效抑制CXCR4功能感兴趣。
肌醇磷酸测量
12G5已经作为连续曲线(n＝2)和单点(10nM)，针对hCXCR4/Gαqi5测定；细胞用30nMCXCL12来刺激。
方法：在第1天，HEK293T细胞以2百万个细胞/皿的密度接种。第二天，利用PEI法，使用2.5μgCXCR4DNA和2.5μgGαqi5转染这些细胞。次日，将细胞接种在聚-L-赖氨酸包被的24孔板(500μl/孔)中并在4-6小时后，用处于无肌醇培养基中的2μCi/ml3H-肌醇进行标记。在第4天，用处于Rosenkilde缓冲液中的纳米抗体、12G5或1μMAMD3100，在37℃预刺激细胞2小时。该预刺激后，向每个孔中加入30nMCXCL12(或基础信号传导用缓冲液)和10mMLiCl二者(终浓度)，随后在37℃进行最终2小时温育。该最终温育后，通过吸出刺激培养基和添加10mM甲酸终止反应(图9)。
实施例：纳米抗体的作用模式
实施例5.1：CXCR4-特异性纳米抗体针对CXCR4的组成型活性突变体表现为中性拮抗剂或反向拮抗剂
CXCR4-特异性单价纳米抗体238D2和238D4以及它们的二价融合产物L3和L8针对组成型活性CXCR4突变体N119A(等于A类GPCR的Ballestros-Weinstein编号中的N3.35A)研究。N119的突变体以前已经由Peiper及同事鉴别为利用组成型活性突变体(CAMs)的酵母报道基因测定从CXCR4随机诱变文库中选择的唯一突变体(ZhangW.B.，NavenotJ.M.，HaribabuB.，TamamuraH.，HiramatuK.，OmagariA.，PeiG.，ManfrediJ.P.，FujiiN.，BroachJ.R.，PeiperS.C.(2002).ApointmutationthatconfersconstitutiveactivitytoCXCR4revealsthatT140isaninverseagonistandthatAMD3100andALX40-4Careweakpartialagonists(赋予CXCR4组成型活性的点突变揭示T140是反向激动剂且AMD3100和ALX40-4C是弱的部分激动剂).J.Biol.Chem.(生物化学杂志)277：24515-24521.)。尽管关于其他A类GPCR的大量CAM和为生成关于CXCR4的其他CAM作出了进一步努力(Berchiche等，2007)，CXCR4的N119突变体仍然是关于该受体的唯一已知CAM。研究的两种单价纳米颗粒，即238D2和238D4，均能够结合CXCR4(N119A)。它们的结合亲和力与野生型受体相比略小。由于减小的亲和力，在最高纳米抗体测试浓度2μM时没有达到平台期(图10)。
方法：制备膜和使用[125I]-CXCL12(40pM)的竞争结合实验如前关于野生型CXCR4所述地进行(见上)。单价纳米抗体238D2和238D4以及二价融合产物L3和L8针对CXCR4(N119A)的功能特征通过测量配体-诱导的基础肌醇磷酸累积的变化来研究。瞬间表达CXCR4(N119A)的HEK293T细胞显示的基础肌醇磷酸累积速率比野生型CXCR4或模拟物(其实质上处于相同水平)高，为其3-8倍。CXCL12进一步刺激突变受体的能力与野生型相比降低(基础值的0.4倍)(图11A)。238D4、L3和L8对该突变体表现为部分反向激动剂且分别降低CXCR4(N119A)的组成型增加的基础信号传导达49、64和65％(图11A)。纳米抗体-诱导的基础肌醇磷酸累积减少受到选择性中性CXCR4拮抗剂普乐沙福(plerixafor)的拮抗，证实观察到的反向拮抗作用通过CXCR4(N119A)介导(图11B-D)。对238D2和普乐沙福既没有观察到显著的激动活性也没有观察到反向拮抗活性(图11A)，尽管这些配体清楚地结合该突变受体(见上)。
我们的结果显示纳米抗体可以充当关于组成型活性CXCR4突变体的中性拮抗剂或反向拮抗剂。最畅销GPCR药物中的大多数表现为反向拮抗剂而非中性拮抗剂(MilliganG.(2003).ConstitutiveactivityandinverseagonistsofGprotein-coupledreceptors：acurrentperspective(G蛋白偶联受体的组成型活性和反向激动剂：当前观点).Mol.Pharmacol.(分子药理学)64：1271-1276)并且已经声称反向激动剂与中性拮抗剂相比，可以具有关于若干疾病包括癌症的特异性治疗益处(KenakinT.(2004).Efficacyasavector：therelativeprevalenceandpaucityofinverseagonism(作为载体的功效：反向激动作用的相对流行和缺乏).Mol.Pharmacol.(分子药理学)65：2-11)。尽管我们的观察结果，即CXCR4-特异性纳米抗体可以表现为反向拮抗剂具有新颖性，但是不清楚反向CXCR4激动作用的生理学相关性。因为与肌醇磷酸累积测定中的模拟物相比，我们不能检测到任何显著的CXCR4(wt)基础活性，所以至少在该测定中不可能检测到任何反向激动作用。此外，最明显的CXCR4功能是使干细胞趋化募集到骨髓。该趋化性由细胞表面受体的不对称活化介导，使细胞朝向化学引诱物梯度移动。因此，趋化性严格取决于化学引诱物配体。然而，反向拮抗剂可以在抑制CXCR4的其他功能如化学增活作用或促进肿瘤生长方面优于中性拮抗剂。
实施例6：针对CXCR4的纳米抗体或纳米抗体构建体的潜在应用
●免疫缺陷障碍
●WHIM综合征：疣、低丙球蛋白血症、感染和先天性骨髓粒细胞缺乏症综合征(Wart，Hypogammaglobulinemia，InfectionandMyelokathexissyndrome)
●癌症：
○造血系统癌症(Hematopoieticcancers)：CLL，AML，ALL，MM，非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkinlymphoma)
○实体瘤(Solidtumors)：乳腺癌，肺癌，脑癌...
○肿瘤的基质化学抗性(Stromalchemoresistanceoftumors)
○白血病和其他癌症
○干细胞动员(Stemcellmobilization)
○破坏赋予肿瘤细胞存活和药物抗性的粘性基质相互作用
○动员肿瘤细胞离开组织部位并使其更易接受常规治疗
○阻断肿瘤细胞的迁移和播散(转移)
○阻断旁分泌生长和存活信号
○阻断SDF-1的血管发生作用
●炎症
●RA，哮喘(asthma)，肺纤维化(pulmonaryfibrosis)，SLE
●干细胞募集到受伤组织(心脏，脑)
●神经炎性疾病
●MS，卒中(stroke)，HIV-相关性痴呆
●感染性疾病
●HIV/AIDS，西尼罗病毒脑炎(WestNileVirusencephalitis)
实施例7：一些治疗相关GPCR(及本发明氨基酸序列、纳米抗体或多肽的理想作用)的非限制性列表的表C。
A类GPCR
-乙酰胆碱受体(激动剂)，
-毒蕈碱性受体(激动剂)，
-毒蕈碱性M1受体(激动剂)，
-毒蕈碱性M2受体(激动剂)，
-毒蕈碱性M3受体(激动剂)，
-毒蕈碱性M4受体(激动剂)，
-毒蕈碱性M5受体(激动剂)
-毒蕈碱性受体(部分激动剂)
-肾上腺素受体(激动剂)，
-α肾上腺素受体(激动剂)，
-α1肾上腺素受体(激动剂)，
-α1A肾上腺素受体(激动剂)，
-α1B肾上腺素受体(激动剂)
-α1D肾上腺素受体(激动剂)
-α2肾上腺素受体(激动剂)，
-α2A肾上腺素受体(激动剂)，
-α2B肾上腺素受体(激动剂)，
-α2C肾上腺素受体(激动剂)，
-α2肾上腺素受体(部分激动剂)
-α3肾上腺素受体(激动剂)，
-β肾上腺素受体(激动剂)，
-β1肾上腺素受体(激动剂)，
-β2肾上腺素受体(激动剂)，
-β3肾上腺素受体(激动剂)，
-多巴胺受体(激动剂)，
-多巴胺D5受体(激动剂)
-多巴胺D1受体(激动剂)，
-多巴胺D2受体(激动剂)，
-多巴胺D3受体(激动剂)，
-多巴胺D4受体(激动剂)，
-组胺受体(激动剂)，
-组胺H1受体(激动剂)，
-组胺H2受体(激动剂)，
-组胺H3受体(激动剂)，
-组胺H4受体(激动剂)，
-5-HTGPCR(激动剂)，
-5-HT1(激动剂)，
-5-HT2(激动剂)，
-5-HT4(激动剂)，
-5-HT5a(激动剂)，
-5-HT5b(激动剂)
-5-HT6(激动剂)，
-5-HT7(激动剂)，
-痕量胺相关受体(激动剂)，
-痕量胺相关受体-1(激动剂)，
-痕量胺相关受体-2(激动剂)
-痕量胺相关受体-3(激动剂)
-痕量胺相关受体-4(激动剂)
-痕量胺相关受体-5(激动剂)
-痕量胺相关受体-6(激动剂)
-痕量胺相关受体-7(激动剂)
-痕量胺相关受体-8(激动剂)
-痕量胺相关受体-9(激动剂)
-Apelin受体(激动剂)，
-大麻素受体(激动剂)，
-大麻素CB1受体(激动剂)，
-大麻素CB2受体(激动剂)，
-溶血鞘脂(Lysosphingolipid)受体(激动剂)，
-鞘氨醇-1-磷酸酯受体-1(激动剂)，
-溶血磷脂(Lysophosphatidate)-1受体(激动剂)
-鞘氨醇-1-磷酸酯受体-3(激动剂)，
-溶血磷脂-2受体(激动剂)
-鞘氨醇-1-磷酸酯受体-2(激动剂)
-鞘氨醇-1-磷酸酯受体-4(激动剂)，
-溶血磷脂-3受体(激动剂)
-鞘氨醇-1-磷酸酯受体-5(激动剂)
-A型激素蛋白GPCR(激动剂)，
-FSH(激动剂)，
-黄体生成素受体(激动剂)，
-TSH(激动剂)，
-白三烯(激动剂)，
-白三烯BLT受体(激动剂)，
-半胱氨酰基白三烯受体(激动剂)，
-褪黑素(激动剂)，
-褪黑素MT1(激动剂)，
-褪黑素MT2(激动剂)，
-褪黑素MT3(激动剂)
-A类核苷酸样GPCR(激动剂)，
-腺苷受体(激动剂)，
-P2Y受体(激动剂)，
-A类孤儿GPCR(激动剂)，
-Chrelin(激动剂)，
-A类肽GPCR(激动剂)，
-血管紧张素受体(激动剂)，
-血管紧张素I受体(激动剂)，
-血管紧张素II受体(激动剂)，
-铃蟾肽受体(激动剂)，
-铃蟾肽BB1受体(激动剂)
-铃蟾肽BB2受体(激动剂)
-铃蟾肽bb3受体(激动剂)，
-胃泌素释放肽配体，
-神经调节肽B配体
-神经调节肽C配体
-缓激肽受体(激动剂)，
-缓激肽B1受体(激动剂)，
-缓激肽B2受体(激动剂)，
-C3a受体(激动剂)，
-C5a(激动剂)，
-CCK受体(激动剂)，
-CCK1受体(激动剂)，
-CCK2受体(激动剂)，
-胃泌素(激动剂)，
-趋化因子(激动剂)，
-CC趋化因子受体(激动剂)，
-CCR1趋化因子(激动剂)，
-CCR2趋化因子(激动剂)，
-CCR3趋化因子(激动剂)，
-CCR4趋化因子(激动剂)，
-CCR5趋化因子(激动剂)，
-CCR6趋化因子(激动剂)，
-CCR7趋化因子(激动剂)
-CCR8趋化因子(激动剂)，
-CCR9趋化因子(激动剂)
-CCR10趋化因子(激动剂)，
-CCR11趋化因子(激动剂)
-CX3C趋化因子受体(激动剂)，
-CX3CR1趋化因子(激动剂)，
-XCR1趋化因子(激动剂)
-CXC趋化因子受体(激动剂)，
-CXCR1趋化因子(激动剂)
-CXCR3趋化因子(激动剂)，
-CXCR4趋化因子(激动剂)，
-CXCR5趋化因子(激动剂)
-肾上腺髓质素受体(激动剂)，
-内皮缩血管肽(激动剂)，
-内皮缩血管肽ET-A(激动剂)，
-内皮缩血管肽ET-B(激动剂)，
-甘丙肽(激动剂)，
-甘丙肽GAL1(激动剂)，
-甘丙肽GAL2(激动剂)，
-甘丙肽GAL3(激动剂)
-IL-9(激动剂)，
-KiSS-1受体(激动剂)，
-黑色素浓缩激素(激动剂)，
-MCH受体-1(激动剂)
-MCH受体-2(激动剂)
-黑皮质素(激动剂)，
-黑皮质素MC1(激动剂)，
-ACTH受体(激动剂)，
-黑皮质素MC3(激动剂)，
-黑皮质素MC4(激动剂)，
-黑皮质素MC5(激动剂)，
-NK(激动剂)，
-NK1(激动剂)，
-NK2(激动剂)
-NK3(激动剂)，药物：1
-神经肽Y受体(激动剂)，
-神经肽Y1受体(激动剂)
-神经肽Y2受体(激动剂)，
-神经肽Y4受体(激动剂)，
-神经肽Y5受体(激动剂)，
-神经肽Y6受体(激动剂)
-神经降压肽受体(激动剂)，
-神经降压肽NTS1(激动剂)，
-神经降压肽NTS2(激动剂)
-促食素(orexin)&神经肽FF受体(激动剂)，
-促食素(激动剂)，
-阿片样物质(激动剂)，
-δ阿片样物质(激动剂)，
-κ阿片样物质(激动剂)，
-μ阿片样物质(激动剂)，
-ORL1受体(激动剂)，
-阿片样物质(部分激动剂)
-∑阿片样物质(激动剂)，
-促食素&神经肽FF受体(激动剂)，
-神经肽FF受体(激动剂)，
-神经肽FF1受体(激动剂)
-神经肽FF2受体(激动剂)，
-促食素(激动剂)，
-促食素-1(激动剂)
-促食素-2(激动剂)
-蛋白酶活化受体(激动剂)，
-蛋白酶活化受体-1(激动剂)，
-蛋白酶活化受体-2(激动剂)，
-蛋白酶活化受体-3(激动剂)
-蛋白酶活化受体-4(激动剂)
-Prokineticin受体(激动剂)，
-Prokineticin受体-1(激动剂)，
-Prokineticin受体-2(激动剂)，
-促生长素抑制素(激动剂)，
-促生长素抑制素1(激动剂)，
-促生长素抑制素2(激动剂)，
-促生长素抑制素3(激动剂)，
-促生长素抑制素4(激动剂)，
-促生长素抑制素5(激动剂)，
-硬骨鱼紧张肽II(激动剂)，
-血管升压素样受体(激动剂)，
-催产素(激动剂)，
-血管升压素(激动剂)，
-血管升压素V1(激动剂)，
-血管升压素V2(激动剂)，
-前列腺素类物质受体(激动剂)，
-DP前列腺素类物质(激动剂)，
-PGD2(激动剂)，
-EP1前列腺素类物质(激动剂)，
-PGE2(激动剂)，
-EP2前列腺素类物质(激动剂)，
-PGE2(激动剂)，
-EP3前列腺素类物质(激动剂)，
-PGE2(激动剂)，
-EP4前列腺素类物质(激动剂)，
-PGE2(激动剂)，
-FP前列腺素类物质(激动剂)，
-PGF2α(激动剂)，
-IP前列腺素类物质(激动剂)，
-前列环素(激动剂)，
-前列腺素类物质受体(部分激动剂)
-TP前列腺素类物质(激动剂)，
-血栓烷A2(激动剂)
-琥珀酸酯受体1(激动剂)
-TRH(激动剂)，
-TRH1(激动剂)
-TRH2(激动剂)
-犁鼻1型受体(激动剂)
-犁鼻1型受体-1(激动剂)
-犁鼻1型受体-2(激动剂)
-犁鼻1型受体-3(激动剂)
-犁鼻1型受体-4(激动剂)
-犁鼻1型受体-5(激动剂)
-Apelin受体(调节剂)，
-大麻素受体(调节剂)，
-趋化因子受体-样1(调节剂)，
-溶学鞘脂受体(调节剂)，
-A型激素蛋白GPCR(调节剂)，
-白三烯受体(调节剂)，
-褪黑素受体(调节剂)，
-A类核苷酸样GPCR(调节剂)，
-A类孤儿GPCR(调节剂)，
-PAF受体(调节剂)，
-A类肽GPCR(调节剂)，
-前列腺素类物质受体(调节剂)，
-琥珀酸酯受体1(调节剂)
-TRH受体(调节剂)，
-犁鼻1型受体(调节剂)，
B类GPCRs
-G蛋白偶联受体-3(调节剂)，
-G蛋白偶联受体-3(激动剂)
-G蛋白偶联受体-3(拮抗剂)，
-G蛋白偶联受体-6(调节剂)，
-G蛋白偶联受体-6(激动剂)
-G蛋白偶联受体-6(拮抗剂)，
-G蛋白偶联受体-12(调节剂)，
-G蛋白偶联受体-12(激动剂)
-G蛋白偶联受体-12(拮抗剂)，
-G蛋白偶联受体-14(调节剂)
-G蛋白偶联受体-14(激动剂)
-G蛋白偶联受体-14(拮抗剂)
-B类GPCR(激动剂)，
-CRF-1受体(激动剂)
-CRF-2受体(激动剂)，
-降钙素受体(调节剂)，
-降钙素(激动剂)，
-降钙素(拮抗剂)，
-ACTH释放因子受体(调节剂)，
-CRF-1受体(调节剂)，
-CRF-1受体(激动剂)
-CRF-1受体(拮抗剂)，
-CRF-2受体(调节剂)，
-CRF-2受体(激动剂)，
-CRF-2受体(拮抗剂)，
-ACTH释放因子(激动剂)，
-CRF-1受体(激动剂)
-CRF-2受体(激动剂)，
-ACTH释放因子(拮抗剂)，
-CRF-1受体(拮抗剂)，
-CRF-2受体(拮抗剂)，
-胰高血糖素-样肽受体(调节剂)，
-胰高血糖素-样肽1受体(调节剂)，
-胰高血糖素-样肽2受体(调节剂)，
-胰高血糖素-样肽(激动剂)，
-胰高血糖素-样肽(拮抗剂)，
-胰高血糖素受体(调节剂)，
-胰高血糖素(激动剂)，
-胰高血糖素(拮抗剂)，
-GHRH受体(调节剂)，
-GHRH(激动剂)，
-生长激素释放因子(拮抗剂)，
-PACAPI型受体(调节剂)，
-PACAPI型受体(激动剂)，
-PACAPI型受体(拮抗剂)
-PTH受体(调节剂)，
-PTH-1受体(调节剂)
-PTH-2受体(调节剂)
-PTH(激动剂)，
-PTH(拮抗剂)，
-分泌素受体(调节剂)，
-分泌素(激动剂)，
-分泌素(拮抗剂)
-VIP受体(调节剂)，
-VIP-1受体(调节剂)，
-VIP-2受体(调节剂)，
-VIP(激动剂)，
-VIP(拮抗剂)，
C类GPCRs
-C类GPCR(调节剂)，
-C类GPCR(激动剂)，
-GABAB受体(激动剂)，
-代谢型谷氨酸受体(激动剂)，
-代谢型谷氨酸受体1(激动剂)，
-代谢型谷氨酸受体2(激动剂)，
-代谢型谷氨酸受体3(激动剂)，
-代谢型谷氨酸受体4(激动剂)，
-代谢型谷氨酸受体5(激动剂)，
-代谢型谷氨酸受体6(激动剂)
-代谢型谷氨酸受体7(激动剂)
-代谢型谷氨酸受体8(激动剂)
表D：人GPCRs的非限制性列表
本领域中技术人员应该承认，或能够利用不超过常规实验确定，本文中所述的特殊实施方案的许多等价方案。所述等价方案意欲属于以下方面。
本文中公开的所有参考文献通过引用整体地结合在本文中，以用于说明书指出的目的和信息。
优选的方面：
1.氨基酸序列，例如单可变结构域，其针对和/或特异性结合GPCR并具有针对所述GPCR的拮抗性质，优选仅拮抗剂性质，即无激动性质。
2.氨基酸序列，例如单可变结构域，其针对和/或特异性结合GPCR并具有针对所述GPCR的拮抗或反向激动性质，优选反向激动性质。
3.氨基酸序列，例如单可变结构域，其针对和/或特异性结合GPCR并具有针对所述GPCR的反向激动性质，优选可以减小例如通过IP累积测量的活性至基础活性的90％以上，优选基础活性的80％以上，更优选基础活性的70％以上，甚至更优选活性至基础活性的60％以上，更优选活性至基础活性的50％以上。
4.氨基酸序列，例如单可变结构域，其针对和/或a)特异性结合GPCR；和b)完全抑制所述GPCR的配体依赖性活化，其中所述配体以100nM以下，更优选30nM以下的浓度存在。
5.氨基酸序列，例如单可变结构域，其针对和/或a)特异性结合GPCR；和b)完全抑制所述GPCR的配体依赖性活化，其中所述配体以100nM以下，更优选30nM以下的浓度存在；和c)不提供所述GPCR的活化。
6.根据以上方面中任一项的氨基酸序列，例如单可变结构域；并且b)可通过包括至少以下步骤的方法获得：
i.用有生命的并以其天然构象在其表面上过表达所述GPCR，例如人CXCR4和/或人CXCR7的所需胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他一个或多个胞外表位的完整细胞免疫骆驼科动物；和
ii.利用过表达所述GPCR，例如人CXCR4和/或人CXCR7的不同(与免疫中使用的那种不同)细胞类型的细胞膜制剂来选择对所需胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他一个或多个胞外表位的结合；和任选地
iii.仅用缓冲液诸如无去污剂的PBS温和地洗涤。
7.根据方面6的氨基酸序列，其中所述骆驼科动物是美洲驼。
8.根据方面6或7的氨基酸序列，其中所述选择以2轮完成，且其中使用2种不同细胞类型的细胞膜制剂。
9.根据前述任一方面的氨基酸序列，其处于基本上分离的形式。
10.根据前述任一方面的氨基酸序列，其施用于受试者，其中所述氨基酸序列不天然存在于所述受试者中。
11.根据前述任一方面的氨基酸序列，其可以以10-5-10-12摩尔/升(M)或更小、并且优选地10-7-10-12摩尔/升(M)或更小并且更优选地10-8-10-12摩尔/升的解离常数(KD)特异性结合GPCR。
12.根据前述任一方面的氨基酸序列，其可以以102M-1s-1-约107M-1s-1，优选103M-1s-1-107M-1s-1，更优选104M-1s-1-107M-1s-1，诸如105M-1s-1-107M-1s-1的缔合速率(kon-速率)特异性结合GPCR。
13.根据前述任一方面的氨基酸序列，其可以以1s-1-10-6s-1，优选10-2s-1-10-6s-1，更优选10-3s-1-10-6s-1，诸如10-4s-1-10-6s-1的解离速率(koff速率)特异性结合GPCR。
14.根据前述任一方面的氨基酸序列，其可以以小于500nM，优选小于200nM，更优选小于10nM，诸如小于500pM的亲和力特异性结合GPCR。
15.根据前述任一方面的氨基酸序列，其是天然存在的氨基酸序列(来自任何合适物种)或合成或半合成的氨基酸序列。
16.根据前述任一方面的氨基酸序列，其包括免疫球蛋白折叠或在合适的条件下能够形成免疫球蛋白折叠。
17.根据前述任一方面的氨基酸序列，其基本由4个构架区(分别地，FR1-FR4)和3个互补性决定区(分别地，CDR1-CDR3)组成。
18.根据前述任一方面的氨基酸序列，其是免疫球蛋白序列。
19.根据前述任一方面的氨基酸序列，其是天然存在的免疫球蛋白序列(来自任何合适物种)或合成或半合成的免疫球蛋白序列。
20.根据前述任一方面的氨基酸序列，其是人源化的免疫球蛋白序列，骆驼化的免疫球蛋白序列或已经通过诸如亲和力成熟的技术获得的免疫球蛋白序列。
21.根据前述任一方面的氨基酸序列，其基本由轻链可变结构域序列(例如VL-序列)；或重链可变结构域序列(例如VH-序列)组成。
22.根据前述任一方面的氨基酸序列，其基本由源自常规四链抗体的重链可变结构域序列组成或基本由源自重链抗体的重链可变结构域组成。
23.根据前述任一方面的氨基酸序列，其基本由结构域抗体(或适合用作结构域抗体的氨基酸序列)、单结构域抗体(或适合用作单结构域抗体的氨基酸序列)、″dAb″(或适合用作dAb的氨基酸序列)或纳米抗体TM(包括但不仅限于VHH序列)组成。
24.根据前述任一方面的氨基酸序列，其基本由纳米抗体TM组成。
25.根据前述任一方面的氨基酸序列，其基本由纳米抗体TM组成，所述纳米抗体TM与SEQIDNO’s：1-22中至少一个氨基酸序列具有80％氨基酸同一性，其中为了确定氨基酸同一性程度的目的，忽视形成CDR序列的氨基酸残基；且其中：优选根据Kabat编号的位置11，37，44，45，47，83，84，103，104和108的一个或多个氨基酸残基选自表A-3中提及的标志残基。
26.根据前述任一方面的氨基酸序列，其基本由纳米抗体TM组成，所述纳米抗体TM与SEQIDNO’s：238-253，更优选238-239中的至少一个氨基酸序列具有80％氨基酸同一性，其中为了确定氨基酸同一性程度的目的，忽视形成CDR序列的氨基酸残基；且其中：优选根据Kabat编号的位置11，37，44，45，47，83，84，103，104和108的一个或多个氨基酸残基选自表A-3中提及的标志残基。
27.根据前述任一方面的氨基酸序列，其基本由人源化的纳米抗体TM组成。
28.根据前述任一方面的氨基酸序列，其除至少一个针对GPCR结合的结合位点外，包含一个或多个针对其他抗原、蛋白或靶标结合的更多的结合位点。
29.单可变结构域，其特异性结合CXCR4的至少一个成员。
30.根据方面29的单可变结构域，其中所述CXCR4的成员是人CXCR4。
31.根据方面29的单可变结构域，其中所述单可变结构域另外阻断由CXCR4，例如人CXCR4组成的组的至少一个成员与具有SEQIDNO：238-253，更优选238-239的序列的至少一个单可变结构域之间的相互作用。
32.根据方面29的单可变结构域，其中所述单可变结构域选自由以下组成的组：a)具有SEQIDNO：238-253，更优选238-239序列的单可变结构域；和b)与选自由具有SEQIDNO：238-253，更优选238-239序列的单可变结构域组成的组中的至少一个序列具有80％氨基酸同一性的单可变结构域。
33.根据方面29的单可变结构域，其中所述单可变结构域选自由以下组成的组：a)具有SEQIDNO：238-253，更优选238-239序列的单可变结构域；和b)具有SEQIDNO：238-253，更优选238-239序列的单可变结构域，其中至多10个氨基酸残基被天然存在的氨基酸替换且其中所述替换的氨基酸位于构架区内。
34.根据方面29的单可变结构域，其中所述单可变结构域选自由以下组成的组：a)具有SEQIDNO：238-253，更优选238-239序列的单可变结构域；和b)具有SEQIDNO：238-253，更优选238-239序列的单可变结构域，其中至多8个氨基酸残基被天然存在的氨基酸替换且其中所述替换的氨基酸位于构架区内。
35.根据方面29的单可变结构域，其中所述单可变结构域选自由以下组成的组：a)具有SEQIDNO：238-253，更优选238-239序列的单可变结构域；和b)具有SEQIDNO：238-253，更优选238-239序列的单可变结构域，其中至多5个氨基酸残基被天然存在的氨基酸替换且其中所述替换的氨基酸位于构架区内。
36.根据方面29的单可变结构域，其中所述单可变结构域选自由以下组成的组：a)具有SEQIDNO：238-253，更优选238-239序列的单可变结构域；和b)具有SEQIDNO：238-253，更优选238-239序列的单可变结构域，其中至多3个氨基酸残基被天然存在的氨基酸替换且其中所述替换的氨基酸位于构架区内。
37.根据方面29的单可变结构域，其中所述单可变结构域选自由以下组成的组：a)具有SEQIDNO：238-253，更优选238-239序列的单可变结构域；和b)与选自由具有SEQIDNO：238-253，更优选238-239序列的序列组成的组中的至少一个序列具有80％氨基酸同一性的单可变结构域，且其中所述由组a)和b)选择的单可变结构域以10-7-10-12摩尔/升或更小的解离常数(KD)结合GPCR受体的至少一个成员。
38.根据方面29的单可变结构域，其中所述单可变结构域选自由以下组成的组：a)具有SEQIDNO：238-253，更优选238-239序列的单可变结构域；和b)具有SEQIDNO：238-253，更优选238-239序列的单可变结构域，其中至多10个氨基酸残基被天然存在的氨基酸替换且其中所述替换的氨基酸位于构架区内；且其中所述由组a)和b)选择的单可变结构域以10-7-10-12摩尔/升或更小的解离常数(KD)结合GPCR受体的至少一个成员。
39.根据方面29的单可变结构域，其中所述单可变结构域选自由以下组成的组：a)具有SEQIDNO：238-253，更优选238-239序列的单可变结构域；和b)具有SEQIDNO：238-253，更优选238-239序列的单可变结构域，其中至多8个氨基酸残基被天然存在的氨基酸替换且其中所述替换的氨基酸位于构架区内；且其中所述由组a)和b)选择的单可变结构域以10-7-10-12摩尔/升或更小的解离常数(KD)结合Notch受体的至少一个成员。
40.根据方面29的单可变结构域，其中所述单可变结构域选自由以下组成的组：a)具有SEQIDNO：238-253，更优选238-239序列的单可变结构域；和b)具有SEQIDNO：238-253，更优选238-239序列的单可变结构域，其中至多5个氨基酸残基被天然存在的氨基酸替换且其中所述替换的氨基酸位于构架区内；且其中所述由组a)和b)选择的单可变结构域以10-7-10-12摩尔/升或更小的解离常数(KD)结合Notch受体的至少一个成员。
41.根据方面29的单可变结构域，其中所述单可变结构域选自由以下组成的组：a)具有SEQIDNO：238-253，更优选238-239序列的单可变结构域；和b)具有SEQIDNO：238-253，更优选238-239序列的单可变结构域，其中至多3个氨基酸残基被天然存在的氨基酸替换且其中所述替换的氨基酸位于构架区内；且其中所述由组a)和b)选择的单可变结构域以10-7-10-12摩尔/升或更小的解离常数(KD)结合Notch受体的至少一个成员。
42.根据方面29的单可变结构域，其中所述单可变结构域选自由以下组成的组：a)具有SEQIDNO：238-253，更优选238-239序列的单可变结构域；和b)与选自由具有SEQIDNO：238-253，更优选238-239的序列组成的组中的至少一个序列具有80％氨基酸同一性的单可变结构域，且其中所述由组a)和b)选择的单可变结构域以10-8-10-12摩尔/升或更小的解离常数(KD)结合Notch信号传导途径的成员。
43.根据方面29的单可变结构域，其中所述单可变结构域选自由以下组成的组：a)具有SEQIDNO：238-253，更优选238-239序列的单可变结构域；和b)具有SEQIDNO：238-253，更优选238-239序列的单可变结构域，其中至多10个氨基酸残基被天然存在的氨基酸替换且其中所述替换的氨基酸位于构架区内；且其中所述由组a)和b)选择的单可变结构域以10-8-10-12摩尔/升或更小的解离常数(KD)结合Notch受体的至少一个成员。
44.根据方面29的单可变结构域，其中所述单可变结构域选自由以下组成的组：a)具有SEQIDNO：238-253，更优选238-239序列的单可变结构域；和b)具有SEQIDNO：238-253，更优选238-239序列的单可变结构域，其中至多8个氨基酸残基被天然存在的氨基酸替换且其中所述替换的氨基酸位于构架区内；且其中所述由组a)和b)选择的单可变结构域以10-8-10-12摩尔/升或更小的解离常数(KD)结合GPCR受体的至少一个成员。
45.根据方面29的单可变结构域，其中所述单可变结构域选自由以下组成的组：a)具有SEQIDNO：238-253，更优选238-239序列的单可变结构域；和b)具有SEQIDNO：238-253，更优选238-239序列的单可变结构域，其中至多5个氨基酸残基被天然存在的氨基酸替换且其中所述替换的氨基酸位于构架区内；且其中所述由组a)和b)选择的单可变结构域以10-8-10-12摩尔/升或更小的解离常数(KD)结合GPCR受体的至少一个成员。
46.根据方面29的单可变结构域，其中所述单可变结构域选自由以下组成的组：a)具有SEQIDNO：238-253，更优选238-239序列的单可变结构域；和b)具有SEQIDNO：238-253，更优选238-239序列的单可变结构域，其中至多3个氨基酸残基被天然存在的氨基酸替换且其中所述替换的氨基酸位于构架区内；且其中所述由组a)和b)选择的单可变结构域以10-8-10-12摩尔/升或更小的解离常数(KD)结合GPCR受体的至少一个成员。
47.单可变结构域，其特异性结合CXCR7的至少一个成员。
48.根据方面29的单可变结构域，其中所述CXCR7的成员是人CXCR7。
49.化合物或构建体，其a)包括根据方面1-29中任一项的一个或多个氨基酸序列或基本由其组成；或b)包括根据方面30-48中任一项的一个或多个氨基酸序列或基本由其组成；和任选地，还包括一个或多个其他组、残基、结构部分或结合单元，它们任选地通过一个或多个接头相连接。
50.根据方面49的化合物或构建体，其中所述一个或多个其他组、残基、结构部分或结合单元是氨基酸序列。
51.根据方面50的化合物或构建体，其中所述一个或多个接头，如果存在，是一个或多个氨基酸序列。
52.根据方面49-51中任一项所述的化合物或构建体，其中所述一个或多个其他组、残基、结构部分或结合单元是免疫球蛋白序列。
53.根据方面49-52中任一项所述的化合物或构建体，其中所述一个或多个其他组、残基、结构部分或结合单元选自由单结构域抗体组成的组。
54.根据方面49-53中任一项所述的化合物或构建体，其中所述一个或多个其他组、残基、结构部分或结合单元是纳米抗体。
55.根据方面49-54中任一项所述的化合物或构建体，其多价构建体诸如例如SEQIDNO：261-266，优选SEQIDNO：263，264和功能性等价物诸如例如a)与SEQIDNO：261-266具有80％同一性和b)完全抑制所述GPCR的配体依赖性活化的化合物或构建体，其中所述配体以100nM以下，更优选30nM以下的浓度存在；或如果GPCR具有基础活性，则其是完全拮抗剂或优选降低活性至基础活性的90％以上，更优选基础活性的80％以上，甚至更优选基础活性的70％以上，甚至更优选活性至基础活性的60％以上。
56.根据方面49-55中任一项所述的化合物或构建体，其是多特异性构建体。
57.根据方面49-56中任一项所述的化合物或构建体，其与根据方面1-48中任一项所述的相应氨基酸序列或单可变结构域本身相比，具有增加的半衰期。
58.根据方面57的化合物或构建体，其中所述一个或多个其他组、残基、结构部分或结合单元提供与根据方面1-48中任一项所述的相应氨基酸序列或单可变结构域本身相比具有增加的半衰期的化合物或构建体。
59.根据方面58的化合物或构建体，其中提供具有增加的半衰期的化合物或构建体的所述一个或多个其他组、残基、结构部分或结合单元选自由血清蛋白或其片段、能够结合血清蛋白的结合单元、Fc部分、和能够结合血清蛋白的小蛋白或肽组成的组。
60.根据方面58或59的化合物或构建体，其中提供具有增加的半衰期的化合物或构建体的所述一个或多个其他组、残基、结构部分或结合单元选自由人血清白蛋白或其片段组成的组。
61.根据方面60的化合物或构建体，其中提供具有增加的半衰期的化合物或构建体的所述一个或多个其他组、残基、结构部分或结合单元选自由能够结合血清白蛋白(诸如人血清白蛋白)或血清免疫球蛋白(诸如IgG)的结合单元组成的组。
62.根据方面61的化合物或构建体，其中提供具有增加的半衰期的化合物或构建体的所述一个或多个其他组、残基、结构部分或结合单元选自由能够结合血清白蛋白(诸如人血清白蛋白)或血清免疫球蛋白(诸如IgG)的结构域抗体、适合用作结构域抗体的氨基酸序列、单结构域抗体、适合用作单结构域抗体的氨基酸序列、″dAb″、适合用作dAb的氨基酸序列、或纳米抗体组成的组。
63.根据方面57-62中任一项所述的化合物或构建体，其具有这样的血清半衰期，所述血清半衰期是根据方面1-48中任一项所述的氨基酸序列或单可变结构域的相应氨基酸序列本身的半衰期的至少1.5倍，优选至少2倍，诸如至少5倍，例如至少10倍或20倍以上。
64.根据方面57-62中任一项所述的化合物或构建体，其具有这样的血清半衰期，所述血清半衰期与根据方面1-48中任一项所述的相应氨基酸序列或单可变结构域本身的血清半衰期相比，增加大于1小时，优选大于2小时，更优选大于6小时，诸如大于12小时，或甚至大于24，48或72小时。
65.根据方面57-64中任一项所述的化合物或构建体，其在人中具有至少约12小时，优选至少24小时，更优选至少48小时，甚至更优选至少72小时以上；例如，至少5天(诸如约5-10天)，优选至少9天(诸如约9-14天)，更优选至少约10天(诸如约10-15天)，或至少约11天(诸如约11-16天)，更优选至少约12天(诸如约12-18天以上)，或大于14天(诸如约14-19天)的血清半衰期。
66.单价构建体，其包括根据方面1-48中任一项的一个氨基酸序列或单可变结构域或基本由其组成。
67.根据方面66的单价构建体，其中所述本发明的氨基酸序列选自由结构域抗体、适合用作结构域抗体的氨基酸序列、单结构域抗体、适合用作单结构域抗体的氨基酸序列、″dAb″、适合用作dAb的氨基酸序列、或纳米抗体组成的组。
68.核酸或核苷酸序列，其编码根据方面1-48中任一项的氨基酸序列或单可变结构域，根据方面49-65中任一项的化合物或构建体，或根据方面66-67中任一项的单价构建体。
69.根据方面68的核酸或核苷酸序列，其采用遗传构建体的形式。
70.宿主或宿主细胞，其表达，或在合适的环境下能够表达，根据方面1-48中任一项的氨基酸序列或单可变结构域，根据方面49-65中任一项的化合物或构建体，或根据方面66-67中任一项的单价构建体；和/或包括根据方面68-69的核酸或核苷酸序列。
71.用于生成根据方面1-48中任一项的氨基酸序列或单可变结构域，根据方面49-65中任一项的化合物或构建体，或根据方面66-67中任一项的单价构建体的方法，所述方法至少包括以下步骤：
a)在合适的宿主细胞或宿主生物体内或在另一种合适的表达系统中表达根据方面68的核酸或核苷酸序列，或根据方面69的遗传构建体；任选地随后：
b)分离和/或纯化根据方面1-48中任一项的氨基酸序列或单可变结构域，根据方面49-65中任一项的化合物或构建体，或根据方面66-67中任一项的单价构建体。
72.用于生成根据方面1-48中任一项的氨基酸序列或单可变结构域，根据方面49-65中任一项的化合物或构建体，或根据方面66-67中任一项的单价构建体的方法，所述方法至少包括以下步骤：
a)在这样的条件下培养和/或维持根据方面70的宿主或宿主细胞，所述条件使得所述宿主或宿主细胞表达和/或生成至少一种根据方面1-48中任一项的氨基酸序列或单可变结构域，根据方面49-65中任一项的化合物或构建体，或根据方面66-67中任一项的单价构建体；任选地随后：
b)分离和/或纯化根据方面1-48中任一项的氨基酸序列或单可变结构域，根据方面49-65中任一项的化合物或构建体，或根据方面66-67中任一项的单价构建体。
73.组合物，其包含至少一种根据方面1-48中任一项的氨基酸序列或单可变结构域，根据方面49-65中任一项的化合物或构建体，或根据方面66-67中任一项的单价构建体。
74.根据方面73的组合物，其是药物组合物。
75.根据方面74的组合物，其还包括至少一种药用载体、稀释剂或赋形剂和/或佐剂，且任选包括一种或多种另外的药物活性多肽和/或组合物。
76.用于预防和/或治疗至少一种GPCR相关疾病或紊乱的方法，所述方法包括向需要所述预防和/或治疗的受试者施用药物活性量的至少一种根据方面1-48中任一项的氨基酸序列或单可变结构域，根据方面49-65中任一项的化合物或构建体，根据方面66-67中任一项的单价构建体，或根据方面74或75的组合物。
77.用于预防和/或治疗至少一种与GPCR、其生物或药理学活性、和/或GPCR参与的生物学途径或信号传导相关的疾病或紊乱的方法，所述方法包括向需要所述预防和/或治疗的受试者施用药物活性量的至少一种根据方面1-48中任一项的氨基酸序列或单可变结构域，根据方面49-65中任一项的化合物或构建体，根据方面66-67中任一项的单价构建体，或根据方面74或75的组合物。
78.用于预防和/或治疗至少一种可以通过向需要所述预防和/或治疗的受试者施用根据方面1-48中任一项的氨基酸序列或单可变结构域，根据方面49-65中任一项的化合物或构建体，根据方面66-67中任一项的单价构建体来预防和/或治疗的疾病或紊乱的方法，所述方法包括向需要所述预防和/或治疗的受试者施用药物活性量的至少一种根据方面1-48中任一项的氨基酸序列或单可变结构域，根据方面49-65中任一项的化合物或构建体，根据方面66-67中任一项的单价构建体，或根据方面76或77的组合物。
79.免疫治疗方法，所述方法包括向需要所述免疫治疗的受试者施用药物活性量的至少一种根据方面1-48中任一项的氨基酸序列或单可变结构域，根据方面49-65中任一项的化合物或构建体，根据方面66-67中任一项的单价构建体，或根据方面72或73的组合物。
80.根据方面1-48中任一项的氨基酸序列或单可变结构域，根据方面49-65中任一项的化合物或构建体，根据方面66-67中任一项的单价构建体在制备用于预防和/或治疗至少一种GPCR相关疾病或紊乱的药物组合物中的应用。
81.生成根据方面1-48中任一项的氨基酸序列或单可变结构域，根据方面49-65中任一项的化合物或构建体的至少一个结构单元(buildingblock)，根据方面66-67中任一项的单价构建体的至少一个结构单元的方法，包括至少以下步骤：
a)用有生命的并以天然构象在其表面上过表达所述GPCR，例如人CXCR4和/或人CXCR7的所需胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他一个或多个胞外表位的完整细胞免疫骆驼科动物，优选美洲驼；和
b)利用过表达所述GPCR，例如人CXCR4和/或人CXCR7的不同(与免疫中使用的那种不同)细胞类型的细胞膜制剂来选择对所需胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他一个或多个胞外表位的结合；和任选地
c)仅用缓冲液诸如无去污剂的PBS温和地洗涤。
82.筛选以鉴别针对GPCR，例如人CXCR4和/或人CXCR7的氨基酸序列，例如单可变结构域的方法，包括使根据方面1-48中任一项的任意氨基酸序列或单可变结构域，根据方面49-65中任一项的任意化合物或构建体，根据方面66-67中任一项的任意单价构建体与所述GPCR相接触的步骤。
83.构建体，其包括i)第一配体，其针对在结合时能够引起反向激动作用或反向拮抗作用的表位或对其具有亲和力；和ii)第二配体，其针对在结合时能够引起拮抗作用的表位或对其具有亲和力。
84.根据方面83的构建体，其中至少一种所述配体是免疫球蛋白序列。
85.根据方面83或84的构建体，其中至少一种所述配体是dAb或纳米抗体，优选纳米抗体。
86.根据方面83-85的构建体，其中两种配体均是免疫球蛋白序列。
87.根据方面83-86的构建体，其中两种配体均是dAb或纳米抗体，优选纳米抗体。
88.根据方面83-87的构建体，其中所述构建体是多肽。

Claims (10)

1.多肽，其由两种特异性结合序列为SEQIDNO：254的人CXCR4的纳米抗体和一个肽接头组成，其中所述纳米抗体选自特异性结合人CXCR4的由4个框架区(分别是FR1-FR4)和3个互补决定区(分别是CDR1-CDR3)组成的纳米抗体，其中CDR1是SEQIDNO：142的氨基酸序列；CDR2是SEQIDNO：174的氨基酸序列和CDR3是SEQIDNO：206的氨基酸序列；和/或特异性结合人CXCR4的由4个框架区(分别是FR1-FR4)和3个互补决定区(分别是CDR1-CDR3)组成的纳米抗体，其中CDR1是SEQIDNO：143的氨基酸序列；CDR2是SEQIDNO：175的氨基酸序列；和CDR3是SEQIDNO：207的氨基酸序列；
其中所述接头是(GGGGS)n，n＝3或4。
2.权利要求1的多肽；其中一种特异性结合人CXCR4的纳米抗体由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补性决定区(分别为CDR1-CDR3)组成，其中CDR1是氨基酸序列SEQIDNO：142；CDR2是氨基酸序列SEQIDNO：174；且CDR3是氨基酸序列SEQIDNO：206；
其中另一种特异性结合人CXCR4的纳米抗体由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补性决定区(分别为CDR1-CDR3)组成，其中CDR1是氨基酸序列SEQIDNO：143；CDR2是氨基酸序列SEQIDNO：175；且CDR3是氨基酸序列SEQIDNO：207。
3.权利要求1所述的多肽，其中所述纳米抗体选自由氨基酸序列SEQIDNO’s：238-239的纳米抗体组成的组。
4.权利要求1所述的多肽，其中所述多肽选自由氨基酸序列SEQIDNO’s：263-264的多肽组成的组。
5.核酸或核苷酸序列，其编码根据权利要求1-4任一项中的多肽。
6.宿主细胞，其在合适的环境下能够表达根据权利要求1-4任一项中的多肽。
7.药物组合物，其包含根据权利要求1-4任一项中的多肽。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其还包含至少一种药用载体、赋形剂和/或佐剂，且其任选地包含一种或多种另外的化合物。
9.根据权利要求8的药物组合物，其中所述赋形剂是稀释剂，所述化合物是药物活性多肽。
10.药物活性量的根据权利要求1-4任一项中的至少一种多肽在制备用于在需要其的受试者中治疗癌症或AIDS的药物中的应用。
CN200980127612.4A 2008-05-16 2009-05-18 针对CXCR4和其他GPCRs的氨基酸序列以及包含所述氨基酸序列的多肽 Active CN102099378B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US5384708P 2008-05-16 2008-05-16
US61/053,847 2008-05-16
US10214208P 2008-10-02 2008-10-02
US61/102,142 2008-10-02
PCT/EP2009/056026 WO2009138519A1 (en) 2008-05-16 2009-05-18 AMINO ACID SEQUENCES DIRECTED AGAINST CXCR4 AND OTHER GPCRs AND COMPOUNDS COMPRISING THE SAME

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102099378A CN102099378A (zh) 2011-06-15
CN102099378B true CN102099378B (zh) 2016-01-20

Family

ID=40974643

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200980127612.4A Active CN102099378B (zh) 2008-05-16 2009-05-18 针对CXCR4和其他GPCRs的氨基酸序列以及包含所述氨基酸序列的多肽

Country Status (14)

Country Link
US (1) US9212226B2 (zh)
EP (1) EP2285833B1 (zh)
JP (1) JP6034023B2 (zh)
KR (1) KR20110020825A (zh)
CN (1) CN102099378B (zh)
AU (1) AU2009248049B2 (zh)
BR (1) BRPI0911984A2 (zh)
CA (1) CA2724208C (zh)
IL (1) IL209176A0 (zh)
MX (1) MX2010012518A (zh)
NZ (1) NZ589036A (zh)
RU (1) RU2010151725A (zh)
WO (1) WO2009138519A1 (zh)
ZA (1) ZA201008180B (zh)

Families Citing this family (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9512236B2 (en) 2006-12-19 2016-12-06 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against GPCRS and polypeptides comprising the same for the treatment of GPCR-related diseases and disorders
JP6034023B2 (ja) 2008-05-16 2016-11-30 アブリンクス エン．ヴェー． Ｃｘｃｒ４及び他のｇｐｃｒに指向性を有するアミノ酸配列及びそれを含む化合物
WO2010043650A2 (en) * 2008-10-14 2010-04-22 Ablynx Nv Amino acid sequences directed against cellular receptors for viruses and bacteria
WO2010070145A2 (en) 2008-12-19 2010-06-24 Ablynx N.V. Method for generation of immunoglobulin sequences
WO2011042398A1 (en) 2009-10-09 2011-04-14 Ablynx Nv Immunoglobulin single variable domain directed against human cxcr4 and other cell associated proteins and methods to generate them
WO2011083140A1 (en) 2010-01-08 2011-07-14 Ablynx Nv Immunoglobulin single variable domain directed against human cxcr4
US8937164B2 (en) 2010-03-26 2015-01-20 Ablynx N.V. Biological materials related to CXCR7
EP2371863A1 (en) * 2010-03-30 2011-10-05 Pierre Fabre Médicament Humanized anti CXCR4 antibodies for the treatment of cancer
WO2011161266A1 (en) 2010-06-25 2011-12-29 Ablynx Nv Improved immunoglobulin single variable domains and constructs thereof directed against cxcr4
GB201014715D0 (en) 2010-09-06 2010-10-20 Vib Vzw Nanobodies stabilizing functional conformational states of GPCRS
EP2621953B1 (en) 2010-09-30 2017-04-05 Ablynx N.V. Biological materials related to c-met
US11644471B2 (en) * 2010-09-30 2023-05-09 Ablynx N.V. Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobulin single variable domains
KR101832040B1 (ko) * 2010-11-08 2018-04-04 노파르티스 아게 Ｃｘｃｒ２ 결합 폴리펩티드
FR2970781B1 (fr) * 2011-01-25 2013-02-08 Centre Nat Rech Scient Procede de fabrication d'un support d'analyse et utilisation pour la detection de toxines
JP6181040B2 (ja) 2011-03-28 2017-08-16 アブリンクス エン．ヴェー． 二特異性抗ｃｘｃｒ７免疫グロブリン単一可変ドメイン
UA117218C2 (uk) 2011-05-05 2018-07-10 Мерк Патент Гмбх Поліпептид, спрямований проти il-17a, il-17f та/або il17-a/f
PT2723764T (pt) * 2011-06-21 2018-03-09 Univ Leland Stanford Junior Domínios de ligação dirigidos contra complexos gpcr:proteína g e suas utilizações derivadas
SG10201805064SA (en) 2011-06-23 2018-07-30 Ablynx Nv Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobulin single variable domains
EP2974737A1 (en) 2011-06-23 2016-01-20 Ablynx N.V. Techniques for predicting, detecting and reducing a specific protein interference in assays involving immunoglobulin single variable domains
EP4350345A2 (en) 2011-06-23 2024-04-10 Ablynx N.V. Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobin single variable domains
AU2012271974B2 (en) 2011-06-23 2017-01-12 Ablynx Nv Serum albumin binding proteins
EP3626739A1 (en) 2011-06-24 2020-03-25 Stephen D. Gillies Light chain immunoglobulin fusion proteins and methods of use thereof
US9346884B2 (en) 2011-09-30 2016-05-24 Ablynx N.V. Biological materials related to c-Met
EP2747783B1 (en) 2011-09-30 2017-06-14 Ablynx N.V. Biological materials related to c-met
ES2906462T3 (es) * 2011-10-17 2022-04-18 Regeneron Pharma Ratones de cadena pesada de inmunoglobulina restringida
US9328174B2 (en) * 2012-05-09 2016-05-03 Novartis Ag Chemokine receptor binding polypeptides
US11339208B1 (en) 2012-05-31 2022-05-24 United States Of America As Represented By The Secretary Of The Air Force Camelidae single-domain antibodies against Yersinia pestis and methods of use
CN102993295A (zh) * 2012-09-29 2013-03-27 张文彬 双峰驼褪黑素受体、编码基因及其获取方法
UY35144A (es) * 2012-11-20 2014-06-30 Novartis Ag Miméticos lineales sintéticos de apelina para el tratamiento de insuficiencia cardiaca
JP2016534114A (ja) * 2013-08-21 2016-11-04 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング Ｃｘ３ｃｒ１標的化イメージング剤並びに疾病の診断及び処置におけるその使用
PT3248986T (pt) 2014-05-16 2022-04-05 Ablynx Nv Domínios variáveis de imunoglobulina
DK3143403T3 (da) 2014-05-16 2022-01-17 Ablynx Nv Fremgangsmåder til påvisning og/eller måling af anti-lægemiddelantistoffer, især behandlingsinducerede anti-lægemiddelantistoffer
NZ726448A (en) 2014-05-16 2023-02-24 Ablynx Nv Improved immunoglobulin variable domains
US10273305B2 (en) 2015-04-02 2019-04-30 Ablynx N.V. Bispecific CXCR4-CD4 polypeptides with potent anti-HIV activity
NO2768984T3 (zh) 2015-11-12 2018-06-09
CA3005061A1 (en) 2015-11-13 2017-05-18 Ablynx Nv Improved serum albumin-binding immunoglobulin variable domains
CR20180279A (es) 2015-11-18 2018-08-24 Merck Sharp & Dohme Enlazadores de ctla4
EP3377526A1 (en) 2015-11-18 2018-09-26 Merck Sharp & Dohme Corp. PD1/CTLA4 Binders
EP3377525A2 (en) 2015-11-18 2018-09-26 Ablynx NV Improved serum albumin binders
IL300122A (en) 2015-11-18 2023-03-01 Merck Sharp ַ& Dohme Llc Substances that bind to PD1 and/or LAG3
AU2017216864B2 (en) 2016-02-12 2023-06-22 Ablynx Nv Method for the production of immunoglobulin single variable domains
TWI784957B (zh) 2016-06-20 2022-12-01 英商克馬伯有限公司 免疫細胞介素
KR102374912B1 (ko) 2016-06-23 2022-03-16 아블린쓰 엔.브이. 면역글로불린 단일 가변 도메인에 대한 개선된 약동학적 어세이
TWI781108B (zh) * 2016-07-20 2022-10-21 比利時商健生藥品公司 抗ｇｐｒｃ５ｄ抗體、結合ｇｐｒｃ５ｄ與ｃｄ３之雙特異性抗原結合分子及其用途
WO2018104444A1 (en) 2016-12-07 2018-06-14 Ablynx Nv Improved serum albumin binding immunoglobulin single variable domains
KR102653724B1 (ko) 2017-01-17 2024-04-02 아블린쓰 엔.브이. 개선된 혈청 알부민 결합제
US11414481B2 (en) 2017-01-17 2022-08-16 Ablynx N.V. Serum albumin binders
US20220099682A9 (en) 2017-03-31 2022-03-31 Ablynx N.V. Improved immunogenicity assays
KR20200103018A (ko) * 2017-12-19 2020-09-01 주식회사 지피씨알 Gpcr 헤테로머 억제제 및 이의 용도
LT3638698T (lt) 2018-01-26 2021-04-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Antikūnai prieš tmprss2 ir antigeną surišantys fragmentai
CN110669137B (zh) * 2019-10-24 2021-07-16 高新 一种多特异性抗体及其制备方法和用途
CA3163164A1 (en) 2020-02-10 2021-08-19 Alina Baum Anti-tmprss2 antibodies and antigen-binding fragments
SG11202103404PA (en) 2020-04-02 2021-04-29 Regeneron Pharma Anti-sars-cov-2-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments
IL298194A (en) 2020-05-26 2023-01-01 Regeneron Pharma Antibodies against sars-cov2-spike glycoprotein and antigen-binding fragments
CN111596070B (zh) * 2020-06-10 2023-05-12 宁波大学 一种三疣梭子蟹原肌球蛋白过敏检测试剂的应用
WO2022187626A1 (en) 2021-03-05 2022-09-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-sars-cov-2-variant-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments
US20230125469A1 (en) 2021-07-14 2023-04-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-SARS-CoV-2-Spike Glycoprotein Antibodies and Antigen-Binding Fragments
WO2023155902A1 (en) 2022-02-18 2023-08-24 Chongqing Mingdao Haoyue Biotechnology Co., Ltd. Intranasal formulations and anti-sars-cov-2-spike protein antibodies
WO2024023271A1 (en) 2022-07-27 2024-02-01 Ablynx Nv Polypeptides binding to a specific epitope of the neonatal fc receptor

Family Cites Families (67)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4559157A (en) 1983-04-21 1985-12-17 Creative Products Resource Associates, Ltd. Cosmetic applicator useful for skin moisturizing
LU84979A1 (fr) 1983-08-30 1985-04-24 Oreal Composition cosmetique ou pharmaceutique sous forme aqueuse ou anhydre dont la phase grasse contient un polyether oligomere et polyethers oligomeres nouveaux
US4820508A (en) 1987-06-23 1989-04-11 Neutrogena Corporation Skin protective composition
US4992478A (en) 1988-04-04 1991-02-12 Warner-Lambert Company Antiinflammatory skin moisturizing composition and method of preparing same
US4938949A (en) 1988-09-12 1990-07-03 University Of New York Treatment of damaged bone marrow and dosage units therefor
KR0184860B1 (ko) 1988-11-11 1999-04-01 메디칼 리써어치 카운실 단일영역 리간드와 이를 포함하는 수용체 및 이들의 제조방법과 이용(법)
SE509359C2 (sv) 1989-08-01 1999-01-18 Cemu Bioteknik Ab Användning av stabiliserade protein- eller peptidkonjugat för framställning av ett läkemedel
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
CA2090126C (en) 1990-08-02 2002-10-22 John W. Schrader Methods for the production of proteins with a desired function
DK0605522T3 (da) 1991-09-23 2000-01-17 Medical Res Council Fremgangsmåde til fremstilling af humaniserede antistoffer
DE69318016D1 (de) 1992-05-08 1998-05-20 Creative Biomolecules Inc Mehrwertige Chimäre Proteine Anologe und Verfahren zu deren Anwendungen
CA2258518C (en) 1996-06-27 2011-11-22 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Recognition molecules interacting specifically with the active site or cleft of a target molecule
EP1051493A2 (en) 1998-01-26 2000-11-15 Unilever Plc Method for producing antibody fragments
NZ528767A (en) * 1998-03-30 2005-08-26 Northwest Biotherapeutics Inc Therapeutic and diagnostic applications based on the role of the CXCR-4 gene in tumorigenesis
ATE276359T1 (de) 1999-01-19 2004-10-15 Unilever Nv Verfahren zur herstellung von antikörperfragmenten
US6849425B1 (en) 1999-10-14 2005-02-01 Ixsys, Inc. Methods of optimizing antibody variable region binding affinity
ATE337403T1 (de) 1999-12-24 2006-09-15 Genentech Inc Verfahren und verbindungen zur verlängerung der halbwertzeiten bei der ausscheidung von biowirksamen verbindungen
WO2002057445A1 (en) 2000-05-26 2002-07-25 National Research Council Of Canada Single-domain brain-targeting antibody fragments derived from llama antibodies
AU2001268855A1 (en) 2000-05-26 2001-12-03 National Research Council Of Canada Single-domain antigen-binding antibody fragments derived from llama antibodies
US7018812B2 (en) * 2000-11-03 2006-03-28 Duke University Modified G-protein coupled receptors
US7054297B1 (en) 2000-12-28 2006-05-30 Cisco Technology, Inc. Distribution of packets to high data rate communications devices using multicast protocols
CA2440582A1 (en) 2001-03-09 2002-10-03 Dyax Corp. Serum albumin binding moieties
GB0110029D0 (en) 2001-04-24 2001-06-13 Grosveld Frank Transgenic animal
US20060073141A1 (en) 2001-06-28 2006-04-06 Domantis Limited Compositions and methods for treating inflammatory disorders
WO2003025020A1 (fr) 2001-09-13 2003-03-27 Institute For Antibodies Co., Ltd. Procede pour creer une banque d'anticorps de chameaux
JP2005289809A (ja) 2001-10-24 2005-10-20 Vlaams Interuniversitair Inst Voor Biotechnologie Vzw (Vib Vzw) 突然変異重鎖抗体
US7871619B2 (en) 2001-11-30 2011-01-18 Chemocentryx, Inc. Compositions and methods for detecting and treating diseases and conditions related to chemokine receptors
US7442512B2 (en) 2001-11-30 2008-10-28 Chemocentryx, Inc. Compositions and methods for detecting and treating diseases and conditions related to chemokine receptors
US20050214857A1 (en) * 2001-12-11 2005-09-29 Algonomics N.V. Method for displaying loops from immunoglobulin domains in different contexts
US20050037358A1 (en) 2001-12-21 2005-02-17 Serge Muyldermans Method for cloning of variable domain sequences
EP1461085A2 (en) 2002-01-03 2004-09-29 Vlaams Interuniversitair Instituut voor Biotechnologie vzw. Immunoconjugates useful for treatment of tumours
AU2003209059A1 (en) * 2002-02-08 2003-09-02 Genetastix Corporation Human monoclonal antibodies against membrane proteins
US7211240B2 (en) 2002-03-01 2007-05-01 Bracco International B.V. Multivalent constructs for therapeutic and diagnostic applications
US20060002935A1 (en) 2002-06-28 2006-01-05 Domantis Limited Tumor Necrosis Factor Receptor 1 antagonists and methods of use therefor
AU2003286003B2 (en) 2002-11-08 2011-05-26 Ablynx N.V. Stabilized single domain antibodies
JP4603894B2 (ja) 2002-12-03 2010-12-22 ユセベ ファルマ ソシエテ アノニム 抗体産生細胞を同定するためのアッセイ
GB0228210D0 (en) 2002-12-03 2003-01-08 Babraham Inst Single chain antibodies
GB0312481D0 (en) 2003-05-30 2003-07-09 Celltech R&D Ltd Antibodies
WO2005018629A1 (en) 2003-08-12 2005-03-03 Yarbrough William M Treatment for acne vulgaris and method of use
US20060263353A1 (en) 2003-08-20 2006-11-23 Lawson Alastair D G Methods for obtaining antibodies
US20050279676A1 (en) 2004-06-21 2005-12-22 Izzy Zuhair A Fluid filter assembly for a dispensing faucet
EP1864998B2 (en) 2004-07-22 2022-06-22 Erasmus University Medical Center Rotterdam Binding molecules
US7180370B2 (en) 2004-09-01 2007-02-20 Micron Technology, Inc. CMOS amplifiers with frequency compensating capacitors
US7563443B2 (en) 2004-09-17 2009-07-21 Domantis Limited Monovalent anti-CD40L antibody polypeptides and compositions thereof
WO2006040153A2 (en) 2004-10-13 2006-04-20 Ablynx N.V. Single domain camelide anti -amyloid beta antibodies and polypeptides comprising the same for the treatment and diagnosis of degenarative neural diseases such as alzheimer's disease
WO2006040154A2 (en) 2004-10-14 2006-04-20 Dublin City University Prokaryotic two hybrid system
WO2006047417A2 (en) 2004-10-21 2006-05-04 University Of Florida Research Foundation, Inc. Detection of cannabinoid receptor biomarkers and uses thereof
EP1844073A1 (en) 2005-01-31 2007-10-17 Ablynx N.V. Method for generating variable domain sequences of heavy chain antibodies
EP1871807B1 (en) * 2005-02-18 2012-11-28 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Antibodies against cxcr4 and methods of use thereof
CN101163718B (zh) 2005-04-21 2012-10-10 凯莫森特里克斯股份有限公司 结合ccx-ckr2的试剂
JP2009511032A (ja) * 2005-10-11 2009-03-19 アブリンクス エン．ヴェー． Ｅｇｆｒおよびｉｇｆ−ｉｒに対するナノボディおよびポリペプチド
WO2007055823A2 (en) 2005-10-28 2007-05-18 Multispan, Inc. Gpcr expressing cell lines and antibodies
ES2353549T3 (es) 2005-11-10 2011-03-03 Chemocentryx, Inc. Quinolonas sustituidas y métodos de uso.
WO2007118670A1 (en) 2006-04-14 2007-10-25 Ablynx N.V. Dp-78-like nanobodies
CN101646689A (zh) 2006-09-08 2010-02-10 埃博灵克斯股份有限公司 具有长半衰期的血清清蛋白结合蛋白
US8088895B2 (en) 2006-10-18 2012-01-03 Chemocentryx, Inc. Antibodies that bind CXCR7 epitopes
JP2010511397A (ja) 2006-12-05 2010-04-15 アブリンクス エン．ヴェー． 血清タンパク質と結合可能なペプチド
US9512236B2 (en) 2006-12-19 2016-12-06 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against GPCRS and polypeptides comprising the same for the treatment of GPCR-related diseases and disorders
WO2008074839A2 (en) * 2006-12-19 2008-06-26 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against gpcrs and polypeptides comprising the same for the treatment of gpcr-related diseases and disorders
JP6034023B2 (ja) 2008-05-16 2016-11-30 アブリンクス エン．ヴェー． Ｃｘｃｒ４及び他のｇｐｃｒに指向性を有するアミノ酸配列及びそれを含む化合物
EP2313436B1 (en) 2008-07-22 2014-11-26 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against multitarget scavenger receptors and polypeptides
WO2010043650A2 (en) 2008-10-14 2010-04-22 Ablynx Nv Amino acid sequences directed against cellular receptors for viruses and bacteria
WO2010070145A2 (en) 2008-12-19 2010-06-24 Ablynx N.V. Method for generation of immunoglobulin sequences
WO2010141986A1 (en) 2009-06-09 2010-12-16 Mabdesign Pty Ltd Novel antibodies and uses therefor
US8937164B2 (en) 2010-03-26 2015-01-20 Ablynx N.V. Biological materials related to CXCR7
US20140228223A1 (en) 2010-05-10 2014-08-14 Andreas Gnirke High throughput paired-end sequencing of large-insert clone libraries
JP6181040B2 (ja) 2011-03-28 2017-08-16 アブリンクス エン．ヴェー． 二特異性抗ｃｘｃｒ７免疫グロブリン単一可変ドメイン

Also Published As

Publication number Publication date
EP2285833B1 (en) 2014-12-17
NZ589036A (en) 2012-07-27
US9212226B2 (en) 2015-12-15
CA2724208C (en) 2018-02-06
RU2010151725A (ru) 2012-06-27
AU2009248049A1 (en) 2009-11-19
WO2009138519A1 (en) 2009-11-19
AU2009248049B2 (en) 2015-07-23
CN102099378A (zh) 2011-06-15
JP2011523550A (ja) 2011-08-18
ZA201008180B (en) 2011-09-28
CA2724208A1 (en) 2009-11-19
BRPI0911984A2 (pt) 2016-09-20
MX2010012518A (es) 2010-12-06
IL209176A0 (en) 2011-01-31
KR20110020825A (ko) 2011-03-03
JP6034023B2 (ja) 2016-11-30
US20110206660A1 (en) 2011-08-25
EP2285833A1 (en) 2011-02-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102099378B (zh) 针对CXCR4和其他GPCRs的氨基酸序列以及包含所述氨基酸序列的多肽
US9803018B2 (en) Amino acid sequences directed against cellular receptors for viruses and bacteria
CN104231082B (zh) 用于治疗骨疾病和病症的针对rank-l的氨基酸序列以及包括其的多肽
CN102307902B (zh) 用于治疗与血管发生相关的疾病和病症的针对血管生成素/Tie系统的氨基酸序列和包括其的多肽
CN102388069B (zh) 用于治疗il-6r相关疾病和病症的改进的针对il-6r的氨基酸序列和包含其的多肽
US10385134B2 (en) CX3CR1-binding polypeptides comprising immunoglobulin single variable domains
KR101832040B1 (ko) Ｃｘｃｒ２ 결합 폴리펩티드
KR102198321B1 (ko) Cxcr2에 대한 이중파라토프성 결합 폴리펩티드 및 그의 용도
CN101970490A (zh) 针对异二聚体细胞因子和/或其受体的氨基酸序列以及包括所述氨基酸序列的多肽
CN102257003A (zh) 用于产生针对细胞相关抗原如p2x7、cxcr7或cxcr4的免疫球蛋白的基因免疫
CN108473579A (zh) Gitr激动剂
CN102056945A (zh) 针对Notch途径的单可变结构域
CN101248087A (zh) 针对肿瘤坏死因子α的改进的纳米体TM
EP2691418A1 (en) Bispecific anti-cxcr7 immunoglobulin single variable domains
CN101528778A (zh) 用于治疗与il-6-介导的信号传导相关的疾病和病症的针对il-6r的氨基酸序列以及包括其的多肽

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant