CN111596070B - 一种三疣梭子蟹原肌球蛋白过敏检测试剂的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种三疣梭子蟹原肌球蛋白过敏检测试剂的应用，检测试剂包括PCR扩增引物，其中，上游引物F为：5’‑CATATGAAGAAGATGCAGCAGGTTGAGAA‑3’；下游引物R为：5’‑CTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGATAGCCAGACAGTTCGCTGAACGT‑3’。通过基因库获得三疣梭子蟹原肌球蛋白的编码基因片段；将致敏原基因片段克隆至原核表达载体中，构建重组表达质粒，再转入宿主菌中诱导其表达，采用亲和层析方法纯化，从而获得重组三疣梭子蟹原肌球蛋白；该蛋白可与三疣梭子蟹过敏患者血清的特异性IgE结合，从而可用于临床诊断及致敏原组分筛查。

Description

一种三疣梭子蟹原肌球蛋白过敏检测试剂的应用
技术领域
本发明涉及食物过敏检测领域，具体涉及一种三疣梭子蟹原肌球蛋白过敏检测试剂的应用。
背景技术
食物过敏是机体的免疫系统对食物过敏原蛋白产生的特异性反应。目前，食物过敏的体外检测常采用酶联免疫吸附检测法。传统的食物过敏酶联免疫检测法分为两种，一种是利用抗过敏原抗体来检测样本中的食物过敏原，另一种是通过天然的食物总蛋白作为抗原来检测样本中的特异性IgE抗体。前一种检测方法需要大量高度纯化的抗体，而抗体的制备耗时较长，产量较少。后一种检测方法则无法人为地控制蛋白的纯度等因素，增加了食物过敏检测的假阴性和假阳性率，降低了检测的准确性。目前，一种新型过敏原检测方法——单组分诊断(component resolved diagnosis，CRD)被广泛认识，该方法利用提取获得的天然过敏原组分或重组表达获得的过敏原作为已知抗原来检测对该过敏组分过敏的疾病。与传统的利用食物总蛋白提取物为抗原的方法相比，CRD可以有目的性地分析天然总蛋白中含量较少的非主要过敏原，重组的过敏单组分可以人为地控制质量、纯度、产量等影响因素。
甲壳类动物及其制品是联合国粮农组织提出的八大类引起过敏的食物之一。三疣梭子蟹是重要的渔业资源，部分消费者食用后会有过敏反应。关于蟹类过敏原的检测主要是采用ImmunoCAP250过敏原检测系统(刘平，陶淇惠，李志艳，等.2013至2017年11641例患者常见过敏原流行特征分析[J].中华检验医学杂志，2019，42(5)：371-374.)、欧蒙公司EIROLineScan系统(钟丽红，丘创华，李卓成，等。过敏性疾病患者血清IgE和细胞结合IgE水平变化及临床意义[J].深圳中西医结合杂志，2019，29(7)：12-15.)和DX-Blot 45型过敏原检测系统(周琼艳，林薇，许素玲，李澍铖，袁波，彭岚，赵可喻，郭小燕.嗜酸性粒细胞和IgE在过敏性皮肤病中的意义[J].现代实用医学，2020，32(2)：198-200.)等，但这些系统没有特别针对三疣梭子蟹过敏原检测。原肌球蛋白(Tropomyosin，TM)是三疣梭子蟹的主要过敏原之一，原肌球蛋白的含量较大。而现有技术还没有关于三疣梭子蟹原肌球蛋白过敏检测试剂相关的报道，这使得针对三疣梭子蟹原肌球蛋白过敏疾病的防控和治疗比较有限。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的现状而提出一种三疣梭子蟹原肌球蛋白过敏检测试剂的应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种三疣梭子蟹原肌球蛋白过敏检测试剂的应用，其特征在于：检测试剂包括PCR扩增引物，其中，
上游引物F为：
5’-CATATGAAGAAGATGCAGCAGGTTGAGAA-3’；
下游引物R为：
5’-CTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGATAGCCAGACAGTTCGCTGAACGT-3’。
进一步地，所述检测试剂包括ELISA检测试剂。
一种制备三疣梭子蟹重组原肌球蛋白的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)从现有数据库里获得三疣梭子蟹原肌球蛋白的基因序列；
2)以步骤1)的基因序列，设计扩增引物，进行扩增；
3)将步骤2)扩增后的目的基因连接到原核表达载体中，构建重组质粒；
4)将步骤3)构建的所述重组质粒转入宿主菌，诱导其表达蛋白；
5)将步骤4)获得的蛋白经纯化而获得三疣梭子蟹重组原肌球蛋白。
进一步地，在所述步骤2)中，PCR扩增的引物为：
上游引物F为：
5’-CATATGAAGAAGATGCAGCAGGTTGAGAA-3’；
下游引物R为：
5’-CTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGATAGCCAGACAGTTCGCTGAACGT-3’。
一种三疣梭子蟹重组原肌球蛋白，其特征在于：该三疣梭子蟹重组原肌球蛋白的氨基酸序列为：
Met Lys Lys Met Gln Gln Val Glu Asn Glu Leu Asp Gln Ala Gln Glu GlnLeu Ser Ala Ala Asn Thr Lys Leu Asp Glu Lys Glu Lys Ala Leu Gln Asn Ala GluGly Glu Val Ala Ala Leu Asn Arg Arg Ile Gln Leu Leu Glu Glu Asp Leu Glu ArgSer Glu Glu Arg Leu Asn Thr Ala Thr Thr Lys Leu Ala Glu Ala Ser Gln Ala AlaAsp Glu Ser Glu Arg Met Arg Lys Val Leu Glu Asn Arg Ser Leu Ser Asp Glu GluArg Met Asp Ala Leu Glu Asn Gln Leu Lys Glu Ala Arg Phe Leu Ala Glu Glu AlaAsp Arg Lys Tyr Asp Glu Val Ala Arg Lys Leu Ala Met Val Glu Ala Asp Leu GluArg Ala Glu Glu Arg Ala Glu Ser Gly Glu Ser Lys Ile Val Glu Leu Glu Glu GluLeu Arg Val Val Gly Asn Asn Leu Lys Ser Leu Glu Val Ser Glu Glu Lys Ala AsnGln Arg Glu Glu Thr Tyr Lys Glu Gln Ile Lys Thr Leu Ala Asn Lys Leu Lys AlaAla Glu Ala Arg Ala Glu Phe Ala Glu Arg Ser Val Gln Lys Leu Gln Lys Glu ValAsp Arg Leu Glu Asp Glu Leu Val Asn Glu Lys Glu Lys Tyr Lys Ser Ile Thr AspGlu Leu Asp Gln Thr Phe Ser Glu Leu Ser Gly Tyr His His His His His His。
与现有技术相比，本发明的优点在于：通过基因库获得三疣梭子蟹原肌球蛋白的编码基因片段；将致敏原基因片段克隆至原核表达载体中，构建重组表达质粒，再转入宿主菌中诱导其表达，采用亲和层析方法纯化，从而获得重组三疣梭子蟹原肌球蛋白；该蛋白可与三疣梭子蟹过敏患者血清的特异性IgE结合，从而可用于临床诊断及致敏原组分筛查。
附图说明
图1为本发明实施例二中重组质粒pMD-19T-TM的双酶切鉴定结果图(M表示DNAMarker；泳道1表示未酶切的质粒；泳道2、泳道3分别表示酶切后的质粒)；
图2为本发明实施例二中表达载体pET-21a(+)的双酶切鉴定结果图(M表示DNAMarker；泳道1表示未酶切的质粒；泳道2、泳道3分别表示酶切后的质粒)；
图3为本发明实施例二中重组质粒pET-21a(+)-TM的菌液PCR验证图(M表示DNAMarker；泳道1-5表示随机挑取的单菌落PCR产物)；
图4为本发明实施例二中重组的原肌球蛋白的SDS-PAGE验证图(M表示蛋白标准Marker；泳道1表示未加IPTG诱导的重组蛋白；泳道2表示IPTG诱导5h后未纯化的重组蛋白；泳道3表示IPTG诱导5h后纯化的重组蛋白)；
图5为本发明实施例三中三疣梭子蟹重组原肌球蛋白在不同浓度包被的ELISA试剂检测结果；
图6为本发明实施例三中不同包被条件下蟹过敏阳性血清与阴性血清的ELISA试剂检测结果(1表示第一组的处理条件37℃包被3h，4℃包被12h；2表示第二组的处理条件37℃包被3h；3表示第三组的处理条件4℃包被12h)；
图7为本发明实施例三中不同封闭条件下蟹过敏阳性血清与阴性血清的ELISA试剂检测结果(1表示第一组的处理条件为37℃包被3h，4℃包被12h；2表示第二组的处理条件37℃包被3h；3表示第三组的处理条件4℃包被12h)；
图8为本发明实施例三中重组原肌球蛋白检测三疣梭子蟹过敏的ROC曲线。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例一、一种三疣梭子蟹原肌球蛋白过敏检测试剂的应用
检测试剂包括ELISA检测试剂、PCR扩增引物，其中，
上游引物F为：
5’-CATATGAAGAAGATGCAGCAGGTTGAGAA-3’；
下游引物R为：
5’-CTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGATAGCCAGACAGTTCGCTGAACG T-3’。
实施例二、一种制备三疣梭子蟹重组原肌球蛋白的方法和重组的原肌球蛋白
1、引物设计
根据三疣梭子蟹原肌球蛋白编码基因序列(Genbank登录号为EF672352)，其具体的序列参见Seq.NO.1，设计重组引物为：
上游引物F为：5’-CATATGAAGAAGATGCAGCAGGTTGAGAA-3’；
下游引物R为：5’-CTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGATAGCCAGACAGTTCGCTGAACGT-3’。
2、表达质粒的构建和表达菌株的获得
通过PCR扩增得到目的基因片段，纯化后连接到克隆载体pMD-19T上，用测序法验证基因是否克隆成功。构建成功的pMD-19T-TM质粒和实验室保存的pET-21a(+)质粒同时进行质粒提取，用Xho I和NdeI双酶切两个质粒，参见如图1和图2，成功获得了酶切后的目的片段和pET-21a(+)载体。将其切胶回收后连接并转入大肠杆菌DH5α，在含有氨苄青霉素的LB平板上挑选单克隆，进行菌液PCR鉴定。菌液PCR鉴定的阳性克隆用测序法再次验证基因的正确性，完成表达重组质粒的构建。该重组质粒的核苷酸分子大小为744bp，其序列为(酶切位点采用倒三角箭头表示，划线部分表示6个His的核苷酸序列)：
Figure BDA0002533755980000041
pET-21a(+)-TM质粒转化进入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，在含有氨苄青霉素的LB平板上挑选单克隆，进行菌液PCR鉴定，参见如图3，其PCR产物大小与目的片段大小一致。菌液PCR鉴定的阳性克隆用测序法再次验证基因的正确性，获得表达菌株，并以3∶2的比列加入到50％灭过菌的甘油中进行保存。将菌株以1∶50的比例接种到两管1mL的LB培养基，培养至OD600达到0.4～0.6时在一管中加入1μL的IPTG，另一管作为对照组不加入IPTG，继续振荡培养5h，收集菌体。加入ddH2O和蛋白上样缓冲液，100℃沸水浴10min，离心后收集上清。通过SDS-PAGE检测pET-21a(+)-TM重组质粒表达情况，参见图4，结果显示诱导表达后的重组原肌球蛋白分子量约为35kDa，与预测的分子量28.27kDa(http：//www.bio-son.net/sms/)相近，表明成功获得了重组原肌球蛋白。该重组原肌球蛋白的序列(含关键结构域和6个His标签)如下：
Met Lys Lys Met Gln Gln Val Glu Asn Glu Leu Asp Gln Ala Gln Glu GlnLeu Ser Ala Ala Asn Thr Lys Leu Asp Glu Lys Glu Lys Ala Leu Gln Asn Ala GluGly Glu Val Ala Ala Leu Asn Arg Arg Ile Gln Leu Leu Glu Glu Asp Leu Glu ArgSer Glu Glu Arg Leu Asn Thr Ala Thr Thr Lys Leu Ala Glu Ala Ser Gln Ala AlaAsp Glu Ser Glu Arg Met Arg Lys Val Leu Glu Asn Arg Ser Leu Ser Asp Glu GluArg Met Asp Ala Leu Glu Asn Gln Leu Lys Glu Ala Arg Phe Leu Ala Glu Glu AlaAsp Arg Lys Tyr Asp Glu Val Ala Arg Lys Leu Ala Met Val Glu Ala Asp Leu GluArg Ala Glu Glu Arg Ala Glu Ser Gly Glu Ser Lys Ile Val Glu Leu Glu Glu GluLeu Arg Val Val Gly Asn Asn Leu Lys Ser Leu Glu Val Ser Glu Glu Lys Ala AsnGln Arg Glu Glu Thr Tyr Lys Glu Gln Ile Lys Thr Leu Ala Asn Lys Leu Lys AlaAla Glu Ala Arg Ala Glu Phe Ala Glu Arg Ser Val Gln Lys Leu Gln Lys Glu ValAsp Arg Leu Glu Asp Glu Leu Val Asn Glu Lys Glu Lys Tyr Lys Ser Ile Thr AspGlu Leu Asp Gln Thr Phe Ser Glu Leu Ser GlyTyr His His His His His His
3、重组原肌球蛋白的纯化
将菌株按照以1∶50的比例接种到300mL LB培养基中，培养至OD600达到0.4～0.6时加入300μL的IPTG(100μg/mL)，继续振荡培养5h，收集菌体。用缓冲液I悬浮菌体，并进行超声波破碎，离心后收集上清。通过Ni琼脂糖凝胶进行纯化，并用SDS-PAGE鉴定纯度，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定浓度。最后得到纯度在95％以上，浓度高达0.35mg/mL。
实施例三、三疣梭子蟹原肌球蛋白过敏检测试剂的制备方法
本实施例中，致敏检测试剂是ELISA检测试剂，ELISA检测试剂的制备方法包括：
1、确定重组原肌球蛋白的最适包被浓度
1)包被：上述实施二制得的重组原肌球蛋白将其浓度调整为16μg/mL，在全新的一排酶标板的第一孔中加入50μL的重组原肌球蛋白(即800ng/孔)，从第二孔开始倍比稀释至最后一个孔，将酶标板放置37℃恒温培养箱中孵育3h后，4℃孵育12h；
2)封闭：将酶标板中的液体倒尽，倒置拍干，每个孔中加入250μL洗涤液，静置1min后倒尽液体，重复洗涤3次，倒置拍干；每个孔中加入220μL 1％BSA封闭液，37℃孵育3h后，4℃孵育12h；
3)一抗孵育：洗涤3次，倒置拍干；每一排的1～11个孔中均加入50μL混合的蟹过敏患者血清(即阳性血清，每份血清2个平行组)；第12个孔中不加血清，视为空白组，37℃孵育30min；这些血清收集自宁波大学附属医院，是经过敏症状和DX-Blot 45型过敏原检测系统确诊的蟹过敏患者血清，试剂盒为浙大迪讯生物基因工程有限公司食物性过敏原特异性抗体IgE检测试剂盒，检测方法为免疫印迹法；
4)二抗孵育：洗涤5次，倒置拍干；每孔加入50μL 1∶1500稀释的HRP标记的羊抗人IgE抗体，37℃孵育30min；
5)显色：洗涤5次，倒置拍干；每孔加入50μL TMB单组分显色液，37℃避光15min后加50μL终止液，以空白孔调零，并在15min内测定A450值；
6)数据分析：将A450值有明显下降趋势时的包被量作为最适的包被浓度。
从图5可知，50ng/孔为重组原肌球蛋白的适宜包被浓度。
2、确定重组原肌球蛋白的最适包被时间与温度
根据上述结果，重组原肌球蛋白以最适的包被浓度(也就是50ng/孔)包被酶标板，然后按照包被条件分为3组，第一组为37℃孵育3h后，再4℃孵育12h，第二组为37℃孵育3h，第三组为4℃孵育12h；洗涤3次后进行封闭，分别用混合的蟹过敏患者血清(即阳性血清)和正常人血清(即阴性血清)进行检测(每份血清3个平行孔)，检测过程同上述步骤1.1。根据不同包被条件下的A450值以及阳性与阴性血清的A450比值(P/N值)，选出P/N值最高的作为最适的抗原包被条件。
从表1和图6可知，37℃孵育3h条件是重组原肌球蛋白的最适包被温度和时间。
表1三疣梭子蟹重组原肌球蛋白在不同包被条件下的ELISA检测结果(A450，x±s)
Figure BDA0002533755980000061
3、确定封闭液的最适浓度、最适种类和最适孵育时间
按照上述步骤1确定的重组原肌球蛋白的最适包被浓度、上述步骤2确定的重组原肌球蛋白的最适包被时间与温度，用重组原肌球蛋白包被酶标板，重组原肌球蛋白包被完成后，洗涤3次。按照封闭条件分为三组，每组的前三行分别加入220μL的1％、1.2％、1.5％的BSA，后三行分别加入2％、4％、6％的脱脂奶粉。第一组封闭条件为37℃孵育3h后4℃孵育12h，第二组为37℃孵育3h，第三组为4℃孵育12h。洗涤5次后，分别用混合的蟹过敏患者血清(即阳性血清)和正常人血清(即阴性血清)进行检测(每份血清3个平行孔)，检测过程同上述步骤1。根据不同封闭条件下的蟹过敏患者阳性血清与阴性血清的A450比值(P/N值)，选出P/N值最高的作为最适的封闭条件。
从图7可知，选择1.2％的BSA为最适的封闭液，每孔220μL，37℃孵育3h为最适的封闭条件。
4、确定HRP标记的羊抗人IgE抗体的最适稀释度
按照上述步骤1、2和3选定的各项最适条件，用重组的原肌球蛋白包被酶标板，经包被、洗涤、封闭、洗涤后，分为3组，每组加入50μL混合的蟹过敏患者血清(即阳性血清，每份血清3个平行孔)，37℃孵育30min后，洗涤5次。向1、2、3组中分别加入50μL 1∶1500、1∶2000和1∶2500稀释的HRP标记的羊抗人IgE抗体，37℃孵育30min后，洗涤5次。每孔经底物显色，以终止液终止反应，在15min内测定A450值。根据不同稀释度二抗作用下阳性血清的A450值，选出数值最高的作为最适的酶标二抗稀释度。
从表2可知，1∶1500稀释度是HRP标记的羊抗人IgE抗体的最适合稀释度。
表2 HRP标记的羊抗人IgE抗体不同稀释度的ELISA检测结果(A450，x±s)
Figure BDA0002533755980000071
5、ELISA检测试剂灵敏度与特异度的评估
按照上述步骤确定的重组原肌球蛋白的最适包被浓度，最适包被时间与温度，封闭液的最适浓度、种类和孵育时间，HRP标记的羊抗人IgE抗体的最适稀释度，对蟹过敏患者血清(即阳性血清)和正常人血清(即阴性血清)进行ELISA检测，每份样品3个平行孔，将检测的阳性血清和阴性血清吸光度值和实际对应的阴性阳性情况(实际对应的阴性阳性情况是血清从宁波大学附属医院收集时宁波大学附属医院检测后确认的情况，宁波大学附属医院是采用DX-Blot 45型过敏原检测系统进行检测，试剂盒为浙大迪讯生物基因工程有限公司食物性过敏原特异性抗体IgE检测试剂盒，检测方法为免疫印迹法)录入SPSS统计软件制作ROC曲线，以不同的检测值为临界值，记录每个临界值所对应的灵敏度和特异度，参见表4，并计算出相对应的阳性似然比和约登指数，选择阳性似然比和约登指数最高的作为最适临界值。
从表3可知，最适临界值为0.45。当临界值为0.45时，ROC曲线下的面积(AUC)最大，为0.979；当临界值为0.45时，此时灵敏度为83.52％、特异度为98.00％、阳性似然比为41.76、约登指数为0.82；
说明本实施例的上述用于检测三疣梭子蟹原肌球蛋白的ELISA检测试剂灵敏度较高、特异性较高，对应地，也就是过敏检测的漏诊率较低、误诊率较低。
表3不同临界值时检测三疣梭子蟹过敏的效率
Figure BDA0002533755980000081
                         序列表
<110>  宁波大学
<120>  一种三疣梭子蟹原肌球蛋白过敏检测试剂的应用
<160>  1
<170>  SIPOSequenceListing 1.0
<210>  1
<211>  855
<212>  DNA
<213>  三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)
<400>  1
atggacgcca tcaagaagaa gatgcaggcg atgaagctgg agaaggacaa cgctatggac  60
agggccaaca ccctggagca gcagaacaag gaggccaacc tcagggcgga aaagaccgag 120
gaggagattc gcgcaaccca gaagaagatg cagcaggttg agaacgagct ggaccaggct 180
caggagcagc tgtccgcagc taacactaag cttgatgaga aggagaaggc cttgcagaat 240
gccgagggtg aggttgccgc cctgaaccgc cgcatccagc tcctggagga ggacctggag 300
aggtctgagg agcgcctcaa caccgccacc accaagctgg ccgaggcgtc ccaggctgcc 360
gacgagtccg agcgtatgcg taaggtgctt gagaaccgct ccctgtctga tgaagagcgc 420
atggacgccc ttgaaaacca gctgaaggag gcgcgattcc tggctgagga ggccgatagg 480
aaatacgatg aggtcgcccg taagctggcc atggttgaag ctgacctgga gagggctgag 540
gagcgtgccg agagcggaga atcgaagatt gtggagctgg aggaggagct gagggtcgtg 600
ggcaacaacc tgaagtccct ggaagtgtct gaggagaagg ccaaccagcg tgaggagact 660
tacaaggaac agatcaagac cctggccaac aagctcaagg cggctgaggc tcgtgctgag 720
ttcgctgaaa ggtctgtgca gaagctccag aaggaggtcg acaggcttga agacgaactg 780
gttaacgaaa aggagaagta caagtcaatt accgacgagc tggaccagac gttcagcgaa 840
ctgtctggct attaa                                                  855

Claims (3)

1.一种三疣梭子蟹原肌球蛋白过敏检测试剂的应用，其特征在于：检测试剂包括PCR扩增引物，其中，
上游引物F为：
5’-CATATGAAGAAGATGCAGCAGGTTGAGAA-3’；
下游引物R为：
5’-CTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGATAGCCAGACAGTTCGCTGAACG T-3’。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述检测试剂包括ELISA检测试剂。
3.一种制备三疣梭子蟹重组原肌球蛋白的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)从现有数据库里获得三疣梭子蟹原肌球蛋白的基因序列；
2)以步骤1)的基因序列，设计扩增引物，进行扩增；
在所述步骤2)中，PCR扩增的引物为：
上游引物F为：
5’-CATATGAAGAAGATGCAGCAGGTTGAGAA-3’；
下游引物R为：
5’-CTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGATAGCCAGACAGTTCGCTGAACG T-3’；
3)将步骤2)扩增后的目的基因连接到原核表达载体中，构建重组质粒；
4)将步骤3)所述重组质粒转入宿主菌，诱导其表达蛋白；
5)将步骤4)获得的蛋白经纯化而获得三疣梭子蟹重组原肌球蛋白。
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