CN108642069B - 一种三疣梭子蟹comt基因及其应用 - Google Patents

一种三疣梭子蟹comt基因及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108642069B
CN108642069B CN201810491438.2A CN201810491438A CN108642069B CN 108642069 B CN108642069 B CN 108642069B CN 201810491438 A CN201810491438 A CN 201810491438A CN 108642069 B CN108642069 B CN 108642069B
Authority
CN
China
Prior art keywords
portunus trituberculatus
comt
gene
comt gene
ptcomt
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810491438.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108642069A (zh
Inventor
刘磊
朱芳
付媛媛
王春琳
母昌考
李荣华
宋微微
史策
叶央芳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ningbo University
Original Assignee
Ningbo University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ningbo University filed Critical Ningbo University
Priority to CN201810491438.2A priority Critical patent/CN108642069B/zh
Publication of CN108642069A publication Critical patent/CN108642069A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108642069B publication Critical patent/CN108642069B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)
    • C12N9/1011—Catechol O-methyltransferase (2.1.1.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y201/00—Transferases transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12Y201/01—Methyltransferases (2.1.1)
    • C12Y201/01006—Catechol O-methyltransferase (2.1.1.6)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及一种三疣梭子蟹COMT基因及应用，涉及三疣梭子蟹基因工程，该三疣梭子蟹COMT基因基因序列如SEQ NO.1所示，本发明还提供一种制备三疣梭子蟹三疣梭子蟹COMT基因重组蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)构建三疣梭子蟹COMT基因重组表达载体；(2)将步骤(1)所得重组表达载体导入宿主细胞，并将宿主细胞进行诱导表达，获得表达产物；(3)将分离纯化步骤(2)所得的表达产物，获得重组蛋白；与现有技术相比，本发明具有如下优点：三疣梭子蟹COMT基因可能广泛参与了三疣梭子蟹攻击行为的分子机制，在继左旋多巴和多巴胺受体激动剂后推入临床治疗波动症的较新一类药物开发上显示出较好的应用前景。

Description

一种三疣梭子蟹COMT基因及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种三疣梭子蟹COMT基因及其应用。
背景技术
三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是最具经济重要性的海蟹之一，它广泛分布于中国沿海地区。随着人工养殖技术的发展，三疣梭子蟹养殖业发展迅速，然而，与其他甲壳类动物一样，三疣梭子蟹非常具有侵略性，并且表现出强大的地域性和同类相食性。大量三疣梭子蟹在培育和繁殖过程中因相互之间的争斗与应激行为造成的个体伤亡或受到损害，导致三疣梭子蟹在养殖过程中的成活率低，产量低。对争斗行为在神经生物学机制的研究发现，神经递质会影响水生动物的争斗行为，特别是单胺类递质如5-羟色胺、章鱼胺和多巴胺，其中5-羟色胺为重要的单胺类神经递质，与争斗性行为关系紧密。同样重要的胺类神经递质如儿茶酚-氧位-甲基转移酶(Catechol-O-methyltransferase，简称COMT)，是1958年首先在人体发现的一种转甲基酶，主要代谢儿茶酚型的化合物，COMT酶在有二价镁离子Mg2+存在时，催化S腺苷蛋氨酸(SAM)的一个甲基转移到底物DHBAc分子的一个羟基上，形成甲基化产物香草酸(VA)和异香草酸(IVA)的反应机理。如一申请号为201310591259.3的中国发明专利申请《中国对虾COMT重组蛋白的生产方法及其应用》(公开号为CN103602642A)里公开其克隆出了中国对虾的COMT基因，公开了该基因编码蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列，同时，还重新设计了中国对虾COMT重组蛋白的生产方法，其直接用酵母液纯化，省去了原核菌体回收、破碎的繁琐步骤，提高了纯化效率，但并未对中国对虾的争斗行为作相应的研究，同时，基于先前的研究已经证实攻击性行为主要受甲壳动物神经系统中生物胺的调节。在甲壳类动物中，DA是一种广泛分布的生物胺神经递质，它调节许多生理功能。COMT是DA的主要代谢酶，它通过控制突触中DA的代谢来影响运动，情感和认知行为，其活动与侵略密切相关。DA的释放被认为是可以引发神经内分泌反应，促进或抑制甲壳动物生理过程，但很少有研究确定甲壳动物攻击行为的攻击相关基因和分子调控机制，尤其是COMT基因在攻击行为期间参与生物胺代谢的机制，包括DA，为此有必要对三疣梭子蟹相互之间的争斗与应激行为作进一步的研究。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种三疣梭子蟹的COMT基因。
本发明所要解决的另一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种三疣梭子蟹的COMT基因的应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：该三疣梭子蟹COMT基因，其特征在于：所述三疣梭子蟹COMT基因的序列如SEQ NO.1所示。
所述的三疣梭子蟹COMT基因的氨基酸序列为：
Met Ala Thr Thr Val Lys Ser Tyr Ser Ser Glu Asp Pro Leu Leu Lys TyrThr Val Asp His Ser Leu Arg Leu Thr Asp Val Gln Lys Arg Leu Asn Glu Val ThrPhe Lys His Ser Arg Tyr Gln Met Leu Gly Ala Pro Glu Val Leu Gln Leu Asn AlaAsn Leu Ile Gln Ala Ile Gly Gly Lys Lys Val Leu Asp Val Gly Val Phe Thr GlyAla Ser Ser Leu Ser Ala Ala Leu Ala Leu Pro Pro Asp Gly Glu Val His Ala LeuAsp Ile Thr Glu Glu Tyr Pro Ser Ile Gly Lys Pro Phe Trp Ala Glu Ala Gly ValAla Asp Lys Ile His Leu His Ile Ala Pro Ala Gly Gln Thr Leu Gln Arg Leu IleAsp Glu Gly His Ala Gly Ser Phe Asp Phe Ala Phe Ile Asp Ala Asp Lys Pro GlyTyr Asp Asp Tyr Tyr Glu Lys Cys Leu Val Leu Leu Arg Arg Gly Gly Ile Ile SerPhe Asp Asn Thr Val Gln Ala Gly Arg Val Ile Asp Pro Asp Asp Gln Lys Pro AlaThr Val Ala Ile Arg Lys Leu Asn Glu Lys Leu Arg Asp Asp Gln Arg Ile Asn LeuSer Phe Leu Lys Ile Ala Asp Gly Leu Thr Leu Cys Phe Ile Lys。
本发明为解决第二个技术问题提供了一种制备上述的三疣梭子蟹COMT基因重组蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)构建三疣梭子蟹COMT基因重组表达载体；
(2)将步骤(1)所得重组表达载体导入宿主细胞，并将宿主细胞进行诱导表达，获得表达产物；
(3)将分离纯化步骤(2)所得的表达产物，获得重组蛋白，即三疣梭子蟹COMT基因重组蛋白。
优选地，在所述步骤(1)中的表达载体选用pET28a(+)。
优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌TOP10F'。
本发明为解决第三个技术问题提供了一种制备上述的三疣梭子蟹COMT基因在制备COMT抑制剂中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：本专利首次克隆出了三疣梭子蟹COMT基因，根据三疣梭子蟹COMT基因序列特征成功构建重组表达载体并在大肠杆菌系统中表达并纯化获得三疣梭子蟹COMT基因的重组蛋白，并作了相关的表达分析以及COMT与三疣梭子蟹攻击性行为之间的关系的研究，同时还分析了三疣梭子蟹COMT的组织分布和幼体发育阶段分布，并初步评估了COMT与多巴胺DA的关系，表明三疣梭子蟹COMT基因可能广泛参与了三疣梭子蟹攻击行为的分子机制，在继左旋多巴和多巴胺受体激动剂后推入临床治疗波动症的较新一类药物开发上显示出较好的应用前景。
附图说明
图1为本发明中三疣梭子蟹COMT全长cDNA核苷酸序列和编码区氨基酸序列图；
图2为本发明中不同物种COMT氨基酸多序列比对结果图；
图3为本发明中不同物种COMT氨基酸的系统进化树结果图；
图4为本发明中PtCOMT在健康三疣梭子蟹不同组织的相对表达量结果图；
图5为本发明中PtCOMT在健康三疣梭子蟹在不同幼体发育阶段的相对表达量结果图；
图6为本发明中实时定量PCR分析注射多巴胺DA后的三疣梭子蟹肌肉中的PtCOMT表达变化的结果图(不同的字母表示DA注射组和对照组之间的显着差异(P<0.05))；
图7为本发明中实时定量PCR分析注射多巴胺DA后的三疣梭子蟹神经节中的PtCOMT表达变化的结果图(不同的字母表示DA注射组和对照组之间的显着差异(P<0.05))；
图8为本发明中Western blot检测注射多巴胺DA后三疣梭子蟹肌肉中的PtCOMT蛋白的表达量变化结果图(不同的字母表示DA注射组和对照组之间的显着差异(P<0.05))；
图9为本发明中Western blot检测注射多巴胺DA后三疣梭子蟹神经节中的PtCOMT蛋白的表达量变化结果图(不同的字母表示DA注射组和对照组之间的显着差异(P<0.05))；
图10为本发明中注射多巴胺实验组和对照组三疣梭子蟹通过池中间的频率统计。
具体实施方式
以下通过结合附图、序列表及实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本发明中的三疣梭子蟹Crustin的cDNA序列克隆及体外重组表达包括下列步骤：
a)三疣梭子蟹总RNA的提取及mRNA的纯化；
b)三疣梭子蟹cDNA文库构建；
c)三疣梭子蟹cDNA文库EST序列的大规模测定；
d)三疣梭子蟹EST序列的同源性分析及COMT基因片段的筛选；
e)EST序列拼接获得COMT的全序列；
f)三疣梭子蟹COMT的体外重组表达及活性分析。
具体操作如下：
1、三疣梭子蟹总RNA的提取：将三疣梭子蟹幼体取样并储存在-80℃冰箱，用
Figure BDA0001667980180000031
试剂提取总RNA，然后用M-MLV逆转录酶和Oligo dT引物AOLPGGCCACGCGTCGACTAGTACT(16)，逆转录得到cDNA。
2、三疣梭子蟹cDNA文库构建：从三疣梭子蟹的转录组测序数据获得PtCOMT的部分序列。根据表达序列标签(EST)片段和cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得全长cDNA。5'-和3'-末端序列扩增基因特异性引物，这两对引物用于RACE技术扩增COMT基因全长；
3’outer primer：TCAAACCCTCCAGCGTCTCATC；
3’inner primer：CTAATCTTGTTCAGTAGCCTTTGGTG；
5’outer primer：CACCAAAGGCTACTGAACAAGATTA；
5’inner primer：CGTCCAGCACCTTCTTCCCACC。
根据制造商的说明，使用50μL反应体积进行PCR扩增。PCR产物在1％琼脂糖凝胶上分离并用PCR纯化试剂盒(BBI，USA)纯化。然后，将其克隆到pMD18-T简单载体(TaKaRa)中并转化到大肠杆菌TOP10F'的感受态细胞中。并用引物M13-47和引物RV-M一对引物用于菌液PCR验证片段是否正确并测序：其中，引物M13-47为CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGA：引物RV-M为GAGCGGATAACAATTTCACACAGG；进行PCR扩增筛选，使用抗卡那霉素平板筛选选择阳性重组体，并对确认了三个阳性克隆进行测序(BGI公司，中国深圳)。除去载体序列后，使用VectorNTI Suite 7软件装配完整的PtCOMT cDNA序列。
结果显示：通过重叠EST序列和扩增片段获得代表PtCOMT的完整cDNA序列的1072bp核苷酸序列。该全长cDNA含有一个110bp的5'-非翻译区(UTR)，具有poly(A)尾的293bp 3'-UTR和669bp的ORF，编码222个氨基酸的多肽，预测分子量为24.4kDa，理论等电点为5.67，没有二硫键(如图1所示)，SignalP软件分析显示该序列中没有信号肽，残基仅含有一个“SAM_OMT_I”结构域。PtCOMT的推导氨基酸与来自其他甲壳类物种的COMT显示出相似性，包括与凡纳滨对虾COMT 73％序列相似性(AFC17961.1)，与Penaeus monodon COMT(AEP84098.1)有73％的相似性(如图2所示)。该树形拓扑结构是基于PtCOMT的CRD结构域和其他无脊椎动物的CRD结构域，并揭示了PtCOMT与其他无脊椎动物COMT或COMT多肽的关系(如图3所示)。
3、序列分析
将测序获得的序列进行比对分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。全长序列ORF的分析利用在线ORF Finder网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)。将根据cDNA序列推导的氨基酸序列利用ExPASy网站(http://www.expasy.org/tools/)提供的分析工具进行蛋白质一级序列分析，如理化性质、亲疏水性等。信号肽分析采用SignalP 3.0程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignaIP/)，结构域利用SMART网站来进行分析(http://smart.embl-heidelberg.de/)，同源性分析采用Cluster X多序列比对软件，系统进化树采用Mega软件包中的邻接法(NJ)构建。结果显示，预测的成熟肽的分子量为24.4kDa，并且该肽包含222个氨基酸的残基，构成一个SAM_OMT_I结构域。该酶的核心由150个氨基酸组成，表现出非常强的空间保守性。PtCOMT是一种标准的I类甲基转移酶，因为它含有共有结构的确切核心，没有额外的结构域。它没有二硫键和信号肽；二硫键与蛋白质高级结构的生物活性有关，信号肽与物质运输和信号识别有关。氨基酸序列的多重比对表明推定的PtCOMT氨基酸显示出与凡纳滨对虾，斑节对虾和中华绒螯蟹的高度相似性。系统发育树分析的结果显示与凡纳滨对虾COMT具有高度的序列相似性。来自三疣梭子蟹和凡纳对虾的OMT都属于COMT类蛋白质，这与不同簇中表达的FAMeT类蛋白质不同((如图3所示)。
4、重组蛋白表达、纯化及抗体制备
用一对PtCOMT基因特异性引物Pt-F(含有6-His-编码序列)和Pt-R:
Pt-F:CTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTTGATGAAGCACAGCGTGAGGCCG；Pt-R：CATATGGCGACGACAGTCAAGAGCTACA，扩增PCR产物来得到编码PtCOMT的成熟肽。在终止密码子之后分别将NdeI和XhoI位点加到P5和P6的5'末端以进行克隆。将PCR产物克隆到pMD18-T简单载体中，用NdeI和XhoI(NEB)完全酶切，并亚克隆到表达载体pET-28a(+)(Novagen)的NdeI/XhoI位点，并将重组质粒(pET-28a(+)-PtCOMT)转化到ROSETTA(Novagen)中，最后使用PCR扩增筛选阳性克隆并通过测序证实。
将重组的PtCOMT蛋白在37℃下在Luria-Bertani肉汤(含有50mg mL-1氨苄青霉素和1％葡萄糖)中以220rpm振荡温育4小时。当菌液浓度达到OD600为0.5-0.7时，加入1mmolL-1IPTG，并在相同条件下再培养4小时。8000×g离心2min收集沉淀，重悬于50mmol·L-1PBS(含8mol L-1尿素和0.5mmol·L-1NaCl，pH7.4)中。在4℃超声处理60分钟后，使用Ni-琼脂糖树脂(CoWin Biosciences)纯化重组PtCOMT蛋白(命名为rPtCOMT)和阴性对照样品。放入含有50mmol·L-1Tris-HCl，50mmol·L-1NaCl，10％甘油，1％甘氨酸，1mmol·L-1EDTA，0.2mmol·L-1氧化型谷胱甘肽和2mmol·L-1还原型谷胱甘肽的透析液(pH 7.0)中，经过6，4，2，1和0M梯度尿素缓冲液进行透析复性。使用15％SDS-PAGE验证纯化的蛋白质，并使用总蛋白定量测定试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)测定浓度。
将纯化的PtCOMT重组蛋白用作抗原免疫兔子获得多克隆抗体(由杭州华安生物技术公司制备)。使用酶联免疫吸附测定(ELISA)测定抗体滴度。结果为用1mM IPTG诱导4小时后观察到高水平的重组蛋白质。根据预测的分子量24.4kDa，纯化的rPtCOMT在SDS-PAGE凝胶上显现为单一条带，其分子量大于25.4kDa。使用Quantity-One 4.4.0软件发现rPtCOMT的产量约为3mg mL-1。使用ELISA测量的兔多克隆抗体的结果是阳性且可再现的；ELISA值为0.64，大于0.6并认为有效。另外，在重组融合蛋白的N-末端检测到针对适当表位的抗体。免疫组化结果表明，大肠杆菌表达的rPtCOMT可以与兔抗His血清发生特异性反应，进一步证实目的蛋白在大肠杆菌中的成功表达。
实施例2 PtCOMT基因在三疣梭子蟹不同组织和不同幼体阶段的实时定量PCR分析
使用
Figure BDA0001667980180000071
480SYBR Green I Master(Roche，USA)的定量RT-PCR测定来确定PtCOMT在三疣梭子蟹各组织和幼体发育阶段中的分布。进行了三次实验重复和三次生物重复。使用引物COMT-F和COMT-R扩增PtCOMT的314bp片段：COMT-F：CTGGGCGCTCCTGAAGTGCT；COMT-R：GGCTTGTCGGCGTCGATAAA；并使用β-肌动蛋白(内标)和肌动蛋白-F和肌动蛋-R的引物Actin-F：CGAAACCTTCAACACTCCCG；Actin-R：GGGACAGTGTGTGAAACGCC，作为内部对照。使用含有3μLPCR级水，10μL2×主混合物，1μL用于β-肌动蛋白或PtCOMT的每种引物(10mmol L-1)的终体积20μL进行RT-PCR，以及5μL的cDNA混合物。使用2-ΔΔCt方法计算PtCOMT的相对表达水平(Livak和Schmittgen，2001)。数据统计分析采用单因素方差分析，P<0.05为有统计学意义。
此外，收集健康三疣梭子蟹的神经节，肌肉和肝胰脏，并在4℃下用10％中性福尔马林固定24小时。将组织包埋在石蜡中并使用切片机切成4μm。为了脱蜡，将切片置于二甲苯中15分钟，取出，再次置于二甲苯中15分钟，无水乙醇5分钟，无水乙醇5分钟，然后在85％酒精和75％酒精中浸泡5分钟，并且最后用单蒸馏水洗涤。使用免疫组织化学确定PtCOMT的特定分布。使用抗原修复试剂盒(HuaAn Biotechnology，杭州，中国)分析组织切片，并完全浸入EDTA抗原修复缓冲液(pH 8.0)中。在膜干的情况下，将微波炉加热至沸腾，然后孵育15分钟。冷却至20℃后，将组织用PBS(pH 7.4)清洗3次，每次5分钟。将切片置于3％H2O2-PBS溶液中，于室温温育25分钟，并用PBS(pH 7.4)洗涤三次，每次5分钟以阻断内源性过氧化物酶活性，蒸馏水浸洗，PBS浸泡5分钟，用吸水纸轻轻去除切片表面上的PBS。将切片在室温下用正常山羊血清(1:10)均匀密封30分钟，以封闭非特异性反应部位；倾去血清，滴加免抗人GnRH受体抗体(1:200)，室温除去封闭溶液，加入溶解于PBS中的初级抗体，并将切片置于4℃的湿盒中过夜。第二天，切片用PBS(pH7.4)洗涤3次，每次5分钟。将切片表面上的PBS用吸水纸轻轻吸干，加入HRP标记的二抗，并将切片在室温下孵育50分钟。最后，将切片用PBS(pH7.4)洗涤3次，每次5分钟，加入新鲜制备的DAB-H2O2显色剂，并在显微镜下观察切片，结果用ImageJ软件分析。
结果为：COMT基因在三疣梭子蟹的神经节，肌肉和肝胰腺中表达，神经节和肌肉中的表达水平显着高于肝胰腺中的表达水平(P<0.05；图4)。此外，使用免疫组织化学分析三疣梭子蟹中PtCOMT的组织分布和表达以了解其空间表达模式(图4)。结果表明，该基因分布在三疣梭子蟹神经节，肌肉和肝胰腺中，并且在与神经系统密切相关的神经节和肌肉中观察到更高的表达水平。免疫组织化学结果表明，COMT分布于肝胰腺，肌肉和神经节，表明这种酶可能参与配子发生和卵母细胞成熟和发育等各种生理过程。免疫组化结果表明，PtCOMT免疫反应细胞和反应物质分布于三疣梭子蟹的肝胰腺，肌肉和神经节组织；然而，PtCOMT的数量，分布和强度是不同的。PtCOMT在肝胰腺中表现出弱的阳性反应，并且在三疣梭子蟹的神经节和肌肉中有高度的阳性反应(图6和图7)。
PtCOMT在三疣梭子蟹的5个幼体阶段(蚤状幼体I，Z1；蚤状幼体II，Z2；蚤状幼体III，Z3；蚤状幼体IV，Z4和大眼幼体，M)各幼体阶段均有表达。PtCOMT基因在三疣梭子蟹在Z4和M阶段PtCOMT的表达高于在Z1，Z2和Z3阶段；然而，在M阶段观察到最高表达(图5)。要了解三疣梭子蟹的攻击行为，我们需要评估与神经系统和攻击行为相关的基因。Z2变态成Z3和Z4变态成M的阶段是三疣梭子蟹发育过程中最敏感的阶段。另外，三疣梭子蟹在幼体期的存活率较低；有明显的相残行为，严重制约了苗种产量。我们的RT-PCR结果显示PtCOMT在三疣梭子蟹的各阶段均有表达(图5)。在M阶段观察到最高表达水平，然后是Z4阶段。此外，之前的研究发现从Z2到Z3和Z4到M的变态是三疣梭子蟹育种的关键和敏感时期。然而，最关键的时期是从Z4到M，因为它是育种成功与否的关键。每个阶段的具体存活率如下：Z1>Z3>Z2>Z4。此外，许多M幼体相互残杀Z4幼体，这是造成三疣梭子蟹低出苗率的主要原因。M幼体具有强大的螯合物，并且其饲养习性可以从过滤饲料转化为捕食，增加了彼此相残和残杀Z4幼体的可能性。
实施例3Western blotting分析多巴胺DA对PtCOMT蛋白表达的影响
将健康的三疣梭子蟹在有40L淡水的池中暂养7天。在实验过程中，水温保持在27±1℃；pH，7.8-8.0；盐度20‰。三疣梭子蟹的重量范围为70至90克(平均80±10克)，处理之间没有显著的尺寸差异。
注射多巴胺DA之前，将DA盐酸盐溶于无菌盐水(0.85％NaCl)中至浓度为5×10- 3mol L-1。实验组在游泳足注入5×10-3mol L-1DA溶液，剂量达到10-6mol/L。记录注射多巴胺的三疣梭子蟹和对照组蟹通过池正中间的频率。注射前和注射后2，4，8，16和24小时，收集肌肉和神经节用于RNA和蛋白质提取。此外，选择8只健康和未注射的螃蟹，并收集包括肝胰腺，神经节和肌肉样品的组织样品。
根据制造商的方案使用RNAiso Plus试剂(TaKaRa)提取总RNA，并且使用M-MLV逆转录酶(Promega)合成第一链cDNA用于RT-PCR测定。同时，在0，2，4，8，16和24小时从DA刺激的三疣梭子蟹肌肉和神经节提取的总蛋白用于通过蛋白质印迹技术检测PtCOMT。将肌肉和神经节在裂解缓冲液中在冰上均化，然后以10000×g离心5分钟。加入等体积上样缓冲液的上清液储存在-20℃直至使用。Western印迹用15％分离凝胶和5％浓缩凝胶进行。蛋白质从凝胶转移到PVDF膜上。将膜在PBST中洗涤三次并用封闭缓冲液(1％酪蛋白)封闭2小时。然后，将PVDF膜与37℃下的一级和二级抗体孵育1小时。在使用Western发光检测试剂盒后，实验室级X光片曝光。选择β-肌动蛋白作为对照，使用Quantity One软件和ImageJ软件分析PtCOMT的表达水平。
结果显示出DA攻击后，PtCOMT的mRNA和蛋白表达水平发生改变。与对照组相比，PtCOMT mRNA表达水平在肌肉2h时显着上调(P<0.05)，随后在4h显着下调(P<0.05)(结果如图8)。在第2小时，神经节中PtCOMT的mRNA表达水平显着下调(P<0.05)，随后在4小时时显着上调(P<0.05)(图9)。DA注射2小时后，三疣梭子蟹的神经组织首先接收到信号，PtCOMT的表达水平显着降低。此时，肌肉组织中的信号传递需要通过内分泌系统，因此基因表达水平上升。同时，通过注射多巴胺实验组和对照组三疣梭子蟹通过池中间的频率统计结果显示，三疣梭子蟹在DA注射后2小时攻击性增强(图10)。
实施例4三疣梭子蟹COMT基因在制备COMT抑制剂中的应用
在本专利中首次确定了在三疣梭子蟹的COMT基因，并描述了PtCOMT能通过调控DA代谢对三疣梭子蟹攻击性行为有影响，具有酶活性的PtCOMT蛋白可以减少内源性神经内分泌信号或激素转化或代谢，但此调节作用是有限的，其可能在继左旋多巴和多巴胺受体激动剂后推入临床治疗波动症的较新一类药物开发上显示出较好的应用前景。
序列表
<110> 宁波大学
<120> 一种三疣梭子蟹COMT基因及其重组蛋白的应用
<130> Not published yet
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1072
<212> DNA
<213> Portunus trituberculatus
<400> 1
ggccagtcat cgctcacggg agagtggtgg tgtccttgtc tggcatcagt tctcccagca 60
cagccccgtg gccacgacac actcactccg ctcgtattca gtcaacaaca atggcgacga 120
cagtcaagag ctacagcagc gaagatccgc tcctcaagta cacggtggat cattccctca 180
gactgacaga cgtccagaaa aggctgaacg aggtcacctt caagcattcc agataccaga 240
tgctgggcgc tcctgaagtg ctgcagctca acgccaacct gattcaggcc atcggtggga 300
agaaggtgct ggacgtgggc gtgttcaccg gggcgagctc actgtcggct gcccttgccc 360
tgccgcctga cggggaggtg cacgccttgg acatcaccga ggagtacccc agcattggta 420
agccgttctg ggccgaggct ggcgtggcag acaagatcca cctgcacatt gcgccagccg 480
gtcaaaccct ccagcgtctc atcgatgaag gtcacgccgg aagttttgac tttgccttta 540
tcgacgccga caagccgggc tacgacgatt actacgagaa gtgtctggtg ctgctgcggc 600
gcggaggtat catctccttt gacaacacag tgcaagccgg ccgagtcata gaccccgacg 660
accaaaaacc tgccactgtg gcgatcagga aactgaacga gaagctccga gacgaccagc 720
gcatcaacct gtccttcctc aagatcgctg acggcctcac gctgtgcttc atcaagtagt 780
gctgcacgtc agtacatgga cgcataggtc ctaatcttgt tcagtagcct ttggtggagt 840
acctttctta aatcatgtta taacataatc attccgatta tcttctggtt cacaaatttt 900
gctctaaaaa ctcaatatgt tagcaaagca taacttacat tctgtgacta tacgtcgtga 960
atcttattaa cctatgtttg tctaatattt ttaatgctca ttgctatcag tttctaatga 1020
attcctgatt ttaataaaga aataaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 1074

Claims (5)

1.一种三疣梭子蟹COMT基因，其特征在于：所述三疣梭子蟹COMT基因的序列如SEQNO.1所示。
2.一种制备如权利要求1所述的三疣梭子蟹COMT基因所编码蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1) 构建三疣梭子蟹COMT基因重组表达载体；
(2) 将步骤(1)所得重组表达载体导入宿主细胞，并将宿主细胞进行诱导表达，获得表达产物；
(3)分离纯化步骤(2)所得的表达产物，获得重组蛋白。
3.根据权利要求 2所述的三疣梭子蟹COMT基因所编码蛋白的制备方法，其特征在于在所述步骤(1)中的表达载体选用pET28a(+)。
4.根据权利要求2所述的三疣梭子蟹COMT基因所编码蛋白的制备方法，其特征在于在所述步骤(2)中，所述宿主细胞为ROSETTA。
5.一种根据权利要求 1所述的三疣梭子蟹COMT基因在制备COMT抑制剂中的应用。
CN201810491438.2A 2018-05-21 2018-05-21 一种三疣梭子蟹comt基因及其应用 Active CN108642069B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810491438.2A CN108642069B (zh) 2018-05-21 2018-05-21 一种三疣梭子蟹comt基因及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810491438.2A CN108642069B (zh) 2018-05-21 2018-05-21 一种三疣梭子蟹comt基因及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108642069A CN108642069A (zh) 2018-10-12
CN108642069B true CN108642069B (zh) 2021-09-03

Family

ID=63757469

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810491438.2A Active CN108642069B (zh) 2018-05-21 2018-05-21 一种三疣梭子蟹comt基因及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108642069B (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110330555A (zh) * 2019-01-22 2019-10-15 宁波大学 一种三疣梭子蟹wnt4基因及其应用
CN110934099B (zh) * 2019-11-08 2021-09-24 上海海洋大学 一种利用da受体抑制河蟹打斗的方法
CN111378669A (zh) * 2020-01-20 2020-07-07 上海海洋大学 中华绒螯蟹5-ht2b受体基因及其克隆方法
CN111596070B (zh) * 2020-06-10 2023-05-12 宁波大学 一种三疣梭子蟹原肌球蛋白过敏检测试剂的应用
CN113189334B (zh) * 2021-04-27 2022-04-26 华南农业大学 Comt蛋白在食蟹猴超数排卵良好应答预测中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1454203A (zh) * 2000-06-21 2003-11-05 坡特拉有限公司 取代的硝化儿茶酚、它们在治疗某些中枢和周围神经系统疾病中的用途以及含有它们的药物组合物
JP2005126402A (ja) * 2003-10-21 2005-05-19 Katsutoshi Terasawa Ｃｏｍｔ阻害剤

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040166159A1 (en) * 2002-05-29 2004-08-26 Chien-Hsuan Han Pharmaceutical dosage forms having immediate and controlled release properties that contain an aromatic amino acid decarboxylase inhibitor and levodopa

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1454203A (zh) * 2000-06-21 2003-11-05 坡特拉有限公司 取代的硝化儿茶酚、它们在治疗某些中枢和周围神经系统疾病中的用途以及含有它们的药物组合物
JP2005126402A (ja) * 2003-10-21 2005-05-19 Katsutoshi Terasawa Ｃｏｍｔ阻害剤

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Catechol-O-methyltransferase and Its Inhibitors in Parkinson’s Disease;Maria Jo˜ao Bonif´acio etal.;《CNS Drug Reviews》;20071231;第13卷(第3期);第352-379页 *
儿茶酚-O位-甲基酸转移酶抑制剂在治疗帕金森病中的应用;张佩兰等;《河北医药》;20080531;第30卷(第5期);第690-692页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN108642069A (zh) 2018-10-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108642069B (zh) 一种三疣梭子蟹comt基因及其应用
Douglas et al. Identification and expression analysis of hepcidin-like antimicrobial peptides in bony fish
Chen et al. Cloning of an orange-spotted grouper Epinephelus coioides heat shock protein 90AB (HSP90AB) and characterization of its expression in response to nodavirus
Hui et al. Characterization of the putative farnesoic acid O-methyltransferase (LvFAMeT) cDNA from white shrimp, Litopenaeus vannamei: Evidence for its role in molting
Chen et al. Cloning of two crustacean hyperglycemic hormone isoforms in freshwater giant prawn (Macrobrachium rosenbergii): evidence of alternative splicing
Yedery et al. Identification, cloning, characterization and recombinant expression of an anti-lipopolysaccharide factor from the hemocytes of Indian mud crab, Scylla serrata
Wei et al. A heat shock protein 90 β isoform involved in immune response to bacteria challenge and heat shock from Miichthys miiuy
Sun et al. Molecular cloning, characterization, and expression analysis of p53 from the oriental river prawn, Macrobrachium nipponense, in response to hypoxia
Luana et al. Molecular characteristics and expression analysis of calreticulin in Chinese shrimp Fenneropenaeus chinensis
Lugo et al. Molecular cloning and characterization of the crustacean hyperglycemic hormone cDNA from Litopenaeus schmitti: Functional analysis by double‐stranded RNA interference technique
Wang et al. Differential responses to low salinity on gene expression, physiological and biochemical indexes between the golden and brown noble scallops Chlamys nobilis
Yang et al. A novel ferritin gene from Procambarus clarkii involved in the immune defense against Aeromonas hydrophila infection and inhibits WSSV replication
Zhang et al. Characterization of E3 ubiquitin ligase neuregulin receptor degradation protein-1 (Nrdp1) in the large yellow croaker (Larimichthys crocea) and its immune responses to Cryptocaryon irritans
Lee et al. Molt-inhibiting hormone from the tropical land crab, Gecarcinus lateralis: cloning, tissue expression, and expression of biologically active recombinant peptide in yeast
US8173790B2 (en) Insect desiccation resistance genes and uses thereof
Wu et al. An iodothyronine deiodinase from Chlamys farreri and its induced mRNA expression after LPS stimulation
Zhu et al. Molecular cloning, characterization and effects of catechol-o-methyltransferase (comt) mRNA and protein on aggressive behavior in the swimming crab Portunus trituberculatus
Sun et al. A novel TRIM9 protein promotes NF-κB activation through interacting with LvIMD in shrimp during WSSV infection
US20060093596A1 (en) Genomic approach to identification of novel broad-spectrum antimicrobial peptides from bony fish
Yang et al. Immunoprotective effects of two histone H2A variants in the grass carp against Flavobacterium columnare infection
Lee et al. Characterization and expression profiles of aquaporins (AQPs) 1a and 3a in mud loach Misgurnus mizolepis after experimental challenges
Zhang et al. Cloning, expression pattern, and potential role of apoptosis inhibitor 5 in the termination of embryonic diapause and early embryo development of Artemia sinica
Wei et al. Characterization and SNP variation analysis of a HSP70 gene from miiuy croaker and its expression as related to bacterial challenge and heat shock
Fu et al. Identification and functional analysis of the estradiol 17β-dehydrogenase gene on the shell hardness of Scylla paramamosain during the molting cycle
CN115058430A (zh) 一种拟穴青蟹5-ht2受体基因及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant