CN111378669A - 中华绒螯蟹5-ht2b受体基因及其克隆方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种中华绒螯蟹5‑HT2B受体基因及其克隆方法，属于基因工程领域。本发明根据5‑HT2B受体的表达序列标签设计引物，通过反转录获得3’和5’末端侧翼片段，并与5‑HT2B受体的表达序列标签进行拼接后可获得中华绒螯蟹5‑HT2B基因的全长序列。对于5‑HT2B受体基因的研究，将为蟹类行为、肠道生理及5‑HT受体功能的研究奠定理论基础，也将为蟹品质、饲料节约、减少由饲料造成的环境污染等应用方向提供理论支持。

Description

中华绒螯蟹5-HT2B受体基因及其克隆方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种中华绒螯蟹5-HT2B受体基因及其克隆方法。

背景技术

中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)又称河蟹，是我国重要的经济淡水养殖蟹类，属甲壳纲(Crustacea)，十足目(Decapoda)，在我国水产养殖业中占据重要位置。河蟹生性好斗，打斗行为使其种内互相残杀现象极其严重，断肢和再生时有发生。打斗会造成断肢蟹的出现，进而影响存活、生长和品质，再生会增加养殖成本，减少再生蟹的品质。

5-羟色胺(5-HT)在行为学中的作用已在哺乳和两栖类动物中已广泛关注(MikóZ,2017；Hernández-Plata,2015)，且与脑等中枢神经调控密切相关。其需要与其受体结合后才能发挥作用。已发现5-HT在龙虾的打斗或抑郁行为中有重要作用(Huber,2005；Moore,2007)。本课题组也已发现其在中华绒螯蟹打斗行为中起着重要的作用(Yang,2018；Pang,2019)，但并不清楚中枢神经系统如脑和胸神经节，在5-HT介导的行为学中的作用如何，而且至今有关蟹类5-HT多种受体的结构与功能仍不清楚。此外，5-HT能促进肠道运动，表现为食物在肠道中的存留时间减少。说明5-HT参与了食物在肠道中的运动。肠道动力直接与投喂频率及量相关，结合生理水平的基础研究，进行科学投喂势必减少饲料浪费及由饲料造成的环境污染。也已证明，5-HT2B受体是GPCR家族中的重要一员，参与体内的多种生理和病理活动。大量的研究表明，5-HT2B受体的选择性拮抗剂，在人类医学中发挥着重要的作用，对肺动脉高血压、偏头痛、肠易激综合症和肝纤维化等相关疾病的治疗方面有潜在的临床应用价值。在蟹类的养殖中肝胰腺是其营养、生殖和发育调节的重要器官，也是疾病损伤最主要的器官之一。因此，本发明对于5-HT2B受体结构的研究，是对其功能研究的基础，对于此基因的研究，将为蟹类行为、肠道生理及5-HT受体功能的研究奠定理论基础，也将为蟹品质、饲料节约、减少由饲料造成的环境污染等应用方向提供理论支持。

本发明存在以下难点：(1)由于蟹没有基因组的参考序列，也没有基因组表达序列，对于此物种的相应受体克隆难度高；(2)对于相近物种也存在基因组差异性大，多态性高的问题；(3)该基因的表达量较低；(4)该基因的GC含量高，GC含量>60％。

发明内容

针对上述技术难题，本发明提供一种克隆方法，以获得中华绒螯蟹5-HT2B的受体基因，内容如下：

一种中华绒螯蟹5-HT2B受体基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

SEQ ID NO:1中华绒螯蟹5-HT2B基因核酸序列(serotonin 2b receptor)

1 ggggattgcaattgcgagtgaaacatatattgaaaaaacacccgcacgtgcgcactgaac 60

61 ggaaacgaaacgaaccgaacgaacatcaaagacaatgcggaataataatgaaacgcacgt 120

121 cgtgaaaatgaactccgaactcacgccaaatactaaaaaggaaaaccatacgtgcgggaa 180

181 agtgaggaagtgagaaaaaaaagagagaaaaagccacatccgccacaccaccccacatgc 240

241 ccaccctaggggacctcaccctcccccctcagccccccacaaacactagggacctcgact 300

301 tggccctcaacctaaccactctttggaccactccccagaacgccactccggggaacctaa 360

361 catgggagggggcgggggacggggaagctggggaggaggggaggggcacggggtcacctc 420

421 ctgccaactggtggggcctggtggcgctgctggtggtgctgctgaccctcttcggcaaca 480

481 tcctgcttatcctggccatctcgtgggaccgccgcctccagaacatgaccaactacttcc 540

541 ttctctccctggccgtgacggatctcatggtagcttccctggtcatgccgctctccattg 600

601 tggtccttgtcttaggtcacttccccttctcgtcggagctgtgtctactctggatctccc 660

661 tcgacgtcctcttctgcaccgcctctatcatgcacctctgtaccctctccgtggaccgct 720

721 tcctttcgctcaggtaccccatcaagttcgggcggcacaaaactcggcggcgcgtggttc 780

781 tcaagatcgtgctggtgtggtgcctctcgctggccgcctcgctgccgctgtccctcatgt 840

841 acgccacggcgccgcacaccaccatcgtggacggcgtgtgtcagatccccgtgtcgctct 900

901 tccagatcatcggctccgtcatctgcttctacattccgctggtcatcatgctggtgacct 960

961 acgccctcacggtgcgtctgctctcccagaaacagagtgaactgcagtcctcggtgctag 1020

1021 agccctcctccgcctccgcctcaccctcgccacgctccctccgctggaagaggctgctct1080

1081 gcaagacaacctccaccctcagcaccagcacggccgtctcgctcaccgacggcgaggtga1140

1141 gcgaggccacctgccgcccggagcagtgcgggcctcacgccaagctgcggcgcctcggca1200

1201 gcagcccccagcggcggccgcccctggtgcgctacgccagccaccactatcaccaccgct1260

1261 ccgcgctcgtgcgggctgacggctgcaacctgaggggttactcgacgcgggagctgcgcg1320

1321 cagccgaggagcagcagcagcagcagcaacagcagtctttcccgactctgtcagcctcgg1380

1381 cacccgcctacgagatgagcgtgctgccccccgccgcccgctccgccccctcctccacca1440

1441 ccacctcgcccctccaccgccgccacccacacctccacccagacgacgctgcggggggcc1500

1501 aagaggagtccagcacctccccgacatacgaacagaacggcgacccgcggggcggtgcga1560

1561 gagagcggtgtggcgaggagtgcgggggcggagcgcgggcggcgggcggcggcagcggcg1620

1621 ggcaggtggcggtgccctgcagctgtgccccgcggttcttcctggaggacatgaaggcgc1680

1681 aggacagccagtgcgaggagtgcgccgccccgcagcccagcgaggtggccgtccactact1740

1741 ctgccccgcggccccgccgcagccgcgacgccagccagccccgggggggagccagctggt1800

1801 gctgctgctgctgtcccgctgccttcatccgcctcacccggcgccgccacgcccagcccg1860

1861 gcgcccctttgtcgtcaccgtggcacgaggggtccagcccgcccagacccacccaggacc1920

1921 tggtcacccgcagcaccctcaggccgggcgggcaggtgaccaccacgctcttgcagaagg1980

1981 gcgggtcctcggaggcggggtcgtcgccgcgcgggctgtggcggcaacagtcatgctccg2040

2041 cctccctcaagtttgtgtcctcgaagcgccatggaaggaacctcaggatggagcagaagg2100

2101 cgacgaaggtcctcggcgtggtcttcttcaccttcgttctgctgtgggcgccgttcttca2160

2161 tcgccaacgtcctcatctcgtgcggggcccacatcggggaggagatgatcaacctggtca2220

2221 cctggctcggctacgcttcgtccatggtcaacccatttttctacacgttcttcaacaaga2280

2281 ccttcagacaaacgttcctcaagatcatgaagtgcgacatcaagaccacaaggaagtacc2340

2341 acctctgaggctttaagaatggttgttatgtacttttattcgtccccgctacccatcttg2400

2401 ttatccctttacctgactacctcaccccgccccgtttcacctgttagaacacctctattc2460

2461 acctggccctcacctggtcacgccggctcgcccctccatcccgccccctaacctcgctat2520

2521 agtgactgcgagctgttgagggcgggagagaagggtgttaaagcgaggtgttggccacgt2580

2581 atccctccctccctcacttaccctccctccctccctcccatacagagtgtcaacccagcg2640

2641 agtaataggcttgaatcagtgtcccttgcgttcgaaaataaggtttgccatgtatatata2700

2701 cagacgtttctaagtgtctttggtgttgcagaagaaaacgttttacctgtgcgaagctat2760

2761 aaaagttattatgtatatttagaggacagtaagtattcctagacgcgcgtgtggcccggg2820

2821 ctggcaggcttcactggagcttcacgattggttcagtttaaagattcactgtttcggtaa2880

2881 taccagtctggaggcttcacgttcacctgtactctcgcgccacgtttaattgacagtatt2940

2941 acgagaagcgacctgcgctgtaccttaattatccccacattacctgtccccttgatcacc3000

3001 tgaagccagtacctgtgttgatacgagtctcgcctttaagtgacaaaaaaatactccttc3060

3061 cgtctattcttttccgtcatacctttaaacattcccaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa3120

3121 aaaaaaa 3127

一种如上所述的中华绒螯蟹5-HT2B受体基因所编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQID NO:2所示。

SEQ ID NO:2中华绒螯蟹5-HT2B受体基因所编码的蛋白

MPTLGDLTLPPQPPTNTRDLDLALNLTTLWTTPQNATPGNLTWEGAGDGEAGEEGRGTGSPPANWWGLVALLVVLLTLFGNILLILAISWDRRLQNMTNYFLLSLAVTDLMVASLVMPLSIVVLVLGHFPFSSELCLLWISLDVLFCTASIMHLCTLSVDRFLSLRYPIKFGRHKTRRRVVLKIVLVWCLSLAASLPLSLMYATAPHTTIVDGVCQIPVSLFQIIGSVICFYIPLVIMLVTYALTVRLLSQKQSELQSSVLEPSSASASPSPRSLRWKRLLCKTTSTLSTSTAVSLTDGEVSEATCRPEQCGPHAKLRRLGSSPQRRPPLVRYASHHYHHRSALVRADGCNLRGYSTRELRAAEEQQQQQQQQSFPTLSASAPAYEMSVLPPAARSAPSSTTTSPLHRRHPHLHPDDAAGGQEESSTSPTYEQNGDPRGGARERCGEECGGGARAAGGGSGGQVAVPCSCAPRFFLEDMKAQDSQCEECAAPQPSEVAVHYSAPRPRRSRDASQPRGGASWCCCCCPAAFIRLTRRRHAQPGAPLSSPWHEGSSPPRPTQDLVTRSTLRPGGQVTTTLLQKGGSSEAGSSPRGLWRQQSCSASLKFVSSKRHGRNLRMEQKATKVLGVVFFTFVLLWAPFFIANVLISCGAHIGEEMINLVTWLGYASSMVNPFFYTFFNKTFRQTFLKIMKCDIKTTRKYHL

一种克隆中华绒螯蟹5-HT2B受体基因的方法，步骤如下：

(1)根据5-HT2B受体的表达序列标签(EST)，分别设计3’-5-HT2B RACE上游引物和5’-5-HT2B RACE下游引物，将提取的中华绒螯蟹总RNA反转录成3’-cDNA和5’-cDNA第一链，以此为模板，分别采用3’-5-HT2B RACE上游引物、5’-5-HT2B RACE下游引物和通用引物进行3’和5’末端侧翼片段RACE，将得到的3’和5’末端侧翼片段分别与载体连接，克隆并测序；

(2)将测序得到的末端侧翼片段与5-HT2B受体的表达序列标签进行拼接获得拼接的5-HT2B受体的全长序列，以该拼接的序列为模板，再在5’和3’非编码区设计特异性基因全长序列验证引物对全长进行验证，并消除个别不确定碱基，最终获得中华绒螯蟹5-HT2B基因的全长序列。

在上述方案的基础上，所述3’-5-HT2B RACE上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

在上述方案的基础上，所述5’-5-HT2B RACE下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。

在上述方案的基础上，所述载体为pM19T质粒。

在上述方案的基础上，所述步骤1)中通用引物如SEQ ID NO:7所示。

在上述方案的基础上，所述步骤2)中基因全长序列验证引物如SEQ ID NO:8和SEQID NO:9所示。

在上述方案的基础上，所述中华绒螯蟹总RNA提取自胸神经节和肠道组织。

本发明有益效果：本发明通过克隆方法获得5-HT2B受体基因的全序列，是对该受体结构功能研究的基础，对于此基因的研究，将为蟹类行为、肠道生理及5-HT受体功能的研究奠定理论基础，也将为蟹品质、饲料节约、减少由饲料造成的环境污染等应用方向提供理论支持。

附图说明

图1为中华绒螯蟹5-HT2B受体基因全长扩增电泳图，其中；模板1为提取的中华绒螯蟹脑和胸神经节RNA经混合后反转录获得的cDNA，模板2为提取蟹肠道组织RNA反转录获得的cDNA，模板3扩增后未获得目的条带；

图2为中华绒螯蟹5-HT2B受体基因cDNA核酸序列及其预测的氨基酸序列；

图3为中华绒螯蟹5-HT2B氨基酸信号肽——无；

图4为中华绒螯蟹5-HT2B蛋白跨膜结构域——7个跨膜区；

图5为中华绒螯蟹5-HT2B氨基酸序列与其他物种5-HT2B氨基酸序列的比较；

图6为中华绒螯蟹5-HT2B受体基因系统进化树(置信度为1000)。

具体实施方式

为实现和理解本发明上述内容，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明，但并不因此理解为对本发明的限制。

实验所用中华绒螯蟹均来自上海海洋大学崇明养殖基地。实验过程中随机取若干只健康且富有活力、无断肢的中华绒螯蟹，解剖取蟹的胸神经节和肠道组织，放入RNaseFree离心管中，迅速置于液氮中冷冻，再存放于-80℃超低温冰箱待用。

本发明所使用的的主要试剂有RNAiso^TMPlus、dNTPs、Taq DNA Polymerase、DNAmarker、pM19T、琼脂糖、T4 DNA Ligase、SMARTer RACE 5’/3’Kit、FastQuantcDNA第一链合成试剂盒、TOP10感受态细胞、氨苄青霉素(Amp)、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、50×TAEBuffer、5×TBE Buffer、无菌去离子水、DEPC水、异丙醇、无水乙醇、三氯甲烷、NaCl、胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉、核酸染料Gold view等。

实验所用引物从实验室已获得的转录组数据中查找5-HT2B受体的表达序列标签(EST)，据此Primer Premier 5软件设计基因克隆所需引物。5-HT2B 3’或5’RACE引物序列如表1所示：

表1

实施例1

总RNA的提取

(1)取-80℃冻存的胸神经节和肠道组织，放入已用液氮预冷的研钵中，将组织研磨至粉末状，收集粉末状组织于事先加入1mL RNAiso^TM Plus的1.5mL离心管中，充分震荡，然后在冰盒上静置10min，同时打开离心机预冷。充分反应后，4℃，12000rpm，离心10min，将所得上清液转移至新的离心管中。

(2)向含有上清液的离心管中加入200μL氯仿，旋涡振荡30s后于冰盒上静置10min，然后4℃，12000rpm，离心10min。

(3)小心谨慎地吸取300-400μL上清液(不能吸到中层和下层的物质)至新的离心管中，加入400μL预冷的异丙醇溶液，快速手动上下颠倒混匀数次，冰盒上静置10min，然后4℃，12000rpm，离心10min，弃去上清液，留下的白色沉淀物。

(4)随后向管中加入1mL 75％酒精，盖上管盖，用手弹管壁若干下，使RNA沉淀充分洗涤，然后4℃，12000rpm，离心3min，倒掉上清，再次离心1min，用枪头吸除剩余的酒精。

(5)在超净台中晾干，直至RNA沉淀由白色变成透明，加入30μL左右的DEPC水，用枪轻轻吸打，将RNA沉淀溶解，置于-80℃超低温冰箱保留待用。

(6)RNA质量检测：取3μL RNA溶液经过1％的琼脂糖，150V，15min后在凝胶成像仪上观察凝胶电泳条带，条带有三条，分别为28S、18S和5S，其中5S最淡；取1μL RNA溶液在Q5000紫外分光光度下检测RNA OD260/OD280的比值及浓度，比值在1.8-2.2之间。

实施例2

3’末端和5’末端快速扩增(RACE)，该过程利用美国Clontech公司的SMARTer RACE5’/3’Kit试剂盒。

1.反转录3’-RACE cDNA第一链的合成

(1)取4.0μL 5×First-Strand Buffer、0.5μL DTT(100mM)和1.0μL dNTPs(20mM)于0.2mL离心管中，置于室温，待用。

(2)取1μg胸神经节和肠道组织的总RNA于一新的离心管中，再往里加入1.0μL 3’-CDS Primer A，补加RNase Free Water至终体积为12μL。

(3)混匀并短暂离心。

(4)水浴72℃3min，42℃2min。然后短暂离心10s，14000×g，使溶液聚于管底。

(5)在室温下向步骤1的离心管中加入0.5μL RNase Inhibitor(40U/μL)和2.0μLSMARTScribe Reverse Transcriptase(100U)。

(6)将步骤5的混合液加入到步骤4变性后的RNA溶液中，获得终体积为20μL的cDNA合成反应液。

(7)轻弹管壁，混匀，短暂离心。

(8)水浴42℃，90min。

(9)70℃，10min。

(10)反应结束后，加入10μL Tricine-EDTA Buffer稀释第一链cDNA合成反应液，-20℃低温保存。

2.3’-RACE PCR产物扩增

以设计的5-HT2B 3’Outer为引物，以3’-RACE cDNA第一链为模板，按照试剂盒说明，如下体系加样：3’-RACE cDNA模板1.25μL，10×UPM 2.5μL，特异性引物(5-HT2B3’Outer)0.5μL，2×SeqAmp Buffer 12.5μL，SeqAmp DNA Polymerase 0.5μL，PCR-GradeWater 7.75μL。设置PCR仪反应条件：94℃5min；94℃30s，72℃3min，5个循环；94℃30s，70℃30s，72℃3min，5个循环；94℃30s，68℃30s，72℃3min，30个循环；72℃10min，16℃保存。

扩增反应完成后，将PCR产物稀释2倍或5倍，并将其作为模板，进行巢式PCR，体系如下：模板1μL，特异性引物(5-HT2B 3’Inner)1μL，Nest Universal Primer 1μL，Taq酶0.4μL，10×PCR Buffer 2.0μL，dNTP Mixture(2.5mM)0.4μL，DMSO 0.6μL，加无菌去离子水至总体积20μL。设置PCR仪反应程序：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃3min，30个循环；72℃10min，16℃保存。

3.反转录5’-RACE cDNA第一链的合成

(1)取4.0μL 5×First-Strand Buffer、0.5μL DTT(100mM)和1.0μL dNTPs(20mM)于0.2mL离心管中，置于室温，待用。

(2)取1μg胸神经节和肠道组织的总RNA于一新的离心管中，再往里加入1.0μL 5’-CDS Primer A，补加RNase Free Water至终体积为11μL。

(3)混匀并短暂离心。

(4)水浴72℃3min，42℃2min。然后短暂离心10s，14000rmp，使溶液聚于管底。

(5)向上述离心管中加入1μL SMARTerⅡA Oligonucleotide。

(6)在室温下向步骤1的离心管中加入0.5μL RNase Inhibitor(40U/μL)和2.0μLSMARTScribe Reverse Transcriptase(100U)。

(7)将步骤6的混合液加入到步骤5变性后的RNA溶液中，获得终体积为20μL的cDNA合成反应液。

(8)轻弹管壁，混匀，短暂离心。

(9)水浴42℃，90min。

(10)70℃，10min。

(11)反应结束后，加入10μL Tricine-EDTA Buffer稀释合成cDNA第一链反应液，-20℃低温保存。

4.5’-RACE PCR产物扩增

以设计的5-HT2B 5’Outer为引物，以5’-RACE cDNA第一链为模板，第一轮PCR反应体系和反应条件同3’-RACE PCR步骤一致。巢式PCR中，使用5-HT7 5’Inner(Tm：68℃)进行扩增。

实施例3

PCR产物的克隆与鉴定

1.PCR产物目的片段回收纯化

PCR反应结束后，取5μLPCR产物经1.5％琼脂糖凝胶，120V，25min电泳后检验结果，片段大小符合后按上述扩增方法，总体系增至100μL。利用天根琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对目的条带进行回收纯化，具体操作步骤如下：

(1)称取0.4g琼脂糖于锥形瓶中，加入20mL TAE溶液，微波炉内溶解后，加入1μL核酸染料Gold view，制成浓度为2％的回收胶；

(2)120V，40min电泳；

(3)准备2.0mL离心管并称重，记下重量；

(4)电泳后在紫外灯照射下，将目的条带小心的切割下来，尽可能的去除多余的胶，将胶条切碎后放入2.0mL离心管并再次称重，计算差值；

(5)取出试剂盒中的吸附柱，对其进行预处理，将吸附柱放入收集管中，往吸附柱中加入500μL平衡液(BL)，12000rpm，离心1min，倒掉废液，吸附柱放回收集管中；

(6)向放有回收胶的离心管中按0.1g凝胶对应100μL溶胶液加入溶胶液(PN)，50℃水浴锅中放置数分钟，期间不断上下颠倒翻转离心管，直至凝胶全部融化；

(7)将胶溶液吸到处理过的吸附柱中，室温静置2min后，12000rpm，离心1min，倒掉废液，重新装回吸附柱；

(8)吸取600μL漂洗液(PW)加入吸附柱中，12000rpm，离心1min，倒掉滤液，重新装回吸附柱；

(9)重复上一个步骤；

(10)12000rpm，离心2min，尽量除去漂洗液，将吸附柱放入一个新的1.5mL离心管中，打开吸附柱的盖子，室温静置2min，使残余的漂洗液完全挥发；

(11)往吸附柱内悬空滴加30μL的溶解液，室温放置2min，使其将柱子中的DNA充分溶解，12000rpm，离心2min，收集溶解后的DNA到离心管中；

(12)取1μL回收的DNA溶液，使用Q5000紫外分光光度仪器检测DNA浓度；同时取3μL产物进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像仪下检测回收结果，剩下的产物放于-20℃冰箱保存。

2.回收产物的连接和转化

连接使用TAKARA公司的pM19T载体连接试剂盒和T4 DNA Ligase

(1)取7μL回收产物于0.2mL离心管中，加入1μL pM19T载体，1μL T4 DNA Ligase和1μL 10×T4 DNA Ligase Buffer，金属浴16℃连接16-18h。

(2)制备LBA固体/液体培养基

LB液体培养基：称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和10g NaCl，定容于1L蒸馏水中，高温高压灭菌冷却后，密封保存。

LBA液体培养基：向LB液体培养基中加入1mL氨苄青霉素(100mg/mL)。

LBA固体培养基：称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g NaCl和10g琼脂粉，定容于1L蒸馏水中，高温高压灭菌冷却至55℃左右后，向培养基中加入1mL氨苄青霉素(100mg/mL)，混合均匀后，在超净工作台中倒入培养皿中，待冷却凝固后封口放入4℃冰箱备用。

(3)从-80℃冰箱中取出一管TOP10感受态细胞，放于冰上融化约5min。

(4)向融化后的感受态细胞中加入16℃连接后的产物，轻弹管壁，冰上静置30min，使重组质粒均匀分布在感受态细胞周围。

(5)30min后，将离心管放于42℃水浴锅中，热击90s，再迅速拿出放于冰上冷却5min。

(6)向离心管中加入900μL LB液体培养基，混匀，于37℃培养箱中培养1.5h。

(7)将离心管在12000rpm转速下离心1min，收集菌体，吸掉上清，留下约100μL上清后，在超净工作台中，用枪吸打混匀菌体，并将其吸取加入到LBA固体培养皿上，用涂布棒均匀的涂开，放入37℃培养箱正面培养1h后再倒置培养12h。

3.阳性克隆的筛选

(1)用小枪头小心挑取平板上的单克隆菌株，放入事先装有100μLLBA液体培养基的0.2mL离心管中，37℃培养箱2.5h。

(2)取1μL菌液做为PCR模板，PCR反应程序和体系同RACE扩增一样。

(3)反应结束后，经1.5％凝胶，120V，25min电泳检测目的条带，如若条带大小与回收目的DNA相同，则将该单克隆菌液扩培后送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

4.全长验证

(1)引物设计

通过测序获得cDNA碱基序列，拼接后获得全长序列，再在5’和3’非编码区设计特异性引物对全长进行验证，并消除个别不确定碱基。5-HT2B基因全长序列验证引物如表2所示：

表2

(2)全长扩增体系

利用先前提取的中华绒螯蟹脑神经节、胸神经节以及肠道组织中的total RNA反转录获得的cDNA，反转录体系(根据TAKARA制造商说明)如下：

1.去除基因组DNA反应

试剂	使用量
		5×gDNA Eraser Buffer	2.0μL
gDNA Eraser	1.0μL
		Total RNA	*1
RNase Free dH<sub>2</sub>O	Up to 10μL

反应参数：42℃2min，4℃保存

其中，*1表示20μL反转录体系中，使用500ng Total RNA

2.反转录反应

试剂	使用量
		步骤1反应液	10μL
PrimeScript RT Enzyme Mix I	1.0μL
		RT Primer Mix	4.0μL
5×PrimeScript Buffer 2	4.0μL
		RNase Free dH<sub>2</sub>O	1.0μL
Total	20μL

反应参数：37℃15min，85℃5sec，4℃保存

以上反转录获得的cDNA作为模板用于5-HT2B编码区全长扩增，反应体系为5-HT2B-F和5-HT2B-R引物各1μL,Taq酶10μL，模板1μL，加无菌去离子水至总体积20μL。PCR扩增体系为：98℃3min，98℃10s；55/57/59/61℃20s，72℃30s，35个循环。

(3)测序

将符合目的片段长度的PCR产物进行回收、连接和转化(方法同上)，送至生工生物工程有限公司进行测序。

5.5-HT2B全长序列分析结果

(1)5-HT2B全长cDNA序列分析

5-HT2B基因全长3127bp，其中5’-UTR(非编码区)为236bp，3’-UTR(非编码区)为779bp，ORF(开放阅读框)含有2112bp(包含终止密码子)，编码703个氨基酸，同时具有Poly-A尾。

(2)5-HT2B编码的氨基酸分析

5-HT2B编码的氨基酸属于G蛋白偶联受体，经过TMHMM和Signal P在线分析显示5-HT2B 7个跨膜结构域，但是N端无信号肽序列(图3和图4)。此外还有N-糖基化位点(N-x-[S/T])和磷酸化位点(S/T-x-[R/K])等氨基酸残基相对保守。

6.中华绒螯蟹5-HT2B氨基酸同源性及构建其系统进化树

经过序列比对发现，中华绒螯蟹5-HT2B氨基酸序列与北黄道蟹(Cancerborealis)、美洲龙鳌虾(Homarusamericanus)、罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)、断沟龙虾(Panulirusinterruptus)以及克氏原螯虾(Procambarusclarkii)5-HT2B序列具有高度的保守性(图5)。运用MEGA 5.0软件的邻接法(Neighbor-Joining)将中华绒螯蟹5-HT2B氨基酸与部分脊椎动物和无脊椎动物的5-HT2B氨基酸序列构建进化树。发现中华绒螯蟹5-HT2B与北黄道蟹聚为一支，表示两者关系较近，同时与果蝇等有一定的亲缘关系，与斑马鱼等水生脊椎动物、非洲爪蟾等两栖类动物以及小鼠等哺乳动物在不同分支，表明亲缘关系较远，这与分子同源关系进化发展和生物进化相符。

以上所述实施例仅提供了本发明的几种实施方式，但并不能因此而理解为对本发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说看，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 上海海洋大学

<120> 中华绒螯蟹5-HT2B受体基因及其克隆方法

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 3127

<212> DNA

<213> 中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)

<400> 2

ggggattgca attgcgagtg aaacatatat tgaaaaaaca cccgcacgtg cgcactgaac 60

ggaaacgaaa cgaaccgaac gaacatcaaa gacaatgcgg aataataatg aaacgcacgt 120

cgtgaaaatg aactccgaac tcacgccaaa tactaaaaag gaaaaccata cgtgcgggaa 180

agtgaggaag tgagaaaaaa aagagagaaa aagccacatc cgccacacca ccccacatgc 240

ccaccctagg ggacctcacc ctcccccctc agccccccac aaacactagg gacctcgact 300

tggccctcaa cctaaccact ctttggacca ctccccagaa cgccactccg gggaacctaa 360

catgggaggg ggcgggggac ggggaagctg gggaggaggg gaggggcacg gggtcacctc 420

ctgccaactg gtggggcctg gtggcgctgc tggtggtgct gctgaccctc ttcggcaaca 480

tcctgcttat cctggccatc tcgtgggacc gccgcctcca gaacatgacc aactacttcc 540

ttctctccct ggccgtgacg gatctcatgg tagcttccct ggtcatgccg ctctccattg 600

tggtccttgt cttaggtcac ttccccttct cgtcggagct gtgtctactc tggatctccc 660

tcgacgtcct cttctgcacc gcctctatca tgcacctctg taccctctcc gtggaccgct 720

tcctttcgct caggtacccc atcaagttcg ggcggcacaa aactcggcgg cgcgtggttc 780

tcaagatcgt gctggtgtgg tgcctctcgc tggccgcctc gctgccgctg tccctcatgt 840

acgccacggc gccgcacacc accatcgtgg acggcgtgtg tcagatcccc gtgtcgctct 900

tccagatcat cggctccgtc atctgcttct acattccgct ggtcatcatg ctggtgacct 960

acgccctcac ggtgcgtctg ctctcccaga aacagagtga actgcagtcc tcggtgctag 1020

agccctcctc cgcctccgcc tcaccctcgc cacgctccct ccgctggaag aggctgctct 1080

gcaagacaac ctccaccctc agcaccagca cggccgtctc gctcaccgac ggcgaggtga 1140

gcgaggccac ctgccgcccg gagcagtgcg ggcctcacgc caagctgcgg cgcctcggca 1200

gcagccccca gcggcggccg cccctggtgc gctacgccag ccaccactat caccaccgct 1260

ccgcgctcgt gcgggctgac ggctgcaacc tgaggggtta ctcgacgcgg gagctgcgcg 1320

cagccgagga gcagcagcag cagcagcaac agcagtcttt cccgactctg tcagcctcgg 1380

cacccgccta cgagatgagc gtgctgcccc ccgccgcccg ctccgccccc tcctccacca 1440

ccacctcgcc cctccaccgc cgccacccac acctccaccc agacgacgct gcggggggcc 1500

aagaggagtc cagcacctcc ccgacatacg aacagaacgg cgacccgcgg ggcggtgcga 1560

gagagcggtg tggcgaggag tgcgggggcg gagcgcgggc ggcgggcggc ggcagcggcg 1620

ggcaggtggc ggtgccctgc agctgtgccc cgcggttctt cctggaggac atgaaggcgc 1680

aggacagcca gtgcgaggag tgcgccgccc cgcagcccag cgaggtggcc gtccactact 1740

ctgccccgcg gccccgccgc agccgcgacg ccagccagcc ccggggggga gccagctggt 1800

gctgctgctg ctgtcccgct gccttcatcc gcctcacccg gcgccgccac gcccagcccg 1860

gcgccccttt gtcgtcaccg tggcacgagg ggtccagccc gcccagaccc acccaggacc 1920

tggtcacccg cagcaccctc aggccgggcg ggcaggtgac caccacgctc ttgcagaagg 1980

gcgggtcctc ggaggcgggg tcgtcgccgc gcgggctgtg gcggcaacag tcatgctccg 2040

cctccctcaa gtttgtgtcc tcgaagcgcc atggaaggaa cctcaggatg gagcagaagg 2100

cgacgaaggt cctcggcgtg gtcttcttca ccttcgttct gctgtgggcg ccgttcttca 2160

tcgccaacgt cctcatctcg tgcggggccc acatcgggga ggagatgatc aacctggtca 2220

cctggctcgg ctacgcttcg tccatggtca acccattttt ctacacgttc ttcaacaaga 2280

ccttcagaca aacgttcctc aagatcatga agtgcgacat caagaccaca aggaagtacc 2340

acctctgagg ctttaagaat ggttgttatg tacttttatt cgtccccgct acccatcttg 2400

ttatcccttt acctgactac ctcaccccgc cccgtttcac ctgttagaac acctctattc 2460

acctggccct cacctggtca cgccggctcg cccctccatc ccgcccccta acctcgctat 2520

agtgactgcg agctgttgag ggcgggagag aagggtgtta aagcgaggtg ttggccacgt 2580

atccctccct ccctcactta ccctccctcc ctccctccca tacagagtgt caacccagcg 2640

agtaataggc ttgaatcagt gtcccttgcg ttcgaaaata aggtttgcca tgtatatata 2700

cagacgtttc taagtgtctt tggtgttgca gaagaaaacg ttttacctgt gcgaagctat 2760

aaaagttatt atgtatattt agaggacagt aagtattcct agacgcgcgt gtggcccggg 2820

ctggcaggct tcactggagc ttcacgattg gttcagttta aagattcact gtttcggtaa 2880

taccagtctg gaggcttcac gttcacctgt actctcgcgc cacgtttaat tgacagtatt 2940

acgagaagcg acctgcgctg taccttaatt atccccacat tacctgtccc cttgatcacc 3000

tgaagccagt acctgtgttg atacgagtct cgcctttaag tgacaaaaaa atactccttc 3060

cgtctattct tttccgtcat acctttaaac attcccaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3120

aaaaaaa 3127

<210> 2

<211> 703

<212> PRT

<213> 中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)

<400> 2

Met Pro Thr Leu Gly Asp Leu Thr Leu Pro Pro Gln Pro Pro Thr Asn

1 5 10 15

Thr Arg Asp Leu Asp Leu Ala Leu Asn Leu Thr Thr Leu Trp Thr Thr

20 25 30

Pro Gln Asn Ala Thr Pro Gly Asn Leu Thr Trp Glu Gly Ala Gly Asp

35 40 45

Gly Glu Ala Gly Glu Glu Gly Arg Gly Thr Gly Ser Pro Pro Ala Asn

50 55 60

Trp Trp Gly Leu Val Ala Leu Leu Val Val Leu Leu Thr Leu Phe Gly

65 70 75 80

Asn Ile Leu Leu Ile Leu Ala Ile Ser Trp Asp Arg Arg Leu Gln Asn

85 90 95

Met Thr Asn Tyr Phe Leu Leu Ser Leu Ala Val Thr Asp Leu Met Val

100 105 110

Ala Ser Leu Val Met Pro Leu Ser Ile Val Val Leu Val Leu Gly His

115 120 125

Phe Pro Phe Ser Ser Glu Leu Cys Leu Leu Trp Ile Ser Leu Asp Val

130 135 140

Leu Phe Cys Thr Ala Ser Ile Met His Leu Cys Thr Leu Ser Val Asp

145 150 155 160

Arg Phe Leu Ser Leu Arg Tyr Pro Ile Lys Phe Gly Arg His Lys Thr

165 170 175

Arg Arg Arg Val Val Leu Lys Ile Val Leu Val Trp Cys Leu Ser Leu

180 185 190

Ala Ala Ser Leu Pro Leu Ser Leu Met Tyr Ala Thr Ala Pro His Thr

195 200 205

Thr Ile Val Asp Gly Val Cys Gln Ile Pro Val Ser Leu Phe Gln Ile

210 215 220

Ile Gly Ser Val Ile Cys Phe Tyr Ile Pro Leu Val Ile Met Leu Val

225 230 235 240

Thr Tyr Ala Leu Thr Val Arg Leu Leu Ser Gln Lys Gln Ser Glu Leu

245 250 255

Gln Ser Ser Val Leu Glu Pro Ser Ser Ala Ser Ala Ser Pro Ser Pro

260 265 270

Arg Ser Leu Arg Trp Lys Arg Leu Leu Cys Lys Thr Thr Ser Thr Leu

275 280 285

Ser Thr Ser Thr Ala Val Ser Leu Thr Asp Gly Glu Val Ser Glu Ala

290 295 300

Thr Cys Arg Pro Glu Gln Cys Gly Pro His Ala Lys Leu Arg Arg Leu

305 310 315 320

Gly Ser Ser Pro Gln Arg Arg Pro Pro Leu Val Arg Tyr Ala Ser His

325 330 335

His Tyr His His Arg Ser Ala Leu Val Arg Ala Asp Gly Cys Asn Leu

340 345 350

Arg Gly Tyr Ser Thr Arg Glu Leu Arg Ala Ala Glu Glu Gln Gln Gln

355 360 365

Gln Gln Gln Gln Gln Ser Phe Pro Thr Leu Ser Ala Ser Ala Pro Ala

370 375 380

Tyr Glu Met Ser Val Leu Pro Pro Ala Ala Arg Ser Ala Pro Ser Ser

385 390 395 400

Thr Thr Thr Ser Pro Leu His Arg Arg His Pro His Leu His Pro Asp

405 410 415

Asp Ala Ala Gly Gly Gln Glu Glu Ser Ser Thr Ser Pro Thr Tyr Glu

420 425 430

Gln Asn Gly Asp Pro Arg Gly Gly Ala Arg Glu Arg Cys Gly Glu Glu

435 440 445

Cys Gly Gly Gly Ala Arg Ala Ala Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gln Val

450 455 460

Ala Val Pro Cys Ser Cys Ala Pro Arg Phe Phe Leu Glu Asp Met Lys

465 470 475 480

Ala Gln Asp Ser Gln Cys Glu Glu Cys Ala Ala Pro Gln Pro Ser Glu

485 490 495

Val Ala Val His Tyr Ser Ala Pro Arg Pro Arg Arg Ser Arg Asp Ala

500 505 510

Ser Gln Pro Arg Gly Gly Ala Ser Trp Cys Cys Cys Cys Cys Pro Ala

515 520 525

Ala Phe Ile Arg Leu Thr Arg Arg Arg His Ala Gln Pro Gly Ala Pro

530 535 540

Leu Ser Ser Pro Trp His Glu Gly Ser Ser Pro Pro Arg Pro Thr Gln

545 550 555 560

Asp Leu Val Thr Arg Ser Thr Leu Arg Pro Gly Gly Gln Val Thr Thr

565 570 575

Thr Leu Leu Gln Lys Gly Gly Ser Ser Glu Ala Gly Ser Ser Pro Arg

580 585 590

Gly Leu Trp Arg Gln Gln Ser Cys Ser Ala Ser Leu Lys Phe Val Ser

595 600 605

Ser Lys Arg His Gly Arg Asn Leu Arg Met Glu Gln Lys Ala Thr Lys

610 615 620

Val Leu Gly Val Val Phe Phe Thr Phe Val Leu Leu Trp Ala Pro Phe

625 630 635 640

Phe Ile Ala Asn Val Leu Ile Ser Cys Gly Ala His Ile Gly Glu Glu

645 650 655

Met Ile Asn Leu Val Thr Trp Leu Gly Tyr Ala Ser Ser Met Val Asn

660 665 670

Pro Phe Phe Tyr Thr Phe Phe Asn Lys Thr Phe Arg Gln Thr Phe Leu

675 680 685

Lys Ile Met Lys Cys Asp Ile Lys Thr Thr Arg Lys Tyr His Leu

690 695 700

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Eriocheirsinensis)

<400> 3

ttcatcgcca acgtcctcat ctcg 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Eriocheirsinensis)

<400> 4

ttcaacaaga ccttcagaca aacg 24

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Eriocheirsinensis)

<400> 5

gatgaccagc ggaatgtaga agca 24

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Eriocheirsinensis)

<400> 6

ggcgttctgg ggagtggtcc aaaga 25

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Eriocheirsinensis)

<400> 7

ctaatacgac tcactatagg gc 22

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Eriocheirsinensis)

<400> 8

atgcccaccc taggggacct cac 23

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Eriocheirsinensis)

<400> 9

tcagaggtgg tacttccttg tggtcttgat gtc 33

Claims (9)

1.一种中华绒螯蟹5-HT2B受体基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种如权利要求1所述的中华绒螯蟹5-HT2B受体基因所编码的蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种克隆中华绒螯蟹5-HT2B受体基因的方法，步骤如下：

(1)根据中华绒螯蟹5-HT2B受体的表达序列标签，分别设计3’-5-HT2B RACE上游引物和5’-5-HT2B RACE下游引物，将提取的中华绒螯蟹总RNA反转录成3’-cDNA和5’-cDNA第一链，以此为模板，分别采用3’-5-HT2B RACE上游引物、5’-5-HT2B RACE下游引物和通用引物进行3’和5’末端侧翼片段RACE，将得到的3’和5’末端侧翼片段分别与载体连接，克隆并测序；

(2)将测序得到的末端侧翼片段与5-HT2B受体的表达序列标签进行拼接获得拼接的5-HT2B受体的全长序列，以该拼接的序列为模板，再在5’和3’非编码区设计特异性基因全长序列验证引物对全长进行验证，并消除个别不确定碱基，最终获得中华绒螯蟹5-HT2B基因的全长序列。

4.根据权利要求3所述的克隆中华绒螯蟹5-HT2B受体基因的方法，其特征在于，所述3’-5-HT2B RACE上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

5.根据权利要求3所述的克隆中华绒螯蟹5-HT2B受体基因的方法，其特征在于，所述5’-5-HT2B RACE下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。

6.根据权利要求3所述的克隆中华绒螯蟹5-HT2B受体基因的方法，其特征在于，所述载体为pM19T质粒。

7.根据权利要求3所述的克隆中华绒螯蟹5-HT2B受体基因的方法，其特征在于，所述步骤1)中通用引物如SEQ ID NO:7所示。

8.根据权利要求3所述的克隆中华绒螯蟹5-HT2B受体基因的方法，其特征在于，所述步骤2)中基因全长序列验证引物如SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示。

9.根据权利要求3所述的克隆中华绒螯蟹5-HT2B受体基因的方法，其特征在于，所述中华绒螯蟹总RNA提取自胸神经节和肠道组织。

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