CN110592095A - 曼氏无针乌贼维甲酸x受体基因的克隆和表达 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种曼氏无针乌贼维甲酸X受体基因的克隆和表达，属于基因工程技术领域，采用RACE技术克隆获得了曼氏无针乌贼维甲酸X受体基因的CDS区核苷酸序列，如SEQ ID NO:1所示，全长1239bp，编码一个由412个氨基酸组成的蛋白质，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。采用荧光定量RT‑PCR技术分析维甲酸X受体基因在在幼年期、性腺发育成熟产卵前期、产卵中期、产卵后濒死期的的如下组织中均有表达：肌肉、胃、心脏、肠、表皮，鳃、脑、胰、肝、视叶和视腺。本发明维甲酸X受体基因或其编码的蛋白质可用于曼氏无针乌贼的抗衰老中。

Description

曼氏无针乌贼维甲酸X受体基因的克隆和表达

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种曼氏无针乌贼维甲酸X受体基因的克隆和表达。

背景技术

核受体超家族具有调控胚胎的健康发育、内环境稳定以及保持生理稳态的作用。维甲酸X受体(retinoid X receptor，RXR)具有典型的核受体结构，作为配体依赖型转录因子在生物个体发育、细胞分化、新陈代谢和细胞凋亡中发挥重要作用。与其他核受体类似，维甲酸X受体分为A/B、C、D、E和F 5个不同的结构区域，其中，A/B区含有一个本身有活性的配体非依赖性的转录激活域(AF1)，与基因的表达调控有关；C区最为保守，也称为DNA结合区(DNA Binding Domain，DBD)；D区或称铰链区，连接C和E区；E区为配体结合区(LigandBinding Domain，LBD)，该区含一个配体依赖性的转录激活域(AF2)，在转录调节中起着非常重要的作用；F区与受体稳定性及抗原性有关。

曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)属于软体动物门、头足纲、十腕目、乌贼科、无针乌贼属，在浙江省历史上达到最高年产量6000吨，占当时全省海洋捕捞产量的近10％，各方面价值颇高。养殖的乌贼一年甚至可以繁殖两次，在3～5月与9～11月，6个月的时间可生长达200g，商品价值很高，在我国现在海水养殖品种中，它的潜力不容小觑。但与普通鱼虾类相比，它的怀卵量明显不高，平均怀卵量都不到2000粒，产卵量只有40％，由于产完卵就死亡的特性，当亲本死亡时，体内还残留了大量来不及产出的卵，这造成了很大浪费，给养殖户造成了直接的经济损失。研究表明RXR与曼氏无针乌贼的生理调控密切相关，虽然到目前为止人们对的曼氏无针乌贼基本功能有了一定的了解，但的在曼氏无针乌贼生长和产卵中的作用机制尚不明确，许多工作仍需开展。为了分析RXR在曼氏无针乌贼生长和产卵过程中的作用与调节机制，从分子水平出发探究RXR基因在发育、生殖、衰老过程中的表达显得尤为必要。这为可促进曼氏无针乌贼生长和繁殖方面的研究，进一步阐明的生理功能，丰富和完善曼氏无针乌贼内分泌的调控理论，解决养殖中所遇到的与生理学相关的难题提供基础理论依据，为养殖业带来更多效益。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种曼氏无针乌贼维甲酸X受体基因。

本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：曼氏无针乌贼维甲酸X受体基因，其CDS区核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明的又一目的，在于提供一种上述曼氏无针乌贼维甲酸X受体基因的克隆方法，包括：

从组织样品中提取总RNA，然后将提取的总RNA反转录成cDNA第一链；

以cDNA为模板进行PCR扩增，然后纯化PCR产物；

采用RACE技术获得如SEQ ID NO:1所示的曼氏无针乌贼维甲酸X受体基因的CDS区核苷酸序列。

其中，上述PCR扩增用引物为：SjRXR-F：5′-ATGGCGCATCTGTCTCGCAC-3′；SjRXR-R：5′-GCACGTAGCTGGCTCGTGAG-3′。

上述PCR扩增的反应体系为：2×Es Taq Master Mix 10μL，上下游引物各0.8μL，cDNA 200ng，ddH₂O补足至20μL。

上述PCR扩增反应条件：94℃2min；94℃30s，65℃30s，72℃40s，30个循环；72℃2min。

本发明的又一目的，在于提供一种上述曼氏无针乌贼维甲酸X受体基因的表达，贼维甲酸X受体基因在曼氏无针乌贼幼年期、性腺发育成熟产卵前期，产卵中期，产卵后濒死期的如下组织中均有表达：肌肉、胃、心脏、肠、表皮，鳃、脑、胰、肝、视叶和视腺。

其中，上述曼氏无针乌贼维甲酸X受体基因在产卵中期的视腺组织中表达量最高。

本发明的又一目的，在于提供一种上述曼氏无针乌贼维甲酸X受体基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明的又一目的，在于提供一种上述曼氏无针乌贼维甲酸X受体基因或蛋白质在曼氏无针乌贼抗衰老中的用途。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明采用RACE技术克隆获得了曼氏无针乌贼维甲酸X受体基因的CDS区核苷酸序列，全长1239bp，编码一个由412个氨基酸组成的蛋白质，分子式为C₂₀₂₂H₃₁₉₉N₅₄₉O₆₂₂S₂₇，为亲水性蛋白；本发明采用荧光定量RT-PCR技术探索了曼氏无针乌贼维甲酸X受体基因在幼年期、性腺发育成熟产卵前期、产卵中期、产卵后濒死期的的如下组织中均有表达：肌肉、胃、心脏、肠、表皮，鳃、脑、胰、肝、视叶和视腺，为进一步开展头足类维甲酸X受体基因功能研究提供基础。

本发明采用了上述技术方案提供一种曼氏无针乌贼维甲酸X受体基因的克隆和表达，弥补了现有技术的不足，设计合理，操作方便。

附图说明

图1是本发明实施例1中曼氏无针乌贼维甲酸X受体基因CDS区及推导的氨基酸序列；

图2是本发明实施例1中曼氏无针乌贼维甲酸X受体基因CDS区编码蛋白结构域；

图3是本发明实施例1中曼氏无针乌贼维甲酸X受体基因编码的蛋白亲(疏)水性；

图4是本发明实施2中曼氏无针乌贼维甲酸X受体基因的CDS氨基酸序列与其他物种CDS氨基酸序列比对；

图5是本发明实施例2中曼氏无针乌贼维甲酸X受体基因CDS氨基酸序列构建的ML系统进化树；

图6是本发明实施例3中曼氏无针乌贼维甲酸X受体基因在四个时期中的表达；

图7是本发明实施例3中曼氏无针乌贼维甲酸X受体基因在四个时期11个组织中的表达。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。

下面，结合具体实施例对本发明实施方式作进一步说明。

实施例1：

曼氏无针乌贼维甲酸X受体(RXR)基因的克隆

1.实验材料：

实验所用曼氏无针乌贼于2017年10月中旬采自福建省福鼎市沙埕镇曼氏无针乌贼苗种繁育和养成示范基地。分别在曼氏无针乌贼生长的4个阶段(即幼年期、性腺发育成熟产卵前期，产卵中期，产卵后濒死期)选取体型大小相近的健康乌贼各30头，根据养殖时间、形态观察及解剖观测准确区分乌贼处于何种生长阶段。解剖分别取其肌肉、鳃、胃、心脏、胰、表皮、肠、肝脏、脑、视叶和视腺组织样品，保存于-80℃超低温冰箱中备用。

实验试剂Trizol、荧光定量PCR试剂Premix ExTaqTM、pMD18-T Vector、E.coliDH5均购自大连宝生物工程有限公司；Transcriptor FirstStrand cDNA SynthesisKit试剂盒购自Roche公司；SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit购自Clontech公司；5′RACE System for Rapid Amplification of cDNAEnds Version2.0购自Gibco BRL公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。

2.总RNA的提取和cDNA的反转录

将曼氏无针乌贼活体解剖，分别取出所需的各个组织(肠、胰脏、鳃、皮肤、肌肉、肝脏、脑、胃、视叶、视腺、心脏)，放入含有RNA保存液的冻存管中，置于液氮中速冻，随后放入-80℃超低温冰箱中保存，用于RNA的提取。本实施例采用试剂盒法提取RNA，使用Omega公司的试剂盒Total RNA Kit II(货号：R6934)。取无菌离心管并做好标记，每个离心管取50～100mg组织，依次放入研磨器中，加入1mLTrizol充分匀浆，室温静置5min。加入200μL氯仿，4℃、12000r/min，离心15min。吸取上清液，加入异丙醇上下颠倒混匀，置于冰上，静置10min4℃，12000r/min,离心10min。弃去上清，加入1mL75％乙醇洗涤。4℃、7500r/min，离心10min，保留沉淀，室温下干燥5min，加入25μL DEPC水溶解。用紫外分光光度计和1.5％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的浓度和完整度。将提取的RNA放置于-80超℃低温冰箱中保存备用。之后使Roche公司的反转录试剂盒(Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit)将提取的RNA反转录为cDNA，操作方法按试剂盒说明书进行。

3.PCR扩增曼氏无针乌贼RXR基因全CDS核苷酸序列

根据获得的曼氏无针乌贼转录组测序及注释信息，初步获得RXR基因的部分cDNA片段，在NCBI上进行Blast并设计引物SjRXR-F、SjRXR-R(表1)。

表1 PCR扩增用引物序列

Primer	Sequences
		SjRXR-F	5′-ATGGCGCATCTGTCTCGCAC-3′
SjRXR-R	5′-GCACGTAGCTGGCTCGTGAG-3′

将获得曼氏无针乌贼RXR基因的部分cDNA片段，按照2×Es Taq Master Mix试剂盒使用说明书建立20μL反应体系：2×Es Taq Master Mix 10μL，上下游引物各0.8μL，cDNA200ng，ddH₂O补足至20μL。反应条件：94℃2min；94℃30s，65℃30s，72℃40s，30个循环；72℃2min。之后对目的片段进行回收纯化、测序，测序结果经比对与转录组数据相同，即作为后续RACE步骤的核心片段。

4.RACE获得曼氏无针乌贼RXR基因CDS区的全长序列

根据已获得的RXR基因片段设计3'-RACE上游引物RXR-3F、下游引物RXR-3R，

设计引物扩增基因的5′端和3′端，所用引物见表2。

表2 RACE用引物序列

3′RACE：使用逆转录酶SMARTScribe^TM Reverse Transcriptase和接头引物3′CDSprimer A对总RNA进行逆转录合成3′RACE-cDNA；使用引物RXR-3F1和UPM，以合成的cDNA为模板进行第一轮PCR扩增；将第一轮PCR扩增产物稀释50倍后用引物RXR-3F2和UPM进行第二轮PCR扩增；将第二轮PCR产物进行电泳并对目的条带进行切胶回收纯化。

5′RACE：使用SUPERSCRIPT II RT酶和引物5′CDS primer A对总RNA进行目的基因第一链cDNA的合成，使用RNase Mix对合成的5′RACE-cDNA进行去RNA处理；使用DNA纯化系统GLASSMAX DNA isolation spin cartridges对经RNAase处理过的cDNA进行纯化；使用TdT酶和dCTP对纯化后的cDNA进行末端加上多聚C；使用引物RXR-5R1和试剂盒里面的桥连铆钉引物AAP对已经加dC尾的cDNA进行PCR第一轮扩增；使用引物RXR-5R2和试剂盒里面带的桥连通用扩增引物AUAP进行巢式PCR第二轮扩增。

5.PCR扩增产物的克隆及测序

将获得的PCR扩增产物用1％琼脂糖电泳检测PCR产物，找到符合预期大小的条带，用凝胶回收试剂盒进行割胶回收纯化，具体操作步骤如下：

(1)跑胶，利用凝胶成像系统观察目的条带，找到条带后用干净的刀片将其切下，放入RNAase free的1.5mL离心管中，称其重量，按每克胶加1mL SolutionⅠ的计算量，向装有胶块的离心管中加入SolutionⅠ，56℃水浴10min，每2-3min震荡一次帮助加速溶解；

(2)将含有琼脂糖胶的SolutionⅠ混合液转移至离心柱中，10000rpm离心2min，若混合液过多，可分多次进行；

(3)收集(2)中的溶液，并将其移入吸附柱AC中，相同离心率条件下，离心1min，弃废液，后将离心柱放回收集管中；

(4)向吸附柱中加入700μL漂洗液，10000rpm离心1min，弃废液，将离心柱放回到收集管中；

(5)为尽可能地去除漂洗液，再次加入500μL漂洗液至吸附柱中，相同离心率条件下，离心1min，倒废液，将离心柱放回管中，离心1min；

(6)换一个干净的收集管，在吸附膜的中间部位加30μL DEPC处理水，12000rpm条件下离心2min，收集溶液；

(7)取4μL回收的DNA检测，5μL用于连接，其余-20℃保存。

然后进行目的片段的克隆，具体操作步骤如下：

(1)PCR产物与pMD18-T Vector(TaKaRa)16℃连接过夜，之后与感受态细胞E.coliDH5混匀，冰上静置30min，42℃处理90s，迅速冰浴静置5min；

(2)加入1mL LB液体培养基，将含有菌液的离心管置于恒温摇床中，37℃200rpm摇床1h；

(3)将离心管从恒温摇床中取出，并置于离心机中，室温4000rpm离心5min，除去1mL上清液，枪头吹吸重悬菌体；

(4)涂布于含有X-Gal、IPTG以及氨苄的LB固体培养基上，置培养箱中37℃培养16h；

(5)次日在长出的蓝白斑菌落中挑选白斑，接种于含氨苄的LB液体培养基中继续振荡培养4h后，进行菌液PCR验证并筛选出阳性克隆后进行测序。测序结果经比对与转录组数据相同，即作为后续RACE步骤的核心片段。

6.生物信息学分析

将得到的测序结果用SeqMan软件进行校正和拼接，获得曼氏无针乌贼RXR基因CDS区核酸序列，利用EditSeq软件将得到的核苷酸序列翻译成氨基酸序列。

使用NCBI的Blastp(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blastx)进行同源性比对；DNAMAN进行多序列比对；使用MEGA6.0软件构建曼氏无针乌贼RXR氨基酸序列与其他物种氨基酸序列的系统进化树。利用ExPasy的ProtParam tool进行其氨基酸序列的物理参数进行分析；使用SignalP4.1 server预测信号肽；TMHMM在线软件进行跨膜结构的分析；利用SMART数据库分析结构域；使用SWISS-MODLE对RXR编码的氨基酸序列进行三维结构预测。

测序结果拼接获得完整的曼氏无针乌贼RXR(SjRXR)基因的CDS区核酸序列如SEQID NO:1或图1所示(图1中：*表示终止信号；灰色阴影为HOLl家族结构域)，全长为1239bp，GenBank数据库登录号为MK041210.1，编码一个由412个氨基酸组成的蛋白质(氨基酸序列如SEQ ID NO:2或图1所示)，分子式为C₂₀₂₂H₃₁₉₉N₅₄₉O₆₂₂S₂₇。ProtParam tool分析表明，编码的蛋白质的分子量为46.01kD，理论等电点为5.63，带有负电的氨基酸残基为49个(Asp和Glu)，带有正电的氨基酸残基为39个(Arg和Lys)，不稳定系数为43.26，亲水性平均数为-0.303，脂溶指数为76.43。使用Signal P 4.1server预测信号肽，结果显示，曼氏无针乌贼RXR基因的CDS区核酸序列编码的蛋白不含有信号肽，因此推测RXR编码蛋白属于非分泌型蛋白。使用TMHMM在线软件分析，SjRXR基因的CDS区核酸序列翻译的蛋白质结构中无跨膜结构,属于非跨膜蛋白。利用SMART数据库对结构域检测分析显示(图2，图中标尺长度为CDS区蛋白的氨基酸长度)，SjRXR基的CDS区核酸序列编码的蛋白质包含1个HOLl结构域。使用SWISS-MODLE对RXR基因的CDS区编码的氨基酸序列进行三维结构预测，结果显示，SjRXR基因的CDS区基因编码的蛋白三级结构由较多的α螺旋、少量β折叠和无规卷曲折叠而成，利用ExPASy的Protscale程序对蛋白进行疏水性分析，如图3(图中横坐标为氨基酸的位置，纵坐标为疏水性得分(亲、疏水性分别用负值、正值表示))，可以发现，亲水性部分大于疏水性部分，可以预测蛋白为亲水性蛋白，这也和核受体蛋白性质相一致。

实施例2：

将曼氏无针乌贼RXR基因的CDS区核酸序列编码的氨基酸序列与GenBank蛋白数据库作Blast比对进行同源性分析(如图4)，各物种序列登录号：Sepiella_japonica(MK041210.1)：曼氏无针乌贼；Octopus bimaculoides(XP_014782898.1)：加州双斑蛸；Pomacea canaliculata(XP_025106188.1)：福寿螺；Mytilus galloprovincialis(ABU89803.1)：紫贻贝；Mizuhopecten yessoensis(XP_021376120.1)：虾夷扇贝；Aplysiacalifornica(XP_012939845.1)：加州海兔。从图4中可以发现，曼氏无针乌贼(Sepiella_japonica)与加州双斑蛸(Octopus bimaculoides)同源性最高，为69％；与福寿螺(Pomaceacanaliculata)、紫贻贝(Mytilus galloprovincialis)、虾夷盘扇贝(Mizuhopectenyessoensis)、和加州海兔(Aplysia californica)的相似性分别为56％、52％、43％、47％。

基于曼氏无针乌贼RXR基因的CDS区核酸序列编码的氨基酸序列，利用MEGA6软件以NJ法构建了系统进化树(如图5，图中分叉处数值表示1000次重复抽样所得到的置信度；标尺长度表示每个位点发生0.1次置换)。可以看出，曼氏无针乌贼与加州双斑蛸亲缘关系最近，它们同属于软体动物门头足纲，最先聚为一支，然后与盘扇贝属的虾夷盘扇贝聚在一起，再与软体动物门双壳纲的紫贻贝、牡蛎科的美洲牡蛎聚在一起，最后与长牡蛎聚为一支。该结果显示了曼氏无针乌贼RXR基因的分子进化地位与其生物学分类地位大体保持一致。

实施例3：

曼氏无针乌贼各组织RXR基因的表达

以曼氏无针乌贼RXR cDNA的保守区设计荧光定量PCR引物(如表3)，先以各组织cDNA为模板进行PCR扩增，再对PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，若观察结果条带单一，则该引物能用于后续实验。以β-actin基因作为内参基因，以曼氏无针乌贼四个时期(幼年期，性腺发育成熟产卵前期，产卵中期，产卵后濒死期)不同组织的cDNA作为模板，使用FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)进行实时荧光定量RT-PCR分析。以每管10μL的体系配制反应液：0.4μL cDNA sample(100ng/μL)、0.4μL qSjRXR-F、0.4μL qSjRXR-R、5μLPremix Ex Taq^TMⅡ(TaKaRa)、0.2μL ROX Reference Dye II、3.6μL ddH₂O。反应程序为：95℃10min，95℃15s，60℃45s，40个循环；95℃15s，60℃1min，95℃30s。为保证实验结果的准确性，加样时每个样品及内参均设置3个重复，并判断反应特异性。通过荧光定量PCR仪器收集各组织的目的基因表达水平数据，采用2^-△△CT法对基因的相对表达量进行分析。利用SPSS17.0软件进行单因素显著性差异分析，最后利用Origin软件对得到的数据进行处理，绘制柱状图并导出。

表3曼氏无针乌贼各组织RXR基因荧光定量PCR中使用的引物

荧光定量PCR检测RXR基因在曼氏无针乌贼的四个生长时期的表达情况如图6所示，从图6中看出，RXR基因在这4个生长阶段均有表达，从幼乌贼到性成熟产卵前，再到产卵中，基因表达量逐渐增加，呈上升趋势，产卵中表达量达到最高，而后到死亡前表达量又有所下降。产卵前、产卵中表达量与幼体、濒死前相比差异显著(P<0.05)。这可能是可能与曼氏无针乌贼在幼体时期时正处于细胞增殖期间有关。曼氏无针乌贼RXR基因在从幼乌贼期到产卵期之间表达量大幅提高，这段时期雌乌贼的卵巢组织及卵细胞逐渐发育成熟，说明促性腺激素的增长可能使RXR蛋白含量上调。在产卵到产卵后濒死前这段时期，RXR基因的相对表达量有所降低，这可能说明了其对衰老的指示作用。

荧光定量PCR检测曼氏无针乌贼RXR基因在各时期各组织中的表达如图7所示，从图7中看出，RXR基因在各时期各组织中均有表达；在同一时期，RXR在肌肉、胃和心脏中表达量较低，在肠、表皮，鳃中表达量中等，在脑、胰、肝、视叶和视腺中表达量较高；与幼乌贼时期相比，RXR基因表达量在性成熟产卵前期的鳃、胰、肝，脑出现了显著性差异(P<0.05)，在视叶，视腺中出现了极显著性差异(P<0.01)。在产卵前期到产卵中期，在脑中的表达量出现了下降(P<0.01)，在胃(P<0.01)、胰(P<0.05)、视腺(P<0.01)中出现了上升趋势。在产卵中期到产卵后濒死期，肌(P<0.05)、肠(P<0.05)、心(P<0.01)、胰(P<0.01)中表达量上升，视叶(P<0.01)，视腺中表达量降低(P<0.05)；此外，RXR基因在产卵中视腺组织中表达量最高，这可能是因为：视腺是与生殖调控有关的内分泌器官，可以调节性腺的发育和成熟以及其他生理行为，而曼氏无针乌贼RXR基因在视腺中的表达具有时期差异性，表达量在产卵后下降，说明RXR基因在其中具有重要的周期调节、控制细胞衰老和凋亡的多效性功能。

上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。

以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

序列表

<110> 浙江海洋大学

<120> 曼氏无针乌贼维甲酸X受体基因的克隆与表达

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1239

<212> DNA

<213> 曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)

<400> 1

atgaaaactg aacctgttga gaacaatata gccaatggcg tgcaaccgag tgcagtcatg 60

gatggcatag gagtgggtaa catgatggca ccaaatggta tttcaaatgg tatcattgcc 120

aatggtattg ctagcagtgg tgttgtcagc agtgcagctg atatcatccc agcaaatatg 180

gtcaacacaa ctgccaatgg gctcccaaat ggaatccacg aaggctgtac tgaaaggatc 240

tctactggca caaatagcaa caaggacaca agcccctcgt cctttgtaat gcctgagacg 300

cctaattcta cctcatctgc agcccctact ccccagacac catcacattt tgatgaatca 360

cagtcagtca tcaaagctga gcccaagttt tccccttgtc aaattggaag tcagagtata 420

cctaagttct taattgataa aatcatcgag gaaggacgac aggagccatc agaacctcga 480

aaaaagctga ttgagcaagt cactgtaact attgttgagg ctcatatgat gacatgtcgg 540

gtgacacatg atgcagtctt ggaggcctac cagaggtggg aagagaataa gagtaaaatc 600

actgcgtctt tacagactca agagagtgcc tctgaacata tgtgggggca gttcctctct 660

aatatggtgc ctgaaatcac aaatgttgtc aaattttgta aacgtctccc aggtttttca 720

gagattgatc aagaggacca aatcaaatta atcaagcaag ggacgtttga agtcatgctg 780

gcaaggttct gcatgttggt caaccatgac aactacacca tgtttgatcc agacatgaaa 840

atgcaatgcc caagagaaat aatccgagcc atgccactgg ggaagttcct tgaggagttc 900

ttttcaatgg cagaaacctt caaccctttg aagcttacag atggcgaaat tgggctcttt 960

acatcagtct tgattatatg tccagatcgt caaaatcttt ctggagtaaa agctatatct 1020

aaaatacaag gactcttttt acaagccttg tataataaaa taaaacacac tcatgaggat 1080

tatgacacat tgtttgaaag ccttatccga acaattccaa tgttccgtga attcaaccat 1140

cagcactcag tgtcactcaa caacatccgc atgaagtcaa caaagagtcg atttgatttt 1200

cctgatctgc acaaagaagt gtttgatttc agaatgtaa 1239

<210> 2

<211> 412

<212> PRT

<213> 曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)

<400> 2

Met Lys Thr Glu Pro Val Glu Asn Asn Ile Ala Asn Gly Val Gln Pro

1 5 10 15

Ser Ala Val Met Asp Gly Ile Gly Val Gly Asn Met Met Ala Pro Asn

20 25 30

Gly Ile Ser Asn Gly Ile Ile Ala Asn Gly Ile Ala Ser Ser Gly Val

35 40 45

Val Ser Ser Ala Ala Asp Ile Ile Pro Ala Asn Met Val Asn Thr Thr

50 55 60

Ala Asn Gly Leu Pro Asn Gly Ile His Glu Gly Cys Thr Glu Arg Ile

65 70 75 80

Ser Thr Gly Thr Asn Ser Asn Lys Asp Thr Ser Pro Ser Ser Phe Val

85 90 95

Met Pro Glu Thr Pro Asn Ser Thr Ser Ser Ala Ala Pro Thr Pro Gln

100 105 110

Thr Pro Ser His Phe Asp Glu Ser Gln Ser Val Ile Lys Ala Glu Pro

115 120 125

Lys Phe Ser Pro Cys Gln Ile Gly Ser Gln Ser Ile Pro Lys Phe Leu

130 135 140

Ile Asp Lys Ile Ile Glu Glu Gly Arg Gln Glu Pro Ser Glu Pro Arg

145 150 155 160

Lys Lys Leu Ile Glu Gln Val Thr Val Thr Ile Val Glu Ala His Met

165 170 175

Met Thr Cys Arg Val Thr His Asp Ala Val Leu Glu Ala Tyr Gln Arg

180 185 190

Trp Glu Glu Asn Lys Ser Lys Ile Thr Ala Ser Leu Gln Thr Gln Glu

195 200 205

Ser Ala Ser Glu His Met Trp Gly Gln Phe Leu Ser Asn Met Val Pro

210 215 220

Glu Ile Thr Asn Val Val Lys Phe Cys Lys Arg Leu Pro Gly Phe Ser

225 230 235 240

Glu Ile Asp Gln Glu Asp Gln Ile Lys Leu Ile Lys Gln Gly Thr Phe

245 250 255

Glu Val Met Leu Ala Arg Phe Cys Met Leu Val Asn His Asp Asn Tyr

260 265 270

Thr Met Phe Asp Pro Asp Met Lys Met Gln Cys Pro Arg Glu Ile Ile

275 280 285

Arg Ala Met Pro Leu Gly Lys Phe Leu Glu Glu Phe Phe Ser Met Ala

290 295 300

Glu Thr Phe Asn Pro Leu Lys Leu Thr Asp Gly Glu Ile Gly Leu Phe

305 310 315 320

Thr Ser Val Leu Ile Ile Cys Pro Asp Arg Gln Asn Leu Ser Gly Val

325 330 335

Lys Ala Ile Ser Lys Ile Gln Gly Leu Phe Leu Gln Ala Leu Tyr Asn

340 345 350

Lys Ile Lys His Thr His Glu Asp Tyr Asp Thr Leu Phe Glu Ser Leu

355 360 365

Ile Arg Thr Ile Pro Met Phe Arg Glu Phe Asn His Gln His Ser Val

370 375 380

Ser Leu Asn Asn Ile Arg Met Lys Ser Thr Lys Ser Arg Phe Asp Phe

385 390 395 400

Pro Asp Leu His Lys Glu Val Phe Asp Phe Thr Met

405 410

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggcgcatc tgtctcgcac 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcacgtagct ggctcgtgag 20

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcatctgtat gctagttgat atcatatgac g 31

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctaatacgac tcactatagg gc 22

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gctgatgcgt cagctgacgt c 21

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

actagagctg acgtgctaga ct 22

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

catgctgaga ttgtcaatga c 21

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agctcgagct catgctgcag 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tgacggtcca tcgagctcat 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atgctccact agctacgtcg 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gtagctgtcg tatcgagcta 20

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gccagttgct cgttacag 18

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gccaacaata gatgggaat 19

Claims (10)

1.曼氏无针乌贼维甲酸X受体基因，其特征在于：其CDS区核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1所述的曼氏无针乌贼维甲酸X受体基因的克隆方法，其特征在于：包括：

从组织样品中提取总RNA，然后将提取的总RNA反转录成cDNA第一链；

以cDNA为模板进行PCR扩增，然后纯化PCR产物；

采用RACE技术克隆获得如SEQ ID NO:1所示的曼氏无针乌贼X受体基因的CDS区核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的曼氏无针乌贼维甲酸X受体基因的克隆方法，其特征在于：所述PCR扩增用引物为：SjRXR-F：5′-ATGGCGCATCTGTCTCGCAC-3′；SjRXR-R：5′-GCACGTAGCTGGCTCGTGAG-3′。

4.根据权利要求2所述的曼氏无针乌贼维甲酸X受体基因的克隆方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应体系为：2×Es Taq Master Mix 10μL，SjRXR-F 0.8μL，SjRXR-R 0.8μL，cDNA200ng，ddH₂O补足至20μL。

5.根据权利要求2所述的曼氏无针乌贼维甲酸X受体基因的克隆方法，其特征在于：所述PCR扩增反应条件：94℃2min；94℃30s，65℃30s，72℃40s，30个循环；72℃2min。

6.权利要求1所述的曼氏无针乌贼维甲酸X受体基因的表达，其特征在于：采用荧光定量RT-PCR技术分析所述维甲酸X受体基因在各个时期各个组织中的表达。

7.权利要求6所述的曼氏无针乌贼维甲酸X受体基因的表达，其特征在于：所述贼维甲酸X受体基因在曼氏无针乌贼幼年期、性腺发育成熟产卵前期，产卵中期，产卵后濒死期的如下组织中均有表达：肌肉、胃、心脏、肠、表皮，鳃、脑、胰、肝、视叶和视腺。

8.根据权利要求6所述的曼氏无针乌贼维甲酸X受体基因，其特征在于：所述曼氏无针乌贼维甲酸X受体基因在产卵中期的视腺组织中表达量最高。

9.权利要求1所述的曼氏无针乌贼维甲酸X受体基因编码的蛋白质，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

10.权利要求1所述的曼氏无针乌贼维甲酸X受体基因或权利要求9所述的蛋白质在曼氏无针乌贼抗衰老中的用途。