CN105647973A - 一种罗氏沼虾的雌雄性别调控方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种调控罗氏沼虾雌雄性别的方法，是在罗氏沼虾胚胎发育期至胚后发育的后期幼体期之前，降低或沉默罗氏沼虾体内序列为SEQ？ID？NO:1的性别蛋白或其衍生蛋白的表达量来完成的。本发明方法攻克目前水产养殖领域虾类全雄化苗种培育中遇到的技术难题，通过RNA干扰技术和基因表达调控技术，进行定向性别控制，诱导虾类动物性别逆转，不仅构建虾类性别控制和单性培育的验证技术体系和平台，而且利用性别可控的雌性亲本培育全雄单性苗种。

Description

一种罗氏沼虾的雌雄性别调控方法

技术领域

本发明属于水产养殖动物性别调控技术领域，具体涉及一种罗氏沼虾的雌雄性别调控方法。

背景技术

我国是世界上虾蟹养殖大国，在沿海地区虾蟹的养殖形成了庞大的产业，成为当地经济的重要支柱，推动农民生活水平提高。在虾蟹类的生长过程中，雌性和雄性个体存在着巨大的差异。罗氏沼虾在生长过程中存在雌雄两态性，在相同的养殖条件下，雄虾体重是雌虾的2-4倍。利用这种雄性特征的优势开展全雄单性养殖具有很好的产业前景，提高水产养殖效益。

动物的性别决定是一个可塑的生物发育过程。性别决定分化发育过程中原始生殖腺开关性别决定相关基因，随后开启雌雄特异的相关基因发育成雄性或雌性，并在多种基因的网络调控体系下进行性腺的发育。因此，可以通过调控动物体内的性别决定相关基因或雌雄特异的相关基因表达水平，从而诱导获得雌雄性别可控的动物个体。罗氏沼虾的ZW-ZZ染色体性别决定机制具有不完全性，同时受环境、上位或其他遗传因素影响。因此，利用分子或化学手段，在沼虾性别分化关键时期调节雄性沼虾体内关键性控基因的表达，可使雄性个体发生性别逆转，获得假雌个体，开展雌性性别的调控。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种调控罗氏沼虾雌雄性别的技术方法，实现虾类全雄苗种生产技术，尤其是罗氏沼虾的单性全雄苗种的培育技术。

本发明的方法，是在罗氏沼虾胚胎发育期至胚后发育的后期幼体期之前，降低或沉默罗氏沼虾体内序列为SEQIDNO:1的性别蛋白或其衍生蛋白的表达量来完成的；

作为优选，是在胚胎发育的原肠胚至溞状幼体期、胚后发育的后期幼体早期进行操作；

这里所述的衍生蛋白，是与SEQIDNO:1的性别蛋白具有70％或以上同源性，且与SEQIDNO:1的性别蛋白的功能相同的蛋白；

所述的降低或沉默罗氏沼虾体内序列为SEQIDNO:1的性别蛋白或其衍生蛋白的表达量；是通过降低编码性别蛋白基因的表达量来完成；

作为实施例的一种优选，是将能干扰性别蛋白编码基因表达的双链RNA分子转入罗氏沼虾体内来实现的；

所述的双链RNA分子，包括正义链和与正义链互补的反义链；其中的正义链与性别蛋白的编码基因cDNA的序列(SEQIDNO:2)部分或全部相同或互补；

作为优选，所述的正义链的核苷酸序列为SEQIDNO:3；

所述的转入罗氏沼虾体内，是通过显微注射、浸泡或投喂方式来完成的；

本发明方法攻克目前水产养殖领域虾类全雄化苗种培育中遇到的技术难题，通过RNA干扰技术和基因表达调控技术，进行定向性别控制，诱导虾类动物性别逆转，不仅构建虾类性别控制和单性培育的验证技术体系和平台，而且利用性别可控的雌性亲本培育全雄单性苗种。

附图说明

图1：双链RNA干扰样品的电泳图；

图2：干扰效率检测图；

图3：罗氏沼虾的雌雄性别检测结果。

具体实施方式

RNA干扰(RNAi)技术是利用体外合成siRNA或dsRNA，输入到动物体内使目的基因沉默，观察目的蛋白缺失后的表观变化。RNA干扰是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的序列特异性基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默。

罗氏沼虾为体外受精，其胚胎发育在雌虾的腹部进行，主要经历卵裂期、囊胚期、原肠期、无节幼体期和溞状幼体期，约20天时间孵化出膜。随后，罗氏沼虾溞状幼体蜕皮11次，经历24-30天的变态发育后成为后期幼体(Post-larval，PL)。本发明涉及的性别相关基因在胚胎发育时期，从进入原肠胚期开始就有高量表达，随着胚胎发育的推进在无节幼体和溞状幼体期都维持一个恒量的转录水平，且在雄虾的生殖腺中有高量的表达。因此，实施RNA干扰的时间是在胚胎发育时期至胚后发育的后期幼体时期。作为优选，实施RNA干扰的时间是胚胎发育的原肠胚至溞状幼体期及胚后发育的后期幼体早期(PL1-PL60)。

实施例1

申请人研究发现了罗氏沼虾中一种与性别有关的基因，其编码的氨基酸序列为SEQIDNO:1；cDNA的序列为SEQIDNO:2；用该基因的部分同源序列SEQIDNO:3及同族基因序列SEQIDNO:4为目标基因分别进行RNA干扰操作；具体步骤如下：

1).RNA干扰样品制备：

根据性别相关基因的cDNA序列设计带有酶切位点的正向引物和反向引物，用于PCR反应扩增获得含有性别相关基因的开放阅读框中的部分核酸序列；抽提罗氏沼虾雄性生殖系统总RNA样品，逆转录合成cDNA，进行PCR扩增，克隆目的基因分子。其主要方法和步骤如下所述：

将成熟雄性罗氏沼虾置于冰浴中约1-2min，使其轻轻麻醉，解剖取雄性生殖系统组织，迅速放到液氮中速冻，然后转移到-80℃长期保存。采用Trizol试剂来进行总RNA的抽提，具体方案如下：称量100mg样品，液氮研磨，加入1ml的Trizol，振荡混匀；4℃，12,000×g，离心10min；转移上清到新的离心管，室温放置5min；加入200μl的氯仿，混匀；4℃，12,000×g，离心15min；转移75-80％的上清到新的离心管，然后加入0.5ml的异丙醇，混匀，室温放置10min；4℃，12,000×g，离心10min；弃上清，然后加入1ml70％的乙醇，混匀；4℃，7,500×g，离心5min；弃上清，空气干燥，加入适量水，4℃溶解过夜。用紫外分光光度计(OD_260/280)测定RNA的浓度和质量。浓度计算公式：RNA(μg/μl)＝OD₂₆₀*0.04*稀释倍数，Ratio＝OD₂₆₀/OD₂₈₀。

利用逆转录试剂盒进行cDNA的合成。逆转录合成cDNA时，12.5μl反应体系中先加入1μgRNA样品和1μl10μMOligodT，混匀离心，置于PCR仪中70℃，5min，立即置于冰上；然后，分别加入2.5μl5×Reactionbuffer，2.5μl10mMdNTPs，0.5μlRibonucleaseInhibitor(HPRI)和0.5μlMMLV逆转录酶，加水补足总体积至12.5μl，混匀离心，置于PCR仪中42℃，60min；-20℃保存待用。

利用PCR扩增的方法克隆目的基因分子，具体方法如下：首先，根据罗氏沼虾性别相关基因的cDNA序列(SEQIDNO:2)设计带有酶切位点的引物RNAi-PF：5’-GCTCTAGAGACACACCCTACATCTTCCAGC-3’(引物扩增位置1428bp-1449bp,下划线为限制性内切酶XbaI的酶切位点)和反向引物RNAi-PR：5’-CGGGATCCAATATCATCCACGTCGCCTACT-3’(引物扩增位置1850bp-1871bp，下划线为限制性内切酶BamHI的酶切位点)。以雄性生殖系统组织的cDNA为模板，进行PCR扩增，反应条件为：94℃变性5min，35个扩增循环(94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min)，最后72℃延伸10min。25μlPCR反应体系中，分别加入2.5μl10×Taq缓冲液，1.5μl25mMMg²⁺，1μl5mMdNTPs，1μl10μMRNAi-PF，1μl10μMRNAi-PR和2μlcDNA模板，0.25μlTaq聚合酶和11.75μl灭菌去离子水。PCR产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳分析，然后采用QIAquickPCRpurificationkit纯化，并作定量分析。

然后，利用pET-T7质粒构建含有性别相关基因片段的表达载体，具体方法如下：利用XbaI和BamHI限制性内切酶对纯化后的PCR产物和pET-T7载体分别进行双酶切。pET-T7载体双酶切时，分别加入1μgpET-T7载体，1μl10×Kbuffer，1μlXbaI限制性内切酶和1μlBamHI限制性内切酶，加水至终体积20μl，37℃反应过夜。PCR产物进行双酶切时，分别加入1μgPCR产物，1μl10×Kbuffer，1μlXbaI限制性内切酶和1μlBamHI限制性内切酶，加水至终体积20μl，37℃反应4hr。酶切后的产物用QIAquickGelExtractionkit纯化后进行电泳检测，定量分析。

随后，将含有基因片段插入的pET-T7表达载体转化到表达型菌株E.coliHT115中，选取含有目的载体的阳性菌落，具体方法如下：PCR产物和pET-T7载体的酶切产物采用DNAligationkit进行连接，并转入感受态细胞E.coliDH5α中。挑选抗性菌落进行PCR检测，引物为T7terminator和RNAi-PF，反应条件同上所述，电泳分析后选取含有目的片段的阳性菌落测序分析插入片段序列的正确性。挑取经鉴定含有正确插入序列的单菌落，接种于LB液体培养基中(含50μg/ml氨苄青霉素)，37℃培养12-16hr，然后采用QIAquickPlasmidMinikit抽提质粒，将该质粒转化到表达型菌株E.coliHT115中，转化和鉴定方法同上所述，鉴定后的质粒命名为pET-T7-性别相关质粒。

最后，将pET-T7-性别相关质粒的E.coliHT115菌落进行培养并诱导其表达双链RNA。通过将表达菌株接种于LB液体培养基中，加入IPTG诱导培养；抽提总RNA，溶解于RNaseA缓冲液变性，冷却复性；加入RNaseA酶切，去除单链RNA；纯化双链RNA，溶解沉淀，所得溶液即为纯化后的双链RNA样品。具体方法如下：将携带双链RNA表达质粒的E.coliHT115接种于5mlLB液体培养基中(含有氨苄青霉素和四环素)，37℃，200rpm，培养过夜；以1：50的比例转接到新鲜的、含有双抗的LB培养基中扩大培养，在同样条件下培养2-3hr；当细菌生长到OD₆₀₀＝0.4-0.6时，加IPTG至终浓度0.4mM，于37℃诱导培养4hr；5,000rpm，4℃离心，收集细菌沉淀，1×PBS漂洗2次，然后加入2mlTrizol试剂，充分振荡混匀，提取菌体中的总RNA，具体方法同上所述；将提取的总RNA溶解于RNaseAbuffer(300mM醋酸钠,10mMTris-HCl,pH8.0)中，85℃变性10min，在水浴中逐渐冷却至室温；在复性后的溶液中加入适量RNaseA，37℃反应约30min,电泳检测；使用酚/氯仿试剂对双链RNA进行分离纯化，制备获得含SEQIDNO:3基因序列的RNA干扰样品。纯化得到的双链RNA经电泳检测(图1)，并定量分析后于-20℃保存，

同时，根据罗氏沼虾性别相关基因的同族基因序列SEQIDNO:4设计带有酶切位点的引物RNAi-PF：5’-CGGGATCCGCCAGATGCTGTCGTCGCT-3’(下划线为限制性内切酶BamHI的酶切位点)和反向引物RNAi-PR：5’-CGGAATTCGCTAATGAGCACACTGGGGGACT-3’(下划线为限制性内切酶EcoRI的酶切位点)，制备RNA干扰样品的方法同上所述。

(2).性别相关基因沉默

从罗氏沼虾育种养殖基地选取体质健壮、附肢完整的罗氏沼虾雄性幼苗，后期幼体早期(PL10-PL40)，体长0.8-1.2cm，进行RNA干扰。利用显微注射的方法，经头胸甲与腹部交界处，第五步足基部腹膜下注射5-10μg双链RNA/只，放回水泥池中继续饲养。每隔一个月再次注射同样的双链RNA样品至同组虾体内，维持RNA干扰的有效性，注射周期为3个月。RNA干扰后，定期取样检测目的基因的表达水平。抽提雄性生殖系统组织RNA，逆转录合成cDNA，利用半定量方法检测目的基因的表达水平，检测RNA干扰后目的基因的表达水平，PCR方法同上所述。

结果表明，用性别相关基因的部分同源序列SEQIDNO:3作为目标基因进行RNA干扰操作后，目的基因的沉默效果很好，基因表达水平明显降低(图2-A)；但以性别相关基因的同族基因序列SEQIDNO:4作为目标基因进行RNA干扰操作后，目的基因的表达量基本不变，干扰效果不明显(图2-B)，因此，作为优选，所述的正义链的核苷酸序列为SEQIDNO:3；

(3).假雌亲本诱导

RNA干扰后的罗氏沼虾于室内水泥池中饲养，体长至3-5cm时抓捕，鉴定雌雄性别情况。利用罗氏沼虾雄性生殖孔作为雌雄性别鉴定指标，第五步足基部存在生殖孔的为雄性虾体，第五步足基部不存在生殖孔的为雌性虾体。与此同时，利用沼虾的性别特异分子标记，对群体中已鉴定性别的雌性个体，进行基因组上的性别验证。雌雄性别鉴定方法包括以下步骤：获得罗氏沼虾的肌肉样品，检测其基因组DNA中一段雌雄性别特异分子的基因片段；存在雌性特异性分子片段的指示该动物个体为雌性沼虾，不存在特异性分子片段的则为遗传学上的雄性沼虾。

在实施了RNA干扰后的全雄沼虾群体中，根据罗氏沼虾雌雄性征差异鉴定沼虾的雌雄性别，并从中筛选出雄性性别逆转后的雌性个体。同时，利用罗氏沼虾的性别特异分子标记和PCR技术，对群体中已鉴定性别的雌虾雄虾和性逆转的雌虾分别进行基因组上的性别鉴定。核酸电泳结果显示，雌虾样本中有特异性分子片段存在，雄虾样本中无特异性片段，而性逆转的雌虾样本中也无特异性片段存在(图3)。这说明性逆转的雌性沼虾虾在遗传学上为雄虾，是由雄虾发生性别逆转后形成的假雌个体。

通过本实施例中所述RNA干扰方法沉默性别相关基因后，可以诱导雄性个体发生性别逆转变成雌性，也就是说，罗氏沼虾群体中原本将发育成雄虾的个体发生性别逆转变成雌虾，即为假雌个体。这种假雌性是由雄性向雌性的完全功能性性别逆转，其在遗传上是雄性但表型是雌性，可与雄性交配产生全雄性后代。

(4).全雄单性群体培育

选取假雌亲虾个体继续养殖至性腺发育成熟，待卵巢膨大呈橙黄色，卵粒隐约可分辨时，配养体质健壮、附肢完整、性腺发育成熟的雄虾交配受精。待抱卵雌虾腹部胚胎的颜色由淡黄色转为浅灰色或灰色，胚胎发育至溞状幼体期时，将雌虾腹部的胚胎洗脱，酒精消毒后移至人工半咸水中集中孵育。罗氏沼虾幼苗孵化后，每天投喂饵料，调控水质，定期检测育苗水体中的水质化学指标、生物指标以及幼体发育状态。罗氏沼虾溞状幼体经过20～22天的培育，90％以上的幼体变成仔虾时，进行虾苗的淡化工作。培育获得的幼苗为全雄苗种，可以开展后续的大规模产业化养殖，完成全雄苗种选育工作。

因此，本实施例证实在罗氏沼虾的性别调控和全雄化培育过程中，利用RNAi的技术手段，在罗氏沼虾性别分化阶段，调节性别分化相关重要功能基因的表达，沉默性别调控关键基因，使雄性个体发生性别逆转，获得假雌个体，培育全雄子代，开展全雄苗种培育的可行性。

Claims (9)

1.一种调控罗氏沼虾雌雄性别的方法，其特征在于，所述的方法是降低或沉默罗氏沼虾体内序列为SEQIDNO:1的性别蛋白或其衍生蛋白的量来完成的。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法是在罗氏沼虾胚胎发育期至胚后发育的后期幼体期之前降低或沉默罗氏沼虾体内序列为SEQIDNO:1的性别蛋白或其衍生蛋白的量。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法是在胚胎发育的原肠胚至溞状幼体期、胚后发育的后期幼体早期进行操作。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的衍生蛋白，是与序列为SEQIDNO:1的性别蛋白具有70％或以上同源性，且功能相同或类似的蛋白。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的降低或沉默罗氏沼虾体内序列为SEQIDNO:1的性别蛋白或其衍生蛋白的表达量是通过降低编码性别蛋白基因的表达量来完成。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的降低编码性别蛋白基因的表达量是通过将能干扰性别蛋白编码基因表达的双链RNA分子转入罗氏沼虾体内来实现的。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的双链RNA分子，包括正义链和与正义链互补的反义链；其中的正义链与序列为SEQIDNO:2的序列部分或全部相同或互补。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的正义链的核苷酸序列为SEQIDNO:3。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的双链RNA分子转入罗氏沼虾体内，是通过显微注射、浸泡或投喂方式来完成的。