CN106434680B - 一种虾类雄性化基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种虾类雄性化基因，及其在实现虾类全雄苗种生产中的应用，尤其是罗氏沼虾的单性全雄苗种的培育技术。本发明的虾类雄性化基因，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:2；其一种核苷酸序列为SEQ ID NO:1。本发明基于雄性化基因的核酸和蛋白序列信息，综合运用RNA干扰技术和基因表达调控等生物技术，实现虾类雄性化基因的有效沉默，并对雄性个体进行定向性别控制，诱导性别逆转，筛选获得性别可控的雌性亲本，培育快速生长的全雄单性苗种，开展全雄化单性养殖实践应用。

Description

一种虾类雄性化基因及其应用

技术领域

本发明属于水产养殖动物性别基因筛选技术领域，具体涉及一种虾类雄性化基因及其应用。

背景技术

我国是世界上虾蟹养殖大国，在沿海地区虾蟹的养殖形成了庞大的产业，成为当地经济的重要支柱，推动农民生活水平提高。在虾蟹类的生长过程中，同龄雌性和雄性个体的大小、生长速度相差悬殊，表现出双模态的生长模式。因此，全雄/全雌性的虾蟹群体产生较高的可销售产量，生长更快，且只需更短的养殖时间即可获得更高的每单位面积受益。若利用好这种雄性/雌性特征的优势，开展全雌/全雄单性化养殖，则可以大幅提高上市商品规格和养殖产量，提高水产养殖效益。因此，虾蟹类性别控制一直是遗传育种、良种选育研究的热点之一。

目前，有关虾蟹类性别分化和性别决定方面的认识仅仅局限于少量性别调控基因的分子结构和组织表达等，在动物水平上开展基因功能研究和育种方面的可操作性则几乎为零。目前，利用移植虾蟹的促雄性腺体生产单雄性虾蟹群体的手段效率低，且包括冗长的方案，诸如人工分隔和从不成熟雄性显微外科的移除促雄性腺体，这两种方案都要求较高的操作技能。因此，对有效的、技术上改进和经济上有益的产生甲壳纲十足目动物，特别是经济虾蟹的单雄性/单雌性群体的方法仍存在迫切需求。

因此，若能通过对动物体内的雄性化基因进行克隆、表达特征分析及定位和基因功能等研究，进而在动物水平层面阐明雄性化基因在性别调控方面的功能和在单性育种的操作实践，提供罗氏沼虾雄性化基因在调控罗氏沼虾雌雄性别和培育单性后代中的应用，将对甲壳纲中单性群体的培育提供极佳的实验思路和技术提升。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种虾类雄性化基因，及其在实现虾类全雄苗种生产中的应用，尤其是罗氏沼虾的单性全雄苗种的培育技术。

本发明首先提供一种虾类雄性化基因，其编码的蛋白包含有：

1)氨基酸序列为SEQ ID NO:2的蛋白；

2)在1)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，由1)衍生的蛋白。

上述的虾类雄性化基因，其一种核苷酸序列为SEQ ID NO:1；

本发明再一个方面提供一种双链RNA，所述的双链RNA能在细胞水平上降低上述虾类雄性化基因的表达量；

所述的双链RNA分子包括正义链和反义链，所述反义链包含与SEQ ID NO:1中所列的核苷酸序列或同系物或片段至少70％互补的核苷酸序列。

作为实施例的优选，上述的双链RNA分子的序列为SEQ ID NO:3；

本发明再一个方面提供一种用于产生能够下调雄性化基因表达的双链RNA分子的DNA构建体，所述DNA构建体用来转录表达上述的双链RNA分子，从而能在细胞水平上降低或去除上述虾类雄性化基因的表达量；

更进一步的，本发明提供一种用于在甲壳纲十足目的雄性生物体中下调上述的雄性化因子表达的方法，是向所述甲壳纲十足目的雄性生物体的至少一个细胞引入根据本发明主旨的双链RNA或DNA构建体。所述的引入所通过注射、浸入、经皮或喂食来进行的。

根据进一步的实施方案，本发明提供与SEQ ID NO:1中所列的核苷酸序列或其同系物或片段互补的反义寡核苷酸序列，其中反义寡核苷酸序列能够与SEQ ID NO:1或其同系物或片段特异性杂交，从而抑制甲壳纲十足目动物中雄性化蛋白的表达。

根据一些实施方案，核苷酸的区域选自5′非翻译区、密码子区、终止密码子区和3’非翻译区组成的组。根据某些实施方案，反义寡核苷酸序列包含至少20个核苷酸。应理解的是，寡核苷酸序列可由长度是从约20个核苷酸到约3300个核苷酸，可选的，每个核苷酸序列包括从约340到约1300个核苷酸构成。

本发明还提供一种获得雌性或假雌性沼虾类生物的方法，是将雄性沼虾类生物中上述的雄性化基因的表达量降低或去除；

再一种获得全雄性沼虾类生物的方法，是使用上述方法获得的假雌性沼虾类生物与雄性交配来产生全雄性后代。

所述的沼虾类生物，作为实施例的优选，为罗氏沼虾。

本发明基于雄性化基因的核酸和蛋白序列信息，综合运用RNA干扰技术和基因表达调控等生物技术，实现虾类雄性化基因的有效沉默，并对雄性个体进行定向性别控制，诱导性别逆转，筛选获得性别可控的雌性亲本，培育快速生长的全雄单性苗种，开展全雄化单性养殖实践应用。

附图说明

图1：雄性化基因的氨基酸相似性比对图；

图2：雄性化基因的同源性比对图；

图3：雄性化基因的组织表达特征图，

图4：雄性化基因的RNA干扰样品制备图，

图5：雄性化基因的RNA干扰效率测定图，

图6：雄性化基因沉默后的雌雄性别鉴定图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。

实施例1雄性化基因和多肽的鉴定

1)通过从虾基因库中获得完整的罗氏沼虾雄性化基因的序列，全雄化基因的全长利用ExPASx蛋白组学服务器(http://ca.expasy.org/tools/dna.html)计算机翻译，并选择最可能的框架。由SMART和CBS预测服务器(http://www.cbs.dtu.dk/services/)进一步评价推定的氨基酸和多肽序列。

罗氏沼虾雄性化基因的cDNA序列全长3264bp(SEQ ID NO:1)，包括3′非翻译区318bp，开放阅读框1314bp，5′非翻译区1632bp，推演生成含438个氨基酸的多肽序列(SEQID NO:2)。推演的开放阅读框中存在两个含CCCH的锌指结构：GDDDNICRDFLRNVCRRGKRCKYRHPED和KTELTFCHDFQNGNCSRPMCRFIHCTC。

利用NCBI平台(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)对雄性化蛋白的氨基酸序列进行相似性和同源性比对。结果表明，罗氏沼虾雄性化基因与哺乳动物狐蝠、脊索动物文昌鱼、软体动物海蜗牛和长牡蛎、棘皮动物海胆等都含有由CCCH保守氨基酸组成的两个特殊的锌指结构域，具有较高相似性和同源性(图1和图2)。

2)雄性化基因的组织表达特征鉴定

从健康、成熟罗氏沼虾中取各组织，包括心、鳃、肝胰脏、神经、肌肉、精巢和卵巢，并利用Trizol试剂盒的方法对各个组织的总RNA进行抽提。随后通过分光光度法对RNA定量。第一链cDNA通过从1ug总RNA在42℃的逆转录反应(Reverse Transcriptase MMLV(RNase H-))30分钟，以Oligod(T)作为引物来合成，根据M-MLV逆转录酶的逆转录酶反应制造商的说明书制备。罗氏沼虾雄性化基因的组织特异性表达通过荧光定量PCR扩增检测。通过利用正向引物5’-AATGCTCGGGCAGACCATAAGT-3’(核苷酸(nt)936-957)和反向引物5’-CAAAATTTCTTCTAAGCCACGTCG-3’；(核苷酸(nt)1006-1029)特异性引物证明。罗氏沼虾的18S核糖体基因用作阳性对照(GenBank序列号DQ642856)，选用恒定表达的基因18S作为内参，通过利用正向引物5’-GGTAGTGACGAAAAATAACAAT-3’和反向引物5’-CCCACCCCAGTCCGGAACTGA-3’特异性引物证明。将雄性化基因的相对定量通过利用上述基因引物和SRYBGreen PCR Master混合物(ApplliedBiosystem)按照制造商的说明书(SYBRPremix Ex Taq^TM(TliRNaseH Plus),Takara)进行。将获得的数据根据各组织和18S核糖体RNA水平标准化两次，然后将标准化的数据表示为2^-△ct。

荧光实时定量PCR结果显示，罗氏沼虾的雄性化基因的转录物在性成熟的罗氏沼虾雌雄个体中差异分布，雄虾体内各组织中雄性化基因的含量明显高于雌虾中的含量(图3)。同时，在罗氏沼虾的生殖系统中，雄性化基因在雌虾卵巢中的表达量却明显高于雄虾精巢中的表达，推测雄性基因在罗氏沼虾的性别维持和调控过程具有重要作用。

实施例2雄性化基因表达的沉默

双链RNA制备

根据罗氏沼虾雄性化基因的cDNA序列设计带有酶切位点的正向引物5’-CGCGGATCCTCACAGCCCCTCCCAATTACA-3’(核苷酸(nt)1249-1269；SEQ ID NO:7，下划线处为BamHI酶切位点)和反向引物5’-CCCAAGCTTATAGGACACAAGATGACCACCAGA-3’(核苷酸(nt)1567-1590；SEQ ID NO:8，下划线处为HindIII酶切位点)，构建包含罗氏沼虾雄性化基因的dsRNA表达载体。以包含罗氏沼虾雄性化基因的cDNA为模板，进行PCR扩增(94℃持续3分钟，随后是94℃持续30秒、55℃持续30秒、72℃持续30秒的35个循环，随后是72℃持续10分钟)，克隆雄性化基因片段，获得目的基因序列的序列为SEQ ID NO：3；

PCR扩增产物在1.2％琼脂糖凝胶上进行电泳，利用UV光在溴化乙锭中显现，从凝胶切下并利用QIAquick RCR纯化试剂盒(QIAGEN)纯化。根据制造商的说明书，利用pET-T7质粒构建含有目的基因片段的表达载体，并将含有基因片段插入的pET-T7表达载体转化到表达型菌株E.coli HT115中。利用双链RNA表达载体pET-T7诱导表达合成dsRNA，随后根据制造商的说明书利用Trizol试剂盒抽提菌体总RNA，通过加热到65℃持续20分钟来使两条链杂交，然后自然冷却至室温，使其冷却复性。随后加入RNase A进行酶切处理，去除单链RNA，苯酚和氯仿纯化双链RNA，乙醇沉淀。溶解纯化后的双链RNA样品并定量(图4)，将其保存在-20℃直到使用。

应理解的是，可对本发明的dsRNA进行化学修饰。可用于本发明的修饰的dsRNA化合物的具体实施包括修饰的骨架或非天然核苷键的寡核苷酸。另外，根据本发明的修饰的核苷酸还可以包含一个或多个取代的糖部分。另外，本发明的寡核苷酸可化学连接于增强寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取的一个或多个部分或共轭物。这些部分或共轭物可包括共价结合于功能基团诸如伯羟基或仲羟基的共轭基团。本发明的共轭基团包括嵌入剂、报告分子、聚胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、增强寡聚物的药效学特性的基团以及增强寡聚物的药代动力学特性的基团。典型的共轭基团包括胆固醇、脂质、磷脂、生物素、吩嗪、叶酸酯、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素类和染料。

RNAi剂可通过包括但不限于以下技术向本发明的靶水生生物体施用：电穿孔、注射、微注射、快速注射、进入、摄食(喂食)、磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、聚凝胺介导的转染、脂质体融合、脂质转染法、原生质体融合、逆转录病毒注射、生物弹法(粒子轰击，如使用基因枪)或病毒载体直接转染细胞。对于甲壳纲十足目动物，注射、微注射、经由浸入或摄食(喂食)而口服、或经皮方法是优选。RNAi剂可以裸形式引入靶生物体。裸形式是指RNAi剂不含有可作用以促进浸入靶细胞的任何递送媒介物，诸如脂质体制剂、带电荷的脂质或沉淀剂。如有需要，可使用递送剂。RNAi剂可以组合物递送，组合物进一步包含核酸凝聚剂诸如亚精胺、硫酸鱼精蛋白、聚赖氨酸、壳聚糖或本领域已知的其他核酸凝聚剂。雄性化基因的“基因递送”或“基因转移”是指用于可靠地将外源核酸插入靶细胞的方法或系统，且可导致目的基因的瞬时或长期表达。

RNAi剂可在生命周期的任何阶段施用与甲壳纲十足目动物，包括为受精的卵或受精卵、或胚胎、或未成熟阶段幼体、或幼虫阶段、或成熟阶段。出于实践考虑，如果RNAi剂将通过注射或微注射向动物体递送，动物是肉眼可见将是优选的。在罗氏沼虾中，最有利的实施阶段是在胚胎阶段、幼虫阶段或幼虫后(postlarvae,PL)阶段之前或期间施用RNAi剂，诸如在幼虫后阶段的第1-200天，优选地在幼虫后阶段的第1-80天。

在向靶生物体施用RNAi剂的方法的一个方式中，使用携带RNAi剂的饲料活生物体。例如，幼体和成体阶段消耗单细胞和多细胞食物源，诸如卤虫(丰年虫)或卤虫休眠卵、浮游生物、类似浮游生物的滤食生物、藻类和酵母。这些食物源可以在水产养殖中采用，可用RNAi剂转化这些食物源以使靶生物体通过摄食食物源最终获得RNAi剂。卤虫、螺旋藻属、水蚤属、钩虾属、轮虫、红蚯蚓和游丝蚯蚓是用于喂养养殖的小虾和成虾的饲料活源的实例，其可被遗传改造以向沼虾递送RNAi。饲料活生物体可以是活体的，也可制备为冷冻干燥、冷藏或冷冻形式。

本发明的组合物可以是固体、半固体或液体形式。取决于施用方式和RNAi剂的性质，组合物可为了向靶生物体递送而适当地配制。组合物可进一步包含载体。RNAi剂可与之混合的载体包括常规赋形剂，并可以是水性溶剂(诸如水、盐水或PBS)、油、右旋糖、甘油、润湿剂或乳化剂、增溶剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、包衣剂、粘合剂、填充剂、崩解剂、稀释剂、润滑剂、pH缓冲剂及类似物。

对于跨粘膜或经皮施用，在制剂中使用适于将被穿透的屏障的渗透剂。这样的渗透剂通常是本领域已知的，包括如去垢剂、胆酸盐和呋西地酸衍生物。本发明的dsRNA制剂包括但不限于溶液、乳剂、泡沫和含脂质体的制剂等。雄性化基因在虾体内的沉默

选取体质健壮、附肢完整的罗氏沼虾进行RNA干扰。利用显微注射的方法，经头胸甲与腹部交界处的第五步足基部腹膜处，向每只动物注射5-10μg雄性化基因的双链RNA或对照GFP基因的双链RNA，放回水循环系统中继续饲养。RNA干扰7天后，沼虾解剖取样，检测雄性化基因的表达水平。抽提含目的基因的组织RNA，逆转录合成cDNA。利用荧光定量PCR的方法，以18S基因作为内参，检测雄性化基因的表达水平，荧光定量PCR方法同上所述。结果表明，RNA干扰后，沼虾体内雄性化基因的核酸表达水平显著下调，与GFP对照组相比，雄性化基因的表达水平降低70％以上(图5)，有效地沉默沼虾体内雄性化基因的表达。

实施例3基于雄性化基因沉默的性别调控

假雌亲本的选育

对于雄性化基因长期沉默的RNAi实验，选取体质健壮、附肢完整的雄性溞状幼体期(Post Larvae,PL，PL20-PL120)(N＝200)，体长0.8-1.2cm的雄虾幼苗进行雄性化基因的RNA干扰，RNA干扰的显微注射和操作流程如上所述。为维持高效持久的RNA干扰效率，每隔一个月重新注射同样的双链RNA样品至虾体内，注射周期为3个月。RNA干扰后的虾体置于室内水泥池中继续饲养，至体长3-5cm，抓捕并鉴定雌雄性别情况。首先，从外观形态方面鉴定雌雄性别，利用显微镜观察罗氏沼虾雌雄性征的外观差异和虾体的雌雄生殖孔。第五步足基部存在生殖孔的为雄性虾体，第五步足基部不存在生殖孔的为雌性虾体，并从中筛选出雌性个体(假雌个体)。RNA干扰实现雄性化基因测长期沉默后，统计虾体雌雄性别数据表明，在雄性幼体RNA干扰组留存的136尾沼虾中，群体中雌虾/雄虾的比值为3：133，存在有3只雌性个体(假雌虾)，即群体中2.2％雄性个体性发生性别逆转变成雌性个体。

在此基础上，利用罗氏沼虾的性别特异分子标记，对群体中已鉴定性别的雌虾和雄虾做基因组上的遗传性别鉴定。通过PCR扩增方法和核酸电泳鉴定，正常虾群体中，雌性性别特异分子标记体现为雌性样本中可鉴定到编码雌性特异性基因的多核苷酸或其同系物或片段，而雄性样品中则不存在对应片段。因此，在GFP对照组中，3尾雌性样本中分别可以扩增获得目的条带，3为雄性样本中不能扩增到目的条带。相应的，在雄性化基因RNA干扰组中鉴定结果则显示5尾沼虾样本(3尾雌虾和2尾雄虾)中都未扩增到目的条带，说明这5尾沼虾在遗传上都为雄性个体(图6)。进一步分析表明，雄性化基因RNA干扰组中，3尾外观表型为雌性的沼虾其体内携带雄性遗传基因信息，为新雌性沼虾(假雌个体)。

以上实验结果表明，在性别分化关键时期，雄性体内的雄性化基因沉默可导致其性别发生逆转，变成新雌性(假雌个体)。所谓的假雌个体是指其体内携带雄性遗传信息，而表型(外观特征和生殖系统)则体现为雌性性征。因此，通过调节雄性化基因在体内的核酸和蛋白表达，可以进一步调控虾类的雌雄性别分化，尤其是调控罗氏沼虾的性别分化，诱导雄性个体性别逆转形成假雌个体。同时，因假雌个体同时兼有雄性的内在遗传背景和雌性的外在表型，可与正常雄性个体交配、受精和产卵，培育生产全雄子代群体，用于全雄单性养殖。实施例4全雄单性群体养殖

假雌亲本和全雄苗种培育：将选育获得的假雌个体置于室内水泥池中继续饲养至卵巢发育成熟，人工控温，25±1度，充气泵增氧，每天早晚投喂鱼块或配合饲料，并及时消除残饵和粪便等。假雌亲虾继续养殖至性腺发育成熟，待卵巢膨大呈橙黄色，卵粒隐约可分辨时，配养体质健壮、附肢完整、性腺发育成熟的雄虾进行交配受精。雌雄虾交配受精完成后，将抱卵雌虾置于水泥池内的小网箱中，单独饲养，人工控温，27±1度，充气泵增氧。观察雌虾腹部胚胎发育情况，待抱卵雌虾腹部胚胎的颜色由淡黄色转为浅灰色或灰色，胚胎发育至溞状幼体期时，将雌虾腹部的胚胎洗脱，酒精消毒后移至人工半咸水中集中孵育。同时，慢慢提升孵育温度至30±1度，孵化幼苗。罗氏沼虾全雄幼苗孵化后，每天投喂饵料，调控水质，定期检测育苗水体中的水质化学指标、生物指标以及幼体发育状态。罗氏沼虾溞状幼体经过20-22天的培育，90％以上的幼体变成仔虾。此时，进行虾苗的淡化工作，直至盐度降为2以下。同时，将苗池水温逐渐降至27±1度，与外界水温接近，仔虾淡化完毕，成功培养出健康的罗氏沼虾全雄苗种。

全雄罗氏沼虾养殖优势

全雄单性虾苗可用于沼虾的池塘化养殖。从罗氏沼虾的育苗基地挑选10万尾淡化后的健康全雄苗种，放样于6亩池塘水域中进行养殖。根据当地的环境水温和养殖习惯，开展为期4个月的养殖试验。结果表明，池塘养殖收获的各池中成熟雄虾比例在94.6％-100％之间，平均雄性比例为97％，维持了高度雄性化比例。单性全雄沼虾在池塘养殖过程中很好地保持其原有的性别特征，维持其雄性性征的稳定性。养殖过程中，虾苗放养密度降为1.7万尾/亩时，平均产量可达为477斤/亩。全雄沼虾的生长指标统计结果表明，沼虾体长范围在6.2-11.3厘米，平均体长为9.3厘米；沼虾体重范围4.8-39.6g，平均体重为20.9g，达到目前市场对成品沼虾的上市规格。

同时，单性沼虾群体中各个不同发育阶段的虾(小虾、橙爪虾和蓝爪虾)共存，符合自然状态下的沼虾群体组成。此外，在单性沼虾群体中，橙爪虾所占的比例相较于小虾和蓝爪虾的比例明显偏高，说明其仍具有很好的生长潜能成长为蓝爪大虾。因此，在池塘养殖条件适宜的条件下，延长养殖周期，将能更好地发掘和体现沼虾单性养殖中的雄性优势。综上所述，在罗氏沼虾全雄单性化养殖过程中，适当降低苗种的放养密度，不仅可以维持养殖产量，而且可以较好地提升养殖产量，且全雄沼虾在其生长后期有很好的生长潜力。

水产养殖虾类具有良好的雄性/雌性特征优势，对这些种类进行定向性别控制，开展单性化养殖，不但可以产生巨大的经济效益，而且具有重要的理论价值。本发明方法攻克目前水产养殖领域虾类单性苗种培育中遇到的技术难题，通过RNA干扰技术和基因表达调控技术，进行定向性别控制，诱导虾类动物性别逆转，不仅构建虾类性别控制和单性培育的验证技术体系和平台，而且利用性别可控的亲本培育单性苗种，实现基于虾类雄性化基因的全雄虾苗生产技术。本发明操作方法具有原创性，实施步骤清晰。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江万里学院

<120> 一种虾类雄性化基因及其应用

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<170> PatentIn version 3.5

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Met Val Glu Gly Met Asn Gly His Thr Lys Glu Glu Gly Thr Gly Pro

1 5 10 15

Val Ser Gly Asp Asp Asp Asn Ile Cys Arg Asp Phe Leu Arg Asn Val

20 25 30

Cys Arg Arg Gly Lys Arg Cys Lys Tyr Arg His Pro Glu Asp Ile Gly

35 40 45

Pro Gly Pro Pro Gly Gly Asn Gln Val Lys Thr Glu Leu Thr Phe Cys

50 55 60

His Asp Phe Gln Asn Gly Asn Cys Ser Arg Pro Met Cys Arg Phe Ile

65 70 75 80

His Cys Thr Cys Glu Asp Glu Asp Tyr Tyr Leu Arg Thr Gly Asp Ile

85 90 95

Pro Pro Tyr Val Leu Asp Gln Ala Ile Arg Arg Gly Gln Ile Asn Asp

100 105 110

Val Thr Leu Asp Gly Asp Ile Pro Ile Cys Lys Asp Tyr Leu Met Gly

115 120 125

Glu Cys Ser Arg Arg Arg Gly Gly Lys Cys Lys Phe Arg His Leu Thr

130 135 140

Leu Ala Glu Tyr Glu Gln Ala Val Tyr Gly Thr Asn Gln Pro Lys Gln

145 150 155 160

Cys Pro Gln Glu Pro Pro Pro Ser Ser Ile Gly Pro Pro Asp Pro Lys

165 170 175

Arg Gln Arg Tyr Glu Pro Lys Ser Val Ser Ala Glu Phe Ala Arg Glu

180 185 190

Arg Asp Phe Leu Arg Pro Val Glu Glu Leu Gly Arg Glu Ala Met Leu

195 200 205

Gly Gln Thr Ile Ser Leu Arg Asp Phe Arg Asp Arg Asp Arg Glu Arg

210 215 220

Asp Lys Glu Arg Asp Arg Arg Gly Leu Glu Glu Ile Leu Ile Leu Arg

225 230 235 240

Lys Gln Ile Asp Asp Leu Lys Lys Asp Asn Ala Asn Leu Lys Lys Glu

245 250 255

Asn Ser Asp Leu Arg Ala Thr Asn Glu Phe Leu Leu Asp Gln Val Thr

260 265 270

Thr Leu Arg Leu Ser Lys Ala Ser Gly Ser Val Thr Ala Val Thr Val

275 280 285

Pro Ala Val Ser Leu Ala Ser Thr Ile Pro Val Ala Thr Ser Val Gln

290 295 300

Pro Leu Thr Ala Gln Leu Ser Gln Pro Leu Pro Ile Thr Ser Asp Val

305 310 315 320

Val Ala Leu Pro Thr Gly Pro Pro Arg Pro Pro Pro Pro Pro Gln Ala

325 330 335

Pro Gln Gln Ala Pro Pro His Ser Leu Ala Pro Pro Ser Gln Gln Val

340 345 350

Val Ala Pro Pro Gly Ser Ala Val Val Gly Ser Val Gly Gly Val Gln

355 360 365

Val Ser Leu Pro Gln Ala Thr Ala Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Thr

370 375 380

Val Thr Leu Asn Pro Gln Ile Ala Pro Ala Thr Ser Met Ala Pro Ser

385 390 395 400

Met Ala Pro Pro Ser Ala Gln Asn Met Ala Ile Ser Met Ser Gly Ala

405 410 415

Ser Gly Gly His Leu Val Ser Tyr Pro Ile Met Thr Gln Pro Gly Leu

420 425 430

Arg Pro Gln Leu Gln

435

<210> 3

<211> 342

<212> DNA

<213> 3

<400> 3

tcacagcccc tcccaattac atcagatgtt gttgccttgc ctactggtcc acctcggcca 60

ccaccaccac ctcaagcacc tcagcaagca ccaccacatt cattggctcc cccatctcag 120

caagttgtag cacctccagg ttcagcagta gtaggatcag tcggtggtgt gcaagtttcg 180

ttgcctcagg caacagctct tacagctgtg tctttgtcaa ctgttactct aaatccacag 240

attgcaccag caacatcaat ggcaccctca atggcccccc catcagcaca gaatatggct 300

atttccatga gtggtgcatc tggtggtcat cttgtgtcct at 342

Claims (8)

1.一种虾类雄性化基因，其特征在于，所述的虾类雄性化基因编码的蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

2.如权利要求1所述的虾类雄性化基因，其特征在于，所述的虾类雄性化基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

3.权利要求1或2所述的虾类雄性化基因在调节甲壳纲十足目动物性别发育中的应用。

4.一种双链RNA，其特征在于，所述的双链RNA能在细胞水平上降低权利要求1或2所述的虾类雄性化基因的表达量；所述的双链RNA分子的序列为SEQ ID NO:3。

5.一种用于产生能够下调雄性化基因表达的双链RNA分子的DNA构建体，所述DNA构建体用来转录表达权利要求4所述的双链RNA。

6.一种获得雌性或假雌性沼虾类生物的方法，其特征在于，所述的方法是将权利要求1所述的虾类雄性化基因的表达量降低或去除。

7.一种获得全雄性沼虾类生物的方法，其特征在于，所述的方法是使用权利要求6所述的方法获得的假雌性沼虾类生物与雄性交配来产生全雄性后代。

8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述的沼虾类生物为罗氏沼虾。