WO2024038497A1 - 新規プロモーター - Google Patents

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WO2024038497A1
WO2024038497A1 PCT/JP2022/030912 JP2022030912W WO2024038497A1 WO 2024038497 A1 WO2024038497 A1 WO 2024038497A1 JP 2022030912 W JP2022030912 W JP 2022030912W WO 2024038497 A1 WO2024038497 A1 WO 2024038497A1
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WO
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promoter
seq
cells
vector
dna
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PCT/JP2022/030912
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English (en)
French (fr)
Inventor
ジョンウン ユン
一衛 長澤
尾定　誠
勇人 横井
Original Assignee
国立大学法人東北大学
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/01—DNA viruses
    • C07K14/03—Herpetoviridae, e.g. pseudorabies virus

Definitions

  • the present invention relates to a novel promoter.
  • bivalves are classified as the second largest class in the phylum Mollusca and are also important as food.
  • CMV IE Cytomegalovirus immediate early promoters and the like have been investigated (Non-patent Documents 1, 2, 3), but no practical promoter has been found so far.
  • An object of the present invention is to provide a new promoter.
  • the inventors conducted intensive research and found that the oshv117 promoter derived from Ostreid herpesvirus 1 (OsHV-1) was used in cells of various animal species including mollusk cells. It was found that it has strong promoter activity.
  • Ostreid herpesvirus 1 Ostreid herpesvirus 1
  • a promoter consisting of any of the following DNAs (1) to (4): (1) DNA containing a base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 3; (2) DNA containing a base sequence in which one or several bases are substituted, added, or deleted in the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 3, and has promoter activity; (3) DNA containing a nucleotide sequence having 90% or more identity with the nucleotide sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 3 and having promoter activity; (4) DNA containing a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions with a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 3, and having promoter activity.
  • [Section 2] Item 1. An expression vector comprising the promoter according to item 1.
  • [Section 3] Item 2. The expression vector according to Item 2, wherein the expression target gene is integrated under the control of the promoter according to Item 1.
  • [Section 4] A transformant comprising the expression vector according to item 2 or 3.
  • [Section 5] 5. The transformant according to item 4, which is an aquatic invertebrate.
  • [Section 6] A method for producing a target substance encoded by an expression target gene, the method comprising the step of culturing the transformant according to item 4 or 5.
  • a novel promoter can be provided. Furthermore, an expression vector containing the above novel promoter and a transformant containing the above expression vector can be provided.
  • Example 2 The results of an optimization study on culture conditions for scallop cardiomyocytes are shown. An overview of electroporation of scallop cardiomyocytes is shown. The results of optimization study of electroporation conditions in Example 1 are shown. 1 shows the results of electroporation of luciferase mRNA in Example 1. Condition of cardiomyocytes 3 days after electroporation. 1 shows the results of electroporation of luciferase mRNA in Example 1. Luciferase expression level 3 days after electroporation. 1 shows the results of electroporation of luciferase mRNA in Example 1. Cell viability after electroporation. The luciferase vector in Example 2 is shown.
  • Example 2 shows the correlation between the luciferase expression level and the number of adherent cells two days after electroporation in Example 3.
  • the results of promoter activity evaluation in Example 4 are shown.
  • the results of optimization study of electroporation conditions in Example 5 are shown.
  • E Expression level when changing plasmid vector concentration.
  • F Cell survival rate when changing plasmid vector concentration.
  • G Expression level when changing the culture period after electroporation.
  • H Cell survival rate when changing the culture period after electroporation.
  • the EGFP vector in Example 6 is shown.
  • Example 3 shows the results of GFP assay of scallop cardiomyocytes in Example 6.
  • 2 shows the results of a scallop hemocyte GFP assay in Example 6.
  • the results of HEK293 GFP assay in Example 6 are shown.
  • 2 shows the results of a zebrafish embryo GFP assay in Example 6.
  • the arrangement of oshv117 and its adjacent genes in Example 7 is shown.
  • the results of sequence analysis of Poshv117 by NNPP and NSite in Example 7 are shown.
  • the results of promoter deletion analysis of Poshv117 in Example 8 are shown.
  • the sequences of SEQ ID NOS: 1 to 3 are shown.
  • the sequences of promoters No. 1 to No. 5 in Example 8 are shown.
  • the present invention provides a promoter consisting of any of the following DNAs (1) to (4).
  • DNA containing a base sequence represented by any of SEQ ID NOS: 1 to 3. (2) DNA containing a base sequence in which one or several bases are substituted, added, or deleted in the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 3, and has promoter activity.
  • promoter activity means an activity that promotes transcription of DNA (gene) into mRNA. Therefore, in the present invention, “having promoter activity” is intended to indicate the activity of promoting transcription of DNA (gene) into mRNA in any one or more experimental systems.
  • a certain DNA can be used in at least one type of experimental system using cells belonging to molluscs, mammals, fish, etc. (preferably in an experimental system using at least one type of aquatic invertebrate cells). ), the DNA is interpreted to have promoter activity.
  • Promoter activity can be confirmed by using a suitable reporter gene to determine whether protein expression is observed.
  • promoter activity can be confirmed by introducing DNA into cells that incorporates DNA encoding a detectable protein (reporter gene) under the control of a promoter, and measuring the production amount of the gene product of the reporter gene.
  • reporter genes include luciferase gene, fluorescent protein genes such as GFP (Green Fluorescent Protein) gene, ⁇ -galactosidase (LacZ) gene, ⁇ -glucuronidase (GUS) gene, ⁇ -lactamase gene, and the like. More specifically, promoter activity can be measured, for example, by the method described in the Examples of the present application, which will be described later.
  • the promoter of the present invention is more than 2 times (more preferably 3 times or more, even more preferably 5 times or more, particularly preferably 5 times or more) as compared to the CMV IE (Cytomegalovirus immediately early) promoter, which is a conventional promoter. has a promoter activity of 7 times or more).
  • the promoter of the present invention has a promoter activity strong enough to enable fluorescence observation with a fluorescence microscope when the GFP gene is used as a reporter gene.
  • the promoter of the present invention may consist of a base sequence that is substantially the same as the base sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 3 in the sequence listing, as long as it has promoter activity.
  • promoter activity By the "promoter activity" of the present invention, a gene under the control of the promoter (typically, for example, located downstream) is transcribed into mRNA.
  • DNAs containing the base sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 3, which have promoter activity are included.
  • the DNA consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 3 is a promoter derived from a virus belonging to the Malacoherpesviridae family.
  • the DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 is the promoter of oshv117 of Ostreid herpesvirus 1.
  • the DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 is the promoter of oshv117 of Ostreid herpesvirus 1 mutants (Ostreid herpesvirus 1 strain microvariant A and Ostreid herpesvirus 1 strain microvariant B).
  • SEQ ID NO: 3 The DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 is the promoter of oshv117 of Chlamys acute necrobiotic virus (AVNV). Note that SEQ ID NO: 2 is a sequence in which 2 bases have been substituted with respect to SEQ ID NO: 1, and SEQ ID NO: 3 is a sequence in which 5 bases have been substituted and 1 base has been inserted in SEQ ID NO: 1.
  • the number of one or several bases to be substituted, deleted, added or inserted is not particularly limited as long as it is an integer of 1 or more.
  • the number can be about 1 to several dozen, preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 15, even more preferably about 1 to 10, particularly preferably about 1 to 5.
  • the number of one or more bases to be substituted, added, or deleted is 1 such that the base sequence identity with the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 3 is 90% or more. ⁇ 107 pieces, preferably about 1 to 54 pieces so that the identity is 95% or more, more preferably about 1 to 21 pieces so that the identity is 98% or more, particularly preferably 99% identity
  • the number can be set to about 1 to 11 so as to satisfy the above.
  • the base sequence identity can be 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more, particularly preferably 99% or more.
  • the homology or identity of the base sequences can be less than 100%. Homology and identity between base sequences can be determined using a known algorithm such as BLAST. Included are nucleic acid molecules containing a nucleotide sequence having 90% or more identity with the nucleotide sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 3, and in which the DNA has promoter activity.
  • TATATAA has a TATA box sequence (TATATAA) and has a base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 3 by 90% or more (preferably 95% or more, more preferably 98% or more, particularly preferably It is preferable that the base sequences have an identity of 99% or more. Furthermore, in the above, one (or two or three) base sequences may be substituted, deleted, added or inserted in the TATA box (TATATAA) sequence.
  • it has a TACGTGGG sequence and has a base sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 1 to 3 at 90% or more (preferably 95% or more, more preferably 98% or more, particularly preferably 99% or more).
  • the base sequences have the same identity.
  • one (or two or three) base sequences may be substituted, deleted, added or inserted in the TACGTGGG sequence.
  • it has the GGATTGGC sequence and has a base sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 1 to 3 at 90% or more (preferably 95% or more, more preferably 98% or more, particularly preferably 99% or more).
  • the base sequences have the same identity.
  • one (or two or three) base sequences may be substituted, deleted, added or inserted in the GGATTGGC sequence.
  • it has the GAGGGAAGGT (SEQ ID NO: 36) sequence, and has a base sequence of 90% or more (preferably 95% or more, more preferably 98% or more, particularly preferably 98% or more) of any of SEQ ID NOS: 1 to 3. It is preferable that the base sequences have an identity of 99% or more). Furthermore, in the above, one (or two or three) base sequences may be substituted, deleted, added or inserted in the sequence GAGGGAAGGT.
  • it has the ACACCATTACATT (SEQ ID NO: 37) sequence and has a nucleotide sequence of 90% or more (preferably 95% or more, more preferably 98% or more, particularly preferably 98% or more) of any of SEQ ID NOS: 1 to 3. It is preferable that the base sequences have an identity of 99% or more). Furthermore, in the above, one (or two or three) base sequences may be substituted, deleted, added or inserted in the ACACCATTACATT sequence.
  • the CAATT box has a consensus sequence (T/C)GATTGG(T/C)(T/C)(G/A) (SEQ ID NO: 38) and is represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 3.
  • the base sequence preferably has an identity of 90% or more (preferably 95% or more, more preferably 98% or more, particularly preferably 99% or more) with the base sequence.
  • the sequence (T/C)GATTGG(T/C)(T/C)(G/A) has one (or two or three) base sequences substituted, deleted, added or inserted. You can leave it there.
  • it has a Kozak consensus sequence (A/G)NNATG(A/G) and has a nucleotide sequence of 90% or more (preferably 95% or more, more preferably 95% or more) of any one of SEQ ID NOS: 1 to 3.
  • the base sequences preferably have an identity of 98% or more, particularly preferably 99% or more.
  • one (or two or three) base sequences may be substituted, deleted, added or inserted in the sequence (A/G)NNATG(A/G).
  • stringent conditions refer to conditions under which only specific hybridization occurs and non-specific hybridization does not occur. Such conditions include “42°C in 1 ⁇ SSC (0.9M NaCl, 0.09M trisodium citrate) or 6 ⁇ SSPE (3M NaCl, 0.2M NaH 2 PO 4 , 20mM EDTA ⁇ 2Na, pH 7.4). Examples of stringent conditions include, but are not limited to, conditions of "hybridizing with 0.5x SSC at 42°C". Such conditions are described, for example, in J. Sambrook et al., Molecular Cloning, Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).
  • the method for obtaining the promoter of the present invention is not particularly limited, and it can be obtained by ordinary genetic engineering techniques or chemical synthesis methods.
  • DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 the genomic DNA of Ostreid herpesvirus 1 is extracted from shellfish such as Pacific oyster (Crassostrea gigas) infected with Ostreid herpesvirus 1, and the DNA is expressed as SEQ ID NO: 1.
  • DNA consisting of base sequences can be cloned.
  • genomic DNA of Ostreid herpesvirus 1 strain microvariant A is extracted from shellfish such as Pacific oysters (Crassostrea gigas) infected with Ostreid herpesvirus 1 strain microvariant A, or
  • the genomic DNA of Ostreid herpesvirus 1 strain microvariant B can be extracted from shellfish such as oysters (Crassostrea gigas) infected with 1 strain microvariant B, and the DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 can be cloned.
  • DNA consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 the genomic DNA of Chlamys acute necrobiotic virus (AVNV) was extracted from shellfish such as the red seal (Chlamys farreri) infected with Chlamys acute necrobiotic virus (AVNV) and sequenced. DNA consisting of the base sequence represented by number 3 can be cloned. Furthermore, the promoter DNA of the present invention can also be artificially synthesized based on the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 3.
  • the promoter of the present invention has extremely high promoter activity in bivalve cells compared to conventional promoters.
  • a promoter consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 when used as a reporter gene, The promoter activity is about 25 times that of the CMV IE (Cytomegalovirus immediate early) promoter ( Figure 9).
  • the promoter consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 uses the GFP gene as a reporter gene, GFP fluorescence can be observed with a fluorescence microscope. It is a particularly useful promoter in bivalves.
  • the present invention provides an expression vector containing the above promoter.
  • the expression vector of the present invention can be constructed by incorporating the promoter of the present invention into an expression vector that enables expression of the expression target gene.
  • an expression target gene is integrated under the control of the DNA of the present invention.
  • an expression target gene is operably linked downstream of the DNA of the present invention.
  • the expression vector into which the promoter of the present invention is incorporated is not particularly limited as long as it can be stably maintained and propagated in host cells, and examples include plasmid vectors, viral vectors, cosmid vectors, and fosmid vectors. , artificial chromosome vectors, etc., can be appropriately selected depending on the host cell. Among these, plasmid vectors are preferred.
  • cloning vectors and expression vectors can be used as expression vectors, such as pNL1.1/1.2/1.3, pNL2.1/2.2/2.3, pNL3.1/3.2/3.3, pGL4, and pGEM T. /T easy, pGEMEX-1 (manufactured by Promega Corporation), T-Vector pMD20/pMD19, pUC18/19, pUC118/119, pBR322, pMW218/219, (manufactured by Takara Bio Inc.), pCR4-TOPO, pCR-XL-2-TOPO, pCR-BluntII-TOPO pcDNA3.1/V5-His-TOPO, pcDNA3.4-TOPO, pcDNA3.3-TOPO, pENTR/D-TOPO, pCR8/GW/TOPO, pENTR/SD /D-TOPO, pcDNA3.1 V5-His A/B/C, pPIC
  • the expression target gene placed downstream of the promoter of the present invention in the above expression vector is not particularly limited.
  • the expression target gene is a gene encoding a target substance or an enzyme involved in its synthesis.
  • the expression target gene can also be referred to as a nucleic acid molecule (eg, DNA, RNA) that encodes these target substances.
  • the expression target gene may be a heterologous gene encoding a heterologous expression product, a gene encoding an expression product native to the host cell, or a gene encoding any other protein, peptide, nucleic acid, etc. It's okay.
  • target substances encoded by expression target genes include reporter fluorescent proteins such as GFP, growth-promoting factors, maturation-promoting factors, sterilization factors, disease resistance acquisition factors, Cas9 proteins, enzymes, hormones, cytokines, and toxins such as diphtheria. , other physiologically active peptides, transporters, non-coding RNAs, and shRNAs (small hairpin RNAs or short hairpin RNAs) used in RNA interference.
  • the present invention provides a transformant containing the above expression vector.
  • the host cell into which the expression vector of the present invention is introduced is not particularly limited as long as the promoter of the present invention functions as a promoter, and examples include aquatic invertebrates (shellfish, squid, octopus, etc.), mammals (human , mice, rats, rabbits, dogs, monkeys, chimpanzees, horses, donkeys, hamsters, guinea pigs, etc.), fish (zebrafish, medaka, rainbow trout, salmon, red sea bream, yellowtail, tuna, etc.), annelids (earthworms, lugworms, leeches, etc.) etc.), flatworms (planarians, etc.), cnidarians (jellyfish, corals, sea anemones, etc.), echinoderms (sea urchins, starfish, sea cucumbers, etc.), arthropods (shrimps, crabs, insects, etc.), urochordates (sea s
  • aquatic invertebrates are preferred, and aquatic molluscs are more preferred.
  • aquatic molluscs include shellfish such as gastropods and bivalves, and cephalopods such as octopus and squid.
  • shellfish are more preferred, and bivalves are particularly preferred.
  • gastropods include abalone and turban shell.
  • bivalves include scallops, Japanese oysters, purple mussels, clams, freshwater clams, clams, red clams, red clams, baka clams, Japanese clams, Japanese oysters, pearl oysters, and the like.
  • the transformant can be prepared by applying an expression vector containing the promoter of the present invention to a general transformation method such as electroporation method, lipofection method, microinjection method, transformation method, transfection method, conjugation method, protoplast method, particle method, etc. - It can be obtained by introducing it into host cells using the cancer method, Agrobacterium method, etc.
  • introduction into host cells includes not only introduction into cells collected from a living body or established cell lines, but also introduction into cell masses, tissues, etc. collected from a living body; It also includes introduction into cell masses, tissues, etc. constructed using cells collected from humans; introduction into living organisms (eg, living organisms other than humans).
  • Conditions for the electroporation method vary depending on the host cell and expression vector and are not particularly limited, but include, for example, a poring pulse voltage of 100 to 250V, preferably 175 to 200V.
  • the impedance is also not particularly limited, but may be 30 to 100 ⁇ , preferably 50 to 70 ⁇ .
  • the osmotic pressure of the expression vector solution is also not particularly limited, but may be 300 to 1500 mOsm/kg, preferably 800 to 1200 mOsm/kg.
  • the amount of expression vector added is 5 to 35 ⁇ g, preferably 10 to 30 ⁇ g, per 1 ⁇ 10 6 host cells.
  • the present invention provides a method for producing a target substance encoded by an expression target gene, which includes the step of culturing the above transformant.
  • the transformant (host cell) transformed with the expression vector in which the expression target gene is linked downstream of the promoter of the present invention is cultured in a suitable medium, and the expression target gene is ligated downstream of the promoter of the present invention.
  • the culture conditions for the host cells are not particularly limited as long as they allow the host cells to proliferate and produce the target substance.
  • the target substance can be obtained by collecting it from the culture. Examples of the target substance include a substance encoded by the above-mentioned target gene and a product synthesized by the action of the substance.
  • the promoter of the present invention By using the promoter of the present invention, genetic recombination, genome editing, etc. can be efficiently performed in aquatic invertebrates such as bivalves, and the elucidation of gene functions in aquatic invertebrates such as bivalves is facilitated. This is expected to lead to applications in ecosystem conservation, such as genetic sterilization technology. Furthermore, it is expected that this technology will be applied to the production of superior varieties of bivalves and other edible species, such as by modifying them to have better taste and nutritional composition. Furthermore, it is expected to be applied to impart water purification functions and produce functional proteins.
  • Heart tissue pieces were enzymatically digested with trypsin-EDTA solution (Table 1) at 4°C for 18-21 hours. Thereafter, enzymatic digestion was stopped by adding the same amount of growth medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) (Table 1), and fine cells and debris were removed.
  • FBS fetal bovine serum
  • Heart tissue pieces after enzymatic digestion were explanted into multiwell plates (manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) or T flasks (Nunc, manufactured by Thermo Fisher Scientific, Inc.) and cultured at 20°C.
  • the heart tissue pieces were first attached to the substrate with a small amount of growth medium (Table 1), and the next day, an appropriate amount of medium was added additionally (for a 75 cm T-flask, 6 ml at the time of seeding) , add 9 ml the next day).
  • an appropriate amount of medium was added additionally (for a 75 cm T-flask, 6 ml at the time of seeding) , add 9 ml the next day).
  • the growth medium was replaced with fresh medium every 10 days or when the pH of the medium decreased.
  • the cells were detached from the T-flask using a cell scraper, and a growth medium was added to a new T-flask for subculture.
  • Primary cardiomyocytes derived from these ventricular cells survive for 3 to 4 weeks at 20°C and then tend to gradually degenerate, although some cells survived for more than 3 months. Note that additional supply of CO 2 and humidity was not required.
  • Human HEK293 cells (JCRB9068) were provided by JCRB cell bank. The cells were cultured in Dulbecco's modified Eagle medium (Gibco, manufactured by Thermo Fisher Scientific, Inc.) supplemented with 10% FBS at 37°C in a humidified incubator supplied with 5% CO2 .
  • Dulbecco's modified Eagle medium Gibco, manufactured by Thermo Fisher Scientific, Inc.
  • Example 1 Examination of electroporation conditions> Primary scallop cardiomyocytes cultured for 1 to 2 weeks were used for electroporation. The growth medium was removed, and the cardiomyocytes cultured with FBS-free growth medium were washed and collected using a cell scraper (manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.). The cardiac tissue fragments at the time of explantation were removed by filtering the cell suspension of the collected cardiomyocytes through a sterilized steel mesh with a hole diameter of 125 ⁇ m (manufactured by Yikai Metal Products Co., Ltd.). The obtained cultured cell suspension was centrifuged at 400 ⁇ g for 5 minutes at 20°C, and the precipitated cultured cells were collected, and the cell number and survival rate were measured using a hemocytometer and trypan blue dye exclusion method. .
  • Electroporation was performed using a NEPA21 electroporator and a 2 mm gap electroporation cuvette (manufactured by Nepa Gene Co., Ltd.). 1 ⁇ 10 6 cardiomyocytes cultured for 1 to 2 weeks were resuspended in 100 ⁇ l of Opti-MEM (Gibco, manufactured by Thermo Fisher Scientific, Inc.) containing 10 ⁇ g of plasmid DNA or 10 ⁇ g of mRNA. Since the osmolarity of Opti-MEM is 300 mOsmol/kg without adjustment, the osmolarity was adjusted to 1050 mOsmol/kg by adding 256.7 mg/ml of sucrose. Note that the impedance of the cell suspension was 50 to 60 ⁇ .
  • Electroporation parameters were set as follows. - For pouring pulses, pulse voltage is variable, pulse length 2.5ms, pulse interval 50ms, number of pulses 2, attenuation rate 10%, polarity switching +. - For transfer pulse, pulse voltage 20V, pulse length 50ms, pulse interval 50ms, number of pulses 5, attenuation rate 40%, polarity switching +/-.
  • the cell survival rate was low even under conditions where the voltage was not high, whereas at an osmolarity of 1050 mOsmol/kg, the cell survival rate was improved by an average of 36.4%.
  • Example 2 Production of luciferase vector> (1) Selection of promoters
  • Ostreid herpesvirus-1 (OsHV-1) promoter which is a bivalve infectious virus, the endogenous promoter of the scallop M. yessoensis, and the shrimp infectious virus.
  • a total of 11 types of promoters were selected and studied, including the vitiligo syndrome virus (WSSV) promoter.
  • the selected promoters are shown below.
  • experiments were also conducted with the CMV IE (Cytomegalovirus immediate early) promoter, which is a promoter conventionally used in bivalves, and without the promoter.
  • CMV IE Cytomegalovirus immediate early
  • Ostreid herpesvirus-1 Ostreid herpesvirus-1 (OsHV-1) promoters Poshv027, Poshv029, Poshv072, Poshv080, Poshv088, Poshv117 Endogenous promoters of the scallop M. yessoensis Pmy-act ⁇ , Pmy-ef1 ⁇ , Pmy-ef1 ⁇ Vitiligo syndrome virus (WSSV) promoter Pwsv-ie1, Pwsv465
  • luciferase vector A vector was prepared using the above promoter (Fig. 7).
  • the OsHV-1 promoter was extracted from OsHV-1-infected oyster (Crassostrea gigas) larvae, and the start codon of six genes selected from OsHV-1 (Poshv027, Poshv029, Poshv072, Poshv080, Poshv088, and Poshv117, respectively)
  • the 5' upstream regions of -1201, -1162, -1017, -1038, -1101, and -1069 were cloned into the PCR linearized pNL1.1 vector.
  • the genomic DNA of the Mutsu Bay scallop was extracted from the closed shell muscle using the DNeasy Blood & Tissue Kit (manufactured by QIAGE N.V.), and the start codons of M. yessoensis act ⁇ , ef1 ⁇ and ef1 ⁇ were The 5'-upstream regions of -4706, -3007, and -2221 were cloned into the SpeedCut HindIII (manufactured by Rikaken Holdings, Inc.) linearized pNL1.1 vector.
  • the DNA sequences of the wsv-ie1 promoter and wsv465 promoter were synthesized based on the NCBI database (contracted to Eurofins Genomics), and the 5'-upstream regions of -502 and -472 of the start codon were synthesized by PCR. Cloned into linearized pNL1.1 vector.
  • pNL1.1.CMV[Nluc/CMV] Vector manufactured by Promega Corporation was purchased.
  • bacterial strain DH-5 ⁇ (manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.) and plasmid DNA extraction mini/MIDI kit (manufactured by Favorgen Biotech Corp.) were used.
  • NuceloSpin Gel and PCR Clean-up Kit (manufactured by Takara Bio Inc.) and QIAquick Gel Extraction Kit (manufactured by Qiagen N.V.) were used for PCR cleanup and gel extraction. All molecular cloning was performed using In-Fusion Snap Assembly (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • Table 2 shows the primers used to create the vector.
  • Example 3 Normalization of luminescence>
  • a calculation process was performed in which the number of adherent cells was counted and the luciferase luminescence value was divided by the number of adherent cells.
  • Autofluorescence of scallop cardiomyocytes was used for counting. Using Pmy-ef1 ⁇ luciferase vector, Poshv088 luciferase vector, or Poshv117 luciferase vector, 1 ⁇ 10 6 primary scallop cardiomyocytes were electroporated with a poring pulse voltage of 100 V (other conditions were the same as above). Ta.
  • the R 2 values were 0.95 and 0.54, indicating a positive correlation between the number of adherent cells and the expression level of luciferase.
  • the R 2 value for Pmy-ef1 ⁇ was 0.3
  • the luciferase expression level was normalized by the number of cells.
  • luciferase assay 10 ⁇ g of the luciferase vector prepared above was electroporated into 1 ⁇ 10 6 scallop primary cardiomyocytes at a poring pulse voltage of 100 V (other conditions were the same as above). After 2 days of culture, the growth medium was removed and the cells were washed twice with FBS-free growth medium to leave only adherent cells. Cells were then lysed by adding 100 ⁇ l of 1% PBS-TX per well and incubating for 10 min, and the collected cell lysate was centrifuged at 12000 x g for 5 min to remove undissolved material. did.
  • luciferase assay was performed using the Nano-Glo luciferase assay system (manufactured by Promega Corporation). Luminescence was measured with a Glomax plate reader (Promega Corporation) and normalized to the number of adherent cells in each well. The results are shown in FIG.
  • Poshv117 showed the highest expression, followed by Poshv088. Furthermore, although the CMV IE promoter and Pmy-ef1 ⁇ showed some activity, the activity was significantly lower than that of Poshv117 and Poshv088. The expression level of Poshv117 was 16.1 times that of Pmy-ef1 ⁇ and 24.7 times that of the CMV IE promoter (a promoter traditionally used in bivalves).
  • Example 5 Further optimization of electroporation conditions> Using Poshv117, we further optimized the electroporation conditions for scallop cardiomyocytes. Pouring pulse voltage (100V, 125V, 150V, 175V, 200V), impedance (60 ⁇ , 54 ⁇ , 49 ⁇ , 42 ⁇ , 38 ⁇ ), plasmid vector concentration (1 ⁇ g, 2 ⁇ g, 5 ⁇ g, 10 ⁇ g, 20 ⁇ g), culture after electroporation The study was conducted over different periods (1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, and 6 days).
  • each condition was examined based on a pouring pulse voltage of 200 V, an impedance of 60 ⁇ , a plasmid vector concentration of 10 ⁇ g, and a culture period of 2 days after electroporation.
  • the impedance of 60 to 38 ⁇ was investigated by adding +20 ⁇ l, +40 ⁇ l, +60 ⁇ l, +80 ⁇ l, and +100 ⁇ l of Opti-MEM whose osmotic pressure was adjusted to 1050 mOsmol/kg. The results are shown in FIG.
  • Example 6 Promoter activity evaluation GFP assay> (1) Preparation of EGFP vector The EGFP vector was prepared by replacing the luciferase translation region of the above luciferase vector with the EGFP translation region (EGFP CDS) (FIG. 11). Vector amplification and extraction were performed in the same manner as above.
  • Table 3 shows the primers used to create the vector.
  • scallop cardiomyocytes were stained with an anti-GFP antibody using immunofluorescence.
  • 10 ⁇ g of Poshv117-EGFP vector was electroporated into 1 ⁇ 10 6 primary scallop cardiomyocytes at a poring pulse voltage of 150 V (other conditions were the same as above). After 2 days, cells were fixed with 4% formaldehyde for 15 minutes at room temperature. Thereafter, permeabilization was performed with 0.1% PBS-TX for 20 minutes, and blocking was performed with 3% BSA for 30 minutes at room temperature.
  • GFP assay in zebrafish embryos EGFP vector prepared at 100 ng/ ⁇ l was microinjected into the scutellum (cell body) of zebrafish at the 1-cell stage or 2-cell stage.
  • EGFP vectors Poshv117-EGFP vector, Poshv088-EGFP vector, and pCS2-GFP vector of CMV IE promoter were used as a control. Thereafter, the cells were cultured at 28°C, and observed using a fluorescence microscope (BZ-X800, manufactured by Keyence Corporation) 24 hours after microinjection. The results are shown in FIG. GFP fluorescence was observed in zebrafish embryos only under conditions using the Poshv117-EGFP vector.
  • Example 7 Sequence analysis> The DNA sequences of Poshv117 and oshv117 translated regions were analyzed using NNPP, NSite, CDD programs and manually.
  • Figure 16 shows the arrangement of oshv117 and its adjacent genes.
  • the OsHV-1 gene has a 4600 bp overlap region consisting of oshv116, oshv117, oshv118, and oshv119.
  • the regions are 100% identical in DNA sequence and are complementary (ie, one in the 5'-3' direction and the other in the 3'-5' direction).
  • Poshv117 is composed of the 5'-UTR of oshv117 (233 bp), the entire translated region of oshv118 (669 bp), and the partial 5'-UTR of oshv118 (167 bp).
  • Figure 17 shows sequence analysis of Poshv117 by NNPP and NSite (SEQ ID NO: 1). Transcription start sites were predicted to be at positions -58 and -30 upstream from the start codons of oshv117 and oshv118 by NNPP (neural network-based promoter prediction program). Additionally, a TATA box (TATATAA) was detected at -30 upstream of the transcription start site of oshv117.
  • TATATAA TATA box
  • binding motifs were predicted by NSite (a consensus-based search tool for putative functional motifs) (lowercase letters below indicate portions that differ from the consensus sequence).
  • ⁇ TACGTGGG a conserved sequence that binds mammalian hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) (Homo sapiens, Mus musculus, Rattus norvegicus);
  • ⁇ GGATTGGC putative binding site for mammalian dihydrofolate reductase (DHFR) (M. musculus);
  • DHFR mammalian dihydrofolate reductase
  • MAF mammalian mammary cell activating factor
  • ⁇ ACACCatTACATT an RPG box-like sequence predicted to bind to Ras-associated protein 1 (RAP1) of Saccharomyces cerevisiae, near the TATA box of oshv117.
  • CAATT box consensus sequence T/C)GATTGG(T/C)(T/C)(G/A) was found at the position -91 5' upstream of the oshv117 transcription start site.
  • the Kozak consensus sequence A/G NNATG (A/G) was conserved around the start codon of oshv117.
  • Continuous and discrete palindromes TTCCTGGT and GCCAGGGAA, AATGCGT and ACGCATT; AACATGTT, AAATATTT, TCCATATGGA, TGATATCA
  • three direct repeats CAACAACAA, CTGTATCTGTAT, AAACAACAACAAC
  • Promoter deletion analysis was performed to identify the core promoter region that controls the expression of Poshv117.
  • the mutant promoters used are as follows. Descriptions No. 1 to No. 5 in FIG. 17 correspond to deletion sites in the promoter region.
  • (Sequence number 1) ⁇ Promoter No. 2: 1-902.
  • the upstream region of ORF118 is deleted.
  • Sequence number 32 ⁇ Promoter No. 3: 1-587. Approximately half of the translated region of ORF118 (including the HIF binding motif) is deleted.
  • the full-length sequence had the highest promoter activity, and when the length was shortened from upstream, the promoter activity decreased in proportion to the length.

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Abstract

下記（１）～（４）のいずれかのDNAからなるプロモーターを提供する。 （１）配列番号１～３のいずれかで表される塩基配列を含むDNA、 （２）配列番号１～３のいずれかで表される塩基配列において１又は数個の塩基が置換、付加、又は欠失した塩基配列を含み、プロモーター活性を有するDNA、 （３）配列番号１～３のいずれかで表される塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列を含み、プロモーター活性を有するDNA、 （４）配列番号１～３のいずれかで表される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、プロモーター活性を有するDNA。

Description

新規プロモーター
　本発明は、新規プロモーターに関する。
　貝類をはじめとする水生無脊椎動物は、再生、適応、生殖、老化等において驚異的な生物学的特徴を示し、その基盤となる遺伝子制御を解明することは高い学術的意義がある。しかし、これまで水生無脊椎動物における遺伝子機能の解明は、HeLa細胞を用いたトランスフェクションや、トランスジェニックマウスのようなアッセイ系がないため、きわめて不十分であった。
　一方、二枚貝は、軟体動物門で2番目に大きなクラスに分類され、食用としても重要である。二枚貝において、これまでCMV IE（サイトメガロウイルス最初期 Cytomegalovirus immediate early）プロモーター等の検討がされてきたが（非特許文献１，２，３）、実用的なプロモーターはこれまで見つかっていなかった。
　二枚貝等の水生無脊椎動物における遺伝子機能の解明を進めるには、培養細胞株の樹立や導入遺伝子を高発現させる強力な遺伝子プロモーターの発見が必須であり、これらを利用して再現性が高く遺伝子の作用を定量的に評価できる解析手法の開発が強く求められていた。
Front. Physiol. 9, 1-8 (2018) Mar. Biotechnol. 3, 322-335 (2001) Fish Shellfish Immunol. 103, 438-441 (2020)
　本発明は、新規プロモーターを提供することを課題とする。
　本明細書において、単数形（ａ, ａｎ, ｔｈｅ等）は、本明細書で別途明示がある場合又は文脈上明らかに矛盾する場合を除き、単数と複数を含むものとする。
　上記課題を解決すべく、発明者らは鋭意研究を重ねた結果、カキヘルペスウイルス１型（Ostreid herpesvirus 1、OsHV-1）由来のoshv117プロモーターが、軟体動物細胞を含む様々な動物種の細胞で強力なプロモーター活性を有することを見出した。
　本発明はこれらの知見に基づいて完成されたものであり、以下に示す広い態様の発明を含むものである。
［項１］
　下記（１）～（４）のいずれかのDNAからなるプロモーター：
（１）配列番号１～３のいずれかで表される塩基配列を含むDNA、
（２）配列番号１～３のいずれかで表される塩基配列において１又は数個の塩基が置換、付加、又は欠失した塩基配列を含み、プロモーター活性を有するDNA、
（３）配列番号１～３のいずれかで表される塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列を含み、プロモーター活性を有するDNA、
（４）配列番号１～３のいずれかで表される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、プロモーター活性を有するDNA。
［項２］
　項１に記載のプロモーターを含む発現ベクター。
［項３］
　項１に記載のプロモーターの制御下に発現標的遺伝子が組み込まれている、項２に記載の発現ベクター。
［項４］
　項２又は３に記載の発現ベクターを含む、形質転換体。
［項５］
　水生無脊椎動物である、項４に記載の形質転換体。
［項６］
　発現標的遺伝子がコードする目的物質を生産する方法であって、項４又は５に記載の形質転換体を培養する工程を含む、方法。
　本発明によれば、新規プロモーターを提供することができる。また、上記新規プロモーターを含む発現ベクター、上記発現ベクターを含む形質転換体を提供することができる。
ホタテガイ心筋細胞の培養条件の最適化検討結果を示す。 ホタテガイ心筋細胞のエレクトロポレーションの概要を示す。 実施例１における、エレクトロポレーション条件の最適化検討の結果を示す。 実施例１における、ルシフェラーゼmRNAのエレクトロポレーションの結果を示す。エレクトロポレーション３日後の心筋細胞の様子。 実施例１における、ルシフェラーゼmRNAのエレクトロポレーションの結果を示す。エレクトロポレーション３日後のルシフェラーゼ発現量。 実施例１における、ルシフェラーゼmRNAのエレクトロポレーションの結果を示す。エレクトロポレーション後の細胞生存率。 実施例２におけるルシフェラーゼベクターを示す。 実施例３における、エレクトロポレーション２日後のルシフェラーゼ発現量と付着細胞数の相関を示す。 実施例４における、プロモーター活性評価の結果を示す。 実施例５における、エレクトロポレーション条件の最適化検討結果を示す。Ａ：ポアリングパルス電圧を変化させた際の発現量。Ｂ：ポアリングパルス電圧を変化させた際の細胞生存率。Ｃ：インピーダンスを変化させた際の発現量。Ｄ：インピーダンスを変化させた際の細胞生存率。Ｅ：プラスミドベクター濃度を変化させた際の発現量。Ｆ：プラスミドベクター濃度を変化させた際の細胞生存率。Ｇ：エレクトロポレーション後の培養期間を変化させた際の発現量。Ｈ：エレクトロポレーション後の培養期間を変化させた際の細胞生存率。 実施例６における、EGFPベクターを示す。 実施例６における、ホタテガイ心筋細胞のGFPアッセイ結果を示す。 実施例６における、ホタテガイ血球のGFPアッセイ結果を示す。 実施例６における、HEK293のGFPアッセイ結果を示す。 実施例６における、ゼブラフィッシュ胚のGFPアッセイ結果を示す。 実施例７における、oshv117とその隣接遺伝子の配置を示す。 実施例７における、NNPP及びNSiteによるPoshv117の配列解析結果を示す。 実施例８における、Poshv117のプロモーターデリーション解析結果を示す。 配列番号１～３の配列を示す。 実施例８におけるプロモーターNo.1～No.5の配列を示す。
　一実施形態において、本発明は、下記（１）～（４）のいずれかのDNAからなるプロモーターを提供する。
（１）配列番号１～３のいずれかで表される塩基配列を含むDNA。
（２）配列番号１～３のいずれかで表される塩基配列において１又は数個の塩基が置換、付加、又は欠失した塩基配列を含み、プロモーター活性を有するDNA。
（３）配列番号１～３のいずれかで表される塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列を含み、プロモーター活性を有するDNA。
（４）配列番号１～３のいずれかで表される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、プロモーター活性を有するDNA。
　本明細書において、「プロモーター活性」とは、DNA（遺伝子）のmRNAへの転写を促進する活性を意味する。従って、本発明において「プロモーター活性を有する」とは、いずれか１つ以上の実験系においてDNA（遺伝子）のmRNAへの転写を促進する活性を示すことを意図する。本発明において、あるDNAが、軟体動物、哺乳動物、魚類等に属する細胞を用いた実験系のうち少なくとも一種類において（好ましくは、水生無脊椎動物の細胞のうち少なくとも一種の細胞を用いた系において）上記活性を示せば、当該DNAはプロモーター活性を有すると解釈される。
　プロモーター活性は、好適なレポーター遺伝子を用いることにより、タンパク質の発現が認められるか否かで確認することができる。例えば、プロモーターの制御下に検出可能なタンパク質をコードするDNA（レポーター遺伝子）を組み込んだDNAを細胞へ導入し、そのレポーター遺伝子の遺伝子産物の生産量を測定することにより、プロモーター活性を確認可能である。レポーター遺伝子の例としては、ルシフェラーゼ遺伝子、GFP（Green Fluorescent Protein）遺伝子等の蛍光タンパク質の遺伝子、β－ガラクトシダーゼ（LacZ）遺伝子、β－グルクロニダーゼ（GUS）遺伝子、β－ラクタマーゼ遺伝子等が挙げられる。より具体的には、例えば、後述する本願実施例に記載の方法によりプロモーター活性の測定をすることができる。
　１つの態様において、本発明のプロモーターは、従来のプロモーターであるCMV IE（Cytomegalovirus immediate early）プロモーターと比較して、２倍以上（より好ましくは、３倍以上、さらに好ましくは５倍以上、特に好ましくは７倍以上）のプロモーター活性を有する。
　また、１つの態様において、本発明のプロモーターは、レポーター遺伝子としてGFP遺伝子を用いた場合、蛍光顕微鏡での蛍光観察を行える程度の強いプロモーター活性を有する。
　本発明のプロモーターは、プロモーター活性を有する限り、配列表の配列番号１～３のいずれかで示される塩基配列と実質的に同一の塩基配列からなっても良い。本発明の「プロモーター活性」により、プロモーターの制御下にある（典型的には、例えば、下流に位置する）遺伝子がmRNAへと転写される。
　上記（１）において、配列番号１～３で表される塩基配列を含むDNAであって、当該DNAがプロモーター活性を有するものが包含される。配列番号１～３で表される塩基配列からなるDNAは、Malacoherpesviridae科に属するウイルス由来のプロモーターである。配列番号１で表される塩基配列からなるDNAは、Ostreid herpesvirus 1のoshv117のプロモーターである。配列番号２で表される塩基配列からなるDNAは、Ostreid herpesvirus 1の変異体（Ostreid herpesvirus 1 strain microvariant A及びOstreid herpesvirus 1 strain microvariant B）のoshv117のプロモーターである。配列番号３で表される塩基配列からなるDNAは、Chlamys acute necrobiotic virus(AVNV)のoshv117のプロモーターである。なお、配列番号２は、配列番号１に対し２塩基の置換がされている配列であり、配列番号３は配列番号１に対し５塩基の置換及び１塩基の挿入がされている配列である。
　上記（２）において、置換、欠失、付加又は挿入する１又は数個の塩基の数は、１以上の整数であれば特に限定されない。例えば、１～数十個程度、好ましくは１～30個程度、より好ましくは１～15個程度、さらに好ましくは１～10個程度、特に好ましくは１～５個程度とすることができる。配列番号１～３のいずれかで表される塩基配列において１又は数個の塩基が置換、付加、又は欠失した塩基配列を含む核酸分子であって、当該DNAがプロモーター活性を有するものが包含される。
　ある態様において、置換、付加又は欠失する１又は複数の塩基の数は、配列番号１～３のいずれかで表される塩基配列との塩基配列の同一性が90％以上となるように１～107個程度、好ましくは同一性が95％以上となるように１～54個程度、より好ましくは同一性が98％以上となるように１～21個程度、特に好ましくは同一性が99％以上となるように１～11個程度とすることができる。
　上記（３）において、塩基配列の同一性は、90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上、特に好ましくは99％以上とすることができる。塩基配列の相同性若しくは同一性は、100％未満とすることができる。塩基配列間の相同性及び同一性は、BLAST等の公知のアルゴリズムを用いて決定することができる。配列番号１～３のいずれかで表される塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列を含む核酸分子であって、当該DNAがプロモーター活性を有するものが包含される。
　ある態様において、TATAボックス配列（TATATAA）を有し、且つ配列番号１～３のいずれかで表される塩基配列と90％以上（好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上、特に好ましくは99％以上）の同一性を有する塩基配列であることが好ましい。また、上記において、TATAボックス（TATATAA）の配列が１（又は２又は３）個の塩基配列が置換、欠失、付加又は挿入されていても良い。
　ある態様において、TACGTGGG配列を有し、且つ配列番号１～３のいずれかで表される塩基配列と90％以上（好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上、特に好ましくは99％以上）の同一性を有する塩基配列であることが好ましい。また、上記において、TACGTGGGの配列が１（又は２又は３）個の塩基配列が置換、欠失、付加又は挿入されていても良い。
　ある態様において、GGATTGGC配列を有し、且つ配列番号１～３のいずれかで表される塩基配列と90％以上（好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上、特に好ましくは99％以上）の同一性を有する塩基配列であることが好ましい。また、上記において、GGATTGGCの配列が１（又は２又は３）個の塩基配列が置換、欠失、付加又は挿入されていても良い。
　ある態様において、GAGGGAAGGT（配列番号３６）配列を有し、且つ配列番号１～３のいずれかで表される塩基配列と90％以上（好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上、特に好ましくは99％以上）の同一性を有する塩基配列であることが好ましい。また、上記において、GAGGGAAGGTの配列が１（又は２又は３）個の塩基配列が置換、欠失、付加又は挿入されていても良い。
　ある態様において、ACACCATTACATT（配列番号３７）配列を有し、且つ配列番号１～３のいずれかで表される塩基配列と90％以上（好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上、特に好ましくは99％以上）の同一性を有する塩基配列であることが好ましい。また、上記において、ACACCATTACATTの配列が１（又は２又は３）個の塩基配列が置換、欠失、付加又は挿入されていても良い。
　ある態様において、CAATTボックスコンセンサス配列(T/C)GATTGG(T/C)(T/C)(G/A) （配列番号３８）を有し、且つ配列番号１～３のいずれかで表される塩基配列と90％以上（好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上、特に好ましくは99％以上）の同一性を有する塩基配列であることが好ましい。また、上記において、 (T/C)GATTGG(T/C)(T/C)(G/A)の配列が１（又は２又は３）個の塩基配列が置換、欠失、付加又は挿入されていても良い。
　ある態様において、コザックコンセンサス配列(A/G)NNATG(A/G)を有し、且つ配列番号１～３のいずれかで表される塩基配列と90％以上（好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上、特に好ましくは99％以上）の同一性を有する塩基配列であることが好ましい。また、上記において、 (A/G)NNATG(A/G)の配列が１（又は２又は３）個の塩基配列が置換、欠失、付加又は挿入されていても良い。
　上記（４）において、「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが生じ、非特異的なハイブリダイゼーションが生じないような条件を言う。このような条件は、「1×SSC（0.9M NaCl，0.09M クエン酸三ナトリウム）又は6×SSPE（3M NaCl，0.2M NaH2PO4, 20mM EDTA・2Na，pH7.4）中の42℃でハイブリダイズさせ、さらに42℃で0.5×SSCにより洗浄する」条件が、ストリンジェントな条件の１例として挙げられるが、これに限定されるものではない。このような条件は、例えば、J．Sambrookら，Molecular Cloning, Laboratory Manual，Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989）に記載されている。
　本発明のプロモーターの取得方法としては、特に制限されず、通常の遺伝子工学的手法又は化学合成法により得ることができる。例えば、配列番号１で表される塩基配列からなるDNA については、Ostreid herpesvirus 1に感染したマガキ（Crassostrea gigas）等の貝類から、Ostreid herpesvirus 1のゲノムDNAを抽出し、配列番号１で表される塩基配列からなるDNAをクローニングすることができる。配列番号２で表される塩基配列からなるDNA については、Ostreid herpesvirus 1 strain microvariant Aに感染したマガキ（Crassostrea gigas）等の貝類からOstreid herpesvirus 1 strain microvariant AのゲノムDNAを抽出し、又は、Ostreid herpesvirus 1 strain microvariant Bに感染したマガキ（Crassostrea gigas）等の貝類からOstreid herpesvirus 1 strain microvariant BのゲノムDNAを抽出し、配列番号２で表される塩基配列からなるDNAをクローニングすることができる。配列番号３で表される塩基配列からなるDNA については、Chlamys acute necrobiotic virus (AVNV)に感染したアカザラガイ（Chlamys farreri）等の貝類から、Chlamys acute necrobiotic virus (AVNV)のゲノムDNAを抽出し、配列番号３で表される塩基配列からなるDNAをクローニングすることができる。また、配列番号１～３で示される塩基配列に基づいて、本発明のプロモーターDNAを人工合成することもできる。
　本発明のプロモーターは、従来のプロモーターを比較して二枚貝細胞におけるプロモーター活性が非常に高く、例えば、配列番号１で表される塩基配列からなるプロモーターは、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を用いた場合、従来のプロモーターであるCMV IE（Cytomegalovirus immediate early）プロモーターと比較して約25倍のプロモーター活性を示す（図９）。また、配列番号１で表される塩基配列からなるプロモーターは、レポーター遺伝子としてGFP遺伝子を用いた場合、蛍光顕微鏡にてGFP蛍光を観察することができる。二枚貝において特に有用なプロモーターである。
　また、他の実施形態において、本発明は、上記プロモーターを含む発現ベクターを提供する。
　本発明の発現ベクターは、本発明のプロモーターを、発現標的遺伝子の発現を可能とする発現ベクターに組み込むことで、構築することができる。本発明の発現ベクターでは、本発明のDNAの制御下に発現標的遺伝子が組み込まれている。典型的には、本発明の発現ベクターでは、本発明のDNAの下流に発現標的遺伝子が作動可能に連結されている。
　本発明のプロモーターを組み込む対象となる発現ベクターとしては、宿主細胞内で安定に保持され増殖が可能なものであるならば特に限定されず、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、及び人工染色体ベクター等、宿主細胞に応じて適宜選択することができる。この中でも、プラスミドベクターが好ましい。
　発現ベクターとしては市販されているクローニング用ベクター及び発現用ベクターが利用可能である、例えばpNL1.1／1.2／1.3、pNL2.1／2.2／2.3、pNL3.1／3.2／3.3、pGL4、pGEM T／T easy、pGEMEX－1(以上、Promega Corporation製)、T-Vector pMD20／pMD19、pUC18／19、pUC118／119、pBR322、pMW218／219、（以上、タカラバイオ株式会社製）、pCR4-TOPO、pCR-XL-2-TOPO、pCR-BluntII-TOPO pcDNA3.1/V5-His-TOPO、pcDNA3.4-TOPO、pcDNA3.3-TOPO、pENTR/D-TOPO、pCR8/GW/TOPO、pENTR/SD/D-TOPO、pcDNA3.1 V5-His A／B／C、pPICZ A／B／C（以上、Thermo Fisher Scientific, Inc.製）、pDRIVE、pQE（以上、QIAGE N.V.製）、pBluescript II SK(+/-)（Stratagene社製）pSC-A-amp/kan、pSC-A-amp/kan（以上、Agilent Technologies, Inc.製）、pET、pGEX（Merck KGaA製）、pACYC184（ニッポンジーン株式会社製）、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、センダイウイルスベクター等が挙げられる。
　上記発現ベクターにおいて本発明のプロモーターの下流に配置される発現標的遺伝子は特に限定されない。例えば、発現標的遺伝子は、目的物質、又はその合成に関わる酵素等をコードする遺伝子である。発現標的遺伝子は、これらの目的物質等をコードする核酸分子（例えば、DNA、RNA）と言い換えることもできる。発現標的遺伝子は、異種発現産物をコードする異種遺伝子であっても、宿主細胞が本来有する発現産物をコードする遺伝子であっても、その他の任意のタンパク質、ペプチド、核酸等をコードする遺伝子であってもよい。発現標的遺伝子がコードする目的物質の例としては、GFP等のレポーター蛍光タンパク質、成長促進因子、成熟促進因子、不妊化因子、耐病性獲得因子、Cas9タンパク質、酵素、ホルモン、サイトカイン、ジフテリア等の毒素、その他生理活性ペプチド、トランスポーター、ノンコーディングRNA、RNA干渉におけるshRNA(small hairpin RNA:小ヘアピンRNAもしくは short hairpin RNA:短ヘアピンRNA)等が挙げられる。
　また、他の実施形態において、本発明は、上記発現ベクターを含む、形質転換体を提供する。
　本発明の発現ベクターを導入する宿主細胞としては、本発明のプロモーターがプロモーターとして機能するものであれば特に限定されず、例えば、水生無脊椎動物（貝類、イカ、タコ等）、哺乳動物（ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、サル、チンパンジー、ウマ、ロバ、ハムスター、モルモット等）、魚類（ゼブラフィッシュ、メダカ、ニジマス、サケ、マダイ、ブリ、マグロ等）、環形動物（ミミズ、ゴカイ、ヒル等）、扁形動物（プラナリア等）、刺胞動物（クラゲ、サンゴ、イソギンチャク等）、棘皮動物（ウニ、ヒトデ、ナマコ等）、節足動物（エビ、カニ、昆虫等）、尾索動物（ホヤ等）等が挙げられる。この中でも、水生無脊椎動物が好ましく、水生軟体動物がより好ましい。水生軟体動物としては、例えば、腹足類や二枚貝類といった貝類や、タコ、イカ等の頭足類等が挙げられる。この中でも、貝類がさらに好ましく、二枚貝が特に好ましい。貝類の中でも腹足類としては、例えば、アワビやサザエ等が挙げられる。また二枚貝としては、例えば、ホタテガイ、マガキ、ムラサキイガイ、アサリ、シジミ、ハマグリ、アカガイ、トリガイ、バカガイ、マテガイ、タイラギ、アコヤガイ等が挙げられる。
　形質転換体は、本発明のプロモーターを含む発現ベクターを、一般的な形質転換法、例えばエレクトロポレーション法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、トランスフォーメーション法、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト法、パーティクル・ガン法、アグロバクテリウム法等を用いて宿主細胞に導入することにより得ることができる。なお、本明細書において、「宿主細胞への導入」には、生体から採取した細胞、株化されている細胞への導入のみならず、生体から採取した細胞塊、組織等への導入；生体から採取した細胞を用いて構築した細胞塊、組織等への導入；生体（例えば、ヒト以外の生体）への導入も含まれる。
　エレクトロポレーション法の条件は、宿主細胞や発現ベクターによって異なり、特に限定されないが、例えば、ポアーリングパルス電圧は100～250V、好ましくは175～200Vが挙げられる。インピーダンスも特に限定されないが、30～100Ω、好ましくは50～70Ωが挙げられる。発現ベクター溶液の浸透圧も特に限定されないが、300～1500mOsm/kg、好ましくは800～1200mOsm/kgが挙げられる。また、発現ベクターの添加量は、宿主細胞1×106 cellsに対し、5～35μg、好ましくは10～30μgが挙げられる。
　また、他の実施形態において、本発明は、上記の形質転換体を培養する工程を含む、発現標的遺伝子がコードする目的物質を生産する方法を提供する。
　本発明のプロモーターの下流に発現標的遺伝子が連結されている発現ベクターで形質転換された、上記形質転換体（宿主細胞）を好適な培地で培養し、本発明のプロモーターの制御下で上記発現標的遺伝子を発現させ、目的物質を生産させる。宿主細胞の培養条件は、該宿主細胞の増殖及び目的物質の生産が可能な条件であるならば特に限定されない。培養終了後、培養物から目的物質を回収することにより、目的物質を取得することができる。目的物質としては、上述した目的遺伝子にコードされる物質、及び該物質の働きで合成される生成物が挙げられる。
　本発明のプロモーターを用いることにより、二枚貝等の水生無脊椎動物において遺伝子組み換えやゲノム編集等を効率的に行うことができ、二枚貝等の水生無脊椎動物の遺伝子機能の解明が促進される。それにより、遺伝的不妊化技術等、生態系の保全への応用が期待される。また、二枚貝等食用に用いられるものについて、当該技術を食味、栄養成分組成をより良いものに改変する等の優良品種の作出技術に応用することが期待される。さらに、水質浄化機能の付与や機能性タンパク質の生産に応用することが期待される。
　本発明を製造例及び実施例を用いてより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例には限定されない。
＜ホタテガイ細胞の培養＞
　１～２歳齢のホタテガイ（Mizuhopecten yessoensis）を、女川湾（宮城県）、陸奥湾（青森県）、又は噴火湾（北海道）の養殖場から入手した。
（１）心筋細胞の培養
　ホタテガイから心室を摘出し、穴径0.22μmの滅菌フィルターでろ過した人工海水（Instant Ocean、Aquarium Systems社製）で洗浄した。洗浄後、取得した心臓組織をエタノール消毒した鉗子とはさみで細かく切断し、さらにシェーカーを用いて室温30分間50 rpm/minの条件でDBSS（表１）ですすいだ。その後、DBSSを除去した後、心臓組織片をトリプシン-EDTA溶液（表1）で4℃、18～21時間酵素消化した。その後、同量の10％ウシ胎児血清（FBS）添加増殖培地（表1）を添加することにより酵素消化を停止し、細かな細胞やゴミを除去した。酵素消化処理後の心臓組織片をマルチウェルプレート（住友ベークライト株式会社製）又はTフラスコ（Nunc、Thermo Fisher Scientific, Inc.製）に外植し、20℃で培養した。細胞培養の開始時に、まず、心臓組織片を少量の増殖培地（表1）で基質に付着させ、翌日、適切な量の培地を追加で添加した（75cm2のTフラスコの場合、播種時に6ml、翌日9mlを添加）。この間、外植した心臓組織片から遊離してくる細胞がTフラスコ底面に接着、伸展することで付着性の初代培養細胞を取得した。増殖培地は、10日おき、又は培地のpHが低下したときに新しい培地と交換した。また、Tフラスコ内の付着した初代培養細胞がコンフルエントに達したときに、セルスクレーパーによってTフラスコから細胞を剥離し、新しいTフラスコに増殖培地を加え継代した。この心室の細胞に由来する初代心筋細胞は20℃で３～４週間生存し、その後徐々に変性する傾向にあるが、3か月以上生存する細胞もあった。なお、CO2及び湿度の追加供給は不要であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に記載の各種溶液は、塩酸（HCl）又は水酸化ナトリウム水溶液（NaOH）を用いて全てpH7.4に調整し、実験に使用した。
（２）血球細胞の培養
　ホタテガイの血リンパ液を22ゲージの針を使用して心室から直接抜き取り、すぐに調整アルセバー溶液（MAS（表1））と1：1で混合した。遠心分離せずに、血リンパ-MAS混合物中の血球を2×105 cells/mlで増殖培地に播種し、培地の最終組成を約2％FBS、10％ホタテガイ血リンパ-MAS混合物となるよう調製した。細胞の凝集を防ぐために、採取した血球は播種前に氷上に置いた。初代血球細胞は20℃で2週間生存し、培地の交換により変性が加速した。なお、CO2及び湿度の追加供給は不要であった。
（３）ホタテガイ心筋細胞の培養条件の最適化
　ホタテガイ心筋細胞の培養条件の検討を行った。心臓組織片をトリプシン-EDTA溶液（表1）で4℃、18時間酵素消化したものを用いて、播種密度、培養温度、浸透圧、FBSの有無について以下の（i）～（iv）の条件で培養し、2日目の付着細胞数を、倍率100倍でランダムに撮影した顕微鏡写真5枚からカウントした（N=20）。結果を図１に示す。また、FBS濃度について追加で検討したところ、FBSは2％で十分であることが分かった。この結果から、培養条件を播種密度4×105cells/ml、培養温度10℃、浸透圧1100mOsmol/kg、FBS2％を最適条件として、以降の実験を行った。
　（i）播種密度2×105 cells/ml又は4×105cells/ml
　（ii）培養温度10℃又は20℃
　（iii）浸透圧900 mOsmol / kg又は1100 mOsmol / kg
　（iv）FBS 0％又は10％
＜ヒトHEK293細胞の培養＞
　ヒトHEK293細胞（JCRB9068）は、JCRB細胞バンクから提供されたものを使用した。10％FBSを添加したダルベッコ改変イーグル培地（Gibco、Thermo Fisher Scientific, Inc.製）で、37℃、5％CO2供給の加湿インキュベーターで培養した。
＜ゼブラフィッシュ胚の取得＞
　ゼブラフィッシュは、株式会社名東水園（愛知県）又は株式会社MASUKO（埼玉県）から成魚を購入した。購入した成魚は60cm水槽に収容し、配合飼料を給餌して飼育した。さらに成熟した雌雄のゼブラフィッシュを交配することで受精卵を獲得した。
＜実施例１：エレクトロポレーション条件の検討＞
　1～2週間培養したホタテガイの初代心筋細胞をエレクトロポレーションに使用した。増殖培地を除去し、FBSを含まない増殖培地で培養した心筋細胞を洗浄し、セルスクレーパー（住友ベークライト株式会社製）で回収した。回収した心筋細胞の細胞懸濁液を滅菌した穴径125μmのスチールメッシュ（Yikai Metal Products Co., Ltd.製）でろ過することで、外植時の心臓組織片を取り除いた。得られた培養細胞懸濁液を400×gで5分間、20℃で遠心分離した後、沈殿した培養細胞を回収し、血球計算盤とトリパンブルー色素排除法により細胞数と生存率を測定した。
　エレクトロポレーションについては、NEPA21エレクトロポレーターと2mmギャップエレクトロポレーションキュベット（ネッパジーン株式会社製）を使用して行った。プラスミドDNA10μg又はmRNA10μgを含むOpti-MEM（Gibco、Thermo Fisher Scientific, Inc.製）100μlに、1～2週間培養した心筋細胞1×106cellsを再懸濁した。Opti-MEMの浸透圧は無調整の場合300 mOsmol/kgであるため、スクロース256.7 mg/mlを加えることで浸透圧1050 mOsmol/kgに調整した。なお、細胞懸濁液のインピーダンスは50～60Ωであった。エレクトロポレーションパラメータは以下のとおり設定した。
・ポアーリングパルスの場合、パルス電圧は可変、パルス長2.5ms、パルス間隔50ms、パルス数2、減衰率10％、極性切り替え＋。
・トランスファーパルスの場合、パルス電圧20V、パルス長50ms、パルス間隔50ms、パルス数5、減衰率40％、極性切り替え＋/－。
（１）mRNA非存在下におけるエレクトロポレーション条件の検討
　ホタテガイの心筋細胞におけるエレクトロポレーションの最適条件を見つけるために、75～200Vのポアーリングパルス電圧を、浸透圧300mOsmol/kgと1050mOsmol/kgで検討した（mRNAなしでの検討）。なお、エレクトロポレーションを行わない細胞、又はDNAやmRNAの代わりに蒸留水を加えた細胞をコントロールとした。結果を図３に示す。浸透圧300mOsmol/kgでは電圧が高くない条件においても細胞の生存率は低かったのに対し、浸透圧1050mOsmol/kgでは、細胞生存率は平均36.4％改善された。
（２）ルシフェラーゼmRNA存在下におけるエレクトロポレーション条件の検討
　浸透圧1050mOsmol/kg、ポアーリングパルス電圧75～200Vの条件でルシフェラーゼのmRNAをエレクトロポレーションした細胞を、500μlの増殖培地中の24ウェルプレートに播種し、mRNA存在下での検討を行った。エレクトロポレーションの直後に、細胞生存率をトリパンブルー色素排除法によって決定した。また、ルシフェラーゼアッセイは、エレクトロポレーションの3日後にmRNA処理細胞で実施した。結果を図４～６に示す。
＜実施例２：ルシフェラーゼベクターの作製＞
（１）プロモーターの選定
　強力な活性を有するプロモーターを特定するために、二枚貝感染性ウイルスであるOstreid herpesvirus-1(OsHV-1)プロモーター、ホタテガイM. yessoensisの内在性プロモーター、エビ感染性ウイルスである白斑性症候群ウイルス（WSSV）プロモーター等から合計11種のプロモーターを選択して検討した。選択したプロモーターを以下に示す。また、コントロールとして、二枚貝において従来から用いられてきたプロモーターであるCMV IE（Cytomegalovirus immediate early）プロモーターとプロモーターなしでも検討した。
・検討したプロモーター
　Ostreid herpesvirus-1(OsHV-1)プロモーター
　　Poshv027、Poshv029、Poshv072、Poshv080、Poshv088、Poshv117
　ホタテガイM. yessoensisの内在性プロモーター
　　Pmy-actβ、Pmy-ef1α、Pmy-ef１β
　白斑性症候群ウイルス（WSSV）プロモーター
　　Pwsv-ie1、Pwsv465
（２）ルシフェラーゼベクターの作製
　上記プロモーターを用いてベクターを作製した（図７）。
　OsHV-1プロモーターは、OsHV-1に感染したマガキ（Crassostrea gigas）の幼生より抽出し、OsHV-1から選出した6遺伝子（それぞれ、Poshv027、Poshv029、Poshv072、Poshv080、Poshv088、Poshv117）の開始コドンの-1201、-1162、-1017、-1038、-1101、-1069の5'上流領域を、PCR線状化pNL1.1ベクターにクローニングした。
　ホタテガイM. yessoensisの内在性プロモーターについては、陸奥湾のホタテガイのゲノムDNAを、DNeasy Blood＆Tissue Kit（QIAGE N.V.製）を使用して閉殻筋から抽出し、M. yessoensis actβ、ef1α及びef1βの開始コドンの-4706、-3007及び-2221の5'-上流領域を、SpeedCut HindIII（リカケンホールディングス株式会社製）線状化pNL1.1ベクターにクローニングした。
　WSSVプロモーターについては、wsv-ie1プロモーター及びwsv465プロモーターのDNA配列は、NCBIデータベースに基づき遺伝子合成を行い（Eurofins Genomics社に委託）、開始コドンの-502及び-472の5'-上流領域を、PCR線状化pNL1.1ベクターにクローニングした。
　コントロールであるCMV-IEプロモーターについては、pNL1.1.CMV[Nluc/CMV] Vector（Promega Corporation製）を購入した。
　ベクターの増幅と抽出には、細菌株DH-5α（株式会社ニッポンジーン製）とプラスミドDNA抽出ミニ/ MIDIキット（Favorgen Biotech Corp.製）を使用した。PCRクリーンアップとゲル抽出には、NuceloSpin Gel and PCR Clean-up Kit（タカラバイオ株式会社製）とQIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen N.V.製）を使用した。分子クローニングはすべて、In-Fusion Snap Assembly（タカラバイオ株式会社製）を使用して行った。
　ベクターの作製に使用したプライマーを表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
＜実施例３：ルミネセンスの正規化＞
　ルシフェラーゼ遺伝子が導入された細胞の発光を正規化するために、付着細胞数をカウントし、ルシフェラーゼの発光値を付着細胞数で除する計算処理をおこなった。カウントには、ホタテガイ心筋細胞の自家蛍光を利用した。Pmy-ef1αルシフェラーゼベクター、Poshv088ルシフェラーゼベクター、又はPoshv117ルシフェラーゼベクターを使用して、ホタテガイ初代心筋細胞1×106cellsに、ポアリングパルス電圧100V（他の条件は上記と同様）でエレクトロポレーションを行った。その後、24穴プレートに5×104cells、1×105cells、2×105cellsで播種し、増殖培地500μlで2日間培養した。その後、各ウェルを増殖培地で2回洗浄し、GFPフィルター下、40倍の倍率で長時間露光し（Keyence BZ-X800、株式会社キーエンス製の場合は0.67秒）で観察した。付着細胞から放出された自己蛍光の領域0.77cm2をウェルごとに撮影し、教師あり機械学習による細胞カウントを、ilastik（1.3.3）のピクセル分類及びオブジェクト分類パイプラインを用いて実施した。結果を図８に示す。
　Poshv088及びPoshv117においては、R2値が0.95、0.54であり、付着細胞数とルシフェラーゼの発現量が正の相関関係にあることを示している。Pmy-ef1αについてはR2値が0.3であったが、ルシフェラーゼ発現量（相対発光単位（RLU）値）は細胞数で正規化することとした。
＜実施例４：プロモーター活性評価　ルシフェラーゼアッセイ＞
　ホタテガイ初代心筋細胞1×106cellsに対し、ポアリングパルス電圧100V（他の条件は上記と同様）で上記において作製したルシフェラーゼベクター10μgをエレクトロポレーションした。2日間培養した後、増殖培地を除去し、FBSを含まない増殖培地で細胞を2回洗浄して、付着細胞のみを残した。その後、ウェルごとに1％PBS-TX 100μlを添加し、10分間インキュベートすることにより細胞を溶解した後、回収した細胞溶解物を12000×gで5分間遠心分離して、未溶解の物質を除去した。その後、Nano-Gloルシフェラーゼアッセイシステム（Promega Corporation製）を用いてルシフェラーゼアッセイを行った。Glomaxプレートリーダー（Promega Corporation製）で発光を測定し、各ウェルの付着細胞の数で正規化した。結果を図９に示す。
　Poshv117が最も高い発現を示し、次いでPoshv088が高い発現を示す結果となった。また、CMV IEプロモーターとPmy-ef1αはある程度の活性を示したものの、Poshv117、Poshv088よりも有意に低い結果であった。Poshv117の発現レベルはPmy-ef1αの16.1倍であり、CMV IEプロモーター（二枚貝において従来から用いられてきたプロモーター）の24.7倍であった。
＜実施例５：エレクトロポレーション条件のさらなる最適化＞
　Poshv117を用い、ホタテガイ心筋細胞のエレクトロポレーション条件のさらなる最適化を行った。ポアリングパルス電圧（100V、125V、150V、175V、200V）、インピーダンス（60Ω、54Ω、49Ω、42Ω、38Ω）、プラスミドベクター濃度（1μg、2μg、5μg、10μg、20μg）、エレクトロポレーション後の培養期間（1日、2日、3日、4日、5日、6日）での検討を行った。なお、ポアリングパルス電圧200V、インピーダンス60Ω、プラスミドベクター濃度10μg、エレクトロポレーション後の培養期間2日を基準として、各条件を検討した。なお、インピーダンス60～38Ωの検討は、浸透圧を1050mOsmol/kgに調整したOpti-MEMを+20μl、+40μl、+60μl、+80μl、+100μl追加することによって行った。結果を図１０に示す。
＜実施例６：プロモーター活性評価　GFPアッセイ＞
（１）EGFPベクターの作製
　EGFPベクターは、上記ルシフェラーゼベクターのルシフェラーゼ翻訳領域をEGFP翻訳領域（EGFP　CDS）に置き換えることで作製した（図１１）。ベクターの増幅、抽出については上記と同様の方法で行った。
　ベクターの作製に使用したプライマーを表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
  
（２）ホタテガイ心筋細胞でのGFPアッセイ
　ホタテガイ初代心筋細胞1×106cellsに対し、ポアリングパルス電圧150V（他の条件は上記と同様）でEGFPベクター10μgをエレクトロポレーションした。EGFPベクターとしては、Poshv117-EGFPベクター、Poshv088-EGFPベクター、Pmy-ef1α-EGFPベクター、及びコントロールとしてCMV IEプロモーターのpCS2-GFPベクターを用いた。エレクトロポレーションから2日後に、細胞を蛍光顕微鏡（BZ-X800、株式会社キーエンス製）で観察した。結果を図１２に示す。Poshv117-EGFPベクターを用いた条件においてのみ、蛍光が観察された。
　また、エレクトロポレーションしたホタテガイ細胞から発現した蛍光がGFPシグナルであることを確認するために、ホタテガイの心筋細胞を免疫蛍光法により抗GFP抗体で染色した。ホタテガイ初代心筋細胞1×106 cellsに対し、ポアリングパルス電圧150V（他の条件は上記と同様）でPoshv117-EGFPベクター10μgをエレクトロポレーションした。2日後、細胞を4％ホルムアルデヒドで室温15分間固定した。その後、0.1％PBS-TXで20分間透過処理し、3％BSAで30分間室温でブロッキングを行った。続いて、細胞を0.1％PBS-TXで200倍希釈した抗GFP抗体（ウサギIgG、Invitrogen、Thermo Fisher Scientific, Inc.製）（10μg/ ml）下で、4℃で一晩反応させた。翌日、細胞を、0.1％PBS-TXで200倍希釈した二次抗体（AlexaFlour Plus 594ロバ抗ウサギIgG、Invitrogen、Thermo Fisher Scientific, Inc.製）（10μg/ml）下で、室温で1時間反応させた。その後、細胞を蛍光顕微鏡（BZ-X800、株式会社キーエンス製）で観察した。結果を図１２に示す。蛍光顕微鏡下でGFP及び赤色蛍光タンパク質（RFP）のシグナルが同一のホタテガイ心筋細胞において観察された。この結果から、エレクトロポレーションしたホタテガイ細胞から発現した蛍光がGFPシグナルであることが明らかである。
（３）ホタテガイ血球細胞でのGFPアッセイ
　ホタテガイの血球においては、エレクトロポレーション後の細胞死亡率が高かったため、リポフェクションによりEGFPベクターを導入した。Lipofectamine 3000（Invitrogen、Thermo Fisher Scientific, Inc.製）を用いて、血球をEGFPベクター500ngを含む増殖培地500μlで1日間培養した。EGFPベクターとしては、Poshv117-EGFPベクター、Poshv088-EGFPベクター、Pmy-ef1α-EGFPベクター、及びコントロールとしてCMV IEプロモーターのpCS2-GFPベクターを用いた。その後ベクター含有培地を除去した後に、細胞を蛍光顕微鏡（BZ-X800、株式会社キーエンス製）で観察した。結果を図１３に示す。Poshv117-EGFPベクターを用いた条件においてのみ、ホタテガイの血球でGFP蛍光が観察された。
（４）HEK293細胞でのGFPアッセイ
　HEK293細胞3×105cellsをOpti-MEM（300mOsmol/kg）100μlに懸濁し、ポアリングパルス電圧155VでEGFPベクター10μgをエレクトロポレーションした。EGFPベクターとしては、Poshv117-EGFPベクター、Poshv088-EGFPベクター、及びコントロールとしてCMV IEプロモーターのpCS2-GFPベクターを用いた。エレクトロポレーションから2日後に、細胞を蛍光顕微鏡（BZ-X800、株式会社キーエンス製）で観察した。また、ホタテガイ心筋細胞と同様に、免疫蛍光法による抗GFP抗体での染色も行った。結果を図１４に示す。Poshv117-EGFPベクターを用いた条件においてのみ、HEK293細胞でGFP蛍光が観察された。
（５）ゼブラフィッシュ胚でのGFPアッセイ
　ゼブラフィッシュの1細胞期又は2細胞期の胚盤（細胞体）に、100ng/μl に調製したEGFPベクターをマイクロインジェクションした。EGFPベクターとしては、Poshv117-EGFPベクター、Poshv088-EGFPベクター、及びコントロールとしてCMV IEプロモーターのpCS2-GFPベクターを用いた。その後、28℃で培養し、マイクロインジェクションから24時間後蛍光顕微鏡（BZ-X800、株式会社キーエンス製）で観察した。結果を図１５に示す。Poshv117-EGFPベクターを用いた条件においてのみ、ゼブラフィッシュ胚でGFP蛍光が観察された。
＜実施例７：配列解析＞
　Poshv117及びoshv117 翻訳領域のDNA配列を、NNPP、NSite、CDDプログラム及び手作業で解析した。
　図１６は、oshv117とその隣接遺伝子の配置を示す。OsHV-1遺伝子には、oshv116、oshv117、oshv118、及びoshv119からなる4600bpの重複領域が存在する。当該領域はDNA配列が100％同一であり、相補的に存在する（つまり、1つは5'-3'方向に、もう1つは3'-5'方向に存在する）。
　Poshv117はoshv117の5'-UTR（233 bp）、oshv118の全翻訳領域（669 bp）、及びoshv118の部分的5'-UTR（167 bp）で構成されている。
　図１７は、NNPP及びNSiteによるPoshv117の配列解析を示す（配列番号１）。NNPP（ニューラルネットワークベースのプロモーター予測プログラム）により、転写開始部位がoshv117及びoshv118の開始コドンから上流の-58及び-30の位置であると予測された。また、TATAボックス（TATATAA）がoshv117の転写開始部位の-30上流で検出された。
　また、NSite（推定機能モチーフのコンセンサスベースの検索ツール）により、以下の結合モチーフが予測された（なお、以下の小文字部分はコンセンサス配列と相違する部分を示す）。
・TACGTGGG、哺乳類の低酸素誘導因子1（HIF-1）に結合する保存配列（Homo sapiens、Mus musculus、Rattus norvegicus）;
・GGATTGGC、哺乳類のジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）（M. musculus）の推定結合部位; 
・GAGGGAagGT、哺乳類乳腺細胞活性化因子（MAF）（H. sapiens、M. musculus）の推定結合部位; 
・ACACCatTACATT、oshv117のTATAボックスの近く、Saccharomyces cerevisiaeのRas関連タンパク質1（RAP1）に結合すると推定されるRPGボックスのような配列。 
　また、CAATTボックスコンセンサス配列(T/C)GATTGG(T/C)(T/C)(G/A)が、oshv117転写開始部位の-91位5'上流の位置に見られた。コザックコンセンサス配列(A/G)NNATG(A/G)が、oshv117の開始コドン周辺で保存されていた。また、連続回文配列及び離散回文配列（TTCCCTGGT及びGCCAGGGAA、AATGCGT及びACGCATT; AACATGTT、AAATATTT、TCCATATGGA、TGATATCA）及び3つの直接反復配列（CAACAACAA、CTGTATCTGTAT、AACAACAACAAC）が見つかった。
＜実施例８：プロモーターのデリーション解析＞
　Poshv117の発現を制御するコアプロモーター領域を同定するために、プロモーターのデリーション解析を行った。使用した変異プロモーターは以下の通りである。図１７のNo.1～No.5の記載が、プロモーター領域における欠損部位に該当する。
・プロモーターNo.1：1～1069。全長領域（ORF117の上流約1kbp、Poshv117）。（配列番号１）
・プロモーターNo.2：1～902。ORF118の上流領域を欠損。（配列番号３２）
・プロモーターNo.3：1～587。ORF118の翻訳領域（HIF binding motifを含む）を約半分欠損。（配列番号３３）
・プロモーターNo.4：1～233。ORF118の翻訳領域（HIF binding motifを含む）を全て欠損、ORF117の上流領域のみ。(配列番号３４)
・プロモーターNo.5：1～151。ORF117の上流領域のうちCCAAT boxを含む領域のみ。（配列番号３５）
・プロモーターNo.6：プロモーターの挿入配列なし。
　上記プロモーターをpNL1.1ベクターにクローニングしてベクターを作製した後、実施例４と同様の方法にてルシフェラーゼアッセイを実施した。結果を図１８に示す。
　全長配列が最もプロモーター活性が高く、上流から長さを短くすると、長さに比例してプロモーター活性が低下した。

Claims (6)

  1. 　下記（１）～（４）のいずれかのDNAからなるプロモーター：
    （１）配列番号１～３のいずれかで表される塩基配列を含むDNA、
    （２）配列番号１～３のいずれかで表される塩基配列において１又は数個の塩基が置換、付加、又は欠失した塩基配列を含み、プロモーター活性を有するDNA、
    （３）配列番号１～３のいずれかで表される塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列を含み、プロモーター活性を有するDNA、
    （４）配列番号１～３のいずれかで表される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、プロモーター活性を有するDNA。
  2. 　請求項１に記載のプロモーターを含む発現ベクター。
  3. 　請求項１に記載のプロモーターの制御下に発現標的遺伝子が組み込まれている、請求項２に記載の発現ベクター。
  4. 　請求項２又は３に記載の発現ベクターを含む、形質転換体。
  5. 　水生無脊椎動物である、請求項４に記載の形質転換体。
  6. 　発現標的遺伝子がコードする目的物質を生産する方法であって、請求項４に記載の形質転換体を培養する工程を含む、方法。
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Non-Patent Citations (2)

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