JP2023526847A

JP2023526847A - がんの治療のためのｒｎａ分子

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Publication number: JP2023526847A
Application number: JP2022570641A
Authority: JP
Inventors: パロ，レナート; ビルバウマー，トスカ; ジアン，イェンルォイ; ビートシュルンプ，トミー; セイミヤ，マキコ
Original assignee: Eidgenoessische Technische Hochschule Zurich ETHZ
Current assignee: Eidgenoessische Technische Hochschule Zurich ETHZ
Priority date: 2020-05-29
Filing date: 2021-05-27
Publication date: 2023-06-23
Also published as: CA3178957A1; EP4158022A1; CN115768893A; WO2021239913A1; AU2021279274A1; US20230192782A1; EP3916093A1

Abstract

本発明は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を有するＲＮＡ分子を、対象にする。同様に、本発明は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＤＮＡ配列の転写により得られる、医薬として使用するためのＲＮＡ分子、及び、そのようなＲＮＡ分子を含む医薬組成物も、対象にする。【選択図】なし

Description

本発明は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を有するＲＮＡ分子を、対象にするものである。また、本発明は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＤＮＡ配列の転写により得られる、がんの治療における使用のためのＲＮＡ分子を、対象にするものである。さらに、本発明は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＤＮＡ配列の転写により得られるＲＮＡ分子、又は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＤＮＡ配列をロードされたベクターを有効成分として含む医薬組成物を、対象にするものである。

ゲノムの大規模なシークエンシング及びマッピングにより、拡張された転写領域が存在し、コーディングの可能性が明らかにないＲＮＡが生成されていることが発見された。これらのノンコーディングＲＮＡの多くは、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ又はｍｉＲＮＡのようなよく知られた機能ファミリーに割り当てられるが、これらの転写産物の大部分は機能的に性質不明のままである。特定のクラスの長鎖ノンコーディングＲＮＡ（long non-coding RNA：ｌｎｃＲＮＡ）は、キャップ構造及びポリＡテールのように又は同じ転写機構及び転写後機構の使用のように、ｍＲＮＡの多くの特徴を示すが、タンパク質のための情報をコードする能力がない。しかし、ｌｎｃＲＮＡもまた、細胞の幅広い機能を果たしており、同様に生物の機能を果たしている証拠が増えている（Kopp, F. & Mendell, J.T. (2018). Functional classification and experimental dissection of long noncoding RNAs. Cell. 172, 393-407.）。過去に、ｍＲＮＡにおけるオープンリーディングフレームの保存により、生物種間の関連タンパク質について機能性の特性解析がサポートされる場合が多かったが、ｌｎｃＲＮＡ配列について進化による保存が非常に減少することにより、このタスクが大幅に妨げられる。多くの場合、その機能は、高度に特異的なパートナー分子との相互作用を可能にする特徴的な二次構造に限定されている。したがって、特定のｌｎｃＲＮＡについて潜在している機能的役割を明らかにするために、複雑な研究戦略が必要とされる場合が多い。

ショウジョウバエ属（Drosophila）は、腫瘍の形成及び成長に潜在しているメカニズムを研究するための強力なモデルである（Read, R.D. (2011). Drosophila melanogaster as a model system for human brain cancers. Glia. 59(9):1364-1376；Miles, W.O., Dyson, N.J., and Walker, J.A. (2011). Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila. Dis Model Mech. 4(6):753-761；Gonzalez, C. (2013). Drosophila melanogaster: a model and a tool to investigate malignancy and identify new therapeutics. Nat Rev Cancer 13, 172-183.）。ショウジョウバエ属の中枢脳は、脳腫瘍（brat）遺伝子変異体における、神経幹細胞に由来する脳腫瘍の研究に使用されている（Jiang, Y. & Reichert, H. (2014). Drosophila neural stem cells in brain development and tumor formation. J Neurogenet. 28, 181 -189.）。

lethal-7（ｌｅｔ－７）は、進化的に高度に保存されたマイクロＲＮＡ（microRNA：ｍｉＲＮＡ）をコードし、最初に発見されたｍｉＲＮＡである（Reinhart B.J., Slack F.J., Basson M., Pasquinelli A.E., Bettinger J.C., Rougvie A.E., Horvitz H.R., and Ruvkun G. (2000). The 21 -nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans. Nature. 403, 901-906.）。ショウジョウバエ属において、ｌｅｔ－７は、第２染色体上の遺伝子座であるｌｅｔ－７複合体（let-7 complex：ｌｅｔ－７－Ｃ）中にある。その一次転写産物は、約１７ｋｂのゲノム領域にわたり、ｌｅｔ－７及びｍｉｒ－１２５に並んでｍｉｒ－１００もまたコードし、３つのエクソン及び２つのイントロンを含む（図１Ａ）（Bussing, I., Slack, F.J., and Grosshans, FI. (2008). let-7 microRNAs in development, stem cells and cancer. Trends Mol Med. 14, 400-409.）。

ショウジョウバエ属の発達中に、ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－１００及びｍｉＲ－１２５の発現は、ステロイドホルモンであるエクジソンにより調節される（Sempere, L.F., Dubrovsky, E.B., Dubrovskaya, V.A., Berger, E.M., and Ambros, V. (2002). The expression of the let-7 small regulatory RNA is controlled by ecdysone during metamorphosis in Drosophila melanogaster. Dev Biol. 244, 170-179.）。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ及びショウジョウバエ属の研究において、ｌｅｔ－７は、発達のタイミング制御及び細胞分化のために、必要であることが示されている（Bussing, I., Slack, F.J., and Grosshans, FI. (2008). let-7 microRNAs in development, stem cells and cancer. Trends Mol Med. 14, 400-409.）。３つのｍｉＲＮＡすべての完全欠失を含むハエは、生存可能であり、形態学的に正常のように見えるが、ハエ変異体の成虫が行動及び老化に関する欠陥を示すことにより、ｌｅｔ－７－Ｃが神経発達、神経筋のリモデリング、並びに、成虫の生存期間及び老化のために必要であることが示唆されている（Sokol, N.S., Xu, P., Jan, Y.N., and Ambros, V. (2008). Drosophila let-7 microRNA is required for remodeling of the neuro musculature during metamorphosis. Genes Dev. 22, 1591-1596；Chawla, G., Deosthale, P., Childress, S., Wu, Y.C., and Sokol, N.S. (2016). A let-7-to-miR-125 microRNA switch regulates neuronal integrity and lifespan in Drosophila. PLoS Genet. 12(8): e1006247；Gendron, C.M. & Pletcher, S.D. (2017). MicroRNAs mir-184 and let-7 alter Drosophila metabolism and longevity. Aging Cell. 16, 1434-1438.）。哺乳類において、３つのｍｉＲＮＡはすべて、異なる染色体上に位置する大きな遺伝子ファミリーとして、連帯的に存在する。機能的な冗長性及び複雑さのために、３つのｍｉＲＮＡのすべてについて、哺乳類のホモログの正確な発現パターン及び生物学的関連性は、未解明のままである（Roush, S. & Slack, F.J. (2008). The let-7 family of microRNAs. Trends Cell Biol. 18, 505-516.）。しかし、幾つかのヒトのがんにおいて、ｌｅｔ－７又はｍｉＲ－１２５の誤発現が観察されており、細胞の増殖及び分化の制御におけるこれらｍｉＲＮＡの必須な機能が示唆されている（Roush, S. & Slack, F.J. (2008). The let-7 family of microRNAs. Trends Cell Biol. 18, 505-516.）。

近年、ショウジョウバエ属における、内因性の腫瘍排除のメカニズムが説明された（Jiang, Y., Seimiya, M., Schlumpf, T.B., and Paro, R. (2018). An intrinsic tumour eviction mechanism in Drosophila mediated by steroid hormone signalling. Nature Communications 9, 1-9.）。変態中のエクジソンのシグナル伝達により、腫瘍形成性のｐｈ^５０５細胞を非腫瘍形成性の「変態した」ｐｈ^５０５細胞へと変え、成虫において排除されるようになることが明らかになった。このプロセスの重要なエフェクターとして、ｌｅｔ－７のｍｉＲＮＡ及びｍｉｒ－１２５が特定された。しかし、ショウジョウバエ属においてｌｅｔ－７－Ｃに由来し得る他の転写産物、及び、それらそれぞれの機能が何かは、まだ不明である。

したがって、解決すべき目的の課題は、ショウジョウバエ属におけるｌｅｔ－７－Ｃから更なる転写産物のＲＮＡを提供し、これらの転写産物について生物学的機能及び効果を解明することにある。

この課題は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を有するＲＮＡ分子により、解決される。

同様に、この課題は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＤＮＡ配列の転写により得られる、医薬として使用するための（好ましくはがんの治療に使用するための）ＲＮＡ分子によって、解決される。

さらに、この課題は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＤＮＡ配列の転写により得られるＲＮＡ分子、又は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＤＮＡ配列をロードされたベクター、又は、ＳＥＱＩＤ：ＮＯ２の配列に対して少なくとも８０％をカバーする複数のＲＮＡ断片、を有効成分として含む医薬組成物によって解決される。

図１は、ｌｅｔ－７－Ｃが２つのノンコーディング転写産物をコードし得ることを示す。（Ａ）ショウジョウバエ属における、３つのエクソン（黒塗り）、１つの大きなイントロン及び１つの小さなイントロン（破線）を含む、ｌｅｔ－７－Ｃのゲノム領域である。蛹（さなぎ）の形成後４８時間での眼－触角原基細胞（eye-antennal disc cell）（変態した対照群）と、変態したｐｈ^５０５細胞とについて、ＲＮＡシークエンシング（ＲＮＡ－ｓｅｑ）によるトランスクリプトーム解析では、最初のイントロンにマッピングされた多くのリード（黒色及び灰色のバーは２回の複製を示す）が明らかにされた。（Ｂ）ｌｅｔ－７－Ｃのイントロン配列は、ＦｌｙＢａｓｅで公開されているＲＮＡ－ｓｅｑデータにおいて、観察することができる。注目すべきは、このイントロン配列は、蛹の段階からのサンプルにおいてエンリッチされているが、胚、幼虫及び成虫の段階からのサンプルにおいてエンリッチされていないことである。（Ｃ）エクジソンで処理したｐｈ^５０５培養細胞のＲＮＡ－ｓｅｑ解析では、第１イントロンにおいてマッピングされた多くのシークエンシングリードが示された。成虫の頭部及びＫｃ１６７細胞のＲＮＡＰｏｌＩＩＣｈＩＰに対して、ｍｏｄＥＮＣＯＤＥデータ解析では、第1イントロン内部においてＰｏｌＩＩが強く局在する領域が複数あることが明らかとなり、転写開始部位である可能性が示唆された。このＰｏｌＩＩ局在部位と、シークエンシングリードとに基づいて、一つのｌｎｃＲＮＡをｌｅｔ－Ａと名づけ、もう一つの転写産物をｌｅｔ－Ｂと名づけた。さらに、イントロン１の後半部分をｌ１Ｂと名づけ、以下の実験に使用した。

図２は、発達の間における、ｌｅｔ－７－ＣのｌｎｃＲＮＡ発現の動態を示す。（Ａ－Ｅ）幼虫及び蛹の様々な段階からの、幼虫又は蛹の全体における、ｌｅｔ－７－Ｃの様々なイントロン領域について発現レベルのｑＲＣＲ定量化である。
（Ａ）ｌｅｔ－Ａコード領域、（Ｂ）ｌｅｔ－Ａとｌｅｔ－Ｂとの中間領域、（Ｃ）ｌｅｔ－Ｂコード領域、（Ｄ）ｌｅｔ－Ｂの外側３′領域、を増幅させるために、プライマーを使用した。ここでは、（Ｅ）エクジソンを誘導する遺伝子として知られるＥｉｐ７５Ｂを、対照群として使用した。（Ｆ）様々な時点でエクジソン処理したｐｈ^５０５培養細胞において、ｌｅｔ－７－Ｃの様々なイントロン領域の発現量について、ｑＰＣＲにより定量した。使用したプライマーは（Ａ－Ｄ）と同じである。（Ｃ）発達の様々な時点での、ｌｅｔ－７のｍｉＲＮＡ発現の動態である。（Ｄ）白色の前蛹の唾液腺全体に対するイントロン１配列についてｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションの共焦点画像であり、核（灰色）の周辺に、強いシグナル（矢印）を示す。

図３は、ｐｈ^５０５細胞において、ｌｅｔ－Ａの誘導性発現により、細胞死が急速にもたらされることを示す。（Ａ－Ｆ）様々な条件、例えば、（Ａ）トランスフェクトされていない条件、（Ｂ）銀で処理された条件、（Ｃ）ｌｅｔ－Ａが誘導された条件、（Ｄ）ｌ１Ｂが誘導された条件、（Ｅ）ｌｅｔ－Ｂが誘導された条件、（Ｆ）ｍＣｈｅｒｒｙ（ｍＣ）が誘導された条件、におけるｐｈ^５０５培養細胞を示す、光学顕微鏡写真である。写真はすべて、誘導後２時間の細胞を示す。（Ａ）における矢印は、伸びた形状でプレートに付着しているｐｈ^５０５細胞を示し、（Ａ）における矢印先端は丸い形状で浮いているｐｈ^５０５細胞を示す。（Ｃ）におけるアスタリスクは、死にかけている細胞を示し、（Ｃ）における破線矢印は、異常な形状のｐｈ^５０５細胞を示す。スケールバーは２０μｍである。（Ｇ）ｐｈ^５０５細胞において様々なＲＮＡを誘導した後、３時間（３ｈ）での細胞の生存率を、アラマーブルーで定量化した。このアッセイには、細胞増殖の結果生じる培地の化学的還元に反応して、蛍光を発し、色が変化する酸化還元指示薬が組み込まれている。蛍光を測定し、値が高いほど、培地において生きている細胞が多いことと相関している。（Ｈ）ｐｈ^５０５細胞において様々なＲＮＡを誘導した後、３日（３ｄ）での細胞の生存率を、アラマーブルーで定量化した。（Ｉ）Ｓ２細胞において様々なＲＮＡを誘導した後、３時間での細胞の生存率を、アラマーブルーで定量化した。

図４は、ｐｈ^５０５細胞において、ｌｅｔ－Ａ発現によりアポトーシス細胞死が誘導されることを示す。（Ａ）ｍＣｈｅｒｒｙを発現しているｐｈ^５０５細胞における、アネキシンＶ染色である。（Ｂ）ｌｅｔ－Ａを発現しているｐｈ^５０５細胞におけるアネキシンＶ染色であり、多くの細胞がアポトーシス細胞死を起こすことを示している。（Ｃ）ｍＣｈｅｒｒｙを発現しているｐｈ^５０５細胞におけるＣｅｌｌＲｏｘ染色である。（Ｄ）ｌｅｔ－Ａを発現しているｐｈ^５０５細胞におけるＣｅｌｌＲｏｘ染色である。（Ｅ）ｍＣｈｅｒｒｙ又はｌｅｔ－Ａの誘導中に様々なアポトーシス阻害剤を適用した場合のｐｈ^５０５細胞について、細胞生存率の測定値である。

図５は、ｌｅｔ－ＡのＲＮＡ分子により、細胞死が誘導されたことを示す。（Ａ－Ｃ）（Ａ）ｌｅｔ－Ａ／培地、（Ｂ）ｍＣｈｅｒｒｙ／培地又は（Ｃ）ＵＶ培地で処理した、ｐｈ^５０５培養細胞を示す光顕微鏡画像である。スケールバーは２０μｍである。（Ｄ）ｍＣｈｅｒｒｙ／培地からの精製したＲＮＡ画分で処理されたｐｈ^５０５培養細胞を示す、光学顕微鏡写真である。（Ｅ）ｍＣｈｅｒｒｙ／培地からの精製したＤＮＡ画分で処理されたｐｈ^５０５培養細胞を示す、光学顕微鏡写真である。（Ｆ）ｌｅｔ－Ａ／培地からの精製したＲＮＡ画分で処理されたｐｈ^５０５培養細胞を示す、光学顕微鏡写真である。（Ｇ）ｌｅｔ－Ａ／培地からの精製したＤＮＡ画分で処理されたｐｈ^５０５培養細胞を示す、光学顕微鏡写真である。（Ｈ）ｌｅｔ－Ａ又はｍＣｈｅｒｒｙの誘導中に、培地にＲＮＡ分解酵素（ＲＮａｓｅ）又はＤＮＡ分解酵素（ＤＮａｓｅ）を加えた場合のｐｈ^５０５細胞について、細胞生存率の測定値である。ＲＮａｓｅを加えると培養中の細胞生存率が著しく増加するが、ＤＮａｓｅでは増加しないことに注目されたい。（Ｉ）ｌｅｔ－Ａ、ｌｅｔ－Ｂ、ｌ１Ｂ又はｍＣｈｅｒｒｙ／培地からの精製したＲＮＡで処理されたｐｈ^５０５細胞について、細胞生存率の測定値である。ｌｅｔ－Ａ／培地からの精製したＲＮＡのみが、細胞に対して毒性があった。（Ｊ）ｌｅｔ－Ａ、ｌｅｔ－Ｂ、ｌ１Ｂ又はｍＣｈｅｒｒｙ／培地からの精製したＲＮＡで処理されたＳ２細胞について、細胞生存率の測定値である。ｌｅｔ－Ａ／培地からの精製したＲＮＡは、Ｓ２細胞に対して毒性がなかった。

図６は、ｉｎｖｉｔｒｏで転写された完全長のｌｅｔ－ＡのＲＮＡにより、細胞毒性が誘導されたことを示す。
（Ａ）ｉｎｖｉｔｒｏで転写されたセンス又はアンチセンスのｌｅｔ－ＡのＲＮＡと、ｍＣｈｅｒｒｙのＲＮＡとで処理されたｐｈ^５０５細胞について、細胞生存率である。センスｌｅｔ－ＡのＲＮＡのみが、細胞に対して毒性があった。（Ｂ）超音波処理したｌｅｔ－ＡのＲＮＡで処理されたｐｈ^５０５細胞について、細胞生存率である。超音波処理の繰り返し数が増えるにつれて、ＲＮＡの毒性は失われた。（Ｃ）ｉｎｖｉｔｒｏで転写したｌｅｔ－Ａ、ｌｅｔ－Ｂ又はｍＣｈｅｒｒｙのＲＮＡで処理されたｐｈ^５０５細胞について、細胞生存率である。ビオチン化リボヌクレオチドを用いて転写されたＲＮＡを、細胞抽出物と共にインキュベートし、アフィニティー精製により精製した後に細胞へ適用した。「Ｉｎｐｕｔ」は精製なし、「ＲＮＡ」はアフィニティー精製されたＲＮＡ、「ＦＴ」はアフィニティー精製後のフロースルー（flow through）である。（Ｄ）（Ｃ）と同様にｉｎｖｉｔｒｏで転写してＩｎｐｕｔ又はアフィニティー精製されたＲＮＡについて、ＲＮＡ－ｓｅｑした。ＲＰＫＭ（reads per kilobase million）の数により、精製後ｌｅｔ－Ａについてエンリッチメントが示された。シークエンシングカウントが上位のＲＮＡの中において、ｌｅｔ－７－Ｃが最も多くのリードを有していた。（Ｅ）ｌｅｔ－Ａ配列のうちで、欠失構築物（deletion constructs）、より短い部分及び断片についてのマップである。ＩＶＴｌｅｔ－ＡＩＰは、ｌｅｔ－Ａのうちで、エンリッチされたシークエンシングリードを示す。（Ｆ）一連のｌｅｔ－Ａ欠失配列をコードする構築物を用いてトランスフェクトしたｐｈ^５０５細胞について、細胞生存率である。（Ｇ）ｌｅｔ－Ａの部分ｐ１～ｐ３をコードするベクターを用いてトランスフェクトしたｐｈ^５０５細胞について、細胞生存率である。（Ｈ）ｌｅｔ－Ａの短い断片をコードするベクターを用いてトランスフェクトしたｐｈ^５０５細胞について、細胞生存率である。

図７は、ｉｎｖｉｖｏで成長しているｐｈ^５０５腫瘍に対して、ｌｅｔ－Ａが毒性であったことを示す。（Ａ、Ｂ）（Ａ）ｌｅｔ－Ａ／培地中で又は（Ｂ）ｍＣｈｅｒｒｙ／培地中で、２４時間インキュベートした後のｐｈ^５０５腫瘍を示す共焦点画像である。ｌｅｔ－Ａ／培地中でインキュベートした後、腫瘍細胞は解離され、もはや球状の構造を形成しなくなったことに注目されたい。スケールバーは５０μｍである。（Ｃ、Ｄ）（Ｃ）ｌｅｔ－Ａ／培地でインキュベートしたｐｈ^５０５腫瘍を移植された又は（Ｄ）ｍＣｈｅｒｒｙ／培地でインキュベートしたｐｈ^５０５腫瘍を移植された、宿主のハエ成虫である。ｌｅｔ－Ａ／培地でインキュベートしたｐｈ^５０５腫瘍は成長しなかったが、ｍＣｈｅｒｒｙ培地でインキュベートしたｐｈ^５０５腫瘍は宿主のハエにおいて腫瘍を形成することができた。（Ｅ、Ｆ）（Ｅ）ｌｅｔ－Ａ／培地から又は（Ｆ）ｍＣｈｅｒｒｙ／培地からの精製したＲＮＡと共に、一晩インキュベートした後のｐｈ^５０５腫瘍を示している共焦点写真である。ｌｅｔ－Ａ／培地からの精製したＲＮＡと共にインキュベートした後、腫瘍細胞は解離され、もはや球状の構造を形成しなくなったことに注目されたい。スケールバーは５０μｍである。

図８は、ｌｅｔ－ＡのＲＮＡがまた、哺乳類細胞に対して毒性であることを示す。（Ａ）ショウジョウバエ属のｌｅｔ－Ａ又はＧＦＰを用いてトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞について、細胞生存率である。ｌｅｔ－Ａの誘導発現は、ＨＥＫ細胞に対して毒性であった。（Ｂ）ｌｅｔ－Ａ／培地、ｌ１Ｂ／培地又はｍＣｈｅｒｒｙ／培地からの精製したＲＮＡで処理された様々な哺乳類細胞株について、細胞生存率である。ｌｅｔ－Ａ／培地からの精製したＲＮＡにより、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞、Ｍｃｆ７細胞、ＢＴ８Ａ細胞及びＫ５６２細胞を、死なせることができた。

図９は、Ｔｏｌｌシグナル伝達経路が、ｌｅｔ－Ａに誘導された細胞毒性に必要であることを示す。（Ａ）Ｔｏｌｌシグナル伝達成分のＴＬＲ３、ＭｙＤ８８及びＴＢＫ１に対する阻害剤を用いて処理したｐｈ^５０５細胞について、細胞生存率である。細胞を、まず様々な阻害剤と共に１時間インキュベートし、次に、ｍＣｈｅｒｒｙ／培地又はｌｅｔ－Ａ／培地からの精製したＲＮＡで３時間にわたり処理した。（Ｂ）２種類のＮＦ－κＢ阻害剤で処理したｐｈ^５０５細胞について、細胞生存率である。（Ａ）と同じプロセスにより、細胞を処理した。（Ｃ）Ｔｏｌｌシグナル伝達成分に対する阻害剤で処理したＨＥＫ３９３Ｔ細胞について、細胞生存率である。（Ａ）と同じ阻害剤及びプロセスにより、細胞を処理した。（Ｄ）Ｔｏｌｌシグナル伝達阻害剤を加えて又は加えないで、ｌｅｔ－Ａ／培地又はｍＣｈｅｒｒｙ／培地からの精製したＲＮＡで処理した、ＨＥＫ－ＤｕａｌｈＴＬＲ３細胞におけるＳＥＡＰ活性である。（Ｅ）ＬＰＳで前処理した後に又は前処理なしで、ｌｅｔ－Ａ又はｍＣｈｅｒｒｙの発現を誘導したｐｈ^５０５細胞について、細胞生存率である。ＬＰＳで前処理した細胞を、ｌｅｔ－Ａの誘導により、更に速く死なせることができたことに注目されたい。（Ｆ）ｐｏｌｙ（ｌ：Ｃ）で前処理した後に又は前処理なしで、ｍＣｈｅｒｒｙ／培地又はｌｅｔ－Ａ／培地からの精製したＲＮＡで処理したＨＥＫ３９３Ｔ細胞について、細胞生存率である。ｌｅｔ－Ａ／培地の精製したＲＮＡにより、前処理された細胞を、より速く死なせることができた。

図１０は、処理された細胞において、ｌｅｔ－Ａ／培地により、核小体の体積を減少させ得ることを示す。（Ａ、Ｂ）（Ａ）ｍＣｈｅｒｒｙ／培地（ｍＣｈ）又は（Ｂ）ｌｅｔ－Ａ／培地（ｌｅｔ－Ａ）で処理されたｐｈ^５０５細胞を示す、共焦点画像である。（核小体）フィブリラリン抗体を用いて免疫染色した。単一の細胞とその核との境界について輪郭を描き、矢印は、フィブリラリン免疫蛍光により染色された核小体を指し示す。（Ｃ）核小体の体積を定量化することにより、ｌｅｔ－Ａ／培地で処理されたｐｈ^５０５細胞において核小体の体積が減少したことが示されている。（Ｄ、Ｅ）（Ｄ）ｍＣｈ又は（Ｅ）ｌｅｔ－Ａで処理されたＨＥＫ細胞を示している、共焦点画像である。（核小体）フィブリラリン抗体を用いて免疫染色した。ｍＣｈ処理された細胞において、各々の核小体には、１つの（体積が２５μｍ^３よりも大きい）大きなフィブリラリン染色と、少数の小さな染色と、が含まれる。矢印は、フィブリラリン免疫蛍光により染色された核小体を指し示す。しかし、ｌｅｔ－Ａで処理された細胞において、大きな構造は消失し、核小体において小さな染色が観察される。（Ｆ）ｍＣｈ又はｌｅｔ－Ａで処理されたＨＥＫ細胞において、様々な体積を有する核小体の数の定量化であり、ｌｅｔ－Ａ／培地で処理された細胞において核小体の体積が減少したことが示されている。

図１１は、突然変異を起こさせたｌｅｔ－Ａについて、細胞毒性を比較している。（Ａ）（ｌｅｔ－Ａ８０）ｌｅｔ－Ａについて２０％を３´末端から除去、又は、中立的（neutral）な配列（ｌｅｔＡ８０－Ｈ：ハイグロマイシンの一部、若しくは、ｌｅｔＡ８０－Ｍ：ｍＣｈｅｒｒｙの一部）で置き換えた。ｌｅｔ－Ａｍｕｔ１３及びｌｅｔ－Ａｍｕｔ１３は、ｌｅｔ－Ａの全長にわたり約２０％の塩基交換を含んでいる２つのバリアントを表す。白塗りはｌｅｔ－Ａのコンセンサス配列であり、黒塗りはｌｅｔ－Ａのコンセンサスと比較して突然変異した配列であり、線は欠失した配列である。（Ｂ）Ａに示したｌｅｔ－Ａバリアントは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内にトランスフェクトされ、バリアントの発現が誘導されたものであり、アラマーブルーにより細胞毒性を評価した。

本発明は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を有するＲＮＡ分子に関するものである。

ＳＥＱＩＤＮＯ：２による配列を有するＲＮＡ分子は、本明細書において、ショウジョウバエ属ｌｅｔ－ＡのｌｎｃＲＮＡ（Drosophila let-A lncRNA）、Ｌｅｔ－ＡのｌｎｃＲＮＡ（let-A lncRNA）又は単にｌｅｔ－Ａと呼ばれることもある。好ましい実施形態において、このＲＮＡ分子は一本鎖のものである。

本発明者らは、ｌｅｔ－Ａの発現を誘導すると、ショウジョウバエ属のｐｈｐ^５０５癌細胞を急死させ、死んだ細胞により更にこのＲＮＡが放出され、結果として、近隣の癌細胞に対して毒性があるようになることを見出した。特に、培養したｐｈ^５０５細胞においてｌｅｔ－ＡのＲＮＡを過剰に発現させた場合には、数時間以内に集団全体を急速に細胞死させることを見出した。驚くべきことに、培養中のｐｈ^５０５細胞のサブセットだけが、ウイルスベクターによりトランスフェクトされてＲＮＡを発現しているが、それにも関わらず、培養中の全ての細胞が死んだ。さらに、その培地もまた毒性となり、新たなｐｈ^５０５細胞の培養に適用した場合、更なる細胞死を誘導することができた。これらの結果により、ｌｅｔ－Ａを発現している細胞は、同じ培養物中のトランスフェクトされていない細胞の死をもたらす、何らかの分子を放出することが示唆された。

メカニズムにより束縛されることを望まないが、ｌｅｔ－ＡのＲＮＡは、Ｔｏｌｌシグナル伝達経路を介して作用することができ、アポトーシスを誘導するものと考えられる。Ｔｏｌｌ様受容体（Toll-like receptor：ＴＬＲ）は、微生物病原体が認識される際に、免疫反応を誘導することができる膜タンパク質のファミリーである。このタンパク質のファミリーは、ショウジョウバエ属で最初に発見され、ハエからヒトまで進化的に保存されている。特に、幾つかのＴＬＲ（ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８及びＴＬＲ９）は、二本鎖又は一本鎖のいずれかのＲＮＡを認識し、下流のシグナル伝達を開始することが知られている（Alexopoulou, L., Holt, A.C., Medzhitov, R., and Flavell, R.A. (2001). Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappaB by Toll-like receptor 3. Nature. 413, 732-738.）。

変態を経たｐｈ^５０５腫瘍細胞に由来する、変態した細胞のトランスクリプトーム解析では、他のシグナル伝達経路の中において、Ｔｏｌｌシグナル伝達の顕著な活性化が示された。先天性のこの免疫経路が高度に保存されているという事実はまた、哺乳類細胞がショウジョウバエ属ｌｅｔ－ＡのｌｎｃＲＮＡの曝露に反応する理由を、説明するものである。

本発明によるＲＮＡ分子は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を有するものである。本発明との関連において、「少なくとも８０％の配列同一性を有する配列（sequences having at least 80% sequence identity）」という用語は、それぞれの配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する配列を含む。すべての場合において、この同一性は、配列の全長にわたっての同一性である。

一つの態様において、本発明によるＲＮＡ分子は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２による配列を有するＲＮＡ分子のバリアント、すなわち、ｌｅｔ－Ａである。本明細書において「バリアント（variant）」という用語は、それぞれのＲＮＡについて生物活性のある誘導体を指す。一般に、「バリアント（variant）」という用語は、修飾により生物活性が損なわれない限り、ネイティブな分子に対して１以上の付加、置換（一般に保存的な性質）及び／又は欠失を有するネイティブな配列及び構造を有しており、参照する分子に対して「実質的に相同（substantially homologous）」である分子を指す。一般に、このようなバリアントの配列は、参照する配列に対して高度な配列相同性を有することになり、例を挙げると、２つの配列を整列させたときに、５０％よりも高い、一般に６０％～７０％よりも高い、更に特には８０～８５％以上、例えば少なくとも９０％～９５％以上等の配列相同性を有することになる。ｌｅｔ－Ａの場合、そのバリアントは、癌細胞において、特にショウジョウバエ属のｐｈ^５０５癌細胞において、同様なアポトーシス誘導能を示す。

好ましい実施形態において、ＲＮＡ分子は、ｌｅｔ－Ａと同然である二次構造を有する。例えば、本発明によるＲＮＡ分子は、相補的塩基対により形成される二本鎖のステム構造と、不対塩基により形成されるループ構造とを有する。このステム構造内において、１つ又は２つの不対塩基に起因して、小さなバルジループ又は内部ループが存在していてもよい。さらに、ＲＮＡ分子には、シュードノット構造が含まれていてもよい。

本発明によるＲＮＡ分子は、好ましくは、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）分子である。本明細書においてｌｎｃＲＮＡ分子は、ＯＲＦを実質的に有していない、２００ヌクレオチドよりも多いＲＮＡ分子と定義される。

さらなる実施形態において、本発明は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＤＮＡ配列の転写により得られる、医薬として使用するためのＲＮＡ分子に関するものである。好ましい実施形態において、ＲＮＡ分子は、がんの治療において使用するためのものである。

本明細書において「ＤＮＡ配列の転写により得られる（obtainable by transcription of a DNA sequence）」という用語は、それぞれのＤＮＡの転写生成物（transcription product）又は転写産物（transcript）がＲＮＡ分子であることを意味するものと理解される。したがって、「ＳＥＱＩＤＮＯ：１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＤＮＡ配列の転写により得られるＲＮＡ分子（RNA molecule obtainable by transcription of a DNA sequence having at least 80% sequence identity to SEQ ID NO: 1）」という用語は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＤＮＡ配列から転写され得る任意のＲＮＡ分子、又は、そのようなＲＮＡ分子に対する任意のプロセシングの産物を意味する。特に、本発明によるＲＮＡ分子は、例えば、ＲＮＡメチル化、フォールディング、切断、又は、例えばエクソソーム等の細胞外カーゴ小胞内へのラッピング、等の転写後修飾を受けることにより、加工されていてもよい。

本明細書において「ＤＮＡ配列の転写により得られる（obtainable by transcription of a DNA sequence）」という用語は、ＲＮＡ分子の供給源に関して限定されないものと理解される。本発明によるＲＮＡ分子は、本発明による医薬組成物において使用されるＲＮＡ分子を包含しており、細胞から精製されｉｎｖｉｖｏで転写されたＲＮＡ分子又はｉｎｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡであり得る。

ＲＮＡを細胞から精製可能な方法又はｉｎｖｉｔｒｏで転写可能な方法は、当業者に知られている。例えば、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、カタログ番号１５５９６０１８）を用いることにより、ＲＮＡの精製を行うことができる。このためには、サンプルを、適切な量のＴＲＩｚｏｌ試薬中で溶解させてホモジナイズする。サンプルを、室温で５分間インキュベートし、次に、１／５の量のクロロホルムを加え、インキュベートし、勢いよく混合する。相を分離させるために、サンプルを、１３，０００×ｇ、１８℃で１５分間の遠心分離をする。ＲＮＡを含む水相を、新しいチューブへ移し、イソプロパノールを用いてＲＮＡを沈殿させる。その結果として生じたペレットを、氷冷した７０％エタノールを用いて洗浄し、風乾させ、適切な緩衝液中に溶解させる。

人為的に又は自然にｌｅｔ－Ａを発現している任意の真核細胞から、本発明によるＲＮＡ分子を精製してもよい。一実施形態において、本発明によるＲＮＡ分子は、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ及びＨ．ｓａｐｉｅｎｓの細胞から精製されたものである。好ましい実施形態において、ＲＮＡ分子は、Ｓｆ２１細胞、ｐｈ５０５細胞、Ｓ２細胞、Ｃｌ．８細胞、ＮＩＨ－３Ｔ３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞又はＨｅＬａ細胞から精製されたものであってもよい。

同様に、例えば、ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ、カタログ番号７４１０６）、又は、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ^ＴＭｍＲＮＡＤＩＲＥＣＴ^ＴＭ精製キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、カタログ番号６１０１２）等の市販のキットを使用して、ＲＮＡの精製を行うことができる。

ｉｎｖｉｔｒｏでのＲＮＡの転写のためには、数多くの業務用キットが利用可能であり、例えば、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ^（Ｒ）Ｔ７転写キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、カタログ番号ＡＭ１３３４）が挙げられる。同様に、オリゴヌクレオチド合成によりＲＮＡを提供することができる。

好ましい実施形態において、ＳＥＱＩＤＮＯ：１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＤＮＡ配列の転写により得られるＲＮＡ分子は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＲＮＡ分子である。

本発明は、医薬としての、好ましくはがんの治療における使用のための、これらのＲＮＡ分子の使用に関するものである。

驚くべきことに、ショウジョウバエ属ｌｅｔ－ＡのｌｎｃＲＮＡは、様々な種類の哺乳類癌細胞株に対して毒性があり、進化的に保存された、がんの腫瘍崩壊を引き起こす機能を示唆していることを、本発明者らは見出した。その結果として、本発明によるＲＮＡ分子は、がんの治療に有用である。

このがんは、結腸がん、肺がん、胃がん、食道がん、膵臓がん、胆嚢がん、腎臓がん、膀胱がん、前立腺がん、精巣がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、絨毛がん、卵巣がん、乳がん、甲状腺がん、脳腫瘍、頭頸部がん、悪性黒色腫、皮膚がん、肝臓がん、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病、神経芽細胞腫及び再生不良性貧血からなる群より選択されたものであってもよい。

本発明はまた、がんの治療方法を対象にしており、その治療には、本発明によるＲＮＡ分子の治療有効量の投与が含まれる。

本明細書において「投与（administering）」という用語は、本発明によるＲＮＡ分子又は医薬組成物について有効量を、それを必要とする対象（subject）へ投与することを指す。

例えば、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子（特にｌｎｃＲＮＡ）等の核酸を、細胞へ投与することは、形質導入、トランスフェクション、エレクトロポレーション、転座、融合、貪食、シューティング又はバリスティック（ballistic）等の方法、すなわち、核酸が細胞膜を越えて輸送され得る任意の手段により行われてもよい。

本発明の一態様において、治療により、がんの中に存在している癌細胞について分化及び細胞死が誘導される。

癌細胞の分化は、核小体タンパク質のフィブリラリンに対する抗体を用いた免疫染色により核小体のサイズを特定し、次いで顕微鏡イメージング及び画像処理により、測定してもよい。癌細胞は、正常な細胞に比べて核小体が大きくなっている場合が多い。分化を評価するもう一つの方法は、分化した細胞に特異的な細胞マーカー、例えば、神経細胞マーカー又は筋肉細胞マーカーを使用することである。この目的に向けて、どのマーカーを使用可能であるかは、当業者に知られている。癌細胞の分化はまた、トランスクリプトミクス、免疫蛍光又は他の細胞試験を用いて、測ることができる。

驚くべきことに、ｌｅｔ－ＡのｌｎｃＲＮＡで処理すると、ほとんどの細胞において核小体の体積が減少した。したがって、本発明のＲＮＡ分子は、健康な細胞の核小体の形態を、癌細胞上へと伝えることができる。

本発明はまた、ＳＥＱＩＤＮＯ：１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＤＮＡ配列の転写により得られるＲＮＡ分子を、有効成分として含む、医薬組成物に関するものである。一実施形態において、医薬組成物は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＲＮＡ分子を、有効成分として含んでいる。

本明細書において、医薬組成物は、治療有効量の有効成分と、薬理学的な賦形剤とを含むことが理解される。ＲＮＡ分子を含む医薬組成物を製剤化する方法は、当業者に知られている。特に、医薬組成物中のＲＮＡ分子を安定化させるための方法は、当業者に知られている。

本発明による医薬組成物において、ＲＮＡ分子は、脂質ナノ粒子内、細胞若しくは合成のエクソソーム模倣物内、又はウイルス様粒子内に封入されていてもよい。

本明細書において「脂質ナノ粒子（lipid nanoparticles）」という用語は、形状が球状であり、界面活性剤により安定化された固体脂質コアを含む分子として定義される。コア脂質は、ステロイド、脂肪酸、アシルグリセロール、ワックス、及びそれらの組み合わせであり得る。界面活性剤は、例えば、リン脂質、スフィンゴミエリン、胆汁酸塩（例を挙げるとタウロコール酸ナトリウム）等の生体膜脂質であってもよい。これらの全ては、本発明の医薬組成物に使用される脂質ナノ粒子において、安定剤として利用されてもよい。

本明細書において「細胞若しくは合成のエクソソーム模倣物（cellular or synthetic exosome mimics）」という用語は、タンパク質、核酸又は他の細胞成分を近隣又は遠隔の細胞へ送るカーゴとしての機能を果たすナノサイズの小胞（エクソソーム）であって、細胞に由来する若しくは細胞から精製された、修飾（modifications）を伴う小胞（細胞のエクソソーム模倣物）である、又は、細胞の押し出しのような人為的方法により作り出された小胞（合成のエクソソーム模倣物）であると定義されている。

本明細書において「ウイルス様粒子（virus-like particles）」という用語は、ウイルスの組織及びコンフォメーションに酷似しているが、ウイルスの遺伝物質を含まない、多タンパク質構造体として定義される。

投与前にＲＮＡ分子を活性化させることにより、本発明による医薬組成物又はＲＮＡ分子の効き目を増強させてもよい。このことは、ＲＮＡ分子を細胞抽出物と共にインキュベートすることにより達成することができる。したがって、一つの態様において、治療には、投与前にＲＮＡ分子を細胞抽出物と共にインキュベートすることが含まれる。例えば、本発明によるＲＮＡ分子を、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ及びＨ．ｓａｐｉｅｎｓの細胞からの細胞抽出物と共にインキュベートしてもよい。特に、ＲＮＡ分子を、Ｓｆ２１細胞、ｐｈ５０５細胞、Ｓ２細胞、Ｃｌ．８細胞、ＮＩＨ－３Ｔ３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞又はＨｅＬａ細胞からの細胞抽出物と共にインキュベートしてもよい。

本明細書において「細胞抽出物と共にインキュベートする（incubating with cell extracts）」という用語は、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤を含んでいる抽出緩衝液中で、細胞を、まずホモジナイズするプロセスを指す。次のステップにおいて、このようにして得られた活性な細胞溶解物を、それぞれのＲＮＡ分子（例えば本発明のＲＮＡ分子）と、適当な時間（例えば５から１５分間）混ぜ合わせる。最後に、ＲＮＡ分子を、上述したように精製する。

メカニズムにより束縛されることを望まないが、細胞抽出物と共にインキュベートすることは、本発明によるＲＮＡ分子を活性化及び／又は安定化し、その結果として、ＲＮＡ分子の効き目を更に増強するものと考えられる。

別の実施形態において、本発明は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列をロードされたベクターを、有効成分として含む、医薬組成物に関するものである。一実施形態において、このポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を有するものである。

このベクターは、プラスミドベクター、コスミドベクター、又は、ＲＮＡ発現システム、ウイルス及びこれらの類似体に基づく任意の他のベクターからなる群より選択されたものであってもよい。このウイルスは、レトロウイルス又はレンチウイルスであってもよい。好ましい実施形態において、このウイルスは、アデノウイルス又はアデノ随伴ウイルスである。

本明細書において「ロードされた（loaded）」という用語は、ベクターがプラスミドベクター又はコスミドベクターである場合には、前記ベクターが前記ＤＮＡ配列を含んでいることを意味するものと理解される。このベクターがウイルスである場合、この用語は、ウイルスが前記ＤＮＡ配列を担い、前記ＤＮＡ配列を伴って細胞に形質導入することが可能なことを意味するものと理解される。

別の実施形態において、医薬組成物は複数のＲＮＡ断片を含み、この複数のＲＮＡ断片はＳＥＱＩＤＮＯ：２の配列の少なくとも８０％をカバーする。驚くべきことに、ｌｅｔ－ＡのＲＮＡ分子の複数の断片は、これらの断片がＳＥＱＩＤＮＯ：２の配列の少なくとも８０％をカバーしている限り、完全長のｌｅｔ－Ａ分子と同様の細胞毒性を示すことを、本発明者らは見出した。したがって、ｌｅｔ－ＡのＲＮＡ分子が1つの分子としてではなく、むしろ個々の断片として存在し、これらの断片がＳＥＱＩＤＮＯ：２の配列の少なくとも８０％をカバーする又はまたがる（span）実施形態にも、本発明はまた及ぶ。

本発明による医薬組成物は、がんの治療において有用である。

実施例１
［材料及び方法］

［ハエの遺伝子］
ハエの系統を、標準培地上で維持した。遺伝子の実験はすべて２５℃で行った。ホモ接合型のｐｈ^５０５ＭＡＲＣＨクローンを作り出すために、ｐｈ^５０５ＦＲＴ１９Ａ／ＦＭ７ａｃｔ－ＧＦＰの処女雌を、ｔｕｂ－Ｇａｌ８０ＦＲＴ１９Ａ；ｅｙ－ｆｌｐａｃｔ＞ＳＴＯＰ＞Ｇａｌ４ＵＡＳ－ＧＦＰ雄と交雑させた。

発達の間におけるｌｎｃＲＮＡ発現を測定するために、発達の様々な時点での幼虫及び蛹（ｗ^１１１８）を採取し、ｑＰＣＲ解析用にＲＮＡを抽出した。幼虫については、餌に留まっている３齢幼虫を後期幼虫（ＬＬ）として採取し、餌を離れて小瓶内で徘徊している幼虫を徘徊幼虫として採取した。蛹については、白色の蛹を採取し、分離したプレート内で１、２、３、２４、４８、７２及び９６時間の加齢をさせた。

本研究において、次のハエの系統を使用した：（１）Ｏｒｅ－Ｒ、（２）ｗ^１１１８、（３）ｐｈ^５０５ＦＲＴ１９Ａ／ＦＭ７ａｃｔ－ＧＦＰ、（４）ｔｕｂ－Ｇａｌ８０ＦＲＴ１９Ａ；ｅｙ－ｆｌｐａｃｔ＞ＳＴＯＰ＞Ｇａｌ４ＵＡＳ－ＧＦＰ。

［移植］
移植の実験については、４～６日齢のｗ^１１１８成虫雌を、宿主として使用した（各々の移植についてｎ＞２０）。宿主のハエを、氷冷した金属板上で動けなくさせて、腹側を上にして、一枚の両面粘着テープに貼り付けた。切り裂いた腫瘍組織を、同様のサイズの小片へと切断し、特注のガラス針を使用して、各片を１の宿主の腹部内へと移植した。標識された細胞がこの宿主内へと注入されることを確実にするために、移植はすべて、ＧＦＰ顕微鏡下で行った。移植後、宿主のハエを、ショウジョウバエ属の新鮮な標準培地において１～２時間室温で回復させた後に、２５℃へ移して維持した。

ｉｎｖｉｖｏで成長している腫瘍でｌｅｔ－Ａ培地の毒性を試験するために、移植後１週間のｐｈ^５０５腫瘍を担っている宿主のハエを解剖し、この腫瘍を、対照群の培地（ｍＣＨｅｒｒｙ培地）又はｌｅｔ－Ａ培地のいずれかで２４時間インキュベートした。この腫瘍を、次に、小片へと切断し、新しい宿主のハエ内へと再移植した。

［ｐｈ^５０５細胞株の作製］
ｐｈ^５０５細胞株の確立については、２つから３つの移植後１週間のｐｈ^５０５腫瘍を、宿主のハエから分離し、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）を含んでいるシールズ・サングＭ３昆虫培地（ＵＳＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を使用して３回洗浄した後に、滅菌されたＰＢＳ中で小片に切り裂いた。この細胞を、１ｍｌのＭ３（Ｐ／Ｓ）培地中に再懸濁させ、９６ウェルプレート内に１ウェルあたり２００ｍｌで蒔いた。安定した細胞増殖の後、テラサキプレート（ＧｒｅｉｎｅｒＢｉｏ－Ｏｎｅ）を使用して、単一の細胞株を分離した。細胞株の確認のために、ゲノムＤＮＡを単離し、配列解析を行った。

［唾液腺におけるＲＮＡｉｎｓｉｔｕ］
一分子ＦＩＳＨ（Fluorescence in situ Hybridization（蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション））解析については、ＳｔｅｌｌａｒｉｓＰｒｏｂｅＤｅｓｉｇｎｅｒｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢｉｏｓｅａｒｃｈＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ｌｅｔ－７－Ｃの第１イントロンにまたがっているオリゴヌクレオチドのセットを設計した。このオリゴヌクレオチドは、ＢｉｏｓｅａｒｃｈＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから注文され、Ｑｕａｓａｒ－６７０で標識された。

細胞懸濁のためのＳｔｅｌｌａｒｉｓプロトコルに従って、若干の改良を加えて、ＲＮＡのＦＩＳＨを行った。簡潔に説明すると、白色の蛹からの唾液腺を、切り裂き、ＰＢＳ中で洗浄し、ＰＢＳ中において４％ホルムアルデヒドを用いて室温で１０分間固定した。ＰＢＳで洗浄した後、サンプルを、７０％ＥｔＯＨを用いて４℃で２４時間インキュベートした。次に、サンプルを、洗浄緩衝液（２×ＳＳＣ、１０％ホルムアルデヒド）中において室温で洗浄した。ハイブリダイゼーションのために、ハイブリダイゼーション緩衝液（ＢｉｏｓｅａｒｃｈＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中において１２５ｎＭのプローブセットを加え、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、サンプルを、洗浄緩衝液を用いて３７℃で３０分間の洗浄を２回行い、２回目の洗浄には５００ｎｇ／ｍｌのＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含めた。ＰＢＳを用いて１回洗浄した後、サンプルを、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤（Ｖｅｃｔｏｒｌａｂｓ）を用いて埋め込んだ（mounted）。

［細胞培養及び処理］
ショウジョウバエ属のクローン８（Drosophila Clone 8：Ｃｌ．８）及びｐｈ^５０５の細胞株は、２％ウシ胎仔血清（Fetal Bovine Serum：ＦＢＳ）（ＰＡＮＢｉｏｔｅｃｈ）、２．５％のＦｌｙｅｘｔｒａｃｔ、５μｇ／ｍｌのヒトインスリン（Ｓｉｇｍａ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ，ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したシールズ・サングＭ３昆虫培地（ＵＳＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ）中において、２５℃で維持した。Ｓ２細胞は、１０％ＦＢＳ（ＰＡＮＢｉｏｔｅｃｈ）を補充したシュナイダー培地（Ｇｉｂｃｏ，ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中において、２５℃で培養した。ＳｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａのＳｆ２１細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）は、１０％ＦＢＳ（ＰＡＮＢｉｏｔｅｃｈ）を補充したグレース培地（Ｇｉｂｃｏ，ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中において、２７℃で増殖させた。間葉系幹細胞を除くすべての哺乳類細胞株は、１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ）及び２ｍＭのＬ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）を補充した高グルコースのダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco's Modified Eagle's Medium：ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ）中において成長させた。ＨＥＫ－ＤｕａｌｈＴＬＲ３細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）の成長培地については、１００μｇ／ｍｌのＮｏｒｍｏｃｉｎ、１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ及び５０μｇ／ｍｌのゼオシン（すべてＩｎｖｏｖｏＧｅｎ製）を更に補充した。初代ヒト骨髄由来間葉系幹細胞はＡＴＣＣから入手した（ＰＣＳ－５００－０１２）。これらのものは、製造業者の取扱説明書に従って維持し、前述したように分化させた（Almalki, S.G. & Agrawal, D.K. (2016). Effects of matrix metalloproteinases on the fate of mesenchymal stem cells. Stem Cell Res Ther. 7(1): 129）。

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ＦｕｇｅｎｅＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、製造業者の取扱説明書に従ってトランスフェクトさせた。２日後、１μｇ／ｌのテトラサイクリン（Ｓｉｇｍａ）を使用して転写を誘導させ、一晩インキュベートした後、細胞生存率を測定した。

ＳＥＡＰ活性は、ＱｕａｎｔｉＢｌｕｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を使用して検出し、ＴｅｃａｎＩｎｆｉｎｉｔｅＭ１０００ＰＲＯマイクロプレートリーダーで６５０ｎｍでの吸光度を定量した。

エクジソン経時変化については、細胞を、接種の１日後に５μＭの２０－ヒドロキシエクジソン（Ｓｉｇｍａ）を使用して処理し、所定の時間インキュベートした後にＲＮＡを抽出した。

アポトーシスの誘導については、ｐｈ^５０５細胞を、ＵＶ－Ｃ（９０ｍＪ／ｃｍ^２、２５４ｎｍ）で２回処理した。ＵＶ処理については、細胞を、ＰＢＳ中で洗浄し、ＰＢＳ中においてＵＶ光で照射し、その後に培地に入れ替えた。

ＲＮａｓｅ及びＤＮａｓｅの処理については、１００μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ）又は１００Ｕ／ｍｌのＤＮａｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ）及び１００μＭのＡｇＮＯ_３を、一緒に形質導入細胞へと加えた。３時間後、アラマーブルーを使用して、細胞生存率を測定した。

阻害剤は、次のものを使用した。アポトーシス阻害剤としては、５０μＭの汎カスパーゼ阻害剤Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫ（ＥｎｚｏＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ）、１５μＭのカスパーゼ８阻害剤Ｚ－ＩＥＴＤ－ＦＭＫ（ＥｎｚｏＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ）、０．５μＭのクラステリン（分泌型、ヒト組換え、ＥｎｚｏＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ）を使用し、酸化的ストレスは１ｍＭのトロロックス（６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボン酸、Ｓｉｇｍａ）を用いて低減させた。Ｔｏｌｌシグナル伝達経路の阻害剤としては、３０μＭのＴＬＲ３／ｄｓＲＮＡ複合阻害剤（Ｓｉｇｍａ）、５０μＭのＭｙＤ８８阻害剤Ｔ６１６７９２３（Ａｎａｗａ）、２μＭのＴＢＫ１阻害剤ＭＲＴ６７３０７（Ｓｉｇｍａ）、及び、１μＭのＮＦ－κＢ阻害剤ロリプラム（Ａｂｅａｍ）、２５μＭのピロリジンジチオ炭酸塩（pyrrolidine dithiocarbonate：ＰＤＴＣ、Ｓｉｇｍａ）を使用した。すべての阻害剤の実験について、細胞は、それぞれの阻害剤を用いて１時間の前処理をした後に、誘導した又は抽出した培地を加えた。細胞生存率は、誘導については３時間後に測り、抽出された培地の処理については１時間後に測り、ショウジョウバエ細胞株及び哺乳類細胞株については一晩のインキュベーション後に測った。

Ｔｏｌｌ経路の活性化については、細胞を、１０μｇ／ｍｌのＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ）又は５μｇ／ｍｌのｐｏｌｙ（ｌ：Ｃ）ＨＭＷ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を用いて１時間前処理した。誘導の２時間後に、アラマーブルーを用いて細胞生存率を測定した。

［組換えバキュロウイルスの作製］
クローニングは、Lee et al. （2000）に記載された研究方法に従って行った。ｌｅｔ－Ａ及びｌ１Ｂの断片を、ＥｘｐａｎｄＬｏｎｇＴｅｍｐｌａｔｅＰＣＲＳｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ）を使用してＳ２細胞のゲノムＤＮＡから増幅させ、ｐＢａｃＰＡＫ８＿ＥＧＦＰ中におけるメタロチオネインのプロモーター下でクローン化した。ｌｅｔ－Ｂは、ｐＢａｃＰＡＫ８＿ＥＧＦＰ＿ｌ１Ｂからクローン化した。ウイルスは、ＢａｃＰＡＫバキュロウイルス発現システム（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を使用して、製造業者の取扱説明書に従って、作製し、増幅させ、解析し、採取した。

［哺乳類細胞の発現のためのクローニング］
哺乳類細胞中における誘導性発現については、ｌｅｔ－Ａ、ｌｅｔ－Ｂ、ｌ１Ｂ、ｍＣｈｅｒｒｙ及びＥＧＦＰを、ｐＢａｃＰＡＫ８から、誘導性ＴＲＥプロモーターの制御下においてｐＳＢｔｅｔ（Ａｄｄｇｅｎｅ）へとクローン化した。

ｉｎｖｉｔｒｏでの転写については、断片を、ｐＧＥＭ－ＴＥａｓｙプラスミド中でＴ７プロモーターの制御下においてクローン化した。

［バキュロウイルスを用いたショウジョウバエ属細胞の形質導入］
細胞は、形質導入の１日前に蒔いた。形質導入については、細胞を、まずグレース培地を用いて２回洗浄し、ウイルス接種材料と共に室温で２時間インキュベートした。ウイルスを除去した後、新鮮な培地を加え、細胞を２５℃でさらに１日インキュベートした後に、誘導を行った。特に指定がない限り、構築物の転写は、１００μＭのＡｇＮＯ_３（Ｓｉｇｍａ）を用いて誘導した。条件付けされた培地は、常に、誘導の１日後に採取した。

［細胞生存率の測定］
細胞生存率は、アラマーブルー細胞生存率測定試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、製造業者の取扱説明書に従って、指示された時間の後に測定した。６５０ｎｍでの蛍光を、ＴｅｃａｎＩｎｆｉｎｉｔｅＭ１０００ＰＲＯマイクロプレートリーダーを用いて測定した。

［ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成及び定量的リアルタイムＰＣＲ］
細胞又は培地からのＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、製造業者の取扱説明書に従って抽出した。プライマーとしてオリゴ（ｄＴ）１８を用いるファーストストランド合成キット（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を使用して逆転写させ、ＦａｓｔＳｔａｒｔＥｓｓｅｎｔｉａｌＤＮＡＧｒｅｅｎＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ｒｏｃｈｅ）を用いてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ９６（Ｒｏｃｈｅ）を使用してｑＰＣＲを実行した。発現量は、ＡＴＰａｓｅｃｆ６に対して正規化した。

ｍｉＲＮＡ発現の解析については、ＴａｑＭａｎｍｉＲＮＡ逆転写キット（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＲＮＡを逆転写し、ｑＰＣＲは、ＴａｑＭａｎＳｍａｌｌＲＮＡＡｓｓａｙ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ｌｅｔ－７及び２ＳｒＲＮＡＴａｑＭａｎマイクロＲＮＡ測定プライマーミックス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して行った。

［ＤＮＡ単離］
ＤＮＡは、条件付けされた培地から、フェノール・クロロホルム抽出により精製した。

［アネキシンＶ染色及びＣｅｌｌＲＯＸ染色］
アポトーシスの初期段階を検出するために、細胞を、形質導入の１日後に、２．５ｍＭのＣａＣｌ_２（Ｓｉｇｍａ）、５μｌ／ｍｌのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－コンジュゲートアネキシンＶ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）及び１μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２と共に室温で１０分間インキュベートし、次に、１００μＭのＡｇＮＯ_３を用いて誘導し、幾つかの時点で画像化した。ＲＯＳの存在を検出するために、ＣｅｌｌＲＯＸＤｅｅｐＲｅｄ試薬（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。細胞を２．５μＭのＣｅｌｌＲＯＸ試薬と共に３０分間インキュベートした後に、誘導を行った。核は、１μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２でも染色した。画像は、ＬｅｉｃａＭＺ１６ＦＡ蛍光顕微鏡を使用して撮影した。

［ｉｎｖｉｔｒｏでのＲＮＡ転写及び精製］
ＲＮＡは、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔＴ７転写キット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して、製造業者の取扱説明書に従って、直線化されたｐＧＥＭプラスミドから転写した。そのＩＶＴ生成物（The IVT products）は、ＭＥＧＡｃｌｅａｒキット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して精製した。この転写産物について濃度及びサイズは、ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ４２００（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して測った。

活性のある細胞抽出物は、（Crevel, G. & Cotterill, S. (1991). DNA replication in cell-free extracts from Drosophila melanogaster. EMBO J. 10, 4361-4369.）に少し変更を加えるだけで、説明されているように調製した。細胞は、ＰＢＳを用いて２回洗浄し、次に、ダウンスホモジナイザー（ＰｅｓｔｌｅＢ）内における抽出緩衝液（ｐＨ７．５且つ１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｖ／ｖ％のエチレングリコール、２５０ｍＭのショ糖、１００ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのＤＴＴ、２ｍＭのＡＴＰ、ＰｈｏｓＳＴＯＰホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）及びｃＯｍｐｌｅｔｅ^ＴＭプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ））中で、４３×１０^６個の細胞を氷上において加圧破砕（dounced）した。その溶解物を、２０，０００ｇ、４℃で１０分間、遠心分離した。その上清を取り、ＰｉｅｒｃｅＢＣＡタンパク質アッセイキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により総タンパク質濃度を測測った。３５μｌの抽出物（約４ｍｇ／ｍｌのタンパク質）を、（１５μｌの抽出緩衝液で希釈した）３７５ｎｇのＩＶＴＲＮＡと混ぜ合わせて、２５℃で１５分間インキュベートした後、ＴＲＩｚｏｌ抽出によりＲＮＡを精製した。

ビオチン化したＲＮＡを、デチオビオチン－１６－ＵＴＰ（ＴｒｉＬｉｎｋＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の存在下でｉｎｖｉｔｒｏでの転写により製造した。得られた転写産物を、活性な細胞抽出物と共にインキュベートした。ビオチンで標識したＲＮＡを単離するために、この混合物を、２０μｌのＤｙｎａｂｅａｄｓＭｙＯｎｅストレプトアビジンＴ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に２５℃で１５分間インキュベートした。その後、別の２０μｌのビーズを加え、再び２５℃で１５分間インキュベートした。次に、ビーズを、抽出緩衝液で２回洗浄し、溶出緩衝液（２ｍＭのアビジン（ＩＢＡ）を含む抽出緩衝液）中において２５℃で１５分間溶出させた。その溶出液及びフロースルーを、ＴＲＩｚｏｌ抽出により精製した。

精製したＲＮＡは、まず、Ｒｉｂｏ－ＺｅｒｏＧｏｌｄｒＲＮＡ除去キットを用いてリボソームＲＮＡを激減させ、次に、残っているＲＮＡを、ＩｌｌｕｍｉｎａＴｒｕＳｅｑＳｔｒａｎｄｅｄＬｉｂｒａｒｙＰｒｅｐＫｉｔにかけることにより、配列を決定した。得られたライブラリは、Ｎｅｘｔ５００において、ペアエンド（paired end）３８で配列を決定した。

［免疫組織化学及び抗体］
腫瘍は、（１×ＰＢＳ中の）２％パラホルムアルデヒド中において室温で２５分間固定し、ＰＢＳＴ（０．５％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００を含む１×ＰＢＳ）中で数回洗浄した。腫瘍を、一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートし、続けて、室温で数回洗浄し、二次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。数回の洗浄後、サンプルを、（ＰＢＳＴ中において１：２００の）ＤＡＰＩと共に室温で２０分間インキュベートし、次にＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ中に埋め込ませて（mounted）、－２０℃で保存した後に画像化した。

本研究において使用した一次抗体は、ニワトリ抗－緑色蛍光タンパク質（green fluorescent protein：ＧＦＰ）（１：１０００、Ａｂｅａｍａｂ１３９７０）であり、二次抗体は、Ａｌｅｘａ４８８－コンジュゲート抗ニワトリ（１：５００、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）であった。

［顕微鏡検査］
免疫蛍光による画像を、ＬｅｉｃａＴＣＳＳＰ８共焦点顕微鏡で記録した。移植された腫瘍がある成虫のハエを、ＮｉｋｏｎＳＭＺ１２７０顕微鏡で撮影した。画像は、ＩｍａｇｅＪ、Ｉｍａｒｉｓ、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ及びＡｄｏｂｅＩｌｌｕｓｔｒａｔｏｒを使用して処理した。

［トランスクリプトーム解析］
トランスクリプトーム解析は、ｍＲＮＡシークエンシングにより行った。ＲＮＡは、エクジソン（５μＭの２０－ヒドロキシエクジソン（Ｓｉｇｍａ））を用いた処理の１６時間後に、ｐｈ^５０５培養細胞から単離した。ＡｒｃｔｕｒｕｓＰｉｃｏＰｕｒｅＲＮＡ単離キット（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＲＮＡを抽出し、ＳＭＡＲＴＳｅｑ２ＮｅｘｔｅｒａＸＴを用いてライブラリ作成し、ＩｌｌｕｍｉｎａＮｅｘｔＳｅｑ２５００又はＮｅｘｔｓｅｑ５００で配列を決定した。

［バイオインフォマティクスによる解析］
短いリードは、Ｂｏｗｔｉｅ２．２．３に関するＴｏｐＨａｔ２．０．１２を使用して、パラメータに「――ｖｅｒｙ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ」、ＩＶＴリードのセグメント長を１８として用いて、ＢＤＧＰｄｍ６ゲノムアセンブリにアラインした。アラインしたリードから、Ｒ３．５．１及びｅｄｇｅＲ３．２４．３を使用して、差次的発現を呼び出した。

ｍｉＲＮＡ発現に関するＲＰＫＭ値の外部データは、ＦｌｙＢａｓｅ（２０１８＿０６公開）から読み出した。

実施例２

［ｌｅｔ－７複合体は２つの推定ノンコーディングＲＮＡをコードする］
我々は、以前の研究において、ショウジョウバエ属における内因性の腫瘍排除のメカニズムを発見した（Jiang et al., 2018）。変態の間におけるエクジソンのシグナル伝達により、腫瘍形成性のｐｈ^５０５細胞は、非腫瘍形成性の「変態した」ｐｈ^５０５細胞へと変換され、成虫において排除されるようになる。このプロセスの重要なエフェクターとして、ｍｉＲＮＡのｌｅｔ－７及びｍｉｒ－１２５が特定された。ショウジョウバエ属におけるｌｅｔ－７複合体（ｌｅｔ－７－Ｃ）は第２染色体上に位置し、その一次転写産物は、ｌｅｔ－７及びｍｉｒ－１２５の他にもｍｉｒ－１００をコードしており、約１７ｋｂのゲノム領域にまたがっており、３つのエクソン及び２つのイントロンからなる（図１Ａ）。変態したｐｈ^５０５細胞について、ＲＮＡ－ｓｅｑによる詳細なトランスクリプトーム解析では、驚くべきことに、ｌｅｔ－７－Ｃのイントロン領域に多くのリードがマッピングされていることが観察された（図１Ａ）。これらのリードは、あるサンプル群においては第１イントロンの５´領域中で特にエンリッチであり、別のサンプル群においては第１イントロンの後半において特にエンリッチであった（図１Ａ）。このことは、ｌｅｔ－７－Ｃが、ｍｉＲＮＡに関してｐｒｉ－ＲＮＡの他に、さらにノンコーディング転写産物をコードしている可能性を示唆している。注釈の付いていない（non-annotated）これらの新たな転写産物が他のトランスクリプトームのデータベースに存在するか否かを調べるために、我々は、ＦｌｙＢａｓｅにおいて公開されている、様々な発達の段階での様々な細胞及び組織から作成されたＲＮＡ－ｓｅｑのデータを、検索した。

実際に、幾つかのサンプル及び細胞株において、イントロン配列をまた観察することができた（図１Ｂ）。興味深いことに、このイントロン配列が特に蛹の段階からのサンプル中において検出され、胚、幼虫又は成体の段階において検出されなかったことから、これらの転写産物の発現が変態でのエクジソンのシグナル伝達の発現に関連する可能性があることが示唆されている（図１Ｂ）。

我々は以前の研究において、幼虫のｐｈ^５０５変異細胞が、宿主のハエ成虫へと移植された後に急速な増殖を続け、新生物腫瘍（neoplastic tumors）を生じさせ得ることを示した（Jiang et al., 2018）。我々は、移植された腫瘍を宿主の成虫から分離させ、この腫瘍を解離させ、解離させた細胞をハエ培地中で培養し、それにより、ｐｈ^５０５初代細胞株を確立させた。エクジソンによりｌｅｔ－７－Ｃ中におけるノンコーディング転写産物の発現を誘導することが可能か否かを試してみるために、ｐｈ^５０５細胞をエクジソン（ecdysone）と共に一晩培養する処理をして、ポリアデニル化されたＲＮＡを分離し、ＲＮＡ－ｓｅｑによるトランスクリプトーム解析を行った。同様に、この解析では、第１イントロンの後半にマッピングされた多くのリードが示され（図１Ｃ）、エクジソンのシグナル伝達により特定のノンコーディング転写産物の発現が誘導されることが示唆された。さらに、成虫の頭部及びＫｃ１６７細胞について、ＲＮＡＰｏｌＩＩＣｈＩＰに関するｍｏｄＥＮＣＯＤＥデータの解析により、第１イントロン内においてＰｏｌＩＩが強く局在する複数の領域があることが明らかになった（図１Ｃ）。これらの観察結果により、ｌｅｔ－７－Ｃの遺伝子座がさらに複雑であり、３つのｍｉＲＮＡに関する一次転写産物に加えて、少なくとも２つのｌｎｃＲＮＡ転写産物をコードしていることが示唆された（図１Ｃ）。ＰｏｌＩＩの局在部位及びシークエンシングのリードに基づいて、第１エクソンとイントロンの前半とからなる１つのｌｎｃＲＮＡをｌｅｔ－Ａと名づけ、第１イントロンの後半内の配列からなるもう１つの転写産物をｌｅｔ－Ｂと名づけた（図１Ｃ）。興味深いことに、ｌｅｔ－７－Ｃのエクジソン誘導性発現のために必要な、以前に発見された３つのエクジソン応答配列（ecdysone responsive element：ＥｃＲＥ）は、全て、ｌｅｔＢの転写産物中に位置している（図１Ｃ）。

［発達の間における２つのｌｎｃＲＮＡについてｉｎｖｉｖｏでの発現］
ｌｅｔ－７－Ｃにおける２つのｌｎｃＲＮＡがｉｎｖｉｖｏで発現しているか否かをさらに調べるために、エクジソンを用いてｐｈ^５０５培養細胞を処理し、幾つかの時点でＲＮＡを回収し、様々なプライマー対を使用して第１イントロン内における幾つかの領域の発現をｑＰＣＲにより定量した。未処理のｐｈ^５０５細胞と比較して、エクジソンに曝露した後には、両方の転写産物の発現を検出することができた（図２Ａ）。ｌｅｔ－Ｂ転写産物の発現はエクジソン処理後１日で初めて観察され、一方、ｌｅｔ－Ａは基底レベルに留まっていた（図２Ａ）。ｌｅｔ－Ｂの発現量は、最初の２日間は同程度で、３日目及び４日目においてわずかに増加した（図２Ａ）。その一方で、ｌｅｔ－Ａの発現量は、エクジソン処理後の最初の２日間においてｌｅｔ－Ｂよりも少なかったが、その後、連続的に増加した（図２Ａ）。このことにより、３つのＥｃＲＥを全て含むｌｅｔ－ＢのｌｎｃＲＮＡがエクジソンに応答して最初に発現し、その後の時点になってｌｅｔ－Ａが発現することが示された。

次に、２つのｌｎｃＲＮＡがハエの発達の間においてどのように発現されるかを解析した。ｌｅｔ－７－Ｃ遺伝子座の発現は幼虫から蛹への移行時にエクジソンのシグナル伝達により調節されるため、野生型の幼虫及び蛹を、幼虫から蛹への移行及び蛹の形成後の間における発達の様々な時点で回収し、ＲＮＡを抽出し、ｌｅｔ－７のイントロンについて様々な領域に関するｑＰＣＲを行った（図２Ｂ）。３齢幼虫後期（late 3rd larval instar：ＬＬ）及び徘徊幼虫（wandering larval：ＷＬ）期では、２つのｌｎｃＲＮＡは両方とも基底レベルで発現していた（図２Ｂ）。白色の蛹（white pupae：ＷＰ）において、ｌｅｔ－Ａとｌｅｔ－Ｂとの両方の発現が増加し始めた（図２Ｂ）。エクジソンで処理した培養細胞と同様に、初期にはｌｅｔ－Ｂの方がｌｅｔ－Ａよりも発現量の倍率変化が高く、ｌｅｔ－Ｂが最初に発現することが示唆された（図２Ｂ）。蛹の形成後（after pupae formation：ＡＰＦ）の最初の３時間（Ｐ１～Ｐ３）の間において、ｌｅｔ－Ｂの発現は増加しなかった。対照的に、ｌｅｔ－Ａの発現は、囲蛹殻形成の早い時間の間に増加し続けた（図２Ｂ）。両方のｌｎｃＲＮＡの発現は、ＡＰＦの２４時間で減少し、ＡＰＦの４８時間、７２時間及び９６時間で基底レベルしか検出できなかった（図２Ｂ）。２つのｌｎｃＲＮＡの発現動態は、既知のエクジソン応答性遺伝子Ｅｉｐ７５Ｂの発現動態と非常によく似ているが（図２Ｂ）、ｌｅｔ－７のｍｉＲＮＡの発現パターンに対して有意差を示した（図２Ｃ）。白色の前蛹の唾液腺全体に対して、ｌｅｔ－Ａ及びｌｅｔ－Ｂの両方の配列をｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションしたところ、核の周辺で強いシグナルが示され、非常に高い確率で合成の高活性部位を反映している（図２Ｄ）。これらの結果により、２つのｌｎｃＲＮＡは、正常な発達において蛹の初期に一時的に発現し、ｌｅｔ－７のｍｉＲＮＡと比較して異なる発現プロファイルを見せることが示された。

実施例３

［培養細胞における２つのｌｎｃＲＮＡについて誘導性発現の効果］
２つのｌｎｃＲＮＡについて潜在的な機能の特性を明らかにするために、ｌｅｔ－Ａ又はｌｅｔ－ＢのいずれかのｌｎｃＲＮＡを発現する銀誘導性ウイルスベクターを用いて、ｐｈ^５０５培養細胞に形質導入した。さらに、対照群としてのｍＣｈｅｒｒｙ又は（ｌ１Ｂと名づけた）第１イントロン後半全体のいずれかを形質導入した（図１Ｃ）。トランスフェクトされていない細胞（図３Ａ）又は銀のみを用いて処理したｐｈ^５０５細胞培養（図３Ｂ）において、ほとんどの細胞は、伸びた形状でプレートに付着しているか（３Ａ中の矢印）又は丸い形状で培地中に浮いており（３Ａ中の矢印先端）、死んだ細胞はごくわずかであった。しかし、ｌｅｔ－Ａの発現を誘導した場合には、驚くべきことに、３時間以内にほぼ全てのｐｈ^５０５細胞が死に（図３Ｃ、アスタリスク）、わずかに残った細胞は異常な形状であった（図３Ｃ、破線矢印）。ｐｈ^５０５細胞においてｌｅｔ－Ａ、ｌｅｔ－Ｂ、ｌ１Ｂ又はｍＣｈｅｒｒｙを誘導した場合には、そのような効果は観察されなかった（図３Ｄ～Ｆ）。ｐｈ^５０５細胞において様々なＲＮＡを活性化させた場合の細胞生存率を定量するために、アラマーブルーのアッセイを使用した。処理しなかった対照群の細胞とは対照的に、ｐｈ^５０５細胞においてｌｅｔ－Ａを発現させた３時間後に、細胞生存率は著しく低下した（図３Ｇ）。しかし、ｌｅｔ－Ｂ、ｌ１Ｂ又はｍＣｈｅｒｒｙを誘導した場合には、細胞生存率に影響を及ぼさなかった（図３Ｇ）。これらのＲＮＡのいずれかが長期的に影響を及ぼすか否かを調べるために、誘導後３日での細胞生存率を測定した。予想どおりに、ｌｅｔ－Ａを誘導した場合に、ほとんどの細胞が死んだ（図３Ｈ）。一方、ｌｅｔ－Ｂの発現のみが細胞生存率を弱々しく減少させ、ｌ１Ｂ又はｍＣｈｅｒｒｙの誘導は細胞生存率に全く影響を及ぼさなかった（図３Ｈ）。これらの結果により、ｐｈ^５０５培養細胞に対して、ｌｅｔ－ＡのｌｎｃＲＮＡ発現には毒性があるが、ｌｅｔ－Ｂには毒性がないことが示された。ｌｅｔ－Ａが培養細胞に対してこのような強い表現型を示したため、このｌｎｃＲＮＡに着目して更に研究を進めることに決めた。

興味深いことに、ｌｅｔ－Ａの効果は、細胞型に特異的であるように思われた。Ｓ２細胞又はＣｌ８細胞において、ＲＮＡを形質導入して発現を誘導した場合には、細胞は死なず、生存率に影響を及ぼさなかった（図３Ｉ）。

ｌｅｔ－Ａ発現で細胞がどのように死ぬのかを調べるために、アポトーシスマーカーであるアネキシンＶに関する免疫染色を行った。ｍＣｈｅｒｒｙを発現させた対照群の培養において、観察された細胞死はごくわずかであった（図４Ａ）。対照的に、ｌｅｔ－Ａを発現させた培養において、誘導の４０分後に早くも、ほとんどの細胞がアポトーシス細胞死を起こしていた（図４Ｂ）。次に、ＣｅｌｌＲＯＸアッセイを使用して、酸化的ストレスによる細胞死が起こるか否かを試験した。ｍＣｈｅｒｒｙの発現は、ｐｈ^５０５細胞における酸化的ストレスに少しの変化も誘導しなかった（図４Ｃ）。しかし、ｐｈ^５０５細胞においてｌｅｔ－Ａを発現させた場合には、細胞の酸化的ストレスが著しく上昇することが観察された（図４Ｄ）。次に、ｌｅｔ－Ａを発現している間のｐｈ^５０５細胞に対して、汎カスパーゼ、カスパーゼ８、ＢＡＸに対する幾つかのアポトーシス阻害剤又は酸化的ストレス阻害剤を適用して、全ての条件において、アポトーシス細胞死の阻害により培養中の生存細胞が増加した（図４Ｅ）。これらの結果を総合すると、ｐｈ^５０５細胞においてｌｅｔ－Ａを発現させることにより、急速なアポトーシス細胞死を誘導可能であることが示された。

［細胞毒性はｌｅｔ－ＡのＲＮＡ分子により誘導される］
ｐｈ^５０５細胞の小さなサブセットのみがウイルスベクターにより形質導入されたため、培養中のほぼ全ての細胞がｌｅｔ－Ａ誘導後の短時間で死んだことが観察されたのは、驚くべきことであった（図３Ｇ）。我々は、形質導入された細胞が何らかの分子を放出し、その結果として培地を毒性にして、さらに、培養中の形質導入されていない細胞の死を誘発したものと推測した。このことを試験するために、ｐｈ^５０５細胞においてｌｅｔ－Ａを発現させ（又は対照群としてｍＣｈｅｒｒｙのＲＮＡを発現させ）、その培地（以後、ｌｅｔ－Ａ／培地又はｍＣｈｅｒｒｙ／培地と呼ぶ）を回収し、回収したその培地を、未処理のｐｈ^５０５細胞の別のプレートに加えた。ｌｅｔ－Ａ／培地の添加により、ほとんどのｐｈ^５０５細胞が１時間以内に死んだ（図５Ａ）。逆に、ｍＣｈｅｒｒｙ／培地を加えても効果はなかった（図５Ｂ）。培地の毒性が一般的な細胞のアポトーシスによるものか否かを試験するために、未処理のｐｈ^５０５細胞をＵＶにより死なせ、培地を回収し、それを新しいプレートのｐｈ^５０５細胞に加えた。ｌｅｔ－Ａ／培地とは異なり、このＵＶ／培地はｐｈ５０５細胞に影響を及ぼさず（図５Ｃ）、培地の毒性はｌｅｔ－Ａの誘導性発現によるものであることが示唆された。

培地中のエフェクター分子の特性を明らかにするために、ｐｈ^５０５細胞においてｌｅｔ－Ａの発現を誘導し、ほとんどの細胞が死んだ後に培地を回収した。次に、その培地からＲＮＡ又はＤＮＡのいずれかを単離し、ＴＲＩｚｏｌ抽出により２回精製し、精製画分をｐｈ^５０５細胞に加えた。ｍＣｈｅｒｒｙ／培地から精製したＲＮＡ又はＤＮＡは、ｐｈ^５０５培養細胞に対して、少しの影響も及ぼさなかったことが示された（図５Ｄ、Ｅ）。しかし、ｌｅｔ－Ａ／培地から精製したＲＮＡは全ての細胞を死なせることができた（図５Ｆ）のに対して、ＤＮＡはそうではなかった（図５Ｇ）ことから、毒性はＲＮＡ分子を介していることが示唆された。この結果を更に確認するために、誘導の間に、培地中にＲＮａｓｅ又はＤＮａｓｅを加えた。明らかに、培地中にＲＮａｓｅを加えることにより細胞生存率が上昇したが、ＤＮａｓｅではそうではなかったことから、エフェクターはＲＮａｓｅ感受性分子であることが確認された（図５Ｈ）。さらに、細胞生存率の試験により、他のＲＮＡ（ｌｅｔ－Ａ、ｌ１Ｂ又はｍＣｈｅｒｒｙ）の培地からの精製したＲＮＡがｐｈ^５０５細胞を殺さないため、毒性はｌｅｔ－Ａの特異的発現によることが示された（図５Ｉ）。また、ｌｅｔ－Ａ／培地からの精製したＲＮＡを用いてＳ２細胞を処理しても影響がなかったため、このＲＮＡの毒性もまた、ｌｅｔ－Ａの形質導入と同様に細胞特異的であった（図５Ｊ）。

［細胞毒性は、ｉｎｖｉｔｒｏで転写された完全長のｌｅｔ－ＡのＲＮＡにより誘導され得る］
この毒性がｌｅｔ－Ａそのものにより引き起こされるのか否かを更に試験するために、センス又はアンチセンスのｌｅｔ－Ａ又はｍＣｈｅｒｒｙを、ｉｎｖｉｔｒｏで転写させ（in vitro transcribed：ＩＶＴ）、その毒性をｐｈ^５０５細胞で試験した。単離されＩＶＴされたｌｅｔ－ＡのＲＮＡを用いてｐｈ^５０５細胞を処理した場合には、生存率に影響を及ぼさなかった。しかし、まずＩＶＴされたｌｅｔ－ＡのＲＮＡを細胞抽出物と共にインキュベートして、次にｐｈ^５０５細胞に加えた場合には、その細胞を死なせることができた（図６Ａ）。さらに、センス配列を有するＲＮＡのみが細胞を死なせることができ、アンチセンス配列を有するＲＮＡは死なせることができなかった（図６Ａ）。また、ＩＶＴされたｌｅｔ－ＡのＲＮＡを超音波処理により断片化させた後にインキュベートして、ｐｈ^５０５細胞に適用した場合には、もはやｐｈ^５０５細胞を死なせることができなくなった（図６Ｂ）。これらの結果により、エフェクター分子はｌｅｔ－Ａであるが、細胞毒性を誘導するためには、更なるプロセシング及び／又は修飾を必要とすることが示唆された。

このことを更に確認するために、ビオチン化ｌｅｔ－Ａをｉｎｖｉｔｒｏで転写し、細胞抽出物と共にインキュベートし、ビオチン－ストレプトアビジンのアフィニティー精製によりＲＮＡを単離した。精製したｌｅｔ－ＡのＲＮＡは、ＩｎｐｕｔのＲＮＡと比較して、ｐｈ^５０５細胞に対してより強い毒性効果を示した（図６Ｃ）。対照的に、ｉｎｖｉｔｒｏで転写して同じ手順により処理した、ｌ１ＢとｍＣｈｅｒｒｙとのいずれもＲＮＡも、ｐｈ^５０５培養細胞を死なせることができなかった（図６Ｃ）。次に、アフィニティー精製したＲＮＡを用いて、ｔｏｔａｌＲＮＡ－ｓｅｑを行った。図６Ｄに示すように、アフィニティー精製後のｌｅｔ－Ａ配列は、Ｉｎｐｕｔサンプルと比較してエンリッチされていた。また、シークエンシングカウントが最も多いＲＮＡの間で、ｌｅｔ－７－Ｃは、シークエンシングリードが最も多かった（図６Ｄ）。

ｌｅｔ－Ａは約６ｋｂの長さを有し、活性化するために更なる修飾及び／又はプロセシングを必要とするため、我々は、完全長ｌｅｔ－Ａ内における必須領域又は短い配列を特定しようと試みた。まず、ｌｅｔ－Ａの３´末端から始まる一連の欠失構築物（deletion constructs）を作製し、一つ一つの構築物を発現するウイルスベクターを用いてｐｈ^５０５細胞にトランスフェクトした（図６Ｅ、ｒ１～ｒ１６）。ｌｅｔ－Ａの完全長ＲＮＡとは対照的に、欠失構築物の全体では、徐々に減少する毒性が示され、誘導からわずか３日後に細胞を死なせることができた（図６Ｆ）。ＲＮＡ－ｓｅｑ解析（図６Ｄ）から、ｌｅｔ－Ａ内において短いシークエンシングリードがエンリッチされた幾つかの領域を観察した（図６Ｅ、ＩＶＴｌｅｔ－Ａｓｅｑ）。これらのシークエンシングの結果に基づいて、次に、完全長ｌｅｔ－Ａを３つの短い断片（ｌｅｔ－Ａｐ１～ｐ３）へと分割した（図６Ｅ）。再び、これらの短い断片をｐｈ^５０５細胞において発現させると、３つの短いＲＮＡでは全て、毒性の減少が示された（図６Ｇ）。２つ又は３つの短いＲＮＡを一緒に発現させた場合にのみ、完全長ｌｅｔ－Ａと同じくらい効率的にｐｈ^５０５細胞を死なせることができた（図６Ｇ）。最後に、シークエンシングの結果において最もエンリッチされた領域からの、単一の短い配列のみを発現する構築物を試験した（図６Ｅ）。ｐｈ^５０５細胞において誘導した場合には、これらの短い配列も全て、組み合わせた（全て混ぜた）場合を除いて、細胞を死なせる活性が著しく減少したことが示された（図６Ｈ）。これらの実験を総合すると、ｌｅｔ－Ａ内の複数の領域は毒性に対して相加効果を有しており、最大の効率で作用するためには完全長の配列を要することが示された。

実施例４

［ｐｈ^５０５腫瘍組織は、ｌｅｔ－Ａ／培地及び精製したｌｅｔ－ＡのＲＮＡにより消滅させることができる］
ｌｅｔ－Ａ／培地及び精製したＲＮＡによりｐｈ^５０５培養細胞を死なせることができるため、このＲＮＡはｉｎｖｉｖｏで成長している腫瘍に対しても毒性があるかもしれないという仮説を立てた。我々はまず、ｐｈ^５０５変異体クローンを含んでいる成虫原基（imaginal discs）を、宿主のハエ成虫へと移植し、これらのハエにおいて成長している腫瘍を回収した。１週間後の腫瘍を担っている宿主のハエを解剖し、この腫瘍を、対照群の培地（ｍＣｈｅｒｒｙ培地）又はｌｅｔ－Ａ／培地のいずれかと共に、２４時間インキュベートした。ｌｅｔ－Ａ／培地と共にインキュベートした後に、この腫瘍組織は解離した（図７Ａ）。対照的に、対照群の培地中でインキュベートした腫瘍において、細胞は、依然として腫瘍の球状（tumor spheres）を形成しており、腫瘍組織の大部分は目に見える変化を示していない（図７Ｂ）。さらに、宿主のハエ成虫へと再移植した後、ｌｅｔ－Ａ／培地－インキュベートした腫瘍は宿主のハエにおいて成長できなくなったが（図７Ｃ）、対照群の培地－インキュベートした腫瘍は依然として腫瘍の形成を引き起こした（図７Ｄ）。これらの結果により、ｌｅｔ－Ａ／培地はｉｎｖｉｖｏで形成された腫瘍に対しても毒性があることが示された。

次に、ｌｅｔ－Ａ／培地からの精製したＲＮＡが同じ効果を有するか否かを試験した。同様に、ｌｅｔ－Ａ／培地－精製ＲＮＡと共にインキュベートした腫瘍は、解離し（図７Ｅ）、再移植後に腫瘍を形成することができなくなった。対照的に、対照群の培地からのＲＮＡと共に一晩インキュベートした腫瘍は、腫瘍形成性のままであり、再移植後に成長することができた（図７Ｆ）。

実施例５

［ｌｅｔ－ＡのＲＮＡは、その毒性効果を哺乳類細胞においても発揮する］
ｌｅｔ－ＡのｌｎｃＲＮＡはショウジョウバエ属の癌細胞において急速なアポトーシスを誘導することができるため、このＲＮＡが哺乳類細胞に対しても同じ効果を有するか否かを試験することは、興味深いことであった。そのために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対してショウジョウバエ属のｌｅｔ－Ａを用いてトランスフェクトし、細胞生存率を測定した。驚いたことに、ショウジョウバエ属のｌｅｔ－Ａは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対しても毒性があり、ほとんどの細胞は一晩のインキュベート後に死んでいた（図８Ａ）。さらに、ｌｅｔ－Ａ／培地からの精製したＲＮＡの画分も、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を死なせことができたが、ｌ１Ｂ／培地又はｍＣｈｅｒｒｙ／培地からのＲＮＡでは死なせることができなかった（図８Ｂ）。次に、ＨｅＬａ細胞、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞、Ｍｃｆ細胞、ＢＴ８Ａ細胞及びＫ５６２細胞を含めた、他の幾つかの哺乳類細胞株を、ｌｅｔ－Ａ／培地からの精製したＲＮＡと共に処理した。実際に、精製したＲＮＡはこれら細胞株を全て死なせることができ（図８Ｂ）、ｌ１Ｂ／培地又はｍＣｈｅｒｒｙ／培地からの精製したＲＮＡは同じ効果を有していなかった（図８Ｂ）。これらの結果により、ショウジョウバエ属のｌｅｔ－Ａが、哺乳類細胞においても活性な、進化的に保存された、腫瘍崩壊を引き起こす機能を有することが示された。

実施例６

［Ｔｏｌｌシグナル伝達経路は、ｌｅｔ－Ａに対する細胞応答の間に活性化される］
ショウジョウバエ属及び哺乳類細胞の両方において潜在しているメカニズムを明らかにするために、このプロセスの間にどのようなシグナル伝達経路が関与している可能性があるのか調査した。ｌｅｔ－Ａにより誘導される細胞死のためにＴｏｌｌシグナル伝達経路を要するか否かを試験するために、ｐｈ^５０５細胞において、様々な成分を標的とした幾つかの阻害剤を適用した（図１０Ａ）。受容体であるＴＬＲ３をブロックした場合、細胞生存率の増加が観察された（図９Ａ）。さらに、アダプタータンパク質であるＭｙＤ８８やキナーゼであるＴＢＫ１を含めた更に下流の成分に対して、阻害剤を適用した場合には、細胞生存率の更なる増加が観察された（図９Ａ）。さらに、最も下流の転写因子であるＮＦ－κＢに対する２つの阻害剤を使用した場合にも、更に良い細胞生存率がもたらされた（図９Ｂ）。次に、同じ阻害剤を使用して、哺乳類ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＴｏｌｌシグナル伝達をブロックした。同様に、この処理により、ＨＥＫ細胞において、ｌｅｔ－Ａにより誘導される毒性を抑制し、細胞生存率を著しく増加させることができた（図９Ｃ）。

次に、Ｔｏｌｌシグナル伝達に対するレポーターとして、胚の分泌型アルカリホスファターゼ（Secreted embryonic alkaline phosphatase：ＳＥＡＰ）を発現する、ＨＥＫ－ＤｕａｌｈＴＬＲ３細胞株を使用した。ＳＥＡＰ活性は、未処理の状態では低かったが、Ｔｏｌｌシグナル伝達経路のインデューサーとして知られたポリイノシン－ポリシチジル酸（polyinosine-polycytidylic acid：Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ））を用いて処理すると上昇した（図９Ｄ）。ＨＥＫ－ＤｕａｌｈＴＬＲ３細胞を、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を用いて処理すると、これらの細胞においてＳＥＡＰ活性を増加させることができた（図９Ｄ）。ＨＥＫ－ＤｕａｌｈＴＬＲ３細胞を、ｍＣｈｅｒｒｙ／培地を用いて処理した場合には、ＳＥＡＰ活性の増加は観察されなかった（図９Ｄ）。しかし、ｌｅｔ－Ａ／培地を用いて細胞を処理することにより、細胞においてＳＥＡＰ活性を上昇させることができ（図９Ｄ）、Ｔｏｌｌシグナル伝達が誘導されたことが示唆された。さらに、Ｔｏｌｌ経路の阻害剤を加えた場合には、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）で処理した細胞及びｌｅｔ－Ａで処理した細胞の両方において、ＳＥＡＰ活性が強く低下した（図９Ｄ）。

最後に、Ｔｏｌｌシグナル伝達のインデューサーであるが細胞死を引き起こさない（図９Ｅ）リポ多糖類（lipopolysaccharide：ＬＰＳ）を用いて、ｐｈ^５０５細胞を前処理して、Ｔｏｌｌシグナル伝達の他のアクチベーターに対して細胞を敏感にさせた。ＬＰＳで前処理したｐｈ^５０５細胞において、ｍＣｈｅｒｒｙを誘導した場合には、少しの効果もなかった（図９Ｅ）。対照的に、ＬＰＳで前処理したｐｈ^５０５細胞において、ｌｅｔ－Ａを誘導した場合には、さらに早く細胞を死なせ、１時間以内に全ての細胞が死んだ（図９Ｅ）。同様に、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）で前処理したＨＥＫ細胞も、ｌｅｔ－Ａに対して更に敏感になり、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を用いた処理をされていない細胞と比較して、生存率が更に低下した（図９Ｆ）。これらの結果を総合すると、ショウジョウバエ属及びヒトの癌細胞の両方において、ｌｅｔ－Ａにより誘導された細胞死に関して、Ｔｏｌｌシグナル伝達経路が必要であることが示された。

実施例７

［突然変異を誘発された配列の作製及び解析］
ｌｅｔ－Ａの８０％構築物（80% let-A construct：ｌｅｔＡ８０）については、ＰＣＲにより、３´末端からｌｅｔ－Ａの２０％を除去した。ｌｅｔＡ８０－ＨについてはＨｙｇＲの一部を、ｌｅｔＡ８０－ＭについてはｍＣｈｅｒｒｙの一部を、３´末端でｌｅｔＡ８０と融合させ、転写サイズを６ｋｂ程度に保った。両方の構築物を、テトラサイクリンで誘導可能なＣＭＶ駆動型（CMV-driven）の発現プラスミド内へとクローン化した。

突然変異を誘発されたｌｅｔ－Ａのバリアントについては、セミランダム方式において手作業で突然変異生成を行った。簡潔に説明すると、ｌｅｔ－Ａを３つの断片（Ｌｅｔ－Ａ５´ １～１９１３、１９１４～３８６０、３８６１～５９４７）へと分け、分子内の局所的な塩基対形成を尊重しながら、手作業でセミランダムに塩基を交換した。合成を可能にするために、塩基導入はＧ／Ｃを優先し、断片のサイズを２，０００塩基程度に保った。各々の断片は、隣接する断片と重複するように６０ｂｐ延長させた。合成は、ＩＤＴ（ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により行った。このＤＮＡ断片と、テトラサイクリンで誘導可能なＣＭＶ駆動型の発現ベクターとは、ＨｉＦｉＤＮＡＡｓｓｅｍｂｌｙＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＮＥＢＥ２６２１）を使用して組み立てた。精製した後、３つのベクターの全てを、Ｔ－ＲＥｘＨＥＫ２９３Ｔ細胞でのトランスフェクトのために使用した。１μｇ／ｍＬのテトラサイクリン（Ｓｉｇｍａ）を用いて一晩誘導した後、アラマーブルー細胞生存率試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して細胞生存率を測定した。

Claims

ＳＥＱＩＤＮＯ：２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を有するＲＮＡ分子。
ＳＥＱＩＤＮＯ：１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＤＮＡ配列の転写により得られるＲＮＡ分子である又は請求項１に記載されたＲＮＡ分子である、医薬として使用するためのＲＮＡ分子。
がんの治療に使用するための、請求項２に記載されたＲＮＡ分子。
前記がんは、結腸がん、肺がん、胃がん、食道がん、膵臓がん、胆嚢がん、腎臓がん、膀胱がん、前立腺がん、精巣がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、絨毛がん、卵巣がん、乳がん、甲状腺がん、脳腫瘍、頭頸部がん、悪性黒色腫、皮膚がん、肝臓がん、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病、神経芽細胞腫及び再生不良性貧血からなる群より選択される、請求項３に記載された使用のためのＲＮＡ分子。
前記がんは癌細胞を含み、前記治療は前記癌細胞において分化及び／又は細胞死を誘導する、請求項３又は請求項４のいずれかに記載された使用のためのＲＮＡ分子。
前記治療は、投与前に前記ＲＮＡ分子を細胞抽出物と共にインキュベートすることを含み、特に、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ又はＨ．ｓａｐｉｅｎｓの細胞からの細胞抽出物と共にインキュベートすることを含む、請求項２から請求項５のいずれか一項に記載された使用のためのＲＮＡ分子。
ＳＥＱＩＤＮＯ：１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＤＮＡ配列の転写により得られるＲＮＡ分子を有効成分として含む、医薬組成物。
前記ＲＮＡ分子が、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を有する、請求項７に記載された医薬組成物。
複数のＲＮＡ断片を有効成分として含む医薬組成物であって、前記複数のＲＮＡ断片がＳＥＱＩＤＮＯ：２の配列の少なくとも８０％をカバーする、医薬組成物。
前記ＲＮＡ分子又は前記ＲＮＡ断片が、細胞から精製された又はｉｎｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡである、請求項７から請求項９のいずれか一項に記載された医薬組成物。
前記ＲＮＡ分子又は前記ＲＮＡ断片が、脂質ナノ粒子内、細胞若しくは合成のエクソソーム模倣物内、又は、ウイルス様粒子内に封入された、請求項７から請求項１０のいずれか一項に記載された医薬組成物。
前記ＲＮＡ分子又は前記ＲＮＡ断片は、投与前に細胞抽出物と共にインキュベートすることにより活性化され、特に、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ又はＨ．ｓａｐｉｅｎｓの細胞からの細胞抽出物と共にインキュベートすることにより活性化される、請求項７又は請求項１１のいずれかに記載された医薬組成物。
ＳＥＱＩＤＮＯ：１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＤＮＡ配列をロードされたベクターを有効成分として含む、医薬組成物。
前記ベクターが、プラスミドベクター、コスミドベクター、ウイルス及びそれらの類似体からなる群より選択される、請求項１３に記載された医薬組成物。
がんの治療に使用するための、請求項７から請求項１４のいずれかに記載された医薬組成物。