KR101825943B1 - 멜리틴 항생펩타이드를 생산하는 형질전환 누에 - Google Patents

멜리틴 항생펩타이드를 생산하는 형질전환 누에 Download PDF

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Abstract

본 발명은 누에형질전환 기술을 이용하여 누에 체액에서 멜리틴 항균펩타이드를 생산하는 것으로서, 본 실험에서는 누에유래의 액틴3 프로모터를 이용하여 멜리틴 항균펩타이드를 발현시켰다. 누에형질전환체 선발을 위해서는 3xP3 프로모터와 EGFP 유전자를 이용하여 선발하였고, 300 개의 누에알에 미세주입하여 F1 세대에서 11 아구(bloods)의 누에형질전환체를 선발하였다. 선발된 누에형질전환체는 초기배 단계의 눈과 신경조직, 유충과 번데기 그리고 성충의 눈에서 EGFP 형광단백질이 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 G2 세대 누에형질전환체를 5령 5일 유충까지 사육 후, 체액을 채취한 후 전처리 하였다. 이 시료를 항균활성검정을 하였고, 총 10마리의 누에를 선발할 수 있었다. 이렇게 선발 된 누에는 서로 교배를 통해서 계대사육을 하였다. 이러한 과정으로 선발된 G3세대 누에형질전환체를 이용하여 앞의 과정과 동일한 방법으로 항균할성을 검정하였다. 그 결과 대조군으로 사용된 시그마사의 melittin (0.016mg/ml)과 거의 동일한 항균활성을 나타내었다. 그럼으로 이상의 결과에서 melittin 항균펩타이드를 생산하는 누에형질전환체가 성공적으로 제작되었음을 확인할 수 있었다.

Description

멜리틴 항생펩타이드를 생산하는 형질전환 누에{Production of the melittin antimicrobial peptide in transgenic silkworm}
본 발명은 누에 체액에서 봉독 유래 멜리틴(melittin) 항균펩타이드를 생산하는 형질전환 누에, 및 상기 형질전환 누에를 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.
멜리틴은 유럽 벌꿀인 Apis mellifera의 주요 독성성분으로 양이온의 용혈성 펩타이드이다. 이 펩타이드는 26개의 아미노산으로 이루어진 선형의 염기성 펩타이드로서 분자량은 2847.5이고, Gly-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly -Leu-ProAla-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln(서열번호 8)의 아미노산 서열로 이루어져 있다. 이 펩타이드는 특이한 아미노산 배열을 가지고 있는데, 비극성인 친수성 및 염기성 아미노산은 C- 말단 (아미노산 21-26) 근처에서 존재하고 반면에, 소수성 및 중성 아미노산은 N 말단 (아미노산 1-20)에 존재한다. 이러한 특성은 다양한 세포 유형에서 항균, 항 바이러스, 항염증 등 다양한 효과를 가지고 있음이 보고되어 있다. 멜리틴은 높은 표면 및 막장력을 가진 천연 세제로서 수용성의 단량체 또는 4 단량체의 구조를 가지고 있다. 이 폴리펩타이드는 천연 및 합성 막에서 이온모공으로 4단량체를 형성시켜서 막을 형태학적으로 변화시키는데, 이는 호르몬 분비유도, 막 단백질의 집합, 막 장력을 변화시킨다. 게다가 멜리틴은 G 단백질, 단백질 키나제 C, 아데닐레이트 시클라제, 포스포리파제 C와 D를 포함하는 다양한 효소를 자극한다. 그리고, 멜리틴은 강력한 항균활성을 나타낸다. 예들 들면 라임병의 원인균인 Borrelia burgdorfer에 대해 높은 억제 효과를 나타내었으며, 효모인 Candida albicans를 죽이고, Mycoplasma hominis 와 Chlamydia trachomatis의 감염을 억제시켰다. 최근에는 나노입자 만큼 작은 nanobee라는 장치를 이용하여 동물의 종양세포로 멜리틴을 운반하거나, HIV를 파괴하는 데 효과가 있다고 보고되었다.
최초의 누에 형질전환은 1971년 일본의 Nawa에 의해 이루어진 실험으로 흑란계통의 게놈을 백란계통의 알에 주입하여 흑란계통의 누에를 얻는 실험이었다. 이후 오랜 기간 동안 누에 형질전환을 위한 많은 시도가 있었지만, 뚜렷한 성과는 없었다. 그러나, 일본의 Tamura 등이 piggyBac유전자를 이용하여 누에 형질전환에 성공하였다. 이후 이 방법을 사용하여 basic fibroblast growth factor (bFGF), human serum albumin (HSA), feline interferon (FeIFN), insulin like growth factor-I (hIGF-I) 등이 성공적으로 발현된다고 보고되어 있다. 최근에는 항균펩타이드인 세크로핀을 발현시키는 실크가 제작되었다고 보고되었다.
가축에서 항생제는 질병 치료뿐만 아니라 질병을 예방하고 성장을 촉진하기 위한 목적으로도 사용된다. 그러나 무분별한 항생제 오·남용으로 가축에서 항생제 내성이 발생하고 있다. 따라서 이러한 항생제 사용을 억제하기 위한 다양한 대책이 다음과 같이 추진되고 있다. 배합사료 첨가용 항생제 종류는 2004년 53종에서 2009년 18종으로 줄이고, 동물용 항생제 잔류 기준은 2007년 58종에서 2009년 72종으로 확대 강화하여, 2007년 3월 무항생제 축산물 인증제를 도입하는 것이다. 그러나 국내에는 항생제 대체제에 대한 관심과 활용은 증대되고 있으나, 대체 물질에 대한 정보와 연구가 미흡한 실정이다. 따라서 본 실험에서는 천연 항생펩타이드인 꿀벌 봉독 유래의 멜리틴 펩타이드를 생산하는 누에를 개발하기 위하여 형질전환 누에를 이용하여 실험을 진행하였다.
본 실험실에서 멜리틴 항생펩타이드를 함유한 누에고치를 생산하는 형질전환 누에를 발명하여 대한민국등록특허 10-1480153를 (등록일: 2014년 12월31일)받으바 있다. 하지만 기존 발명에서는 피브로인 H-Chain 유전자 프로모터를 사용함으로서 멜리틴이 누에고치(실크)에 한정하여 발현하게 고안된 형질 전환누에로 혈구세포, 지방세포 등 기타 조직에서는 멜리틴이 생산되지 않는다. 실크에 융합된 멜리틴의 경우 순수 정제에 많은 노력과 비용이 드는 문제점이 있다.
이런 문제점을 해결하기 위하여 본 발명은 근육과 세포구성물을 이루는 액틴 단백질의 발현을 조절하는 액틴3 프로모터를 사용함으로서 누에의 혈림프, 지방체 등 실크 이외의 다른 조직에서 멜리틴이 발현되도록 고안하였다.
이는 실크에 융합된 멜리틴을 순수 정제하는 것보다 훨씬 용이 하며 비용이 적게 든다. 또한 가축 면역증강용 음용수를 개발할 경우, 형질전환누에 혈림프를 쉽게 추출하여 바로 사용할 수 있는 장점이 있다.
관련 선행기술로는 대한민국등록특허 제10-0267742호(등록일: 2000년 07월 07일, 명칭: 녹색 형광단백질 유전자가 삽입된 재조합 베큘로바이러스를 이용한 형광누에 및 제조방법)과 대한민국등록특허 제10-0323550호(등록일: 2002년 01월 24일, 명칭: 누에의 형질전환방법과 형질전환된 누에)가 있다.
본 발명의 목적은 가축사료 내 첨가할 천연항생제를 저가로 대량생산하기 위하여 표지 유전자 조절 프로모터, 표지 유전자, 누에 유래의 액틴3(BmA3) 프로모터 및 봉독 유래의 멜리틴(melittin) 유전자가 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 발현벡터, 및 상기 재조합 발현벡터로 형질전환시킨 혈액내 멜리틴이 발현되는 형질전환 누에를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 상기 형질전환 누에를 이용하여 멜리틴 항생펩타이드가 함유된 누에고치를 대량으로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 표지 유전자 조절 프로모터, 표지 유전자, 누에 유래의 액틴3(BmA3) 프로모터 및 봉독 유래의 멜리틴(melittin) 유전자가 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.
상기 멜리틴 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 한다.
상기 표지 유전자 조절 프로모터는 3xP3 프로모터인 것을 특징으로 한다.
상기 표지 유전자는 EGFP(green fluorescent protein) 유전자인 것을 특징으로 한다.
상기 유전자 컨스트럭트는 도 1의 구조로 구성되는 것을 특징으로 한다.
상기 발현벡터는 piggyBac 벡터인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 재조합 발현벡터를 누에(Bombyx mori) 또는 누에알에 형질전환시켜 제조한, 혈액내 멜리틴이 발현되는 형질전환 누에를 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 상기 본 발명에 따른 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 재조합 발현벡터를 누에알에 형질전환시켜 형질전환된 누에알을 제조하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 형질전환된 누에알을 부화시켜 형질전환 누에를 제조하는 단계를 포함하는 누에 혈액내 멜리틴이 발현되는 형질전환 누에를 제조하는 방법을 제공한다.
상기 단계 2)의 형질전환은 미세주입법(microinjection)을 이용하는 것을 특징으로 하는 혈액내 멜리틴이 발현되는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 단계 3)에 있어서 i) 발현벡터에 표지 유전자를 도입한 후, 형질전환 누에에서 상기 표지 유전자의 발현을 확인하는 방법; 또는 ii) 형질전환 누에에서 멜리틴 유전자의 발현을 확인하는 방법 중 하나의 방법으로 형질전환 누에를 선발하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 한다.
아울러, 본 발명은
1) 상기 본 발명에 따른 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 재조합 발현벡터를 누에 또는 누에알에 형질전환시켜 형질전환 누에를 제조하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 형질전환된 누에를 사육하여 누에고치를 획득하는 단계를 포함하는 멜리틴 항생펩타이드가 함유된 누에고치를 대량으로 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 형질전환 누에는 혈액내 꿀벌 봉독의 주성분인 멜리틴 항생펩타이드를 함유하고 있는 누에고치를 생산함으로써, 천연항생제로서 개발이 가능하며, 멜리틴 정제가 용이하므로 노력과 비용을 적게 들이면서도 가축사료 첨가제 뿐만 아니라 화장품, 치약 등 생활용품의 소재 등으로 유용하게 사용할 수 있다. 또한, 양잠농가는 본 발명을 통해 일반누에와는 차별화된 고부가가치의 천연항생제를 생산하는 형질전환누에를 사육함으로써 소득향상에 크게 기여할 수 있다.
도 1은 전이벡터(pG3xP3-EGFP-BmA3-Melittin)의 구조를 나타내는 도면이다.
도 2는 형질전환 누에의 EGFP의 형광을 나타내는 도면이다.
A는 알의 경우, 1세대 7령 배아의 눈 및 복부 신경계에서 형광이 나타나는 것을 보여준다. 이때, 화살표는 눈 및 신경계를 표시한다.
B는 유충의 경우, 눈에서 형광이 나타나는 것을 보여준다. 이때, 화살표는 눈을 표시한다.
C는 번데기의 경우, 눈에서 형광이 나타나는 것을 보여준다. 이때, 화살표는 눈을 표시한다.
D는 성충의 경우, 눈에서 형광이 나타나는 것을 보여준다. 이때, 화살표는 눈을 표시한다.
도 3은 멜리틴을 생산하는 형질전환 누에의 대장균에 대한 항균활성을 본 도면이다.
도 4는 대장균에 대한 항균활성을 본 도면이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 표지 유전자 조절 프로모터, 표지 유전자, 누에 액틴3(BmA) 프로모터 및 봉독 유래의 멜리틴(melittin)유전자가 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.
상기 재조합 발현벡터에 있어서, 상기 멜리틴 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 구성된 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 상기 염기서열에서 하나 또는 둘 이상의 염기가 삽입, 결실 또는 치환된 서열로 구성된 것도 포함할 수 있다.
상기 재조합 발현벡터에 있어서, 상기 액틴3 프로모터는 누에 유래 액틴3 프로모터(BmA3)를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 한가지 실시예에서는 멜리틴 유전자의 발현조절을 위해서 근육과 세포구성의 주성분인 액틴단백질의 프로모터 액틴3(BmA3)를 사용하였다.
상기 재조합 발현벡터에 있어서, 상기 표지 유전자 조절 프로모터는 3xP3 프로모터인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 표지 유전자를 발현시킬 수 있는 프로모터는 모두 사용가능하다.
상기 재조합 발현벡터에 있어서, 상기 표지 유전자는 형광단백질을 발현하는 유전자는 모두 사용가능하며, EGFP(green fluorescent protein) 유전자를 사용하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 한가지 실시예에서는 형질전환체 선발을 위해서, 형광단백질(EGFP)을 표지유전자로 사용하였고, 표지유전자의 발현조절은 눈과 신경시스템에서 특이적으로 발현하는 3xP3 프로모터를 사용하였다.
상기 재조합 발현벡터에 있어서, 상기 유전자 컨스트럭트는 도 1의 구조로 구성된 컨스트럭트를 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 재조합 발현벡터에 있어서, 상기 유전자 컨스트럭트가 도입되는 발현벡터는 piggyBac 벡터인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 상기 재조합 발현벡터를 누에(Bombyx mori) 또는 누에알에 형질전환시켜 제조한, 혈액에서 멜리틴이 발현되는 형질전환 누에를 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 본 발명에 따른 상기 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 재조합 발현벡터를 누에알에 형질전환시켜 형질전환된 누에알을 제조하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 형질전환된 누에알을 부화시켜 형질전환 누에를 제조하는 단계를 포함하는 혈액내 멜리틴이 발현되는 형질전환 누에를 제조하는 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 상기 단계 2)의 형질전환은 미세주입법(microinjection)을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 공지된 형질전환법은 모두 사용가능하다.
상기 방법에 있어서, 상기 단계 3)에 있어서, 하기 중 하나의 방법으로 형질전환 누에를 선발하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
i) 발현벡터에 표지 유전자를 도입한 후, 형질전환 누에에서 상기 표지 유전자의 발현을 확인하는 방법; 또는,
ii) 형질전환 누에에서 멜리틴 유전자의 발현을 확인하는 방법.
본 발명의 한가지 실시예에서는 공지된 미세주입법을 이용하여 상기 재조합 발현벡터로 누에알을 형질전환시킨 후, 그 중 일부를 유충으로 부화시켰으며, 그 중 일부 성충이 된 나방들을 서로 교배시켜 F1세대의 누에알을 획득하였다. 그런 다음, 이들 F1세대의 누에알의 산란 후 초기배, 유충, 번데기 또는 성충에서 각각 눈 또는 신경조직에서의 표지 유전자의 발현을 관찰함으로써 형질전환체를 선발하였다. 그런 다음, 최종적으로 이들만을 교배시켜 F2세대의 형질전환체를 획득하였다.
아울러, 본 발명은
1) 본 발명에 따른 상기 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 재조합 발현벡터를 누에 또는 누에알에 형질전환시켜 형질전환 누에를 제조하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 형질전환된 누에를 사육하여 누에고치를 획득하는 단계를 포함하는 멜리틴 항생펩타이드가 함유된 누에고치를 대량으로 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 형질전환 누에는 항생펩타이드인 멜리틴을 혈액내 다량 함유하고 있는 누에고치를 생산할 수 있고, 멜리틴 정제가 용이하여 천연항생제, 가축사료 첨가제, 화장품, 치약 등 생활용품의 소재 등으로 유용하게 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 누에형질전환용 전이벡터 제작
<1-1> 전이벡터
누에 형질전환에 사용된 전이벡터는 체코의 Jindra 박사로부터 pBac-3xP3-EGFP 벡터와 헬퍼(helper)벡터인 pHA3PIG 를 분양 받아서 사용하였다.
<1-2> 누에형질전환용 전이벡터의 제작
누에에서 멜리틴(Melittin) 유전자가 발현되는 형질전환 누에를 제작하기 위해, 누에 액틴3(BmA3)와 멜리틴(Melittin) 유전자를 pBac-3xP3-EGFP 벡터에 도입하여 제작하였다. 형질전환체를 선발하기 위한 마커 유전자로는 EGFP 유전자를 사용하였고, 이 유전자의 조절 프로모터로는 3xP3 프로모터를 사용하였다.
먼저 누에 액틴3 프로모터를 얻기 위해서, 다음의 primer를 이용하여 PCR 증폭을 통해 확보하였다. 정방향 프라이머는 Asc I 제한효소 인식서열을 포함하여 5′-GGCGCGCCGCGCGTTACCATATATGGTG-3′(서열번호: 2)(28 mer)를 사용하였고 역방향 프라이머는 Nhe I 제한효소가 포함된 5′-GCTAGCCTTGAATTAGTCTGCAAGAAA 3′(서열번호: 3)(27 mer)를 사용하여 누에 gDNA를 주형으로 PCR을 이용하여 증폭하였고, pGEM-T Easy Vector System (Promega, Madison WI)에 클로닝하였다. 완성된 플라스미드는 pGEMT-BmA3로 명명하였다.
그리고, pGEMT-BmA3는 Asc I과 Nhe I으로, 제한효소 처리함으로써 단편들을 준비하였다. 이들 단편들은 Asc I과 Nhe I으로 제한효소 처리된 piggybac 전이벡터인 pBac-3xP3-EGFP vector에 클로닝하였고, pG3xP3EGFPBmA3 로 명명하였다. 멜리틴 유전자는 유전자합성 (Bioneer Co.)에 의해서 확보하였고, Nhe I/Afl II 제한효소를 사용하여 멜리틴 유전자를 piggyBac 벡터의 Nhe I/Afl II 위치에 재클로닝하여 형질전환 전이벡터인 pG3xP3EFGPBmA3Mellittin (도 1)를 제작하였다.
< 실시예 2> 누에 형질전환체의 제작 및 선발
<2-1> 실험곤충
형질전환에 사용된 누에(Bombyx mori,농촌진흥청 국립농업과학원 잠사양봉소재과에서 보유하고 있는 누에를 사용함)는 백옥잠(123x124)을 사용하였고, 농촌진흥청 농업생물부의 표준 사육 기준 (온도: 24℃ ~ 27℃, 상대습도: 70% ~ 90%)에 준하여 사육하였다. 형질전환에 사용된 누에알은 산란 후 4시간 이내의 것만 사용하였다.
<2-2> 누에 형질전환체의 제작
상기 <실시예 1>에서 제작한 전이벡터 pG3xP3EFGPBmA3Mellittin와 헬퍼(helper)벡터 HELPERA3PIG5-3(Voff)의 농도비는 1 : 1(각각 200 ng/ul)의 비율로 사용하였고, 미세주입(microinjection)용 완충용액(5 mM KCl, 0.5 mM Phosphate buffer, pH 7.0)에 0.2 ㎍/㎕의 농도로 희석하였다. 누에 초기배로의 미세주입은 배아의 주공과 후부 사이의 가운데 배면 부분에 주사하였으며, 그 과정은 다음과 같이 실시하였다. 먼저 텅스텐 침으로 누에알의 난각에 작은 구멍을 뚫고, 이 구멍에 DNA 용액이 들어있는 미세관(microcapillary)의 끝을 삽입 후, 미세주입기(microinjector)의 공기압을 이용하여 DNA 용액을 알 속으로 주입하였다. 이 때 각 배아에 주입된 DNA 용액의 양은 10~15 nl가 사용되었고, 난각에 생긴 구멍은 시아노크릴레이트(Cyanocrylate)접착제를 사용하여 막았다. 총 300 개의 누에알에 미세주입을 하였다. 미세주사 후 누에알은 보습한 패트리디쉬에 넣어서 25℃에서 부화할 때까지 보호하였다.
<2-3> 누에 형질전환체의 선발
누에 형질전환체의 선발은 형광현미경을 이용하였다. 구체적으로, LEICA MZ16FA 현미경(Leica사, USA) 및 Microscope MZ FLIII Flourescence Filter EGFP 형광필터(Leica사, USA)를 사용하여, 누에의 세대별 및 시기별로 관찰하여 선발하였다.
형질전환을 유도한 총 300개의 누에알로부터 131마리의 G0 세대 의 부화유충을 확보할 수 있었고, 최종적으로 성충(누에나방) 80마리를 확보하였다. 확보한 G0 세대의 성충은 상호교배를 통 하여 G1 세대의 잠종 36아구를 확보하였다. 누에 형질전환체 선발 결과, 총 36아구로부터 표지유전자인 EGFP가 누에 배아의 5개의 홑 눈(stemmata) 과 신경시스템에서 뚜렷하게 발현되는 4개의 아구를 선발할 수 있었다.

G1 (broods)


EGFP
G1 with positive larvae

300
131
36
4
11
누에형질전환체를 포함하고 있는 4개의 아구는 누에사육용 잠박에 개별로 분리하여 사육하였고, 비형질전환체와 형질전환체가 혼재되어 있으므로 형질전환체 선발을 위하여 1령 2일까지 사육한 후, 전체 사육 누에를 대상으로 형광현미경 검경에 의해서 선발하였다. 형질전환체 선발은 누에 홑눈 내 표지유전자인 EGFP 발현 유무로 확인하였다. 4 개 아구 내의 형질전환체 발생개체 수는 각 아구별로 차이가 있었는데 적게는 8 개체부터 많게는 40여 개체 이상을 확인할 수 있었다. 이후 각 아구별로 선발한 누에 형질전환체는 아구 별로 분리사육하여 번데기를 확보한 다음 번데기를 이용하여 형질전환 유무를 재차 확인하였다. 번데기의 형질전환 유무는 향후 성충의 눈으로 형성될 부분에 표지유전자인 EGFP 발현 유무를 형광현미경으로 검경하였다. 형광현미경 검경에 의해서 형질전환이 확인된 번데기는 성충(누에나방)까지 발생시킨 다음, 같은 아구 내 성충을 sib-mating하여 제 2세대 (G2) 잠종을 확보하였다 (도 2).
도 2의 A는 알 일때, 눈 및 복부 신경계에서 형광이 나타나며, B는 유충 일때, C는 번데기 일때, D는 성충 일 때 눈에서 형광이 나타나는 사진이다.
<2-4> Inverse PCR
누에 게놈 내 멜리틴 유전자 도입 확인 및 염색체 내에 도입 위치를 분석하였다.
형질전환누에로부터 각각 genomic DNA를 분리한 다음, 제한효소 Sau3AI으로 처리하였다. 제한효소 Sau3AI로 절단된 genomic DNA는 T4 DNA ligase를 사용하여 self-ligation을 유도하고, 이를 주형으로 하여 5′접합부위를 증폭하기 위해서 정방향 프라이머는 5'-ATCAGTGACACTTACCGCATTGACA-3'(서열번호 4)(25 mer) 와 역방향 프라이머는 5'-TGACGAGCTTGTTGGTGAGGATTCT-3’(서열번호 5)(25mer)을 사용하였고, 3′ 접합부위를 증폭하기 위해서 정방향 프라이머는 5′-TACGCATGATTATCTTTAACGTA-3′(서열번호 6)(23 mer)와 역방향 프라이머는 5′-GGGGTCCGTCAAAACAAAACATC-3′(서열번호 7)(23 mer)를 사용하여 Inverse PCR를 수행하였다. Inverse PCR 결과로 증폭된 PCR product는 pGEM-T easy 벡터에 클로닝한 다음, 삽입 단편에 대하여 염기서열을 결정하였다. 확보된 염기서열에서 전이벡터(piggyBac) 서열을 제외한 염기서열만으로 Silkworm genome research program(http://sgp.dna.affrc.go.jp/)을 이용하여 누에 염색체 내 삽입 위치를 결정하였다.
분리사육 된 제2세대(G2) 누에 형질전환체 4개 아구의 강건성, 생존율, 우화을, 산란율 등을 고려하여 최종적 2개 아구만을 선정하여 분석하였다. 선정된 2개의 형질전환체 아구는 Mel-1과 Mel-2로 명명하였다. 선정된 두 아구 내 누에 개체를 대상으로 멜리틴 유전자 도입을 확인하기 위하여 Inverse PCR을 수행하였다. 그 결과, 형질전환 라인 Rel-1과 Rel-2는 각각 1 copy로 존재하고 있었으며, 형질전환 라인 Mel-1는 전이벡터가 9번 염색체 상에 삽입되어 있었고 형질전환 라인 Mel-2는 전이벡터가 21번 염색체 상에 삽입되어 있는 것을 확인할 수 있었다 (표 2).
< 실시예 3> 항균활성 분석
G2 세대 형질전환누에를 서로 교배하여 5령 5일까지 사육한 후 형질전환누에180 마리에서 생산된 멜리틴 항균펩타이드에 대한 항균활성을 분석하였다. 분석방법은 방사상 확산 분석(RDA, Radial Diffusion Assay)방법을 이용하였고, 그람음성 세균인 E. coli (KACC 1039) 에 대하여 항균활성을 검정하였다. 그 결과 항균활성이 높은 10마리 형질전환누에를 선발할 수 있었고, 이 누에들을 서로 교배하여 계대사육을 하였다 (도 3).
앞의 과정으로 선발 된 G3 세대 5령5일 누에에서 체액을 채취한 후 전처리 하여 방사상 확산 분석(RDA) 검정을 하였다. 대조군으로는 백옥잠 5령5일 누에의 체액과 시그마에서 구입한 멜리틴(melittin) (0.016mg/ml)을 사용하였다.
전처리 과정은 다음과 같다. 5령5일 누에 유충에서 체액을 채취하여 90℃ 에서 10분간 배양한 후 얼음에서 10분간 처리하였다. 이렇게 처리 된 시료는 13,000rpm에서 4℃, 10분간 원심분리 후 상층액만을 분리하여 항균활성 분석을 위한 시료로 사용하였다. 항균활성 분석은 다음의 과정으로 진행하였다. Citrate phosphate buffer(9mM sodium phosphate, 1mM sodium citrate, pH 7.4)와 1 %(w/v) type (low electroendosmosis) agarose, 0.03 % TSB로 구성된 멸균된 underlay gel에 배양된 세균 (4x106 colony forming units/ml)을 넣고 혼합해준 뒤 배양접시에 굳힌 후 지름 3 mm의 구멍을 내어 1 mg/ml의 농도의 peptide를 5 ㎕씩 넣는다. peptide가 확산되도록 37℃에서 3시간 배양한 후, Overlay gel (6 % TSB, 1 % agarose)을 붓고 37℃에서 다시 배양한다. 각각의 peptide의 항균 활성력은 18시간 후부터 나타나는데, 세균이 번식하지 않는 clear zone의 크기로 확인하였다.
그 결과 멜리틴(melittin) 누에 형질전환체에서 채취한 체액의 항균활성이 시그마에서 구입한 멜리틴(melittin)과 거의 동일한 활성을 나타내었다(도 4). 따라서 누에에서 멜리틴(melittin)항균 펩타이드를 생산하는 누에형질전환체가 제작되었음을 확인할 수 있었다.
이러한 결과는 누에를 재조함단백질의 대량생산 연구에 활용될 수 있을 것으로 생각된다.
이와 같이, 상기 형질전환 누에는 꿀벌 봉독의 주성분인 멜리틴 항생펩타이드를 함유하고 있는 누에고치를 생산함으로써, 천연항생제로서 개발이 가능하여, 가축사료 첨가제 뿐만 아니라 화장품, 치약 등 생활용품의 소재 등으로 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 양잠농가는 본 발명을 통해 일반누에와는 차별화된 고부가가치의 천연항생제를 생산하는 형질전환누에를 사육함으로써 소득향상에 크게 기여할 수 있다.
상기의 본 발명은 바람직한 실시예를 중심으로 살펴보았으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 본질적 기술 범위 내에서 상기 본 발명의 상세한 설명과 다른 형태의 실시예들을 구현할 수 있을 것이다. 여기서 본 발명의 본질적 기술범위는 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Production of the melittin antimicrobial peptide in transgenic silkworm <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1 <212> DNA <213> Apis mellifera <400> 1 0 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer1 <400> 2 ggcgcgccgc gcgttaccat atatggtg 28 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer2 <400> 3 gctagccttg aattagtctg caagaaa 27 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer3 <400> 4 atcagtgaca cttaccgcat tgaca 25 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer4 <400> 5 tgacgagctt gttggtgagg attct 25 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer5 <400> 6 tacgcatgat tatctttaac gta 23 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer6 <400> 7 ggggtccgtc aaaacaaaac atc 23 <210> 8 <211> 26 <212> PRT <213> Apis mellifera <400> 8 Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu 1 5 10 15 Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gln Gln 20 25

Claims (10)

  1. 표지 유전자 조절 프로모터, 표지 유전자, 누에 액틴3(BmA3) 프로모터 및 봉독 유래의 멜리틴(melittin) 유전자가 작동가능하게 연결된 하기 구조의 유전자 컨스트럭트를 포함하되,
    상기 표지 유전자 조절 프로모터는 3xP3 프로모터이고, 상기 표지 유전자는 EGFP(green fluorescent protein) 유전자이며, 상기 멜리틴 유전자는 Gly-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-ProAla-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln(서열번호 8)의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 발현하는 염기서열로 구성된 것을 특징으로 하는 piggyBac 재조합 발현벡터.

    Figure 112017087437797-pat00005
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  6. 제 1항의 재조합 발현벡터를 누에(Bombyx mori) 또는 누에알에 형질전환시켜 제조한, 혈액내 멜리틴이 발현되는 형질전환 누에.
  7. 1) 제 1항의 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;
    2) 상기 단계 1)의 재조합 발현벡터를 누에알에 형질전환시켜 형질전환된 누에알을 제조하는 단계; 및
    3) 상기 단계 2)의 형질전환된 누에알을 부화시켜 형질전환 누에를 제조하는 단계를 포함하는 혈액내 멜리틴이 발현되는 형질전환 누에의 제조방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 단계 2)의 형질전환은 미세주입법(microinjection)을 이용하는 것을 특징으로 하는 혈액내 멜리틴이 발현되는 형질전환 누에의 제조방법.
  9. 제 7항에 있어서, 상기 단계 3)에 있어서 하기 중 하나의 방법으로 형질전환 누에를 선발하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 혈액내 멜리틴이 발현되는 형질전환 누에의 제조방법:
    i) 발현벡터에 표지 유전자를 도입한 후, 형질전환 누에에서 상기 표지 유전자의 발현을 확인하는 방법; 또는
    ii) 형질전환 누에에서 멜리틴 유전자의 발현을 확인하는 방법.
  10. 1) 제 1항의 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;
    2) 상기 단계 1)의 재조합 발현벡터를 누에 또는 누에알에 형질전환시켜 형질전환 누에를 제조하는 단계; 및
    3) 상기 단계 2)의 형질전환된 누에를 사육하여 누에고치를 획득하는 단계를 포함하는 멜리틴 항생펩타이드가 함유된 누에고치의 대량 생산방법.
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