KR20150084152A - 재조합 항균펩타이드를 생산하는 형질전환 누에 - Google Patents

Abstract

본 발명은 재조합 항균펩타이드 세크로핀 B1을 생산하는 형질전환 누에, 및 상기 형질전환 누에를 이용하여 재조합 항균펩타이드 세크로핀 B1을 생산하는 형질전환 누에를 대량 생산하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 표지 유전자 조절 프로모터, 표지 유전자, 누에 유래 프로모터 및 누에 유래 BmCecB1 합성유전자가 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 발현벡터를 제작하여 상기 재조합 발현벡터로 누에를 형질전환시킴으로써 항균 펩타이드가 함유된 누에를 생산하는 형질전환 누에를 제조할 수 있으며, 이로 인해 천연항생제로서 개발이 가능하여, 가축사료 첨가제뿐만 아니라 화장품, 치약 등 생활용품의 소재 등으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

재조합 항균펩타이드를 생산하는 형질전환 누에{Transgenic silkworms producing recombinant antibacterial peptide}

본 발명은 재조합 항균펩타이드 세크로핀 B1을 생산하는 형질전환 누에, 및 상기 형질전환 누에를 이용하여 재조합 항균펩타이드 세크로핀 B1을 생산하는 형질전환 누에를 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.

누에는 분류학상 곤충각(Insectada), 인시목(lepidoptera), 가잠아과 (Bombyxidae), 가잠아속(Bombyx), 가잠종(mori)에 속한다. 누에는 완전변태 곤충으로 알에서 부화한 유충이 발육하여 번데기가 되고, 성충(나방)이 되어 알을 낳고 일생을 마친다. 누에의 일생은 평균 60일 정도로 비교적 짧아 실험동물로서 이점을 가지고 있다. 산란된 알에는 방치하면 착색하여 다음해 봄까지 부화하지 않는 것과 착색하지 않고 부화하는 것이 있다. 1년에 몇 회 부화하는가는 각각의 유전자 작용에 의하여 식도 하 신경절 내에서 생산되는 휴면 호르몬의 분비량에 의해 결정된다. 누에알에서 수정 핵은 여러 번 분열하여 분열 핵을 형성하고 핵 주위에 원형질이 둘러싸게 되고 이들은 알의 가장자리를 향하여 이동하게 된다. 예를 들면 개미누에는 산란 후 12시간이 지나면 세포융합(Syncytial blastoderm)이 형성되고 20시간 후면 인공부화법의 하나인 침산 처리가 가능해진다. 산란 후 30시간이면, 완전한 난황세포가 되고 약 10일 후 개미누에로 부화된다.

누에는 연구용뿐만 아니라 그 산업적 가치로 인해 형질전환된 누에를 생산하기 위한 다양한 연구가 진행되어 왔다. 누에 형질전환 기술 개발은 일본의 Tamura 등에 의해 나비목곤충인 Trichopusia ni에서 유래한 piggyBac 유전자를 이용하여 형질전환용 전이벡터를 구축하고 이를 다화성 누에 품종의 알에 미세주입(microinjection)하여 최초로 형질전환 누에 제작에 성공하였다. 최근에는 다양한 바이오의약품을 생산하는 형질전환 누에가 보고되고 있다. 한편, 누에알에 전이벡터를 주입하는 것은 2000년 Tamura 등이 사용한 미세주입법으로서 미세주입의 위치는 배아의 주공과 후부 사이의 가운데 배면 부분에 주사함으로써 형질전환 효율을 향상시킬 수 있음이 보고된바 있다.

형질전환 동물이란 외래의 유전자가 숙주의 게놈상에 삽입되어 그 형질의 일부가 변한 동물을 말하며 그때의 외래유전자를 트랜스젠(transgene)이라 한다. 1970년 중반부터 체세포나 생식세포에 유전자재조합 바이러스를 사용하여 외래유전자를 도입하기 시작하였고, 1980년도에는 미세주사방법(microinjection)으로 고든에 의해 슈퍼마우스를 생산하게 되었다.

외래유전자를 도입하는 기술로는 인산칼슘법, 전기천공법, DEAE-덱스트란법, 리포좀법, 미세주사법, bombardment법 등이 있다. 상기 방법들 중 DEAE-덱스트란법과 전기 천공법은 세포를 DNA가 열린 구멍을 통해 직접 세포질로 들어가게 하는 방법인데, 이 두 방법에서는 DNA가 손상을 입을 수도 있다. 리포좀을 이용하는 방법은 DNA를 인공지질 소포체인 리포좀을 넣어 세포막과 융합시켜 직접 세포 내로 운반시키는 방법으로 광범위하게 사용되고 있다. 미세주사법은 1세포기 수정란에 미세조작기를 사용하여 난에 손상을 주지 않을 정도의 미세주사침으로 DNA를 직접 주입하는 방법이다. 실용화 단계에 있는 외래유전자 도입기술은 도입되는 외래 유전자들이 성장률 조절, 극한 환경에서의 내성, 유전자 치료에 관련된 것이라면 인류에게 무한한 혜택을 줄 수 있을 것이다.

2011년 7월 부로 가축사료 내 성장촉진용 항생제 사용 전면금지로 인한 무항생제 사육시 발생할 수 있는 생산성 감소, 질병발생율 증가 등의 문제를 해결하기 위해 효율적인 항생제 대체제 개발이 시급히 요구되고 있는 실정이다.

관련 선행기술로는 대한민국등록특허 제10-0267742호(등록일: 2000년 07월 07일, 명칭: 녹색 형광단백질 유전자가 삽입된 재조합 베큘로바이러스를 이용한 형광누에 및 제조방법)과 대한민국등록특허 제10-0323550호(등록일: 2002년 01월 24일, 명칭: 누에의 형질전환방법과 형질전환된 누에)가 있다.

본 발명의 목적은 가축사료 내 첨가할 천연항생제를 저가로 대량생산하기 위하여 누에 유래 BmCecB1 합성유전자가 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 발현벡터, 및 상기 재조합 발현벡터로 형질전환시킨 재조합 항균펩타이드 세크로핀 B1이 발현되는 형질전환 누에를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 상기 형질전환 누에를 이용하여 재조합 항균 펩타이드 세크로핀 B1을 생산하는 형질전환 누에를 대량으로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 재조합 발현벡터는 표지 유전자 조절 프로모터, 표지 유전자, 누에 유래 프로모터 및 누에 유래 BmCecB1 합성유전자가 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 것이 특징이다.

상기 누에 유래의 BmCecB1 합성유전자는 BmCecB1 유전자의 35개의 활성부위와 누에 유래의 단백질이황화이성질화효소의 시그날 펩타이드를 융합하여 합성된 유전자인 것이 특징이다.

상기 누에 유래 프로모터는 누에 유래 액틴3 프로모터인 것이 특징이다.

상기 표지 유전자 조절 프로모터는 눈과 신경시스템에 발현하는 3xP3 프로모터인 것이 특징이다.

상기 표지 유전자는 형광단백질(green fluorescent protein, EGFP) 유전자인 것이 특징이다.

상기 유전자 컨스트럭트는 도 2의 구조로 구성되는 것이 특징이다.

상기 발현벡터는 piggyBac 벡터인 것이 특징이다.

본 발명의 재조합 항균 펩타이드가 발현되는 형질전환 누에는 상기의 재조합 발현벡터를 누에(Bombyx mori) 또는 누에알에 형질전환시켜 제조하는 것이 특징이다.

본 발명의 재조합 항균펩타이드가 발현되는 형질전환 누에의 제조방법은, 1) 상기의 재조합 발현벡터를 제조하는 단계, 2) 상기 단계 1)의 재조합 발현벡터를 누에알에 주입하여 형질전환된 누에알을 제조하는 단계 및, 3) 상기 단계 2)의 형질전환된 누에알을 부화시켜 형질전환 누에를 제조하는 단계를 포함하는 것이 특징이다.

상기 단계 2)의 형질전환은 미세주입법(microinjection)을 이용하는 것이 특징이다.

상기 단계 3)에 있어서 하기 중 하나의 방법으로 형질전환 누에를 선발하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 본 발명의 재조합 항균펩타이드가 발현되는 형질전환 누에의 제조방법은 i) 발현벡터에 표지 유전자를 도입한 후, 형질전환 누에에서 상기 표지 유전자의 발현을 확인하는 방법; 또는 ii) 형질전환 누에에서 재조합 항균펩타이드의 발현을 확인하는 방법인 것이 특징이다.

본 발명의 재조합 항균펩타이드가 함유된 형질전환 누에의 대량 생산방법은 1) 상기의 재조합 발현벡터를 제조하는 단계, 2) 상기 단계 1)의 재조합 발현벡터를 누에 또는 누에알에 형질전환시켜 형질전환 누에를 제조하는 단계 및, 3) 상기 단계 2)의 형질전환된 누에를 사육하여 펩타이드를 함유하는 형질전환 누에를 획득하는 단계를 포함하는 것이 특징이다.

본 발명의 형질전환 누에는 본 발명자가 개발한 재조합 항균펩타이드 세크로핀 B1를 함유하고 있는 형질전환 누에를 생산함으로써, 천연항생제로서 개발이 가능하여, 가축사료 첨가제 뿐만 아니라 화장품, 치약 등 생활용품의 소재 등으로 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 양잠농가는 본 발명을 통해 일반누에와는 차별화된 고부가가치의 천연항생제를 생산하는 형질전환 누에를 사육함으로써 소득향상에 크게 기여할 수 있다.

도 1은 본 발명에서 사용된 bPDIsp-BmCecB1 유전자의 염기서열을 나타내는 도면이다.
빨간색; 누에 유래 protien disulfide isomerase(bPDI) 시그널 펩타이드의 염기서열 및 연역아미노산 표기
파란색 : 누에 유래 세크로핀 B1의 활성영역 염기서열 및 연역아미노산, 밑줄 : 제한효소 NotI의 인식 염기서열(GCGGCCGC) 표기
도 2는 전이벡터(pG-3xP3-EGFP-BmA3-bPDIsp-BmCecB1)의 구조를 나타내는 도면이다.
도 3은 G2 형질전환 누에의 EGFP의 형광을 나타내는 도면이다.
A는 알의 경우, G2 7일째 배아의 눈 및 신경계에서 형광이 나타나는 상태임.
(화살표는 눈 및 신경계를 표시)
B는 유충의 경우, G2 3령충의 눈에서 형광이 나타나는 것을 보여줌.
(화살표는 눈 및 신경계를 표시)
C,D는 번데기와 성충의 경우, 눈에서 형광을 나타내는 것을 보여줌.
(화살표는 눈을 표시)
도 4는 BmCecB1 합성유전자를 포함하는 형질전환 누에의 항균활성을 나타낸 도면이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 표지 유전자 조절 프로모터, 표지 유전자, 누에 유래 프로모터 및 누에 유래 BmCecB1 합성유전자가 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

본 발명의 한가지 실시예에서는 누에에서 면역유도에 의해 재조합 항균펩타이드를 생산하기 위해 도입되는 누에 유래 BmCecB1 합성유전자로서 이는 BmCecB1 유전자의 35개의 활성부위와 누에 유래의 단백질이황화이성질화효소의 시그날 펩타이드를 융합하여 합성된 유전자이다.

상기 재조합 발현벡터에 있어서, 상기 증폭된 BmCecB1 유전자의 발현조절을 위해서 상기 누에 유래 프로모터는 누에 액틴3(BmA3)를 사용하는 것이 바람직하다.

상기 재조합 발현벡터에 있어서, 상기 표지 유전자의 발현을 조절하는 상기 표지 유전자 조절 프로모터는 3xP3 프로모터인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 표지 유전자를 발현시킬 수 있는 프로모터는 모두 사용가능하다.

상기 재조합 발현벡터에 있어서, 형질전환체 선발을 위해 상기 표지 유전자는 형광단백질을 발현하는 유전자는 모두 사용가능하며, EGFP(green fluorescent protein) 유전자를 사용하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 한가지 실시예에서는 형질전환체 선발을 위해서, 형광단백질(EGFP)을 표지유전자로 사용하였고, 표지유전자의 발현조절은 눈과 신경시스템에서 특이적으로 발현하는 3xP3 프로모터를 사용하였다.

상기 재조합 발현벡터에 있어서, 상기 유전자 컨스트럭트는 도 2의 구조로 구성된 컨스트럭트를 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 재조합 발현벡터에 있어서, 상기 유전자 컨스트럭트가 도입되는 발현벡터는 piggyBac 벡터인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 상기 재조합 발현벡터를 누에(Bombyx mori) 또는 누에알에 형질전환시켜 제조한 재조합 항균펩타이드가 발현되는 형질전환 누에를 제공한다. 이때 상기 재조합 항균펩타이드는 본 발명에서 새로 개발된 것으로써 이를 '재조합 항균펩타이드 세크로핀 B1'로 명명한다.

또한, 본 발명은

1) 본 발명에 따른 상기 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 재조합 발현벡터를 누에알에 형질전환시켜 형질전환된 누에알을 제조하는 단계; 및

3) 상기 단계 2)의 형질전환된 누에알을 부화시켜 형질전환 누에를 제조하는 단계를 포함하는 상기 재조합 항균펩타이드 세크로핀 B1이 발현되는 형질전환 누에의 제조방법을 제공한다.

상기 방법에 있어서, 상기 단계 2)의 형질전환은 미세주입법(microinjection)을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 공지된 형질전환법은 모두 사용가능하다.

상기 방법에 있어서, 상기 단계 3)에 있어서, 하기 중 하나의 방법으로 형질전환 누에를 선발하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.

i) 발현벡터에 표지 유전자를 도입한 후, 형질전환 누에에서 상기 표지 유전자의 발현을 확인하는 방법; 또는,

ii) 형질전환 누에에서 상기 재조합 항균펩타이드 세크로핀 B1의 발현을 확인하는 방법.

본 발명의 한가지 실시예에서는 공지된 미세주입법을 이용하여 상기 재조합 발현벡터로 누에알을 형질전환시킨 후, 그 중 일부를 유충으로 부화시켰으며, 그 중 일부 성충이 된 나방들을 서로 교배시켜 F1세대의 누에알을 획득하였다. 그런 다음, 이들 F1세대의 누에알의 산란 후 초기배, 유충, 번데기 또는 성충에서 각각 눈 또는 신경조직에서의 표지 유전자의 발현을 관찰함으로써 형질전환체를 선발하였다. 그런 다음, 최종적으로 이들만을 교배시켜 F2세대의 형질전환체를 획득하였다.

아울러, 본 발명은

1) 본 발명에 따른 상기 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 재조합 발현벡터를 누에 또는 누에알에 형질전환시켜 형질전환 누에를 제조하는 단계; 및

3) 상기 단계 2)의 형질전환된 누에를 사육하여 상기 재조합 항균펩타이드 세크로핀 B1이 함유된 형질전환 누에를 획득하는 단계를 포함하는 재조합 항균펩타이드가 함유된 형질전환 누에의 대량 생산방법을 제공한다.

본 발명의 형질전환 누에는 재조합 항균펩타이드를 다량 함유하고 있는 형질전환 누에를 생산할 수 있으므로, 천연항생제, 가축사료 첨가제, 화장품, 치약 등 생활용품의 소재 등으로 유용하게 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 형질전환용 전이벡터의 제작

누에 형질전환 기술 개발은 일본의 Tamura 연구팀에 의해 나비목곤충인 Trichopusia ni에서 유래한 piggyBac 유전자를 이용하여 형질전환용 전이벡터를 구축하고 이를 다화성 누에 품종의 알에 미세주사하여 최초로 형질전환 누에 제작에 성공하였다.

또한 최근에는 다양한 바이오의약품을 생산하는 형질전환누에가 보고되고 있다. 이에, 누에에서 BmCecB1 재조합단백질이 발현되는 형질전환누에를 제작하기 위해 piggyBac 벡터를 이용하여 전이벡터를 구축하였다. 형질전환체를 선발하기 위한 마커 유전자로는 EGFP 유전자를 사용하였고, 이 유전자의 조절 프로모터로는 3xP3 promoter를 사용하였다. 누에의 액틴3 프로모터를 얻기 위해서, 누에 게놈으로부터 PCR을 이용하여 증폭하였고, BmCecB1 유전자는 누에 액틴3 프로모터와 SV40poly A사이에 클로닝하였다.

이와 같이 본 발명의 형질전환용 전이벡터의 제작방법을 구체적으로 설명하면 하기와 같다.

먼저, 누에에서 BmCecB1 유전자가 발현되는 형질전환 누에를 제작하기 위해서, 누에 액틴3 프로모터와 BmCecB1 유전자를 piggyBac 벡터에 도입하여 제작하였다.

먼저 누에 액틴3 프로모터를 얻기 위해서, 다음의 primer를 이용하여 PCR 증폭을 통해 확보하였다. sense primer는 번역 개시코돈인 ATG 및 Asc I 제한효소 인식서열을 포함하여 5′-GGCGCGCCGCGCGTTACCATATATGGTG-3′를 사용하였고 antisense primer는 Nhe I 제한효소가 포함된 5′-GCTAGCCTTGAATTAGTCTGCAAGAAA-3′를 사용하여 PCR로 증폭하였고, pGEM-T Easy Vector System (Promega, Madison WI)에 클로닝하였다.

완성된 플라스미드는 'pGEMT-BmA3'로 명명하였다. 그 다음, pGEMT-BmA3는 Asc I과 Nhe I으로, 제한효소 처리함으로써 단편들을 준비하였다. 이들 단편들은 Asc I과 Nhe I으로 제한효소 처리된 piggybac 전이벡터인 pG3xP3-EGFP vector에 클로닝하였고, pG3xP3-EGFP-BmA3로 명명하였다.

bPDIsp-BmCecB1 유전자는 다음의 과정에 의하여 확보하였다.

먼저, BmCecB1 펩타이드를 세포외로 분비시키기 위해서 누에 유래의 단백질 이황화결합 효소인 protein disulfide isomerase (bPDI)의 signal peptide를 사용하였다. bPDI 유전자의 ORF (open reading frame)는 누에로부터 cDNA를 합성한 후 RT-PCR로 확보하였다. 그리고 보고된 bPDI의 signal peptide는 bPDI ORF를 주형으로 하고, Nhe I/ Not I 제한효소 서열을 부가하여 PCR로 확보하였다. 누에 유래 BmCecB1 유전자의 ORF (open reading frame)는 누에로부터 cDNA를 합성한 후 RT-PCR로 확보하였다. 그리고 Taniai 등(1992)이 보고한 BmCecB1의 활성영역은 BmCecB1 ORF를 주형으로 하고, Not I/Afl II 제한효소 서열을 부가하여 PCR로 확보하였다. 이러한 과정으로 확보된 두 유전자는 pGEM-T-easy vector (Promega)에 순서대로 클로닝하여 두 유전자를 연결하였다(도 1).

이렇게 bPDIsp-BmCecB1 cDNA는 pGEM-T easy벡터(Promega.Co)에 클로닝하여 pGEMT-bPDIsp-BmCecB1를 구축하였고, pGEMT-bPDIsp-BmCecB1의 Nhe I/Afl II 사이에 있는 bPDIsp-BmCecB1 절편을 piggyBac 벡터의 Nhe I/Afl II 위치에 재클로닝하여 형질전환 전이벡터인 pG-3xP3-EGFP-BmA3-bPDIsp-BmCecB1를 제작하였다(도 2).

<실시예 2> 누에 형질전환체의 제작 및 선발

<2-1> 누에의 준비 및 사육

형질전환에 사용된 누에(Bombyx mori, 농촌진흥청 국립농업과학원 잠사양봉소재과에서 보유하고 있는 누에를 사용함)는 백옥잠(잠123× 잠124)을 사용하였고, 표준 사육 기준(온도, 24℃- 27℃; 상대습도, 70% - 90%)에 준하여 사육하였다.

<2-2> 누에 형질전환체의 제작

누에알에 전이벡터를 주입하는 것은 2000년 Tamura 등이 사용한 microinjection 법으로, microinjection위치는 배아의 주공과 후부 사이의 가운데 배면 부분에 주사함으로써 형질전환 효율을 향상시킬 수 있었다.

또한, 형질전환에 사용된 누에 품종인 백옥잠은 잠123와 잠124의 교잡종으로서 일반 원종에 비해 누에알이 크고, 인공사료에 의한 연중 사육이 가능하며, 월년종의 특징인 염산처리에 의해 부화된다.

그러므로 선발된 누에형질전환체를 장기간 보관 할 수 있는 장점을 가지고 있다. 이에, 누에형질전환체 제작을 위해 2000년 Tamura 등이 사용한 microinjection 법을 참고로 실험을 진행하였고, 총 600개의 누에알을 microinjection 하였으며, 형질전환에 사용된 누에알은 산란 후 4시간 이내의 것만 사용하였다.

구체적으로, 상기 <실시예 1>에서 제작한 전이벡터 'pG-3xP3-EGFP-BmA3-bPDIsp-BmCecB1'와 헬퍼(Helper) 플라스미드인 pHA3PIG의 농도비는 1 : 1(각각 200 ng/ul)의 비율로 사용하였고, 미세주입(microinjection)용 완충용액 (5 mM KCl, 0.5 mM Phosphate buffer, pH 7.0)에 0.2 ㎍/㎕의 농도로 희석하였다.

누에 초기 배로의 미세주입(microinjection)은 배아의 주공과 후부 사이의 가운데 배면 부분에 주사하였는데, 그 과정은 다음과 같이 실시하였다.

먼저 텅스텐 침으로 누에알의 난간에 작은 구멍을 뚫고, 이 구멍에 DNA 용액이 들어있는 미세관(microcapillary)의 끝을 삽입 후, 미세주입기(microinjector)의 공기압을 이용하여 DNA 용액을 알 속으로 주입하였다.

이때 각 배아에 주입된 DNA 용액의 양은 10~15nl 가 사용되었고, 난간에 생긴 구멍은 시아노크릴레이트(Cyanocrylate) 접착제를 사용하여 막았다.

총 600개의 누에 알에 미세주입(microinjection)하였으며, 미세주사 후 누에알은 보습한 패트리디쉬에 넣어서 25℃에서 부화할 때까지 보호하였다.

<2-3> 누에 형질전환체의 선발

누에 형질전환체의 선발은 형광현미경을 이용하였으며, 구체적으로, LEICA MZ16FA 현미경(Leica사, USA)과 Microscope MZ FLIII Flourescence Filter EGFP 형광필터(Leica사, USA)를 사용하여, 누에의 세대별 및 시기별로 관찰하여 선발하였다.

기존에 보고된 문헌에 의하면 3xP3 프로모터는 누에 초기 배 단계의 눈과 신경조직, 유충의 눈에서 작용한다고 알려져 있으므로, 이러한 특징을 근거로 형질전환체를 선발하였다

그 결과, 49마리의 유충이 부화되었으며, 그 중 성충이 된 나방들을 서로 교배시켜 총 22아구(Broods)의 F1세대 누에알을 얻었고, 형질전환체 선발을 위해 시기에 따라 형광현미경으로 관찰한 결과, 산란 후 3일째부터 누에초기배(G1)의 눈과 신경조직에서 녹색형광이 관찰되었으며, 총 2아구(Broods)의 형질전환체를 선발할 수 있었다(표 1).

또한, 이렇게 선발된 아구에서 녹색형광의 눈을 가진 유충과 번데기 그리고 성충을 선발하였고(도 3), 최종적으로 이들만을 교배하여 F2세대의 형질전환체를 선발하였다.

백옥잠 배아에 대한 컨스트럭트 DNA의 형질전환 비율

주입된 배아	부화된 배아	G1 양	EGFP 양성을 갖는 G1 양
600 마리	49 마리	22 마리	2마리

백옥잠 종이 숙주 종으로 사용되었다.

벡터 플라스미드 p3xP3-EGFP-BmA3-BmCecB1(200 ng/ul) 및 헬퍼 플라스미드(200 ng/ul)를 주입을 위해 사용되었다.

< 실험예 1> 누에 형질전환체 내에서 BmCecB1 합성유전자에 의해 생산되는 재조합 항균펩타이드 세크로핀 B1 의 항균활성확인

1. 실험방법

누에 형질전환체 내에서 BmCecB1 합성유전자에 의해 생산되는 재조합 항균펩타이드 세크로핀 B1의 활성을 알아보기 위해 Radial diffusion assay(RDA)를 통하여 검정하였다.

구체적으로, Citrate phosphate buffer(9mM sodium phosphate, 1mM sodium citrate, pH 7.4)와 1 %(w/v) type (low electroendosmosis) agarose, 0.03 % TSB로 구성된 멸균된 underlay gel에 배양된 세균 (4X10⁶ colony forming units/ml)을 넣고 혼합해준 뒤 배양접시에 굳힌 후 지름 3 mm의 구멍을 내어 1 mg/ml의 농도의 peptide를 10 ㎕씩 넣었다.

peptide가 확산되도록 37℃에서 3시간 배양한 후, Overlay gel (6 % TSB, 1 % agarose)을 붓고 37℃에서 다시 배양하였다.

각각의 peptide의 항균 활성력은 18시간 후부터 나타나는데, 세균이 자라지 못해 생기는 clear zone의 크기로 확인하였다.

2. 실험결과

상기 실험결과 도 4에 나타나 있듯이, 그람음성균인 Escherichia coli, Salmonella enteritides, Salmonella gallinarum, Salmonella pullorum, Salmonella typhimurium에서 본 발명의 재조합 항균펩타이드 세크로핀 B1이 발현되는 형질전환 누에가 정상누에에 비해 강한 항균활성을 나타내는 것이 확인되었고, 또한 도 4에 나타나 있듯이 형질전환누에의 체액 10 ㎕가 Sigma사에서 시판되는 멜리틴 항균펩타이드(320ng)와 거의 유사한 활성을 나타내었다.

따라서 누에에서 재조합 항균펩타이드 세크로핀 B1이 생산되는 누에형질전환체가 제작되었음을 확인할 수 있었다.

이와 같이, 상기 형질전환 누에는 본 발명의 재조합 항균펩타이드 세크로핀 B1을 함유하고 있는 형질전환 누에를 생산함으로써, 천연항생제로서 개발이 가능하여, 가축사료 첨가제 뿐만 아니라 화장품, 치약 등 생활용품의 소재 등으로 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 양잠농가는 본 발명을 통해 일반누에와는 차별화된 고부가가치의 천연항생제를 생산하는 형질전환 누에를 사육함으로써 소득향상에 크게 기여할 수 있다.

상기의 본 발명은 바람직한 실시예 및 시험예를 중심으로 살펴보았으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 본질적 기술 범위 내에서 상기 본 발명의 상세한 설명과 다른 형태의 실시예들을 구현할 수 있을 것이다. 여기서 본 발명의 본질적 기술범위는 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (12)

1. 표지 유전자 조절 프로모터, 표지 유전자, 누에 유래 프로모터 및 누에 유래 BmCecB1 합성유전자가 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는,
   재조합 발현벡터.
   
2. 제 1항에 있어서,
   상기 누에 유래의 BmCecB1 합성유전자는 BmCecB1 유전자의 35개의 활성부위와 누에 유래의 단백질이황화이성질화효소의 시그날 펩타이드를 융합하여 합성된 유전자인 것을 특징으로 하는,
   재조합 발현벡터.
   
3. 제 1항에 있어서,
   상기 누에 유래 프로모터는 누에 유래 액틴3 프로모터인 것을 특징으로 하는,
   재조합 발현벡터.
   
4. 제 1항에 있어서,
   상기 표지 유전자 조절 프로모터는 눈과 신경시스템에 발현하는 3xP3 프로모터인 것을 특징으로 하는,
   재조합 발현벡터.
   
5. 제 1항에 있어서,
   상기 표지 유전자는 형광단백질(green fluorescent protein, EGFP) 유전자인 것을 특징으로 하는,
   재조합 발현벡터.
   
6. 제 1항에 있어서,
   상기 유전자 컨스트럭트는 도 2의 구조로 구성되는 것을 특징으로 하는,
   재조합 발현벡터.
   
7. 제 1항에 있어서,
   상기 발현벡터는 piggyBac 벡터인 것을 특징으로 하는,
   재조합 발현벡터.
   
8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 재조합 발현벡터를 누에(Bombyx mori) 또는 누에알에 형질전환시켜 제조한,
   재조합 항균펩타이드가 발현되는 형질전환 누에.
   
9. 1) 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;
   2) 상기 단계 1)의 재조합 발현벡터를 누에알에 주입하여 형질전환된 누에알을 제조하는 단계; 및
   3) 상기 단계 2)의 형질전환된 누에알을 부화시켜 형질전환 누에를 제조하는 단계를 포함하는,
   재조합 항균펩타이드가 발현되는 형질전환 누에의 제조방법.
   
10. 제 9항에 있어서,
    상기 단계 2)의 형질전환은 미세주입법(microinjection)을 이용하는 것을 특징으로 하는,
    재조합 항균펩타이드가 발현되는 형질전환 누에의 제조방법.
    
11. 제 9항에 있어서,
    상기 단계 3)에 있어서 하기 중 하나의 방법으로 형질전환 누에를 선발하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 재조합 항균펩타이드가 발현되는 형질전환 누에의 제조방법:
    i) 발현벡터에 표지 유전자를 도입한 후, 형질전환 누에에서 상기 표지 유전자의 발현을 확인하는 방법; 또는
    ii) 형질전환 누에에서 재조합 항균펩타이드의 발현을 확인하는 방법.
    
12. 1) 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;
    2) 상기 단계 1)의 재조합 발현벡터를 누에 또는 누에알에 형질전환시켜 형질전환 누에를 제조하는 단계; 및
    3) 상기 단계 2)의 형질전환된 누에를 사육하여 상기 재조합 항균펩타이드를 함유하는 형질전환 누에를 획득하는 단계를 포함하는,
    재조합 항균펩타이드가 함유된 형질전환 누에의 대량 생산방법.

Images