DE60021404T2

DE60021404T2 - System zur herstellung von proteinen

Info

Publication number: DE60021404T2
Application number: DE60021404T
Authority: DE
Inventors: Roger Sandbach CRAIG; Charalambos Savakis
Original assignee: Minos Biosystems Ltd
Current assignee: Minos Biosystems Ltd
Priority date: 1999-10-19
Filing date: 2000-10-19
Publication date: 2006-04-27
Anticipated expiration: 2020-10-20
Also published as: JP4101517B2; BR0014926A; AU779239C; CN1399685A; EP1222301B2; WO2001029204A3; CN1273605C; JP2003512051A; ES2241665T5; DE60021404D1; EP1222301A2; DE60021404T3; AU779239B2; CA2387991A1; ATE299944T1; EP1222301B1; AU1036301A; ES2241665T3; WO2001029204A2; MXPA02003883A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein System zur Herstellung von Proteinen in Insektenlarven. Insbesondere umfasst die Erfindung die Herstellung von Proteinen von Interesse in Drosophila- und Mittelmeerfruchtfliegen-Larven.
Proteinproduktionssysteme, bei denen Polypeptide oder Proteine von Interesse in rekombinanten Organismen oder Zellen hergestellt werden, sind das Rückgrat der kommerziellen Biotechnologie. Die frühesten Systeme, basierend auf der bakteriellen Expression in Wirten wie E. coli, sind durch Systeme ergänzt worden, die auf eukaryotischen Wirten basieren, insbesondere auf Säugerzellen in Kultur, Insektenzellen, sowohl in Kultur als auch in Form ganzer Insekten, und auf transgenen Säugern, wie etwa Schafen und Ziegen.
Prokaryotische Zellkultursysteme sind leicht aufrechtzuerhalten und lassen sich preiswert betreiben. Jedoch sind prokaryotische Zellen nicht zur posttranslationalen Modifikation eukaryotischer Proteine befähigt. Darüber hinaus werden viele Proteine inkorrekt gefaltet, was spezifische Prozeduren erfordert, um diese erneut zu falten, was die Produktionskosten erhöht.
Eukaryotische Zellkultursysteme sind für eine Reihe von Anwendungen beschrieben worden. Beispielsweise sind Säugerzellen zur posttranslationalen Modifikation befähigt und produzieren allgemein Proteine, die korrekt gefaltet und löslich sind. Die Hauptnachteile von Säugerzellsystemen beinhalten die Erfordernis spezialisierter und teurer Kultureinrichtungen, sowie das Risiko von Infektion, die zum Verlust der gesamten Kultur führen kann.
Pflanzliche Produktionssysteme können für die Proteinexpression verwendet werden und können eine Produktion mit hoher Ausbeute erreichen. Jedoch sind transgene Nutzpflanzen schwer einzuschließen und verursachen das Risiko einer Kontamination der Umwelt mit genetisch manipuliertem Material.
Insektenzellen werden ebenfalls für die Polypeptidexpression verwendet. Das am weitesten verbreitete Expressionssystem, das in Insektenzellen verwendet wird, basiert auf Baculovirus-Vektoren. Ein Baculovirus-Expressionsvektor wird konstruiert, indem man das Polyhedringen des Baculovirus, das für ein Hauptstrukturprotein des Baculovirus codiert, durch ein heterologes Gen ersetzt, das unter der Kontrolle des starken nativen Polyhedrin-Promotors steht. Kultivierte Insektenwirtszellen werden mit dem rekombinanten Virus infiziert, und das dadurch produzierte Protein kann aus den Zellen selbst oder aus dem Kulturmedium gewonnen werden, wenn geeignete Sekretionssignale verwendet werden. Diese Systeme jedoch leiden an Problemen, die mit der Infektion der Kultur und der Erfordernis spezialisierter Kultureinrichtungen verbunden sind.
Auf Organismen basierende Expressionssysteme vermeiden viele der Infektionsnachteile und sind leichter heranzuzüchten als Zellkulturen. Beispielsweise erlaubt die Verwendung von Virusvektoren, wie etwa dem Baculovirus, die Infektion ganzer Insekten, die weniger Erfordernisse hinsichtlich spezieller Zuchtbedingungen aufweisen. Große Insekten, wie etwa Seidenmotten, erbringen eine hohe Ausbeute des heterologen Proteins. Das Protein kann gemäß konventionellen Extraktionstechniken aus den Insekten extrahiert werden.
Ebenfalls bekannt sind Techniken, die auf der Expression von interessierenden Proteinen in Säugern, wie etwa Ziegen und Schafen, basieren, und zwar unter der Kontrolle von Milchprotein-Expressionskontrollsequenzen, sodass diese in die Milch exprimiert werden. Diese Techniken besitzen große potentielle Vorteile, sind jedoch aufgrund des Erfordernisses zur Isolierung bzw. Entfernung von endogenen Säugerviren, Prionen und Proteinen aus dem Endprodukt kostspielig. Darüber hinaus sind die Kosten zur Erzeugung und Haltung großer transgener Tiere hoch.
Die Verwendung von Insektenlarven, denjenigen von Trichoplusia ni, ist zur Anwendung in Proteinproduktionssystemen vorgeschlagen worden (Pham et al., 1999, Biotech Bioeng 62: 175–182). Jedoch sind solche Systeme nur in Kombination mit viraler Vektortechnologie, basierend auf dem Bereich der Baculoviren, vorgeschlagen worden.
Wenn Proteine für Nahrungszwecke oder pharmazeutische Zwecke gedacht sind, so ist die Verwendung bakterieller Systeme und/oder viraler Vektoren nicht erstrebenswert. Es gibt daher in der Technik einen Bedarf für ein Proteinproduktionssystem, das sowohl robust als auch skalierbar ist, wie es Systeme auf Basis ganzer Organismen sind, das frei von Virusbasierten Vektoren ist, und das außerdem kostengünstig in einer abgeschlossenen Umgebung betrieben werden kann.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines interessierenden Proteins bereit, bei dem man:

(a) ein Insekt mit einem auf einem Transposon basierenden Expressionssystem, welches in der Lage ist, das interessierende Protein in den Larven des Insektes zu exprimieren, transformiert,
(b) das Insekt für eine Produktion von Larven kultiviert,
(c) die Larven massenweise züchtet und
(d) das interessierende Protein aus den massengezüchteten Larven isoliert.

Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erlaubt die schnelle Produktion von Milligramm-Mengen an Polypeptiden für Forschungszwecke, die Produktion von Kilogramm-Mengen an Proteinen für klinische und diagnostische Anwendungen und potentiell von tausenden von Kilogramm an industriellen Enzymen bei geringen Kosten aufgrund der Problemlosigkeit, mit der Insektenlarven unter Verwendung etablierter Kulturtechniken kultiviert werden können.
Die Vorteile der Verfahren gemäß der Erfindung sind vielfältig. Die Massenzucht von Insektenlarven ist unter Verwendung bestehender Technik möglich und erlaubt die Produktion von Polypeptidprodukten bei extrem niedrigen Kosten und in einer kontrollierten Produktionsumgebung. Dies erleichtert eine behördliche Zulassung im Hinblick auf ganze Organismen, wie etwa Säugern, bei denen die Abwesenheit von Viren und Prionen bewiesen werden muss, bevor die Zulassung erteilt wird. Darüber hinaus umgeht das Verfahren der Erfindung die mit der Kultur von Tierzellen (einschließlich Insektenzellen) verbundenen Nachteile, die das höhere Risiko von Infektion und das Risiko der Kontamination durch Viren und Prionen bei Säugerzellkultur oder transgenen Produktionssystemen einschließen.
Der Begriff „Protein" beinhaltet einzelkettige Polypeptidmoleküle ebenso wie multiple Polypeptidkomplexe, bei denen einzelne Polypeptidbestandteile auf kovalentem oder nicht-kovalentem Wege verbunden sind. Der Begriff „Polypeptid" beinhaltet Peptide mit einer Länge von zwei oder mehr Aminosäuren, typischerweise von mehr als 5, 10 oder 20 Aminosäuren.
Das bevorzugte Expressionssystem zur Verwendung in Insektenlarven basiert auf Transposons. Geeignete Transposons sind unten in größerem Detail beschrieben.
Das in dem Verfahren der Erfindung verwendete Expressionssystem umfasst Kontrollelemente, die in Insektenzellen und insbesondere in Insektenlarven, aktiv sind. Viele Insekten-Kontrollsequenzen, einschließlich verschiedener Promotoren, sind in einer Anzahl verschiedener Spezies aktiv. Daher ist es nicht essentiell, dass Sequenzen verwendet werden, die von dem fraglichen Insekt stammen. Es können induzierbare oder konstitutiv aktive Sequenzen verwendet werden.
Vorzugsweise sind die Kontrollsequenzen induzierbare Sequenzen. Ein bevorzugter induzierbarer Promotor ist der Hitzeschockprotein HSP70-Promotor, der induziert wird, indem man die Temperatur erhöht, bei der die Larven kultiviert werden, sowie durch Tetracyclin induzierbare Expressionssysteme (Heinrich und Scott, PNAS 97: 8229–8232, 2000).
Um die Proteinproduktion zu erhöhen, können multiple Expressionssysteme verwendet werden. Diese Systeme können mit zwei oder mehr codierenden Sequenzen, die in jedem System vorliegen, angeordnet werden, oder als multiple Einzelsysteme. In jedem Fall kann ein Balancer-Chromosom verwendet werden, um die Aufrechterhaltung des Expressionssystems und dessen Weitergabe an die Nachkommenschaft während der Fortpflanzung bzw. Kreuzung der Insekten zu begünstigen.
Ein Vorteil der Kultur von Insektenlarven besteht darin, dass die Kulturen synchronisiert werden können, sodass alle Larven zur selben Zeit das gleiche Entwicklungsstadium erreichen. Dies kann erreicht werden, indem man die Kulturtemperatur variiert, da die Larven sich bei niedrigeren Temperaturen langsamer entwickeln. Beispielsweise entwickeln sich die Larven bei 18°C mit der halben Geschwindigkeit im Vergleich zum Wachstum bei 25°C.
Weitere Vorteile der Erfindung beinhalten die Tatsache, dass die Proteinanreicherung auf den Fettkörper ausgerichtet werden kann, oder dass das Protein unter der Kontrolle geeigneter Kontrollregionen und Signalpeptide, wie etwa denjenigen der larvalen Serumprotein-Sequenzen, in die Hämolymphe sekretiert werden kann.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt die Struktur des Transposons pMiHspGFP/HspCcW, das GFP und das Gen white unter der Kontrolle des Hsp70-Promotors exprimiert.
2 zeigt die Struktur des Plasmids pMiAct5CGFP, das GFP unter der Kontrolle des Drosophila Actin 5C-Gens exprimiert.
3 zeigt die Expression von GFP bei transgenen Mittelmeerfruchtfliegen und Mittelmeerfruchtfliegen-Larven nach Hitzeschock.
4 zeigt die konstitutive Expression von GFP in Drosophila-Fliegen.
5 zeigt die konstitutive Expression von GFP bei adulter Drosophila. Die beobachtete Fluoreszenz ist von der Gendosis abhängig.
6 zeigt die Expression von GFP bei Drosophila-Larven (oben: transgen; unten: Wildtyp).
7 zeigt die Struktur eines Vektors zur Expression eines Proteins in der larvalen Hämolymphe. LspP/L ist der Promotor des Larvalen Serumprotein(Lsp)-Gens aus Drosophila- oder der Mittelmeerfruchtfliege, gefolgt von dem untranslatierten 5'-Leader von Lsp (gestreifte Box) und dem Lsp-Signalpeptid (schwarze Box). Das Gen von Interesse wird im Leseraster mit dem Leader-Peptid fusioniert. HspP und HspT sind Hitzeschock 70-Genpromotor, bzw. -Terminator. CcW ist das white-Gen der Mittelmeerfruchtfliege, das als dominanter sichtbarer Marker für die Detektion von Transformanten verwendet wird. MiL und MiR sind die Enden des Minos-Elements.
8 ist eine vorläufige Sequenz eines anti-PERV p30-Antikörperklons, der aus einer Kamelartigen-Antikörperbibliothek isoliert und in Mittelmeerfruchtfliegen-Larven exprimiert wird.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Obwohl die hier genannten Techniken allgemein im Stand der Technik wohlbekannt sind, verweisen wir insbesondere auf Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989) und Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999), 4. Auflage, Herausgeber John Wiley & Sons, Inc.
Transposons
Transposons sind genetische Elemente, die befähigt sind, zu „springen", bzw. die im Genom einer Spezies von einer Position zu einer anderen transponierbar sind. Sie sind unter Tieren, einschließlich Insekten, weit verbreitet.
Transposons sind aufgrund der Aktivität eines Transposaseproteins, das von den Elementen selbst codiert wird oder über andere Mittel – wie etwa durch die Injektion Transposase-codierender mRNA, die Verwendung einer zweiten, für Transposase codierenden Sequenz oder die Zuführung des Transposaseproteins selbst – bereitgestellt wird, innerhalb ihrer Wirtsspezies aktiv. Fortschritte beim Verständnis der Mechanismen der Transposition haben zur Entwicklung genetischer Werkzeuge auf Basis von Transposons geführt, die für die Genübertragung verwendet werden können.
Es kann jedes transponierbare Element verwendet werden, das in dem gewünschten Insekt aktiv ist. Bevorzugt wird das transponierbare Element jedoch aus der Gruppe, bestehend aus Minos, mariner, Hermes, Sleeping Beauty und piggyBac, ausgewählt.
Minos ist ein transponierbares Element, das in der Mittelmeerfruchtfliege aktiv ist. Es ist im US-Patent 5,840,865 beschrieben, das hier durch Referenz vollumfänglich in Bezug genommen wird. Die Verwendung von Minos zur Transformation von Insekten ist in dem vorstehend genannten US-Patent beschrieben.
Mariner ist ein Transposon, das ursprünglich aus Drosophila isoliert wurde, das jedoch seitdem in mehreren Invertebraten- und Vertebratenspezies entdeckt wurde. Die Verwendung von mariner zur Transformation von Organismen ist in der internationalen Patentanmeldung WO 99/09817 beschrieben.
Hermes stammt von der gewöhnlichen Stubenfliege. Seine Verwendung zur Erzeugung transgener Insekten ist im US-Patent 5,614,398 beschrieben, das hier durch Referenz vollumfänglich in Bezug genommen wird.
PiggyBac ist ein Transposon, das von dem Baculoviruswirt Trichoplusia ni stammt. Seine Verwendung zur Keimbahntransformation der Mittelmeerfruchtfliege ist in Handler et al., (1998) PNAS (USA) 95: 7520–5 beschrieben.
Der Gentransfer erfolgt durch nachgewiesene Transposon-vermittelte Keimbahntransformation. Das Transposon der Wahl ist Minos, für das gezeigt wurde, dass es als Transgenese-Vektor in der Mittelmeertruchtfliege (Loukeris et al., 1995) und in Drosophila fungiert. Andere Transposons, die in der Mittelmeerfruchtfliege funktionell sind, so etwa piggyBac (McCombs et al., 1998) können als Alternativen verwendet werden. Die Transformationsmethodik der Mittelmeerfruchtfliege ist in der Literatur gut beschrieben (Loukeris et al., 1995). Kurz dargestellt, wird zirkuläre Plasmid-DNA, die ein Transposon enthält, das aus einem interessierenden Gen (wie etwa Erythropoietin, plus geeigneter regulatorischer DNA-Sequenzen), flankiert durch die beiden Transposonenden, besteht, zusammen mit einer Transposase-Quelle (einem Transposase exprimierenden Plasmid; einer für Transposase codierenden, in vitro synthetisierten mRNA; oder dem Transposase-Protein selbst) in Präblastoderm- Mittelmeerfruchtfliegen-Embryos injiziert. In den frühen Embryos interagiert die Transposase mit den Transposonenden und katalysiert das Ausschneiden des Transposons und dessen Reintegration in die Chromosomen an zufälligen Positionen. Für gewöhnlich wird zur Erleichterung der Detektion der transgenen Fliegen ein „Markergen", wie etwa ein Gen, das einen dominanten sichtbaren oder anderweitig selektierbaren Phänotyp verleiht, ebenfalls in das Transposon einbezogen. Die transgenen Fliegen werden unter der Nachkommenschaft der injizierten Fliegen unter Ausnutzung des Markergen-Phänotyps detektiert und dann bis zur Homozygotie weiter gezüchtet. Verschiedene derartige Stämme, die jeweils eine Insertion an einer unterschiedlichen Position im Genom enthalten, können bei jedem Transformationsexperiment erzeugt werden, was die Injektion mehrerer hundert Eier mit sich bringt.
Multiple Insertionen
Um die Expressionsniveaus zu erhöhen, können durch Kreuzung zwischen verschiedenen transgenen Stämmen Stämme erzeugt werden, die multiple Insertionen enthalten. Diese Prozedur kann durch die Verwendung von Balancer-Chromosomen erleichtert werden. Balancer-Chromosomen enthalten mehrere überlappende Inversionen, eine oder mehrere rezessive letale Mutationen und wenigstens eine dominante sichtbare Mutation. Diese Chromosomen unterdrücken die Rekombination und können verwendet werden, um Chromosomen, die mehrere mutante Gene tragen, aufrechtzuerhalten und zu manipulieren. Ein Mittelmeerfruchffliegen-Balancer-Chromosom, FiM 1, ist beschrieben worden. Durch Unterdrücken der Rekombination über einen großen Bereich von Chromosom 5, kann es dafür verwendet werden, ein Chromosom 5 zu konstruieren, das mehrere Transposon-Insertionen trägt.
Auswahl des Insekts und des Promotors
Es gibt eine Anzahl von Insektenlarven, die für die Verwendung bei der vorliegenden Erfindung geeignet sind, einschließlich einer jeden von Bactrocera oleae (Olivenfliege), Bactrocera orientalis (orientalische Fruchtfliege), Heliothis armigera (Baumwollkapselwurm), Trichoplusia ni (Kohlspannerraupe), Manduca sexta (Tabakschwärmer), Lobesia botrana (Traubenwickler), Anopheles gambiae (Malariamücke), Aedes aegypti (Gelbfiebermücke), Glossina morsitans (Tse-Tse-Fliege), Simulium sp. (Kriebelmücke), Phlebotomus sp. (Sandmücke), Musca domestica (Stubenfliege) und Ceratitis capitata (Mittelmeerfruchtfliege). Bevorzugt ist jedoch die Mittelmeerfruchtfliege.
Vorzugsweise ist der verwendete Promotor ein starker Promotor. Es sind zwei alternative Kategorien von Promotoren für die Verwendung verfügbar: induzierbare und konstitutive Promotoren.
Induzierbare Promotoren beinhalten z.B. Hitzeschockpromotoren. Bevorzugt ist der Hitzeschockpromotor ein Insektenhitzeschockpromotor, z.B. der Drosophila melanogaster hsp70-Promotor, der befähigt ist, die Expression von Genen in heterologen Organismen, einschließlich der Mittelmeerfruchtfliege, anzutreiben. Die Erfindung umfasst auch die Verwendung des Mittelmeerfruchtfliegen-hsp70-Promotors (Papadimitriou et al., (1998) Insect Mol Biol 7: 279–90). Alternative Systeme können auf der Induktion mit dem Antibiotikum Tetracyclin basieren (Heinrich und Scott, PNAS 97: 8229–8232, 2000).
Hitzeschockpromotoren können induziert werden, indem man die Temperatur bei den Haltungsbedingungen der Mittelmeerfruchtfliege erhöht. Beispielsweise ist der hsp70-Promotor bei 23–25°C nur auf niedrigem Niveau oder gar nicht aktiv. Dies erlaubt es den Insektenlarven, sich ohne die Belastung, die durch die Produktion eines heterologen Proteins hervorgerufen wird, zu entwickeln. Bei höheren Temperaturen, wie etwa bei 37–42°C jedoch wird der hsp70-Promotor induziert und exprimiert das heterologe Protein auf hohem Niveau.
Induzierbare Promotoren können auf Basis bekannter induzierbarer Genkontrollelemente konstruiert werden. Beispielsweise können induzierbare Promotoren durch die Kombination mit einem Element konstruiert werden, das auf einen Wirkstoff oder ein Hormon anspricht, der/das mit der Nahrung verabreicht werden kann. Bei einer bevorzugten Ausführungsform kann ein humanes Östrogen-Response-Element (ERE) verwendet werden, um die Expression des interessierenden Proteins zu regulieren, solange das Insekt mit einer zweiten codierenden Sequenz transformiert wird, die den humanen Östrogen-Rezeptor exprimiert.
Es können auch konstitutive Promotoren verwendet werden, um das interessierende Protein und/oder andere Proteine zu exprimieren, die in der Insektenlarve benötigt werden. Beispielsweise kann der konstitutive Promotor ein zytoplasmatischer Actin-Promotor sein. Der zytoplasmatische Actin-Promotor von D. melanogaster ist kloniert worden (Act5C) und ist hochgradig aktiv in Moskitos (Huynh und Zieler, (1999) J. Mol. Biol. 288: 13–20). Zytoplasmatische Actingene und ihre Promotoren können auch aus anderen Insekten, einschließlich Mittelmeertruchtfliege, isoliert werden.
Andere Beispiele beinhalten den zytoplasmatischen Tubulin-Promotor, beispielsweise den zytoplasmatischen Tubulin-Promotor der Mittelmeerfruchtfliege.
Es können Promotoren verwendet werden, die sekretierte Polypeptide kontrollieren, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Signalsequenzen, um die Sekretion des Proteins in die Hämolymphe zu veranlassen. Beispielsweise kann der larvale Serumprotein-Promotor verwendet werden (Benes et al., (1995) Mol. Gen. Genet. 249(5): 545–56).
Zucht der Larven
Die Technik zur Massenzucht der Mittelmeerfruchtfliege ist hoch entwickelt. Es existieren Einrichtungen zur Massenzucht, die über 1.000 Millionen Fliegen pro Woche produzieren. Diese Fliegen werden zur Schädlingskontrolle der Mittelmeerfruchtfliege mittels der Technik steriler Insekten verwendet: sie werden sterilisiert, indem man sie im Puppenstadium bestrahlt, und dann ins Gelände entlassen.
Der Lebenszyklus der Mittelmeerfruchtfliege beträgt etwa 25 Tage bei 25°C, und ein Weibchen legt normalerweise 100–200 Eier. Ebenso wie alle holometabolen Insekten besitzt die Mittelmeerfruchtfliege vier abgegrenzte Entwicklungsstadien: das embryonale (das etwa 2 Tage andauert), das larvale (etwa 8 Tage), das pupale (etwa 10 Tage) und das adulte Stadium. Die Geschlechtsreife wird innerhalb von 4–6 Tagen des adulten Lebens erreicht. Gerade vor der Verpuppung besitzt jede Larve eine Masse von etwa 10 mg und enthält etwa 200 Mikrogramm an Protein.
Für die Proteinproduktion können larvale Kulturen, die zu unterschiedlichen Zeiten gestartet wurden, durch geeignete Schemata des Temperaturwechsels synchronisiert werden. Dies ist möglich, da die Wachstumsgeschwindigkeit von der Umgebungstemperatur abhängt: bei 18°C nimmt die larvale Wachstumsgeschwindigkeit um etwa 50% ab.
Für die Herstellung im Labormaßstab ist die Verwendung kleinerer Insekten, wie etwa Drosophila, bevorzugt. Obwohl pro Larve weniger Protein erzeugt wird, ist der Lebenszyklus kürzer und die Produktion kann schneller etabliert werden. Beispielsweise beträgt der Lebenszyklus von Drosophila 12 Tage, mit 1 mg-Larven, die in der Lage sind, jeweils 20 μg an Protein zu liefern.
Die Erfindung wird, allein zu Zwecken der Veranschaulichung, anhand der folgenden Beispiele erläutert.
Beispiele
Beispiel 1: Produktion von GFP in Larven von Mittelmeerfruchtfliege und Drosophila
Das Gen, das für das Grüne Fluoreszenzprotein (GFP) aus der Qualle Aequorea victoria codiert, ist in der Mittelmeerfruchtfliege (Ceratitis capitata) und in der Fruchtfliege (Drosophila melanogaster) exprimiert worden. Transgene Drosophila- und Mittelmeerfruchtfliegen-Larven, -Puppen und Adulttiere, die einzelne und multiple Insertionen eines Minos/GFP-Transposons in ihrem Genom enthalten, zeigen GFP-charakteristische Fluoreszenz. Es werden zwei GFP-Konstrukte verwendet, eines mit einem induzierbaren Promotor (dem Drosophila Hsp70) und eines mit einem konstitutiven Promotor (dem Drosophila ActinSC-Promotor). Drosophila- und Mittelmeerfruchtfliegen-Larven mit dem Hsp70/GFP-Gen zeigen bei den normalen Zuchttemperaturen (22°C) niedrige Niveaus der Fluoreszenz, und erhöhte Fluoreszenz nachdem sie für 1 Stunde erhöhter Temperatur (39°C) ausgesetzt wurden. Drosophila-Larven mit dem Actin5C/GFP-Gen zeigen konstitutiv hohe Niveaus der GFP-Fluoreszenz. GFP wird in den meisten, wenn nicht sogar in allen Geweben von Drosophila und Mittelmeerfruchtfliege exprimiert. Außerdem wird das GFP-Protein in den transgenen Insekten unter Verwendung eines Immunoblot-Assays detektiert. Der Vergleich verschiedener transgener Linien zeigte, dass die Niveaus der GFP-Expression von der Integrationsposition des Transgens und der Anzahl der im Genom vorhandenen Transgen-Kopien abhängt.
Materialien und Methoden
Fliegen und DNA-Injektion: Der Drosophila yw-Stamm und der Ceratitis capitata-Stamm A71, ein weißäugiger Stamm, der für das w1-Gen homozygot ist, werden in allen Versuchen verwendet; die Fliegen werden bei 22°C unter Standardbedingungen gezüchtet. Die DNA-Injektionen von Transposon-Plasmiden zusammen mit einem Transposase exprimierenden Helferplasmid werden, wie zuvor beschrieben (Loukeris et al., 1995, Science), unter Verwendung von Präblastoderm-Embryos durchgeführt.
Plasmid-Konstruktionen und DNA-Analyse
Das Plasmid pMiHsp70/GFP wird konstruiert, indem man ein PCR-amplifiziertes Fragment, das das GFP-Gen enthält, in der richtigen Orientierung in die multiple Klonierungsstelle des Plasmids pHSS6Hsp70PT inseriert. Das Plasmid pHSS6Hsp70PT enthält, in der richtigen Orientierung, den Promotor und das 3'-mRNA-Trailer-Polyadenylierungssignal (hier im Folgenden als „Terminator" bezeichnet) des Hsp70-Gens von Drosophila melanogaster. Promotor und Terminator sind durch eine multiple Klonierungsstelle voneinander getrennt. Der Hsp70-Promotor enthält auch die 5'-untranslatierte Leader-Sequenz der Hsp70-mRNA für erhöhte mRNA-Stabilität. Die Promotor/GFP/Terminator-Kassette wird dann als Not1-Fragment in einen Minos-Vektor kloniert, der die wildtypische cDNA des white-Gens der Mittelmeerfruchtfliege (Loukeris et al., 1995, Science) enthält. Das white-Gen wird als primärer sichtbarer genetischer Marker für die Detektion von Transformanten verwendet (Loukeris et al., 1995, Science). Die Struktur des Transposons pMiHspGFP/HspCcW ist in 1 dargestellt.
Das Plasmid pMiAct5CGFP (2) enthält das GFP-Gen stromabwärts des Drosophila melanogaster 2 kb-Fragments, das den Promotor des Actin5C-Gens enthält, welches für das ubiquitär exprimierte zytoplasmatische Actin codiert. Das Plasmid pMiAct5CGFP enthält nicht das white-Gen als primären Marker, und die mit diesem Plasmid erzeugten Transformanten werden nur auf Basis der GFP-Expression identifiziert (siehe unten).
Bei einem typischen Transgenese-Experiment wird ein Gemisch von Transposon-Plasmid-DNA und Helferplasmid-DNA in Drosophila- oder Mittelmeerfruchtfliegen-Präblastoderm-Embryos (0–1 Stunde nach der Eiablage), die für die Augenfarbenmutation white homozygot sind, co-injiziert. Um die transgenen Mittelmeerfruchtfliegen zu detektieren, werden die Fliegen, die aus den injizierten Embryos erhalten wurden (Generation G0) über Rückkreuzung mit dem Empfängerstamm weitergezüchtet, und die zugehörige Nachkommenschaft wird individuell im Larvenstadium auf die Expression entweder des white-Gens (Fliegen, die mit pMiHspGFP/HspCcW injiziert worden waren) oder von GFP (Fliegen, die mit pMiAct5CGFP injiziert worden waren) getestet. Die Expression von white ist als Wechsel der Augenfarbe von weiß nach farbig (variierend von blassgelb bis zu wildtypischem rot) detektierbar. Die Expression von GFP wird durch das Detektieren der GFP-spezifischen Fluoreszenz in den Geweben der Larven nach zwei aufeinander folgenden 1-stündigen Hitzebehandlungen der Larven bei 39°C im Abstand von 1 Tag unter Verwendung von Standard-Epifluoreszenzmikroskopie überwacht.
Einzelne transgene Larven (Generation G1) werden durch Rückkreuzen mit dem Empfängerstamm weitergezüchtet, und einzelne white oder GFP exprimierende Nachkommen (G2) werden untereinander gekreuzt, um homozygote Nachkommenschaft (G3) zu erhalten. Die Intensität der Augenfarbe oder der GFP-Fluoreszenz ist von der Gendosis abhängig. Durch Untersuchen dieser Phänotypen werden somit unter der G3-Nachkommenschaft homozygote Individuen detektiert. Putativ homozygote G3-Individuen werden untereinander weiter gezüchtet, und deren Nachkommenschaft wird mittels Southern-Blot analysiert, um zu bestimmen, ob sie einfache oder mehrfache Insertionen enthalten. Stämme, die für Einzelinsertionen homozygot sind, werden mittels dieser Prozedur etabliert.
Hitze-induzierbare Expression von GFP in Drosophila- und Mittelmeerfruchtfliegen-Larven
Transgene Drosophila- oder Mittelmeerfruchtfliegen-Larven, die für die Insertionen des Transposons MiHspGFP/HspCcW homozygot waren und bei der Standardtemperatur von 22–24°C gezüchtet werden, zeigen niedrige, jedoch detektierbare Niveaus der GFP-Fluoreszenz im Vergleich zu nicht-transgenen Larven. Nach dem Hitzeschock nimmt die Fluoreszenz dramatisch zu (3).
Konstitutive Expression von GFP in Drosophila
Transgene Drosophila, die homozygot für die Insertion des Transposons MiActSCGFP waren und bei einer Standardtemperatur von 22–24°C gezüchtet wurden, zeigen hohe Niveaus der GFP-Fluoreszenz im Vergleich zu nicht-transgenen adulten Fliegen (4) und Larven (6). Die Niveaus der Fluoreszenz sind von der Gendosis abhängig (5).
Es wurden keine GFP exprimierenden Mittelmeerfruchtfliegen in der Nachkommenschaft von mehr als 1000 G0-Tieren, die mit MiAct5CGFP injiziert wurden, detektiert. Wir schließen daraus, dass der Drosophila Actin5C-Promotor ein schwacher Promotor in der Mittelmeertruchtfliege ist und dass ein homologer Actin-Promotor in der Mittelmeertruchtfliege verwendet werden muss, um hohe Niveaus der konstitutiven Expression heterologer Proteine zu erreichen.
Mehrere transgene Drosophila-Linien, die für MiAct5CGFP homozygot sind, werden im Hinblick auf GFP-Expression miteinander verglichen. Obwohl alle Linien hohe Niveaus der Fluoreszenz zeigten, waren Linien-spezifische Unterschiede der Intensität detektierbar.
Beispiel 2: Produktion von humanem Wachstumshormon in Mittelmeerfruchtfliegenlarven
Eine cDNA-Sequenz, die für hGH codiert, wird stromabwärts des D. melanogaster-Promotors für das Hsp70-Hitzeschockgen kloniert. Der Hsp70-Promotor enthält auch die 5'-untranslatierte Leader-Sequenz der Hsp70-mRNA für gesteigerte mRNA-Stabilität. Der 3'-untranslatierte Trailer von D. melanogaster Hsp70, der ein Polyadenylierungssignal enthält, wird stromabwärts der für hGH codierenden Sequenz kloniert. Das Konstrukt wird in einen Minos- Vektor inseriert, der auch ein Markerkonstrukt enthält. Das Markerkonstrukt besteht aus dem Grünen Fluoreszenzprotein(GFP)-Gen aus Aequorea victoria, angetrieben von dem D. melanogaster Hsp70-Promotor und unter Einbeziehung der Hsp70 3'-Region. Dieser Marker verleiht den transgenen Organismen einen sichtbaren Genotyp (GFP-Fluoreszenz) und wird verwendet, um transgene Mittelmeerfruchtfliegen im embryonalen, larvalen oder adulten Stadium zu detektieren. Die Gesamtstruktur des vollständigen Transposons ist daher:
Minos linkes invertiertes Repeat – hGH exprimierendes Konstrukt – GFP-Marker exprimierendes Konstrukt – Minos rechtes invertiertes Repeat
Das Transposon wird in einem BlueScript-Vektor in E. coli konstruiert.
In vitro synthetisierte mRNA, die für Minos-Transposase codiert, wird als Transposase-Quelle bei den Transgenese-Versuchen verwendet. Die mRNA wird in vitro synthetisiert, wobei als Matrize ein Expressionsvektorplasmid verwendet wird, das das Transposase-Gen stromabwärts des Phage T7-Promotors kloniert sowie eine kommerziell erhältliche T7 RNA-Polymerase enthält. Die vollständige, nicht unterbrochene DNA-Sequenz, die für Minos-Transposase codiert, wird durch die reverse Transkription der Minos-mRNA aus transgener D. melanogaster, die die Minos-Transposase exprimiert, erhalten.
Plasmid-DNA, die das Transposon enthält, wird mit Minos-Transposase-mRNA in Präblastoderm-Embryos (0–1 Stunde nach der Eiablage) co-injiziert. Bedingungen für die Handhabung und Injektion von Mittelmeerfruchtfliegenembryos sind in der Literatur beschrieben (Loukeris et al., 1995). Unter diesen Bedingungen ist zu erwarten, dass 10–20% der fertilen Fliegen, die von den injizierten Embryos herrühren, transgene Nachkommen hervorbringen. Um transgene Mittelmeerfruchtfliegen zu detektieren, werden die Fliegen, die von den injizierten Embryos herrühren (Generation G0), durch Rückkreuzen mit dem Empfängerstamm weitergezüchtet, und ihre Nachkommenschaft wird einzeln im Larvenstadium auf GFP-Expression hin überprüft. Dies erfolgt durch die Detektion von GFP-spezifischer Fluoreszenz in den Geweben der Larven nach zwei aufeinander folgenden 1-Stunden-Behandlungen bei 39°C im Abstand von einem Tag und unter Verwendung von Standard-Epifluoreszenzmikroskopie.
Einzelne transgene Larven (Generation G1) werden durch Rückkreuzen mit dem Empfängerstamm weitergezüchtet, und einzelne GFP-exprimierende Nachkommen (G2) werden untereinander vermehrt, um homozygote Nachkommen (G3) zu erzeugen. Homozygote G3-Individuen sind durch Messen der GFP-Expression mittels quantitativer Epifluoreszenzmikroskopie detektierbar. Stämme, die für Einzelinsertionen homozygot sind, werden etabliert.
Bei solchen transgenen Stämmen hängen die Niveaus der Transgenexpression nicht nur von dem Promotor und den Bedingungen der Induktion ab, sondern auch von der Insertionsstelle des Transgens. Verschiedene unanhängig erhaltene Stämme (d.h. Stämme, die von verschiedenen G0-Fliegen abgeleitet sind) werden auf die Niveaus der hGH-Expression hin getestet, und diejenigen, die die höchsten Niveaus zeigen, werden auf der molekularen und zytogenetischen Ebene weiter charakterisiert. Die molekulare Charakterisierung besteht aus einer Southern-Analyse und, bei Stämmen, die schließlich für die Proteinproduktion verwendet werden, aus der Klonierung und Sequenzierung des Transgens. Die zytogenetische Charakterisierung erfolgt mittels in situ-Hybridisierung an Speicheldrüsen-Polytänchromosomen, um die Stelle der chromosomalen Insertion zu bestimmen.
Um Stämme mit multiplen Insertionen zu konstruieren, werden geeignete Kreuzungen zwischen Mitgliedern verschiedener Stämme durchgeführt. Die Nachkommenschaft dieser Kreuzungen wird untereinander vermehrt, und Individuen, die mehrfach homozygot sind, werden unter Verwendung von GFP als Marker gewonnen. In Abhängigkeit von der chromosomalen Position der Insertionen können Stämme, die Balancer-Chromosomen tragen, verwendet werden, um diese Konstruktionen zu erleichtern. Es sind drei bis vier Generationen erforderlich, um stabile Stämme mit multiplen Insertionen zu konstruieren.
Die Massenzucht von Larven erfolgt gemäß etablierten Verfahren. Die Larven werden auf einem halb-trockenem Futter vermehrt, das aus einer Kleiebasis, supplementiert mit Hefe, besteht. Das Larvenwachstum wird durch geeignete Temperaturverschiebungen synchronisiert, und Larven des dritten Stadiums werden für die Zeit, die zur maximalen Induktion des Transgens erforderlich ist, bei 39–41°C behandelt. Späte Larven des dritten Stadiums bewegen sich von dem Futter weg, um sich einen Platz zur Verpuppung zu suchen. Dieses Verhalten wird genutzt, um Larven für die massenhafte Fliegenproduktion in Massenzuchteinrichtungen von dem Futter abzusammeln; es wird auch für das Abernten der futterfreien Larven zur Proteinproduktion und Reinigung verwendet.
Die Mittelmeerfruchtfliegenlarven werden mit gekühlter Saline gewaschen und dann in Gegenwart von Protease-Inhibitoren homogenisiert. hGH wird gemäß Standardverfahren aus dem Homogenat gereinigt.
Beispiel 3: Produktion eines Kamelartigen-Antikörpers in Larven der Mittelmeerfruchtfliege
Ein Vektor, der zur Expression eines Proteins in der larvalen Hämolymphe vorgesehen ist, ist in 7 dargestellt. LspP/L ist der Promotor des Larvalen Serumprotein(Lsp)-Gens aus Drosophila oder der Mittelmeerfruchtfliege (Benes et al., (1995) Mol. Gen. Genet. 249(5): 545–56), gefolgt von dem untranslatierten Lsp 5'-Leader (gestreifte Box) und dem Lsp-Signalpeptid (schwarze Box). Das interessierende Gen, in diesem Fall das Kamelartigen-Antikörpergen, wird im Leseraster mit dem Leaderpeptid fusioniert. HspP bzw. HspT sind der Hitzeschock 70-Genpromotor bzw. -Terminator. CcW ist das white-Gen der Mittelmeerfruchtfliege, das als dominanter sichtbarer Marker zur Detektion von Transformanten verwendet wird. MiL und MiR sind die Enden des Minos-Elements.
Ein Kamelartigen-Antikörper wird aus einer Phagen-Expressionsbibliothek (Unilever) isoliert. Der Antikörper ist spezifisch für das Schweineretrovirus PERV (porcines endogenes Retrovirus) und erkennt die p30-Komponente der PERV gag-Proteine (virale Kern-Proteine). Ein p30-Klon wird in dem Expressionsvektor pHEN1 exprimiert, um Antigen zum Durchtesten der Antikörperbibliothek zu erhalten, und es werden entsprechende Antikörperklone selektiert. Eine vorläufige Sequenz und Translation des in diesem Versuch verwendeten Antikörpers ist in 8 dargestellt.
Die transgenen Fliegen werden, wie in Beispiel 1, durch white-Expression identifiziert. Die Antikörperexpression wird in der Hämolymphe der transgenen Fliegenlarven detektiert.
Der Antikörper wird durch Homogenisieren von Larvenextrakt und Reinigung über eine Protein A-Säulenchromatographie gereinigt. Die Immunglobuline binden an Protein A bei pH 8,6 und eluieren von der Säule bei pH 4,3. Die Elution erfolgt durch Verringern des pH der Protein A-Säule. Man lässt Protein A-Agarose (0,25 g; Sigma) in Tris-gepufferter Saline (0,05 M Tris 0,15 M NaCl, pH 8,6) quellen und lädt diese dann auf eine Säule (das Bettvolumen beträgt 1 ml). Der Kulturüberstand wird durch Zugabe von verdünnter NaOH auf pH 8,6 eingestellt und wird dann für 30 min bei 4°C bei 600 g zentrifugiert. Nach dem Auftragen der Probe wird die Protein A-Säule mit Tris-gepufferter Saline, pH 8,6, gewaschen, bis keine Proteine mehr von der Säule eluiert werden. Es erfolgen dann schrittweise Elutionen mit PBS (0,05 M Phosphat/0,15 M NaCl, pH 7,0), Citrat-gepufferter Saline (0,05 M Citrat/0,15 M NaCl, pH 5,5) und Acetatgepufferter Saline (0,05 M Acetat/0,15 M NaCl, pH 4,3), bis der Antikörper eluiert ist. Fraktionen, die zum Peak bei A 280 beitragen, werden vereint, in 0,01 × PBS dialysiert, lyophilisiert, in 500 μl PBS erneut gelöst und bei –70°C gelagert. Die Reinheit des Protein-Peaks wird mittels SDS-PAGE analysiert. Die Säule wird durch Waschen mit Glycin-gepufferter Saline (0,05 M Glycin/HCl/0,15 M NaCl, pH 2,3), gefolgt von Tris-gepufferter Saline (pH 8,6, mit 0,02% NaN₃), regeneriert.
Ein ELISA-Test wird unter Verwendung von immobilisiertem p30-Antigen, das wie oben hergestellt wird, und eines markierten murinen, monoklonalen Anti-Kamelartigen-Antikörpers durchgeführt. Die Spezifität des Antikörpers, der aus der Mittelmeerfruchtfliegenlarve für PERV p30 eluiert wurde, ist damit bestätigt.
Beispiel 4: Produktion von humaner α-Glucosidase in Mittelmeerfruchtfliegenlarven
Ein durch Hitzeschock induzierbares Transposon-Expressionssystem wird gemäß Beispiel 1 konstruiert, wobei das humane α-Glucosidasegen (GenBank: Gl: 182907) anstelle des GFP-Gens verwendet wird.
Es wird ein Gemisch von Transposon-Plasmid-DNA und Helferplasmid-DNA, wie in Beispiel 1, in Drosophila- oder Mittelmeerfruchtfliegen-Präblastoderm-Embryos (0–1 Stunde nach der Eiablage), die für die Augenfarbenmutation white homozygot sind, co-injiziert. Um die transgenen Mittelmeerfruchtfliegen zu detektieren, werden die Fliegen, die aus den injizierten Embryos erhalten wurden (Generation G0) über Rückkreuzung mit dem Empfängerstamm weitergezüchtet, und die zugehörige Nachkommenschaft wird individuell im Larvenstadium auf die Expression des white-Gens getestet. Die Expression von white ist als Wechsel der Augenfarbe von weiß nach farbig (variierend von blassgelb bis zu wildtypischem rot) detektierbar.
Einzelne transgene Larven (Generation G1) werden durch Rückkreuzen mit dem Empfängerstamm weitergezüchtet, und einzelne white-Nachkommen (G2) werden untereinander vermehrt, um homozygote Nachkommenschaft (G3) zu erhalten. Die Intensität der Augenfarbe ist von der Gendosis abhängig. Durch Untersuchen dieser Phänotypen werden somit unter der G3-Nachkommenschaft homozygote Individuen detektiert. Putative homozygote G3-Individuen werden untereinander weiter gezüchtet, und deren Nachkommenschaft wird mittels Southern-Blot analysiert, um zu bestimmen, ob sie einfache oder mehrfache Insertionen enthalten. Stämme, die für Einzelinsertionen homozygot sind, werden mittels dieser Prozedur etabliert.
Hitze-induzierbare Expression von α-Glucosidase in Larven von Drosophila und Mittelmeerfruchtfliege
Transgene Drosophila- und Mittelmeerfruchtfliegen-Larven, die für die Insertionen des Transposons MiHsp-α-Glucosidase/HspCcW homozygot waren und bei der Standardtemperatur von 22–24°C gezüchtet werden, zeigen in den Fettpolstern niedrige, jedoch detektierbare Niveaus an α-Glucosidase im Vergleich zu nicht-transgenen Larven, wie dies durch Immunquantifizierung gemäß Umapathysivam et al., Clin. Chem. 2000 46(9): 1318–25, gezeigt wurde. Nach dem Hitzeschock nimmt die Menge an α-Glucosidase merklich zu.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines interessierenden Proteins, bei dem man (a) die Keimbahn eines Insektes mit einem auf einem Transposon basierenden Expressionssystem, welches in der Lage ist, das interessierende Protein in den Larven des Insektes zu exprimieren, transformiert, (b) das Insekt für eine Produktion von Larven kultiviert, (c) die Larven massenweise züchtet und (d) das interessierende Protein aus den massengezüchteten Larven isoliert.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Transformieren des Insektes die Stufen umfaßt, bei denen man a) ein transponierbares Element bereitstellt, welches ein Transposase-Protein codiert, das in dem Insekt aktiv ist, b) das transponierbare Element durch Einsetzen einer codierenden Sequenz, welche das interessierende Protein codiert, modifiziert und c) die Zielinsekten mit dem modifizierten transponierbaren Element transformiert.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das transponierbare Element aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Minos, mariner, Hermes, sleeping beauty und piggyBac.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Expressionssystem eine codierende Sequenz, welche das interessierende Protein codiert, unter der Kontrolle eines induzierbaren Transkriptionskontrollelementes, welches in den Insektenlarven funktionsfähig ist, umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das induzierbare Kontrollsystem durch Tetracyclin oder Östrogene regulierbar ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Expressionssystem eine codierende Sequenz, welche das interessierende Protein codiert, unter der Kontrolle eines konstitutiven Transkriptionskontrollelementes, welches in den Insektenlarven funktionsfähig ist, umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das konstitutive Kontrollelement aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus dem zytoplasmatischen Actinpromotor, wie dem Drosophila Act5C-Promotor, und dem zytoplasmatischen Tubulinpromotor.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die induzierbare Expressionskontrollsequenz ein Hitzeschockpromotor ist, wie der Drosophila- oder der Mittelmeerfruchffliege-hsp70-Promotor.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Proteinprodukt in erster Linie in den Fettkörpern oder der Hämolymphe angesammelt wird.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Larvale Serumprotein-Promotor die Sekretion des Proteinproduktes in die Hämolymphe steuert und der Hsp70-Promotor für eine Expression in Fettkörpern verwendet wird.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Insekt mit zwei oder mehr Expressionssystemen oder einem Expressionssystem, welches zwei oder mehr codierende Sequenzen umfaßt, transformiert wird.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Aufrechterhaltung des Expressionssystems durch die Verwendung eines Balancer-Chromosoms gefördert wird.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das interessierende Protein aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einem Enzym, einem Zytokin, einem Hormon oder einem proteinartigen Arzneimittel.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Insekt aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Bactrocera oleae (Olivenfliege), Bactrocera orientalis (orientalische Fruchtfliege), Heliothis armigera (Baumwollkapselwurm), Trichoplusa ni (Kohlspannerraupe), Manduca sexta (Tabakschwärmer), Lobesia botrana (Traubenwickler), Anopheles gambiae (Malariamücke), Aedes aegypti (Gelbfiebermücke), Glossina morsitans (Tse-Tse-Fliege), Simulium sp. (Kriebelmücke), Phlebotomus sp. (Sandmücke), Musca domestica (Stubenfliege), Drosophila Melanogaster und Ceratitis capitata (Mittelmeerfruchtfliege).
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Insekt Ceratitis capitata ist.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Insekt Drosophila melanogaster ist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Larvenkulturen durch Manipulation der Kulturtemperaturen synchronisiert werden.