DE60037752T2 - Biologische kontrolle mittels konditionell-dominant-lethalem genetischen system - Google Patents

Biologische kontrolle mittels konditionell-dominant-lethalem genetischen system Download PDF

Info

Publication number
DE60037752T2
DE60037752T2 DE60037752T DE60037752T DE60037752T2 DE 60037752 T2 DE60037752 T2 DE 60037752T2 DE 60037752 T DE60037752 T DE 60037752T DE 60037752 T DE60037752 T DE 60037752T DE 60037752 T2 DE60037752 T2 DE 60037752T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
lethal
population
animal
gene
expression
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE60037752T
Other languages
English (en)
Other versions
DE60037752D1 (de
Inventor
Luke Oxford ALPHEY
Dean Oxford THOMAS
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Oxford University Innovation Ltd
Original Assignee
Oxford University Innovation Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Oxford University Innovation Ltd filed Critical Oxford University Innovation Ltd
Publication of DE60037752D1 publication Critical patent/DE60037752D1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE60037752T2 publication Critical patent/DE60037752T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/033—Rearing or breeding invertebrates; New breeds of invertebrates
    • A01K67/0333—Genetically modified invertebrates, e.g. transgenic, polyploid
    • A01K67/0337—Genetically modified Arthropods
    • A01K67/0339—Genetically modified insects, e.g. Drosophila melanogaster, medfly
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/033—Rearing or breeding invertebrates; New breeds of invertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/033—Rearing or breeding invertebrates; New breeds of invertebrates
    • A01K67/0333—Genetically modified invertebrates, e.g. transgenic, polyploid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8237—Externally regulated expression systems
    • C12N15/8238—Externally regulated expression systems chemically inducible, e.g. tetracycline
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8285—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for nematode resistance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/70—Invertebrates
    • A01K2227/706—Insects, e.g. Drosophila melanogaster, medfly
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Catching Or Destruction (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Electrotherapy Devices (AREA)
  • Measuring Pulse, Heart Rate, Blood Pressure Or Blood Flow (AREA)
  • Air Conditioning Control Device (AREA)

Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Verfahren zur biologischen Kontrolle für Insekten und Pflanzen sind bekannt. Ein derzeit zur Kontrolle von Insektenpopulationen eingesetztes Verfahren wird als die „sterile Insektentechnik" (SIT; Sterile Insect Technique) bezeichnet, die auch als das „sterile Insektenfreisetzungsverfahren" (SIRM; Sterile Insect Release Method) bekannt ist. In diesem Verfahren werden sterile Männchen in die Umwelt freigesetzt, worin sie mit den (fertilen) Wildtypmännchen um Paarungspartner konkurrieren. Weibchen, die mit sterilen Männchen paaren, produzieren keine Nachkommen und die Freisetzung großer Zahlen steriler Männchen führt deshalb zu einer Abnahme der Größe der nächsten Generation. Auf diese Weise wird die Größe der Wildpopulation kontrolliert.
  • SIT erfordert einen Mechanismus zur Sterilisation von Insekten. Außerdem setzt SIT häufig auch die Trennung von Männchen von den Weibchen ein, wobei nur ein Geschlecht freigesetzt wird. Dies ist im Fall eines landwirtschaftlichen Schädlings, wie zum Beispiel der Fruchtfliege, erwünscht, wo das Weibchen selbst dann die Furcht schädigt, wenn das Weibchen steril ist. Auf ähnliche Weise werden Menschen nur von weiblichen Stechmücken gebissen. Als solches wird die Freisetzung weiblicher Insekten in diesen Fallen bevorzugt vermieden.
  • Derzeitige Verfahren zum Erreichen von sowohl Sterilisation als auch Trennung der Geschlechter sind alle mit Nachteilen behaftet. In einigen Fällen ist es möglich, Männchen und Weibchen mittels Kriterien, wie zum Beispiel der Puppenmasse oder der Entpuppungszeit zu trennen, aber es ist unwahrscheinlich, dass diese Verfahren zuverlässig zu einer wirklich eingeschlechtigen Population führen. Die Trennung von Männchen und Weibchen beinhaltet häufig die Verwendung von Mutantenstämmen, die zur Induktion eines sichtbaren oder anderweitig selektierbaren Unterschieds zwischen den Geschlechtern mutagenisiert wurden, eine solche Mutagenese kann jedoch die Fitness des resultierenden Stamms in Bezug auf den Wildtyp reduzieren, was unerwünscht ist.
  • Die Fitness könnte im Sterilisationsverfahren gegebenenfalls weiter reduziert werden, wobei den Insekten eine zur Sterilisation führende Bestrahlungsdosis (Röntgen- oder Gammastrahlen) verabreicht wird oder wenn sie chemisch sterilisiert werden. Häufig sind die zur Induktion der Sterilisation erforderlichen Chemikaliendosen oder die Bestrahlungsdosis sehr ähnlich denen, die für den Organismus letal sind. Als solches werden sterile Organismen häufig in ihrer Paarungsfähigkeit beeinträchtigt. Sowohl chemische Verfahren als auch Bestrahlungsverfahren machen sich überdies Technologien zu Nutze, die für den Targetorganismus nicht spezifisch sind, was in der Folge mit einer potenziellen Gefahr für Mitarbeiter verbunden ist. Beide Verfahren führen zu einer Gefahr für die Umwelt, da die Bestrahlungsquelle oder die Chemikalien entsorgt werden müssen. Außerdem bringt die Verwendung einer Bestrahlungsquelle, wie zum Beispiel einer Strontiumquelle, inhärente Gefahren und einen zusätzlichen Arbeitsaufwand mit sich.
  • Fryxell und Miller (Journal of Economic Entomology, Vol 88, Nr. 5, Seiten 1221–1232) offenbaren eine alternative Strategie für die Insektenkontrolle unter Verwendung von Drosophila, die ein dominantes konditionelles letales Gen enthält, das unter angemessenen kalten Bedingungen im Freiland exprimiert wird. Dieses Verfahren kann jedoch aufgrund variierender Feldbedingungen, unter denen die Umwelt keine geeignet kalten Bedingungen bereitstellt, unwirksam sein. Organismen, die in einem Bereich von Temperaturhabitaten leben, könnten überdies gegebenenfalls nicht unter allen Bedingungen kontrolliert werden.
  • Asburner et al. (Insect Molecular Biology, 1998, 7(3), 201–213) offenbaren Verfahren zur Transformation von Insektenspezies mit Fremd-DNA zur Produktion von transgenen Spezies.
  • DeVault et al., (Biotechnology, Vol. 14, Januar 1996, Seite 46–49) offenbaren ein Zweistufenverfahren, das eine Modifikation des SIT-Verfahrens darstellt. Die Insekten werden durch Expression eines stabil insertierten weibchenspezifischen Promotors, der mit einem letalen Gen verknüpft ist, das zum Abtöten von Weibchen und zur Herbeiführung von nur einem Geschlecht exprimiert wird, initial getrennt. Die verbleibenden Männchen können dann durch Bestrahlung oder chemische Behandlung sterilisiert und in die Umwelt freigesetzt werden. Dieses Verfahren leidet jedoch an dem vorstehend erwähnten Nachteil insofern, dass die freigesetzten Fliegen aufgrund der Sterilisationsbehandlung eine reduzierte Fitness aufweisen. Als Alternative offenbart der DeVault-Artikel die Verwendung dieses genetischen Geschlechtsbestimmungsschritts in Kombination mit einem zweiten genetischen System, das zur Sterilisation oder Retardierung der Widerstandsfähigkeit der natürlichen Population dienen kann.
  • Bello et al., worauf in den Beispielen verwiesen wird, offenbaren die konditionelle Expression der Antp-Derepression, die zur Expression von Antp führt, die in Drosophila-Embryos eine letale Wirkung aufweist. Burchin et al. (Frontiers in Bioscience, Vol. 3, 1. März 1998, S. C1–17) besprechen auch ein auf Tetracyclin basierendes Regulationssystem für die Genexpression.
  • Es besteht im Stand der Technik noch ein Bedarf an einem Verfahren zur Populationskontrolle, das die Probleme mit den vorstehenden Verfahren vermeidet.
  • Mit der vorliegenden Erfindung wird beabsichtigt, derartigen Problemen zu begegnen.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • In einem ersten erfindungsgemäßen Aspekt wird ein Verfahren zur Populationskontrolle eines nicht humanen mehrzelligen Tieres in einer natürlichen Umgebung dafür bereitgestellt, umfassend:
    • i) Züchten eines Stammes des Tieres, wobei das Tier ein dominantes letales genetisches System trägt, wobei die letale Wirkung des letalen Systems konditionell ist und in der natürlichen Umgebung über die Expression eines letalen Gens auftritt, wobei sich die Expression des letalen Gens unter der Kontrolle eines reprimierbaren Transaktivatorproteins befindet, wobei die Züchtung unter permissiven Bedingungen in Anwesenheit einer Substanz stattfindet, wobei die Substanz in der natürlichen Umgebung nicht vorhanden ist und zur Repression des Transaktivators fähig ist;
    • ii) Verteilen der Stammtiere in der Umgebung an einem Locus zur Populationskontrolle; und
    • iii) Erreichen der Populationskontrolle durch embryonale Letalität anhand der Expression des letalen Systems in Embryos von Nachkommen, die sich aus der Kreuzung der Stammindividuen mit Individuen des anderen Geschlechts der Wildpopulation ergeben.
  • In einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt ist auch ein Verfahren zur Populationskontrolle eines wirbellosen mehrzelligen Tieres in einer natürlichen Umgebung dafür bereitgestellt, umfassend:
    • i) Züchten eines Stammes des Tieres, wobei das Tier ein dominantes letales genetisches System trägt, wobei die letale Wirkung des letalen Systems konditionell ist und in der natürlichen Umgebung über die Expression eines letalen Gens auftritt, wobei sich die Expression des letalen Gens unter der Kontrolle eines reprimierbaren Transaktivatorproteins befindet, wobei die Züchtung unter permissiven Bedingungen in Anwesenheit einer Substanz stattfindet, wobei die Substanz in der natürlichen Umgebung nicht vorhanden ist und zur Repression des Transaktivators fähig ist;
    • ii) Verteilen der Stammtiere in der Umgebung an einem Locus zur Populationskontrolle; und
    • iii) Erreichen der Populationskontrolle durch Expression des letalen Systems in Nachkommen, die sich aus der Kreuzung der Stammindividuen mit Individuen des anderen Geschlechts der Wildpopulation ergeben.
  • Das Tier ist in einem Laboratorium unter kontrollierten Bedingungen lebensfähig. Kontrollierte Bedingungen stellen Bedingungen dar, die in der natürlichen Umgebung des Organismus nicht vorkommen. Als solches sind die Bedingungen in der Regel artifiziell. Die Entfernung der kontrollierten Bedingungen lässt die Expression des letalen genetischen Systems zu. Der Organismus kann autozid sein, indem er nach der Freisetzung in die Umwelt abgetötet wird. Der Organismus kann geeigneterweise ein letales Element an mindestens einen Teil seiner Nachkommen dergestalt übertragen, dass mindestens ein Teil dieser Nachkommen auch abgetötet werden.
  • WO 94/03619A betrifft ein Verfahren, das Kulturpflanzen dergestalt enthält, dass transgene Nukleinsäuren nicht unter den Wildtyppflanzen disseminiert werden. WO 97/30162A offenbart, in Beispiel 3, die chemisch induzierte Expression von anti-LacIq-RNA, welche die Inhibition der Expression des modifizierten 35S-RNA-CaMV-B*-Gens blockiert. Die Akkumulation dieses Genprodukts in Blütenorganen inhibiert die letale Genfunktion. WO 96/04393 offenbart klassische Terminatortechnologien in Pflanzen. Diese Offenbarungen betreffen Pflanzen, und ein erfindungsgemäßes Transaktivatorprotein wird nicht erwähnt.
  • Der Organismus kann in der Populationskontrolle zur Weitergabe des letalen genetischen Systems durch Paarung und auch zum Blockieren der potenziell produktiven Paarung von Wildtyporganismen eingesetzt werden. Die Verteilung des erfindungsgemäßen Organismus in der Umwelt initiiert folglich ein biologisches Kontrollsystem. Der erfindungsgemäße Organismus braucht nicht sterilisiert zu werden, wobei folglich sterilisationsbezogenene Probleme aufgrund von Bestrahlung und Verlust der genetischen Fitness vermieden werden.
  • Bevorzugt wird kein spezifischer Sterilisationsschritt für freigesetzte Organismen eingesetzt.
  • Außerdem ist nun ein neues Verfahren zur biologischen Kontrolle entdeckt worden, das auf Organismen zutrifft, die zur geschlechtlichen Reproduktion fähig sind, worin nur ein letales genetisches System erforderlich ist, dessen Expression sowohl zur geschlechtlichen Trennung als auch biologischen Kontrolle verwendet wird. In diesem Fall wird das letale genetische System so hergestellt, dass es geschlechtsspezifisch ist. Das letale genetische System stellt bevorzugt ein konditionelles dominantes geschlechtsspezifisches letales genetisches System dar, das unter den restriktiven Bedingungen der natürlichen Umgebung eines Organismus exprimiert wird. Die Expression des letalen genetischen Systems kann jedoch unter permissiven Bedingungen in einem Laboratorium, einer Betriebsanlage oder einem anderen regulierten System kontrolliert werden, um zum Beispiel das Wachstum einer normalen Population, z. B. eines Insektenstamms mit beiden Geschlechtern zu erlauben. Vor der Freisetzung des Betriebsanlagen- oder Laboratoriumsstamms in die Umwelt können die Bedingungen manipuliert werden, um sicherzustellen, dass nur eingeschlechtige Populationen des Organismus in der Umwelt verteilt werden. Es ist keine zusätzliche Bestrahlung des Organismus erforderlich, und das Arrangement beseitigt jedwede Notwendigkeit zur Verwendung von zwei getrennten genetischen Systemen (d. h. von denen, die von DeVault et al. zur Geschlechtsbestimmung und zum Beispiel zur Sterilisation eingesetzt werden). Es braucht nur ein genetisches System konstruiert und in den Organismus insertiert zu werden, wodurch die Methodologie einfacher und schneller gemacht wird.
  • Folglich trägt der mehrzellige Organismus in einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform, ein dominantes geschlechtsspezifisches letales genetisches System, das konditionell ist und kein dominantes geschlechtsspezifisches genetisches System aufweist, das unkonditionell ist und in jedem Individuum exprimiert wird.
  • Unter permissiven Bedingungen wird das letale genetische System spezifisch nicht in den erfindungsgemäßen Organismen exprimiert und ein Stamm von Organismen kann gezüchtet werden. Die Auferlegung restriktiver Bedingungen erlaubt dann, dass ein Geschlecht (zum Beispiel Weibchen) abgetötet wird. Das verbleibende Geschlecht (Männchen) kann in die Umwelt freigesetzt werden, und das genetische System wird mindestens an einen Teil der Nachkommen, die sich aus jedweder geschlechtlichen Reproduktion zwischen den Männchen und einem Wildtyporganismus der gleichen Spezies ergeben, übertragen werden. Das konditionelle dominante letale genetische System wird dergestalt ausgewählt, dass die Expression des letalen Systems in der natürlichen Umgebung auftritt. Aufgrund dessen werden dann für ein weibchenspezifisches letales genetisches System alle Weibchen, die aus der Paarung resultieren, abgetötet oder aufgrund der Funktion des genetischen Systems nicht lebensfähig gemacht, während die Männchen überleben, um das System in einem Teil der Fälle an die nächste Generation weiterzugeben. Auf diese Weise wird eine biologische Kontrolle erreicht.
  • Gegebenenfalls kann der unter permissiven Bedingungen gezüchtete Stamm von Organismen in die Umwelt freigesetzt werden, ohne die restriktiven Bedingungen zum Abtöten eines Geschlechts vor der Freisetzung aufzuerlegen. Diese Variation erlaubt die Möglichkeiten der Verwendung eines zeitlich regulierten Mechanismus, z. B. des Lebenszyklusstadiums, zur Herbeiführung eines biologischen Kontrollmittels. Das heißt, die Auferlegung der restriktiven Bedingung ist durch ein Ereignis mit Ausnahme von zum Beispiel einer prädeterminierten Änderung der Betriebsanlagen-/Laboratoriumsbedingungen vor der Freisetzung in die Umwelt programmiert. Die Freisetzung einer normalen Larvenpopulation schafft zum Beispiel ein nützliches Mittel zur Zeitstreuung oder der verzögerten Freisetzung. Darunter versteht man, dass individuelle Larven bis zur Maturität bei verschiedenen Raten fortschreiten können, und deshalb könnte die Freisetzung der eingeschlechtigen genetisch manipulierten Population über eine Zeitdauer hinweg auftreten und folglich eine maximale Wahrscheinlichkeit der Interaktion mit sexuell aktiven Wildpopulationen über diesen Zeitraum hinweg schaffen. Dieser Aspekt kann im Vergleich zur Freisetzung einer eingeschlechtigen Population der genetisch manipulierten Adulten an einem einzelnen Zeitpunkt Vorteile aufweisen. Es gibt noch andere Vorteile, insbesondere die, dass die letzte (größte) Generation nicht in der Betriebsanlage, in einem Laboratorium oder einer anderen regulierten Umgebung gezüchtet werden muss, wobei Raum und Futter eingespart und somit ein wirtschaftlicheres Verfahren geboten wird. Die freigesetzten Larven konkurrieren überdies mit den Larven der Wildpopulation, wobei die Mortalität durch dichteabhängige Mechanismen gesteigert wird. Zur Erläuterung sei gesagt, dass diese Variation mit Stechmücken, bei denen die Larven für Menschen harmlos sind, aber nicht mit der Fruchtfliege oder dem Apfelwickler, deren/dessen Larven die Frucht fressen, gegebenenfalls nützlich sein könnten.
  • Deshalb ist in einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt ein Verfahren zur biologischen Kontrolle für einen Organismus bereitgestellt, wobei der Organismus diskrete geschlechtliche Entitäten aufweist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
    • 1 Produktion eines Stamms aus einem genetisch manipulierten Organismus;
    • 2 Freisetzung des genetisch manipulierten Organismus in die Umwelt entweder als a) eine normale Population (d. h. sie enthält beide Geschlechter) in einem bestimmten Stadium des Lebenszyklus des Organismus, zum Beispiel Larven, in der Kenntnis, dass die Weibchen sterben und nur die Männchen zu Adulten maturieren, oder b) eine eingeschlechtige Population, d. h. nachdem die geschlechtsspezifische dominante letale Wirkung vor der Freisetzung exprimiert wurde.
  • Die Erfindung verlasst sich auf die Expression eines konditionellen dominanten letalen genetischen Systems, das zur geschlechtsspezifischen Letalität fähig ist, um eine geschlechtliche Entität zu eliminieren. Die konditionelle Expression des letalen Genes erfolgt dergestalt, dass die letale Wirkung in der natürlichen Umgebung des Organismus zur Herbeiführung der biologischen Kontrolle auftritt.
  • Ein noch weiterer erfindungsgemäßer Aspekt beinhaltet einen dritten Schritt;
    • 3 wobei das Auftreten der biologischen Kontrolle erlaubt wird.
  • Es wird weiter ein erfindungsgemäßes Verfahren zur biologischen Kontrolle bereitgestellt, umfassend:
    Züchten eines Stammes von männlichen und weiblichen Organismen unter permissiven Bedingungen, die das Überleben von Männchen und Weibchen ermöglichen, um ein zweigeschlechtiges biologisches Kontrollmittel bereitzustellen;
    optional vor dem nächsten Schritt das Auferlegen oder das Zulassen restriktiver Bedingungen zur Veranlassung des Todes von Individuen eines Geschlechts und dadurch Bereitstellung eines eingeschlechtigen biologischen Kontrollmittels, umfassend Individuen des anderen Geschlechts, die das konditionelle dominante letale genetische System tragen;
    Freisetzen des zwei- oder eingeschlechtigen biologischen Kontrollmittels in die Umwelt an einem Locus zur biologischen Kontrolle, und Erreichen der biologischen Kontrolle durch Expression des genetischen Systems in den Nachkommen, was zur Züchtung durch Kreuzung der Individuen des biologischen Kontrollmittels mit Individuen des anderen Geschlechts der Wildpopulation führt.
  • Gegenstand der Erfindung sind auch Organismen, umfassend ein konditionelles dominantes letales genetisches System zur Verwendung in einem kombinierten Verfahren zur Geschlechtstrennung und biologischen Kontrolle, wie hierin definiert ist.
  • Gegenstand der Erfindung ist weiter ein mehrphasiges letales System mit einer Letalität in mehr als einem Lebenszyklusstadium. Gegenstand der Erfindung ist spezifisch die Bereitstellung eines Organismus oder einer eingeschlechtigen Population zur Verwendung in einer biologischen Kontrolle, worin der Organismus oder die eingeschlechtige Population keine lebensfähige Nachkommenschaft produziert, wenn sie mit dem Wildtyp des anderen Geschlechts unter restriktiven Bedingungen, z. B. in der natürlichen Umgebung, gepaart wird. Gegenstand der Erfindung ist zum Beispiel die Bereitstellung einer männlichen Population, die keine lebensfähige männliche oder weibliche Nachkommenschaft produziert. Dies steht im Gegensatz zur Situation, in der eine nur aus Männchen bestehende Population keine weibliche Nachkommenschaft, aber eine lebensfähige männliche Nachkommenschaft produziert.
  • Gegenstand der Erfindung ist weiter die Bereitstellung eines Verfahrens für die Geschlechtstrennung von Organismen, worin die Expression eines geschlechtsspezifischen dominanten konditionellen letalen Systems zur Abtötung eines Geschlechts verwendet wird, um entweder eine im Wesentlichen reine männliche oder weibliche Population oder eine Population, in der Organismen entweder männliche oder weibliche Gewebe umfassen, oder eine Population, in der Organismen nicht dazu fähig sind, funktionelle männliche Gameten oder weibliche Gameten (oder beide) zu produzieren, zu deren Produktion sie ohne die Expression des letalen genetischen Systems fähig gewesen waren, zurückzulassen.
  • Gegenstand der Erfindung ist weiter die Bereitstellung eines Verfahrens zur biologischen Kontrolle, worin das Wachstum eines Stamms von Organismen unter permissiven Bedingungen, sobald es initiiert ist, selbsterhaltend ist und keinen zusätzlichen Pool von Organismen für seine Aufrechterhaltung benötigt.
  • Gegenstand der Erfindung ist weiter die Bereitstellung eines Verfahrens zur biologischen Kontrolle, worin die Expression des letalen genetischen Systems in Abwesenheit einer Substanz auftritt, die in der natürlichen Umgebung des Organismus abwesend ist, wobei folglich bei Freisetzung des Organismus die wirksame biologische Kontrolle gewährleistet ist.
  • Gegenstand der Erfindung ist weiter die Bereitstellung eines Vektors zur Verwendung bei der Transformation eines Organismus zur Produktion eines erfindungsgemäßen Organismus, der zur Verwendung in einem biologischen Kontrollschema geeignet ist.
  • ALLGEMEINE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die allgemeinen erfindungsgemäßen Merkmale werden zunächst zur Erleichterung des Verständnisses in großen Zügen dargelegt, bevor sie spezifisch detailliert werden. Die Erfindung wird hierin in Bezug auf beide Organismen zur Verwendung in einem Verfahren zur biologischen Kontrolle und in Verfahren zur biologischen Kontrolle besprochen. Es wird folglich im Allgemeinen auf einen Organismus verwiesen, um ein Verfahren zur biologischen Kontrolle einzuschließen, das diesen Organismus einsetzt und umgekehrt.
  • Der erfindungsgemäße nicht humane Organismus stellt einen geeigneten rekombinanten Organismus dar, in den das dominante letale genetische System transformiert wurde. Der Organismus ist auch zumindest zur geschlechtlichen Reproduktion oder eines Versuchs der geschlechtlichen Reproduktion dergestalt fähig, dass das dominante letale genetische System an die natürlich vorkommende Population dieses Organismus weitergegeben werden oder der Organismus mit dem Wildtyporganismus bei der Paarung konkurrieren kann.
  • Das letale genetische System besteht geeigneterweise aus einem letalen Gen und Kontroll- und/oder Regulationselementen. In einer Ausführungsform kann das letale System jedoch einfach ein letales Gen umfassen, das zur Hervorrufung der letalen Wirkung ausreicht.
  • Das dominante genetische System schließt geeigneterweise ein dominantes Gen ein, dessen Wirkung im heterozygoten Zustand phänotypisch exprimiert wird. Diese dominante Wirkung gewährleistet, dass wenn ein Organismus nur eine Kopie des letalen genetischen Systems erhält, die letale Wirkung von diesem System dann im Wirt in der natürlichen Umgebung des Organismus trotzdem ausgeübt werden kann.
  • Das letale genetische System kann geschlechtsspezifisch oder nicht geschlechtsspezifisch sein, wobei Ersteres gewöhnlich bevorzugt ist. Im Fall eines geschlechtsspezifischen letalen Systems ist es möglich, vor der Freisetzung von Organismen zur biologischen Kontrolle eine genetische Geschlechtsauswahl vorzunehmen.
  • Wenn ein eingeschlechtiges biologisches Kontrollmittel erwünscht ist, wird die Trennung der geschlechtlichen Entitäten in der Regel im Verfahren durch Entfernung permissiver Bedingungen erreicht, während ein Stamm eines Organismus gezüchtet wird, was zur geschlechtsspezifischen letalen Wirkung des zu manifestierenden genetischen Systems führt. Danach kann eine zurückbleibende eingeschlechtige Population isoliert werden.
  • Es wird bevorzugt, dass die letale Wirkung weibchenspezifisch ist. In bestimmten Situationen kann jedoch eine männchenspezifische letale Wirkung erforderlich sein.
  • In Bezug auf Insekten und andere Tiere tritt die Verteilung des Organismus in der Regel durch Freisetzung des Organismus in die Umwelt auf.
  • Die konditionelle Wirkung des dominanten letalen genetischen Systems wird außer unter definierten permissiven Bedingungen gesehen. In der vorliegenden Erfindung treten die restriktiven Bedingungen in der natürlichen Umgebung des Organismus auf, und es handelt sich um diese Bedingungen. die die letale Wirkung des zu exprimierenden letalen Systems erlauben. Die permissiven Bedingungen, welche das Überleben des Organismus erlauben, sind nur anwesend, wenn sie permissive Bedingungen in der regulierten Wachstumsumgebung annehmen.
  • Die Expression des dominanten letalen genetischen Systems ist bevorzugt von der Anwesenheit einer Substanz oder Bedingung, die in der natürlichen Umgebung nicht gefunden wird, wie zum Beispiel einer artifiziellen oder synthetischen Verbindung, geeigneterweise eines Antibiotikums, eines antibiotischen Analogs oder Derivats, abhängig. Eine derartige artifizielle Substanz oder Bedingung ist geeigneterweise immer aus der natürlichen Umgebung abwesend, das heißt, sie ist niemals oder nur selten in der natürlichen Umgebung in ausreichender Fülle oder Konzentration zur Inaktivierung oder funktionellen Repression des letalen genetischen Systems anwesend. Die Abwesenheit der Substanz oder der Bedingung führt zur Expression der letalen Wirkung des letalen Systems.
  • Die natürliche Umgebung des Organismus stellt im Allgemeinen die Umgebung dar, in der sich die zu kontrollierende Population befindet oder in der er überleben kann. Die natürliche Umgebung stellt außerdem auch eine Umgebung dar, welche die notwendigen restriktiven Bedingungen bereitstellt. Die erfindungsgemäße universelle Natur lässt eine universelle Applikation des erfindungemäß verwendeten Verfahrens zu, und die natürliche Umgebung kann folglich jedwede Umgebung auf der Welt darstellen, in der die biologische Kontrolle ohne Restriktion benötigt wird.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Das erfindungsgemäße letale genetische System kann jedwedes genetische Element oder jedwede Kombination von Elementen darstellen, das zur Herbeiführung einer letalen Wirkung fähig ist. Es ist bevorzugt, dass das letale genetische System eine DNA-Sequenz, kodierend für ein potenziell letales Genprodukt (ein letales Gen) und Kontrollelemente, wie zum Beispiel Promotor-, Enhancer- oder Transaktivator-Komponenten, umfasst. Die das Gen regulierenden Elemente können sich bevorzugt auf dem gleichen Chromosom wie das letale Gen oder auf einem anderen Chromosom befinden. Insbesondere bevorzugt ist, dass das letale System ein letales Gen darstellt, dessen Expression sich unter der Kontrolle eines reprimierbaren Transaktivatorproteins befindet. In einer alternativen Ausführungsform kann das letale System einfach das letale Gen allein oder in Kombination mit seinem nativen Promotor darstellen.
  • Der erfindungsgemäße Organismus weist bevorzugt nur ein letales genetisches System auf, wobei das System von Umweltfaktoren abhängt. Das System weist bevorzugter nur ein konditionelles letales Gen auf. Die Verwendung eines einfachen genetischen Systems minimiert bei der erfindungemäßen Produktion oder Ausführung die Chance einer genetischen Komplikation. Der Organismus enthält in der Regel keine Transgene oder andere nicht natürliche Gen- oder DNA-Arrangements, mit Ausnahme des erfindungsgemäßen letalen genetischen Systems.
  • Die letale Wirkung des letalen Systems kann sich auf den gesamten Organismus auswirken oder kann auf spezifische Gewebe in einem Organismus targetiert werden.
  • Die letale Wirkung kann auch auf ein spezifisches Lebenszyklusstadium des Organismus targetiert werden. Wenn Lebenszyklusspezifität angestrebt wird, wird bevorzugt, dass es sich bei der erfindungsgemäßen Letalität um eine embryospezifische Letalität handelt. Die letale Phase endet geeigneterweise vor dem Entwicklungsstadium, in dem die Organismen freigesetzt werden, oder sie können die Fitness verlieren oder nach der Freisetzung sterben. Im Fall von Insekten stellt die embryonale Letalität sicher, dass keine die Kulturpflanzen oder Tiere schädigende Larven schlüpfen. Während dies im Fall von Krankheitsvektoren, wie zum Beispiel Stechmücken, von denen nur die adulten Stadien die Krankheit übertragen, weniger wichtig ist, ist dies im Fall vieler Kulturpflanzenschädlinge, bei denen die Larven wirtschaftlichen Schaden anrichten, wichtig. Die embryospezifische Letalität erlaubt, dass die letzte und größte massengezüchtete Generation, die auf Futter gezüchtet wird, dem der Repressor mangelt, die Kosten reduziert. Die embryospezifische Letalität kann auch mit der späteren geschlechtsspezifischen Letalität, z. B. der weibchenspezifischen Letalität, kombiniert werden. In diesem Fall wird nachgewiesen, dass dies die Konstruktion eines Stammes erlaubt, in dem sowohl die Geschlechtstrennung als auch „Sterilisation" automatische Folgen des Entzugs permissiver Bedingungen von der letzten Generation vor der Freisetzung darstellen.
  • Unter bestimmten Umständen ist auch die spät wirkende Letalität bevorzugt, die den Vorteil des Merkmals der dichteabhängigen negativen Selektion wahrnimmt, worin die Chancen des Überlebens eines Individuums, um zu reproduzieren, von der Gesamtzahl von Individuen in der Population, von denen es einen Teil darstellt, negativ abhängig ist. Den Mechanismus dafür stellt in der Regel der Wettbewerb zwischen Individuen um begrenzte Ressourcen, wie zum Beispiel Futter, dar. Erläuternd sei gesagt, dass sich dieser Wettbewerb im Fall von Stechmücken gegebenenfalls auf Larven, die um Futter konkurrieren, auswirken könnte. Wenn die letale Phase später als dieses Wettbewerbsstadium der Larven eintritt, dann werden die Individuen (z. B. weibliche Larven), die vom letalen System abgetötet werden, während ihres Larvenstadiums dennoch um Ressourcen konkurrieren und auf diese Weise die Zahlen ihrer Artgenossen indirekt reduzieren, selbst diejenigen, die das letale System überhaupt nicht tragen.
  • Deshalb ist ein letales System bevorzugt, das in einem Stadium des Lebenszyklus letal ist, welches das Auftreten der Konkurrenz zwischen den erfindungsgemäßen Organismen und den Wildtyporganismen erlaubt.
  • Die letale Expression ist dergestalt bevorzugt, dass die Individuen sterben, bevor sie den Schaden anrichten, den sie absichtsgemäß verhindern sollen. Als Beispiel sei der Fall von Stechmücken genannt, bei denen die Reduktion der Krankheitsübertragung erwünscht ist. Den frühesten Zeitpunkt, an dem eine weibliche Stechmücke die Krankheit übertragen kann, stellt die zweite Blutmahlzeit dar (nachdem der Parasit/das Virus in der ersten Blutmahlzeit aufgefangen wird und auf diese Weise infektiös wird). Deshalb kann die Stechmücke so spät wie kurz nach der ersten Blutmahlzeit abgetötet werden. Außerdem sind fressende Stechmücken auch unerwünscht, und das Abtöten wird bevorzugt kurz vor oder eben nach der ersten Blutmahlzeit bewirkt.
  • Das letale Gen des letalen genetischen Systems kann jedwedes genetische Element darstellen, das zur Herbeiführung des Todes fähig ist oder zur Fatalität des Wirtes führt. Der Begriff deckt insbesondere Genfragmente ab, die zur Ausübung einer letalen Wirkung fähig sind, und ist nicht auf Gene der vollen Länge beschränkt. Jedwedes Element, das zur Ausübung einer letalen Wirkung fähig ist, die konditionell kontrolliert werden kann, ist durch diesen Begriff abgedeckt.
  • Die Wahl des dominanten letalen Gens ist für die Erfindung nicht kritisch. Es liegt ein breiter Bereich geeigneter Genprodukte mit variierenden Toxizitäten vor. Dominante Mutantenformen von Zellsignalisierungs- und Zellzyklusgenen sind zum Beispiel zur erfindungsgemäßen Verwendung geeignet. Konstrukte, die zu einer Überexpression solcher Gene führen, können auch letal sein. Auf ähnliche Weise würden Konstrukte, die zu einer unangemessenen Expression von jedwedem essenziellen Gen führen, auch letal sein. Dies könnte durch Expression einer inhibitorischen Sequenz, zum Beispiel einer Antisense-RNA, Sense-RNA (die durch das Gen-Silencing wirkt), einer doppelsträngigen RNA (einer „inhibitorischen RNA" oder RNAI) oder eines anderen inhibitorischen RNA-Moleküls erreicht werden. Die Überexpression von Proteininhibitoren von essenziellen Funktionen könnte diese letale Funktion auch ausführen. Andere geeignete Targets zum Manipulieren von Konstrukten schließen Gene ein, die den Metabolismus oder die Regulation der Zelle bis zu einem fatalen Ausmaß disruptieren, wie zum Beispiel die Disruption oder Überexpression von extrazellulären signalisierenden Faktoren, wie zum Beispiel funktionellen Homologen von Wnt, Shh oder TGF-β. Bevorzugte letale Gene stellen die dar, die in den Beispielen hierin beschrieben sind, das hid-Gen [siehe Heinrich und Scott, P.N.A.S, 18. Juli 2000, Vol. 97, 15, 8229–8232], und das Nipp1Dm-Gen, ein Drosophila-Homolog von Säuger-NPP1 (siehe Beispiel 7). Andere Möglichkeiten für letale Gene schließen die Geschlechtsdeterminierungsgene ein, die zur Transformation des Geschlechts des Organismus wirken können. In diesem Fall würde die Transformation von Weibchen zu sterilen Männchen auch die angestrebte biologische Kontrolle ermöglichen, und das letale Gen ist für die Population als solches und nicht spezifisch für den Organismus letal. Wenn hoch toxische Genprodukte, wie zum Beispiel Diphtherietoxin und Ricin A, angewendet werden, wird bevorzugt, dass die Gene nur in Spiegeln exprimiert werden, die zum Abtöten des Organismus, aber mit einer minimalen Auswirkung auf die Umwelt, ausreichend sind.
  • Ein bevorzugtes letales Gen zur erfindungsgemäßen Verwendung weist eine Toxizitätsschwelle auf, die unter einer bestimmten Höhe harmlos ist, während sie darüber letal ist. Zur Reduktion der Resistenzmöglichkeit weist das letale Gen außerdem bevorzugt multiple essenzielle Targets auf. Nipp1 Dm erfüllt im Allgemeinen diese Kriterien. Es kodiert für ein hoch konserviertes Protein, das in allen Zellen in einer signifikanten Höhe vorliegt. Es ist deshalb unwahrscheinlich, dass eine mäßige Überexpression von irgendwelchen adversen Folgen begleitet ist. Es stellt einen potenten Inhibitor von drei essenziellen Genen in Drosophila dar, von denen jedes hoch pleiotrope Wirkungen aufweist. Aufgrund des hohen Konservierungsgrades dieses Proteins zwischen C. elegans, D. melanogaster und Säugern stellt Nipp1 Dm demgemäß ein bevorzugtes letales Gen zur erfindungsgemäßen Verwendung dar.
  • Die konditionelle Beschaffenheit des letalen Systems erlaubt, dass rekombinante Organismen unter Bedingungen gezüchtet werden, die für das Überleben des Organismus, zum Beispiel in einer Betriebsanlage oder einem Laboratorium, permissiv sind und dann in die natürliche Umgebung freigesetzt werden. Die letale Wirkung des letalen Systems wird dergestalt kontrolliert, dass die freigesetzten Organismen zum Brüten fähig sind, und die geschlechtliche Reproduktion erlaubt, dass das letale System an die Wildtyppopulation weitergegeben wird, wobei alle oder eine definierte Gruppe dieser Organismen abgetötet werden. Es wird bevorzugt, dass die letale Wirkung zur Abtötung von mehr als 90% der Targetklasse der Nachkommenschaft von Paarungen zwischen freigesetzten Organismen und der Wildpopulation führt. Bei der Targetklasse kann es sich zum Beispiel um Weibchen, d. h. 50% der Nachkommenschaft handeln. Die letale Wirkung führt bevorzugter zur Abtötung von mehr als 95% der Targetklasse, noch bevorzugter 99% und am bevorzugtesten 100% der Targetorganismen in der Umwelt.
  • Die konditionelle Beschaffenheit des letalen Systems kann von jedwedem geeigneten Faktor, wie zum Beispiel der Temperatur, dem tagesperiodischen Rhythmus (wobei die Helligkeitsdauer und/oder -intensität Faktoren darstellen) oder zum Beispiel Pheromenen, abhängig sein. In diesem Fall könnte der rekombinante Stamm bei der permissiven Temperatur gezüchtet und in eine Umgebung mit einer restriktiven Temperatur freigesetzt werden. Die letale Wirkung tritt in geeigneter Weise bei einer Temperatur auf, die mindestens 5°C, bevorzugter 10°C, noch bevorzugter 20°C innerhalb der Extremen des Temperaturbereichs liegt, von denen bekannt ist, dass sie in der Umgebung des Organismus weltweit dergestalt auftreten, dass in der Umwelt immer eine Expression der letalen Wirkung vorliegt.
  • Die letale Wirkung des letalen Systems ist gegenüber Temperaturvariationen oder -fluktuationen, die in der natürlichen Umgebung des Organismus auftreten, bevorzugt inhärent unempfindlich.
  • Wenn die Expression des letalen Systems nicht temperaturabhängig ist, sondern wenn sie überhaupt temperaturempfindlich ist, werden bevorzugt mehr als 90%, bevorzugter mindestens 95%, bevorzugt mindestens 98%, bevorzugt mindestens 99% der Organismen oder mehr in der natürlichen Umgebung abgetötet.
  • Die erfindungsgemäßen letalen genetischen Systeme sind im Allgemeinen nicht in einem signifikanten Ausmaß temperaturempfindlich, so dass zum Beispiel der Unterschied der letalen Wirkung bei 18°C und 29°C weniger als 5%, bevorzugt weniger als 1% beträgt. Die erfindungsgemäß bevorzugten letalen genetischen Systeme sind über einen breiten Temperaturbereich, wie er zum Beispiel natürlich in der Umgebung, in der der Organismus gefunden wird, vorkommnen kann, ausreichend funktionell. Beispiele typischer Temperaturbereiche liegen bei 0°C bis 50°C, gewöhnlicher bei 10°C bis 45°C, wie zum Beispiel 15°C, 20°C oder 25°C bis 30°C, 35°C oder 40°C. Bevorzugt wird die letale Wirkung bei mindestens 95% der Organismen über diesen ganzen Temperaturbereich hinweg aufgewiesen, in dem 95% der Organismen bei einer gegebenen Temperatur in dem Bereich, bevorzugter 98%, 99% oder noch mehr abgetötet werden. Die höchste Überlebensrate bei jedweder Temperatur beträgt allgemeiner bevorzugt weniger als 10%, angemessen 5%, 2%, 1% oder weniger.
  • Die letale Wirkung des letalen Systems wird bevorzugt in der natürlichen Umgebung exprimiert, wenn der Organismus in seiner natürlichen Umgebung oder in jedweder natürlich vorkommenden Umgebung, ungeachtet der natürlichen Bedingungen, die vorkommen oder in dieser Umgebung vorherrschen können, verteilt wird.
  • Es wird bevorzugt, dass die letale Wirkung des letalen Systems von einem Ernährungszusatzstoff, wie zum Beispiel einem Futter- oder Wasserzusatzstoff, der keine übliche Futterkomponente für die Targetspezies darstellt, abhängig ist. Dies ermöglicht, dass der rekombinante Stamm auf einem Futter oder Wasser mit dem Zusatzstoff gezüchtet wird, wodurch die letale Wirkung verhindert wird. Bei Freisetzung in das Freiland weist der Organismus keine Exposition gegenüber dem Zusatzstoff auf, und die letale Wirkung des letalen Systems wird in der Nachkommenschaft von einer Paarung mit dem erfindungsgemäßen rekombinanten Organismus exprimiert. Sie kann unter bestimmten Umständen auch im parentalen Organismus exprimiert werden, obwohl der freigesetzte Organismus zum Paaren lange genug überleben muss.
  • Bevorzugte Faktoren, von denen die Expression des letalen Systems abhängig gemacht werden kann, schließen Antibiotika, wie zum Beispiel Tetracyclin und nicht antibiotische Tetracyclin-Analoge und Derivate davon ein, die mit dem bevorzugten erfindungsgemäßen reprimierbaren Tetracyclinsystem funktionieren. Nicht antibiotische Verbindungen sind besonders bevorzugt, um die potenziellen Probleme mit der Akkumulation von Antibiotika in der Umwelt zu vermeiden. Geeignete Analoge schließen Epioxytetracyclin und Anhydrotetracyclin ein, obwohl andere geeignete Analoge gegebenenfalls auch eingesetzt werden könnten.
  • Wenn die letale Wirkung von einem Ernährungszusatzstoff abhängig ist, kann es möglich sein, dass die Nachkommenschaft überlebt, ohne den Ernährungszusatzstoff selbst aufzunehmen oder zu absorbieren. Die Nachkommenschaft könnte ausreichende Mengen des Zusatzstoffs ohne ihn zu fressen, aus ihren Eltern oder aus einem früheren Lebenszyklusstadium, zurückbehalten oder der Zusatzstoff kann zumindest langsam aus der Nachkommenschaft verloren gehen. Diese Wirkung könnte durch eine oder mehr Generation(en) passieren, bevor die letale Wirkung unter restriktiven Bedingungen voll exprimiert wird.
  • Es wird bevorzugt, dass der erfindungsgemäße rekombinante mehrzellige Organismus ein dominantes letales System enthält, dessen Wirkung konditionell supprimierbar ist. Auf diese Weise wird die letale Wirkung unter kontrollierten Bedingungen, aber nicht in der natürlichen Umgebung des Organismus supprimiert. Es können jedoch auch andere Wege zum Erhalt der konditionellen Expression (zum Beispiel die konditionelle Aktivierung) beschritten werden, von denen jedweder in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann.
  • Es wird insbesondere bevorzugt, dass das reprimierbare Expressionssystem ein reprimierbares Tetracyclinsystem darstellt, in dem Tetracyclin oder ein Analog oder Derivat davon zum Inhibieren der Expression des letalen Systems verwendet wird. Ein geeignetes System wird ausführlich in den Beispielen hierin in Insekten beschrieben. Es wurde auch gezeigt, dass dieses Tetracyclinsystem in Pflanzen funktioniert (siehe Zuo und Chua, 2000, Curr. Opin. Biotech. 11: 146 und die Verweise darin).
  • Das reprimierbare lac-Repressorsystem ist weniger bevorzugt, da der Induktor (IPTG) weniger diffusionsfähig und toxischer als Tetracyclin ist.
  • Dem gegenüber kann ein induzierbares System auf der konstitutiven Expression eines Toxins und der induzierbaren Expression eines Repressors des Toxins basieren.
  • Der Tapetum-spezifische A9-Promotor kann verwendet werden. Das Tapetum stellt ein Gewebe dar, das zur Produktion von funktionellen Pollen erforderlich ist. Das System ist dann in allen Geweben außer dem Tapetum „off" (abgeschaltet). Im Tapetum werden sowohl das Toxin als auch der Transkriptionsfaktor exprimiert. In Anwesenheit des Induktors (hier Dexamethason) wird auch das Antidot exprimiert. Folglich verhalten sich mit Dexamethason behandelte Pflanzen normal, während die nicht mit Dexamethason behandelten keine Pollen produzieren.
  • Barnase und Barstar (Hartley, RW, 1988, J. Mol. Biol. 202: 913, Hartley, RW, T.I.B.S. 14: 450–454, 1989) können geeigneterweise als Toxin bzw. als Antidot verwendet werden. Während jedoch Barnase und Barstar geeignete Beispiele eines Toxin-/Repressorpaars darstellen, ist die Erfindung auf diese Weise nicht eingeschränkt, und ein geeigneter Repressor könnte auf einer transkriptionalen (oder anderen) Ebene wirken, und das Toxin selbst braucht kein Protein zu sein.
  • Es handelt sich um die letale Wirkung des letalen Systems und nicht lediglich die Expression des letalen Gens, die konditionell ist. Deshalb schließt die Erfindung die Möglichkeit der konditionellen Kontrolle sowohl auf der Ebene der letalen Genexpression als auch durch die Kontrolle der Aktivität des letalen Genprodukts ein. Als solches schließt die Erfindung den Fall ein, in dem das letale Genprodukt produziert wird, dessen Wirkung aber auf eine gewisse Weise maskiert ist.
  • Es wird bevorzugt, dass sich das erfindungsgemäße Verfahren nur Tiere mit einem einzelnen konditionellen, dominanten, letalen genetischen System zu Nutze macht. Außerdem wird bevorzugt, dass dieses System das in dem Tier vorhandene einzige rekombinante Element darstellt. Es wird besonders bevorzugt, dass das Tier nur einen letalen Gentyp enthält, es ist aber vorstellbar, dass multiple letale Gene unter der gleichen Regulationskontrolle möglich sind, die das Konzept vom integrierten genetischen Konstrukt, aber eine effizientere Letalität des Systems bereitstellen. Dieses letale Einzelgen kann sich unter der Kontrolle von nur einem Promotor im genetischen System oder mehr als einem Promotor befinden.
  • Das erfindungsgemäße Tier ist bevorzugt rekombinant, was im Allgemeinen auf jedwedes Tier verweist, dessen genetisches Material anhand der genetischen Manipulation verändert wurde. Es wird bevorzugt, dass das Tier durch Insertion eines Gens, Genfragments oder genetischen Elements (wie zum Beispiel einen Promotor oder Enhancer) aus einer anderen Spezies zur Produktion eines transgenen Tiers modifiziert wird. Die transgene Komponente stellt im Allgemeinen das letale System dar, das eine konditionelle letale Wirkung produziert. Eine konditionelle letale Wirkung kann jedoch auch unter Verwendung genetischer Komponenten generiert wurden, die sich von der gleichen (Wirts)spezies herleiten. Ein sich aus einem anderen Gen in der gleichen Spezies herleitender Promotor, kann zum Beispiel, wenn er vor ein Gen platziert wird, das in der Regel nur in geringen Mengen exprimiert wird, zu einer letalen Wirkung führen könnte. Das rekombinante Tier stellt folglich entweder ein transgenes Tier oder eines dar, in dem das genetische Material des Wirts zur Produktion eines letalen Systems modifiziert wurde.
  • Der mehrzellige Organismus stellt ein Tier dar. Die Erfindung ist im Allgemeinen tatsächlich nur auf die Tiere beschränkt, die eine Geschlechtskomponente in ihrem Lebenszyklus aufweisen, die ermöglicht, dass das letale System aus einem Organismus an einen anderen transferiert wird. Die Erfindung ist zum Beispiel auch auf Fische, wie zum Beispiel das Meerneunauge, gegen das sterile männliche Freisetzungsverfahren eingesetzt wurden, anwendbar. Es wird besonders bevorzugt, dass das erfindungsgemäße Tier ein Insekt darstellt, wobei Insektenschädlinge besonders bevorzugt sind. Ein Insektenschädling kann entweder einen direkten oder indirekten Schädling darstellen. Zu direkten Schädlingen gehören die Insekten, die eine Schädigung in einem Stadium oder mehr Stadien ihres Lebenszyklus verursachen, indem sie zum Beispiel Kulturpflanzen fressen oder Tiere schädigen. Die amerikanische Schraubenwurmfliege, Cochliomyia hominivorax, stellt zum Beispiel einen direkten Schädling für Vieh dar. Indirekte Schädlinge stellen die Insekten dar, bei denen es sich um Vektoren humaner Krankheiten handelt, wie zum Beispiel Malaria tragende Stechmücken. Indirekte Schädlinge von Organismen mit Ausnahme von Menschen, wie zum Beispiel Nutzvieh oder Pflanzen, sind auch bekannt.
  • Bevorzugte erfindungsgemäße Insektentargets schließen Schädlinge von Kulturpflanzen (Landwirtschaft und Forstbewirtschaftung), Tierschädlinge und Krankheitsvektoren ein. Beispiele spezifischer Organismen, die erfindungsgemäß potenziell verwendet werden können, schließen die folgenden ein, sind aber nicht beschränkt auf: die Australische Schafsschmeißfliege (Lucilla cuprina), Asiatische Tigermücke (Aedes albopictus); den Japankäfer (Popilla japonica), White-fringed beetle [Rüsselkäfer] (Graphognatus spp.), die Mottenschildlaus (Aleurocanthus woglumi), Orientalische Fruchtfliege (Dacus dorsalis), Olivenfliege (Dacus oleae), tropische Fruchtfliege (Dacus cucurbitae, Dacus zonatus), Mittelmeerfruchtfliege (Ceratitis capitata), Natal Fruchtfliege (Ceratitis rosa), Kirschenfruchtfliege (Rhagoletis cerasi), Queensland Fruchtfliege (Bactrocera tryoni), Karibische Fruchtfliege (Anastrepha suspensa), Feuerameisen, importiert (Solenopis richteri, Solenopis invicta), den Schwammspinner (Lymantria dispar), Apfelwickler (Cydia pomonella), Goldafter (Euproctis chrysorrhoea), die Gelbfiebermücke (Aedes aegypti), Malariastechmücke (Anopheles gambiae, Anopheles stephansi), amerikanische Schraubenwurmfliege (Cochliomyia hominivorax), Schraubenfliege der Alten Welt (Chrysomya bezziana), Tsetsefliege (Glossina spp.), den Baumwollkapselkäfer (Anthonomous grandis), die Hagen's-Bluet [Schlankjungfer] (Enallagma hageni), Libelle [Familie: Segellibellen] (Libellula luctuosa) und den Reisstengelbohrer (Tryporyza incertulas). Übersichten, welche die Eignung von vielen der Vorstehenden besprechen, stellen folgende dar: C. Bocke et al., (1996) Annu. Rev. Entomol. 41: 211–219, J. Meyers et al., (1998) Annu. Rev. Entomol. 43: 471–491, C. Calkins et al., (1994) Fruit flies and the sterile insect technique. CRC Press. ISBN 0849348544, E. Krafsur et al., (1997) Annu. Rev. Entomol. 42: 503–523 und R. de Shazo et al., (1994) J. Allergy Clin. Immunol. 93(5): 847–850. Man sollte zur Kenntnis nehmen, dass die vorliegende Erfindung im Allgemeinen auf alle mehrzelligen Tiere zutrifft.
  • Die erfindungsgemäßen Prinzipien wie sie in Beziehung auf eine Spezies dargelegt sind, können von einem Fachmann ohne weiteres auf andere Spezies angewendet werden.
  • Die Erfindung ist bevorzugt dergestalt, dass die Expression des letalen genetischen Systems immer in der Umgebung auftritt, in der der Organismus zur biologischen Kontrolle freigesetzt wird, und durch die natürliche Variation der Umweltfaktoren nicht beeinflusst wird. Auf diese Weise ist die biologische Kontrolle unter der Verwendung der vorliegenden Erfindung, ungeachtet des Freisetzungsortes, der Zeit der Freisetzung oder jedweder anderen Umweltbedingungen, immer erreichbar. Wenn der Faktor, der die konditionelle Expression kontrolliert, artifiziell ist, dann geht sofort eindeutig hervor, dass ein solcher Faktor definitionsgemäß nicht in der natürlichen Umwelt auftreten kann. Die vorliegende Erfindung ist im Wesentlichen in dem Sinne pandemisch, das sie universell auf die Umwelt eines ganzen Landes oder die Umwelt weltweit angewendet werden kann.
  • Im Wesentlichen stellt jedwede natürliche Umgebung selbst die restriktiven Bedingungen für den Organismus bereit, was in der biologischen Kontrolle resultiert. Als solches treten die restriktiven Bedingungen nach der Freisetzung des Organismus garantiert auf, und es bestehen keine Bedenken, dass sich die lokalen Umweltbedingungen auf die Funktion des letalen Systems auswirken. Die natürliche Umgebung des Organismus stellt bevorzugt die Abwesenheit eines Kontrollfaktors oder einer Kontrollbedingung bereit, die dann zur Expression des letalen genetischen Systems in der Umwelt führt.
  • Das erfindungsgemäße Tier weist bevorzugt ein letales System auf, das an einem Locus oder mehr Loci homozygot ist. In der Situation, in der eine homozygote Kopie des letalen Systems vorliegt, wird dann mindestens eine Kopie des Systems während der geschlechtlichen Reproduktion an jedwede Nachkommen weitergegeben. Deshalb wird, außer unter permissiven Bedingungen, die dominante letale Wirkung ausgeübt. Die vorliegende Erfindung kann unter Verwendung einer Heterozygoten für das dominante letale System ausgeführt werden. In diesem Fall weist jedoch nicht die gesamte Nachkommenschaft eine Kopie des letalen Systems auf, und die Wirkung auf die Population ist reduziert.
  • Es ist bevorzugt, dass alle die Elemente des genetischen Systems auf dem gleichen Chromosom in enger Nachbarschaft zueinander anwesend sind. Auf diese Weise ist es möglich, dass alle Elemente des letalen Systems an die nachfolgenden Generationen übertragen werden. Das letale System kann jedoch auch funktionieren, wenn die Kontrollelemente an verschiedenen genetischen Loci für das letale Gen anwesend sind, wenn die Kontrollwirkungen dieser Elemente zum Beispiel in trans ausgeübt werden. In diesem Fall ist das genetische System noch wirksam, wenn die Kontrollelemente und letalen Elemente auch homozygot sind und mindestens eine Kopie von jedem an die Nachkommen transferiert wird.
  • In einem erfindungsgemäßen Aspekt wird auf ein nicht geschlechtsspezifisches System verwiesen, in dem sowohl Männchen als auch Weibchen durch das letale genetische System abgetötet werden. Ein derartiger Ansatz ist in bestimmten Organismen bevorzugt. In einem solchen Fall liegt ein erfindungsgemäßer Vorteil in der Vermeidung der Sterilisation durch Bestrahlung. Anhand des Beispiels sind Freisetzungen eines gemischten Geschlechts beim rosaroten Baumwollkapselwurm (einem Schmetterlingsschädling von Baumwolle) bevorzugt, es wird jedoch geschätzt, dass bestrahlte Motten als Folge der Bestrahlung aufgrund des Verlusts von Vitalität und einer reduzierten Lebensspanne eine um das mindestens 10fache Reduktion der Wirksamkeit erleiden. Ähnliche Vorteile werden in anderen Organismen vorausgesagt. In Fruchtfliegen sind bestrahlte Männchen um ca. 50% weniger wirksam als die nicht bestrahlte Äquivalente in kompetitiven Paarungstests, und sie leben 3–5 Tage anstelle der 10–15 Tage der nicht bestrahlten Fliegen. Dies ergibt eine zusammengesetzte 4- bis 10fache potenzielle Leistungsverbesserung durch Vermeiden der Bestrahlung.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren verwendet als Alternative ein geschlechtsspezifisches letales System zum Erreichen der Geschlechtstrennung vor oder nach der Freisetzung von Organismen in die Umwelt. In einer bevorzugten Ausführungsform stellt der mehrzellige Organismus ein Insekt dar, das ein homozygotes, dominantes letales System enthält, dessen letale Wirkung nur für Weibchen letal ist. In dieser Ausführungsform werden in die natürliche Umgebung freigesetzte Männchen nicht abgetötet. Nach der Paarung mit Weibchen enthalten die weiblichen Nachkommen mindestens eine Kopie des dominanten Systems und werden abgetötet. Die männlichen Nachkommen, von denen 50% das dominante System enthalten, sind jedoch lebensfähig und können mit weiteren Weibchen paaren. Auf diese Weise kann das dominante System auf die nachfolgenden Generationen übertragen werden, obwohl das System ohne weitere artifizielle Einführungen aus dem Genpool allmählich verloren geht.
  • In dem Fall, in dem ein Männchen ein letales genetisches System mit einer weibchenspezifischen letalen Wirkung enthält, wird das in die Umwelt freigesetzte Männchen nicht abgetötet. Die letale Wirkung des letalen Systems ist jedoch noch in der natürlichen Umgebung manifestiert – selbst wenn diese Wirkung auf Weibchen beschränkt ist.
  • Die geschlechtsspezifische Letalität kann auf eine Anzahl verschiedener Weisen erreicht werden. So ist es zum Beispiel möglich, ein geschlechtsspezifisches letales Gen als Teil des letalen Systems zu verwenden, dessen Genprodukt nur in einem Geschlecht toxisch ist. Dieser Ansatz erlaubt das Abtöten von nur einem Geschlecht, selbst wenn die Expression des letalen Gens des Genprodukts nicht geschlechtsspezifisch ist. Kandidaten für weibliche geschlechtsspezifische letale Gene schließen Gene aus dem Geschlechtsdeterminierungsweg, die zum Beispiel in der Regel nur in Männchen aktiv und in Weibchen toxisch sind oder Gene, die sich von Geschlechtsdifferenzierungs- oder Gametogenesesystemen herleiten, ein.
  • Als Alternative kann die Expression des letalen Gens oder des Genprodukts dergestalt kontrolliert werden, dass es nur in einem Geschlecht (oder nur in einem Gameten oder Geschlechtsorgan eines Hermaphroditen) exprimiert oder produziert wird. Geschlechtsspezifische Promotoren oder Enhancer können zum Beispiel entweder in Kombination mit geschlechtsspezifischen letalen Genen oder nicht spezifischen letalen Genen verwendet werden. Geschlechtsspezifisches Spleißen stellt eine andere Form der geschlechtsspezifischen Genexpression dar. Alle möglichen Kombinationen nicht spezifischer letaler Gene, geschlechtsspezifischer letaler Gene, nicht spezifischer Promotoren und geschlechtsspezifischer Promotoren werden erfindungsgemäß angestrebt. Außerdem sind andere geschlechtsspezifische Faktoren, welche die letale Wirkung des letalen Gens kontrollieren, erfindungsgemäß eingeschlossen.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur biologischen Kontrolle, in dem die letale Wirkung in einem Stadium des Lebenszyklus geschlechtsspezifisch, in einem anderen Stadium hingegen für beide Geschlechter letal sein kann. Zum Beispiel kann das letale System in einem adulten Organismus weibchenspezifisch, im Larvenstadium hingegen sowohl für Männchen als auch Weibchen letal sein. In einem derartigen Fall kann ein Geschlecht durch Expression des letalen Systems in der adulten Form abgetötet werden. Wenn der Organismus dann im Freiland brütet, wobei das genetische Konstrukt weitergegeben wird, dann können sowohl Männchen als auch Weibchen abgetötet werden. Eine derartige Wirkung kann durch einen Promotor, der in einem Stadium des Lebenszyklus geschlechtsspezifisch, in einem anderen aber nicht geschlechtsspezifisch ist, oder indem das letale Gen zum Beispiel unter die Kontrolle von zwei verschiedenen Promotoren gebracht wird, erreicht werden. Multiple letale Systeme könnten gegebenenfalls auch eingesetzt werden.
  • Die sich zum Beispiel in einem Embryo- oder Larvenstadium manifestierende letale Wirkung wirkt sich nicht auf adulte Organismen aus, wenn sie über dieses Stadium hinweg unter permissiven Bedingungen gezüchtet werden. Als solches können die Organismen nach dem letalen Stadium des Lebenszyklus in der Umwelt verteilt werden, wobei dem letalen System erlaubt wird, durch die geschlechtliche Reproduktion an die Wildtyppopulation weitergegeben zu werden. Andere Stadien des Lebenszyklus, wie zum Beispiel das adulte Stadium, kann durch Selektion von Genen oder Promotoren, die in spezifischen Stadien des Lebenszyklus exprimiert werden, gegebenenfalls auch targetiert werden.
  • Es wird bevorzugt, dass der erfindungsgemäße mehrzellige Organismus eine Kopie des letalen genetischen Systems an mehr als einem Locus darstellt. Das letale System ist bevorzugt an mehr als einem Locus homozygot.
  • Mehrfache Kopien des letalen Systems sind zur Verstärkung der erfindungsgemäßen Wirkung nützlich. Wenn der Organismus zum Beispiel an einem Locus für ein weibchenspezifisches letales System homozygot ist, werden jedwede Weibchen, die sich aus der Paarung des Organismus mit den Wildtypweibchen ergeben, abgetötet. Die männliche Nachkommenschaft überlebt und trägt eine Kopie des Systems. Nur 50% der nächsten (zweiten) Generation der männlichen Nachkommenschaft trägt das letale System.
  • Der Ansatz ist eindeutig wirksamer, wenn mehr als 50% dieser nächsten (zweiten) Generation der männlichen Nachkommenschaft das letale genetische System erben würden. Es gibt verschiedene Weisen, mit denen dies erreicht werden kann. Wenn das letale genetische System zum Beispiel an mehr als einem, nicht eng verknüpften Locus, z. B. auf mehr als einem Chromosom, homozygot ist, dann nimmt der Anteil dieser Männchen, die das letale genetische System tragen, zu. Spezifisch, wenn das letale genetische System an zwei nicht miteinander verknüpften Loci homozygot ist, ist die erste Generation der Männchen an beiden Loci heterozygot und 75% der Männchen in der zweiten Generation trägt mindestens eine Kopie des letalen genetischen Systems. Dementsprechend sterben unter restriktiven Bedingungen alle Weibchen der ersten Generation und 75% der zweiten Generation.
  • Eine andere Weise zum Erreichen dieser Wirkung besteht in der Verwendung eines Segregationsdistorsions-/meiotischen Antriebssystems. Im SD-System von Drosophila wird das SD-Chromosom bevorzugt von Männchen geerbt, die für SD heterozygot sind und ein normales (+) SD-empfindliches Chromosom aufweisen. SD/+–Männchen übertragen SD-tragende Homologe, zum virtuellen Ausschluss von +–tragenden Homologen; so viele wie 99% der funktionellen Spermien können SD tragen. Die Segregationsdistorsions-/meiotischen Antriebssysteme sind in einer breiten Reihe von Insekten- und nicht Nichtinsektenspezies bekannt.
  • Eine dritte Weise zur Gewährleistung einer > 50%igen Vererbung des letalen genetischen Systems in der zweiten Generation besteht in der Verknüpfung des letalen genetischen Systems mit der Insektizidresistenz und der Verwendung des Insektizids zur Eliminierung eines Teils oder der gesamten Nachkommenschaft der zweiten (und nachfolgenden) Generation, die das letale genetische System nicht tragen und folglich nicht das verknüpfte Resistenzgen tragen.
  • Das letale System kann sich auf jedwedem Chromosom, entweder einem Autosom oder einem Geschlechtschromosom befinden. In Spezies, in denen das Geschlecht durch den X- oder Y-Chromosomengehalt bestimmt wird und bei denen die Elimination des Transgens aus dem Genpool erwünscht ist, wird dann bevorzugt, dass sich das letale System auf dem X-Chromosom befindet. In Betracht gezogen werden sollte der Fall, in dem das letale System weibchenspezifisch ist. Ein männlicher Organismus (XY) mit dem letalen System auf dem X-Chromosom paart im Freiland mit einem weiblichen Wildtyporganismus (XX). Die männlichen Nachkommen müssen ihr Y-Chromosom von dem rekombinanten Männchen und ihr X-Chromosom von ihrer Mutter herleiten. Diese Männchen sind lebensfähig und weisen kein letales Gen auf. Die weiblichen Nachkommen müssen ein X-Chromosom von dem rekombinanten Männchen herleiten und enthalten folglich das letale genetische System – sie werden abgetötet. Als solches wird das letale System aus dem Genpool eliminiert, was bevorzugt sein könnte, wenn es sich bei diesem Element um ein Transgen handelt.
  • Die vorliegende Technologie stellt auch ein Verfahren zur Selektion von Männchen oder Weibchen als solches bereit, das die Produktion eines wie hierin beschriebenen Organismus umfasst, der ein konditionelles dominantes letales System enthält, worin die letale Wirkung des letalen Systems geschlechtsspezifisch ist. Die Geschlechtsselektion wird durch Zulassen der Expression der letalen Wirkung des letalen Systems zur Eliminierung eines Geschlechts erreicht. Die individuelle männliche oder weibliche Population kann dann für jedweden gewünschten Zweck verwendet werden, der nicht auf die biologische Kontrolle beschränkt ist.
  • Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten mehrzelligen Organismus zur erfindungsgemäßen Verwendung, worin der Organismus mit einem Vektor oder Vektoren transformiert wird, der/die ein dominantes letales System oder eine geeignete Sequenz für die ortsspezifische Mutation enthält/enthalten.
  • Gegenstand der Erfindung ist/sind weiter ein Vektor oder Vektoren, der/die ein dominantes letales System wie hierin beschrieben umfasst/umfassen.
  • Es ist bevorzugt, dass alle erforderlichen Elemente zur Kontrolle der Expression des dominanten letalen Gens auf einem einzelnen Transformationskonstrukt (Vektor) anwesend sind. Auf diese Weise sind nur ein einzelner Transformationsschritt und ein einzelner Transformationsmarker erforderlich. Außerdem hilft die Verwendung eines einzelnen Transformationskonstrukts bei der Verhinderung der Rekombination von getrennten Elementen des letalen genetischen Systems. Deshalb ist ein einzelner Vektor bevorzugt, der jedwedes erfindungsgemäße konditionelle dominante letale genetische System umfasst.
  • Ferner bevorzugt sind Vektoren, die das erfindungsgemäße konditionelle dominante letale genetische System umfassen, worin die Komponenten des Vektors (wie zum Beispiel die Gene oder die Regulationselemente, insbesondere das letale Gen) genetisch voneinander isoliert sind. Bevorzugt findet zwischen den verschiedenen Elementen des letalen genetischen Systems des Vektors kein „cis-Crosstalk" statt. Bevorzugt sind Vektoren, worin die Komponenten des letalen genetischen Systems durch sich von Vertebraten-DNA herleitenden Isolatorsequenzen, die ein solches Cross-talk verhindern, voneinander getrennt sind. Es wurde berichtet, dass solche Isolatoren zum Beispiel in Drosophila funktionieren [Namciu, S. J., et al., (1998) Mol. Cell. Biol. 18: 2382–91 und Chung, JH., et al., (1993) Cell 74: 505–514] und durch Verlängerung wahrscheinlich zumindest in anderen Insektenspezies wirksam sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der erfindungsgemäße Vektor ein reprimierbares Tetracyclinsystem. Ein letales Gen befindet sich bevorzugt auf der gleichen DNA-Sequenz oder dem Vektor wie dieses System, optional mit einem Reportergen. Ein geeignetes auf einem Tetracyclin basierendes letales System umfasst zwei Hauptkomponenten, ein letales Gen und ein tTA-Gen, das die Expression des letalen Gens aktiviert. Tetracyclin oder ein Analog davon blockiert dann die Aktivierung des letalen Gens durch das tTA. In diesem Fall wird bevorzugt, dass Enhancer-blockierende Isolatoren zum Isolieren einer Komponenten von der nächsten, nämlich des letalen Gens von tTa, des letalen Gens vom Reporter und des tTa vom Reportergen, verwendet werden.
  • Ein besonders bevorzugter Vektor, in dem die genetischen Elemente getrennt und modular sind, wird im Beispiel 7 hierin dargelegt. Dieser Vektor umfasst ein dominantes letales Tetracyclinreprimierbares genetisches System, worin mindestens einige der genetischen Komponenten des Systems durch genetische Isolatorsequenzen getrennt sind. Das letale Gen stellt das Nipp-Gen von Drosophila dar.
  • Dieser modulare Vektor kann durch Austauschen des BmA3-Promotors durch jedweden geeigneten Promotor angepasst werden, um zuzulassen, dass das Konstrukt in jedwedem Organismus von Interesse verwendet werden kann. Als solches wird erfindungsgemäß ein modularer Template-Vektor, wie hierin beschrieben, bereitgestellt, in dem das BmA3-Promotormodul zur Verwendung in jedwedem geeigneten Organismus durch jedweden Promotor ersetzt werden kann.
  • Gegenstand der Erfindung sind auch Varianten dieses spezifischen modularen Vektors, worin die funktionellen Elemente durch andere Elemente ausgetauscht werden, die äquivalente Funktionen durchführen, wie zum Beispiel andere Isolatoren oder letale Gene, und DNA, die für solche Varianten kodieren.
  • Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Konstruktion eines Vektors, der zur Verleihung eines dominanten letalen genetischen Systems an einen Organismus geeignet ist, umfassend die Schritte von:
    • i Bereitstellen von mindestens einem konditionellen letalen genetischen System;
    • ii Wählen eines zur Expression des Systems im Organismus geeigneten Promotors; und
    • iii Ligieren des Promotors und des konditionellen letalen genetischen Systems, optional mit anderen Komponenten, zur Produktion eines zur Transformation geeigneten funktionellen Vektors;
    worin die Transformation des Vektors in den Organismus einen Organismus zur erfindungsgemäßen biologischen Kontrolle produziert.
  • Das letale genetische System des Vektors ist bevorzugt modular, insofern, dass Komponenten vorliegen, die durch funktionell äquivalente genetische Komponenten, die für das letale System zur Funktion in einem Organismus von Interesse geeignet sind, individuell ausgetauscht werden können. Ein solcher modularer Vektor ermöglicht zum Beispiel, dass das letale Gen oder Promotorsequenzen zum Beispiel ohne die Notwendigkeit, einen vollkommen neuen Vektor zu generieren, ausgetauscht werden können. Die individuellen genetischen Komponenten können auf geeignete Weise durch Isolatorsequenzen getrennt werden und noch zusammen zur Herbeiführung der letalen Wirkung funktionieren. Der Vektor umfasst bevorzugt mindestens eine Isolatorsequenz, bevorzugt zwei solcher Sequenzen.
  • Gegenstand der Erfindung sind auch Vektoren, die durch das vorstehende Verfahren erhalten werden oder erhaltbar sind.
  • Gegenstand der Erfindung sind auch Polynukleotidsequenzen, die für ein erfindungsgemäßes konditionelles dominantes letales genetisches System kodieren, wobei es sich bevorzugt um eine DNA-Sequenz handelt. Gegenstand der Erfindung ist insbesondere DNA, die für das letale genetische System der Beispiele kodiert, insbesondere den modularen Transformationsvektor von Beispiel 7 hierin, und Mutanten und Varianten solcher DNA mit geringgradigen Veränderungen, wie zum Beispiel Substitutionen, Deletionen oder Additionen, aber worin die Funktion des Vektors oder des letalen genetischen Systems nicht im Wesentlichen beeinflusst wird und der Vektor fähig ist, gegebenenfalls die erfindungsgemäße letale Wirkung herbeizuführen.
  • Als Alternative können gegebenenfalls multiple Vektoren zur Transformation des Organismus mit den notwendigen Elementen des letalen Systems verwendet werden. Es ist auch möglich, dass die Kontrollelemente und zur Kontrolle verwendete Enhancer, zum Beispiel ein Transkriptionsfaktor, der auf das letale Gen einwirkt, auch mit der letalen Genexpression selbst interferieren können. Es kann deshalb notwendig sein, die Komponenten unter Verwendung von Silencer-Elementen oder anderen genetischen Isolationselementen zur Vermeidung unerwünschter Genexpressionsprobleme zu trennen.
  • Die Wirkung eines Promotors oder Enhancers auf ein Gen erfordert in der Regel, dass die Elemente auf der gleichen DNA-Strecke vorhanden sind. Die Wirkung eines Transkriptionsfaktors kann jedoch in trans ausgeübt werden und kann sich zum Beispiel auf einem anderen Chromosom befinden. Die Erfindung ist nicht auf die Integration der Kontrollelemente auf dem gleichen Chromosom beschränkt.
  • Die Konstruktion eines rekombinanten mehrzelligen Organismus kann die Verwendung eines Transformationssystems für die Targetspezies (die Spezies, die kontrolliert werden soll) erforderlich machen. Die spezifische Beschaffenheit des Transformationssystems stellt kein kritisches Merkmal der Erfindung dar, und Transformationsprotokolle für eine Anzahl von, zum Beispiel Insekten, sind bereits bekannt.
  • Vektoren können unter Verwendung von molekularbiologischen Standardverfahren in Bakterien, wie zum Beispiel E. coli konstruiert werden. Es ist bevorzugt, das der zur Transformation verwendete Vektor einen selektierbaren Marker, wie zum Beispiel Gene enthält, die eine G418-Resistenz oder Hygromycin-Resistenz produzieren. Alternative Gene, mit Ausnahme derjenigen, die mit den Antibiotikaresistenzmerkmalen in Beziehung stehen, wie zum Beispiel grün fluoreszierendes Protein (GFP), können auch verwendet werden. Dieses unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors exprimierte Protein kann einfach durch Beleuchtung mit einer geeigneten exzitatorischen Wellenlänge (z. B. Blau) sichtbar gemacht und die Fluoreszenz beobachtet werden. Ein derartiger Marker würde also auch die leichte Identifizierung von in „Release-und-Recapture"-Experimenten eingefangenen Insekten zulassen.
  • Andere zur Transformation geeignete Marker sind dem Fachmann gut bekannt.
  • Gegenstand der Erfindung sind auch Zellen, wie zum Beispiel Bakterienzellen, die mit einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert sind. Geeignete Zelllinien zur Aufrechterhaltung und/oder Propagierung von zum Beispiel solchen Vektoren sind dem Fachmann gut bekannt.
  • Es wird bevorzugt, dass die Deletion des gesamten oder eines Teils des erfindungsgemäßen letalen genetischen Systems aus einem Organismus keinen selektiven Vorteil gegenüber einem Organismus bietet, der das System unter permissiven Bedingungen enthält. Die Verwendung eines letalen genetischen Systems, wie hierin beschrieben, weist signifikante Vorteile in Bezug auf die Stabilität des Stammes auf. Im Allgemeinen kann die Cross-Mobilisation zwischen verwandten Transposons und/oder anderen unbekannten Mechanismen bedeuten, dass die Transposon-Insertionen nicht so stabil wie „wirkliche" Gene sein könnten. Wenn sie auf einer Höhe von Milliarden/Woche gezüchtet werden, wie für die biologische Kontrolle erforderlich sein könnte, werden selbst extrem seltene Ereignisse wiederholt vorkommen. Dies stellt eine bedeutende Problematik hinsichtlich der derzeitigen Geschlechtsbestimmung von Stämmen der Fruchtfliege dar, bei denen die Chromosomen-Translokationen, von denen sie abhängig sind, (bei einer niedrigen Frequenz) abgebaut werden. Die sich ergebenden Fliegen weisen leider eine signifikant höhere Fitness als der Rest des Stamms auf und folglich tendieren ihre Zahlen dazu, schnell zuzunehmen. Im vorliegenden System weist das Abbauprodukt (Deletion des gesamten oder eines Teils des Transposons) jedoch keinen großen Vorteil gegenüber dem beabsichtigten Stamm auf, wenn er auf einem Tc-enthaltenden Medium gezüchtet wird. Wenn darüber hinaus mehrfache Insertionen vorgenommen werden, würden mehrere unabhängige Ereignisse benötigt (d. h. der Verlust von jeder Insertion), um den Stamm vollkommen unwirksam zu machen.
  • Der letale genetische Komplex kann gegebenenfalls weiter stabilisiert werden. Geeignete Verfahren schließen die Deletion von einem Ende des Transposons nach der Integration oder sekundären Mobilisation des Systems aus dem Transposon in einen anderen Ort unter Verwendung eines ortsspezifischen Rekombinationssystems, wie zum Beispiel FRT/Flp oder cre/lox ein. Es ist bekannt, dass diese beiden Systeme in Drosophila funktionieren.
  • Die vorliegende Erfindung wird nun mit Bezugnahme auf die folgenden Beispiele erläutert, die nur für erläuternde Zwecke und nicht als einschränkend für die vorliegende Erfindung vorgesehen sind, worin:
  • 1 einen modularen Vektor für die Transformation des Organismus erläutert;
  • 2 ein Modell eines erfindungsgemäßen meiotischen Antriebssystems erläutert;
  • 3 ein Populationskontrollmodell unter Verwendung mehrfach unverknüpfter Loci erläutert;
  • 4 ein Modell eines erfindungsgemäßen meiotischen Antriebssystems erläutert;
  • 5 ein Populationskontrollmodell unter Verwendung mehrfach unverknüpfter Loci erläutert;
  • 6 ein weiteres erfindungsgemäßes Modell eines meiotischen Antriebssystems erläutert;
  • 7 ein Populationskontrollmodell unter Verwendung mehrfach unverknüpfter Loci erläutert; und
  • 8 Populationskontrollmodelle unter Verwendung der Parameter von 2, 6 und 7 erläutert, aber worin die ersten beiden Freisetzungen die doppelte Größe aufweisen.
  • BEISPIELE: BIOLOGISCHE KONTROLLE IN EINEM DROSOPHILA-MODELL EINLEITUNG
  • In einer spezifischen Ausführungsform kann ein zweiteiliges System zur Herstellung einer konditionellen letalen Wirkung verwendet werden. Dieses System basiert auf dem Repressor (tetR) des sich vom Transposon-1 herleitenden Tetracyclin-(Tc)-Resistenzoperons von E. coli. Die Verwendung dieses Repressors für die reprimierbare Genexpression in Eukaryoten wurde von Manfred Gossen und Hermann Bujard entwickelt (besprochen in Gossen, et al., TIBS 18, 471–475, 1993). In diesem System wird das tetR-Genprodukt an die saure Domäne von VP16 fusioniert, um einen hoch effizienten Tc-reprimierbaren Transaktivator (tTA) zu schaffen.
  • Der erste Teil des Systems stellt das tTA dar, das unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors exprimiert wird, und der zweite Teil stellt ein dominantes letales Gen dar, das unter der Kontrolle des tTA exprimiert wird. Insgesamt ergibt dies eine dominant-letale Expression auf eine Tc-reprimierbare Weise. Wenn Tetracyclin nicht zur Verfügung steht, aktiviert das tTA das letale Gen. Wenn Tetracyclin anwesend ist, bindet es an das tTA und verhindert die Aktivierung des letalen Gens durch tTA. Dieses letale System befindet sich unter der Kontrolle eines Promotors der Wahl. Ein weiterer Kontrollgrad kann durch die Wahl ausgeübt werden, welches Tc-Analog für die Repression verwendet werden soll: unterschiedliche Analoge weisen unterschiedliche Halbwertzeiten in dem Insekt auf, was zur Induktion des Killergens mehr oder weniger prompt nachdem der Repressor dem Futter entzogen wird, führt.
  • Es wird bevorzugt, dass ein nicht bakterizides Analog verwendet werden sollte, um auf diese Weise die Tetracyclin-Resistenz in den Mikroorganismen in der Umgebung nicht zu fördern. Die Verwendung eines nicht bakteriziden Analogs ist auf alle Fälle für Spezies, wie zum Beispiel die Tsetsefliege, wesentlich, die für die Reproduktion der Fliege wesentliche symbiotische Bakterien aufweisen, die durch Antibiotika abgetötet werden.
  • Selbst dieses eine System kann zur Bereitstellung eines flexiblen Werkzeugs zur Populationskontrolle variiert werden. Eine größere Flexibilität kann durch Kombination von zwei oder mehr Promotoren oder Enhancers erreicht werden. Die Kontrolle der Fruchtfliege könnte zum Beispiel die Expression im adulten Weibchen (zur Verhinderung der Freisetzung von Eier legenden Weibchen) und in der frühen embryonalen Entwicklung (zur Verhinderung des Larvenwachstums in der Frucht) verwendet werden. Da dies eine Expression bedeutet, bevor der Embryo beginnt, selbst zu fressen, wäre es zum Züchten des Stamms wichtig, dass ein relativ stabiles Tc-Analog verwendet wird, damit die Embryos aufgrund des maternalen Beitrags von Tc überleben. Die larvale Expression könnte auch als eine Alternative, aber mit einem größeren Schaden für die Frucht verwendet werden.
  • Die Verwendung des vorstehenden Systems zur Kontrolle der letalen Wirkung des letalen Gens stellt nur ein Beispiel dar, wie eine Wirkung erreicht werden könnte, und es gibt zum Beispiel zahlreiche Promotoren, Transaktivatoren und letale Gene, die zum Erreichen der gewünschten Wirkung verwendet werden könnten.
  • In der Expression des vorstehenden Szenarios könnte mehr als eine Stufe erforderlich sein. Dies könnte unter Verwendung von zwei getrennten tTA-Konstrukten oder durch Kombination des stufenspezifischen Enhancers zu einem einzelnen Konstrukt erreicht werden. Geeignete Promotoren für die stufenspezifische Expression können durch subtraktive Hybridisierung oder andere bekannte Verfahren erreicht werden.
  • Die Insertion des letalen Gens oder Systems in das Chromosom des transgenen Organismus kann an jedwedem geeigneten Punkt geschehen. Die Bestimmung der Stelle des letalen Gens auf dem Chromosom ist nicht notwendig. Obwohl insertierte Elemente auf Kontrollelemente im angrenzenden Chromatin ansprechen können, stellt dies kein Problem für die tRE-Killerlinien dar, wo die eine unangemessene Expression gebenden Linien wahrscheinlich nicht überleben.
  • Die vorliegende Erfindung wurde anhand der Modellinsektenspezies Drosophila melanogaster erläutert. Obwohl D. melanogaster keinen wirtschaftlich wichtigen Schädling darstellt, ist sie experimentell leicht handhabbar. Das tTA-System wurde im Allgemeinen in Drosophila nachgewiesen (Bello, B., et al., 1998, Development 125: 2193–2202). Die nachstehend verwendeten Hsp26-tTA und tRE-lacZ und einige Vektoren [nachstehend beschrieben], wurden dieser Arbeit entnommen.
  • KOMPONENTEN:
  • Transaktivatorkomponente (Promotor-tTA)
    • Hsp26-tTA: Hitzeschockprotein 26-tTA. Niedriges Basalniveau, Hitzeschock-induzierbar auf ein höheres Niveau, nicht geschlechtsspezifisch.
  • Erhalten von Bruno Bello (NIMR, London). Wie ausgeführt in Bello et al. (1998) Development 125, 2193–2202. Die Hsp26-Promoterregion mit einem Anteil der translatierten Region (Sequenzen von –1917 bis +490) wurde mit einer tTa-Kodierungsregion fusioniert, isoliert als ein EcoRI/BamHI-Fragment aus pUHD 15-1.neo, gefolgt von der Transkriptionsterminationssequenz des Hsp70-Gens.
    • Act5C-tTA: Actin 5C-tTA. Starker, konstitutiver, ubiquitärer Promotor, nicht geschlechtsspezifisch.
  • Die tTA-Kodierungsregion wurde als ein EcoRI/PvuII-Fragment ausgeschnitten, dann unter Verwendung von T4-DNA-Polymerase am Ende aufgefüllt. Das pCaSpeR (Actin5C-GFP) (Reichhart und Ferrandon, (1998), D. I. S. 81: 201–202) wurde mit XbaI/BamHI zum Entfernen des GFP-Fragments verdaut, danach unter Verwendung von T4-Polymerase am Ende aufgefüllt. Diese beiden Fragmente wurden dann ligiert. Die sich ergebenden Klone wurden unter Verwendung eines SmaI/EcoRV-Verdaus zur Auswahl eines Klons der richtigen Orientierung gescreent, wobei die tTa-Kodierungsregion unter die Kontrolle des Actin 5C-Promotors gebracht wurde.
    • Stwl-tTA: Stonewall-tTa. Weibchenspezifisch in Embryos, später aber Expression in beiden Geschlechtern.
  • Die tTa-Kodierungsregion wurde aus dem Plasmid pUHD 15-1.neo durch Verdau mit EcoRI und PvuII ausgeschnitten. Dieses Fragment wurde dann in den Vektor pstwl+mCa ligiert (Clark, K. A. und McKearin D. M. (1996), Development 122 (3): 937–950), mit EcoRI/PvuII dergestalt verdaut, dass tTa unter die transkriptionale Kontrolle von 1,7 kb der genomischen DNA des stwl-Promotors gebracht wurde.
    • Sxlpe-tTA: Geschlechtsletale-tTA. Früher Promotor (PE) von Sxl. Es wird angenommen, dass dieser nur in den frühen weiblichen Embryos exprimiert wird.
  • Die tTa-Kodierungsregion wurde aus dem Plasmid pUHD 15-1.neo (Gossen M. und Bujard H. (1992); PNAS, 89, 5547–51) durch Verdau mit EcoRI/PvuII ausgeschnitten. Dieses Fragment wurde in das 5-1 sxlpe: Bluescript (enthaltend Sxlpe-Sequenzen (Keyes LN, et al. (1992) Cell. 6; 68(5): 933–43) ligiert, mit EcoRI und EcoRV zum Herbeiführen von sxlpe tTa-Bluescript verdaut. Ein KpnI/NotI-Fragment, enthaltend die tTa-Kodierungsregion und den sxlpe-Promoter wurden in den P-Element-Transformationsvektor pP {W8} subkloniert (Klemenz et al., (1987) Nucleic Acids Res. 15: 3947–3959) und mit KpnI/NotI zur Herbeiführung von p(sxlpe-tTa) verdaut.
    • Yp3-tTA: Dotterprotein 3-tTA. Weiblicher Fettkörper-Enhancer (FBE) aus Dotterprotein 3 mit hsp70-Minimalpromotor. Exprimiert im weiblichen Fettkörper in Larven und Adulten.
  • Die tTa-Kodierungsregion wurde aus dem Plasmid pUHD 15-1.neo durch Verdau mit EcoRI und PvuII ausgeschnitten. Dieses Fragment wurde dann zwischen den EcoRI/PvuII-Orten des yp 3-Expressionskonstrukts pFBE (Bownes M., persönliche Mitteilung) dergestalt kloniert, dass es sich unter der transkriptionalen Kontrolle des weiblichen Fettkörper-Enhancers (FBE; Female Fat Body Enhancer) (Ronaldson E, et al. Genet Res. 1995 Aug; 66(1): 9–17.) und einem viralen Minimalpromoter befand.
  • tRE-RESPONSIVES GEN
  • tRe-lacZ: E. coli lacZ-Gen, kodierend β-Galactosidase. Als Reporter verwendet. Erhalten von Bruno Bello (NIMR, London). Wie ausgeführt in: Bello et al., (1998) Development 125, 2193–2202. Die heptamere Wiederholung des tet-Operators wurde als ein EcoRI/KpnI-Fragment aus pUHC 13-3 (Gossen M. und Bujard H. (1992); PNAS, 89, 5547–51) isoliert und stromaufwärts von der P-lacZ-Fusion des Enhancer-Testvektors CPLZ (Wharton KA and Crews ST. (1994) Development. 120(12): 3563–9) kloniert. CPLZ enthält den Promotor der P-Element-Transposase (bis zu –42 vom Verkappungsort) und die N-terminale Transposase-Sequenz, fusioniert Inframe mit lacZ und dem Polyadenylierungssignal von SV40.
  • WTP-2 (white-tetO-P-PROMOTOR-VEKTOR, ENTHALTEND tRe-SEQUENZEN)
  • Erhalten von Bruno Bello (NIMR, London). Wie ausgeführt in: Bello et al. (1998) Development 125, 2193–2202. Dieser P-Element-Vektor wurde zur Expression von jedwedem Gen unter der Kontrolle eines Tetracyclin-responsiven Promotors konstruiert. Er enthält das Vektor-Rückgrat von CPLZ, die heptamere Wiederholung des tet-Operators, den P-Element-Promotor und Leadersequenzen von Carnegie 4 (Rubin GM und Spradling AC (1983) Nucleic Acids Res. Sep. 24; 11(18): 6341–51) und das Polyadenylierungssignal von SV40.
  • WTP-3 (MODIFIZIERTER WTP-2)
  • Der WTP-2-Vektor wurde durch die Addition der beiden komplementären kurzen Oligos 5'-UAS ATG+ (AATTGCCACCATGGCTCATATGGAATTCAGATCTG) und 3'-UAS ATG-(GGCCGCAGATCTGAATTCCATATGAGCCATGGTGGGC) in den WTP-2 MCS modifiziert. Die Oligos durften annealen und ligierten an WTP-2, der mit EcoRI/NotI verdaut wurde. Diese Oligos führten einen Konsensus-Translationsstart und mehrere zusätzliche Klonierungsorte in den multiplen Klonierungsort (MCS; „multiple cloning site") von WTP-2 ein.
  • tRe-EGFP. Kodiert eine Mutantenversion des grün fluoreszierenden Proteins (GFP), ein Quallen-(Aequoria)-Gen, das für ein fluoreszierendes Protein kodiert. Die EGFP-Mutante weist zwei Aminosäure-Änderungen auf, die ein helleres, löslicheres Protein ergeben. Verwendet als Reporter. Die Kodierungsregion des enhanced grün fluoreszierenden Proteins (EGFP, ein F64L, S65T-Mutantenderivat von GFP) (Craven et al. (1998) Gene 9; 221(1): 59–68) wurde als ein NcoI/EcoRI-Fragment aus dem pP{UAS-EGFP}-Vektor isoliert, dann am Ende mit T4-Polymerase aufgefüllt. pP{UAS-EGFP}. pP{UAS-EGFP} wurde wie folgt konstruiert.
  • Der einzelne NdeI-Ort von pP{UAST} wurde durch Verdau, Auffüllen am Ende und Religation eliminiert, um NdeI in den multiplen Klonierungsorten verwenden zu können. Es wurden dann zwei Oligonukleotide (UAS-ATG+ = 5'-AATTGCCACCATGGCTCATATGGAATTCAGATCTGC und UAS-ATG– = 5'-GGCCGCAGATCTGAATTCCATATGAGCCATGGTGGC) verwendet, denen erlaubt wurde, zu annealen und an EcoRI-NotI verdautes pP{UAST} (aus dem der NdeI-Ort entfernt wurde) zu ligieren, um pP{UAS-LP} herzustellen. Es wurden Inserts aus pGEM-T-EGFP [Craven, 1998, vorstehend] unter Verwendung von Pfu-Polymerase und den Oligonukleotiden 5'-TAGGAGTAAAGGAGAAGAAC und 5'-AATTCCATATGTTTGTATAGTTCA amplifiziert. Jedes PCR-Produkt wurde Gel-gereinigt, dann mit T4-DNA-Polymerase in Anwesenheit von dGTP und dCTP, aber nicht dATP oder dTTP inkubiert. Dies führte ein NdeI-kompatibles kohäsives Ende an einem Ende des Fragments und ein EcoRI-kompatibles kohäsives Ende am anderen Ende herbei. Diese Fragmente wurden dann in NdeI-EcoRI verdautes pP{UAS-LP}pP{UAS-EGFP} subkloniert.
  • Der WTP-3-Vektor wurde dann mit EcoRI verdaut und am Ende mit T4-Polymerase aufgefüllt und die Fragmente zusammenligiert. Ein diagnostischer Verdau unter Verwendung von PvuII/BamHI wurde dann zum Auswählen eines Klons der richtigen Orientierung verwendet.
  • tRe-Ras64Bv12. Mutantenversion von Drosophila melanogaster Ras64B, beteiligt am Zellsignalisieren. Die Mutante ist konstitutiv aktiv, die sie für die Zelle toxisch macht, wenn sie in einer ausreichend hohen Menge exprimiert wird. Die Toxizität ist nicht geschlechtsspezifisch. Die Ras64BV12-cDNA wurde als ein EcoRI/NotI-Fragment aus dem p{sevRas64BV12} kloniert (Matsuo et al., (1997), Development 124(14): 2671–2680) und mit EcoRI/NotI zu WTP-2 verdaut.
  • tRe-Msl-1Mpu. Mutantenversion von Drosophila melanogaster Msl-1. Msl-1 stellt eine Komponente des Geschlechtsdeterminierungswegs dar, die gewöhnlich nur in Männchen exprimiert wird, die in Weibchen durch ein Produkt des „Sex-lethal"-Gens reprimiert wird. Die Aktivität der Mutanten ist unabhängig von „Sex-lethal", wodurch sie für Weibchen toxisch gemacht wird, wenn es in einer ausreichend hohen Menge exprimiert wird. Die Toxizität ist deshalb geschlechtsspezifisch. Die msl-1MPU-cDNA wurde als ein EcoRI-Fragment aus M1-ECTOPIC (Chang und Kuroda, (1998) Genetics 150(2): 699–709) in den mit EcoRI verdauten WTP-2-Vektor kloniert. Ein diagnostischer Verdau unter Verwendung von HindIII/NotI wurde dann zur Auswahl eines Klons der richtigen Orientierung verwendet, der die msl-1MPU-cDNA unter die Kontrolle der tRe-Sequenzen brachte.
  • tRe-Msl-2Nopu. Mutantenversion von Drosophila melanogaster Msl-2. Msl-2 stellt eine andere Komponente des Geschlechtsdeterminierungswegs dar, die gewöhnlich nur in Männchen exprimiert wird, die in Weibchen durch ein Produkt des „Sex-lethal"-Gens reprimiert wird. Die Aktivität der Mutanten ist unabhängig von „Sex-lethal", wodurch sie für Weibchen toxisch gemacht wird, wenn sie in einer ausreichend hohen Menge exprimiert wird. Die Toxizität ist deshalb geschlechtsspezifisch. Die msl-2-cDNA wurde als ein NotI/XbaI-Fragment aus pM2 NOPU kloniert (Kelley et al. (1995), Cell 81; 867–877) und zu mit NotI/XbaI verdautes WTP-2 kloniert.
  • BEISPIEL 1: EINZELCHROMOSOMEN-KREUZUNGEN
  • In „Einzelchromosomen-Kreuzungen" bei 25°C wurden zehn bis fünfzehn für das tTA-Konstrukt homozygote Jungfrauen und fünf bis zehn für das tRe-Konstrukt homozygote junge Männchen auf Futter gebracht, das eine Tetracyclin-Ergänzung enthielt oder Tetracyclin-frei war. Ihre Nachkommenschaft durfte sich auf diesem Futter entwickeln. Sxlpe
    Tetracyclin-Konz. μg/ml Weibchen Insgesamt Männchen Insgesamt
    0 0A, 0B, 0C, 0F, 0, 0, 0, 0 0 58, 47, 60, 51, 46, 60, 52, 54 428
    0,1 46, 49, 50, 51, 52, 50, 41, 40 379 56, 42, 72, 41, 56, 72, 61, 34 434
    1 52, 40, 60, 0, 60, 72, 50, 52 386 50, 51, 55, 3, 63, 54, 57, 56 389
    5 41, 55, 49, 52, 48, 47, 40, 51 383 36, 47, 42, 55, 36, 55, 52, 52 375
    Sxlpe tTa(A,B,C,F) × tRe Ras64V12(B,C)
  • Format für Daten: Die 8 Zahlen stellen die Ergebnisse von Kreuzungen unter Verwendung unabhängiger Insertionen von jedem Element (zur Kontrolle der Positionswirkung) dar. Hier wurden 4 Insertionen von Sxlpe-tTA (A, B, C und F) und zwei von tRE-Ras64BV12 (B und C) verwendet. Die Reihenfolge der Daten ist wie folgt: Sxlpe-tTA( A )-Weibchen mit tRe-Ras64BV12(B)-Männchen, dann SxlB × RasB, SxlC × RasB, SxlF × RasB, SxlA × RasC, SxlB × RasC, SxlC × RasC und schließlich SxlF × RasC. Die Daten werden in den anderen Tabellen auf ähnliche Weise präsentiert.
    Tetracyclin-Kon z. μg/ml Weibchen Insgesamt Männchen Insgesamt
    0 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 0 59, 57, 62, 51, 73, 69, 57, 55 483
    0,1 61, 52, 47, 46, 22, 31, 36, 15 296 60, 62, 56, 71, 69, 75, 55, 72 520
    1 59, 57, 63, 59, 31, 21, 15, 21 326 47, 56, 49, 62, 63, 67, 71, 58 473
    5 61, 47, 52, 56, 38, 22, 16, 12 304 68, 72, 67, 92, 58, 54, 61, 63 535
    Sxlpe tTa(A,B,C,F) × tRe Msl-1Mpu(A,B)
    Tetracyclin-Kon z. μg/ml Weibchen Insgesamt Männchen Insgesamt
    0 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 0 56, 72, 81, 69, 62, 63, 56, 47, 82, 57, 55, 61 761
    0,1 79, 56, 47, 42, 51, 61, 52, 52, 49, 51, 53, 54 647 58, 41, 40, 35, 50, 67, 71, 39, 52, 62, 40, 70 562
    1 42, 45, 56, 48, 52, 61, 57, 54, 55, 56, 57, 61 644 60, 39, 61, 60, 69, 49, 59, 38, 64, 69, 71, 35 674
    5 58, 61, 52, 53, 54, 61, 29, 31, 55, 50, 49, 62 615 61, 59, 57, 56, 55, 48, 91, 63, 54, 50, 81, 67 742
    Sxlpe tTa(A,B,C,F) × tRe Msl-2Nopu(B,C,D)
    Stwl
    Tetracyclin-Kon z. μg/ml Weibchen Insgesamt Männchen Insgesamt
    0 0, 0, 0, 0, 0, 0 0 0, 0, 0, 0, 0, 0 0
    0,1 36, 62, 71, 41, 49, 58 317 43, 442, 63, 35, 68 315
    1 58, 37, 58, 41, 55, 58 307 47, 70, 51, 51, 39, 70 328
    5 36, 38, 56, 43, 34, 64 271 57, 71, 68, 53, 44, 42 335
    Stwl tTa(A,B,C) × tRe Ras64BV12(B,C)
    Tetracyclin-Kon z. μg/ml Weibchen Insgesamt Männchen Insgesamt
    0 0, 0, 0, 0, 0, 0 0 50, 44, 45, 56, 40, 67 302
    0,1 67, 56, 37, 23, 16, 12 211 56, 53, 50, 61, 42, 74 336
    1 69, 64, 41, 13, 31, 18 236 33, 70, 39, 45, 40, 70 257
    5 52, 42, 49, 19, 20, 41 223 37, 80, 41, 48, 80 291
    Stwl tTa(A,B,C) × tRe Msl-1Mpu(A,B)
    Tetracyclin-Kon z. μg/ml Weibchen Insgesamt Männchen Insgesamt
    0 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 0 38, 53, 47, 68, 38, 70,5 2,60, 55 481
    0,1 54, 57, 41, 64, 40, 63, 39, 42, 36 436 59, 58, 49, 73, 48, 69, 45, 47, 43 491
    1 46, 34, 35, 63, 47, 70, 64, 39, 41 439 55, 40, 40, 71, 50, 72,7 4,46, 42 490
    5 52, 70, 37, 34, 35, 57, 49, 50, 50 434 54, 71, 41, 42, 41, 66, 56, 55, 55 481
    Stwl tTa(A,B,C) × tRe Msl-2Nopu(B,C,D)
    Actin5C
    Tetracyclin-Konz. μg/ml Weibchen Insgesamt Männchen Insgesamt
    0 0, 0, 0, 0, 0, 0 0 0, 0, 0, 0, 0, 0 377
    0,1 77, 57, 69, 50, 45, 63 361 50, 70, 71, 67, 53, 61 372
    1 86, 59, 60, 80, 70, 72 427 46, 89, 72, 45, 76, 55 383
    5 46, 49, 87, 63, 59, 71 375 75, 83, 58, 83, 72, 82 400
    Actin5C tTa(B,C,E) × tRe Ras64BV12(B,C)
    Tetracyclin-Konz. μg/ml Weibchen Insgesamt Männchen Insgesamt
    0 0, 0, 0, 0, 0, 0 0 83, 73, 65, 69, 53, 80 423
    0,1 72, 74, 80, 68, 72, 46 412 82, 52, 57, 66, 86, 59 402
    1 61, 83, 48, 66, 65, 57 321 74, 69, 85, 58, 48, 61 351
    5 70, 57, 50, 62, 61, 86 386 48, 68, 52, 62, 84, 87 401
    Actin5C tTa(B,C,E) × tRe Msl-1Mpu(A,B)
    Tetracyclin-Konz. μg/ml Weibchen Insgesamt Männchen Insgesamt
    0 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 0 63, 52, 67, 71, 88, 55, 46, 86, 75 603
    0,1 84, 85, 83, 73, 48, 48, 46, 71, 58 548 62, 54, 48, 81, 85, 74, 78, 77, 78 637
    1 70, 70, 66, 81, 50, 52, 69, 81, 51 590 69, 87, 47, 64, 66, 59, 58, 47, 52 549
    5 67, 70, 87, 61, 54, 54, 67, 74, 81 615 71, 61, 57, 53, 51, 65, 45, 68, 51 522
    Actin5C tTa(B,C,E) × tRe Msl-2Nopu(B,C,D)
    Hsp26
    Tetracyclin-Konz. μg/ml Weibchen Insgesamt Männchen Insgesamt
    0 0, 0, 0, 0 0 0, 0, 0, 0 0
    0,1 47, 56, 71, 61 235 46, 52, 53, 59 210
    1 60, 46, 52, 41 199 79, 71, 68, 56 274
    5 2, 51, 71, 32 156 0, 49, 62, 43 154
    Hsp26 tTa(A) × tRe Ras64BV12(B,C,)
    Tetracyclin-Konz. μg/ml Weibchen Insgesamt Männchen Insgesamt
    0 0, 0, 0, 0, 0, 0 0 64, 58, 33, 66, 55, 42 318
    0,1 45, 44, 72, 56, 62, 49 328 53, 54, 80, 57, 66, 58 368
    1 70, 35, 61, 50, 57, 37 310 78, 36, 70, 56, 61, 42 343
    5 44, 58, 58, 59, 42, 52 313 46, 68, 66, 64, 48, 55 347
    Hsp26 tTa(A) × tRe Msl-1Mpu(A,B,)
    Tetracyclin-Konz. μg/ml Weibchen Insgesamt Männchen Insgesamt
    0 0, 0, 0 0 56, 47, 56 159
    0,1 48, 49, 62 159 56, 68, 49 159
    1 43, 45, 51 135 36, 39, 47 122
    5 55, 3, 66 124 61, 5, 54 120
    Hsp26 tTa(A) × tRe Msl-2Mopu(A,B,)
    Yp3
    Tetracyclin-Konz. μg/ml Weibchen Insgesamt Männchen Insgesamt
    0 0, 0, 0, 0, 0, 0 0 65, 70, 61, 65, 47, 42 350
    0,1 33, 54, 50, 72, 63, 50 322 42, 64, 52, 74, 67, 54 352
    1 56, 56, 61, 69, 57, 43 342 59, 64, 65, 75, 64, 49 376
    5 46, 51, 73, 65, 42, 39 316 44, 56, 79, 74, 52, 49 354
    Yp3 tTa(A) × tRe Ras64BV12(B,C,)
    Tetracyclin-Konz. μg/ml Weibchen Insgesamt Männchen Insgesamt
    0 0, 0, 2, 0, 0, 0 2 49, 58, 39, 65, 35, 51 297
    0,1 36, 65, 71, 37, 59, 68 336 46, 73, 77, 46, 66, 71 379
    1 42, 65, 67, 57, 35, 53 319 49, 72, 68, 59, 41, 58 347
    5 55, 55, 43, 58, 36, 60 307 63, 64, 49, 63, 45, 64 348
    Yp3 tTa(A) × tRe Msl-1Mpu(A,B,)
    Tetracyclin-Konz. μg/ml Weibchen Insgesamt Männchen Insgesamt
    0 0, 0, 0, 0, 0, 0 0 35, 35, 72, 52, 45, 37 276
    0,1 34, 68, 42, 51, 33, 40 268 35, 72, 45, 56, 36, 44 248
    1 41, 39, 42, 60, 70, 72 324 51, 49, 46, 61, 78, 77 362
    5 70, 55, 56, 65, 43, 61 349 74,58,64,73,51,66 386
    Yp3 tTa(A) × tRe Msl-2Mopu(A,B,)
  • SCHLUSSFOLGERUNG
  • Diese Daten zeigen, dass ein Geschlecht oder beide Geschlechter effizient eliminiert werden können, während eine gute Repression dieser Letalität durch Zufügen mittelgradiger Konzentrationen von Tetracyclin zum Futter erreicht werden kann. Diese Repression ist über einen breiten Bereich von Tetracylcin-Konzentrationen wirksam.
  • BEISPIEL 2: REPORTER-KREUZUNGEN
  • In „Reporter-Kreuzungen" bei 25°C wurden weibliche Homozygoten, die eine Insertion von Sxlpe tTa auf ihrem X-Chromosom (Sxlpe tTa(A)) tragen, mit Männchen gekreuzt, die verschiedene Reporter-Konstrukte tragen. Wie bei den „Einzelchromosomen-Kreuzungen wurden zehn bis fünfzehn für das tTA-Konstrukt homozygote Jungfrauen und fünf bis zehn für das tRe-Konstrukt homozygote junge Männchen auf Futter gebracht, das eine Tetracyclin-Ergänzung enthielt oder Tetracyclin-frei war. Ihre Nachkommenschaft durfte sich auf diesem Futter entwickeln.
  • lacZ
  • Die Embryos wurden unter Verwendung eines histochemischen Standardverfahrens auf lacZ gefärbt.
    Tetracyclin-Konz. μg/ml LacZ-positiv Insgesamt LacZ-negativ Insgesamt
    0 60, 85, 99, 60 304 78, 89, 85, 93 345
    0,1 0, 0, 0, 0 0 176, 174, 178, 181 709
    1 0, 0, 0, 0 0 188, 190, 181, 180 739
    5 0, 0, 0, 0 0 156, 151, 159, 185 651
    (Weibchen) Sxlpe tTa(A) × tRe lacZ(III)(Männchen)
    Tetracyclin-Konz. μg/ml LacZ-positiv Insgesamt LacZ-negativ Insgesamt
    0 57, 82, 97, 45 281 61, 74, 59, 82 276
    0,1 0, 0, 0, 0 0 131, 165, 132, 90 518
    1 0, 0, 0, 0 0 170, 161, 181, 195 707
    5 0, 0, 0, 0 0 126, 190, 190, 196 702
    (Männchen) Sxlpe tTa(A) × tRe lacZ(III)(Weibchen)
    Tetracyclin-Konz. μg/ml LacZ-positiv Insgesamt LacZ-negativ Insgesamt
    0 0, 0, 0, 0 0 189, 200, 153, 169 711
    0,1 0, 0, 0, 0 0 164, 175, 190, 179 708
    1 0, 0, 0, 0 0 182, 190, 195, 167 737
    5 0, 0, 0, 0 0 199, 151, 169, 164 683
    (Männchen) Sxlpe tTa(A) tRe lacZ(I) × C(1)DX (Weibchen)
  • EGFP
  • Die Embryos wurden auf Fluoreszenz bewertet. Im Fall von Embryos auf Tetracyclin-freiem Medium wurden diese getrennt, durften sich auf Tetracyclin-freiem Medium entwickeln und das Geschlecht der schlüpfenden Adulten wurde bewertet.
    Tetracyclin-Konz. μg/ml Fluoreszierend Weibchen Männchen Nicht fluoreszierend Weibchen Männchen
    0 89, 100, 53, 55 200 0 99, 86, 46, 51 0 232
    0,1 0, 0, 0, 0 - - 199, 182, 188, 153 - -
    1 0, 0, 0, 0 - - 170, 135, 163, 196 - -
    5 0, 0, 0, 0 - - 186, 159, 127, 200 - -
    (Weibchen) Sxlpe tTa(A) × tRe EGFP(II)(Männchen)
    Tetracyclin-Konz. μg/ml Fluoreszierend Weibchen Männchen Nicht fluoreszierend Weibchen Männchen
    0 60, 91, 62, 83 243 0 102, 56, 79, 72 1 256
    0,1 0, 0, 0, 0 - - 196, 170, 165, 162 - -
    1 0, 0, 0, 0 - 182, 200, 197, 161 - -
    5 0, 0, 0, 0 - - 182, 161, 188, 182 - -
    (Männchen) Sxlpe tTa(A) × tRe EGFP(II)(Weibchen)
    Tetracyclin-Konz. μg/ml Fluoreszierend Männchen Weibchen Nicht fluoreszierend Männchen Weibchen
    0 0, 0, 0, 0 - - 196, 179, 165, 164 - -
    0,1 0, 0, 0, 0 - - 179, 197, 198, 188 - -
    1 0, 0, 0, 0 - - 198, 187, 190, 164 - -
    5 0, 0, 0, 0 - - 170, 177, 199, 165 - -
    (Männchen) Sxlpe tTa(A); tRe EGFP(II)C(1)DX(Weibchen)
  • C(1)DX stellt ein zusammengesetztes X-Chromosom dar, wobei effektiv zwei X-Chromosomen zusammengefügt sind. Das X-Chromosom von Männchen, das mit C(1)DX-Weibchen gekreuzt wurde, wird deshalb von den Söhnen anstelle der Töchter geerbt.
  • SCHLUSSFOLGERUNGEN
  • Die Daten weisen darauf hin, dass die Reportergen-Expression, wie erwartet, in Gegenwart von Tetracyclin über einen Konzentrationsbereich hinweg, abgeschaltet („turned-off") ist.
  • BEISPIEL 3: REKOMBINANTE CHROMOSOMENEXPERIMENTE
  • 40–45 junge Weibchen und 20–25 junge Männchen, die bei 25°C auf Futter mit der angegebenen Tetracyclin-Ergänzung gezüchtet wurden, durften paaren und wurden dann nach 3–4 Tagen auf normales (Tetracyclin-freies) Futter transferiert. Diese Fliegen wurden jeden Tag für die Dauer von 12 Tagen in frische Fläschchen mit normalem Futter transferiert und dann am 13. Tag entfernt. Alle Fläschchen wurden bei 25°C inkubiert, während sich die Nachkommenschaft entwickelte. Die Zahlen der männlichen und weiblichen Nachkommenschaft, die in jedem Fläschchen als Adulte schlüpften, wurden aufgezeichnet. TETRACYCLIN-KONZENTRATION Sxlpe
    Tet.-Konz. Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 5 Tag 6 Tag 7
    μg/ml Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib.
    0,1 103 0 98 0 89 0 92 0 105 0 95 0 110 0
    1 128 0 137 0 150 0 136 0 111 0 87 0 100 0
    5 110 0 111 0 95 0 90 0 144 0 93 0 138 0
    20 131 0 126 0 133 0 120 0 93 0 99 0 111 0
    100 139 0 127 0 145 0 110 0 149 0 128 0 94 0
    500 95 11 133 12 145 1 137 1 86 0 112 0 128 0
    1000 140 12 133 24 119 8 94 2 92 1 137 1 129 1
    2000 110 35 97 25 94 16 138 12 115 2 126 1 145 1
    Tet.-Konz. Tag 8 Tag 9 Tag 10 Tag 11 Tag 12 Insgesamt
    μg/ml Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib.
    0,1 106 0 131 0 148 0 86 0 99 0 1262 0
    1 106 0 109 0 97 0 124 0 114 0 1399 0
    5 106 0 89 0 148 0 148 0 87 0 1359 0
    20 87 0 149 0 104 0 113 0 132 0 1398 0
    100 93 0 125 0 99 0 121 0 139 0 1469 0
    500 142 0 129 0 114 0 131 0 126 0 1478 25
    1000 89 0 94 0 97 0 138 0 87 0 1349 49
    2000 94 0 137 0 99 0 141 0 143 0 1439 92
    Sxlpe-tTA, tRE-Ras64BV12 auf dem X-Chromosom
    Tet.-Konz. Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 5 Tag 6 Tag 7
    μg/ml Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Wei Männ. Weib. Männ. Weib.
    0,1 103 0 98 0 149 0 121 0 134 0 150 0 117 0
    1 149 0 86 0 111 0 112 0 126 0 148 0 136 0
    5 104 0 99 0 148 0 128 0 142 0 134 0 93 0
    20 121 0 106 0 97 0 127 0 142 0 131 0 107 0
    100 94 0 142 0 115 0 131 0 114 0 103 0 131 0
    500 140 34 148 23 100 14 95 1 122 0 120 0 115 0
    1000 110 29 87 12 138 22 145 17 91 5 106 1 102 1
    2000 123 42 145 37 131 43 139 15 126 12 118 7 100 4
    Tet.Kon z. Tag 8 Tag 9 Tag 10 Tag 11 Tag 12 Insgesamt
    μg/ml Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib.
    0,1 138 0 142 0 147 0 130 0 112 0 1541 0
    1 129 0 123 0 91 0 99 0 131 0 1441 0
    5 99 0 106 0 95 0 144 0 129 0 1421 0
    20 149 0 150 0 89 0 128 0 140 0 1487 0
    100 93 0 119 0 143 0 87 0 144 0 1416 0
    500 98 0 129 0 90 0 124 0 107 0 1388 72
    1000 92 0 150 0 145 0 107 0 143 0 1416 87
    2000 92 1 120 0 89 0 106 0 149 0 1438 161
    Sxlpe-tTA, tRE-Ras64BV12 auf dem dritten Chromosom
    Tet.-K onz. Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 5 Tag 6 Tag 7
    μg/ml Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib
    0,1 97 0 136 0 152 0 130 0 108 0 114 0 88 0
    1 102 0 99 0 134 0 171 0 171 0 118 0 91 0
    5 130 0 159 0 156 0 91 0 84 0 127 0 110 0
    20 76 0 129 0 126 0 79 0 89 0 98 0 94 0
    100 112 0 145 0 130 0 124 0 79 0 109 0 134 0
    500 136 2 79 0 161 0 102 0 171 0 151 0 161 0
    1000 92 15 83 9 150 3 149 2 146 0 92 0 115 0
    2000 127 21 95 14 153 3 164 4 135 1 97 1 144 0
    Tet.-Konz. Tag 8 Tag 9 Tag 10 Tag 11 Tag 12 Insgesamt
    μg/ml Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib.
    0,1 140 0 104 0 141 0 173 0 81 0 1464 0
    1 104 0 120 0 171 0 102 0 144 0 1527 0
    5 116 0 123 0 155 0 163 0 121 0 1535 0
    20 122 0 103 0 126 0 123 0 78 0 1243 0
    100 127 0 133 0 79 0 157 0 154 0 1483 0
    500 164 0 95 0 160 0 154 0 91 0 1625 2
    1000 168 0 153 0 80 0 95 0 79 0 1402 29
    2000 158 0 103 0 129 0 141 0 97 0 1543 44
    Sxlpe-tTA, tRE-Msl-2Nopu auf dem X-Chromosom
    Tet.-Konz. Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 5 Tag 6 Tag 7
    μg/ml Männ. Weib Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib.
    0,1 111 0 108 0 130 0 69 0 101 0 110 0 130 0
    1 89 0 106 0 119 0 70 0 87 0 117 0 138 0
    5 112 0 80 0 68 0 130 0 78 0 93 0 78 0
    20 92 0 83 0 129 0 127 0 66 0 69 0 95 0
    100 72 0 90 0 72 0 66 0 106 0 122 0 100 0
    500 78 0 118 0 69 0 67 0 88 0 83 0 135 0
    1000 122 2 107 1 133 0 116 0 115 0 107 0 119 0
    2000 134 12 79 14 123 5 130 1 102 0 114 0 83 0
    Tet. -Konz. Tag 8 Tag 9 Tag 10 Tag 11 Tag 12 Insgesamt
    μg/ml Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib.
    0,1 127 0 92 0 79 0 77 0 133 0 1267 0
    1 71 0 104 0 81 0 124 0 65 0 1171 0
    5 106 0 84 0 135 0 119 0 82 0 1165 0
    20 101 0 71 0 108 0 74 0 112 0 1127 0
    100 136 0 104 0 116 0 77 0 107 0 1168 0
    500 128 0 104 0 73 0 106 0 88 0 1137 0
    1000 101 0 115 0 86 0 96 0 92 0 1309 3
    2000 130 0 105 0 120 0 104 0 101 0 1325 32
    Sxlpe-tTA, tRE-Msl-2Nopu auf dem dritten Chromosom
    Tet.-Konz. Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 5 Tag 6 Tag 7
    μg/ml Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib.
    0,1 93 0 137 0 84 0 66 0 114 0 107 0 114 0
    1 73 0 90 0 99 0 120 0 118 0 85 0 85 0
    5 84 0 122 0 131 0 93 0 104 0 90 0 133 0
    20 127 0 128 0 80 0 105 0 81 0 122 0 108 0
    100 72 0 80 0 87 0 128 0 78 0 92 0 86 0
    500 98 0 78 0 94 1 105 0 138 0 77 0 92 0
    1000 117 1 105 2 130 1 130 1 82 0 88 0 113 0
    2000 91 16 70 11 69 13 70 4 108 1 90 0 115 0
    Tet-Konz. Tag 8 Tag 9 Tag 10 Tag 11 Tag 12 Insgesamt
    μg/ml Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib.
    0,1 117 0 78 0 123 0 125 0 121 0 1279 0
    1 91 0 90 0 68 0 88 0 82 0 1089 0
    5 89 0 70 0 138 0 85 0 100 0 1239 0
    20 95 0 118 0 70 0 114 0 114 0 1262 0
    100 66 0 137 0 85 0 109 0 93 0 1113 0
    500 68 0 70 0 109 0 86 0 136 0 1151 1
    1000 95 0 137 0 99 0 120 0 66 0 1282 5
    2000 84 0 98 0 83 0 128 0 131 0 1137 45
    Sxlpe-tTA, tRE-Msl-1Mpu auf dem X-Chromosom
    Hsp26
    Tet.-Konz. Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 5 Tag 6 Tag 7
    μg/ml Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib.
    0,1 153 0 154 0 127 0 130 0 81 0 151 0 147 0
    1 138 0 98 0 74 0 88 0 150 0 123 0 115 0
    5 140 0 132 0 119 0 129 0 87 0 156 0 157 0
    20 115 0 113 0 92 0 92 0 129 0 77 0 119 0
    100 150 0 127 0 126 0 114 0 78 0 93 0 98 0
    500 119 1 146 0 154 0 132 0 112 0 97 0 80 0
    1000 77 5 109 2 105 2 85 0 84 0 127 0 91 0
    2000 156 18 101 6 149 3 115 1 134 0 139 0 151 0
    Tet-Konz. Tag 8 Tag 9 Tag 10 Tag 11 Tag 12 Insgesamt
    μg/ml Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib.
    0,1 117 0 81 0 106 0 135 0 141 0 1523 0
    1 152 0 89 0 105 0 146 0 89 0 1367 0
    5 79 0 148 0 120 0 92 0 119 0 1478 0
    20 69 0 78 0 149 0 72 0 116 0 1221 0
    100 121 0 126 0 157 0 141 0 143 0 1474 0
    500 142 0 103 0 104 0 144 0 129 0 1462 1
    1000 75 0 147 0 105 0 97 0 123 0 1225 9
    2000 86 0 97 0 98 0 131 0 76 0 1433 28
    Hsp26-tTA, tRE-Msl-2Nopu auf dem zweiten Chromosom
    Tet-Konz. Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 5 Tag 6 Tag 7
    μg/ml Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib.
    0,1 120 0 87 0 127 0 115 0 121 0 80 0 100 0
    1 84 0 153 0 100 0 88 0 93 0 71 0 126 0
    5 134 0 95 0 122 0 141 0 80 0 77 0 106 0
    20 135 0 137 0 140 0 135 0 107 0 141 0 89 0
    100 146 1 146 0 82 0 106 0 118 0 118 0 82 0
    500 124 12 144 8 99 2 154 1 137 0 96 1 75 0
    1000 72 27 85 17 76 15 87 12 102 5 93 5 69 3
    2000 132 67 96 45 119 38 135 35 104 22 90 17 149 12
    Tet-Konz. Tag 8 Tag 9 Tag 10 Tag 11 Tag 12 Insgesamt
    μg/ml Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib.
    0,1 151 0 79 0 108 0 69 0 107 0 1264 0
    1 78 0 95 0 105 0 112 0 154 0 1259 0
    5 135 0 84 0 152 0 145 0 142 0 1413 0
    20 79 0 157 0 92 0 73 0 139 0 1424 0
    100 96 0 135 0 86 0 106 0 157 0 1378 1
    500 139 0 142 0 145 0 84 0 136 0 1475 24
    1000 114 1 145 0 130 0 136 0 152 0 1261 85
    2000 149 2 81 0 127 0 146 0 88 0 1416 238
    Hsp26-tTA, tRE-Msl-1Mpu auf dem zweiten Chromosom
    Yp3
    Tet.-Konz. Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 5 Tag 6 Tag 7
    μg/ml Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib.
    0,1 93 0 119 0 112 0 141 0 100 0 126 0 89 0
    1 117 0 135 0 122 0 121 0 127 0 101 0 136 0
    5 112 0 116 0 128 0 111 0 136 0 113 0 130 0
    20 89 0 107 0 107 0 98 0 88 0 102 0 107 0
    100 120 0 136 0 128 0 127 0 135 0 144 0 107 0
    500 136 2 88 0 113 0 113 0 87 0 94 0 109 0
    1000 107 13 140 5 110 0 141 0 98 0 129 0 88 0
    2000 119 32 102 15 107 12 109 9 109 8 140 2 127 0
    Tet-Konz. Tag 8 Tag 9 Tag 10 Tag 11 Tag 12 Insgesamt
    μg/ml Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib.
    0,1 105 0 133 0 93 0 131 0 121 0 1363 0
    1 90 0 119 0 94 0 98 0 100 0 1360 0
    5 119 0 96 0 88 0 144 0 91 0 1384 0
    20 135 0 126 0 143 0 123 0 141 0 1366 0
    100 96 0 92 0 104 0 94 0 115 0 1407 0
    500 141 0 144 0 123 0 104 0 124 0 1376 2
    1000 138 0 105 0 124 0 115 0 114 0 1409 18
    2000 114 0 123 0 132 0 115 0 107 0 1404 78
    Yp3-tTA, tRE-Ras64BV12 zweiten Chromosom
    Tet.-Konz. Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 5 Tag 6 Tag 7
    μg/ml Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib.
    0,1 121 0 94 0 103 0 93 0 96 0 119 0 119 0
    1 95 0 123 0 79 0 78 0 130 0 103 0 112 0
    5 109 0 110 0 118 0 124 0 86 0 122 0 90 0
    20 81 0 89 0 127 0 82 0 81 0 79 0 128 0
    100 112 0 87 1 87 1 113 0 95 1 91 1 84 1
    500 84 21 96 16 86 15 124 9 123 5 86 3 106 1
    1000 100 47 110 12 109 8 103 13 102 9 97 2 82 6
    2000 127 63 130 54 128 34 117 21 89 12 87 11 90 4
    Tet.-Konz. Tag 8 Tag 9 Tag 10 Tag 11 Tag 12 Insgesamt
    μg/ml Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib.
    0,1 84 0 127 0 104 0 76 0 95 0 1231 0
    1 94 0 106 0 83 0 93 0 113 0 1209 0
    5 132 0 126 0 76 0 128 0 102 0 1323 0
    20 119 0 99 0 90 0 106 0 87 0 1168 0
    100 85 1 122 0 114 0 90 0 126 0 1206 6
    500 85 1 93 0 111 0 111 0 104 0 1209 71
    1000 95 0 113 0 110 0 85 0 87 0 1193 97
    2000 131 1 128 0 91 0 95 0 82 0 1295 200
    Yp3-tTA, tRE-Msl-2Nopu auf dem zweiten Chromosom
    Tet.-Konz. Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 5 Tag 6 Tag 7
    μg/ml Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib.
    0,1 91 0 84 0 107 0 80 0 88 0 92 0 99 0
    1 117 0 92 0 128 0 80 0 104 0 116 2 8 0
    5 82 0 123 0 116 0 120 2 89 0 90 0 95 0
    20 92 1 101 0 87 0 109 0 81 0 121 0 83 1
    100 108 13 130 9 131 5 99 7 109 3 123 1 107 1
    500 78 22 85 16 80 12 106 15 130 11 91 10 118 7
    1000 130 35 86 42 78 26 116 14 80 12 82 17 77 15
    2000 116 79 130 72 78 44 101 29 132 32 94 22 89 16
    Tet-Konz. Tag 8 Tag 9 Tag 10 Tag 11 Tag 12 Insgesamt
    μg/ml Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib. Männ. Weib.
    0,1 88 1 135 0 123 0 128 0 114 0 1229 1
    1 101 0 127 2 84 0 101 0 79 0 1137 4
    5 80 0 94 0 127 0 128 3 86 0 1230 5
    20 132 0 81 0 88 0 112 0 127 0 1214 2
    100 106 1 132 0 81 0 115 0 107 0 1348 40
    500 115 2 98 0 86 0 82 4 115 0 1184 99
    1000 131 3 104 1 99 0 125 0 108 0 1216 165
    2000 91 8 88 2 85 5 114 0 80 0 1198 309
    Yp3-tTA, tRE-Msl-1Mpu auf dem zweiten Chromosom
  • SCHLUSSFOLGERUNGEN
  • Diese Daten zeigen, dass das Füttern der Mütter mit hohen Tetracyclin-Konzentrationen eine gewisse Schutzwirkung aufweist, dass aber alle diese rekombinanten Chromosomen über einen breiten Bereich (parentaler) Tetracyclin-Konzentrationen mit der einzigen Ausnahme von „Yp3 tTa, tRe Ms-1Mpu auf dem 2. Chromosom", das einige (< 1%) Ausreißer selbst bei niedrigen Konzentrationen aufweist, extrem effizient funktioniert. Da in Männchen von Drosophila melanogaster keine meiotische Rekombination vorliegt, könnten jedwede dieser rekombinanten Chromosomen gegebenenfalls in einer genetischen Geschlechtsbestimmung oder einem Insektenkontrollprogramm verwendet werden. In der Praxis stellt Drosophila melanogaster keinen landwirtschaftlichen Schädling oder Krankheitsvektor dar, diese Daten weisen jedoch darauf hin, dass die wirksame Eliminierung eines Geschlechts anhand dieses Verfahrens erreicht werden kann.
  • BEISPIEL 4: VERWENDUNG VON NICHT ANTIBIOTISCHEN TETRACYCLIN-ANALOGEN
  • Rekombinante Chromosomenstämme können ohne weiteres bei 25°C auf Epioxytetracyclin-Konzentrationen von 1 μg/ml oder Anhydrotetracyclin-Konzentrationen von 0,1 μg/ml aufrechterhalten werden, was darauf hinweist, dass diese nicht antibiotischen Tetracyclin-Analoge bei der Repression der tTA-responsiven Genexpression wirksam ist.
  • EPIOXYTETRACYCLIN
  • Ein Standardbereich von Zusatzstoffkonzentrationen wurden in den folgenden Experimenten (0,05–20 μg/ml) verwendet. Es war nicht möglich, den Stamm bei den zwei niedrigsten Konzentrationen aufrechtzuerhalten und ist folglich mit „n. d." (= „nicht durchgeführt") gekennzeichnet.
    Epioxytetracyclin-Konz. (μg/ml) Weibchen Männchen
    0,05 n. d. n. d.
    0,1 n. d. n. d.
    1 0 1306
    5 0 1581
    20 0 1495
    Sxlpe tTa, tRe Ras64BV12 auf dem X-Chromosom
    Epioxytetracyclin-Konz. (μg/ml) Weibchen Männchen
    0,05 n. d. n. d.
    0,1 n. d. n. d.
    1 0 1165
    5 0 1279
    20 0 1257
    Sxlpe tTa, tRe Ras64BV12 auf dem 3. Chromosom
    Epioxytetracyclin-Konz. (μg/ml) Weibchen Männchen
    0,05 n. d. n. d.
    0,1 n. d. n. d.
    1 0 1076
    5 0 1119
    20 0 1159
    Sxlpe tTa, tRe Msl-2Nopu auf dem X-Chromosom
    Epioxytetracyclin-Konz. (μg/ml) Weibchen Männchen
    0,05 n. d. n. d.
    0,1 n. d. n. d.
    1 0 1250
    5 0 1300
    20 0 1364
    Sxlpe tTa, tRe Msl-2Nopu auf dem 3. Chromosom
    Epioxytetracyclin-Konz. (μg/ml) Weibchen Männchen
    0,05 n. d. n. d.
    0,1 n. d. n. d.
    1 0 1483
    5 0 1585
    20 0 1565
    Sxlpe tTa, tRe Msl-1Mpu auf dem X-Chromosom
    Epioxytetracyclin-Konz. (μg/ml) Weibchen Männchen
    0,05 n. d. n. d.
    0,1 n. d. n. d.
    1 0 1362
    5 0 1181
    20 0 1403
    Hsp26 tTa, tRe Msl-2Nopu auf dem 2. Chromosom
    Epioxytetracyclin-Konz. (μg/ml) Weibchen Männchen
    0,05 n. d. n. d.
    0,1 n. d. n. d.
    1 0 1243
    5 0 1409
    20 0 1373
    Hsp26 tTa, tRe Msl-1Mpu auf dem 2. Chromosom
    Epioxytetracyclin-Konz. (μg/ml) Weibchen Männchen
    0,05 n. d. n. d.
    0,1 n. d. n. d.
    1 0 1431
    5 0 1424
    20 0 1387
    Yp3 tTa, tRe Ras64BV12 auf dem 2. Chromosom
    Epioxytetracyclin-Konz. (μg/ml) Weibchen Männchen
    0,05 n. d. n. d.
    0,1 n. d. n. d.
    1 0 1350
    5 0 1308
    20 0 1343
    Yp3 tTa, tRe Msl-1Mpu auf dem X-Chromosom
    ANHYDROTETRACYCLIN
    Anhydrotetracyclin-Konz. (μg/ml) Weibchen Männchen
    0,05 0 1452
    0,1 0 1528
    1 0 1614
    5 0 1448
    20 5 1592
    Sxlpe tTa, tRe Ras64BV12 auf dem X-Chromosom
    Anhydrotetracyclin-Konz. (μg/ml) Weibchen Männchen
    0,05 0 1381
    0,1 0 1304
    1 0 1121
    5 0 1269
    20 1 1247
    Sxlpe tTa, tRe Ras64BV12 auf dem 3. Chromosom
    Anhydrotetracyclin-Konz. (μg/ml) Weibchen Männchen
    0,05 0 1114
    0,1 0 1120
    1 0 1130
    5 0 1148
    20 0 1128
    Sxlpe tTa, tRe Msl-2Nopu auf dem X-Chromosom
    Anhydrotetracyclin-Konz. (μg/ml) Weibchen Männchen
    0,05 0 1331
    0,1 0 1431
    1 0 1309
    5 0 1359
    20 1 1362
    Sxlpe tTa, tRe Msl-2Nopu auf dem 3. Chromosom
    Anhydrotetracyclin-Konz. (μg/ml) Weibchen Männchen
    0,05 0 1582
    0,1 0 1499
    1 0 1474
    5 0 1619
    20 5 1533
    Sxlpe tTa, tRe Msl-1Mpu auf dem X-Chromosom
    Anhydrotetracyclin-Konz. (μg/ml) Weibchen Männchen
    0,05 0 707
    0,1 0 1457
    1 0 1437
    5 0 773
    20 5 1447
    Hsp26 tTa, tRe Msl-2Nopu auf dem 2. Chromosom
    Anhydrotetracyclin-Konz. (μg/ml) Weibchen Männchen
    0,05 0 1492
    0,1 0 1426
    1 0 1418
    5 0 1457
    20 8 1499
    Hsp26 tTa, tRe Msl-1Mpu auf dem 2. Chromosom
    Anhydrotetracyclin-Konz. (μg/ml) Weibchen Männchen
    0,05 0 1449
    0,1 0 1411
    1 0 1397
    5 0 1430
    20 2 1428
    Yp3 tTa, tRe Ras64BV12 auf dem 2. Chromosom
    Anhydrotetracyclin-Konz. (μg/ml) Weibchen Männchen
    0,05 0 1339
    0,1 0 1263
    1 0 1265
    5 0 1284
    20 0 1297
    Yp3 tTa, tRe Msl-1Mpu auf dem X-Chromosom
    Anhydrotetracyclin-Konz. (μg/ml) Weibchen Männchen
    0,05 0 1316
    0,1 0 1358
    1 0 1354
    5 0 1344
    20 1 1312
    Yp3 tTa, tRe Msl-2Nopu auf dem 2. Chromosom
  • SCHLUSSFOLGERUNGEN
  • Diese Daten zeigen, dass nicht antibiotische Analoge von Tetracyclin-Analogen anstelle von Tetracyclin verwendet werden können. Im Fall von Epioxytetracyclin sind zur Repression der Genexpression geringgradig höhere Konzentrationen erforderlich. Keine der beiden weist parentale Transmissionsmerkmale auf, die sich wesentlich von Tetracyclin unterscheiden, wobei die verschiedenen wirksamen Konzentrationen berücksichtigt werden.
  • BEISPIEL 5: WIRKUNG DER TEMPERATUR
  • Alle vorangehenden Experimente wurden bei 25°C, der Standardtemperatur für die Drosophila-Kultur, durchgeführt. Die freilebenden Insekten würden jedoch eindeutig variierenden Temperaturen ausgesetzt, deshalb wurde das Ausmaß untersucht, in dem die Effizienz des Systems durch die Temperatur beeinflusst wird. Wie mit den rekombinanten Chromosomen-Experimenten durften 40–45 junge Jungfrauen und 20–25 junge Männchen bei 25°C nach der Futteraufnahme mit der angezeigten Tetracyclin-Ergänzung paaren und wurden dann nach 3–4 Tagen auf normales Futter (Tetracyclin-frei) transferiert. Diese Fliegen wurden jeden Tag in frische Fläschchen mit normalem Futter transferiert. Die Zahlen männlicher und weiblicher Nachkommenschaft, die in jedem Fläschchen als Adulte schlüpften, wurden aufgezeichnet.
  • Diese Experimente wurden entweder bei 18°C oder 29°C durchgeführt. 18°C
    Tetracyclin-Konz. (μg/ml) Weibchen Männchen
    0,1 8 982
    1 10 912
    5 7 871
    Sxlpe tTa, tRe Ras64BV12 auf dem X-Chromosom
    Tetracyclin-Konz. (μg/ml) Weibchen Männchen
    0,1 6 1065
    1 9 1124
    5 7 989
    Sxlpe tTa, tRe Ras64BV12 auf dem 3. Chromosom
    Tetracyclin-Konz. (μg/ml) Weibchen Männchen
    0,1 6 695
    1 8 816
    5 8 785
    Sxlpe tTa, tRe Msl-2Nopu auf dem X-Chromosom
    Tetracyclin-Konz. (μg/ml) Weibchen Männchen
    0,1 2 973
    1 9 985
    5 5 983
    Sxlpe tTa, tRe Msl-2Nopu auf dem 3. Chromosom
    Tetracyclin-Konz. (μg/ml) Weibchen Männchen
    0,1 8 840
    1 5 927
    5 8 837
    Sxlpe tTa, tRe Msl-1Mpu auf dem X-Chromosom
    Tetracyclin-Konz. (μg/ml) Weibchen Männchen
    0,1 8 832
    1 7 879
    5 4 818
    Hsp26 tTa, tRe Msl-2Nopu auf dem 2. Chromosom
    Tetracyclin-Konz. (μg/ml) Weibchen Männchen
    0,1 6 628
    1 3 614
    5 5 712
    Hsp26 tTa, tRe Msl-1Mpu auf dem 2. Chromosom
    Tetracyclin-Konz. (μg/ml) Weibchen Männchen
    0,1 8 1152
    1 12 1122
    5 3 1225
    Yp3 tTa, tRe Msl-2Nopu auf dem 2. Chromosom
    Tetracyclin-Konz. (μg/ml) Weibchen Männchen
    0,1 5 1303
    1 14 1218
    5 7 1386
    Yp3 tTa, tRe Msl-1Mpu auf dem X-Chromosom
    Tetracyclin-Konz. (μg/ml) Weibchen Männchen
    0,1 2 1190
    1 4 1213
    5 0 1058
    Yp3 tTa, tRe Ras64BV12 auf dem 2. Chromosom
    29°C
    Tetracyclin-Konz. (μg/ml) Weibchen Männchen
    0,1 0 716
    1 0 711
    5 0 715
    Sxlpe tTa, tRe Ras64BV12 auf dem X-Chromosom
    Tetracyclin-Konz. (μg/ml) Weibchen Männchen
    0,1 0 781
    1 0 749
    5 0 741
    Sxlpe tTa, tRe Ras64BV12 auf dem 3. Chromosom
    Tetracyclin-Konz. (μg/ml) Weibchen Männchen
    0,1 0 682
    1 0 804
    5 0 648
    Sxlpe tTa, tRe Msl-2Nopu auf dem X-Chromosom
    Tetracyclin-Konz. (μg/ml) Weibchen Männchen
    0,1 0 732
    1 0 771
    5 0 816
    Sxlpe tTa, tRe Msl-1Mpu auf dem X-Chromosom
    Tetracyclin-Konz. (μg/ml) Weibchen Männchen
    0,1 0 749
    1 0 737
    5 0 718
    Sxlpe tTa, tRe Msl-2Nopu auf dem 3. Chromosom
    Tetracyclin-Konz. (μg/ml) Weibchen Männchen
    0,1 0 696
    1 0 658
    5 0 711
    Hsp26 tTa, tRe Msl-2Nopu auf dem 2. Chromosom
    Tetracyclin-Konz. (μg/ml) Weibchen Männchen
    0,1 0 733
    1 0 776
    5 0 728
    Hsp26 tTa, tRe Msl-1Mpu auf dem 2. Chromosom
    Tetracyclin-Konz. (μg/ml) Weibchen Männchen
    0,1 0 765
    1 0 702
    5 0 773
    Yp3 tTa, tRe Msl-2Nopu auf dem 2. Chromosom
    Tetracyclin-Konz. (μg/ml) Weibchen Männchen
    0,1 0 799
    1 0 749
    5 0 744
    Yp3 tTa, tRe Msl-1Mpu auf dem X-Chromosom
    Tetracyclin-Konz. (μg/ml) Weibchen Männchen
    0,1 0 718
    1 0 753
    5 0 757
    Yp3 tTa, tRe tRe Ras64BV12 auf dem 2. Chromosom
  • SCHLUSSFOLGERUNGEN
  • Bei niedriger Temperatur besteht eine geringgradige Undichtigkeit, aber nur in einer Höhe von < 1% Ausreißern. Alle Versionen sind bei 29°C extrem wirksam. Dies ist wichtig, da viele der wichtigsten Targetspezies zur Kontrolle tropisch sind und in Kultur bei ca. 28°C gezüchtet werden, wie z. B. Ceratitis capitata, Anopheles gambiae und Aedes aegypti.
  • BEISPIEL 6:
  • Dieses Beispiel erläutert die maternale Transmission von Tc und der Tc-reprimierbaren Letalität unter Verwendung eines embryospezifischen Promotors.
  • MATERIALIEN UND VERFAHREN
  • PLASMIDKONSTRUKTION
  • Ein bnk-Promotor-Fragment von ca. 2 kb wurde aus dem Plasmid pW+ 2,8 kb bnk-Rescue-Fragment (Schejter und Wieschaus, (1993), Cell 75, 373–385) unter Verwendung von Oligonukleotid-Primern amplifiziert.
    5'-GCCGAGCTCTTGACGGTTGAAGTACGAATG-3' und
    5'-CGGCCATTCATATGCGTATATTCACTATG-3'. Dieses Fragment wurde mit einem SacI-XhoI-Fragment verdaut und als ein SacI-XhoI-Fragment zu pUHD15-1 subkloniert (Gossen und Bujard, (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5547–51). Ein XhoI-HpaI-Fragment, enthaltend bnk-tTa, wurde aus diesem zu pW8 (Klemenz et al., (1987), Nucl. Acids Res. 15, 3947–59) subkloniert, mit XhoI und HpaI zum Herbeiführen von pP{bnk-tTa} verdaut.
  • WTP-2 (Bello et al., (1998), Development 125, 2193–2202) wurde durch Zufügen von zwei komplementären Oligonukleotiden
    (5'-AATTGCCACCATGGCTCATATGGAATTCAGATCTG-3' und
    5'-GGCCGCAGATCTGATTCCATATGAGCCATGGTGGGC-3') zwischen den EcoRI und NotI-Orten zur Bereitstellung einer Konsensus-Translationsstartsequenz modifiziert (Kozak, (1987), Nucleic Acids Res. 15, 8125–48). Eine cDNA, die die gesamte Kodierungsregion eines Drosophila-Homologs von Nipp1 (Van Eynde et al., (1995), J. Biol. Chem. 270, 28068–74) in pNB40 (Brown und Kafatos, (1988) (J. Mol. Biol. 203, 425–437) enthält, wurde unter Verwendung des Verfahrens von Alphey, (1997), BioTech. 22, 481–486, basierend auf einer partiellen Sequenz, die durch ein Zweihybrid-Screen für PP1c-bindende Proteine von Drosophila (Alphey et al., (1997), J. Cell Biol. 138, 395–409) erhalten wurde, isoliert. Die gesamte Kodierungsregion und 3'-UTR wurden zwischen den NdeI- und NotI-Orten von WTP-2, modifiziert wie vorstehend, zum Herbeiführen von pP{tRe-Nipp1 Dm} kloniert.
  • DROSOPHILA-KULTUR
  • Die Fliegen wurden auf standardmäßigem Hefe-/Maismehl-/Agar-Futter mit einer Hefekonzentration von 45–50 gl–1 gezüchtet. Das Tc-enthaltende Futter wurde nach dem gleichen Rezept unter Zufügen von Tetracyclinhydrochlorid-Lösung (Sigma-Aldrich) bis zur entsprechenden Endkonzentration hergestellt.
  • HISTOCHEMIE
  • Die embryonale Nachkommenschaft von bnk-tTA/tRe-lacZ-Kreuzungen wurden in 12-stündigen Intervallen gesammelt und dann wie in Ashburner, (1989), Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laborstory Press, beschrieben, auf β-Galactosidase gefärbt.
  • ERGEBNISSE
  • MATERNALE TRANSMISSION VON TETRACYCLIN
  • Ein massengezüchteter Insektenstamm, der für ein dominantes letales Gen oder genetisches System homozygot ist, wird keine Nachkommenschaft haben, wenn er mit Wildinsekten gepaart wird. In dieser Beziehung ist die Wirkungszeit des letalen Gens irrelevant. Damit die massengezüchteten Insekten jedoch als Kontrollmittel nützlich sind, wird in Betracht gezogen, dass die Wirkungszeit von „dominantletal" sehr wichtig sein kann. Eine letale Phase im Erwachsenenalter kann die freigesetzten Adulten vor der Paarung abtöten oder ihre Fitness zumindest reduzieren. Dies wäre eindeutig kontraproduktiv. Viele landwirtschaftlichen Schädlinge schädigen Kulturpflanzen durch Fressen in ihren Larvenstadien. Es wäre deshalb wünschenswert, die Nachkommenschaft so früh wie möglich, bevorzugt als Embryos, abzutöten. Die Embryos fressen jedoch nicht und nehmen folglich keinen im Futter vorhandenen Repressor (Tetracyclin) vom letalen genetischen System auf. Die Insektenembryos sind auch für die meisten Makromoleküle impermeabel, folglich penetriert das exogene Tetracyclin nicht. Angesichts der Vorteile einer embryonalen letalen Phase wurde getestet, ob das von einer weiblichen Drosophila aufgenommene Tetracyclin in ihre Eier und folglich ihre Nachkommenschaft in ausreichender Konzentration übertreten könnte, um den Phänotyp eines Tc-reprimierbaren Gens zu supprimieren.
  • Es wurde ein Stamm von Drosophila verwendet, bei dem Weibchen, aber nicht Männchen, Tc zur Lebensfähigkeit benötigen. Die weibchenspezifische Letalität ist auf die Expression eines toxischen Gens (Ras64BV12, (Matsuo et al., (1997), Development 124, 2671–80) im Fettkörper von weiblichen Larven und Adulten zurückzuführen (Thomas et al., (2000), Science 287, 2474–2476). Das Züchten dieses Stammes auf Futter, ergänzt mit 0,1 μg/ml Tc, ist zur Suppression der Expression des toxischen Gens ausreichend, wobei sowohl Männchen als auch Weibchen überleben. Man ging dabei von der Überlegung aus, dass wenn Tc, das von einer weiblichen Drosophila aufgenommen wird, in ihre Eier und folglich ihre Nachkommenschaft übertreten könnte, es gegebenenfalls möglich sein könnte, die Eier mit einer ausreichend hohen Konzentration zu beladen, um das Überleben der Nachkommenschaft selbst auf Medium zu erlauben, dem das Tc mangelt. Es wurde festgestellt, wenn Eltern Futter fressen dürften, das mit Tc bei 500 μg/ml oder höher ergänzt ist, dass dies zum Überleben eines kleinen Anteils an weiblichen Nachkommen führen würde (Tabelle 1). Es wurden mehrere andere Linien und andere Promoter-Killergen-Kombinationen mit ähnlichen Ergebnissen (Daten nicht gezeigt) getestet. Es wurde daraus geschlossen, dass wenn einem Weibchen Tc gefüttert wird, es möglich ist, genügend Tc in ihre Nachkommenschaft einzuführen, um die tTa-abhängige Genexpression zu reprimieren.
  • EMBRYOSPEZIFISCHE EXPRESSION VON tTA
  • Von den vielen Genen, von denen bekannt ist, dass sie in Drosophila-Embryos exprimiert werden, wird der überwiegende Teil auch später exprimiert. Zum Beispiel werden die überall bekannten Entwicklungsgene, die an der Festlegung des grundlegenden Körperplans des Embryos beteiligt sind, später zur Musterbildung der Anhänge und der Imaginalscheiben, die die adulten Strukturen bilden, erneut verwendet. Für viele andere embryonale Gene wurde die Möglichkeit einer späteren Expression nicht eingehend genug untersucht. Bottleneck (bnk) stellt eine relativ kleine Anzahl von Genen dar, über die berichtet wurde, dass sie exklusiv in Embryos exprimiert werden. bnk ist für die Reorganisation des Actinfilaments während der Zellularisierung des Drosophila-Embryos zwischen den nuklearen Zyklen 13 und 14 erforderlich (Schejter und Wieschaus, (1993), Cell 75, 373–385). Sein Transkript liegt in hohen Mengen nur von den nuklearen Zyklen 11 bis 14 vor. Es wurden stabile transformierte Fliegenlinien konstruiert, die den offenen Leserahmen von tTa unter der Kontrolle eines bnk-Promotorfragments tragen. Die Fähigkeit des bnk-tTa zur Aktivierung der Transkription im Embryo und in anderen Entwicklungsstadien wurde unter Verwendung eines tTa-responsiven Reporter-Konstrukts, tRe-lacZ, überwacht (Bello et al., (1998), Development 125, 2193–2202). Es wurde festgestellt, dass das tTa-Protein im Embryo exprimiert wurde und es die Expression des Reporter-Konstrukts steuern könnte.
  • Die tTa-abhängige transkriptionale Aktivierung wird durch Tc reprimiert. tTa bindet an eine spezifische DNA-Sequenz, das Tetracyclin-responsive Element (tRe). Tc bindet an tTa, und dies verhindert die tTa-Proteinbindung an DNA. Deshalb wurde versucht, die Expression des Reporter-Gens entweder durch Ergänzung des Futters der Eltern mit Tc oder durch Ablegen der Embryos auf das mit Tc ergänzte Medium zu reprimieren. Die wirksame Repression der Reporter-Gene wurde dadurch erreicht, dass die Eltern mindestens zwei Tage vor dem Sammeln der Embryos auf Medium gebracht wurden, das 1 μg/ml Tc enthielt. Das Ablegen der Embryos auf Tc enthaltendes Medium schien sich nicht auf die Expression des Reporter-Gens auszuwirken. Diese Daten deuten darauf hin, dass Tc während der Oogenese über die Mutter in das Ei eindringen und sich auf die tTa-vermittelte Transkription in den frühen Entwicklungsstadien auswirken, Tc aber nicht aus dem Substrat, auf dem sie abgelegt sind, in Embryos diffundieren kann.
  • EIN IN EMBRYOS AKTIVES „KILLERGEN"
  • Zur Konstruktion eines maternalen Tc-abhängigen dominanten letalen genetischen Systems wurden Fliegen, die stabile Insertionen von bnk-tTa tragen, zu Fliegen gekreuzt, die Insertionen von tRe-Ras64BV12 tragen. Vorherige Studien haben gezeigt, dass tRe-Ras64BV12 in den späteren Stadien in Kombination mit einer Reihe von weibchenspezifischen und nicht geschlechtsspezifischen tTa-Linien (Thomas et al., (2000), Science 287, 2474–2476) toxisch ist. Embryos, die bnk-tTa und tRe-Ras64BV12 tragen, überlebten überraschenderweise bis zum Erwachsenenalter, ungeachtet der parentalen oder zygotischen Exposition gegenüber Tc (Tabelle 2; und Daten werden nicht gezeigt). Angesichts der vorstehenden embryonalen Reporter-Genexpression wurde geschlossen, dass die Expression von Ras64BV12 während der Periode, wenn bnk-tTa bei der Auslösung der embryonalen Letalität aktiv ist, nicht toxisch oder nicht ausreichend toxisch ist.
  • Da ektopem Ras64BV12 scheinbar die embryonale Toxizität unter den von uns verwendeten Bedingungen mangelt, wurde ein anderes toxisches Gen unter die Kontrolle von tRe gebracht. Es wurde die Verwendung von Nipp1 Dm, einem Drosophila-Homolog von Säuger-NIPP-1, einen nuklearen Inhibitor von Proteinphosphatase Typ 1 gewählt (Beullens at al., (1992), J. Biol. Chem. 267, 16538–16544; Van Eynde et al., (1995), J. Biol. Chem. 270, 28068–74). NIPP1 weist als „Killergen" in diesem System mehrere Vorteile auf. Fliegen, die homozygote Insertionen von bnk-tTa oder tRe-Nipp1 tragen, wurden miteinander gekreuzt. Fliegen, die auf mit Tc ergänztem Medium gefüttert wurden, produzierten eine lebensfähige F1-Nachkommenschaft; diejenigen auf nicht mit Tc ergänztem Medium produzierten keine (Tabelle 2). Darüber hinaus wurde das F1-Überleben nicht von der An- oder Abwesenheit von Tc im Medium, aus dem die F1 gezüchtet wurden, beeinflusst. Deshalb wurde ein durch das parentale Tc in der Ernährung reprimierbares effizientes dominantes letales genetisches System konstruiert.
    Figure 00460001
  • Ein für Insertionen von sowohl Yp3-tTA als auch tRe-Ras64BV12 auf dem zweiten Chromosom homozygoter Stamm wurde auf die Wirkung von parentalem Tc in der Ernährung getestet. 40–45 junge Weibchen und 20–25 junge Männchen, die bei 25°C nach der Futteraufnahme mit der angezeigten Tetracyclin-Ergänzung gezüchtet wurden, durften paaren und wurden dann nach 3–4 Tagen auf normales (Tetracyclin-freies) Futter transferiert. Diese Fliegen wurden jeden Tag für die Dauer von 12 Tagen in frische Fläschchen mit normalem Futter transferiert und dann am 13. Tag entfernt. Alle Fläschchen wurden, während sich die Nachkommenschaft entwickelte, bei 25°C inkubiert. Die Gesamtzahlen der männlichen und weiblichen Nachkommenschaft, die als Adulte schlüpften, wurden aufgezeichnet. Das Überleben der weiblichen Nachkommenschaft hängt eindeutig von der Tc-Konzentration ab, auf der ihre Eltern gezüchtet wurden und von der Länge der Zeit zwischen der Entfernung der Eltern aus dem Tc-Medium und der Eiablage.
    Tabelle 2. Tc-reprimierbare Letalität unter Verwendung eines embryospezifischen Promotors
    Tc (μg/ml) Männchen Weibchen
    bnk-tTa × tRe-Nipp1 Dm 0 0 0
    0,1 60 58
    1,0 78 82
  • Für bnk-tTa homozygote Männchen wurden mit für entweder tRe-Ras64BV12 oder tRe-Nipp1 Dm homozygoten Weibchen gepaart. Diese Fliegen wurden auf Tc-freiem Medium gezüchtet, wurden aber vor dem Paaren auf Futter mit verschiedenen Tc-Konzentrationen gebracht. Sie durften auf diesem Futter 9 Tage Embryos ablegen, und dann wurden die Eltern entfernt. Ihre adulte Nachkommenschaft von jedem Geschlecht wurde gezählt. In Kombination mit bnk-tTa ergibt tRe-Nipp1 Dm eine Tc-reprimierbare Letalität von beiden Geschlechtern, tRe-Ras64BV12 ergibt jedoch keine.
  • BEISPIEL 7: MODULARER TRANSFORMATIONSVEKTOR
  • Dieses Beispiel erläutert Einzelheiten der Konstruktion eines Vektors, der für die Transformation zur Herstellung eines Organismus, der das erfindungsgemäße letale genetische System enthält, geeignet ist.
  • Der Zweck dieses modularen Vektors besteht darin, dass er die schnelle Herbeiführung eines Transformationskonstrukts zulässt, das für eine gegebene Spezies geeignet ist. In diesem Beispiel ist die Herbeiführung eines „Dominant Repressible Lethal" beabsichtigt. Dies wird durch Insertieren eines geeigneten Promotors in dieses Konstrukt, dann seine Verwendung zur Transformation in die Targetspezies erreicht. Der Promoter leitet sich in der Regel von der Targetspezies selbst her, wobei es sich wahrscheinlich um den direktesten und sichersten Weg zur Gewährleitung handelt, dass der Promotor die gewünschte Spezifität (z. B. weibchenspezifisch) in der Targetspezies aufweist. Dies ist jedoch nicht notwendig und im nachstehenden Beispiel wurde tatsächlich ein modifizierter Actin-Genpromotor vom Seidenspinner Bombyx mori mit der Absicht verwendet, ihn im rosaroten Baumwollkapselwurm, einem Schädling der Baumwolle, zu verwenden.
  • PiggyBac wurde erfolgreich zur Transformation einer breiten Reihe verschiedener Insekten, einschließlich Diptera, Coleoptera und Lepidoptera, verwendet, dies ist jedoch nicht unbedingt optimal, noch wird Act5C-EGFP in jedem Fall den optimalen Transformationsmarker darstellen. Das Plasmid wurde dergestalt konstruiert, dass die Kernelemente des Systems (tTa, tRe-Nipp1 und Isolatoren) durch einzigartige Orte für selten-schneidende („rare-cutting") Restriktionsenzyme (NotI und den multiplen Klonierungsort von SbfI-PmeI-AscI) zur Förderung der Subklonierung dieser Elemente zu einem neuen Transformationsvektor flankiert werden. Auf ähnliche Weise könnten alternative Isolatoren verwendet oder ein zusätzlicher Isolator bei 5' vom neuen Promoter zum Schutz gegen Positionswirkungen vom flankierenden Chromatin insertiert werden.
  • Das allgemeine Arrangement des Vektors ist in 1 ersichtlich und die Elemente sind wie folgt:
    tTa umfasst: den offenen Leserahmen von tTa und SV40-PolyA-Signal, beide aus pUHD15-1neo (Gossen und Bujard, 1992) als EcoRI-BamHI. pUHD15-1 wurde mit XhoI und EcoRI verdaut und ein Oligo-Paar insertiert, das diese beiden Orte zerstörte und einen AscI-Ort herbeiführte. Dieses Plasmid (pUHD15Asc) wurde mit HpaI und BamHI verdaut und ein anderes Oligo-Paar insertiert:
    tTa 3'-Linker+
    5'-gcggccgc ac gggccc a ctcgag cac aagctt c ggtacc ac gaattc-3' (SEQ ID NO: 2)
    tTa 3'-Linker–
    5'-agct gaattc gt ggtacc g aagctt gtg ctcgag a gggccc gt gcggccgc-3' (SEQ ID NO: 3)
    zum Herbeiführen von pUHD15Asc3'-Linker#42.
  • tRe-Nippt Dm umfasst: den tRe-Vektor WTP-2 von Bruno Belle (Belle et al., (1998), Development 125, 2193–2202), modifiziert durch Insertion vom Oligo-Paar „Kozak Spe +/– „zwischen dem EcoRI- und NotI-Ort, um pWTP-KozakSpe zu geben. Dies stellt die Konsensus-Translationsstartsequenz bereit.
    Kozak Spe+/–: 5'-aattgccaccatggaattcactagtgc-3' (SEQ ID NO: 4)
    3'-cggtggtaccttaagtgatcacgccgg-5' (SEQ ID NO: 5)
  • Nipp1 Dm-cDNA in pNB40 (Brown und Kafatos, (1988), J. Mol. Biol. 203, 425–437), modifiziert, um einen EcoRI-Ort am Startcodon aufzuweisen, danach subkloniert als EcoRI-{am Ende aufgefülltes NotI} in mit EcoRI und StuI geschnittenes pWTP-KozakSpe. tRe-Nipp1 Dm-hsp70-PolyA-Fragment, ausgeschnitten als partielles XhoI-HindIII und subkloniert zu pUHD15Asc3'-Linker#43, geschnitten mit XhoI und HindIII, um ptTatReNipp1#77 zu ergeben. Die komplette vorhergesagte Sequenz dieses Fragments ist angehängt. Nipp1 Dm-DNA kann ohne weiteres durch RT-PCR oder PCR aus genomischer DNA unter Verwendung dieser Sequenz hergestellt werden.
  • PiggyBac und der Plasmidvektor leiten sich von p3E1.2-white (Handler et al., (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 7520–5) von Al Handler her. Das white-Gen der Fruchtfliege, das ursprünglich als ein NotI-Fragment in den HpaI-Ort von piggyBac, unter Verwendung von Linkern, insertiert wurde, wurde durch Verdau mit NotI entfernt und rezirkularisiert. Ein Set von Vektorsequenzen von extranen Restriktionsorten (außerhalb von piggyBac) wurde durch Verdau mit EcoRI und SalI, Auffüllen am Ende und Rezirkularisieren entfernt, wobei sich p3E1ΔRI-Sal ergibt Dieses Plasmid wurde dann mit BgIII und NotI verdaut und ein Oligopaar insertiert, um nützliche Restriktionsorte zuzufügen:
    piggy-Linker 2+/–: 5'-ggcc ctcgag aga aggcct gcggccgc tgt ggcgcgcc aga gtttaaac agt cctgcagg-3' (SEQ ID NO: 6)
    3'-gagctc tct tccgga cgccggcg aca ccgcgcgg tct caaatttg tca ggacgtcc ctag-5'(SEQ ID NO: 7)
    das sich ergebende Plasmid stellt den pPB-Linker2 #93 dar.
  • Der Act5C-EGFP-Transformationsmarker wurde durch Subklonieren als ein 4,2 kb großes XhoI-EcoRV-Fragment von Act5C-EGFP in pP{CaSpeR} (Jean-Marc Reichhart) in den XhoI-StuI geschnittenen pPB-Linker 2 zugefügt, um pPB-Act5CEGFP#181 zu ergeben.
  • Der HS4-Isolator wurde durch Schneiden von pJC13-1 (Chung et al., (1993), Cell 74, 505–14) von Gary Felsenfeld mit BamHI zugefügt und zur Entfernung des neo-Reporters rezirkularisiert, danach wurde ein HS4-Dimer (2 × 1,2 kb = 2,4 kb insgesamt) als (am Ende aufgefülltes SalI}-KpnI ausgeschnitten und in ptTatReNipp1#77 subkloniert und sequenziell mit HindIII, Klenow-DNA-Polymerase und KpnI (d. h. mit KpnI-kohäsivem Ende – am Ede aufgefülltem HindIII) inkubiert, um ptTatReNipp1HS4#101 zu ergeben.
  • Der apoB-Isolator wurde durch Änderung des SpeI-Ortes von apoB3'MAR (Namciu et al., (1998), Mol. Cell. Biol. 18, 2382–91) von Stephanie Namciu zu ApaI unter Verwendung des Oligo-SpeI-ApaI zugefügt:
    SpeI-ApaI: CTAGAAGGGCCCTT (SEQ ID NO: 8)
  • Der apoB-Isolator wurde dann als ein 0,8 kb großes ApaI-NotI-Fragment zu ApaI-NotI verdautem ptTatReNipp1HS4#101 subkloniert.
  • Ein AscI-NotI-Fragment von ptTatReNipp1HS4#101 wurde zu pPB-Act5CEGFP#181 subkloniert, um pRIDL#204 zu ergeben.
  • BEISPIELE ZUM INSERTIEREN EINES PROMOTORS:
    • 1) Ein BmA3-Promotorfragment von ca. 190 bp wurde mittels der PCR aus pJP88 (John Peloquin) (Peloquin et al., (2000), Insect Mol. Biol. 9, 323–33) unter Verwendung von Platin-Pfx-Polymerase (Life Technologies) und den Oligos wie folgt amplifiziert: BmA3 5': 5-aaacAATTCTGATAGCGTGCGCGTTAC-3' (SEQ ID NO: 9) BmA3 3'Asc-2: 5'-ggtaggcgcgcc TGGCGACCGGTGGATCCGAATG-3' (SEQ ID NO: 10) Dieses PCR-Produkt wurde mit AscI verdaut und in AscI-PmeI verdautes pRIDL#204 subkloniert, um pRIDL-BmA3 zu ergeben.
    • 2) An Vgl-Promotorfragment von Aedes aegypti, das zuvor verwendet wurde, um eine weibchenspezifische Expression in der Gelbfiebermücke Aedes aegypti unter Verwendung von Platin-Pfx-Polymerase (Life Technologies) und den Oligos wie folgt zu erhalten: Aedes vg5' aaac gaattcaccaccaggcagtg (SEQ ID NO: 11) Aedes vg3'AscI ggaggcgcgcc tcaagtatccggcagctgttc (SEQ ID NO: 12) Dieses PCR-Produkt wurde mit AscI verdaut und zu AscI-PmeI verdautem pRIDL#204 subkloniert, um pRIDL-A.a.Vg1 zu ergeben.
  • DIE VORHERGESAGTE SEQUENZ VON tRE-Nipp1. (XhoI-HindIII)
  • Sich von WTP-2 herleitendes nt 1-543 (Bello et al., (1988), Development 125: 2193,), von dem 1-309 sieben Wiederholungen der tet-Operator-Sequenz (tetO) enthält, gefolgt von 98 nt des Core-Promotors der P-Element-Transposase, von Carnegie 4, –52/+51 relativ zum Transkriptionsstart, verknüpft mit einem SmaI-PstI-Linker (synthetisches Oligonukleotid, GGGCTGCAG) mit der Leadersequenz von hsp70 von CaSpeR-hs (Thummel und Pirrotta, (1991), Dros. Inf. Neves. 2,) bis zum EcoRI-Ort ihres Polylinkers. Der nächste Abschnitt leitet sich von einem synthetischen Oligonukleotid her und stellt einen Konsensus-Translationsstart und einige Restriktionsorte bereit, gefolgt von der Kodierungsregion von Nipp1 und 3'-UTR von Drosophila an die PolyA-Sequenz aus einer unveröffentlichten cDNA in pNB40 (Brown und Kafatos, (1988), J. Mol. Biol. 203: 425) bis zum NotI-Ort, der am Ende aufgefüllt und in einen StuI-Ort kloniert wurde. Der StuI-Ort und die sich anschließende Sequenz stammt von WTP-2 und leitet sich von CaSpeR-hs her, es handelt sich hauptsächlich um die Trailer-Sequenz (3'-UTR) von hsp70, flankiert von einigen Restriktionsorten. (SEQ ID NO: 1)
    Figure 00510001
  • BEISPIEL 8: MODELLE DER INSEKTENKONTROLLE
  • VERFAHREN
  • Thomas et al. (Science 287, 2474–2476, 2000) legten ein einfaches mathematisches Modell zur Wirksamkeit der Insektenkontrollprogramme vor, einschließlich SIT und verschiedener Formen von „RIDL" (= „Release of Insects carrying a Dominant Lethal" – hierin verwendet, um den Organismus und das erfindungsgemäße Verfahren anzuzeigen) und erwähnten, dass verbesserte Systeme auch in Erwägung gezogen werden könnten, einschließlich freigesetzter Männchen, die für DFLs („Dominant Female Lethals") homozygot sind, an multiplen nicht verknüpften Loci und Verknüpfung der DFL mit einem meiotischen Antriebs-/Segregationsdistorsionssystem (Thomas et al., 2000, Science 287, 2474–2476). Es wurde hier die Auswirkung dieser und anderer Systemenhancements auf die Wirksamkeit der Insektenkontrolle in Erwägung gezogen.
  • Im Allgemeinen wird angenommen, dass alle Kontrollprogramme eine konstante Anzahl an Männchen pro Schädlingsgeneration freisetzen (siehe nachstehend). Diese Anzahl („Input") wird relativ zur initialen männlichen Schädlingspopulation angegeben. Das Modell berücksichtigt diskrete Generationen.
  • Es wird angenommen, dass Weibchen ihre Paarungspartner proportional zu ihrer Fülle und Fitness dergestalt auswählen, dass ein Weibchen einen Paarungspartner des Typs i mit einer Wahrscheinlichkeit pi dergestalt wählt, dass: pi = niri/(Sjnjrj)worin ni die Zahl der männlichen Insekten des Typs i darstellt und ri die Fitness des Typs i relativ zu Wildtypmännchen darstellt, von denen vorausgesetzt wird, dass sie eine Fitness von 1 aufweisen. Der Insektentyp kann sowohl von seinem Gentyp als auch seiner Generation abhängen – insbesondere berücksichtigt werden Szenarios, in denen freigesetzte Fliegen eine reduzierte Fitness aufweisen, aber ihre männlichen Nachkommen, ungeachtet des Gentyps, die gleiche Fitness wie Wildtypmännchen aufweisen.
  • Es werden zwei Szenarios zur Fertilität in Betracht gezogen. Im dichteabhängigen Fall wird angenommen, dass jedes Weibchen, das mit einem fertilen Männchen paart, R0 weibliche Nachkommen produziert – von denen der Anteil si bis zum Erwachsenenalter überlebt, wobei si gegeben ist durch: si = 1/(1 + (aoi)b)worin oi die Zahl der Nachkommenschaft darstellt, die bis zu dem Punkt überlebt, an dem die Dichteabhängigkeit wirkt (Maynard Smith und Slatkin, 1973 Ecology 54, 384–391), und a und b Parameter darstellen. Rogers und Randolph (1984 Insect Sci. Applic. 5, 419–23) betrachten ein solches dichteabhängiges System mit einem SIT-Programm und zeigen, dass die Wirksamkeit des SIT-Programms weitgehend von der natürlichen Widerstandsfähigkeit der Targetinsektenpopulation bestimmt wird, die durch den Parameter b charakterisiert ist (Rogen and Randolph, 1984 Insect Sci. Applic. 5, 419–23). Eine wichtige Erwägung stellt der richtige Zeitpunkt der dichteabhängigen Mortalität dar, insbesondere aber, ob die freigesetzten Männchen vor oder nachdem der dichteabhängige Mechanismus wirkt, freigesetzt werden und ob die RIDL-induzierte Mortalität, vor oder nachdem der dichteabhängige Mechanismus wirkt, erreicht wird. In Abwesenheit von Kontrolle bleibt eine solche Population konstant, wenn sie die Kapazität (si = 1/R0) trägt und tendiert zur Rückkehr auf diese Höhe, wenn sie gestört wird. Dies würde ein geeignetes Modell für eine etablierte Population darstellen. Dies bedeutet nicht unbedingt, dass keine Kontrolle versucht wurde – Kontrollverfahren, wie zum Beispiel die Elimination von Brutorten, reduziert mehr die stabile Höhe der Population als die Größe der Population relativ zur stabilen Höhe.
  • Im dichteabhängigen Fall wird angenommen, dass jedes Weibchen, das mit einem fertilen Männchen paart, eine R0 weibliche Nachkommenschaft produziert, die alle bis zum Erwachsenenalter in der nächsten Generation überleben. Dies stellt im Wesentlichen die Grenze des dichteabhängigen Falls dar – wobei die Population so klein ist, dass im Wesentlichen keine dichteabhängige Mortalität auftritt und si ≈ 1 darstellt. In Abwesenheit einer Kontrolle, wenn R0 größer als 1 ist, nimmt die Population folglich exponentiell zu. Dies würde ein geeignetes Modell für eine Neueinführung oder einen Ausbruch einer Schädlingsspezies oder eine Population, die sich von einer schwergradigen Depletion erholt, z. B. aufgrund eines kurzen intensiven Kontrollprogramms, das zur Reduktion der Targetspezieszahlen vor einem RIDL- oder SIT-Programm bestimmt ist, darstellen.
  • Für ein sehr einfaches System mit keiner Dichteabhängigkeit, R0 gleich 2 und einem Input of 1,5 sterilen Männchen in jeder Generation, würde das Modell zum Beispiel auf die folgende Weise funktionieren:
    • (i) Die initiale Population besteht zu gleichen Teilen aus Wildtypmännchen und Wildtypweibchen. Alle Zahlen werden relativ zur initialen weiblichen Population gezählt, folglich ist diese definitionsgemäß 1,0 und die initiale männliche Wildttyppopulation liegt hier auch bei 1,0. Da nur Populationen berücksichtigt werden, die in der Regel gleiche Zahlen von Männchen und Weibchen aufweisen, beträgt die initiale Population von Männchen in diesen Beispielen immer 1,0;
    • (ii) es wird ein Input von 1,5 sterilen Männchen vorgenommen, das heißt 1,5-mal so viele Männchen wie Weibchen in der initialen Population;
    • (iii) 60% der Weibchen paaren mit sterilen Männchen (da von den 2,5 Männchen 60% steril sind) und keine Nachkommen produzieren. 40% der Weibchen paaren mit Wildtypmännchen, um 0,8 weibliche Nachkommen zu produzieren (0,8 = R0·(0,4·1) Weibchen, die mit Wildtypmännchen paaren). Sie produzieren auch 0,8 männliche Nachkommen;
    • (iv) folglich besteht die zweite Generation zu gleichen Teilen aus Wildtypmännchen und -weibchen (je 0,8);
    • (v) es wird ein Input von 1,5 sterilen Männchen vorgenommen;
    • (vi) 65% der Weibchen paaren mit sterilen Männchen (da von den 2,3 Männchen 65% steril sind) und keine Nachkommen produzieren. 35% der Weibchen paaren mit Wildtypmännchen, um 0,56 weibliche Nachkommen zu produzieren (0,56 = R0·(0,35·0,8) Weibchen, die mit Wildtypmännchen paaren). Sie produzieren auch 0,56 männliche Nachkommen;
    und so weiter, bis die Population eliminiert ist.
  • SIT
  • In jedem Fall wird die Wirksamkeit verschiedener Versionen des RIDL-Systems mit der von SIT verglichen. Für SIT wird ein optimaler Fall mit perfekter Geschlechtstrennung und 100% Sterilität in Erwägung gezogen. Eine solche SIT stellt selbst ein hoch wirksames Kontrollverfahren dar, und es wurde auch die Höhe berücksichtigt, die die Population in Abwesenheit von jedweder Kontrolle erreicht hätte, es wird jedoch gezeigt, dass verschiedene Versionen von RIDL viel wirksamer sind, und dass es viele Situationen gibt, in denen RIDL eine Schädlingspopulation kontrollieren kann, während SIT nicht dazu in der Lage ist. Diese Modelle berücksichtigen nicht einige zusätzliche Vorteile von RIDL, wie zum Beispiel die größere Leichtigkeit des Transports des Systems an eine neue Spezies (siehe Vektor von Beispiel 7).
  • INPUT
  • Im Allgemeinen wird vorausgesetzt, dass alle Kontrollprogramme eine konstante Anzahl von Männchen pro Schädlingsgeneration freisetzen. Diese Zahl („Input") wird relativ zur initialen männlichen Schädlingspopulation angegeben. Eine potenzielle RIDL-Strategie beinhaltet die Freisetzung einer gemischtgeschlechtigen Population, in der Kenntnis, dass ein Geschlecht durch die letale Wirkung eines geschlechtsspezifischen letalen genetischen Systems an einem späteren Zeitpunkt in ihrem Lebenszyklus, z. B. vor der Geschlechtsreife, abgetötet wird. In dem Fall, in dem diese Individuen eine dichteabhängige Mortalität in ihren Artgenossen induzieren können (6a und 7a), wird angenommen, dass eine gleiche Zahl von Weibchen zusätzlich zu den Männchen freigesetzt wird.
  • Die Fähigkeit zur Freisetzung in jedem Stadium des Lebenszyklus lässt eine andere Strategie zu, bei der Individuen in einem dormanten Zustand gelagert werden, dann simultan freigesetzt werden, wodurch eine größere Freisetzung erlaubt wird als dies anderweitig der Fall wäre. So können zum Beispiel Embryos von vielen Stechmückenspezies über Monate hinweg unter relativ trockenen Bedingungen mit wenig Verlust der Lebensfähigkeit gelagert werden, die dann schlüpfen und die Larvenentwicklung induziert wird, indem sie einfach in ein wässriges Milieu gebracht werden. Ein bedeutender Vorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass eine Massenzuchteinrichtung während des Winters weiter betrieben werden könnte, während sich die Targetinsekten in einer Diapause befinden und folglich gegenüber einer sterilen Freisetzung unempfindlich sind. Im Frühling könnte dann eine viele größere Freisetzung stattfinden, wobei die gelagerten Embryos aus mehreren Generationen eingesetzt werden können. Hier beschäftigen wir uns mit den Konsequenzen der Lagerung von zwei Generationen an Betriebsleistung und die Verwendung derselben zum Verdoppeln der Größe der ersten beiden Freisetzungsgenerationen (8). Obwohl die Fähigkeit zur Lagerung von Embryos für RIDL nicht spezifisch ist, müsste ein SIT-Programm diese Embryos in der Regel bis zu einem späteren Entwicklungsstadium züchten, um sie durch Bestrahlung sterilisieren zu können. Da wahrscheinlich mehr der Zuchtraum in der Betriebsanlage und nicht so sehr die Verfügbarkeit von Embryos einen limitierenden Faktor darstellt, ist das Potenzial eines RIDL-Programms zur Freisetzung in jedem Stadium des Lebenszyklus für diese neue Strategie kritisch. In 8 wird trotzdem der Vorteil, den eine solche Freisetzungsstrategie einem üblichen SIT-Programm verleihen würde, in Erwägung gezogen. Jede der Kurven in 8 basiert auf einer früheren Kurve mit einer Freisetzung der doppelten Größe in den ersten beiden Generationen. Zum Vergleich mit der üblichen SIT ohne eine solche Freisetzung der doppelten Größe sollten diese Kurven mit den früheren Figuren, aus denen sie hergeleitet sind, verglichen werden.
  • LETALE PHASE UND VERWENDUNG EINES MULTIPHASEN-LETALSYSTEMS (MPLS)
  • Wenn die Anforderung einfach darin besteht, die gesamte Nachkommenschaft oder die gesamte Nachkommenschaft eines Geschlechts abzutöten, dann ist die letale Phase nicht wichtig. Es wird jedoch in Erwägung gezogen, dass die Manipulation der embryospezifischen Letalität mehrere Vorteile mit sich bringt. Die letale Phase muss vor dem Entwicklungsstadium, in dem die Insekten freigesetzt werden, enden oder sie könnten ihre Fitness verlieren oder sterben, sobald der Repressor, z. B. nach der Freisetzung, entzogen wurde. Die embryonale Letalität gewährleistet, dass keine Larven zur Schädigung der Kulturpflanzen oder Tiere schlüpfen. Dies könnte im Fall von Krankheitsvektoren, wie zum Beispiel Stechmücken, wo nur die adulten Stadien die Krankheit übertragen, nicht wichtig sein, ist aber im Fall vieler Kulturpflanzenschädlinge eindeutig kritisch, wo es sich um die fressgierigen Larven handelt, die den wirtschaftlichen Schaden anrichten. Die embryospezifische Letalität erlaubt, dass die letzte und größte massengezüchtete Generation auf Futter gezüchtet wird, dem der Repressor mangelt, wobei die Kosten und jedwede mit großen Tc-Mengen assoziierten Umweltgefahren reduziert werden. Die embryospezifische Letalität (oder eine andere frühe Letalität) kann auch mit späterer geschlechtsspezifischer Letalität, z. B. der weibchenspezifischen Letalität, kombiniert werden. Es wurde nachgewiesen, dass dies die Konstruktion eines Stammes zulässt, bei dem sowohl die Geschlechtstrennung als auch „Sterilisation" automatische Konsequenzen des Entzugs von Tc aus der letzten Generation vor der Freisetzung darstellen. Dieses System wird als ein Multiphasen-Letalsystem (MPLS) bezeichnet, um darauf hinzuweisen, dass es zwei verschiedene letale Phasen mit verschiedenen Eigenschaften gibt. In vielen Zucht-/Verteilungsszenarios scheint die Genetik eines solchen Systems ähnlich der einer eingeschlechtigen Freisetzung von durch Bestrahlung sterilisierten Männchen zu sein, insofern, dass nur Männchen erreicht werden und sie bei einer Paarung mit freilebenden Männchen in der natürlichen Umgebung keine lebensfähige Nachkommenschaft aufweisen. Es bestehen jedoch zwei bedeutende Vorteile, die den nachstehenden Modellen entnommen werden können. Erstens wurden die MPLS-Männchen natürlich nicht bestrahlt und erleiden folglich als Folge der Bestrahlung keinen Verlust der Fitness und der Langlebigkeit. Da zweitens die Anforderung nur darin besteht, dass die beiden (oder mehr) letalen Phasen nicht überlappen, damit nicht eine von ihnen für Embryos spezifisch ist, könnte veranlasst werden, dass die erste letale Phase nach der dichteabhängigen Mortalitätsphase in der Wildpopulation kommt. Im Fall von Stechmücken ist es zur Verhinderung der Transmission der meisten von Stechmücken übertragenen Krankheiten z. B. Malaria, Dengue-Fieber, Gelbfieber) zum Beispiel nur notwendig zu verhindern, dass die Weibchen ihre zweite Blutmahlzeit einnehmen. Das Abtöten der Weibchen als Puppen, schlüpfende Adulte oder kurz nach ihrer ersten Blutmahlzeit wäre folglich geeignet. Die frühere nicht geschlechtsspezifische letale Phase muss nur früher als diese liegen und könnte deshalb zum Beispiel so spät wie im frühen Erwachsenenalter auftreten. Als Alternative wäre eine erste letale Phase in der späten Larven-/Puppenentwicklung möglich. Für alle diese Stufen geeignete Promotoren – die Blutmahlzeit induzierbare Gene zum Abtöten nach der Blutmahlzeit usw. – sind überall bekannt. Unter Verwendung einer letalen Phase, die erst später als eine dichteabhängige Mortalitätsphase in der Wildpopulation wirkt, bedeutet, dass Individuen, die aufgrund der letalen Wirkung des RIDL-Systems später sterben, dennoch mit ihren Wildtypartgenossen um Ressourcen konkurrieren und folglich zur Erhöhung der Mortalität dieser Wildtypartgenossen tendieren.
  • In den nachstehenden grafischen Darstellungen ergeben SIT und MPLS, sofern nicht anderweitig angegeben, die gleichen Ergebnisse.
  • VERKNÜPFUNG DER DFL MIT EINEM MEIOTISCHEN ANTRIEBS-/SEGREGATIONSDISTORSIONSSYSTEM
  • Das meiotische Antriebssystem wirkte zur Verstärkung der Wirksamkeit des RIDL-Systems (2). Die meiotischen Antriebssysteme von variierender Wirksamkeit sind in einer breiten Reihe verschiedener Spezies, einschließlich Drosophila und Stechmücken bekannt. In der normalen Mendelschen Vererbung wird jedes der beiden Homologen eines bestimmten Chromosoms mit gleicher Wahrscheinlichkeit vererbt, d. h. jedes besitzt eine 50%ige Chance, dass es durch jede individuelle Nachkommenschaft vererbt wird. Die Folge eines meiotischen Antriebs-/Segregationsdistorsionssystems besteht darin, dass ein Chromosom präferenziell vererbt wird. Es wurde diese Wirkung durch Berücksichtigung von Systemen untersucht, in denen das Chromosom, das das RIDL-System trägt, präferenziell durch die Nachkommenschaft von Heterozygoten, die dieses Chromosom tragen und seinem Homolog aus der Wildpopulation vererbt wird. Da meiotische Antriebs-/Segregationsdistorsionssysteme hinsichtlich der Wirksamkeit variieren, wurden die Vererbungsfrequenzen von 50% (d. h. kein meiotischer Antrieb/keine Segregationsdistorsion), 60%, 70%, 80%, 90% und 100% in Betracht gezogen. Höhere Vererbungsfrequenzen machen das RIDL-System immer wirksamer.
  • FREIGESETZTE MÄNNCHEN, DIE FÜR DFLs AUF MULTIPLEN CHROMOSOMEN HOMOZYGOT SIND
  • Im Gegensatz zu SIT kann der Impakt eines RIDL-Systems durch die Steigerung der Kopienzahl des Systems im Rahmen der freigesetzten Individuen potenziell erhöht werden. Es wurden die Konsequenzen einer Freisetzung von Männchen in Erwägung gezogen, die für ein „Dominant Femalespecific Lethal" (DFL) an einem, zwei oder drei nicht verknüpften Locus/Loci homozygot sind. Es wurde festgestellt, dass freigesetzte Männchen mit multiplen DFL-Chromosomen die Populationsgröße wirksamer kontrollieren (3).
  • REDUZIERTE FITNESS
  • 4 und 5 zeigen die Wirkungen der reduzierten Fitness auf SIT- und RIDL-Systemen (mit meiotischem Antrieb und multiplen Chromosomensystemen). Eine reduzierte Fitness bei freigesetzten Männchen reduziert offensichtlich die Wirksamkeit dieser Kontrollsysteme. In 4b und 5b wird angenommen, dass RIDL-Männchen die zweifache der kompetitiven Paarungsfitness von SIT-Männchen aufweisen. Hierbei handelt es sich um eine sehr konservative Schätzung. Die Bestrahlung reduziert die kompetitive Paarungsfähigkeit der bestrahlten Insekten (um schätzungsweise das Zweifache im Fall der Fruchtfliege) und reduziert auch ihre Langlebigkeit (um schätzungsweise das 2- bis 5fache im Fall der Fruchtfliege). Dies reduziert die kompetitive Paarungsfähigkeit insgesamt um schätzungsweise das 4- bis 10fache im Fall der Fruchtfliege, mehr im Fall des rosaroten Baumwollkapselwurms, weniger im Fall der Schraubenwurmfliege. Ein insgesamt zweifacher Vorteil für die nicht bestrahlten RIDL-Fliegen gegenüber ihren bestrahlten SIT-Äquivalenten stellt deshalb eine sehr konservative Schätzung dar. Es wurde festgestellt, dass selbst dieser Vorteil hinsichtlich der Kosten und Wirksamkeit eines Kontrollprogramms extrem signifikant ist (4b und 5b).
  • DICHTEABHÄNGIGKEITSMECHANISMUS
  • Es werden drei Szenarios in Betracht gezogen:
    • (a) Die dichteabhängige Mortalität wirkt vor der RIDL-induzierten Mortalität und wirkt auf neu freigesetzte RIDL- oder SIT-Insekten;
    • (b) die dichteabhängige Mortalität wirkt vor der RIDL-induzierten Mortalität, aber wirkt nicht auf neu freigesetzte RIDL-Insekten, und
    • (c) die dichteabhängige Mortalität wirkt nach der RIDL-induzierten Mortalität, aber wirkt nicht auf neu freigesetzte RIDL-Insekten.
  • Modelle von Szenario (a) von einer adulten letalen Phase und der dichteabhängigen Mortalität, die auf dem Niveau von Adulten wirkt. Eine adulte letale Phase für RIDL könnte gegebenenfalls für Malariavektoren geeignet sein, wo die Weibchen erst innerhalb von einer Woche nach ihrer ersten Blutmahlzeit abgetötet werden müssen, um eine Übertragung der Krankheit zu verhindern. Als Alternative untersucht dieses Szenario auch Modelle einer früheren Freisetzung und dichteabhängigen Stufe, die für RIDL zur Verfügung steht, wo die Freisetzungspopulation in jedem Stadium des Lebenszyklus freigesetzt werden kann, aber nicht für SIT, wo vor der Freisetzung (gegebenenfalls) eine Geschlechtstrennung und Bestrahlung durchgeführt werden müssen, wobei der Bereich der Stadien des Lebenszyklus, in dem sie freigesetzt werden können, beschränkt ist.
  • Szenario (b) stellt einen sehr wichtigen und neuen Fall dar. Dieses stellt eine dichteabhängige Mortalität dar, die vor der RIDL-induzierten Mortalität wirkt. Im Fall von Stechmücken stellt der Wettbewerb zwischen Larven um Ressourcen eine wahrscheinliche Stufe für die dichteabhängigen Wirkungen dar. Die RIDL-induzierte Mortalität kann sicher später als diese eintreten, da nur die adulten Weibchen die Krankheit übertragen. Eine solche Mortalität konnte unter Verwendung eines spät wirkenden Promotors, wie zum Beispiel dem vom Vitellogeningen (für die weibchenspezifische Mortalität) im Vektor von Beispiel 7 erreicht werden. Diese Strategie ist auch unter Verwendung eines Multiphasen-Letalsystems (MPLS) möglich, in dem die nicht geschlechtsspezifische letale Stufe später eintritt als die dichteabhängige Mortalität. Für SIT steht keine äquivalente Strategie zur Verfügung.
  • Szenario (c) stellt die Freisetzung in einem späten Stadium des Lebenszyklus, wie z. B. bei Adulten und einer früh durch RIDL induzierten Letalität, wie z. B. Embryos dar. Die dichteabhängige Mortalität liegt zwischen diesen. Dies könnte gegebenenfalls einige Kulturpflanzen fressende landwirtschaftliche Schädlinge darstellen, bei denen die Larvenstadien den Schaden anrichten und somit wäre es unangemessen, diese Stadien freizusetzen oder zu veranlassen, dass die RIDL-induzierte Mortalität so spät eintritt, dass die Larven bereits einigen Schaden angerichtet haben, bevor sie sterben. Im Gegensatz zu Szenarios (a) und (b) weist RIDL unter diesem Szenario keinen speziellen sich vom Lebenszyklus herleitenden Vorteil gegenüber SIT auf.
  • 6 und 7 erläutern die Vorteile der Verzögerung der RIDL-induzierten Mortalität bis nach der dichteabhängigen Mortalität ebenso wie das Potenzial des weiteren Vorteils der Freisetzung von Insekten (sowohl Männchen als auch Weibchen) vor der dichteabhängigen Mortalität. Diese grafischen Darstellungen erläutern weiter die von meiotischen Antriebssystemen und multiplen Chromosomen-DFL-Systemen zu gewinnenden Vorteile. 6b, 6c, 7b and 7c geben zu erkennen, dass SIT tatsächlich zu einer Population von höherer Stabilität führen kann als dies bei Abwesenheit des Kontrollprogramms der Fall gewesen wäre. Auf diese Wirkung wurde zuvor von Rogers und Randolph (Rogers und Randolph, 1984 Insect Sci. Applic. 5, 419–23) aufmerksam gemacht.
  • ALLGEMEINE PUNKTE
  • Für ein angenommenes Produktivitäts- und Mortalitätsmuster ist es leicht vorherzusagen, dass Zunahmen des meiotischen Antriebs die Wirksamkeit verbessern, Zunahmen der Anzahl von Loci mit DFL die Wirksamkeit verbessern und die Fitness bei freigesetzten Männchen reduzieren, im Vergleich zu Wildtypmännchen, die die Wirksamkeit vermindern. Das Modell weist jedoch auf die relative Auswirkung dieser Änderungen bin und weist am wichtigsten darauf hin, dass die reduzierte Fitness einfach wirken kann, um die Kontrolle einer Insektenpopulation zu verlangsamen, aber es kann auch bedeuten, dass die Insektenpopulation nicht ohne einen größeren Input von RIDL- oder SIT-Männchen eliminiert werden kann. Auf ähnliche Weise können erhöhte meiotische Antriebe zur Verbesserung eines bestimmten Systems, das zur Elimination einer Insektenpopulation ausreichend ist, die mit einem meiotischen Antrieb von 50% nicht eliminiert worden wäre. Darüber hinaus sind nicht alle die Ergebnisse intuitiv offensichtlich. Die Möglichkeit, dass SIT faktisch zu einer höheren stabilen Population führen kann als dies in Abwesenheit des Kontrollprogramms der Fall gewesen wäre, wurde vorstehend erwähnt. Außerdem geht deutlich hervor, dass unter einigen Umständen die Wildpopulation während der frühen Stufen des Kontrollprogramms faktisch ansteigen und dennoch in langer Sicht noch eradiziert werden kann. In 2b ist die Population zum Beispiel mit einem 70%igen meiotischem Antrieb höher als seine initiale Höhe von Generation 1 bis Generation 7, dennoch wird sie letztendlich noch kontrolliert.
  • Man sollte darauf achten, dass in mehreren der grafischen Darstellungen die im Schlüssel gezeigte lange Strichlinie in der Kurve als durchgehende oder segmentierte Linien erscheinen. Es geht dennoch aus dem Kontext deutlich hervor, welche Linie gemeint ist.
  • Die Figuren werden wie folgt ausführlich erklärt:
  • 2: Meiotisches Antriebssystem. 50%, 60%, 70%, 80%, 90% und 100% für ein Einzellocussystem mit keiner verminderten Fitness. Die schwarze Linie im Fettdruck stellt in jedem Fall das SIT-System dar. Das RIDL-System ist mit grauen Linien aufgetragen.
    • a R0 stellt 1,5 und der Input stellt 0,5 (relativ zur initialen Population) dar. SIT hält die Population auf einer konstanten Höhe aufrecht, wohingegen die RIDL-Systeme die Populationen schnell reduzieren. Wenn die Population nicht der Kontrolle unterläge, würde man bei Generation 15 (1,5)15 = 438-mal so viele Insekten wie in der initialen Population erwarten.
    • b R0 stellt 2,25 und der Input stellt (relativ zur initialen Population) 1 dar. Die Population wird durch SIT oder RIDL mit 50%igem oder 60%igem meiotischem Antrieb nicht kontrolliert. Bei der Generation 15 weisen sie 8000-, 2200- bzw. 360-mal so viele Insekten wie die initiale Population auf. Wenn die Population nicht der Kontrolle unterläge, würde man bei Generation 15 (2,25)15 = 191751-mal so viele Insekten wie in der initialen Population erwarten. Die Populationen werden mit größeren meiotischen Antriebsniveaus schnell unter Kontrolle gebracht.
  • 3: Im RIDL-System verwendete multiple nicht verknüpfte Loci. Die schwarze Linie im Fettdruck stellt in jedem Fall das SIT-System dar. Das RIDL-System ist mit grauen Linien aufgetragen.
    • a R0 stellt 1,5 und der Input stellt 0,5 (relativ zur initialen Population) dar. SIT erhält die Population bei einer konstanten Höhe aufrecht, wohingegen die RIDL-Systeme die Populationen schnell reduzieren. Wenn die Population nicht der Kontrolle unterläge, würde man bei Generation 15 (1,5)15 = 438-mal so viele Insekten wie in der initialen Population erwarten.
    • b R0 stellt 2,25 und der Input stellt 1 (relativ zur initialen Population) dar. Die Population wird durch SIT oder RIDL mit 1 Locus oder 2 Loci nicht kontrolliert. Bei Generation 15 weist sie 8000-, 2200- bzw. 34-mal so viele Insekten wie die initiale Population auf. Wenn die Population nicht der Kontrolle unterläge, würde man bei 15 (2,25)15 = 191751-mal so viele Insekten wie in der initialen Population erwarten. Die Populationen werden mit einem 3-Locus-RIDL-System schnell unter Kontrolle gebracht.
  • 4: Meiotisches Antriebsystem. 50%, 60%, 70%, 80%, 90% und 100% für ein Einzellocussystem mit verminderter Fitness. Die schwarze Linie im Fettdruck stellt in jedem Fall das SIT-System dar. Das RIDL-System ist mit grauen Linien aufgetragen.
    • a R0 stellt 1,5 und der Input stellt 0,5 (relativ zur intialen Population) dar. Die Fitness von SIT- und freigesetzten RIDL-Insekten beträgt 80% von der von Wildtypinsekten. Es wird angenommen, dass sich anschließende Generationen, ungeachtet ihrer Elternschaft, die gleiche Fitness wie Wildtypinsekten aufweisen. Die Population wird durch SIT oder RIDL mit 50%igem meiotischen Antrieb nicht kontrolliert. Bei Generation 15 weisen sie 44- bzw. 1,5-mal so viele Insekten wie die initiale Population auf. Wenn die Population nicht der Kontrolle unterläge, würde man bei Generation 15 (1,5)15 = 438-mal so viele Insekten wie die initiale Population erwarten. Die Populationen werden mit größeren meiotischen Antriebsniveaus trotz der reduzierten Fitness schnell unter Kontrolle gebracht.
    • b R0 stellt 1,5 und der Input stellt 1,75 (relativ zur initialen Population) dar. Die Fitness von SIT beträgt 25% von der von Wildtypinsekten, wohingegen die freigesetzten RIDL-Insekten 50% der Fitness von den Wildtypinsekten aufweisen. Es wird angenommen, dass sich anschließende Generationen im Vergleich zu Wildtypinsekten, ungeachtet ihrer Elternschaft, die gleiche Fitness aufweisen. Die Population wird durch SIT nicht kontrolliert. Bei Generation 15 weist sie 23-mal so viele Insekten wie die initiale Population auf. Wenn die Population nicht der Kontrolle unterläge, würde man bei Generation 15 (1,5)15 = 438-mal so viele Insekten wie die initiale Population erwarten. Die Populationen werden trotz der reduzierten Fitness mit RIDL-Systemen schnell unter Kontrolle gebracht.
  • 5: Im RIDL-System verwendete multiple nicht verknüpfte Loci mit verminderter Fitness. Die schwarze Linie im Fettdruck stellt in jedem Fall das SIT-System dar. Das RIDL-System ist mit grauen Linien aufgetragen.
    • a R0 stellt 1,5 und der Input stellt 0,5 (relativ zur initialen Population) dar. Die Fitness von SIT- und freigesetzten RIDL-Insekten beträgt im Vergleich zu der von Wildtypinsekten 80%. Es wird angenommen, dass sich anschließende Generationen im Vergleich zu Wildtypinsekten, ungeachtet ihrer Elternschaft, die gleiche Fitness aufweisen. Die Population wird durch SIT oder RIDL mit einem 50%igen meiotischen Antrieb nicht kontrolliert. Bei Generation 15 weisen sie 44- bzw. 1,5-mal so viele Insekten wie die initialen Population auf. Wenn die Population nicht der Kontrolle unterläge, würde man bei Generation 15 (1,5)15 = 438-mal so viele Insekten wie die initiale Population erwarten. Die Populationen werden trotz der reduzierten Fitness mit multiplen Loci schnell unter Kontrolle gebracht.
    • b R0 stellt 1,5 und der Input stellt 1,75 (relativ zur initialen Population) dar. Die Fitness von SIT beträgt im Vergleich zu Wildtypinsekten 25%, wohingegen freigesetzte RIDL-Insekten 50% der Fitness von Wildtypinsekten aufweisen. Es wird angenommen, dass sich anschließende Generationen im Vergleich zu Wildtypinsekten, ungeachtet ihrer Elternschaft, die gleiche Fitness aufweisen. Die Population wird durch SIT nicht kontrolliert. Bei Generation 15 weist sie 23-mal so viele Insekten wie die initiale Population auf. Wenn die Population nicht der Kontrolle unterläge, würde man bei Generation 15 (1,5)15 = 438-mal so viele Insekten wie die initiale Population erwarten. Die Populationen werden mit RIDL-Systemen, trotz ihrer reduzierten Fitness, schnell unter Kontrolle gebracht.
  • 6: Meiotisches Antriebssystem. 50%, 60%, 70%, 80%, 90% und 100% für ein Einzellocussystem mit keiner verminderten Fitness – in einem dichteabhängigen System. Die schwarze Linie im Fettdruck stellt in jedem Fall das SIT-System dar. Das RIDL-System ist mit grauen Linien aufgetragen. In allen Fällen stellt a = 1, b = 2 dar, R0 stellt 4,5 und der Input stellt 1 (relativ zur initialen Population) dar.
    • a Die dichteabhängige Mortalität wirkt vor der RIDL-induzierten Mortalität und wirkt auf neu freigesetzte RIDL-Insekten. SIT erhält die Population bei einer konstanten Höhe von 0,8 relativ zur initialen Population aufrecht, wohingegen die RIDL-Systeme die Populationen schnell reduzieren. Wenn die Population nicht der Kontrolle unterläge, würde man erwarten, dass die Population bei der initialen Größe stabil bleibt.
    • b Die dichteabhängige Mortalität wirkt vor der RIDL-induzierten Mortalität, aber wirkt nicht auf neu freigesetzte RIDL-Insekten. Die Population wird durch SIT oder RIDL mit 50%igem oder 60%igem meiotischem Antrieb eliminiert. Sie stabilisieren die Population in den Höhen von 1,2, 0,4 bzw. 0,3, relativ zur initialen Population. Die Populationen werden mit größeren meiotischen Antriebsniveaus schnell unter Kontrolle gebracht. Wenn die Population nicht der Kontrolle unterläge, würde man erwarten, dass die Population bei der initialen Größe stabil bleibt.
    • c Die dichteabhängige Mortalität wirkt nach der RIDL-induzierten Mortalität, aber wirkt nicht auf neu freigesetzte RIDL-Insekten. Die Population wird durch SIT oder RIDL mit 50%igem, 60%igem oder 70%igem meiotischen Antrieb eliminiert. Sie stabilisieren die Population in Höhen von 1,2, 0,75, 0,7 bzw. 0,6, relativ zur initialen Population. Die Populationen werden mit größeren meiotischen Antriebsniveaus, trotz der reduzierten Fitness, schnell unter Kontrolle gebracht. Wenn die Population nicht der Kontrolle unterläge, würde man erwarten, dass die Population bei der initialen Größe stabil bleibt.
  • 7: Im RIDL-System mit keiner verminderten Fitness verwendete multiple nicht verknüpfte Loci – in einem dichteabhängigen System. Die schwarze Linie im Fettdruck stellt in jedem Fall das SIT-System dar. Das RIDL-System ist mit grauen Linien aufgetragen. In allen Fallen stellt a = 1, b = 2 dar, R0 stellt 4,5 und der Input stellt (relativ zur initialen Population) 1 dar.
    • a Die dichteabhängige Mortalität wirkt vor der RIDL-induzierten Mortalität und wirkt auf neu freigesetzte RIDL-Insekten. SIT erhält die Population bei einer konstanten Höhe von 0,8 relativ zur initialen Population aufrecht, wohingegen die RIDL-Systeme die Populationen reduzieren. Wenn die Population nicht der Kontrolle unterläge, würde man erwaten, dass die Population bei der initialen Größe stabil bleibt.
    • b Die dichteabhängige Mortalität wirkt vor der RIDL-induzierten Mortalität, aber wirkt nicht auf neu freigesetzte RIDL-Insekten. Die Population wird durch SIT oder RIDL mit 1 Locus bei einer konstanten Höhe aufrechterhalten. Sie stabilisieren die Population in den Höhen von 1,2 bzw. 0,4, relativ zur initialen Population. Die Populationen werden mit 2- oder 3-Locussystemen eliminiert. Wenn die Population nicht der Kontrolle unterläge, würde man erwarten, dass die Population bei der initialen Größe stabil bleibt.
    • c Die dichteabhängige Mortalität wirkt nach der RIDL-induzierten Mortalität, aber wirkt nicht auf neu freigesetzte RIDL-Insekten. Die Population wird durch SIT oder RIDL mit 1, 2 oder 3 Locus/Loci bei einer konstanten Höhe aufrechterhalten. Sie stabilisieren die Population in den Höhen von 1,2, 0,75, 0,63 bzw. 0,5, relativ zur initialen Population. Wenn die Population nicht der Kontrolle unterläge, würde man erwarten, dass die Population bei der initialen Größe stabil bleibt.
  • 8: Die Kurven a–d basieren auf dem Szenario von 2, wobei sich die ersten beiden Freisetzungen größenmäßig verdoppelten.
    • (a) R0 = 1,5, späterer Input = 0,5
    • (b) R0 = 2,25, späterer Input = 1
    • (c) R0 = 1,5, späterer Input = 0,5
    • (d) R0 = 2,25, späterer Input = 1
  • Die Kurven e–g basieren auf dem Szenario von 6, wobei sich die ersten beiden Freisetzungen größenmäßig verdoppelten.
    • (e) Siehe 6.
    • (f) Siehe 6b.
    • (g) Siehe 6c.
  • Die Kurven h–j basieren auf dem Szenario von 7, wobei sich die ersten beiden Freisetzungen größenmäßig verdoppelten.
    • (h) Siehe 7a.
    • (i) Siehe 7b.
    • (j) Siehe 7c.
    ANHANG SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00620001
    Figure 00630001
    Figure 00640001
    Figure 00650001
    Figure 00660001
    Figure 00670001

Claims (40)

  1. Verfahren zur Populationskontrolle eines nicht humanen mehrzelligen Tieres in einer natürlichen Umgebung dafür, umfassend: i) Züchten eines Stamms des Tieres, wobei das Tier ein dominantes letales genetisches System trägt, wobei die letale Wirkung des letalen Systems konditionell ist und in der natürlichen Umgebung über die Expression eines letalen Gens auftritt, wobei sich die Expression des letalen Gens unter der Kontrolle eines reprimierbaren Transaktivatorproteins befindet, wobei die Züchtung unter permissiven Bedingungen in Anwesenheit einer Substanz stattfindet, wobei die Substanz in der natürlichen Umgebung nicht vorhanden ist und zur Repression des Transaktivators fähig ist; ii) Verteilen der Stammtiere in der Umgebung an einem Locus zur Populationskontrolle; und iii) Erreichen der Populationskontrolle durch embryonale Letalität anhand der Expression des letalen Systems in Embryos von Nachkommen, die sich aus der Kreuzung der Stammindividuen mit Individuen des anderen Geschlechts der Wildpopulation ergeben.
  2. Verfahren zur Populationskontrolle eines wirbellosen mehrzelligen Tieres in einer natürlichen Umgebung dafür, umfassend: i) Züchten eines Stamms des Tieres, wobei das Tier ein dominantes letales genetisches System trägt, wobei die letale Wirkung des letalen Systems konditionell ist und in der natürlichen Umgebung über die Expression eines letalen Gens auftritt, wobei sich die Expression des letalen Gens unter der Kontrolle eines reprimierbaren Transaktivatorproteins befindet, wobei die Züchtung unter permissiven Bedingungen in Anwesenheit einer Substanz stattfindet, wobei die Substanz in der natürlichen Umgebung nicht vorhanden ist und zur Repression des Transaktivators fähig ist; ii) Verteilen der Stammtiere in der Umgebung an einem Locus zur Populationskontrolle; und iii) Erreichen der Populationskontrolle durch Expression des letalen Systems in Nachkommen, die sich am der Kreuzung der Stammindividuen mit Individuen des anderen Geschlechts der Wildpopulation ergeben.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das konditionelle dominante letale genetische System das einzige in dem Tier vorhandene rekombinante Element darstellt.
  4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin die Expression des letalen genetischen Systems in Abwesenheit einer Substanz auftritt, die in der natürlichen Umgebung des Tieres nicht vorliegt.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, worin die Substanz in Nahrungszusatzstoff ist, der keine übliche Futtermittelkomponente für das Tier darstellt.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, worin ein Nahrungszusatzstoff eine artifizielle oder synthetische Verbindung, ein Antibiotikum, Antibiotikum-Analogon oder -Derivat darstellt.
  7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin die konditionelle letale Wirkung des letalen Systems nicht vom Temperaturbereich abhängig ist, der in der natürlichen Umgebung des Tieres vorkommt.
  8. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin die letale Wirkung des dominanten letalen Systems konditionell reprimierbar ist.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, worin das Expressionssystem durch Tetracyclin oder ein Analogon oder Derivat davon reprimierbar ist.
  10. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin das letale System an mehr als einem Locus vorliegt.
  11. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin sich das letale System auf dem X-Chromosom befindet.
  12. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin das letale System multiple essenzielle Targets aufweist.
  13. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin das letale genetische System das gesamte oder einen Teil des Nipp1Dm-Gens von Drosophil(i)a oder ein funktionelles Äquivalent davon umfasst.
  14. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin das letale Gen eine inhibitorische Sequenz darstellt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, umfassend: Antisense-RNA, Sense-RNA und doppelsträngige RNA.
  15. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin das nicht humane oder wirbellose mehrzellige Tier ein Insekt darstellt.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, worin das nicht humane oder wirbellose mehrzellige Tier aus der Gruppe ausgewählt ist, umfassend: die Australische Schafsschmeißfliege (Lucilla cuprina), Asiatische Tigermücke (Aedes albopictus); den Japankäfer (Popilla japonica), „White-fringed beetle" [Rüsselkäfer] (Graphognatus spp.), die Mottenschildlaus (Aleurocanthus woglumi), Orientalische Fruchtfliege (Dacus dorsalis), Olivenfliege (Dacus oleae), tropische Fruchtfliege (Dacus cucurbitae, Dacus zonatus), Mittelmeerfruchtfliege (Ceratitis capitata), Natal Fruchtfliege (Ceratitis rosa), Kirschenfruchtfliege (Rhagoletis cerasi), Queensland Fruchtfliege (Bactrocera tryoni), Karibische Fruchtfliege (Anastrepha suspensa), Feuerameisen, importiert (Solenopis richteri, Solenopis invicta), den Schwammspinner (Lymantria dispar), Apfelwickler (Cydia pomonella), Goldafter (Euproctis chrysorrhoea), die Gelbfiebermücke (Aedes aegypti), Malariastechmücke (Anopheles gambiae, Anopheles stephansi), amerikanische Schraubenwurmfliege (Cochliomyia hominivorax), Schraubenfliege der Alten Welt (Chrysomya bezziana), Tsetsefliege (Glossina spp.), den Baumwollkapselkäfer (Anthonomous grandis), die Hagen's-Bluet [Schlankjungfer] (Enallagma hageni), Libelle [Familie: Segellibellen] (Libellula luctuosa) und den Reisstengelbohrer (Tryporyza incertulas).
  17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 3–16, worin das Tier ein nicht humanes mehrzelliges Tier darstellt und die letale Wirkung des letalen genetischen Systems in den Embryos geschlechtsspezifisch ist.
  18. Verfahren nach Anspruch 17, worin die letale Wirkung des letalen genetischen Systems für ein Geschlechtsgewebe in den Embryos spezifisch ist.
  19. Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, worin die letale Wirkung für Weibchen spezifisch ist.
  20. Verfahren nach einem der Ansprüche 2–16, worin das Tier ein wirbelloses mehrzelliges Tier darstellt und die letale Wirkung des letalen genetischen Systems geschlechtsspezifisch ist.
  21. Verfahren nach Anspruch 20, worin die letale Wirkung des letalen genetischen Systems für ein Geschlechtsgewebe spezifisch ist.
  22. Verfahren nach einem der Ansprüche 2–16, worin das Tier ein wirbelloses mehrzelliges Tier darstellt, und die letale Wirkung auf einer Stufe des Lebenszyklus des wirbellosen mehrzelligen Tieres spezifisch, aber auf einer anderen Stufe nicht spezifisch ist.
  23. Verfahren nach einem der Ansprüche 2–16, worin das Tier ein wirbelloses mehrzelliges Tier darstellt und die letale Wirkung auf einer Stufe des Lebenszyklus des wirbellosen mehrzelligen Tieres geschlechtsspezifisch, aber auf einer anderen Stufe nicht spezifisch ist.
  24. Verfahren nach Anspruch 22 oder 23, worin die letale Wirkung embryospezifisch ist.
  25. Verfahren nach einem der Ansprüche 20, 21 oder 23, worin die letale Wirkung für Weibchen spezifisch ist.
  26. Verfahren nach einem der Ansprüche 17–25, worin das nicht humane oder wirbellose mehrzellige Tier kein dominantes geschlechtsspezifisches letales genetisches System, das unkonditionell ist und in jedem Individuum exprimiert wird, aufweist.
  27. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin sowohl Männchen als auch Weibchen verteilt sind.
  28. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 26, worin ein Geschlecht verteilt ist.
  29. Verfahren nach Anspruch 28, worin eine Geschlechtstrennung vor der Verteilung eines nicht humanen oder wirbellosen mehrzelligen Tieres durch Expression eines geschlechtsspezifischen letalen genetischen Systems eines nicht humanen oder wirbellosen mehrzelligen Tieres, wie nach einem der Ansprüche 17–36 definiert ist, stattfindet.
  30. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin die letale Wirkung zur Abtötung von mehr als 90% der Targetklasse der Nachkommenschaft aus Paarungen zwischen freigesetzten Tieren und der Wildpopulation führt.
  31. Verfahren zur Geschlechtstrennung von Tieren wie nach Ansprüchen 1 und 2 definiert, worin die Expression eines geschlechtsspezifischen dominanten konditionellen letalen Systems nach einem der Ansprüche 17–20, 22 und 24–25 in dem Tier zum Abtöten eines Geschlechts verwendet wird, um Folgendes zurückzulassen: entweder eine reine oder prädominant männliche oder weibliche Population; eine Population, in der die Tiere entweder männliche oder weibliche Gewebe umfassen; oder eine Population, in der die Tiere unfähig sind, funktionelle männliche Gameten oder weibliche Gameten oder beides zu produzieren.
  32. Polynukleotidsequenz, kodierend für ein konditionelles dominantes letales genetisches System nach einem der vorangehenden Ansprüche, kodierend für das Nipp1-Gen.
  33. Polynukleotidsequenz nach Anspruch 32, umfassend SEQ ID NO: 1.
  34. Polynukleotidsequenz, kodierend für ein konditionelles dominantes letales genetisches System nach einem der Ansprüche 1–30, worin das letale Gen eine inhibitorische Sequenz darstellt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, umfassend: Antisense-RNA, Sense-RNA und doppelsträngige RNA.
  35. Vektor oder Vektoren, umfassend eine Polynukleotidsequenz nach Anspruch 32 oder 34.
  36. Vektor nach Anspruch 35, umfassend ein Tetracyclin-reprimierbares dominantes letales Gen oder genetisches System.
  37. Vektor nach Anspruch 35 oder 36, umfassend mindestens eine Isolatorsequenz.
  38. Vektor nach Anspruch 37, worin sich die Isolatorsequenz von Vertebralen-DNA herleitet.
  39. Vektor nach einem der Ansprüche 35 bis 38, worin der Vektor modulare genetische Elemente umfasst.
  40. Nicht humane Wirtszelle, umfassend einen Vektor nach einem der Ansprüche 35–39.
DE60037752T 1999-11-29 2000-11-29 Biologische kontrolle mittels konditionell-dominant-lethalem genetischen system Expired - Lifetime DE60037752T2 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB9928181 1999-11-29
GB9928181A GB2355459B (en) 1999-11-29 1999-11-29 A dominant conditional lethal genetic system
PCT/GB2000/004541 WO2001039599A2 (en) 1999-11-29 2000-11-29 Biological control by conditional dominant lethal genetic system

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE60037752D1 DE60037752D1 (de) 2008-02-21
DE60037752T2 true DE60037752T2 (de) 2008-12-24

Family

ID=10865351

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE60037752T Expired - Lifetime DE60037752T2 (de) 1999-11-29 2000-11-29 Biologische kontrolle mittels konditionell-dominant-lethalem genetischen system

Country Status (15)

Country Link
US (4) US20030213005A1 (de)
EP (1) EP1246927B1 (de)
CN (1) CN1311083C (de)
AT (1) ATE383434T1 (de)
AU (1) AU784705B2 (de)
CA (1) CA2392111C (de)
DE (1) DE60037752T2 (de)
ES (1) ES2298167T3 (de)
GB (1) GB2355459B (de)
IL (2) IL149885A0 (de)
MX (1) MXPA02005337A (de)
NZ (1) NZ519175A (de)
SK (1) SK288001B6 (de)
WO (1) WO2001039599A2 (de)
ZA (1) ZA200204167B (de)

Families Citing this family (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2355459B (en) 1999-11-29 2001-09-26 Isis Innovation A dominant conditional lethal genetic system
GB2402675B (en) * 2003-05-12 2008-02-20 Oxitec Ltd Resistance dilution
GB2403475B (en) 2003-07-01 2008-02-06 Oxitec Ltd Stable integrands
GB2404382B (en) 2003-07-28 2008-01-30 Oxitec Ltd Pest control
US20060123489A1 (en) * 2004-12-03 2006-06-08 Envivo Pharmaceuticals, Inc. Sex-specific automated sorting of non-human animals
AU2007213444B2 (en) * 2006-02-10 2013-08-29 Oxitec Limited Gene expression system using alternative splicing in insects
GB2443186A (en) 2006-10-25 2008-04-30 Oxitec Ltd Expression system for mediating alternative splicing
US7868222B1 (en) 2006-03-10 2011-01-11 University Of Kentucky Research Foundation Transfected mosquito vectors
SG152938A1 (en) * 2007-11-21 2009-06-29 Erich Dollansky Automated insect breeding system
US9131671B2 (en) * 2008-02-01 2015-09-15 Entogenetics, Inc. Methods, compositions and systems for production of recombinant spider silk polypeptides
US8263397B2 (en) 2010-03-12 2012-09-11 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Female specific insect expression system
BR112013024346A2 (pt) 2011-03-23 2016-08-23 Duong Thanh Hoang técnica de interferência de tra-2 rna do mosquito culicinae para geneticamente produzir populações de machos
GB2500113A (en) 2012-03-05 2013-09-11 Oxitec Ltd Arthropod male germline gene expression system
EP2880166A4 (de) 2012-08-02 2016-04-20 Univ Central Florida Res Found Zusammensetzungen und verfahren für genetische konstrukte
GB201303932D0 (en) 2013-03-05 2013-04-17 Oxitec Ltd Muscle actin promoter
WO2015040449A1 (en) * 2013-09-20 2015-03-26 Hoang Duong Thanh Culicinae mosquito tra-2 rnai, a method to genetically produce maleness populations
US20150237838A1 (en) * 2014-02-26 2015-08-27 California Institute Of Technology Regulation of insect populations
GB2526867A (en) 2014-06-05 2015-12-09 Oxitec Ltd Gene expression system
US11344009B2 (en) 2014-07-07 2022-05-31 Duong Thanh Hoang All sterile males of culicine mosquitoes: a method of creation
GB201414210D0 (en) 2014-08-11 2014-09-24 Oxitec Ltd Bulk culture system and method
US10966414B2 (en) 2015-05-26 2021-04-06 California Institute Of Technology Population control using engineered translocations
WO2017132207A1 (en) * 2016-01-25 2017-08-03 The Regents Of The University Of California Use of medea elements for biocontrol of d. suzukii populations
US11028410B2 (en) 2016-01-27 2021-06-08 Just-Evotec Biologics, Inc. Hybrid promoter and uses thereof
US11261462B2 (en) 2016-01-27 2022-03-01 Just-Evotec Biologics, Inc. Inducible expression from transposon-based vectors and uses
US11098310B2 (en) 2016-01-27 2021-08-24 Just-Evotec Biologics, Inc. Expression from transposon-based vectors and uses
BR112019002771A2 (pt) 2016-08-12 2019-05-14 Oxitec Ltd polinucleotídeo de módulo de controle de união de doublesex, sistema de expressão de gene, plasmídeo vetor de expressão, inseto geneticamente engenheirado, métodos para produzir insetos geneticamente engenheirados, para cultivar seletivamente insetos macho geneticamente engenheirados, para reduzir uma população de inseto selvagem, para criar um mosquito aedes aegypti transgênico e para detectar a presença de uma molécula de dna, local alvo cromossômico de aedes aegypti, mosquito aedes aegypti geneticamente engenheirado, molécula de dna, e, kit de detecção de dna.
CN106561577B (zh) * 2016-11-03 2019-07-26 广州威佰昆生物科技有限公司 携带致倦库蚊沃尔巴克氏体的白纹伊蚊的制备方法及应用
US20200149054A1 (en) * 2017-04-27 2020-05-14 Stowers Institute For Medical Research Compositions and methods of dual poison-antidote meiotic drivers
US11834665B2 (en) 2017-05-10 2023-12-05 Regents Of The University Of Minnesota Programmable transcription factors and methods
WO2019058376A1 (en) * 2017-09-19 2019-03-28 The State Of Israel, Ministry Of Agriculture & Rural Development, Agricultural Research Organization (Aro) (Volcani Center) BIRDS WITH GENOME EDITION
US10653904B2 (en) 2017-12-02 2020-05-19 M-Fire Holdings, Llc Methods of suppressing wild fires raging across regions of land in the direction of prevailing winds by forming anti-fire (AF) chemical fire-breaking systems using environmentally clean anti-fire (AF) liquid spray applied using GPS-tracking techniques
US11865394B2 (en) 2017-12-03 2024-01-09 Mighty Fire Breaker Llc Environmentally-clean biodegradable water-based concentrates for producing fire inhibiting and fire extinguishing liquids for fighting class A and class B fires
US11865390B2 (en) 2017-12-03 2024-01-09 Mighty Fire Breaker Llc Environmentally-clean water-based fire inhibiting biochemical compositions, and methods of and apparatus for applying the same to protect property against wildfire
US11826592B2 (en) 2018-01-09 2023-11-28 Mighty Fire Breaker Llc Process of forming strategic chemical-type wildfire breaks on ground surfaces to proactively prevent fire ignition and flame spread, and reduce the production of smoke in the presence of a wild fire
AR117409A1 (es) 2018-03-29 2021-08-04 Oxitec Ltd Noctuidas autolimitantes
US11968963B2 (en) 2018-04-05 2024-04-30 Vanderbilt University Male arthropod killing factors and methods of use thereof
MA52650A1 (fr) 2018-08-14 2021-12-31 Oxitec Ltd Arthropodes mâles stériles à sélection automatique
CN109055360B (zh) * 2018-09-14 2022-10-11 皖南医学院 一种提取按蚊总rna的方法
US11965172B2 (en) 2018-11-05 2024-04-23 California Institute Of Technology DNA sequence modification-based gene drive
WO2021076342A2 (en) * 2019-10-02 2021-04-22 Regents Of The University Of Minnesota Systems and methods for batch cultivation of non-transgenic heterogametes
US11911643B2 (en) 2021-02-04 2024-02-27 Mighty Fire Breaker Llc Environmentally-clean fire inhibiting and extinguishing compositions and products for sorbing flammable liquids while inhibiting ignition and extinguishing fire
CN114467861B (zh) * 2022-01-11 2023-04-11 湖北省农业科学院植保土肥研究所 用于防治红铃虫的x射线辐照不育方法
CN115088681B (zh) * 2022-08-02 2024-03-08 浙江省农业科学院 一种获得番茄潜叶蛾不育雄虫的方法及其在该虫防治中的应用

Family Cites Families (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4383885A (en) * 1980-02-06 1983-05-17 Bell Telephone Laboratories, Incorporated Reactive sputter etching of polysilicon utilizing a chlorine etch gas
US5180873A (en) * 1985-04-16 1993-01-19 Dna Plant Technology Corporation Transformation of plants to introduce closely linked markers
GB8901677D0 (en) * 1989-01-26 1989-03-15 Ici Plc Hybrid seed production
US5643776A (en) * 1988-11-01 1997-07-01 The Regents Of The University Of California Insect diagnostic and control compositions
US4948458A (en) * 1989-08-14 1990-08-14 Lam Research Corporation Method and apparatus for producing magnetically-coupled planar plasma
US5254801A (en) * 1990-12-03 1993-10-19 Monsanto Company Heterologous dominant conditional lethal gene which is a phosphonate monoester hydrolase and use thereof in plants
US5200023A (en) * 1991-08-30 1993-04-06 International Business Machines Corp. Infrared thermographic method and apparatus for etch process monitoring and control
US5234529A (en) * 1991-10-10 1993-08-10 Johnson Wayne L Plasma generating apparatus employing capacitive shielding and process for using such apparatus
GB9216151D0 (en) * 1992-07-29 1992-09-09 Ici Plc Containment of plant germplasm
US6225121B1 (en) 1992-09-14 2001-05-01 Institute Of Molecular Biology And Biotechnology/Forth Eukaryotic transposable element
GB9313975D0 (en) * 1993-07-06 1993-08-18 Sandoz Ltd Improvements in or relating to organic compounds
EG23907A (en) * 1994-08-01 2007-12-30 Delta & Pine Land Co Control of plant gene expression
US5633447A (en) * 1994-08-25 1997-05-27 Mycogen Plant Science, Inc. Plant tissue comprising a subgenomic promoter
US5753434A (en) 1995-02-10 1998-05-19 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions for altering sexual behavior
US5851796A (en) * 1995-06-07 1998-12-22 Yale University Autoregulatory tetracycline-regulated system for inducible gene expression in eucaryotes
WO1996041900A1 (en) * 1995-06-13 1996-12-27 Massively Parallel Instruments, Inc. Improved parallel ion optics and apparatus for high current low energy ion beams
US5691642A (en) * 1995-07-28 1997-11-25 Trielectrix Method and apparatus for characterizing a plasma using broadband microwave spectroscopic measurements
FR2737731B1 (fr) * 1995-08-07 1997-10-10 Pasteur Institut Sequence de retroelements naturels ou synthetiques ayant pour fonction de permettre l'insertion de sequences nucleotidiques dans une cellule eucaryote
AUPN816196A0 (en) * 1996-02-19 1996-03-14 Forbio Research Pty Ltd Regulation of eukaryotic gene expression
US5773697A (en) * 1996-04-23 1998-06-30 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genetic constructs and methods for producing fruits with very little or diminished seed
EP0920521A1 (de) 1996-08-26 1999-06-09 Genencor International, Inc. Identifikationen und klonierung von einem mobilen transposon aus aspergillus
US6017437A (en) * 1997-08-22 2000-01-25 Cutek Research, Inc. Process chamber and method for depositing and/or removing material on a substrate
US7135608B1 (en) * 1997-08-28 2006-11-14 The Salk Institute For Biological Studies Site-specific recombination in eukaryotes and constructs useful therefor
US6338040B1 (en) * 1999-02-12 2002-01-08 Agren, Inc. Method for delaying the development in pest species of resistance to control techniques, using insurance to encourage correct uses of refuges
EP2395094A3 (de) 1999-06-01 2012-04-18 The University of Utah Research Foundation Verfahren zur transposonvermittelten Mutagenese im nematoden Caenorhabditis elegans
GB2355459B (en) 1999-11-29 2001-09-26 Isis Innovation A dominant conditional lethal genetic system
JP2003521941A (ja) 2000-02-11 2003-07-22 クイーンメリー アンド ウエストフィールド カレッジ ベクター
US20030150007A1 (en) * 2000-03-21 2003-08-07 Charalambos Savakis Method of generating transgenic organisms using transposons
US20060057553A1 (en) 2000-05-30 2006-03-16 Estuardo Aguilar-Cordova Chimeric viral vectors for gene therapy
US6962810B2 (en) * 2000-10-31 2005-11-08 University Of Notre Dame Du Lac Methods and compositions for transposition using minimal segments of the eukaryotic transformation vector piggyBac
WO2002046444A2 (en) 2000-12-05 2002-06-13 Wisconsin Alumni Research Foundation Double transposition methods for manipulating nucleic acids
ITRM20010120A1 (it) * 2001-03-08 2002-09-08 Univ Napoli Federico Ii Gene cctra come strumento per produrre progenie di soli maschi nella mosca mediterranea ceratitis capitata.
FR2825579B1 (fr) 2001-06-11 2004-07-23 Rhobio Methode d'obtention de plante monocotyledone contenant un gene d'interet sans sequence auxiliaire etrangere
DE10251918A1 (de) 2002-11-08 2004-05-19 Horn, Carsten, Dipl.-Biochem. Dr. Systeme zur Erzeugung stabiler genomischer Transgen-Insertionen
GB2402675B (en) 2003-05-12 2008-02-20 Oxitec Ltd Resistance dilution
GB2403475B (en) 2003-07-01 2008-02-06 Oxitec Ltd Stable integrands
GB2404382B (en) * 2003-07-28 2008-01-30 Oxitec Ltd Pest control
CN1961071A (zh) * 2004-03-15 2007-05-09 比奥根艾迪克Ma公司 使用可选剪接在真核细胞中表达多肽多聚体的方法和构建物
US7563601B1 (en) * 2005-06-01 2009-07-21 City Of Hope Artificial riboswitch for controlling pre-mRNA splicing
AU2007213444B2 (en) * 2006-02-10 2013-08-29 Oxitec Limited Gene expression system using alternative splicing in insects

Also Published As

Publication number Publication date
US9125388B2 (en) 2015-09-08
CN1311083C (zh) 2007-04-18
SK288001B6 (sk) 2012-10-02
US20160044902A1 (en) 2016-02-18
EP1246927B1 (de) 2008-01-09
WO2001039599A3 (en) 2002-05-10
SK7352002A3 (en) 2002-11-06
NZ519175A (en) 2004-02-27
DE60037752D1 (de) 2008-02-21
US20030213005A1 (en) 2003-11-13
IL149885A (en) 2008-12-29
US20080115233A1 (en) 2008-05-15
AU784705B2 (en) 2006-06-01
ZA200204167B (en) 2003-10-29
WO2001039599A2 (en) 2001-06-07
ES2298167T3 (es) 2008-05-16
GB2355459A (en) 2001-04-25
US20130298266A1 (en) 2013-11-07
AU1716501A (en) 2001-06-12
CN1433475A (zh) 2003-07-30
CA2392111C (en) 2013-09-03
MXPA02005337A (es) 2004-04-02
GB9928181D0 (en) 2000-01-26
CA2392111A1 (en) 2001-06-07
IL149885A0 (en) 2002-11-10
ATE383434T1 (de) 2008-01-15
GB2355459B (en) 2001-09-26
EP1246927A2 (de) 2002-10-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE60037752T2 (de) Biologische kontrolle mittels konditionell-dominant-lethalem genetischen system
US10844402B2 (en) Expression systems
Alphey Re-engineering the sterile insect technique
Phuc et al. Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control
Martins et al. Germline transformation of the diamondback moth, Plutella xylostella L., using the piggyBac transposable element
JP6363023B2 (ja) 生物的防除
Morrison et al. Genetic improvements to the sterile insect technique for agricultural pests
Benedict et al. Defining environment risk assessment criteria for genetically modified insects to be placed on the EU market
Yan et al. Building a transgenic sexing strain for genetic control of the Australian sheep blow fly Lucilia cuprina using two lethal effectors
Handler Molecular genetic mechanisms for sex-specific selection
DE60021404T3 (de) System zur herstellung von proteinen
US20210324409A1 (en) Self-Selecting Sterile Male Arthropods
Yamamoto et al. Evaluation of additional Drosophila suzukii male-only strains generated through remobilization of an FL19 transgene
AT500838B1 (de) Multiple hse
Abraham et al. Towards the genetic control of insect vectors: an overview
KR102673530B1 (ko) 곤충에서 엔도뉴클레아제 암수구별 및 불임
Ray et al. GENETIC ENGINEERING OF INSECTS AND THEIR APPLICATION
Ant Genetic control of the olive fruit fly, Bactrocera oleae
KR20200088446A (ko) 곤충에서 엔도뉴클레아제 암수구별 및 불임
Asokan Genetic engineering of insects
Martins Development of genetic control methods in two lepidopteran species

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition