KR102673530B1 - 곤충에서 엔도뉴클레아제 암수구별 및 불임 - Google Patents
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Abstract
상기 개시된 정밀 유도 불임 곤충 기술 (pgSIT)의 방법은 유전적으로 변형된 곤충에서 수컷 성별을 지시하는 방법 및 유전적으로 변형된 불임 수컷 곤충 난의 자손을 생산하는 방법을 포함한다. 이러한 방법은, 적어도 하나의 핵산 서열을 제 1 곤충의 게놈에 통합시키는 단계로서, 상기 적어도 하나의 핵산 서열은 암컷-특이적 생존력에 필요한 암컷-필수 게놈 서열을 표적으로 하는 적어도 하나의 제 1 가이드 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단계, 엔도뉴클레아제를 제 2 곤충에 도입하는 단계로서, 및 상기 제 1 곤충 및 상기 제 2 곤충을 유전적으로 교차시키는 단계로서, 상기 교차시키는 단계는 상기 엔도뉴클레아제와 상기 적어도 하나의 핵산 서열을 발현하는 것을 포함한다. 수컷 불임의 경우, 제 2 가이드 폴리뉴클레오티드는 수컷-특이적 불임에 필요한 수컷 불임 게놈 서열을 표적으로 한다.
Description
본 발명은 곤충에서 엔도뉴클레아제 암수구별 및 불임에 관한 것이다.
[상호참조]
본 출원은 "신규한 불임 곤충 기술" 라는 명칭의 2017년 11월 21일자로 출원된 미국 출원 62/589,405호로부터 우선권을 주장하고, 그 전문이 참고자료로 포함된다.
[미 연방정부 지원 연구 또는 개발]
본 발명은 국립보건원(National Institutes of Health)에서 보조금 번호 5K22AI113060 및 1R21AI123937, 국방부 첨단연구 프로젝트국(Defense Advanced Research Project Agency)으로부터 보조금 번호: HR0011-17-2-0047의 정부 지원을 받아 만들어졌다. 미 연방정부는 본 발명에 대하여 일정 권리를 가진다.
[배경기술]
불임곤충기술(Sterile Insect Technique; SIT)로 알려진 불임 수컷의 대량 생산과 방출은 역사적으로 1930년대 중반으로 거슬러 올라가 해충의 개체수를 조절하고 근절하기 위해 사용되어 왔다. 종래의 방법론은 불임을 위해 DNA-손상제에 의존하여, 방출된 수컷의 전반적인 건강 및 교미 경쟁력을 실질적으로 감소시킨다. 이러한 문제를 극복하기 위해, 올바키아 기반(Wolbachia-based)의 비호환 곤충 기술 (incompatible insect technique; IIT)과 같은 미생물 매개 불임 기술과 우성치사 운반 해충의 방출(Release of Insects carrying a Dominant Lethal; RIDL)과 같은 현대 유전적 SIT 유사 시스템, 및 숫컷 특이적 RIDL(female-specific RIDL; fsRIDL)과 같이 유전적으로 암컷을 죽이는 가임 수컷을 방출하는 방법, 상 염색체 연결 X-염색체 슈레더와 같은 다른 방법론들이 개발되었다. 이러한 1 세대 유전적 SIT 방법들은 상당한 진보를 나타내지만, IIT는 현장에서 달성되기 어려운 감염된 암컷이 방출되지 않는 것을 요구하고, 미생물을 제거하는 것으로 알려진 테트라 사이클린의 사용은 RIDL / fsRIDL수컷의 건강을 손상시킨다. 수컷 및 X-염색체 슈레더는 원칙적으로 이형 배우자적 성 염색체를 가진 종에서만 개발될 수 있으므로 다른 종에 대한 광범위한 적용을 제한한다. 따라서, 불임 수컷 만이 생존할 수 있는 난(eggs)로 배치될 수 있는 보다 효율적인 SIT 기반 기술을 사용하는 것이 논리적으로 유리하다.
본 개시의 실시 양태는 정밀 유도 불임 곤충 기술(pgSIT)을 포함하는 방법에 관한 것이다.
본 개시의 일부 실시 양태에서, 유전적으로 변형된 곤충에서 수컷 성별을 지시하는 방법은, 적어도 하나의 핵산 서열을 제 1 곤충의 게놈 내로 통합시키는 단계로서, 상기 적어도 하나의 핵산 서열은 암컷-특이적 생존력에 필요한 암컷 필수 게놈 서열을 표적으로 하는 적어도 하나의 제 1 가이드 폴리뉴클레오티드를 가지는 단계; 엔도뉴클레아제를 제 2 곤충에 도입하는 단계로서, 상기 제 2 곤충은 상기 제 1 곤충과 유전적으로 교차될 수 있는 단계; 및 상기 제 1 곤충 및 상기 제 2 곤충을 유전적으로 교차시키는 단계로서, 상기 교차시키는 단계는 상기 엔도뉴클레아제와 수컷 곤충 난이 성체로 성숙하는 적어도 하나의 핵산 서열을 발현하는 자손을 생산하는 것;을 포함한다.
본 개시의 일부 실시 양태에서, 유전적으로 변형된 불임 수컷 곤충 난의 자손을 생산하는 방법은, 적어도 하나의 핵산 서열을 제 1 곤충의 게놈 내로 통합시키는 단계로서, 상기 적어도 하나의 핵산 서열은 암컷-특이적 생존력에 필요한 암컷-필수 게놈 서열을 표적으로 하는 적어도 하나의 제 1 가이드 폴리뉴클레오티드를 가지는 단계; 엔도뉴클레아제를 제 2 곤충에 도입하는 단계로서, 상기 제 2 곤충은 상기 제 1 곤충과 유전적으로 교차될 수 있고, 상기 적어도 하나의 핵산 서열은 수컷-특이적 불임에 필요한 수컷 불임 게놈 서열을 표적으로 하는 적어도 하나의 제 2 가이드 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 단계; 및 상기 제 1 곤충 및 상기 제 2 곤충을 유전적으로 교차시키는 단계로서, 상기 교차시키는 단계는 유전적으로 변형된 불임 수컷 곤충 난의 자손을 생산하는 것;을 포함한다.
본 개시의 일부 실시 양태에서, 상기 적어도 하나의 핵산 서열을 제 1 곤충의 게놈 내로 통합시키는 단계는 게놈 내의 모든 염색체 사본 내로 동형접합적 통합인 것을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 상기 적어도 하나의 핵산 서열을 통합시키는 단계는 적어도 하나의 핵산 서열을 배아 단계에서 상기 제 1 곤충 내로 도입하는 것을 포함한다.
본 개시의 일부 실시 양태에서, 상기 적어도 하나의 제 1 가이드 폴리뉴클레오티드 및 상기 적어도 하나의 제 2 가이드 폴리뉴클레오티드는 각각 적어도 하나의 가이드 리보 핵산 (gRNA)을 포함한다.
본 개시의 일부 실시 양태에서, 상기 암컷-필수 게놈 서열은 암컷-특이적 생존력에 필수적인 유전자, 또는 암컷-특이적 발달 및/또는 암컷-특이적 생존력에 필수적인 암컷-특이적 엑손(exon)을 포함한다.
본 개시의 일부 실시 양태에서, 상기 적어도 하나의 제 1 가이드 폴리뉴클레오티드는 각각 암컷-특이적 생존력에 필요한 동일한 암컷-필수 게놈 서열의 상이한 영역을 표적으로 하는 하나 이상의 제 1 가이드 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 개시의 일부 실시 양태에서, 상기 적어도 하나의 제 1 가이드 폴리뉴클레오티드는 각각 암컷-특이적 생존력에 필요한 상이한 암컷-필수 게놈 서열을 표적으로 하는 하나 이상의 제 1 가이드 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 개시의 일부 실시 양태에서, 상기 암컷-필수 게놈 서열은 유전자 또는 유전자의 스플라이스-변이체이고, 상기 유전자는 섹스 레탈 (Sxl), 트랜스포머 (Tra), 더블섹스 (Dsx), 이의 호모로그, 이의 오솔로그, 이의 파라로그 또는 이들의 조합의 군으로부터 선택된다.
본 개시의 일부 실시 양태에서, 상기 적어도 하나의 제 1 가이드 폴리뉴클레오티드는, 각각 이의 호모로그, 이의 오솔로그 또는 이의 파라로그를 포함하는 Sxl, Tra, Dsx로부터 선택된 상이한 유전자를 표적으로 하는 하나 이상의 제 1 가이드 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 개시의 일부 실시 양태에서, 상기 하나 이상의 제 1 가이드 폴리뉴클레오티드는, 각각 이의 호모로그, 이의 오솔로그 또는 이의 파라로그를 포함하는 Sxl, Tra, Dsx로부터 선택된 상이한 유전자를 표적으로 하는 두 개의 제 1 가이드 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 개시의 일부 실시 양태에서, 상기 하나 이상의 제 1 가이드 폴리뉴클레오티드는, 각각 이의 호모로그, 이의 오솔로그 또는 이의 파라로그를 포함하는 Sxl, Dsx로부터 선택된 상이한 유전자를 표적으로 하는 두 개의 제 1 가이드 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 개시의 일부 실시 양태에서, 상기 수컷 불임 게놈 서열은, 이의 호모로그, 이의 오솔로그 또는 이의 파라로그를 포함하는 베타튜뷸린 85D (βTubulin 85D; βTub), 퍼지 오니온 (fuzzy onions; Fzo), 프로타민 A (protamine A; ProtA), 스퍼마토사이트 어레스트 (spermatocyte arrest; Sa)로부터 선택된 유전자이다.
본 개시의 일부 실시 양태에서, 상기 제 2 곤충이 수컷인 경우, 상기 엔도뉴클레아제를 제 2 곤충에 도입하는 단계는 엔도뉴클레아제를 코딩하는 유전자를 동형접합적으로 통합시키는 것을 포함하고, 상기 제 2 곤충이 암컷인 경우, 상기 엔도뉴클레아제를 제 2 곤충에 도입하는 단계는 엔도뉴클레아제를 코딩하는 유전자를 동형접합적 또는 이형접합적으로 통합하거나 또는 엔도뉴클레아제 단백질을 상기 제 2 곤충에 침착시키는 것을 포함한다.
본 개시의 일부 실시 양태에서, 엔도뉴클레아제를 제 2 곤충 내로 도입하는 단계는 배아 단계에서 엔도뉴클레아제를 상기 제 2 곤충 내로 도입하는 것을 포함한다.
본 개시의 일부 실시 양태에서, 유전적으로 변형된 곤충 난의 자손은 본 개시의 방법에 따라 생산된 최대 100 % 의 수컷 곤충 난을 포함한다.
본 개시의 일부 실시 양태에서, 유전적으로 변형된 곤충 난의 자손은 본 개시의 방법에 따라 생산된 최대 100 % 의 불임 수컷 곤충 난을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 본 개시의 방법에 따라 생산된 유전적으로 변형된 불임 수컷 곤충은 야생형 암컷 곤충과 교미함으로써 부화되지 않은 난의 비율을 증가시킬 수 있다.
본 개시의 일부 실시 양태에서, 야생형 곤충 개체군을 감소시키는 방법은 본 개시의 방법에 따라 생산된 유전적으로 변형된 불임 수컷을 야생형 곤충 개체군에 도입하는 것을 포함한다.
본 특허 또는 출원 파일은 컬러로 실행된 적어도 하나의 도면을 포함한다. 신청 및 필요한 수수료를 지불하면 미국 특허상표청에서 컬러 도면과 함께 본 특허 또는 특허 출원 공개의 사본을 제공합니다. 첨부 도면은, 본 명세서와 함께, 본 개시의 예시적인 실시 양태를 나타내고, 상세한 설명과 함께, 본 개시의 원리를 설명한다.
도 1a는 본 개시의 실시 양태에 따른, 이원성 CRISPR / Cas9 시스템의 두가지 성분인, 상기 엔도뉴클레아제 Cas9 및 가이드 리보핵산 (gRNA) (청색 또는 녹색 표적-특이적 서열을 갖는)을 이용하는 pgSIT의 개략도이며, 분리된 동형접합 라인(homozygous lines)으로 유지되며, 이들의 교차 결과는 F1 불임 수컷에서만 생존을 초래하는 암컷 생존력에 필요한 유전자 및 수컷 불임에 필요한 유전자의 동시적 또는 일시적(concurrent or simultaneous) 녹아웃(knockouts)을 초래한다.
도 1b는 본 개시의 실시 양태에 따른, Sxl (녹색) 및 Tra (황색) 단백질 (회색선)의 암컷 발현에 의해 조절된 sxl, tra 및 dsx 유전자에서의 성 특이적 대안적 스플라이싱의 개략도이다; 주요 성 결정 유전자, sxl, tra 및 dsx의 암컷-특이적 엑손의 파괴는, 암컷의 발달을 방해한다; pgSIT 엑손 표적은 황색 크로스로 표시된다.
도 1c는 본 개시의 실시 양태에 따라 조작된 모든 구축물의 개략도를 제시하고, 기능적 구축물과 파리들은 각각 Addgene.org 및 블루밍톤 드로소필라 스톡 센터(Bloomington Drosophila Stock Center)에 기탁되었다. 유전자 이름 및 gRNA 표적 부위 서열을 박스 내에 나타내었다. SpCas9의 코딩 서열은 양쪽 말단에 2 개의 핵 위치 신호 (NLS) 및 C-말단에 eGFP 코딩 서열을 갖는 자가-절단 T2A 펩티드에 의해 플랭킹되었으며, 이는 Cas9 발현의 시각적 지표로서 작용한다.
도 1d는 본 개시의 실시 양태에 따라 조작된 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9 (Streptococcus pyogenes; SpCas9)를 발현하는 세 개의 새로운 동형접합 라인의 형광 입체 현미경 이미지이다. 엄격하게 생식선에서 또는 체세포와 함께 생식선에서 SpCas9의 발현을 지지하는 세 개의 드로소필라(Drosophila) 라인이 개발되었다. Nanos-Cas9 (nos-Cas9), vasa-Cas9 (vas-Cas9) 및 Ubiquitin-63E (Ubi-Cas9)를 φC31-매개 통합을 사용하여 제 3 염색체의 동일한 부위에 삽입하였다. 도 1c에 나타낸 바와 같이, Opie2-dsRed 전이 유전자는 형질 전환 마커 및 자가-절단 T2A-eGFP 서열로서 역할을 하였고, 이는 SpCas9 코딩 서열의 3'-말단에 부착되었으며, Cas9 발현의 지표를 제공하였다. 각 Cas9 라인에서 dsRed 및 eGFP의 발현 수준을 야생형 (wt) 파리와 비교했다. Cas9-T2A-eGFP 발현은 대부분 nos-Cas9 및 vas-Cas9에서 암컷 생식선으로 제한되었으며, nos-Cas9에서 강한 발현을 나타냈다. Ubi-Cas9는 eGFP에 의해 측정된 Cas9의 가장 강한 발현을 암컷 및 수컷 생식선 및 체세포에서 모두 지지했다.
도 1e는 본 개시의 실시 양태에 따른 조작된 부계 곤충과의 교차의 F1 자손에서의 평균 성별 빈도의 막대 그래프를 도시한다. 2 개의 상부 패널은 동형 접합 sgRNA 라인의 양방향 제어 교차로부터 야생형 (wt)까지의 성별 빈도를 나타내며, 생식력 있는 암컷 및 수컷 (♀ 및 ♂)이 유사한 비율로 존재하지만 불임의 인터섹스(□)는 확인되지 않았다. 생식력 있는 암컷은 분홍색으로 표시되고, 생식력 있는 수컷은 파란색으로 표시되고, 불임 암컷은 주황색으로, 불임 수컷은 회색으로 나타낸다. 하부 2 개의 패널은 동형 접합 나노스-Cas9 (nos-Cas9)의 교차에서 wt (대조군) 및 4 개의 동형 접합 sgRNA 라인(실험)까지의 성별 빈도를 나타낸다. 모계 또는 부계 Cas9 유전과 독립적으로, 100%의 트랜스-이형접합 sgRNASxl ♀가 치사이었고, 100 %의 트랜스-이형접합 sgRNATra 및 sgRNADsxF ♀가 불임 인터섹스□로 웅성화되었고, 100 %의 트랜스-이형접합 sgRNAβTu ♂가 불임되었다. 트랜스-이형접합체에서의 성별 빈도 및 생식력은 nos-Cas9 (실선) 또는 sgRNA (점선) 및 wt 파리를 갖는 상응하는 제어 교차의 자손에서의 것과 비교되었다. 각 막대는 평균 성별 빈도와 하나의 표준 편차를 보여준다. 통계적 유의성은 이분산을 가정하고 t 검정으로 계산하였고, 수컷 불임을 위해, P 값은 분할표를 위한 피어슨의 카이제곱 검정(Pearson’s Chi-squared test)를 사용하여 계산하였다(적색 *). (P > 0.001***).
도 1f는 본 개시의 실시 양태에 따른, 동형접합 단일 gRNA (sgRNA / sgRNA)와 동형접합 nos-Cas9 (nos-Cas9 / nos-Cas9) 사이의 교차로부터의 F1 자손의 표이다.
도 1g (본 명세서에서 도 1g는 도면의 도 1ga와 도 1gb를 포함한다.)는 본 개시의 실시 양태에 따른 방법을 사용하여 gRNA에 의해 표적화 된 유전자형 게놈 유전자좌의 표이며, 여기서 (삽입 / 삭제) 인델 (indels) (적색 글자)은 이형접합 파리에서 발견되었다.
도 2a는 본 개시의 실시 양태에 따른 이중 gRNA (dsRNA) 및 Cas9 동형접합 라인 사이의 교차로부터 생산된 트랜스-이형 접합 F1 자손의 성별 (♀ (암컷), ♂ (수컷) 및 □ 인터 섹스) 빈도의 막대 그래프를 도시한다. βTub와 결합된 sxl, tra 또는 dsx를 각각 표적으로 하는 3 개의 이중 가이드 RNA (dgRNA)는, 나노스 (nanos; nos), 바사 (vasa; vas) 및 유비퀴틴 (Ubiquitin-63E; Ubi) 프로모터에 의해 구동되는 3 개의 Cas9 라인과 양방향으로 교차되었고, 도 1c-1d에서 표시된 바와 같이, 각각의 상호 교차에서 암컷 치사 / 웅성화 및 수컷 불임의 완전한 침투를 보장하기에 충분하다. 트랜스-이형접합체에서의 성별 빈도 및 생식력은 Cas9 (왼쪽 막대 그룹, 실선) 또는 dgRNA (상부 패널, 점선) 및 wt 파리와 상응하는 제어 교차 자손의 것과 비교되었다. 각 막대는 평균 성별 빈도와 하나의 표준 편차를 보여준다. 통계적 유의성은 이분산을 가정하고 t 검정으로 계산하였고, 수컷 불임을 위해, P 값은 분할표를 위한 피어슨의 카이제곱 검정을 사용하여 계산하였다(적색 *). (P > 0.01**, P > 0.001***).
도 2b는 본 개시의 실시 양태에 따른, 동형접합 이중 gRNA (sgRNA / dgRNA) 및 동형접합 Cas9 (Cas9 / Cas9) 라인 사이의 교차로부터의 F1 자손의 표이다.
도 2c는 본 개시의 실시 양태에 따른 자손에서의 성-결정 경로 (상부) 및 상응하는 녹아웃 표현형 (이미지 포함)에서 표적화된 유전자의 순서를 나타내는 데이터 표이다. dgRNA유도-녹아웃과 인터섹스 형태의 표현형은 wt ♀ 및 ♂과 비교하였다. βTub, Sxl 녹아웃 ♀은 도 2d-2e에 나타낸 바와 같이 번데기 단계에서 소멸된다. 나타난 것처럼, 확대된 내부 인서트를 보면 dgRNAβTub,Tra/+; nos-Cas9/+ 인터섹스 (□)는 성즐을 가지나, dgRNAβTub,DsxF/+; nos-Cas9/+□은 아니다.
도 2d는 본 개시의 실시 양태에 따라, 동형접합 nos-Cas9 / nos-Cas9 ♀ 및 dgRNAβTub,Sxl/dgRNAβTub,Sxl ♂ 을 교차시켜 생산된 dgRNAβTub,Sxl/+; nos-Cas9/+ 난에 대해 추정된 부화율(백분율)은 표 2(실시예 6)에 표시된 야생형 (wt) 난과 통계적으로 상이하지 않았다는 것을 보여주는 막대 그래프를 나타낸다. 통계적 유의성은 이분산을 가정하고 t 검정으로 계산하였다. (P <0.05NS, P > 0.001***).
도 2e는 본 개시의 실시 양태에 따라, 부화한 dgRNAβTub,Sxl/+; nos-Cas9/+ 유충에 대한 상이한 결과의 속도를 나타내는 막대 그래프를 나타내고, 그 배치(batches)의 50 마리의 부화 유충을 성체로 키우고, 표 3 (실시예 6)에 나타낸 바와 같이 그들의 성별 또는 사멸의 발달시간을 기록하였다. 추가 유충 사멸의 대부분은 번데기 전이 동안 발생했으며 번데기 사멸률은 wt ♀ 백분율과 통계적으로 다르지 않았다. 이분산을 가정하고 t 검정으로 통계적 유의성을 계산하였다. (P <0.05NS, P > 0.001***)
도 2f는 본 개시의 실시 양태에 따라, Cas9 및 이중 gRNA (dsRNA)를 갖는 트랜스-이형접합 파리의 표현형 특성의 표이다.
도 2g는 본 개시의 실시 양태에 따라, βTub, Tra 녹아웃 □에서의 성즐모(sex comb bristles) 수의 가변 표현성의 현미경 이미지를 도시한다.
도 2h는 본 개시의 실시 양태에 따라, wt 암컷의 내부 생식 기관의 현미경 이미지(상단 이미지): 두개의 난소 (ov), 정액 리셉터클 (Sr), 이중 수정낭 (sp), 두개의 보조 글랜드(ag), 자궁 (ut), 및 dgRNAβTub,Tra/+; nos-Cas9/+□ 인터섹스 파리 (하단 이미지)는 하나의 발육불량(rudimentary) 난소와 수컷의 보조 글랜드와 유사한 기관을 가짐을 보여준다.
도 2i는 본 개시의 실시 양태에 따라, Dsx 유전자의 수컷 및 암컷 스플라이스 변이체가 βTub, Tra 녹아웃 인터섹스로 발현됨을 나타내는 증폭된 전사체의 아가로스 겔(agarose gel) 이미지이다. RT-PCR을 사용하여 야생형 (wt) 암컷 (♀), wt 수컷 (♂) 및 dgRNAβTub,Tra/+; nos-Cas9/+ 인터섹스 (βTub*, Tra* □)를 비교하는 dsx의 암컷-특이적 및 수컷-특이적 대안 스플라이스 변이체를 평가하였다. 암컷 및 수컷-특이적 dsx 전사체 모두 βTub *, Tra * □에서 확인되었다. 이중 가닥 DNA의 분자 사다리 (ML) 및 템플렛이 없는 컨트롤 (No template control; NTC)이 표시되었다.
도 2j는 본 개시의 실시 양태에 따라, dgRNAβTub,DsxF/+; nos-Cas9/+ □ 인터섹스 파리에서는 표시된 대로 수컷-특이적 보조 글랜드 (ag)와 유사한 기관들과 수란관과 종종 연결되지 않은 단일 난소 (ov)만을 개발된 것의 현미경 이미지를 나타낸다.
도 2k는 본 개시의 실시 양태에 따라, 표시된 것처럼 고환 (ts) 및 부신 (ag)을 가진 dgRNAβTub,Sxl/+; nos-Cas9/+ ♂ 파리에서 수컷 내부 생식계의 현미경 이미지를 보여준다.
도 2l은 본 개시의 실시 양태에 따라, 표시된 것처럼 고환 (ts) 및 부신 (ag)을 가진 dgRNAβTub,Sxl/+; nos-Cas9/+ ♂ 파리에서 수컷 내부 생식계의 현미경 이미지를 보여준다.
도 2m은 본 개시의 실시 양태에 따라, 본 도면과 도 2k-2l 에서 표시된 것처럼 dgRNAβTub,Sxl/+; nos-Cas9/+고환 (ts) 에서 발견되지 않은 성숙 정세포를 갖는 길쭉한 낭포를 갖는 야생형 wt 고환 (왼쪽 이미지)의 현미경 이미지를 나타낸다.
도 2n은 본 개시의 실시 양태에 따라, βTub 표적 부위에서 정확하게 모자이크 삽입 / 삭제 (인델; indels)을 나타내는 트랜스-이형접합 dgRNAβTub,Sxl/+; nos-Cas9/+(이중 녹아웃) 불임 수컷 (♂)에서 베타튜뷸린85D (βTub) 표적에 대한 서열 정보의 개략도이다. gRNA 표적 부위 및 표적 유전자의 유전적 구조와 관련된 PCR에 사용되는 프라이머의 상단에 존재하는 다이어그램. 양쪽 끝으로부터의 서열 판독은 불임 ♂에서 gRNA로 표적화된 부위에 특이적으로 위치하는 템플릿의 다양성을 유추한 반면, 야생형 ♂는 임의의 서열 모호성이 없는 단일 대립 유전자를 가졌다.
도 2o는 본 개시의 실시 양태에 따라, 트랜스-이형접합 dgRNAβTub,Sxl/+; nos-Cas9/+ (이중 녹아웃) 불임 수컷(♂)에서 성 치명적 (Sxl) 표적에 대한 서열 정보의 개략도이고, 이는 동일한 dgRNAβTub,Sxl/+; nos-Cas9/+ 불임 수컷 (♂) 의 Sxl 표적 부위에서 확인된 모자이크 인델(indel)을 나타내며, 도 2d-2e에서 관찰된 트랜스-이형접합 암컷의 번데기(pupal) 치사와 관련될 수 있다. gRNA 표적 부위 및 표적 유전자의 유전적 구조와 관련하여 PCR에 사용되는 프라이머의 상단에 있는 다이어그램. 양쪽 끝으로부터의 서열 판독은 불임 ♂에서 gRNA로 표적화된 부위에 특이적으로 위치하는 템플릿의 다양성을 유추한 반면, 야생형 ♂는 임의의 서열 모호성이 없는 단일 대립 유전자를 가졌다. 양쪽 끝으로부터의 서열 판독은 불임 ♂에서 gRNA로 표적화된 부위에 특이적으로 위치하는 템플릿의 다양성을 유추한 반면, 야생형 ♂는 임의의 서열 모호성이 없는 단일 대립 유전자를 가졌다.
도 2p는 본 개시의 실시 양태에 따라, 이형접합 dgRNAβTub,Tra/+; nos-Cas9/+ 이중 녹아웃 불임 수컷 (♂)과 인터섹스 (□) 에서 트랜스포머 (Tra) 표적에 대한 서열 정보의 개략도이고, dgRNAβTub,Tra 이중 가이드 RNA (dgRNA)에 의해 표적화 된 Tra 부위에 위치된 모자이크 삽입 / 삭제 (인델)를 나타낸다. 상단의 다이어그램은 표적 유전자의 유전자 구조와 관련하여 PCR에 사용된 gRNA 표적 및 프라이머의 위치를 보여준다. 야생형 ♂는 양쪽 부위에서 서열 모호성이없는 단일 대립 유전자를 가졌지만, 양쪽 끝으로부터의 서열 판독은 불임 ♂ 및 □에서 gRNA로 표적화된 부위에 특이적으로 위치된 템플릿의 다양성을 유추하였다.
도 2q는 본 개시의 실시 양태에 따라, dgRNAβTub,DsxF/+; nos-Cas9/+ 불임 ♂ 에서 트랜스-이형접합 dgRNAβTub,Dsx 이중 gRNA에서 더블섹스 (DsxF) 표적에 대한 서열 정보의 개략도이고, 모자이크 인델을 보여주는 □는 DsxF 부위 표적에서 확인되었다. 상단의 다이어그램은 표적 유전자의 유전자 구조와 관련하여 PCR에 사용된 gRNA 표적 및 프라이머의 위치를 보여준다. 야생형 ♂는 양쪽 부위에서 서열 모호성이 없는 단일 대립 유전자를 가졌지만, 양쪽 끝으로부터의 서열 판독은 불임 ♂ 및 □에서 gRNA로 표적화된 부위에 특이적으로 위치된 템플릿의 다양성을 유추하였다.
도 3a는 Cas9의 모계 로딩에 의한 우세한 효과의 유전자 정량을 나타내는 막대 그래프를 보여주고, 여기에서 동형 접합 dgRNA와 이형 접합 Cas9 파리 사이의 상호 교차에 의해 생산된 파리의 유전자형, 성별 빈도 및 생식력은 도면 범례(legends)에서 보여지듯이 핑크색, 청색, 오렌지색, 또는 회색 단색 또는 줄무늬 막대에 의해 표시되었다. 이형 접합 부계 Cas9와의 교차로부터의 자손은 좌측 패널에 도시되어 있고 이형 접합 모계 Cas9는 우측 패널에 도시되어있다. 각 막대는 평균 성별 빈도와 하나의 표준 편차를 보여줍니다. 통계적 유의성은 이분산을 가정한 t 테스트로 계산되었다. (P > 0.01**, P > 0.001***). 줄무늬 막대는 유전자로서 Cas9의 유전을 나타내는 반면 단색 막대는 + 대립 유전자의 유전을 나타낸다.
도 3b는 본 개시의 실시 양태에 따른, 배아에서의 유전자형 및 모계 / 접합체 기여의 조합 및 그들의 침투를 나타내는 개략도이다.
도 3c는 본 개시의 실시 양태에 따른, 동형접합 이중 gRNA (dgRNA / dgRNA)와 이형접합 Cas9 (Cas9 / TM3, Sb) 사이의 교차로부터의 F1 자손의 표이다.
도 3d는 곤충 개발 전반에 걸쳐 높은 수준의 이중 대립형질 모자이크형 (BM) 축적이 유기적 수준에서 유전자 기능의 상실을 초래하고 유도된 표현형의 완전한 침투를 보장하는 것을 보여주는 도식적 표이다: 치사율 (치명적 이중 대립형질 모자이크형 (LBM)) (핑크색 박스), 암컷 웅성화, 또는 수컷 불임이 표시되었다. NHEJ에 의해 생산된, 미 절단 wt 대립 형질 (밝은 녹색 박스) 및 저항 대립 형질 (황색 박스)에 의한 일부 세포에서의 유전자 기능의 보완은 유기체 레벨에서 유도된 표현형을 구제하기에 충분하지 않으므로, 트랜스-이형접합 자손의 100 %가 유도된 표현형을 가진다. 세포가 분열함에 따라 박스들이 더 작아지고 더 풍부해진다.
도 4a는 본 개시의 실시 양태에 따라, wt 암컷과의 교미를 확보하기 위해 wt 수컷과 경쟁하는 dgRNAβTub,Sxl/+; nos-Cas9/+ 불임 수컷(적색으로 표시된)의 교미 경쟁력을 추정하기위한 실험 설정의 개략도이다. 교미한 암컷은 약 24 시간 동안 다음 교미에 저항력이 있으며, 불임 수컷의 교미 성공은 생식력 감소 (예 : 부화되지 않은 난율의 증가)에 의해 평가되었다.
도 4b는 도 4c 의 표에 표시된 바와 같이, 낳아진 난의 수를 가장 높은 난의 수 (n = 199)에 대해 정규화하여 난을 백분위 수로 변환한, 낳고 부화한 난의 백분율을 보여주는 막대 그래프를 나타낸다. 1 마리의 불임 수컷의 존재는 1 마리의 wt 수컷 (# 2 대 # 1)의 제거에 의해 설명될 수 없는 암컷 생식력의 현저한 감소 (# 3 대 # 2)를 초래하였다. 통계학적 유의성은 그룹 # 3을 # 2 및 # 1 에 비교하는 이분산을 가정하여 t 검정으로 계산했다. (P> 0.003 **, P> 0.0001 ***)
도 4c는 본 개시의 실시 양태에 따라, 표시된 크로스를 갖는 야생형 수컷과 비교한 dgRNAbTub,Sxl/+; nos-Cas9/+ 수컷에 대한 낳은, 부화되지 않은, 그리고 부화한 난에 기초한 교미 경쟁력의 표이다.
도 4d는 본 개시의 실시 양태에 따라, 부계 (적색선) 또는 모계 (녹색선) Cas9 유전성을 갖는, wt 수컷 (청색선) 및 두 가지 유형의 dgRNAβTub,Sxl/+; nos-Cas9/+ 불임 수컷의 생존 곡선의 그래프이다. 생존 곡선은 세 가지 수컷 그룹에 대한 비 모수적 최대 가능성 추정치 (NPMLE)와, 밝은 음영으로 표시된 부트스트랩 추정 95 % 신뢰 구간 및 어두운 음영으로 표시된 표상적 비고유성(non-uniqueness)을 보여줍니다. y 축은 추정 생존율을 나타낸다. 두 유형의 pgSIT 수컷은 wt 수컷보다 유의하게 더 오래 살았으며 (P < 2.2-16), 두 유형의 pgSIT 수컷 사이에는 통계적으로 유의한 차이가 발견되지 않았다. 썬의 로그 랭크 테스트의 일반화(Sun’s generalization of the logrank test)는 생존 곡선의 차이를 테스트하는데 사용되었다.
도 4e는 본 개시의 실시 양태에 따라, 대조군 w-암컷과 비교한, dgRNAbTub,Sxl/+; nos-Cas9/+ 수컷에 대한 장생 데이터 (일수에 따른 수명)의 표이다.
도 4f는 본 개시의 실시 양태에 따른, 여기에 개시된 바와 같이, 아에데스 아에집티 (Aedes aegypti) 개체군 억제 모델에 사용된 입력 파라미터의 표이다. 상기 표에 표시된 모든 인용 참고 문헌의 전체 내용은 참고로 본원에 포함된다.
도 4g는 본 개시의 실시 양태에 따라, 올 바키아 기반 비호환 곤충 기술 (Wolbachia-based incompatible insect technique; IIT) (보라색)의 방출과 비교하여 아에데스 아에집티 모기 개체군 밀도에 대한 pgSIT 난의 방출 (어두운 청색)의 모델-예측된 영향의 그래프이며, 본원에 기재된 바와 같은 억제 모델을 사용하여 우세한 치사 유전자 (RIDL) (밝은 청색), 및 암컷-특이적 RIDL (fsRIDL) (적색)을 운반하는 곤충의 방출이다. 방출은 삽입 범례에 표시된 바와 같이 방출 비율 (야생 성체에 비해)로 6 개월 동안 매주 수행되었다. 랜덤하게 혼합되는 10,000 성체 암컷와 성체 아에. 아에집티 (Ae. Aegypti) 개체군과 도 4f의 표에서 기술된 모델 파라미터에 대한 MGDrivE 시뮬레이션 프레임 워크의 확률적 구현의 2000 실현을 사용하여 모델 예측을 계산했다. 도시된 바와 같이, pgSIT 방출은 모든 다른 억제 또는 감소 기술의 성능을 능가하여 지역 개체군을 제거할 가장 높은 잠재력을 보여준다.
도 4h는 도 4f의 표에 제시된 바와 같이 모든 다른 파라미터를 일정하게 유지하면서, 수컷 짝짓기 경쟁력에 대한 pgSIT 모델 예측의 민감도, 야생 성체 당 200 개의 난의 방출 비율로 수명 감소를 측정하는 그래프를 보여준다. 성체 암컷 10,000마리의 무작위 혼합된 아에. 아에집티 개체군에 대한 MGDrivE 시뮬레이션 프레임워크의 확률적 구현의 250 실현을 사용하여 모델 예측을 계산했다. 본 개시의 실시 양태에 따르면, 좌측 그래프에서 볼 수 있듯이, 야생 성체 당 200 개 난의 주간 방출 비율로 pgSIT 구축물로 인한 수명 감소를 18 %로 유지하면, 제거는 25 %의 수컷 교미 경쟁에서 확실하게 달성될 수 있다; RIDL 성체 수컷의 경우와 마찬가지로 5 %는 아니다. 본 개시의 실시 양태에 따르면, 우측 그래프에서 볼 수 있듯이, 야생 성체 당 200 개 난의 주간 방출 비율로 수컷의 교미 경쟁력을 78 %로 유지하면, 제거는 75 % 이하의 수명 감소에서 확실하게 달성될 수 있다.
도 4i는 본 개시의 실시 양태에 따르면, 야생 성체 당 200개의 난의 주간 방출 비율이 주어지면 지역적 아에. 아에집티 제거가 확실히 얻어질 수 있는 (황갈색 타일) 광범위한 파라미터 값 (표시된 것과 같이 동시에 다양한 수명 감소 및 수컷 교미 경쟁력)을 보여주는 그래프이다.
도 4j는 도 4f의 표에 제시된 바와 같이 모든 다른 파라미터를 일정하게 유지하면서, 수컷 교미 경쟁력에 대한 pgSIT 모델 예측의 민감도, 야생 성체 당 100개 난의 방출 비율로 수명 감소에 대한 민감도를 측정하는 그래프를 보여준다. 본 개시의 실시 양태에 따르면, 왼쪽 그래프에서 볼 수 있듯이, 야생 성체 당 주당 100 개의 난의 방출 비율과 pgSIT 구축물로 인한 수명 감소를 18 %로 유지하면, 수컷 교미 경쟁력에 대하여 50 %로의 제거가 확실하게 달성될 수 있다; 25 %가 아니다. 본 개시의 실시 양태에 따르면, 오른쪽 그래프에서 볼 수 있듯이, 야생 성체 당 주당 100 개 난의 방출 비율과 수컷 짝짓기 경쟁력을 78 %로 일정하게 유지하면, 수명 감소에 대하여 50 % 또는 50% 이하로의 제거를 확실하게 얻을 수 있다.
도 4k는 본 개시의 실시 양태에 따르면, 야생 성체 1 마리당 100 개의 난의 주당 방출 비율이 주어지면 지역적 아에. 아에집티 제거가 확실하게 달성될 수 있는 (탄 타일) 것에 대한 넓은 범위의 파라미터 값 (표시된 바와 같이 다양한 수명 감소 및 수컷 교미 경쟁력)을 보여주는 그래프이다.
도 5는 본 개시의 실시 양태에 따르면, 분배(예를 들어, 무인 항공기에 의해)를 위한 pgSIT 난 생산을 위해 미국에 위치하고 있는 공장과, 전세계 원격 위치에서 방출되는 공장 (예를 들어, 남미, 아프리카 및 아시아 (핑크색 점))을 도시한 개략도이다.
도 1a는 본 개시의 실시 양태에 따른, 이원성 CRISPR / Cas9 시스템의 두가지 성분인, 상기 엔도뉴클레아제 Cas9 및 가이드 리보핵산 (gRNA) (청색 또는 녹색 표적-특이적 서열을 갖는)을 이용하는 pgSIT의 개략도이며, 분리된 동형접합 라인(homozygous lines)으로 유지되며, 이들의 교차 결과는 F1 불임 수컷에서만 생존을 초래하는 암컷 생존력에 필요한 유전자 및 수컷 불임에 필요한 유전자의 동시적 또는 일시적(concurrent or simultaneous) 녹아웃(knockouts)을 초래한다.
도 1b는 본 개시의 실시 양태에 따른, Sxl (녹색) 및 Tra (황색) 단백질 (회색선)의 암컷 발현에 의해 조절된 sxl, tra 및 dsx 유전자에서의 성 특이적 대안적 스플라이싱의 개략도이다; 주요 성 결정 유전자, sxl, tra 및 dsx의 암컷-특이적 엑손의 파괴는, 암컷의 발달을 방해한다; pgSIT 엑손 표적은 황색 크로스로 표시된다.
도 1c는 본 개시의 실시 양태에 따라 조작된 모든 구축물의 개략도를 제시하고, 기능적 구축물과 파리들은 각각 Addgene.org 및 블루밍톤 드로소필라 스톡 센터(Bloomington Drosophila Stock Center)에 기탁되었다. 유전자 이름 및 gRNA 표적 부위 서열을 박스 내에 나타내었다. SpCas9의 코딩 서열은 양쪽 말단에 2 개의 핵 위치 신호 (NLS) 및 C-말단에 eGFP 코딩 서열을 갖는 자가-절단 T2A 펩티드에 의해 플랭킹되었으며, 이는 Cas9 발현의 시각적 지표로서 작용한다.
도 1d는 본 개시의 실시 양태에 따라 조작된 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9 (Streptococcus pyogenes; SpCas9)를 발현하는 세 개의 새로운 동형접합 라인의 형광 입체 현미경 이미지이다. 엄격하게 생식선에서 또는 체세포와 함께 생식선에서 SpCas9의 발현을 지지하는 세 개의 드로소필라(Drosophila) 라인이 개발되었다. Nanos-Cas9 (nos-Cas9), vasa-Cas9 (vas-Cas9) 및 Ubiquitin-63E (Ubi-Cas9)를 φC31-매개 통합을 사용하여 제 3 염색체의 동일한 부위에 삽입하였다. 도 1c에 나타낸 바와 같이, Opie2-dsRed 전이 유전자는 형질 전환 마커 및 자가-절단 T2A-eGFP 서열로서 역할을 하였고, 이는 SpCas9 코딩 서열의 3'-말단에 부착되었으며, Cas9 발현의 지표를 제공하였다. 각 Cas9 라인에서 dsRed 및 eGFP의 발현 수준을 야생형 (wt) 파리와 비교했다. Cas9-T2A-eGFP 발현은 대부분 nos-Cas9 및 vas-Cas9에서 암컷 생식선으로 제한되었으며, nos-Cas9에서 강한 발현을 나타냈다. Ubi-Cas9는 eGFP에 의해 측정된 Cas9의 가장 강한 발현을 암컷 및 수컷 생식선 및 체세포에서 모두 지지했다.
도 1e는 본 개시의 실시 양태에 따른 조작된 부계 곤충과의 교차의 F1 자손에서의 평균 성별 빈도의 막대 그래프를 도시한다. 2 개의 상부 패널은 동형 접합 sgRNA 라인의 양방향 제어 교차로부터 야생형 (wt)까지의 성별 빈도를 나타내며, 생식력 있는 암컷 및 수컷 (♀ 및 ♂)이 유사한 비율로 존재하지만 불임의 인터섹스(□)는 확인되지 않았다. 생식력 있는 암컷은 분홍색으로 표시되고, 생식력 있는 수컷은 파란색으로 표시되고, 불임 암컷은 주황색으로, 불임 수컷은 회색으로 나타낸다. 하부 2 개의 패널은 동형 접합 나노스-Cas9 (nos-Cas9)의 교차에서 wt (대조군) 및 4 개의 동형 접합 sgRNA 라인(실험)까지의 성별 빈도를 나타낸다. 모계 또는 부계 Cas9 유전과 독립적으로, 100%의 트랜스-이형접합 sgRNASxl ♀가 치사이었고, 100 %의 트랜스-이형접합 sgRNATra 및 sgRNADsxF ♀가 불임 인터섹스□로 웅성화되었고, 100 %의 트랜스-이형접합 sgRNAβTu ♂가 불임되었다. 트랜스-이형접합체에서의 성별 빈도 및 생식력은 nos-Cas9 (실선) 또는 sgRNA (점선) 및 wt 파리를 갖는 상응하는 제어 교차의 자손에서의 것과 비교되었다. 각 막대는 평균 성별 빈도와 하나의 표준 편차를 보여준다. 통계적 유의성은 이분산을 가정하고 t 검정으로 계산하였고, 수컷 불임을 위해, P 값은 분할표를 위한 피어슨의 카이제곱 검정(Pearson’s Chi-squared test)를 사용하여 계산하였다(적색 *). (P > 0.001***).
도 1f는 본 개시의 실시 양태에 따른, 동형접합 단일 gRNA (sgRNA / sgRNA)와 동형접합 nos-Cas9 (nos-Cas9 / nos-Cas9) 사이의 교차로부터의 F1 자손의 표이다.
도 1g (본 명세서에서 도 1g는 도면의 도 1ga와 도 1gb를 포함한다.)는 본 개시의 실시 양태에 따른 방법을 사용하여 gRNA에 의해 표적화 된 유전자형 게놈 유전자좌의 표이며, 여기서 (삽입 / 삭제) 인델 (indels) (적색 글자)은 이형접합 파리에서 발견되었다.
도 2a는 본 개시의 실시 양태에 따른 이중 gRNA (dsRNA) 및 Cas9 동형접합 라인 사이의 교차로부터 생산된 트랜스-이형 접합 F1 자손의 성별 (♀ (암컷), ♂ (수컷) 및 □ 인터 섹스) 빈도의 막대 그래프를 도시한다. βTub와 결합된 sxl, tra 또는 dsx를 각각 표적으로 하는 3 개의 이중 가이드 RNA (dgRNA)는, 나노스 (nanos; nos), 바사 (vasa; vas) 및 유비퀴틴 (Ubiquitin-63E; Ubi) 프로모터에 의해 구동되는 3 개의 Cas9 라인과 양방향으로 교차되었고, 도 1c-1d에서 표시된 바와 같이, 각각의 상호 교차에서 암컷 치사 / 웅성화 및 수컷 불임의 완전한 침투를 보장하기에 충분하다. 트랜스-이형접합체에서의 성별 빈도 및 생식력은 Cas9 (왼쪽 막대 그룹, 실선) 또는 dgRNA (상부 패널, 점선) 및 wt 파리와 상응하는 제어 교차 자손의 것과 비교되었다. 각 막대는 평균 성별 빈도와 하나의 표준 편차를 보여준다. 통계적 유의성은 이분산을 가정하고 t 검정으로 계산하였고, 수컷 불임을 위해, P 값은 분할표를 위한 피어슨의 카이제곱 검정을 사용하여 계산하였다(적색 *). (P > 0.01**, P > 0.001***).
도 2b는 본 개시의 실시 양태에 따른, 동형접합 이중 gRNA (sgRNA / dgRNA) 및 동형접합 Cas9 (Cas9 / Cas9) 라인 사이의 교차로부터의 F1 자손의 표이다.
도 2c는 본 개시의 실시 양태에 따른 자손에서의 성-결정 경로 (상부) 및 상응하는 녹아웃 표현형 (이미지 포함)에서 표적화된 유전자의 순서를 나타내는 데이터 표이다. dgRNA유도-녹아웃과 인터섹스 형태의 표현형은 wt ♀ 및 ♂과 비교하였다. βTub, Sxl 녹아웃 ♀은 도 2d-2e에 나타낸 바와 같이 번데기 단계에서 소멸된다. 나타난 것처럼, 확대된 내부 인서트를 보면 dgRNAβTub,Tra/+; nos-Cas9/+ 인터섹스 (□)는 성즐을 가지나, dgRNAβTub,DsxF/+; nos-Cas9/+□은 아니다.
도 2d는 본 개시의 실시 양태에 따라, 동형접합 nos-Cas9 / nos-Cas9 ♀ 및 dgRNAβTub,Sxl/dgRNAβTub,Sxl ♂ 을 교차시켜 생산된 dgRNAβTub,Sxl/+; nos-Cas9/+ 난에 대해 추정된 부화율(백분율)은 표 2(실시예 6)에 표시된 야생형 (wt) 난과 통계적으로 상이하지 않았다는 것을 보여주는 막대 그래프를 나타낸다. 통계적 유의성은 이분산을 가정하고 t 검정으로 계산하였다. (P <0.05NS, P > 0.001***).
도 2e는 본 개시의 실시 양태에 따라, 부화한 dgRNAβTub,Sxl/+; nos-Cas9/+ 유충에 대한 상이한 결과의 속도를 나타내는 막대 그래프를 나타내고, 그 배치(batches)의 50 마리의 부화 유충을 성체로 키우고, 표 3 (실시예 6)에 나타낸 바와 같이 그들의 성별 또는 사멸의 발달시간을 기록하였다. 추가 유충 사멸의 대부분은 번데기 전이 동안 발생했으며 번데기 사멸률은 wt ♀ 백분율과 통계적으로 다르지 않았다. 이분산을 가정하고 t 검정으로 통계적 유의성을 계산하였다. (P <0.05NS, P > 0.001***)
도 2f는 본 개시의 실시 양태에 따라, Cas9 및 이중 gRNA (dsRNA)를 갖는 트랜스-이형접합 파리의 표현형 특성의 표이다.
도 2g는 본 개시의 실시 양태에 따라, βTub, Tra 녹아웃 □에서의 성즐모(sex comb bristles) 수의 가변 표현성의 현미경 이미지를 도시한다.
도 2h는 본 개시의 실시 양태에 따라, wt 암컷의 내부 생식 기관의 현미경 이미지(상단 이미지): 두개의 난소 (ov), 정액 리셉터클 (Sr), 이중 수정낭 (sp), 두개의 보조 글랜드(ag), 자궁 (ut), 및 dgRNAβTub,Tra/+; nos-Cas9/+□ 인터섹스 파리 (하단 이미지)는 하나의 발육불량(rudimentary) 난소와 수컷의 보조 글랜드와 유사한 기관을 가짐을 보여준다.
도 2i는 본 개시의 실시 양태에 따라, Dsx 유전자의 수컷 및 암컷 스플라이스 변이체가 βTub, Tra 녹아웃 인터섹스로 발현됨을 나타내는 증폭된 전사체의 아가로스 겔(agarose gel) 이미지이다. RT-PCR을 사용하여 야생형 (wt) 암컷 (♀), wt 수컷 (♂) 및 dgRNAβTub,Tra/+; nos-Cas9/+ 인터섹스 (βTub*, Tra* □)를 비교하는 dsx의 암컷-특이적 및 수컷-특이적 대안 스플라이스 변이체를 평가하였다. 암컷 및 수컷-특이적 dsx 전사체 모두 βTub *, Tra * □에서 확인되었다. 이중 가닥 DNA의 분자 사다리 (ML) 및 템플렛이 없는 컨트롤 (No template control; NTC)이 표시되었다.
도 2j는 본 개시의 실시 양태에 따라, dgRNAβTub,DsxF/+; nos-Cas9/+ □ 인터섹스 파리에서는 표시된 대로 수컷-특이적 보조 글랜드 (ag)와 유사한 기관들과 수란관과 종종 연결되지 않은 단일 난소 (ov)만을 개발된 것의 현미경 이미지를 나타낸다.
도 2k는 본 개시의 실시 양태에 따라, 표시된 것처럼 고환 (ts) 및 부신 (ag)을 가진 dgRNAβTub,Sxl/+; nos-Cas9/+ ♂ 파리에서 수컷 내부 생식계의 현미경 이미지를 보여준다.
도 2l은 본 개시의 실시 양태에 따라, 표시된 것처럼 고환 (ts) 및 부신 (ag)을 가진 dgRNAβTub,Sxl/+; nos-Cas9/+ ♂ 파리에서 수컷 내부 생식계의 현미경 이미지를 보여준다.
도 2m은 본 개시의 실시 양태에 따라, 본 도면과 도 2k-2l 에서 표시된 것처럼 dgRNAβTub,Sxl/+; nos-Cas9/+고환 (ts) 에서 발견되지 않은 성숙 정세포를 갖는 길쭉한 낭포를 갖는 야생형 wt 고환 (왼쪽 이미지)의 현미경 이미지를 나타낸다.
도 2n은 본 개시의 실시 양태에 따라, βTub 표적 부위에서 정확하게 모자이크 삽입 / 삭제 (인델; indels)을 나타내는 트랜스-이형접합 dgRNAβTub,Sxl/+; nos-Cas9/+(이중 녹아웃) 불임 수컷 (♂)에서 베타튜뷸린85D (βTub) 표적에 대한 서열 정보의 개략도이다. gRNA 표적 부위 및 표적 유전자의 유전적 구조와 관련된 PCR에 사용되는 프라이머의 상단에 존재하는 다이어그램. 양쪽 끝으로부터의 서열 판독은 불임 ♂에서 gRNA로 표적화된 부위에 특이적으로 위치하는 템플릿의 다양성을 유추한 반면, 야생형 ♂는 임의의 서열 모호성이 없는 단일 대립 유전자를 가졌다.
도 2o는 본 개시의 실시 양태에 따라, 트랜스-이형접합 dgRNAβTub,Sxl/+; nos-Cas9/+ (이중 녹아웃) 불임 수컷(♂)에서 성 치명적 (Sxl) 표적에 대한 서열 정보의 개략도이고, 이는 동일한 dgRNAβTub,Sxl/+; nos-Cas9/+ 불임 수컷 (♂) 의 Sxl 표적 부위에서 확인된 모자이크 인델(indel)을 나타내며, 도 2d-2e에서 관찰된 트랜스-이형접합 암컷의 번데기(pupal) 치사와 관련될 수 있다. gRNA 표적 부위 및 표적 유전자의 유전적 구조와 관련하여 PCR에 사용되는 프라이머의 상단에 있는 다이어그램. 양쪽 끝으로부터의 서열 판독은 불임 ♂에서 gRNA로 표적화된 부위에 특이적으로 위치하는 템플릿의 다양성을 유추한 반면, 야생형 ♂는 임의의 서열 모호성이 없는 단일 대립 유전자를 가졌다. 양쪽 끝으로부터의 서열 판독은 불임 ♂에서 gRNA로 표적화된 부위에 특이적으로 위치하는 템플릿의 다양성을 유추한 반면, 야생형 ♂는 임의의 서열 모호성이 없는 단일 대립 유전자를 가졌다.
도 2p는 본 개시의 실시 양태에 따라, 이형접합 dgRNAβTub,Tra/+; nos-Cas9/+ 이중 녹아웃 불임 수컷 (♂)과 인터섹스 (□) 에서 트랜스포머 (Tra) 표적에 대한 서열 정보의 개략도이고, dgRNAβTub,Tra 이중 가이드 RNA (dgRNA)에 의해 표적화 된 Tra 부위에 위치된 모자이크 삽입 / 삭제 (인델)를 나타낸다. 상단의 다이어그램은 표적 유전자의 유전자 구조와 관련하여 PCR에 사용된 gRNA 표적 및 프라이머의 위치를 보여준다. 야생형 ♂는 양쪽 부위에서 서열 모호성이없는 단일 대립 유전자를 가졌지만, 양쪽 끝으로부터의 서열 판독은 불임 ♂ 및 □에서 gRNA로 표적화된 부위에 특이적으로 위치된 템플릿의 다양성을 유추하였다.
도 2q는 본 개시의 실시 양태에 따라, dgRNAβTub,DsxF/+; nos-Cas9/+ 불임 ♂ 에서 트랜스-이형접합 dgRNAβTub,Dsx 이중 gRNA에서 더블섹스 (DsxF) 표적에 대한 서열 정보의 개략도이고, 모자이크 인델을 보여주는 □는 DsxF 부위 표적에서 확인되었다. 상단의 다이어그램은 표적 유전자의 유전자 구조와 관련하여 PCR에 사용된 gRNA 표적 및 프라이머의 위치를 보여준다. 야생형 ♂는 양쪽 부위에서 서열 모호성이 없는 단일 대립 유전자를 가졌지만, 양쪽 끝으로부터의 서열 판독은 불임 ♂ 및 □에서 gRNA로 표적화된 부위에 특이적으로 위치된 템플릿의 다양성을 유추하였다.
도 3a는 Cas9의 모계 로딩에 의한 우세한 효과의 유전자 정량을 나타내는 막대 그래프를 보여주고, 여기에서 동형 접합 dgRNA와 이형 접합 Cas9 파리 사이의 상호 교차에 의해 생산된 파리의 유전자형, 성별 빈도 및 생식력은 도면 범례(legends)에서 보여지듯이 핑크색, 청색, 오렌지색, 또는 회색 단색 또는 줄무늬 막대에 의해 표시되었다. 이형 접합 부계 Cas9와의 교차로부터의 자손은 좌측 패널에 도시되어 있고 이형 접합 모계 Cas9는 우측 패널에 도시되어있다. 각 막대는 평균 성별 빈도와 하나의 표준 편차를 보여줍니다. 통계적 유의성은 이분산을 가정한 t 테스트로 계산되었다. (P > 0.01**, P > 0.001***). 줄무늬 막대는 유전자로서 Cas9의 유전을 나타내는 반면 단색 막대는 + 대립 유전자의 유전을 나타낸다.
도 3b는 본 개시의 실시 양태에 따른, 배아에서의 유전자형 및 모계 / 접합체 기여의 조합 및 그들의 침투를 나타내는 개략도이다.
도 3c는 본 개시의 실시 양태에 따른, 동형접합 이중 gRNA (dgRNA / dgRNA)와 이형접합 Cas9 (Cas9 / TM3, Sb) 사이의 교차로부터의 F1 자손의 표이다.
도 3d는 곤충 개발 전반에 걸쳐 높은 수준의 이중 대립형질 모자이크형 (BM) 축적이 유기적 수준에서 유전자 기능의 상실을 초래하고 유도된 표현형의 완전한 침투를 보장하는 것을 보여주는 도식적 표이다: 치사율 (치명적 이중 대립형질 모자이크형 (LBM)) (핑크색 박스), 암컷 웅성화, 또는 수컷 불임이 표시되었다. NHEJ에 의해 생산된, 미 절단 wt 대립 형질 (밝은 녹색 박스) 및 저항 대립 형질 (황색 박스)에 의한 일부 세포에서의 유전자 기능의 보완은 유기체 레벨에서 유도된 표현형을 구제하기에 충분하지 않으므로, 트랜스-이형접합 자손의 100 %가 유도된 표현형을 가진다. 세포가 분열함에 따라 박스들이 더 작아지고 더 풍부해진다.
도 4a는 본 개시의 실시 양태에 따라, wt 암컷과의 교미를 확보하기 위해 wt 수컷과 경쟁하는 dgRNAβTub,Sxl/+; nos-Cas9/+ 불임 수컷(적색으로 표시된)의 교미 경쟁력을 추정하기위한 실험 설정의 개략도이다. 교미한 암컷은 약 24 시간 동안 다음 교미에 저항력이 있으며, 불임 수컷의 교미 성공은 생식력 감소 (예 : 부화되지 않은 난율의 증가)에 의해 평가되었다.
도 4b는 도 4c 의 표에 표시된 바와 같이, 낳아진 난의 수를 가장 높은 난의 수 (n = 199)에 대해 정규화하여 난을 백분위 수로 변환한, 낳고 부화한 난의 백분율을 보여주는 막대 그래프를 나타낸다. 1 마리의 불임 수컷의 존재는 1 마리의 wt 수컷 (# 2 대 # 1)의 제거에 의해 설명될 수 없는 암컷 생식력의 현저한 감소 (# 3 대 # 2)를 초래하였다. 통계학적 유의성은 그룹 # 3을 # 2 및 # 1 에 비교하는 이분산을 가정하여 t 검정으로 계산했다. (P> 0.003 **, P> 0.0001 ***)
도 4c는 본 개시의 실시 양태에 따라, 표시된 크로스를 갖는 야생형 수컷과 비교한 dgRNAbTub,Sxl/+; nos-Cas9/+ 수컷에 대한 낳은, 부화되지 않은, 그리고 부화한 난에 기초한 교미 경쟁력의 표이다.
도 4d는 본 개시의 실시 양태에 따라, 부계 (적색선) 또는 모계 (녹색선) Cas9 유전성을 갖는, wt 수컷 (청색선) 및 두 가지 유형의 dgRNAβTub,Sxl/+; nos-Cas9/+ 불임 수컷의 생존 곡선의 그래프이다. 생존 곡선은 세 가지 수컷 그룹에 대한 비 모수적 최대 가능성 추정치 (NPMLE)와, 밝은 음영으로 표시된 부트스트랩 추정 95 % 신뢰 구간 및 어두운 음영으로 표시된 표상적 비고유성(non-uniqueness)을 보여줍니다. y 축은 추정 생존율을 나타낸다. 두 유형의 pgSIT 수컷은 wt 수컷보다 유의하게 더 오래 살았으며 (P < 2.2-16), 두 유형의 pgSIT 수컷 사이에는 통계적으로 유의한 차이가 발견되지 않았다. 썬의 로그 랭크 테스트의 일반화(Sun’s generalization of the logrank test)는 생존 곡선의 차이를 테스트하는데 사용되었다.
도 4e는 본 개시의 실시 양태에 따라, 대조군 w-암컷과 비교한, dgRNAbTub,Sxl/+; nos-Cas9/+ 수컷에 대한 장생 데이터 (일수에 따른 수명)의 표이다.
도 4f는 본 개시의 실시 양태에 따른, 여기에 개시된 바와 같이, 아에데스 아에집티 (Aedes aegypti) 개체군 억제 모델에 사용된 입력 파라미터의 표이다. 상기 표에 표시된 모든 인용 참고 문헌의 전체 내용은 참고로 본원에 포함된다.
도 4g는 본 개시의 실시 양태에 따라, 올 바키아 기반 비호환 곤충 기술 (Wolbachia-based incompatible insect technique; IIT) (보라색)의 방출과 비교하여 아에데스 아에집티 모기 개체군 밀도에 대한 pgSIT 난의 방출 (어두운 청색)의 모델-예측된 영향의 그래프이며, 본원에 기재된 바와 같은 억제 모델을 사용하여 우세한 치사 유전자 (RIDL) (밝은 청색), 및 암컷-특이적 RIDL (fsRIDL) (적색)을 운반하는 곤충의 방출이다. 방출은 삽입 범례에 표시된 바와 같이 방출 비율 (야생 성체에 비해)로 6 개월 동안 매주 수행되었다. 랜덤하게 혼합되는 10,000 성체 암컷와 성체 아에. 아에집티 (Ae. Aegypti) 개체군과 도 4f의 표에서 기술된 모델 파라미터에 대한 MGDrivE 시뮬레이션 프레임 워크의 확률적 구현의 2000 실현을 사용하여 모델 예측을 계산했다. 도시된 바와 같이, pgSIT 방출은 모든 다른 억제 또는 감소 기술의 성능을 능가하여 지역 개체군을 제거할 가장 높은 잠재력을 보여준다.
도 4h는 도 4f의 표에 제시된 바와 같이 모든 다른 파라미터를 일정하게 유지하면서, 수컷 짝짓기 경쟁력에 대한 pgSIT 모델 예측의 민감도, 야생 성체 당 200 개의 난의 방출 비율로 수명 감소를 측정하는 그래프를 보여준다. 성체 암컷 10,000마리의 무작위 혼합된 아에. 아에집티 개체군에 대한 MGDrivE 시뮬레이션 프레임워크의 확률적 구현의 250 실현을 사용하여 모델 예측을 계산했다. 본 개시의 실시 양태에 따르면, 좌측 그래프에서 볼 수 있듯이, 야생 성체 당 200 개 난의 주간 방출 비율로 pgSIT 구축물로 인한 수명 감소를 18 %로 유지하면, 제거는 25 %의 수컷 교미 경쟁에서 확실하게 달성될 수 있다; RIDL 성체 수컷의 경우와 마찬가지로 5 %는 아니다. 본 개시의 실시 양태에 따르면, 우측 그래프에서 볼 수 있듯이, 야생 성체 당 200 개 난의 주간 방출 비율로 수컷의 교미 경쟁력을 78 %로 유지하면, 제거는 75 % 이하의 수명 감소에서 확실하게 달성될 수 있다.
도 4i는 본 개시의 실시 양태에 따르면, 야생 성체 당 200개의 난의 주간 방출 비율이 주어지면 지역적 아에. 아에집티 제거가 확실히 얻어질 수 있는 (황갈색 타일) 광범위한 파라미터 값 (표시된 것과 같이 동시에 다양한 수명 감소 및 수컷 교미 경쟁력)을 보여주는 그래프이다.
도 4j는 도 4f의 표에 제시된 바와 같이 모든 다른 파라미터를 일정하게 유지하면서, 수컷 교미 경쟁력에 대한 pgSIT 모델 예측의 민감도, 야생 성체 당 100개 난의 방출 비율로 수명 감소에 대한 민감도를 측정하는 그래프를 보여준다. 본 개시의 실시 양태에 따르면, 왼쪽 그래프에서 볼 수 있듯이, 야생 성체 당 주당 100 개의 난의 방출 비율과 pgSIT 구축물로 인한 수명 감소를 18 %로 유지하면, 수컷 교미 경쟁력에 대하여 50 %로의 제거가 확실하게 달성될 수 있다; 25 %가 아니다. 본 개시의 실시 양태에 따르면, 오른쪽 그래프에서 볼 수 있듯이, 야생 성체 당 주당 100 개 난의 방출 비율과 수컷 짝짓기 경쟁력을 78 %로 일정하게 유지하면, 수명 감소에 대하여 50 % 또는 50% 이하로의 제거를 확실하게 얻을 수 있다.
도 4k는 본 개시의 실시 양태에 따르면, 야생 성체 1 마리당 100 개의 난의 주당 방출 비율이 주어지면 지역적 아에. 아에집티 제거가 확실하게 달성될 수 있는 (탄 타일) 것에 대한 넓은 범위의 파라미터 값 (표시된 바와 같이 다양한 수명 감소 및 수컷 교미 경쟁력)을 보여주는 그래프이다.
도 5는 본 개시의 실시 양태에 따르면, 분배(예를 들어, 무인 항공기에 의해)를 위한 pgSIT 난 생산을 위해 미국에 위치하고 있는 공장과, 전세계 원격 위치에서 방출되는 공장 (예를 들어, 남미, 아프리카 및 아시아 (핑크색 점))을 도시한 개략도이다.
불임 곤충 기술 (SIT)은 야생 개체군을 감소시키기 위해 억제하는 환경적으로 안전하고 입증된 기술이다. 본 개시의 실시 양태는 본원에서 "정밀 유도 SIT"(precision guided SIT ; pgSIT) 방법으로 지칭되는 CRISPR 기반 기술을 사용하여 곤충을 유전적으로 변형시키는 방법을 포함한다. 본 발명 전반에 걸쳐보다 상세하게 개시된 바와 같이, pgSIT 방법은 곤충에서 동시적 또는 일시적으로 암수감별(sexing) 및 불임(sterilizing)을 가능하게 하는 주요(dominant) 유전적 기술에 기계적으로 의존한다. 곤충 난의 동시적 암수감별 및 불임은 난을 불임 성체 수컷이 출현하도록 보장하는 환경에 방출하는 능력을 허용한다. 현장 적용에서, 상기 난의 방출은 수컷을 수작업으로 암수감별 및 불임시키는 부담을 제거함으로써 전체 노력을 줄이고 확장성을 증가시킨다.
본 개시의 실시 양태에 따른 pgSIT 기술의 효능을 입증하기 위해, 다수의 pgSIT 시스템이 예시적 곤충으로서 드로소필라 (Drosophila)에서 조작되고 입증되었다. 본원에 기술되고 참조된 유전적 기술 및 방법은 광범위한 곤충에 적용 가능한 것으로 이해된다.
현재 개시된 수컷 성별의 pgSIT 방법과 및 수컷 성별과 불임의 방법은 CRISPR-기반 기술의 정확성 및 정확성을 사용하여 암컷 생존력에 필수적인 유전자를 파괴하거나 (수컷 감별을 위해) 암컷 생존력과 수컷 생식력에 필수적인 유전자를 동시적 또는 일시적으로 파괴한다. 본 개시의 pgSIT 방법은 두 개의 곤충 균주 (제 1 부모 계통 및 제 2 부모 계통)를 필요로 하는 간단한 번식(breeding) 계획을 이용하는데, 하나는 엔도뉴클레아제 (예를 들어, Cas9)를 발현하고 다른 하나는 파괴될 유전자(들)로 유도되는 적어도 하나의 가이드 폴리 뉴클레오티드를 갖는 핵산 서열 구축물(construct)을 발현한다. 이러한 두 개의 부모 계통 사이의 단일 교미(single mating)는 개발 전반에 걸쳐 기계적으로 표적 유전자 또는 유전자들의 동기적 폴리뉴클레오티드-유도 (예를 들어, RNA- 유도) 우성 대립형질 또는 우성 이중 대립형질 녹아웃을 초래한다.
CRISPR 기술은 클러스터된 규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문 반복(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)을 지칭하고, Mol. Cell 58, 568-574 (2015), Sternberg and Doudna 에 개시된 바와 같이 대부분의 연구된 유기체에서 게놈 편집을 위해 광범위하게 연구되고 변형되었다. 이 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
본원에 사용된, CRISPR-기반 기술과 관련하여, "가이드 폴리뉴클레오티드"라는 용어는 "합성 서열"을 갖는 폴리뉴클레오티드를 지칭하며, 이는 상응하는 엔도뉴클레아제 효소 단백질 (예를 들어, Cas9)과 게놈 표적(예를 들어, 표적 유전자의 엑손에서 발견되는 뉴클레오타이드 서열)에 붙을 수 있는 가변 표적 서열을 결합시킬 수 있다. 본 개시의 일부 실시 양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 가이드 리보 핵산 (gRNA)이다. 본 발명의 실시예에서, 가이드 폴리뉴클레오타이드의 가변 표적 서열은 나머지 게놈과 관련하여 독특하고 프로토스페이서 인접 모티프 (Protospacer Adjacent Motif; PAM)에 바로 인접한 표적 내의 임의의 서열이다. PAM 서열의 정확한 서열은 상이한 엔도뉴클레아제가 상이한 PAM 서열을 요구함에 따라 달라질 수 있다. 본원에 사용된 표현 "두 개의 상이한 단일 가이드 RNA (sgRNA)를 갖는 단일 이종 구축물"는 이중 가이드 RNA (dgRNA)를 지칭한다.
CRISPR-기반 기술의 엔도뉴클레아제 효소 단백질과 관련하여, "엔도뉴클레아제"라는 용어는 적합한 엔도뉴클레아제 효소 단백질 또는 그 변이체를 지칭하는 것으로, 이는 특히 선택된 가이드 폴리뉴클레오티드에 의해 효소적으로 가이드 폴리뉴클레오티드의 표적 서열을 녹아웃(knock-out) 하도록 한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 엔도뉴클레아제와 관련하여 사용되는 용어 "이의 변이체"는 적합한 숙주 유기체 또는 발현 시스템에서 발현된, 및/또는 엔도뉴클레아제의 효소적 활성을 향상시키는 변경을 포함하는, 효소적으로 기능하는 형태를 지칭한다.
본 개시 전반에 걸쳐 개시된 실시예들은 적어도 2 개의 가이드 폴리뉴클레오타이드를 사용하여 암컷 생존력 유전자 및 수컷 생식력 유전자 둘 모두가 저해된 불임 수컷 곤충 자손의 생산 방법을 나타낸다. 그러나, 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 수컷 성별을 지시하는 방법은 암컷 생존력에 필수적인 유전자가 표적화되고 수컷 불임에 대한 유전자는 표적화되지 않는 현재 개시된 방법을 포함한다. 예를 들어, 도 1a에서 엔도뉴클레아제 부모 곤충 (Cas9 라인으로 표시됨)은 암컷 필수 유전자 및 수컷 불임 유전자를 표적으로 하는 2 개의 gRNA (1 개의 청색, 1 개의 녹색)를 갖는 가이드 RNA 부모 곤충 (gRNA 라인)과 교차된다. 그러나, 수컷 성별을 지시하는 방법에서, gRNA 라인은 수컷 불임 유전자를 발현하도록 유전적으로 변형되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "통합(integrating)", "통합(integration)" 및 유사한 용어는 이종 재조합 핵산 서열을 표적 곤충 내로 도입하는 것을 지칭한다. 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 곤충의 유전자 변형 기술은 공지되어 있고, 예를 들면 Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, 2: 68-99, (1984)에서와 같이 기술되어 있고, 그 전문이 본원에 참고자료로 포함된다. 본원에 사용된 통합(Integrating)은 재조합 핵산 서열의 표적 곤충 게놈 내로의 통합을 지칭할 수 있다. 표적 곤충의 게놈은 표적 곤충의 적어도 하나의 염색체를 포함하지만, 모든 관련 염색체 카피를 포함할 수 있다. 이와 같이, 게놈으로의 통합은 이형접합 또는 동형접합일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어인 표적 곤충 내로 "엔도뉴클레아제의 도입"은 엔도뉴클레아제가 곤충에 존재하도록 엔도뉴클레아제를 곤충 내로 재조합 도입하는 것을 의미한다. 곤충 내 엔도뉴클레아제의 도입은 게놈 통합을 요구하지 않지만, 게놈 통합을 포함할 수 있다. 예를 들면, 엔도뉴클레아제의 도입은 예로써 Lin and Potter, G3, (2016), doi:10.1534/g3.116.034884에 기술된 것과 같이 곤충 내로 엔도뉴클레아제를 "침착(depositing)" 하는 것을 포함할 수 있고, 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
또한, 본 개시의 예는 최대 100 % 수컷 불임 자손을 얻는 방법을 포함하지만, 100 % 미만의 수컷 불임 자손을 생산하는 방법도 본 발명의 범위 내에 포함된다. 예를 들어, 본 개시의 일부 양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드를 발현하는 부모(parental) 곤충 균주는 가이드 폴리뉴클레오티드 (단일, 이중 또는 그 이상의 가이드 폴리뉴클레오티드)에 대해 이형접합성 또는 동형접합성일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드를 발현하는 부모 곤충 균주는 가이드 폴리 뉴클레오티드에 대해 동형접합성이므로, 모든 자손이 가이드 폴리뉴클레오티드를 수용하도록 보장한다.
도 2a 및 3a에서, 본 개시의 또 다른 양태에서, 엔도뉴클레아제를 발현하는 부모 곤충 계통이 수컷이면, 그 수컷 부모 곤충은 엔도뉴클레아제에 대해 이형접합성 또는 동형접합성일 수 있는 반면, 엔도뉴클레아제를 발현하는 부모 곤충 계통이 암컷이면, 엔도뉴클레아제가 암컷에 침착되거나, 이형접합성 또는 동형접합성으로 발현될 수 있다.
도 2f에서, 양쪽 부모 균주가 각각의 엔도뉴클레아제 또는 가이드 폴리뉴클레오타이드에 대해 동형접합인 경우, 모든 또는 거의 모든 자손은 비-멘델리아 완전 침투(non-Mendelian complete penetrance)의 결과로 엔도뉴클레아제 및 가이드 폴리뉴클레오타이드(들)를 받는다. 따라서, 모든 자손에서 원하는 표현형 (예를 들어, 모든 수컷 곤충 또는 모든 수컷 및 불임 곤충)이 단일 세대로 생산될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "거의 모든 자손"은 적어도 자손의 70 %, 75 % 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 %를 가리킨다. 표 3을 참조하면, 본 개시의 일부 실시 양태에서, 자손의 생존력은 성인 단계에서 결정된다.
본 개시의 일부 실시 양태에서, 수컷 성별을 지시하는 방법은 엔도뉴클레아제를 제 1 곤충 부모에 도입하는 단계; 적어도 하나의 핵산 서열 구축물을 제 2 곤충 부모의 게놈 (예를 들어, 플라스미드 벡터)의 핵산 서열에 통합시키는 단계로, 상기 핵산 서열은 적어도 하나의 제 1 가이드 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, 암컷-필수 게놈 서열의 뉴클레오티드 서열을 표적으로 하는 sgRNA 또는 dgRNA)를 가지고, 및 제 1 곤충 부모 및 제 2 곤충 부모를 교미시켜 모든 또는 거의 모든 수컷 자손을 생산하는 단계를 포함한다. 여기에 사용된, 용어 "암컷 필수 게놈 서열"은 암컷 곤충에 특이적인 임의의 게놈 서열 또는 유전자를 포함한다. 암컷 필수 게놈 서열의 예는 성별 결정 유전자 또는 이의 암컷 특이적 스플라이스 변이체, 수컷에서 발견되지 않은 유전자 또는 유전자의 스플라이스 변이체, 암컷 생식선 발달에 필수적인 유전자 또는 유전자의 스플라이스 변이체, 및/또는 수컷 생존력에 필수적이지 않은 유전자 또는 유전자의 스플라이스 변이체를 포함한다. 도 1b를 참고하면, 암컷 필수 게놈 서열의 비 제한적 예는 이의 호모로그(homolog), 오솔로그(orthologs) 및 파라로그(paralogs)를 포함하는 성 결정 드로소필라 유전자 Sxl, Tra 및 Dsx에 있는 암컷-특이적 엑손을 포함한다. 여기서 사용된 용어 "호모로그(homolog)"는 동일한 기능을 부여하는 다른 유기체에서 발견되는 유기체의 비교 가능한 유전자를 지칭한다. 여기서 사용된 용어 " 오솔로그(orthologs)"및 "패럴로그(paralogs)"는 호모로그의 유형을 지칭한다. 오솔로그는 상이한 계통에서 상응하는 유전자이고 종 분화의 결과이며, 파라로그는 유전자 복제에서 유래한다.
곤충에서 TRA 단백질 또는 TRA / TRA-2 복합체에 의해 중재되는 조절 및 성-특이적 대안적 스플라이싱(splicing)은 Pane et al., Development 129: 3715-3725 (2002) 에서 알려지고 논의되었고, 그 전문이 참고자료로 포함된다. Dsx 유전자의 수컷 및 암컷 특이적 스플라이스 생성물이 Suzuki et al., Insect Biochem Mol Biol 31: 1201-1211 (2001), Salvemini et al., BMC Evol. Biol. 11, 41 (2011), and Scali et al., J. Exp. Biol. 208, 3701-3709 (2005)에서 알려지고 논의되었고, 그 전문이 참고로 포함된다.
본 개시의 일부 실시 양태에서, 수컷 성별을 지시하는 방법은, 엔도뉴클레아제를 제 1 곤충 부모에 도입하는 단계, 및 적어도 하나의 핵산 서열 구축물을 제 2 곤충 부모의 게놈 내로 통합시키는 단계로서, 상기 핵산 서열은 그 호모로그, 오솔로그 또는 파라로그를 포함하는 Tra 및 / 또는 Dsx 유전자의 암컷-특이적 엑손에서 선택된 암컷-필수 게놈 서열에서 뉴클레오티드 서열을 표적으로 하는 적어도 하나의 제 1 가이드 폴리뉴클레오티드를 가지고, 상기 제 1 곤충 부모 및 상기 제 2 곤충 부모를 교미하여 모든 또는 거의 모든 수컷 자손을 생산한다.
본 개시의 일부 실시 양태에서, 수컷 불임 곤충 난을 생산하는 방법은, 엔도뉴클레아제를 제 1 곤충 부모에 도입하는 단계, 적어도 하나의 핵산 서열 구축물을 제 2 곤충 부모의 게놈 내로 통합시키는 단계로서, 상기 적어도 하나의 핵산 서열 구축물은 암컷-특이적 생존력 또는 발달에 필요한 암컷 필수 게놈 서열을 표적하는 적어도 하나의 제 1 가이드 폴리뉴클레오티드 및 수컷 생식력에 필요한 수컷 불임 게놈 서열을 표적하는 적어도 하나의 제 2 가이드 폴리뉴클레오티드를 가지고, 및 상기 제 1 곤충 부모 및 제 2 곤충 부모를 교미시키는 단계로서, 이 단계에서 모든 또는 거의 모든 불임 수컷 자손을 생산하는 것을 포함한다. 여기서 사용된, 용어 "수컷 불임 게놈 서열"은 수컷 곤충의 발달 또는 수컷 곤충의 생존력에 영향을 미치지 않는 수컷 생식에 필요한 임의의 수컷-특이적 게놈 서열을 지칭한다. 곤충에서 수컷 생식에 필요한 수컷-특이적 게놈 서열의 비 제한적 예에는 베타튜뷸린 85D (βTub), 퍼지 오니온 (Fzo), 프로타민 A (ProtA) 및 스퍼마토사이트 어레스트(Sa) 유전자 및 이들의 호모로그, 오솔로그 및 파라로그를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 핵산 서열 구축물은 수컷 생식에 필요한 하나 이상의 수컷-특이적 게놈 서열을 표적하는 하나 이상의 제 2 가이드 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 아노펠레스(Anopheles) 및 아에데스 아에집티 베타튜뷸린 85D의 기능 보존은 Catteruccia et al., Nat. Biotechnol. 23, 1414-1417 (2005) and Smith et al., Insect Mol. Biol. 16, 61-71 (2007)에 기재되어 있고, 그 전문이 참고로 포함된다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 암컷 생존력 및 수컷 생식력에 중요한 많은 유전자가 표적화될 수 있다. 파괴를 위한 추가의 암 / 수 특이 곤충 유전자는 Akbari et al., G3 3, 1493-1509 (2013) 및 Papa et al., (2016) doi : 10.1101 / 081620에 논의되어 있으며, 그 전문이 참고로 포함된다.
본 개시의 일부 실시 양태에서, 유전적으로 변형된 곤충 및 유전적으로 변형된 곤충을 생산하는 방법은 디프테라(Diptera), 레피도프테라(Lepidoptera) 또는 콜레오프테라(Coleoptera) 목(Order)으로부터의 곤충을 포함한다.
본 개시의 실시 양태에서, 유전적으로 변형된 곤충 및 유전적으로 변형된 곤충을 생성하는 방법은 스테고미아 (Stegomyia), 아에데스 (Aedes), 아노펠레스 (Anopheles) 또는 쿨렉스 (Culex) 속(genera)의 모기로부터 선택된 곤충을 포함한다. 이 속의 모기 종의 예로는 아에데스 아에집티(Aedes aegypti), 아에데스 알보피쿠스(Aedes albopictus), 오클레로타투스 트리세리아투스(Ochlerotatus triseriatus (Aedes triseriatus)), 아노펠레스 스테펜시(Anopheles stephensi), 아노펠레스 알비마누스(Anopheles albimanus), 아노펠레스 감비아에(Anopheles gambiae), 아노펠레스 쿠아드리마쿨라투스(Anopheles quadrimaculatus), 아노펠레스 프리보르니(Anopheles freeborni), 쿨렉스 스피시스(Culex species) 또는 쿨리세타 멜라누라(Culiseta melanura) 종이 있다.
또한, Cas9-발현 계통은 Li et al., (2017) doi:10.1101/156778, Hammond et al., Nat. Biotechnol. 34, 78-83 (2016), and Gantz et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, E6736-43 (2015)에서 각각 기술되었듯이, 아에 아아집티(Ae. aegypti), 아노펠리스 감비아에(Anopheles gambiae) 및 아노펠레스 스테렌시(Anopheles stephensi)를 포함한 주요 뎅기열 및 말라리아 질환 벡터에서 개발되었고, 그 전문들이 본원에 참고자료로 포함된다.
일부 실시 양태에서, 유전적으로 변형된 곤충 및 유전적으로 변형된 곤충을 생산하는 방법은 다음 중 하나로부터 선택된 임의의 곤충을 포함한다: 메드 플라이(Medfly (세라티티스 카피타타; Ceratitis capitata)), 멕스플라이(Mexfly (아나스트레파 루덴스; Anastrepha ludens)), 오리엔탈 프룻 플라이(Oriental fruit fly (박트로테라 돌사리스; Bactrocera dorsalis)), 올리브 프룻 플라이(Olive fruit fly (박트로세라 오레아에; Bactrocera oleae)), 멜론 플라이(Melon fly (박트로세라 쿠쿠르비타에; Bactrocera cucurbitae)), 나탈 프룻 플라이(Natal fruit fly (세라티티스 로사; Ceratitis rosa)), 체리 프룻 플라이(Cherry fruit fly (라골레티스 세라시; Rhagoletis cerasi)), 퀸스란드 프룻 플라이(Queensland fruit fly (박트로세라 티로니; Bactrocera tyroni)), 피치 프룻 플라이(Peach fruit fly (박트로세라 조나타; Bactrocera zonata)), 카리비안 프룻 플라이(Caribbean fruit fly (아나스트레파 서스펜사; Anastrepha suspensa)), 오리엔탈 프룻 플라이(Oriental Fruit Fly (막트로세라 도르사리스; Bactrocera dorsalis)), 웨스트 인디안 프룻 플라이(West Indian fruit fly (아나스트레파 오플리쿠아; Anastrepha obliqua)), 더 뉴 월드 스크루웜(the New World screwworm (코크리오키아 호미니보락스; Cochliomyia hominivorax)), 더 올드 월드 스크루웜(the Old World screwworm (크리솜야 베지아나; Chrysomya bezziana)), 오스트랄리안 쉽 블로우플라이/그린바틀 플라이(Australian sheep blowfly/greenbottle fly (루시리아 쿠프리나; Lucilia cuprina)), 더 핑크 볼웜(the pink bollworm (펙티노포라 고시피엘라; Pectinophora gossypiella)), 더 유로피안 집시 모스(the European Gypsy moth (리만트리아 디스파르; Lymantria dispar)), 더 나블 오랜지 웜(the Navel Orange Worm (아미에로이스 트란시텔라; Amyelois transitella)), 더 피치 트위그 보레르(the Peach Twig Borer (아나르시아 리네아텔라; Anarsia lineatella)), 더 라이드 스템 보레르(the rice stem borer (트리포리자 인제르투라스Tryporyza incertulas)), 더 녹투이드 모스(the noctuid moths), 헬리오티오나에(Heliothinae), 더 재패니즈 비틀(the Japanese beetle (파필라 자포니카; Papilla japonica), 화이트-프린지드 비틀(White-fringed beetle (그라포그나투스 스피시스; Graphognatus spp.)), 볼 위빌(Boll weevil (아나토노모우스 그란디스; Anthonomous grandis)), 더 콜로라도 포테이토 비틀(the Colorado potato beetle (렙티노타르사 데셈리네아타; Leptinotarsa decemlineata)), 더 바인 밀리버그(the vine mealybug (플라노코쿠스 피쿠스; Planococcus ficus)), 에이시안 시트러스 사일리드(Asian citrus psyllid (디아포리나 시트리; diaphorina citri)), 스팟티드 윙 드로소필라(Spotted wing drosophila (드로소필라 스즈키이; drosophila suzukii)), 블루그린 샤프슈터(Bluegreen sharpshooter (그라포세팔라 아트로펑크타타; graphocephala atropunctata)), 글래시 윙드 샤프슈터(Glassy winged sharpshooter (호마로디스카 비트리페니스; Homalodisca vitripennis)), 라이트 브라운 애플 모스(Light brown apple moth (에피피야스 포스트비타나; Epiphyas postvittana)), 바그라다 버그(Bagrada bug (바그라다 힐라리스; Bagrada hilaris)), 브라운 말모라티드 스팅 버그(Brown marmorated stink bug (할요몰파 할리스; Halyomorpha halys))로부터 선택된 테프리티드 프룻 플라이(tephritid fruit fly), 리만트리아 디스파르 아시아티카(Lymantria dispar asiatica), 리만트리아 디스파르 야포니카(Lymantria dispar japonica), 리만트리아 알베센스(Lymantria albescens), 리만트리아 움브로사(Lymantria umbrosa), 및 리만트리아 포스탈바(Lymantria postalba), 아시안 롱혼드 비틀(Asian longhorned beetle (아노프로포라 그라브리페니스; Anoplophora glabripennis)), 코코넛 리노세로스 비틀(Coconut Rhinoceros Beetle (오리크테스; Oryctes rhinoceros)), 에머랄드 애쉬 보레르(Emerald Ash Borer (아그리러스 플라니페니스; Agrilus planipennis)), 유러피안 그래입바인 모스(European Grapevine Moth (로베시아 보트라나; lobesia botrana)), 유러피안 집시 모스(European Gypsy Moth (리만트리아 디스파르; Lymantria dispar)), 폴스 코드링 모스(False Codling Moth (타우마토티비아 류코트레타; Thaumatotibia leucotreta))의 군으로부터 선택된 아시안 집시 모스(Asian Gypsy Moth), 소레노프시스 인빅타 부렌(Solenopsis invicta Buren), 및 에스. 리치테리 포렐(S. richteri Forel), 올드 월드 볼웜(Old World Bollworm (헤리코베르파 아르미게라; Helicoverpa armigera)), 스팟티드 랜턴플라이(Spotted Lanternfly (리코르마 델리코투라; Lycorma delicatula)), 아프리카나이즈드 하니비(Africanized honeybee (아피스 멜리페라 스쿠텔라타; apis mellifera scutellata)), 프룻 앤 슛 보러(Fruit and shoot borer (류치노데스 오르보날리스; leucinodes orbonalis)), 콘 루트 웜(corn root worm (디아브로티카 스피시스; Diabrotica spp.)), 웨스턴 콘 루트웜(Western corn rootworm (디아브로타카 비르기페라; diabrotica virgifera)), 화이트플라이(Whitefly (베미시아 타바치; bemisia tabaci)), 하우스 플라이(House Fly (무스카 도메스티카; Musca Domestica)), 그린 바틀 플라이(Green Bottle Fly (루실리아 쿠프리나; Lucilia cuprina), 실크 모스(Silk Moth (봄빅스 모리; Bombyx mori)), 레드 스케일(Red Scale (아오니디엘라 아우란티아; Aonidiella aurantia)), 도그 하트웜(Dog heartworm (디로필라리아 이미스티스; Dirofilaria immitis)), 서든 파인 비틀(Southern pine beetle (덴드록토너스 프론타리스; Dendroctonus frontalis)), 아보카도 트리프(Avocado thrip (티사노프테라 스피시스; Thysanoptera Spp.))로부터 선택된 파이어 앤트(fire ants), 오에스트리다에 스피시스 및 덜마토미아 호미니스(Oestridae spp. and Dermatobia hominis), 홀스 플라이(Horse Fly (타바누스 술시프론스; Tabanus sulcifrons)), 혼 플라이(Horn Fly (하에마토비아 이리탄스; Haematobia irritans))로부터 선택된 봇플라이, 코칠리오미아 마첼라리아(Cochliomyia macellaria (씨. 마첼라리아C. macellaria)), 씨. 호미니보락스,(C. hominivorax), 씨. 아르리치(C. aldrichi), 또는 씨. 미니마(C. minima), 체체 플라이(Tsetse Fly (글로시나 스피시스; Glossina spp.))로부터 선택된 스크루웜, 하이포덜마 보비스(Hypoderma bovis) 또는 하이포덜마 리니아툼(Hypoderma lineatum), 스팟티드 랜턴 플라이(Spotted lanternfly (리코르마 데리카투라; Lycorma delicatula)), 카프라 비틀(Khapra beetle (트로고덜마 그라나리움; Trogoderma granarium)), 하니비 마이트(Honeybee mite (바로아 디스트럭터; Varroa destructor)), 털마이츠(Termites (코프토터르미스 포르모사누스; Coptotermes formosanus)), 헴락 울리 아델기드(Hemlock woolly adelgid (아델기스 츠개; Adelges tsugae), 월넛 트위그 비틀(Walnut twig beetle (피쵸프토루스 요그란디스; Pityophthorus juglandis)), 유로피안 우드 와스프(European wood wasp (시렉스 녹틸리오; Sirex noctilio)), 핑크-스팟티드 볼웜(Pink-spotted bollworm (펙티노포라 스큐티게라; pectinophora scutigera)), 투 스팟티드 스파이더 마이트(Two spotted spider mite (털타니쿠스 얼티채; Tertanychus urticae), 다이아몬드백 모스(Diamondback moth (플루텔라 자이로스텔라; plutella xylostella)), 타로 카테르필라(Taro caterpillar (스론도프테라 리투라; spodoptera litura)), 레드 플라우어 비틀(Red flour beetle (트리볼리움 카스타니움; tribolium castaneum)), 그린 피치 에이피드(Green peach aphid (미주스 페르시채; Myzus persicae)), 코튼 에이피드(Cotton Aphid (아피스 고시피이; aphis gossypii)), 브라운 플란토퍼(Brown planthopper (니라파바타 루겐스; nilaparvata lugens)), 비트 알미웜(Beet armyworm (스폰도테라 엑시규아; spodotera exigua)), 웨스턴 플라워 쓰립스(Western flower thrips (프랭클리니엘라 옥시덴탈리스; frankliniella occidentalis)), 코들링 모스(Codling moth (사이디아 포모닐라; cydia pomonella)), 카우피아 위빌(Cowpea weevil (칼로소브루추스 마쿠라투스; callosobruchus maculatus)), 피 에이피드(Pea aphid (아치르토시폰 피숨; acyrthosiphon pisum)), 토마토 피프미너르(Tomato leafminer (투타 아브솔루타; tuta absoluta)), 오니온 트리프스(Onion thrips (트리프스 타바치; thrips tabaci)), 및 코튼 볼웜( Cotton bollworm (헤리코베르파 아르미게라; Helicoverpa armigera))로부터 선택된 와블 플라이.
본 개시의 일부 실시 양태에서, 적합한 엔도뉴클레아제는 CRISPR-연관 서열 9 (Cas9) 엔도뉴클레아제 또는 이의 변이체, CRISPR-연관 서열 13 (Cas13) 엔도뉴클레아제 또는 이의 변이체, CRISPR-연관 서열 6 (Cas6) 엔도뉴클레아제 또는 이의 변이체, 프레보텔라(Prevotella) 및 프란시셀라 1(Francisella 1) (Cpf1) 엔도뉴클레아제 또는 이의 변이체로부터 CRISPR, 또는 마이크로게노매이츠(Microgenomates) 및 스미스엘라 1(Smithella 1) (Cms1) 엔도뉴클레아제의 또는 이의 변이체로부터 CRISPR를 포함한다.
본 개시의 일부 실시 양태에서, 적합한 엔도뉴클레아제는 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9 (Streptococcus pyogenes Cas9; SpCas9), 스트라필로코쿠스 아우레우스 Cas9 (Staphylococcus aureus Cas9; SaCas9), 프란시셀라 노비시다 Cas9 (Francisella novicida Cas9; FnCas9), 또는 그의 변이체를 포함한다. 변이체는 프로토스페이서 인접 모티프 (protospacer adjacent motif; PAM) SpCas9 (xCas9), 하이 피델리티 SpCas9 (high fidelity SpCas9; SpCas9-HF1), 하이 피델리티 SaCas9(a high fidelity SaCas9) 또는 하이 피델리티 FnCas9(a high fidelity FnCas9)를 포함한다.
본 개시의 다른 실시 양태에서, 상기 엔도뉴클레아제는 FokI 뉴클레아제 또는 이의 변이체와 융합된 Cas9 단백질 또는 이의 변이체를 포함하는 Cas 융합 뉴클레아제를 포함한다. 이 융합 뉴클레아제의 상기 Cas9 단백질의 변이체는 촉매적으로 불활성인 Cas9 (예를 들어, 죽은 Cas9)를 포함한다.
본 개시의 일부 실시 양태에서, 상기 엔도뉴클레아제는 다음에서 유래되거나 발현된 Cas9, Cas13, Cas6, Cpf1, CMS1 단백질 또는 이의 변이체일 수 있다: 메타노코쿠스 마리파루디스 C7(Methanococcus maripaludis C7), 코리네박터리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria), 코리네박테리움 에피시엔스 YS-314(Corynebacterium efficiens YS-314), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) (ATCC 13032), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) (ATCC 13032), 코리네박테리움 글루타미쿰 R(Corynebacterium glutamicum R), 코리네박테리움 프로펜스테디티이(Corynebacterium kroppenstedtii) (DSM 44385), 미코박테리움 아브세서스(Mycobacterium abscessus) (ATCC 19977), 노카르디아 파르시티아 IFM10152 (Nocardia farcinica IFM10152), 로도코쿠스 에리트로폴리스 PR4(Rhodococcus erythropolis PR4), 로도코쿠스 요스티이 RHA1(Rhodococcus jostii RHA1), 로도코쿠스 오파쿠스 B4(Rhodococcus opacus B4) (uid36573), 아시도테르무스 셀룰로리티쿠스11B(Acidothermus cellulolyticus 11B), 아르트로박터 클로로페노리쿠스 A6(Arthrobacter chlorophenolicus A6), 클리벨라 플라비다(Kribbella flavida) (DSM 17836, uid43465), 써모모모노스포라 쿠르바타(Thermomonospora curvata) (DSM43183), 비피도벡테리움 덴티움 Bd1(Bifidobacterium dentium Bd1), 비피도박테리움 롱검 DJO10A (Bifidobacterium longum DJO10A), 슬랙시아 헬리오트리니리듀센스(Slackia heliotrinireducens) (DSM 20476), 페르세포넬라 마리나 EX H1(Persephonella marina EX H1), 박테로이데스 플라길리스 NCTC 9434(Bacteroides fragilis NCTC 9434), 카프노사이토파가 오클라세아(Capnocytophaga ochracea) (DSM 7271), 플라보박테리움 사이크로필룸 JIP02 86 (Flavobacterium psychrophilum JIP02 86), 아케르만시아 무치니팔라(Akkermansia muciniphila) (ATCC BAA 835), 로제이플렉서스 카스텐홀지(Roseiflexus castenholzii) (DSM 13941), 로제이플렉서스 RS1(Roseiflexus RS1), 시네코시스티스 PCC6803(Synechocystis PCC6803), 엘루시미크로비움 미누툼 Pei191(Elusimicrobium minutum Pei191), 배양되지 않은 테르마이트 그룹 1 박테리아 필로타입 Rs D17(uncultured Termite group 1 bacterium phylotype Rs D17), 피브로박터 수키노제네스 S85(Fibrobacter succinogenes S85), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) (ATCC 10987), 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 람노서스 GG(Lactobacillus rhamnosus GG), 락토바실러스 살리바리우스 UCC118(Lactobacillus salivarius UCC118), 스트렙토코쿠스 아가락티애-5-A909(Streptococcus agalactiae-5-A909), 스트렙토코쿠스 아가락티애 NEM316(Streptococcus agalactiae NEM316), 스트렙토코쿠스 아가락티애 2603(Streptococcus agalactiae 2603), 스트렙토코쿠스 디스갈락티애 에퀴시밀리스 GGS 124(Streptococcus dysgalactiae equisimilis GGS 124), 스트렙토코쿠스 에쿠이 주에피데미쿠스 MGCS10565(Streptococcus equi zooepidemicus MGCS10565), 스트렙토코쿠스 갈로리티쿠스 UCN34(Streptococcus gallolyticus UCN34) (uid46061), 스트렙토코쿠스 고르도니이 찰리스 서브스트 CH1(Streptococcus gordonii Challis subst CH1), 스트렙토코쿠스 무탄스 NN2025(Streptococcus mutans NN2025) (uid46353), 스트렙토코쿠스 무탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코쿠스 피오게네스 M1 GAS (Streptococcus pyogenes M1 GAS), 스트렙토코쿠스 피오게네스 MGAS5005(Streptococcus pyogenes MGAS5005), 스트렙토코쿠스 피오게네스 MGAS2096(Streptococcus pyogenes MGAS2096), 스트렙토코쿠스 피오게네스 MGAS9429(Streptococcus pyogenes MGAS9429), 스트렙토코쿠스 피오게네스 MGAS10270(Streptococcus pyogenes MGAS10270), 스트렙토코쿠스 피오게네스 MGAS6180(Streptococcus pyogenes MGAS6180), 스트렙토코쿠스 피오게네스 MGAS315(Streptococcus pyogenes MGAS315), 스트렙토코쿠스 피오게네스 SSI-1(Streptococcus pyogenes SSI-1), 스트렙토코쿠스 피오게네스 MGAS10750(Streptococcus pyogenes MGAS10750), 스트렙토코쿠스 피오게네스 NZ131(Streptococcus pyogenes NZ131), 스트렙토코쿠스 써모필레스 CNRZ1066 (Streptococcus thermophiles CNRZ1066), 스트렙토코쿠스 써모필레스 LMD-9(Streptococcus thermophiles LMD-9), 스트렙토코쿠스 써모필레스 LMG 18311(Streptococcus thermophiles LMG 18311), 클로스트리디움 보툴리눔 A3 로치 마레(Clostridium botulinum A3 Loch Maree), 클로스트리디움 보툴리눔 B 에클룬드 17B (Clostridium botulinum B Eklund 17B), 클로스트리디움 보툴리눔 Ba4 657(Clostridium botulinum Ba4 657), 클로스트리디움 보툴리눔 F 랑겔란드(Clostridium botulinum F Langeland), 클로스트리디움 셀룰로리티쿰 H10(Clostridium cellulolyticum H10), 피네골디아 마그나(Finegoldia magna) (ATCC 29328), 유박테리움 렉테일(Eubacterium rectale) (ATCC 33656), 마이코플라스마 갈리셉티쿰(Mycoplasma gallisepticum), 마이코플라스마 모빌레 163K(Mycoplasma mobile 163K), 마이코플라스마 페네트란스(Mycoplasma penetrans), 마이코플라스마 시노비애 53(Mycoplasma synoviae 53), 스트렙토바실러스 모닐리포르미스(Streptobacillus moniliformis) (DSM 12112), 브라디라이조비움 BTAi1(Bradyrhizobium BTAi1), 니트로박터 함브루겐시스 X14 (Nitrobacter hamburgensis X14), 로도슈도모나스 팔루스트리스 BisB18 (Rhodopseudomonas palustris BisB18), 로도슈도모나스 팔루스트리스 BisB5(Rhodopseudomonas palustris BisB5), 파르비바쿠룸 바라멘티보란스 DS-1(Parvibaculum lavamentivorans DS-1), 디노로세오박터 시배. DFL 12 (Dinoroseobacter shibae. DFL 12), 글루코나세토박터 디아조트로피쿠스 Pal 5 FAPERJ(Gluconacetobacter diazotrophicus Pal 5 FAPERJ), 글루코나세토박터 디아조트로피쿠스 Pal 5 JGI(Gluconacetobacter diazotrophicus Pal 5 JGI), 아조스피릴룸 B510(Azospirillum B510) (uid46085), 로도스피릴룸 루브룸(Rhodospirillum rubrum) (ATCC 11170), 디아포로박터 TPSY(Diaphorobacter TPSY) (uid29975), 베르미네프로박터 에이세니애 EF01-2 (Verminephrobacter eiseniae EF01-2), 나이세리아 메닌기티데스 053442 (Neisseria meningitides 053442), 나이세리아 메닌기티데스 알파14(Neisseria meningitides alpha14), 나이세리아 메닌기티데스 Z2491(Neisseria meningitides Z2491), 디설포비브리오 살렉시겐스 DSM 2638(Desulfovibrio salexigens DSM 2638), 캄필로박터 제주니 도일레이 269 97(Campylobacter jejuni doylei 269 97), 캄필로박터 제주니 81116(Campylobacter jejuni 81116), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 캄필로박터 라리 RM2100(Campylobacter lari RM2100), 헬리코박터 헤파티쿠스(Helicobacter hepaticus), 울리넬라 숙시노게네스(Wolinella succinogenes), 톨루모나스 아우엔시스 DSM 9187(Tolumonas auensis DSM 9187), 슈도알터로모나스 아틀란티카 T6c (Pseudoalteromonas atlantica T6c), 셰와넬라 페알리아나(Shewanella pealeana) (ATCC 700345), 레지오넬라 슈도모필라 파리스(Legionella pneumophila Paris), 악티노바실러스 숙시노게네스 130Z(Actinobacillus succinogenes 130Z), 파스뇌렐라 물토시다(Pasteurella multocida), 프란시셀라 툴라렌시스 노비시다 U112(Francisella tularensis novicida U112), 프란시셀라 툴라렌시스 홀라르크티카(Francisella tularensis holarctica), 프란시셀라 툴라렌시스 FSC 198(Francisella tularensis FSC 198), 프란시셀라 툴라렌시스 툴라렌시스(Francisella tularensis tularensis), 프란시셀라 툴라렌시스 WY96-3418(Francisella tularensis WY96-3418), 또는 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola) (ATCC 35405).
도 4a-4c를 참조하면, 본 개시의 실시 양태에 따른 pgSIT 방법을 사용하여 제조된 불임 수컷의 교미 경쟁력은 이들 불임 수컷이 야생에서 성공적으로 교미하고 야생에서 암컷 배우자를 위해 성공적으로 경쟁할 수 있음을 나타낸다. 또한, 도 4d-4e를 참조하면, 본 개시의 실시 양태에 따른 pgSIT 방법을 사용하여 제조된 불임 수컷의 수명은 이들 불임 수컷은 상응하는 야생형 수컷보다 길지 않다면 적어도 야생형 수컷 만큼 긴 수명 (총 일수)을 가짐을 나타낸다. 초기 억제 또는 감소가 달성되면, 유충의 자원이 풍부하고 따라서 방출된 미성숙 형태에 의한 더 큰 소비는 덜 영향을 미치기 때문에, 교미 경쟁력 및 수명은 지역적 제거를 달성하는데 주요한 요인이다. 유충 부화는 생식력이 있는 유충이 이용될 수 있는 자원을 소비하기 때문에 난 방출은 초기에 개체군을 빠르게 억제하거나 감소시킨다. 또한, 본 개시의 실시 양태에 따른 pgSIT 수컷 불임 난들은 야생에 방출시 배아 / 유충 단계 동안 암컷 치사가 발생하여 유충을 부화시킬 수 있으며, 이는 방출된 미성숙 형태에 의해 유충 자원의 최대 소비를 초래한다.
또한, 본원에 개시된 바와 같은 pgSIT 방법은 염색체 전좌, 화학 살균제, 조사, 항생제 또는 박테리아 감염에 의존하지 않으며, 이는 방출된 불임 수컷의 건강 및 교미 경쟁력을 심하게 위협할 수 있다.
도 4f-4k 를 참조하면, 본원의 실시예 5에 기재된 바와 같이 매주 야생 성체 당 200 pgSIT 수컷 불임 난이 방출되는 것으로 실험한 MGDrivE 시뮬레이션 프레임워크를 사용하는 것은, 지역적 아에. 아에집티 제거가 신뢰할 수 있게 달성되는 광범위한 파라미터 값을 나타낸다.
도 5를 참조하면, 질병 벡터 및 농업 해충을 포함하는 곤충 종들의 곤충 개체군을 억제 또는 감소시키는 방법은 본 발명의 pgSIT 방법을 사용하여 생산된 수컷 불임난들을 표적 곤충 억제 또는 감소가 필요한 지역에 도입하는 것을 포함한다.
본 개시의 일부 실시 양태는 동형접합 엔도뉴클레아제 (예를 들어, Cas9) 및 dgRNA 발현 계통을 각각 번식시키는 양육 시설의 개발을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 자동화된 워크플로우는 암수-분류 미성숙 단계 (예를 들어, dgRNA 수컷을 갖는 Cas9 암컷)로 구현되고 난의 성숙, 교배 및 번식을 위해 케이지(cages)로 합쳐진다. 암수 분류는 기계적 크기 분리, 유전적 암수 계통으로 결합된 자동화된 코파스 암수 분류 플랫폼 (Union Biometrica) 또는 자동화된 로봇 광학 분류를 포함하여 임의의 수의 적절한 방식으로 달성될 수 있다. 적합한 성 분류 Papathanos et al., Transgenic insects: techniques and applications 83-100, (October, 2014) and Gilles et al., Acta Trop. 132, S178-S187 (2014)에서 논의되고, 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
일부 실시 양태에서, 불임 수컷 난을 생산하는 pgSIT 방법은 난기 단계 동안 휴면기가 있는 곤충 종에 특히 효과적이다. 난기 단계 동안 휴면기를 갖는 곤충은 예를 들어 Diniz et al., Parasit. Vectors 10, 310 (2017)에 기재된 아에. 아에집티 및 아에. 알보피쿠스(Ae. aegypti and Ae. Albopictus)를 포함하고, 그 전문이 본원에 참고자료로 포함된다. 이 휴면기는 과도한 방출을 위해 확장 가능한 난 축적을 가능하게 한다. 따라서, 도 5에 일반적으로 도시된 바와 같이, 하나의 효율적인 pgSIT 난 생산 시설은 pgSIT 난을 전 세계의 많은 원격 현장에 배포할 수 있으며, 여기서 단순히 부화, 양육 및 방출될 수 있고, 각 현장 위치에서 수동적 암수-분류, 불임 및 취약한 성체 수컷을 방출하는 수송부담을 제거하거나 감소하여, 확장성과 효율성을 높이고 더 넓은 대규모의 개체군 억제 또는 감축 능력을 가능하게 한다.
하기 실시예들은 단지 예시의 목적으로 제시되며, 본 출원의 범위 또는 내용을 제한하지 않는다.
실시예1. 암컷 웅성화/치사, 또는 수컷 불임을 유도한 이원성(binary) CRISPR
pgSIT를 조작하기 위해, 드로소필라에서 단일 가이드 RNA (sgRNA) 및 spCas9 (여기서의 Cas9) 발현 라인이 생성되었다. 총 9 개의 동형 접합성 sgRNA 라인이 암컷 생존력에 필수적인 유전자, 또는 수컷 생식력에 중요한 유전자를 표적으로 하기 위하여 개발되었다. 암컷 생존력을 위해, 도 1b-1c에 도시되고, Slee and Bownes, Q. Rev. Biol. 65, 175-204 (1990); Bell et al., Cell 65, 229-239 (1991); Boggs et al., Cell 50, 739-747 (1987), and Burtis and Baker, Cell 56, 997-1010 (1989)에서 기재된 바와 같이, 이들 유전자에는 섹스 레탈 (Sxl, 두 개의 분리된 트랜스제닉 라인-sgRNASxl, sgRNASxl-B), 트랜스포머 (tra, 두 개의 분리된 라인-sgRNATra, sgRNATra-B) 또는 더블섹스 (dsxF, sgRNADsxF)을 포함하는 성-특이적 대안적으로 접합된 성-결정 유전자를 포함하고, 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 수컷 생식력을 방해하기 위해, 도 1c에 도시되고, Kemphues et al., Cell 21, 445-451 (1980), Hales and Fuller, Cell 90, 121-129 (1997), Kanippayoor et al., Spermatogenesis 3, e24376 (2013), and Lim et al., Spermatogenesis 2, 158-166 (2012)에 기재된 바와 같이, 베타튜뷸린 85D (βTub, sgRNAβTub), 퍼지 오니온 (fzo, sgRNAFzo), 프로타민 A (ProtA, sgRNAProtA), 또는 스퍼마토사이트 어레스트 (sa, sgRNASa)와 같은 정자 형성 동안 활성인 유전자들이 표적이 되었다. 강력한 Cas9 발현을 촉진하기 위해, 두 개의 강력한 우세한 생식 계열 특이적 프로모터의 제어 하에 세 개의 동형 접합 Cas9 발현 라인이 Sano et al., Mech. Dev. 112, 129-139 (2002) and Doren et al., Curr. Biol. 8, 243-246 (1998)에 기재된 nanos (nos-Cas9) 또는 vasa (vas-Cas9)을 포함하여 확립되었고, 두 문서의 전문이 본원에 참고로 포함된다. 또한, 유비쿼터스 프로모터 유비퀴틴 63E (Ubi-Cas9) https://paperpile.com/c/cKXxhc/zEwAO는 Akbari et al., BMC Cell Biol. 10, 8 (2009) 에 기재되고 도 1d에 도시된 바와 같이, 거의 모든 발달 생활 단계에서 체세포와 생식선 조직 모두에서 강력한 발현이 가능하도록 확립되었다. 자가-절단 T2A 펩티드 및 eGFP 코딩 서열은, 도 1c-1d에 도시되고 Li et al., (2017). doi:10.1101/156778에 기재된 바와 같이, 프로모터 활성의 시각적 지표로서 작용하는 프로모터 구동 Cas9(promoter-driven Cas9)에 하류 (3 ')에 함께 삽입되었다.
sgRNA 라인의 유전적 활성을 평가하기 위해, 각각의 계통은 nos-Cas9에 교차시키고, 생산된 트랜스-이형접합 F1 자손을 분석하였다. 이들 교배로부터, sgRNASxl, sgRNATra, sgRNADsxF, sgRNAβTub를 포함한 sgRNA의 4/9는 예상되는 표현형을 나타내었고, 추가 특성화의 대상이 되었다. 이들 4 개의 sgRNA를 추가로 평가하기 위해, 도 1f에서 도시된 바와 같이, 이들 선택된 4 개의 계통들은 각각 야생형 wt (10♀ 과 10♂ 간 교차의 레플리케이트 수, N = 24; 자손 수, n = 3519) 또는 동형접합 nos-Cas9와 양방향으로 교차시켰다. (N = 28, n = 3628). 도 1e-1f에서, wt 교차는 유의한 성별비 편차 또는 손상된 생식력을 나타내지 않았다 (N = 30, n = 4371). 계속해서 도 1e-1f를 참조하면, nos-Cas9가 모계 또는 부모로 유전되었는지 여부에 관계없이, sgRNASxl을 유전받은 모든 F1 트랜스-이형 접합체는 100 % 수컷 (N = 7, n = 540)이고, sgRNATra 또는 sgRNADsxF를 유전받은 트랜스-이형접합된 암컷의 100 %는 난을 낳을 수 없는 불임 웅성화된 인터섹스로 전환되었고 (N = 14, n = 942), sgRNAβTub 트랜스-이형접합된 수컷의 100 %가 불임되었다 (N = 7, n = 517). 이들 표현형은 표적화된 유전자좌에서 분자적으로 탐색되었고, 모든 서열화된 파리 (n = 16)는 도 1g 에 도시된 바와 같이 표적화된 유전자좌에서 모자이크 삽입 / 삭제 (인델)을 가졌다.
실시예 2: 최대 100%의 불임 수컷 개체군의 생산
본 개시의 일부 실시 양태에서, 개시된 pgSIT 방법은 암컷 생존력 및 / 또는 수컷 불임에 필수적인 유전자를 파괴하는데 사용될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 개시된 pgSIT 방법은 생존 F1 자손의 대다수 또는 전부 (최대 100 %)를 불임 수컷으로 유전적으로 지시하기 위해 암컷 생존력 및 수컷 불임에 필수적인 유전자들을 동시에 또는 일시에 파괴하는데 사용될 수 있다. 이러한 지시된 암수감별 및 불임을 달성하기 위해, dgRNAβTub, Sxl, dgRNAβTub, Tra 및 dgRNAβTub, DsxF를 포함하는 다중화 된 이중 gRNA (dgRNA) 조합을 발현하는 3 개의 추가 동형 접합의 계통들이 도 1c에 도시된 바와 같이 생성되었다. 이들 pgSIT 계통의 활성을 유전적으로 평가하기 위해, 각각의 계통들은 wt 또는 동형접합 Cas9 (nos-Cas9, vas-Cas9 또는 Ubi-Cas9)에 양방향으로 교차시켰다. 도 2a-2b에서, wt 교차는 유의한 성별 편차 또는 손상된 생식력을 생성하지 않았다 (N = 36, n = 5747). 계속해서 도 2b를 참조하면, 각각의 dgRNAβTub,Sxl 과 Cas9 계통 사이의 교차는 βTub의 동시적 또는 일시적 파괴로 인한 100 % 수컷 불임에 더하여, sxl의 파괴로 인한 100 % 암컷 치사율을 초래하였다 (N = 24, n = 2521). 또한, 각각의 Cas9 계통과 dgRNAβTub, Tra (N = 24, n = 1697) 또는 dgRNAβTub, DsxF (N = 24, n = 1791) 사이의 교차로부터의 100 % 암컷이 tra 또는 dsx의 파괴로 인하여 불임 인터섹스로 웅성화되었고, 100 % 수컷 자손은 βTub의 동시 또는 일시적 파괴로 인해 불임되었다 (N = 48, n = 4231). 따라서, 도 2a-2c 를 참조하면, 본 개시의 pgSIT 방법은 dgRNA에 의해 포화되지 않고 최대 100 % 불임 수컷 성체 자손을 재현성 있게 그리고 전례없는 효율로 생성하는 고 활성 Cas9-gRNA 복합체를 제시한다.
도 2a-2c의 교차의 F1 자손의 표현형 분석과 관련하여, 도 2D-2E 에 도시된 바와 같이, dgRNAβTub, Sxl 녹아웃 암컷의 100 %는 도 2d-2e에 도시된 바와 같이 번데기 전이 동안 대부분의 사멸과 함께 성체 전 단계 동안 소멸되었다. 인터섹스 표현형의 경우, 생식력은 항상 손상되었으나, 도 2C 및 도 2F 에 도시된 바와 같이 가변적 표현력은 해부학적 웅성화의 정도가 개체마다 다양하고 dgRNAβTub, DsxF와 비교하여 dgRNAβTub, Tra 녹아웃에서 더 현저한 것으로 관찰되었다. 예를 들어, 도 2f 및 도 2h를 참조하면. dgRNAβTub, Tra 녹아웃 인터섹스들은 다양한 강모 수(bristle numbers)를 가진 성즐(sexcomb)를 가졌으며 거의 하나 이상의 기초 난소가 발달하지 않았다. 또한, 도 2i에서, 분자적으로 dgRNAβTub, Tra 녹아웃 인터섹스들은 dsx 유전자의 암컷 및 수컷-특이적 대안 스플 라이스 변이체 둘 다를 발현하였는데, 이는 아마도 수컷-특이적인 것을 저해하고 dsx의 암컷-특이적 대안적 스플라이싱을 증진시키는데 중요한 Tra의 부재로 인한 것으로 추정된다. Nagoshi et al., Cell 53, 229-236 (1988) 에 기술되어 있으며, 그 전문이 본원에 참고자료로 포함된다. 대조적으로, 도 2c, 도 2f 및 도 2j를 참조하면, dgRNAβTub, DsxF 녹아웃 인터섹스들은 성즐을 발달시키는 것으로 관찰되지 않았으며, 일부 인터섹스들은 난을 낳을 수 없지만, 임신할 수 있는 정상적인 난소들을 가졌다.
수컷 불임 표현형을 분석하기 위해, F1 불임 수컷에서 고환의 구조와 정자 발달은 βTub85D-프로모터 (βTub-GFP)로부터의 제어하에 eGFP를 발현하는 생산된 트랜스 제닉 라인을 사용하여 도 1c 에서 도시된 바와 같이 고환과 정자를 형광 표지되어 시각화되었다. dgRNA 계통으로 유전자 이입. 도 2k를 참조하면, 동형 접합성 nos-Cas9로 도입된 경우, 트랜스-이형접합성 dgRNAβTub, Sxl / +; βTub-GFP / nos-Cas9 F1 불임 수컷은 완전히 발달된 코일형 고환 (ts)과 보조 글랜드 (ag)를 보여 주었다. 그러나, 이들 F1 불임 수컷에서의 정자 발달은 Kemphues et al., Cell 21, 445-451 (1980)에 기재된 바와 같이 이전의 βTub 파괴 보고서와 일치하는 표현형으로 완전히 파괴되었으며, 이의 전문이 본원에 참고자료로 포함된다. 예를 들어, 도 2l을 참조하면, 원형 낭종 및 초기 정자 세포 만이 GFP로 표시된 불임 수컷의 고환 (ts)에서 확인되었지만, 도 2m을 참조하면, wt 고환 (ts)은 연장된 늦은 정자를 갖는 강력한 GFP-표지된 낭종을 가졌다. 도 2f를 참조하면, dgRNAβTub,Tra 또는 gRNAβTub,DsxF 녹아웃 인터섹스들(n>20)에서 GFP-양성 고환이 확인되지 않았지만, 도 2h, 도 2j 및 도 2k 에 도시된 바와 같이 기관과 같은 한쌍의 추정 수컷 보조 글랜드가 두 가지 인터섹스 유형에 존재하였다. 녹아웃 표현형을 초래한 분자적 변화를 확인하기 위해, 각각의 F1 파리로부터의 표적화된 유전자좌 둘 모두가 시퀀싱되었다. 도 1g 및 도 2n-2q를 참조하면, 대조군 파리 (n = 32)와 비교하여, 각각의 검사된 이중 녹아웃 파리 (n = 20)는 PCR 앰플리콘의 양 말단을 통한 시퀀싱을 방지하는 절단 부위에서 정확하게 모자이크 인델을 가졌다.
실시예 3. 접합성 발현(Zygotic Expression)으로부터 초래된 완전한 침
투
배아 발달에 Cas9 / gRNA 복합체의 모계 침착은, 자손이 편집 성분을 인코딩하는 유전자를 유전적으로 물려받지 않더라도, 받는 자손에서 돌연변이의 비멘델성 유전을 보장하기에 충분하다. 이 현상은 Lin and Potter, G3 (2016) doi : 10.1534 / g3.116.034884에 기술된 바와 같이 지배적인 모계 효과로 알려져 있으며, 이의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다. 이와 관련하여, 상용성 구성요소의 모계 침착과 조합된, 핵심 구성요소 중 하나 (예를 들어, Cas9 또는 dgRNA)의 부계 유전은 유전성 돌연변이를 생성하기에 충분한지 여부를 결정하기 위하여 조사되었다. 도 1g 및 도 3b 를 참조하면, 동형접합 Cas9 부체(fathers)와 이형접합 dgRNA 발현 모체(mothers) 사이의 교미는 dgRNA를 유전자로서 유전하지 않는 F1 자손에서 돌연변이(n=12) 또는 녹아웃 표현형(N=6, n=252)을 유도하기에 충분하지 않았다. 임의의 특정 메커니즘 또는 이론에 구속되지 않고, 이 결과는 모계 침착 동안 Cas9가 없이 짧은 dgRNA 반감기의 결과에 의해 야기될 수 있다. 도 3a 및 도 3c를 참조하면, 이형접합 Cas9 부체와 동형접합 dgRNA-발현 모체 사이의 교미는 Cas9 유전자를 유전한 모든 트랜스-이형접합 F1 자손에서 수컷 불임 및 암컷 치사 / 웅성화 표현형을 초래하였고 (N = 27, n = 2191), dgRNA-암호화 유전자만을 물려받은 모든 F1 자손은 정상적인 특징을 유지했다 (N = 27, n = 2640). 계속해서 도 3a 및 3c를 참조하면, 이형접합 Cas9 모체와 동형접합 dgRNA-발현 부체 사이의 교미는 모든 트랜스-이형접합 F1 자손에서 수컷 불임 및 암컷 치사 / 웅성화 표현형을 초래하였다 (N = 36, n = 3019). 또한, 도 3a를 참조하면, Cas9 단백질의 모계 기여는 tra 또는 dsx (N = 24, n = 782)를 표적화 할 때 Cas9 유전자를 받지 않은 자손에서 인터섹스 표현형을 유도하기에 충분하였고, 우세한 모계 효과를 입증하였다. 그러나, 도 3a-3b를 참조하면, 오직 Ubi-Cas9에 의한 Cas9의 모계 기여 (N = 4; n = 0, 생존 암컷 수), nos-Cas9 또는 vas-Cas9는 아닌(N = 8, n = 556), 프로모터 강도를 가리키는 유도된 dgRNAβTub, Sxl / +; + / + 암컷 치사는 돌연변이 효율에 영향을 줄 수 있다. 도 1g 및 도 3b을 참조하면, nos-Cas9로부터 모계로 로딩된 Cas9 단백질을 수용하고 dgRNAβTub, Sxl 유전자를 수용하는 암컷에서의 치사 표현형의 부재에도 불구하고, 이들 생존 암컷은 Sxl 유전자 좌위에서 모자이크 인델을 가졌다 (n = 2). 유사하게, 도 1g 및 도 3a-3b를 참조하면, dgRNA 유전자만을 상속하고 모계로 로딩된 Cas9 단백질을 가졌던 모든 수컷 자손은 각각의 유전자형 수컷(n=6)이 βTub 유전자 좌위에서 모자이크 인델을 가짐에도 불구하고, 모든 표시된 Cas9 계통에 대해 생식력이 있었다. 본 개시의 일부 구체예에 따르면, 도 3d에 도시된 바와 같이, 유전자로서 유전된 Cas9의 부재하에, 발달 배아 내로 엔도뉴클레아제 (예를 들어, Cas9)의 모계 침착과 함께 가이드 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, gRNA)의 부계 상속은 검출 가능한 이중 대립 형질 모자이크 현상을 유도하기에 충분하다.
실시예 4. pgSIT 수컷은 배우자를 위하여 성적으로 경쟁하고 그들의 생존은 줄어들지 않는다.
도 4a를 참조하면, 암컷-특이적 생존력 및 정자 성숙에 필요한 단일 유전자의 정확한 녹아웃을 갖는 pgSIT 수컷의 전반적 및 교미 적합성을 평가하기 위해, 교미 경쟁 분석을 수행하고 추정된 생존 곡선을 계산하였다. 도 4b-4c를 참조하면, pgSIT-생산된 수컷은 구애, 교미할 수 있었고, wt 수컷과 성공적으로 경쟁할 수 있었다. 계속해서 도 4b-4c를 참조하면, 하나의 pgSIT 수컷과 함께하는 하나의 wt에 대한 47.9 % ± 13.8 %의 관찰된 감소된 난 부화율 대(vs) 둘의 wt 수컷 (N = 5, P> 0.003)에 대한 85.1% ± 13.5% 부화율 또는 하나의 wt 수컷(N=5, P>0.001)에 대한 87.6 % ± 7.2 % 부화율은, wt 수컷에 비해 pgSIT 수컷에 대한 78 %의 교미 경쟁력과 일치하였다. 도 4d를 참조하면, 장수 (예를 들어, 수명)는 wt 수컷에 비해 pgSIT 수컷에서 손상되지 않았다. 또한, Lin and Potter, G3 (2016) doi : 10.1534 / g3.116.034884 는 모계 퇴적 Cas9가 자손 표현형, 두 가지 유형의 pgSIT 수컷 -- 부계 Cas9을 유전한 하나와 모계 Cas9을 유전한 다른 하나--에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다고 보고했고, 이 두가지 유형은 별도로 고려되었다. 도 4d-4e를 참조하면, wt 수컷의 중간 생존 시간은 32.3 ± 1.3 일 (N = 5, n = 275)로 추정되는 반면, pgSIT 수컷의 중간 생존 시간은 부계 Cas9 및 모계 Cas9를 각각 갖는 수컷에 대해 각각 52.7 ± 1.6 일(N = 5, n = 220) 및 53.7 ± 0.9 일(N = 5, n = 275) 이었다. 도 4d를 참조하면, 이들 Cas9 pgSIT 수컷 둘 다 wt 수컷보다 유의하게 더 오래 생존하였으나 (P <2.2-16),이 두 가지 유형의 pgSIT 수컷에 대한 수명 (일 단위로 측정 된 생존 시간) 사이에는 유의한 차이가 확인되지 않았다. 드로소필라 야생형 수컷의 경우 다른 중간 생존 시간을 고려하여, 예를 들어, 35.5 일 (in Tatar et al., Science 292, 107-110 (2001)에서 보고됨) 및 57 일 (reported in Clancy et al., Science 292, 104-106 (2001) and Lin et al., Science 282, 943-946 (1998)에서 보고됨) 이고, 식품 조성, 온도 등과 같은 번식 조건은 생존 시간에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. pgSIT 수컷의 중간 생존 시간이 wt 수컷에 대해 보고된 더 긴 생존 시간과 비교될 만하고, pgSIT 수컷은 78 %의 교미 경쟁력을 나타내므로, 본 개시의 방법에 따라 제조된 유전적으로 조작된 pgSIT수컷 곤충에서 생존 (예를 들어, 수명) 또는 교미 경쟁력이 손상되지 않는다.
실시예 5. 현재의 방법들을 능가하여 모기 개체군을 억제 또는 감소시키는 pgSIT의 잠재력
본 개시의 pgSIT 방법론이 현재 이용 가능한 자기-제한 억제 또는 감소 기술 (예를 들어, RIDL, fsRIDL 및 IIT)과 비교하는 방법을 평가하기 위해, Sanchez et al., (2018), doi:10.1101/350488에서 개시된 MGDrivE 시뮬레이션 프레임워크를 사용하여 이들 기술 각각에 대해 방출 방식을 시뮬레이션 하였고, 이의 전문이 본원에 참고로 포함된다. 이 시뮬레이션 프레임워크는 중첩되는 세대에서 난, 유충, 번데기 및 성체 모기 생 단계, 유충 밀도에 따라 유충 사망률 증가, 암컷이 그들의 성체 수명의 기간 동안 그들이 교미하는 성체 수컷의 유전 물질을 유지하는 교미 구조를 모델링한다. 도 4f를 참조하면, 시뮬레이션 프레임워크는 표시된 바와 같은 모델 및 매개 변수를 갖는 10,000 마리 성체 암컷으로 구성된 무작위 혼합 개체군으로의 방출을 위해 프로그램 되었다.
도 4f-4g를 참조하면, 성체 수컷의 주간 방출이 RIDL 및 IIT에 대해 모의되었고 난이 6 개월 동안 모의되거나 fsRIDL 및 pgSIT에 시뮬레이션 되었다. 성인 방출 비율은 Carvalho et al., (2015) (supra)에 개시된 브라질에서 아에. 아에집티 RIDL 모기의 현장 시험의 선례에 따라 야생 성체 당 10마리의 성체 RIDL / IIT 수컷이었고, 난자 방출 비율은 Otero et al., 2006 (supra)에 개시된 것과 같이 온화한 기후에서 암컷 아에데스(아에) 아에집티가 하루에 약 20개의 난을 생산하는 것을 고려하여 야생 성체 당 200 개의 난 이었다. 이러한 시뮬레이션 결과는 난이 방출된 시스템 (예: pgSIT 및 fsRIDL)이 방출된 난이 유충처럼 빠르게 부화하고 밀도 의존 유충 경쟁의 결과로서 생식력 있는 유충의 생존을 감소시키면서 처음 3 주 동안 가장 빠른 개체군 억제 또는 감소를 초래함을 시사한다. pgSIT 접근법은 첫번째 달 말부터 가장 큰 억제 또는 감소, 방출 기간 동안 개체군을 제거할 수 있는 가장 큰 잠재력을 보여준다. 이는 pgSIT 수컷 (wt 수컷의 78 %) c.f. fsRIDL 수컷 (케이맨 제도와 브라질에서 RIDL 현장 시험을 기준으로 wt 수컷의 약 5 %) (Harris 등, 2011 및 Carvalho 등, 2015) (supra) 의 더 높은 교미 경쟁력 때문이고, 그것은 방출된 미성숙 형태에 의한 유충 자원의 더 큰 소비가 억제 또는 감소에 미치는 더 적은 영향을 가질 때 낮은 개체군 밀도에서 우세한 요소가 된다. 성체 RIDL 수컷의 10 : 1 방출로 인한 개체군 억제 또는 감소는 밀도-의존적 유충 경쟁에 대한 영향의 지연으로 인해 fsRIDL 난을 2 내지 3 주간 방출하는 것을 추적하고; 그러나 규모는 비슷하다. 올바키아 감염을 통해 수컷의 비호환성이 유도되고, 억제 또는 감소를 방해하는 올바키아-감염된 암컷의 의도하지 않은 방출의 가능성이 Zhang et al., 20151 and Zhang et al., 20152 (supra)에서 보고된 바와 같이 저수준의 방사선 조사를 통해 줄어들기 때문에, 성인 IIT 수컷의 동등한 방출은 시뮬레이션 전략에 덜 영향을 미치고, Yamada et al., 2014 (supra)에서 보고된 바와 같이, 방출된 IIT 수컷의 수명이 대략 절반으로 줄어드는 결과를 가져왔다.
실시예 6. 재료 및 방법
CRISPR 표적 부위 디자인
암컷 치사 및 수컷 불임을 부여하기 위해, 가이드 RNA (gRNA)에 대한 표적 부위는 성별 결정 유전자의 암컷-특이적 엑손, 섹스 레탈 (Sxl), 트랜스포머 (tra) 및 더블 섹스 (dsx) 내에서, 수컷 특이적 유전자에서, 베타튜뷸린 85D (βTub), 퍼지 오니온즈 (fzo), 프로타민 A (ProA) 및 스퍼마토사이트 어레스트 (sa)에서 선택되었다. CHOPCHOP v2 (Labun et al., Nucleic Acids Res. 44, W272-6 (2016)에 개시된 바와 같이, 그 전체 내용은 본원에 참고로 포함됨)는 표적외 절단을 최소화하기 위하여 드로소필라 게놈 (dm6)에서 특정 서열로부터 gRNA 표적 부위를 선택하는데 사용되었다. 대안적인 스플라이싱으로 인해, 기능성 Sxl 및 Tra 단백질은 드로소필라 암컷에서만 생성되는 반면, 두 가지 버전의 Dsx 단백질 - 암컷 (DsxF) 또는 수컷 (DsxM)- 은 도 1b에 도시된 바와 같이 각각 상응하는 성별에서 만들어진다. βTub에 대한 gRNA 표적은 Kemphues et al., Cell 21, 445-451 (1980) (supra)에 보고된 바와 같이 βTub85DD (B2tD) 돌연변이체 대립 유전자 부근에서 선택되었다. gRNA 표적 부위의 서열이 도 1c에 제시되어 있다.
구축물의 디자인 및 조립
Gibson et al., Nat. Methods 6, 343-345 (2009)에 개시된 바에 따라 Gibson 효소 조립 방법을 사용하여 모든 구축물들을 만들었고, 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 핵 위치 신호 (NLS) 플랭킹 SpCas9 코딩 서열 및 Opie2-dsRed 형질 전환 마커를 갖는 SpCas9-T2A-GFP를 보유하는 상기 기재된 플라스미드는 본원에서 사용된 드로소필라 Cas9 구축물을 구축하는데 사용되었다. 이 플라스미드를 아에. 아에집티 형질전환transgenesis)에 사용하였고, 이는 피기백(piggyback) 및 attB-도킹 부위 (Addgene # 100608) 둘 다를 가졌다. 이는 Li et al., (2017) doi:10.1101/156778 에 개시되었다.
도 1c에 개략적으로 나타낸 바와 같이, 상기 아에. 아에집티는프로모터는 NotI & XhoI 부위에서 절단하고 이를 Nanos (nos), 또는 유비퀴틴-63E (Ubi), 또는 Vasa (vas) 프로모터로 대체함으로써 제거되었다. 프로모터 단편을 표 1에 열거된 바와 같은 다음의 프라이머을 사용하여 드로소필라 게놈 DNA로부터 PCR 증폭시켰다: nos-F, nos-R, Ubi-F, Ubi-R, vas-F 및 vas-F. 단일 gRNA를 갖는 구축물을 생성하기 위해, 드로소필라(Drosophila) U6-3 프로모터 및 표적, 스캐 폴드 및 종결자 신호 (gRNA)를 갖는 가이드 RNA를 백색 유전자와 D. 멜라노개스터(melanogaster) 형질전환에 사용된 플라스미드 내부 atB-도킹 부위 사이의 다중 클로닝 부위 (MCS)에서 클로닝 하였다. Akbari et al., Curr. Biol. 23, 671-677 (2013)에 기재되어 있으며, 이의 전체 내용은 참고로 포함된다. 이 시리즈의 첫 번째 플라스미드의 경우, U6-3-gRNAβTub, 드로소필라 U6-3 프로모터는 U6-1F 및 U6-2R 프라이머로 드로소필라 게놈 DNA로부터 증폭된 반면, 완전한 gRNA는 두 개의 ultramer® gRNA-3F로부터 PCR-조립되었고, gRNA-4R 올리고(gRNA-4R oligos)는 통합 DNA 기술 (Integrated DNA Technology; IDT)에 의해 합성되었다. gRNA 전사의 종결 효율을 개선시키기 위해, 11 개의 티민을 갖는 종결 신호를 본 발명의 디자인에 사용하였다. 연속적인 플라스미드에서, U6-3 프로모터 및 gRNA 스캐 폴드는 gRNA 표적(U6-1AF, U6-2A/B/CR, gRNA-3A/B/CF, and gRNA-4AR)을 구성하는 20 개의 염기를 대체하도록 설계된 중첩 중간 올리고를 사용하여 U6-3-gRNAβTub 플라스미드로부터 증폭되었고, AscI 및 NotI 부위에서 동일한 플라스미드를 분해하여 대체되었다. 이중 gRNA (dsRNA)로 플라스미드 세트를 조립하기 위해, U6-3 프로모터 및 gRNA를 2XgRNA-5F 및 2XgRNA-6R 프라이머로 암컷 성별-결정 유전자를 표적으로 하는 단일 gRNA (sgRNA) 플라스미드에서 하나의 단편으로 증폭시켰고, 백색 유전자와 U6-3 프로모터 사이의 BamHI 부위에서 선형화 된 U6-3-gRNAβTub 플라스미드 내에서 클론되었다. 각각의 dgRNA 플라스미드는 도 1c에 도시된 것과 같이, βTub85D를 표적으로 하는 동일한 gRNAβTub 및 동일한 방향으로 독립적으로 발현된 Sxl, tra 또는 dsxF를 표적으로하는 다른 gRNA를 가졌다. 도 1c을 참조하면, 본 연구를 위해 생산된 드로소필라 Cas9 플라스미드 및 gRNA 플라스미드를 애드젠(Addgene)에 기탁하였다. βTub85D-GFP 구축물을 구축하기 위해, βTub 코딩 서열의 직접적 업스트림의 481bp 단편이 βTub-F 및 βTub-R 프라이머를 갖는 초파리 게놈 DNA로부터 PCR 증폭되었고, 상기 기재된 백색 attB-도킹 부위 플라스미드 내로 GFP의 업스트림이 클론되었다.
표 1. 프라이머 서열
파리 유전학 및 이미징
파리를 25 ℃에서 표준 조건 하에 유지시켰다. 배아 주사는 Rainbow Transgenic Flies, Inc. (http://www.rainbowgene.com)에서 수행되었다. 도 1c을 참조하면, Cas9 및 gRNA 구축물은 각각 세 번째 염색체 (블루밍톤 # 9750)의 PBac {y + -attP-3B} KV00033 및 두 번째 염색체 (블루밍톤 # 9750)의 P {CaryP} attP1에 삽입되었다; 반면βTub-GFP 구축물은 세 번째 염색체 (블루밍톤 # 24486)의 M {3XP3-RFP.attP '} ZH-86Fa에 삽입되었다. 형질전환된 파리는 w1118; CyO / snaSco 및 w1118; TM3, Sb1 / TM6B, Tb1와 균형을 이루고; 그리고 w1118; CyO / Sp; Dr1 / TM6C, Sb, Tb1. βTub-GFP 과 이중 균형을 이루었다. 상기 βTub-GFP(세 번째 염색체 위의)는 두 번째 염색체 위에 각각 gRNAβTub, Sxl, gRNAβTub, Tra 및 gRNAβTub, DsxF와 이중 균형을 이루고 유전자 이입되어 트랜스-이형접합 평형 스톡 (dgRNA / CyO; βTub-GFP / TM6C, Sb, Tb)을 발생시켰다.
sgRNA에 의해 유발된 녹아웃 및 상응하는 표현형의 효율을 시험하기 위해, 각 성별의 7 마리 파리를 교차시켜 트랜스-이형접합 F1 sgRNA / +; sgRNA의 각 조합에 대한 nos-Cas9 / + 파리를 생성하였고; 및 그들의 외부 형태와 생식력을 검사했다. 두 이식유전자(Both transgenes) 모두 w + 아이즈 (sgRNA, dgRNA) 및 dsRed (Cas9)를 갖는 형광 입체 현미경에서 확인되었다. 녹아웃 표현형을 야기한 sgRNA 라인을 각각의 복제 교차에 대해 10♂ 및 10♀ 파리를 사용하여 양 방향으로 nos-Cas9 파리를 갖는 동형접합 스톡으로서 추가로 시험하였다. DgRNA 라인을 동형접합 nos-Cas9, vas-Cas9 및 Ubi-Cas9 라인들과 양방향으로 테스트 하였다. 또한, 비교 제어를 제공하기 위해 sgRNA, dgRNA 및 Cas9 동형접합 라인들을 양방향으로 w-파리에 교차시켰다. Lin and Potter, G3 (2016) doi : 10.1534 / g3.116.034884에 개시된 바와 같이 배아에 단백질로서 로드된 Cas9의 비멘델성 우성 모성 효과를 테스트하기 위해, 동형 접합 dgRNA 파리들을 이형접합 Cas9 파리; 및 dgRNA / +의 표현형로 교차시켰고; 모계 Cas9 또는 부계 Cas9를 갖는 + / TM3, Sb 자손을 비교하였다. 부계 Cas9와의 교차로부터의 F1 자손은 Cas9의 우세한 모계 효과를 조사하기 위해 대조군으로서 제공되었다. Cas9 유전자를 가지고, Cas9 유전자 없이 생산된 녹아웃 파리들의 생식력을 검사하기 위해, 10-20 F1 수컷 및 암컷, 또는 인터 섹스들의 배치(batches)들이, 상응하게, W- 및 / 또는 Cantos S 스톡으로부터 15-20 개의 암컷 숫처녀(virgin) 및 수컷 파리와 교차되었다. 상기 교차 후 3 일 또는 4 일이 지난 뒤에, 상기 파리들을 새로운 바이알(bials)에 통과시켰고, 일주일 안에, 두 바이알 모두를 생존 가능한 자손이 있는지 검사하였다. 전체 배치의 생식력은 생존 가능한 유충이 하나의 바이알에서 확인되었을 때 100 %, 또는 두개의 바이알에서 자손이 부화되지 않은 경우 0 %로 기록되었다. 인터 섹스 및 wt 수컷을 함유하는 바이알들 또한 낳은 난들의 존재에 대해 검사되었다. 통계학적 비교를위한 평균 및 표준 편차를 생성하고 결과의 일관성 및 견고성을 측정하기 위해 모든 교차를 최소 3 회 반복하였다.
라이카(Leica) DMC2900 카메라가 장착된 라이카 M165FC 형광 입체 현미경에서 파리들이 기록되고, 검사 및 이미지화 되었다. 성체 파리들의 이미지를 생성하기 위해, 다른 초점 플레이트에서 수집된 이미지 스택을 헬리오스 포커스(Helios Focus) 6에서 단일 이미지로 컴파일되고, 아도비 포토샵(Adobe Photoshop) CS6에서 편집되었다. 인터섹스 파리와 불임 수컷의 내부 해부학적 특징을 연구하기 위해, 생식 기관을 PBS 완충액에서 해부하고 검사하고 이미지화 했다. 녹아웃 표현형의 변화를 추정하기 위해, 약 10-20 파리들이 각 시험된 유전자형에 대해 해부되었다.
Sxl 치사의 발달 단계
Sxl 녹아웃 암컷이 죽는 발달 단계를 확인하기 위해, 난 부화 및 유충 사멸률을 dgRNAβTub, Sxl / +; nos-Cas9 / + 트랜스-이형접합 파리에서 수량화 되었다. 난 부화 속도를 정량화하기 위해, 3 개의 복제 교차가, 각각 20-30 마리의 동형 접합 nos-Cas9 암컷 숫처녀 및 10-20 마리의 dgRNAβTub, Sxl 수컷이, 포도 주스 아가(agar) 플레이트와 함께 배아 수집 케이지 (Genesee Scientific 59-100)에 설치되었다. w-파리들이 있는 3 개의 배아 수집 케이지가 비교 대조군으로 사용되었다. 각각의 수집 케이지로부터 약 200 개의 낳은 난의 배치들을 계산하고, 부화되지 않은 난의 수를 계산하기 위해 36 시간 이상 동안 추적하였다. 유충의 사멸률을 정량화하기 위해, 50 마리 출현한 유충의 2 개 배치들을 각 아가 플레이트에서 음식과 함께 플라이 바이알로 분리하여 성체로 기른 후, 출현한 성체의 수와 성별을 기록하였다. 번데기 단계에서 치사율을 정량화하기 위해, 각각의 바이알에서 다수의 죽은 번데기가 기록되었다. gRNA(βTub.Sxl) / +의 부화 속도 및 암컷 번데기 치사율; nos-Cas9 / + 배아에 대한 데이터가 각각 표 2 및 표 3에 제시되어 있다.
표 2. gRNA(βTub.Sxl)/ +; nos-Cas9 / + 배아의 부화율
표 3. gRNA(βTub.Sxl)/+; nos-Cas9/+ 배아에서 암컷 번데기 치사율
Dsx의 암컷- 및 수컷-특이적 스플라이스 전사체의 RT-PCR
dsx 스플라이싱에 대한 tra 녹아웃의 효과를 평가하기 위해, 우리는 tra 녹아웃 인터 섹스에서 dsx의 암컷 및 수컷-특이적 mRNA를 스크린 했다. MirVana miRNA 분리 키트 (Ambion)의 표준 프로토콜에 따라 성체 w- 수컷, w- 암컷 및 tra 녹아웃 (dgRNAβTub, Tra / +; nos-Cas9 / +) 인터 섹스 파리들로부터 총 RNA를 추출하였다. DNA 오염을 제거하기 위해, TURBO DNA-freeTM Kit (Ambion)를 사용하여 TURBOTM DNase로 2 μg을 처리했다. 프로토콜에 따라 Dsx 암컷 및 수컷 스플라이스 변이체들을 SuperScript ® III 원스텝 RT-PCR 키트 (Invitrogen)로 증폭시켰다. 동일한 정방향 프라이머, Dsx-RT-1F 및 두 개의 상이한 역방향 프라이머, DsxF-RT-2R 및 DsxM-RT-3R (표 1)을 사용하여 암컷 또는 수컷 전사체를 각각 증폭시켰다. PCR 특이성을 테스트하기 위해 10 μL의 PCR 산물을 1 % 아가로즈 겔에서 작동시키고, 나머지 40μL을 QIAquick PCR 정제 키트 (QIAGEN)를 사용하여 정제하거나, 이중 밴드가 겔에서 확인 된 경우, Zymoclean ™ 겔 DNA 복구 키트 (Zymo Research)로 겔 정제하고, 그 다음 깨끗한 앰플리콘(amplicons)을 Source BioScience에서 생어(Sanger) 방법을 사용하여 양방향으로 서열분석하였다 (https://www.sourcebioscience.com).
gRNA를 표적으로하는 유전자형 유전자좌
Cas9 및 gRNA를 운반하는 파리에서 암컷 치사 또는 웅성화 및 수컷 불임을 유발한 분자적 변화를 조사하기 위해, 4 개의 기능성 gRNA(도 1c)에 대한 표적 부위를 포함하는 4 개의 게놈 유전자좌를 증폭시키고 서열 분석하였다. 30 μl의 새로 제조된 스퀴싱 버퍼 (squishing buffer, 10 mM Tris-Cl pH 8.0, 1 mM EDTA, 25 mM NaCL, 200 μg / mL Proteinase K)에서 파리를 균질화하여 단일 파리 게놈 DNA preps를 준비했고, 이는 37 ℃ 에서 35 분 동안에서 인큐베이팅하고, 95 ℃에서 2 분 동안 가열한다. 2μl의 게놈 DNA를 LongAmp® Taq DNA Polymerase (NEB)와의 40μL PCR 반응에서 템플릿으로 사용했다. 다음의 프라이머들 (표 1)이 해당하는 gRNA 표적으로 유전자좌를 증폭시키는데 사용되었다: 베타튜뷸린 85D을 위해 βTub-1AF 및 βTub-2AR; 섹스 레탈을 위해 Sxl-3BF 및 Sxl-4AR; 트랜스포머를 위해 Tra-5F 및Tra-6R; 더블 섹스를 위해 Dsx-7F 및 Dsx-8R. QIAquick PCR 정제 키트 (QIAGEN)를 사용하여 PCR 생성물을 정제하고, Source BioScience에서 생어 방법으로 양방향으로 서열분석하였다. 표적화된 부위에서 분자적 변화를 특성화하기 위해, 서열 AB1 파일을 SnapGene® 4 및 / 또는 Sequencher™ 5에서 해당 참조 서열에 대비하여 정렬시켰다.
불임 수컷의 경쟁 분석
βTub 녹아웃 (gRNAβTub,Sxl/+; nos-Cas9/+) 수컷의 경쟁력을 평가하기 위해, wt 수컷 존재시 암컷과 교미를 확보하는 능력을 평가하였다. W-수컷은 βTub 녹아웃 수컷과 동일한 유전적 배경을 공유하고, 이상적인 비교를 제공한다. 두 개의 wt, 하나의 wt, 하나의 wt와 하나의 βTub 녹아웃, 또는 두 개의 βTub 녹아웃 수컷을 이틀 동안 효모 페이스트에서 분리된 10 마리의 w-숫처녀가 있는 플라이 바이알에 넣고 어두운데에서 밤새(12 시간) 암컷과 함께 구애하고 교미를 하도록 하였다. 수컷 구애 원동력을 높이기 위해, 새롭게 출현한 dgRNAβTub,Sxl/+ ; nos-Cas9/+ 및 wt 수컷들은 암컷으로부터 분리하고 경쟁 분석 전에 4 일 동안 숙성시켰다. 드로소필라 암컷은 일생 동안 여러 수컷과 짝을 짓는다; 그리고 성교 후 수정낭에 정자가 옮겨지지 않은 경우, 암컷의 금욕은 성교 후 하루 동안 지속된다. 이는 Peng et al., Curr. Biol. 15, 207-213 (2005)에 개시되어 있으며, 이의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다. 따라서, 12 시간의 교미 후, 모든 수컷을 바이알들로부터 제거하고 암컷들은 포도 주스 아가 플레이트를 사용한 작은 배아 수집 케이지 (Genesee Scientific 59-100)로 옮겼다. 36 시간 이내에 세 개의 배치들의 난을 수집하고 부화되지 않은 난을 세었다. 다수의 부화되지 않은 난에 의해 추정되는 생식력의 감소는 wt 수컷의 존재하에 암컷과의 성공적인 교미를 기록하는 gRNAβTub,Sxl/+; nos-Cas9/+ 수컷의 능력을 나타냈다; 따라서 βTub 녹아웃 수컷의 경쟁력에 대한 정보를 제공했다. 12 시간 동안 10 마리의 암컷 각각을 수정하는 능력을 시험하기 위해 한마리의 wt 수컷을 사용하였고, 따라서 진정한 경쟁 또는 두 마리 wt 수컷의 희석 효과 사이에 차이를 두었다.
pgSIT 수컷의 수명을 추정하기 위한 생존 곡선
pgSIT (gRNAβTub,Sxl/+; nos-Cas9/+)와 wt 수컷 사이의 생존의 차이를 비교하기 위해, 세 개의 실험 그룹의 수컷에 대한 평균 수명이 추정되었다. 두 가지 유형의 pgSIT 파리들은 분리된 실험 그룹들로 취급되었다--하나는 부계 Cas9를 가지고 다른 하나는 모계 Cas9를 가진다. 생존 곡선을 추정하기 위해 세 그룹 각각에 대해 5 개의 레플리케이트(replicates)가 적용되었다. 각 유형의 수컷을 매일 수집하고 바이알 당 20 마리의 수컷 배치에서 성숙시켰다. 각각의 레플리케이트는 각각 2 개 또는 4 개의 바이알에 보관된 40 내지 75 마리의 수컷을 가졌다. 신선한 음식이 있는 새로운 바이알로로 파리를 옮기는 동안 매 3 일마다 죽은 파리의 수가 기록되었다. Fay et al., J. Stat. Softw. 36, (2010) 에 기술된 바와 같이 R 패키지 "간격"에서 구현된, 각 그룹에 대한 생존 곡선의 비모수적 최대 가능성 추정치 (NPMLE)를 계산함으로써 세 개의 실험 그룹에 대해 이벤트 간 간격 검열 된 시간 (예를 들어, 사멸) 데이터를 분석하였다. 상기 자료의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다. 추정 절차는 3 일의 관측 기간에 의해 도입된 불확실성을 고려한다. 중간값 생존 시간 및 표준 편차를 정량화하기 위해 10,000 회 반복된 부트 스트랩을 적용하였다.
수학적 모델링
현재 이용 가능한 자가-제한 억제 또는 감소 기술- RIDL, fsRIDL and IIT - ＼ 방출 계획과 비교하여 지역적 아에. 아에집티 개체군을 억제 또는 감소시킬 때의 pgSIT의 예상 성능을 모델링하기 위하여, Sanchez et al., 2018, doi:10.1101/350488 (https://marshalllab.github.io/MGDrivE/)에 개시된 MGDrivE 시뮬레이션 프레임워크를 사용하여 각각 시뮬레이션 되었다. 상기 자료의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다. 이 프레임워크는 난, 유충, 번데기 및 성인 모기 생의 단계 (수컷과 암컷 성체가 모두 모델링 됨)를 모델링하여 일일 시간 단계, 중첩되는 세대, 교미 구조를 구현하였고, 상기 교미 구조는 성체 암컷이 성체의 수명 기간 동안 교미하는 성체 수컷의 유전 물질 유지하고, 출현시 한 번 교미를 하는 동안, 성체 수컷이 일생 동안 교미하는 교미 구조이다. 유년(juvenile) 생의 단계에 대한 밀도 독립적 치사율은 동일하다고 가정되며 밀도 의존적 치사율이 없을 때 개체군 성장율과 일관성이 있도록 선택된다. 추가 밀도-의존성 치사율은 유충(larval) 단계에서 발생하며, 그 형태는 Deredec et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, E874-80 (2011)에서 인용하였고, 그 전체 내용은 본원 참고로 포함된다. pgSIT, RIDL, fsRIDL 및 IIT 시스템의 유전 패턴은 성체 수명, 수컷 교미 경쟁력 및 퓨파토리(pupatory) 성공에 미치는 영향과 함께, Sanchez et al., 2018, doi:10.1101/350488에 기재된 대로 MGDrivE 프레임워크 https://paperpile.com/c/cKXxhc/fx0P6의 유전 모듈 내에서 모델링 되었다. MGDrivE 프레임워크의 확률적 버전은 개체군이 적을 때의 무작위 효과와 개체군 제거의 가능성을 포착하기 위해 구현되었다.도 4f의 표에 열거된 아에. 아에집티 수명 이력 및 중재 파라미터 값과 함께, 평형 상태에서 10,000 마리의 성체 암컷으로 구성된 무작위-혼합 개체군으로, 6 개월에 걸쳐 주간 방출이 시뮬레이션 되었다.
통계적 분석
SAS 인스티튜트 잉크(SAS Institute Inc.)에 의한 JMP 8.0.2에서 통계 분석이 수행되었다. 3 ~ 5 개의 생물학적 레플리케이트들이 비교를 위한 통계적 수단을 생성하기 위해 사용되었다. P 값은 이분산으로 두개-샘플 스튜던트 t-검정(two-sample Student’s t-test)에 대해 계산했다. 수컷 불임의 중요성을 테스트하기 위해, 분할표를 위해 피어슨의 카이제곱 검정(Pearson’s Chi-squared tests)이 P 값을 계산하기 위해 사용되었다. 추정된 생존 곡선 간의 차이를 테스트하기 위해 우리는 Sun, Stat. Med. 15, 1387-1395 (1996) 에 기술된 대로 Sun의 로그-순위 테스트의 일반화(Sun’s generalization of the log-rank test)를 사용했고, 상기 자료의 전체 내용은 본원의 참고로 포함된다. 또한, 컨저브티브 Bonferroni 보정(conservative Bonferroni correction)으로 두 pgSIT 그룹 간의 차이에 대한 짝 사후 검증 테스트(pairwise post-hoc tests)를 수행했다.
디파짓된 데이터
완전한 주석 플라스미드(annotated plasmid) 서열 및 플라스미드 DNA는 공개적으로 애드젠(Addgene)에 주문할 수 있다. 유전자 변형 파리는 블루밍톤 드로소필라 스톡 센터(Bloomington Drosophila stock center)에서 주문할 수 있게 되었다.
본 개시가 특정 예시적인 실시 양태들을 참조하여 예시되고 설명되었지만, 당업자는 다음의 청구범위에 정의된 바와 같이 본 개시의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 기술된 구체적 양태에 대한 다양한 수정 및 변경이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다.
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<160> 25
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> Drosophila sp.
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> Sxl gRNA target
<400> 1
gattgtcaac tacttgcccc agg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Drosophila sp.
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> Sxl B gRNA target
<400> 2
cagaatcatg cgagactata agg 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Drosophila sp.
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> Tra gRNA target
<400> 3
cggcgagaaa gagaatacca tgg 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> Drosophila sp.
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> Tra B gRNA target
<400> 4
gattccgtac tttgcagacg agg 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Drosophila sp.
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> DsxF gRNA target
<400> 5
gtgagctgcg caacacaacg cgg 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> Drosophila sp.
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> BTb gRNA target
<400> 6
cctgagtgtg catcagctgg tgg 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> Drosophila sp.
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> Fzo gRNA target
<400> 7
ggcaacggtc cgaaattgct ggg 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> Drosophila sp.
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> ProtA gRNA target
<400> 8
gagtgcaaga gcctgtggaa tgg 23
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> Drosophila sp.
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> Sa gRNA target
<400> 9
gctgagctcc acaaaggccg tgg 23
<210> 10
<211> 73
<212> DNA
<213> Drosophila sp.
<400> 10
ggtggtggag ccctacaatg ccaccctgag tgtgcatcag ctggtggaga acaccgatga 60
gacgtactgc atc 73
<210> 11
<211> 73
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide
<220>
<221> modified_base
<222> (41)..(73)
<223> a, c, t, g, unknown or other
<400> 11
ggtggtggag ccctacaatg ccaccctgag tgtgcatcag nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60
nnnnnnnnnn nnn 73
<210> 12
<211> 73
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(41)
<223> a, c, t, g, unknown or other
<400> 12
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ntggtggaga acaccgatga 60
gacgtactgc atc 73
<210> 13
<211> 73
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide
<220>
<221> modified_base
<222> (40)..(73)
<223> a, c, t, g, unknown or other
<400> 13
ggtggtggag ccctacaatg ccaccctgag tgtgcatcan nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60
nnnnnnnnnn nnn 73
<210> 14
<211> 75
<212> DNA
<213> Drosophila sp.
<400> 14
atcctcgggc aagcaacacc aacctgattg tcaactactt gccccaggac atgaccgatc 60
gcgagctgta cgccc 75
<210> 15
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide
<220>
<221> modified_base
<222> (39)..(75)
<223> a, c, t, g, unknown or other
<400> 15
atcctcgggc aagcaacacc aacctgattg tcaactacnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60
nnnnnnnnnn nnnnn 75
<210> 16
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(42)
<223> a, c, t, g, unknown or other
<400> 16
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nncccaggac atgaccgatc 60
gcgagctgta cgccc 75
<210> 17
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide
<220>
<221> modified_base
<222> (33)..(34)
<223> a, c, t, g, unknown or other
<220>
<221> modified_base
<222> (39)..(75)
<223> a, c, t, g, unknown or other
<400> 17
atcctcgggc aagcaacacc aacctgattg tcnnctacnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60
nnnnnnnnnn nnnnn 75
<210> 18
<211> 74
<212> DNA
<213> Drosophila sp.
<400> 18
ttcccgtggc tcaaggtctc gatcccggcg agaaagagaa taccatgggc gatcaagcga 60
gagggacagc agaa 74
<210> 19
<211> 74
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide
<220>
<221> modified_base
<222> (42)..(74)
<223> a, c, t, g, unknown or other
<400> 19
ttcccgtggc tcaaggtctc gatcccggcg agaaagagaa tnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60
nnnnnnnnnn nnnn 74
<210> 20
<211> 74
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(44)
<223> a, c, t, g, unknown or other
<400> 20
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnatgggc gatcaagcga 60
gagggacagc agaa 74
<210> 21
<211> 74
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(42)
<223> a, c, t, g, unknown or other
<400> 21
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnccatgggc gatcaagcga 60
gagggacagc agaa 74
<210> 22
<211> 75
<212> DNA
<213> Drosophila sp.
<400> 22
acataatttg aatatctatg acgggggtga gctgcgcaac acaacgcggc aatgtggatg 60
ataatttttc attaa 75
<210> 23
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide
<220>
<221> modified_base
<222> (41)..(75)
<223> a, c, t, g, unknown or other
<400> 23
acataatttg aatatctatg acgggggtga gctgcgcaac nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60
nnnnnnnnnn nnnnn 75
<210> 24
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(42)
<223> a, c, t, g, unknown or other
<400> 24
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnaacgcggc aatgtggatg 60
ataatttttc attaa 75
<210> 25
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide
<220>
<221> modified_base
<222> (31)..(75)
<223> a, c, t, g, unknown or other
<400> 25
acataatttg aatatctatg acgggggtga nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60
nnnnnnnnnn nnnnn 75
Claims (30)
- 유전적으로 변형된 곤충의 자손에서 수컷 성별을 유도하는 방법에 있어서,
적어도 하나의 핵산 서열을 제 1 곤충의 게놈 내로 통합시키는 단계로서, 상기 적어도 하나의 핵산 서열은 암컷-특이적 생존력에 필요한 암컷-필수 게놈 서열을 표적으로 하는 적어도 하나의 제 1 가이드 폴리뉴클레오티드 및 수컷-특이적 생식력에 필요한 수컷 불임 게놈 서열을 표적으로 하는 적어도 하나의 제 2 가이드 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 수컷 불임 게놈 서열은, 베타튜뷸린 85D (βTub), 퍼지 오니온 (Fzo), 프로타민 (ProtA), 및 스퍼마토사이트 어레스트 (Sa)로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자이고;
엔도뉴클레아제를 코딩하는 핵산 서열을 제 2 곤충의 게놈 내로 통합시키는 단계로서, 상기 제 2 곤충은 제 1 곤충과 유전적으로 교차될 수 있고,
상기 제 1 곤충과 상기 제 2 곤충은 교미가 가능한 동일한 곤충 또는 두 개의 상이한 곤충이며, 디프테라 목(Order)에 속하고,
상기 엔도뉴클레아제는 CRISPR-연관 서열 9 (Cas9) 엔도뉴클레아제를 포함하며, 및
상기 엔도뉴클레아제는 적어도 하나의 제 2 가이드 폴리뉴클레오티드에 의해 수컷 불임 게놈 서열을 효소적으로 녹아웃하도록 하고; 및
상기 제 1 곤충 및 상기 제 2 곤충을 유전적으로 교차시키는 단계로서, 상기 교차시키는 단계는 상기 엔도뉴클레아제와 수컷 곤충 난이 성체로 성숙하는 상기 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 자손을 생산하는 것;을 포함하는, 유전적으로 변형된 곤충의 자손에서 수컷 성별을 유도하는 방법.
- 불임 수컷 곤충 난의 유전적으로 변형된 자손을 생산하는 방법에 있어서,
제1항의 방법을 포함하고, 상기 제 1 곤충과 상기 제 2 곤충을 유전적으로 교차시키는 단계는 불임 수컷 곤충 난의 자손을 생산하는, 불임 수컷 곤충 난의 유전적으로 변형된 자손을 생산하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 적어도 하나의 핵산 서열을 제 1 곤충의 게놈 내로 통합시키는 단계는, 게놈 내의 모든 염색체 사본 내로 동형접합적 통합을 포함하는, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 적어도 하나의 핵산 서열을 통합시키는 단계는, 상기 적어도 하나의 핵산 서열을 배아단계에서 상기 제 1 곤충으로 도입하는 것을 포함하는, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 적어도 하나의 제 1 가이드 폴리뉴클레오티드와 상기 적어도 하나의 제 2 가이드 폴리뉴클레오티드는 각각 적어도 하나의 가이드 리보 핵산(gRNA)을 포함하는, 방법.
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 적어도 하나의 제 1 가이드 폴리뉴클레오티드는, 각각 암컷-특이적 생존력에 필요한 동일한 암컷-필수 게놈 서열의 상이한 영역을 표적으로 하는 하나 이상의 제 1 가이드 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 적어도 하나의 제 1 가이드 폴리뉴클레오티드는, 각각 암컷-특이적 생존력에 필요한 상이한 암컷-필수 게놈 서열을 표적으로 하는 하나 이상의 제 1 가이드 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 암컷-필수 게놈 서열은, 유전자 또는 유전자의 스플라이스-변이체이고, 상기 유전자는 섹스 레탈 (Sxl), 트랜스포머 (Tra), 더블섹스 (Dsx), 및 이의 호모로그로 이루어지는 군에서 선택되는, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 적어도 하나의 제 1 가이드 폴리뉴클레오티드는, 각각 Sxl, Tra, Dsx, 및 이의 호모로그로 이루어진 군으로부터 선택된 상이한 유전자를 표적으로 하는 하나 이상의 제 1 가이드 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
- 제10항에 있어서,
상기 하나 이상의 제 1 가이드 폴리뉴클레오티드는, 각각 Sxl, Tra, Dsx, 및 이의 호모로그로 이루어진 군으로부터 선택된 상이한 유전자를 표적으로 하는 두 개의 제 1 가이드 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
- 제10항에 있어서,
상기 하나 이상의 제 1 가이드 폴리뉴클레오티드는, 각각 Sxl, Dsx, 및 이의 호모로그로 이루어진 군으로부터 선택된 상이한 유전자를 표적으로 하는 두 개의 제1가이드 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 제 2 곤충이 수컷인 경우, 상기 엔도뉴클레아제를 코딩하는 핵산 서열을 제 2 곤충의 게놈 내로 통합시키는 단계는 엔도뉴클레아제를 코딩하는 유전자를 동형접합적으로 통합하는 것을 포함하고, 및
상기 제 2 곤충이 암컷인 경우, 상기 엔도뉴클레아제를 코딩하는 핵산 서열을 제 2 곤충의 게놈 내로 통합시키는 단계는 엔도뉴클레아제를 코딩하는 유전자를 동형접합적 또는 이형접합적으로 통합하거나 또는 엔도뉴클레아제 단백질을 상기 제 2 곤충에 침착시키는 것을 포함하는, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 엔도뉴클레아제를 코딩하는 핵산 서열을 제 2 곤충의 게놈 내로 통합시키는 단계는, 배아 단계에서 상기 엔도뉴클레아제를 상기 제 2 곤충 내로 통합시키는 것을 포함하는, 방법.
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 엔도뉴클레아제는, 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9 (SpCas9), 스타필로코쿠스 아우레우스 Cas9 (SaCas9), 프란시셀라 노비시다 Cas9 (FnCas9), 또는 이의 변이체를 포함하는, 방법.
- 제17항에 있어서,
상기 이의 변이체는, 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM) SpCas9 (xCas9), 하이 피델리티 SpCas9 (SpCas9-HF1), 하이 피델리티 SaCas9, 또는 하이 피델리티 FnCas9을 포함하는, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 엔도뉴클레아제는, FokI 뉴클레아제 또는 이의 변이체와 융합된 Cas9 단백질 또는 이의 변이체를 포함하는 Cas 융합 뉴클레아제를 포함하는, 방법.
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 엔도뉴클레아제는 메타노코쿠스 마리파루디스 C7(Methanococcus maripaludis C7), 코리네박터리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria), 코리네박테리움 에피시엔스 YS-314(Corynebacterium efficiens YS-314), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) (ATCC 13032), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) (ATCC 13032), 코리네박테리움 글루타미쿰 R(Corynebacterium glutamicum R), 코리네박테리움 프로펜스테디티이(Corynebacterium kroppenstedtii) (DSM 44385), 미코박테리움 아브세서스(Mycobacterium abscessus) (ATCC 19977), 노카르디아 파르시티아 IFM10152 (Nocardia farcinica IFM10152), 로도코쿠스 에리트로폴리스 PR4(Rhodococcus erythropolis PR4), 로도코쿠스 요스티이 RHA1(Rhodococcus jostii RHA1), 로도코쿠스 오파쿠스 B4(Rhodococcus opacus B4) (uid36573), 아시도테르무스 셀룰로리티쿠스11B(Acidothermus cellulolyticus 11B), 아르트로박터 클로로페노리쿠스 A6(Arthrobacter chlorophenolicus A6), 클리벨라 플라비다(Kribbella flavida) (DSM 17836, uid43465), 써모모모노스포라 쿠르바타(Thermomonospora curvata) (DSM43183), 비피도벡테리움 덴티움 Bd1(Bifidobacterium dentium Bd1), 비피도박테리움 롱검 DJO10A (Bifidobacterium longum DJO10A), 슬랙시아 헬리오트리니리듀센스(Slackia heliotrinireducens) (DSM 20476), 페르세포넬라 마리나 EX H1(Persephonella marina EX H1), 박테로이데스 플라길리스 NCTC 9434(Bacteroides fragilis NCTC 9434), 카프노사이토파가 오클라세아(Capnocytophaga ochracea) (DSM 7271), 플라보박테리움 사이크로필룸 JIP02 86 (Flavobacterium psychrophilum JIP02 86), 아케르만시아 무치니팔라(Akkermansia muciniphila) (ATCC BAA 835), 로제이플렉서스 카스텐홀지(Roseiflexus castenholzii) (DSM 13941), 로제이플렉서스 RS1(Roseiflexus RS1), 시네코시스티스 PCC6803(Synechocystis PCC6803), 엘루시미크로비움 미누툼 Pei191(Elusimicrobium minutum Pei191), 배양되지 않은 테르마이트 그룹 1 박테리아 필로타입 Rs D17(uncultured Termite group 1 bacterium phylotype Rs D17), 피브로박터 수키노제네스 S85(Fibrobacter succinogenes S85), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) (ATCC 10987), 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 람노서스 GG(Lactobacillus rhamnosus GG), 락토바실러스 살리바리우스 UCC118(Lactobacillus salivarius UCC118), 스트렙토코쿠스 아가락티애-5-A909(Streptococcus agalactiae-5-A909), 스트렙토코쿠스 아가락티애 NEM316(Streptococcus agalactiae NEM316), 스트렙토코쿠스 아가락티애 2603(Streptococcus agalactiae 2603), 스트렙토코쿠스 디스갈락티애 에퀴시밀리스 GGS 124(Streptococcus dysgalactiae equisimilis GGS 124), 스트렙토코쿠스 에쿠이 주에피데미쿠스 MGCS10565(Streptococcus equi zooepidemicus MGCS10565), 스트렙토코쿠스 갈로리티쿠스 UCN34(Streptococcus gallolyticus UCN34) (uid46061), 스트렙토코쿠스 고르도니이 찰리스 서브스트 CH1(Streptococcus gordonii Challis subst CH1), 스트렙토코쿠스 무탄스 NN2025(Streptococcus mutans NN2025) (uid46353), 스트렙토코쿠스 무탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코쿠스 피오게네스 M1 GAS (Streptococcus pyogenes M1 GAS), 스트렙토코쿠스 피오게네스 MGAS5005(Streptococcus pyogenes MGAS5005), 스트렙토코쿠스 피오게네스 MGAS2096(Streptococcus pyogenes MGAS2096), 스트렙토코쿠스 피오게네스 MGAS9429(Streptococcus pyogenes MGAS9429), 스트렙토코쿠스 피오게네스 MGAS10270(Streptococcus pyogenes MGAS10270), 스트렙토코쿠스 피오게네스 MGAS6180(Streptococcus pyogenes MGAS6180), 스트렙토코쿠스 피오게네스 MGAS315(Streptococcus pyogenes MGAS315), 스트렙토코쿠스 피오게네스 SSI-1(Streptococcus pyogenes SSI-1), 스트렙토코쿠스 피오게네스 MGAS10750(Streptococcus pyogenes MGAS10750), 스트렙토코쿠스 피오게네스 NZ131(Streptococcus pyogenes NZ131), 스트렙토코쿠스 써모필레스 CNRZ1066 (Streptococcus thermophiles CNRZ1066), 스트렙토코쿠스 써모필레스 LMD-9(Streptococcus thermophiles LMD-9), 스트렙토코쿠스 써모필레스 LMG 18311(Streptococcus thermophiles LMG 18311), 클로스트리디움 보툴리눔 A3 로치 마레(Clostridium botulinum A3 Loch Maree), 클로스트리디움 보툴리눔 B 에클룬드 17B (Clostridium botulinum B Eklund 17B), 클로스트리디움 보툴리눔 Ba4 657(Clostridium botulinum Ba4 657), 클로스트리디움 보툴리눔 F 랑겔란드(Clostridium botulinum F Langeland), 클로스트리디움 셀룰로리티쿰 H10(Clostridium cellulolyticum H10), 피네골디아 마그나(Finegoldia magna) (ATCC 29328), 유박테리움 렉테일(Eubacterium rectale) (ATCC 33656), 마이코플라스마 갈리셉티쿰(Mycoplasma gallisepticum), 마이코플라스마 모빌레 163K(Mycoplasma mobile 163K), 마이코플라스마 페네트란스(Mycoplasma penetrans), 마이코플라스마 시노비애 53(Mycoplasma synoviae 53), 스트렙토바실러스 모닐리포르미스(Streptobacillus moniliformis) (DSM 12112), 브라디라이조비움 BTAi1(Bradyrhizobium BTAi1), 니트로박터 함브루겐시스 X14 (Nitrobacter hamburgensis X14), 로도슈도모나스 팔루스트리스 BisB18 (Rhodopseudomonas palustris BisB18), 로도슈도모나스 팔루스트리스 BisB5(Rhodopseudomonas palustris BisB5), 파르비바쿠룸 바라멘티보란스 DS-1(Parvibaculum lavamentivorans DS-1), 디노로세오박터 시배. DFL 12 (Dinoroseobacter shibae. DFL 12), 글루코나세토박터 디아조트로피쿠스 Pal 5 FAPERJ(Gluconacetobacter diazotrophicus Pal 5 FAPERJ), 글루코나세토박터 디아조트로피쿠스 Pal 5 JGI(Gluconacetobacter diazotrophicus Pal 5 JGI), 아조스피릴룸 B510(Azospirillum B510) (uid46085), 로도스피릴룸 루브룸(Rhodospirillum rubrum) (ATCC 11170), 디아포로박터 TPSY(Diaphorobacter TPSY) (uid29975), 베르미네프로박터 에이세니애 EF01-2 (Verminephrobacter eiseniae EF01-2), 나이세리아 메닌기티데스 053442 (Neisseria meningitides 053442), 나이세리아 메닌기티데스 알파14(Neisseria meningitides alpha14), 나이세리아 메닌기티데스 Z2491(Neisseria meningitides Z2491), 디설포비브리오 살렉시겐스 DSM 2638(Desulfovibrio salexigens DSM 2638), 캄필로박터 제주니 도일레이 269 97(Campylobacter jejuni doylei 269 97), 캄필로박터 제주니 81116(Campylobacter jejuni 81116), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 캄필로박터 라리 RM2100(Campylobacter lari RM2100), 헬리코박터 헤파티쿠스(Helicobacter hepaticus), 울리넬라 숙시노게네스(Wolinella succinogenes), 톨루모나스 아우엔시스 DSM 9187(Tolumonas auensis DSM 9187), 슈도알터로모나스 아틀란티카 T6c (Pseudoalteromonas atlantica T6c), 셰와넬라 페알리아나(Shewanella pealeana) (ATCC 700345), 레지오넬라 슈도모필라 파리스(Legionella pneumophila Paris), 악티노바실러스 숙시노게네스 130Z(Actinobacillus succinogenes 130Z), 파스뇌렐라 물토시다(Pasteurella multocida), 프란시셀라 툴라렌시스 노비시다 U112(Francisella tularensis novicida U112), 프란시셀라 툴라렌시스 홀라르크티카(Francisella tularensis holarctica), 프란시셀라 툴라렌시스 FSC 198(Francisella tularensis FSC 198), 프란시셀라 툴라렌시스 툴라렌시스(Francisella tularensis tularensis), 프란시셀라 툴라렌시스 WY96-3418(Francisella tularensis WY96-3418), 또는 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola) (ATCC 35405) 로부터 유래된 Cas9 단백질 또는 그 변이체인, 방법.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 곤충은 메드 플라이(Medfly (세라티티스 카피타타; Ceratitis capitata)), 멕스플라이(Mexfly (아나스트레파 루덴스; Anastrepha ludens)), 오리엔탈 프룻 플라이(Oriental fruit fly (박트로테라 돌사리스; Bactrocera dorsalis)), 올리브 프룻 플라이(Olive fruit fly (박트로세라 오레아에; Bactrocera oleae)), 멜론 플라이(Melon fly (박트로세라 쿠쿠르비타에; Bactrocera cucurbitae)), 나탈 프룻 플라이(Natal fruit fly (세라티티스 로사; Ceratitis rosa)), 체리 프룻 플라이(Cherry fruit fly (라골레티스 세라시; Rhagoletis cerasi)), 퀸스란드 프룻 플라이(Queensland fruit fly (박트로세라 티로니; Bactrocera tyroni)), 피치 프룻 플라이(Peach fruit fly (박트로세라 조나타; Bactrocera zonata)), 카리비안 프룻 플라이(Caribbean fruit fly (아나스트레파 서스펜사; Anastrepha suspensa)), 오리엔탈 프룻 플라이(Oriental Fruit Fly (막트로세라 도르사리스; Bactrocera dorsalis)), 웨스트 인디안 프룻 플라이(West Indian fruit fly (아나스트레파 오플리쿠아; Anastrepha obliqua)), 더 뉴 월드 스크루웜(the New World screwworm (코크리오키아 호미니보락스; Cochliomyia hominivorax)), 더 올드 월드 스크루웜(the Old World screwworm (크리솜야 베지아나; Chrysomya bezziana)), 오스트랄리안 쉽 블로우플라이/그린바틀 플라이(Australian sheep blowfly/greenbottle fly (루시리아 쿠프리나; Lucilia cuprina)), 스팟티드 윙 드로소필라(Spotted wing drosophila (드로소필라 스즈키이; drosophila suzukii))로부터 선택된 테프리티드 프룻 플라이(tephritid fruit fly), 스팟티드 랜턴플라이(Spotted Lanternfly (리코르마 델리코투라; Lycorma delicatula)), 화이트플라이(Whitefly (베미시아 타바치; bemisia tabaci)), 하우스 플라이(House Fly (무스카 도메스티카; Musca Domestica)), 그린 바틀 플라이(Green Bottle Fly (루실리아 쿠프리나; Lucilia cuprina)), 오에스트리다에 스피시스 및 덜마토미아 호미니스(Oestridae spp. and Dermatobia hominis), 홀스 플라이(Horse Fly (타바누스 술시프론스; Tabanus sulcifrons)), 혼 플라이(Horn Fly (하에마토비아 이리탄스; Haematobia irritans))로부터 선택된 봇플라이, 코칠리오미아 마첼라리아(Cochliomyia macellaria (씨. 마첼라리아; C. macellaria)), 씨. 호미니보락스(C. hominivorax), 씨. 아르리치(C. aldrichi), 또는 씨. 미니마(C. minima), 체체 플라이(Tsetse Fly (글로시나 스피시스; Glossina spp.))로부터 선택된 스크루웜 플라이, 하이포덜마 보비스(Hypoderma bovis) 또는 하이포덜마 리니아툼(Hypoderma lineatum), 및 스팟티드 랜턴 플라이(Spotted lanternfly (리코르마 데리카투라; Lycorma delicatula))로부터 선택된 와블 플라이로 이루어지는 군에서 선택되는, 방법.
- 제1항 내지 제5항, 제7항 내지 제12항, 제14항 내지 제15항, 제17항 내지 제19항, 제21항, 및 제25항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 최대 100 % 수컷 곤충 난을 포함하는 곤충 난의 자손.
- 제2항 내지 제5항, 제7항 내지 제12항, 제14항 내지 제15항, 제17항 내지 제19항, 제21항, 및 제25항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 최대 100% 불임 수컷 곤충 난을 포함하는 곤충 난의 자손.
- 제2항 내지 제5항, 제7항 내지 제12항, 제14항 내지 제15항, 제17항 내지 제19항, 제21항, 및 제25항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 유전적으로 변형된 불임 수컷 곤충에서,
상기 유전적으로 변형된 불임 수컷 곤충은 야생형 암컷 곤충과 교미함으로써 부화되지 않은 난의 비율을 증가시킬 수 있는, 유전적으로 변형된 불임 수컷 곤충.
- 제28항의 유전적으로 변형된 불임 수컷 곤충에서,
상기 유전적으로 변형된 불임 수컷 곤충은 상응하는 야생형 수컷 곤충과 같거나 더 긴 수명을 가지는, 유전적으로 변형된 불임 수컷 곤충.
- 유전적으로 변형된 불임 수컷을 야생형 곤충 개체군으로 도입하는 것을 포함하는 야생형 곤충 개체군을 감소시키는 방법에서, 상기 유전적으로 변형된 불임 수컷은 제2항 내지 제5항, 제7항 내지 제12항, 제14항 내지 제15항, 제17항 내지 제19항, 제21항, 및 제25항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된, 야생형 곤충 개체군을 감소시키는 방법.
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