KR102365188B1 - 전자빔 조사를 이용한 호박꽃과실파리 불임 수컷의 제조방법 및 이를 이용한 호박꽃과실파리의 방제방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 호박꽃과실파리 번데기에 150Gy 이상 250Gy 미만 선량의 전자빔을 조사하여 호박꽃과실파리 불임 수컷을 제조하는 방법 및 제조된 불임 수컷을 정상 수컷과 9:1의 비율로 방사하여 호박꽃과실파리를 방제하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 방사선 대신 전자빔을 사용하고 적합한 전자빔 조사량을 확인하여 국내 자생하는 호박꽃과실파리의 불임 수컷을 제조하며, 제조된 호박꽃과실파리 불임 수컷을 정상 수컷과 9:1의 비율로 방사하여 불임충방사기술(SIT)로 호박꽃과실파리를 유효하게 방제할 수 있다.

Description

전자빔 조사를 이용한 호박꽃과실파리 불임 수컷의 제조방법 및 이를 이용한 호박꽃과실파리의 방제방법 {Producing method of sterile males of striped fruit flies, Zeugodacus scutellata, using electron beam irradiation and control method using them}

본 발명은 전자빔을 조사하여 호박꽃과실파리 불임 수컷을 제조하는 방법과 제조된 호박꽃과실파리 불임 수컷을 이용한 불임충방사기술로 호박꽃과실파리를 방제하는 방법에 관한 것이다.

기후변화와 국제 무역량 증가로 인하여 국내에 없었던 새로운 해충이 출현하고 있다(Lyu and Lee, 2017). 동남아시아를 중심으로 널리 분포하고 있는 과실파리는 이러한 환경 변화에 따라 국내로 침입하여 들어올 가능성이 매우 높으며(Kim and Kim, 2016), 우리나라 검역본부에서 지정한 60종의 금지해충들 중 41종을 이들 과실파리류가 차지하고 있다(Kim et al., 2017a).

농작물에 큰 피해를 줄 것으로 여겨지는 과실파리는 주로 약 4,400종 이상을 포함하고 있는 대형 분류군인 과실파리과(Tephritidae)에 속한 파리류이다(White and Elson-Harris, 1992; Norrbom et al.. 1999). 국내에 자생하고 있는 과실파리류는 90종으로, Dacinae 아과에 4종, Phytalmiinae 아과에 4종, Tephritinae 아과에 39종, Trypetinae 아과에 43종이 속한 것으로 분류되고 있다(Han and Kwon. 2010; Han et al., 2014). 이 가운데 농작물에 경제적 피해를 주고 있는 과실파리는 Dacinae 아과에 속한 호박꽃과실파리(Zeugodacus scutellata)와 호박과실파리(Z. depressa)의 두 종이다.

호박꽃과실파리는 제주지역을 중심으로 노랑하늘타리(Trichosanthes kirilowii var. japonica Kitam)에서 자생하지만, 전국적으로는 호박에 피해를 주고 있다(Kim et al., 2017b). 호박의 열매보다는 꽃을 가해하지만 암꽃 피해(30.7%) 보다는 수꽃 피해(53.8%)가 더 큰 것으로 보고되어 있다(Kim et al., 2010). 호박꽃과실파리 성충은 월동세대를 포함하여 연 4회 이상 발생하는 것으로 추정되고 있다(Al Baki et al., 2017; Kim et al., 2019). 호박꽃과실파리는 화분매개충으로 식물체 유래의 시노몬(synomone)인 라즈베리케톤 (4-(4-하이드록시페닐)-2-부타논)[raspberry ketone (4-(4-Hydroxyphenyl)-2-butanon)]에 유인되는 특성을 이용하여 보다 안정된 화합물인 큐루어[Cuelure, CL: 4-(4-Acetoxyphenyl)-2-butanon)]를 야외 모니터링에 이용하고 있다(Kim et al., 2012, 2017b).

호박꽃과실파리 유충은 호박꽃 내부에 서식하기 때문에 살포용 약제에 노출되지 않아 방제에 어려움을 주고 있으므로, 야외 노출된 발육시기인 성충을 방제대상으로 하고 있다(Kim et al., 2017b). 예를 들어, 수컷 과실파리류가 보이는 교미 전 무리행동(lekking)과 화합물섭취(pharmacophagy) 습성(Hee and Tan, 2004)을 이용하여 큐루어에 살충제를 혼합한 수컷박멸기술(male annihilation technique: MAT)이 호박꽃과실파리 방제에 적용되었다(Kim et al., 2017b). 또한 많은 과실파리 암컷의 경우는 알을 만들기 위해서 먹이를 통해 영영원의 공급을 받아야 하는 영양의존형(anautogenic) 생식을 보이는 데(Drew and Yuval, 2000), 이를 이용하여 단백질성 유인물질에 살충제를 혼합한 암컷박멸기술(female annihilation technique: FAT)에 테르피닐 아세테이트(terpinyl acetate)를 첨가하는 방법이 개발되었다(Kim and Kwon, 2018).

국내로 침입하는 외래 해충에 대해서 조기 모니터링하여 박멸하는 프로그램은 국내 농산물 보호라는 검역의 기본적 방향이다.

국내로 검역 대상 과실파리가 침입할 경우 수컷 및 암컷박멸기술을 이용하여 방제기술을 적용하지만, 궁극적으로 박멸효과를 얻기 위해서는 불임충방사를 통한 유전방제기술을 적용할 수 있다(Kim et al., 2018a). 불임충방사기술(sterile insect release technique: SIT)은 방사선 조사에 의해 수컷을 불임화시키고 이를 야외에 방사시켜 야생 암컷과 교미하게 하여 무정난을 형성하게 하는 방제 전략에 기초하고 있다(Knipling, 1955).

호박꽃과실파리를 포함한 Dacus 아과에 속한 여러 과실파리 종들은 나리과 꽃에서 분비되는 이차대사산물에 유인되어 성적과시(lekking)라는 특이적 집단 교미행동을 보이기 때문에 방사된 불임충과 야외충이 충분한 혼합될 가능성을 기대할 수 있어 SIT 기술이 이들 과실파리류 방제에 매우 효과적일 것으로 예견되었다(Benelli et al., 2014, 2015).

SIT 방제기술은 다양한 지역에서 과실파리 방제에 적용되고 있다. 실제로 미국 하와이와 호주의 과학자들은 북부 마리아나 군도의 Rota 섬에 서식하는 오이과실파리(Zeugodacus cucurbitae) (Steiner et al., 1965), 호주의 퀸즐랜드과실파리(B. tryoni) (Andreawartha et al., 1967), 마이크로네시아의 오리엔탈과실파리(Steiner et al., 1970), 하와이의 지중해과실파리(Ceratitis capitata) (Harris et al., 1986)를 완전박멸하기 위해 SIT 기술을 적용하였다. 일본에서도 침입한 오이과실파리를 박멸하는 데 SIT를 이용하였다고 보고하였다(Koyama, 1996). 태국의 경우 오리엔탈과실파리를 대상으로 SIT가 지속적으로 적용되어 전체 집단의 크기를 낮추는 데 지대한 효과를 주었다(Aketarawong et al., 2011).

오리엔탈과실파리(Bactrocera dorsalis)의 경우 불임 수컷을 제조하는 데 방사선을 이용하였는데 우화하기 2일 전에 저산소 조건에서 번데기를 방치하고 100Gray(Gy)의 선량으로 방사선을 조사하였다(Shelly et al., 2010). 이렇게 얻어진 불임충은 공중에서 또는 지상에서 오리엔탈과실파리가 발생한 지역에 방사된다. 예를 들어, 미국 하와이에서 실시된 SIT의 경우는 약 8 개월간(2005년 2월 2일~9월 29일) 매주 99,600~595,800마리의 오리엔탈과실파리 불임충이 방사되어 총 11,556,000마리가 투입되었다(Vargas et al., 2010). 그러나 불임충을 제조하는 데 방사선을 이용하는 경우 방사선 방출물질로 인한 유해성이 문제가 되고 있으며, 이를 해결하기 위해 X 선과 같은 비교적 안전한 불임충 유도 기술이 개발되었다(Mastrangelo et al., 2010).

또한 SIT 기술은 대량사육과 이어진 방사선 조사를 통한 수컷 성충의 교미능력 저하 및 수명 단축이라는 단점이 있다(Barry et al., 2003). 이러한 유전방제 기술의 단점을 보완하기 위해 또 다른 개념으로 제2차 성징을 나타내는 성결정 시기에 암수에 특징적 전사후과정이 일어나는 트랜스포머(transformer) 유전자에 대한 조작 기술이 우성치사유전자를 지닌 곤충방사(release of insects carrying a dominant lethal: RIDL)의 하나의 전략으로 제기되었다(Alphey, 2002; Fu et al., 2007). 지중해과실파리에 대해서 적용된 암컷치사 RIDL은 간이 모형실험에 성공적 박멸효과를 줄 수 있다고 이를 입증하였다(Leftwich et al., 2014). 그러나 이 기술은 piggyBac이라는 트랜스포존(transposon)에 의존하여 제작된 형질전환 곤충을 방사한다는 점에서 생태계 유전자 교란이라는 여러 우려를 나타내기에 실제로 야외에 이러한 곤충을 방사하기는 어려울 것으로 예상된다.

대한민국 특허등록 제10-1976280호

Aketarawong, N., Chinvinijkul, S., Orankanok, W., Guglielmino, C.R., Franz, G., Malacrida, A.R., Thanaphum, S., 2011. The utility of microsatellite DNA markers for the evaluation of area-wide integrated pest management using SIT for the fruit fly, Bactrocera dorsalis (Hendel), control programs in Thailand. Genetica 139, 129-140. Al Baki, Kim, H., Keum, E., Song, Y., Kim. Y., Kwon, K., Park, Y., 2017. Age grading and gene flow of overwintered Bactrocera scutellata populations. J. Asia Pac. Entomol. 20, 1402-1409. Alphey, L., 2002. Re-engineering the sterile insect technique. Insect Biochem. Mol. Biochem. 32, 1243-1247. Andreawartha, H.G., Monro, J., Richardson, N.L., 1967. The use of sterile males to control populations of Queensland fruit fly, Dacus tryoni (Frogg.) (Diptera: Tephritidae). II. Filed experiments in New South Wales. Aust. J. Zool. 15, 461-473. Barry, J.D., McInnis, D.O., Gates, D., Morse, J.G., 2003. 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본 발명은 호박꽃과실파리에 대해 불임충방사기술(SIT)을 적용하기 위하여 국내 자생하는 호박꽃과실파리의 생식발달과정을 분석하여 난모세포 및 정자의 발달을 성충 발육시기별로 분석하고, 전자빔의 조사량을 확인하여 유효한 불임 수컷을 제조하며, 제조된 불임 수컷을 방사하여 호박꽃과실파리를 방제하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명에서는 호박꽃과실파리 번데기에 150Gy 이상 250Gy 미만 선량의 전자빔을 조사하여 호박꽃과실파리 불임 수컷을 제조하는 방법을 제공한다. 보다 바람직하게는 상기 호박꽃과실파리 번데기에 200Gy 선량의 전자빔을 조사할 수 있다. 또한, 상기 호박꽃과실파리 번데기는 용화된 지 3~5일 경과된 번데기인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에서는 호박꽃과실파리 번데기에 150Gy 이상 250Gy 미만 선량의 전자빔을 조사하여 호박꽃과실파리 불임 수컷을 제조하는 단계; 및 상기 불임 수컷을 방사하는 단계를 포함하는 호박꽃과실파리의 방제방법을 제공한다. 보다 바람직하게는 상기 호박꽃과실파리 번데기에 200Gy 선량의 전자빔을 조사할 수 있다. 상기 호박꽃과실파리 번데기는 용화된 지 3~5일 경과된 번데기인 것이 바람직하다. 또한, 상기 불임 수컷은 방사 후 2개월 내 재방사하는 것이 바람직하다.

본 발명은 종래 불임충방사기술에 사용되던 위험성이 높은 방사선 대신 비교적 안전한 전자빔을 사용하고 적절한 조사량으로 조사함으로써 호박꽃과실파리의 불임 수컷을 제조할 수 있다.

본 발명에 따라 제조된 호박꽃과실파리의 불임 수컷은 3개월 정도는 무처리한 대조구와 큰 차이 없이 성충의 수명을 유지할 수 있으며, 교미율과 산란율은 크게 떨어지지 않으면서 산란된 알이 거의 부화되지 않으므로 높은 방제효과를 나타낼 수 있다.

본 발명에서는 제조된 호박꽃과실파리 불임 수컷을 정상 수컷과 9:1의 비율로 방사함으로써 호박꽃과실파리를 유효하게 방제할 수 있다.

본 발명은 향후 국내로 침입할 검역 대상 과실파리에 대해서도 적용할 수 있다.

도 1은 호박꽃과실파리의 난소 및 정소 발육상태를 현미경으로 관찰한 결과이다. 사진에서 스케일 바(scale bar)는 10㎛를 나타낸다.
도 2는 호박꽃과실파리 성충으로 우화 후 일정 기간별(0일, 5일, 10일, 15일, 20일, 25일 및 30일, 'DAE')로 난소와 정소의 발달과정을 관찰한 결과를 나타낸 것이다. 사진에서 스케일 바는 10㎛를 나타낸다.
도 3은 호박꽃과실파리 성충 발달에 전자빔 조사가 미치는 효과를 확인한 결과이다. 표준편차 막대 위의 다른 문자들은 Type I error = 0.05 (LSD test)에서 평균들 사이에 유의차가 있음을 나타낸다.
도 4는 호박꽃과실파리 번데기에 전자빔을 조사하였을 때 전자빔의 세기가 발육된 호박꽃과실파리 성충의 수명에 미치는 효과를 확인한 결과이다.
도 5는 조사된 전자빔의 세기에 따라 호박꽃과실파리 수컷과 무처리 암컷이 교미하는 비율을 비교한 결과를 나타낸 것이다. 별표는 Type I error = 0.05 (LSD test)에서 비교하는 평균들 사이에 유의차가 있음을 나타낸다. 'NS'는 유의차가 없음을 나타낸다.
도 6은 전자빔의 조사가 호박꽃과실파리 성충의 산란력에 미치는 효과를 확인한 결과이다. 'NS'는 Type I error = 0.05 (LSD test)에서 비교하는 평균들 사이에 유의차가 없음을 나타낸다.
도 7은 전자빔 조사가 호박꽃과실파리 다음 세대의 알 부화율에 미치는 효과를 확인한 결과이다. 'NS'는 Type I error = 0.05 (LSD test)에서 비교하는 평균들 사이에 유의차가 없음을 나타낸다.
도 8은 전자빔 조사한 호박꽃과실파리 성충을 방사한 후 사망율을 확인한 결과이다.
도 9는 전자빔 조사한 호박꽃과실파리 성충을 방사한 후 산란수와 부화율을 조사한 결과이다.

이하 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

불임충방사기술(SIT) 개발에 앞서 호박꽃과실파리의 체내 생식 생리과정을 분석하였다.

도 1에서와 같이, 암컷의 경우 1쌍의 난소는 약 50 개의 난소소관을 가지고 있고, 각 난소소관은 말단에 생식세포 줄기세포들이 관찰되었으며, 이로부터 난포가 연속적으로 성장되어지는 모습을 띠었다. 각 난포는 이를 둘러싸는 난포세포와 내부의 영양세포 및 난모세포로 분화되어 있다. 즉, 호박꽃과실파리는 전형적인 다영양실형(polytrophic) 난소소관을 지니고 있다. 난모세포의 분화는 줄기세포로 분화되는 난황형성전단계(previtellogenesis), 이후 난모세포가 비대해지는 난황형성과정(vitellogenesis) 및 난모세포를 둘러싸는 난각을 형성하는 난각형성과정(choriogenesis)이 모두 암컷 성충의 나이가 진행됨에 따라 관찰되었다. 우화 이후 약 20일이 경과되면 난각을 지닌 난모세포가 형성되어 기본적으로 산란의 준비가 된다고 볼 수 있다. 즉, 환경 온도에 따라 다르겠지만 25℃ 조건에서 호박꽃과실파리는 산란전 기간이 약 20일로 추정된다.

호박꽃과실파리의 1쌍의 정소는 공통수정관(vas deferens)을 이어 사정관으로 이어지는 구조를 지녔다. 이러한 모습은 우화 직후의 수컷에서도 관찰되었다. 또한 이 시기에 측수정관(vas efferens)에 해당되는 부위를 절단하여 내부물질을 모아보면 성숙된 정자 모습을 관찰할 수 있었다. Guill

n et al. (2016)은 지중해과실파리를 대상으로 생식력이 있는 수컷의 형태적 기준을 완전히 발달된 정소의 모습 그리고 정자분화과정(spermatogenesis)의 가동으로 제시하였다. 이러한 기준에서 보면 생리적으로 호박꽃과실파리 수컷은 우화 직후에 교미할 준비되어 있을 것으로 추정된다.

호박꽃과실파리 번데기에 전자빔을 조사하여 호박꽃과실파리 불임 수컷을 제조한다.

호박꽃과실파리 번데기는 용화된지 3~5일 경과된 번데기를 사용하는 것이 바람직하다. 전자빔이 조사된 호박꽃과실파리는 우화하여 호박꽃과실파리 불임 수컷이 된다.

호박꽃과실파리의 불임 수컷을 제조하기 위해서 전자빔을 사용한다. 5~10 MeV의 에너지를 갖는 전자빔은 세포의 DNA 이중 나선구조를 절단하는 작용과 수분 등을 전리시켜 라디칼을 형성하는 간접적인 작용 등에 의해 균을 사멸시키는 작용이 있다(Kwon et al., 2014). 전자빔은 200Gy의 선량으로 조사하는 것이 바람직하다.

다양한 선량으로 전자빔을 조사한 결과 250Gy 보다 높은 선량에서는 용발육에 심각한 피해를 주어 우화율이 낮아졌다. 250Gy 이하의 선량에서는 선량 증가에 따라 무처리 암컷과의 교미율 및 성충수명이 감소하였으며 250Gy에 이르면 매우 낮은 교미율과 짧은 수명을 보였다. 200Gy의 선량으로 전자빔을 조사한 경우, 비록 교미율은 낮아지지만 우화 후 일정기간 동안 교미하는 암컷의 산란수에 영향을 주지 않은 것으로 미루어 정상적 교미가 이루어진 것으로 판단되며, 전자빔 조사된 호박꽃과실파리 성충이 3개월 정도는 무처리한 대조구와 차이없이 성충의 수명을 유지한다. 또한 200Gy 선량의 전자빔을 처리한 수컷과 교미한 정상 암컷에서 산란된 알은 전혀 부화되지 않았다.

방사능 조사에 따른 수명 및 교미행동의 변화가 수명과 교미 행동에 관련된 분자 구조의 변화를 일으켰다는 연구가 방사선 처리된 오리엔탈과실파리(Bactrocera orientalis)에서 단백질체학 분석을 통해 나타났는데, 이는 처리된 수컷의 경우 35 개의 단백질의 발현이 교란되었고 이들은 주로 에너지 대사 및 페로몬 감지관련 단백질인 것으로 판명되었다(Chang et al., 2015).

이러한 결과를 토대로, 본 발명에서는 호박꽃과실파리 번데기에 150Gy 이상 250Gy 미만 선량의 전자빔을 조사하여 호박꽃과실파리 불임 수컷을 제조한다. 보다 바람직하게는 상기 호박꽃과실파리 번데기에 200Gy 선량의 전자빔을 조사할 수 있다. 상기 호박꽃과실파리 번데기는 용화된 지 3~5일 경과된 번데기인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에서는 150Gy 이상 250Gy 미만 선량의 전자빔을 처리한 호박꽃과실파리 불임 수컷을 방사함으로써 호박꽃과실파리를 효과적으로 방제할 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 호박꽃과실파리 번데기에 200Gy 선량의 전자빔을 조사할 수 있다. 상기 호박꽃과실파리 번데기는 용화된 지 3~5일 경과된 번데기인 것이 바람직하다.

본 발명의 호박꽃과실파리 불임 수컷을 방사할 때 정상 수컷과 9:1의 비율로 방사하는 것이 바람직하다. 호박꽃과실파리 불임 수컷은 짧은 수명으로 인해 2개월 정도 방제효과를 가지는 것으로 확인되므로, 불임충 방사 후 2개월 이내에 재방사를 하는 것이 바람직하다.

이하 실험예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로서 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

[실험예]

공시충 사육

제주 지역에서 자생하고 있는 노랑하늘타리 꽃에서 호박꽃과실파리 유충을 채집하였다. 수거된 유충은 호박꽃을 먹이로 실내 조건(온도 24~27℃, 광주기 16:8 (L:D), 상대습도 60~80%)에서 증식되었다. 노숙 유충 시기에 먹이 주변에 상토를 투입하여 용화를 유도하였으며, 우화된 성충에는 인공사료(이스트추출물: 전지분유: 설탕: 물 = 2: 2: 4: 1, g/g)와 물을 공급하였다.

통계분석

우화율에 대한 생물검정 결과는 백분율 자료로서 아르신(arsine) 변환 후 SAS PROC GLM (SAS Institute, 1989)을 이용하여 ANOVA 분석 및 처리 평균간 비교를 실시하였다. 반면에 교미율 및 부화율과 같은 빈도자료는 PROC FREQ를 이용하여 빈도분석의 독립성 검정을 실시하였다.

<실험예 1>

호박꽃과실파리 성충의 생식기관 관찰

호박꽃과실파리 성충의 난모세포 및 정자 구조를 다음과 같이 형광현미경으로 관찰하였다.

형광물질을 이용한 세포 구조 관찰을 위해, FITC-태그된 팔로이딘[fluorescein isothiocyanate (FITC)-tagged phalloidin](Sigma-Aldrich Korea; 서울, 한국)과 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)(Thermo Fisher Scientific; Rockford, IL, USA)를 사용하였다.

성충의 난소 또는 정소 발육을 분석하기 위하여, 미교미 암수를 상기 사육 조건에서 우화 이후 발육시기별(0~30일)로 임의로 선택하였다.

해부현미경(Stemi SV11, Zeiss, Germany)에서 100mM 인산완충용액(phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4)을 이용하여 호박꽃과실파리 암컷과 수컷으로부터 난소와 정소를 각각 적출하였다.

형광분석을 위하여, 적출한 난소와 정소의 조직을 각각 3.7% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)에서 60분 동안 실온 및 암 조건에서 고정하였다. 고정된 조직을 PBS로 3회 세척한 후 PBS에서 0.2%의 농도로 용해된 Triton X-100을 이용하여 실온에서 20분 동안 반응시켰다. 반응 후 다시 PBS로 3회 세척한 후 5% 탈지유(skim milk)(MB cell, Seoul, Korea)로 실온에서 60분 동안 반응시켰다. 반응 후 다시 PBS로 세척한 후 FITC-태그된 팔로이딘으로 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후 다시 PBS로 3회 세척한 후 DAPI (1mg/㎖)로 실온에서 2분 동안 핵과 세포질을 각각 DAPI(파란색)와 팔로이딘(phalloidin)(초록색)으로 염색하였다. 염색 후 다시 PBS로 3회 세척한 후 염색된 세포를 형광현미경(DM2500, Leica, Wetzlar, Germany)을 이용하여 200배의 배율에서 관찰하였다.

현미경으로 관찰한 호박꽃과실파리의 난소 및 정소 발육상태를 도 1에 나타내었다. 도 1에서 형광을 나타내는 파란색은 핵을 DAPI로 염색한 것이고 초록색은 F-액틴(F-actin)을 FITC로 염색한 것이다.

암컷의 생식계를 관찰한 결과를 도 1의 (A)에 나타내었다. 전체적인 암컷 내부기관은 난소(ovary, 'OV'), 옆산란관(lateral oviduct, 'LO'), 총 수란관(common oviduct, 'CO') 및 산란관(ovipositor, 'OVP')을 포함한다.

각 난소는 약 50개의 난소소관(ovariole)으로 이루어져 있고, 각 난소소관의 말단부위에는 배아줄기세포(germline stem cell)가 존재하며, 이를 기반으로 난포(follicle)가 분화되었다. 난소소관의 말단부위는 DAPI로 염색되어 난포 발달을 보여준다. 초기 난포는 난포세포(follicular epithelium)로 둘러싸이고 포낭아세포(cystoblast, 포낭배질)에서 포낭세포(cystocyte, 포세포)로 분열된 모습을 지니고 있다. 난소발육이 진행함에 따라 포낭아세포는 난모세포(oocyte, 'OC')와 영양세포(nurse cell, 'NC')로 분화하게 된다. 이후 다자란 난모세포는 난각(chorion)에 둘러싸이게 된다. FITC 염색부위는 영양세포('NC'), 난모세포('OC') 및 융모막화 난모세포(chorionated oocyte, 'CH')를 나타낸다.

수컷의 생식계를 관찰한 결과를 도 1의 (B)에 나타내었다. 전체적인 수컷 내부 기관은 정소(testis, 'TE'), 수정관(vas deferens, 'VD'), 부속샘(accessory gland, 'AG') 및 사정관(ejaculatory duct, 'ED')을 포함한다.

정소는 1쌍으로 존재하고 각각의 긴 공통수정관(vas deferens)이 사정관(ejaculatory duct)에서 모이게 된다. 이때 부속샘(accessory gland)이 다시 사정관에 연결된다. 정소의 기부에 존재하는 측수정관(vas efferens) 부위를 통해 발육된 정소를 형광현미경으로 관찰하였다. 각 정자는 머리와 긴 꼬리를 가지고 있으며, 머리 부위에는 DNA가 존재하는 핵 부위와 말단 부위에 첨체(acrosome)가 관찰되었다.

성충으로 우화 후 일정 기간별(0일, 5일, 10일, 15일, 20일, 25일 및 30일, 'DAE')로 난소와 정소의 발달과정을 관찰하여 도 2에 나타내었다. 전체 발달은 50배의 배율에서 관찰하였다. F-액틴을 염색한 FITC는 200배의 배율에서 형광현미경으로 관찰하였다.

우화직후의 난소는 아직 난소소관이 분화되지 않은 형태로 다수의 기관지가 각 난소 부위에 모여있는 형태로 존재하였다. 우화 후 10일이 지나면 난소의 비대 성장이 관찰되었으며 15일이 경과하면 난소소관의 발달을 관찰할 수 있었다. 우화 후 20일이 경과하면 다수의 난모세포가 난황형성과정을 진행하고 있지만 일부 난모세포는 난각을 지닌 알의 모습을 형성하기 시작하였다. 우화 후 25일 이후에는 대부분의 난소소관은 완전히 발달된 알 구조를 지니고 있어 언제든 산란이 가능한 모습을 보였고, 난모세포의 구조는 영양세포('NC'), 난모세포('OC') 및 포린피막(follicular epithelium, 'FE')을 나타내었다.

정소는 우화 직후부터 완전한 정소 구조를 지녔으며 내부에도 다수의 DNA 염색 구조물을 지니는 것이 관찰되었다. 이러한 모습은 우화 후 30일까지 유사한 구조를 나타내었다.

<실험예 2>

전자빔 조사충의 우화율 분석

호박꽃과실파리의 불임 수컷을 형성하기 위해 호박꽃과실파리의 번데기에 다양한 세기의 전자빔을 조사한 후 성충의 우화를 관찰하여 전자빔이 호박꽃과실파리에 번데기 발육에 미치는 영향을 다음과 같이 분석하였다.

실내 조건(25℃)에서 용화된 지 3~5일 경과된 호박꽃과실파리의 번데기에 다양한 세기의 전자빔(0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 및 1,000Gy)을 조사하고 상기 실내 조건에서 발육시켰다.

전자빔 조사는 (주)서울방사선 회사(충북 음성 소재)의 전자빔 기기(MB10-8/635, Mevex, Stittsville, Ontario, Canada)를 이용하였다. 각 전자빔 처리에는 10마리의 번데기를 사용하였으며, 처리는 3회 반복하였다. 전자빔처리한 후 매일 우화수를 계수하여 처리 후 15일간 우화된 총 마리수를 비교하여 분석하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3의 결과에서와 같이, 조사한 전자빔 세기가 250Gy 이상일 때 전자빔의 세기가 증가하면 우화율이 현저히 낮아졌다(F = 28.29; df = 8, 31; P < 0.0001). 특히 전자빔 세기 400Gy 이상에서는 번데기 발육에 심각한 영향을 주어 성충으로 우화를 억제하였다. 다만, 전자빔의 세기가 250Gy 이하일 때는 성충으로 발육하는 데 무처리와 차이가 없는 것으로 나타났다. 반수치사 전자빔 세기는 약 503Gy로 추정된다.

<실험예 3>

전자빔 조사충의 성충 수명 조사

번데기에 전자빔을 조사하였을 때 전자빔의 세기가 발육된 성충의 수명에 미치는 효과를 다음과 같이 조사하였다.

용화된 지 3~5일 경과된 호박꽃과실파리의 번데기에 다양한 세기의 전자빔(0, 200, 400 및 600Gy)을 조사한 후 얻어진 수컷을 용기(지름 11.5㎝ × 높이 8㎝)에 각각 넣고 성충 먹이와 물을 3~4일 마다 교체하며 공급하였다. 실험에 0Gy를 조사한 수컷은 21마리, 200Gy를 조사한 수컷은 12마리, 400Gy를 조사한 수컷은 16마리, 600Gy를 조사한 수컷은 10마리를 사용하였다.

사육 조건은 온도 24~28℃, 습도 60~80%, 광주기 15L:9D였다. 각 처리는 10~21마리로 반복하였다. 치사는 자의적 활동이 없는 것으로 판정하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4의 결과에서와 같이, 무처리 수컷의 경우 수명이 최대 약 5개월 이상이었지만, 전자빔을 조사하면 수컷 성충으로 우화하여도 성충 수명이 감소하였다. 이러한 수명단축현상은 조사한 전자빔의 세기가 증가할수록 뚜렷하게 나타났으며, 200Gy의 전자빔으로 처리한 수컷은 대부분 3개월까지는 무처리 수컷과 유사한 생존율을 나타냈다.

<실험예 4>

전자빔 조사충의 성충 교미율, 산란력 및 부화율 분석

조사된 전자빔의 세기에 따라 수컷이 교미하는 비율을 다음과 같이 조사하였다.

용화된 지 3~5일 경과된 호박꽃과실파리의 번데기에 다양한 세기의 전자빔(0, 50, 200 및 250Gy)을 조사한 후 얻어진 수컷을 무처리 암컷('CON')과 1쌍씩 용기(지름 11.5㎝ × 높이 8㎝)에 넣고 성충 먹이와 물을 제공하였다. 먹이와 물은 3~4일마다 교체하였고, 암컷이 산란할 수 있도록 호박꽃대나 호박꽃을 제공하였다. 매일 짝짓기 및 산란 유무를 관찰하였다. 사육 조건은 온도 24~28℃, 습도 60~80%, 광주기15L: 9D였다. 각 처리는 5회 반복하였다. 산란 여부는 꽃대를 분해하여 유관으로 확인하였다. 알은 페트리디쉬(지름 9㎝ × 높이 3㎝)로 옮겨 부화유무를 관찰하였다.

1. 교미율

조사된 전자빔의 세기에 따라 수컷과 무처리 암컷이 교미하는 비율을 비교한 결과를 도 5에 나타내었다. 무처리 수컷의 경우 교미율이 약 40%이었고, 50Gy로 처리한 수컷의 경우 교미율이 약 60%로 증가하였으며, 200Gy로 처리한 수컷의 경우 약 20%로 감소하였다. 반면 250Gy로 처리한 수컷의 경우 교미율이 크게 감소하였다.

2. 산란력

전자빔의 조사가 성충 산란력에 미치는 효과를 확인하기 위하여 전자빔 조사된 수컷과 교미한 암컷의 산란력을 무처리 수컷과 교미된 암컷과 비교하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다. 산란력은 산란한 알의 수로 확인하였다.

무처리 수컷과 교미한 암컷의 경우 약 40개의 알을 산란하였다. 그러나, 200Gy 선량으로 처리된 수컷과 교미한 암컷은 약 80개의 알을 산란하였고, 250Gy 처리된 수컷과 교미한 암컷도 이와 유사한 숫자의 산란력을 나타내었다.

3. 부화율

전자빔 조사가 다음 세대의 알 부화율에 미치는 효과를 확인한 결과를 도 7에 나타내었다.

전자빔 조사된 수컷과 교미한 암컷이 산란한 알들의 부화율을 무처리구와 비교하였다. 무처리 수컷과 교미한 암컷의 경우 약 90%의 부화율을 기록하였다. 낮은 선량인 50Gy를 처리한 수컷과 교미하여 얻어진 알을 경우에도 유사한 부화율을 기록하였다. 그러나 200Gy 이상의 선량으로 처리된 수컷과 교미하여 얻어진 알의 경우는 모두 부화하지 못하였다.

<실험예 5>

전자빔 조사충의 수컷 방사 기술 및 차세대 형성 능력 분석

처리구로는, 호박꽃과실파리 번데기에 200Gy의 전자빔을 조사한 불임수컷 36마리와 무처리 수컷 4마리를 일정 크기의 상자(40㎝×40㎝×40 ㎝)에 넣고 여기에 무처리 암컷 4마리를 방사하였다. 즉, 처리구는 정상 암수가 존재하는 상자에 정상 수컷의 9배의 밀도로 불임 수컷을 방사하였다.

무처리구(대조구)의 경우 동일한 크기의 상자에 무처리 수컷을 40마리와 무처리 암컷 4마리를 방사하였다.

1. 사망율

방사 이후 매일 성충의 사망 숫자를 확인하여 그 결과를 도 8에 나타내었다.

방사 후 약 3개월 동안 성충 사망을 계수한 결과, 수컷의 사망율은 처리구에서의 사망율이 무처리구에서의 사망율에 비해 높았다. 그러나, 암컷의 사망율은 무처리구와 처리구 상자에서 거의 유사하였으며, 처리구에서 1마리의 암컷만 사망하였다.

2. 산란수와 부화율

방사 후 약 10일간 각 상자에서 산란수와 부화율을 조사하여 그 결과를 도 9에 나타내었다.

처리구와 무처리구 상자에서 약 100일간 산란수와 부화율을 조사한 결과, 무처리구에서는 218개의 알을 산란하여 암컷 1마리당 54.5개의 알을 산란한 것으로 확인되었다. 반면 처리구에서는 338개의 알이 산란되어 암컷 1마리당 약 84.5개의 알을 산란하였다.

전체적인 부화율은 무처리구가 76.6%이고 처리구가 45.9%였다. 그러나 이러한 차이를 시기적으로 나누어 분석하면 방사 후 초기 약 2개월 동안 산란된 알의 부화율을 조사하였을 때 불임 수컷을 방사한 처리구에서는 부화율이 12.7%였고, 무처리구에서는 77.6%였다. 불임 수컷의 수가 정상 수컷의 9배이므로 부화율이 10% 정도일 것으로 예상하였고, 결과도 12.7%로 유사하게 나타났다.

그러나 방사 후 2개월이 지나면 처리구에서도 부화율이 높아져 무처리구와 큰 차이를 보이지 않았다. 이는 불임충의 수명이 짧기 때문에 후반기에는 불임충의 교미능력이 현저하게 낮아진 것으로 추정된다. 따라서, 불임충 방사 후 2개월 내에 재방사가 이루어져야 더 효과적인 방제효과를 얻을 수 있을 것으로 해석된다.

Claims (7)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 용화된 지 3~5일 경과된 호박꽃과실파리 번데기에 5~10 MeV의 전자빔을 150Gy 이상 250Gy 미만 선량으로 조사하여 우화율은 저하시키지 않으면서 호박꽃과실파리의 수컷을 불임화하는, 호박꽃과실파리의 불임 수컷 제조 단계;
   상기 호박꽃과실파리의 불임 수컷을 방사하는 단계; 및
   상기 방사 후 2개월 이내에 상기 호박꽃과실파리의 불임 수컷을 재방사하는 단계를 포함하는 호박꽃과실파리의 방제방법.
5. 제4항에 있어서,
   상기 호박꽃과실파리 번데기에 200Gy 선량의 전자빔을 조사하는 것을 특징으로 하는 방제방법.
6. 삭제
7. 제4항 또는 제5항에 있어서,
   상기 방사는 상기 호박꽃과실파리의 불임 수컷과 정상 수컷을 9:1의 비율로 혼합하여 방사하는 것을 특징으로 하는 방제방법.

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