CN114807144B - 一种亚洲玉米螟Doublesex基因突变体及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于病虫害防治领域，涉及亚洲玉米螟，特别是指一种亚洲玉米螟Doublesex基因突变体及其构建方法和应用。本发明以鳞翅目害虫亚洲玉米螟为研究对象，结合第三代CRISPR/Cas9基因编辑技术，构建了亚洲玉米螟显微注射体系和基因编辑体系。本发明以亚洲玉米螟重要性别决定基因Dsx为靶标基因，构建了Dsx突变体，通过表型观察和生测确定了，亚洲玉米螟Dsx突变导致蛹期和成虫期外生殖器畸形，成虫期突变体表现为雌雄不育，构建了亚洲玉米螟雌雄不育品系。该发明提供了敲除亚洲玉米螟的技术体系和提供了亚洲玉米螟不育品系，为亚洲玉米螟的绿色防控提供理论基础和应用。

Description

一种亚洲玉米螟 Doublesex基因突变体及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于病虫害防治领域，涉及亚洲玉米螟，特别是指一种亚洲玉米螟 Doublesex基因突变体及其构建方法和应用。

背景技术

亚洲玉米螟( Ostrinia furnacalis)，属鳞翅目螟蛾科，是我国侵害范围最广，危害程度最严重的玉米害虫。亚洲玉米螟雌雄之间存在明显的二态性，如雌雄外生殖器，内生殖腺，触角，个体大小和翅膀颜色等生物学特征。据FAOSTAT(http://faostat.fao.org)统计，玉米螟可导致东亚地区每年4000万吨的玉米产量损失，严重时其钻蛀率可达90%，使得每亩减产30%以上。我国玉米年种植总面积高达3800万公顷，总产量约2.24亿吨，是我国主粮作物并为粮食深加工产业提供重要保障。亚洲玉米螟幼虫对玉米的伤害包括穗和叶片，严重影响了玉米的质量和产量。亚洲玉米螟的防治方法主要是喷洒化学杀虫剂，长期使用使得害虫产生了严重的抗药性，并对环境和人类健康产生了不利影响，迫切需要新的害虫防治方法。昆虫种群的遗传调控技术（GRT）在害虫绿色防控方面具有潜在的应用价值，而 Dsx基因在昆虫遗传调控技术中广泛作为靶标基因调控害虫种群密度和数量，并且已经报道了 Dsx基因在鳞翅目SIT中的应用。研究 Dsx基因功能及其相互间的调控机制为亚洲玉米螟的遗传防治奠定理论基础。

随着分子生物学技术的不断发展，缺少高效的染色体和基因组标记手段成为了限制发展的主要瓶颈，而基因组编辑技术也在越来越多的领域发挥作用。基因组编辑是一种用来精确而有效地修饰DNA的技术，它涉及利用工程核酸酶在特定的DNA序列上进行切割，从而达到添加、删除或改变基因组中DNA序列的目的。锌指核酸酶（Zinc Finger Nuclease,ZFNs）作为第一代基因组编辑技术技术自21世纪初开始发挥作用，到2006年发展起来的第二代的类转录激活因子核酸酶(Transcription Activator-Like Effector Nuclease,TALENs)基因组编辑技术，以及2013年开始兴起的RNA靶向编辑（Clustered RegularlyInterspaced Short Palindromic Repeats/Cas9，CRISPR/Cas9）技术，使得包括非模式生物在内的诸多生物的基因组编辑成为可能。基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术在诸多非模式物种中发挥功能，有效解决了RNAi技术在鳞翅目昆虫基因功能研究中的不足，并有望在害虫防治和遗传调控中发挥作用。

目前，基于CRISPR/Cas9基因组编辑系统在害虫种群控制方面，主要集中体现在两种方法，基因驱动（Gene Drive）在媒介类害虫蚊子中的应用和可遗传的CRISPR/Cas9介导的性别特异性不育基因应用。前者主要借助于CRISPR/Cas9基因组定点敲入系统，将敲除元件（Cas9和sgRNA）定点整合到sgRNA靶标位点，然后通过稳定表达的敲除元件对等位靶点进行切割，再利用同源修复方式在归巢过程中将敲除元件整合到等位靶点，使得靶标基因的两条染色体都带有了敲除元件。这种超孟德尔遗传定律的遗传方式，使得在冈比亚按蚊( Anopheles gambiae)和斯氏按蚊( Anophelesstephensi)防治中展现出巨大的应用潜力。第二种方法借助于性别特异性不育基因 Ser2、 Osp和性别决定通路关键基因 Masc、 Doublesex在家蚕及其鳞翅目害虫小菜蛾、斜纹夜蛾、美国白蛾和小地老虎中，造成了可遗传的雄性和雌性特异性不育个体，这种性比失衡在害虫种群繁殖过程中产生巨大的影响，如徐霞等人在鳞翅目模式昆虫家蚕中以 Ser2基因和 Osp基因为靶标位点，成功构建了家蚕雌雄不育调控品系。这两种方法都展现出了良好的害虫防治应用前景，但是基因驱动方法面临着定点敲入技术上的巨大困难，而可遗传的CRISPR/Cas9介导的性别特异性不育方法只在少数鳞翅目害虫中得到应用且机理尚不清楚。鳞翅目是昆虫纲的第二大目，全世界大约有15万种鳞翅目昆虫，也是害虫种类最多的一个目。但由于鳞翅目昆虫RNA干扰效率较低，导致鳞翅目昆虫基因功能研究和害虫防治应用发展较慢，尤其是玉米重要害虫亚洲玉米螟的研究急需引物基因突变体构建方法和昆虫不育品系，促进亚洲玉米螟绿色防控的发展需求。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提出一种亚洲玉米螟 Doublesex基因突变体及其构建方法和应用。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种亚洲玉米螟 Doublesex基因突变体的构建方法，步骤为：

（1）提取亚洲玉米螟的总RNA，并反转录获得cDNA，设计sgRNA靶标位点；

（2）构建CRISPR/Cas9敲除体系，分别制备Cas9 mRNA和sgRNA；

（3）将Cas9 mRNA和sgRNA的混合物显微注射到亚洲玉米螟卵中，经培养获得突变体。

进一步，所述步骤（1）中sgRNA靶标位点位于 Doublesex基因的二号外显子区域。

进一步，所述sgRNA靶标位点的序列为5’-GGTGTCCCTAGAAACCCTGGTGG-3’。

进一步，所述步骤（3）中Cas9 mRNA和sgRNA在混合物中的终浓度均为300 ng/μL。

注射到亚洲玉米螟卵的位置在亚洲玉米螟卵近尖端1/3处。

培养的条件为温度25±2℃，相对湿度50%，光暗周期L：D 为16h：8h。

上述的构建方法制备的亚洲玉米螟 Doublesex基因突变体。

上述的亚洲玉米螟 Doublesex基因突变体，其蛹期生殖孔畸形，存在明显的二态性。

上述的构建方法在制备雌雄不育的亚洲玉米螟突变体中的应用。

上述的构建方法在防治亚洲玉米螟病害中的应用。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明以鳞翅目害虫亚洲玉米螟为研究材料，利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术，以性别决定关键基因 Dsx为切入点，构建 Dsx突变体，阐明 Dsx调控亚洲玉米螟生殖发育的关键作用，揭示性别决定通路调控亚洲玉米螟雌雄二态性的分子机制，研究结果为亚洲玉米螟的害虫生物学防治奠定理论基础。

2、本申请以性别决定关键基因 Doublesex（ Dsx）为靶标基因，引入第三代基因编辑方法CRISPR/Cas9技术体系，设计了针对该基因特异的sgRNA靶标位点，并通过改造的显微注射品系，构建了亚洲玉米螟 Dsx突变体。通过上述技术改造后，设计合成 Dsx特异的sgRNA靶标位点，利用亚洲玉米螟遗传操作系统，将体外合成的Cas9 mRNA和sgRNA注入到刚产的亚洲玉米螟卵中，构建了亚洲玉米螟 Dsx突变体，突变体长到蛹期和成虫时，发现突变体存在生殖孔和生殖器畸形的表型，生测表现为突变体失去交配能力，导致雌雄均不育，不能产生下一代。

3、本发明的 Dsx突变体，通过表型观察和生化检测确定了，亚洲玉米螟 Dsx突变导致蛹期和成虫期外生殖器畸形，成虫期突变体表现为雌雄不育，构建了亚洲玉米螟雌雄不育品系。该发明提供了敲除亚洲玉米螟的技术体系和提供了亚洲玉米螟不育品系，为亚洲玉米螟的绿色防控提供理论基础和应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为亚洲玉米螟显微注射示意图。

图2为亚洲玉米螟 Dsx突变检测。

图3为亚洲玉米螟 Dsx突变体蛹期表型。

图4为亚洲玉米螟 Dsx突变体成虫表型。

图5为亚洲玉米螟 Dsx突变影响成虫翅膀颜色。

图6为亚洲玉米螟 Dsx突变体成虫不育表型。

图7为PTD-Cas9质粒的图片。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

1基因时空表达谱的构建

收集适量亚洲玉米螟卵、各龄期幼虫、蛹、成虫（4龄以后雌、雄分开收集）；收集5龄幼虫雌、雄个体，分别解剖收集头、前肠、中肠、后肠、马氏管、脂肪体、表皮、血淋巴、生殖腺（卵巢、精巢）；提取总RNA，琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，Nano Drop超微量分光光度计测定RNA浓度；利用TaKaRa PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser反转录获得cDNA，其中 Dsx 雌性CDS序列如SEQ ID No.1所示， Dsx雄性CDS序列序列如SEQ ID No.2所示；设计检测引物，通过荧光定量PCR检测各基因的时空表达模式。

构建CRISPR/Cas9敲除体系

依据GGN₁₉GG原则，在基因组序列的外显子区域寻找潜在的敲除靶点。对于存在雌雄特异可变剪切的基因，可分别在性别特异序列区域查找敲除靶点，尝试进行特异性敲除。依照MEGAscript® Kit提供的实验操作步骤，体外转录合成敲除靶点的sgRNA，保存于-80℃待用。将实验室保存的含PTD-Cas9基因的质粒线性化后回收（PTD-Cas9质粒的图片如图7所示，碱基序列如SEQ ID No.4所示），用mMESSAGE mMACHINE® Kit试剂盒进行体外转录，合成Cas9 mRNA，保存于-80℃待用。

胚胎显微注射

亚洲玉米螟胚胎显微注射利用课题组现有的显微注射仪完成，全部过程应在亚洲玉米螟卵产后2小时内全部完成。收集亚洲玉米螟新卵块并排布于玻璃载玻片，底部加水粘贴吸附，甲醛熏蒸5分钟，进行表面消毒。配制终浓度sgRNA300 ng/μL、Cas9 mRNA 300 ng/μL注射体系，现配现用。

在实验室建立人工饲养亚洲玉米螟室内种群的基础上，申请人根据对亚洲玉米螟产卵情况的不断观察和深入研究，发现亚洲玉米螟成块状产卵，每卵块大约有100枚卵，显微镜下观察发现卵与卵成鳞片状层叠排布，且卵体较弱不易分离，根据这一特点进行亚洲玉米螟胚胎成块依次进行显微注射，如图1所示，注射位点选择于亚洲玉米螟卵近尖端1/3处。注射后的卵放于恒温培养箱中，温度25±2℃，相对湿度50%，光暗周期16：8（L：D）。

突变体的筛选和鉴定

敲除突变体的筛选主要依赖于表型上的变化。首先筛选出在外在表形，如体型、足型、翅型、触角形状、复眼形状等出现显著变化的个体，提取DNA、扩增、测序检测靶点处是否出现碱基插入、缺失等造成的基因移码突变，确认外在表型变化是源于靶标基因的敲除突变。若无显著外在表型变化，则解剖观察5龄幼虫、蛹、成虫的卵巢、精巢等生殖系统器官的变化。表型变化检测首选普通光学显微镜，对复眼、触角等超微结构的变化检测则采用扫描电镜。另外，在基因组水平上进行突变体鉴定后，提取突变个体总RNA，利用qPCR进一步检测突变个体靶标基因的转录水平变化，进而确认基于CRISPR/Cas9系统的基因敲除体系可在鳞翅目害虫亚洲玉米螟中成功使用。

根据sgRNA靶点设计原则，在 Dsx二号外显子区域设计一个靶点。通过体外转录，胚胎显微注射，以及突变检测检测，其中 Dsx基因组突变位点检测序列如SEQ ID No.3所示，检测原理如图2所示，发现在 Dsx靶点附近存在序列缺失情况，证明我们利用亚洲玉米螟CRISPR/Cas9基因组编辑体系成功敲除了 Dsx基因。

分析突变品系遗传稳定性

对可依据外在表型变化鉴定出的突变品系进行遗传稳定性分析。收集获得的亚洲玉米螟成虫突变体并进行单头饲养。与野生型个体杂交，检测是否可正常交配，产卵是否正常，卵表型是否有变化、卵是否正常孵化、后代有无突变表型等。通过连续多代杂交饲养，检测突变品系的遗传稳定性。

如图3所示，亚洲玉米螟在蛹期时，雌雄生殖孔存在明显的二态性，其中雌性的生殖孔呈现Y字形，而雄性的生殖孔两侧则有两个明显的点状凸起。当 Dsx突变体生长至蛹期时，突变体则表现为雌雄生殖孔均出现明显地畸形和黑化现象，在图3中，突变体M1，M2，M3表现为雌性突变体生殖孔黑化畸形；突变体M4，M5，M6表现为雌雄外生殖孔特征均存在的类型；突变体M7，M8，M9表现为雄性突变体生殖孔黑化畸形。证明 Dsx突变导致蛹期生殖孔畸形，破坏雌雄二态性特征。

如图4所示，亚洲玉米螟成虫的外生殖器也存在明显的二态性，其中雌性具有排列整齐的刚毛，形态规则的腹侧板，雄性具有抱握器，阳茎和爪形钩，雌雄外生殖器的不同则代表雌雄在生殖发育方面存在差异。当 Dsx突变体羽化至成虫后，M1突变体为雌性突变体，其上的生殖乳突排列错乱缺失，腹侧板畸形；M2为雌性突变体，其上出现了类似雄虫的爪形钩，腹侧板畸形；M3为雄性突变体，其阳茎、爪形钩和抱握器相对于野生型明显变短和畸形；M4为雄性突变体，其阳茎缩短，抱握器畸形，且出现了雌性特有的生殖乳突和腹侧板。证明 Dsx突变体表现为明显的性反转现象。

此外，本申请还发现成虫的身体着色有明显的性二态性，如图5所示，雌性成虫体色略浅，翅膀纹路不明显，而雄性成虫体色较深，翅膀纹路明显。 Dsx突变体的身体着色则表现为中间类型，推测 Dsx可能控制着色基因的表达，影响身体颜色。

为了验证 Dsx突变体是否影响雌雄生殖可育性，我们进行了突变体和野生型随机交配统计实验，结果如图6所示，可知存活至成虫的 Dsx突变体则表现为后代明显不育。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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atggaagcat cccccaccag attcacctgg gcgaactgca cgctatcctc aggcggcaag      1560

aggatttcta cccctttttg aaagataaca gggaaaagat tgagaaaatc ctcacatttc      1620

ggatacccta ctatgtaggc cccctcgccc ggggaaattc cagattcgcg tggatgactc      1680

gcaaatcaga agagaccatc actccctgga acttcgagga agtcgtggat aagggggcct      1740

ctgcccagtc cttcatcgaa aggatgacta actttgataa aaatctgcct aacgaaaagg      1800

tgcttcctaa acactctctg ctgtacgagt acttcacagt ttataacgag ctcaccaagg      1860

tcaaatacgt cacagaaggg atgagaaagc cagcattcct gtctggagag cagaagaaag      1920

ctatcgtgga cctcctcttc aagacgaacc ggaaagttac cgtgaaacag ctcaaagaag      1980

actatttcaa aaagattgaa tgtttcgact ctgttgaaat cagcggagtg gaggatcgct      2040

tcaacgcatc cctgggaacg tatcacgatc tcctgaaaat cattaaagac aaggacttcc      2100

tggacaatga ggagaacgag gacattcttg aggacattgt cctcaccctt acgttgtttg      2160

aagataggga gatgattgaa gaacgcttga aaacttacgc tcatctcttc gacgacaaag      2220

tcatgaaaca gctcaagagg cgccgatata caggatgggg gcggctgtca agaaaactga      2280

tcaatgggat ccgagacaag cagagtggaa agacaatcct ggattttctt aagtccgatg      2340

gatttgccaa ccggaacttc atgcagttga tccatgatga ctctctcacc tttaaggagg      2400

acatccagaa agcacaagtt tctggccagg gggacagtct tcacgagcac atcgctaatc      2460

ttgcaggtag cccagctatc aaaaagggaa tactgcagac cgttaaggtc gtggatgaac      2520

tcgtcaaagt aatgggaagg cataagcccg agaatatcgt tatcgagatg gcccgagaga      2580

accaaactac ccagaaggga cagaagaaca gtagggaaag gatgaagagg attgaagagg      2640

gtataaaaga actggggtcc caaatcctta aggaacaccc agttgaaaac acccagcttc      2700

agaatgagaa gctctacctg tactacctgc agaacggcag ggacatgtac gtggatcagg      2760

aactggacat caatcggctc tccgactacg acgtggatca tatcgtgccc cagtcttttc      2820

tcaaagatga ttctattgat aataaagtgt tgacaagatc cgataaaaat agagggaaga      2880

gtgataacgt cccctcagaa gaagttgtca agaaaatgaa aaattattgg cggcagctgc      2940

tgaacgccaa actgatcaca caacggaagt tcgataatct gactaaggct gaacgaggtg      3000

gcctgtctga gttggataaa gccggcttca tcaaaaggca gcttgttgag acacgccaga      3060

tcaccaagca cgtggcccaa attctcgatt cacgcatgaa caccaagtac gatgaaaatg      3120

acaaactgat tcgagaggtg aaagttatta ctctgaagtc taagctggtc tcagatttca      3180

gaaaggactt tcagttttat aaggtgagag agatcaacaa ttaccaccat gcgcatgatg      3240

cctacctgaa tgcagtggta ggcactgcac ttatcaaaaa atatcccaag cttgaatctg      3300

aatttgttta cggagactat aaagtgtacg atgttaggaa aatgatcgca aagtctgagc      3360

aggaaatagg caaggccacc gctaagtact tcttttacag caatattatg aattttttca      3420

agaccgagat tacactggcc aatggagaga ttcggaagcg accacttatc gaaacaaacg      3480

gagaaacagg agaaatcgtg tgggacaagg gtagggattt cgcgacagtc cggaaggtcc      3540

tgtccatgcc gcaggtgaac atcgttaaaa agaccgaagt acagaccgga ggcttctcca      3600

aggaaagtat cctcccgaaa aggaacagcg acaagctgat cgcacgcaaa aaagattggg      3660

accccaagaa atacggcgga ttcgattctc ctacagtcgc ttacagtgta ctggttgtgg      3720

ccaaagtgga gaaagggaag tctaaaaaac tcaaaagcgt caaggaactg ctgggcatca      3780

caatcatgga gcgatcaagc ttcgaaaaaa accccatcga ctttctcgag gcgaaaggat      3840

ataaagaggt caaaaaagac ctcatcatta agcttcccaa gtactctctc tttgagcttg      3900

aaaacggccg gaaacgaatg ctcgctagtg cgggcgagct gcagaaaggt aacgagctgg      3960

cactgccctc taaatacgtt aatttcttgt atctggccag ccactatgaa aagctcaaag      4020

ggtctcccga agataatgag cagaagcagc tgttcgtgga acaacacaaa cactaccttg      4080

atgagatcat cgagcaaata agcgaattct ccaaaagagt gatcctcgcc gacgctaacc      4140

tcgataaggt gctttctgct tacaataagc acagggataa gcccatcagg gagcaggcag      4200

aaaacattat ccacttgttt actctgacca acttgggcgc gcctgcagcc ttcaagtact      4260

tcgacaccac catagacaga aagcggtaca cctctacaaa ggaggtcctg gacgccacac      4320

tgattcatca gtcaattacg gggctctatg aaacaagaat cgacctctct cagctcggtg      4380

gagacagcag ggctgacccc aagaagaaga ggaaggtgtg agggcccgac tctagatcat      4440

aatcagccat accacatttg tagaggtttt acttgcttta aaaaacctcc cacacctccc      4500

cctgaacctg aaacataaaa tgaatgcaat tgttgttgtt aacttgttta ttgcagctta      4560

taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca aataaagcat ttttttcact      4620

gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatga tatcgtcgac ctgcaggcat      4680

gcaagcttgg cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact gggaaaaccc tggcgttacc      4740

caacttaatc gccttgcagc acatccccct ttcgccagct ggcgtaatag cgaagaggcc      4800

cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg gcgaatggcg cctgatgcgg      4860

tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatggtgcac tctcagtaca      4920

atctgctctg atgccgcata gttaagccag ccccgacacc cgccaacacc cgctgacgcg      4980

ccctgacggg cttgtctgct cccggcatcc gcttacagac aagctgtgac cgtctccggg      5040

agctgcatgt gtcagaggtt ttcaccgtca tcaccgaaac gcgcgagacg aaagggcctc      5100

gtgatacgcc tatttttata ggttaatgtc atgataataa tggtttctta gacgtcaggt      5160

ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca      5220

aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg      5280

aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc      5340

cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg      5400

ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt      5460

cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta      5520

ttatcccgta ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat      5580

gacttggttg agtactcacc agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga      5640

gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca      5700

acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact      5760

cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc      5820

acgatgcctg tagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact      5880

ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt      5940

ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt      6000

gggtctcgcg gtatcattgc agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt      6060

atctacacga cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata      6120

ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag      6180

attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat      6240

ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa      6300

aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca      6360

aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt      6420

ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct agtgtagccg      6480

tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc      6540

ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga      6600

cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc      6660

agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc      6720

gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca      6780

ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg      6840

tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta      6900

tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct      6960

cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag      7020

tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa      7080

gcggaaga                                                         7088

Claims (4)

1.一种亚洲玉米螟Doublesex基因突变体的构建方法，其特征在于，步骤为：

（1）提取亚洲玉米螟的总RNA，并反转录获得cDNA，设计sgRNA靶标位点；其中sgRNA靶标位点位于Doublesex基因的二号外显子区域；所述sgRNA靶标位点的序列为5’-GGTGTCCCTAGAAACCCTGGTGG-3’；

（2）构建CRISPR/Cas9敲除体系，分别制备Cas9 mRNA和sgRNA；

（3）将Cas9 mRNA和sgRNA的混合物显微注射到亚洲玉米螟卵的近尖端1/3处，经培养获得突变体；其中培养的条件为温度25±2℃，相对湿度50%，光暗周期L：D 为16h：8h。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述步骤（3）中Cas9 mRNA和sgRNA在混合物中的终浓度均为300 ng/μL。

3.权利要求1-2任一项所述的构建方法在制备雌雄不育的亚洲玉米螟突变体中的应用。

4.权利要求1-2任一项所述的构建方法在防治玉米害虫中的应用，其特征在于：所述害虫为亚洲玉米螟。

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