JP6710825B2 - 遺伝子改変家禽卵 - Google Patents
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Description
また、本発明は、外因性遺伝子の発現産物の調製方法に関する。
また、本発明は、外因性遺伝子の発現が安定し、かつ、遺伝子産物発現量の多い家禽卵を提供することを目的とする。
さらに、本発明はノックイン技術により鶏卵に外来遺伝子産物を発現した際に効率良く外来遺伝子産物を回収する技術を提供することを目的とする。
本発明は、一態様において、
〔1〕オボアルブミン、オボムコイド、オボムチン、オボトランスフェリン、オボインヒビター及びリゾチームからなる群から選ばれる少なくとも1種の卵管特異的遺伝子がノックアウトされ、かつ、オボアルブミン、オボムコイド、オボムチン、オボトランスフェリン、オボインヒビター及びリゾチームからなる群から選ばれる少なくとも1種の卵内アレルゲンタンパク質が低減又は消失されたノックアウト家禽の卵に関する。
〔2〕上記〔1〕に記載のノックアウト家禽の卵であって、
前記ノックアウトされた卵管特異的遺伝子をコードする塩基配列において、PAM配列より5’側または3’側の領域近傍に塩基の欠失、置換、または挿入を有していることを特徴とする。
また、本発明のノックアウト家禽の卵は、一実施の形態において、
〔3〕上記〔1〕または〔2〕に記載のノックアウト家禽の卵であって、
前記卵管特異的遺伝子がホモノックアウトされており、前記卵管特異的遺伝子の遺伝子型がnull(-/-)であることを特徴とする。
また、本発明のノックアウト家禽の卵は、一実施の形態において、
〔4〕上記〔1〕〜〔3〕のいずれかに記載のノックアウト家禽の卵であって、
前記卵管特異的遺伝子がオボアルブミンであることを特徴とする。
〔5〕上記〔4〕に記載のノックアウト家禽の卵であって、
オボアルブミンをコードする塩基配列において、配列番号1(OVATg1)に示される塩基配列に相当する領域およびその近傍領域に塩基の欠失、置換、または挿入を有していることを特徴とする。
また、本発明のノックアウト家禽の卵は、一実施の形態において、
〔6〕上記〔1〕〜〔3〕のいずれかに記載のノックアウト家禽の卵であって、
前記卵管特異的遺伝子がオボムコイド遺伝子であることを特徴とする。
また、本発明のノックアウト家禽の卵は、一実施の形態において、
〔7〕上記〔6〕に記載のノックアウト家禽の卵であって、
オボムコイドをコードする塩基配列において、配列番号6(OVMTg2)に示される塩基配列に相当する領域およびその近傍領域に塩基の欠失、置換、または挿入を有していることを特徴とする。
また、本発明のノックアウト家禽の卵は、一実施の形態において、
〔8〕上記〔6〕または〔7〕に記載のノックアウト家禽の卵であって、
内在性のオボムコイドを実質的に含まないことを特徴とする。
〔9〕上記〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載のノックアウト家禽の卵由来のノックアウト家禽に関する。
〔10〕卵管特異的遺伝子プロモーターの制御下に外因性遺伝子がホモ又はヘテロでノックインされ、かつ、外因性遺伝子の発現産物が卵内で安定高発現しているノックイン家禽の卵であって、
前記卵管特異的遺伝子プロモーターが、オボアルブミン、オボムコイド、オボムチン、オボトランスフェリン、オボインヒビター及びリゾチームからなる群から選ばれる少なくとも1種の卵管特異的遺伝子のプロモーターである、ノックイン家禽の卵に関する。
〔11〕上記〔10〕に記載のノックイン家禽の卵であって、
前記卵管特異的遺伝子プロモーターが、オボアルブミン遺伝子のプロモーターであり、前記外因性遺伝子が薬剤耐性遺伝子とともにオボアルブミン遺伝子のエクソン2に挿入されていることを特徴とする。
また、本発明のノックイン家禽の卵は、一実施の形態において、
〔12〕上記〔10〕または〔11〕に記載のノックイン家禽の卵であって、
前記外因性遺伝子が、オボアルブミンをコードする塩基配列における配列番号1(OVATg1)に示される塩基配列に相当する領域およびその近傍、または、配列番号24(OVATg2)に示される塩基配列に相当する領域およびその近傍に挿入されていることを特徴とする。
また、本発明のノックイン家禽の卵は、一実施の形態において、
〔13〕上記〔10〕〜〔12〕のいずれかに記載のノックイン家禽の卵であって、
前記外因性遺伝子によりコードされるタンパク質が、卵1個あたり1mg以上で含まれることを特徴とする。
また、本発明のノックイン家禽の卵は、一実施の形態において、
〔14〕上記〔10〕〜〔13〕のいずれかに記載のノックイン家禽の卵であって、
前記外因性遺伝子の発現産物が濃厚卵白に優位に発現することを特徴とする。
また、本発明のノックイン家禽の卵は、一実施の形態において、
〔15〕上記〔10〕〜〔14〕のいずれかに記載のノックイン家禽の卵であって、
前記外因性遺伝子が、インターフェロンβ、免疫グロブリン、または、コラーゲンをコードする遺伝子であることを特徴とする。
また、本発明のノックイン家禽の卵は、一実施の形態において、
〔16〕上記〔10〕〜〔15〕のいずれかに記載のノックイン家禽の卵であって、
前記外因性遺伝子がヒト由来の遺伝子であることを特徴とする。
〔17〕オボアルブミン遺伝子プロモーターの制御下に外因性遺伝子がホモ又はヘテロでノックインされたノックイン家禽の卵由来の濃厚卵白であって、
安定高発現している前記外因性遺伝子の発現産物を優位に含む、濃厚卵白に関する。
〔18〕外因性遺伝子の安定高発現により前記外因性遺伝子の発現産物を含む、ノックイン家禽の卵を作製する方法であって、
(a)家禽始原生殖細胞の卵管特異的遺伝子プロモーターの制御下に前記外因性遺伝子をノックインする工程と、
(b)前記家禽生殖細胞を用いて、前記卵管特異的遺伝子プロモーターの制御下に前記外因性遺伝子をホモ又はヘテロでノックインした雌家禽を作製する工程と、
(c)前記雌家禽から得られた前記外因性遺伝子を発現する家禽卵を得る工程と
を含む、方法に関する。
〔19〕上記〔18〕に記載の外因性遺伝子の安定高発現により前記外因性遺伝子の発現産物を含む、ノックイン家禽の卵を作製する方法であって、
前記工程(a)が、(i)前記卵管特異的遺伝子プロモーターの制御下にある翻訳開始点の5’側領域、前記外因性遺伝子、薬剤耐性遺伝子ユニット、および、前記翻訳開始点の3’側領域を含むドナーコンストラクトと、(ii)標的配列、および、異なる薬剤耐性遺伝子ユニットを含むベクターとを用いて、前記外因性遺伝子をゲノム編集により導入する工程であることを特徴とする。
また、本発明の外因性遺伝子の安定高発現により前記外因性遺伝子の発現産物を含む、ノックイン家禽の卵を作製する方法は、一実施の形態において、
〔20〕上記〔19〕に記載の外因性遺伝子の安定高発現により前記外因性遺伝子の発現産物を含む、ノックイン家禽の卵を作製する方法であって、
前記工程(a)における前記卵管特異的遺伝子プロモーターが、オボアルブミン遺伝子プロモーターであることを特徴とする。
また、本発明の外因性遺伝子の安定高発現により前記外因性遺伝子の発現産物を含む、ノックイン家禽の卵を作製する方法は、一実施の形態において、
〔21〕上記〔19〕または〔20〕に記載の外因性遺伝子の安定高発現により前記外因性遺伝子の発現産物を含む、ノックイン家禽の卵を作製する方法であって、
前記工程(a)が、(i)オボアルブミン翻訳開始点の5’側2.8kb、前記外因性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子ユニット、および、オボアルブミン翻訳開始点の3’側3.0kbを含むドナーコンストラクトと、(ii)前記標的配列としての配列番号24に示される塩基配列、および、ネオマイシン耐性遺伝子ユニットを含むベクターとを用いて、前記外因性遺伝子をCRISPRにより導入する工程であることを特徴とする。
〔22〕ノックイン家禽の卵より外因性遺伝子の発現産物を調製する方法であって、
上記〔18〕〜〔21〕のいずれかに記載の方法における前記工程(c)の後に、(d)前記家禽卵から前記外因性遺伝子の発現産物を回収する工程をさらに含む、方法に関する。
本発明のノックアウト家禽の卵は、ノックアウトされる遺伝子が卵管特異的遺伝子であり、発生に影響することが懸念されるが、本発明者は、このようなノックアウト家禽の卵が得られることを確認した。
本明細書において、「ノックイン家禽の卵」は、ノックインされた遺伝子の遺伝子型がヘテロ(+/-)の雌の家禽が産んだ卵、或いは、ノックインされた遺伝子の遺伝子型がホモ(+/+)の家禽受精卵の両方を含む。ノックインされた遺伝子の遺伝子型がヘテロ(+/-)の雌の家禽が産んだ卵と比較して、ノックインされた遺伝子の遺伝子型がホモ(+/+)の雌の家禽が産んだ卵の方が、外因性遺伝子の発現産物が多く含まれる。
始原生殖細胞は雄と雌のいずれでもよい。ニワトリなどの家禽始原生殖細胞は浮遊性の細胞であり、BRL細胞やSTO細胞などのフィーダー細胞存在下で培養される。または適当なサイトカインを培地に添加することでフィーダー細胞非存在下で培養しても良い。
ゲノム編集により遺伝子機能はノックアウトにより消失する。ゲノム編集により、遺伝子の少なくとも1つの塩基が欠失もしくは挿入する場合、フレームシフトにより遺伝子機能は消失し得、フレームシフトが起こらない場合でも一部のアミノ酸が欠失することで機能が消失し得る。また、欠失や置換によって終止コドンが生じて機能が消失することもある。
外因性タンパク質は、適切なシグナルペプチドを付加してもよく、家禽類で発現しやすくするためにコドンユーセージを変更してもよい。
卵管特異的遺伝子としてオボアルブミン遺伝子を選択し、オボアルブミン遺伝子プロモーター制御下に外因性遺伝子を導入する場合、好ましい形態として、当該外因性遺伝子の5’端が、オボアルブミンをコードする塩基配列における配列番号1(OVATg1)に示される塩基配列に相当する領域、または、配列番号24(OVATg2)に示される塩基配列に相当する領域に挿入された形態を挙げることができる。より好ましくはオボアルブミンの翻訳開始点に外因性遺伝子の翻訳開始点を挿入すれば良い。
本発明のノックアウト家禽の卵は、一実施の形態として、以下に限定されないが、卵管特異的遺伝子としてオボアルブミン、または、オボムコイドをノックアウトした形態を挙げることができる。卵管特異的遺伝子として、オボアルブミンをノックアウトする際の好ましい一実施の形態としては、配列番号1(OVATg1)に示される塩基配列に相当する領域およびその近傍領域に塩基の欠失、置換、または挿入を生じさせることができる。また、卵管特異的遺伝子として、オボムコイドをノックアウトする際の好ましい一実施の形態としては、配列番号6(OVMTg2)に示される塩基配列に相当する領域およびその近傍領域に塩基の欠失、置換、または挿入を生じさせることができる。
ここで、例えば、「配列番号6(OVMTg2)に示される塩基配列に相当する領域」というとき、オボムコイド遺伝子のホモログにおける対応する領域も含み、当業者であれば、対象の家禽により当該塩基配列に相当する領域を把握することができる。
オボムコイドの分泌前蛋白質は、(開始メチオニンを1として)210アミノ酸(210aa)より構成され、1-24aaにシグナルペプチドを有する。また、配列番号6(OVMTg2)のPAM配列は、38-39aa部に相当する。よって、本発明のオボムコイド遺伝子をノックアウトした家禽の卵は、一実施の形態において、少なくとも160aa以降を含まない、好ましくは100aa以降を含まない、より好ましくは38aa以降を含まないオボムコイド変異蛋白質を発現する。
また、本発明のオボムコイド遺伝子をノックアウトした家禽の卵は、好ましい実施の形態において、内在性のオボムコイドを実質的に含まない。内在性のオボムコイドを実質的に含まないとは、ノックアウト雌家禽のオボムコイド遺伝子がホモでノックアウトされることにより、当該ノックアウト雌家禽より産生される卵中に、内在性のオボムコイドが消失している状態をいう。
例えば、内在性の始原生殖細胞をゲノム編集を用いて改変するには、各社から販売されているゲノム編集用ウイルスベクターを用いて任意の標的配列を認識、切断するヌクレアーゼやsgRNAを発現するウイルスベクターを構築し、パッケージングにより感染可能な形態とし、家禽初期胚の胚盤葉、血液や生殖巣領域等始原生殖細胞の存在する場所に投与することで始原生殖細胞におけるゲノム編集を行い、後代に遺伝子改変個体や遺伝子改変産物を得ることが可能である。市販のゲノム編集用ウイルスベクターは国内外の多くの会社が販売しているが、例えばアデノ随伴ベクターを用いたTakara社の「AAVpro(登録商標) CRISPR/Cas9 Helper Free System (AAV2)」やレンチウイルスベクターを用いたSystem Biosciences, LLCの「Lentiviral CRISPR/ Cas9 System」などが挙げられる。遺伝子改変がノックインの場合、ゲノム編集に必要なウイルスベクターとノックインされる遺伝子を含むウイルスベクター、プラスミド、Bacベクター、一本鎖や二本鎖のDNA等を併用することができる。
本法により得られる卵白アレルゲン遺伝子のホモノックアウトニワトリを飼養し、卵を得ることで卵白アレルゲン蛋白質を欠損した卵を得ることができる。このような卵は低アレルゲン性であることが想定される。非特許文献4ではヘテロ型のオボアルブミンノックアウトニワトリの例が示されているが、ホモノックアウトニワトリが得られるか、更にホモノックアウトニワトリから卵が得られるかについては当時の技術常識を総合しても予見できないし、当該文献からも予見できない。
<製造例1>
ニワトリ雄始原生殖細胞を用いたゲノム編集
(製造例1−1)
オボアルブミン(OVA)遺伝子座へのノックインおよびオボムコイド(OVM)ノックアウトのための遺伝子構築
ニワトリ雄始原生殖細胞株を用い、オボアルブミンならびにオボムコイド遺伝子を標的としてCRISPR法の適用を行った。図1(オボアルブミン)、図2(オボムコイド)に示すようにそれぞれOVATg1、OVMTg2の標的としての適性を検討した。
図1に示すオボアルブミン遺伝子の標的配列を標的とし、CRISPR用プラスミドを構築した。
まず、配列番号1(OVATg1)を標的として配列番号2,配列番号3で示されるオリゴDNAを合成し、T4 Polynucleotide Kinaseを用いて5’末端をリン酸化した後、両者の混合液を98℃まで加熱し、室温までゆるやかに冷却することでアニールした。このDNA断片をプラスミドpx330(AddGENE,米国)のNotI部位に配列番号4のピューロマイシン耐性遺伝子ユニットを挿入したプラスミドpx330-Puror のBbsI切断部位に挿入した(px330-Puror-OVATg1)。さらにpx330-Puror-OVATg1のピューロマイシン耐性遺伝子ユニットを配列番号5で示すネオマイシン耐性遺伝子ユニットに置き換えたプラスミドを構築した(px330-Neor-OVATg1)。
図2に示すオボムコイド遺伝子の標的配列を標的とし、CRISPR用プラスミドを構築した。配列番号6(OVMTg2)を標的として配列番号7と配列番号8で示されるオリゴDNAを合成し、リン酸化後、アニールし、プラスミドpx330-PurorのBbsI切断部位に挿入した(px330-Puror-OVMTg2)。
オボアルブミン、オボムコイド遺伝子ノックアウト
横斑プリマスロック雄胚血液中より採取し、株化したニワトリ雄始原生殖細胞(非特許文献3に準拠して調製)に上述の遺伝子(プラスミド)を一過的に導入した。1×105〜5×105個の雄始原生殖細胞株をPBSで洗浄し、OPTI-MEMに懸濁後、3μlのリポフェクタミン2000(Life Technologies, 米国)を用いて1.6μgのpx330-Neor-OVATg1を遺伝子導入した。具体的には、リポフェクタミン2000とプラスミドを80μl OPTI-MEM中で混合し、雄始原生殖細胞株と混合後室温で5分程度静置し、その後抗生物質を含まない培地を500μl添加し、37℃で1〜4時間程度静置した上でフィーダー細胞上に播種した。遺伝子導入後2〜4日の間、ネオマイシン(G418二硫酸塩、ナカライテスク、日本)終濃度0.5mg/mlで添加し、これを洗浄除去した後に1〜2週間の培養を行った。培養後に細胞を回収し、ゲノムDNAを抽出後、配列番号9,配列番号10で示されるオリゴDNAプライマーを用いたPCR法によりオボアルブミン遺伝子の一部領域を増幅し、TAベクター(pGEM-T Easy, Promega, 米国)にサブクローンし、配列番号1(OVATg1)を含む領域のゲノム塩基配列を解析した。図3に示すように開始コドンの欠失、置換を含む変異を確認した。
次に、オボムコイド遺伝子を標的とした同様の解析を行った。上述と同様に1×105〜5×105個の雄始原生殖細胞株にリポフェクタミン2000を用いてpx330-Puror-OVMTg2を1.6μg遺伝子導入し、導入後2〜4日の間、ピューロマイシンを終濃度1μg/mlで添加した。ピューロマイシンを洗浄除去した後に1〜2週間の培養を行ない、細胞を回収し、ゲノムDNAを抽出後、配列番号11,配列番号12で示されるオリゴDNAプライマーを用いたPCR法によりオボムコイド遺伝子の一部領域を増幅し、TAベクターにサブクローンし、配列番号6(OVMTg2)を含む領域のゲノム塩基配列を解析した。解析した23クローン中21クローン(91%)においてオボムコイド遺伝子の配列番号6(OVMTg2)を含む領域で遺伝子の欠失が認められた。一方、対照群として薬剤選択を行わなかったものの遺伝子欠損は24クローン中0個(0%)であった。OVMTg2を含む領域に認められた遺伝子変異の例を図4Aに示す。これらのことは家禽始原生殖細胞の遺伝子をゲノム編集する上で、薬剤耐性遺伝子導入と薬剤による一過的選択が変異の効率を顕著に上昇しうること、特にピューロマイシン耐性遺伝子とピューロマイシンによる薬剤選択で高い変異効率が得られることを示している。
ゲノム編集ニワトリの樹立
(製造例1-2)に記載した要領で横斑プリマスロック種始原生殖細胞にpx330-Puror-OVMTg2を遺伝子導入し、薬剤選択した細胞を培養し、白色レグホン種2.5日胚(レシピエント胚)の血液中に顕微注射により移植を行った。移植に先立ち、レシピエント胚内在性の始原生殖細胞数を減少させる目的で孵卵操作前の受精卵に電離放射線を5Gyまたは6Gy照射した。電離放射線照射はガンマセル40(カナダ原子力公社)を用いたガンマ線照射により行った。
オボアルブミン遺伝子座へのヒトインターフェロン遺伝子ノックイン
(製造例2−1)
始原生殖細胞樹立へのノックインとノックインキメラニワトリの樹立
オボアルブミン遺伝子の翻訳開始点に外因性遺伝子(ヒトインターフェロンβ;IFNβ)を挿入することを目的とし、配列番号13に示されるヒトインターフェロンβ遺伝子を導入したドナーコンストラクト(IFNβドナーコンストラクト)を作製した。このドナーコンストラクトはオボアルブミン翻訳開始点の5’側約2.8kb、ヒトインターフェロンβ遺伝子、薬剤耐性遺伝子ユニット(PGK-Puror)、オボアルブミン翻訳開始点の3’側約3.0kbから構成される。このドナーコンストラクトをプラスミドpBlue ScriptII(SK+))(Stratagene,米国 現Agilent technologies)に挿入しpBS-IFNβドナーとした。製造例1と同様に1×105〜5×105個の始原生殖細胞株にリポフェクタミン2000を用いてpx330-Neor-OVATg1を0.8μg、pBS- IFNβドナーを0.8μg同時に遺伝子導入し、導入後3日以降、ピューロマイシンを終濃度1μg/mlで添加した。適宜培地交換を行い、終濃度1μg/mlのピューロマイシン存在下で増殖する細胞を回収し、ゲノムDNAを調製した。ドナーコンストラクトがオボアルブミン遺伝子座にノックインされていることをゲノムPCRにより確認した。5’領域についてドナーコンストラクトの外因性遺伝子とドナーコンストラクトに含まれないオボアルブミンの5’領域に対するプライマーを用いたPCRを以下のように行った。配列番号14に示されるインターフェロンβに対するアンチセンスプライマーと配列番号15に示すオボアルブミン翻訳開始点の5’側約3.0kbの領域に対するセンスプライマーを用いてPCRを行い、さらに増幅産物に対して配列番号16に示すインターフェロンβに対するアンチセンスプライマーと配列番号17に示すオボアルブミン翻訳開始点の5’側約2.85kbでドナーコンストラクトには含まれない領域に対するセンスプライマーを用いてPCRを行った(nested PCR)。図5Aに示すようにpx330-Neor-OVATg1と共にドナーコンストラクトを導入し、薬剤選択した始原生殖細胞(ノックインPGCs)由来ゲノムを鋳型とした場合、ドナーコンストラクトが挿入された際に期待される約2.9kの位置に増幅産物が認められるのに対し、対照の遺伝子導入を行っていない始原生殖細胞由来ゲノム(対照PGCs)を鋳型とした場合、増幅産物は認められない。
ノックイン効率の改善
遺伝子ノックインの効率改善について検討を行った。まず、上述製造例2−1のインターフェロンβドナーコンストラクトの薬剤耐性ユニットをPGK-PurorからSV40Pe-Neor(配列番号23)に置換したIFNβ-Neoドナーコンストラクト<配列番号33>を作製した。このドナーコンストラクトはオボアルブミン翻訳開始点の5’側約2.8kb、ヒトインターフェロンβ遺伝子、薬剤耐性遺伝子ユニット(SV40Pe-Neor)、オボアルブミン翻訳開始点の3’側約3.0kbから構成される。このドナーコンストラクトをプラスミドpBlue ScriptII(SK+)に挿入しpBS-IFNβ-Neoドナーとした。また、図6Aに示すようにOVATg1と一部重なるオボアルブミンの標的配列OVATg2(配列番号24)を標的とし、CRISPR用プラスミドを構築した。配列番号25と配列番号26でそれぞれ示されるオリゴDNAを合成し、製造例1−1と同様にリン酸化後、アニールし、DNA断片をpx330のBbsI切断部位に挿入するとともに、NotI部位に配列番号4のピューロマイシン耐性ユニットを挿入したプラスミドpx330-Puror-OVATg2を構築した。約5×105個の始原生殖細胞株を調製し、3分割した後に、製造例2−1と同様にリポフェクタミン2000を用いてpx330-Neor-OVATg1を0.8μg、pBS-IFNβドナー(ピューロマイシン耐性遺伝子ユニットを持つ)を0.8μg(導入群1)もしくはpx330-Puror-OVATg1を0.8μg、pBS-IFNβ-Neoドナーを0.8μg(導入群2)もしくはpx330-Puror-OVATg2を0.8μg、pBS-IFNβ-Neoドナーを0.8μg(導入群3)それぞれ同時に遺伝子導入し、(導入群1)は製造例2−1同様導入後3日以降、ピューロマイシンを終濃度1μg/mlで添加した。一方、(導入群2)と(導入群3)は製造例1−2と同様に遺伝子導入後2〜4日の間、終濃度1μg/mlのピューロマイシン存在下で培養し、洗浄後、終濃度0.5mg/mlのネオマイシンを添加し培養を行った。導入後24日後に各導入群の細胞数をそれぞれ計測した所、導入群1の2×104に対し、導入群2と3では1×105の薬剤耐性細胞が認められた。また、それぞれの群より細胞を回収し、ゲノムDNAを調製後、製造例2−1と同様に配列番号18と配列番号19のプライマー(オボアルブミン遺伝子にノックインされたインターフェロンの3’側を増幅)、配列番号15と配列番号14のプライマー(オボアルブミン遺伝子にノックインされたインターフェロンの5’側を増幅)、配列番号15と配列番号22のプライマー(ノックインされていないオボアルブミンを増幅)を用いてそれぞれPCRを行った。なお、導入群2と3については配列番号18のプライマーの代わりに配列番号71のプライマーを用いた(図6B)。導入群1と2との間でPCRシグナル強度比の大きな違いを認めないことから、導入群2のピューロマイシンで短期間選択後、ネオマイシン選択する方法のほうが迅速に目的細胞を調製可能と考えられる。また、導入群3は導入群2と比較してノックインされていないオボアルブミンが殆ど認められないことから、より効率の良いノックインが起こっていると考えられる。以上より、OVATg2配列を標的とし、CRISPRコンストラクトにピューロマイシン耐性遺伝子をドナーコンストラクトにネオマイシン耐性遺伝子をそれぞれ挿入し、始原生殖細胞に導入後一過的にピューロマイシンで選択し、その後ネオマイシンで選択を行うことで迅速かつ高効率に外因性遺伝子のオボアルブミン遺伝子座へのノックインが可能になると考えられる。
オボアルブミン遺伝子座へのヒト抗体遺伝子ノックイン
上記製造例2−1のインターフェロンβドナーコンストラクトのヒトインターフェロンβの代わりに配列番号27に示されるヒト免疫グロブリン遺伝子を導入したドナーコンストラクト(免疫グロブリンドナーコンストラクト)を作製した。このドナーコンストラクトはオボアルブミン翻訳開始点の5’側約2.8kbの下流に卵白リゾチームシグナルペプチド、ヒト免疫グロブリン重鎖、furinタンパク質切断標的配列、2A自己プロセッシング性ペプチド、卵白リゾチームシグナルペプチド、ヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子をそれぞれコードする遺伝子を連結して配置し、薬剤耐性遺伝子ユニット(PGK-Puror)、オボアルブミン翻訳開始点の3’側約3.0kbから構成されている。このドナーコンストラクトが転写、翻訳されることで免疫グロブリンの重鎖と軽鎖からなる抗体タンパク質を発現する。
更に製造例2−2と同様に免疫グロブリンドナーコンストラクトの薬剤耐性ユニットをPGK-PurorからSV40Pe-Neor(配列番号23)に置換した免疫グロブリン-Neoドナーコンストラクト(配列番号30)を作製した。このドナーコンストラクトはオボアルブミン翻訳開始点の5’側約2.8kbの下流に卵白リゾチームシグナルペプチド、ヒト免疫グロブリン重鎖、furinタンパク質切断標的配列、2A自己プロセッシング性ペプチド、卵白リゾチームシグナルペプチド、ヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子をそれぞれコードする遺伝子を連結して配置し、薬剤耐性遺伝子ユニット(SV40Pe-Neor)、オボアルブミン翻訳開始点の3’側約3.0kbから構成されている。このドナーコンストラクトをプラスミドpBlue ScriptII(SK+)に挿入しpBS-免疫グロブリン-Neoドナーとした。製造例1−2と同様の方法でpx330-Puror-OVATg2を0.8μgとpBS-免疫グロブリン-Neoドナー0.8μgを約2×105個の始原生殖細胞株に3μlのリポフェクタミン2000を用いて遺伝子導入し、遺伝子導入後2〜4日の間、終濃度1μg/mlのピューロマイシン存在下で培養し、洗浄後、終濃度0.5mg/mlのネオマイシンを添加し培養を行った。3週間程度の培養の後、得られた免疫グロブリンノックイン細胞を含む細胞集団を(製造例1−3)と同じ手法によりレシピエント胚に移植後孵化させ免疫グロブリンノックイン生殖巣キメラニワトリを樹立した。後代にオボアルブミン遺伝子座にヒト免疫グロブリン遺伝子がノックインされたニワトリが得られ、卵白にヒト免疫グロブリンの重鎖と軽鎖からなる抗体タンパク質を発現する。
オボアルブミン遺伝子座へのヒトコラーゲン遺伝子ノックイン
上記製造例2−1のインターフェロンβドナーコンストラクトのヒトインターフェロンβの代わりに配列番号31に示されるヒトI型コラーゲン遺伝子を導入したドナーコンストラクト(コラーゲンドナーコンストラクト)を作製した。このドナーコンストラクトはオボアルブミン翻訳開始点の5’側約2.8kbの下流に卵白リゾチームシグナルペプチド、ヒトI型コラーゲンα1鎖(COLLAGEN1A1)、furinタンパク質切断標的配列、2A自己プロセッシング性ペプチド、卵白リゾチームシグナルペプチド、ヒトI型コラーゲンα2鎖(COLLAGEN1A2)遺伝子をそれぞれコードする遺伝子を連結して配置し、薬剤耐性遺伝子ユニット(PGK-Puror)、オボアルブミン翻訳開始点の3’側約3.0kbから構成されている。このドナーコンストラクトが転写、翻訳されることでヒトI型コラーゲンα1鎖とα2鎖からなるI型コラーゲンタンパク質を発現する。
プラスミドpBlue ScriptII(SK+)にコラーゲンドナーコンストラクトを挿入しpBS-COL1(A1+A2)ドナーとした。 上記pBS-IFNβドナー、pBS-IgG(Hc+Lc)ドナーと同様の手法によりpBS-COL1(A1+A2)ドナーを雄ニワトリ始原生殖細胞にノックイン後ピューロマイシンで選択し、選択された細胞のゲノムを鋳型としてPCRを行なった。5’側はpBS-IgG(Hc+Lc)ドナーと同様、配列番号15のプライマーと配列番号28に示される卵白リゾチームシグナルペプチドに対するアンチセンスプライマーによるPCRの後、増幅産物に対して配列番号17のプライマーと配列番号29に示す卵白リゾチームシグナルペプチドに対するアンチセンスプライマーを用いてPCRを行った(nested PCR)。3’側は上記pBS-IFNβドナー、pBS-IgG(Hc+Lc)ドナーのノックイン時と同様に配列番号18と配列番号19に示すプライマーを用いたPCRの後、増幅産物に対して配列番号20と配列番号21に示すプライマーを用いてnested PCRを行った。図8に示すように、コラーゲンドナーを用いた場合でも始原生殖細胞のオボアルブミン遺伝子へのノックインが認められた。
上記製造例2−1に記されたようにオボアルブミン遺伝子座の翻訳開始点にヒトインターフェロンβドナーベクターがノックインされた雌ニワトリ、雄ニワトリを樹立した。
樹立したノックインニワトリは、発生異常や顕著な病態を示すこと無く、性成熟に達し、ノックイン雌ニワトリは産卵を始めた。卵殻を割り、内容物を検証した所、卵黄の周囲に白濁した濃厚卵白が確認された。一方粘性の低い水溶性卵白は野生型の卵と同様に存在した。典型的な割卵像を図9に示す。
次に、卵白におけるヒトインターフェロンβの存在について検証を行った。
濃厚卵白、水溶性卵白をそれぞれスポイトを用いて回収し、等量のサンプルバッファー(0.125M Tris pH6.8, 10% 2-ME, 4% SDS, 10%グリセロール 0.1%BPB)を加え、これをそれぞれ10倍ずつ計3段階に希釈し、5-20%のアクリルアミドゲルで電気泳動により分離を行ったのちにPVDF膜に転写し、スキムミルクで膜への抗体分子の非特異吸着をブロッキングした後、1000倍希釈した抗ヒトインターフェロンβ抗体(abcam ab85803 ウサギポリクローナル)を一次抗体、1000倍希釈した抗ウサギHRP結合抗体(GEヘルスケアNA934V)を二次抗体としたウエスタンブロットを行った。結果を図10に示す。
このことは濃厚卵白に遺伝子ノックインによる組換え発現蛋白質が比較的多く含まれる可能性を示唆している。
次に、野生型卵(NC: negative control)、2つのヒトインターフェロンβノックインニワトリ由来卵(KI egg1および2)の水溶性卵白と濃厚卵白を採取し、等量ずつ計2段階の希釈をして5-20%アクリルアミドゲルで電気泳動し、クマシーブリリアントブルー染色(ナカライ CBBステインワン)により卵白に含まれる蛋白質の可視化を行った。結果を図11に示す。先のウエスタンブロットの結果と同様、約30kDaの位置に野生型卵には存在せず、2つのノックイン卵に存在する明瞭なバンドが認められ、ヒトインターフェロンβであることが分かる。また、ウエスタンブロットの結果と同様に、このヒトインターフェロンβのバンドは水溶性卵白を電気泳動した場合には殆ど認められない。CBB染色したバンドのシグナルを比較すると、オボトランスフェリンやオボアルブミンなど他の卵白成分は水溶性卵白と濃厚卵白では量が殆ど変わらないにも関わらず、ヒトインターフェロンβ量が大きく異なることから、オボアルブミン遺伝子座にノックインにより発現させたヒトインターフェロンβは濃厚卵白に優位に集積することが明らかとなった。
初卵を産んでから3ヶ月後の4羽のインターフェロンノックイン雌より卵を得て割卵した(図23)。いずれの卵においても濃厚卵白の白濁が認められた。また、5羽のニワトリ(#584,#766,#714,#645,#640)から卵を得てそれぞれの濃厚卵白を上記(3)と同様に電気泳動、CBB染色を行った。全ての卵でヒトインターフェロンのバンドを認めた(図17)。NIH imageで定量比較すると#584,#766,#714,#645,#640のインターフェロン濃度は
1.0:1.0:0.94:0.91:0.89となる。これは、非特許文献1でみられる個体間の分泌濃度のゆらぎ(5μg/ml-100μg/ml)と比べると最大-最小の濃度差11%以内と極めて安定しており、個体間で差がないことは複数の組換えニワトリを用いて組換え蛋白質を大量に得ようとする場合に有利な点である。
(1)濃厚卵白からの効率のよいインターフェロン抽出の試み(可溶化処理が可能)
濃厚卵白に高濃度のインターフェロンβが存在することが分かったが、このインターフェロンβを一般的に活用するには卵白から抽出され、精製されることが望ましい。精製技術には分子量や化学的性状に基づいた様々なカラム処理などがあるが、カラム処理を行うには対象となる蛋白質が水溶液となっていることが望ましい。水溶液と不溶物は遠心操作により分離可能である。そこで、濃厚卵白中のインターフェロンが水溶液に含まれるか、不溶物なのか検討した。
濃厚卵白を200μl採取し、20k×Gで15分遠心すると白色の沈殿画分と液体の画分に分離が可能である(図13チューブ1)。液体の画分をアクリルアミドゲル電気泳動するとヒトインターフェロンβは含まれるものの(図14レーン1)、同量の分離前濃厚卵白(図14レーン0)よりは明らかに量が少ない。したがって、遠心により生ずる白色沈殿部に多くのインターフェロンが含まれると考えられた。そこで、白色沈殿を減らし、インターフェロンの収量を増加させる幾つかの試みを行った。図13ではそれぞれのチューブに濃厚卵白液200μlを加え、3Mの飽和アルギニン溶液4倍量(800μl)を加え転倒混和したもの(チューブ2)、3Mの飽和アルギニン溶液4倍量(800μl)を加え超音波破砕を行ったもの(チューブ3)、少量のアルギニン(20mg)を加え転倒混和したのちPBSにより1mlにしたもの(チューブ4)、少量のアルギニン塩酸塩(20mg)を加え転倒混和したのちPBSにより1mlにしたもの(チューブ5)、PBSにより1mlにし、超音波破砕を行ったもの(チューブ6)、飽和量以上のアルギニン塩酸塩(200mg)を加えて転倒混和したもの(チューブ7)、3Mの飽和アルギニン溶液2倍量(400μl)を加え超音波破砕を行ったもの(チューブ8)、少量のアルギニン塩酸塩(20mg)を加え超音波破砕したもの(チューブ9)、少量の食塩(40mg)を加え超音波破砕したもの(チューブ10)などである。20k×Gで15分遠心すると白色沈殿は認められるが、いずれも無処理(チューブ1)の場合より減少しており、特に超音波破砕を行ったもののうちチューブ3,6,8,9で顕著に減少していた。
バイオアッセイにより、水溶性卵白、濃厚卵白、濃厚卵白粗精製物のインターフェロン活性について検討した。HEK-blue IFN-α/β(Invivogen)は培地にヒトインターフェロンβを添加することでアルカリフォスファターゼを分泌する培養細胞であり、アルカリフォスファターゼの基質液(Quanti-Blue ; Invivogen)に反応後の培地を加え、基質液の変化(Quanti-Blueの場合赤色から青色への変色)を見る事でヒトインターフェロンβの活性の有無を見ることが出来る。HEK-blue IFN-α/βの培養液中にヒトインターフェロンノックイン卵由来の水溶性卵白、濃厚卵白(20k×Gで15分遠心後の上清)、濃厚卵白粗精製物(チューブ3由来))を添加した。また、ネガティブコントロールとして野生型鶏卵の水溶性卵白ならびにPBSをポジティブコントロールとして組換えヒトインターフェロンをそれぞれ添加した。細胞を20時間培養し、培養上清をQuanti-Blue基質液に添加し、摂氏37℃で1時間反応させた。結果を図15に示す。
インターフェロンノックイン(IFN-KI)卵の水溶性卵白、濃厚卵白の遠心上清、濃厚卵白の粗精製物いずれにおいてもヒトインターフェロンβの活性が認められ、未精製のノックイン卵産物にインターフェロン活性が認められるとともに、超音波破砕やアルギニンバッファーによる可溶化処理を行っても活性があることを示している。したがって鶏卵由来インターフェロンは鶏卵のまま未加工や遠心分画など簡単な加工を行っても、また可溶化、精製などのプロセスをとっても利用可能である。
バイオアッセイにより濃厚卵白中のインターフェロン活性を測定した。(2)と同様にHEK-blue IFN-α/βの培養液中にヒトインターフェロンノックイン卵由来(初卵後3ヶ月で採卵)の濃厚卵白(超音波破砕後20k×Gで15分遠心後の上清)を5倍ずつ連続希釈して10μlずつ添加した。比較として市販の組換えヒトインターフェロンβ(和光純薬)10μg/mlを同様に5倍ずつ連続希釈して10μlずつ添加した。細胞を20時間培養し、培養上清をQuanti-Blue基質液に添加し、摂氏37℃で1時間反応させた。結果を図18に示す。上段市販のヒトインターフェロンを添加した培養上清の反応系は、赤色と青色が混在するウエルが左から4番目にあるのに対し、濃厚卵白を添加した培養上清(下段)は左から8番目に存在する(希釈系列は共に左が濃く、右が薄い)。従って濃厚卵白のインターフェロン活性は市販の10μg/mlのインターフェロンより625倍以上高く、6.25mg/ml以上と想定される。濃厚卵白はこの時点で約16ml程度取れたことから、卵1個に市販品換算で約100mg相当の活性を有するヒトインターフェロンが得られた事になる。和光純薬の組換えヒトインターフェロンβは20μgの市価が39,000円であり、100mgは195,000,000円(約2億円)に相当する。本法を用いることで、活性でみても極めて大量のヒト組換え蛋白質を生産することが可能である。
G1のノックインニワトリ(雄)を野生型の雌と交配し、G2ノックインニワトリ(雄および雌)を樹立した。G2ノックインニワトリを性成熟させ、卵を得て割卵した(図19右)。G1由来卵と同様に得られた卵は全て濃厚卵白が白濁していた。更に3羽のG2ノックインニワトリより卵を得て濃厚卵白を電気泳動した。G1由来卵の濃厚卵白を比較のために電気泳動した。CBB染色像はG2由来の卵でもG1同様にインターフェロンのシグナルが認められる。以上により、卵管遺伝子にノックインした外来遺伝子の鶏卵への発現が世代を超えて安定的に行われると示された。これにより、ノックインニワトリを用いた組換え蛋白質生産の大規模化や経時的な安定運用が担保される。
製造例3で記したようにして得られた、オボアルブミン遺伝子座へヒト抗体遺伝子をノックインしたニワトリから卵を得た。卵白におけるヒト抗体蛋白質の存在について検証を行った。卵白を、等量のサンプルバッファー(0.125M Tris pH6.8, 4% SDS, 10%グリセロール 0.1%BPBなお、2-MEは含まない)を加え、これをそれぞれ10倍ずつ計3段階に希釈し、5-20%のアクリルアミドゲルで電気泳動により分離を行ったのちにPVDF膜に転写し、スキムミルクで膜への抗体分子の非特異吸着をブロッキングした後、1000倍希釈した抗ヒトイムノグロブリン抗体(Jackson Immuno Research、Anti-Human IgG F(ab))を一次抗体、1000倍希釈した抗ウサギHRP結合抗体(Jackson Immuno Research、Peroxidase-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L))を二次抗体としたウエスタンブロットを行った。結果を図20に示す。
リコンビナントの精製ヒト抗体(商品名:ハーセプチン、ロッシュ)と同位置の約200kDaの場所に抗体で認識されるバンドが認められた(図20右)。また、このバンドは野生型の卵では全く検出されなかった(図20左)。これらのことから、鶏卵内で正常なサブユニット構成でヒト抗体複合体が存在すると考えられる。図20各レーンの1/20, 1/200,1/2k(=1/2000)は卵白の原液を1とした相対泳動量を示している。濃度既知のハーセプチンの泳動量との比較により、抗体複合体の濃度が1mg/ml以上であると推定される(図20右)。
(1)オボムコイドホモ型遺伝子ノックアウトニワトリ
オボムコイドは卵白蛋白質であるが、初期発生過程における発現動態や発生における機能は解析されておらず、機能欠失が及ぼす影響も全くわかっていない。製造例1−3で示したように、我々はゲノム編集技術により、ヘテロ型のオボムコイドノックアウトニワトリ(雄および雌)を作製した。さらにこれらを交配することでオボムコイドを完全欠損するニワトリ(ホモ型のオボムコイドノックアウトニワトリ)を樹立した。図16に示すようにオボムコイドの蛋白質をコードするエクソン3の同じ場所5塩基を欠損した雄、雌ヘテロノックアウトニワトリを性成熟後交配し、後代を得た。図16に示すように後代の中には野生型、ヘテロ型ノックアウトに加えてホモ型のノックアウトニワトリが得られた。また、オボムコイドのホモ型ノックアウトニワトリは雄、雌が得られており、いずれも野生型と同様に健康で形態の異常なく成長を続けている。このことから、オボムコイドは機能欠失により致死や形態異常等の初期発生に影響を及ぼすものではないことを初めて明らかにすることができた。
ホモ型のオボムコイドノックアウトニワトリはオボムコイドを分泌しないため、オボムコイドを含まない卵を生産する。オボムコイドは非常に強力なアレルゲン物質であり、加熱や酵素による分解によってもアレルゲン性を失わないことが知られている。オボムコイドを欠損した卵は当然オボムコイドによる強いアレルゲン性を持たないことから、低アレルギー性の卵として生食、加工食品、ワクチン製造、化粧品原料等卵を用いる全ての製造物のアレルギー性を大きく低減させるのに役に立つことが自明である。
ホモ型のノックアウトニワトリの雌は産卵する。少なくとも6ヶ月に渡り野生型と同様ほぼ毎日産卵した。割卵像を図21左に示す。外観上は野生型の卵と違いは認められない。また、加熱により凝固するなど、加工性も通常の鶏卵と顕著な違いを認めない(図21右)。
更に、ホモ型ノックアウトニワトリ同士の交配に依りニワトリ固体が発生し得る。5bpホモ欠損個体の雌雄を交配した卵を孵卵した結果G3世代のオボムコイド5bpホモ欠損個体が得られている(図23)。このことはオボムコイド遺伝子だけでなく、オボムコイド蛋白質が欠損していてもニワトリは発生するすなわちオボムコイドがニワトリ発生に必須ではないことを示している。
今回の実施例で得られたインターフェロンβの濃度は5mg/mlと非常に高いものであったが、更に卵内における組換え蛋白質の濃度の向上を図ることが可能である。
1.ノックイン遺伝子のホモ化
解析した鶏卵の親の遺伝子型はオボアルブミン遺伝子座の片アリルにヒトインターフェロンβが挿入されたもの(ヘテロ型遺伝子ノックイン)である。ヘテロ型遺伝子ノックイン親同士の交配やノックイン始原生殖細胞を有する生殖巣キメラ個体同士の交配により両アリルにヒトインターフェロンβが挿入された個体(ホモ型遺伝子ノックイン)を作製すれば、より高濃度の組換え蛋白質を発現する個体を得ることが出来る。
2.シグナルペプチドやコドンユーセージの改良
今回オボアルブミン遺伝子の翻訳開始点にはヒトインターフェロンβのcDNAをノックインしている。したがってシグナルペプチドはヒトインターフェロンβのシグナルペプチドであり、ニワトリ卵管細胞に最適化しているものではない。ニワトリ卵管で高効率に分泌するためのシグナルペプチドとしては実際に卵管から分泌される蛋白質のシグナルペプチドが挙げられ、例えば卵白リゾチームのMRSLLILVLCFLPLAALGやオボトランスフェリンのMKLILCTVLSLGIAAVCFAなどが挙げられる。また、これに限らずニワトリ細胞で高効率に蛋白質を分泌できる人工または天然のシグナルペプチドでも良い。これらシグナルペプチドを目的蛋白質のN端に含む蛋白質をオボアルブミン遺伝子座にノックインすることでより高濃度の目的蛋白質生産が可能である。さらにノックインするcDNAの塩基配列をニワトリで用いられるコドン使用頻度に併せて最適化することで蛋白質生産の向上を図る事ができる。
3.挿入遺伝子数の増大
今回ノックインした遺伝子は1つだけであったが、複数個の遺伝子を転写、翻訳が可能な形で連結してノックインし、同時に発現させることで発現量を増大させることが出来る。複数個の遺伝子は単一の遺伝子であっても複数種の遺伝子であっても良く、数もいくつあっても良い。具体的には、遺伝子ノックインに際し、複数の遺伝子をIRESなどの配列を介在させて挿入することでより多くの転写、翻訳を行い、遺伝子産物を得ることが出来る。また、2Aペプチドなどを介在させて複数の蛋白質をオボアルブミンプロモーターの制御下に一度に発現させ、ペプチドを切断することでより多くの蛋白質生産が可能である。
ヒト抗体遺伝子の軽鎖遺伝子と重鎖遺伝子ならびにヒトI型コラーゲン遺伝子のα1とα2をそれぞれ2Aペプチドの遺伝子を介して連結し、ノックインしたニワトリは好ましい実施形態の1つである。
4.ノックアウトニワトリ卵の有効性
ホモ型のオボムコイドノックアウトニワトリはオボムコイドを分泌しないため、オボムコイドを含まない卵を生産する。オボムコイドは非常に強力なアレルゲン物質であり、加熱や酵素による分解によってもアレルゲン性を失わないことが知られている。オボムコイドを欠損した卵は当然オボムコイドによる強いアレルゲン性を持たないことから、低アレルギー性の卵として生食、加工食品、ワクチン製造、化粧品原料等卵を用いる全ての製造物のアレルギー性を大きく低減させるのに役に立つことが自明である。また、交配やゲノム編集された始原生殖細胞を用いることで外因性遺伝子の発現を卵白アレルゲンノックアウトニワトリの卵で行うことも可能であり、このようにして生産された外因性遺伝子産物は精製時のアレルゲン除去過程が容易になることが自明である。
オボムコイド以外の卵管特異的遺伝子をノックアウトした家禽卵は、同様にアレルギー性を大きく低減させるのに役に立つ。
Claims (12)
- オボアルブミン遺伝子プロモーターの制御下に外因性遺伝子がホモ又はヘテロでノックインされ、かつ、外因性遺伝子の発現産物が卵内で安定高発現しているノックイン家禽の卵であって、
前記外因性遺伝子がストップコドンを含み、オボアルブミン遺伝子のエクソン2に挿入されている、ノックイン家禽の卵。 - 請求項1に記載のノックイン家禽の卵であって、
前記外因性遺伝子が薬剤耐性遺伝子とともにオボアルブミン遺伝子のエクソン2に挿入されている、ノックイン家禽の卵。 - 請求項1または2に記載のノックイン家禽の卵であって、
前記外因性遺伝子の5’端が、オボアルブミンをコードする塩基配列における配列番号1(OVATg1)に示される塩基配列に相当する領域、または、配列番号24(OVATg2)に示される塩基配列に相当する領域に挿入されている、ノックイン家禽の卵。 - 請求項1〜3のいずれか一項に記載のノックイン家禽の卵であって、
前記外因性遺伝子によりコードされるタンパク質が、卵1個あたり1mg以上で含まれる、ノックイン家禽の卵。 - 請求項1〜4のいずれか一項に記載のノックイン家禽の卵であって、
前記外因性遺伝子の発現産物が濃厚卵白に優位に発現する、ノックイン家禽の卵。 - 請求項1〜5のいずれか一項に記載のノックイン家禽の卵であって、
前記外因性遺伝子が、インターフェロンβ、免疫グロブリン、または、コラーゲンをコードする遺伝子である、ノックイン家禽の卵。 - 請求項1〜6のいずれか一項に記載のノックイン家禽の卵であって、
前記外因性遺伝子がヒト由来の遺伝子である、ノックイン家禽の卵。 - オボアルブミン遺伝子のエクソン2に、ストップコドンを含む外因性遺伝子がホモ又はヘテロでノックインされたノックイン家禽の卵由来の濃厚卵白であって、
安定高発現している前記外因性遺伝子の発現産物を優位に含む、濃厚卵白。 - 外因性遺伝子の安定高発現により前記外因性遺伝子の発現産物を含む、ノックイン家禽の卵を作製する方法であって、
(a)家禽始原生殖細胞のオボアルブミン遺伝子のエクソン2に、ストップコドンを含む前記外因性遺伝子をノックインする工程と、
(b)前記家禽生殖細胞を用いて、前記オボアルブミン遺伝子のエクソン2に前記外因性遺伝子をホモ又はヘテロでノックインした雌家禽を作製する工程と、
(c)前記雌家禽から得られた前記外因性遺伝子を発現する家禽卵を得る工程と
を含む、方法。 - 請求項9に記載の外因性遺伝子の安定高発現により前記外因性遺伝子の発現産物を含む、ノックイン家禽の卵を作製する方法であって、
前記工程(a)が、(i)前記オボアルブミン遺伝子のエクソン2にある翻訳開始点の5’側領域、前記外因性遺伝子、薬剤耐性遺伝子ユニット、および、前記翻訳開始点の3’側領域を含むドナーコンストラクトと、(ii)標的配列、および、異なる薬剤耐性遺伝子ユニットを含むベクターとを用いて、前記外因性遺伝子をゲノム編集により導入する工程である、方法。 - 請求項10に記載の外因性遺伝子の安定高発現により前記外因性遺伝子の発現産物を含む、ノックイン家禽の卵を作製する方法であって、
前記工程(a)が、(i)オボアルブミン翻訳開始点の5’側2.8Kb、前記外因性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子ユニット、および、オボアルブミン翻訳開始点の3’側3.0kbを含むドナーコンストラクトと、(ii)前記標的配列としての配列番号24に示される塩基配列、および、ネオマイシン耐性遺伝子ユニットを含むベクターとを用いて、前記外因性遺伝子をCRISPRにより導入する工程である、方法。 - ノックイン家禽の卵より外因性遺伝子の発現産物を調製する方法であって、
請求項9〜11のいずれか一項に記載の方法における前記工程(c)の後に、(d)前記家禽卵から前記外因性遺伝子の発現産物を回収する工程をさらに含む、方法。
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