CN108138165A - 鸟类、鸟类的生产方法和鸟类的卵 - Google Patents

鸟类、鸟类的生产方法和鸟类的卵 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种鸟类，所述鸟类产下的卵在其基因组中不含人为导入的外来基因，并且卵类粘蛋白含量比野生型低。一种鸟类的生产方法，包括如下步骤：修饰步骤，用可编程的核酸内切酶切割鸟类的多能干细胞的卵类粘蛋白基因座并进行修饰；以及移植步骤，将修饰了卵类粘蛋白基因座的上述多能干细胞移植到鸟类的胚中。一种鸟类的卵，在其基因组中不含人为导入的外来基因，并且卵类粘蛋白含量比野生型低。

Description

鸟类、鸟类的生产方法和鸟类的卵
技术领域
本发明涉及鸟类、鸟类的生产方法和鸟类的卵。
背景技术
鸡蛋处于日本人食物过敏的原因食物的第1位。鸡蛋中的几种蛋白成为引起食物过敏的过敏原。作为鸡蛋中所含的过敏原，可以列举卵类粘蛋白、卵清蛋白、溶菌酶和卵转铁蛋白等。
为了不引起以鸡蛋作为原因食物的食物过敏，人们尝试着从鸡蛋中除去上述过敏原。想要从鸡蛋中除去过敏原，只要生产编码过敏原的基因被破坏的鸡即可。
非专利文献1中公开了一种基因修饰鸡，该基因修饰鸡是利用类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALEN)敲除了卵清蛋白基因。根据该基因修饰鸡，认为可获得不含卵清蛋白的鸡蛋。
现有技术文献专利文献
非专利文献1：Park TS,另外4名,“Targeted gene knockout in chickensmediated by TALENs.”,Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America,2014年,111(35),12716－12721.
发明内容
技术问题
即使是不含卵清蛋白的鸡蛋，在其卵白中也会含有10％左右的卵类粘蛋白。卵类粘蛋白是鸡蛋中过敏原性最强的蛋白质。由于卵类粘蛋白具有高度的物理化学稳定性，所以即使加热也可维持卵类粘蛋白的过敏原性。因此，根据上述非专利文献1中公开的方法，即使使鸡蛋中不含卵清蛋白、或者通过加热使卵清蛋白失活，也很难说会充分降低鸡蛋的过敏原性。
而且，在上述非专利文献1中，使用了原始生殖细胞。由于原始生殖细胞在产生过程中存在的个数很少，因此需要培养原始生殖细胞的技术。迄今为止，有人报道了多个原始生殖细胞的培养方法，但该报道仅限于几个研究机构，即使按照所报道的方法进行培养，也无法培养原始生殖细胞，因此存在着缺乏确定性的不良情形。
本发明鉴于上述实情而提出，其目的在于：提供一种能够充分降低卵的过敏原性的鸟类和鸟类的生产方法、以及过敏原性得到充分降低的鸟类的卵。
解决问题的方案
本发明人利用现有的同源重组法敲除了鸡的卵类粘蛋白基因。然而，在现有的同源重组法中，细胞的培养需要长时间，细胞受到损伤，核型可见异常。而且，即使将通过同源重组法得到的嵌合鸡彼此交配，也无法获得敲除了卵类粘蛋白基因的同源接合鸡。在该嵌合鸡所产的卵中含有来自受体基因组的卵类粘蛋白，卵的过敏原性没有充分降低。
因此，本发明人反复进行深入研究，通过应用基因组编辑技术，完成了本发明。即：
本发明的第1观点所涉及的鸟类，所产下的卵在其基因组中不含人为导入的外来基因，并且，卵类粘蛋白的含量比野生型低。
这种情况下，上述本发明的第1观点所涉及的鸟类，从其卵类粘蛋白基因座的5’末端数起，在第1～3个外显子的至少1个中可以包含终止密码子，或者
从其卵类粘蛋白基因座的5’末端数起，在第1个外显子中可以不含起始密码子。
另外，上述本发明的第1观点所涉及的鸟类，其卵类粘蛋白基因座中的信号序列可以被修饰。
另外，上述本发明的第1观点所涉及的鸟类可以是鸡。
本发明的第2观点所涉及的鸟类的生产方法包括以下步骤：
修饰步骤，使用可编程的核酸内切酶切割鸟类的多能干细胞的卵类粘蛋白基因座并进行修饰；以及
移植步骤，将修饰了卵类粘蛋白基因座的上述多能干细胞移植到鸟类的胚中。
这种情况下，上述可编程的核酸内切酶可以是类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator－like effector nuclease)。
另外，上述类转录激活因子效应物核酸酶可以是第1核酸酶和第2核酸酶，
上述第1核酸酶可以包含序列号4所示的氨基酸序列，
上述第2核酸酶可以包含序列号5所示的氨基酸序列。
另外，上述类转录激活因子效应物核酸酶可以是第3核酸酶和第4核酸酶，
上述第3核酸酶可以包含序列号6所示的氨基酸序列，
上述第4核酸酶可以包含序列号7所示的氨基酸序列。
另外，上述可编程的核酸内切酶可以是成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关蛋白(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat－CRISPRassociated protein)系统中的Cas9核酸酶。
另外，上述Cas9核酸酶可以在上述卵类粘蛋白基因座的包含序列号8所示核苷酸序列的区域切割双链DNA。
另外，上述Cas9核酸酶可以在上述卵类粘蛋白基因座的包含序列号9所示核苷酸序列的区域切割双链DNA。
另外，上述Cas9核酸酶可以在上述卵类粘蛋白基因座的包含序列号10所示核苷酸序列的区域切割双链DNA。
另外，上述Cas9核酸酶可以在上述卵类粘蛋白基因座的包含序列号11所示核苷酸序列的区域切割双链DNA。
另外，上述Cas9核酸酶可以在上述卵类粘蛋白基因座的包含序列号12所示核苷酸序列的区域切割双链DNA。
另外，上述Cas9核酸酶可以在上述卵类粘蛋白基因座的包含序列号13所示核苷酸序列的区域切割双链DNA。
另外，在上述修饰步骤中，可以修饰来自上胚层的多能干细胞的卵类粘蛋白基因座。
本发明的第3观点所涉及的鸟类的卵，在其基因组中不含人为导入的外来基因，并且，
卵类粘蛋白的含量比野生型低。
发明效果
根据本发明，能够充分降低卵的过敏原性。另外，根据本发明，可获得过敏原性充分降低的鸟类的卵。
附图说明
图1是显示在鸡的卵类粘蛋白基因座中从5’末端数起最初的外显子(外显子1)的核苷酸序列、第2个外显子(外显子2)的核苷酸序列、以及第3个外显子(外显子3)的核苷酸序列的图。
图2是显示在外显子1和外显子3中鉴定的TALEN识别区的图。
图3是显示以外显子1和外显子3为靶标的TALEN的相对切割活性的图。
图4是显示导入了以外显子3为靶标的TALEN表达载体的来自上胚层的多能干细胞的基因组中的靶区的核苷酸序列的图。
图5是显示以外显子3为靶标的TALEN和以外显子1为靶标的高活性型TALEN的相对切割活性的图。
图6是显示TALEN表达载体的构成的图。
图7是显示鸡细胞内的TALEN的相对切割活性的图。
图8是显示通过TALEN表达载体向来自上胚层的多能干细胞中导入突变的图。(A)显示基因组PCR(聚合酶链反应)的结果。(B)显示Cel－I测定的结果。
图9是显示克隆的卵类粘蛋白基因座的核苷酸序列的一部分和由该核苷酸序列编码的氨基酸序列的图。(A)、(B)和(C)显示获得了敲除突变的克隆。(D)显示野生型。
图10是显示克隆化的具有敲除突变的来自上胚层的多能干细胞株的集落的图。
图11是显示克隆化的具有敲除突变的来自上胚层的多能干细胞株和野生型中的卵类粘蛋白基因座的一部分核苷酸序列的图。
图12是显示克隆化的具有敲除突变的来自上胚层的多能干细胞株的卵类粘蛋白基因座的核苷酸序列的一部分以及由该核苷酸序列编码的氨基酸序列和由野生型卵类粘蛋白基因座的核苷酸序列编码的氨基酸序列的一部分的图。(A)显示来自上胚层的多能干细胞株#4的核苷酸序列和氨基酸序列。(B)显示来自上胚层的多能干细胞株#5和#5－3的核苷酸序列和氨基酸序列。
图13是显示由具有敲除突变的来自上胚层的多能干细胞株生产的敲除嵌合鸡的照片的图。(A)显示来自多能干细胞株#5的嵌合鸡，所述多能干细胞株#5来自上胚层。(B)显示来自多能干细胞株#4的嵌合鸡，所述多能干细胞株#4来自上胚层。
图14是显示卵类粘蛋白敲除用CRISPR/Cas9载体的构成的图。
图15是显示插入到卵类粘蛋白敲除用CRISPR/Cas9载体中的各寡DNA的核苷酸序列的图。
图16是显示卵类粘蛋白敲除用CRISPR/Cas9载体在HEK293细胞内的相对切割活性的图。
图17是显示卵类粘蛋白敲除用CRISPR/Cas9载体在来自上胚层的多能干细胞内的相对切割活性的图。
具体实施方式
对本发明的实施方式进行说明。此外，本发明并不受下述实施方式和附图的限定。
(实施方式1)
首先，对实施方式1进行说明。实施方式1所涉及的鸟类产下的卵在其基因组中不含人为导入的外来基因、并且卵类粘蛋白的含量比野生型低。
对鸟类没有特别限定，例如有鸡、鸭、火鸡、野鸭、雁、鹌鹑、野鸡、鹦鹉、雀、鹰、鸵鸟、鸸鹋和鹤鸵等。优选鸟类为鸡。对鸡的品种没有特别限定，例如可以列举白色来航鸡(White Leghorn)、棕色来航鸡(Brown Leghorn)、芦花岩鸡(Barred-Rock)、苏塞克斯鸡(Sussex)、新罕布什尔鸡(New Hampshire)、罗得岛鸡(Iihode Island)、澳洲黑鸡(Australorp)、米诺卡鸡(Minorca)、Amrox鸡、加利福尼亚灰鸡(California Gray)、意大利鹧鸪斑鸡(Italian Partidge coloured)和韩国Oge鸡等。
在本实施方式所涉及的鸟类的基因组中，不包含人为导入的外来基因。这里的“人为导入的外来基因”是指，通过基因重组技术等人为导入的、具有突变的基因和该鸟类的基因组中本来就不包含的基因。作为人为地向基因组中导入外来基因的方法，可以列举同源重组法、反转录病毒载体法、慢病毒载体法和人工病毒载体法等。在上述鸟类的基因组中，不包含通过这些方法导入的外来基因。
卵类粘蛋白是分子量约28000的耐热性糖蛋白。卵类粘蛋白由输卵管的分泌细胞产生。卵类粘蛋白通常主要包含在鸟类的卵的卵白中。卵类粘蛋白例如占鸡蛋的卵白中所含蛋白的约11重量％。在本实施方式的鸟类所产下的卵中卵类粘蛋白的含量较相同种类的鸟类的野生型的卵相比有所降低。这里，野生型是指基因未经人为修饰的与上述鸟类相同种类的鸟类。
卵内的卵类粘蛋白的含量可以利用检测靶标蛋白的已知方法进行定量。例如，以由从野生型的卵和本实施方式的鸟类所产下的卵采集的卵白制备的样品为对象，在蛋白质印迹法中，通过使用与卵类粘蛋白结合的抗体对其进行免疫染色，根据谱带的颜色深度可以比较卵类粘蛋白的含量。
为了确保定量性，卵类粘蛋白的含量优选通过夹层ELISA(Enzyme－LinkedImmunoSorbent Assay)来测定。夹层ELISA中使用的捕获抗体和检测抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。例如，作为捕获抗体和检测抗体，分别可以列举兔抗卵类粘蛋白抗体和小鼠抗卵类粘蛋白抗体。
作为兔抗卵类粘蛋白抗体，只要使用从经卵类粘蛋白免疫的兔中回收抗血清、再通过使用了卵类粘蛋白的亲和层析进行纯化而获得的多克隆抗体即可。另一方面，作为小鼠抗卵类粘蛋白抗体，只要使用通过使用了小鼠脾细胞的细胞融合法建立抗卵类粘蛋白的单克隆抗体产生性杂交瘤、再由腹水抗体进行纯化而获得的小鼠抗卵类粘蛋白抗体即可。对检测抗体没有特别限定，只要用过氧化物酶标记即可。用过氧化物酶进行标记时，卵类粘蛋白可以根据TMB(3,3’,5,5’－四甲基联苯胺)的显色来定量。卵类粘蛋白的含量可以根据样品中的浓度进行评价。通过构建适当的夹层ELISA，可以按照50pg/ml左右的检测界限对卵类粘蛋白定量。
通过以上述方式定量卵类粘蛋白的含量，能够确认本实施方式所涉及的鸟类产下的卵中的卵类粘蛋白含量较相同种类的鸟类的野生型有所降低。例如，本实施方式所涉及的鸟类产下的卵中的卵类粘蛋白含量为相同种类的鸟类的野生型的卵中的卵类粘蛋白含量的95重量％以下、80重量％以下、60重量％以下、40重量％以下、20重量％以下、10重量％以下或5重量％以下。此外，本实施方式所涉及的鸟类产下的卵，在定量其卵类粘蛋白时，卵类粘蛋白的浓度可以在检测界限以下。特别是，当本实施方式所涉及的鸟类为鸡时，该鸡所产的鸡蛋的卵白蛋白中的卵类粘蛋白可以是0～8重量％、0～4重量％、0～3重量％、0～2重量％或0～1重量％。此外，卵类粘蛋白的含量可以根据每单位量的卵白的卵类粘蛋白的重量来进行评价。
特别优选在本实施方式所涉及的鸟类产下的卵中不含卵类粘蛋白。此外，不含卵类粘蛋白是指不含野生型的卵的卵白中所含的卵类粘蛋白。因此，不含卵类粘蛋白的卵也包括含有非全长的卵类粘蛋白片段的卵。
在本实施方式所涉及的鸟类基因组中的卵类粘蛋白基因座中，存在着卵类粘蛋白未表达的敲除突变、或者全长卵类粘蛋白无法表达的突变，因此卵类粘蛋白没有正常表达。该突变是任意的，只要卵类粘蛋白没有正常表达即可，具体而言，优选在卵类粘蛋白基因座内的外显子中插入终止密码子。
卵类粘蛋白基因座中包含5个外显子。从5’末端开始计数以最初的外显子起依次作为外显子1～5时，终止密码子只要插入在外显子1～5的任意位置上即可。更优选上述鸟类在卵类粘蛋白基因座的外显子1～3的至少1个外显子中包含终止密码子。当卵类粘蛋白基因座内的外显子1～5中插入有终止密码子时，卵类粘蛋白没有完全合成，全长卵类粘蛋白没有表达。根据终止密码子所插入的位置，虽然作为一部分卵类粘蛋白的片段得以表达，但在卵类粘蛋白的片段的抗原决定部位(epitope)较全长卵类粘蛋白有所减少时，能够降低过敏原性。
另外，该突变可以是卵类粘蛋白基因座内的起始密码子的突变。当卵类粘蛋白基因座内的起始密码子存在突变时，只要根据mRNA来进行卵类粘蛋白的合成即可。例如，上述鸟类在卵类粘蛋白基因座的外显子1中不含起始密码子。
优选上述鸟类的卵类粘蛋白基因座中的信号序列被修饰。卵类粘蛋白基因座中的信号序列包含外显子1的一部分核苷酸序列和外显子2的一部分核苷酸序列，编码25个残基的氨基酸。图1显示外显子1、外显子2和外显子3的核苷酸序列。在图1中，外显子的碱基用大字显示，而内含子的碱基用小字显示。图1所示下划线的核苷酸序列为信号序列。不仅是全长卵类粘蛋白不表达、为了使卵类粘蛋白的片段也不表达，在信号序列的修饰中，可以向作为起始密码子的ATG中导入突变，也可以导入在信号序列中产生终止密码子的突变。优选终止密码子包含在卵类粘蛋白基因座的外显子1中。此外，外显子1、外显子2和外显子3的核苷酸序列分别如序列号1、序列号2和序列号3所示。
如上所述，上述鸟类在其基因组中不含人为导入的外来基因。因此，在卵类粘蛋白基因座已被修饰的上述鸟类的生产中，没有采用将外来基因取代成基因组上的特定基因的同源重组法，而是优选采用下面详述的基因组编辑技术。
如以上详细说明的那样，本实施方式所涉及的鸟类由于卵类粘蛋白没有正常表达，所以产下卵类粘蛋白含量比野生型低的卵。在卵过敏的检查中，除卵黄和卵白以外，即使仅独立检查卵类粘蛋白，卵类粘蛋白的过敏原性也高。因此，卵类粘蛋白含量较野生型少的卵能够充分降低卵的过敏原性。
另外，上述鸟类在其基因组中不含人为导入的外来基因。由于不含外来基因，所以能够防止非预期的表现型和毒性的出现。另外，由于不含外来基因，所以能够极力避免损害上述鸟类中的生殖遗传的确定性。
另外，由于卵类粘蛋白具有高度的物理化学稳定性，所以即使在实施了加热处理的包含鸟类卵白的加工食品或疫苗等中，也可维持卵类粘蛋白的过敏原性。因此，本实施方式所涉及的卵类粘蛋白含量比野生型低的卵作为加工食品和疫苗等各种制品的原料也是有用的。
另外，上述鸟类可以在其卵类粘蛋白基因座的外显子1～3的至少1个外显子中包含终止密码子。当外显子3中包含终止密码子时，所分泌的卵类粘蛋白的片段的抗原决定部位较全长卵类粘蛋白少，因此能够降低过敏原性。特别是，由于在卵类粘蛋白基因座的外显子1中包含终止密码子，所以本实施方式所涉及的鸟类能够产下不仅不含全长卵类粘蛋白、就连卵类粘蛋白的片段也完全不含的卵。另外，在卵类粘蛋白基因座的外显子1中不含起始密码子的情况下，由于无法根据mRNA进行卵类粘蛋白的合成，所以上述鸟类能够产下不含卵类粘蛋白的卵。
另外，上述鸟类其卵类粘蛋白基因座中的信号序列可以被修饰。由于信号序列所对应的信号肽在细胞的内质网内被切割而没有分泌，所以当信号序列中包含终止密码子时，能够防止来自卵类粘蛋白基因座的肽分泌到卵白中。其结果，能够进一步降低由卵类粘蛋白引起的过敏原性。
此外，本实施方式所涉及的鸟类优选为鸡。由于鸡会产下需求大的鸡蛋，所以能够高效地供给充分降低了过敏原性的鸡蛋。在供给食用的卵方面，除了鸡以外，还优选鹌鹑等。
此外，卵类粘蛋白基因座中的突变可以是引起向卵类粘蛋白基因座内的外显子中移码的突变等。
在另一实施方式中，提供一种鸟类的卵，该鸟类的卵在其基因组中不含人为导入的外来基因、且卵类粘蛋白的含量比野生型低。特别是，鸡蛋被广泛用作点心、饮料、加工食品等的原料，或者用于制造疫苗等药品。使用该实施方式所涉及的鸡蛋时，即使卵类粘蛋白混入了各种制品中，也能够减轻卵类粘蛋白的过敏原性。而且，在使用不含卵类粘蛋白的鸟类的卵时，能够极力抑制过敏原性最强的卵类粘蛋白混入各种制品中的风险。
(实施方式2)
接下来，对实施方式2进行说明。在实施方式2中，对上述实施方式1所涉及的鸟类所适合的鸟类的生产方法进行说明。
在生产产下卵类粘蛋白的含量比野生型低的卵的鸟类时，需要生产卵类粘蛋白基因座已被修饰的鸟类。为了生产修饰了基因的基因修饰动物，必需修饰一细胞期受精卵的基因组，再由所得个体筛选导入有目标突变的个体。因此，在基因修饰动物的生产中，需要在体外操作受精卵，由受精卵产生个体。例如，在小鼠和大鼠中，可由1个雌个体得到多个未受精卵。因此，在体外受精后产生受精卵直到一细胞期为止，修饰基因组，将受精卵放回雌个体的卵巢中，从而可以制作多个个体。
另一方面，鸟类的体外受精技术尚未确立。另外，由1只产卵的鸟类只能得到1个一细胞期受精卵。而且，难以特定输卵管内所存在的一细胞期受精卵。出于上述理由，难以对鸟类的受精卵应用基因修饰技术。因此，为了生产基因已被修饰的鸟类，使用具有多能性或生殖细胞分化能力的多能干细胞代替受精卵。
因此，本实施方式所涉及的鸟类的生产方法包括以下步骤：修饰步骤，用可编程的核酸内切酶(programmable endonuclease)切割鸟类的多能干细胞的卵类粘蛋白基因座并进行修饰；以及移植步骤，将修饰了卵类粘蛋白基因座的上述多能干细胞移植到鸟类的胚中。
首先，对上述修饰步骤进行详细说明。作为鸟类的多能干细胞，例如可以列举具有多能性和生殖细胞分化能力的胚性干细胞(ES细胞)。鸟类的ES细胞例如是来自上胚层的多能干细胞(来自上胚层的干细胞(epiblast－derived stem cell)，以下还仅称作“epiSC”)，其可由从受精卵的上胚层分离的胚盘细胞建立。当为鸡时，Eyal－Giladi andKochav的产生阶段(I～XIV)中的阶段X的胚盘包含上胚层。鸡的epiSC例如按照公知方法在支持细胞上培养由上胚层分离的胚盘细胞而获得，所述支持细胞通过照射或者丝裂霉素C处理而停止了细胞增殖。作为支持细胞，可以列举鸡胚成纤维细胞、小鼠胚成纤维细胞和来自小鼠胚成纤维细胞的细胞株等。
此外，在具有多能性和生殖细胞分化能力方面，可以利用原始生殖细胞。原始生殖细胞例如可以按照公知的方法由鸟类的胎儿性腺分离。此外，下面对修饰步骤中使用了epiSC的情形进行说明。
在卵类粘蛋白基因座的修饰中，利用可编程的核酸内切酶在特定部位切割例如epiSC的基因组上的卵类粘蛋白基因座。可编程的核酸内切酶在能够特异性修饰(删除、取代、插入)基因组的靶部位的、所谓的基因组编辑技术中使用。可编程的核酸内切酶是根据靶标DNA的核苷酸序列设计的，能够用任意的核苷酸序列切割DNA。对可编程的核酸内切酶没有特别限定，例如有TALEN、锌指核酸酶(ZFN)和CRISPR－Cas(成簇规律间隔短回文重复序列和Crisper相关蛋白(Clustered Regularly Interspaced Short PalindromicRepeat and Crisper associated protein))系统(也称作“CRIPPR/Cas9”)中的Cas9核酸酶等。
TALEN和ZFN是包含DNA结合结构域和DNA切割结构域的多肽。TALEN和ZFN在DNA结合结构域的结合位点一对DNA切割结构域接近而形成二聚物，从而切割双链DNA。DNA结合结构域重复包含多个DNA结合模块，各DNA结合模块识别DNA的特定碱基对，因此通过适当设计DNA结合模块，能够特异性地切割卵类粘蛋白基因座的作为靶标的核苷酸序列。
在CRISPR－Cas系统中使用向导RNA和Cas9核酸酶，所述向导RNA具有与基因组上的PAM序列所相邻的与靶标核苷酸序列互补的核苷酸序列。向导RNA包含与靶标核苷酸序列互补的CRISPR RNA(crRNA)和辅助的tracrRNA。Cas9核酸酶在从PAM序列起5’末端侧的靶标核苷酸序列所构成的区域切割双链DNA，所述Cas9核酸酶识别与卵类粘蛋白基因座的作为靶标的核苷酸序列结合的向导RNA。
利用可编程的核酸内切酶切割双链DNA是导致多个遗传信息的损失或者癌化的原因，因此在细胞内非常迅速地被修复。在作为修复的主要路径之一的、使被切割的末端彼此连接的非相同末端结合修復时，以高概率在基因组的核苷酸序列中加入突变(缺失或插入)。因此，在使用TALEN时，在卵类粘蛋白基因座中想要修饰的位点的5’末端侧和3’末端侧分别存在TALEN，只要根据通过DNA结合模块识别的区域的核苷酸序列(效应物序列)来设计TALEN即可。适用于卵类粘蛋白基因座中想要修饰的位点的效应物序列例如可以通过“TALEN Targeter”(https：//tale－nt.cac.cornell.edu/)等进行特定。另外，在使用CRISPR－Cas系统时，例如只要通过“CRISPR direct”(http：//crispr.dbcls.jp/)特定卵类粘蛋白基因中的靶标核苷酸序列即可。
在修饰步骤中，例如只要通过显微注射法、电穿孔法、磷酸钙法和脂质转染法等公知的方法将表达可编程的核酸内切酶的载体导入epiSC中即可。例如，将表达作为可编程的核酸内切酶的TALEN的载体导入epiSC中时，使用根据基因组DNA的各个双链的作为靶标的核苷酸序列设计的表达TALEN的载体。在使用CRISPR－Cas系统作为可编程的核酸内切酶时，只要将表达向导RNA和Cas9核酸酶的载体同样地导入epiSC中即可。
在卵类粘蛋白基因座的修饰中，只要以不表达卵类粘蛋白的方式，向卵类粘蛋白基因座的任意位点、优选外显子1～3中的至少1个外显子或者信号序列中导入突变即可。优选根据该突变使外显子1～3中的至少1个外显子包含终止密码子、或者使外显子1不包含起始密码子即可。因此，只要以切割外显子1～3中的至少1个外显子或信号序列的方式设计可编程的核酸内切酶即可。根据切割位点附近的核苷酸序列，按照公知的方法设计可编程的核酸内切酶。
具体而言，TALEN有TALEN左(第1核酸酶)和TALEN右(第2核酸酶)。在切割外显子1时，例如TALEN左和TALEN右分别包含序列号4和序列号5所示的氨基酸序列。另外，在切割外显子3时，例如TALEN左(第3核酸酶)和TALEN右(第4核酸酶)分别包含序列号6和序列号7所示的氨基酸序列。
此外，当TALEN左具有特异性地切割靶标核苷酸序列的核酸酶活性时，可以包含在序列号4或序列号6所示氨基酸序列中有1个或多个氨基酸发生缺失、取代或添加而获得的氨基酸序列。当TALEN右也具有特异性地切割靶标核苷酸序列的核酸酶活性时，也可以包含在序列号5或序列号7所示氨基酸序列中有1个或多个氨基酸发生缺失、取代或添加而获得的氨基酸序列。
另一方面，在CRISPR－Cas系统中，例如，在切割外显子1时，Cas9核酸酶只要在包含卵类粘蛋白基因座的序列号8～11的任一个所示的核苷酸序列的区域中切割双链DNA即可。另外，在切割外显子2时，Cas9核酸酶只要在卵类粘蛋白基因座的包含序列号12或序列号13所示的核苷酸序列的区域中切割双链DNA即可。
为了将向导RNA导入epiSC内，优选使用表达向导RNA的寡DNA。寡DNA的核苷酸序列根据靶标核苷酸序列来确定。当Cas9核酸酶切割包含序列号8所示核苷酸序列的区域时，在epiSC内表达向导RNA的寡DNA的正义核苷酸序列包含序列号14所示的核苷酸序列，而该寡DNA的反义核苷酸序列包含序列号15所示的核苷酸序列。此外，当Cas9核酸酶切割的区域的核苷酸序列为序列号9、序列号10和序列号11中的任一个所示的核苷酸序列时，作为寡DNA的正义和反义核苷酸序列中所含的核苷酸序列的组合，分别可以列举序列号16和序列号17、序列号18和序列号19、以及序列号20和序列号21。另外，当Cas9核酸酶切割的区域的核苷酸序列为序列号12和序列号13中的任一个所示的核苷酸序列时，作为上述寡DNA的正义和反义核苷酸序列中所含的核苷酸序列的组合，分别可以列举序列号22和序列号23、以及序列号24和序列号25。
在上述修饰步骤中卵类粘蛋白基因座是否已被修饰，这可以通过分析epiSC的基因组上的卵类粘蛋白基因座的核苷酸序列来判定。例如，只要在导入可编程的核酸内切酶后，从稳定增殖的epiSC中回收基因组DNA，再分析卵类粘蛋白基因座的核苷酸序列即可。
此外，为了高效率地获得具有以不表达卵类粘蛋白的方式修饰的基因组的嵌合个体，可以筛选在卵类粘蛋白基因座中导入有卵类粘蛋白基因未表达的敲除突变的epiSC。另外，为了将导入了表达可编程的核酸内切酶的载体的细胞浓缩，可以将瞬时表达嘌呤霉素等耐药性基因的表达系统导入epiSC内。
接着，对移植步骤进行详细说明。在移植步骤中，将修饰了卵类粘蛋白基因座的epiSC移植到鸟类的胚中。对移植操作没有特别限定，只要使用细管向鸟类的胚中注入epiSC即可。
具体而言，在移植步骤中，例如，只要将以未表达卵类粘蛋白的方式修饰了卵类粘蛋白基因座的epiSC移植到照射了γ射线的刚刚产卵后的受精卵胚的胚盘中即可。此时，通过使用与epiSC系统的羽毛颜色不同的系统的受体，根据羽毛颜色能够容易地判别嵌合个体。例如，在生产嵌合鸡时，优选将雏鸡中黑羽毛的来自横斑普利茅斯洛克种的epiSC移植到雏鸡中白羽毛的白色来航种的胚中。
在移植步骤之后，通过孵化含有移植了epiSC的胚的卵，能够生产嵌合个体。当为鸡时，孵化期间为约20天。在嵌合个体中会形成具有基因组的精子和卵子，所述基因组包含已修饰的卵类粘蛋白基因座。因此，通过将嵌合个体交配，以高概率生产基因修饰鸟类，其继承了通过同源接合具有已修饰的卵类粘蛋白基因座的基因组。由于该基因修饰鸟类的卵类粘蛋白基因座被修饰，所以在基因修饰鸟类所产的卵中卵类粘蛋白的含量比野生型低、或者在基因修饰鸟类所产的卵中不含卵类粘蛋白。
此外，如上所述，基因修饰鸟类可以根据羽毛颜色来识别。另外，基因修饰鸟类还可以通过DNA印迹等分析其基因组DNA的核苷酸序列来判别。
如以上详细说明的那样，在本实施方式所涉及的鸟类的生产方法中，用可编程的核酸内切酶切割鸟类的多能干细胞的卵类粘蛋白基因座并进行修饰，因此可以获得没有正常表达卵类粘蛋白的鸟类。由于该鸟类的基因组进行生殖遗传，所以在该鸟类所产的卵中卵类粘蛋白的含量比野生型低、或者在该鸟类所产的卵中不含卵类粘蛋白。由此，可以充分降低卵的过敏原性。
另外，在本实施方式中的修饰步骤中，可以修饰epiSC的卵类粘蛋白基因座。epiSC可以容易地由通过一个胚得到约6万个的胚盘细胞建立，并且维持多能性不变而可以稳定地进行培养，所以能够更确定地修饰卵类粘蛋白基因座。
实施例
通过以下的实施例，进一步具体说明本发明，但本发明并不受实施例的限定。
实施例1：TALEN表达载体的制作
(卵类粘蛋白的靶标序列的选定)
为了通过TALEN向卵类粘蛋白基因内导入突变，以卵类粘蛋白的外显子1、外显子2和外显子3的核苷酸序列为对象，通过TALEN Targeter检索了效应物序列。其结果，如图2的带下划线的区域所示，在外显子1和外显子3的核苷酸序列中分别看到了1组效应物序列。此外，在外显子2中没有看到效应物序列。
(TALEN表达载体的制作和TALEN的切割活性的研究)
首先，按照6－模块组装法进行可与外显子1和外显子3中的各效应物序列结合的模块的构建，在外显子1和外显子3中分别制作了两种金门TALEN表达载体(左和右)。金门TALEN表达载体(以下还仅称作“G－TALEN表达载体”)是使用金门TALEN和TAL效应物试剂盒2.0以及Yamamoto Lab TALEN Accessory Pack(均可由Addgene公司获取)，按照试剂盒所附带的操作规则制作的。
接下来，为了研究TALEN的切割活性，进行了使用HEK293细胞的单链退火(SSA,single-strand annealing)测定。在SSA测定中，如下所述，将具有作为TALEN的靶标的核苷酸序列的报告载体和G－TALEN表达载体一同导入HEK293细胞中，由报告活性测定切割活性。
通过在Yamamoto Lab TALEN Accessory Pack所含的pGL4－SSA中插入已退火的合成寡DNA，制作了报告载体。首先，对pGL4－SSA进行BsaI处理，不进行脱磷酸化即进行电泳，之后进行切割。关于外显子1，已插入的合成寡DNA中所含的正义寡DNA和反义寡DNA的核苷酸序列分别见序列号26和序列号27。关于外显子3，已插入的合成寡DNA中所含的正义寡DNA和反义寡DNA的核苷酸序列分别见序列号28和序列号29。
这里，合成寡DNA退火的溶液的详细内容如下所示。
10×缓冲液1μl(400mM的Tris－HCL(pH8)、200mM的MgCl2、500mM的NaCl)
正义寡DNA(50μM)1μM
反义寡DNA(50μM)1μM
灭菌蒸馏水7μM
将上述退火的溶液在95℃下维持5分钟，之后用90分钟冷却至25℃，从而将合成寡DNA退火。
接下来，将已退火的合成寡DNA插入到进行了BsaI处理的pGL4－SSA中。将亚克隆的产物进行小型培养，用KpnI进行处理时，呈现3800bp和1800bp这两条谱带，确认插入了合成寡DNA。
接下来，按照以下顺序进行报告载体的序列分析。对报告载体进行NarI处理后进行电泳，切取凝胶，回收凝胶片段至微型管中。将其在深度冷冻器中放置10分钟左右，使其完全冻结，之后用手指温热使其融化，使用离心机进行旋降。取6～8μl左右的渗出液体，用作序列的模板。
序列分析的引物使用Luc2－up－F(序列号30)或Luc2－down－R(序列号31)。在确认插入了正确的核苷酸序列之后，使用转染级Miniprep试剂盒纯化报告载体，定量浓度，制备成150ng/μl。
将混合有以下4种质粒的DNA溶液转染到HEK293细胞中。
使用直径为10cm的培养用皿，在70～80％的融合中培养HEK293细胞。向微型管中分别注入必需量的DNA稀释用无血清Dulbecco’s改良Eagle’s培养基(以下记作“DMEM”)和Lipofectamine LTX稀释用无血清DMEM。在96孔板的各孔中加入25μl DNA稀释用无血清DMEM，在各孔中分别加入4～8μl的上述DNA溶液，进行混合。在LTX稀释用无血清DMEM中加入LTX使达到0.7μl/孔(25μl)，进行悬浮，并立即向各孔中分别加入25μl进行混合。反复进行必需根数分的上述操作。从培养用皿的细胞中除去培养基，加入15％的胎牛血清(fetalbovine serum、以下记作“FBS”)/DMEM，在培养用皿上直接吸移，将细胞悬浮。使用血细胞计数器计测细胞数，共计为6×105细胞/ml。
向最初的孔中加入LTX，经过30分钟后向各孔中分别加入100μl所准备的细胞，在37℃的CO2培养箱中进行培养。在转染的24小时后，使用Dual－Glo萤光素酶测定系统(Dual－Glo Luciferase Assay System)(Promega公司制造)，按照操作说明书进行萤光素酶的活性测定。
(结果)
图3显示通过SSA测定得到的G－TALEN表达载体的切割活性。阳性对照TALEN是以HPRT1为靶标而制作的具有充分的切割活性的TALEN表达载体。相对活性是指使用HEK293细胞测定HPRT1的切割活性、并以该测定值作为1时的相对值。阴性对照显示向不含靶标序列的HEK293细胞中导入了G－TALEN表达载体时的相对活性值。如图3所示，在以外显子1为靶标的G－TALEN表达载体中没有确认到切割活性，而只在以外显子3为靶标的G－TALEN表达载体中确认了切割活性。
实施例2：使用G－TALEN表达载体向鸡epiSC中导入突变和通过Cel－I测定确认突变的导入
向鸡epiSC中导入突变时，使用确认了切割活性的以外显子3为靶标的G－TALEN表达载体。
(鸡epiSC的培养)
首先，按照下述顺序从刚刚产卵后的新鲜受精卵中分离胚盘细胞。使用蛋清分离器完全除去卵白后，将受精卵静置在塑料制皿中，使胚盘位于卵黄的上部。将已灭菌干燥的滤纸环(在滤纸上开直径为5mm的孔，沿其外轮用剪刀剪成圆形而得到的环)粘附在受精卵上，使胚盘位于中央。沿滤纸环的外缘插入剪刀(两头尖的小直剪刀)，将每个卵黄膜上的胚盘剪成圆形。接着，使用小镊子将滤纸慢慢地倾斜上提，尽可能地除去附着在滤纸环上的卵黄。此时，形成在滤纸环上粘附有上胚层的状态。
然后，使卵黄侧朝上，将滤纸环浸在装有灭菌PBS(磷酸缓冲盐)的皿中，慢慢地摇晃滤纸环，除去所附着的卵黄。将滤纸环转移到另外准备的装有灭菌PBS的皿中，稍稍剧烈摇晃，使胚盘细胞从滤纸环上分离呈圆盘状。已分离的胚盘细胞通过微量吸液管回收到1.5ml的管中。
接下来，在事先准备好的支持细胞上培养已分离的胚盘细胞。使用来自小鼠胚成纤维细胞的细胞株(STO细胞)作为支持细胞。下面对支持细胞的准备进行说明。
将STO细胞接种在直径为10cm的培养用皿中。培养液为10％FBS(胎牛血清)－DMEM(Dulbecco’s改良Eagle培养基)。培养是在5％CO2、37℃的条件下进行。STO细胞经过约3天的培养达到融合，用冷PBS清洗3次，之后用0.025％的胰蛋白酶、0.02％的EDTA 2Na－PBS剥离细胞，将其接种在直径为15cm的培养用皿中。细胞达到融合后，在培养液中加入丝裂霉素C使其以终浓度计算达到10μg/ml，培养细胞2小时。用冷PBS清洗5次，使用0.025％的胰蛋白酶、0.02％的EDTA 2Na－PBS剥离细胞，至少进行3次离心清洗。使用血细胞计数器算出细胞数。
在支持细胞的培养中，使用直径为6cm的培养用皿的明胶包被。明胶包被液在使用前添加到蒸馏水中使明胶达到0.1％，之后使用高压釜进行溶解、灭菌。在培养支持细胞的至少2小时前，培养用皿处于底面浸在明胶包被液中的状态，在37℃下进行包被。除去明胶包被液后，将上述丝裂霉素C处理过的支持细胞在10％FBS－DMEM中调整、接种，使每个直径为6cm的培养用皿中有2～3×105个细胞。支持细胞在接种后第二天起在5日以内使用。
(向鸡epiSC中导入突变)
使用1个接种有支持细胞的培养用皿培养由一个胚分离的胚盘细胞。胚盘细胞的培养中使用的培养基的组成见表1。此外，该培养基以表1的KnockOut－DMEM为基础，重组鸡白血病抑制因子(recombinant chicken LIF)在临使用前添加在已加热的所需最低限量的培养基中。
这里，对重组鸡LIF的制备方法进行说明。使用含有10％FBS(Hyclone；ThermoFisher Scientific公司制造)、100μg/ml的青霉素和70μg/ml的链霉素的低葡萄糖DMEM(Invitrogen公司制造)，在5％CO2中、在37℃下培养鸡胚细胞株CHCC－OU2。通过使用了序列号32所示正向引物和序列号33所示反向引物的PCR扩增LIF的编码区。将PCR产物用Nhe I和Sal I进行处理，并亚克隆到含有组氨酸标签的pSecTag2A质粒(Invitrogen公司制造)中。
接下来，使用限制酶从pSecTag2A质粒中除去myc－决定部位。使用Polyfect转染试剂(Qiagen公司制造)将重组质粒导入CHCC－OU2中，使用含有0.25μg/ml的Zeocin(Invitrogen公司制造)的培养基筛选细胞。筛选具有生物学活性的分泌LIF的稳定细胞株，使用ProBond树脂(Invitrogen公司制造)从培养上清中纯化重组鸡LIF。
[表1]
使用FuGENE HD(Promega公司制造)向在支持细胞上培养胚盘细胞2～3天而得到的epiSC中导入6.5μg的G－TALEN表达载体。在导入G－TALEN表达载体的24小时后，以2μg/mL的浓度向培养基中添加嘌呤霉素，培养48小时。48小时后，进行培养基交换以从培养基中除去嘌呤霉素，培养约10天直至epiSC稳定增殖。
使用DNeasy血液&组织试剂盒(QIAGEN公司制造)，从稳定增殖的epiSC中回收基因组DNA，进行基因组PCR。基因组PCR的条件如下：以94℃下2分钟、之后是98℃下10秒、68℃下30秒和72℃下2分钟作为1个循环，进行35个循环。基因组PCR中使用的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如序列号34和序列号35所示。
(Cel－I测定)
接着，将PCR产物进行再杂交，利用surveyor核酸酶进行处理，进行在异源双链部分切割的Cel－I测定。在Cel－I测定中使用SURVEYOR(商标)突变检测试剂盒(Transgenomic公司制造)。使用Wizard SV Gel和PCR Clean－up系统(Promega公司制造)来纯化PCR产物。使用15μl进行DNA的洗脱，洗脱后定量DNA浓度。
接下来，按照以下的组成制备Cel－I测定用DNA溶液。
PCR产物400ng
10×杂交缓冲液(100mM Tris－HCl(pH8.5)、750mM KCl、15mM MgCl2)0.8μl使用灭菌蒸馏水制备成8μl
将上述DNA溶液在95℃下维持5分钟，用60～90分钟冷却至25℃。
在该DNA溶液中加入0.4μl的增强子S和0.4μl的核酸酶S，充分吸移，在42℃下培养30分钟。反应后，立即使用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶将全量进行电泳。
(结果)
在Cel－I测定中，没有得到显示突变导入的明确的谱带。另一方面，在分析PCR产物的核苷酸序列时，如图4所示，在靶区确认了添加1个碱基和取代1个碱基这两种突变(参照下划线)。然而，这些突变均不是产生终止密码子的突变。
实施例3：铂门TALEN表达载体的制作和切割活性的评价
制作了以上述外显子1的核苷酸序列为靶标的高活性型TALEN即铂门TALEN(以下还仅称作“P－TALEN”)表达载体。按照6－模块组装法构建可与上述外显子1中的效应物序列结合的模块，相对于外显子1制作了P－TALEN表达载体(左和右)。P－TALEN表达载体是使用铂门TALEN试剂盒和Yamamoto Lab TALEN Accessory Pack(可均由Addgene公司获取)，按照试剂盒所附带的操作规则制作的。按照与上述相同的方式，通过SSA测定评价了P－TALEN表达载体的切割活性。
(结果)
图5显示通过SSA测定得到的P－TALEN表达载体的切割活性。在P－TALEN表达载体中确认了超过实施例1中制作的以外显子3为靶标的G－TALEN表达载体的切割活性。
实施例4：P－TALEN的单一载体化和向鸡epiSC中导入突变
为了提高P－TALEN表达载体的导入效率，将P－TALEN表达载体(左)和P－TALEN表达载体(右)这两种载体进行单一载体化，同时向这单一载体中导入嘌呤霉素耐性基因的表达盒，以将导入有载体的细胞瞬时浓缩。图6显示所构建的单一载体的构成。按照与上述相同的方式，通过SSA测定评价了所构建的单一载体的切割活性。此外，在SSA测定中，为了评价鸡细胞内的切割活性，使用了鸡胚成纤维细胞(CEF)。
使用FuGENE HD(Promega公司制造)向所培养的epiSC中导入6.5μg的单一载体。此外，独立于仅导入单一载体，为了提高突变导入效率，将单一载体和鸡核酸外切酶I表达载体(EXO I)同时导入epiSC中。在导入单一载体的24小时后，以2μg/mL的浓度向培养基中添加嘌呤霉素，培养48小时。48小时后进行培养基交换，以从培养基中除去嘌呤霉素，培养约10天直至epiSC稳定增殖。
按照与上述相同的方式，从epiSC中回收基因组DNA，进行基因组PCR。基因组PCR中使用的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如序列号36和序列号37所示。进一步使用PCR产物进行Cel－I测定。
(结果)
图7显示通过SSA测定获得的单一载体的切割活性。相对活性是指以向不含靶标序列的CEF中导入单一载体时的测定值作为1时的相对值。如图7所示，显示了单一载体具有充分的切割活性。此外，“CMV－ptTALEN L+R”显示由CMV启动子控制左和右的TALEN的表达的载体，“CAG－ptTALEN L+R”显示由CAG启动子控制左和右的TALEN的表达的载体。在基因组PCR中，如图8(A)所示，观察到了移位谱带，其显示在药物筛选系统中通过突变而产生的异源双链。在Cel－I测定中，如图8(B)所示，观察到了消化片段的谱带，其显示来自进行了药物筛选的epiSC的基因组的突变导入。没有确认到鸡EXO I的导入效果。
实施例5：向epiSC中导入敲除突变和克隆
通过PCR扩增上述epiSC的基因组DNA的突变导入区，克隆到载体中后，分析突变导入区的核苷酸序列。分析了43个克隆，结果如下：缺失为10克隆、插入为1克隆、取代为2克隆。突变导入效率的值高达30％。其中在分析敲除突变时，在3个克隆(缺失为2克隆和插入为1克隆)中检测到了通过插入终止密码子而产生的敲除突变。在图9中，作为导入有突变的代表性核苷酸序列，例示了存在缺失的#3(A)和#36(C)、以及存在插入的#4和#18(B)。在图9中，野生型(D)的双重下划线显示信号序列，#3、#18和#36的下划线显示因导入突变而发生了突变的氨基酸序列。敲除突变的效率为7％。
向epiSC中导入单一载体后，将3300个细胞接种在96孔板上，进行克隆。epiSC的集落从共计9块板的49个孔中增殖，最终成功地在27个孔中增殖。这27个孔的细胞在进行冻结保存的同时，分别由一部分细胞提取基因组，按照与上述相同的方式进行Cel－I测定，再分析核苷酸序列。
(结果)
这27个孔中，在4个孔中确认了Cel－I测定的阳性。如图10中例示的#5的克隆那样使各细胞稳定增殖后，分析了核苷酸序列。如图11所示，在克隆化的卵类粘蛋白敲除epiSC株#4的突变导入区的核苷酸序列中，从5’末端数起在第35个碱基的下一位插入有“T”。将该核苷酸序列转换成氨基酸序列时可知：从N末端数起在第26个残基和第31个残基所对应的位置插入有终止密码子。
另一方面，在卵类粘蛋白敲除epiSC株#5的突变导入区的核苷酸序列中，在与图9(C)中所示的核苷酸序列相同的位置缺失了5个碱基。将该核苷酸序列转换成氨基酸序列时可知：从N末端数起在第24个残基和第29个残基所对应的位置插入有终止密码子。
将由epiSC株#4的核苷酸序列编码的氨基酸序列与野生型的卵类粘蛋白的氨基酸序列进行比较时可知：如图12(A)所示，通过移码在从信号肽的N末端数起第13个残基起发生氨基酸的突变，到信号肽内的第25个残基为止均被翻译。由于信号肽在细胞的内质网内被切割而未分泌，所以确认了该突变是卵类粘蛋白的敲除突变。
将由epiSC株#5的核苷酸序列编码的氨基酸序列与野生型的卵类粘蛋白的氨基酸序列进行比较时可知：如图12(B)所示，通过移码在从信号肽的N末端数起第11个残基起发生氨基酸的突变，到信号肽内的第23个残基为止均被翻译。关于epiSC株#5，也确认了是卵类粘蛋白的敲除突变。此外，卵类粘蛋白敲除epiSC株#5的核苷酸序列的分析结果，由于没有确认到其他的核苷酸序列，所以确认其被完全克隆化，为了慎重起见，再一次进行克隆，还准备了卵类粘蛋白敲除epiSC株#5－3。
实施例6：嵌合鸡的生产
将卵类粘蛋白敲除epiSC株#4、#5和#5－3移植到以5Gy进行了γ射线照射的刚刚产卵后的受精卵胚的胚盘中，孵化生殖细胞嵌合鸡(G0)。
(结果)
生产了18只嵌合鸡。由于卵类粘蛋白敲除epiSC株为横斑普利茅斯洛克种(雏鸡为黑羽毛)、而移植用的受体胚为白色来航种(雏鸡为白羽毛)，所以当为嵌合体时，卵类粘蛋白敲除epiSC分化成表皮，可确认到黑羽毛。图13(A)和(B)分别显示来自epiSC株#5的嵌合鸡和来自#4的嵌合鸡的外观。在这些嵌合鸡中确认了黑羽毛。如表2所示，嵌合鸡的详情如下：雄性有6只、雌性有7只、未定的有5只。在18只嵌合鸡中有11只是黑羽毛嵌合鸡。表2的“羽毛”显示黑羽毛的比例。
[表2]
系列号 个体编号 孵化日 epiSC 雌雄 羽毛
1 1 20140930 #5 ♂ 黑(15％)
2 2 20141017 #5 ♂ 黑(5％)
3 7289 20141111 #5 ♂ -
4 7292 20141230 #5-3 ♀ 黑(5％)
5 7293 20150106 #5 ♀ 黑(1％)
6 7294 20150407 #5 ♂ 黑(30％)
7 7295 20150407 #5 ♀ -
8 7296 20150407 #5 ♂ -
9 7606 20150414 #5 ♀ 黑(10％)
10 7607 20150414 #5 ♂ -
11 7608 20150414 #5-3 ♀ 黑(％)
12 7609 20150414 #5-3 ♀ -
13 7610 20150414 #5-3 ♀ -
14 3 20150519 #5 未定 -
15 4 20150519 #5-3 未定 黑(5％)
16 5 20150609 #5 未定 黑(15％)
17 6 20150609 #5-3 未定 黑(50％)
18 7 20150616 #4 未定 黑(＞90％)
通过将所得嵌合鸡的雄性和雌性交配，能够生产敲除了卵类粘蛋白基因的同源接合鸡(G1)。由于该鸡的卵类粘蛋白基因被敲除，所以该鸡所产的卵不含卵类粘蛋白。
实施例7：CRISPR/Cas9载体的构建
为了构建CRISPR/Cas9载体，如下所示，与TALEN的情形一样，在pX330－U6－Chimeric＿BB－CBh－hSpCas9载体(Addgene公司制造)中插入了嘌呤霉素耐性基因(参照图14)。
首先，利用“CRISPR direct”(http：//crispr.dbcls.jp/)检测能够诱导卵类粘蛋白基因的敲除的靶标序列。检索的结果，确定了外显子1中的4个位点和外显子2中的2个位点的靶标序列(序列号8～13)。根据该靶标序列，分别合成了具有图15所示核苷酸序列的寡DNA。在图15中，“正义”以卵类粘蛋白基因的正链为靶标，而“反义”以卵类粘蛋白基因的负链为靶标。图15的带下划线的核苷酸序列显示用于插入到载体中的添加序列。
将所合成的寡DNA导入载体中，制作了6种卵类粘蛋白敲除用CRISPR/Cas9载体(CRISPR/Cas9－Pur)。另外，根据靶标序列，按照与上述相同的方式还制作了SSA测定用报告载体，评价了靶标序列的切割活性。此外，关于外显子1，SSA测定用报告载体中插入的合成寡DNA所包含的正义寡DNA和反义寡DNA的核苷酸序列分别见序列号38和序列号39。另外，关于外显子3，上述插入的合成寡DNA所包含的正义寡DNA和反义寡DNA的核苷酸序列分别见序列号40和序列号41。
(CRISPR/Cas9的切割活性的研究)
为了测定卵类粘蛋白敲除用CRISPR/Cas9载体的靶标序列的切割活性，向HEK293细胞中导入CRISPR/Cas9载体，之后进行SSA测定。另外，为了试验鸡细胞内的切割活性，利用epiSC进行了同样的SSA测定。
(结果)
可知：如图16所示，以外显子1为靶标制作的两种载体(外显子1#1和外显子1#2)具有在SSA测定中显示出高活性的CMV－ptTALEN L+R载体的约2倍高的切割活性。可知：如图17所示，#1的载体即使在epiSC中也具有与TALEN相同的切割活性。
根据本实施例显示：即使使用CRISPR/Cas9，也能够修饰鸡epiSC的卵类粘蛋白基因座。进而，使用CRISPR/Cas9，能够生产敲除了卵类粘蛋白基因的鸡。
上述实施方式用于说明本发明，并不限定本发明的范围。即，本发明的范围不是通过实施方式来显示，而是通过权利要求范围来显示。而且，在权利要求范围内和与其同等的发明意义范围内进行的各种变形也视为在本发明的范围内。
本申请基于2015年8月27日申请的日本国专利申请2015－168372号。将日本国专利申请2015－168372号的说明书、权利要求范围、附图整体作为参照而纳入本说明书中。
产业实用性
本发明适合于鸟类的卵的制造、特别是鸡蛋的生产。

Claims (17)

1.一种鸟类，所述鸟类产下的卵在其基因组中不含人为导入的外来基因，并且，
卵类粘蛋白的含量比野生型低。
2.根据权利要求1所述的鸟类，其中，
从卵类粘蛋白基因座的5’末端数起，在第1～3个外显子的至少1个中包含终止密码子，或者
从卵类粘蛋白基因座的5’末端数起，在第1个外显子中不含起始密码子。
3.根据权利要求1或2所述的鸟类，其中，
卵类粘蛋白基因座中的信号序列被修饰。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的鸟类，其中，
所述鸟类为鸡。
5.一种鸟类的生产方法，包括以下步骤：
修饰步骤，使用可编程的核酸内切酶切割鸟类的多能干细胞的卵类粘蛋白基因座并进行修饰；以及
移植步骤，将修饰了卵类粘蛋白基因座的所述多能干细胞移植到鸟类的胚中。
6.根据权利要求5所述的鸟类的生产方法，其中，
所述可编程的核酸内切酶为类转录激活因子效应物核酸酶。
7.根据权利要求6所述的鸟类的生产方法，其中，
所述类转录激活因子效应物核酸酶为第1核酸酶和第2核酸酶，
所述第1核酸酶包含序列号4所示的氨基酸序列，
所述第2核酸酶包含序列号5所示的氨基酸序列。
8.根据权利要求6所述的鸟类的生产方法，其中，
所述类转录激活因子效应物核酸酶为第3核酸酶和第4核酸酶，
所述第3核酸酶包含序列号6所示的氨基酸序列，
所述第4核酸酶包含序列号7所示的氨基酸序列。
9.根据权利要求5所述的鸟类的生产方法，其中，
所述可编程的核酸内切酶为成簇规律间隔短回文重复序列－CRISPR相关蛋白系统中的Cas9核酸酶。
10.根据权利要求9所述的鸟类的生产方法，其中，
所述Cas9核酸酶在所述卵类粘蛋白基因座的包含序列号8所示核苷酸序列的区域切割双链DNA。
11.根据权利要求9所述的鸟类的生产方法，其中，
所述Cas9核酸酶在所述卵类粘蛋白基因座的包含序列号9所示核苷酸序列的区域切割双链DNA。
12.根据权利要求9所述的鸟类的生产方法，其中，
所述Cas9核酸酶在所述卵类粘蛋白基因座的包含序列号10所示核苷酸序列的区域切割双链DNA。
13.根据权利要求9所述的鸟类的生产方法，其中，
所述Cas9核酸酶在所述卵类粘蛋白基因座的包含序列号11所示核苷酸序列的区域切割双链DNA。
14.根据权利要求9所述的鸟类的生产方法，其中，
所述Cas9核酸酶在所述卵类粘蛋白基因座的包含序列号12所示核苷酸序列的区域切割双链DNA。
15.根据权利要求9所述的鸟类的生产方法，其中，
所述Cas9核酸酶在所述卵类粘蛋白基因座的包含序列号13所示核苷酸序列的区域切割双链DNA。
16.根据权利要求5～15中任一项所述的鸟类的生产方法，其中，
在所述修饰步骤中修饰来自上胚层的多能干细胞的卵类粘蛋白基因座。
17.一种鸟类的卵，在其基因组中不含人为导入的外来基因，并且，
卵类粘蛋白的含量比野生型低。
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