JP6927496B2 - 鳥類、鳥類の作出方法および鳥類の卵 - Google Patents

Description

本発明は、鳥類、鳥類の作出方法および鳥類の卵に関する。

鶏卵は、日本人の食物アレルギーの原因食物の第１位である。鶏卵中のいくつかのタンパク質が食物アレルギーを引き起こすアレルゲンとなる。鶏卵に含まれるアレルゲンとしては、オボムコイド、オボアルブミン、リゾチームおよびオボトランスフェリンなどが挙げられる。

鶏卵を原因食物とする食物アレルギーを引き起こさないために、上述のアレルゲンを鶏卵から除去する試みがなされている。鶏卵からアレルゲンを除去するには、アレルゲンをコードする遺伝子が破壊されたニワトリを作出すればよい。

非特許文献１には、オボアルブミン遺伝子をｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＴＡＬＥＮ）でノックアウトした遺伝子改変ニワトリが開示されている。当該遺伝子改変ニワトリによれば、オボアルブミンを含まない鶏卵が得られると考えられる。

Ｐａｒｋ ＴＳ、外４名、「Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｉｎ ｃｈｉｃｋｅｎｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ＴＡＬＥＮｓ．」、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ、２０１４年、１１１（３５）、１２７１６−１２７２１

オボアルブミンが含まれない鶏卵であっても、卵白には、オボムコイドが１０％程度含まれている。オボムコイドは、鶏卵中で最もアレルゲン性が強いタンパク質である。オボムコイドは物理化学的に高い安定性を有するため、オボムコイドのアレルゲン性は加熱しても維持される。したがって、前記非特許文献１に開示された方法によって、鶏卵にオボアルブミンが含まれないようにしたり、あるいはオボアルブミンを加熱により失活させたりしても、鶏卵のアレルゲン性を十分に低減したとは言い難い。

しかも、上記非特許文献１では、始原生殖細胞が用いられている。始原生殖細胞は発生過程に存在する個数がわずかであるため、始原生殖細胞を培養する技術が必要となる。これまでに複数の始原生殖細胞の培養方法が報告されているが、その報告はいくつかの研究機関に限られており、報告された手法に従って培養しても培養できないため、確実性が乏しいといった不都合がある。

本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、卵のアレルゲン性を十分に低減することができる鳥類および鳥類の作出方法、ならびにアレルゲン性が十分に低減された鳥類の卵を提供することを目的とする。

本発明者は、従来の相同組換え法を用いて、ニワトリのオボムコイド遺伝子をノックアウトした。しかし、従来の相同組換え法では、細胞の培養に長期間を要し、細胞が損傷を受け、核型に異常が見られた。さらに、相同組換え法で得られたキメラニワトリ同士を交配してもオボムコイド遺伝子がノックアウトされたホモ接合のニワトリは得られなかった。当該キメラニワトリが産む卵には、レシピエントのゲノム由来のオボムコイドが含まれ、卵のアレルゲン性が十分には低減されていなかった。

そこで、本発明者は鋭意研究を重ね、ゲノム編集技術を適用することで本発明を完成させた。すなわち、
本発明の第１の観点に係る鳥類は、
人為的に導入された外来遺伝子をゲノムに含まず、
オボムコイド遺伝子座の５’末端から数えて１番目のエクソンにおけるシグナル配列に終止コドンを含み、
オボムコイドの含有量が消失した卵を産む。

また、上記本発明の第１の観点に係る鳥類は、
ニワトリである、
こととしてもよい。

本発明の第２の観点に係る鳥類の作出方法は、
鳥類の多能性幹細胞のオボムコイド遺伝子座におけるシグナル配列を、ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅで切断し、オボムコイド遺伝子座の５’末端から数えて１番目のエクソンにおけるシグナル配列に終止コドンを含む多能性幹細胞を取得する改変ステップと、
前記改変ステップで取得した前記多能性幹細胞を、鳥類の胚に移植する移植ステップと、
を含み、
前記ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅは、
第１のヌクレアーゼおよび第２のヌクレアーゼであって、
前記第１のヌクレアーゼは、
配列番号４に示されるアミノ酸配列からなり、
前記第２のヌクレアーゼは、
配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる。

また、前記改変ステップでは、前記第１のヌクレアーゼを発現するベクターおよび前記第２のヌクレアーゼを発現するベクターが１つのベクターにされたｏｎｅベクターを前記鳥類の多能性幹細胞に導入する、
こととしてもよい。

また、前記多能性幹細胞は、
胚盤葉上層由来多能性幹細胞である、
こととしてもよい。

本発明の第３の観点に係る鳥類の卵は、
人為的に導入された外来遺伝子をゲノムに含まず、
オボムコイド遺伝子座の５’末端から数えて１番目のエクソンにおけるシグナル配列に終止コドンを含み、
オボムコイドの含有量が消失している。

本発明によれば、卵のアレルゲン性を十分に低減することができる。また、本発明によれば、アレルゲン性が十分に低減された鳥類の卵が得られる。

ニワトリのオボムコイド遺伝子座における５’末端から数えて最初のエクソン（エクソン１）の塩基配列、２番目のエクソン（エクソン２）の塩基配列、および３番目のエクソン（エクソン３）の塩基配列を示す図である。 エクソン１およびエクソン３において同定したＴＡＬＥＮ認識領域を示す図である。 エクソン１およびエクソン３を標的とするＴＡＬＥＮの相対的な切断活性を示す図である。 エクソン３を標的とするＴＡＬＥＮ発現ベクターを導入した胚盤葉上層由来多能性幹細胞のゲノムにおける標的領域の塩基配列を示す図である。 エクソン３を標的とするＴＡＬＥＮおよびエクソン１を標的とする高活性型のＴＡＬＥＮの相対的な切断活性を示す図である。 ＴＡＬＥＮ発現ベクターの構成を示す図である。 ニワトリ細胞内でのＴＡＬＥＮの相対的な切断活性を示す図である。 ＴＡＬＥＮ発現ベクターによる胚盤葉上層由来多能性幹細胞への変異導入を示す図である。（Ａ）はゲノミックＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）の結果を示す。（Ｂ）はＣｅｌ−Ｉアッセイの結果を示す。 クローンのオボムコイド遺伝子座の塩基配列の一部と該塩基配列でコードされるアミノ酸配列を示す図である。（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）はノックアウト変異が得られたクローンを示す。（Ｄ）は野生型を示す。 クローン化したノックアウト変異を有する胚盤葉上層由来多能性幹細胞株のコロニーを示す図である。 クローン化したノックアウト変異を有する胚盤葉上層由来多能性幹細胞株および野生型におけるオボムコイド遺伝子座の塩基配列の一部を示す図である。 クローン化したノックアウト変異を有する胚盤葉上層由来多能性幹細胞株のオボムコイド遺伝子座の塩基配列の一部ならびに該塩基配列でコードされるアミノ酸配列および野生型のオボムコイド遺伝子座の塩基配列でコードされるアミノ酸配列の一部を示す図である。（Ａ）は胚盤葉上層由来多能性幹細胞株＃４の塩基配列とアミノ酸配列とを示す。（Ｂ）は胚盤葉上層由来多能性幹細胞株＃５および＃５−３の塩基配列とアミノ酸配列とを示す。 ノックアウト変異を有する胚盤葉上層由来多能性幹細胞株から作出されたノックアウトキメラニワトリの写真を示す図である。（Ａ）は胚盤葉上層由来多能性幹細胞株＃５由来のキメラニワトリを示す。（Ｂ）は胚盤葉上層由来多能性幹細胞株＃４由来のキメラニワトリを示す。 オボムコイドノックアウト用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターの構成を示す図である。 オボムコイドノックアウト用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターに組み込まれた各オリゴＤＮＡの塩基配列を示す図である。 オボムコイドノックアウト用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターのＨＥＫ２９３細胞内での相対的な切断活性を示す図である。 オボムコイドノックアウト用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターの胚盤葉上層由来多能性幹細胞内での相対的な切断活性を示す図である。

本発明に係る実施の形態について説明する。なお、本発明は下記の実施の形態および図面によって限定されるものではない。

（実施の形態１）
まず、実施の形態１について説明する。実施の形態１に係る鳥類は、人為的に導入された外来遺伝子をゲノムに含まない、かつオボムコイドの含有量が野生型よりも低減された卵を産む。

鳥類は、特に限定されず、例えば、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウ、カモ、ガン、ウズラ、キジ、オウム、フィンチ、タカ、ダチョウ、エミューおよびヒクイドリなどである。好適には、鳥類は、ニワトリである。ニワトリの品種は特に限定されず、例えば、Ｗｈｉｔｅ Ｌｅｇｈｏｒｎ、Ｂｒｏｗｎ Ｌｅｇｈｏｒｎ、Ｂａｒｒｅｄ Ｒｏｃｋ、Ｓｕｓｓｅｘ、Ｎｅｗ Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ、Ｒｈｏｄｅ Ｉｓｌａｎｄ、Ａｕｓｓｔｒａｌｏｒｐ、Ｍｉｎｏｒｃａ、Ａｍｒｏｘ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｇｒａｙ、Ｉｔａｌｉａｎ Ｐａｒｔｉｄｇｅ ｃｏｌｏｒｅｄおよびＫｏｒｅａｎ Ｏｇｅなどが挙げられる。

本実施の形態に係る鳥類のゲノムには、人為的に導入された外来遺伝子が含まれていない。ここでの「人為的に導入された外来遺伝子」とは、遺伝子組み換え技術などによって人為的に導入される、変異を有する遺伝子および該鳥類のゲノムに本来含まれない遺伝子である。人為的に外来遺伝子をゲノムに導入する方法としては、相同組換え法、レトロウイルスベクター法、レンチウイルスベクター法および人工ウイルスベクター法などが挙げられる。上記鳥類のゲノムには、これらの方法で導入された外来遺伝子は含まれない。

オボムコイドは、分子量約２８０００の耐熱性糖タンパク質である。オボムコイドは、卵管の分泌細胞で産生される。オボムコイドは、通常、鳥類の卵の卵白に主に含まれる。オボムコイドは、例えば、鶏卵の卵白に含まれるタンパク質の約１１重量％を占める。本実施の形態に係る鳥類が産む卵におけるオボムコイドの含有量は、同じ種類の鳥類の野生型の卵と比較して低減されている。ここで、野生型とは、人為的に遺伝子が改変されていない上記鳥類と同じ種類の鳥類をいう。

卵内のオボムコイドの含有量は、標的のタンパク質を検出する既知の手法を用いて定量することができる。例えば、野生型の卵および本実施の形態に係る鳥類が産む卵より採取した卵白から調製した試料を対象として、ウエスタンブロット法において、オボムコイドに結合する抗体を用いて免疫染色することで、バンドの濃さに基づいてオボムコイドの含有量を比較できる。

定量性を担保するために、オボムコイドの含有量は、サンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）で測定するのが好ましい。サンドイッチＥＬＩＳＡで用いる捕捉抗体および検出抗体は、モノクローナル抗体でもよいし、ポリクローナル抗体でもよい。例えば、捕捉抗体および検出抗体として、それぞれウサギ抗オボムコイド抗体およびマウス抗オボムコイド抗体が挙げられる。

ウサギ抗オボムコイド抗体としては、オボムコイドで免疫したウサギから抗血清を回収し、オボムコイドを用いたアフィニティークロマトグフィーにより精製したポリクローナル抗体を用いればよい。一方、マウス抗オボムコイド抗体としては、マウス脾臓細胞を用いた細胞融合法により、オボムコイドに対するモノクローナル抗体産生性ハイブリドーマを樹立し、腹水抗体から精製したマウス抗オボムコイド抗体を用いればよい。検出抗体は、特に限定されないが、ペルオキダーゼで標識すればよい。ペルオキシダーゼで標識した場合、オボムコイドは、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）の発色で定量できる。オボムコイドの含有量は、試料中の濃度で評価してもよい。適切なサンドイッチＥＬＩＳＡを構築することで、５０ｐｇ／ｍｌ程度の検出限界でオボムコイドを定量できる。

上述のようにオボムコイドの含有量を定量することで、本実施の形態に係る鳥類が産む卵におけるオボムコイドの含有量が、同じ種類の鳥類の野生型よりも低減されていることを確認できる。例えば、本実施の形態に係る鳥類が産む卵におけるオボムコイドの含有量は、同じ種類の鳥類の野生型の卵におけるオボムコイドの含有量の９５重量％以下、８０重量％以下、６０重量％以下、４０重量％以下、２０重量％以下、１０重量％以下または５重量％以下である。なお、本実施の形態に係る鳥類が産む卵は、オボムコイドを定量した場合、オボムコイドの濃度が検出限界以下であってもよい。特に、本実施の形態に係る鳥類がニワトリの場合、該ニワトリが産む鶏卵の卵白タンパク質中におけるオボムコイドは、０〜８重量％、０〜４重量％、０〜３重量％、０〜２重量％または０〜１重量％であってもよい。なお、オボムコイドの含有量は、卵白単位量当たりのオボムコイドの重量で評価してもよい。

特に好ましくは、本実施の形態に係る鳥類が産む卵には、オボムコイドが含まれない。なお、オボムコイドを含まないとは、野生型の卵の卵白中に含まれるオボムコイドを含まないことを意味する。したがって、オボムコイドを含まない卵は、全長ではないオボムコイドの断片を含む卵をも包含する。

本実施の形態に係る鳥類のゲノムにおけるオボムコイド遺伝子座には、オボムコイドが発現しないノックアウト変異、または全長のオボムコイドが発現できない変異があるため、オボムコイドが正常に発現しない。当該変異は、オボムコイドが正常に発現しなければ任意であるが、具体的には、オボムコイド遺伝子座内のエクソンへの終止コドンの挿入が好ましい。

オボムコイド遺伝子座には、５つのエクソンが含まれる。５’末端から数えて最初のエクソンから順にエクソン１〜５とすると、終止コドンは、エクソン１〜５の任意の位置に挿入されていればよい。より好ましくは、上記鳥類は、オボムコイド遺伝子座のエクソン１〜３の少なくとも１つのエクソンに終止コドンを含む。オボムコイド遺伝子座内のエクソン１〜５に終止コドンが挿入されていると、オボムコイドが完全に合成されず、全長のオボムコイドが発現しない。終止コドンが挿入された位置によっては、オボムコイドの一部である断片が発現するが、オボムコイドの断片の抗原エピトープが、完全長のオボムコイドと比較して少なくなっていれば、アレルゲン性を低減させることができる。

また、当該変異は、オボムコイド遺伝子座内の開始コドンの変異であってもよい。オボムコイド遺伝子座内の開始コドンに変異があると、ｍＲＮＡに基づくオボムコイドの合成が行われない。例えば、上記鳥類は、オボムコイド遺伝子座のエクソン１に開始コドンを含まない。

好ましくは、上記鳥類は、オボムコイド遺伝子座におけるシグナル配列が改変されている。オボムコイド遺伝子座におけるシグナル配列は、エクソン１の一部の塩基配列とエクソン２の一部の塩基配列とを含み、２５残基のアミノ酸をコードする。図１には、エクソン１、エクソン２およびエクソン３の塩基配列が示されている。図１において、エクソンの塩基は大文字で、イントロンの塩基は小文字で示される。図１に示す下線の塩基配列がシグナル配列である。全長のオボムコイドはもちろん、オボムコイドの断片が発現しないように、シグナル配列の改変では、開始コドンであるＡＴＧに変異を導入してもよいし、シグナル配列中で終止コドンが生じる変異を導入してもよい。好適には、終止コドンは、オボムコイド遺伝子座のエクソン１に含まれる。なお、エクソン１、エクソン２およびエクソン３の塩基配列は、それぞれ配列番号１、配列番号２および配列番号３に示される。

上述のように、上記鳥類は、人為的に導入された外来遺伝子をゲノムに含まない。このため、オボムコイド遺伝子座が改変された上記鳥類の作出においては、外来遺伝子をゲノム上の特定の遺伝子と置換させる相同組換え法ではなく、下記で詳述するゲノム編集技術が利用されるのが好ましい。

以上詳細に説明したように、本実施の形態に係る鳥類は、オボムコイドが正常に発現しないため、オボムコイドの含有量が野生型よりも低減された卵を産む。オボムコイドは、卵アレルギーの検査において、卵黄と卵白に加えて、オボムコイドのみ独立して検査されるほどアレルゲン性が高い。このため、オボムコイドの含有量が野生型よりも少ない卵は、卵のアレルゲン性を十分に低減することができる。

また、上記鳥類は、人為的に導入された外来遺伝子をゲノムに含まない。外来遺伝子を含まないことで予期せぬ表現型および毒性の出現を防ぐことができる。また、外来遺伝子を含まないことで上記鳥類における生殖遺伝の確実性を損なうことを極力回避できる。

また、オボムコイドは物理化学的に高い安定性を有するため、加熱処理を施した鳥類の卵白を含む加工食品またはワクチンなどでも、オボムコイドのアレルゲン性が維持される。したがって、本実施の形態に係るオボムコイドの含有量が野生型よりも低減された卵は、加工食品およびワクチンなどの様々な製品の原料としても有用である。

また、上記鳥類は、オボムコイド遺伝子座のエクソン１〜３の少なくとも１つのエクソンに終止コドンを含んでもよいこととした。エクソン３に終止コドンが含まれていれば、分泌されるオボムコイドの断片の抗原エピトープが完全長のオボムコイドよりも少なくなるので、アレルゲン性を低減させることができる。特に、オボムコイド遺伝子座のエクソン１に終止コドンを含むことで、本実施の形態に係る鳥類は、全長のオボムコイドはもちろんのこと、オボムコイドの断片をも一切含まない卵を産むことができる。また、オボムコイド遺伝子座のエクソン１に開始コドンを含まない場合、ｍＲＮＡに基づくオボムコイドの合成が行われないので、上記鳥類は、オボムコイドを含まない卵を産むことができる。

また、上記鳥類は、オボムコイド遺伝子座におけるシグナル配列が改変されていてもよいこととした。シグナル配列に対応するシグナルペプチドは細胞の小胞体内で切断され分泌されないため、シグナル配列に終止コドンが含まれていれば、オボムコイド遺伝子座に由来するペプチドの卵白への分泌を防ぐことができる。この結果、オボムコイドに起因するアレルゲン性をさらに低減させることができる。

なお、本実施の形態に係る鳥類は、好ましくはニワトリであることとした。ニワトリは、需要の大きい鶏卵を産むため、アレルゲン性が十分に低減された鶏卵を効率よく供給できる。食用の卵を供給する点では、ニワトリの他に、ウズラなどが好ましい。

なお、オボムコイド遺伝子座における変異は、オボムコイド遺伝子座内のエクソンへのフレームシフトを起こす変異などであってもよい。

別の実施の形態では、人為的に導入された外来遺伝子をゲノムに含まない、かつオボムコイドの含有量が野生型よりも低減された、鳥類の卵が提供される。特に、鶏卵は、菓子、飲料、加工食品などの原料として広く使用され、あるいはワクチンなどの医薬品の製造に利用される。当該実施の形態に係る鶏卵を用いれば、オボムコイドが様々な製品に混入したとしても、オボムコイドのアレルゲン性を軽減できる。さらに、オボムコイドを含まない鳥類の卵を用いれば、最もアレルゲン性が強いオボムコイドが様々な製品に混入するリスクを極力抑えることができる。

（実施の形態２）
次に、実施の形態２について説明する。実施の形態２では、上記実施の形態１に係る鳥類に好適な鳥類の作出方法について説明する。

オボムコイドの含有量が野生型よりも低減された卵を産む鳥類を作出するには、オボムコイド遺伝子座が改変された鳥類を作出する必要がある。遺伝子を改変した遺伝子改変動物を作出するには、一細胞期受精卵のゲノムを改変し、得られた個体から目的の変異が導入された個体を選抜しなければならい。そこで、遺伝子改変動物の作出では、体外で受精卵を操作し、受精卵から個体を発生させる必要がある。例えば、マウスおよびラットでは、１個体の雌から複数の未受精卵を得ることが可能である。したがって、体外受精後、一細胞期まで発生させゲノムを改変し、受精卵を雌の卵巣に戻すことで複数の個体を作製することが可能である。

一方、鳥類では体外受精の手技が確立されていない。また、一細胞期受精卵は、産卵する鳥類１羽から１個しか得られない。さらに、卵管内に存在する一細胞期受精卵の特定が難しい。これらの理由から、鳥類の受精卵に対する遺伝子改変技術の適用は困難である。そのため、遺伝子が改変された鳥類を作出するために、受精卵の代わりに多能性または生殖細胞分化能を有する多能性幹細胞を利用する。

そこで、本実施の形態に係る鳥類の作出方法は、鳥類の多能性幹細胞のオボムコイド遺伝子座を、プログラマブルエンドヌクレアーゼ（ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）で切断し、改変する改変ステップと、オボムコイド遺伝子座を改変した上記多能性幹細胞を、鳥類の胚に移植する移植ステップと、を含む。

まず、上記改変ステップについて詳細に説明する。鳥類の多能性幹細胞としては、例えば、多能性および生殖細胞分化能を有する胚性幹細胞（ＥＳ細胞）が挙げられる。鳥類のＥＳ細胞は、例えば、受精卵の胚盤葉上層から単離した胚盤葉細胞から樹立できる胚盤葉上層由来多能性幹細胞（ｅｐｉｂｌａｓｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、以下単に「ｅｐｉＳＣ」ともいう）である。ニワトリの場合、Ｅｙａｌ−Ｇｉｌａｄｉ ａｎｄ Ｋｏｃｈａｖの発生ステージ（Ｉ〜ＸＩＶ）のステージＸの胚盤葉は、胚盤葉上層からなる。ニワトリのｅｐｉＳＣは、胚盤葉上層から単離した胚盤葉細胞を、例えば、イラジエーションまたはマイトマイシンＣ処理によって細胞増殖を停止させた支持細胞上で公知の方法で培養することで得られる。支持細胞としては、ニワトリ胚線維芽細胞、マウス胚線維芽細胞およびマウス胚線維芽細胞由来細胞株などが挙げられる。

なお、多能性および生殖細胞分化能を有する点では、始原生殖細胞を利用してもよい。始原生殖細胞は、例えば、鳥類の胎児性腺から公知の方法で単離できる。なお、以下では、改変ステップにおいて、ｅｐｉＳＣを用いる場合について説明する。

オボムコイド遺伝子座の改変では、プログラマブルエンドヌクレアーゼで、例えばｅｐｉＳＣのゲノム上のオボムコイド遺伝子座を特定の部位で切断する。プログラマブルエンドヌクレアーゼは、ゲノムの標的部位を特異的に改変（削除、置換、挿入）できる、いわゆるゲノム編集技術で使用される。プログラマブルエンドヌクレアーゼは、標的のＤＮＡの塩基配列に応じて設計され、任意の塩基配列でＤＮＡを切断することができる。プログラマブルエンドヌクレアーゼは、特に限定されないが、例えば、ＴＡＬＥＮ、ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＺＦＮ）およびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ ａｎｄ Ｃｒｉｓｐｅｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）システム（「ＣＲＩＰＰＲ／Ｃａｓ９」ともいう）におけるＣａｓ９ヌクレアーゼなどである。

ＴＡＬＥＮおよびＺＦＮは、ＤＮＡ結合ドメインとＤＮＡ切断ドメインからなるポリペプチドである。ＴＡＬＥＮおよびＺＦＮは、ＤＮＡ結合ドメインの結合部位において一対のＤＮＡ切断ドメインが近接して二量体を形成することによって、二本鎖ＤＮＡを切断する。ＤＮＡ結合ドメインは、複数のＤＮＡ結合モジュールを繰り返して含み、それぞれのＤＮＡ結合モジュールが、ＤＮＡの特定の塩基対を認識するため、ＤＮＡ結合モジュールを適切に設計することによって、オボムコイド遺伝子座の標的とする塩基配列を特異的に切断できる。

ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムでは、ゲノム上のＰＡＭ配列に隣接する標的の塩基配列に相補的な塩基配列を有するガイドＲＮＡと、Ｃａｓ９ヌクレアーゼとを使用する。ガイドＲＮＡは、標的とする塩基配列に相補的なＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、補助的なｔｒａｃｒＲＮＡとを含む。オボムコイド遺伝子座の標的とする塩基配列に結合したガイドＲＮＡを認識したＣａｓ９ヌクレアーゼがＰＡＭ配列より５’末端側の標的の塩基配列からなる領域において二本鎖ＤＮＡを切断する。

プログラマブルエンドヌクレアーゼによる二本鎖ＤＮＡの切断は、多くの遺伝情報の損失またはガン化の原因になるため、細胞内で極めて迅速に修復される。修復の主な経路の１つである、切断された末端同士を繋ぎ合わせる非相同末端結合修復の際、ゲノムの塩基配列に変異（欠失または挿入）が高確率で加えられる。したがって、ＴＡＬＥＮを用いる場合、オボムコイド遺伝子座において改変したい部位の５’末端側および３’末端側にそれぞれ存在し、ＤＮＡ結合モジュールによって認識される領域の塩基配列（エフェクター配列）に応じて、ＴＡＬＥＮを設計すればよい。オボムコイド遺伝子座において改変したい部位に好適なエフェクター配列は、例えば「ＴＡＬＥＮ Ｔａｒｇｅｔｅｒ」（ｈｔｔｐｓ：／／ｔａｌｅ−ｎｔ．ｃａｃ．ｃｏｒｎｅｌｌ．ｅｄｕ／）などで特定することができる。また、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを用いる場合は、例えば、「ＣＲＩＳＰＲ ｄｉｒｅｃｔ」（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｄｂｃｌｓ．ｊｐ／）で、オボムコイド遺伝子における標的の塩基配列を特定すればよい。

改変ステップでは、例えば、プログラマブルエンドヌクレアーゼを発現するベクターを、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法およびリポフェクション法などの公知の方法でｅｐｉＳＣに導入すればよい。例えば、プログラマブルエンドヌクレアーゼとしてＴＡＬＥＮを発現するベクターをｅｐｉＳＣに導入する場合、ゲノムＤＮＡの二本鎖各々の標的とする塩基配列に応じて設計されたＴＡＬＥＮを発現するベクターを用いる。プログラマブルエンドヌクレアーゼとしてＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを用いる場合は、ガイドＲＮＡと、Ｃａｓ９ヌクレアーゼとを発現するベクターを同様にｅｐｉＳＣに導入すればよい。

オボムコイド遺伝子座の改変では、オボムコイドが発現しないようにオボムコイド遺伝子座に任意の部位、好ましくは、エクソン１〜３の少なくとも１つのエクソンまたはシグナル配列に変異が導入されればよい。好ましくは、当該変異によって、エクソン１〜３の少なくとも１つのエクソンが終止コドンを含む、あるいはエクソン１が開始コドンを含まないようになればよい。このために、エクソン１〜３の少なくとも１つのエクソンまたはシグナル配列が切断されるように、プログラマブルエンドヌクレアーゼを設計すればよい。プログラマブルエンドヌクレアーゼは、切断部位近傍の塩基配列に応じて、公知の方法で設計される。

具体的には、ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬＥＮ ｌｅｆｔ（第１のヌクレアーゼ）およびＴＡＬＥＮ ｒｉｇｈｔ（第２のヌクレアーゼ）である。エクソン１を切断する場合、例えば、ＴＡＬＥＮ ｌｅｆｔおよびＴＡＬＥＮ ｒｉｇｈｔは、それぞれ配列番号４および配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる。また、エクソン３を切断する場合、例えば、ＴＡＬＥＮ ｌｅｆｔ（第３のヌクレアーゼ）およびＴＡＬＥＮ ｒｉｇｈｔ（第４のヌクレアーゼ）は、それぞれ配列番号６および配列番号７に示されるアミノ酸配列からなる。

なお、ＴＡＬＥＮ ｌｅｆｔは、標的とする塩基配列を特異的に切断するヌクレアーゼ活性を有するのであれば、配列番号４または配列番号６に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるものでもよい。ＴＡＬＥＮ ｒｉｇｈｔも、標的とする塩基配列を特異的に切断するヌクレアーゼ活性を有するのであれば、配列番号５または配列番号７に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるものでもよい。

一方、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムでは、例えば、エクソン１を切断する場合、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、オボムコイド遺伝子座の配列番号８〜１１のいずれかに示される塩基配列からなる領域において二本鎖ＤＮＡを切断すればよい。また、エクソン２を切断する場合、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、オボムコイド遺伝子座の配列番号１２または配列番号１３に示される塩基配列からなる領域において二本鎖ＤＮＡを切断すればよい。

ガイドＲＮＡをｅｐｉＳＣ内に導入するために、好適には、ガイドＲＮＡを発現させるオリゴＤＮＡが用いられる。オリゴＤＮＡの塩基配列は、標的とする塩基配列に基づいて決定される。Ｃａｓ９ヌクレアーゼが配列番号８に示す塩基配列からなる領域を切断する場合、ｅｐｉＳＣ内でガイドＲＮＡを発現させるオリゴＤＮＡのセンスの塩基配列は、配列番号１４に示される塩基配列を含み、該オリゴＤＮＡのアンチセンスの塩基配列は、配列番号１５に示される塩基配列を含む。この他、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが切断する領域の塩基配列を配列番号９、配列番号１０および配列番号１１のいずれかに示す塩基配列とした場合、オリゴＤＮＡのセンスおよびアンチセンスの塩基配列に含まれる塩基配列の組み合わせとしては、それぞれ配列番号１６および配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９、ならびに配列番号２０および配列番号２１が挙げられる。また、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが切断する領域の塩基配列を配列番号１２および配列番号１３のどちらかに示す塩基配列とした場合、上記オリゴＤＮＡのセンスおよびアンチセンスの塩基配列に含まれる塩基配列の組み合わせとしては、それぞれ配列番号２２および配列番号２３、ならびに配列番号２４および配列番号２５が挙げられる。

上記改変ステップにおいてオボムコイド遺伝子座が改変されたか否かは、ｅｐｉＳＣのゲノム上のオボムコイド遺伝子座の塩基配列を解析することで判定できる。例えば、プログラマブルエンドヌクレアーゼを導入した後、安定的に増殖するｅｐｉＳＣからゲノムＤＮＡを回収し、オボムコイド遺伝子座の塩基配列を解析すればよい。

なお、オボムコイドが発現しないように改変されたゲノムを有するキメラ個体を効率よく得るために、オボムコイド遺伝子が発現しないノックアウト変異がオボムコイド遺伝子座に導入されたｅｐｉＳＣを選抜してもよい。また、プログラマブルエンドヌクレアーゼを発現するベクターを導入した細胞を濃縮するために、ピューロマイシンなどの薬剤耐性遺伝子を一過性に発現させる発現系を、ｅｐｉＳＣに導入してもよい。

続いて、移植ステップについて詳細に説明する。移植ステップでは、オボムコイド遺伝子座を改変したｅｐｉＳＣを、鳥類の胚に移植する。移植操作は、特に限定されないが、細管を用いて、鳥類の胚にｅｐｉＳＣを注入すればよい。

具体的には、移植ステップでは、例えば、オボムコイドが発現しないようにオボムコイド遺伝子座が改変されたｅｐｉＳＣを、ガンマ線を照射した放卵直後の受精卵胚の胚盤葉へ移植すればよい。このとき、ｅｐｉＳＣの系統と羽装色の異なる系統のレシピエントを用いることで、キメラ個体を羽装色に基づいて容易に判別できる。例えば、キメラニワトリを作出する場合、好ましくは、雛において黒羽装の横斑プリマスロック種由来のｅｐｉＳＣが、雛において白羽装の白色レグホン種の胚に移植される。

移植ステップに続いて、ｅｐｉＳＣを移植された胚を含む卵を、孵化させることでキメラ個体を作出することができる。孵化の期間は、ニワトリの場合、約２０日間である。キメラ個体においては、改変されたオボムコイド遺伝子座を含むゲノムを有する精子および卵子が形成される。したがって、キメラ個体を交配することで、改変されたオボムコイド遺伝子座をホモ接合で有するゲノムを受け継いだ遺伝子改変鳥類が高い確率で作出される。当該遺伝子改変鳥類のボムコイド遺伝子座は改変されているため、遺伝子改変鳥類が産む卵におけるオボムコイドの含有量が野生型よりも低減されている、あるいは遺伝子改変鳥類が産む卵にはオボムコイドが含まれない。

なお、遺伝子改変鳥類は、上述のように羽装色により識別することができる。また、遺伝子改変鳥類は、そのゲノムＤＮＡの塩基配列をサザンブロットなどで解析することでも判別できる。

以上詳細に説明したように、本実施の形態に係る鳥類の作出方法では、鳥類の多能性幹細胞のオボムコイド遺伝子座をプログラマブルエンドヌクレアーゼで切断し、改変するため、オボムコイドが正常に発現しない鳥類を得ることができる。当該鳥類のゲノムは、生殖遺伝するため、当該鳥類が産む卵におけるオボムコイドの含有量が野生型よりも低減されている、あるいは当該鳥類が産む卵にはオボムコイドが含まれない。これにより、卵のアレルゲン性を十分に低減することができる。

また、本実施の形態における改変ステップでは、ｅｐｉＳＣのオボムコイド遺伝子座を改変してもよいこととした。ｅｐｉＳＣは、ひとつの胚から約６万個得られる胚盤葉細胞から容易に樹立でき、かつ多能性を維持したまま安定に培養可能できるので、オボムコイド遺伝子座をより確実に改変することができる。

以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

実施例１：ＴＡＬＥＮ発現ベクターの作製
（オボムコイドの標的配列の選定）
ＴＡＬＥＮでオボムコイド遺伝子に変異を導入するために、オボムコイドのエクソン１、エクソン２およびエクソン３の塩基配列を対象に、ＴＡＬＥＮ Ｔａｒｇｅｔｅｒでエフェクター配列を検索した。その結果、図２の下線を付した領域に示されるように、エクソン１およびエクソン３の塩基配列においてそれぞれ１組のエフェクター配列を見出した。なお、エクソン２には、エフェクター配列が見出されなかった。

（ＴＡＬＥＮ発現ベクターの作製とＴＡＬＥＮの切断活性の検討）
まず、エクソン１およびエクソン３における各エフェクター配列に結合できるモジュールの構築を、６−モジュールアセンブリ法で行い、エクソン１とエクソン３でそれぞれＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ ＴＡＬＥＮ発現ベクター２種（ｌｅｆｔとｒｉｇｈｔ）を作製した。Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ ＴＡＬＥＮ発現ベクター（以下、単に「Ｇ−ＴＡＬＥＮ発現ベクター」ともいう）は、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ ＴＡＬＥＮ ａｎｄ ＴＡＬ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ ２．０およびＹａｍａｍｏｔｏ Ｌａｂ ＴＡＬＥＮ Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ Ｐａｃｋ（共にＡｄｄｇｅｎｅ社より入手可能）を用いて、キットに添付のプロトコールに従って作製した。

次に、ＴＡＬＥＮの切断活性を検討するために、ＨＥＫ２９３細胞を用いたＳｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄ ａｎｎｅａｌｉｎｇ（ＳＳＡ）アッセイを行った。ＳＳＡアッセイでは、以下のように、ＴＡＬＥＮの標的となる塩基配列を有するレポーターベクターとＧ−ＴＡＬＥＮ発現ベクターとをＨＥＫ２９３細胞に共導入し、レポーター活性から切断活性を測定した。

レポーターベクターは、Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｌａｂ ＴＡＬＥＮ Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ Ｐａｃｋに含まれるｐＧＬ４−ＳＳＡにアニーリングした合成オリゴを挿入することによって作製した。まず、ｐＧＬ４−ＳＳＡをＢｓａＩ処理し、脱リン酸化せずに電気泳動した後、切り出しを行った。エクソン１に関して、挿入した合成オリゴに含まれるセンスオリゴおよびアンチセンスオリゴの塩基配列は、それぞれ配列番号２６および配列番号２７に示す。エクソン３に関して、挿入した合成オリゴに含まれるセンスオリゴおよびアンチセンスオリゴの塩基配列は、それぞれ配列番号２８および配列番号２９に示す。

ここで、合成オリゴのアニーリングの溶液の詳細を以下に示す。
１０×バッファー １μｌ（４００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８）、２００ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５００ｍＭ ＮａＣｌ）
センスオリゴ（５０μＭ） １μＭ
アンチセンスオリゴ（５０μＭ） １μＭ
滅菌蒸留水 ７μＭ
上記アニーリングの溶液を、９５℃で５分間維持した後、９０分間かけて２５℃まで冷却することで、合成オリゴをアニールした。

次に、アニールさせた合成オリゴをＢｓａＩ処理したｐＧＬ４−ＳＳＡに挿入した。サブクローニングしたものをスモールカルチャーし、ＫｐｎＩで処理すると、３８００ｂｐおよび１８００ｂｐの２本のバンドが出現し、合成オリゴが挿入されたことを確認した。

次に、レポーターベクターの配列解析を以下の手順で行った。レポーターベクターをＮａｒＩ処理の後、電気泳動し、ゲルを切り出し、マイクロチューブにゲル断片を回収した。これをディープフリーザーに１０分程度置き、完全に凍らせた後、指で温めて融かし、遠心機でスピンダウンした。しみ出された液体を６〜８μｌほど取り、シーケンスのテンプレートとして使用した。

配列解析のプライマーには、Ｌｕｃ２−ｕｐ−Ｆ（配列番号３０）またはＬｕｃ２−ｄｏｗｎ−Ｒ（配列番号３１）を用いた。正しい塩基配列が挿入されたことを確認した後、トランスフェクショングレードのＭｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔを用いてレポーターベクターを精製し、濃度を定量し、１５０ｎｇ／μｌに調製した。

以下の４種類のプラスミドを混合したＤＮＡ溶液をＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションした。
Ｇ−ＴＡＬＥＮ発現ベクター（Ｌｅｆｔ） ２００ｎｇ
Ｇ−ＴＡＬＥＮ発現ベクター（Ｒｉｇｈｔ） ２００ｎｇ
レポーターベクター １００ｎｇ
ｐＲＬ−ＣＭＶ（リファレンスベクター） ２０ｎｇ

ＨＥＫ２９３細胞は、直径１０ｃｍの培養用シャーレで７０〜８０％コンフルエントに培養した。ＤＮＡ希釈用の無血清Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（以下「ＤＭＥＭ」とする）およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ希釈用の無血清ＤＭＥＭを、それぞれ必要量ずつマイクロチューブに分注した。ＤＮＡ希釈用の無血清ＤＭＥＭ２５μｌを９６ウェルプレートの各ウェルに加え、上記ＤＮＡ溶液を各ウェルに４〜８μｌずつ加えて混合した。ＬＴＸ希釈用の無血清ＤＭＥＭに、１ウェル（２５μｌ）当たり０．７μｌとなるようにＬＴＸを加えて懸濁し、素早く２５μｌずつ各ウェルへ加えて混合した。これを必要本数分繰り返した。培養用シャーレの細胞からメディウムを除き、１５％ウシ胎仔血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、以下「ＦＢＳ」とする）／ＤＭＥＭを加えて培養用シャーレ上で直接ピペッティングし、細胞を懸濁した。血球計算盤で細胞数を計測し、６×１０^５細胞／ｍｌに合わせた。

最初のウェルへＬＴＸを加えてから３０分経過後、準備した細胞を１００μｌずつ各ウェルへ加え、３７℃のＣＯ_２インキュベーターでインキュベートした。トランスフェクションの２４時間後に、Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、取扱説明書に従って、ルシフェラーゼの活性測定を行った。

（結果）
図３は、ＳＳＡアッセイによるＧ−ＴＡＬＥＮ発現ベクターの切断活性を示す。陽性対照ＴＡＬＥＮは、ＨＰＲＴ１を標的に作製された十分に切断活性を有するＴＡＬＥＮ発現ベクターである。相対活性は、ＨＥＫ２９３細胞でＨＰＲＴ１の切断活性を測定し、この測定値を１としたときの相対値である。陰性対照は、標的配列を含まないＨＥＫ２９３細胞にＧ−ＴＡＬＥＮ発現ベクターを導入した場合の相対活性値を示す。図３に示すように、エクソン１を標的としたＧ−ＴＡＬＥＮ発現ベクターには切断活性は認められず、エクソン３を標的としたＧ−ＴＡＬＥＮ発現ベクターでのみ切断活性が認められた。

実施例２：Ｇ−ＴＡＬＥＮ発現ベクターのニワトリｅｐｉＳＣへの変異導入とＣｅｌ−Ｉアッセイによる変異導入の確認
切断活性が認められたエクソン３を標的としたＧ−ＴＡＬＥＮ発現ベクターを、ニワトリｅｐｉＳＣに対する変異導入に使用した。

（ニワトリｅｐｉＳＣの培養）
まず、産卵直後の新鮮な受精卵から次の手順で胚盤葉細胞を分離した。エッグセパレーターで卵白を完全に除去したのち、プラスチック製シャーレ中に胚盤葉が卵黄の上部に位置するように受精卵を静置した。滅菌乾燥させたろ紙のリング（ろ紙に直径５ｍｍの穴を開け、その外輪に沿ってハサミで円形にカットしたもの）を、中央に胚盤葉が位置するように受精卵に張りつけた。ろ紙のリングの外縁に沿ってハサミ（小直剪刀両鋭）を入れ、卵黄膜ごと円形に胚盤葉をカットした。続いて、ろ紙をピンセットでゆっくり斜めに持ち上げて、ろ紙のリングに付着する卵黄を可能な限り除去した。このとき、ろ紙のリングには、胚盤葉上層が張り付いた状態となる。

そして、ろ紙のリングを、卵黄側を上にして、滅菌ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）入りのシャーレに浸し、ろ紙のリングをゆっくり揺すって、付着した卵黄を除去した。別に準備した滅菌ＰＢＳ入りシャーレにろ紙のリングを移し、少しだけ激しく揺することで、胚盤葉細胞をろ紙のリングから円盤状に分離させた。分離した胚盤葉細胞は、マイクロピペットで１．５ｍｌのチューブに回収した。

次に、分離した胚盤葉細胞を、事前に準備しておいた支持細胞上で培養した。支持細胞として、マウス胚線維芽細胞由来細胞株（ＳＴＯ細胞）を用いた。以下、支持細胞の準備について説明する。

ＳＴＯ細胞を直径１０ｃｍの培養用シャーレに播種した。培養液は、１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）−ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ）である。培養は、５％ＣＯ_２、３７℃の条件下で行った。ＳＴＯ細胞は、約３日間の培養でコンフルエントに達し冷ＰＢＳで３回洗浄した後、０．０２５％トリプシン、０．０２％ＥＤＴＡ ２Ｎａ−ＰＢＳで細胞を剥離し、これを直径１５ｃｍの培養用シャーレに播種した。細胞がコンフルエントに達してから、培養液にマイトマイシンＣを終濃度で１０μｇ／ｍｌとなるように加え、細胞を２時間培養した。冷ＰＢＳで５回洗浄し、０．０２５％トリプシン、０．０２％ＥＤＴＡ ２Ｎａ−ＰＢＳで細胞を剥離し、遠心洗浄を少なくとも３回行った。血球計算盤を用いて細胞数を算出した。

支持細胞の培養には、直径６ｃｍの培養用シャーレのゼラチンコートを用いた。ゼラチンコート液は、使用前に、ゼラチンを０．１％になるように蒸留水に添加後、オートクレイブにより溶解、滅菌した。培養用シャーレは、支持細胞を培養する少なくとも２時間前に、底面がゼラチンコート液に浸る状態とし３７℃でコートした。ゼラチンコート液を除去後、上記のマイトマイシンＣ処理済みの支持細胞を、直径６ｃｍの培養用シャーレ１個あたり２〜３×１０^５細胞となるように、１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭに調整して播種した。支持細胞は、播種後翌日から５日以内に使用した。

（ニワトリｅｐｉＳＣへの変異導入）
ひとつの胚から分離した胚盤葉細胞を、支持細胞を播種した１個の培養用シャーレで培養した。胚盤葉細胞の培養に使用する培地の組成を表１に示す。なお、当該培地は、表１のＫｎｏｃｋＯｕｔ−ＤＭＥＭを基礎とし、組み換えニワトリ白血病抑制因子（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｃｈｉｃｋｅｎ ＬＩＦ）は、加温した最低限必要な量の培地に使用直前に添加した。

ここでｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｃｈｉｃｋｅｎ ＬＩＦの調製方法について説明する。ニワトリ胚細胞株ＣＨＣＣ−ＯＵ２を、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、１００μｇ／ｍｌのペニシリンおよび７０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含む低グルコースＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で、５％ＣＯ_２下、３７℃で培養した。配列番号３２に示すフォワードプライマーおよび配列番号３３に示すリバースプライマーを用いたＰＣＲによって、ＬＩＦのコーディング領域を増幅した。ＰＣＲ産物をＮｈｅ ＩおよびＳａｌ Ｉで処理し、ヒスチジンタグを含むｐＳｅｃＴａｇ２Ａプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にサブクローニングした。

次に、制限酵素を用いてｐＳｅｃＴａｇ２Ａプラスミドからｍｙｃ−エピトープを除去した。Ｐｏｌｙｆｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、組み換えプラスミドをＣＨＣＣ−ＯＵ２に導入し、０．２５μｇ／ｍｌのゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含む培地で細胞を選抜した。生物学的に活性のあるＬＩＦを分泌する安定した細胞株を選択し、ＰｒｏＢｏｎｄ ｒｅｓｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、培養上清からｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｃｈｉｃｋｅｎ ＬＩＦを精製した。

胚盤葉細胞を支持細胞上で２〜３日間培養することで得られたｅｐｉＳＣに、ＦｕＧＥＮＥ ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、６．５μｇのＧ−ＴＡＬＥＮ発現ベクターを導入した。Ｇ−ＴＡＬＥＮ発現ベクターの導入２４時間後に２μｇ／ｍＬの濃度でピューロマイシンを培地に添加し、４８時間培養した。４８時間後、培地からピューロマイシンを除くために培地交換を行い、ｅｐｉＳＣが安定的に増殖するまで約１０日間培養した。

安定増殖したｅｐｉＳＣから、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてゲノムＤＮＡを回収し、ゲノミックＰＣＲを行った。ゲノミックＰＣＲの条件は、９４℃で２分間の後、９８℃で１０秒、６８℃で３０秒および７２℃で２分を１サイクルとして３５サイクルである。ゲノミックＰＣＲに用いたフォワードプライマーおよびリバースプライマーの塩基配列は、それぞれ配列番号３４および配列番号３５に示される。

（Ｃｅｌ−Ｉアッセイ）
続いて、ＰＣＲ産物を再ハイブリダイゼーションし、ｓｕｒｖｅｙｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅにより処理し、ヘテロデュープレックス部分で切断するＣｅｌ−Ｉアッセイを行った。Ｃｅｌ−Ｉアッセイには、ＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標） Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ社製）を用いた。ＰＣＲ産物をＷｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて精製した。ＤＮＡの溶出は１５μｌで行い、溶出後、ＤＮＡ濃度を定量した。

次に、以下の組成でＣｅｌ−Ｉアッセイ用のＤＮＡ溶液を調製した。
ＰＣＲ産物 ４００ｎｇ
１０×ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．５）、７５０ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ_２） ０．８μｌ
滅菌蒸留水で８μｌに調製
上記ＤＮＡ溶液を、９５℃で５分間維持し、６０〜９０分間かけて２５℃に冷却した。

当該ＤＮＡ溶液に、０．４μｌのＥｎｈａｎｃｅｒ Ｓと０．４μｌのＮｕｃｌｅａｓｅ Ｓとを加えて、よくピペッティングし、４２℃で３０分間インキュベートした。反応後すぐに、アガロースゲルないしポリアクリルアミドゲルで全量を電気泳動した。

（結果）
Ｃｅｌ−Ｉアッセイでは、変異導入を示す明瞭なバンドは得られなかった。一方、ＰＣＲ産物の塩基配列を解析したところ、図４に示すように、標的領域に１塩基付加と１塩基置換の２種の変異が認められた（下線参照）。しかし、これらの変異は、いずれも終止コドンを生じる変異ではなかった。

実施例３：Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｇａｔｅ ＴＡＬＥＮ発現ベクターの作製と切断活性の評価
上記エクソン１の塩基配列を標的とする高活性型のＴＡＬＥＮであるＰｌａｔｉｎｕｍ Ｇａｔｅ ＴＡＬＥＮ（以下、単に「Ｐ−ＴＡＬＥＮ」ともいう）発現ベクターを作製した。上記エクソン１におけるエフェクター配列に結合できるモジュールの構築を、６−モジュールアセンブリ法で行い、エクソン１に対してＰ−ＴＡＬＥＮ発現ベクター（ｌｅｆｔとｒｉｇｈｔ）を作製した。Ｐ−ＴＡＬＥＮ発現ベクターは、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｇａｔｅ ＴＡＬＥＮ ＫｉｔおよびＹａｍａｍｏｔｏ Ｌａｂ ＴＡＬＥＮ Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ Ｐａｃｋ（共にＡｄｄｇｅｎｅ社より入手可能）を用いて、キットに添付のプロトコールに従って作製した。Ｐ−ＴＡＬＥＮ発現ベクターの切断活性を上述と同様にＳＳＡアッセイで評価した。

（結果）
図５は、ＳＳＡアッセイによるＰ−ＴＡＬＥＮ発現ベクターの切断活性を示す。Ｐ−ＴＡＬＥＮ発現ベクターにおいて、実施例１で作製したエクソン３を標的としたＧ−ＴＡＬＥＮ発現ベクターを上回る切断活性が認められた。

実施例４：Ｐ−ＴＡＬＥＮのｏｎｅベクター化とニワトリｅｐｉＳＣへの変異導入
Ｐ−ＴＡＬＥＮ発現ベクターの導入効率を向上させるため、Ｐ−ＴＡＬＥＮ発現ベクター（Ｌｅｆｔ）とＰ−ＴＡＬＥＮ発現ベクター（Ｒｉｇｈｔ）の２種のベクターをｏｎｅベクター化するとともに、ベクターを導入した細胞を一過性に濃縮するために、ピューロマイシン耐性遺伝子の発現カセットをｏｎｅベクターに導入した。図６は、構築したｏｎｅベクターの構成を示す。構築したｏｎｅベクターの切断活性を、上記と同様にＳＳＡアッセイで評価した。なお、ＳＳＡアッセイでは、ニワトリ細胞内での切断活性を評価するために、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）を用いた。

培養したｅｐｉＳＣに、ＦｕＧＥＮＥ ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、６．５μｇのｏｎｅベクターを導入した。なお、ｏｎｅベクターのみの導入とは独立に、変異導入効率を上昇させるために、ｏｎｅベクターとともにニワトリｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉ発現ベクター（ＥＸＯ Ｉ）をｅｐｉＳＣに導入した。ｏｎｅベクターの導入２４時間後に２μｇ／ｍＬの濃度でピューロマイシンを培地に添加し、４８時間培養した。４８時間後、培地からピューロマイシンを除くために培地交換を行い、ｅｐｉＳＣが安定的に増殖するまで約１０日間培養した。

上記と同様にｅｐｉＳＣからゲノムＤＮＡを回収し、ゲノミックＰＣＲを行った。ゲノミックＰＣＲに用いたフォワードプライマーおよびリバースプライマーの塩基配列は、それぞれ配列番号３６および配列番号３７に示される。さらに、ＰＣＲ産物を用いてＣｅｌ−Ｉアッセイを行った。

（結果）
図７は、ＳＳＡアッセイによるｏｎｅベクターの切断活性を示す。相対活性は、標的配列を含まないＣＥＦにｏｎｅベクターを導入した場合の測定値を１としたときの相対値である。図７に示すように、ｏｎｅベクターが十分な切断活性を有することが示された。なお、「ＣＭＶ−ｐｔＴＡＬＥＮ Ｌ＋Ｒ」は、ＬｅｆｔおよびＲｉｇｈｔのＴＡＬＥＮの発現をＣＭＶプロモーターで制御しているベクターを示し、「ＣＡＧ−ｐｔＴＡＬＥＮ Ｌ＋Ｒ」は、ＬｅｆｔおよびＲｉｇｈｔのＴＡＬＥＮの発現をＣＡＧプロモーターで制御しているベクターを示す。ゲノミックＰＣＲでは、図８（Ａ）に示したように薬剤選抜した系で変異により生じるヘテロデュープレックスを示すシフトバンドが観察された。Ｃｅｌ−Ｉアッセイでは、図８（Ｂ）に示すように、薬剤選抜を行ったｅｐｉＳＣのゲノムから変異導入を示す消化断片のバンドが観察された。ニワトリＥＸＯ Ｉの導入の効果は、認められなかった。

実施例５：ｅｐｉＳＣへのノックアウト変異の導入およびクローニング
上記ｅｐｉＳＣのゲノムＤＮＡの変異導入領域をＰＣＲにより増幅し、ベクターへクローニング後、変異導入領域の塩基配列を解析した。４３クローンを解析した結果、欠失が１０クローン、挿入が１クローンおよび置換が２クローンであった。変異導入効率は、３０％と高値であった。このうちノックアウト変異を解析したところ、３クローン（欠失が２クローンおよび挿入が１クローン）で、終止コドンの挿入によるノックアウト変異が検出された。図９に、変異が導入された代表的な塩基配列として、欠失があった＃３（Ａ）および＃３６（Ｃ）と、挿入があった＃４および＃１８（Ｂ）とを例示する。図９では、野生型（Ｄ）の二重下線はシグナル配列を示し、＃３、＃１８および＃３６の下線は変異導入により変異したアミノ酸配列を示す。ノックアウト変異の効率は、７％であった。

ｅｐｉＳＣにｏｎｅベクターを導入後、３３００細胞を９６ウェルプレートに播種し、クローニングを行った。計９枚のプレートの４９ウェルからｅｐｉＳＣのコロニーが増殖し、最終的に２７ウェルで増殖させることに成功した。２７ウェルの細胞は、凍結保存を作製するとともに、それぞれ一部からゲノムを抽出し、上述と同様にＣｅｌ−Ｉアッセイを行い、さらに塩基配列を解析した。

（結果）
２７ウェルのうち、４ウェルにおいてＣｅｌ−Ｉアッセイの陽性が確認された。図１０に例示する＃５のクローンのように各細胞を安定に増殖させた後、塩基配列を解析した。図１１に示すように、クローン化されたオボムコイドノックアウトｅｐｉＳＣ株＃４の変異導入領域の塩基配列では、５’末端から数えて３５番目の塩基の次に「Ｔ」が挿入されていた。この塩基配列をアミノ酸配列に変換したところ、Ｎ末端から数えて２６残基目および３１残基目に対応する位置に終止コドンが入ることがわかった。

一方、オボムコイドノックアウトｅｐｉＳＣ株＃５の変異導入領域の塩基配列では、図９（Ｃ）で示した塩基配列と同じ位置で５塩基が欠失していた。この塩基配列をアミノ酸配列に変換したところ、Ｎ末端から数えて２４残基目および２９残基目に対応する位置に終止コドンが入ることがわかった。

ｅｐｉＳＣ株＃４の塩基配列でコードされるアミノ酸配列を野生型のオボムコイドのアミノ酸配列と比較したところ、図１２（Ａ）に示すように、フレームシフトによりシグナルペプチドのＮ末端から数えて１３残基目からアミノ酸の変異が起こり、シグナルペプチド内の２５残基目まで翻訳されることがわかった。シグナルペプチドは、細胞の小胞体内で切断され分泌されないため、この変異はオボムコイドのノックアウト変異であることが確認された。

ｅｐｉＳＣ株＃５の塩基配列でコードされるアミノ酸配列を野生型のオボムコイドのアミノ酸配列と比較したところ、図１２（Ｂ）に示すように、フレームシフトによりシグナルペプチドのＮ末端から数えて１１残基目からアミノ酸の変異が起こり、シグナルペプチド内の２３残基目まで翻訳されることがわかった。ｅｐｉＳＣ株＃５についてもオボムコイドのノックアウト変異であることが確認された。なお、オボムコイドノックアウトｅｐｉＳＣ株＃５は、塩基配列の解析の結果、他の塩基配列が確認されなかったことから完全にクローン化されていることが確認されたが、念のため、さらにもう一度クローニングを行い、オボムコイドノックアウトｅｐｉＳＣ株＃５−３も準備した。

実施例６：キメラニワトリの作出
オボムコイドノックアウトｅｐｉＳＣ株＃４、＃５および＃５−３を、５Ｇｙでガンマ線照射した放卵直後の受精卵胚の胚盤葉へ移植し、生殖細胞キメラニワトリ（Ｇ０）を孵化させた。

（結果）
１８羽のキメラニワトリを作出できた。オボムコイドノックアウトｅｐｉＳＣ株は横斑プリマスロック種（雛で黒羽装）であり、移植用のレシピエント胚は、白色レグホン種（雛で白羽装）であるため、キメラ体であれば、オボムコイドノックアウトｅｐｉＳＣが表皮に分化し、黒の羽装が認められる。図１３（Ａ）および（Ｂ）は、それぞれｅｐｉＳＣ株＃５由来のキメラニワトリおよび＃４由来のキメラニワトリの外観を示す。これらのキメラニワトリには、黒の羽装が認められた。表２に示すように、キメラニワトリの内訳は、雄が６羽、雌が７羽、未定が５羽であった。１８羽のうち１１羽が黒羽装キメラであった。表２の「羽装」は黒羽装の割合を示している。

得られたキメラニワトリの雄と雌とを交配することで、オボムコイド遺伝子がノックアウトされたホモ接合のニワトリ（Ｇ１）を作出できる。当該ニワトリのオボムコイド遺伝子はノックアウトされているので、当該ニワトリが産む卵は、オボムコイドを含まない。

実施例７：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターの構築
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターを構築するために、以下のように、ｐＸ３３０−Ｕ６−Ｃｈｉｍｅｒｉｃ＿ＢＢ−ＣＢｈ−ｈＳｐＣａｓ９ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ社製）に、ＴＡＬＥＮの場合と同様にピューロマイシン耐性遺伝子を挿入した（図１４参照）。

まず、「ＣＲＩＳＰＲ ｄｉｒｅｃｔ」（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｄｂｃｌｓ．ｊｐ／）を用いて、オボムコイド遺伝子のノックアウトを誘導できる標的配列を検索した。検索の結果、エクソン１で４箇所およびエクソン２で２箇所の標的配列を決定した（配列番号８〜１３）。当該標的配列に基づいて、図１５に示す塩基配列を有するオリゴＤＮＡをそれぞれ合成した。図１５では、「センス」がオボムコイド遺伝子のプラス鎖を標的とし、「アンチセンス」がマイナス鎖を標的とする。図１５の下線を付した塩基配列は、ベクターに組み込むための付加配列を示す。

合成したオリゴＤＮＡをベクターに導入し、６種のオボムコイドノックアウト用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターを作製した（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−Ｐｕｒ）。また、標的配列に基づいて、上記と同様にＳＳＡアッセイ用のレポーターベクターも作製し、標的配列の切断活性を評価した。なお、エクソン１に関して、ＳＳＡアッセイ用のレポーターベクターに挿入した合成オリゴに含まれるセンスオリゴおよびアンチセンスオリゴの塩基配列を、それぞれ配列番号３８および配列番号３９に示す。また、エクソン３に関して、上記挿入した合成オリゴに含まれるセンスオリゴおよびアンチセンスオリゴの塩基配列を、それぞれ配列番号４０および配列番号４１に示す。

（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の切断活性の検討）
オボムコイドノックアウト用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターの標的配列の切断活性を測定するために、ＨＥＫ２９３細胞にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターを導入後、ＳＳＡアッセイを行った。また、ニワトリ細胞内での切断活性を試験するために、ｅｐｉＳＣを用いて同様のＳＳＡアッセイを行った。

（結果）
エクソン１を標的に作製した２種のベクター（エクソン１ ＃１とエクソン１ ＃２）は、図１６に示すように、ＳＳＡアッセイで高い活性を示すＣＭＶ−ｐｔＴＡＬＥＮ Ｌ＋Ｒベクターの約２倍高い切断活性を有することがわかった。＃１のベクターは、図１７に示すように、ｅｐｉＳＣ中でもＴＡＬＥＮと同等の切断活性を有することがわかった。

本実施例により、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いても、ニワトリｅｐｉＳＣのオボムコイド遺伝子座を改変できることが示された。ひいては、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いて、オボムコイド遺伝子がノックアウトされたニワトリを作出することができる。

上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内およびそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。

本出願は、２０１５年８月２７日に出願された日本国特許出願２０１５−１６８３７２号に基づく。本明細書中に、日本国特許出願２０１５−１６８３７２号の明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。

本発明は、鳥類の卵の製造、特には鶏卵の生産に好適である。

Claims (6)

1. 人為的に導入された外来遺伝子をゲノムに含まず、
   オボムコイド遺伝子座の５’末端から数えて１番目のエクソンにおけるシグナル配列に終止コドンを含み、
   オボムコイドの含有量が消失した卵を産む、鳥類。
2. ニワトリである、
   請求項１に記載の鳥類。
3. 鳥類の多能性幹細胞のオボムコイド遺伝子座におけるシグナル配列を、ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅで切断し、オボムコイド遺伝子座の５’末端から数えて１番目のエクソンにおけるシグナル配列に終止コドンを含む多能性幹細胞を取得する改変ステップと、
   前記改変ステップで取得した前記多能性幹細胞を、鳥類の胚に移植する移植ステップと、
   を含み、
   前記ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅは、
   第１のヌクレアーゼおよび第２のヌクレアーゼであって、
   前記第１のヌクレアーゼは、
   配列番号４に示されるアミノ酸配列からなり、
   前記第２のヌクレアーゼは、
   配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる、
   鳥類の作出方法。
4. 前記改変ステップでは、前記第１のヌクレアーゼを発現するベクターおよび前記第２のヌクレアーゼを発現するベクターが１つのベクターにされたｏｎｅベクターを前記鳥類の多能性幹細胞に導入する、
   請求項３に記載の鳥類の作出方法。
5. 前記多能性幹細胞は、
   胚盤葉上層由来多能性幹細胞である、
   請求項３または４に記載の鳥類の作出方法。
6. 人為的に導入された外来遺伝子をゲノムに含まず、
   オボムコイド遺伝子座の５’末端から数えて１番目のエクソンにおけるシグナル配列に終止コドンを含み、
   オボムコイドの含有量が消失した、鳥類の卵。

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