JP2023115711A - Fag e 2タンパク質欠失ソバ属植物およびその利用 - Google Patents
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Abstract
Description
[1] 配列番号1または8の配列において翻訳領域にストップコドンが導入された変異型ポリヌクレオチドを有する、ソバ属植物。
[2] 以下のいずれかの変異型ポリヌクレオチドを有する、ソバ属植物:
(a)配列番号3の配列からなるポリヌクレオチド;
(b)配列番号3の配列と80%以上の配列同一性を有し、かつ配列番号3の244~246位に相当する部分がストップコドンである配列または配列番号3の244に相当する位置より上流の領域にストップコドンを有する配列からなる、ポリヌクレオチド;
(c)配列番号3の配列とは相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号3の244~246位に相当する部分がストップコドンである配列または配列番号3の244に相当する位置より上流の領域にストップコドンを有する配列からなる、ポリヌクレオチド;
(d)配列番号8の配列と80%以上の配列同一性を有し、かつ配列番号3の244~246位に相当する部分がストップコドンである配列または配列番号3の244に相当する位置より上流の領域にストップコドンを有する配列からなる、ポリヌクレオチド;
(e)配列番号8の配列とは相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号3の244~246位に相当する部分がストップコドンである配列または配列番号3の244に相当する位置より上流の領域にストップコドンを有する配列からなる、ポリヌクレオチド。
[3] ソバ属植物が、ソバ(Fagopyrum esculentum)、ダッタンソバ(F. tataricum)、宿根ソバ(F. cymosum)、もしくはソバ近縁野生種(F. homotropicum)、またはそれらのいずれかの雑種である、1または2に記載のソバ属植物。
[4] 変異型ポリヌクレオチドをホモ接合体として有する、1から3のいずれか1項に記載のソバ属植物。
[5] 種子から、Fag e 2タンパク質が検出されない、1から4のいずれか1項に記載のソバ属植物。
[6] 1から5のいずれか1項に記載のソバ属植物の、植物体 。
[7] 6に記載の植物体、またはその後代を用いることを含む、ソバ属植物の育種方法。
[8] 6に記載の植物体の、収穫物、繁殖材料または加工品。
[9] 1から5のいずれか1項に記載のソバ属植物の子実を製粉することを特徴とする、低アレルゲンそば粉の製造方法。
[10] アレルゲンとなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列において翻訳領域にのストップコドンを導入する変異を生じさせることによる、植物のアレルゲンを低減する方法。
[11] 下記の少なくとも一方を満たす、ソバ属植物の子実、そば粉、またはそれらを用いた製品:
・1から5のいずれか1項に記載のソバ属植物、または7に記載の育種方法により得られた品種から得られたものである。
・Fag e 2タンパク質が検出されない。
(Fag e 2遺伝子の変異)
本発明のソバ属植物は、Fag e 2遺伝子において変異を有する。
(a)配列番号3の配列からなるポリヌクレオチド;
(b)配列番号3の配列と80%以上の配列同一性を有し、かつ配列番号3の244~246位に相当する部分がストップコドンである配列または配列番号3の244に相当する位置より上流の領域にストップコドンを有する配列からなる、ポリヌクレオチド;
(c)配列番号3の配列とは相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号3の244~246位に相当する部分がストップコドンである配列または配列番号3の244に相当する位置より上流の領域にストップコドンを有する配列からなる、ポリヌクレオチド;
(d)配列番号8の配列と80%以上の配列同一性を有し、かつ配列番号3の244~246位に相当する部分がストップコドンである配列または配列番号3の244に相当する位置より上流の領域にストップコドンを有する配列からなる、ポリヌクレオチド;
(e)配列番号8の配列とは相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号3の244~246位に相当する部分がストップコドンである配列または配列番号3の244に相当する位置より上流の領域にストップコドンを有する配列からなる、ポリヌクレオチド。
サンガー法あるいは次世代DNA解析技術などの塩基配列解析方法による当該変異塩基配列そのものの解読、あるいは当該塩基配列を認識部位とする制限酵素を用いたゲノムDNAあるいはPCR増幅断片等の切断状況の差異、もしくはLGC Genomics社の KASP(Kompetitive Allele Specific PCR)ジェノタイピングアッセイ、高分解能融解曲線(HRM)解析、等の当該塩基配列の差異を検出する技術、あるいはPCR-SSCP(Single Nucleotide Conformation Polymorphism)等が挙げられる。また、当該変異塩基部分に連鎖するDNAマーカーを用いて検出してもよい。Fag e 2タンパク質の欠失または低減を判断するためには、免疫化学的手法(イムノブロット法、イムノクロマト法等)、Fag e 2タンパク質の活性または機能を測定する方法等が挙げられる。
本発明のソバ属植物においては、Fag e 2遺伝子の変異により、Fag e 2タンパク質が欠失または低減されている。
本発明のソバ属植物は、Fag e 2タンパク質の欠失または低減により、アレルゲン反応性に差異が生じている。具体的には、野生型のソバ属植物より、アレルゲン反応性が低減されている。アレルゲン反応性に差異が生じているか否かは、評価対象となるソバ属植物から得たそば粉、および対応する野生型ソバ属品種(比較品種)のそば粉から抽出した全タンパク質抽出液について、IgE Crosslinking-induced Luciferase Expression(EXiLE)法によるアレルゲン反応性検証試験を実施することにより確認できる。EXiLE法は、ヒトの高親和性IgE受容体(FcεRI)を発現させた培養マスト細胞株(RS-ATL8)を、アレルギー患者の血清(IgE)で感作し、抗原の添加によるRS-ATL8の活性化をルシフェラーゼアッセイにより検出する手法である。マスト細胞の活性化に必要なIgEの架橋を捉えるため生理的で感度の高い評価法であるといえる。
本発明により提供される、Fag e 2遺伝子において変異を有し、Fag e 2タンパク質が欠失または低減されているソバ属植物の例として、Fag e 2遺伝子領域内ストップコドン変異型自殖系統(Fag e 2_Stop(245)_self)が挙げられる。
・科学的性質 (形態的、栽培上の特徴、生理学的特徴等)
分類学上の位置:ソバ(Fagopyrum esculentum)の系統である。
一年生の直立分枝型植物であり、播種後に双葉が展開し、その後本葉が展開し、主茎および分枝に花房が発生した後、結実する。
・原産地: 北海道農業研究センターにて突然変異育種により開発した。
・栽培条件: 生存確認試験のための条件(発芽試験の条件)としては、種子滅菌のため70% エタノールに1分浸し、1%(有効塩素濃度)次亜塩素酸ナトリウム溶液中で、スターラーを用いて30分間攪拌し、滅菌水で5回洗浄し、暗所25℃(許容範囲22~28℃)にてペトリ皿内の滅菌水を浸したろ紙上に播種し、冠根が伸びた状態に至った実生を発芽したと判断する。発芽試験は12日間とする。植物体の屋外での気象条件としては、日平均気温13℃~18℃、日最高気温18℃~25℃、日最低気温10℃~18℃であり、水はけがよく、降水量が月あたり200~400mmであり、日照時間が月あたり100時間以上ある条件。
・種子の保管方法:5℃
本発明はまた、アレルゲンとなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列において翻訳開始領域にストップコドンを導入する変異を生じさせることによる、植物のアレルゲンを低減する方法を提供する。変異を生じさせたポリヌクレオチドは下記のいずれかであってもよい。
(a)配列番号3の配列からなるポリヌクレオチド;
(b)配列番号3の配列と80%以上の配列同一性を有し、かつ配列番号3の244~246位に相当する部分がストップコドンである配列または配列番号3の244に相当する位置より上流の領域にストップコドンを有する配列からなる、ポリヌクレオチド;
(c)配列番号3の配列とは相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号3の244~246位に相当する部分がストップコドンである配列または配列番号3の244に相当する位置より上流の領域にストップコドンを有する配列からなる、ポリヌクレオチド;
(d)配列番号8の配列と80%以上の配列同一性を有し、かつ配列番号3の244~246位に相当する部分がストップコドンである配列または配列番号3の244に相当する位置より上流の領域にストップコドンを有する配列からなる、ポリヌクレオチド;
(e)配列番号8の配列とは相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号3の244~246位に相当する部分がストップコドンである配列または配列番号3の244に相当する位置より上流の領域にストップコドンを有する配列からなる、ポリヌクレオチド。
本発明はまた、本発明のソバ属植物を用いた、新規なソバ属植物を育種する方法を提供する。本発明の育種方法は、本発明のソバ属植物、その植物体、またはその後代を育種素材として用いることを特徴とする。育種のための手法は特に限定されず、例として、交配、変異体の選抜、戻し交雑、遺伝子組換え、細胞融合、ゲノム編集等が挙げられる。
本発明はまた、本発明のソバ属植物から得た植物体の、収穫物、繁殖材料または加工品、および下記の少なくとも一方を満たす、ソバ属植物の子実、そば粉、またはそれらを用いた製品を提供する。
・この子実、そば粉、または製品が、本発明により得られたソバ属植物の系統または品種から得られたものであること。
・Fag e 2タンパク質が検出されないこと(例えば、低アレルゲン反応性、等)。
Fag e 2タンパク質を欠失化させるため、EMS(Ethyl Methanesulfonate、エチルメタンスルホン酸)処理による突然変異誘導を実施した。約4,600粒の種子(供試品種:春のいぶき)を0.33%(v/v)のEMS溶液で15時間処理後、圃場での栽培・増殖を実施した。1個体から3~6粒ずつを採取し、7,490粒の種子を得た。さらにこれらの種子に対して、0.60%(v/v)のEMSで15時間での再処理を実施し、圃場での栽培・増殖を実施した。2,710個体から1個体当たり1から2粒ずつで採種した。これらの種子を栽培し、3,336個体から個体ごとに採種するとともに、12個体の葉を等量ずつまとめてDNAを抽出し、278のDNAバルクとした(12個体 × 278バルク = 3,336個体)。
Fag e 2遺伝子のコーディング領域を増幅するPCRプライマーを設計し(フォワードプライマー: 5'- TGAAGCTCTTCATCATCCTAGCAA -3'(配列番号5)、リバースプライマー: 5'- TACACAAAATACCGATTTCCTCTCG -3'(配列番号6))、278のDNAバルクをテンプレートとして、98℃3分、(98℃10秒、63.5℃5秒、72℃90秒) × 30回、72℃5分でのPCR増幅を行なった。PCR後にNextera XT DNA Library Prep kit(イルミナ社)を用いてバルクごとにPCR産物をライブラリー化し、Hiseq X(イルミナ社)を用いて塩基配列リードを取得した。その後に、trimmomatic 0.3.2(Bolger et al., 2014)でリードのクリーニング、野生型Fag e 2遺伝子配列(配列番号1および2)へのBWA(Li and Durbin, 2009)によるマッピング、samtools(Li et al., 2009)による処理(BAM変換、ソート、mpileup)、VarScan(Koboldt et al., 2009)によるVcf作成、SnpEff(Cingolani et al., 2012)により、ストップコドン変異を有するバルクの検出を行った。
ストップコドン変異が確認されたバルク種子を播種後、各個体からDNAを抽出し、設計したKASPジェノタイピングアッセイおよびKASPマスターミックス(エル・ジー・シー・ゲノミクス社)を用いて、実施手法に従い、ストップコドン変異をヘテロ型で有する個体(Fag e 2_Stop(245)_hetero)を選抜し、選抜個体間交配を実施することで採種した。この種子を播種し、前述の方法でストップコドン変異をホモ型で有する系統(Fag e 2_Stop(245))を作製した。さらに、この系統と自殖性のソバ系統とを交配することで、前述と同様の手法によりストップコドン変異をホモ型で有する自殖性系統(Fag e 2_Stop(245)_self)を作製した。
野生型および変異型自殖系統種子の果皮を取り除き、粉砕して得たそば粉25mgに対して、500μlのタンパク質抽出液(10×PBS、ニッポンジーン社: Protease Inhibitor Cocktail、シグマ社: ミリQ、10:0.5:89.5)を用いて、4℃で15分間の振とう抽出による全タンパク質抽出した。全タンパク質抽出液を240倍に希釈し、酵母発現系によるリコンビナントFag e 2抗原(Al Athamneh et al., 2020)を免疫したウサギポリクローナル抗体(rabbit anti-Fag e 2 pAb-4)、および、シグナル配列を含むN末端からのアミノ酸番号(121~128)のFag e 2タンパク質の既知IgEエピトープ配列部位を含むアミノ酸番号(121~132)のペプチドを抗原とするウサギポリクローナル抗体(rabbit anti-Fag e 2 pAb-1)(Satoh et al., 2010)、さらに、N末端部位ペプチド(アミノ酸番号:21-38)を抗原としたウサギポリクローナル抗体(rabbit anti-Fag e 2 pAb-2)を一次抗体(40倍希釈)、キット付属の抗ウサギHRP結合抗体を二次抗体とし、全自動ウェスタンシステム(Wes、プロテインシンプル社)の実施手法に従いウェスタンブロットを行うことで、Fag e 2タンパク質の検出を実施した。
野生型および変異型自殖系統の成熟中の種子に対して、RNAiso Plus(タカラバイオ社)とFruit-mate for RNA Purification(タカラバイオ社)を用いて、実施手法に従い全RNAを調製した。この全RNAに対して、逆転写酵素であるSuperScript III Reverse Transcriptase(インビトロジェン社)を用いて、実施手法に従い各cDNAを合成した。各Fag e 2遺伝子のmRNAの蓄積量を、cDNAとqPCR用試薬であるTB Green Premix Ex Taq II(タカラバイオ社)、およびMicリアルタイムPCR装置(スクラム社)を用いたqPCRを実施することで解析した。
Fag e 2タンパク質の欠失化によりアレルゲン反応性に差異が生じるか検証するために、変異型自殖系統と市場に流通する比較品種のそば粉から抽出した全タンパク質抽出液、および4症例のソバアレルギー患者血清を用いた、EXiLE法によるアレルゲン反応性検証試験を実施した。
配列番号1(Fag e 2_野生型塩基配列)(NCBI_Sequence ID: FJ430161.1、灰色網掛けはシグナルペプチド配列部位、囲みは既知IgEエピトープ部位配列、下線はEMS処理による変異創出部位配列を示す)
Bolger, A. M., Lohse, M., and Usadel, B. (2014). Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina Sequence Data. Bioinformatics, 30(15): 2114-2120.
Li, H. and Durbin, R. (2009). Fast and Accurate Short Read Alignment with Burrows-Wheeler Transform. Bioinformatics, 25(14): 1754-1760.
Li, H., Handsaker, B., Wysoker, A., Fennell, T., Ruan, J., Homer, N., Marth, G., Abecasis, G., Durbin, R. and 1000 Genome Project Data Processing Subgroup (2009). The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics, 25(16): 2078-2079.
Koboldt, D. C., Chen, K., Wylie, T., Larson, D. E., McLellan, M. D., Mardis, E. R., Weinstock, G. M., Wilson, R. K. and Ding, L. (2009). VarScan: variant detection in massively parallel sequencing of individual and pooled samples. Bioinformatics, 25(17): 2283-2285.
Cingolani, P., Platts, A., Wang, L. L., Coon, M., Nguyen, T., Wang, L., Land, S. J. Lu, X. and Ruden, D. M. (2012). A program for annotating and predicting the effects of single nucleotide polymorphisms, SnpEff. Fly, 6(2): 80-92.
Al Athamneh, A. M., Suzuki, Y., Nakamura, S and Katayama, S. (2020). Hydrolysate of highly digestible phosphorylated buckwheat major allergen Fag e 2 attenuates allergic reactions in Fag e 2-sensitized mice. Japanese Journal of Food Chemistry and Safety, 27(2): 67-75.
Satoh, R., Koyano, S., Takagi, K., Nakamura, R. and Teshima, R. (2010). Identification of an IgE-binding epitope of a major buckwheat allergen, BWp16, by SPOTs assay and mimotope screening. International Archives of Allergy and Immunology, 153(2): 133-140.
SEQ ID NO:2 Fag e 2_wild type protein, amino acid sequence
SEQ ID NO:3 Fag e 2_stop codon-mutant type gene, nucleotide sequence
SEQ ID NO:4 Fag e 2_stop codon-mutant type protein, amino acid sequence
SEQ ID NO:5 PCR Forward primer
SEQ ID NO:6 PCR Reverse primer
SEQ ID NO:7 Nucleotide sequence for KASP genotyping assay
SEQ ID NO:8 F. tataricum, major allergen, nucleotide sequence
SEQ ID NO:9 F. tataricum, major allergen, amino acid sequence
Claims (11)
- 配列番号1または8の配列において翻訳領域にストップコドンが導入された変異型ポリヌクレオチドを有する、ソバ属植物。
- 以下のいずれかの変異型ポリヌクレオチドを有する、ソバ属植物:
(a)配列番号3の配列からなるポリヌクレオチド;
(b)配列番号3の配列と80%以上の配列同一性を有し、かつ配列番号3の244~246位に相当する部分がストップコドンである配列または配列番号3の244に相当する位置より上流の領域にストップコドンを有する配列からなる、ポリヌクレオチド;
(c)配列番号3の配列とは相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつの244~246位に相当する部分がストップコドンである配列または配列番号3の244に相当する位置より上流の領域にストップコドンを有する配列からなる、ポリヌクレオチド;
(d)配列番号8の配列と80%以上の配列同一性を有し、かつ配列番号3の244~246位に相当する部分がストップコドンである配列または配列番号3の244に相当する位置より上流の領域にストップコドンを有する配列からなる、ポリヌクレオチド;
(e)配列番号8の配列とは相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号3の244~246位に相当する部分がストップコドンである配列または配列番号3の244に相当する位置より上流の領域にストップコドンを有する配列からなる、ポリヌクレオチド。 - ソバ属植物が、ソバ(Fagopyrum esculentum)、ダッタンソバ(F. tataricum)、宿根ソバ(F. cymosum)、もしくはソバ近縁野生種(F. homotropicum)、またはそれらのいずれかの雑種である、請求項1または2に記載のソバ属植物。
- 変異型ポリヌクレオチドをホモ接合体として有する、請求項1から3のいずれか1項に記載のソバ属植物。
- 種子から、Fag e 2タンパク質が検出されない、請求項1から4のいずれか1項に記載のソバ属植物。
- 請求項1から5のいずれか1項に記載のソバ属植物の、植物体。
- 請求項6に記載の植物体、またはその後代を用いることを含む、ソバ属植物の育種方法。
- 請求項6に記載の植物体の、収穫物、繁殖材料または加工品。
- 請求項1から5のいずれか1項に記載のソバ属植物の子実を製粉することを特徴とする、低アレルゲンそば粉の製造方法。
- アレルゲンとなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列において翻訳領域にストップコドンを導入する変異を生じさせることによる、植物のアレルゲンを低減する方法。
- 下記の少なくとも一方を満たす、ソバ属植物の子実、そば粉、またはそれらを用いた製品:
・請求項1から5のいずれか1項に記載のソバ属植物、または請求項7に記載の育種方法により得られた品種から得られたものである。
・Fag e 2タンパク質が検出されない。
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