EA032207B1 - Ячмень и его применение - Google Patents

Ячмень и его применение Download PDF

Info

Publication number
EA032207B1
EA032207B1 EA201270200A EA201270200A EA032207B1 EA 032207 B1 EA032207 B1 EA 032207B1 EA 201270200 A EA201270200 A EA 201270200A EA 201270200 A EA201270200 A EA 201270200A EA 032207 B1 EA032207 B1 EA 032207B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
starch
grain
gene
barley
plant
Prior art date
Application number
EA201270200A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201270200A1 (ru
Inventor
Чжуньи Ли
Мэттью Кеннеди Морелл
Original Assignee
Коммонвелт Сайентифик Энд Индастриал Рисерч Организейшн
Острэйлиан Кэпитал Венчерз Лимитед
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from AU2009903563A external-priority patent/AU2009903563A0/en
Application filed by Коммонвелт Сайентифик Энд Индастриал Рисерч Организейшн, Острэйлиан Кэпитал Венчерз Лимитед filed Critical Коммонвелт Сайентифик Энд Индастриал Рисерч Организейшн
Publication of EA201270200A1 publication Critical patent/EA201270200A1/ru
Publication of EA032207B1 publication Critical patent/EA032207B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/46—Gramineae or Poaceae, e.g. ryegrass, rice, wheat or maize
    • A01H6/4624—Hordeum vulgarus [barley]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A01H5/10—Seeds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L2/00—Non-alcoholic beverages; Dry compositions or concentrates therefor; Their preparation
    • A23L2/02—Non-alcoholic beverages; Dry compositions or concentrates therefor; Their preparation containing fruit or vegetable juices
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L7/00—Cereal-derived products; Malt products; Preparation or treatment thereof
    • A23L7/10—Cereal-derived products
    • A23L7/198—Dry unshaped finely divided cereal products, not provided for in groups A23L7/117 - A23L7/196 and A23L29/00, e.g. meal, flour, powder, dried cereal creams or extracts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/10—Laxatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/14—Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/12—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis
    • A61P3/14—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis for calcium homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/25—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving enzymes not classifiable in groups C12Q1/26 - C12Q1/66

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)

Abstract

Изобретение предлагает зерно ячменя с пониженным уровнем или пониженной активностью белка синтазы крахмала IIa и содержанием крахмала, составляющим по меньшей мере 41% (мас./мас.), а также способы получения, идентификации или применения указанного зерна. Зерно может содержать по меньшей мере 50% амилозы, 5-9% (мас./мас.) или более 9% (мас./мас.) β-глюкана и/или 3-11% (мас./мас.) фруктана. Степень полимеризации фруктана может составлять от 3 до 12. Например, растение и зерно содержат аллель sex6-292 и/или мутацию amo1. Изобретение также предлагает пищевой продукт или напиток, содержащий указанное зерно или полученный из указанного зерна, а также способы получения такого пищевого продукта или напитка и способы обработки зерна с получением продукта. В объем изобретения также входят способы улучшения одного или нескольких показателей здоровья млекопитающего, включающие в себя введение композиции, содержащей зерно ячменя настоящего изобретения или полученный из него продукт.

Description

Настоящее изобретение описывает вариантные растения ячменя и их зерна, содержащие пониженный уровень или пониженную активность белка 8811а и желательные крахмальные и некрахмальные компоненты, продуцирующиеся с относительно высоким выходом.
Уровень техники
Зерно ячменя дикого типа содержит примерно от 50 до 60% крахмала, который находится в эндосперме и состоит примерно из 25% амилозы и 75% амилопектина. Амилоза, которая имеет молекулярную массу от 104 до 105, состоит в основном из линейной глюкозильной цепи, содержащей а-(1-4) связи, и небольшого количества глюкановых цепей, содержащих а-(1-6) связи. Амилопектин, который имеет молекулярную массу от 105 до 106, представляет собой высокоразветвленный глюкан, содержащий глюкозильные цепи с а-(1-4) связями, причем обычно от 3 до 60 глюкозильных мономеров соединены а-(1-6) связями, так, что примерно 5-6% глюкозильных связей представляют собой а-(1-6) связи.
В биосинтезе крахмала в зерновых культурах участвует ряд ферментов, в том числе АДФглюкозопирофосфорилазы (ЕС 2.7.7.27), крахмальные синтазы (ЕС 2.4.1.21), крахмалветвящие ферменты (ЕС 2.4.1.18) и крахмалдеветвящие ферменты (ЕС 3.2.1.41 и 3.2.1.68). Первая стадия синтеза крахмала включает в себя синтез АДФ-глюкозы из глюкозы-1-Р и АТФ, катализируемый ферментом АДФглюкозопирофосфорилаза. Затем АДФ-глюкоза используется в качестве субстрата для синтеза крахмала под действием крахмальных синтаз, которые переносят глюкозу к невосстанавливающему концу уже существующей глюкозильной цепи крахмала, содержащей а-(1-4) связи. Разветвленные глюкановые цепи крахмала, содержащие а-(1-6) связи, образуются под действием крахмалветвящих ферментов в результате расщепления участка глюкана, содержащего а-(1-4) связи, с последующим переносом короткого глюкана в какое-либо положение глюкановой цепи крахмала с а-(1-4) связями. Чтобы сохранить определенную структуру крахмала, избыток глюкановых цепей, содержащих а-(1-6) связи, удаляется с помощью деветвящих ферментов (см. обзоры Коззтапп апб Ь1оуб, Стй Ксу Р1ап1 8а, 19: 171-226, 2000; Кайтап е! а1., I Сегеа1 8а, 31: 91-110, 2000; 8тйй, Вютасгото1еси1е8, 2: 335-341, 2001; Моге11 е! а1., Еирйуйса, 119: 55-58, 2001; Моге11 е! а1., I Арр1 С1усовс1, 50: 217-224, 2003а; Моге11 е! а1., Соп!го1 крахмала Ью8уп!йе818 т уавси1аг р1ап!з апб а1дае. 1п: Р1ах!оп \УС. МсМапиз МТ (ебз) Соп1го1 оГ рптагу те!аЬо118т т р1ап!з. Аппиа1 р1ап! геу1ете, уо1 22, В1аскхте11, ОхГогб, рр 258-289, 2006; Ва11 апб Моге11, Аппи Кеу Р1ап! Вю1, 54: 207-233, 2003; 1атез е! а1., Сигг Орш Р1ап! Вю1, 6: 215-222, 2003; Те11о\у е! а1., I Ехр Во!, 55: 21312145, 2004).
Десять генов крахмальных синтаз, которые были идентифицированы в геноме риса (Нйозе апб Тегао, Р1ап!а, 220: 9-16, 2004), подразделяют на пять разных классов: гранулосвязанная синтаза крахмала (СВ88), синтаза крахмала I (881), синтаза крахмала II (8811), синтаза крахмала III (88ΙΙΙ) и синтаза крахмала IV (88Ш) (Ь1 е! а1., Гипс! (п(ецг Сепоткз, 3: 76-85, 2003). В рисе обнаружены две изоформы СВ88 (СВ88I и СВ88П), одна изоформа 88Ц три изоформы 88П (88Па [88П-3], 88пЬ [88П-2] и 88пс [88П-1]), две изоформы 88Ш (88Ша [88Ш-2] и 88ШЬ [88ш-1]) и две изоформы 88Γν (88Ша [88Γν-1] и 88Г^ [88Γν-2]) (Нпозе апб Тегао, 2004 (выше); Еиц!а е! а1., Р1ап! Рйу8ю1, 144: 2009-2023, 2007). Белки 88Ц 88Па и СВ88I присутствуют в гранулах крахмала, а белок 88Ша обнаружен только в растворимой фазе амилопластидов (Ь1 е! а1., Р1ап! Рйу8ю1оду, 123: 613-624, 2000). Роль синтаз крахмала, которую они выполняют по отдельности или в совокупности, в образовании конечной структуры гранул крахмала точно еще не определена, хотя установлены возможные функции крахмальных синтаз в разных органах и разных видах.
Мутантные формы крахмальных синтаз используют для определения их роли в некоторых зерновых культурах. СВ88I играет ключевую роль в биосинтезе амилозы (Ва11 е! а1., Се11 5(5(3): 349-52, 1996), однако он также может вносить вклад в синтез длинных цепей амилопектина (Маббе1еш е! а1., I Вю1 Сйет. 269(40): 25150-7, 1994; Эепуег е! а1., Р1ап! Рйузю1 112(2) :779-85, 1996). Влияние на свойства крахмала исследуют на ячмене и пшенице с использованием СВ88!-нулевых мутантов (Апбетззоп е! а1., I. Сегеа1 8а 30: 183-191, 1999; Уататоп апб Оиупй, Тйеог Арр1 Сепе!, 100: 32-38, 2000). Содержание амилозы в ячмене с нулевой мутацией по СВ88I составляет менее 5% от содержания амилозы в ячмене дикого типа (Апбетззоп е! а1., 1999 (выше)). СВ88Енулевой мутант пшеницы также имеет низкое содержание амилозы (К1т е1 а1., I Сегеа1 8а, 37: 195-204, 2003; Мшта е! а1., Еирйуйса, 108: 91-95, 1999; Мшта е! а1. Еирйуйса, 123: 353-359, 2002). По данным дифференциальной сканирующей калориметрии (О8С) СВ88Енулевой мутант пшеницы также характеризуется более высоким максимумом температуры и энтальпии желатинизации (Уазш е! а1., I Сегеа1 8а, 24: 131-137, 1996).
Полагают, что 88Ц 88Па и 88Ш преимущественно участвуют в синтезе амилопектина, обеспечивая удлинение конкретных подгрупп существующих невосстанавливающих концов молекулы крахмала. Исследования 88I-нулевых мутантов АгаЫбор818 и риса демонстрируют, что 88I участвует в биосинтезе маленьких внешних цепей амилопектинового кластера (8-12 бр) в крахмале листьев АгаЫбор818 (Пе1уа11е е! а1., Р1ап! I. 43(3): 398-412, 2005) и в крахмале эндосперма риса (Еир!а е! а1., Р1ап! Рйу8ю1. 140: 10701084, 2006). Крахмал 88Па-мутантов ячменя и пшеницы имеет повышенное содержание цепей ΌΡ3-8, свидетельствуя о том, что фермент 88Па участвует в удлинении коротких глюкановых цепей ΌΡ3-8 с
- 1 032207 получением более длинных глюкановых цепей ΌΡ12-35 (Моге11 е! а1., Р1ап! 1. 34: 173-185, 2003; Уашашоп е! а1., Тйеот Арр1 Оепе!, 101: 21-29, 2000; Кои1к-Ко8е е! а1., Тйеот Арр1 Оепе!, 115: 1053-1065, 2007). Утрата 88111а в кукурузе и рисе приводит к появлению фенотипа с повышенным содержанием амилозы и с уменьшением доли очень длинных цепей (ΌΡ>50 в кукурузе или ΌΡ>30 в рисе) и небольшому уменьшению температуры желатинизации (1аие е! а1., Сегеа1 Сйеш. 76: 629-637, 1999; Ещйа е! а1., 2007 (выше)). В пластидах мутантов АтаЫборШ, дефектных по 881У, содержится меньше гранул крахмала, но они имеют более крупный размер, что позволяет постулировать участие белка 881У в инициации образования гранул крахмала (Ко1баи е! а1., Р1ап! 1. 49: 492-504, 2007).
Показано, что 8811а-мутантный ячмень имеет фенотип, характеризующийся высоким содержанием амилозы, пониженным содержанием крахмала и пониженной массой семян, который является следствием уменьшения биосинтеза крахмала. Линии мутантного ячменя М292 и М342, гомозиготные по нулевой мутации гена, кодирующего 8811а, получают путем мутагенеза зерен ячменя сорта Нтша1ауа под действием азида натрия. Вначале из зерен потомства популяции, подвергнутой мутагенезу, выбирают мутантные семена по фенотипу сморщенного зерна. Мутантные линии дополнительно характеризуются изменением свойств крахмала, снижением уровня и активности белка 8811а, и в генетическом отношении присутствием раннего стопкодона в кодирующем участке гена 8811а (Моге11 е! а1., 2003 (выше), полностью включенный в данное описание в качестве ссылки). Это приводит к утрате фермента 8811а в эндосперме. Однако содержание крахмала в 8811а-мутантном зерне значительно снижено, что приводит к умеренному уменьшению выхода при выращивании растений ячменя в поле. Неизвестно, можно ли улучшить выход при сохранении фенотипа с высоким содержанием амилозы, и, если можно, то как.
Таким образом, существует потребность в ячмене с высоким содержанием амилозы, который обладает улучшенными агрономическими характеристиками.
Сущность изобретения
На протяжении данного описания, если контекст не указывает иначе, термин содержат или его вариации, такие как содержит или содержащий, следует понимать как включающий в себя указанный элемент, или указанное целое число, или указанную группу элементов или целых чисел, но не исключающий какой-либо другой элемент, или другое целое число, или другую группу элементов или целых чисел.
В данном описании, если контекст однозначно не указывает иначе, единственное число включает в себя множественное число. Так, например, термин мутация относится как к одной мутации, так и к двум или нескольким мутациям; термин средство относится к одному средству, а также к двум или нескольким средствам; и так далее.
Нуклеотидные и аминокислотные последовательности обозначают с помощью идентификационного номера последовательности (8ЕО ΙΌ N0:). 8ЕО ΙΌ N0: численно соответствуют идентификаторам последовательностей 4001 (8ЕО ΙΌ N0: 1), 4002 (8ЕО ΙΌ N0: 2) и т.д. Идентификаторы последовательностей приведены в табл. 8.
Гены и другой генетический материал (например, мРНК, нуклеотидные конструкции и др.) обозначают в данном описании курсивом, а белковые продукты их экспрессии не выделяют курсивом. Так, например, полипептид синтазы крахмала ΙΙ (88ΙΙ) является продуктом экспрессии нуклеотидных последовательностей 88ΙΙ.
Типичные примеры нуклеотидных и аминокислотных последовательностей молекул 8811а приведены в списке последовательностей, дополнительно описанном в табл. 8.
Библиографические сведения о публикациях, упоминаемых автором в данной заявке, приведены в конце описания.
Приведенную в данном описании ссылку на какую-либо предшествующую публикацию (или полученную из нее информацию) или любой известный материал не следует рассматривать как информацию или допущение или какую-либо форму предположения о том, что предшествующая публикация (или полученная из нее информация) или любой известный материал образует часть известных знаний в области науки, к которой относится настоящая заявка.
Если не указано иначе, все описанные здесь воплощения можно применять, внося необходимые изменения, к любым другим воплощениям.
В одном воплощении настоящее изобретение предлагает зерно ячменя с пониженными уровнем или активностью белка 8811а и содержанием крахмала по меньшей мере 41% (мас./мас.). Зерно, полученные из него продукты и способы получения, идентификации или применения зерна характеризуются по меньшей мере двумя указанными признаками. В частности, термин содержание крахмала относится к содержанию крахмала в целом зерне, тогда как содержание крахмала, например, в шлифованном зерне является более высоким. В некоторых воплощениях содержание крахмала в зерне ячменя составляет по меньшей мере 43% (мас./мас.), по меньшей мере 45% (мас./мас.), по меньшей мере 47% (мас./мас.) , по меньшей мере 50% (мас./мас.) или 41-65% (мас./мас.).
В родственном воплощении содержание амилозы в зерне составляет по меньшей мере 50% или по меньшей мере 60% по отношению к общему содержанию крахмала в зерне. Кроме того, в некоторых воплощениях содержание β-глюкана в зерне составляет 5-9% (мас./мас.) или более 9% (мас./мас.).
- 2 032207
В другом воплощении содержание фруктана в зерне составляет 3-11% (мас./мас.) или 4-11% (мас./мас.). Подходящий фруктан имеет степень полимеризации примерно от 3 до 12.
В другом родственном воплощении зерно содержит мутацию в эндогенном гене, который кодирует полипептид, обладающий активностью 8811а, причем мутация приводит к уменьшению экспрессии гена, кодирующего 8811а, в растении ячменя или к экспрессии 8811а на пониженном уровне или с более низкой активностью. В иллюстративном воплощении предлагается растение или зерно, гомозиготное по аллелю 5ехб-292. В некоторых воплощениях уровень 8811а уменьшают с помощью экзогенной молекулы нуклеиновой кислоты, способной осуществлять понижающую регуляцию экспрессии гена, кодирующего 8811а, в растении ячменя. В некоторых воплощениях настоящего изобретения экзогенная молекула нуклеиновой кислоты включает в себя химерный молчащий ген, антисмысловую молекулу, рибозим, совместно экспрессирующуюся молекулу, молекулу дцРНК, молекулу шпилечной РНК или микроРНК, которая осуществляет понижающую регуляцию экспрессии эндогенного 8811.
В предпочтительном воплощении настоящее изобретение предлагает зерно ячменя, которое дополнительно содержит генетическое изменение, приводящее к уменьшению активности гена ато1. Как описано далее в данном документе, уменьшение активности гена ато1 удобно оценивать по сравнению с немодифицированным контролем, например, по сравнению с зерном ячменя сорта Н1та1ауа. В иллюстративном воплощении генетическое изменение включает в себя мутацию гена ато1. В другом воплощении растение или полученное из него зерно является гомозиготным по аллелю ато1-АС38 (8сйопбе1та1ет е! а!., Р1аи1 Вгеебшд, 109: 274-281, 1992, включена в настоящее описание в качестве ссылки во всей полноте). В одном воплощении зерно ячменя содержит мутацию в гене ато1 и характеризуется пониженной активностью синтазы крахмала, отличной от 8811а, предпочтительно пониженным уровнем СВ88. более предпочтительно пониженным уровнем СВ881. Зерно также может содержать повышенный уровень лизина (>4 г на 100 г белка). Такое зерно можно получить путем скрещивания ячменя сорта Ртотеакйопирапа с ячменем, содержащим мутантный локус ато1, таким как Н1дй Ату1о8е С1ас1ег.
Зерно может находиться в любой пригодной форме, включающей в себя, без ограничения, целое или дробленое зерно, молотое, шлифованное, измельченное, раздробленное, плющеное зерно или перловую крупу.
Настоящее изобретение относится к растению ячменя, способному продуцировать описанные здесь зерна, а также к непросеянной ячменной муке или порошку, полученному из зерна.
В некоторых воплощениях настоящее изобретение предлагает зерно ячменя, в котором содержание крахмала составляет по меньшей мере 41% (мас./мас.) и которое содержит мутантный ген 8811а и мутантный ген ато1. В некоторых воплощениях мутация 8811а включает в себя наличие аллели 8ехб-292. В некоторых воплощениях зерно, которое содержит мутацию, приводящую к утрате функции 8811а, например мутацию 8ехб-292 и мутацию ато1, получают или продуцируют и обрабатывают с получением пищевого продукта или напитка.
В другом аспекте настоящее изобретение предлагает способ получения пищевого продукта или напитка, который включает в себя (ί) получение или продуцирование зерна ячменя, как описано в данном документе; и (ίί) обработку зерна с получением продукта. Продукт соответственно можно выбрать из группы, включающей в себя непросеянную муку, муку, крахмал, отруби, β-глюкан, фруктан, отличный от крахмала полисахарид, а также дробленое, молотое, шлифованное, измельченное, раздробленное, плющеное зерно или перловую крупу. Обработанное зерно ячменя можно использовать непосредственно или в другом воплощении обработанное зерно можно смешать с одним или несколькими другими ингредиентами с получением пищевого продукта или напитка. В некоторых воплощениях способы дополнительно включают в себя (ίίί) определение в зерне ячменя или полученном из него продукте уровня или типа крахмала, крахмалистости, амилозы, амилопектина, β-глюкана, фруктана, отличных от крахмала полисахаридов, клетчатки или резистентного крахмала.
В некоторых воплощениях пищевой продукт или напиток включает в себя зерно, муку, зерновой завтрак, сухое печенье, сдобную булку, батончик мюсли, лапшу, подсластитель, низкокалорийную добавку, наполнитель, клетчатку, улучшитель консистенции, консервант, пробиотик и т.п. или их любые сочетания. Пищевой продукт может представлять собой экструдированный зерновой завтрак или сухой завтрак или хлопьевидный или плющеный продукт. Пищевой продукт может представлять собой пищевой ингредиент, такой как компонент сырья хлебопекарного производства или смеси для выпекания.
В другом воплощении настоящее изобретение предлагает способ получения растения ячменя, способного продуцировать зерно, характеризующееся пониженным уровнем или пониженной активностью белка 8811а и содержанием крахмала, составляющим по меньшей мере 41%, где способ включает в себя (ί) введение в указанное растение средства, осуществляющего понижающую регуляцию уровня или активности эндогенной синтазы крахмала II (8811) в растении по сравнению с контрольным растением, или мутации эндогенного гена, кодирующего 8811 в растении, и (ίί) выбор растения ячменя, продуцирующего зерно. В некоторых воплощениях способы дополнительно включают в себя введение в растение генетического изменения, приводящего к уменьшению активности гена ато1. Средства соответственно включают в себя молекулу нуклеиновой кислоты, которая осуществляет понижающую регуляцию экспрессии
- 3 032207 эндогенного гена 8811 и включает в себя химерный молчащий ген, антисмысловую молекулу, рибозим, совместно экспрессирующуюся молекулу, молекулу дцРНК, молекулу шпилечной РНК или другую экзогенную молекулу нуклеиновой кислоты, способную осуществлять понижающую регуляцию экспрессии эндогенного гена 8811.
В некоторых воплощениях способы дополнительно включают в себя определение в зерне ячменя или полученном из него продукте уровня активности и/или типа крахмала, крахмалистости, амилозы, амилопектина, β-глюкана, фруктана, отличного от крахмала полисахарида, клетчатки или резистентного крахмала. В некоторых воплощениях способы включают в себя анализ растения с использованием одного или нескольких генетических маркеров. В некоторых воплощениях пониженный уровень или пониженная активность белка 8811а составляет менее 25%, менее 10%, менее 5% от соответствующих показателей контрольного растения или того же растения до введения средства или мутации или практически отсутствует.
В некоторых воплощениях изобретение предлагает способ получения описанного выше зерна ячменя, включающий в себя стадии выращивания растения ячменя и сбора зерна. В другом воплощении настоящее изобретение предлагает применение раскрытого здесь растения, или зерна, или непросеянной муки, или муки для получения продукта с повышенным уровнем резистентного крахмала, клетчатки, водорастворимого углевода, β-глюкана, фруктана или отличного от крахмала углевода или продукта с пониженным гликемическим индексом (01) . Фруктан, крахмал или β-глюкан, выделенный из растения, зерна или непросеянной муки, в соответствии с настоящим изобретением используют, например, для получения пищевого продукта, включающего в себя подсластитель, низкокалорийную добавку, наполнитель, клетчатку, средство, улучшающее консистенцию, консервант, пробиотическое средство и т. п. или их сочетание. Таким образом, в некоторых воплощениях зерно, муку, непросеянную муку, крахмал, βглюкан или фруктан, выделенные из растения, зерна, непросеянной муки или муки настоящего изобретения, используют для получения пищевого продукта с повышенным уровнем резистентного крахмала, клетчатки, водорастворимого углевода, β-глюкана, фруктана или пищевого продукта с пониженным гликемическим индексом (01) . В некоторых воплощениях повышают уровни амилозы, β-глюкана и фруктана, предпочтительно резистентного крахмала. Соответственно настоящее изобретение относится к пищевому продукту, содержащему пищевой ингредиент на уровне, составляющем по меньшей мере 10% по отношению к сухой массе, где пищевой ингредиент представляет собой указанное зерно ячменя, описанное в данном документе, которое содержит по меньшей мере 41% (мас./мас.) крахмала, или непросеянную муку, или муку, полученную из указанного зерна, где непросеянная мука или мука имеет пониженный уровень или пониженную активность 8811а и содержание крахмала, составляющее по меньшей мере 41% (мас./мас.). В некоторых воплощениях непросеянная мука или мука содержит 3-11% (мас./мас.) фруктана или 4-11% (мас./мас.) фруктана.
В некоторых других воплощениях содержание β-глюкана в непросеянной муке или муке составляет 5-9% (мас./мас.) или более 9% (мас./мас.). В других воплощениях непросеянная мука или мука содержит 50 или 60% амилозы по отношению к общему содержанию крахмала в непросеянной муке или муке.
В иллюстративном воплощении ячмень содержит аллель 8ех6-292.
В другом иллюстративном воплощении продукт выбирают из группы, включающей в себя хлеб, сдобные булочки, зерновые завтраки, кексы, печенье, пирожные, сухари, оладьи, пиццы, круассаны, бублики, соленые крендельки, макароны, лапшу, компоненты сырья хлебопекарного производства, смеси для выпекания, супы, соусы, загустители, конфеты, тортильи, батончики мюсли, сухие завтраки и другие мучные изделия. Продукт может представлять собой напиток, такой как высокоэнергетический напиток или фруктовый коктейль.
В другом воплощении настоящее изобретение предлагает применение зерна или муки, полученной из растения или зерна настоящего изобретения, в производстве пищевого продукта с повышенным уровнем одного или нескольких компонентов, выбранных из крахмала, амилозы, амилопектина, β-глюкана, фруктана, отличного от крахмала полисахарида, клетчатки или резистентного крахмала.
В другом воплощении изобретение предлагает способ идентификации разновидности зерна ячменя, характеризующейся повышенными уровнями одного или нескольких компонентов, выбранных из крахмала, амилозы, амилопектина, β-глюкана, фруктана, отличного от крахмала полисахарида, клетчатки или резистентного крахмала. В некоторых воплощениях способ включает в себя (ί) получение зерна ячменя с изменением синтеза или катаболизма крахмала, и (ίί) определение содержания в зерне одного или нескольких компонентов, выбранных из крахмала, амилозы, амилопектина, β-глюкана, фруктана, отличного от крахмала полисахарида, клетчатки или резистентного крахмала. В других воплощениях способ включает в себя (ίίί) сравнение уровня компонента, указанного в пункте (ίί), с уровнем, наблюдающимся в зерне дикого типа, в котором отсутствуют изменения синтеза или катаболизма, или в зерне исходного или другого контрольного растения. В следующих воплощениях способ включает в себя отбор измененного зерна, характеризующегося повышением уровня/уровней, указанных в пункте (ίί). В некоторых воплощениях способы включают в себя мутагенез или трансформацию растительной клетки перед стадией (ί). В предпочтительных воплощениях зерно ячменя содержит мутацию в гене ато1 и характеризуется
- 4 032207 пониженной активностью синтазы крахмала, такой как 8811а, 88111а или СВ88, например пониженным уровнем СВ881. Такое зерно можно получить путем скрещивания мутанта ячменя М292 или другого ячменя, содержащего аллель кехб-292, или разновидности Рготеакйопирапа с ячменем, содержащим мутантный локус ато1, таким как Нщ11 Лту1о§е С1ас1ет.
В другом аспекте настоящее изобретение предлагает способ определения уровня (уровней) крахмала, амилозы, амилопектина, β-глюкана, фруктана, отличного от крахмала полисахарида, клетчатки или резистентного крахмала в зерне хлебных злаков, таком как зерно ячменя, где указанный способ включает в себя стадию получения зерна, содержащего по меньшей мере 41% (мас./мас.) крахмала в соответствии с настоящим изобретением, обработку зерна с целью экстракции крахмала, амилозы, амилопектина, βглюкана, фруктана, отличного от крахмала полисахарида, клетчатки или резистентного крахмала, и измерение количества экстрагированных крахмала, амилозы, амилопектина, β-глюкана, фруктана, отличного от крахмала полисахарида, клетчатки или резистентного крахмала с целью определения содержания крахмала, амилозы, амилопектина, β-глюкана, фруктана, отличного от крахмала полисахарида, клетчатки или резистентного крахмала в зерне.
В другом воплощении изобретение предлагает способ получения пищевого продукта или напитка, включающий в себя смешивание зерна ячменя или полученного из него продукта с помощью раскрытых здесь способов с другим ингредиентом пищевого продукта или напитка. Таким образом, способ включает в себя (ί) получение или продукцию зерна ячменя, характеризующегося пониженным уровнем или пониженной активностью белка 8811а и содержанием крахмала, составляющим по меньшей мере 41% (мас./мас.); и (ίί) обработку зерна с получением продукта. Продукт может быть выбран из группы, включающей в себя непросеянную муку, муку, крахмал, отруби, β-глюкан, фруктан, отличный от крахмала полисахарид, а также дробленое, молотое, шлифованное, измельченное, раздробленное, плющеное зерно или перловую крупу. Способ дополнительно включает в себя смешивание продукта с другим пищевым продуктом или напитком или их предшественником.
Изобретение также предлагает способ получения крахмала, амилозы, амилопектина, β-глюкана, фруктана, отличного от крахмала полисахарида, клетчатки или резистентного крахмала с целью улучшения одного или нескольких показателей здоровья млекопитающих, где способ включает в себя введение млекопитающему композиции, содержащей зерно ячменя, полученную из него непросеянную муку или муку или полученный из него пищевой продукт или напиток, которые характеризуются пониженным уровнем или пониженной активностью белка 8811а и содержанием крахмала, составляющим по меньшей мере 41% (мас./мас.), как описано в данном документе. В одном воплощении зерно, мука, крахмал, амилоза, амилопектин, β-глюкан, фруктан, отличный от крахмала полисахарид, клетчатка или резистентный крахмал находятся в виде пищевого продукта, напитка или фармацевтической композиции. В некоторых воплощениях зерно или мука находится в виде фруктанового продукта. В одном воплощении один или несколько показателей здоровья включают в себя повышенное число полезных кишечных бактерий, пониженное число очагов аберрантных крипт, повышенную абсорбцию минеральных веществ, пониженный уровень инсулина, пониженный гликемический индекс, пониженную гликемическую нагрузку, пониженный уровень глюкозы в крови, пониженное кровяное давление, пониженную массу тела, пониженный уровень холестерина в крови, повышенный уровень холестерина НИЬ, повышенную плотность кости, повышенный уровень кальция, повышенную частоту кишечной перистальтики или улучшенный сердечно-сосудистый профиль сыворотки крови.
В родственном воплощении изобретение предлагает способ улучшения одного или нескольких симптомов состояния, связанного с наличием у субъекта низких уровней пищевого крахмала, крахмалистости, амилозы, амилопектина, β-глюкана, фруктана, отличного от крахмала полисахарида, клетчатки или резистентного крахмала, указанный способ включает в себя пероральное введение субъекту зерна, описанного в данном документе, или полученного из зерна обработанного продукта, содержащего один или несколько ингредиентов, выбранных из крахмала, амилозы, амилопектина, β-глюкана, фруктана, отличного от крахмала полисахарида, клетчатки или резистентного крахмала, в течение периода времени и в условиях, достаточных для улучшения одного или нескольких симптомов.
В некоторых воплощениях способа состояние выбрано из группы, включающей в себя диабет, ожирение, болезнь сердца, гипертонию, констипацию, остеопороз и рак.
Способы или композиции настоящего изобретения можно применять к любому субъекту при условии, что они вызывают улучшение состояния субъекта. Термин субъект включает в себя, без ограничения, людей и отличных от людей приматов, домашний скот, в том числе крупный рогатый скот, свиньи или куры, или молодые животные, такие как телята или поросята, домашние животные, такие как собаки или кошки, лошади, лабораторные животные, находящиеся в неволе дикие животные, рептилии и амфибии, рыбы и птицы. Субъект независимо от того, является ли он человеком или отличным от человека животным, может упоминаться как пациент, особь, субъект, животное, хозяин или реципиент. В отдельном воплощении субъект представляет собой человека.
Приведенное выше описание сущности изобретения не следует рассматривать как исчерпывающее перечисление воплощений настоящего изобретения.
- 5 032207
Краткое описание фигур
На фиг. 1 приведены фотографии семян, отражающие их морфологию. Используют линии дикого типа (НН21 и НН61), линии мутантов ато1 (НН17 и НН30), мутантов 8811а (НН35 и НН50), двойных мутантов 8811а-ато1 (НН4 и НН88), полученные из популяции ВС3Р6, являющейся результатом скрещивания Н1та1ауа292 и НАС. Также используют две исходные линии и две контрольные линии.
На фиг. 2 приведена гистограмма, иллюстрирующая содержание крахмала, выраженное в виде процента от сухой массы семян, для четырех генотипов: дикого типа, 8811а-ато1, 88Па-ато1 и 88Па-ато1.
Краткое описание таблиц
В табл. 1 показаны содержание К.8 и уровень С1 в непросеянной муке ячменя.
В табл. 2 показаны содержание К8 и уровень С1 в хлебе, полученном с использованием 100% непросеянной муки ячменя.
В табл. 3 приведены результаты статистического анализа влияния генотипа на содержание К8 в хлебе, полученном с использованием 30 или 100% муки ячменя.
В табл. 4 показаны содержание К8 и уровень С1 в хлебе, полученном с использованием 30% муки ячменя.
В табл. 5 приведены результаты статистического анализа влияния генотипа на содержание К8 (мг К8 на г крахмала) в хлебе, полученном с использованием 100% муки ячменя.
В табл. 6 приведены результаты статистического анализа влияния генотипа на содержание К8 (мг К8 на г крахмала) в хлебе, полученном с использованием 30% муки ячменя.
В табл. 7 приведены результаты статистического анализа влияния генотипа на уровень С1 в 10 г хлеба, полученного с использованием 30 или 100% муки ячменя.
В табл. 8 описаны 8ЕС Ш N0, упоминающиеся в настоящем документе.
В табл. 9 описано подразделение аминокислот на подклассы.
В табл. 10 приведены типичные аминокислотные замены.
Подробное описание
Настоящее изобретение основано на неожиданном открытии, которое заключается в том, что агрономические преимущества 8811а-мутантного ячменя, включающие в себя, в числе прочего, высокие уровни амилозы и фруктана, могут быть дополнительно улучшены в разновидности, содержащей связанную с утратой функции мутацию гена 8811а и генетическое изменение, приводящее к уменьшению активности гена ато1. В частности, как показано на фиг. 2, двойные мутанты ячменя имеют более высокие уровни крахмала, чем одинарные 8811а-мутанты.
Соответственно в одном воплощении настоящее изобретение предлагает зерно ячменя, характеризующееся пониженным уровнем или пониженной активностью белка 8811а и содержанием крахмала, составляющим по меньшей мере 41% (мас./мас.). В родственном воплощении содержание амилозы в зерне составляет по меньшей мере 50% или по меньшей мере 60% по отношению к общему содержанию крахмала в зерне. Кроме того, в некоторых воплощениях зерно содержит β-глюкан в количестве 5-9% (мас./мас.) или более 9% (мас./мас.). В другом воплощении зерно содержит фруктан в количестве 3-11% (мас./мас.) или 4-11% (мас./мас.). В другом воплощении содержание лизина в зерне составляет по меньшей мере 4 г на 100 г белка.
Крахмал состоит только из глюкозидных остатков и присутствует в виде молекул двух типов, амилозы и амилопектина, которые различаются по размеру молекул и другим характеристикам. Молекулы амилозы в основном представляют собой линейные полимеры, состоящие из а-1,4-связанных глюкозидных мономеров, тогда как амилопектин представляет собой высокоразветвленную молекулу, содержащую а-1,6-глюкозидные связи, соединяющие многочисленные линейные цепи а-1,4-связанных глюкозидных мономеров. Амилопектин состоит из больших молекул, которые варьируют по размеру от нескольких десятков тысяч до сотен тысяч мономеров глюкозы и содержат примерно 5% а-1,6разветвлений. Амилоза же состоит из молекул, которые варьируют по размеру от нескольких сотен до нескольких тысяч глюкозидных остатков и содержат менее одного процента разветвлений (обзор можно найти в Ви1еоп с1 а1., 1п1егпайопа1 1оитиа1 о£ Вю1ощса1 Масгото1еси1е8, 23: 85-112, 1998). Крахмалы злаков дикого типа обычно содержат 20-30% амилозы, а остаток составляет амилопектин.
Синтез крахмала в эндосперме высших растений осуществляет набор ферментов, которые катализируют четыре ключевые стадии. На первой стадии АДФ-глюкозопирофосфорилаза активирует мономер предшественника крахмала посредством синтеза АДФ-глюкозы из С-1-Р и АТФ. На второй стадии синтазы крахмала переносят активированный донор глюкозильного остатка, АДФ-глюкозу, на невосстанавливающий конец существующей а1-4-цепи. На третьей стадии крахмалветвящие ферменты вводят точки ветвления путем расщепления участка а-1,4-связанного глюкана с последующим переносом расщепленной цепи на акцепторную цепь и образованием новой а-1,6-связи. Крахмалветвящие ферменты представляют собой ферменты, которые вводят а-1,6-связи в α-полиглюканы и, следовательно, играют важную роль в образовании амилопектина. И наконец, крахмалдеветвящие ферменты удаляют некоторые из точек ветвления, хотя механизм их действия еще не ясен.
Очевидно, что для синтеза нормальных гранул крахмала в высших растениях требуется по меньшей
- 6 032207 мере четыре указанные активности, однако в эндосперме высших растений обнаружено несколько изоформ каждого из четырех ферментов, специфические функции которых были предложены на основе результатов мутационного анализа или модификации уровней экспрессии генов с использованием трансгенных способов. В эндосперме зерновых, где обнаружено четыре класса синтазы крахмала, одна изоформа локализована исключительно в гранулах крахмала, так называемая гранулосвязанная синтаза крахмала (СВ88), которая в основном используется для синтеза амилозы, две формы распределены между гранулами и растворимой фракцией (881, Ь1 е! а1., Р1ап! Рйукю1оду, 120: 1147-1155, 1999, 8811, Ы е! а1., Тйеогейса1 апб АррНеб Сепебск, 98: 1208-1216, 1999), а четвертая форма присутствует только в растворимой фракции, 88ΙΙΙ (Сао е! а1., АтсЫуек о£ Вюсйеш1к!ту апб Вюрйукюк, 373: 135-146, 2000; Ы е! а1., 1999 (выше); Ы е! а1., 2000 (выше)). Показано, что мутации в 88ΙΙ и 88ΙΙΙ приводят к изменению структуры амилопектина (Сао е! а1., Р1ап! Се11, 10: 399-412, 1998; Сга1д е! а1., Р1ап! Се11 10: 413-426, 1998). Мутации, позволяющие определить роль фермента 88Ι, не описаны.
В эндосперме зерновых экспрессируется три формы ветвящего фермента, ветвящий фермент Ι (8ΒΕΙ), ветвящий фермент Па (8ВЕПа) и ветвящий фермент ПЬ (8ВЕПЬ) (Небтап апб Воуег, Вюсйеш1са1 Сепебск, 20: 483-492, 1982; Воуег апб РгеА. СатЬойубта!е Пекеатсй, 61: 321-334, 1978; Μί/ипо е! а1., 1оитпа1 о£ Вюсйеш1к1ту, 112: 643-651, 1992; 8ип е! а1., ТПе Ыете Р11у1о1ощк1 137: 215-215, 1997). Результаты выравнивания последовательностей 8ВЕ свидетельствуют о высокой степени подобия как нуклеотидных, так и аминокислотных последовательностей и позволяют сгруппировать ферменты в классы 8ВЕГ 8ВЕПа и 8ВЕПЬ.
В высших растениях присутствуют два типа деветвящих ферментов, которые различаются по субстратной специфичности, а именно деветвящие ферменты изоамилазного типа и деветвящие ферменты пуллуланазного типа (Муегк е! а1., Р1ап! РПук1о1оду, 122: 989-997, 2000). Мутации по 1 положению сахарного остатка в кукурузе и рисе связаны с дефицитом обоих деветвящих ферментов (1ашек е! а1., Р1ап! Се11, 7: 417-429, 1995; КиЬо е! а1., Р1ап! Рйукю1оду, 121: 399-409, 1999), однако казуальную мутацию вводят в такое же положение, как в гене деветвящего фермента изоамилазного типа.
Показано, что мутантная форма ячменя, обозначаемая М292 или М342, имеет фенотип, характеризующийся повышенным уровнем амилозного крахмала и пониженным уровнем амилопектинового крахмала. Предположительно данный фенотип оказывает благоприятное влияние на здоровье человека (Моге11 е! а1., Р1ап! 1. 34: 173-185, 2003; Торршд е! а1., 81атсй/8!атке 55: 539-545, 2003; В1гб е! а1., 1. ЫиН. 134: 831-835, 2004; В1гб е! а1. Вг. 1. ΝιιΙγ. 92: 607-615, 2004). Он обусловлен мутацией в гене синтазы крахмала Па (88Па) , расположенном на хромосоме 7Н ячменя, как описано в международной патентной заявке РСТ/АИ01/01452 (публикация № XVО 02/37955), описание которой полностью включено в настоящий документ в качестве ссылки.
Мутация ячменя кех6 является следствием присутствия стоп-кодона в гене синтазы крахмала Па (88Па). Стоп-кодон вызывает преждевременное окончание трансляции транскрипта. Белок 88Па не детектируется в эндосперме данного мутанта (Моге11 е! а1. 2003 (выше)). Утрата активности 88Па приводит к уменьшению синтеза амилопектина на 80%, а оставшиеся амилопектиновые полимеры, как правило, имеют измененное распределение длин цепей и, следовательно, измененное отношение амилоза: амилопектин, в результате крахмал зерна содержит примерно 70% амилозы.
В некоторых воплощениях настоящее изобретение предлагает повышение полезности растения ячменя путем увеличения содержания в зерне крахмала и отличных от крахмала компонентов. Модификация может присутствовать только в зерне или, альтернативно, она может присутствовать в разных тканях и частях растения. В данном описании термины модификация или модифицированный относятся к изменению в растении или зерне, которое может включать в себя увеличение или уменьшение количества, активности, скорости продукции, скорости инактивации, скорости разрушения, отсрочку начала экспрессии, раннее начало экспрессии, добавление или удаление вещества, мутацию или их сочетание при условии, что наблюдается пониженный уровень или пониженная активность синтазы крахмала ΙΙ. Термины включают в себя увеличение или уменьшение функционального уровня представляющего интерес гена или белка. Следует понимать, что термин функциональный уровень относится к уровню активного белка. Функциональный уровень представляет собой сочетание фактического уровня белка, присутствующего в клетке-хозяине, и удельной активности белка. Соответственно функциональный уровень можно модифицировать, например, путем увеличения или уменьшения фактической концентрации белка в клетке-хозяине, что легко достигается путем изменения экспрессии гена, кодирующего белок. Функциональный уровень также можно модифицировать путем модуляции удельной активности белка. Увеличение или уменьшение удельной активности можно достичь путем экспрессии варианта белка, обладающего более высокой или более низкой удельной активностью, или путем замены эндогенного гена, кодирующего релевантный белок, аллелью, кодирующей такой вариант. Увеличение или уменьшение удельной активности также можно достичь путем модификации экспрессии эффекторной молекулы. В некоторых воплощениях уровень экспрессии соответствующей кодирующей последовательности или активности или количества фермента выбирают так, чтобы он был по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 80% или даже по меньшей мере примерно на 100%, по
- 7 032207 меньшей мере на 200%, по меньшей мере на 500%, или по меньшей мере на 1000% выше, или по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% ниже, чем контрольный уровень экспрессии, или он может быть снижен до недетектируемого уровня.
Другой способ определения необходимого уменьшения уровня или активности 8811 включает в себя количественное определение в модифицированном растении или полученном из него зерне повышенного уровня или увеличения содержания в разных формах фруктана.
В данном описании термины модификация, изменение, повышение, повышенный, понижение, пониженный, ингибированный, мутантный и т.п. считаются родственными терминами и определяют состояние в сравнении с состоянием дикого типа или неизмененным состоянием. В некоторых воплощениях растение дикого типа может использоваться в качестве соответствующего контрольного растения, однако во многих ситуациях контрольное растение определяет опытный специалист в данной области, используя традиционные навыки.
Термин уровень белка относится к количеству конкретного белка, например 8811, которое можно измерить с помощью известных в данной области способов, таких как, например, вестерн-блоттинг или другие иммунологические методы анализа.
Термин уровень ферментативной активности относится к количеству конкретного фермента, измеряемому с помощью ферментного анализа.
Термин активность белка 8811а относится к количеству конкретного фермента, измеряемому с помощью ферментного анализа.
Следует понимать, что активность фермента в мутанте может измениться, если увеличить или уменьшить активность продуцируемого белка, но не уровень его экспрессии (количество). И наоборот, можно изменить количество белка, сохранив при этом его активность (на единицу белка). Кроме того, можно уменьшить и количество, и активность, например, путем уменьшения экспрессии гена, кодирующего фермент, на уровне транскрипции или на посттранскрипционном уровне. В некоторых воплощениях уровень или активность белка 8811 уменьшается по меньшей мере на 40% или по меньшей мере на 60% по сравнению с уровнем или активностью белка в зерне немодифицированного ячменя или по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95%. Уменьшение уровня белка, или активности фермента, или экспрессии гена можно осуществлять на любой стадии развития листа, семени или зерна, в особенности в дневное время, когда происходит фотосинтез, или в период налива зерна, когда в развивающемся эндосперме синтезируется крахмал, или на всех стадиях развития зерна на протяжении созревания. Термин дикий тип в настоящем описании имеет значение, традиционно используемое в области генетики, и включает в себя ячмень, сорт или генотип которого не подвергался изменениям, как описано в данном документе. Здесь описаны некоторые предпочтительные разновидности ячменя дикого типа, такие как, например, сорт Н1та1ауа.
Модифицированный фенотип можно получить путем частичного или полного ингибирования экспрессии гена 8811а. Гидролизованные и негидролизованные зерна и их фракции анализируют с помощью хорошо известных в данной области методов, таких как 8Ό8-ΡΑΟΕ и иммуноблоттинг, чтобы идентифицировать растения или зерна, которые содержат модификации крахмалобразующих ферментов. Указанные способы включают в себя анализ растений с помощью описанных здесь методов, а также с помощью таких методов, как анализ с использованием микрочипов, электрофорез, хроматография (в том числе бумажная хроматография, тонкослойная хроматография, газовая хроматография, газожидкостная хроматография и высокоэффективная жидкостная хроматография). Разделенные компоненты обычно идентифицируют путем сравнения профилей разделения с профилями разделения известных стандартов или с помощью аналитических методов, таких как масс-спектрометрия и спектроскопия ядерного магнитного резонанса. Например, описание таких способов можно найти в Ехатр1е 9, ВоЫикои, ТНс Огдашс СоикИ!иси!к о£ НщНсг Рк-нИк, Согбик Ргекк, ΝοΠίι АтНсгкк ϋ8Α, 1980; Абатк с! а1., Аиа1. ВюсНст.. 266: 77-84, 1999; Усгоискс с! а1., Εηζ. М1сгоЫа1 Тсс1г 24: 263-269, 1999; Нсибпх с! а1., 1. 1иксс! РЬ.у8ю1, 47: 423-432, 2001; Тйотркои с! а1., СагЬо11убга1с Иск., 331: 149-161, 2001 и в цитирующихся здесь ссылках. Углеводы можно анализировать с помощью стандартных методов, известных специалистам в данной области.
Изменение уровня или активности 8811а можно осуществить путем введения одного или нескольких генетических изменений в растение ячменя. То есть генетические изменения приводят непосредственно или косвенно к изменению активности или уровня фермента в части растения в процессе роста или развития и, следовательно, к описанным здесь изменениям фермента, крахмала и фруктана. Генетическое изменение может включать в себя введение в растение или клетку-предшественник гетерологичного полинуклеотида, например, путем трансформации или мутагенеза. Затем генетическое изменение можно ввести в другую генетическую среду путем скрещивания с помощью способов, известных в области селекции растений. В некоторых воплощениях уровень или функциональная активность 8811а подвергаются понижающей регуляции до уровня, составляющего менее чем примерно 80%, менее чем 70%, менее чем 60%, менее чем 50%, менее чем 40%, менее чем 30%, менее чем 20% или менее чем 15% и предпоч
- 8 032207 тительно менее чем примерно 10%, менее чем 9%, менее чем 8%, менее чем 7%, менее чем 6%, менее чем 5%, менее чем 4%, менее чем 3%, менее чем 2%, или менее чем 1% от соответствующих показателей контрольного растения, чтобы достичь повышенных уровней крахмала или отличных от крахмала компонентов, предпочтительно повышенного содержания амилозы в крахмале зерна. В предпочтительном воплощении повышенные уровни по меньшей мере в два раза превышают контрольные. Предпочтительно в данном воплощении указанное уменьшение приводит к значительному повышению уровня отличного от крахмала полисахарида, такого как фруктан, которое обычно составляет по меньшей мере примерно 50 или 55%, более предпочтительно по меньшей мере примерно 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или более по отношению к соответствующему уровню в контрольном растении, наблюдающемуся в таких же условиях окружающей среды. Необходимая степень снижения уровня или активности 8811а может зависеть от других факторов, таких как разновидность растения или факторы окружающей среды. Однако полагают, что любую оптимизацию, которая может потребоваться для такого процесса, можно осуществить с помощью рутинных методов, в том числе описанных здесь.
Пониженных уровней 8811а в тканях всего растения можно достичь, например, с использованием конститутивного промотора, управляющего экспрессией гетерологичного полинуклеотида, который осуществляет понижающую регуляцию 8811а. Предпочтительно снижение уровня 8811а можно проводить в акцептирующих тканях, более предпочтительно в развивающемся эндосперме с использованием тканеспецифичного или зависимого от стадии развития промотора. Термины акцептирующая клетка и акцептирующая ткань в данном описании относятся к клеткам, тканям или органам, в которых существует чистый приток органического углерода, который входит в клетки в виде, отличном от фиксированного диоксида углерода, т.е. в виде сахаров или других углеводов. В растениях акцептирующие ткани включают в себя все нефотосинтезирующие ткани, а также фотосинтезирующие ткани с чистым притоком органического углерода, фиксированного другими фотосинтезирующими клетками, или иным образом полученного из окружающей среды с использованием средств, отличных от непосредственной фиксации диоксида углерода.
Гены.
В некоторых воплощениях настоящее изобретение включает в себя модификацию активности и конструкции гена и применение химерных генов. В данном описании термин ген включает в себя любую дезоксирибонуклеотидную последовательность, содержащую участок, который кодирует белок или который транскрибируется в клетке, но не транслируется, и ассоциированные с ним некодирующие и регуляторные участки. Такие ассоциированные участки обычно расположены вблизи 5'- и З'-концов кодирующего или транскрибируемого участка, с каждой стороны на расстоянии примерно 2 т.о. Входящие в состав гена ассоциированные участки могут включать в себя регуляторные элементы, такие как промоторы, энхансеры, сигналы терминации и/или полиаденилирования, которые могут быть в природе связаны с данным геном, или могут представлять собой гетерологичные регуляторные элементы, в этом случае ген называют химерным. Последовательности, примыкающие к 5'-концу кодирующего участка и присутствующие в мРНК, называют 5'-нетранслируемые последовательности. Последовательности, примыкающие к З'-концу кодирующего участка или расположенные ниже и присутствующие в мРНК, называют З'-нетранслируемые последовательности. Термин ген охватывает как кДНК, так и геномные формы гена.
Термин ген синтазы крахмала II 8811 и т.п. в данном описании относится к нуклеотидной последовательности, кодирующей синтазу крахмала II (8811) в ячмене, которую специалисты в данной области могут легко отличить от других синтаз крахмала или других белков. В предпочтительном воплощении ген 88П ячменя представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая может присутствовать в ячмене, или может быть выделена из ячменя, или может быть получена из него и которая содержит нуклеотидную последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную последовательности кДНК, описанной в 8ЕО Ш N0: 1. В предпочтительном воплощении ген 88П представляет собой ген 88Па или белок 88П представляет собой белок 88Па, каждый из которых можно применить к одному из аспектов или ко всем аспектам изобретения, раскрытого в настоящем описании. Нуклеотидная последовательность кДНК гена 88Па из М292 описана в 8ЕО Ю N0: 9.
Геномная форма или клон гена содержит транскрибируемый участок, в который могут быть встроены некодирующие последовательности, называемые интроны, или встроенные участки, или встроенные последовательности. Термин интрон в данном описании относится к сегменту гена, который транскрибируется как часть первичного транскрипта РНК, но отсутствует в зрелой молекуле РНК. Интроны удаляются из ядерного или первичного транскрипта в процессе сплайсинга; таким образом, интроны отсутствуют в матричной РНК (мРНК). Интроны могут содержать регуляторные элементы, такие как энхансеры. Термин экзоны в данном описании относится к участкам ДНК, соответствующим последовательностям РНК, которые присутствуют в молекуле зрелой мРНК или зрелой РНК, в случае, если молекула РНК не транслируется. Функция мРНК в процессе трансляции заключается в определении последовательности или порядка аминокислот в образующемся полипептиде. Термин ген включает в себя синтетическую или гибридную молекулу, кодирующую полноразмерные белки настоящего изобретения
- 9 032207 или их фрагменты, а также нуклеотидную последовательность, комплементарную одной из указанных выше. Ген можно ввести в подходящий вектор, способный существовать в клетке вне хромосомы или способный интегрироваться в геном хозяина.
В данном описании термин химерный ген относится к любому гену, который не является нативным геном в его природном местоположении. Как правило, химерный ген содержит регуляторные и транскрибируемые или кодирующие белок последовательности, которые не встречаются вместе в природе. Соответственно химерный ген содержит регуляторные последовательности и кодирующие последовательности, полученные из разных источников, или регуляторные последовательности и кодирующие последовательности, полученные из одного источника, но расположенные в таком порядке, который отсутствует в природе. Термин эндогенный используется в настоящем описании для обозначения вещества, которое обычно присутствует или продуцируется в немодифицированном растении на той же стадии развития, на которой находится исследуемое растение. Термин эндогенный ген относится к нативному гену в его природном местоположении в геноме организма. В данном описании термин рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая была сконструирована или модифицирована с помощью методов рекомбинантных ДНК. Термины чужеродный полинуклеотид, или экзогенный полинуклеотид, или гетерологичный полинуклеотид и т.п. относится к любой нуклеиновой кислоте, введенной в геном клетки посредством экспериментальных манипуляций. Указанные термины включают в себя генные последовательности, обнаруженные в клетке, при условии, что введенный ген содержит некоторые изменения (такие как мутация, присутствие селектируемого маркерного гена и другие) по сравнению с природным геном. Чужеродные или экзогенные гены могут представлять собой гены, вставленные в неприродный организм, нативные гены, введенные в новое положение в нативном хозяине, или химерные гены. Трансген представляет собой ген, введенный в геном посредством процедуры трансформации. Термин генетически модифицированный включает в себя введение генов в клетки путем трансформации или трансдукции, мутагенез генов в клетках и изменение или модуляцию регуляции гена в клетке или организме, к которым применялись указанные действия, или в их потомстве.
Полинуклеотиды.
Настоящее изобретение, включающее в себя описание, таблицы и список последовательностей, относится к разным полинуклеотидам. В настоящем описании термин полинуклеотид, или нуклеиновая кислота, или молекула нуклеиновой кислоты обозначает полимер из нуклеотидов, который может представлять собой ДНК или РНК или их сочетание, и включает в себя мРНК, кРНК, кДНК, тРНК, миРНК, 8ЙРНК и ЬрРНК. Данный термин может относиться к ДНК или РНК клеточного, геномного или синтетического происхождения, например, полученной с помощью автоматического синтезатора, которая может образовывать комплекс с углеводами, липидами, белками и другими веществами, может содержать флуоресцентные и другие метки, или может быть присоединена к твердому носителю с целью выполнения определенной функции, указанной в данном описании, или она может содержать один или несколько модифицированных нуклеотидов, отсутствующих в природе, хорошо известных специалистам в данной области. Полимер может быть одноцепочечным, в основном двухцепочечным или частично двухцепочечным. Примером частично двухцепочечной молекулы РНК является шпилечная РНК (ЬрРНК), короткая шпилечная РНК (8ЙРНК) или самокомплементарная ΚΝΆ, которая содержит двухцепочечный участок, образованный в результате спаривания оснований, находящихся на комплементарных нуклеотидных последовательностях, и петлеобразную последовательность, в которой комплементарные нуклеотидные последовательности соединены ковалентно. В данном описании термин спаривание оснований относится к стандартному спариванию нуклеотидов, включающему в себя образование пар С:И. Термин комплементарные относится к двум полинуклеотидам, способным к спариванию оснований (гибридизации) на протяжении части последовательности или по всей длине последовательности одного или обоих полинуклеотидов. Термин способный к гибридизации полинуклеотид относится к полинуклеотиду, который в действительности способен к спариванию оснований с комплементарной ему последовательностью. Термин полинуклеотид и термин нуклеиновая кислота используются как взаимозаменяемые.
Термин выделенный относится к веществу, которое в основном или практически не содержит компоненты, обычно сопутствующие ему в нативном состоянии. В данном описании термин выделенный полинуклеотид или выделенная молекула нуклеиновой кислоты относится к полинуклеотиду, который, по меньшей мере, частично отделен от полинуклеотидных последовательностей, с которыми он ассоциирован или связан в нативном состоянии, или который в основном или практически не содержит такие полинуклеотидные последовательности. Например, выделенный полинуклеотид включает в себя полинуклеотид, очищенный или отделенный от последовательностей, которые фланкируют его в природном состоянии, например, фрагмент ДНК, который был отделен от последовательностей, которые обычно примыкают к данному фрагменту. Кроме того, предпочтительно выделенный полинуклеотид по меньшей мере на 90% освобожден от других компонентов, таких как белки, углеводы, липиды и другие. Термин рекомбинантный полинуклеотид в данном описании относится к полинуклеотиду, полученному ίη νίΐτο в результате манипуляций с нуклеиновой кислотой в виде формы, обычно не встречающейся в
- 10 032207 природе. Например, рекомбинантный полинуклеотид может находиться в виде вектора экспрессии. Как правило, такие векторы экспрессии содержат нуклеиновую кислоту, регулирующую транскрипцию и трансляцию, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью.
Настоящее изобретение относится к применению олигонуклеотидов. В данном описании термин олигонуклеотиды обозначает полинуклеотиды, содержащие до 50 нуклеотидов в длину. Они могут представлять собой РНК, ДНК или их сочетания или производные. Олигонуклеотиды, как правило, представляют собой относительно короткие одноцепочечные молекулы, содержащие от 10 до 30 олигонуклеотидов, обычно 15-25 нуклеотидов в длину. Минимальный размер олигонуклеотида, используемого в качестве зонда или в качестве праймера в реакции амплификации, представляет собой размер, необходимый для образования стабильного гибрида олигонуклеотида и комплементарной последовательности, входящей в состав целевой молекулы нуклеиновой кислоты. Предпочтительно олигонуклеотиды содержат по меньшей мере 15 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 18 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 19 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 20 нуклеотидов, еще более предпочтительно по меньшей мере 25 нуклеотидов в длину.
В качестве зонда обычно используют полинуклеотиды, конъюгированные с детектируемой меткой, такой как радиоизотоп, гаптен, фермент, биотин, флуоресцентная или хемилюминесцентная молекула. Олигонуклеотиды данного изобретения можно использовать в способах детекции аллеля 88ΙΙ или другого гена, связанного с представляющим интерес признаком, таким как измененные уровни крахмала или фруктана. Такие способы могут быть основаны, например, на гибридизации нуклеиновых кислот и зачастую включают в себя удлинение олигонуклеотидного праймера под действием подходящей полимеразы (как в методе ПЦР).
Вариант олигонуклеотида данного изобретения включает в себя молекулы разных размеров, способные гибридизоваться, например, с участком генома зерновых, близким описанным здесь специфическим олигонуклеотидным молекулам. Например, варианты могут содержать дополнительные нуклеотиды (например, 1, 2, 3, 4 или более) или меньше нуклеотидов при условии, что они сохраняют способность гибридизоваться с целевым участком. Кроме того, несколько нуклеотидов можно заменить, не оказывая неблагоприятного влияния на способность олигонуклеотида гибридизоваться с целевым участком. Кроме того, можно легко сконструировать варианты, которые гибридизуются с участком, находящимся вблизи, например, на расстоянии, не превышающем 50 нуклеотидов, участка растительного генома, с которым гибридизуются описанные здесь специфические олигонуклеотиды. Зонды, олигонуклеотиды и т.п. включают в себя описанные здесь последовательности или их корректные версии или варианты или функциональные гомологи из других зерновых растений.
Термины полинуклеотидный вариант, вариант и т.п. относятся к полинуклеотидам или комплементарным им формам, последовательности которых в значительной степени идентичны исходной полинуклеотидной последовательности. Данные термины также охватывают полинуклеотиды, полученные из исходного полинуклеотида путем добавления, делеции или замены по меньшей мере одного нуклеотида. Соответственно термины полинуклеотидный вариант и вариант включают в себя полинуклеотиды, в которых один или несколько нуклеотидов добавлены, или удалены, или замещены другими нуклеотидами. В этой связи в данной области хорошо известно, что в исходный полинуклеотид можно внести некоторые изменения, включающие в себя мутации, добавления, делеции и замены, так, что полученный в результате измененный полинуклеотид сохраняет биологическую функцию или активность исходного полинуклеотида. Соответственно указанные термины охватывают полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, обладающие ферментативной или другой регуляторной активностью, или полинуклеотиды, которые можно использовать в качестве селективных зондов или других способных к гибридизации средств. В частности, к ним относятся полинуклеотиды, которые кодируют одинаковые полипептидные или аминокислотные последовательности, но которые имеют разные нуклеотидные последовательности в результате избыточности генетического кода. Термины полинуклеотидный вариант и вариант также включают в себя встречающиеся в природе аллельные варианты.
Под термином соответствует или соответствующий подразумевают полинуклеотид, (а) имеющий нуклеотидную последовательность, которая практически идентична или комплементарна полноразмерной исходной полинуклеотидной последовательности или большей ее части, или (Ь) кодирующий аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности пептида или белка. В объем данного термина также входит пептид или полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая практически идентична последовательности аминокислот в исходном пептиде или белке. Для описания взаимоотношения последовательностей двух или более полинуклеотидов или полипептидов используют такие термины, как исходная последовательность, окно сравнения, идентичность последовательностей, процент идентичности последовательностей, практическая идентичность и идентичный, которые могут применяться в отношении к минимальному числу нуклеотидов или аминокислотных остатков или к полной длине последовательностей. Термины идентичность последовательностей и идентичность используются в настоящем описании как взаимозаменяемые для обозначения степени, в которой последовательности являются идентичными по нуклеотидному или аминокислотному составу на протяжении окна сравнения. Так процент идентичности последовательностей
- 11 032207 рассчитывают путем сравнения двух оптимально выравненных последовательностей в окне сравнения, определения числа положений обоих последовательностей, в которых находятся идентичные нуклеиновые основания (например, А, Т, С, С. и) или идентичные аминокислотные остатки (например, А1а, Рго, 8ег, ТЪг, С1у, Уа1, Ьеи, 11е, Рйе, Туг, Тгр, Ьук, Агд, Н1к, Акр, С1и, Аки, С1п, Сук и Ме1) с получением числа совпадающих положений, деления числа совпадающих положений на общее число положений в окне сравнения (т. е. на размер окна) и умножения результата на 100.
Процент идентичности полинуклеотидов можно определить с помощью анализа САР (ИееШетап апб Аипксй, 1. Мо1. Бю1. 48: 443-453, 1970) (программа ССС) с использованием штрафа за открытие гэпа=5 и штрафа за продолжение гэпа=0,3. Если не указано иначе, длина запрашиваемой последовательности составляет по меньшей мере 45 нуклеотидов, и с помощью анализа САР выравнивают две последовательности на протяжении участка, составляющего по меньшей мере 45 нуклеотидов. Предпочтительно длина запрашиваемой последовательности составляет по меньшей мере 150 нуклеотидов, и с помощью анализа САР выравнивают две последовательности на протяжении участка, составляющего по меньшей мере 150 нуклеотидов. Более предпочтительно длина запрашиваемой последовательности составляет по меньшей мере 300 нуклеотидов, и с помощью анализа САР выравнивают две последовательности на протяжении участка, составляющего по меньшей мере 300 нуклеотидов, или по меньшей мере 400, по меньшей мере 500 или по меньшей мере 600 нуклеотидов в каждом случае. Можно также использовать семейство программ ВЬА8Т, как описано, например, в А11ксНи1 е1 а1., Ыис1е1с АсШк Век. 25: 3389, 1997. Подробное обсуждение анализа последовательностей можно найти в разделе 19.3 АикиЬе1 е1 а1., Сштеп! Рго1осо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду, 1оЬп АПеу & 8опк 1пс, 1994-1998, СНар1ег 15.
Нуклеотидные или аминокислотные последовательности называют практически подобными, если такие последовательности идентичны по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, особенно предпочтительно по меньшей мере на 95% и наиболее предпочтительно, если такие последовательности являются полностью идентичными. Разумеется, если указано, что последовательности РНК являются практически подобными, соответствующими или в определенной степени идентичными последовательностям ДНК, тимин (Т) в последовательности ДНК считается эквивалентным урацилу (И) в последовательности РНК.
В отношении определенных полинуклеотидов следует понимать, что значения % идентичности, превышающие указанные значения, составляют предпочтительные воплощения. Так, если это применимо, с учетом минимальных значений % идентичности полинуклеотид предпочтительно содержит полинуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 91%, более предпочтительно по меньшей мере на 92%, более предпочтительно по меньшей мере на 93%, более предпочтительно по меньшей мере на 94%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, более предпочтительно по меньшей мере на 96%, более предпочтительно по меньшей мере на 97%, более предпочтительно по меньшей мере на 98%, более предпочтительно по меньшей мере на 99%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,1%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,2%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,3%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,4%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,5%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,6%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,7%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,8% и еще более предпочтительно по меньшей мере на 99,9% идентична релевантной представленной 8Еф ГО N0, такой как 8Еф ГО N0: 1 или 3-6.
Предпочтительно полинуклеотид данного изобретения, который кодирует полипептид с активностью 8811, содержит более 800, предпочтительно более 900 и еще более предпочтительно более 1000 или 2000 нуклеотидов в длину.
Полинуклеотиды настоящего изобретения могут содержать по сравнению с молекулами, встречающимися в природе, одну или несколько мутаций, которые представляют собой делеции, вставки или замены нуклеотидных остатков. Мутанты могут быть либо природными (то есть выделенными из природного источника) либо синтетическими (например, полученные путем направленного мутагенеза нуклеиновой кислоты).
Настоящее изобретение включает в себя применение жестких условий гибридизации для определения степени комплементарности двух полинуклеотидов. Термин жесткость в данном описании относится к условиям проведения гибридизации и промывания, включающим в себя температуру, ионную силу и присутствие или отсутствие некоторых органических растворителей. Чем выше жесткость, тем выше степень комплементарности целевой нуклеотидной последовательности и меченой полинуклеотидной последовательности (зонда). Термин жесткие условия относится к температуре и ионной силе, при которых гибридизуются только нуклеотидные последовательности с высокой встречаемостью комплементарных оснований. В данном описании термин гибридизация в условиях низкой жесткости, средней жесткости, высокой жесткости или очень высокой жесткости описывает условия гибридизации и промывания. Руководство по проведению реакций гибридизации можно найти в АикиЬе1 е1 а1., (ебк.), Сиггеп! Рго1осо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду, 1ойп АПеу & 8опк, ΝΥ, 6.3.1-6.3.6., 1989. В этой работе описаны водные и неводные способы, любые из которых можно использовать. В соответствии с настоящим изо
- 12 032207 бретением можно использовать следующие конкретные условия гибридизации: 1) условия низкой жесткости включают в себя проведение гибридизации в присутствии бХ хлорид натрия/цитрат натрия (88С) при 45°С, и затем двух промываний с использованием 0,2Х 88С, 0,1% 8Ό8 при 50-55°С; 2) условия средней жесткости включают в себя проведение гибридизации в присутствии бХ 88С примерно при 45°С, и затем одного или нескольких промываний с использованием 0,2Х 88С, 0,1% 8Ό8 при б0°С; 3) условия высокой жесткости включают в себя проведение гибридизации в присутствии бХ 88С при 45°С, и затем одного или нескольких промываний с использованием 0,2Х 88С, 0,1% 8Ό8 при б5°С; и 4) условия очень высокой жесткости включают в себя проведение гибридизации в присутствии 0,5М натрий-фосфатного буфера, 7% 8Ό8 при б5°С и затем одного или нескольких промываний с использованием 0,2Х 88С, 1% 8Ό8 при б5°С.
Полипептиды.
Термины полипептид и белок обычно используют как взаимозаменяемые. Термины белки и полипептиды в соответствии с данным описанием также включают в себя варианты, мутанты, модификации, аналоги и/или производные полипептидов настоящего изобретения, как описано в данном документе. Термин практически очищенный полипептид относится здесь к полипептиду, отделенному от липидов, нуклеиновых кислот, других пептидов и других молекул, с которыми он ассоциирован в природном состоянии. Предпочтительно практически очищенный полипептид по меньшей мере на 90% освобожден от других компонентов, с которыми он ассоциирован в природе. Под термином рекомбинантный полипептид подразумевают полипептид, полученный рекомбинантными методами, т. е. путем экспрессии рекомбинантного полинуклеотида в клетке, предпочтительно в клетке растения и более предпочтительно в клетке злакового растения.
Примеры полипептидов, обладающих активностью 8811, приведены в списке последовательностей и описаны в табл. 8. Соответственно настоящее изобретение предлагает, без ограничения, модификации полипептидов 8811, имеющих аминокислотные последовательности, описанные в 8ЕЦ ГО N0: 2, а также по по по по по по по по мере мере мере мере меньшей меньшей меньшей меньшей меньшей мере на меньшей мере на меньшей мере на меньшей мере на на 93%, более предпочтительно по меньшей мере на 94%, на 95%, более предпочтительно по меньшей мере на 9б%, на 97%, более предпочтительно по меньшей мере на 98%, на 99%, более предпочтительно по меньшей мере
99,2%, более
99,4%, более
99,б%, более
99,8% и еще на на на на более более более более
99,1%,
99,3%, более
99,5%, более
99,7%, более предпочтительно по меньшей мере предпочтительно по меньшей мере предпочтительно по меньшей мере более предпочтительно по меньшей мере на 99,9% природные варианты, их исправленные версии и варианты, описанные в данном документе, такие как варианты, обладающие примерно 80% идентичностью последовательности.
Следует понимать, что в отношении к определенному полипептиду значения % идентичности, превышающие указанные выше, составляют предпочтительные воплощения. Так, если это применимо, с учетом минимальных значений % идентичности, полипептид предпочтительно содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75%, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 91%, более предпочтительно по меньшей мере на 92%, более предпочтительно предпочтительно предпочтительно предпочтительно предпочтительно предпочтительно предпочтительно предпочтительно идентична релевантной представленной 8ЕЦ ГО N0 2.
Процент идентичности полипептида другому полипептиду можно определить с помощью анализа САР (№еб1етап апб АшъсН. 1970 (выше)) (программа ССС) с использованием штрафа за открытие гэпа=5 и штрафа за продолжение гэпа=0,3. Длина запрашиваемой последовательности составляет по меньшей мере 15 аминокислот, и с помощью анализа САР выравнивают две последовательности на протяжении участка, составляющего по меньшей мере 15 аминокислот. Более предпочтительно длина запрашиваемой последовательности составляет по меньшей мере 50 аминокислот, и с помощью анализа САР выравнивают две последовательности на протяжении участка, составляющего по меньшей мере 50 аминокислот. Более предпочтительно длина запрашиваемой последовательности составляет по меньшей мере 100 аминокислот, и с помощью анализа САР выравнивают две последовательности на протяжении участка, составляющего по меньшей мере 100 аминокислот. Еще более предпочтительно длина запрашиваемой последовательности составляет по меньшей мере 250 аминокислот, и с помощью анализа САР выравнивают две последовательности на протяжении участка, составляющего по меньшей мере 250 ами нокислот.
Используемый здесь биологически активный фрагмент полипептида является частью полипептида настоящего изобретения, которая имеет размер меньше, чем полная длина полипептида, и сохраняет определенную активность полноразмерного полипептида. В особенно предпочтительном воплощении биологически активный фрагмент способен к синтезу крахмала с получением цепей амилозы, в которых содержание ΌΡ составляет по меньшей мере 15. Биологически активные фрагменты могут иметь любой размер при условии сохранения заданной активности, однако предпочтительно их длина составляет по меньшей мере 200 или по меньшей мере 250 аминокислотных остатков.
- 13 032207
Мутантные аминокислотные последовательности полипептидов настоящего изобретения можно получить путем введения соответствующих нуклеотидных изменений в нуклеиновую кислоту настоящего изобретения или путем синтеза ίη νίΐΐΌ целевого полипептида. Такие мутантные последовательности включают в себя, например, делеции, инсерции или замены остатков аминокислотной последовательности. Для получения конечной конструкции можно использовать сочетание делеции, инсерции и замены при условии, что конечный пептидный продукт обладает желательными характеристиками.
Мутантные (измененные) пептиды можно получить с помощью любого известного в данной области метода. Например, полинуклеотид настоящего изобретения можно подвергнуть мутагенезу ίη νίΙΐΌ. Способы осуществления мутагенеза ίη νίΙΐΌ включают в себя субклонирование полинуклеотида в подходящем векторе, трансформацию вектором мутируемого штамма, такого как Е. со11 ХЬ-1 геб (8(га1адепе) и размножение трансформированной бактерии до получения подходящего числа поколений. В другом примере полинуклеотиды настоящего изобретения подвергают методам перетасовки ДНК, подробно описанным Нагауата, Тгепбк Вю1ес11по1. 1б: 7б- 82, 1998. Для проведения указанных методов перетасовки ДНК можно использовать гены, родственные генам настоящего изобретения, такие как гены 8811 из видов растений, отличных от пшеницы или ячменя, и/или другие гены из того же растения, кодирующие подобные белки, такие как гены синтазы крахмала I или III пшеницы или ячменя. Продукты, полученные с использованием мутантной/измененной ДНК, можно подвергнуть скринингу с помощью описанных здесь методов, чтобы определить, обладают ли они, например, активностью синтазы крахмала.
При конструировании мутантных аминокислотных последовательностей местоположение и природа мутации зависят от признака (признаков), подлежащих изменению. Участки введения мутаций можно изменять по отдельности или последовательно, например, (1) вначале путем замен на консервативные аминокислоты и затем путем более радикальных замен в зависимости от достигнутых результатов, (2) путем делеции целевого остатка или (3) путем вставки других остатков, примыкающих к указанному участку.
Делеции в аминокислотной последовательности, как правило, включают в себя удаление примерно от 1 до 15 остатков, более предпочтительно примерно от 1 до 10 остатков и чаще всего примерно от 1 до 5 смежных остатков.
Замены включают в себя удаление по меньшей мере одного аминокислотного остатка и вставку на его место другого остатка. Участки, представляющие наибольший интерес с точки зрения заместительного мутагенеза, включают в себя положения, идентифицированные как активный участок (активные участки). Также представляют интерес участки, в которых отдельные остатки являются идентичными у разных штаммов или видов. Такие положения могут иметь большое значение для биологической активности. В указанных участках, особенно в тех, которые входят в состав последовательности, включающей в себя по меньшей мере три других идентично консервативных участка, предпочтительно проводят относительно консервативные замены. Такие консервативные замены показаны в табл. 10 под заголовком Примеры замен.
Полипептиды настоящего изобретения можно получить разными способами, включающими в себя получение и выделение природных полипептидов, получение и выделение рекомбинантных полипептидов и химический синтез полипептидов. В одном воплощении выделенный полипептид настоящего изобретения получают путем культивирования клетки, способной экспрессировать полипептид в условиях, эффективных для получения полипептида, и выделения полипептида. Предпочтительной клеткой, используемой для культивирования, является рекомбинантная клетка настоящего изобретения. Эффективные условия культивирования включают в себя, без ограничения, эффективную среду, биореактор, температуру, рН и содержание кислорода, которые обеспечивают продукцию полипептида. Эффективная среда представляет собой любую среду, в которой можно культивировать клетку с получением полипептида настоящего изобретения. Такая среда, как правило, включает в себя водную среду, содержащую усваиваемые источники углерода, азота и фосфата, а также подходящие соли, минералы, металлы и другие питательные вещества, такие как витамины. Клетки настоящего изобретения можно культивировать в традиционных ферментационных биореакторах, встряхиваемых колбах, пробирках, микротитрационных чашках и чашках Петри. Рекомбинантную клетку можно культивировать при подходящих значениях температуры, рН и содержания кислорода. Выбор таких условий культивирования находится в пределах компетенции рядового специалиста в данной области.
Настоящее изобретение относится к функционально соединенным или связанным элементам. Термины функционально соединенный или функционально связанный и т.п. относятся к функциональной взаимосвязи полинуклеотидных элементов. Как правило, функционально связанные нуклеотидные последовательности соединены непосредственно друг с другом, а если нужно соединить два участка, кодирующих белки, их располагают по соседству друг с другом в рамке считывания. Кодирующая последовательность функционально связана с другой кодирующей последовательностью, если две кодирующие последовательности транскрибируются под действием РНК-полимеразы в одну РНК, которая транслируется, если трансляция имеет место, в один полипептид, содержащий аминокислоты, кодируемые двумя кодирующими последовательностями. Кодирующие последовательности могут не примыкать одна к другой при условии, что экспрессируемые последовательности в конечном счете после процес
- 14 032207 синга дают целевой белок.
В данном описании термины цис-действующая последовательность, цис-действующий элемент или цис-регуляторный участок, или регуляторный участок, или подобные им термины используют для обозначения любой последовательности нуклеотидов, которая при соответствующем расположении и соединении с экспрессируемой генной последовательностью способна регулировать, по меньшей мере, частично экспрессию генной последовательности. Специалистам в данной области известно, что цисрегуляторный участок может осуществлять активацию экспрессии, сайленсинг гена, повышение, подавление или иное изменение уровня экспрессии и/или он может отвечать за клеточную специфичность и/или специфичность к стадии развития генной последовательности на транскрипционном или посттранскрипционном уровне. В некоторых воплощениях настоящего изобретения цис-действующая последовательность представляет собой активаторную последовательность, которая повышает или стимулирует экспрессию генной последовательности.
Термин функционально связанный в отношении промоторного или энхансерного элемента и транскрибируемого полинуклеотида означает, что транскрибируемый полинуклеотид (например, полинуклеотид, кодирующий белок, или другой транскрипт) помещают под регуляторный контроль промотора, который впоследствии регулирует транскрипцию данного полинуклеотида. При конструировании сочетаний гетерологичный промотор/структурный ген, как правило, предпочитают располагать промотор или его вариант на расстоянии от участка начала транскрипции транскрибируемого полинуклеотида, которое примерно равно расстоянию между промотором и регулируемым им белок-кодирующим участком, присутствующему в природе; т.е. в гене, из которого получен промотор. Как известно в данной области, некоторые изменения этого расстояния можно использовать без потери функции. Подобным образом, предпочтительное положение последовательности регуляторного элемента (например, оператора, энхансера и других) по отношению к регулируемому им транскрибируемому полинуклеотиду определяется положением элемента в природном окружении; т.е. в гене, из которого он получен.
Термин промотор или промоторная последовательность в настоящем описании относится к участку гена, обычно расположенного выше по ходу считывания (5') РНК-кодирующего участка, который контролирует инициацию и уровень транскрипции в представляющей интерес клетке. Промотор включает в себя последовательности, регулирующие транскрипцию классического геномного гена, такие как последовательности ТАТА-блока и ССААТ-блока, а также другие регуляторные элементы (т.е. расположенные выше активирующие последовательности, энхансеры и сайленсеры), которые изменяют экспрессию гена в ответ на дифференцировочные стимулы и/или стимулы окружающей среды или обеспечивают тканеспецифичную или клеточно-специфичную экспрессию гена. Промотор чаще всего, но не обязательно (например, некоторые промоторы Ро1111), располагают выше структурного гена, экспрессию которого он регулирует. Кроме того, регуляторные элементы, содержащие промотор, обычно располагают на расстоянии 2 т. о. от участка начала транскрипции. Промоторы могут содержать другие специфические регуляторные элементы, расположенные дальше от участка начала транскрипции, которые позволяют дополнительно увеличить экспрессию в клетке и/или изменить хронирование или индуцируемость экспрессии структурного гена, с которым они функционально связаны.
Термин конститутивный промотор относится к промотору, который управляет экспрессией функционально связанной с ним транскрибируемой последовательности во многих или во всех тканях растения. Термин конститутивный в данном описании не обязательно указывает на то, что ген экспрессируется в клетках всех типов на одинаковом уровне, но что ген экспрессируется в широком диапазоне клеток, хотя часто детектируются некоторые изменения уровня. Термин селективная экспрессия в настоящем описании относится к экспрессии почти исключительно в отдельных органах растения, таких как, например, эндосперм, зародыш, листья, плоды, клубни или корни. В одном воплощении промотор экспрессируется во всех фотосинтезирующих тканях, которые могут соответствовать всем надземным частям растения, примером такого промотора является промотор, участвующий в экспрессии гена, необходимого для фотосинтеза, такой как промотор малой субъединицы рибулозо-1,5бифосфаткарбоксилазы/оксигеназы. Термин также может относиться к экспрессии на отдельных стадиях развития органа, таких как ранний или поздний эмбриогенез или разные стадии созревания; или к экспрессии, индуцируемой некоторыми условиями или воздействиями окружающей среды. Таким образом, селективную экспрессию можно противопоставить конститутивной экспрессии, которая осуществляется во многих или во всех тканях растения в любых или почти в любых условиях, воздействующих на растение.
Селективная экспрессия также может приводить к компартментализации продуктов экспрессии генов в отдельных тканях или органах растений или на отдельных стадиях развития. Распределение по конкретным субклеточным компартментам, таким как эндосперм, цитозоль, вакуоли или апопластическое пространство, можно осуществлять путем включения в структуру генного продукта соответствующих сигналов, обеспечивающих транспорт в нужный клеточный компартмент, или в случае полуавтономных органелл (пластиды и митохондрии) путем интеграции трансгена, содержащего подходящие регуляторные последовательности, непосредственно в геном органеллы.
Тканеспецифичный промотор или органоспецифичный промотор представляет собой промотор,
- 15 032207 который селективно экспрессируется в одной ткани или в одном органе по сравнению с многими другими тканями или органами, предпочтительно с большей частью, если не со всеми другими тканями или органами растения. Как правило, уровень экспрессии промотора в специфической ткани или в специфическом органе в 10 раз превышает уровень экспрессии в других тканях или органах. Примером тканеспецифичного промотора является промотор гена высокомолекулярного (НМ^) глютенина, Вх17, который преимущественно экспрессируется в развивающемся эндосперме злаковых растений. Другие эндоспермспецифичные промоторы включают в себя промотор высокомолекулярного глютенина, промотор 881 пшеницы и промотор ВЕ II пшеницы. Другие эндоспермспецифичные промоторы можно легко получить из генов, которые кодируют ферменты биосинтеза крахмала или запасные белки в развивающемся зерне.
Промоторы, охватываемые настоящим изобретением, могут быть нативными по отношению к растению-хозяину или они могут быть получены из альтернативного источника, в этом случае промоторный участок должен быть способен к функционированию в растении-хозяине. Другие источники включают в себя гены Т-ДНК АдгоЬас!егшт, такие как промоторы генов биосинтеза нопалина, октапина, маннопина или другие опиновые промоторы; растительные промоторы, такие как промоторы убиквитина, например промотор иЫ из гена кукурузы иЬ1-1, СНпкЮпкеп е! а1., (1996) (см., например, патент И8 № 4962028) или промоторы актина; тканеспецифичные промоторы (см., например, патент США № 5459252, СопкЕпд е! а1.; \ν0 91/13992, Абуапсеб Тес11по1од1е8); промоторы вирусов (включающих в себя хозяинспецифичные вирусы) или частично или полностью синтетические промоторы. В данной области известно большое число промоторов, способных функционировать в однодольных и двудольных растениях (см., например, Сгеуе I. Мо1. Арр1. Сепе!., 1: 499-511, 1983; 8а1отоп е! а1., ЕМВ0 I., 3: 141-146, 1984; СагГтке1 е! а1., Се11, 27: 143-153, 1983; Вагкег е! а1., Р1ап! Мо1. Вю1., 2: 235-350, 1983); они включают в себя разные промоторы, выделенные из растений и вирусов, такие как промотор вируса мозаики цветной капусты (СаМУ 358, 198) . Известно много тканеспецифичных промоторных участков. Другие участки инициации транскрипции, которые преимущественно обеспечивают транскрипцию в отдельных тканях или в определенных условиях роста, включают в себя участки, полученные из генов, кодирующих напин, АСР семян, зеин или другие запасные белки семян. Также известны плодоспецифичные промоторы, такие как промотор Е8, описанный Ое1ктап е! а1., ЕМВ0 I., 2: 3315-3320, 1998 и ^е11аРеηиа е! а1., Р1ап! Се11, 1: 53-63, 1989. Неограничивающие способы определения промоторной активности раскрыты МебЬеггу е! а1., Р1ап! Се11, 4: 185-192, 1992; МебЬеггу е! а1., Р1ап! I. 3: 619-626, 1993, 8атЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1 (2пб еб.). Со1б 8рппд НагЬоиг ЬаЬога!огу, Со1б 8рппд НагЬоиг, ΝΥ, 1989 и МсРкегкоп е! а1. (патент США № 5164316).
Альтернативно или дополнительно промотор может представлять собой индуцируемый промотор или зависимый от стадии развития промотор, который может управлять экспрессией введенного полинуклеотида на соответствующей стадии развития растения. Другие заслуживающие особого внимания и подходящие для применения последовательности включают в себя энхансеры транскрипции и/или трансляции. Энхансерные участки хорошо известны специалистам в данной области и могут включать в себя кодон инициации трансляции АТС и примыкающие к нему последовательности. Кодон инициации должен функционировать синхронно с рамкой считывания кодирующей последовательности, включающей в себя чужеродный или экзогенный полинуклеотид, чтобы обеспечить трансляцию полноразмерной последовательности. Сигналы, регулирующие трансляцию, и кодоны инициации могут иметь разное происхождение как природное, так и синтетическое. Участки инициации трансляции можно получить из источника участков инициации транскрипции или из чужеродного или экзогенного полинуклеотида. Последовательность также можно получить из источника промотора, используемого для управления транскрипцией, и ее можно специфически модифицировать с целью увеличения трансляции мРНК.
Конструкция нуклеиновой кислоты настоящего изобретения обычно содержит 3'-нетранслируемую последовательность, состоящую примерно из 50-1000 пар нуклеотидных оснований, которые могут включать в себя последовательность терминации транскрипции. 3'-Нетранслируемая последовательность может содержать сигнал терминации транскрипции, который необязательно может включать в себя сигнал полиаденилирования и другие регуляторные сигналы, способные влиять на процессинг мРНК. Сигнал полиаденилирования участвует в добавлении полиадениловой кислоты к 3'-концу предшественника мРНК. Сигналы полиаденилирования обычно распознают по наличию гомологии с канонической формой 5'-ААТААА-3', хотя часто встречаются вариации. Последовательности терминации транскрипции, в которых отсутствует сигнал полиаденилирования, содержат терминаторы для РНК-полимеразы Ро11 или Ро1Ш, которые включают в себя участок из четырех или более остатков тимидина. Примеры подходящих 3'-нетранслируемых последовательностей представляют собой 3' -транскрибируемые нетранслируемые участки, содержащие сигнал полиаденилирования из гена нопалин-синтазы (пок) АдгоЬас!егшт !ите£ааепк (Веуап е! а1., Νικ1 Ас1б Кек., 11: 369, 1983) и терминатор транскрипта Т7 из гена октопин-синтазы АдгоЬас!егшт ШтеГааепк. Альтернативно подходящие 3'-нетранслируемые последовательности можно получить из растительных генов, например из 3'-конца генов ингибитора протеазы I или II картофеля или томата, генов запасных белков соевых бобов и гена малой субъединицы рибулозо-1,5бифосфаткарбоксилазы (88КиВ!8С0). хотя можно использовать и другие 3'-элементы, известные специалистам в данной области. Альтернативно 3'-нетранслируемые регуляторные последовательности
- 16 032207 можно получить бе ηονο, как описано, например, в Ап, МеШобк ίη Епхуто1оду. 153: 292, 1987, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки.
Поскольку последовательность ДНК, находящаяся между участком инициации транскрипции и началом кодирующей последовательности, т.е. нетранслируемая 5'-лидерная последовательность (5'ИТВ), может влиять на экспрессию гена, также можно использовать определенную лидерную последовательность. Подходящие лидерные последовательности включают в себя последовательности, обеспечивающие непосредственную оптимизацию экспрессии чужеродной или эндогенной последовательности ДНК. Например, такие лидерные последовательности включают в себя предпочтительную консенсусную последовательность, которая может повышать или поддерживать стабильность мРНК и предотвращать некорректную инициацию трансляции, как описано, например, в 1окЫ, Νιιοί АсИВек. 15: 6643, 1987.
Кроме того, можно использовать направляющие последовательности, которые обеспечивают направление фермента, кодируемого чужеродным или экзогенным полинуклеотидом, во внутриклеточный компартмент, например в хлоропласт, находящийся в клетке растения, или во внеклеточную среду. Например, нуклеотидная последовательность, кодирующая транзитную или сигнальную пептидную последовательность, может быть функционально связана с последовательностью, кодирующей выбранный фермент настоящего изобретения, так что после трансляции транзитный или сигнальный пептид может транспортировать фермент в конкретное внутриклеточное или внеклеточное место назначения, после чего его необязательно подвергают посттрансляционному удалению. Действие транзитных или сигнальных пептидов заключается в обеспечении транспорта белков через внутриклеточные мембраны, такие как мембраны эндоплазматического ретикулума, вакуолей, везикул, пластид, митохондрий и плазмалемма. Например, направляющая последовательность может направлять целевой белок к конкретной органелле, отличной от цитозоля, такой как вакуоль или пластида (например, хлоропласт). Таким образом, нуклеотидная конструкция настоящего изобретения может дополнительно содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид доставки в пластиду, функционально связанную с промоторным участком и чужеродным или экзогенным полинуклеотидом.
Векторы.
Настоящее изобретение включает в себя применение векторов для манипуляций или переноса генетических конструкций. Термин вектор относится к молекуле нуклеиновой кислоты, предпочтительно молекуле ДНК, полученной, например, из плазмиды, бактериофага или вируса растения, в которую можно вставить или в которой можно клонировать нуклеотидную последовательность. Предпочтительно вектор содержит один или несколько уникальных участков рестрикции и обладает способностью к автономной репликации в определенной клетке-хозяине, включающей в себя клетку- или ткань-мишень, или клетку или ткань, являющиеся их предшественниками, или способностью интегрироваться в геном определенного хозяина, обеспечивая воспроизведение клонируемой последовательности. Соответственно вектор может представлять собой автономно реплицирующийся вектор, т.е. вектор, существующий вне хромосомы, репликация которого происходит независимо от репликации хромосом, такой как линейная или замкнутая циклическая плазмида, внехромосомный элемент, мини-хромосома или искусственная хромосома. Такой вектор может содержать любые элементы, обеспечивающие саморепликацию. Альтернативно вектор может представлять собой вектор, который после введения в клетку интегрируется в геном реципиентной клетки и реплицируется вместе с хромосомой (хромосомами), в которую он интегрировался. Векторная система может содержать один вектор или одну плазмиду или несколько векторов или плазмид, которые вместе содержат полноразмерную ДНК, подлежащую введению в геном клеткихозяина, или транспозон. Выбор вектора обычно определяется совместимостью вектора с клеткой, в которую вводят вектор. Вектор также может содержать маркер селекции, такой как ген устойчивости к антибиотику, ген устойчивости к гербициду или другой ген, который можно использовать для селекции подходящих трансформантов. Примеры таких генов хорошо известны специалистам в данной области.
Нуклеотидную конструкцию настоящего изобретения можно ввести в вектор, такой как плазмида. Плазмидные векторы обычно содержат дополнительные нуклеотидные последовательности, которые позволяют легко провести селекцию, амплификацию и трансформацию прокариотических и эукариотических клеток кассетой экспрессии, такие как векторы, полученные на основе рИС, р8К, рСЕМ, р8Р или рВ8. Дополнительные нуклеотидные последовательности содержат точки начала репликации, обеспечивающие автономную репликацию вектора, селектируемые маркерные гены, предпочтительно кодирующие устойчивость к антибиотику или гербициду, уникальные участки множественного клонирования, позволяющие вставлять нуклеотидные последовательности или гены в нескольких участках нуклеотидной конструкции, а также последовательности, которые повышают трансформацию прокариотических и эукариотических (особенно растительных) клеток.
Термин маркерный ген относится к гену, который придает клеткам, экспрессирующим маркерный ген, особый фенотип и, следовательно, позволяет отличать такие трансформированные клетки от клеток, не содержащих маркер. Селектируемый маркерный ген обуславливает признак, позволяющий проводить отбор по устойчивости к селекционному средству (включающему в себя гербицид, антибиотик, облучение, нагревание или другое воздействие, разрушающее нетрансформированные клетки). Облегчающий скрининг маркерный ген (или репортерный ген) отвечает за признак, который можно идентифицировать
- 17 032207 посредством наблюдения или тестирования, т.е. путем скрининга (например, он может обуславливать активность β-глюкуронидазы, люциферазы, СЕР или другого фермента, отсутствующую в нетрансформированных клетках). Маркерный ген и представляющая интерес нуклеотидная последовательность не должны быть связаны.
Чтобы облегчить идентификацию трансформантов, нуклеотидная конструкция предпочтительно содержит селектируемый или облегчающий скрининг маркерный ген вместо или помимо чужеродного или экзогенного полинуклеотида. Можно использовать любой маркер при условии, что он способен функционировать (т.е. может служить селекционным средством) в выбранной растительной клетке. Маркерный ген и представляющий интерес чужеродный или экзогенный полинуклеотид могут не быть связанными, поскольку можно эффективно осуществлять совместную трансформацию растения несвязанными генами, как описано, например, в патенте США № 4399216.
Примерами бактериальных селектируемых маркеров являются маркеры, придающие устойчивость к антибиотикам, таким как ампициллин, канамицин, эритромицин, хлорамфеникол или тетрациклин. Примеры маркеров, используемых для облегчения селекции трансформантов растений, включают в себя, без ограничения, ген йуд, который кодирует устойчивость к гидромицину В; ген неомицинфосфотрансферазы (ηρΐ), который придает устойчивость к канамицину, паромомицину, С418 и т.п., как, например, описано Ро!гукик е! а1., Мо1 Сеп. Сепе1. 199: 183, 1985; ген глутатион-8-трансферазы из крысиной печени, который придает устойчивость к полученным на основе глутатиона гербицидам, как описано, например, в ЕР-А 256223; ген глутамин-синтазы, который в случае повышенной экспрессии обуславливает устойчивость к ингибиторам глутамин-синтазы, таким как фосфинотрицин, как описано, например, в УО 87/05327, ген ацетилтрансферазы 81гер1отусек ушйосйтотодепек, придающий устойчивость к селекционному средству фосфинотрицин, как описано, например, в ЕР-А 275957, ген, кодирующий 5енолшикимат-3-фосфат-синтазу (ЕР8Р8), который обуславливает толерантность к Νфосфонометилглицину, как описано, например, в Нтсйее е! а1., Вю!есй. 6: 915, 1988, ген Ьат, придающий устойчивость к биалафосу, как описано, например, в УО 91/02071; ген нитрилазы, такой как Ьхп из К1еЬ81е11а охаете, придающий устойчивость к бромоксинилу (81а1кет е! а1., 8с1епсе, 242: 419, 1988); ген дигидрофолатредуктазы (ΌΗΕΒ), придающий устойчивость к метотрексату (ТЫ11е! е! а1., 1 Вю1. Сйетп. 263: 12500, 1988); мутантный ген ацетолактат-синтазы (АЕ8), придающий устойчивость к имидазолинону, сульфонилмочевине или другим АЬ8-ингибирующим химическим веществам (ЕР-А 154204); мутантный ген антранилат-синтазы, придающий устойчивость к 5-метилтриптофану; или ген далапон-дегалогеназы, придающий устойчивость к гербициду.
Предпочтительные облегчающие скрининг маркеры включают в себя, без ограничения, ген шбА, кодирующий фермент β-глюкуронидазу (СИ8), для которого известны разные хромогенные субстраты, ген β-галактозидазы, кодирующий фермент, для которого известны разные хромогенные субстраты, ген экворина (Ртакйег е! а1., Вюсйет. Вюрйук. Век. Сотт. 126: 1259-68, 1985), который можно использовать для детекции кальцийчувствительной биолюминесценции; ген зеленого флуоресцентного белка (№е6х е! а1., Р1ап! Се11 Керойк, 14: 403, 1995); ген люциферазы (1ис) (Ο\ν е! а1., 8с1епсе, 234: 856, 1986), который позволяет осуществлять детекцию биолюминесценции, и другие известные в данной области гены. Термин репортерная молекула в настоящем описании относится к молекуле, которая вследствие ее химической природы генерирует идентифицируемый аналитическими методами сигнал, который облегчает определение активности промотора по анализу белкового продукта.
Способы модификации экспрессии гена.
Уровень белка, такого как фермент, участвующий в синтезе крахмала в развивающемся эндосперме растения ячменя, можно модулировать путем повышения уровня экспрессии нуклеотидной последовательности, кодирующей белок в клетке растения, или уменьшения уровня экспрессии гена, кодирующего белок в растении, с целью изменения накопления фруктана в зерне. Уровень экспрессии гена можно модулировать путем изменения числа копий на клетку, например путем введения синтетической генетической конструкции, содержащей кодирующую последовательность и элемент, регулирующий транскрипцию, функционально связанный с кодирующей последовательностью и способный функционировать в клетке. Выбранную совокупность трансформантов можно подвергнуть скринингу с целью выявления трансформантов с желательным уровнем и/или желательной специфичностью экспрессии трансгена, обусловленных влиянием эндогенных последовательностей, находящихся вблизи участка интеграции трансгена. Желательный уровень и характер экспрессии трансгена приводит к существенному увеличению уровней фруктана. Указанные уровни можно детектировать путем простого тестирования зерна трансформантов. Альтернативно, скринингу с целью выявления отдельных линий с повышенным накоплением фруктана можно подвергнуть популяцию зерна, полученного в результате мутагенеза, или популяцию растений, полученных с помощью селекционной программы.
Уменьшения экспрессии гена можно достичь путем введения в растительную клетку и последующей транскрипции химерного гена, обеспечивающего сайленсинг гена. Можно осуществить стабильное введение химерного гена, обеспечивающего сайленсинг гена, в геном растительной клетки, предпочтительно в ядерный геном, или такой ген можно ввести временно, например, в составе вирусного векто
- 18 032207 ра. В данном описании термин эффект сайленсинга генов относится к уменьшению экспрессии целевой нуклеиновой кислоты в клетке растения в результате введения РНК, обуславливающей сайленсинг. Такое уменьшение может являться следствием уменьшения транскрипции, обусловленного метилированием при реконструкции хроматина или посттранскрипционной модификацией молекул РНК, в том числе разрушением РНК, или и тем, и другим. Сайленсинг гена включает в себя полное или частичное (в любой степени и любой длительности) прекращение экспрессии целевой нуклеиновой кислоты или целевого гена. Достаточно, чтобы уровень экспрессии целевой нуклеиновой кислоты в присутствии РНК, обеспечивающей сайленсинг, был ниже, чем в ее отсутствие. Уменьшение уровня экспрессии может составлять по меньшей мере примерно 40%, или по меньшей мере примерно 50%, или по меньшей мере примерно 60%, или по меньшей мере примерно 70%, или по меньшей мере примерно 80%, или по меньшей мере примерно 90%, или по меньшей мере примерно 95%, или по меньшей мере примерно 99%. Целевая нуклеиновая кислота может представлять собой ген, участвующий в синтезе или метаболизме крахмала, например в разрушении крахмала, однако она также может включать в себя любые другие эндогенные гены, трансгены или экзогенные гены, такие как вирусные гены, которые могут отсутствовать в клетке во время введения трансгена.
Молекулы антисмысловых РНК.
В соответствии с настоящим изобретением для уменьшения экспрессии гена можно использовать антисмысловые методы. Термин антисмысловая РНК относится к молекуле РНК, комплементарной по меньшей мере части конкретной молекулы мРНК и способной уменьшать экспрессию гена, кодирующего указанную мРНК. Как правило, такое уменьшение происходит в последовательностьзависимой манере, предположительно, в результате препятствования посттранскрипционному событию, такому как транспорт мРНК из ядра в цитоплазму, стабильность мРНК или ингибирование трансляции. Антисмысловые методы широко используются в данной области (см., например, Найтапп апб Епбгек, Мапиа1 о£ Антисмысловая Ме4йобо1оду, К1итег, 1999) . Обзор по применению антисмысловых методов можно найти в Воитцие, Р1ап1 8с1. 105: 125-149, 1995 апб 8ешог, Вю1ес11. Сепе1. Епди!. Кет5. 15: 79-119, 1998. Воищие, 1995 (выше), описывает большое число примеров применения антисмысловых последовательностей в растительных системах с целью инактивации генов. Автор также указывает, что достижение 100% ингибирования не является обязательным, поскольку частичное ингибирование с большой вероятностью приводит к измеримому изменению в системе 8ешог, 1998 (выше), констатирует, что в настоящее время антисмысловые методы широко используются для манипуляций с экспрессией генов.
В настоящем описании термин антисмысловой полинуклеотид, гибридизующийся в физиологических условиях означает, что полинуклеотид (полностью или частично одноцепочечный), по меньшей мере, способен образовывать двухцепочечный полинуклеотид с РНК-продуктом гена, подлежащего ингибированию, как правило, с мРНК, кодирующей описанный здесь белок, в нормальных условиях, присутствующих в клетке. Антисмысловые молекулы могут включать в себя последовательности, которые соответствуют структурным генам, или последовательностям, осуществляющим регуляцию экспрессии гена или события сплайсинга. Например, антисмысловая последовательность может соответствовать кодирующему участку целевого гена, или 5'-нетранслируемому участку (ИТК.), или З'-иТК, или их сочетанию. Она может быть комплементарна части последовательностей интрона, которые могут подвергаться сплайсингу в процессе или после транскрипции, однако предпочтительно она комплементарна последовательностям экзона целевого гена. Поскольку ИТК обычно характеризуются повышенной дивергенцией, направленность на эти участки обеспечивает более высокую специфичность ингибирования гена.
Длина антисмысловой последовательности может составлять по меньшей мере 19 смежных нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 25, или 30, или 50 нуклеотидов и более предпочтительно по меньшей мере 100, 200, 500 или 1000 нуклеотидов с максимумом, равным полной длине гена, подлежащего ингибированию. Можно использовать полноразмерную последовательность, комплементарную целому генному транскрипту. Наиболее предпочтительно длина составляет 100-2000 нуклеотидов. Степень идентичности антисмысловой последовательности транскрипту-мишени может составлять по меньшей мере 90%, более предпочтительно 95-100%. Разумеется, молекула антисмысловой РНК может содержать посторонние последовательности, функция которых может заключаться в стабилизации молекулы.
Генетические конструкции для экспрессии антисмысловой РНК можно легко получить путем соединения промоторной последовательности с участком гена-мишени в антисмысловой ориентации, которая в соответствии с настоящим изобретением представляет собой ориентацию, противоположную ориентации последовательности гена-мишени, используемой для транскрипции и трансляции (если они имеют место) в растительной клетке. Соответственно настоящее изобретение также предлагает молекулу нуклеиновой кислоты, такую как химерная ДНК, кодирующую антисмысловую РНК настоящего изобретения, а также клетки, ткани, органы, растения, зерна и т.п., содержащие указанную молекулу нуклеиновой кислоты.
- 19 032207
Рибозимы.
В настоящем описании термин рибозим относится к молекуле РНК, которая специфически распознает определенную РНК-субстрат и катализирует ее расщепление. Как правило, рибозим содержит нуклеотидный участок, комплементарный участку РНК-мишени, обеспечивающий специфическую гибридизацию с РНК-мишенью в физиологических условиях, например в клетке, в которой действует рибозим, и ферментный участок, называемый в данном документе каталитический домен. В данном изобретении предпочтительно используют следующие типы рибозимов: рибозим в виде головки молота (Накс1оГГ аиб СсбасЬ №ιΙι.ιιό 334: 585-591, 1988; Рсттаи с! а1., Ссис, 113: 157-163, 1992) и рибозим, содержащий шпилечную структуру (8ирру с! а1., Мо1. В1о1ссН. 12: 117-129, 1999). ДНК, кодирующую рибозимы, можно синтезировать с помощью хорошо известных в данной области способов и затем вставить в генетическую конструкцию или вектор экспрессии с целью экспрессии в представляющей интерес клетке.
Соответственно данное изобретение также предлагает молекулу нуклеиновой кислоты, такую как химерная ДНК, кодирующую рибозим настоящего изобретения, а также клетки, ткани, органы, растения, зерна и т.п., содержащие указанную молекулу нуклеиновой кислоты. Как правило, ДНК, кодирующую рибозим, вставляют в кассету экспрессии под контролем промотора и сигнала терминации транскрипции, способных функционировать в клетке. Специфические участки расщепления рибозимом в любой потенциальной РНК-мишени можно идентифицировать путем сканирования молекулы мишени с целью выявления участков расщепления рибозимом, которые включают в себя тринуклеотидные последовательности СИА, СИИ и СИС. После идентификации короткие последовательности РНК, содержащие примерно от 5 до 20 рибонуклеотидов и соответствующие фрагменту гена-мишени, кодирующему 5'- и 3'-участки расщепления, анализируют, чтобы прогнозировать структурные признаки, такие как вторичная структура, которые делают последовательность олигонуклеотида менее подходящей. В случае применения рибозимы, которые могут быть выбраны из группы, включающей в себя рибозимы в виде головки молота, рибозимы, содержащие шпилечную структуру, рибозимы в виде головки топора, рабочие сателлитные рибозимы, рибозимы Те!^аЬутеηа и рибозимы РНКаза Р, конструируют с помощью известных в данной области способов на основе последовательности гена-мишени (см., например, патент США № 5741679). Пригодность кандидатов-мишеней также можно оценить путем определения их доступности для гибридизации с комплементарными олигонуклеотидами, используя анализы рибонуклеазной защиты.
Как и описанные здесь антисмысловые полинуклеотиды, рибозимы настоящего изобретения способны гибридизоваться с целевой молекулой нуклеиновой кислоты (такой как мРНК, кодирующая полипептид, описанный как 8ЕО Ш N0: 2) в физиологических условиях, а именно в условиях, присутствующих в клетке, особенно в растительной клетке, такой как клетка пшеницы или ячменя.
РНК-интерференция/дуплексная РНК.
В настоящем описании термин искусственно введенная молекула дцРНК относится к введению молекулы дцРНК, которая, например, может встречаться эндогенно путем транскрипции химерного гена, кодирующего такую молекулу дцРНК, но не к превращению одноцепочечной молекулы РНК в дцРНК внутри эукариотической или растительной клетки. РНК-интерференцию (РНК-и), в частности, можно использовать для специфического уменьшения экспрессии гена или ингибирования продукции конкретного белка. Не желая ограничиваться какой-либо теорией, ХУаЮгНоикс с! а1., Ргос. №111. Асаб, 8ск И.8.А. 95: 13959-13964, 1998 предлагают модель механизма, посредством которого дцРНК уменьшает продукцию белка. В основе данного механизма лежит присутствие молекул дцРНК, которые содержат последовательность, практически идентичную мРНК представляющего интерес гена или ее части. дцРНК можно получить с использованием одного промотора в рекомбинантном векторе или клетке-хозяине, где транскрибируются смысловая и антисмысловая последовательности с получением шпилечной РНК, в которой смысловая и антисмысловая последовательности гибридизуются с образованием участка дцРНК и промежуточной последовательности или спейсерного участка, образующего петлеобразную структуру, следовательно, шпилечная РНК имеет структуру типа стебель-петля. Конструирование и продукция молекул дцРНК, подходящих для применения в настоящем изобретении, входят в объем компетенции специалиста в данной области, в частности они описаны в \Уа1сг1юикс с! а1., 1998 (выше), 8ιηί11ι с! а1., №а!иге, 407: 319-320, 2000, \УО 99/53050, \УО 99/49029 и \УО 01/34815. Соответственно настоящее изобретение также предлагает молекулу нуклеиновой кислоты, например химерную ДНК, кодирующую дуплексную РНК, такую как шпилечная РНК настоящего изобретения, а также клетки, ткани, органы, растения, зерна и т.п., содержащие молекулу нуклеиновой кислоты.
В одном примере вводят ДНК, которая управляет синтезом, по меньшей мере, частично двухцепочечного РНК-продукта (продуктов), гомологичного гену-мишени, подлежащему инактивации. Следовательно, ДНК содержит как смысловую, так и антисмысловую последовательности, которые после транскрибирования в РНК могут гибридизоваться с образованием двухцепочечного участка РНК. В предпочтительном воплощении смысловая и антисмысловая последовательности разделяются спейсерным участком, включающим в себя интрон, который после транскрибирования в РНК удаляется в процессе сплайсинга. Показано, что такой механизм обеспечивает высокоэффективный сайленсинг гена (8ιηί11ι с! а1., 2000 (выше)). Двухцепочечный участок может содержать одну или две молекулы РНК, транскриби
- 20 032207 рованные либо из одного участка, либо из двух участков ДНК. дцРНК можно классифицировать как длинную ЬрРНК, содержащую длинные смысловые и антисмысловые участки, которые могут быть в значительной степени комплементарными, но не обязательно полностью комплементарными (как правило, длина участка, образованного в результате спаривания оснований, составляет более чем примерно 100 п.о., предпочтительно, она находится в диапазоне 200-1000 п.о.). ЬрРНК также может иметь меньший размер и содержать двухцепочечный участок, варьирующий по размеру примерно от 30 до 50 п.о. или примерно от 30 до 100 п.о. (см. \У0 04/073390, включенный в настоящее описание в качестве ссылки). Полагают, что двухцепочечный участок РНК запускает ответ эндогенной растительной системы, который включает в себя процессинг двухцепочечной РНК с образованием олигонуклеотидов длиной 2124 нуклеотидов и применение этих олигонуклеотидов для последовательностьспецифичного расщепления транскрипта гомологичной РНК, кодируемой растительным геном-мишенью, с эффективным уменьшением или прекращением активности гена-мишени.
Длина каждой из гибридизующихся смысловой и антисмысловой последовательностей должна составлять по меньшей мере 19 смежных нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 27, или 30, или 50 нуклеотидов и более предпочтительно по меньшей мере 100, 200 или 500 нуклеотидов, вплоть до полноразмерной последовательности, соответствующей целому генному транскрипту. Наиболее предпочтительная длина составляет 100-2000 нуклеотидов. Степень идентичности смысловой и антисмысловой последовательностей целевому транскрипту должна составлять по меньшей мере 85%, предпочтительно по меньшей мере 90% и более предпочтительно 95-100%. По мере увеличения длины последовательности уменьшается жесткость требований к общей идентичности последовательностей. Разумеется, молекула РНК может содержать посторонние последовательности, функция которых может заключаться в стабилизации молекулы. Молекула РНК может представлять собой гибрид разных последовательностей, направленных на разные РНК-мишени, который обеспечивает уменьшение нескольких генов-мишеней, или она может представлять собой одну последовательность, которая соответствует семейству родственных генов-мишеней, такому как мультигенное семейство. Последовательности, используемые для получения дцРНК, предпочтительно соответствуют последовательностям экзона гена-мишени и могут соответствовать 5'- и/или 3'- нетранслируемым последовательностям или белоккодирующим последовательностям или любому их сочетанию.
Промотор, используемый для экспрессии дцРНК-образующей конструкции, может представлять собой любой тип промотора, при условии, что полученная дцРНК является специфичной к генному продукту в клеточной линии, подлежащей деструкции. Альтернативно промотор может быть линияспецифичным, то есть он может экспрессироваться только в клетках конкретной опытной линии. Такая специфичность может иметь преимущество в тех случаях, когда наблюдается некоторое перекрывание гомологии с геном, экспрессирующимся в клеточной линии-не мишени. Промотор также может индуцироваться внешними факторами или внутриклеточными факторами окружающей среды. Как правило, молекула РНК экспрессируется под контролем промотора РНК-полимеразы ΙΙ или РНК-полимеразы ΙΙΙ. Примеры последних включают в себя промоторы тРНК или малой ядерной РНК.
Другая обеспечивающая сайленсинг РНК может представлять собой РНК, не содержащую участка полиаденилирования, которая содержит по меньшей мере 20 смежных нуклеотидов и обладает по меньшей мере 95% идентичностью по отношению к последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности транскрипта РНК гена-мишени, как описано в XV0 01/12824 или И8 6423885 (оба документа включены в настоящее описание в качестве ссылки). Следующий тип обеспечивающей сайленсинг РНК включает в себя молекулу РНК, описанную в ν0 03/076619 (включенном в настоящее описание в качестве ссылки), которая содержит по меньшей мере 20 смежных нуклеотидов и обладает по меньшей мере 95% идентичностью по отношению к последовательности нуклеиновой кислоты-мишени или к комплементарной ей последовательности и дополнительно содержит участок, который в основном является двухцепочечным, как описано в ν0 03/076619.
Регуляция под действием микроРНК представляет собой особую ветвь пути сайленсинга, обеспечиваемого РНК, которая развивается в направлении регуляции гена, отклоняясь от традиционного пути РНКи/РТО8. МикроРНК представляют собой специфический класс малых РНК, которые кодируются генподобными элементами, организованными в специфический частично инвертированный повтор. После транскрипции гены микроРНК дают РНК-предшественники, содержащие частично спаренный стебель и петлеобразный участок, из которых в результате процессинга образуются микроРНК. микроРНК обычно содержат примерно 21 нуклеотид в длину. Высвобожденные микроРНК образуют К18Сподобные комплексы, содержащие конкретный набор белков Агдопаи!е, которые вызывают последовательность-специфическую репрессию гена (см., например, М111аг апб Vа!е^йои8е, Рипс! 1п!едг 6епош1С8, 5: 129-135, 2005; Ра5С.|шпеШ е! а1., Сигг 0рш Оепе! Эеуе1ор 15: 200-205, 2005; А1те1ба апб АШЫге, Тгепбк Се11 Бю1. 15: 251-258, 2005, включенные посредством ссылки).
Совместная супрессия.
Другим методом молекулярной биологии, используемым для специфического уменьшения экспрессии генов, является совместная супрессия. Механизм совместной супрессии точно не известен, однако полагают, что он включает в себя посттранскрипционный сайленсинг гена (РТО8) и в этом отношении
- 21 032207 он может быть очень похож на многочисленные примеры антисмысловой супрессии. Указанный метод включает в себя введение в растение повышенного числа копий гена или его фрагмента в смысловой ориентации по отношению к промотору, используемому для его экспрессии, которая в соответствии с настоящим описанием соответствует ориентации транскрипции и трансляции (если она имеет место) последовательности гена-мишени. Размер смыслового фрагмента, его соответствие участкам генамишени и степень его гомологии по отношению к гену-мишени имеют такие же значения, как и в случае описанных выше антисмысловых последовательностей. В некоторых случаях дополнительная копия генной последовательности препятствует экспрессии растительного гена-мишени. Применение способов совместной супрессии раскрыто в описании патента АО 97/20936 и в описании европейского патента № 0465572. Антисмысловые использующиеся для совместной супрессии или двухцепочечные молекулы РНК также могут содержать участок РНК, являющийся в основном двухцепочечным, предпочтительно включающий в себя сигнал ядерной локализации, как описано в АО 03/076619.
Все описанные методы уменьшения экспрессии гена также можно использовать для согласованного уменьшения активности нескольких генов. Например, одна молекула РНК может быть направлена против семейства родственных генов, если она специфична к участку, который является общим для этих генов. Альтернативно молекулу РНК можно направить против неродственных генов путем введения в ее состав нескольких участков, каждый из которых направлен на отдельный ген. Это можно осуществить путем гибридизации нескольких участков под контролем одного промотора.
Способы введения нуклеиновых кислот в растительные клетки/трансформация.
Специалистам в данной области хорошо известен ряд способов введения молекул нуклеиновых кислот в растительные клетки-хозяева. Термин трансформация относится к изменению генотипа организма, такого как бактерия или растение, путем введения чужеродной или экзогенной нуклеиновой кислоты. Термин трансформант обозначает измененный таким образом организм. В настоящем описании термин трансгенный относится к генетически модифицированному растению, эндогенный геном которого дополнен или изменен путем интеграции, или стабильного поддерживания в реплицируемой неинтегрированной форме, чужеродного или экзогенного гена или чужеродной или экзогенной последовательности. Термин трансген относится к чужеродным или экзогенным генам или последовательностям, которые вводят в геном растения. Молекулу нуклеиновой кислоты можно стабильно интегрировать в геном растения или она может реплицироваться в виде внехромосомного элемента. Термин геном относится к полному наследуемому генетическому составу клетки, растения или части растения и включает в себя молекулы хромосомной ДНК, пластидной ДНК, митохондриальной ДНК и внехромосомной ДНК. Термин регенерация, используемый в настоящем описании в применении к растительным материалам, обозначает выращивание целого дифференцированного растения из растительной клетки, группы растительных клеток, части растения, такой как, например, зародыш, щиток зародыша, протопласт, каллюс или другая ткань, но не включает в себя выращивание растения из семени.
Конкретный выбор метода трансформации определяется его эффективностью в отношении трансформации определенного вида растения, а также опытом и предпочтением специалиста, осуществляющего настоящее изобретение с помощью конкретной выбранной методологии. Для опытного специалиста очевидно, что конкретный выбор системы трансформации для введения нуклеотидной конструкции в растительные клетки не является необходимостью для настоящего изобретения, или ограничением настоящего изобретения, при условии, что он позволяет достичь приемлемого уровня переноса нуклеиновой кислоты. Руководство по практическому применению систем трансформации для усовершенствования растения можно найти в Впсй, Апп Рег Р1ап1 РЬук1о1 Р1ап1 Мо1 Вю1. 48: 297-326, 1997.
Введение и экспрессию чужеродных или экзогенных полинуклеотидов можно проводить с использованием Т-ДНК опухолеиндуцирующей (Т1) плазмиды Адгойас1егшт ШтеГааепк (см., например, ИтЬеск, патент США № 5004863 и международную заявку РСТ/И8 93/02480). Конструкцию настоящего изобретения можно вводить в растительную клетку, используя А. ТитеГас1епк, содержащие Т1-плазмиду. При применении культуры А. ШтеГааепк в качестве трансформационной среды, в качестве вектораносителя наиболее предпочтительно использовать неонкогенный штамм АдгоЬас1егшт, который обеспечивает нормальную неонкогенную дифференциацию трансформированных тканей. Предпочтительно АдгоЬас1егшт несет бинарную Т1-плазмидную систему. Такая бинарная система состоит из (1) первой Т1плазмиды, которая содержит участок вирулентности, необходимый для внедрения переносимой ДНК (ТДНК) в растения, и (2) химерной плазмиды. Химерная плазмида содержит по меньшей мере один граничный участок Т-ДНК Т1-плазмиды дикого типа, фланкирующий переносимую нуклеиновую кислоту. Показано, что с помощью бинарных Т1-плазмидных систем можно эффективно трансформировать растительные клетки, например, как описано Эе Егатопб, Вю1есйпо1оду, 1: 262, 1983 апб Ноекета е1 а1., №1иге, 303: 179, 1983. Такие бинарные системы являются предпочтительными в числе прочих, поскольку они не требуют интеграции в Т1-плазмиду АдгоЬас1егшт.
Способы, в которых используются АдгоЬас1егшт, включают в себя без ограничения (а) совместное культивирование АдгоЬас1егшт с культивируемыми выделенными протопластами; (Ь) трансформацию растительных клеток или тканей с использованием АдгоЬас1егшт; (с) трансформацию семян, точек роста или меристем с использованием АдгоЬас1егшт или (б) инокуляцию растений, например, с помощью ме
- 22 032207 тода Дога1-б1р, описанного в Весй!о1б е! а1., СК. Асаб. 8с1. Рап8, 31б: 1194, 1993, или пшеницы (как описано в АО 00/б3398, включенном в данное описание в качестве ссылки). Этот способ основан на инфильтрации суспензии клеток АдгоЬас!егшт. Альтернативно химерную конструкцию можно вводить, используя в качестве векторов плазмиды АдтоЬас!егшт, индуцирующие рост корней (К1).
Способы трансформации зерновых растений, таких как пшеница и ячмень, с целью введения генетического изменения в растение путем внедрения экзогенной нуклеиновой кислоты и способы регенерации растений из протопластов или незрелых зародышей растений хорошо известны в данной области, их описание можно найти, например, в Аап апб Ьетаих, Р1ап! Рйу8ю1. 104: 37-48, 1994, Тшдау е! а1., Р1ап! 1. 11: 13б9-137б, 1997, патентной заявке Канады № 2092588, патентной заявке Австралии № б1781/94, патенте Австралии № бб7939, патенте США № б100447, международной патентной заявке РСТ/И8 97/10б21, патенте США № 5589б17, патенте США № б541257. Предпочтительно трансгенные растения получают путем трансформации, опосредованной АдгоЬас!егшт !ите£ааеп5. Векторы, несущие целевую нуклеотидную конструкцию, можно вводить в способные к регенерации клетки тканей культивируемых зерновых растений или эксплантаты. Способные к регенерации клетки предпочтительно получают из щитка незрелых зародышей, зрелых зародышей, полученного из них каллюса или меристематической ткани. Незрелые зародыши предпочтительно получают из соцветий примерно через 10-15 дней после начала цветения.
Генетическую конструкцию также можно вводить в растительные клетки путем электропорации, как описано, например, в Еготт е! а1., Ргос, №111. Асаб. 8ск И.8.А. 82: 5824, 1985 и 8Ытато!о е! а1., Ыа!иге, 338: 274-27б, 1989. В данном методе протопласты растения подвергают электропорации в присутствии векторов или нуклеиновых кислот, содержащих соответствующие нуклеотидные последовательности. Электрические импульсы в поле высокой напряженности обеспечивают обратимую проницаемость мембраны, позволяющую нуклеиновым кислотам проникать в клетки. После электропорации протопласты растения восстанавливают клеточную стенку, делятся и образуют каллюс.
Другой способ введения конструкции нуклеиновой кислоты в клетку растения включает в себя высокоскоростное баллистическое проникновение маленьких частиц (также известное как бомбардировка частицами или бомбардировка микрочастицами), при этом подлежащая введению нуклеиновая кислота содержится либо в матриксе маленьких шариков или частиц, либо на их поверхности, как описано, например, в К1еш е! а1., Ыа!иге, 327: 70, 1987.
Альтернативно нуклеотидную конструкцию можно вводить в растительную клетку путем приведения ее в контакт с растительной клеткой с использованием механических или химических средств. Например, нуклеиновую кислоту можно механически перенести в растительную клетку путем непосредственной микроинъекции или с помощью микропипетки. Альтернативно нуклеиновую кислоту можно ввести в растительную клетку путем применения полиэтиленгликоля, который образует с генетическим веществом осадочный комплекс, поглощаемый клеткой.
Мутагенез.
Растения настоящего изобретения можно получить путем мутагенеза и затем провести их идентификацию. В результате можно получить не трансгенное растение, что является желательным для некоторых рынков.
Мутанты могут быть природными (другими словами, выделенными из природного источника), синтетическими (например, полученными путем мутагенеза нуклеиновой кислоты) или индуцированными. Как правило, родительские клетки, ткани, семена растения или растения можно подвергнуть мутагенезу с получением одной или нескольких мутаций, таких как нуклеотидные замены, делеции, добавления и/или модификации кодонов. В контексте данной заявки термин индуцированная мутация относится к искусственно индуцированному генетическому изменению, которое может быть следствием химического, радиационного или биологического мутагенеза, такого как вставка транспозона или Т-ДНК. Предпочтительные мутации представляют собой нулевые мутации, такие как нонсенс-мутации, мутации со сдвигом рамки, инсерционные мутации или введение вариантов участков сплайсинга, которые полностью инактивируют ген. Нуклеотидинсерционные производные включают в себя 5'- и 3'-концевые гибриды, а также молекулы, полученные в результате вставки одного или нескольких нуклеотидов внутри последовательности. Инсерционные варианты нуклеотидной последовательности получают путем введения в нуклеотидную последовательность одного или нескольких нуклеотидов, например путем случайной вставки с последующим соответственным скринингом полученных продуктов. Делеционные варианты получают путем удаления из последовательности одного или нескольких нуклеотидов. Предпочтительно нуклеотидная последовательность мутантного гена содержит только одну вставку или делецию по сравнению с геном дикого типа. Нуклеотидзамещенные варианты представляют собой молекулы, в последовательности которых по меньшей мере один нуклеотид удален и на его место вставлен другой нуклеотид. Предпочтительное число нуклеотидов, которые могут быть заменены в мутантном гене по сравнению с геном дикого типа, составляет максимум десять нуклеотидов, более предпочтительно максимум 9, 8, 7, б, 5, 4, 3 или 2 нуклеотида или оно равно одному нуклеотиду. Такая замена может быть молчащей, это означает, что замена не приводит к изменению аминокислоты, кодируемой кодоном. Альтернативно можно осуществить консервативную замену, приводящую к изменению одной аминокислоты на другую,
- 23 032207 функционально подобную ей, аминокислоту. Типичные консервативные замены приведены в табл. 10 под заголовком Примеры замен.
Термин мутация в соответствии с настоящим описанием не включает в себя молчащие нуклеотидные замены, которые не влияют на активность гена, и, следовательно, включает в себя только те изменения в последовательности гена, которые влияют на его активность. Термин полиморфизм относится к любому изменению в нуклеотидной последовательности, включающему в себя такие молчащие нуклеотидные замены.
В предпочтительном воплощении растение содержит делецию по меньшей мере части гена 88ΙΙ, или сдвиг рамки считывания, или изменение участка сплайсинга указанного гена.
В другом предпочтительном воплощении растение содержит мутацию в гене ато1, такую как аллель АС38, известную в данной области.
Мутагенез можно проводить с использованием химических или лучевых средств, например путем обработки семян ЕМ8 или азидом натрия (Ζ\ν;·ΐΓ апб Сбапб1ег, Р1ап!а 197: 39-48, 1995), или гаммаоблучением, хорошо известных в данной области.
Химический мутагенез чаще включает в себя благоприятные нуклеотидные замены, чем делеции. Облучение потоком тяжелых ионов (НТВ) представляет собой эффективный метод мутационной селекции, приводящий к получению новых сортов растений, как описано, например, в НауакЫ е! а1., ЕГГесГк о£ 1оп Ьеат итаб1абоп оп ти!абоп тбисбоп ш псе, Сус1обопк апб ТНеб Аррбсабопк 2007, Е1дб!ееп!б биегпабопа1 СопТегепсе 237-239, 2007 и Кахата е! а1., Р1ап! Вю!есбпо1оду 25: 113-117, 2008. Облучение потоком ионов имеет две физические характеристики, включающие в себя дозу (Гр) и ЬЕТ (линейный перенос энергии, кэВ/мкм), которые оказывают биологическое действие, определяющее степень разрушения ДНК и размер делеции ДНК, и которые можно регулировать в зависимости от желательной степени мутагенеза. НГВ генерирует набор мутантов, многие из которых содержат делеции, затем полученные мутанты можно подвергнуть скринингу для выявления мутаций в конкретных генах 88Па или Ато1. Идентифицированные мутанты можно подвергнуть обратному скрещиванию с немутантными растениями пшеницы, используемыми в качестве рекуррентных родителей, чтобы устранить и, следовательно, уменьшить влияние несвязанных мутаций в мутантном геноме.
Биологические средства, используемые для получения сайт-специфичных мутантов, включают в себя ферменты, осуществляющие двухнитевые разрывы в ДНК, которая стимулирует механизмы эндогенной репарации. Примерами таких ферментов являются эндонуклеазы, нуклеазы белкового домена цинковые пальцы, транспозазы и сайт-специфичные рекомбиназы. Нуклеазы белкового домена цинковые пальцы (ΖΓΝκ), например, обеспечивают сайт-специфическое расщепление в геноме, создавая возможность для эндогенных или других механизмов репарации путем стыкового соединения, которые могут включать в себя введение делеций или вставок для репарации пробела. Обзор по технологии нуклеаз белкового домена цинковые пальцы можно найти в Ье Ргоуок! е! а1., Тгепбк ш Вю!есбпо1оду 28(3): 134-141, 2009, 8ее а1ко Эига! е! а1., Шс1е1с Ас1бк Кекеагсб 53(18): 5978-5990, 2005 и Ьщ е! а1., Вю!есбпо1оду апб Вюепдтееппд, 106: 97-105, 2010.
Выделение мутантов можно проводить путем скрининга мутантных растений или семян. Например, мутантную популяцию растений ячменя можно подвергнуть скринингу на низкую активность 88Па в крахмале листьев или зерен, на мутацию гена 88Па или ато1 с использованием ПЦР или гетеродуплексного анализа или на отсутствие белка 88ΙΙ методом ЕЫ8А. В полиплоидном растении скрининг предпочтительно проводят в генотипе, который уже не содержит одну или две активности 88ΙΙ, например, в растении пшеницы, уже мутантном по генам 88ΙΙ, в двух из трех геномов, так, чтобы осуществлять поиск по мутанту, полностью утратившему функциональную активность. Альтернативно в популяции, подвергшейся мутагенезу под действие такого средства, как ЕМ8, мутацию можно идентифицировать с помощью таких методов, как ТШГШС (81абе апб КпаиТ, Тгапкдешс Кек. 14: 109-115, 2005). Затем такую мутацию можно ввести в желательную генетическую среду путем скрещивания мутанта с растением, имеющим желательный генетический фон, и проведения подходящего числа перекрестных скрещиваний для удаления исходно нежелательного родительского фона.
Мутацию можно ввести в растение непосредственно путем мутагенеза или косвенно путем скрещивания двух родительских растений, одно из которых содержит введенную мутацию. Модифицированные растения, такие как злаковые растения, могут быть трансгенными или нетрансгенными. Используя мутагенез, можно получить нетрансгенное растение, утратившее представляющую интерес функцию. Настоящее изобретение также охватывает зерно или другие части растений, полученные из растений, и любой способный к репродукции растительный материал, который можно использовать для получения растений с желательными характеристиками, такой как культивируемые ткани или клетки. Разумеется, изобретение охватывает способы получения или идентификации таких растений или зерна, продуцируемого такими растениями.
Растения настоящего изобретения можно получить с помощью способа, известного как ТГЬЬШС (Тагдебпд б1бисеб Ьоса1 Ьекюпк ΙΝ Сепотек - таргетирование индуцированных локальных повреждений в геномах). На первой стадии введенные мутации, такие как новые изменения, затрагивающие одну пару оснований, индуцируют в популяции растений путем обработки клеток, семян, пыльцы или других час
- 24 032207 тей растений химическим мутагеном или облучением, и затем растения культивируют до получения поколения, стабильно наследующего мутации. ДНК экстрагируют, а семена всех членов популяции хранят, чтобы использовать их для повторных анализов через определенные периоды времени.
Чтобы провести анализ ТГЬЬШС, конструируют праймеры ПЦР, обеспечивающие специфическую амплификацию одного представляющего интерес гена-мишени. Специфичность особенно важна, если ген-мишень является членом семейства генов или частью полиплоидного генома. Далее, чтобы амплифицировать продукты ПЦР из совокупной ДНК нескольких субъектов, можно использовать меченные красителем праймеры. Полученные продукты ПЦР подвергают денатурации и повторному отжигу, чтобы обеспечить образование несовпадающих пар оснований. Несовпадения или гетеродуплексы обуславливаются как природными однонуклеотидными полиморфизмами (8ΝΡ) (т.е. несколько растений из популяции с большой вероятностью несут один и тот же полиморфизм), так и индуцированными 8ΝΡ (т.е. только в небольшом числе отдельных растений может проявляться мутация). После образования гетеродуплекса используют эндонуклеазу, такую как СеП, которая распознает и расщепляет ДНК, содержащую несовпадения, что является ключевой стадией обнаружения новых 8ΝΡ в популяции ТГЬЬШС.
С помощью данного способа можно подвергнуть скринингу многие тысячи растений, чтобы идентифицировать отдельный организм, содержащий изменение, затрагивающее одно основание, а также небольшие вставки или делеции (1-30 п.о.) в любом гене или конкретном участке генома. Размер анализируемых геномных фрагментов может варьировать примерно от 0,3 до 1,6 т.о. Сочетание параметров, включающих в себя 8-кратное объединение, фрагменты размером 1,4 т.о. (без учета концов фрагментов, где обнаружение 8ΝΡ затруднено из-за шума) и применение 96 линий в анализе, позволяет подвергать скринингу до миллиона пар оснований геномной ДНК в одном анализе, что делает ТГЬЬШС методом с высокой пропускной способностью. ТШЬШС также описан в 81абе апб КпаиГ, 2005 (выше) и НешкоГГ е! а1., Р1ап! Рйукю1. 135: 630-636, 2004, включенных в настоящее описание в качестве ссылки.
Помимо эффективной детекции мутаций метод ТГЬЬШС с высокой пропускной способностью идеально подходит для детекции природных полиморфизмов. Соответственно анализ неизвестной гомологичной ДНК путем образования гетеродуплекса с известной последовательностью позволяет установить число и положение полиморфных участков. Идентифицируют как изменения нуклеотидов, так и небольшие вставки и делеции, в том числе, по меньшей мере, некоторое число повторов полиморфизмов. Такой метод называют ЕсойШпд (Сота1 е! а1., Р1ап! I 37: 778-786, 2004).
Каждый 8ΝΡ регистрируют по его приблизительному положению относительно нескольких нуклеотидов. Таким образом, информацию о каждом гаплотипе можно архивировать на основе его мобильности. Информацию о последовательности можно получить с приложением относительно небольших дополнительных усилий, используя аликвоты такой же амплифицированной ДНК, как и для анализа несовпадающих последовательностей. Лево- или правосеквенирующий праймер для одной реакции выбирают в зависимости от его близости к полиморфизму. С помощью программного обеспечения 8едиепсйег, выполняющего множественное выравнивание, можно обнаружить изменение основания, которое в каждом случае подтверждают наличием полосы в геле.
ЕсойШпд дешевле проводить, чем полное секвенирование, метод, который в настоящее время используется для обнаружения большинства 8ΝΡ. Планшеты, содержащие упорядоченную экотипическую ДНК, проще подвергнуть скринингу, чем пулы ДНК из мутантных растений. Поскольку детекцию проводят в гелях с разрешением примерно в одну пару оснований, а фоновые образцы являются одинаковыми для всех линий, полосы, соответствующие молекулам одинакового размера, могут совпадать, что позволяет выявлять и генотипировать 8ΝΡ в одну стадию. В данном способе конечное секвенирование 8ΝΡ является простым и эффективным, тем более, что для ДНК-секвенирования можно использовать аликвоты тех же продуктов ПЦР, что и для скрининга.
Генетическая связь.
В настоящем описании термин генетически связанный относится к маркерному локусу и второму локусу, находящимся достаточно близко друг к другу на хромосоме, на которой они вместе наследуются более чем в 50% случаев мейоза, например, не случайно. Это определение включает в себя ситуацию, когда маркерный локус и второй локус образуют часть одного гена. Кроме того, данное определение включает в себя ситуацию, когда маркерный локус содержит полиморфизм, отвечающий за представляющий интерес признак (другими словами, маркерный локус непосредственно связан с фенотипом). Так, процент рекомбинаций, наблюдающихся между локусами в одном поколении (сантиморганы (сМ)), составляет менее чем 50. В конкретных воплощениях настоящего изобретения генетически связанные локусы могут находиться на хромосоме на расстоянии друг от друга, составляющем 45, 35, 25, 15, 10, 5, 4, 3, 2, 1 или менее сМ. Предпочтительно расстояние между маркерами составляет менее чем 5 или 2 сМ, наиболее предпочтительно примерно 0 сМ.
В настоящем описании термин другие генетические маркеры может относиться к любым молекулам, связанным с желательным признаком злаковых растений, таких как пшеница или ячмень. Такие маркеры хорошо известны в данной области и включают в себя молекулярные маркеры, связанные с генами, отвечающими за такие признаки, как устойчивость к заболеванию, урожайность, морфология растения, качество зерна, другие нефункциональные признаки, такие как цвет зерна, содержание гибберел
- 25 032207 линовой кислоты в семенах, высота растения, цвет муки и т. п.
Селекция с помощью маркера представляет собой известный метод селекции гетерозиготных растений, которая необходима при обратном скрещивании с рекуррентным родителем в классической программе селекции. Популяция растений в каждом поколении, полученном в результате обратного скрещивания, является гетерозиготной по представляющему интерес гену, обычно присутствующему в популяции, полученной в результате обратного скрещивания, в соотношении 1:1, и молекулярный маркер можно использовать для различения двух аллелей одного гена. Путем экстракции ДНК, например, из молодых побегов, и тестирования ее с использованием специфического маркера на интрогрессию желательного признака проводят раннюю селекцию растений для последующего обратного скрещивания, при этом энергия и ресурсы затрачиваются на меньшее количество растений.
В способах настоящего изобретения можно использовать любой известный в данной области метод молекулярной биологии, который позволяет детектировать аллели 8811 или другого гена. Такие методы включают в себя, без ограничения, амплификацию нуклеиновых кислот, секвенирование нуклеиновых кислот, гибридизацию нуклеиновых кислот с подходящими мечеными зондами, конформационный анализ одноцепочечных нуклеиновых кислот (88СА), электрофорез в градиенте денатурирующего геля (ЭССЕ), гетеродуплексный анализ (НЕТ), анализ химического расщепления (ССМ), каталитическое расщепление нуклеиновых кислот или их сочетание (см., например, Ьет1еих, Сиггеп! Сепот1ск, 1: 301311, 2000; Ьапдпбде е! а1., Айк! 1 Адпс Кек 52: 1043-1077, 2001). Изобретение также включает в себя применение молекулярного маркера для детекции полиморфизмов, связанных с аллелями (например) гена 8811, которые приводят к изменению накопления фруктана. Такие методы включают в себя детекцию или анализ полиморфизмов длин рестрикционных фрагментов (КРЬР), КАРО, полиморфизмов длин амплифицированных фрагментов (АРЬР) и микросателлитных (простой повтор последовательности, 88К) полиморфизмов. Близкорасположенные связанные маркеры можно легко получить с помощью известных в данной области способов, таких как объемный сегрегационный анализ, обзор по которому можно найти в Ьапдпбде е! а1., 2001 (выше).
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) представляет собой реакцию, с помощью которой получают идентичные копии целевого полинуклеотида, используя пару праймеров или набор праймеров, включающих в себя прямой и обратный праймеры, и катализатор полимеризации, такой как ДНКполимераза, в качестве которой обычно используют термостабильную полимеразу. Методы ПЦР известны в данной области и описаны, например, в РСК (МсРйегкоп апб Мо11ег (Еб), В108 8аепЦПс РиЬНкйегк Ыб, ОхГогб, 2000). Для проведения ПЦР можно использовать кДНК, полученную в результате обратной транскрипции мРНК, выделенной из растительных клеток, экспрессирующих ген 8811, или геномную ДНК, выделенную из растения.
Праймер представляет собой олигонуклеотидную последовательность, способную гибридизоваться в последовательность-специфичной манере с целевой последовательностью и удлиняться в процессе ПЦР. Ампликоны или продукты ПЦР, или фрагменты ПЦР, или продукты амплификации представляют собой продукты удлинения, которые содержат праймер и новосинтезированные копии целевых последовательностей. Системы множественных ПЦР включают в себя несколько наборов праймеров, которые обеспечивают одновременную продукцию нескольких ампликонов. Праймеры могут идеально совпадать с целевой последовательностью или они могут содержать внутри цепи несовпадающие основания, которые могут приводить к введению в конкретную целевую последовательность участков распознавания/расщепления рестриктазой или каталитической нуклеиновой кислотой. Праймеры также могут содержать дополнительные последовательности и/или модифицированные или меченые нуклеотиды, облегчающие улавливание или детекцию ампликонов. Повторяющиеся циклы термической денатурации ДНК, отжиг праймеров с комплементарными им последовательностями и удлинение отожженных праймеров под действием полимеразы приводят к экспоненциальной амплификации целевой последовательности. Термины мишень, или целевая последовательность, или матрица относятся к амплифицируемым нуклеотидным последовательностям.
Методы прямого секвенирования нуклеотидных последовательностей хорошо известны специалистам в данной области и описаны, например, в АикиЬе1 е! а1. (выше) апб 8атЬгоок е! а1. (выше). Секвенирование можно проводить с помощью любого подходящего метода, такого как дидезоксисеквенирование, химическое секвенирование или их вариации. Преимущество прямого секвенирования заключается в том, что оно позволяет определить изменение в любой паре оснований конкретной последовательности.
Растения.
Термин растение, используемый здесь как существительное, обозначает целые растения, однако в случае использования в качестве прилагательного означает любое вещество, которое присутствует в растениях, получено от растений, получено из растений или связано с растениями, такое как, например, органы растений (например, листья, стебли, корни, цветки), отдельные клетки (например, пыльца), семена, растительные клетки и т.п. Ростки и проросшие семена, у которых появились корни и побеги, также входят в объем термина растение. Термин части растения в настоящем описании относится к одному или нескольким тканям или органам, полученным из растений, которые содержат геномную ДНК растения.
- 2б 032207
Части растений включают в себя вегетативные структуры (например, листья, стебли), корни, органы/структуры цветков, семена (включающие в себя зародыш, эндосперм и семенную кожуру), растительные ткани (например, сосудистые ткани, покровные ткани и т.п.), клетки и потомство перечисленных элементов. Термин растительная клетка в настоящем описании относится к клетке, полученной из растения или в растении, и включает в себя протопласты или другие клетки, полученные из растений, гаметапродуцирующие клетки и клетки, способные регенерировать с образованием целых растений. Растигельные клетки могут представлять собой культуру клеток. Термин растительная ткань относится к дифференцированной ткани, находящейся в растении или полученной из растения (эксплант), или к недифференцированной ткани, полученной из незрелых или зрелых эмбрионов, семян, корней, побегов, плодов, пыльцы, опухолевой ткани, такой как корневой рак, и к различным формам скоплений растительных клеток в культуре, таким как каллюс. Примерами растительных тканей, находящихся в семенах или полученных из семян, являются эндосперм, щиток зародыша, алейроновый слой и зародыш. Соответственно настоящее изобретение включает в себя растения, части растений и полученные из них продукты, в частности зерно, содержащее фруктан.
В настоящем описании термин зерно относится к зрелым семенам растений, таким как обычно собираемые в коммерческих целях на поле. Так, указанный термин включает в себя собранные семена и семена на растении, готовые к сбору. Зрелое зерно злаков, таких как пшеница или ячмень, обычно имеет содержание влаги менее чем примерно 18-20%.
Термин трансгенное растение в настоящем описании обычно относится к растению, которое содержит генетическую конструкцию, отсутствующую в растениях дикого типа, относящихся к тому же виду, разновидности или сорту. То есть трансгенные растения (трансформированные растения) содержат генетический материал (трансген), который отсутствовал в них до трансформации. Трансген может включать в себя генетические последовательности, полученные от или полученные из растительной клетки, или из другой растительной клетки, или из отличного от растения источника, или синтетические последовательности. Как правило, трансген вводит в растение человек путем таких манипуляций, как, например, трансформация, с использованием любых способов, известных специалистам в данной области. Предпочтительно генетическое вещество стабильно интегрируется в геном растения. Введенное генетическое вещество может содержать последовательности, которые встречаются в природе у тех же видов, но в реаранжированном виде, то есть с другим порядком расположения элементов, например антисмысловая последовательность. Растения, содержащие такие последовательности, входят в объем термина трансгенные растения. Нетрансгенное растение представляет собой растение, не модифицированное генетически путем введения генетического вещества с помощью методов рекомбинантных ДНК. В предпочтительном воплощении трансгенные растения являются гомозиготными по каждому введенному гену (трансгену), чтобы их потомство не разделялось по целевому признаку.
В настоящем описании термин соответствующее нетрансгенное растение относится к растению, которое является изогенным по отношению к трансгенному растению, но не содержит представляющий интерес трансген. Предпочтительно соответствующее нетрансгенное растение представляет собой растение, относящееся к тому же сорту, или к той же разновидности, что и родитель представляющего интерес трансгенного растения, или к потомкам тех же родителей, которые не содержат конструкцию, часто называемым сегрегант, или растение того же сорта, или той же разновидности, трансформированное конструкцией пустого вектора. Термин дикий тип в настоящем описании относится к клеткам, тканям или растениям, не модифицированным с помощью способов настоящего изобретения. Клетки, ткани или растения дикого типа можно использовать в качестве контролей для сравнения уровня экспрессии экзогенной нуклеиновой кислоты или степени и характера изменения признака в клетках, тканях или растениях, модифицированных по способам настоящего изобретения.
Трансгенные растения в соответствии с контекстом настоящего изобретения включают в себя потомство растений, которые были генетически модифицированы с помощью рекомбинантных методов, где потомство содержит представляющий интерес трансген. Такое потомство можно получить путем самоопыления исходного трансгенного растения или путем скрещивания таких растений с другим растением того же вида. Это, как правило, позволяет модулировать продукцию по меньшей мере одного из определенных здесь белков/ферментов в целевом растении или органе растения. Трансгенные части растений включают в себя все части и клетки указанных растений, содержащие трансген, такие как, например, культивируемые ткани, каллюс и протопласты.
Присутствие трансгена в трансформированном растении можно определить с помощью нескольких способов. Например, с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) можно амплифицировать последовательности, являющиеся уникальными для трансформированного растения, с последующей детекцией амплифицированных продуктов методом гель-электрофореза или с помощью других методов. Из растений с помощью традиционных методов можно экстрагировать ДНК и затем с помощью реакции ПЦР, используя подходящие праймеры, можно амплифицировать специфическую ДНК, по присутствию или отсутствию которой различают трансформированные и нетрансформированные растения. Например, можно сконструировать праймеры, которые обеспечивают амплификацию участка ДНК из трасформирующего вектора, считывая информацию с конструкции, и обратный праймер, полученный из представ
- 27 032207 ляющего интерес гена. Указанные праймеры обеспечивают амплификацию фрагмента только в том случае, если растение было успешно трансформировано. Альтернативным методом подтверждения положительной трансформации является гибридизация методом саузерн-блоттинга, хорошо известный в данной области метод. Трансформированные растения также можно идентифицировать по отличию их фенотипа от фенотипа нетрансформированных растений или растений дикого типа, например фенотип трансформированного растения может быть обусловлен присутствием селектируемого маркерного гена, или данный фенотип может включать в себя изменение содержания фруктана в зерне растения или изменение активности синтазы крахмала.
В настоящем документе термин прорастание относится к появлению кончика корня из кожуры после набухания. Термин степень набухания относится к проценту семян в популяции, которые прорастают через определенный период времени, например через 7 или 10 дней, после набухания. Чтобы определить степень набухания с течением времени, популяцию семян нужно анализировать ежедневно. В отношении к семенам настоящего изобретения используемый здесь термин практически одинаковая степень прорастания означает, что степень прорастания трансгенных семян составляет по меньшей мере 90% от степени прорастания изогенных семян дикого типа.
В настоящем документе термин ячмень относится к любым видам рода Ногбеит, в том числе к его прародителям, а также к потомству, полученному путем скрещивания с другими видами. Предпочтительно растение относится к виду Ногбеит, культивируемому в коммерческих целях, например, оно может относиться к штамму или сорту, или разновидности Ногбеит уи1даге, или оно является подходящим для промышленного производства зерна.
Получение пищевых продуктов.
В другом аспекте изобретение предлагает растения и зерно ячменя и полученные из них продукты, которые можно использовать для получения пищевых продуктов или кормов, причем зерно содержит повышенные уровни крахмала по сравнению с соответствующими 8811а-мутантными зернами и повышенные уровни отличных от крахмала компонентов по сравнению с соответствующими зернами дикого типа. Предпочтительно растение, из которого получают зерно, имеет пониженный уровень активности 8811а в эндосперме в процессе развития. Растение настоящего изобретения можно использовать для получения пищевого продукта, в частности для промышленного получения пищевого продукта. Такое получение пищевого продукта может включать в себя получение муки, теста или других продуктов, которые можно использовать в качестве ингредиентов для промышленного получения пищевого продукта. В воплощении, которое является желательным для применения в производстве пищевого продукта, семена или зерно растения имеют повышенное содержание фруктана по сравнению с растением дикого типа. Уровень активности деструктивных ферментов, в частности одной или нескольких амилаз, таких как аамилаза или β-амилаза, в зерне может быть снижен в результате присутствия трансгена или введения мутации, которая уменьшает экспрессию гена, кодирующего такой деструктивный фермент. Полученные из такого зерна мука или тесто обладают свойствами, подходящими для выпекания или получения других пищевых продуктов.
Желательный генетический фон растения включает в себя факторы, обуславливающие агрономический выход, и другие характеристики. Такие характеристики могут определять принадлежность к озимым или яровым типам, агрономические показатели, устойчивость к заболеваниям и устойчивость к стрессу, вызванному абиотическими факторами. Для разных районов выращивания подходят разные сорта. Предпочтительно урожайность сорта растения настоящего изобретения составляет не менее чем 80% от урожайности соответствующего сорта дикого типа, по меньшей мере, в некоторых районах выращивания, более предпочтительно не менее чем 85% и еще более предпочтительно не менее чем 90%. Урожайность можно легко измерить в контролируемых полевых испытаниях.
В других воплощениях содержание крахмала в зерне составляет по меньшей мере примерно 42%, по меньшей мере примерно 43%, по меньшей мере примерно 45%, по меньшей мере примерно 47%, по меньшей мере примерно 50% или по меньшей мере примерно 55% (мас./мас.), до 65% от содержания крахмала в зерне дикого типа и более предпочтительно оно не снижено по сравнению с зерном дикого типа. Содержание крахмала в зерне ячменя дикого типа, выращиваемом в промышленном масштабе, обычно находится в диапазоне 55-65% и в некоторой степени зависит от выращиваемого сорта. Альтернативно содержание крахмала в семенах или зерне настоящего изобретения составляет по меньшей мере 90% по сравнению с содержанием крахмала в зерне растения дикого типа, предпочтительно по меньшей мере 95%. Другие желательные характеристики включают в себя способность зерна подвергаться размалыванию, в частности твердость зерна. Другие аспекты, влияющие на ценность растения, включают в себя степень экстракции фруктана или крахмала из зерна, причем с увеличением степени экстракции повышается ценность растения, содержание белка, отношение амилозы к амилопектину, или содержание других отличных от крахмала полисахаридов, таких как β-глюкан, который также вносит вклад в содержание клетчатки в зерновых продуктах. Форма зерна представляет собой другой признак, влияющий на коммерческую полезность растения, так форма зерна может влиять на легкость и другие характеристики размалывания.
- 28 032207
Крахмал можно легко выделить из зерна настоящего изобретения с помощью стандартных методов, таких как метод 8с1ш1тап апб Каттюу1йа, 81агсЬ, 43: 387-389, 1991. В промышленном масштабе можно использовать влажное или сухое размалывание. Размер гранул крахмала имеет важное значение для отрасли, обрабатывающей крахмал, где более крупные гранулы А отделяют от более мелких гранул В.
Пищевые продукты.
Изобретение также охватывает пищевые продукты, напитки или фармацевтические препараты, предпочтительно полученные с использованием продуктов, содержащих повышенное количество резистентного крахмала, клетчатки, амилозы, β-глюкана, фруктана или других компонентов, полученных из растений или зерна настоящего изобретения. Такое получение пищевого продукта может включать в себя получение обработанного зерна, непросеянной муки, муки, теста или других продуктов, которые можно использовать в качестве ингредиентов для промышленного получения пищевого продукта. Зерно настоящего изобретения или полученные из него продукты, содержащие резистентный крахмал, клетчатку, амилозу, β-глюкан или фруктан, можно использовать в ряде применений пищевых продуктов для потребления человеком. В данном описании термин человек относится к Ното кар1епк. Зерно можно легко использовать в способах обработки пищевых продуктов и, следовательно, изобретение включает в себя молотое, измельченное, дробленое, рушеное или плющеное зерно или продукты, полученные из обработанного или целого зерна растений настоящего изобретения, в том числе муку. Указанные продукты можно затем использовать для получения разных пищевых продуктов, например мучных продуктов, таких как зерновой завтрак, хлеб, пирожные, печенье и т.п., или пищевых добавок, таких как загустители или связующие средства, или для получения напитков, лапшы, макарон или супов быстрого приготовления. Зерно настоящего изобретения или продукты, полученные из зерна настоящего изобретения, особенно желательно использовать для получения зернового завтрака или в виде экструдированных продуктов. Крахмал или другие компоненты могут входить в состав жирных или масляных продуктов, таких как маргарин или жир, приправа к салату, яичные продукты, такие как майонез, молочные продукты, такие как мороженое, йогурт или сыр, зерновые продукты, такие как мука, фруктовые соки, другие продукты питания или пищевые вещества, или крахмал или другие компоненты можно обработать с получением напитков или продуктов, таких как хлеб, пирожные, печенье, зерновой завтрак, макароны, лапша или соусы. Фруктан также можно использовать в качестве низкокалорийного подсластителя.
Входящие в состав хлеба ингредиенты, содержащие фруктан, которые могут находиться в виде муки или непросеянной муки, могут замещать 10% (мас./мас.) или более неизмененной муки или непросеянной муки, предпочтительно они могут замещать по меньшей мере 30%, еще более предпочтительно по меньшей мере 50% неизмененной муки или непросеянной муки. Следовательно, смесь может содержать, например, муки 70 частей, крахмала с высоким содержанием фруктана 30 частей, жира 2 части, соли 2 части, улучшителя 1 часть, дрожжей 2,5 части. Для получения хлеба можно использовать метод интенсивного образования теста или другие методы, известные специалистам в данной области.
Альтернативно продукт настоящего изобретения может входить в состав макаронных изделий на основе мучных продуктов. Количество фруктана настоящего изобретения, используемое в композиции макаронных изделий, может находиться в диапазоне 5-20% (мас./мас.) по отношению к общей массе мучнистого вещества, более предпочтительно в диапазоне 10-20%. Специалист в данной области может легко выбрать другие подходящие мучнистые вещества. Композиция также может содержать другое вещество, такое как сухие или жидкие яйца (желтки, белки или то и другое) или вещества с высоким содержанием белка, такие как молочный белок или рыбный белок. Кроме того, в композицию можно добавить витамины, минералы, соли кальция, аминокислоты, забуферивающие средства, такие как гидрофосфат натрия, специи, смолы, глютен или моностеарат глицерина.
Другие съедобные части растений настоящего изобретения можно использовать в качестве пищевых продуктов для потребления человеком или в качестве кормов для потребления животными. Например, для потребления человеком или животными можно использовать листья, стебли или их экстракты или части, содержащие клетки настоящего изобретения. Повышенное содержание резистентного крахмала, клетчатки, амилозы, β-глюкана или фруктана в растениях настоящего изобретения и их частях может иметь преимущество для применения указанных материалов в качестве корма для животных, такого как, например, корм для свиней, крупного рогатого скота, лошадей, птиц, таких как куры, и других животных.
Способы.
Продукты или соединения настоящего изобретения можно вводить в состав фармацевтических композиций, которые получают с помощью традиционных методов (см., например, КеттдЮп'к РЬагтасеибса1 8^1^^ 18п Еб., Маск РиЬНкЬтд, Сотрапу, Еак!оп, РА, И.8.А. 1990). Композиция может содержать активное средство или фармацевтически приемлемое производное активного средства. Указанные композиции могут содержать, помимо одного из активных веществ, фармацевтически приемлемый эксципиент, носитель, буфер, стабилизатор или другие вещества, известные в данной области. Такие вещества не должны быть токсичными и не должны препятствовать эффективности активного ингредиента. Носитель может находиться в виде широкого ряда форм в зависимости от вида препарата, необходимого
- 29 032207 для введения.
В случае перорального введения соединения могут находиться в составе твердых или жидких препаратов, таких как капсулы, пилюли, таблетки, пастилки, порошки, суспензии или эмульсии. Для получения композиций в виде пероральных дозированных форм можно использовать любую традиционную фармацевтическую среду, такую как, например, вода, гликоли, масла, спирты, ароматизаторы, консерванты, красители, суспендирующие средства и т.п., в случае пероральных жидких препаратов (таких как, например, суспензии, эликсиры и растворы); или такие носители, как крахмалы, сахара, разбавители, гранулирующие средства, смазывающие средства, связующие средства, разрыхлители и т.п., в случае пероральных твердых препаратов (таких как, например, порошки, капсулы и таблетки). Вследствие простоты введения таблетки и капсулы представляют собой наиболее предпочтительные пероральные единичные дозированные формы, для получения которых, разумеется, используют твердые фармацевтические носители. При необходимости таблетки могут содержать сахарное или энтеросолюбильное покрытие, которое наносят стандартными способами.
Активное средство предпочтительно вводят в терапевтически эффективном количестве. Фактически вводимое количество, а также скорость и период введения зависят от природы и тяжести состояния, подлежащего лечению. Назначение лечения, например решение о дозировке, времени и т.д., находится в пределах ответственности врачей общего профиля или специалистов, которые обычно учитывают расстройство, подлежащее лечению, состояние пациента, участок доставки, способ введения и другие факторы, известные врачам. Примеры методов и схем можно найти в КештЦопА Рйагтасеибса1 8с1епсе8, (выше).
Пищевой продукт, или напиток, или фармацевтический препарат можно легко упаковать для продажи или он может находиться в виде насыпной формы. Изобретение также предлагает способы получения пищевого продукта, напитка или фармацевтического препарата настоящего изобретения, а также составы и инструкции для получения таких пищевых продуктов и напитков. Способы могут включать в себя стадии сбора растения или части растения, отделение зерна от других частей растения, дробление, экстракцию, размалывание, тепловую обработку, консервирование, упаковывание или другие технологические операции, известные в данной области. Способы, или составы, или инструкции могут включать в себя стадии обработки растительного продукта настоящего изобретения и/или смешивание его с другими пищевыми ингредиентами, такие как нагревание или выпекание смеси, или продукта, например, по меньшей мере при 100°С. Способ может включать в себя стадию упаковывания продукта с получением готового к продаже продукта.
Промышленное применение.
Растительные продукты, предпочтительно зерно, можно использовать в производстве промышленных продуктов, таких как, например, этанол.
Далее настоящее изобретение описывается с помощью нижеследующих неограничивающих примеров.
Пример 1. Иллюстративные методы и материалы.
Растительный материал.
Используют линии ячменя (Ногбеит уифаге) из популяции, полученной путем обратного скрещивания, начиная со скрещивания родителя, относящегося к сорту Н1та1ауа292 (М292 (8Е0 ΙΌ N0: 9-11), Моге11 е1 а1. 2003 (выше)), который содержит мутацию 8811а, обозначаемую здесь как аллель §ех6-292, с родителем, относящимся к сорту Нщ11 Лту1о§е С1ас1ег (НЛО, также называемым АС38) . Подходящие родительские сорта присутствуют в продаже. Например, сорт НАС (Н1дй Ату1о§е С1ас1ег, также называемый АС38) поставляется С81КО или Австралийской коллекцией озимых зерновых культур, Тат^оПН, Ν8\ν. Скрещивание растений ячменя проводят в теплице стандартными способами. Популяции обратного скрещивания получают путем 3 обратных скрещиваний растения сорта Н1та1ауа292 (мужское) с растением сорта НАС (женское) с последующим получением 3 поколений одного семени (88И). Семена, полученные от 3-го обратного скрещивания, называют ВС3Е1, а семена, полученные от 3-го 88И, называют ВС3Е4. Чтобы повысить качество семян, для каждой линии выращивают 2 или 3 дополнительных поколения. Такие поколения, обозначаемые ВС3Е6 или ВС3Е7, используют в данном исследовании.
линий ячменя ВС3Е6 выращены в 2005 г. растениеводческой компанией С81К0, СапЬегга в горшках с использованием в качестве остальных условий природные. Чтобы подтвердить состав и параметры выбранных семян, подгруппу линий ячменя ВС3Е7, выбранную по массе семян, содержанию амилозы и присутствию мутаций 8811а и ато1, выращивают либо в растениеводческой компании С81КО, СапЬегга в теплице с природным освещением и при температуре 18°С (ночь) и 24°С (день) либо на поле Уапсо, Νον 8ои111 АийгаНа, в 2007 г.
Колосья ячменя метят во время цветения через 2 дня после первого появления ости, на вершине кроющего листа, содержащего закрытый колос. Развивающиеся семена собирают через 20 дней после цветения (ИРА), удаляют зародыши, развивающийся эндосперм экструдируют через режущую поверхность и хранят при -80°С.
Другие сорта, указанные в настоящем описании, получают на коммерческой основе от Австралий
- 30 032207 ской коллекции озимых зерновых культур, Тат\гог1к Ν8Α, Аик1га11а.
Генотипирование популяции ВС3Р6 путем амплификации ПЦР.
Молодые листья пшеницы из поколения ВС3Р6 популяции, полученной в результате обратного скрещивания, собирают и лиофилизируют (с помощью систем для лиофилизации РТ8, 81опе Кзбде, №\ν Υо^к). Геномную ДНК выделяют с помощью набора для быстрого выделения ДНК ΌΝΛ® в соответствии с инструкциями поставщиков (ф-ВЮдепе).
Генотипирование мутации 8811а проводят методом амплификации ПЦР, используя праймеры 8811аР (5'-ССТССААСАСТТСАСАСТСТАСС-3' (8ЕО ГО N0: 3)), начиная с нуклеотида 1616, и 8811аВ (5'АССАТСАССАССТССАССТССТ-8' (8ЕО ГО N0: 4)), начиная с нуклеотида 2044 кДНК 8811а (СепВапк № АΥ133249), с получением продукта размером 451 п.о., содержащего участок мутации 8811а в положении 1829 Н1та1ауа292, как описано Моге11 е1 а1. 2003Ь (выше) (см. также 8Еф ГО N0: 9). Полученный методом ПЦР микросателлитный маркер ЕВтас0501 используют для детекции мутации ато1, расположенной на расстоянии 68,0 сМ на хромосоме 1Н и расположенной близко от локуса ато1, также на расстоянии 68,0 сМ. Для амплификации фрагмента ПЦР из локуса ато1 используют праймеры ННас0501Р (5'-САССАССТТСТААААССАСАСТТААСТСССАТССАААС-3' (8ЕЕ) ГО N0: 5) и ННас0501В (5'АСССАСАААААТСССТААС-3' (8ЕО ГО N0: 6)) (СгашСепек Оа!аЬаке).
Для каждой реакции ПЦР используют реакционную смесь объемом 20 мкл, которая содержит 50 нг геномной ДНК, 1,5 мМ МдС12, 0,125 мМ каждого б№ТР, 10 пмоль праймеров, 0,5М глицинбетаина, 1 мкл ДМСО и 1,5 ед. полимеразы Тад Но1к1аг (ф1АСЕ№). Реакции ПЦР проводят на оборудовании ΗΥВАI^ РСР Ехргекк (1п1егдга1еб 8с1епсек), используя 1 цикл, включающий в себя 95°С в течение 5 мин, 35 циклов, включающих в себя 94°С в течение 45 с, 58°С в течение 30 с и 12°С в течение 1 мин, 1 цикл, включающий в себя 12°С в течение 10 мин, и 1 цикл, включающий в себя 25°С в течение 1 мин. Продукты ПЦР, используемые для детекции мутации 8811а, расщепляют с помощью фермента рестрикции №11У при 37°С в течение ночи. Расщепленные (в случае мутации 8811а) и нерасщепленные (в случае мутации ато1) фрагменты ПЦР разделяют в 2% агарозных гелях и визуализируют, используя прилагающиеся к гелю документы (ИУйес), после окрашивания Се1Реб (Вюкит).
Для генотипирования линий ячменя из популяции, полученной в результате обратного скрещивания Н1та1ауа292 х НАС, используют описанные выше праймеры 88ПаР и 88ПаВ, позволяющие детектировать мутацию 8811а из родительской линии Н1та1ауа292, и микросателлитный маркер ЕВтас0501, позволяющий детектировать локус ато1 из родительской линии НАС. В случае мутации 8811а после расщепления продукта ПЦР ферментом Ма1У и последующего гель-электрофореза наблюдают три типа фрагментов ПЦР, которые позволяют различать мутантные аллели 8811а и аллели 8811а дикого типа. Фрагмент ДНК размером 347 п.о. указывает на присутствие мутантного гена 8811а, фрагмент ДНК размером 236 п.о. указывает на присутствие гена 8811а дикого типа, а наличие обоих фрагментов размером 347 п.о. и размером 236 п.о. свидетельствует о том, что линии имеют гетерозиготный генотип. В случае мутации ато1 из НАС, микросателлитный маркер ЕВтас0501 также дает три варианта фрагментации ПЦР. Фрагмент 167 п.о. соответствует мутантному ато1, фрагмент 141 п.о. детектируют в линиях дикого типа, а наличие обоих фрагментов, 167 п.о. и 141 п.о., свидетельствует о том, что линии являются гетерозиготными.
Характеристика зерна.
Зерно собирают из растений после созревания. Если не указано иначе, среднюю массу семян определяют путем взвешивания 100 семян с 3 повторами. Массу семян для выбранных линий также определяют как среднюю массу семян, определенную путем взвешивания 500 семян с 3 повторами, в случае материала ВС3Р7, выращенного на поле Υаηсо, Содержание влаги в зерне измеряют стандартным методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР) с помощью 0хГогб 4000 NМВ Мадпе! (0хГогб апа1уйса1 шккитеШк Ытйеб). Пористость зерна измеряют с помощью прибора 8шд1е-Кегпе1 Ск1гас1епха1юп кук1ет 4100 (Рейеп 1пк1гитеп1к 1пс. 8ргшдДе1б, 1Ь 62707 И8А), используя официальный метод тестирования химии зерна ВАС1 12-01. Налив зерна подразделяют на три категории: морщинистое, полуналитое и налитое.
Микроскопический анализ поперечных срезов зерна ячменя и сканирующая электронная микроскопия.
Поперечные срезы средней части зерна ячменя толщиной примерно 1 мм вырезают с помощью лезвия бритвы и фотографируют. Затем их покрывают частицами золота и анализируют с помощью сканирующего электронного микроскопа 18М-6400 (8ЕМ) при 15 кВ.
Размалывание зерна.
Зерно размалывают до состояния непросеянной муки и пропускают через сито 0,5 мм, используя вихревую мельницу (Сус1о1ес 1093, ТесаЮг 8\гебеп). Затем непросеянную муку используют в описанном ниже анализе.
Анализ β-глюкана и пентозана.
Содержание β-глюкана определяют с помощью метода, описанного в Медахуте Ме11юб (ААСС32.23), используя 20 мг непросеянной муки для каждого образца из трех повторов. Содержание
- 31 032207 пентозана определяют с помощью метода, описанного Вс11 (1985), используя 20 мг непросеянной муки для каждого образца из трех повторов.
Экстракция крахмала.
Крахмал выделяют из непросеянной муки путем экстракции протеазой (Моткои с! а1., 1 Ссгса1 8а, 2: 257-271, 1984), промывают водой и удаляют остатки. Затем крахмал промывают ацетоном и сушат на воздухе при комнатной температуре (Кошк-Вокс с! а1., 2007 (выше)).
Общий анализ крахмала.
Содержание общего крахмала определяют с помощью метода, описанного в Мсд-иутс Мсбюб (ААСС76.13), используя 20 мг непросеянной муки для каждого образца из трех повторов.
Анализ состава и характеристика крахмала.
Содержание амилозы и амилопектина в крахмале зерна или отношение амилозы к амилопектину определяют путем гель-фильтрации на сефарозе СЬ-2В с помощью описанного ниже метода (метод гельфильтрации). Примерно 10 мг общего крахмала растворяют в 3,0 мл 1М №аОН и фракционируют по молекулярной массе путем хроматографии на колонке с сефарозой СЬ-2В (Всдюа с! а1., Ргос №а!1 Асаб 8а И8А, 103: 3546-3551, 2006). Количество крахмала в каждой фракции, выходящей с колонки, измеряют с помощью набора для анализа крахмала (8щта) в соответствии с инструкциями поставщика. Рассчитывают общее количество амилопектина (первый пик, более высокая молекулярная масса) и амилозы (второй пик, более низкая молекулярная масса) и определяют их отношение.
Альтернативно содержание амилозы измеряют с помощью мелкомасштабного (2 мг крахмала) метода адсорбции иода (Моткои аиб Ьа1дис1с!, 1 Ссгеа1 8а, 1: 9-20, 1983) с некоторыми модификациями, как описано Кошк-Вокс с! а1., 2007 (выше).
Распределение длин цепей.
Распределение длин цепей амилопектина измеряют после расщепления разветвленной структуры крахмала в образцах с помощью метода, описанного О'811са с! а1., СагЬойубг Иск, 307: 1-12, 1998, используя систему капиллярного электрофореза Р/АСЕ 5510 (Вссктаи Сои1!сг, Ν8Α Аикйайа) с детекцией флуоресценции, индуцированной аргоновым лазером (Ь1Е). Разностные диаграммы для молекулярных масс получают путем вычитания нормализованного распределения длин цепей модифицированного крахмала из нормализованного распределения длин цепей крахмала, полученного из изогенного немодифицированного контрольного растения.
Профиль температур желатинизации образцов крахмала можно измерить с помощью дифференциального сканирующего калориметра Рупк 1 (Рсгкш Е1тсг, №ота1к СТ, И8А). Вязкость растворов крахмала можно измерить с помощью Кар1б-У1ксо-Аиа1уксг (ИУА, №с\урог1 8аси!гГю Р1у Ь!б, Аатс^ооб, 8убису), используя условия, описанные Ва!су с! а1., 8!агсй 48: 338-344, 1997. Измеряемые параметры включают в себя максимальную вязкость (максимальная вязкость горячей пасты), степень стабилизации, конечную вязкость и температуру пастообразования. Характеристики пастообразования можно измерить с помощью Вар|б У1ксо Аиа1уксг следующим способом. Крахмал (3,0 г) добавляют к дистиллированной воде (25,0 мл) в чашке для Э8С и проводят анализ, используя следующий режим ИУА: 2 мин при 50°С, нагревание в течение 6 мин до 95°С, выдерживание при 95°С в течение 4 мин, охлаждение в течение 4 мин до 50°С, выдерживание при 50°С в течение 4 мин. Измеряют следующие параметры: максимальная вязкость при 95°С, степень стабилизации в конце периода выдерживания при 95°С, разрушение=максимальная вязкость - степень стабилизации, конечная вязкость в конце периода выдерживания при 50°С, уменьшение=конечная вязкость - степень стабилизации. Для сбора и анализа данных можно использовать программное обеспечение Т11сгтос1шс версии 2.2 для \Утбо\ук (№с\урог1 8асийДс Р1у Ь!б, Ν8Α Аикйайа).
Объем набухания муки или крахмала можно определить по способу Кошк-Вокс с! а1., 8!агсй-81агкс, 53: 14-20, 2001. Поглощение воды определяют путем взвешивания образца до и после смешивания образца муки или крахмала с водой при определенной температуре (например, при 90°С) и после сбора желатинизированного вещества.
Морфология гранул крахмала, двойное лучепреломление и распределение размера гранул.
Морфологию гранул анализируют методом 8ЕМ (18М-6400) и микроскопии в поляризованном свете. Форму и двойное лучепреломление гранул крахмала анализируют с помощью описанного способа (Уататоп с! а1., 2000 (выше)). Распределение размера гранул (по объему) в взвесях крахмала определяют с помощью лазерного дифракционного анализатора размера частиц (Мак1с1Асг 2000, Ма1усги 1ик!гитси!к, Ма1усги, Еид1аиб). Процент маленьких гранул крахмала типа В определяют, используя отсекаемый диаметр 7 мкм.
Анализ липидов.
Общее содержание липидов можно определить методом ЯМР, используя магнит ЯМР ОхГогб 4000, ОхГогб Апа1уРса1 1ик!гитси!к Ытйсб, ИК. Для получения каждого образца 1 г семян сушат при 38,8°С в течение 64 ч. Затем высушенные семена анализируют методом ЯМР и сравнивают с контрольными образцами, содержащими чистое масло ячменя, полученными из зерна Н1та1ауа или М292.
Содержание белков, содержание липидов, содержание влаги и содержание золы.
- 32 032207
Содержание белка определяют путем измерения содержания азота методом масс-спектрометрии с помощью масс-спектрометра для измерения отношения изотопов Еигора 20-20 с автоматизированной препаративной системой анализатора азота и углерода. Используют от 3 до 8 мг непросеянной муки ячменя. Для расчета содержания белка в семенах ячменя используют коэффициент конверсии азота в белок б,25 (Мо88е 1990). Содержание липидов, содержание влаги и содержание золы измеряют методом АОАС 983.23, методом ААСС 44-19 и методом ААСС 08-01.
Анализ общего содержания клетчатки.
Для определения общего содержания клетчатки (ΊΌΕ) в непросеянной муке используют гравиметрический метод Ргохку е! а1. (1985; АОАС 985.29). Анализируют двойные повторы образцов.
Анализ отличных от крахмала полисахаридов.
Общее содержание нейтральных отличных от крахмала полисахаридов (Ы8Р) измеряют с помощью модифицированного метода газовой хроматографии, описанного ТНеапбег е! а1., 1 АОАС Ш! 78: 10301044, 1995. Модификация включает в себя гидролиз 1М серной кислотой в течение 2 ч с последующим центрифугированием, чтобы удалить нерастворимые Ы8Р, и дополнительный гидролиз растворимых Ы8Р в супернатанте 2М трифторуксусной кислотой.
Анализ резистентного крахмала.
Для определения содержания резистентного крахмала (К8) используют анализ ш νίΙΐΌ. Этот способ включает в себя две стадии: вначале крахмал в каждом образце гидролизуют в условиях, имитирующих физиологические; затем побочные продукты удаляют промыванием и после гомогенизации и высушивания образца определяют содержание остаточного крахмала. Количество крахмала, определенное в конце расщепляющей обработки, представляет собой содержание резистентного крахмала в образце. Обычно тройные повторы образцов целой муки и соответствующие стандарты смешивают с искусственной слюной, после чего полученные комки инкубируют с ферментами поджелудочной железы и желудочного сока при физиологических значениях рН и температуры. Количество остаточного крахмала в переваренном содержимом определяют, используя традиционные ферментные методы и спектрофотометрию, содержание резистентного крахмала в образце выражают в виде процента по отношению к массе образца или к общему содержанию крахмала.
В 1 день количество образца, содержащего до 500 мг углеводов, взвешивают в колбе Эрленмейера объемом 125 мл. Карбонатный буфер получают путем растворения 121 мг ЫаНСО3 и 157 мг КС1 примерно в 90 мл очищенной воды, затем добавляют 159 мкл 1М раствора СаС12-бН2О и 41 мкл 0,49М МдС12-бН2О, доводят рН до 7-7,1 с помощью 0,32 М НС1 и доводят объем до 100 мл. Полученный буфер хранят при 4°С до пяти дней. Получают искусственный раствор слюны, содержащий 250 единиц аамилазы (81дта А-317б тип УЬВ, из поджелудочной железы свиньи) на мл карбонатного буфера. Искусственный раствор слюны добавляют в колбу в количестве, примерно равном массе пищевого продукта.
Примерно через 15-20 с после добавления слюны в каждую колбу добавляют 5 мл раствора пепсина в НС1 (1 мг/мл пепсина (81дта) в 0,02М НС1, рН 2,0, полученного в день применения). Смешивание с амилазой и затем с пепсином имитирует пережевывание образца человеком перед проглатыванием. Смесь инкубируют при 37°С в течение 30 мин, встряхивая при 85 об/мин. Затем смесь нейтрализуют, используя 5 мл 0,02М ЫаОН. В каждую колбу добавляют 25 мл ацетатного буфера (0,2М, рН б) и 5 мл смеси ферментов поджелудочной железы, содержащей 2 мг/мл панкреатина (81дта, из поджелудочной железы свиньи, активность 4х И8Р) и 28 ед. амилоглюкозидазы (АМ6, 81дта) из АкрегдШш шдег в ацетатном буфере, рН б. Каждую колбу закрывают алюминиевой фольгой и инкубируют при 37°С в течение 1б ч в качающейся водяной бане при 85 об/мин.
На 2 день содержимое каждой колбы количественно переносят в полипропиленовую пробирку объемом 50 мл и центрифугируют при 2000хд в течение 10 мин при комнатной температуре. Супернатанты отбрасывают, каждый осадок промывают три раза 20 мл воды, осторожно встряхивая пробирку при каждом промывании, чтобы разбить осадок, и центрифугируют. 50 мкл последнего водного смыва анализируют с помощью реагента Триндера для определения глюкозы на отсутствие глюкозы. Каждый осадок ресуспендируют примерно в б мл очищенной воды и гомогенизируют три раза в течение 10 с с помощью и1!га Тиггах ТР18/10, используя диспергирующее устройство 825Ν-86. Содержимое каждой пробирки количественно переносят в мерную колбу объемом 25 мл и доводят объем. Содержимое осторожно перемешивают и возвращают в полипропиленовую пробирку. Образец каждой суспензии объемом 5 мл переносят в пробирку для культивирования объемом 25 мл, сразу подвергают поверхностному замораживанию в жидком азоте и сушат из замороженного состояния.
На 3 день измеряют общее содержание крахмала в каждом образце, используя реагенты, присутствующие в наборе для определения общего содержания крахмала Меда/уте. Получают стандарты крахмала (нормальный кукурузный крахмал, 81дта 8-529б) и пустые образцы, содержащие только реагенты для анализа.
Образцы, контрольные образцы и пустые образцы, содержащие только реагенты, увлажняют путем добавления 0,4 мл 80% этанола, чтобы обеспечить диспергирование, и затем встряхивают. Сразу после этого добавляют 2 мл ДМСО, и растворы перемешивают встряхиванием. Пробирки помещают в кипя
- 33 032207 щую водяную баню на 5 мин и сразу добавляют 3 мл раствора термостабильной а-амилазы (100 ед./мл) в буфере МОР8 (рН 7, содержит 5 мМ СаС12 и 0,02% азида натрия). Растворы инкубируют в кипящей водяной бане еще 12 мин, перемешивая путем встряхивания с интервалами в 3 мин. Пробирки помещают в водяную баню при 50°С и добавляют 4 мл натрий-ацетатного буфера (200 мМ, рН 4,5, содержит 0,02% азида натрия) и 0,1 мл амилоглюкозидазы с концентрацией 300 ед./мл. Смеси инкубируют при 50°С в течение 30 мин при осторожном перемешивании с интервалами в 10 мин. Объемы доводят до 25 мл в мерной колбе и хорошо перемешивают. Аликвоты центрифугируют при 2000хд в течение 10 мин. Количество глюкозы в 50 мкл супернатанта определяют, используя 1,0 мл реагента Триндера для определения глюкозы, поглощение измеряют при 505 нм после инкубации пробирок при комнатной температуре в темноте в течение минимум 18 мин и максимум 45 мин.
Количественное определение содержания водорастворимых углеводов.
Общие водорастворимые углеводы (У8С) экстрагируют из непросеянной муки с помощью метода Ьипп апб На!сЬ, Р1ап!а 197: 385-391, 1995 с указанными ниже модификациями. Непросеянную муку в настоящем описании определяют как продукт, полученный в результате перемалывания зрелого зерна, без последующего фракционирования (такого как просеивание) с целью удаления отрубей. Следовательно, непросеянная мука содержит все компоненты зерна.
Непросеянную муку (100 мг) экстрагируют три раза 10 мл 80% этанола (об./об.) на кипящей водяной бане в течение 10 мин. Супернатанты каждой экстракции объединяют, лиофилизируют и ресуспендируют в 2 мл воды ιηί11ίθ. Количества сахарозы, глюкозы и фруктозы измеряют с помощью калориметрического ферментативного анализа в микропланшетах по описанному способу (СатрЬе11 е! а1., 1 8с ί Бооб Адпс 79: 232-236, 1999; Виикка е! а1., Гипс! Р1ап! Вю1 33: 799-809, 2006). Содержание сахаров, мальтозы и фруктоолигосахаридов (фруктанов) также анализируют методом высокоэффективной анионообменной хроматографии (НРАЕС), описанным в Виикка е! а1., 2006 (выше). Оба способа дают сравнимые результаты.
Чтобы определить уровни мальтозы, общие сахара, экстрагированные из непросеянной муки ячменя, анализируют, по существу, как описано в ВегпГеИ, Ату1акек ар1рЬа апб Ье!а. 1п: С’о1о\\'1ск апб Кар1ап (ебк), МеФобк т еп/утоАу, Асайетк, ΝΥ, р. 149, 1955, используя для сравнения стандартные растворы мальтозы, нижеследующим способом. Общие сахара разбавляют в 10-100 раз. Получают стандартные растворы мальтозы (10 пробирок) с концентрацией от 0,3 до 5 мкмолей на мл. Один мл каждого разведения мальтозы (в составе раствором общих сахаров или растворов мальтозы) смешивают с 1 мл динитросалициловой кислоты, используемой в качестве окрашивающего реагента. Затем раствор сахара инкубируют при 100°С в течение 5 мин и охлаждают до комнатной температуры. В каждую пробирку добавляют 10 мл химически чистой воды и хорошо перемешивают. Образцы измеряют при А540 с помощью спектрофотометра. Содержание мальтозы также определяют с помощью описанного выше метода НРАЕС.
Ферментные анализы.
Общую активность синтазы крахмала в таких образцах, как развивающийся эндосперм зерновых, можно измерить путем экстракции белков и анализа с помощью методов, описанных в ЫЬеккаП е! а1. Р1ап! Се11. 7(8): 1117-1127, 1995 или Сао е! а1., Р1ап! Рйукю1. 120(1): 205-16, 1999. Данные анализы позволяют измерить включение мономера в полимеры крахмала с использованием 14С-меченого субстрата АЭРС. Отдельные изоформы синтазы крахмала можно разделить методом гель-электрофореза и анализировать в геле (с получением зимограммы) с помощью нижеследующего способа. Экстракты образцов, таких как развивающиеся семена, можно получить с использованием 50 мМ калий-фосфатного буфера, рН 7,5, содержащего 5 мМ ЕЭТА, 20% глицерина, 10 мкМ Ре£аЬ1ос и 0,05 мМ дитиотреитола (ЭТТ). После размалывания семян с получением кашицы в буфере или гомогенизирования образца смесь центрифугируют при 14000хд в течение 15 мин при 4°С, и затем супернатант отсасывают. Концентрацию белка в супернатанте можно измерить с использованием реагента Кумасси или других стандартных средств. Экстракты можно хранить при -80°С до последующих анализов на нативных гелях. Для проведения денатурирующего гель-электрофореза 100 мкл экстракта смешивают с 8Ό8 и β-меркаптоэтанолом, после чего смеси инкубируют в кипящей воде в течение 4 мин, чтобы денатурировать белки. Электрофорез проводят в стандартных денатурирующих полиакриламидных гелях, используя 8% полиакриламидные разделяющие гели с наложенными 4,5% полиакриламидными концентрирующими гелями. После электрофореза белки можно ренатурировать путем пропитывания гелей 40 мМ буфером Тпк-НС1 в течение минимум 2 ч, заменяя буфер каждые 30 мин новой порцией объемом по меньшей мере 100 мл. В случае неденатурирующих гелей стадию денатурации 8Ό8 и β-меркаптоэтанолом опускают и из гелей убирают 8Ό8. Буфер для анализа синтазы крахмала, содержащий трис-глицин (25 мМ трис, 0,19М глицин), 0,133М сульфат аммония, 10 мМ МдС12, 670 мкг/мл БСА и 1 мМ субстрат АОРС, можно использовать для детекции полос синтазы крахмала с последующей детекцией крахмального продукта путем окрашивания йодным раствором, содержащим 2% К1, 0,2% 12.
Альтернативно синтазу крахмала или другие ферменты биосинтеза крахмала можно детектировать в образцах с помощью специфических антител (ЕЫ8А).
- 34 032207
Статистические анализа взаимоотношения генотипов и компонентов семян или свойств крахмала.
Статистические анализы проводят с использованием СепЛак версия 9. Проводят вариационный анализ массы семян, общего содержания крахмала, содержания амилазы, содержания бета-глюкана, содержания сахара, размера гранул крахмала и распределения длин цепей амилопектина с получением минимально значимого различия (Ъ8Э. Р<0,05), наблюдая различия между генотипами.
Пример 2. Генотипирование растений.
Популяцию линий, сегрегирующих по присутствию или отсутствию мутаций в локусах 8811а и ато1, получают путем проведения трех обратных скрещиваний донорной линии §ех6-292 (Н1та1ауа292) с рекуррентным родителем ато1-АС38. Из линий ВС3Р2 выращивают три поколения одного семени, чтобы получить генотипы, достаточно фиксированные для того, чтобы исследовать относительное влияние локусов §ех6 и ато1, по отдельности или в сочетании, на синтез крахмала и состав зерна. Для генотипирования локуса §ех6 в линиях ВС3Р6 используют маркер казуальной мутации в гене 8811а (Моге11 е! а1. 2003Ь (выше)), тогда как тесно связанный микросателлитный маркер ЕВтас0501 используют в качестве суррогатного маркера статуса ато1-38, как описано в примере 1.
Среди 70 генотипированных линий ВС3Р6 14 линий являются гомозиготными как по аллелю §ех6292, так и по аллелю ато1-АС38 (§ех6-292/ато1-АС38), и, следовательно, считаются двойными мутантами 8811а-ато1, 17 линий являются гомозиготными по аллелю §ех6-292 и по аллелю ато1 дикого типа (5ех6-292/ато1-\\1) и, следовательно, представляют собой одиночные мутанты 8811а, 10 линий являются гомозиготными по аллелю §ех6 дикого типа и по аллелю ато1-АС38 (5ех6-\\1/ато1-АС38) и, следовательно, представляют собой одиночные мутанты ато1, и 15 линий содержат аллели §ех6 и ато1 дикого типа (Аех6-\\1/ато1-\\1) и, следовательно, характеризуются как линии дикого типа. Остальные линии являются гетерозиготными либо по мутации §ех6 (7 линий), либо по маркеру ЕВтас0501.
ДНК-маркер гена 88111а, который является полиморфным в родительских линиях НАС и Н1та1ауа292 (пример 3), также используют для генотипирования 56 гомозиготных линий. Данный анализ показывает, что ген 88111а из НАС присутствует в 26 линиях, а ген 88111а из Н1та1ауа292 присутствует в 30 линиях. Показано, что среди 56 линий, генотипированных с использованием маркера ЕВтас0501 и маркера гена 88111а, 5 линий имеют рекомбинантные генотипы. С учетом корреляции генотипов и фенотипов, включающих в себя налив зерна и содержание крахмала, 4 линии, генотипированные с использованием ЕВтас0501, и 1 линия, генотипированная с использованием маркера гена 88111а, дают рекомбинантные фенотипы. Это свидетельствует о том, что существует некоторая степень рекомбинации между маркерами и локусом ато1, отвечающим за фенотипы крахмала, и что ген ато1 и ген 88111а являются генетически разными, даже если они близко расположены в ячмене.
Фенотипы родительских сортов также различаются по присутствию или отсутствию кожуры - НАС представляет собой сорт, имеющий кожуру, а Н1та1ауа292 не имеет кожуры. Двойные мутанты 8811аато1 сегрегируют по данным характеристикам, и, следовательно, их можно подразделить на две подгруппы - имеющие кожуру или не имеющие кожуру. Таким образом, четыре генотипа линий ячменя, различающиеся, как описано выше, подразделяют на пять групп, а именно линии дикого типа, одиночные мутанты 8811а, одиночные мутанты ато1, не имеющие кожуру двойные мутанты и имеющие кожуру двойные мутанты. Четыре линии из каждой из пяти групп используют для анализа распределения гранул крахмала, ν8^ СЕ и морфологии семян. Одну линию каждого генотипа используют для анализа структуры эндосперма и морфологии гранул крахмала. 11 линий дикого типа, 9 линий мутантов ато1, 13 линий мутантов 8811а, 4 линии не имеющих кожуру двойных мутантов и 6 линий имеющих кожуру двойных мутантов используют для анализа состава зерна, содержания амилозы и массы семян с помощью описанных ниже способов.
Масса семян.
Среднюю массу семян (среднее значение от массы 100 семян) измеряют в гомозиготных линиях популяции ВС3Р6. Средняя масс семян составляет 52,7±5,0 мг для 11 линий дикого типа, 52,8±2,8 мг для 9 линий ато1, 38,7±2,5 мг для 13 8811а-мутантных линий, 47,6±4,5 мг для 6 линий, имеющих кожуру двойных мутантов, и 44,7±1,0 мг для 4 линий, не имеющих кожуру двойных мутантов. Значимые различия в массе семян мутантных линий ато1 и линий дикого типа отсутствуют (Р<0,05), свидетельствуя о том, что мутация ато1 не влияет на массу семян. Однако существуют статистически значимые различия (Р<0,05) между каждым из одиночных мутантов 8811а и двойных мутантов (имеющих кожуру и не имеющих кожуру) и каждым из трех других соответствующих генотипов. Аналогичные данные по массе семян 4 генотипов из популяции ВС3Р7 получены в 2007 г в отдельных испытаниях линий в теплицах и на поле. Удивительный и неожиданный результат заключается в том, что снижение массы семени, вызванное наличием мутации 8811а, которая, как известно, приводит к уменьшению синтеза амилопектина в отсутствии активности 8811а, отчасти возмещается сочетанием с мутацией ато1.
Морфология семян.
Интактные семена четырех типичных линий из каждого генотипа анализируют с помощью стереоскопического микроскопа с тыльной стороны и на стороне бороздки. Линии с одиночной мутацией 8811а имеют морщинистые семена, тогда как линии дикого типа и линии с одиночной мутацией ато1 дают на
- 35 032207 литые хорошо заполненные семена. Семена двойных мутантов, как имеющих кожуру, так и не имеющих кожуру, характеризуются промежуточным фенотипом, они более налитые, чем 88Па-мутантные семена, но не так хорошо наполнены, как семена ато1 и семена дикого типа. Эти наблюдения согласуются с результатами измерения массы семян.
Для дополнительной иллюстрации налитости семян указанных генотипов анализируют поперечные срезы средней части семян по наибольшему диаметру (фиг. 1). На поперечных срезах семян линий дикого типа и мутантных линий ато1 можно видеть полностью заполненный эндосперм, тогда как мутантные линии 88Па имеют не полностью заполненные (морщинистые) семена со значительным снижением плотности упаковки эндосперма. Линии двойных мутантов 88Па-ато1 имеют промежуточный фенотип, характеризующийся эндоспермом, более наполненным, чем у мутантов 88Па, но менее наполненным, чем у линий дикого типа или мутантных линий ато1.
Чтобы повысить точность анализа, обратные срезы семян ячменя всех генотипов анализируют методом сканирующей электронной микроскопии (8ЕМ). На поверхности срезов тыльной стороны зерен ячменя дикого типа можно обнаружить квадратные алейроновые клетки размером примерно 20-25x20-25 мкм с дифференцированными клетками субалейронового слоя и эндосперм, заполненный плоскими круглыми клетками с четкими границами размером примерно 210x130 мкм. У мутанта кех6-\\1/ашо1АС38 алейроновые клетки имеют прямоугольную форму с размерами примерно 20-25x10-15 мкм. Субалейроновые клетки являются четко дифференцированными, а эндосперм содержит плоские клетки с четкими границами, длиннее и уже, чем в эндосперме дикого типа, с размером примерно 230x30 мкм. Мутант 5ех6-292/ато1-\\1 содержит неупорядоченные прямоугольные алейроновые клетки размером 4550x5-10 мкм, субалейроновые клетки не являются четко дифференцированными, а эндосперм содержит неупорядоченные клетки размером 90-95x25-30 мкм. В случае генотипа двойного мутанта кех6292/ато1-АС38 алейроновые клетки имеют форму, близкую к квадратной, и размер примерно 20x20 мкм, субалейроновые клетки так плохо дифференцированы, что их нельзя идентифицировать, а эндосперм содержит плоские круглые клетки с четкими границами размером примерно 110x90 мкм.
Содержание общего крахмала.
Общее содержание крахмала измеряют по способу, описанному в примере 1 для семян ВС3Р6 четырех генотипов. Среднее содержание крахмала составляет 64,3±2,4% в линиях дикого типа, 57,2±2,8% в мутантных линиях ато1, 34,9±4,0% в мутантных линиях 88Па, 50,8±2,8% в линиях двойных мутантов, не имеющих кожуру, и 47,6±2,3% в линиях двойных мутантов, имеющих кожуру (фиг. 2) . По сравнению с линиями дикого типа содержание общего крахмала в линиях мутантов ато1, не имеющих кожуру двойных мутантов, имеющих кожуру двойных мутантов и мутантов 88Па, уменьшается на 7,1, 13,5, 16,7 и 29,4% соответственно. Указанные различия среди пяти групп являются статистически достоверными (Р<0,05), за исключением значений, полученных для не имеющих кожуру и имеющих кожуру групп, отличие которых от контрольных значений не является существенным. Соответствующие взаимоотношения для масс семян из пяти групп получают (Р<0,05) для зерна ВС3Р7, выращенного в 2007 г. в отдельных испытаниях в теплице и на поле. Полученные результаты показывают, что повышенная масса семян двойных мутантов 88Па-ато1 по сравнению с одиночным мутантом 88Па обусловлена повышенным содержанием крахмала.
Содержание амилозы.
Содержание амилозы измеряют во всех линиях четырех генотипов. Содержание амилозы составляет 32,0±3,2% в линиях дикого типа, 49,5±2,7% в мутантных линиях ато1, 57,6±10,0% в мутантных линиях 88Па, 62,2±4,1% в линиях двойных мутантов, не имеющих кожуру, и 59,8±2,3% в линиях двойных мутантов, имеющих кожуру. Статистический анализ показывает, что мутантные линии 88Па и линии двойных мутантов имеют гораздо более высокое содержание амилозы в семенах, чем мутанты ато1 и линии дикого типа, однако содержание амилозы у мутантов 88Па и двойных мутантов практически не различается (Р<0,05), свидетельствуя о том, что мутация 88Па повышает долю амилозы в общем крахмале зерна, однако добавление мутации ато1 не приводит к дополнительному значимому увеличению доли амилозы. Указанные различия в содержании амилозы у разных генотипов согласуются с результатами, полученными для линий ВС3Р7, выращенных в 2007 г.
Распределение длин цепей крахмала.
Для анализа влияния генотипов на распределение длин цепей крахмал выделяют из четырех линий каждой группы популяции ВС3Р6 и анализируют методом электрофореза углеводов с применением флуорофора (РАСЕ). Объединяют проценты цепей, входящих в кластеры, содержащие ΌΡ 6-8, ΌΡ 9-14, ΌΡ 15-24, ΌΡ 35-34, ΌΡ 35-44 и ΌΡ>45. Не существует значимых различий (Р<0,05) среди кластеров в мутантах 88Па, в двойных мутантах, не имеющих кожуру, и в двойных мутантах, имеющих кожуру. Однако существует большое различие (Р<0,05) между группами, содержащими аллель 88Па дикого типа, и группами, содержащими мутантный аллель 88Па. Генотипы, содержащие мутантный аллель 88Па, соответствуют повышенной доле цепей ΌΡ 6-8, которая превышает 10%, и повышенной доле цепей ΌΡ 9-14. Они также соответствуют повышенной доле цепей ΌΡ 15-24. Линии дикого типа содержат менее чем 5% цепей длиной ΌΡ 6-8. Мутанты ато1 характеризуются статистически значимым уменьшением количества
- 36 032207
ΌΡ 9-14 и уменьшением количества ΌΡ 15-24.
Распределение размеров гранул крахмала.
Чтобы исследовать влияние генотипа §ех6 и ато1 на размер гранул крахмала в эндосперме крахмала, распределение размеров гранул крахмала анализируют в четырех линиях, выбранных из каждой группы популяции ВС3Е6, полученной в результате обратного скрещивания. Результаты показывают, что содержание гранул крахмала В (определенных как имеющие диаметр<7 мкм) в линиях дикого типа, мутантах ато1, мутантах 88Па, двойных мутантах, не имеющих кожуру, и двойных мутантах, имеющих кожуру, составляет 20,2±6,4%, 30,7±3,6%, 17,5±1,8%, 19,7±3,6% и 18,3±7,2% по отношению к общему содержанию крахмала в каждой линии соответственно. Семена мутантов ато1 содержат гораздо больше гранул крахмала В, чем семена из других четырех групп.
Также определяют содержание гранул крахмала, средний размер которых, соответствующий пику профиля распределения, превышает 10 мкм в диаметре (гранулы крахмала А). Средний размер гранул крахмала А составляет 18,9±0,5 мкм в линиях дикого типа, 10,9±0,3 мкм в мутантах ато1, 16,4±2,6 мкм в мутантах 88Па, 18,7±0 мкм в двойных мутантах, не имеющих кожуру, и 17,5±0,6 мкм в двойных мутантах, имеющих кожуру. Статистический анализ показывает, что семена мутантов ато1 содержат гораздо меньше гранул крахмала А, чем семена других четырех групп ячменя (Р<0,05). Не существует статистически значимого различия (Р<0,05) значений содержания гранул А в семенах дикого типа, мутантах 88Па, двойных мутантах, не имеющих кожуру, и двойных мутантах, имеющих кожуру.
Морфология гранул крахмала.
Очищенный крахмал ячменя из линий, полученных из пяти групп, окрашивают иодом и анализируют с помощью обычного светового микроскопа. Благодаря содержанию амилозы гранулы крахмала из растений всех генотипов окрашиваются иодом в фиолетовый цвет. Результаты микроскопии в поляризованном свете показывают, что более 90% гранул крахмала из семян дикого типа и семян ато1 демонстрируют мальтийский крест, характерное двойное лучепреломление кристаллических гранул крахмала. Однако менее чем 10% гранул крахмала из семян мутанта 88Па или двойного мутанта имеют такое двойное лучепреломление.
Анализ с помощью 8ЕМ показывает, что зерно диких линий содержит нормальные сферические гранулы крахмала, а мутантный генотип ато1 приводит к образованию более мелких сферических гранул крахмала А, что совпадает с результатами описанного выше анализа. Крахмал из семян 88Па и двойных мутантов преимущественно содержит более мелкие деформированные гранулы крахмала. Из двух мутантов, дающих деформированные гранулы крахмала, мутантная линия 88Па продуцирует трубчатые удлиненные гранулы А (26x12 мкм), а семена двойного мутанта, не имеющего кожуру, содержат более выраженные трубчатые удлинения гранул А (28x21 мкм).
Расположение гранул крахмала в матриксе эндосперма исследуют на поперечных срезах семян ячменя. Линии дикого типа содержат несколько плоских сферических гранул крахмала А, окружающих несколько маленьких гранул крахмала В, а мутантная линия ато1 содержит несколько неплотно упакованных гранул крахмала, окружающих более мелкие гранулы крахмала В. На поперечных срезах мутантных семян 88Па гранулы крахмала невозможно четко идентифицировать. Линии двойного мутанта, не имеющего кожуру, содержат лентовидные гранулы крахмала А, плотно упакованные в клетках эндосперма.
Содержание β-глюкана.
Содержание β-глюкана, измеряемое во всех линиях популяции ВС3Е6, составляет 6,0±0,5% (диапазон от 5,3 до 7,0%) в линиях дикого типа, 8,2±0,5% (диапазон от 7,6 до 8,4%) в мутантных линиях ато1, 7,6±1,4% (диапазон от 5,9 до 11,3%) в мутантах 88Па, 7,1±0,4% в двойных мутантах, не имеющих кожуру, и 6,5±0,8% (диапазон от 5,5 до 7,7%) в двойных мутантах, имеющих кожуру. Статистический анализ показывает, что семена мутанта ато1, мутанта 88Па и двойного мутанта, не имеющего кожуру, содержат намного больше β-глюкана, чем семена линий дикого типа и линий двойных мутантов, имеющих кожуру (Р<0,05), однако отсутствуют статистически значимые различия в содержании β-глюкана среди мутантов ато1, мутантов 88Па и двойных мутантов, не имеющих кожуру, или среди семян дикого типа и двойных мутантов, имеющих кожуру соответственно.
Статистический анализ для указанных линий Г7, выбранных из пяти групп, выращенных в теплице или в полевых условиях, показывает, что во всех испытаниях семена мутантных линий ато1 содержат больше β-глюкана, чем семена линий двойных мутантов. Значимые различия в содержании β-глюкана среди семян мутантов 88Па и семян двойных мутантов отсутствуют.
Содержание пентозана.
Содержание пептозана измеряют в линиях, полученных из пяти групп. Содержание пентозана составляет 4,9±0,6% в линиях дикого типа, 4,9±1,1% в мутантных линиях ато1, 7,3± 1,4% в мутантах 88Па, 5,0±0,3% в двойных мутантах, не имеющих кожуру, и 6,5± 1,0% в двойных мутантах, имеющих кожуру. Статистический анализ показывает, что и мутантные линии 88Па, и двойные мутанты, имеющие кожуру, по существу, содержат больше пентозана, чем линии дикого типа, мутантные линии ато1 и линии двойных мутантов, не имеющих кожуру (Р<0,05), однако отсутствуют значимые различия в содержании пен
- 37 032207 тозана среди мутантных линий 88Па и двойных мутантов, имеющих кожуру, или среди линий дикого типа, мутантов ато1 и двойных мутантов, не имеющих кожуру соответственно.
Содержание золы.
Содержание золы измеряют в семенах пяти групп. Содержание золы составляет 2,5±0,1% в семенах дикого типа, 2,6±0,2% в семенах мутантов ато1, 3,1±0,3% в семенах мутантов 88Па, 2,1±0,1% в семенах двойных мутантов, не имеющих кожуру, и 2,7±0,1% в семенах двойных мутантов, имеющих кожуру. Семена мутантов 88Па содержат гораздо больше золы, а семена двойных мутантов, не имеющих кожуру, содержат значительно меньше золы, чем семена дикого типа, семена мутантов ато1 или семена двойных мутантов, имеющих кожуру, однако отсутствуют значимые различия в содержании золы среди линий дикого типа, мутантов ато1 и двойных мутантов, имеющих кожуру соответственно.
Водорастворимые углеводы.
Чтобы определить влияние мутаций по отдельности или в сочетании на содержание водорастворимых углеводов в семенах ячменя, анализируют четыре линии из каждой группы. В семенах дикого типа и семенах ато1 отсутствуют значительные различия в содержании общих ^8С, свободной глюкозы, сахарозы, или мальтозы, или фруктана. Однако семена мутантов 88Па и двойных мутантов содержат значительно более высокие количества каждого из указанных углеводов (Р<0,05). Семена одиночных мутантов 88Па содержат значительно более высокие уровни фруктозы, сахарозы и общих \ν8Ο
Содержание белка.
Содержание белка измеряют в семенах пяти групп. Содержание белка составляет 10,3±0,8% в семенах дикого типа, 10,4±1,1% в семенах мутантов ато1, 12,6±0,9% в семенах мутантов 88Па, 14,6±0,6% в семенах двойных мутантов, не имеющих кожуру, и 13,8±1,4% в семенах двойных мутантов, имеющих кожуру. Семена двойных мутантов, как не имеющих кожуру, так и имеющих кожуру, содержат значительно больше белка, чем семена мутантов 88Па, семена дикого типа или семена мутантов ато1, однако отсутствуют значимые различия в содержании белка среди семян двойных мутантов, не имеющих кожуру и имеющих кожуру, или среди семян мутантов ато1 и семян дикого типа.
Содержание липидов.
Содержание липидов измеряют в семенах пяти групп. Общее содержание липидов составляет 2,9±0,2% в семенах дикого типа, 3,5±0,3% в семенах мутантов ато1, 6,4±0,9% в семенах мутантов 88Па, 4,9±0,3% в семенах двойных мутантов, не имеющих кожуру, и 5,0±0,3% в семенах двойных мутантов, имеющих кожуру. Семена мутантов 88Па содержат гораздо больше липидов, чем семена двойных мутантов, не имеющих кожуру и имеющих кожуру, семена дикого типа и семена мутантов ато1, однако отсутствуют значимые различия среди семян двойных мутантов, не имеющих кожуру и имеющих кожуру, или среди семян мутантов ато1 и семян дикого типа.
Обсуждение.
Целью настоящего исследования является анализ взаимодействия рецессивных мутаций в локусах кех6 и ато1. Каждая из указанных мутаций приводит к развитию фенотипа с повышенным по сравнению с диким типом содержанием амилозы, причем содержание амилозы в крахмале обычно составляет 6070% в 88Па-мутантных семенах и 35-45% в семенах ато1-АС38. Определение 4 положительных генотипов в локусах кех6 (кех6-те! и кех6-292) и ато1 (ато1-\\1 и ато1-АС38) является важным аспектом данного исследования. Мутантные аллели и аллели дикого типа локуса 8ех6 можно однозначно различить с помощью маркера на основе казуальной мутации в гене синтазы крахмала Па. Точная природа мутации в локусе ато1 остается неизвестной, следовательно, тесно связанный с ней маркер (Втас0501, местоположение на консенсусной карте 58,0 сМ) используют для определения присутствия хромосомального участка, содержащего локус ато1.
Целью настоящего исследования является определение влияния сочетания указанных мутаций на содержание амилозы. Результаты показывают отсутствие статистически значимого различия в доле амилозы в линиях, содержащих сочетание мутанта 88Па и локуса ато1-АС38, и в линиях, несущих только мутантный локус 88Па. Однако сочетание мутаций 88Па и ато1-АС38 оказывает неожиданное влияние на синтез крахмала и массу зерна, приводя к увеличению содержания крахмала и массы семян по сравнению с одной мутацией 88Па.
Мутанты ячменя 88Па содержат крахмал с высокой долей амилозы. Результаты показывают, что 88Па-мутантное зерно в среднем содержит только 40% крахмала по отношению к содержанию крахмала в зерне дикого типа. Таким образом, высокоамилозный фенотип 88Па-мутантных семян обусловлен преимущественным уменьшением содержания амилопектина, которое снижается на 75%, тогда как содержание амилозы уменьшается только на 25%. В случае зерна двойного мутанта 88Па-ато1 также наблюдается уменьшение синтеза амилопектина по сравнению с диким типом (уменьшение на 31%), но увеличение содержания амилозы (увеличение на 37%) в семени. Полученные результаты вызывают интерес и позволяют предположить, что продукт гена ато1 не только участвует в синтезе амилопектина, но и подавляет синтез амилозы.
Предыдущие исследования роли гена синтазы крахмала III в транзиторном синтезе крахмала в АгаЫборкгк, описанные йНапд е! а!, Р1ап! РЬукю1. 138: 663-674, 2005, позволяют сделать вывод, что синтаза
- 38 032207 крахмала III является отрицательным регулятором синтеза крахмала в листьях. В рисе обнаружены два гена синтазы крахмала III, 88111а и 88111Ь. 88111а экспрессируется в эндосперме в процессе синтеза крахмала, тогда как 88ШЬ экспрессируется во время раннего развития эндосперма, но не в более поздний период высокоактивного синтеза крахмала во время налива зерна (Ойбаи е! а1., I Ехр Во 5б: 3229-3244, 2005). Мутации 88Ша в рисе не уменьшают содержание крахмала, но приводят к увеличению содержания амилозы примерно от 15 до 20%, позволяя предположить, что происходит уменьшение синтеза амилопектина и сопутствующее увеличение синтеза амилозы (Ецц!а е! а1., 2007 г. (выше)). Данное наблюдение согласуется с увеличением активности СВ88I и 88I (Ги)йа е! а1., 2007 г. (выше)). Ы е! а1., 2000 г.(выше) располагают ген 88Ш (обозначаемый сейчас 88Ша) на коротком плече хромосомы пшеницы 1, что не противоречит местоположению локуса ато1 в ячмене. Следовательно, ген 88Ша может являться геном-кандидатом на роль казуального гена, подлежащего разрушению в локусе ато1. Однако эксперименты демонстрируют, что белок 88Ша экспрессируется в мутантах ато1 и обладает активностью синтазы крахмала, и что существует рекомбинационное событие между генами 88Ша и ато1, указывая на то, что они являются разными генами.
Мутантный аллель ато1 оказывает едва заметное влияние на распределение длин цепей крахмала. По сравнению с диким типом присутствие мутантного аллеля ато1 вызывает небольшое уменьшение фракции коротких цепей (ИР 9-14) и увеличение фракции ИР 15-24. По сравнению с мутантом 88Па влияние мутантного локуса ато1 на распределение длин цепей является незначительным. И наоборот, мутантный аллель 88Па оказывает сильное влияние на структуру амилопектина и, следовательно, на распределение длин цепей, увеличивая долю коротких цепей (ИР б-8 и ИР 9-14) и уменьшая долю цепей с ПР 15-25.
Сочетание мутантных аллелей 88Па и ато1 дает неожиданный фенотип, который характеризуется частичным восстановлением содержания крахмала и массы семян по сравнению с линиями, содержащими только мутантный аллель 88Па.
Пример 3. Генетические маркеры, связанные с локусом ячменя ато1.
Местоположение локуса мутации ато1 определяют примерно как 5б,5 сМ на хромосоме ячменя 1Н (Ваг1еу-В1пМар 2005, база данных СгашСепе). Чтобы тестировать генетические маркеры, тесно связанные с локусом ато1, выбирают 11 маркеров 88К (81тр1е 8ес.|иепсе Кереа!) (Каткау е! а1., Сепейск. 15б(4): 1997-2005, 2000), расположенных между 5б,00 и б4,б0 сМ на хромосоме ячменя 1Н, и тестируют путем амплификации продуктов ПЦР из двух родительских линий, Ηί§1ι Ату1оке С1ааег (НАС) и Н1та1ауа292. Указанные 88К-маркеры включают в себя ЕВтас0405, Втад0105, Втас00б3, НУМ20Е, ЕВтас05б0а, ЕВтас0501, Втас0044, Втас0032, Втад0113, Втад0211 и Втад0350. Праймеры для указанных 88Кмаркеров синтезируют в соответствии с последовательностями, присутствующими в базе данных СгашСепек.
Для каждой реакции ПЦР (20 мкл) используют 50 нг геномной ДНК, 1,5 мМ МдС12, 0,125 мМ каждого бХГР, 10 пмоль праймеров, 0,5М глицинбетаин, 1 мкл ДМСО и 1,5 ед. Тад-полимеразы Но!к!аг (ОЕ АСЕН Аик!гайа). Для амплификации 88К-маркеров методом ПЦР используют следующие условия: 1 цикл, включающий в себя 95°С в течение 4 мин, 15 циклов, включающих в себя 94°С в течение 30 с, уменьшение от б5 до 50°С с шагом 1°С на каждый цикл в течение 30 с, и 12°С в течение 1 мин 20 с, 30 циклов, включающих в себя 94°С в течение 15 с, 50°С в течение 15 с и 12°С в течение 45 с, и 1 цикл, включающий в себя 25°С в течение 1 мин. Продукты ПЦР разделяют методом электрофореза на 2% агарозных гелях и визуализируют, используя прилагающиеся к гелю документы (ИУйес), после окрашивания Се1Кеб (Вюйит).
При тестировании 11 88К-маркеров 2 из них, а именно Втас0032, расположенный на б4,б сМ, и ЕВтас0501, расположенный на 58,0 сМ, дают продукты ПЦР разного размера для ДНК из родительских растений НАС и Н1та1ауа292. То есть указанные маркеры характеризуются полиморфизмом среди двух родительских сортов. Размер продуктов амплификации маркеров Втас0032 и ЕВтас0501 составляет соответственно 175 и 189 п.о. для НАС и 230 и 150 п.о. для Н1та1ауа292. Затем оба маркера 88К используют для генотипирования 70 линий ВС3Еб. Все линии, генотипированные с использованием маркера Втас0032, дают фрагменты такого же размера, как и НАС, свидетельствуя о том, что во всех линиях наблюдается рекомбинация между Втас0032 и локусом ато1, и что 88К-маркер Втас0032 не находится в тесной связи с локусом ато1. И наоборот, из 70 линий ВС3Еб, генотипированных с использованием маркера ЕВтас0501, 5б являются гомозиготными по одному или другому сочетанию фрагментов. Среди 5б гомозиготных линий 25 содержат маркер ЕВтас0501 из НАС, а 31 линия содержит маркер ЕВтас0501 из Н1та1ауа292. Полученные результаты демонстрируют отсутствие высокой встречаемости генетической рекомбинации маркера ЕВтас0501 с локусом ато1. Следовательно, 88К-маркер ЕВтас0501 представляет собой тесно связанный микросателлитный маркер локуса ато1-АС38.
Маркеры на основе гена ячменя 88Ша.
Полагают, что локус ато1 может находиться вблизи гена 88Ша ячменя. Чтобы подтвердить данное предположение и разработать ДНК-маркер на основе гена 88Ша ячменя, вначале из двух родительских сортов выделяют фрагменты гена 88Ша. ДНК из НАС и Н1та1ауа292 используют для амплификации
- 39 032207
ПЦР-фрагментов с использованием праймеров, полученных на основе последовательностей геномной ДНК 88Ша пшеницы (Ъ1 е! а1. , 2000 (выше)). Олигонуклеотидные праймеры 88ШаЕ (5'-ССАССТСТСССССАТСТ-3' (8ЕО ГО N0: 7)), расположенный в экзоне 7, и 88ШаК (5'-ССТССАССААСТАААСССТСАСС-3' (8Е0 ГО N0: 8)), расположенный в экзоне 8 гена 88Ша пшеницы, используют для ПЦРной ДНК, 1,5 мМ МдС12, 0,125 мМ каждого бNТР, 10 пмоль праймеров, 0,5М глицинбетаин, 1 мкл ДМСО и 1,5 ед. Тад-полимеразы Но!кГаг. Реакции ПЦР проводят в следующих условиях: 1 цикл, включающий в себя 95°С в течение 5 мин, 35 циклов, включающих в себя 94°С в течение 45 с, 58°С в течение 30 с и 12°С в течение 1 мин, 1 цикл, включающий в себя 72°С в течение 10 мин, и 1 цикл, включающий в себя 25°С в течение 1 мин. В каждой реакции амплификации получают фрагмент размером 464 п.о. ПЦРфрагменты обрабатывают, используя 0,5 ед. щелочной фосфатазы 8бптр (И8В Согрогабои, И8А), 2,5 ед. экзонуклеазы Ι и 1х буфер для ПЦР (ОМСЕН Аикбаба), в соответствии с инструкцией корпорации И8В и затем секвенируют, используя автоматизированную систему АΒI с окрашивающими терминаторами, как описано производителями.
Фрагменты размером 464 п. о. имеют различие в последовательностях, заключающееся в том, что один из них содержит участок рестрикции Ν1ηΙV, а другой - нет. Следовательно, обработка продуктов ПЦР указанным ферментом с последующим электрофорезом на 2% агарозных гелях является удобным способом различения генов 88Ша из двух родительских сортов. Получение одного фрагмента ДНК размером 464 п.о. указывает на присутствие гена 88Ша из Н1та1ауа292, а получение двух фрагментов ДНК размером 303 и 161 п.о. указывает на присутствие гена 88Ша из НАС.
Пример 4. Полевые испытания двойных мутантов 88Па-ашо1.
Чтобы определить показатели урожайности двойных мутантов 88Па-ато1 при выращивании на поле, 3 линии двойных мутантов, не имеющих кожуру, 2 линии двойных мутантов, имеющих кожуру, 4 линии мутантов 88Па, не имеющих кожуру, 1 линию мутантов 88Па, имеющих кожуру, 1 линию ячменя дикого типа, не имеющего кожуру (сорт Тоггепк), 2 линии ячменя дикого типа, имеющего кожуру (сорта ТапГапдага, 81оор), выращивают на Аигапбега и Могее, Ν8ν, Аик!габа, в 2008 г. Каждую из линий ячменя в обоих регионах выращивают в условиях орошения или его отсутствия (засушливый район). Каждую линию выращивают на двух делянках в каждом из условий в обоих регионах в рандомизированном порядке. Семена ячменя (120 г) высевают в каждую делянку (19 м2).
Измеряют массу зерна, полученного после сбора урожая с каждой делянки в декабре 2008 г. В №ггапбега в условиях орошения двойной мутант, мутант 88Па и линия дикого типа, не имеющая кожуру, продуцируют 2,23±0,16 кг, 1,1±0,57 кг и 1,6±0,79 кг зерна на делянку соответственно. В условиях засушливого района двойной мутант, мутант 88Па и линия дикого типа, не имеющая кожуру, продуцируют 0,55±0,34 кг, 0,11±0,12 кг и 0,41±0,16 кг зерна на делянку соответственно.
В Могее в присутствии орошения двойной мутант, мутант 88Па и линия дикого типа, не имеющая кожуру, продуцируют 1,62±0,72 кг, 0,54±0,40 кг и 2,11±0,08 кг зерна соответственно. В условиях засушливого района двойной мутант, мутант 88Па и линия дикого типа, не имеющая кожуру, продуцируют 0,88±0,33 кг, 0,38±0,27 кг и 1,14±0,34 кг зерна ячменя соответственно.
Следовательно, как в условиях орошения, так и в условиях его отсутствия в обоих регионах двойной мутант, не имеющий кожуру, и линии дикого типа, не имеющие кожуру, дают подобную урожайность зерна, которая значительно превышает урожайность мутантов 88Па, не имеющих кожуру.
Урожайность зерна линий ячменя, имеющих кожуру.
В Аигапбега в условиях орошения двойной мутант, мутант 88Па и линия дикого типа, имеющая кожуру, продуцируют 2,77±0,37 кг, 2,09±0,76 кг и 4,39±2,59 кг зерна на делянку соответственно. В условиях засушливого района двойной мутант, мутант 88Па и линия дикого типа, имеющая кожуру, продуцируют 0,60±0,06 кг, 0,35±0,14 кг и 0,59±0,46 кг зерна на делянку соответственно.
В Могее в присутствии орошения двойной мутант, мутант 88Па и линия дикого типа, не имеющая кожуру, продуцируют 2,15±0,81 кг, 1,24±0,12 кг и 2,73±0,96 кг зерна соответственно. В условиях засушливого района двойной мутант, мутант 88Па и линия дикого типа, имеющая кожуру, продуцируют 1,19±0,40 кг, 0,76±0,60 кг и 2,13±0,23 кг зерна на делянку соответственно.
Следовательно, как в условиях орошения, так и в условиях его отсутствия в обоих регионах линии дикого типа, имеющие кожуру, дают более высокую урожайность зерна, чем двойные мутанты, имеющие кожуру, и мутантные линии 88Па, имеющие кожуру, причем двойные мутанты, имеющие кожуру, продуцируют больше зерна, чем мутантные линии 88Па, имеющие кожуру.
Пример 5. Получение пищевых продуктов.
Зерно собирают из 11 линий ячменя, выращенных на поле в Уапсо, Ν8ν, Аик!габа, в 2008 г., и перемалывают с получением муки. Линии включают в себя 3 двойных мутанта, не имеющих кожуру, 2 двойных мутанта, имеющих кожуру, 3 мутанта 88Па, в том числе Н1та1ауа292, 2 линии дикого типа (сорта Тап!апдага и Н1та1ауа) и 1 мутант ато1 (НАС). Зерно, собранное из указанных линий, перемалывают с помощью мельницы Опабгита! ίπΓ. ш111 (ВгаЬепбег Оиабпппа! 1пг. М111, СугиПа'к ^бите^к, 8убпеу, Ν8ν Аик!габа), получая муку, которую затем просеивают с получением частиц диаметром 300 мкм.
- 40 032207
Перед перемалыванием с помощью Оиабгиша! режим выдержки не используют.
Для каждой из 11 линий ячменя проводят два типа выпекания мелкого (10 г) хлеба. Выпекание мелкого хлеба проводят в исследовательских целях, однако размер хлеба можно легко увеличить до промышленных размеров. Один тип хлеба получают с использованием 100% муки ячменя в качестве ингредиента, перемолотой, как описано выше, тогда как другой тип хлеба получают с использованием муки, содержащей в качестве ингредиентов 30% указанной муки и 70% коммерческой пшеничной муки. Муку (13,02 г) и другие ингредиенты смешивают, получая тесто, которое созревает в миксографе емкостью 35 г. Используют рецепт, в котором на 13,02 г муки в каждом случае добавляют следующие ингредиенты: мука 100%, соль 2%, сухие дрожжи 1,5%, растительное масло 2% и улучшитель 1,5%. Уровень добавления воды, которую доводят для полного объема, зависит от значений абсорбции воды в миксере тюго Ζагт. Формование и укладку теста в форму проводят с двумя стадиями расстойки при 40°С и 85% влажности в помещении. Выпекание проводят в печи Ко1е1 в течение 14 мин при 190°С.
После выпекания хлеба массой 10 г хранят при -80°С в течение трех недель в случае партии 100% ячменных хлебов или в течение 1 недели в случае партии 30% ячменных хлебов, после чего анализируют содержание К8, как описано в примере 1, и уровни С1. Содержание резистентного крахмала определяют с помощью процедуры ш νίΙΐΌ. Образцы хлеба массой 10 г с двойными повторами параллельно с подходящими стандартами смешивают с искусственной слюной, полученные комки инкубируют с ферментами поджелудочной железы и желудочного сока при физиологических значениях рН и температуры. Количество крахмала, оставшегося в переваренной массе, определяют с помощью традиционных ферментных и спектрофотометрических методов, содержание резистентного крахмала в образце выражают в виде процента от массы образца.
Для определения уровней С1 используют анализ ш νίΙΐΌ.
Содержание К8 в непросеянной муке ячменя.
Содержание К8 и уровни С1 вначале определяют в непросеянной муке, полученной из каждой группы генотипов ячменя. Содержание К8 в непросеянной муке мутантов ато1, двойных мутантов, не имеющих кожуру, двойных мутантов, имеющих кожуру, мутантов 8811а и дикого типа составляет 0,9%, 3,5±0,3%, 3,4±0,1%, 1,9% и 0,5±0,1% соответственно (табл. 1). Неожиданно было обнаружено, что в непросеянной муке как не имеющих кожуру, так и имеющих кожуру двойных мутантов содержание К8 примерно в 3,5, 2,3 и 10 раз выше, чем в непросеянной муке мутанта ато1, мутанта 8811а и дикого типа соответственно. Важно, что непросеянная мука из не имеющих кожуру и имеющих кожуру двойных мутантов содержит гораздо больше К8, чем непросеянная мука мутанта 8811а. Отсутствуют статистически значимые различия в содержании К8 в непросеянной муке не имеющих кожуру двойных мутантов и имеющих кожуру двойных мутантов или в непросеянной муке мутанта ато1 и дикого типа. Хотя уровни С1 различаются среди непросеянной муки из 5 групп ячменя, статистически значимые различия отсутствуют.
Содержание К8 в хлебе, полученном с использованием 100% ячменной муки.
Определяют содержание К8 в хлебе, который содержит 100% муку ячменя. Результаты представлены в табл. 2. Анализ показывает, что содержание К8 в хлебе, полученном с использованием в качестве мучного ингредиента 100% ячменной непросеянной муки, составляет 2,2±0,3%, 5,5±0,1%, 5,6±0,3%, 2,1±0,4% и 0,8±0,3% для мутантов ато1, двойных мутантов, не имеющих кожуру, двойных мутантов, имеющих кожуру, мутантов 8811а и дикого типа (табл. 3). Статистический анализ показывает, что содержание К8 в хлебе, полученном из непросеянной муки как не имеющих кожуру, так и имеющих кожуру двойных мутантов ячменя, значительно превышает содержание К8 в хлебе, полученном из мутантов 88Ι1а, мутантов ато1 и нормальных линий ячменя (табл. 3). Не существует значительных различий в содержании К8 в хлебе, полученном с использованием 100%-ной муки не имеющих кожуру и имеющих кожуру двойных мутантов. Содержание К8 в хлебе, полученном из муки не имеющих кожуру и имеющих кожуру двойных мутантов, в 2,5, 2,5 и 6,7 раз выше, чем в хлебе, полученном из муки 8811а-мутантного, ато1-мутантного и нормального ячменя соответственно (табл. 3).
Содержание К8 в хлебе, полученном с использованием 30% ячменной муки
Определяют содержание К8 в хлебе, который содержит 30% муку ячменя. Результаты представлены в табл. 4. Содержание К8 в хлебе, полученном из непросеянной муки мутантов ато1, двойных мутантов, не имеющих кожуру, двойных мутантов, имеющих кожуру, мутантов 8811а и дикого типа, составляет 1,9±0,3%, 3,1±0,2%, 3,0±0,1%, 2,0±0,3% и 0,9±0,1% соответственно (табл. 3). Содержание К8 в хлебе, полученном из как не имеющих кожуру, так и имеющих кожуру двойных мутантов ячменя, значительно превышает содержание К8 в хлебе, полученном из мутантов 8811а, мутантов ато1 и нормальных линий ячменя (табл. 3). Не существует значительных различий в содержании К8 в хлебе, полученном с использованием 30% муки не имеющих кожуру и имеющих кожуру двойных мутантов. Содержание К8 в хлебе, полученном из муки не имеющих кожуру и имеющих кожуру двойных мутантов, в 1,6, 1,6 и 3,3 раза выше, чем в хлебе, полученном из муки 8811а-мутантного, ато1-мутантного и нормального ячменя соответственно (табл. 3).
Вычисляют содержание К8, которое выражают в виде мг К8 на грамм крахмала, и анализируют
- 41 032207 природу повышения уровня К8 в хлебе, полученном из двойных мутантов. Полученные результаты анализируют, чтобы определить, связано ли повышение содержания К8 с увеличением общего содержания крахмала или с изменением структуры крахмала. Результаты показывают, что хлеб, полученный с использованием 100%-ной ячменной муки мутантов ато1, двойных мутантов, не имеющих кожуру, двойных мутантов, имеющих кожуру, мутантов 8811а и дикого типа, содержит 41,7, 105,1±2,8, 106,9±3,3, 75,0±8,1 и 16,3±4,5 мг К8 на г крахмала (фиг. 4.6). Содержание К.8 в хлебе, полученном из муки не имеющих кожуру и имеющих кожуру двойных мутантов, примерно в 2,5, 1,4 и 6,5 раз выше, чем в хлебе, полученном из ато1-мутантного зерна, 8811а-мутантного зерна и зерна дикого типа. Статистический анализ показывает, что хотя хлеб, полученный из всех 4 групп ячменя, содержит больше К8, чем хлеб, полученный из линий дикого типа, содержание К8 (мг К8 на г крахмала) в хлебе, полученном из обоих двойных мутантов, статистически является гораздо более высоким, чем в хлебе, полученном из мутантов ато1 и мутантов 8811а (Р<0,05). Увеличение содержания К8 в хлебе, полученном из зерна мутанта 8811а, по сравнению с хлебом, полученным из мутантов ато1, является статистически значимым.
Уровень С1 в хлебе, полученном с использованием 100% ячменной муки.
Определяют уровень С1 в хлебе, который содержит 100%-ную муку ячменя, для всех линий ячменя. Результаты представлены в табл. 2. Уровень С1 в хлебе, полученном из зерна мутантов ато1, двойных мутантов, не имеющих кожуру, двойных мутантов, имеющих кожуру, мутантов 8811а и зерна дикого типа, составляет 68,5±2,1, 63,5±4,5, 60,8±4,1, 63,9±10,3, 80,3±2,9 соответственно (табл. 7). Статистический анализ показывает, что хлеб, полученный из зерна не имеющих кожуру и имеющих кожуру двойных мутантов и мутантов 8811а, содержит С1 на гораздо более низком уровне, чем хлеб, полученный из зерна мутантов ато1 и нормальных линий ячменя (табл. 7). Не существует значительных различий в уровне С1 в хлебе, полученном с использованием 100%-ной муки не имеющих кожуру и имеющих кожуру двойных мутантов, и в хлебе, полученном с использованием 8811а-мутантного зерна. Уровень С1 в хлебе, полученном из зерна не имеющих кожуру и имеющих кожуру двойных мутантов и 8811а-мутантного зерна, составляет примерно 80% от уровня С1 в хлебе, полученном из ато1-мутантных и нормальных линий ячменя соответственно (табл. 7).
Уровень С1 в хлебе, полученном с использованием 30%-ной ячменной муки.
Определяют уровень С1 в хлебе, который содержит 30%-ную муку ячменя, для всех линий ячменя. Результаты представлены в табл. 4. Уровень С1 в хлебе, полученном из зерна мутантов ато1, двойных мутантов, не имеющих кожуру, двойных мутантов, имеющих кожуру, мутантов 8811а и зерна дикого типа, составляет 84,5±3,5, 83,2±2,1, 83,5±0,8, 82,3±3,9, 87,8±4,5 соответственно (табл. 7). Статистически значимые различия в значениях уровня С1 в хлебе, полученном из ячменя 5 групп, отсутствуют.
Выводы.
Непросеянная мука из зерна не имеющих кожуру и имеющих кожуру двойных мутантов ячменя имеет гораздо более высокое содержание К8, чем непросеянная мука из зерна мутантов ато1, мутантов 8811а и дикого типа. Содержание К8 в непросеянной муке из обоих двойных мутантов примерно в 3,5, 1,8 и 7,0 раз выше, чем в непросеянной муке ато1-мутантных линий, 8811а-мутантных линий и линий дикого типа. Подобным образом, хлеб, полученный из зерна двойного мутанта ячменя, имеет гораздо более высокое содержание К8, чем хлеб, полученный из зерна мутантов 8811а, мутантов ато1 и ячменя дикого типа. Содержание К8 увеличивается не только вследствие повышения количества крахмала с высоким содержанием амилозы, но и вследствие изменения структуры крахмала, где содержание К8 приводят на г крахмала.
Значения уровня С1 в хлебе, полученном из зерна двойного мутанта и 8811а-мутантного зерна значительно ниже, чем в хлебе, полученном из зерна мутанта ато1 и зерна дикого типа. Значения уровня С1 в хлебе, полученном из зерна двойного мутанта 8811а-ато1 и 8811а-мутантного зерна, примерно на 7% и 20% ниже, чем в хлебе, полученном из зерна мутанта ато1 и зерна дикого типа, если хлеб содержит 100%-ную ячменную муку.
Пример 6. Широкомасштабное производство фруктана.
Зерно ячменя, мутантное по 8811а и ато1, содержащее примерно 10% фруктана, можно использовать для выделения и очистки фруктана, а также других продуктов, таких как крахмал с высоким содержанием амилозы и β-глюкан. Такое производство с использованием в качестве исходного вещества зерна, которое можно легко получить путем выращивания на обширных площадях, является экономически эффективным по сравнению с существующими способами продукции фруктана, например, включающими в себя экстракцию инулинов из цикория.
Широкомасштабную экстракцию фруктана можно осуществить путем перемалывания зерна с получением непросеянной муки и затем экстрагирования общих сахаров, содержащих фруктаны, из муки в воду. Указанные процессы проводят при температуре окружающей среды, после чего смесь центрифугируют или фильтруют. Затем супернатант нагревают примерно до 80°С, центрифугируют, чтобы удалить белки, и сушат. Альтернативно муку экстрагируют 80%-ным этанолом, фазы разделяют с использованием смесей вода/хлороформ, и водную фазу, содержащую сахара и фруктан, сушат и перерастворяют в воде. Из экстракта, полученного любым способом, удаляют сахарозу ферментативным методом путем
- 42 032207 добавления α-глюкозидазы, затем удаляют гексозы (моносахариды) путем гель-фильтрации с получением фракций фруктана разного размера. В результате можно получить обогащенную фруктаном фракцию, содержащую по меньшей мере 80% фруктана.
Таблица 1 Содержание В8 и уровень С1 в непросеянной муке ячменя
Генотип Название линии 01 Средний уровень ‘ ΟΙ 8И Содержание Β.8 в непросеянной муке (г-100 г) Среднее содержание К8 8Ω
Мутант ашо1 НАС 64.6 64.6’ 0.9 0.9 е
Двойной мутант, имеющий кожуру ННР7-88 81.0 79.0’ 2.8 3.5 3.4’ 0.1
Двойной мутант, имеющий кожуру ННР7-122 77.0 3.3
Двойной мутант, не имеющий кожуру ННР7-4 77.3 78.0 0.9 3.3 3.5’ 0.3
Двойной мутант, не имеющий кожуру ' ННР7-7 79.1 3.4
Двойной мутант, не имеющий кожуру ННР7-29 77.8 3.8
Мутант 8811а 292.0 68.2 68.2’ 1.9 1.9Ь
Ячмень дикого типа Н1тпа1ауа 76.6 70.8’ 9.6 0.6 0.5 е 0.1
Ячмень дикого типа О1аС1ег 76.0 0.4
Ячмень дикого типа Тап1а£щага 59.7 0.4
Ь8О (5%) 22.6 0.7
Ь8Э - наименьшее значимое различие, различия, превышающие это значение, являются значимыми (Р<0,05);
а, Ь и с - по отношению к Ь8Э средние значения с одинаковыми буквами не обладают значимыми различиями, а средние значения с разными буквами обладают значимыми различиями (Р<0,05).
Таблица 2
Содержание В8 и уровень С1 в хлебе, полученном из 100%-ной непросеянной муки ячменя
Юобразца Генотип Название линии Содержание П.8 (г/100 г) Уровень ΟΙ
ΖΕ2.9.1 Мутант ато1 НАС 2.39 70
ΖΕ2.9.1 Мутант ато1 НАС 2.01 67
10.1 Двойной мутант, не имеющий кожуру ННР7_29 5.46 57
10.1 Двойной мутант, не имеющий кожуру ННР7Ц9 5.6 62
6.1 Двойной мутант, не имеющий кожуру ННР7_4 5.53 66
6.1 Двойной мутант, не имеющий кожуру ННГ7_4 5.32 61
2.1 Двойной мутант, не имеющий кожуру ННР7_7 5.61 70
2.1 Двойной мутант, не имеющий кожуру ННР7.7 5.65 65
11.1 Двойной мутант, имеющий кожуру ННР7_88 5.76 66
11.1 Двойной мутант, имеющий кожуру ННР7_88 5.96 62
1.1 Двойной мутант, имеющий кожуру ННР7_122 5.29 57
1.1 Двойной мутант, имеющий кожуру ННР7Д22 5.2 58
ΖΕ1.8.1 Мутант 8811а 871 1.96 49
гы.8.1 Мутант 8811а 871 2.08 53
гы.1.1 Мутант 8811а Нппа1ауа292 1.49 57
гы.ы Мутант 8811а Нйпа1ауа292 1.58 60
4.1 Мутант 8811а ННР7_50 2.22 74
4.1 Мутант 8811а 11111'7,50 2.26 74
3.1 Линия дикого типа Нппа1ауа 0.65 82
3.1 Линия дикого типа Нппа1ауа 0.52 82
9.1 Линия дикого типа Тап1ап§ага 1.04 76
9.1 Линия дикого типа ТаЫапёата 1.05 81
- 43 032207
Таблица 3 Статистический анализ влияния генотипа на содержание К8 в хлебе, полученном с использованием 30- или 100%-ной муки ячменя
Генотип № образца Содержание 100% (г/100 г) 5Ό Содержание К.5 30% (г/100 г) 50
Мутант ато1 2 2.2° 0.3 ТЕ 0.3
Двойной мутант, не имеющий кожуру 6 5.5а 0.1 3.1 8 0.2
Двойной мутант, имеющий кожуру 4 5.4’ 0.4 3.0а 0.1
Мутант 88Па 6 ТЕ6 0.4 Γδ* 0.3
Дикого типа 4 0.7 е 0.3 1.0е 0.1
ϋ.δ.ϋ. (р<о.О5) 0.5 0.3
Примечание.
Содержание К8 30% - содержание К8 в хлебе, полученном с использованием 30%-ной муки ячменя;
содержание К8 100% - содержание К8 в хлебе, полученном с использованием 100%-ной муки ячменя;
Ь8Э - наименьшее значимое различие, различия, превышающие это значение, являются значимыми (Р<0,05);
а, Ь и с - по отношению к Ь8Э средние значения с одинаковыми буквами не обладают значимыми различиями, а средние значения с разными буквами обладают значимыми различиями (Р<0,05).
Таблица 4
Содержание К8 и уровень С! в хлебе, полученном из 30%-ной муки ячменя
Ю образца Генотип -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------1 Название линии --, Содержание К8 (г/100 г) Уровень 61
ΖΕ1.4.1 Мутант ато1 НАС 2.15 82
2Ы.4.1 Мутант ато1 НАО 1.72 87
ΖΕ1.5.3 Двойной мутант, не имеющий кожуру ННГ7_29 3.01 83
Ζί 1,5.1 Двойной мутант, не имеющий κοκνρν НПР7_М 3.07 82
ΖΕ2.7.1 Двойной мутант. не имеющий кожуру ННЕ7% 3.03 83
ζυ.7.ι Двойной мутант, не имеющий кожуру 1ΙΙ1Ε74 3.27 83
ΖΕ2.6.1 Двойной мутант, не имеющий кожуру ННЕ7_7 3.15 84
ΖΙ.2.6.1 Двойной мутант, не имеющий кожуру ННГ7_7 3.03 84
ΖΕ1.3.1 Двойной мутант, имеющий кожуру ННР7_88 3.04 83
гы.з.1 Двойной мутант, имеющий кожуру ННР7_88 3.09 86
ΖΕ1.10.1 Двойной мутант, имеющий кожуру ННЕ7Ц22 3.01 81
ΖΓΠ.ΙΟ.Ι Двойной мутант, имеющий кожуру ННР7Ц22 2.71 84
ΖΕ2.1.1 Мутант 8811а 871 1,87 77
2Ь2,1.1 Мутант 8811а 871 1.82 81
ΖΕ2.3.1 Мутант 8811а Нйпа1ауа292 1.7 80
ΖΙ.2.3.1 Мутант 8811а Н1та1ауа292 1.87 82
ΖΓ,2.2.1 Мутант 8811а ННР750 2.15 86
ΖΕ2.2.1 Мутант 8811а ННР7_50 1.69 84
гы .2.1 Линия дикого типа Ннпа1ауа 0.96 93
ΖΕ1.2.1 Линия дикого типа Н1та1ауа 1.02 94
ΖΕ2.8.1 Линия дикого типа ТапСэпдага 0.84 83
21.2.8.1 Линия дикого типа Ташап^ага 0.89 85
Таблица 5
Статистический анализ влияния генотипа на содержание К8 (мг К8 на г крахмала) в хлебе, полученном с использованием 100%-ной муки ячменя
Г енотип № образца Содержание Β5 100% (г/100 г) 50 Общее содержание крахмала в хлебе 80 мг Р5 на г крахмала 80
Мутант ато1 1 2.2’ 0.3 57.4’ - 41.7е
Двойной мутант, не имеющий кожуру 3 5.5’ 0.1 52.7’ 1.8 105.1’ 2.8
Двойной мутант, имеющий кожуру 2 5.4“ 0.4 51.8а 4.7 106.9’ 3.3
Мутант 8811а 3 1.9“ 0.4 25.1° 3.0 75.0’ 8.1
Дикого типа 2 0.7“ 0.3 51.6’ 2.6 16.3’ 4.5
Ь.8.О. (Р<0.05) 0.5 8.9 16.3
- 44 032207
Таблица 6
Статистический анализ влияния генотипа на содержание В8 (мг В8 на г крахмала) в хлебе, полученном с использованием 30%-ной муки ячменя
Генотип № образца Содержание К.5 30% (г/100 г) 8Ω Общее содержание крахмала в хлебе 5ϋ мг Κ8 на г крахмала 50
Мутант апю1 1 1.9 й 0.3 61.9Э - 30.7 й '
Двойной мутант, не имеющий кожуру 3 3.1а 0.2 65.3 а 2,2 47.5а 0.8
Двойной мутант, имеющий кожуру 2 3.0а 0.1 63.73 1.1 47.1 а 3.0
Мутант 8811а 3 1,8 й 0.3 ίΤο1’ 2.3 31.6й 0.3
Дикого типа 2 1.0е ол 65.1а 0.1 14.6 е 1.1
Ь.8,0. (Р<0.05) 0.3 5.6 4.2
Таблица 7 Статистический анализ влияния генотипа на уровень 0Ί в хлебе массой 10 г, полученном с использованием 30- или 100%-ной муки ячменя
Генотип № образца Уровень ΟΙ 100% Ж Уровень ΟΙ 30% 80
Мутант ато1 2 68.5а 2.1 84.5 * 3,5
Двойной мутант, не имеющий кожуру 6 63.5 1: 4.5 83.2 а 2.1
Двойной мутант, имеющий кожуру 4 60.8” 4.1 83.5 й 0.8
Мутант 88Па 6 63.9 ” 10.3 823 3 3.9
Дикого типа 4 80,3а 2.9 87.8 а 4.5
Т.8.0. (Р<0.05) 12,1 5,8
Уровень 0Ί 30% - уровень 0Ί в хлебе, полученном с использованием 30%-ной муки ячменя;
уровень ΟI 100% - уровень ΟI в хлебе, полученном с использованием 100%-ной муки ячменя;
Γ8Ό - наименьшее значимое различие, различия, превышающие это значение, являются значимыми (Р<0,05);
а, Ь и с - по отношению к Γ8Ό средние значения с одинаковыми буквами не обладают значимыми различиями, а средние значения с разными буквами обладают значимыми различиями (Р<0,05).
Таблица 8
Условное обозначение последовательностей
Идентификационный номер последовательности Описание
1 Полноразмерная последовательность кДНК, мРНК синтазы крахмала II Ногаеит уцЗдаге зиЬзр. Уи1даге. № доступа ΑΥ133249, 2972 нуклеотида, участок, кодирующий белок: нуклеотиды 114-2522, расположен на хромосоме 7 ячменя
2 Аминокислотная последовательность синтазы крахмала II, кодируемая ЗЕО Ю N0: 1, 802 аминокислоты
3 Олигонуклеотидный праймер, соответствующий последовательности кДНК 3311а, СепВапк №
- 45 032207
ΑΥ133249, начиная с нуклеотида 1616 (55ЫаЕ)
4 Олигонуклеотидный праймер, соответствующий последовательности кДНК 2311а, СепВапк № ΑΥ133249, начиная с нуклеотида 2044 (ЗЗИаК)
5 Олигонуклеотидный праймер, соответствующий локусу ато1 ННас0501Е
б Олигонуклеотидный праймер, соответствующий локусу ато1 ННас0501К
7 Олигонуклеотидный праймер ЗЗШаГ
8 Олигонуклеотидный праймер ЗЗШаК
9 Нуклеотидная последовательность 3311а М292 (кДНК)
10 Аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидами 1-1852 5Е<2 Ιϋ N0: 9
11 Аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидами 1856-2946 3Εζ) Ю N0: 9
Таблица 9
Разделение аминокислот на подклассы
Подклассы Аминокислоты
Кислые Аспарагиновая кислота, Глутаминовая кислота
Основные нециклические: Аргинин, Лизин; циклические: Гистидин
Заряженные Аспарагиновая кислота, Глутаминовая кислота, Аргинин, Лизин, Гистидин
Маленькие полярные/нейтральные Глицин, Серин, Аланин, Треонин, Пролин, Аспарагин, Гистидин, Глутамин, Цистеин, Серин, Треонин
Полярные/большие гидрофобные Аспарагин, Глутамин, Тирозин, Валин, Изолейцин, Лейцин, Метионин, Фенилаланин, Триптофан
Ароматические остатки, Триптофан, Тирозин,
влияющие на ориентацию цепи Фенилаланин, Глицин и Пролин
Таблица 10
Типичные и предпочтительные замены аминокислот
Исходный остаток Типичные замены Предпочтительные
А1а Уа1, Ьеи, Не замены Уа1
Аге Ьуз, 01η, Αδη Ьуз
Αδη С1п, Ηίδ, Ьуз, Аг£ О1п
Азр О1и С1и
Суз Зег Зег
С1п Азп, Нй, Ьуз, Азп
С1и Азр, Ьуз Азр
О1у Рго Рго
Н15 Азп, С1п, Ьуз, Аг§ Агв
Не Ьеи, Уа1, Ме(, А1а, РЬе, Νοτίβυ Ьеи
Ьеи ΝοΓίβυ, Не, Уа1, Мег, А1а, РЬе Не
Ьуз Аг£, О1п, Азп Аг®
Мс! Ьеи, Не, РЬе Ьеи
РЬе Ьеи, Не, А1а Ьеи
Рго О1у О1у
Зег ТЬг ТЬг
ТЬг 8ег Зег
Тгр Туг Туг
Туг Тгр, РЬе, ТЬг, 8ег РЬе
Уа1 Ле, Ьеи, Ме1, РЬе, А1а, Ь!ог1еи Ьеи
- 46 032207
Список литературы
Абатз βί а!, Апа1. Вюскет., 266: 77-84,1999
АЬпегбаапб АИаЫге, Тгепск Се11 ΒΐοΙ. 15: 251-258, 2005
АИзсКи! βία!, ΝικΑβία Асгск Кез. 25: 3389, 1997
Ап, МеСкоск ίη Енсуто'ю^у, 153: 292, 1987
Апбегззоп е1 а!, 7 Сегеа1 Ас! 30: 183-191, 1999
АидиЬе! е1 а!, СиггепС РгоСосо1з ίη Мо1еси1аг ΒϊοΙοξγ, ФоЬп ΨίΙεγ & 8опз 1пс, ϋηίΐ
19.3 апс! СЬар1ег 15, 1994-1998
АизиЬе1 ζί а!·, (е<1з.), Сиггеп( РгогосоЬ ΐη Мо1еси1аг Βίαίο§ν, 1оЬп 7/11еу & Зопз, ΝΥ,
б.3.1-6.3.6,, 1989
Ва11 апб МогеП, Аппи Ιϊβυ ΡΙαηί ΒΐοΙ, 54: 207-233, 2003
ВаП а!г СеИ 86(3}: 349-52, 1996
Вагкег е1 αί, ΡΙαηί МЫ. Βίοι., 2: 235-350, 1983
Ваку ега!, Яагск 48: 338-344,1997
ΒεοΚίοΙά е/ а!, С.К. АсаА. 8с! Раш, 316: 1194, 1993
ВегпкИ, Ату1азез ар1рка апб Ье1а. 1п: Сокглчск апб Кар1ап (ебз), МехЬобз ίη епгуто1оёу, Асабетк, ΝΥ, р, 149, 1955
Веуап βίαΙ.,ΝιιαΙ. Аси! Кез., 11: 369, 1983
ВксЬ, Αηη Κβν ΡΙαηί Ркуз1о1 Ρίαηΐ ΜοΙ Βίο! 48: 297-326, 1997
Вкб е/ а! Вг. Α. ΝαΡ. 92: 607-615, 20046
ΒίΜε/α/., ΑΝκΙγ, 134: 831-835, 2004а
Βύιηςυε, ΡΙαηί 8с1 105: 125-149, 1995
Воуег апб Рге158, СагЬопуАга/е Кезеагск, 61: 321-334, 1978
Викоп βί а!., 1п1егпаИона1 Аоита1 о/ΒΙοΙοξκαΙ Масгото1еси1ез, 23: 85-112, 1998
СатрЬеП ег αί, Α 8αΐ РооАА§пс 79: 232-236, 1999
Сао ег а!, Агскмез о/ВгоскетгзИу αηά Шорку&ау 373: 135-146,2000
Сао βί αί, ΡΙαηί РкуМ /20(1); 205-16, 1999
Сотш ег αί, ΡΙαηί А. 37: 7П-736, 2004
Сга1£ е1 а!.. ΡΙαηί Се11, 10: 413—126, 1998 ϋβ Ргатопб, Вк>1ескпо1о%у, 1: 262,1983
ОеИстап е/ а!, ЕМВО1, 2: 3315-3320, 1998
ОеПаРеппа е! а!, ΡΙαηί СеИ, 1: 53-63, 1989
Ое1уа11е е1 а!, ΡΙαηίА 45(3): 398-412,2005
Пепуегега/., ΡΙαηί Ркумо! П 2(2):779-85,1996
Бига1 ег а!, Р’исХс Асй1$ Ке$еагск 55(18); 5978-5990,2005
Рготт ег ей., Ргос. ΝαίΙ. Асас1 8с1 ίΙ.Ε.Α. 82: 5824,1985
Еирга βία!, ΡΙαηί Рку&о! 144: 2009-2023, 2007
ГирТа е! αί, ΡΙαηί Ркумо! 140: 1070-1084, 2006
Сао ег αί., ΡΙαηί СеИ, 10: 399-412, 1998
Сагйпке! βία!, СеИ, 27: 143-153, 1983
Сгеуе, А. Мо! Арр! Оепег., 1: 499-511, 1983
Нагауата, ТгепЖ ВкЯескпо! 16: 76-82,1998
Нантапп апб Епбгез, Мапиа! о/АпОзепзе Мегкойо1о§у> Юии’ег, 1999
НазеЬй1 апб СегксЬ, Ыагиге 334: 585-591,1988
НауазЫ ег а!, Е$еск о/ΐοη Ьеат г'ггшИаНоп оп тигаНоп гпИисНоп ίη псе. Сус1оггоп$ αηά ТИегг АррИсаНопл 2007, Е1§Ь1ееп(Ь 1п1егпабопа1 СопГегепсе 237-239,2007
Небтап апб Воуег, Вюскетгса! ОепеНсз. 20: 483-492, 1982
Непбпх ег а!, А. 1пзес1 Ркумо!, 47: 423-432,2001
НешкоОГегц/., ΡΙαηί РкуЫо! 135: 630-636, 2004
Нтскее βί а!, Вю1еск. 6: 915, 1988
Н1гозе апб Тегао, ΡΙαηία, 220: 9—16,2004
Ноекета ег а1., МаГиге, 303: 179, 1983
1ате2 ег а!, Сигг Орт ΡΙαηί Βίο! 6: 215-222, 2003
1ате&егαί, ΡΙαηί СеИ, 7:417-429, 1995 .1апе е1а4, Сегеа1 СЪепт. 76: 629-637,1999 кзЫ, №ис! АсШКех. 15: 6643, 1987
Кагата е(а1.г ΡΙαηίВй4ескпо1о§у 25: 113-117,2008
Кате/а/., АСегеа18с1, 37: 195-204,2003
К1етеГй7., Ыагиге, 327: 70,1987
Котк-Козе ег а!, 8гагск-5!агке, 53: 14-20, 2001
Когик-ВозееГй/., ТАеог Арр! Сепе1, 115: 1053-1065,2007
- 47 032207
Коззшапл апс! ЫоуП, СпГ Ι&ν ΡΙαηί 8αΐ, 19: 171-226, 2000
КиЬоега/., ΡΙαηί Ркуяо1о£у, 121: 399-409. 1999
Ьап§пс1§е5Г а!, АиМ X Αχήΰ Кез 52: 1043-1077» 2001
Ье Ргоуоз! е(а!., ТгепХз ΐη В1о1ескпо!о§у 25(3): 134-141,2009
Ьепмеих, Сиггеп! Сепописз, 1: 301-311,2000
1л е( а!., Рипс1 Ιηίβ^κ (Эепопйсз, 3: 76-85, 2003
1л е/ а!.. ΡΙαηί Ркуыо!, 120: 1147-1156,1999а
1л е/ αΐ., ΡΙαηί Ркуя1о1о^у. 123: 613-624, 2000
1ле1а1., Ткеогекса! αηά АррИес! Оепексз, 98: 1208-1216, 1999Ь
ГлЬеззаг! е/ αΐ. ΡΙαηί Се!!. 7(8): 1117-1127, 1995
Ыиега/., В!о1ес!то!о§у αηά Вюеп%1пеегт& 106: 97-105,2010
1л1ппап<1 На1сЬ, Ρΐαηία 197: 385-391, 1995
МасШеш е! а!., ΧΒΐοΙ Скет. 259(40): 25150-7, 1994
МсРЬегзоп апб Мо11ег (Εά), ΒΙΟ8 δΰίβηΐίΓιο РиЪНзЪегз Ш, ОхГога. 2000
МеЛЬеггу е( αΐ.. ΡΙαηί Се11, 4: 185-192, 1992
МебЬеггу ёГа!.. ΡΙαηίΧ. 3: 619-626,1993
М111аг ап<1 Ша1егЬоизе, Рипе/ 1п1е^г (Зепописз, 5: 129-135,2005
М1игаеСа/., ЕиркуНса, 108: 91-95, 1999
ΜιατΛβΐ а!.,ЕиркуНса, 123: 353-359,2002
Μίζιιηο е! а!, Хойта! о/Вгоскет^гу, 112: 643-651, 1992
Моге11 ее а!., СопГго! о/з1агск Ыозуткезгз ίη уазси!аг ρΐαηίχ αηά а!§ае. Ιη: ΡΙαχίοη №С, МсМапиз МТ (еХз) СогИго! о/ргапагу те!аЬокзт ΐη ρΐαηυ. Аппиа!ρΐαηί νο! 22,
В1аск\уе11, Οχίοπΐ, рр 258-289,2006
МогеП ег а!., ЕиркуИса, 119: 55-58, 2001
МогеП е( а!., ХАрр! Оусозск 50: 217-224, 2003а
МогеП е1а!„ ΡΙαηΐ, X 34: 173-185, 2003Ь
Могпзоп ап<1 Ьа1§пе1е1, X Сегеа! 8ск 7:9-20, 1983
Могпзоп е( а!., XСегеа!8с! 2: 257-271, 1984
Муегз βία!., ΡΙαηίРкуз1о1о§у, 122: 989-997, 2000 №е<11етап апс! Шипкск, X. Мо! Βίο! 48: 443-453,1970
Νίβάζ ΡΙαηί СеПКероПз, 14: 403, 1995
О'ЗЬеа е/ а!., СагЬокуХг Кез, 307: 1-12,1998
ОЬсЗап е( а!., ХЕхр Во 56: 3229-3244, 2005
Ο\ν е1 а!, В&епсе, 234: 856, 1986
РазяшпеШ е/ а!., Сигг Орт Оепе! Εβνζίορ 15: 200-205, 2005
Регптад еГ а!., Оепе, 113: 157-163,1992
Ро1гукиз ега!.. Мо1. Оеп. Оепег. 199:183, 1985
Ргазкег ес а!., Вюскет. Вгоркуз. Кез. Сотт. 126: 1259-68, 1985
Кактап е1 а!., XСегеа! $αΐ, 31: 91-110,2000
Катзау е/ а!,, ОепеИсз. 756(4): 1997-2005,2000
Ке£1па е(а!., Ргос Ναι! АсаХЗег 1Х8А, 103: 3546-3551,2006
Кетт§топ'з РкагтасеиНса! 8с1епсез, 18,н Εά., Маск РиЫ1зЬт§, Сотрапу, ЕазТоп, РА, и.8.А. 1990
КоЫпзоп, Тке Ог^агйс СопзШиеШз о/ ЕИ§кег Р!ап1з, СогПиз Ргезз, ΝογΙΙί Аткегз!, и8А, Ехатр1е 9, 1980
КоМап е( а!., ΡΙαηί X. 49: 492-504,2007
Р.иизка еГ а!., Рапс! ΡΙαηΐ Βίο! 33: 799-809, 2006
8а1отоп е! а!., ЕМВОХ, 3: 141-146, 1984
ЗатЬгоок е/ а!., Мо!еси!аг С!отп§: А ЬаЪогаЩгу Мапиа! (2п<1 её.), СоИ 8рпп§
НагЪоиг ЬаЬогаЮгу, СоМ 8рпп§ НагЪоиг, ΝΥ, 1989
ЗскопсЫтЫегеГа/., ΡΙαηί ВгееХт& 109: 274-281,1992
Зепюг, ΒίοιβοΗ. Оепе!. Εη§ΐη. Кеуз. 15: 79-119,1998
8Ытато1о е( а!., Еа1иге, 338: 274-276,1989 бЫрру βί а!.> Мо!. Вю1еск. 12: 117-129, 1999
81ас1е апс! КпаиГ, Тгап$§егис Кез. 14: 109-115, 2005
ЗтИке/аД, Ναίια-ε, 407: 319-320,2000
8т!1к, Вютасгото1еси!ез, 2: 335-341,2001
8(а1кег е( а!.. ЗФепсе, 242: 419, 1988
8ипе7аА, Тке Νβνν ΡΙψίοΙοξίζί. 137: 215-215, 1997
Τείίολν е1 а!., ΧΕχρΒοί, 55: 2131-2145, 2004
Ткеапдег е/ αΐ., XАОЛС Ιη! 78: 1030-1044, 1995
ТкШеи/αΖ, X. ΒίοΙ. Скет. 263: 12500, 1988
- 48 032207
ΊΊιοηιρεοη ε( а!., СагЬокус!га1е Ке;., 331: 149-161,2001
Ти1§ау είαΐ., ΡΙαηίΙ 11: 1369-1376, 1997
Τορρίη§ εΐ αι. 81агск-81агке, 55: 539-545,2003
Уегопезе е1 αΐ., Εηζ М1сгоЫа1 Теск, 24: 263-269, 1999 \Уап апс1 Ьетаих, ΡΙαηί ΡΙιγειοΙ 104: 37-48,1994
ХУаПтИо^е ею!., Ргос. ΝαΐΙ. Асаа 8α. '1.8.4. 95: 13959-13964, 1998
Уататоп апО С.)иуа11, Ткеог ΑρρΙ Оепег, 100: 32-38, 2000
Уататог! е/ αΐ, Пеог Арр! Оепе!, 101: 21—29, 2000
Уа5и1^/а/., А Сегеа! 8сг, 24: 131—137, 1996
Ζ1ΐ№§ е1 αΐ., ΡΙαηί ΡΗγζίοΙ. 138: 663-674, 2005
Ζν/аг аа4 СЬапс11ег, ΡΙαηία 197: 39-48, 1995
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> Со1шпоп»еа1й ΞοίθηϋίΓίο апй 1пДизбг1а1 КезеагсИ.
Огдапхзабхоп
АиебгаИап Сар1ба1 Уепбигез ЫтгЬеЦ
Ш, ЕНопдух (ИЗ 0п1у)
МОКЕЬЬ, МаббЬевд К (ИЗ 0п1у)
<120> Ячмень и его применение
<130> 31001967/ΰΈΗ/ΌΧΤ
<150> АИ2009903563
<151> 2009 '-07-30
<160> 11
<170> РабепЫп уегзтоп 3.5
<210> 1
<211> 2972
<212> ДНК
<213> НогДеит -уи1даге
<400> 1
ссбсдаддбд сдбббасссс асасададба сасбссаасб ссадбссааб ссадсссасб 60
дссдсббсбд сссдсссабс дбассдбсдс ссдссссдаб сссддссдсс дссабдбсдб 120
сддсддбсдс дбсссссдсд бссббссбсд сдсбсдсдбс сдссбсдссс дддадабсаб 180
сасддаддад ддсдадддбд ддсдсдбсдс саасссдсдс бддддссддс аддсбдсааб 240
ддсддссдбс дссдсбдсад сдсасддсбс дсдасддадс ддбддссдсд сдсдссдссд 300
ддабсдасда сдссдсдссс ддбаддсадс сссдсдсбсд ссдсбабддс дссдссасса 360
аддбсдсдда бсссдбсаад асдсбсдабс дсдасдссдс ддааддбддб дддссдбссс 420
сдссддсасс даддсаддас дссдсссдбс бдссдадбаа даасддсасд сбдабсаасд 480
дбдадаасаа ассбассддс ддсддбддсд сдасбааада садсдддсбд сссасасссд 540
сасдсдсдсс ссабсбдбса абссадааса дадбассддб даасддбдаа аасааасаба 600
аддбсдссбс дссдссдасс адсабадбдд абдбсдсдбс бссдддббсс дсадсбааса 660
бббссабсад баасааддбд ссдссдбссд ббдбсссадс саадаадасд ссдссдбсдб 720
ссдббббссс ддссаадаад асдсбдссдб сдбссддсбс аааббббдбд бссбсддссб 780
сбдсбсссад дсбддасасб дбсадсдабд бддаасббдс асадаадаад дабдсдсбда 840
- 49 032207
ббдбсааада адсбссаааа ссаааддсбс бббсддсссс бдсадссссс дсбдбасаад 900
аадассбббд ддабббсаад ааабасаббд дбббсдадда дсссдбддад дссааддабд 960
абддсбсддс бдббдсадаб дабдсдддбб ссбббдааса бсассадааб сабдаббссд 1020
дассбббддс аддддадаас дбсабдаасд бддбсдбсдб бдсбдсбдаа бдббсбсссб 1080
ддбдсаааас аддбддбсбб ддадабдббд сдддбдсббб дсссааддсб ббддсбаада 1140
даддасабсд бдббабддбб дбддбассаа ддбабдддда сбабдаддаа дссбасдабд 1200
бсддадбссд аааабасбас ааддсбдсбд дасаддабаб ддаадбдааб бабббссабд 1260
сббабабсда бддадбддаб бббдбдббса ббдасдсбсс бсбсббссда сассдбсадс 1320
аадасаббба бдддддсадс адасаддааа ббабдаадсд сабдаббббд ббсбдсаадд 1380
ссдсбдбсда ддббссббдд сасдббссаб дсддсддбдб сссббасддд дабддааабс 1440
бддбсббсаб бдсааабдаб бддсасасдд сасбссбдсс бдбсбабсбд ааадсабабб 1500
асадддасса бддбббдабд саабасадбс дсбссдббаб ддбдабасаб аасабсдсбс 1560
ассадддссд бддсссбдба дабдааббсс сдббсассда дббдссбдад сасбассбдд 1620
аасасббсад асбдбасдас сссдбсддсд дбдадсасдс саасбасббс дссдссддсс 1680
бдаадабддс ддассаддбб дбсдбсдбда дссссдддба ссбдбдддад сбдаадасдд 1740
бддадддсдд сбдддддсбб сасдасабса басддсадаа сдасбддаад асссдсддса 1800
бсдбдаасдд сабсдасаас абддадбдда асссбдаддб ддасдбссас сбдаадбсдд 1860
асддсбасас саасббсбсс сбдаадасдс бддасбссдд саадсддсад бдсааддадд 1920
сссбдсадсд сдадсбдддд сбдсаддбсс дсддсдасдб дссдсбдсбс дддббсабсд 1980
ддсддсбдда сдддсадаад ддсдбддада бсабсдсдда сдсдабдссс бддабсдбда 2040
дссаддасдб дсадсбддбд абдсбдддса сддддсдсса сдассбддад адсабдсбдс 2100
адсасббсда дсдддадсас сасдасаадд бдсдсдддбд ддбддддббс бссдбдсдсс 2160
бддсдсассд дабсасддсд ддсдссдасд сдсбссбсаб дсссбсссдд ббсдадссдб 2220
дсдддсбдаа ссадсбсбас дсдабддссб асддсассаб сссбдбсдбд сасдссдбсд 2280
дсддсббдад ддабассдбд ссдссдббсд ассссббсаа ссасбссддд сбсдддбдда 2340
сдббсдассд сдссдаддсд сасаадсбда бсдаддсдсб сдддсасбдс сбссдсассб 2400
ассдддасса сааддададс бддаддддсс бссаддадсд сддсабдбсд саддасббса 2460
дсбдддааса бдссдссаад сбсбасдадд асдбссбсдб ссаддссаад бассадбддб 2520
даасдсбдсб асссддбсса дссссдсабд сдбдсабдад аддабддааа бдсдсаббдс 2580
дсасббдсад абббддсдса сдсаддаасд бдссдбссбб сббдабдада асдссддсаб 2640
ссдсдаддбб дадасдсбда ббссдабсбд дбссдбсдса дадбададбд ааасдсбссб 2700
бдббдсаддб абабдддааб дббббббббс сббббббббб дсдадддадд бабабдддаа 2760
бдббаасббд дбаббдбааб дбддбабдсб дбдбдсабба ббасабсддб бдббдббдсб 2820
баббсббдсб адсбаадбсд даддссаада дсдааадсба дсбсасабдб сбдабдбабд 2880
саадбдасаб ддббддбббд дббдбдсадб дсааасддса ддаабдддаа дбдааббссб 2940
- 50 032207 сссЕдсЕЕаа аЕЕааааааа аааааааааа аа
2972 <210> 2 <211> 802 <212> БЕЛОК <213> НогДеит -уи1даге <400> 2
МеЕ 1 Зег Зег А1а Уа1 5 А1а Зег Рго А1а Зег 10 РЕе Ьеи А1а Ьеи А1а 15 Зег
А1а Зег Рго С1у Агд Зег Зег Агд Агд Агд А1а Агд Уа1 С1у А1а Зег
20 25 30
Рго ТЕг Агд А1а С1у А1а С1у Агд Ьеи С1п Тгр Агд Рго Зег Рго Ьеи
35 40 45
Θ1π Агд ТЕг А1а Агд Азр С1у А1а Уа1 А1а А1а Агд А1а А1а С1у 11е
50 55 60
Азр Азр А1а А1а Рго С1у Агд С1п Рго Агд А1а Агд Агд Туг С1у А1а
65 70 75 80
А1а ТЕг Ьуз Уа1 А1а Азр Рго Уа1 Ьуз ТЕг Ьеи Азр Агд Азр А1а А1а
85 90 95
С1и С1у С1у С1у Рго Зег Рго Рго А1а Рго Агд С1п Азр А1а А1а Агд
100 105 110
Ьеи Рго Зег Ьуз Азп С1у ТЕг Ьеи 11е Азп С1у С1и Азп Ьуз Рго ТЕг
115 120 125
С1у С1у С1у С1у А1а ТЕг Ьуз Азр Зег С1у Ьеи Рго ТЕг Рго А1а Агд
130 135 140
А1а Рго Н1з Ьеи Зег 11е С1п Азп Агд Уа1 Рго Уа1 Азп С1у С1и Азп
145 150 155 160
Ьуз Н1з Ьуз Уа1 А1а Зег Рго Рго ТЕг Зег 11е Уа1 Азр Уа1 А1а Зег
165 170 175
Рго С1у Зег А1а А1а Азп 11е Зег 11е Зег Азп Ьуз Уа1 Рго Рго Зег
180 185 190
Уа1 Уа1 Рго А1а Ьуз Ьуз ТЕг Рго Рго Зег Зег Уа1 РЕе Рго А1а Ьуз
195 200 205
Ьуз ТЕг Ьеи Рго Зег Зег С1у Зег Азп РЕе Уа1 Зег Зег А1а Зег А1а
210 215 220
Рго Агд Ьеи Азр ТЕг Уа1 Зег Азр Уа1 С1и Ьеи А1а С1п Ьуз Ьуз Азр
225 230 235 240
- 51 032207
А1а Ьеи 11е Уа1 Ьуз 245 С1и А1а Рго Ьуз Рго 250 Ьуз А1а Ьеи Зег А1а 255 Рго
А1а А1а Рго А1а Уа1 Θ1π С1и Азр Ьеи Тгр Азр РАе Ьуз Ьуз Туг 11е
260 265 270
С1у РАе С1и С1и Рго Уа1 С1и А1а Ьуз Азр Азр С1у Зег А1а Уа1 А1а
275 280 285
Азр Азр А1а С1у Зег РАе С1и Низ Низ С1п Азп Низ Азр Зег С1у Рго
290 295 300
Ьеи А1а С1у С1и Азп Уа1 МеЬ Азп Уа1 Уа1 Уа1 Уа1 А1а А1а С1и Суз
305 310 315 320
Зег Рго Тгр Суз Ьуз ТАг С1у С1у Ьеи С1у Азр Уа1 А1а С1у А1а Ьеи
325 330 335
Рго Ьуз А1а Ьеи А1а Ьуз Агд С1у Низ Агд Уа1 МеЬ Уа1 Уа1 Уа1 Рго
340 345 350
Агд Туг С1у Азр Туг С1и С1и А1а Туг Азр Уа1 С1у Уа1 Агд Ьуз Туг
355 360 365
Туг Ьуз А1а А1а С1у Θ1π Азр МеЬ С1и Уа1 Азп Туг РАе Низ А1а Туг
370 375 380
11е Азр С1у Уа1 Азр РАе Уа1 РАе 11е Азр А1а Рго Ьеи РАе Агд Низ
385 390 395 400
Агд Θ1π Θ1π Азр 11е Туг С1у С1у Зег Агд С1п С1и 11е МеЬ Ьуз Агд
405 410 415
МеЬ 11е Ьеи РАе Суз Ьуз А1а А1а Уа1 С1и Уа1 Рго Тгр Низ Уа1 Рго
420 425 430
Суз С1у С1у Уа1 Рго Туг С1у Азр С1у Азп Ьеи Уа1 РАе 11е А1а Азп
435 440 445
Азр Тгр Низ ТАг А1а Ьеи Ьеи Рго Уа1 Туг Ьеи Ьуз А1а Туг Туг Агд
450 455 460
Азр Низ С1у Ьеи МеЬ Θ1π Туг Зег Агд Зег Уа1 МеЬ Уа1 11е Низ Азп
465 470 475 480
11е А1а Низ Θ1π С1у Агд С1у Рго Уа1 Азр С1и РАе Рго РАе ТАг С1и
485 490 495
Ьеи Рго С1и Низ Туг Ьеи С1и Низ РАе Агд Ьеи Туг Азр Рго Уа1 С1у
500 505 510
С1у С1и Низ А1а Азп Туг РАе А1а А1а С1у Ьеи Ьуз МеЬ А1а Азр С1п
515 520 525
- 52 032207
Уа1 Уа1 530 Уа1 Уа1 Зег Рго С1у 535 Туг Ьеи Тгр С1и Ьеи 540 Ьуз ТЬг Уа1 С1и
С1у С1у Тгр С1у Ьеи Низ Азр 11е 11е Агд Θ1π Азп Азр Тгр Ьуз ТЬг
545 550 555 560
Агд С1у 11е Уа1 Азп С1у 11е Азр Азп МеЬ С1и Тгр Азп Рго С1и Уа1
565 570 575
Азр Уа1 Низ Ьеи Ьуз Зег Азр С1у Туг ТЬг Азп РЬе Зег Ьеи Ьуз ТЬг
580 585 590
Ьеи Азр Зег С1у Ьуз Агд С1п Суз Ьуз С1и А1а Ьеи С1п Агд С1и Ьеи
595 600 605
С1у Ьеи С1п Уа1 Агд С1у Азр Уа1 Рго Ьеи Ьеи С1у РЬе 11е С1у Агд
610 615 620
Ьеи Азр С1у С1п Ьуз С1у Уа1 С1и 11е 11е А1а Азр А1а МеЬ Рго Тгр
625 630 635 640
11е Уа1 Зег С1п Азр Уа1 С1п Ьеи Уа1 МеЬ Ьеи С1у ТЬг С1у Агд Низ
645 650 655
Азр Ьеи С1и Зег МеЬ Ьеи С1п Низ РЬе С1и Агд С1и Низ Низ Азр Ьуз
660 665 670
Уа1 Агд С1у Тгр Уа1 С1у РЬе Зег Уа1 Агд Ьеи А1а Низ Агд 11е ТЬг
675 680 685
А1а С1у А1а Азр А1а Ьеи Ьеи МеЬ Рго Зег Агд РЬе С1и Рго Суз С1у
690 695 700
Ьеи Азп С1п Ьеи Туг А1а МеЬ А1а Туг С1у ТЬг 11е Рго Уа1 Уа1 Низ
705 710 715 720
А1а Уа1 С1у С1у Ьеи Агд Азр ТЬг Уа1 Рго Рго РЬе Азр Рго РЬе Азп
725 730 735
Низ Зег С1у Ьеи С1у Тгр ТЬг РЬе Азр Агд А1а С1и А1а Низ Ьуз Ьеи
740 745 750
11е С1и А1а Ьеи С1у Низ Суз Ьеи Агд ТЬг Туг Агд Азр Низ Ьуз С1и
755 760 765
Зег Тгр Агд С1у Ьеи С1п С1и Агд С1у МеЬ Зег С1п Азр РЬе Зег Тгр
770 775 780
С1и Низ А1а А1а Ьуз Ьеи Туг С1и Азр Уа1 Ьеи Уа1 С1п А1а Ьуз Туг
785 790 795 800
- 53 032207
Θ1π Тгр <210>3 <211>23 <212> ДНК <213> НогДеит -уи1даге <400>3 ссЬддаасас ЬЬсадасЬдЬ асд <210> 4 <211> 22 <212> ДНК <213> НогДеит -уи1даге <400> 4 адсаЬсасса дсЬдсасдЬс сЬ
<210> 5
<211> 38
<212> ДНК
<213> НогДеит -уи1даге
<400> 5 сасдасдЬЬд Ьаааасдаса сЬЬаадЬдсс аЬдсааад
<210> 6
<211> 19
<212> ДНК
<213> НогДеит -уи1даге
<400> 6
адддасаааа аЬддсЬаад <210>7 <211>17 <212> ДНК <213> Тг1Ь1сит аевНуит <400>7 ддаддЬсЬсд дддаЬдЬ <210> 8 <211> 23 <212> ДНК <213> Тг1Ь1сит аевНуит <400> 8 дсЬссаддаа дЬааасддЬс адд <210> 9 <211> 2946 <212> ДНК <213> НогДеит -уи1даге <400> 9
дЬдсдЬЬЬас сссасасада дЬасасЬсса асЬссадЬсс адЬссадссс асЬдссдсЬЬ 60
сЬдсссдссс аЬсдЬассдЬ сдсссдсссс даЬсссддсс дссдссаЬдЬ сдЬсддсддЬ 120
сдсдЬссссс дсдЬссЬЬсс ЬсдсдсЬсдс дЬссдссЬсд сссдддадаЬ саЬсасддад 180
- 54 032207
дадддсдадд дЬдддсдсдЬ сдссаасссд сдсЬддддсс ддсаддсЬдс ааЬддсддсс 240
дЬсдссдсЬд садсдсасдд сЬсдсдасдд адсддЬддсс дсдсдсдссд ссдддаЬсда 300
сдасдссдсд сссддЬаддс адссссдсдс ЬсдссдсЬаЬ ддсдссдсса ссааддЬсдс 360
ддаЬсссдЬс аадасдсЬсд аЬсдсдасдс сдсддааддЬ ддЬдддссдЬ ссссдссддс 420
ассдаддсад дасдссдссс дЬсЬдссдад Ьаадаасддс асдсЬдаЬса асддЬдадаа 480
сааассЬасс ддсддсддЬд дсдсдасЬаа адасадсддд сЬдсссасас ссдсасдсдс 540
дссссаЬсЬд ЬсааЬссада асададЬасс ддЬдаасддЬ даааасааас аЬааддЬсдс 600
сЬсдссдссд ассадсаЬад ЬддаЬдЬсдс дЬсЬссдддЬ Ьссдсадсса асаЬЬЬссаЬ 660
садЬаасаад дЬдссдссдЬ ссдЬЬдЬссс адссаадаад асдссдссдЬ сдЬссдЬЬЬЬ 720
сссддссаад ааддсдссдс сдЬсдЬссдЬ ЬдЬсссддсс аадаадасдс ЬдссдЬсдЬс 780
сддсЬсаааЬ ЬЬЬдЬдЬссЬ сддссЬсЬдс ЬсссаддсЬд дасасЬдЬса дсдаЬдЬдда 840
асЬЬдсасад аадааддаЬд сдсЬдаЬЬдЬ сааадаадсЬ ссаааассаа аддсЬсЬЬЬс 900
ддссссЬдса дсссссдсЬд Ьасаадаада ссЬЬЬдддаЬ ЬЬсаадаааЬ асаЬЬддЬЬЬ 960
сдаддадссс дЬддаддсса аддаЬдаЬдд сЬсддсЬдЬЬ дсадаЬдаЬд сдддЬЬссЬЬ 1020
ЬдаасаЬсас садааЬсаЬд аЬЬссддасс ЬЬЬддсаддд дадаасдЬса ЬдаасдЬддЬ 1080
сдЬсдЬЬдсЬ дсЬдааЬдЬЬ сЬсссЬддЬд саааасаддЬ ддЬсЬЬддад аЬдЬЬдсддд 1140
ЬдсЬЬЬдссс ааддсЬЬЬдд сЬаадададд асаЬсдЬдЬЬ аЬддЬЬдЬдд ЬассааддЬа 1200
ЬддддасЬаЬ даддаадссЬ асдаЬдЬсдд адЬссдаааа ЬасЬасаадд сЬдсЬддаса 1260
ддаЬаЬддаа дЬдааЬЬаЬЬ ЬссаЬдсЬЬа ЬаЬсдаЬдда дЬддаЬЬЬЬд ЬдЬЬсаЬЬда 1320
сдсЬссЬсЬс ЬЬссдасасс дЬсадсаада саЬЬЬаЬддд ддсадсадас аддаааЬЬаЬ 1380
даадсдсаЬд аЬЬЬЬдЬЬсЬ дсааддссдс ЬдЬсдаддЬЬ ссЬЬддсасд ЬЬссаЬдсдд 1440
сддЬдЬсссЬ ЬасддддаЬд даааЬсЬддЬ сЬЬсаЬЬдса ааЬдаЬЬддс асасддсасЬ 1500
ссЬдссЬдЬс ЬаЬсЬдааад саЬаЬЬасад ддассаЬддЬ ЬЬдаЬдсааЬ асадЬсдсЬс 1560
сдЬЬаЬддЬд аЬасаЬааса ЬсдсЬсасса дддссдЬддс ссЬдЬадаЬд ааЬЬсссдЬЬ 1620
сассдадЬЬд ссЬдадсасЬ ассЬддааса сЬЬсадасЬд Ьасдассссд ЬсддсддЬда 1680
дсасдссаас ЬасЬЬсдссд ссддссЬдаа даЬддсддас саддЬЬдЬсд ЬсдЬдадссс 1740
сдддЬассЬд ЬдддадсЬда адасддЬдда дддсддсЬдд дддсЬЬсасд асаЬсаЬасд 1800
дсадаасдас Ьддаадассс дсддсаЬсдЬ даасддсаЬс дасаасаЬдд адЬдааассс 1860
ЬдаддЬддас дЬссассЬда адЬсддасдд сЬасассаас ЬЬсЬсссЬда адасдсЬдда 1920
сЬссддсаад сддсадЬдса аддаддсссЬ дсадсдсдад сЬддддсЬдс аддЬссдсдд 1980
сдасдЬдссд сЬдсЬсдддЬ ЬсаЬсдддсд дсЬддасддд садаадддсд ЬддадаЬсаЬ 2040
сдсддасдсд аЬдсссЬдда ЬсдЬдадсса ддасдЬдсад сЬддЬдаЬдс Ьдддсасддд 2100
дсдссасдас сЬддададса ЬдсЬдсадса сЬЬсдадсдд дадсассасд асааддЬдсд 2160
сдддЬдддЬд дддЬЬсЬссд ЬдсдссЬддс дсассддаЬс асддсдддсд ссдасдсдсЬ 2220
ссЬсаЬдссс ЬсссддЬЬсд адссдЬдсдд дсЬдаассад сЬсЬасдсда ЬддссЬасдд 2280
- 55 032207
сассабсссб дбсдбдсасд ссдбсддсдд ссбдадддаб ассдбдссдс сдббсдассс 2340
сббсаассас бссдддсбсд ддбддасдбб сдассдсдсс даддсдсаса адсбдабсда 2400
ддсдсбсддд сасбдссбсс дсассбассд ддассасаад дададсбдда ддддссбсса 2460
ддадсдсддс абдбсдсадд асббсадсбд ддаасабдсс дссаадсбсб асдаддасдб 2520
ссбсдбссад дссаадбасс адбддбдаас дсбдсбассс ддбссадссс сдсабдсдбд 2580
сабдададда бддааабдсд саббдсдсас ббдсадаббб ддсдсасдса ддаасдбдсс 2640
дбссббсббд абдадаасдс сддсабссдс даддббдада сдсбдаббсс дабсбддбсс 2700
дбсдсададб ададбдааас дсбссббдбб дсаддбабаб дддаабдббб бббббссббб 2760
ббббббдсда дддаддбаба бдддаабдбб аасббддбаб бдбаабдбдд бабдсбдбдб 2820
дсаббаббас абсддббдбб дббдсббабб сббдсбадсб аадбсддадд ссаададсда 2880
аадсбадсбс асабдбсбда бдбабдсаад бдасабддбб ддбббддббд бдсадбдсаа 2940
асддса 2946
<210> <211> <212> <213> 10 571 БЕЛОК НогЛеит -уи1даге
<400> 10
Меб 1 Зег Зег А1а Уа1 5 А1а Зег Рго А1а Зег 10 РЬе Ьеи А1а Ьеи А1а 15 Зег
А1а Зег Рго С1у Агд Зег Зег Агд Агд Агд А1а Агд Уа1 С1у А1а Зег
20 25 30
Рго Ткг Агд А1а С1у А1а С1у Агд Ьеи С1п Тгр Агд Рго Зег Рго Ьеи
35 40 45
Θ1π Агд Ткг А1а Агд Азр С1у А1а Уа1 А1а А1а Агд А1а А1а С1у 11е
50 55 60
Азр Азр А1а А1а Рго С1у Агд С1п Рго Агд А1а Агд Агд Туг С1у А1а
65 70 75 80
А1а Ткг Ьуз Уа1 А1а Азр Рго Уа1 Ьуз Ткг Ьеи Азр Агд Азр А1а А1а
85 90 95
С1и С1у С1у С1у Рго Зег Рго Рго А1а Рго Агд С1п Азр А1а А1а Агд
100 105 110
Ьеи Рго Зег Ьуз Азп С1у Ткг Ьеи 11е Азп С1у С1и Азп Ьуз Рго Ткг
115 120 125
С1у С1у С1у С1у А1а Ткг Ьуз Азр Зег С1у Ьеи Рго Ткг Рго А1а Агд
130 135 140
А1а Рго Н1з Ьеи Зег 11е С1п Азп Агд Уа1 Рго Уа1 Азп С1у С1и Азп
145 150 155 160
- 56 032207
Ьуз Низ Ьуз Уа1 А1а 165 Зег Рго Рго ТЬг Зег 170 11е Уа1 Азр Уа1 А1а 175 Зег
Рго С1у Зег А1а А1а Азп 11е Зег 11е Зег Азп Ьуз Уа1 Рго Рго Зег
180 185 190
Уа1 Уа1 Рго А1а Ьуз Ьуз ТЬг Рго Рго Зег Зег Уа1 РЬе Рго А1а Ьуз
195 200 205
Ьуз ТЬг Ьеи Рго Зег Зег С1у Зег Азп РЬе Уа1 Зег Зег А1а Зег А1а
210 215 220
Рго Агд Ьеи Азр ТЬг Уа1 Зег Азр Уа1 С1и Ьеи А1а С1п Ьуз Ьуз Азр
225 230 235 240
А1а Ьеи 11е Уа1 Ьуз С1и А1а Рго Ьуз Рго Ьуз А1а Ьеи Зег А1а Рго
245 250 255
А1а А1а Рго А1а Уа1 С1п С1и Азр Ьеи Тгр Азр РЬе Ьуз Ьуз Туг 11е
260 265 270
С1у РЬе С1и С1и Рго Уа1 С1и А1а Ьуз Азр Азр С1у Зег А1а Уа1 А1а
275 280 285
Азр Азр А1а С1у Зег РЬе С1и Низ Низ С1п Азп Низ Азр Зег С1у Рго
290 295 300
Ьеи А1а С1у С1и Азп Уа1 МеЬ Азп Уа1 Уа1 Уа1 Уа1 А1а А1а С1и Суз
305 310 315 320
Зег Рго Тгр Суз Ьуз ТЬг С1у С1у Ьеи С1у Азр Уа1 А1а С1у А1а Ьеи
325 330 335
Рго Ьуз А1а Ьеи А1а Ьуз Агд С1у Низ Агд Уа1 МеЬ Уа1 Уа1 Уа1 Рго
340 345 350
Агд Туг С1у Азр Туг С1и С1и А1а Туг Азр Уа1 С1у Уа1 Агд Ьуз Туг
355 360 365
Туг Ьуз А1а А1а С1у С1п Азр МеЬ С1и Уа1 Азп Туг РЬе Низ А1а Туг
370 375 380
11е Азр С1у Уа1 Азр РЬе Уа1 РЬе 11е Азр А1а Рго Ьеи РЬе Агд Низ
385 390 395 400
Агд Θ1π Θ1π Азр 11е Туг С1у С1у Зег Агд С1п С1и 11е МеЬ Ьуз Агд
405 410 415
МеЬ 11е Ьеи РЬе Суз Ьуз А1а А1а Уа1 С1и Уа1 Рго Тгр Низ Уа1 Рго
420 425 430
- 57 032207
Суз С1у <31у Уа1 435 Рго Туг С1у Азр 440 С1у Азп Ьеи Уа1 РАе 445 11е А1а Азп
Азр Тгр Низ ТАг А1а Ьеи Ьеи Рго Уа1 Туг Ьеи Ьуз А1а Туг Туг Агд
450 455 460
Азр Низ С1у Ьеи МеЬ С1п Туг Зег Агд Зег Уа1 МеЬ Уа1 11е Низ Азп
465 470 475 480
11е А1а Низ С1п С1у Агд С1у Рго Уа1 Азр С1и РАе Рго РАе ТАг С1и
485 490 495
Ьеи Рго С1и Низ Туг Ьеи С1и Низ РАе Агд Ьеи Туг Азр Рго Уа1 С1у
500 505 510
С1у С1и Низ А1а Азп Туг РАе А1а А1а С1у Ьеи Ьуз МеЬ А1а Азр С1п
515 520 525
Уа1 Уа1 Уа1 Уа1 Зег Рго С1у Туг Ьеи Тгр С1и Ьеи Ьуз ТАг Уа1 С1и
530 535 540
С1у С1у Тгр С1у Ьеи Низ Азр 11е 11е Агд С1п Азп Азр Тгр Ьуз ТАг
545 550 555 560
Агд С1у 11е Уа1 Азп С1у 11е Азр Азп МеЬ С1и
565 570
<210> 11
<211> 230
<212> ] БЕЛОК
<213> ] НогЛеит -уи1даге
<400> 11
Азп Рго С1и Уа1 Азр Уа1 Низ Ьеи Ьуз Зег Азр С1у Туг ТАг Азп РАе
1 5 10 15
Зег Ьеи Ьуз ТАг Ьеи Азр Зег С1у Ьуз Агд С1п Суз Ьуз С1и А1а Ьеи
20 25 30
С1п Агд С1и Ьеи С1у Ьеи С1п Уа1 Агд С1у Азр Уа1 Рго Ьеи Ьеи С1у
35 40 45
РАе 11е С1у Агд Ьеи Азр С1у С1п Ьуз С1у Уа1 С1и 11е 11е А1а Азр
50 55 60
А1а МеЬ Рго Тгр 11е Уа1 Зег С1п Азр Уа1 С1п Ьеи Уа1 МеЬ Ьеи С1у
65 70 75 80
ТАг С1у Агд Низ Азр Ьеи С1и Зег МеЬ Ьеи С1п Низ РАе С1и Агд С1и
85 90 95
Низ Низ Азр Ьуз Уа1 Агд С1у Тгр Уа1 С1у РАе Зег Уа1 Агд Ьеи А1а
100 105 110
- 58 032207
Н15 Агд 11е 115 ТЬг А1а С1у А1а Азр А1а 120 Ьеи Ьеи Меб Рго 125 Зег Агд РЬе
С1и Рго Суз С1у Ьеи Азп С1п Ьеи Туг А1а Меб А1а Туг С1у ТЬг 11е
130 135 140
Рго Уа1 Уа1 Нгз А1а Уа1 С1у С1у Ьеи Агд Азр ТЬг Уа1 Рго Рго РЬе
145 150 155 160
Азр Рго РЬе Азп Низ Зег С1у Ьеи С1у Тгр ТЬг РЬе Азр Агд А1а С1и
165 170 175
А1а Н15 Ьуз Ьеи 11е С1и А1а Ьеи С1у Низ Суз Ьеи Агд ТЬг Туг Агд
180 185 190
Азр Н15 Ьуз С1и Зег Тгр Агд С1у Ьеи С1п С1и Агд С1у Меб Зег С1п
195 200 205
Азр РЬе Зег Тгр С1и Низ А1а А1а Ьуз Ьеи Туг С1и Азр Уа1 Ьеи Уа1
210 215 220
С1п А1а Ьуз Туг С1п Тгр
225 230

Claims (33)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Зерно ячменя, включающее:
    (ΐ) гомозиготную мутацию в гене эндогенной синтазы крахмала 11а (8811а) , благодаря которой зерно ячменя обладает пониженным уровнем или пониженной активностью белка синтазы крахмала (8811а), кодируемого эндогенным геном 8811а, по сравнению с ячменем дикого типа, где пониженный уровень или пониженная активность белка 8811а в зерне ячменя составляет менее 10% от уровня или активности белка 8811а в ячмене дикого типа, где эндогенный ген 8811а кодирует полипептид с аминокислотной последовательностью 8Еф ΙΌ N0: 2 и где мутация в эндогенном гене 8811а подавляет экспрессию гена 8811а в растении ячменя или приводит к экспрессии белка 8811а с пониженным уровнем или пониженной активностью по сравнению с ячменем дикого типа, и (ίί) гомозиготную мутацию в гене ато1, приводящую к уменьшению активности гена ато1 по сравнению с геном ячменя дикого типа, и содержащее крахмал в количестве по меньшей мере 41% (мас./мас.).
  2. 2. Зерно ячменя по п.1, содержащее крахмал в количестве по меньшей мере 47% (мас./мас.).
  3. 3. Зерно по п.1 или 2, содержащее амилозу в количестве по меньшей мере 50% по отношению к общему содержанию крахмала в зерне.
  4. 4. Зерно по п.3, содержащее амилозу в количестве по меньшей мере 60% по отношению к общему содержанию крахмала в зерне.
  5. 5. Зерно по любому из пп.1-4, содержащее β-глюкан в количестве 5-9% (мас./мас.) или более 9% (мас./мас.).
  6. 6. Зерно по любому из пп.1-5, содержащее фруктан в количестве 3-11% (мас./мас.) или 4-11% (мас./мас.).
  7. 7. Зерно по п.6, в котором степень полимеризации фруктана составляет примерно от 3 до 12.
  8. 8. Зерно по любому из пп.1-7, в котором ген 8811а является гомозиготным по аллелю кех6-292.
  9. 9. Зерно по п.1, где ген ато1 включает аллель ато1-АС38.
  10. 10. Зерно по любому из пп.1-9, которое представляет собой цельное зерно или шлифованное, измельченное, раздробленное, плющеное или рушеное зерно.
  11. 11. Растение ячменя, способное продуцировать зерно по любому из пп.1-10, содержащее (ί) гомозиготную мутацию в гене эндогенной синтазы крахмала 11а (8811а), благодаря которой зерно ячменя обладает пониженным уровнем или пониженной активностью белка синтазы крахмала (8811а), кодируемого
    - 59 032207 эндогенным геном 8811а, по сравнению с ячменем дикого типа, где пониженный уровень или пониженная активность белка 8811а в зерне ячменя составляет менее 10% от уровня или активности белка 8811а в ячмене дикого типа, где эндогенный ген 8811а кодирует полипептид с аминокислотной последовательностью 8ЕО Ш №О: 2, и где мутация в эндогенном гене 8811а подавляет экспрессию гена 8811а в растении ячменя или приводит к экспрессии белка 8811а с пониженным уровнем или пониженной активностью по сравнению с ячменем дикого типа, и (ίί) гомозиготную мутацию в гене ато1, приводящую к уменьшению активности гена ато1 по сравнению с геном ячменя дикого типа, и содержащее крахмал в количестве по меньшей мере 41% (мас./мас.).
  12. 12. Ячменная мука, в том числе непросеянная мука, полученная из зерна по любому из пп.1-10.
  13. 13. Способ получения пищевого ингредиента, включающий обработку зерна по любому из пп.1-10 с получением пищевого ингредиента, выбранного из группы, состоящей из муки, в том числе непросеянной муки, крахмала, отрубей, фруктана, отличного от крахмала полисахарида и шлифованного, измельченного, раздробленного, плющеного или рушеного зерна.
  14. 14. Способ по п.13, дополнительно включающий определение уровня или типа крахмала, амилозы, амилопектина, фруктана, отличных от крахмала полисахаридов, клетчатки, резистентного крахмала в зерне ячменя или в полученном из него пищевом ингредиенте.
  15. 15. Способ по любому из пп.13 или 14, в котором отличным от крахмала полисахаридом является βглюкан.
  16. 16. Способ по любому из пп.13-15, где ингредиент включают в зерновой завтрак, печенье, сдобную булку, батончик мюсли или лапшу.
  17. 17. Способ получения растения ячменя, способного продуцировать зерно по любому из пп.1-10, характеризующееся пониженным уровнем или пониженной активностью белка 8811а по сравнению с ячменем дикого типа и содержанием крахмала, составляющим по меньшей мере 41%, где пониженный уровень или пониженная активность белка 8811а в ячмене составляет менее 10% от уровня или активности белка 8811а в ячмене дикого типа, в котором эндогенный ген 8811а кодирует полипептид с аминокислотной последовательностью 8ЕО Ш №О: 2, и где мутация в эндогенном гене 8811а подавляет экспрессию гена 8811а в растении ячменя или приводит к экспрессии белка 8811а с пониженным уровнем или пониженной активностью по сравнению с ячменем дикого типа, где способ включает (ί) введение гомозиготной мутации в эндогенный ген 8811а растения ячменя и гомозиготной мутации в ген ато1, которая приводит к уменьшению активности гена ато1 по сравнению с геном ячменя дикого типа, и (ίί) отбор растения ячменя, которое продуцирует указанное зерно.
  18. 18. Способ по п.17, дополнительно включающий определение уровня, активности и/или типа крахмала, амилозы, амилопектина, фруктана, отличного от крахмала полисахарида, клетчатки или резистентного крахмала в зерне ячменя.
  19. 19. Применение зерна по любому из пп.1-10 в производстве пищевого продукта для увеличения уровня крахмала, амилозы, амилопектина, резистентного крахмала, клетчатки, водорастворимого углевода, β-глюкана, фруктана или отличного от крахмала углевода в указанном продукте.
  20. 20. Применение зерна по любому из пп.1-10 в производстве пищевого продукта для снижения гликемического индекса (С1) указанного пищевого продукта.
  21. 21. Применение по п.20, где в пищевом продукте повышены уровни амилозы, β-глюкана и фруктана.
  22. 22. Пищевой продукт, содержащий пищевой ингредиент в количестве, составляющем по меньшей мере 10% по отношению к сухой массе, где пищевой ингредиент представляет собой зерно ячменя по любому из пп.1-10 или муку, в том числе непросеянную муку, полученную из указанного зерна.
  23. 23. Пищевой продукт по п.22, где мука, в том числе непросеянная мука, содержит 3-11% (мас./мас.) или 4-11% (мас./мас.) фруктана.
  24. 24. Пищевой продукт по п.22 или 23, где мука, в том числе непросеянная мука, содержит β-глюкан в количестве 5-9 или более 9% (мас./мас.).
  25. 25. Пищевой продукт по любому из пп.22-24, где мука, в том числе непросеянная мука, содержит амилозу в количестве 50 или 60% по отношению к общему содержанию крахмала в указанной муке.
  26. 26. Пищевой продукт по любому из пп.22-25, выбранный из группы, состоящей из хлеба, сдобной булочки, зерновых завтраков, кексов, печенья, пирожных, сухарей, оладий, пицц, круассанов, бубликов, соленых крендельков, макарон, лапши, компонентов сырья хлебопекарного производства, смесей для выпекания, супов, соусов, загустителей, конфет и других мучных изделий.
  27. 27. Применение ячменной муки, в том числе непросеянной муки, полученной из зерна ячменя по любому из пп.1-10, в производстве пищевого продукта для увеличения уровня крахмала, амилозы, амилопектина, фруктана, отличного от крахмала полисахарида, клетчатки или резистентного крахмала в пищевом продукте.
  28. 28. Применение по п.27, где отличным от крахмала полисахаридом является β-глюкан.
  29. 29. Способ улучшения одного или нескольких показателей здоровья млекопитающего, включающий введение в рацион млекопитающего пищевого продукта по любому из пп.22-26.
    - 60 032207
  30. 30. Способ по п.29, где один или несколько показателей здоровья включают повышенное число полезных кишечных бактерий, пониженное число очагов аберрантных крипт, повышенную абсорбцию минеральных веществ, пониженный уровень инсулина, пониженный гликемический индекс, пониженную гликемическую нагрузку, пониженный уровень глюкозы в крови, пониженное кровяное давление, пониженную массу тела, пониженный уровень холестерина в крови, повышенный уровень холестерина НОЬ, повышенную плотность кости, повышенный уровень кальция, повышенную частоту кишечной перистальтики или улучшенный сердечно-сосудистый профиль сыворотки крови.
  31. 31. Способ улучшения одного или нескольких симптомов состояния, связанного с наличием у субъекта низких уровней амилозы, включающий пероральное введение в рацион субъекту зерна по любому из пп.1-10 или продукта, содержащего муку, в том числе непросеянную муку, полученную из зерна.
  32. 32. Способ по п.31, где состояние выбрано из группы, состоящей из диабета, ожирения, болезни сердца, гипертонии, констипации и остеопороза.
  33. 33. Способ по п.32, где субъектом является человек.
EA201270200A 2009-07-30 2010-07-30 Ячмень и его применение EA032207B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2009903563A AU2009903563A0 (en) 2009-07-30 Barley and uses thereof
PCT/AU2010/000968 WO2011011833A1 (en) 2009-07-30 2010-07-30 Barley and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201270200A1 EA201270200A1 (ru) 2012-08-30
EA032207B1 true EA032207B1 (ru) 2019-04-30

Family

ID=43528643

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201270200A EA032207B1 (ru) 2009-07-30 2010-07-30 Ячмень и его применение

Country Status (16)

Country Link
US (3) US10154632B2 (ru)
EP (1) EP2458974A4 (ru)
JP (1) JP5982282B2 (ru)
KR (1) KR101806299B1 (ru)
CN (1) CN102933072B (ru)
AU (1) AU2010278678B9 (ru)
BR (1) BR112012002114A2 (ru)
CA (1) CA2769311C (ru)
EA (1) EA032207B1 (ru)
MX (1) MX2012001376A (ru)
MY (1) MY159360A (ru)
NZ (1) NZ597971A (ru)
SG (1) SG178164A1 (ru)
UA (1) UA116969C2 (ru)
WO (1) WO2011011833A1 (ru)
ZA (1) ZA201200766B (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2771671C1 (ru) * 2021-12-17 2022-05-11 Дмитрий Актамович Кулушев Смесь для выпечки оладий

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101274849B1 (ko) 2003-10-27 2013-06-13 코몬웰스 싸이언티픽 엔드 인더스트리얼 리서치 오가니제이션 아밀로스 비율이 증가된 전분을 갖는 쌀 및 이의 생성물
CA2693630C (en) 2006-07-14 2021-08-31 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Altering the fatty acid composition of rice
EA025360B1 (ru) * 2007-11-27 2016-12-30 Коммонвелт Сайентифик Энд Индастриал Рисерч Органайзейшн Растения с модифицированным метаболизмом крахмала
CA2653883C (en) 2008-07-17 2022-04-05 Colin Leslie Dow Jenkins High fructan cereal plants
AU2009273754B2 (en) 2008-07-21 2016-07-14 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Improved cottonseed oil and uses
MX2012001376A (es) 2009-07-30 2012-09-07 Commw Scient Ind Res Org Cebada y usos de la misma.
NZ610181A (en) 2010-11-04 2015-03-27 Arista Cereal Technologies Pty Ltd High amylose wheat
AU2012212404B2 (en) * 2011-02-03 2016-05-12 The Healthy Grain Pty Limited Barley with modified SSIII
AR087159A1 (es) 2011-06-20 2014-02-26 Gen Biscuit Galletita para desayuno con glucosa de lenta disponibilidad
BR112014007928B1 (pt) 2011-10-04 2021-07-06 Arcadia Biosciences, Inc. polinucleotídeos sbeiia de trigo
UA116538C2 (uk) 2012-04-25 2018-04-10 Коммонвелт Сайнтіфік Енд Індастріел Рісерч Організейшн Насінина сафлору з високим вмістом олеїнової кислоти
WO2015004638A2 (en) * 2013-07-12 2015-01-15 Texcity Bio-Sciences Pvt. Ltd Mutations in starch biosynthesis genes leading to high fiber and resistant starch expression in rice endosperm
WO2015117181A1 (en) * 2014-02-07 2015-08-13 Shoalhaven Starches Pty Ltd Wheat-based products in foods for the wheat intolerant
US9681620B2 (en) * 2014-04-10 2017-06-20 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Barley mutant lines having grain with ultra-high beta glucan content
MX2017000109A (es) 2014-07-07 2017-05-23 Commw Scient Ind Res Org Procesos para producir productos industriales de lipidos vegetales.
CN105238788A (zh) * 2015-11-10 2016-01-13 吉林农业大学 一种玉米淀粉合成酶SSⅡa启动子及其制备表达载体的构建方法
AU2016355920B2 (en) 2015-11-18 2020-11-12 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Rice grain with thickened aleurone
CA3035570A1 (en) 2016-09-02 2018-03-08 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Plants with modified traits
CA3085899A1 (en) * 2017-12-28 2019-07-04 Carlsberg A/S Barley with increased hydrolytic enzyme activity
JP7088779B2 (ja) * 2018-08-20 2022-06-21 帝人株式会社 サーチュインタンパク質活性化組成物
KR102174835B1 (ko) * 2018-10-18 2020-11-05 한국식품연구원 보리잎 유래 다당 분획물을 함유하는 골 관련 질환의 개선, 예방 또는 치료용 조성물
KR102238430B1 (ko) * 2019-05-29 2021-04-09 한국식품연구원 보리잎 유래 다당 분획물을 함유하는 비만 및 대사질환의 개선, 예방 또는 치료용 조성물
KR102421910B1 (ko) * 2020-03-31 2022-07-19 농업회사법인 유한회사 영인바이오 반려동물용 식이섬유 면 간식 및 그 제조방법
CN113261636A (zh) * 2021-07-01 2021-08-17 中国科学院成都生物研究所 一种高产γ-氨基丁酸的方法及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002037955A1 (en) * 2000-11-09 2002-05-16 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Barley with reduced ssii activity and starch containing products with a reduced amylopectin content
WO2010006373A1 (en) * 2008-07-17 2010-01-21 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation High fructan cereal plants

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3690896A (en) 1970-05-15 1972-09-12 Gen Mills Inc Process for forming a multi-colored food product
US4770710A (en) 1987-07-02 1988-09-13 American Maize-Products Company Novel starch and products produced therefrom
US5792920A (en) 1988-11-10 1998-08-11 Imperial Chemical Industries Plc Plants with altered ability to synthesize starch and process for obtaining them
US6013861A (en) 1989-05-26 2000-01-11 Zeneca Limited Plants and processes for obtaining them
US5051271A (en) 1989-11-22 1991-09-24 Opta Food Ingredients, Inc. Starch-derived, food-grade, insoluble bulking agent
SG71659A1 (en) 1992-12-24 2000-04-18 Goodman Fielder Ltd Food compositions including resistant starch
HUP9902112A3 (en) 1995-12-20 2001-11-28 Du Pont Novel starches via modification of expression of starch biosynthetic enzyme genes
CA2624375C (en) 1996-05-29 2010-07-27 Bayer Cropscience Gmbh Nucleic acid molecules encoding enzymes from wheat which are involved in starch synthesis
NZ336608A (en) 1997-02-21 2001-07-27 Danisco Method of inhibiting gene expression where the nucleotide codes for a Class A SBE intron in the antisense direction
NZ503137A (en) 1997-09-12 2000-10-27 Groupe Limagrain Pacific Pty L Sequence and promoters for starch branching enzyme I, starch branching enzyme II, soluble starch synthase I and starch debranching enzyme derived from Triticum tauschii to modulate gene expression
AU758890B2 (en) 1998-06-15 2003-04-03 National Starch And Chemical Investment Holding Corporation Improvements in or relating to plants and plant products
AU767103B2 (en) 1998-09-10 2003-10-30 Monsanto Uk Ltd Isoforms of starch branching enzyme II (SBE-IIA and SBE-IIB) from wheat
US6083547A (en) 1999-01-14 2000-07-04 Conagra, Inc. Method for obtaining a high beta-glucan barley fraction
AUPQ005299A0 (en) 1999-04-29 1999-05-27 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Novel genes encoding wheat starch synthases and uses therefor
CA2273673A1 (en) 1999-06-04 2000-12-04 Makoto Yamamori High amylose wheat starch and wheat containing the same
US6897354B1 (en) 1999-06-04 2005-05-24 National Institute Of Agrobiological Sciences High amylose wheat starch and wheat containing the same
US7041484B1 (en) 1999-10-29 2006-05-09 National Research Council Of Canada Starch branching enzymes
AU1122701A (en) 1999-10-29 2001-05-14 National Research Council Of Canada Starch branching enzymes
AUPQ574200A0 (en) 2000-02-21 2000-03-16 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Starch branching enzyme
GB2360521A (en) 2000-03-20 2001-09-26 Danisco Genetic modification of starch in plants
US20030035857A1 (en) 2001-03-22 2003-02-20 Sroka Pongpun Elisa Process for preparing wheat bread and dough mix for same
US7009092B1 (en) 2001-06-04 2006-03-07 Iowa State University Research Foundation Transgenic corn plants having seeds with modified cornstarch characteristics and method of making the transgenic corn plants
EP1483390B1 (en) 2001-06-12 2008-05-07 Bayer CropScience AG Transgenic plants synthesising high amylose starch
JP4308002B2 (ja) 2001-09-10 2009-08-05 独立行政法人科学技術振興機構 デンプン合成酵素類
AUPS219802A0 (en) 2002-05-09 2002-06-06 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Barley with altered branching enzyme activity and starch and starch containing products with a reduced amylopectin content
EP2290084A3 (en) 2003-06-30 2011-10-12 Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization Wheat with altered branching enzyme activity and starch and starch containing products derived therefrom
CN1875105B (zh) * 2003-06-30 2012-04-25 联邦科技产业研究组织 改变了分支酶活性的小麦和淀粉以及由此而获得的淀粉产品
KR101274849B1 (ko) 2003-10-27 2013-06-13 코몬웰스 싸이언티픽 엔드 인더스트리얼 리서치 오가니제이션 아밀로스 비율이 증가된 전분을 갖는 쌀 및 이의 생성물
WO2006069422A1 (en) 2004-12-30 2006-07-06 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Method and means for improving bowel health
US7993686B2 (en) 2004-12-30 2011-08-09 Commonwealth Scientific And Industrial Organisation Method and means for improving bowel health
PL1833291T3 (pl) 2004-12-30 2017-05-31 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Metoda i środki poprawy stanu zdrowia jelit
EA025360B1 (ru) 2007-11-27 2016-12-30 Коммонвелт Сайентифик Энд Индастриал Рисерч Органайзейшн Растения с модифицированным метаболизмом крахмала
MX2012001376A (es) 2009-07-30 2012-09-07 Commw Scient Ind Res Org Cebada y usos de la misma.
NZ610181A (en) 2010-11-04 2015-03-27 Arista Cereal Technologies Pty Ltd High amylose wheat
AU2012212404B2 (en) 2011-02-03 2016-05-12 The Healthy Grain Pty Limited Barley with modified SSIII
WO2013063653A1 (en) 2011-11-04 2013-05-10 Arista Cereal Technologies Pty Limited High amylose wheat - ii

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002037955A1 (en) * 2000-11-09 2002-05-16 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Barley with reduced ssii activity and starch containing products with a reduced amylopectin content
WO2010006373A1 (en) * 2008-07-17 2010-01-21 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation High fructan cereal plants

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CLARKE B. et al "Gene expression in a starch synthase IIa mutant of barley: changes in the level of gene transcription and grain composition", Functional Integrated genomics, 2008, vol. 8, pages 211-221 *
MORELL M. K. el al. "Barley sex6 mutants lack starch synthase IIa activity and contain a starch with novel properties", The Plant Journal, 2003, vol. 34, pages 173-185 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2771671C1 (ru) * 2021-12-17 2022-05-11 Дмитрий Актамович Кулушев Смесь для выпечки оладий

Also Published As

Publication number Publication date
US20120129805A1 (en) 2012-05-24
NZ597971A (en) 2013-09-27
ZA201200766B (en) 2013-05-29
AU2010278678B2 (en) 2013-07-11
KR20120079057A (ko) 2012-07-11
EP2458974A4 (en) 2013-04-03
CN102933072A (zh) 2013-02-13
US20210289730A1 (en) 2021-09-23
MX2012001376A (es) 2012-09-07
EP2458974A1 (en) 2012-06-06
WO2011011833A1 (en) 2011-02-03
BR112012002114A2 (pt) 2015-09-15
AU2010278678B9 (en) 2013-08-29
EA201270200A1 (ru) 2012-08-30
MY159360A (en) 2016-12-30
SG178164A1 (en) 2012-03-29
US11026384B2 (en) 2021-06-08
CA2769311C (en) 2021-06-01
CN102933072B (zh) 2016-09-21
US20190150385A1 (en) 2019-05-23
JP2013500022A (ja) 2013-01-07
UA116969C2 (uk) 2018-06-11
US10154632B2 (en) 2018-12-18
KR101806299B1 (ko) 2017-12-07
JP5982282B2 (ja) 2016-08-31
AU2010278678A1 (en) 2012-03-22
CA2769311A1 (en) 2011-02-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA032207B1 (ru) Ячмень и его применение
US20220162627A1 (en) High fructan cereal plants
AU2011325875B2 (en) High amylose wheat
AU2012327161A1 (en) High amylose wheat - II
CA2920310A1 (en) Wheat having high levels of beta-glucan
KR20180109859A (ko) 두꺼워진 호분을 갖는 벼 낟알
JP2018516601A (ja) グルテン減少穀粒及びその組成物
US20220403408A1 (en) Puccinia resistance gene
US20220042034A1 (en) Rust Resistance Gene
US10308949B2 (en) Methods of controlling fructan synthesis in plants
UA119742C2 (uk) РОСЛИНА ПШЕНИЦІ З НОВИМИ АЛЕЛЯМИ Rht-B1
US20240349677A1 (en) Wheat with reduced susceptibility to late-maturity alpha-amylase

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KZ KG MD TJ TM