CN105238788A - 一种玉米淀粉合成酶SSⅡa启动子及其制备表达载体的构建方法 - Google Patents

一种玉米淀粉合成酶SSⅡa启动子及其制备表达载体的构建方法 Download PDF

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陈展宇
张治安
崔喜艳
王阔
李大勇
刘秀明
王欢
刘相国
赵春莉
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Abstract

本发明公开了一种玉米淀粉合成酶SSIIa启动子及其制备表达载体的构建方法，该启动子是以玉米B73基因组DNA为模板，以5’-TGTCAGACTGGTTAGTGGAGC-3’；5’-AGAAGGTGGAGGAAGAGGACG-3’为引物，通过PCR方法扩增获得的一种含有碱基序列为2526bp玉米SSIIa基因序列。本发明为玉米SSII基因启动子序列研究提供理论依据；为组织特异性启动子的开发和应用，为用基因工程手段提高玉米淀粉含量，改良淀粉品质提供了候选胚乳特异性启动子；为明晰整个淀粉合成网络的调控提供理论依据。

Description

一种玉米淀粉合成酶SSⅡa启动子及其制备表达载体的构建方法
技术领域
本发明涉及生物化学与分子生物学，具体涉及一种玉米淀粉合成酶SSIIa启动子及其制备表达载体的构建方法。
背景技术
随着美国等国家快速增长的染料乙醇用玉米，其玉米出口也将大幅下降，必然影响国际粮食价格和供需平衡状态，如不及时改变国内玉米生产现状，我国玉米相关产业的发展必然出现巨大的压力和阻力，甚至影响到粮食安全；因此利用先进的科技创新技术提高玉米产量或生产多用途玉米已成为当务之急，转基因技术是目前各国争相发展的高新技术，利用转基因技术改良玉米性状，增强玉米品质不但能够简化玉米生产技术甚至能够提高玉米总产量，美国转基因玉米面积已经从2000年的25％增加到88％，而且随着技术的完善，种植面积进一步增加，其抗虫，抗除草剂复合性状玉米的大量种植使其玉米种植成本降低，效益不断提高，因此使用优良的玉米种质，配合先进的种植及管理等高新技术是我国玉米产业发展的必然方向。
世界淀粉的80％来源于玉米，而我国淀粉90％以来源于玉米，玉米淀粉的生产在整个玉米产业中占有非常重要的地位，近年来由于淀粉在化工、医药、纺织、造纸和建筑等领域的应用，使得相关产业对淀粉结构的要求也有所增加，所以加强高淀粉的玉米品种和高直链淀粉玉米种质的研究具有显著的社会效益和经济效益。
三、现有技术的缺点是什么？针对本发明的缺点，说明本发明的目的。
植物基因工程研究的主要内容是基因的表达和调控，但外源基因表达量不足是不能获得理想转基因植物的重要原因。启动子在决定基因表达方面起着关键作用，因此选择合适的植物启动子是增强外源基因表达的首要问题。
组成型启动子在转基因植物应用中暴露出一些问题，如：外源基因在整株植物中表达，产生大量异源蛋白质或代谢产物在植物体内积累，打破了植物原有的代谢平衡；有些产物对植物并非必需甚至有毒，因而阻碍了植物的正常生长，甚至导致死亡。因此，人们必需寻找特异性启动子代替组成型启动子，以更好地调控外源基因表达。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种玉米淀粉合成酶SSIIa启动子及其制备表达载体的构建方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种玉米淀粉合成酶SSIIa启动子，它是以玉米B73基因组DNA为模板，以
5’-TGTCAGACTGGTTAGTGGAGC-3’
5’-AGAAGGTGGAGGAAGAGGACG-3’
为引物，通过PCR方法扩增获得的一种含有碱基序列为2526bp玉米SSIIa基因序列，其序列如SEQIDNo.1所示。
本发明还提供了上述玉米淀粉合成酶SSIIa启动子的植物表达载体的构建方法，包括如下步骤：
选取玉米淀粉合成酶SSIIa启动予1407bp片段(P1407)(其中含胚乳特异性表达等顺式作用元件)，利用EcoRI，BglII两个限制性酶切位点将其替换到pCAMBIA-3301植物表达载体的CaMV35S启动子处，即得玉米淀粉合成酶SSIIa启动子的植物表达载体。
本发明具有以下有益效果：
针对SSIIa启动子进行克隆及功能研究，明确此启动子部分功能和驱动活性，为玉米SSII基因启动子序列研究提供理论依据；为组织特异性启动子的开发和应用，为用基因工程手段提高玉米淀粉含量，改良淀粉品质提供了候选胚乳特异性启动子；为明晰整个淀粉合成网络的调控提供理论依据。
附图说明
图1为SSIIa启动子扩增电泳结果图，
图中，M：DL2000DNAMarker；泳道1、2、3：SSIIa启动子PCR产物。
图2为P1407片段扩增电泳结果图，
图中，M：DL2000DNAMarker1：启动子P1407片段。
图3为pCAMBIA3301-P1407双酶切验证电泳结果图，
图中，M：DL2000DNAMarker1：10487bp片段为酶切后pCAMBIA3301，1407bp片段为启动子P1407。
具体实施方式
为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供了一种玉米淀粉合成酶SSIIa启动子，它是以玉米B73基因组DNA为模板，以
5’-TGTCAGACTGGTTAGTGGAGC-3’
5’-AGAAGGTGGAGGAAGAGGACG-3’
为引物，通过PCR方法扩增获得的一种含有碱基序列为2526bp(图1)玉米SSIIa基因序列，其序列如SEQIDNo.1所示。
本发明还提供了上述玉米淀粉合成酶SSIIa启动子的植物表达载体的构建方法，包括如下步骤：
选取玉米淀粉合成酶SSIIa启动子1407bp片段(P1407图2)(其中含胚乳特异性表达等顺式作用元件)，利用EcoRI，BglII两个限制性酶切位点将其替换到pCAMBIA-3301植物表达载体的CaMV35S启动子处，即得玉米淀粉合成酶SSIIa启动子的植物表达载体。
本具体实施采用常规PCR方法克隆2526bp玉米SSIIa基因序列，通过PlantCare软件对其进行分析，发现其除具有典型启动子基本顺式作用元件之外，还含有胚乳特异性表达功能元件，抗旱诱导结合位点，光诱导相关元件等胁迫诱导顺式作用元件(表1)。
表1PzmSSIIa启动子区顺式作用元件
以双元载体pCAMBIA3301为载体，构建以SSIIa启动子1407bp片段(P1407)为驱动启动子，以GUS基因为报告基因，以抗除草剂为筛选标记的植物表达载体，命名为pCAMBIA3301-P1407(图3)。
将2526bp玉米SSIIa基因序列经Plantcare软件分析发现，PzmSSIIa序列含有重要的顺式作用元件，其中包括TATA-box，CAAT-box等元件。该序列存在近9个TATA-box，离SSIIa基因ATG最近的为处于1979bp处的TATA-box，根据核心启动子结构特点，转录起始位点为位于TATA-box下游20-30bp处的“A”碱基，且转录起始位点处序列通常为PyPyAPyPy(Py为嘧啶碱基)，据此推测序列中2007bp处“CCATT”为转录起始位点；CAAT-box为1672bp处的CAAT。
除此之外，分析还发现了众多重要的功能元件和结合位点，如表1所示：如①MBS：MYB结合位点，能够响应水分，盐，低温等逆境胁迫；②Skn-1_motif和GCN4_motif：胚乳表达所需的顺式作用元件；③motifllb：参与脱落酸响应的功能元件；④02-site：参与玉米醇溶蛋白代谢调控的功能元件和其他相关元件(表中均已列出)。这些功能元件的存在，说明玉米SSIIa基因能够受到多种生物及非生物胁迫的诱导及影响，而且拥有胚乳特异性表达的功能元件，针对SSIIa启动子进行克隆及功能研究，明确此启动子部分功能和驱动活性，为玉米SSII基因启动子序列研究提供理论依据；为组织特异性启动子的开发和应用，为用基因工程手段提高玉米淀粉含量，改良淀粉品质提供候选胚乳特异性启动子；为明晰整个淀粉合成网络的调控提供理论依据。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种玉米淀粉合成酶SSIIa启动子，其特征在于，它是以玉米B73基因组DNA为模板，以
5’-TGTCAGACTGGTTAGTGGAGC-3’
5’-AGAAGGTGGAGGAAGAGGACG-3’
为引物，通过PCR方法扩增获得的一种含有碱基序列为2526bp玉米SSIIa基因序列。
2.一种玉米淀粉合成酶SSIIa启动子，其特征在于，其序列如SEQIDNo.1所示。
3.一种玉米淀粉合成酶SSIIa启动子的植物表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
选取玉米淀粉合成酶SSIIa启动子1407bp片段(P1407)，利用EcoRI，Bg/II两个限制性酶切位点将其替换到pCAMBIA-3301植物表达载体的CaMV35S启动子处，即得玉米淀粉合成酶SSIIa启动子的植物表达载体。
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