CN104928318B - 水稻OsLEA5c‑1基因在培育抗重金属水稻品种中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了水稻OsLEA5c‑1基因在培育抗重金属水稻品种中的应用，其中水稻OsLEA5c‑1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，还公开了含有水稻OsLEA5c‑1基因的植物表达载体和微生物转化体在培育抗重金属水稻品种中的应用；将水稻OsLEA5c‑1基因转化水稻获得的转基因阳性植株的抗重金属能力较非转基因水稻植株明显增强，说明水稻OsLEA5c‑1基因可以用于抗重金属水稻品种培育，在提高水稻抗重金属、促进水稻稳产、高产方面具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及水稻OsLEA5c-1基因在培育抗重金属水稻品种中的应用。
背景技术
水稻是人类主要粮食作物之一，全世界约有二分之一以上的人食用水稻，有三分之一以上的人口以水稻为主食。在全世界粮食短缺的今天，生产出足够的稻米对于维持足够的粮食来说十分重要，如果水稻减产，可能导致饥饿、死亡和社会不稳定。中国人口众多，是大米生产和消费大国，水稻在国民经济中占有举足轻重的地位。但是，在水稻生产中，干旱、洪涝、低温、高温、病虫害等逆境因子影响水稻品质、降低水稻产量，造成了巨大的经济损失。提高水稻的抗逆性、增加水稻产量、改善水稻品质对于保障库区人们的生活、提高人们的经济收入有着重要的意义。
虽然传统的植物育种在改良农作物(如质量性状)的过程中做出了巨大的贡献，但常规育种在筛选优良品种时难度大、耗时长，已经不能满足水稻生产的需要。近年来，随着基因工程的迅速发展和转基因技术的日益完善，基因工程育种已成为育种领域的一个重要分支，在定向改良水稻特性方面也显示出极大的潜力。利用分子生物学手段，克隆水稻抗逆关键基因，在研究基因功能的基础上，将基因导入目标水稻品种，定向改良该品种抗逆性，将是水稻品种改良的一种有效手段，这对提高水稻的抗逆性、增加水稻产量、改善水稻品质、保障人们的生活、提高人们的经济收入有着重要的意义。
水稻OsLEA5c-1基因的核苷酸序列已有文献报道，但迄今为止，还未见利用该基因在培育抗重金属水稻品种的相关报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供水稻OsLEA5c-1基因在培育抗重金属水稻品种中的应用；本发明的目的之二在于提供含有水稻OsLEA5c-1基因的植物表达载体在培育抗重金属水稻品种中的应用；本发明的目的之三在于提供含有水稻OsLEA5c-1基因的微生物转化体在培育抗重金属水稻品种中的应用。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
1、水稻OsLEA5c-1基因在培育抗重金属水稻品种中的应用，所述水稻OsLEA5c-1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
优选的，所述水稻品种为水稻中花11号。
2、含有水稻OsLEA5c-1基因的植物表达载体在培育抗重金属水稻品种中的应用，所述水稻OsLEA5c-1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
优选的，所述水稻品种为水稻中花11号。
优选的，所述含有水稻OsLEA5c-1基因的植物表达载体包括水稻OsLEA5c-1基因表达单元，所述水稻OsLEA5c-1基因表达单元由启动子、水稻OsLEA5c-1基因和终止子。
优选的，所述含有水稻OsLEA5c-1基因的植物表达载体是由水稻OsLEA5c-1基因替换pCAMBIA1301载体上GUS基因读码框而得。
更优选的，所述含有水稻OsLEA5c-1基因的植物表达载体由以下方法制备：
a.克隆水稻OsLEA5c-1基因：以水稻总RNA为模板，反转获得cDNA第一链，然后以cDNA第一链为模板，SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示核苷酸序列为引物，进行PCR扩增，获得带酶切位点的水稻OsLEA5c-1基因；
b.植物表达载体的构建：将步骤a扩增获得的带酶切位点的水稻OsLEA5c-1基因分别用NcoI和BstEII双酶切，同时用NcoI和BstEII双酶切pCAMBIA1301载体，然后将酶切后的水稻OsLEA5c-1基因与pCAMBIA1301载体骨架连接，得含有水稻OsLEA5c-1基因的植物表达载体。
3、含有水稻OsLEA5c-1基因的微生物转化体在培育抗重金属水稻品种中的应用，所述水稻OsLEA5c-1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
优选的，所述水稻品种为水稻中花11号。
优选的，所述微生物为农杆菌，更优选为根癌农杆菌AGL0。
本发明的有益效果在于：本发明首次发现水稻OsLEA5c-1基因具有抗重金属的功能，因此根据水稻OsLEA5c-1基因的序列特点，选取水稻OsLEA5c-1基因的读码框片段，构建了水稻OsLEA5c-1基因的植物表达载体，通过农杆菌介导将水稻OsLEA5c-1基因的植物表达载体转入中花11号中，获得了转基因水稻阳性植株，检测结果显示，转基因水稻阳性植株中OsLEA5c-1基因的表达较非转基因水稻植株显著增加，转基因水稻阳性植株对CuSO4、HgCl2和K2Cr2O7的抗性显著增加，说明该植物表达载体可用于抗重金属植物的育种，在提高植物抗重金属能力、修复重金属污染土壤方面具有良好的应用前景。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图和附表：
图1为OsLEA5c-1基因读码框片段PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中M为DNA分子量标准，1为OsLEA5c-1基因PCR扩增产物。
图2为超表达双元载体pCAMBIA1301-OsLEA5c-1的PCR鉴定图，其中M为DNA分子量标准，1为以超表达双元载体pCAMBIA1301-OsLEA5c-1为模板获得的PCR扩增产物。
图3为超表达双元载体pCAMBIA1301-OsLEA5c-1的酶切鉴定图，其中M为DNA分子量标准，1为超表达双元载体pCAMBIA1301-OsLEA5c-1的酶切产物。
图4为OsLEA5c-1基因植物表达载体pCAMBIA1301-OsLEA5c-1的结构图(LB：左边界、RB：右边界；T35S：35S终止子；HPT：潮霉素磷酸转移酶基因；Pnos：胭脂碱合成酶启动子；MCS：多克隆酶切位点；P35S：35S启动子；OsLEA5c-1：水稻OsLEA5c-1基因；Tnos：终止子)。
图5为转基因阳性植株与非转基因植株基因组DNA PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中M为DNA分子量标准，L1、L2和L3分别为不同株系的转基因阳性植株，NT为非转基因植株。
图6为转基因阳性植株与非转基因植株的定量RT-PCR图，其中NT为非转基因植株，L1、L2和L3分别为不同株系的转基因阳性植株。
图7为CuSO4、HgCl2和K2Cr2O7处理后的水稻幼苗图，其中NT为非转基因植株，L1、L2和L3分别为不同株系的转基因阳性植株。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
优选实施例中使用的水稻品系为中花11号(Oryza sativa cv.Zhonghua 11)，质粒pCAMBIA1301(携带CaMV35S启动子和终止子)和大肠杆菌DH5α由本实验室保存。TaKaRaRNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0试剂盒、限制性内切酶、Taq DNA合成酶等为大连TaKaRa公司产品。超薄/普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(离心柱型)为TIANGEN公司产品。其余试剂均为进口或国产分析纯试剂。
实施例1、水稻OsLEA5c-1基因读码框片段的克隆
根据GenBank中查找到的OsLEA5c-1基因候选序列(CT829063)，用序列处理在线工具包(SMS)生物软件网http://www.bio-soft.net/sms查找其最大开放阅读框序列，采用Primer Premier 5.0软件设计引物OsLEA5c-f：5’-catgccatggtaatggcgcagctggtgg-3’(SEQ ID No.1，下划线部分为NcoI酶切位点)和OsLEA5c-r：5’-cccggtcaccttagaagacgtcggagaggg-3’(SEQ ID No.2，下划线部分为BstEII酶切位点)。
取不同中花11号水稻幼苗，提取总RNA，然后将提取的总RNA根据TaKaRa RNA PCRKit(AMV)Ver.3.0试剂盒说明书进行cDNA第一链的合成，再以该cDNA第一链为模板，利用引物OsLEA5c-f和OsLEA5c-r扩增OsLEA5c-1基因的读码框序列。PCR扩增体系组成为：ddH2O34μL、10×PCR Buffer 5μL、MgCl25μL、dNTP(20μM)2μL、上下游引物各1μL、模板1.0μL、TaqDNA合成酶1μL，共50μL。序列扩增条件为94℃预变性2min；94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸1min，循环35次；最后72℃后延伸10min。PCR扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图1所示，PCR扩增出一条大小为478bp的DNA片段。
PCR扩增产物采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收纯化，按照试剂盒说明书操作。
实施例2、水稻OsLEA5c-1基因植物表达载体的构建
用NcoI和BstEII双酶切纯化的PCR扩增产物，得到OsLEA5c-1基因的开放读码框片段，再与经同样双酶切的载体pCAMBIA1301骨架连接，获得植物超表达双元载体pCAMBIA1301-OsLEA5c-1。将构建的超表达双元载体pCAMBIA1301-OsLEA5c-1用引物OsLEA5c-f和OsLEA5c-r扩增进行PCR鉴定，结果如图2所示。结果显示，超表达双元载体pCAMBIA1301-OsLEA5c-1用引物OsLEA5c-f和OsLEA5c-r扩增获得了长478bp的DNA片段，与OsLEA5c-1基因的开放读码框片段大小一致。同时，将构建的超表达双元载体pCAMBIA1301-OsLEA5c-1用NcoI和BstEII进行双酶切鉴定，结果如图3所示。结果显示，超表达双元载体pCAMBIA1301-OsLEA5c-1的酶切后产物长分别为9771bp和456bp，分别与载体pCAMBIA1301骨架片段和水稻OsLEA5c-1基因的开放读码框片段大小一致，表明水稻OsLEA5c-1基因成功连接于pCAMBIA1301骨架上，OsLEA5c-1基因植物表达载体pCAMBIA1301-OsLEA5c-1的结构如图4所示。然后将阳性重组子委托英潍捷基(上海)贸易有限公司进行测序验证，结果显示，构建的植物超表达双元载体pCAMBIA1301-OsLEA5c-1序列正确，其开放读码框序列如SEQ ID No.3所示。
实施例3、水稻OsLEA5c-1基因农杆菌工程菌株的制备
将超表达双元载体pCAMBIA1301-OsLEA5c-1采用液氮冷激法转化根癌农杆菌AGL0感受态细胞，涂布于YEB固体培养基(含有1.5％(w/w)的琼脂、50mg/L的卡那霉素(Kan)、500mg/L的链霉素(Sm)和50mg/L的利福平(Rif))，pH 7.0)上，在28±2℃、黑暗条件下培养2天，挑取单菌落，用YEB液体培养基(含有50mg/L的Kan、500mg/L的Sm和50mg/L的Rif，pH7.0)培养2天，取菌液进行PCR鉴定，阳性重组子即为水稻OsLEA5c-1基因农杆菌工程菌株，-80℃冻存保存，备用。
实施例4、农杆菌介导的水稻OsLEA5c-1基因植物表达载体转化水稻与鉴定
将剥去外壳的中花11种子在NBD2愈伤诱导培养基(表1)上，待长出愈伤后，选取呈球形，颜色亮黄的愈伤组织转入NBD2愈伤继代培养基上继代培养。一次继代时间为20d左右。继代两次后选取紧实、呈球形或片状、颜色亮黄、直径为10μm左右大小的愈伤浸入上述OsLEA5c-1基因农杆菌工程菌株的AAM悬液(表2)中共培养。转化植株的再生和培养按文献方法进行(Hu TZ.OsLEA3,a Late embryogenesis abundant protein gene from rice,confers tolerance to water deficit and salt stress to transgenic rice.Russ JPlant Physiol.2008,55:530-537)。
表1. NBD2培养基配方
注：一升培养基中加蔗糖30g，琼脂6-7g，pH为5.8，115℃高压灭菌20min，冷却到45℃-55℃后在超净工作台中倒瓶。
表2. AAm培养基配方
注：如果配制100mL AAm悬浮培养基，则需另加入肌醇0.01g、酸水解络蛋白0.05g、蔗糖6.85g、葡萄糖3.6g。pH为5.2，115℃，高压灭菌20min，冷却到45℃-55℃，再加入10×AA氨基酸10mL+AS100μL。
PCR检测转基因水稻中潮霉素磷酸转移酶基因(HPT)的存在：分别取不同株系的转基因水稻植株及非转基因水稻植株，提取基因组DNA，然后以所得基因组DNA为模板，以HPT-f(SEQ ID No.4)和HPT-r(SEQ ID No.5)为特异引物进行PCR检测，筛选转基因阳性植株。PCR扩增体系如前所述。PCR扩增循环参数为：94℃预变性2min；然后94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，共35个循环；最后72℃终延伸10min。PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图5所示。结果显示不同株系转基因阳性植株的PCR扩增产物都在1026bp的特异电泳条带，而非转基因植株的PCR扩增产物在相应位置没有出现电泳条带，表明转基因阳性植株中水稻OsLEA5c-1基因成功整合入水稻植株中。
定量RT-PCR检测水稻OsLEA5c-1基因在转基因植株中的表达：分别取不同株系的转基因水稻植株及非转基因水稻幼苗，提取总RNA，以水稻幼苗的RNA为模板，根据TaKaRaRNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0试剂盒说明书进行合成cDNA第一链。再以合成的cDNA第一链为模板，以水稻OsLEA5c-1基因的特异性引物OsLEA5c-qf(SEQ ID No.6)和OsLEA5c-qr(SEQID No.7)为扩增引物，并以OsEF1α基因为内参基因，OsEF1α基因特异性引物OsEF1α-f(SEQID No.8)和OsEF1α-r(SEQ ID No.9所示)进行定量RT-PCR检测。定量RT-PCR反应体系包括：ddH2O 3.0μL、SYBR 5μL、引物(OsLEA5c-qf、OsLEA5c-qr、OsEF1α-f、OsEF1α-r)各0.5μL、模板1.0μL、Taq DNA合成酶1μL，共50μL；反应条件为95℃预变性30s；95℃变性5ms、58℃退火延伸30s，循环39次；65℃3ms，95℃10s。PCR扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图6所示。结果显示，不同转基株系的OsEF1α基因表达明显高于非转基因水稻。
实施例5、转基因阳性植株与非转基因植株对重金属的抗性比较
分别将转基因阳性植株株系L1、L2、L3号和非转基因水稻植株分别置于含1mMCuSO4、1mM HgCl2和1mM K2Cr2O7的MS培养液中培养，观察植株的状态，结果如图7所示。结果发现非转基因水稻植株受到的损伤较转基因水稻严重，说明转基因阳性植株对重金属的抗性较非转基因植株更强。因此，水稻OsLEA5c-1基因能够用于培育抗重金属水稻品种。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.水稻OsLEA5c-1基因在培育抗重金属水稻品种中的应用，其特征在于：所述水稻OsLEA5c-1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述重金属为铜、汞或铬。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述水稻品种为水稻中花11号。
3.含有水稻OsLEA5c-1基因的植物表达载体在培育抗重金属水稻品种中的应用，其特征在于：所述水稻OsLEA5c-1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述重金属为铜、汞或铬。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述水稻品种为水稻中花11号。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于：所述含有水稻OsLEA5c-1基因的植物表达载体包括水稻OsLEA5c-1基因表达单元，所述水稻OsLEA5c-1基因表达单元由启动子、水稻OsLEA5c-1基因和终止子组成。
6.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于：所述含有水稻OsLEA5c-1基因的植物表达载体是由水稻OsLEA5c-1基因替换pCAMBIA1301载体上GUS基因读码框而得。
7.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于：所述含有水稻OsLEA5c-1基因的植物表达载体由以下方法制备：
a.克隆水稻OsLEA5c-1基因：以水稻总RNA为模板，反转获得cDNA第一链，然后以cDNA第一链为模板，SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示核苷酸序列为引物，进行PCR扩增，获得带酶切位点的水稻OsLEA5c-1基因；
b. 植物表达载体的构建：将步骤a扩增获得的带酶切位点的水稻OsLEA5c-1基因分别用NcoI和BstEII双酶切，同时用NcoI和BstEII双酶切pCAMBIA1301载体，然后将酶切后的水稻OsLEA5c-1基因与pCAMBIA1301载体骨架连接，得含有水稻OsLEA5c-1基因的植物表达载体。
8.含有水稻OsLEA5c-1基因的微生物转化体在培育抗重金属水稻品种中的应用，其特征在于：所述水稻OsLEA5c-1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述重金属为铜、汞或铬。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述水稻品种为水稻中花11号。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述微生物为农杆菌。
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