CN105755022A - 一种水稻耐镉基因OsGSTU5及其编码蛋白与应用 - Google Patents

一种水稻耐镉基因OsGSTU5及其编码蛋白与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105755022A
CN105755022A CN201610249074.8A CN201610249074A CN105755022A CN 105755022 A CN105755022 A CN 105755022A CN 201610249074 A CN201610249074 A CN 201610249074A CN 105755022 A CN105755022 A CN 105755022A
Authority
CN
China
Prior art keywords
osgstu5
cadmium
resistance
oryza sativa
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610249074.8A
Other languages
English (en)
Inventor
秦瑞英
杨剑波
杨亚春
魏鹏程
李�浩
李娟�
李莉
许蓉芳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Rice Research Institute of Anhui Academy of Agricultural Sciences
Anhui Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Rice Research Institute of Anhui Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rice Research Institute of Anhui Academy of Agricultural Sciences filed Critical Rice Research Institute of Anhui Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN201610249074.8A priority Critical patent/CN105755022A/zh
Publication of CN105755022A publication Critical patent/CN105755022A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
    • C12N9/1088—Glutathione transferase (2.5.1.18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y205/00—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5)
    • C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
    • C12Y205/01018—Glutathione transferase (2.5.1.18)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明公开了一种水稻耐镉基因OsGSTU5及其编码蛋白与应用。本发明的水稻耐镉基因OsGSTU5包含序列表中SEQ ID NO:1中所示序列或其衍生物。本发明的水稻耐镉基因OsGSTU5编码的蛋白质氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。水稻耐镉基因OsGSTU5编码表达蛋白质谷胱甘肽S?转移酶(glutathione S?transferase,GSTs)，催化谷胱甘肽(glutathione,GSH)与镉螯合，促进镉的代谢隔离，从而提高植物耐镉能力。此外，本发明通过构建OsGSTU5基因的水稻过表达株系，提高水稻植株对镉胁迫的耐受能力。通过水稻耐镉基因OsGSTU5的生理特性及调控机制研究，为镉胁迫下植物的生理功能及调控机理研究提供了基因资源和理论依据，同时为GSTs蛋白超级家族的功能研究提供基因资源。

Description

一种水稻耐镉基因OsGSTU5及其编码蛋白与应用
技术领域
本发明涉及生物技术和作物基因工程技术领域。具体地，本发明涉及一种水稻耐镉基因OsGSTU5及其编码蛋白与应用。
背景技术
镉(Cd)是一种重金属元素，是植物生长和发育的非必需元素，工业污染造成农田土壤中镉含量严重超标。土壤镉污染严重影响植物的正常生长发育，造成作物减产。镉在作物植株中富集还会经过食物链进入人和动物体内，进而危害人和动物的健康。水稻是我国最重要的农作物之一，水稻生产面积约占农作物种植面积的40％，水稻较其他农作物对镉有一定的耐受性，很容易吸收和富集镉，在不影响水稻的正常生长下，水稻体内镉含量已较高，水稻的镉污染具有很强的隐蔽性和危险性。因此，探明水稻对镉吸收、耐受、解毒的分子机理，对于有效利用土地资源，降低环境毒害，以及选育镉低积累作物新品种具有深远意义。
水稻遭受镉胁迫，会启动一系列防御机制。其中谷胱甘肽-S-转移酶(glutathioneS-transferase，GSTs)家族蛋白发挥重要的作用。它主要通过催化谷胱甘肽(GSH)和重金属结合形成复合物然后转运至液泡或细胞膜来解除镉对水稻的毒害。GSTs家族蛋白是个超级家族，广泛存在于胞液中，但是研究表明一个GST蛋白的功能不能依据该蛋白与家族其他成员的序列相似性而推导得知，这些GSTs家族蛋白功能呈现多样化。因此，人们并不知道每一种GST都具有什么样的性状或功能。例如，OsGSTU3和OsGSTU4，在水稻遭遇重金属、低氧和盐胁迫时在水稻根部诱导表达的(Moonsetal.，2003)。OsGSTU17在CDNB、过氧化氢和阿特拉津等非生物胁迫下表达量显著变化，其mRNA通过多种不同的机制在水稻的多组织中表达(Fukudaetal.，2004)。OsGSTU3和OsGSTU4的酵母体内试验表明其更耐铬(Ankitaetal.，2014)。基因OsGSTU5的功能至今仍未揭示。
发明内容
本发明的发明人发现并验证了一条耐镉基因的特性。本发明对基因OsGSTU5展开研究证实其受镉胁迫诱导，在水稻根、茎、叶均有强表达，通过进一步研究证明其具有对镉毒害耐受的特性。深入研究基因OsGSTU5为进一步解析基因OsGSTU5对镉耐受性的调控机理，为GSTs基因的应用提供基因资源和理论依据。
具体而言，本发明提供一种水稻耐镉基因OsGSTU5，其特征在于，所述水稻耐镉基因OsGSTU5的核苷酸序列包含：序列表中SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；或者在序列表中SEQIDNO:1所示的核苷酸序列中添加、取代、缺失一个或多个核苷酸后所获得的具有同等或更高耐镉性能的核苷酸序列；或者在严谨条件下与序列表中SEQIDNO:1所示的核苷酸序列杂交所获得的具有同等或更高耐镉性能的核甘酸序列；或者与序列表中SEQIDNO:1所示的核苷酸序列具有90％以上同源性且编码相同蛋白质并具有同等或更高耐镉性能的核苷酸序列。
该水稻耐镉基因OsGSTU5来源于水稻品种日本晴(OryzasativaLcv.Nipponbare)。
本发明还提供一种水稻耐镉蛋白OsGSTU5，其由水稻耐镉基因OsGSTU5编码表达，其特征在于，水稻耐镉蛋白GSTs的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO:2所示或者为序列表中SEQIDNO:2经取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基后与序列表中SEQIDNO:2限定的蛋白质具有相同功能的序列。需要说明的是，上面的表述中，根据生物科学语言的表述规则，大写斜体的英语名称OsGSTU5表示为基因；而大写正体的英语名称OsGSTU5则表示为蛋白。
本发明还提供一种表达盒，其特征在于，所述表达盒包含上述基因OsGSTU5或其片段。
本发明还提供一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有上述表达盒。所述载体包括：酵母表达载体pART1、作物过表达载体pCAMBIA1300。
本发明还利用上述基因或其片段获得了相应的宿主细胞，所述宿主细胞含有上述的基因或其片段，或者上述表达盒，或者上述的任一载体。所述的宿主细胞，选自大肠杆菌细胞、酵母细胞、农杆菌细胞或植物细胞。
本发明提供一种培育耐镉植物的方法，其特征在于，所述方法包括：利用上述的水稻耐镉基因OsGSTU5的过表达载体转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。
所述方法中，所述转化通过农杆菌介导法进行。所述植物为双子叶或单子叶作物，优选为禾本科作物，更优选为水稻。
此外，本发明构建基因OsGSTU5的酵母表达载体，转化酵母细胞。在镉胁迫下，酵母体内试验证明OsGSTU5具有耐镉特性。
在构建基因OsGSTU5的过表达载体中，所用过表达载体为pCAMBIA1300(市售的公开使用载体)，为植物双元表达载体。不过需要说明的是，该载体经过本发明的发明人改造，利用玉米Ubiquitin基因启动子驱动目标基因表达，其在水稻中转录活性更强。构建成功的基因OsGSTU5过表达载体，用来转化根癌农杆菌，通过水稻遗传转化培育过表达株系。
再一方面，本发明对基因OsGSTU5的1个位点(ko)构建了靶向敲除载体pHUN411-GSTU5ko，转入根癌农杆菌，通过水稻遗传转化成功获得无义突变植株。获得基因OsGSTU5的敲除株系。
最后，镉胁迫下的种子萌发试验结果显示，在非镉胁迫下野生型、基因OsGSTU5敲除系和过表达株系均能正常发芽生长；而在100μM浓度Cd2+胁迫下进行发芽试验，10天后观察发现相比于野生型植株，基因OsGSTU5敲除株系萌发和生长受到严重抑制；基因OsGSTU5的过表达株系发芽生长优于野生型，说明基因OsGSTU5在耐镉机制中具有重要作用。
本发明所提供的水稻耐镉基因OsGSTU5表达GSTs蛋白，催化GSH参与镉的代谢、区域化隔离及清除。用于提高植物的耐镉能力，降低镉对植物的损害，减少镉在植物体内的富集，避免其通过食物链危害人类健康。同时为GSTs蛋白超级家族的功能研究提供基因资源。
因此，本发明筛选出参与镉胁迫的GSTU基因，对其生理特性及调控机制进行研究，弥补了水稻重金属螯合机制研究的不足，更有利于系统阐述GSTU在水稻耐镉上的作用机制。不仅为GSTU基因的应用提供基因资源和理论依据，还增加了水稻耐镉方式的多样性，加深人们对GSH缓解镉毒害的作用机制的认识，推动以生物方法修复镉污染源进程。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1A为非镉胁迫下酵母长势图，图中显示空载体及基因OsGSTU5的酵母长势一致；B为在50μMCdCl2胁迫下酵母长势图，图中显示对照空载体酵母生长受到严重抑制，而表达OsGSTU5的酵母仍然可以部分生长。图2为基因OsGSTU5过表达载体酶切验证图。
图3为基因OsGSTU5过表达载体示意图。
图4为基因OsGSTU5过表达T2代植株中OsGSTU5相对表达量。
图5为部分敲除系转基因植株PCR检测结果图。
图6为T0代单拷贝敲除系植株中OsGSTU5靶向突变。针对两个不同位点构建的转基因株系在不同位点上均表现为突变。下划线“＿”标记为靶向位点；浅色标示NGG结构；短线“-”标示碱基缺失；圆圈“○”标示插入或替换碱基；右侧标记表示突变情况，i为碱基插入，d缺失，s替换，其后数字表示突变碱基数目和出现次形式。
图7为野生型、基因OsGSTU5的敲除系和过表达系在镉胁迫下的种子萌发试验结果。在非镉胁迫下野生型、OsGSTU5敲除系和过表达株系均能正常发芽生长；而在100μM浓度Cd2+胁迫下进行发芽试验，10天后观察发现相比于野生型植株，OsGSTU5敲除株系萌发和生长受到严重抑制；OsGSTU5的过表达系发芽生长优于野生型。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的生化试剂，载体耗材等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
实施例1基因OsGSTU5的酵母体内耐镉分析
步骤1、引物的设计
根据NCBI中提供的水稻品种日本晴(OryzasativaLcv.Nipponbare)全基因组序列，依据水稻基因OsGSTU5的编码区(CDS)序列设计扩增引物，并在引物上加上酶切位点。
具体设计的引物为：正向引物(SEQIDNO:3)5’端带NcoI，酶切位点(CCATGG)，反向引物(SEQIDNO:4)5’端带BamHI，酶切位点(GGATCC)，引物序列如下：
正向引物：CCATGGATGGCGGACGAGGTGGTGCTCCNcoI
反向引物：GGATCCCTTGGCGCCAAACTTGGCCTTGBamHI
步骤2基因OsGSTU5的获得
以水稻cDNA为模板，利用上述正向引物、反向引物扩增OsGSTU5基因，克隆所用的酶为HIFI高保真聚合酶(购自trans公司)，采用如下扩增程序：
95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸10min。
回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度684bp(SEQIDNo.1的CDS)，将其连接到pEASY-BluntSimpleT载体(购自transGen公司，按载体说明书中的比例混合)上，按照热激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆摇菌液提质粒，用NcoI和BamHI进行双酶切验证，将经过鉴定的阳性克隆送交铂尚公司测序。验证正确的克隆即为所要获得的基因OsGSTU5。
步骤3酵母表达载体的构建
提取基因OsGSTU5阳性克隆质粒，用NcoI和BamHI双酶切，回收基因OsGSTU5片段。同时利用NcoI和BamHI对酵母表达载体pART1(购自addgene公司)进行线性化处理、回收，将上述的基因OsGSTU5片段和pART1大载体片段用T4DNA连接酶(购于TaKaRa公司)进行连接，按照热激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆摇菌液提质粒，用NcoI和BamHI进行双酶切验证，将经过鉴定的阳性克隆送交铂尚公司测序。验证正确的克隆即基因OsGSTU5的酵母表达载体(命名为pART1-OsGSTU5)。
步骤4酵母转化
(1)从-80℃冰箱中取出酵母空菌株JS23(安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)，在YPD固体培养基上划线生长，30℃培养2～3天；
(2)从YPD固体培养平板上分别挑取单个直径约为2mm的克隆至20mLYPD液体培养基中，30℃，250rpm振荡过夜(16-18小时)，至OD600为0.6～0.8；
(3)4000×g离心5分钟，将上述培养基中的酵母菌收集在1.5mL离心管中；
(4)弃上清，加入1mL的ddH2O,震荡重悬，6000×g离心5分钟；
(5)弃上清，并用枪头将剩余液体吸尽，依次加入160μLddH2O、20μL10×TEbuffer(pH7.5)、20μL10×LiAc(pH7.5)，加完一种试剂混匀，再加入另一种试剂。
(6)加入20μL煮沸10min后速冷的鲑鱼精DNA和2μLpART1-OsGSTU5融合载体质粒，pART1空载体做对照；
(7)按序加入1.2mLPEG溶液(包括960μL50％PEG，120μL10×TEbuffer，120μL10mMLiAc)；
(8)混匀后于30℃温育30min(100r/min)；
(9)42℃热击15min(其间不时混匀)；
(10)6000×g室温离心15s；
(11)弃上清，加入150μLddH2O重悬，涂布于Leu固体培养基上；
(12)30℃培养2～3天后观察菌落生长情况。
步骤5基因OsGSTU5酵母体内耐镉试验
将pART1-OsGSTU5融合载体质粒验证正确的单克隆菌及pART1空载体单克隆菌，溶于0.9％的NaCl中，分别调OD600值为0.2、0.02、0.002、0.0002、0.00002，吸取各个浓度的菌液6μL分别滴于leu固体培养基和含浓度50、100和200μM浓度Cd2+leu固体培养基上，30℃恒温培养箱倒置培养3-5天。
结果如图1所示，图1中上方为pART1-OsGSTU5融合载体质粒的培养结果，下方为pART1空载体的培养结果，并且其中，A部分为非镉胁迫下的情况，B部分为50μMCdCl2胁迫下的情况，结果显示：非镉胁迫下空载体及该基因的酵母长势一致；而在50μMCdCl2胁迫下对照载体酵母生长受到严重抑制，而表达OsGSTU5的酵母仍然可以部分生长。该酵母体内试验足以证明基因OsGSTU5具有耐镉特性。
实施例2基因OsGSTU5的过表达株系的获得
1.1基因OsGSTU5的过表达载体的构建
步骤1、引物的设计
根据NCBI中提供的水稻品种日本晴(OryzasativaLcv.Nipponbare)全基因组序列，依据水稻基因OsGSTU5的CDS序列设计扩增引物，并在引物上加上酶切位点。
构建过表达载体用pCAMBIA1300，该载体经本发明的发明人改造，整个编码框由玉米Ubiquitin基因启动子驱动，并融合FLAG标签。
具体设计的引物为：正向引物(SEQIDNO:5)5’端带酶切位点HindIII(AAGCTT)，反向引物(SEQIDNO:6)5’端带酶切位点KpnI(GGTACC)，引物序列如下：
正向引物：AAGCTTATGGCGGACGAGGTGGTGCTCCHindIII
反向引物：GGTACCCTTGGCGCCAAACTTGGCCTTGKpnI
步骤2基因OsGSTU5的获得
以基因OsGSTU5cDNA为模板，利用上述正向引物、反向引物扩增基因OsGSTU5，克隆所用的酶为HIFI高保真聚合酶(购自transGen公司)，采用如下扩增程序：
95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸10min。
回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度684bp，将其连接到pEASY-BluntSimpleT载体(购自transGen公司，按载体说明书中的比例混合)上，按照热激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆摇菌液提质粒，用HindIII和KpnI进行双酶切验证，将经过鉴定的阳性克隆送交铂尚公司测序。验证正确的克隆即为所要获得的基因OsGSTU5。
步骤3过表达载体的构建和农杆菌的转化
提取基因OsGSTU5阳性克隆质粒，用HindIII和KpnI双酶切，回收基因OsGSTU5片段。同时利用HindIII和KpnI对pCAMBIA1300进行线性化处理、回收pCAMBIA1300，将上述的基因OsGSTU5片段和pCAMBIA1300片段用T4DNA连接酶(购于TaKaRa公司)进行连接，按照热激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆摇菌液提质粒，用HindIII和KpnI进行双酶切验证(结果如图2所示)，将经过鉴定的阳性克隆送交铂尚公司测序。验证正确的即基因OsGSTU5的过表达载体克隆(如图3所示)。
利用冻融法将基因OsGSTU5过表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105(安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)。
1.2基因OsGSTU5过表达株系的获得
步骤1：农杆菌介导的水稻遗传转化
成熟水稻种子去掉颖壳后，用70％酒精浸泡种子1min，倒掉酒精。用含有1滴Tween20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％)溶液浸泡种子30min(150r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀沿种子的糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30℃下暗培养11天后将愈伤组织与胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3～5天后用于农杆菌转化。
采用上述“过表达载体的构建和农杆菌的转化”过程中转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，该遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等参照YongboDuan(YongboDuan，ChenguangZhai，etal.Anefficientandhigh-throughputprotocolforAgrobacteriummediatedtransformationbasedonphosphomannoseisomerasepositiveselectioninJaponicarice(OryzasativaL.)[J].PlantCellReport，2012.DOI10.1007/s00299-012-1275-3.)等提出的方法。
共获得基因OsGSTU5过表达植株25株。
步骤2：过表达植株的相对表达量的鉴定
分别提取各转基因植物的总RNA，并反转录成cDNA，用Real-Time-PCR的方法检测其表达量，RT-PCR采用天根公司SuperRealPreMixPlus(SYBRGreen)试剂盒。以水稻Actin基因作为内标对所用RNA模板量进行定量。
引物序列如下(SEQIDNO:7-10)：
RTGSTU5FP：5'-AGTACGAGTACAGCGAGCAG-3'
RTGSTU5RP：5'-GGGGACCTTCTTGTGGACGG-3'
ActinFP：5'-CCTGACGGAGCGTGGTTAC-3'
ActinRP：5'-CCAGGGCGATGTAGGAAAGC-3'
反应体系：
采用两步法PCR进行扩增，按95℃30s，95℃5s，60℃34s，40个循环的程序扩增后进入溶解曲线分析程序。
本实验对过表达T1代植株用RT-PCR进行拷贝数的鉴定，同时也做了在潮霉素筛选压上分离比的筛选以及阳性转基因植株的鉴定，最终选择低拷贝而且在潮霉素筛选压的分离比接近3：1的阳性植株进行水稻正季繁代。然后用RT-PCR的方法对过表达T2代植株的基因表达量进行检测，定量引物为水稻基因OsGSTU5特异性探针并以Actin为内参，以同时期日本晴(WT)为对照。两株T2过表达植株中OsGSTU5相对表达量见图4，两株过表达植株OsGSTU5-OE-1和OsGSTU5-OE-2的过表达量约为对照的200倍，表明基因OsGSTU5过表达株系有过表达。
实施例3基因OsGSTU5的靶向敲除株系的获得
1.1敲除载体的构建
根据NCBI中提供的水稻品种日本晴(OryzasativaLcv.Nipponbare)全基因组序列，依据水稻基因OsGSTU5的序列，在该基因的外显子上设计靶位点KO(SEQIDNO:11)的引物，靶位点的设计时注意最后位点的PAM序列要求为NGG即可，引物序列如下(SEQIDNO:12-13)：
KOFP:GGCAGCAGGCCAAGAGGGACATGG
KORP:AAACCCATGTCCCTCTTGGCCTGC
引物充分溶解后，按表1的体系将引物退火。
表1引物退火体系
反应条件：37℃，1h。
加入2.5ul1MNaCl，95℃，5s。将孵育器关掉，让其自然退火2～3h。加入450uL的超纯水，使得探针终浓度为10mM。
所用的表达载体是pHUN411(自addgene公司公开获取),对表达载体酶切，将打靶基因的退火片段ko溶于用BsaI单切的pHUN411表达载体中按照热激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，我们采取负筛选的方式获得阳性克隆(Kana板长，Spec不长)，挑取单克隆摇菌液提质粒，送交铂尚公司测序。验证正确的克隆即为所要的打靶载体，命名为pHUN411-GSTU5ko。
1.2敲除载体转化EHA105/pSOUP农杆菌感受态细胞
利用冻融法将作物表达载体pHUN411-GSTU5ko转入根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105/pSOUP。
1.3水稻遗传转化和T0代转化植株PCR鉴定
水稻遗传转化所采用的方法如前面实施例所述，转化获得pHUN411-GSTU5ko转化植株。对这些转化植株进行了叶片基因组DNA的提取后，根据筛选标记潮霉素中编码潮霉素磷酸转移酶的基因hpt序列，设计引物，对基因组DNA进行了PCR扩增。引物序列为(SEQIDNO:14-15)：
HptFP：5’-CGCCGATGGTTTCTACAA-3’
HptRP：5’-CGCCGATGGTTTCTACAA-3’
扩增片段长度为827bp。绝大部分的PCR扩增结果为阳性(图5)，由此证明我们已经成功的获得了融合打靶载体的水稻转化植株。
1.4基因OsGSTU5突变检测
首先提取单拷贝转化植株基因组DNA，根据NCBI分析结果，设计OSGSTU5的特异引物(SEQIDNO:16-17)：
GSTU5kogenomeFP：CCCGTCTGCGAGTCCCTCGT；
GSTU5kogenomeRP：CCTCCCCTTGCATCGTTCCC。
以转化植株的基因组DNA做模板进行目的片段的克隆，克隆所用的酶为HIFI高保真聚合酶，采用如下扩增程序：
95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸10min。
克隆、回收目的片段，连接T载体，单菌落经测序来检测基因OsGSTU5突变情况，结果(见图6)表明已成功获得了4个无义突变株系。选取其中低拷贝植株(#3)进行了自交得到T1代种子，对T1代苗进行鉴定，得到一株纯和无T-DNA插入的稳定遗传的株系(#3-1)，突变形式为d1d1(在编码区出现纯合的1碱基缺失)，收获T2代种子(#3-1-1)用于萌发试验。
实施例4镉胁迫下的种子萌发试验
对获得的基因OsGSTU5的敲除和过表达株系及野生型种子做萌发试验。对无义突变植株和过表达株系T2种子及野生型种子去颖壳，70％乙醇浸泡，剧烈摇晃90s后，进行表面消毒，倒掉乙醇，加入50％的次氯酸钠(有效氯4％)和几滴Tween20浸泡20min(28℃，150r/min)，后用无菌水清洗干净。将洗好的种子分别接种于1/2MS培养基和含100μM浓度Cd2+的1/2MS培养基，于30℃、16h光照和8h黑暗条件下培养7-10天。
结果显示：在非镉胁迫下野生型、OsGSTU5敲除系和过表达株系均能正常发芽生长；而在100μM浓度Cd2+胁迫下进行发芽试验，10天后观察发现相比于野生型植株，基因OsGSTU5敲除株系萌发和生长受到严重抑制；基因OsGSTU5的过表达系发芽生长优于野生型(图7)，说明基因OsGSTU5在耐镉机制中具有重要作用。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (10)

1.一种水稻耐镉基因OsGSTU5，其特征在于，所述水稻耐镉基因OsGSTU5的核苷酸序列包含：序列表中SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；或者在序列表中SEQIDNO:1所示的核苷酸序列中添加、取代、缺失一个或多个核苷酸后所获得的具有同等或更高耐镉性能的核苷酸序列；或者在严谨条件下与序列表中SEQIDNO:1所示的核苷酸序列杂交所获得的具有同等或更高耐镉性能的核甘酸序列；或者与序列表中SEQIDNO:1所示的核苷酸序列具有90％以上同源性且编码相同蛋白质并具有同等或更高耐镉性能的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的水稻耐镉基因OsGSTU5，其特征在于，所述水稻耐镉基因OsGSTU5的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:1所示。
3.一种水稻耐镉蛋白OsGSTU5，其特征在于，所述水稻耐镉蛋白OsGSTU5的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO:2所示或者为序列表中SEQIDNO:2经取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基后与序列表中SEQIDNO:2限定的蛋白质具有相同功能的序列。
4.根据权利要求1所述水稻耐镉基因OsGSTU5，其特征在于，所述水稻耐镉基因OsGSTU5编码表达权利要求3所述的水稻耐镉蛋白GSTs。
5.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒包含权利要求1所述水稻耐镉基因OsGSTU5或其片段。
6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求5所述表达盒。
7.权利要求6所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括：包含OsGSTU5序列的酵母表达载体和植物双元表达载体。
8.一种培育耐镉植物的方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求7所述的水稻耐镉基因OsGSTU5的过表达载体转化到植物细胞或组织中，并将转化的植物细胞或组织培育成植株，优选地，所述转化通过农杆菌介导法进行。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述植物为双子叶或单子叶作物，优选为禾本科作物，更优选为水稻。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：
步骤1、获取权利要求1所述的水稻耐镉基因OsGSTU5；
步骤2、将所获取的水稻耐镉基因OsGSTU5与目标载体进行连接，获得相应过表达载体；
步骤3、利用冻融法将基因OsGSTU5的过表达载体转入根癌农杆菌；
步骤4、将转入过表达载体的根癌农杆菌通过农杆菌介导方法转入到目标植株中，获得相应的耐镉植株。
CN201610249074.8A 2016-04-19 2016-04-19 一种水稻耐镉基因OsGSTU5及其编码蛋白与应用 Pending CN105755022A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610249074.8A CN105755022A (zh) 2016-04-19 2016-04-19 一种水稻耐镉基因OsGSTU5及其编码蛋白与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610249074.8A CN105755022A (zh) 2016-04-19 2016-04-19 一种水稻耐镉基因OsGSTU5及其编码蛋白与应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105755022A true CN105755022A (zh) 2016-07-13

Family

ID=56325333

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610249074.8A Pending CN105755022A (zh) 2016-04-19 2016-04-19 一种水稻耐镉基因OsGSTU5及其编码蛋白与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105755022A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108250280A (zh) * 2016-12-28 2018-07-06 中国科学院上海生命科学研究院 一种降低细胞质镉积累的短肽，其编码基因和用途
CN111041035A (zh) * 2020-01-14 2020-04-21 连云港市农业科学院 水稻转录因子OsNAC3在提高植物耐镉能力中的应用
CN114507687A (zh) * 2022-04-02 2022-05-17 中国科学院华南植物园 水稻OsORM基因及其蛋白的应用
CN116083386A (zh) * 2022-12-13 2023-05-09 东北林业大学 绢毛委陵菜PsSPMS基因及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103483438A (zh) * 2013-09-26 2014-01-01 合肥工业大学 一种用于植物土壤镉污染修复的基因及其编码蛋白与应用
CN104928318A (zh) * 2015-07-14 2015-09-23 重庆大学 水稻OsLEA5c-1基因在培育抗重金属水稻品种中的应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103483438A (zh) * 2013-09-26 2014-01-01 合肥工业大学 一种用于植物土壤镉污染修复的基因及其编码蛋白与应用
CN104928318A (zh) * 2015-07-14 2015-09-23 重庆大学 水稻OsLEA5c-1基因在培育抗重金属水稻品种中的应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SONALI DUBEY ET AL: "Transcriptomic and metabolomic shifts in rice roots in response to Cr (VI) stress", 《BMC GENOMICS》 *
UNIPROT: "UniProtKB-Q0J294(Q0J294_ORYSJ)", 《UNIPROT》 *
邱春红: "水稻镉诱导启动子的分离和功能分析", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108250280A (zh) * 2016-12-28 2018-07-06 中国科学院上海生命科学研究院 一种降低细胞质镉积累的短肽，其编码基因和用途
CN108250280B (zh) * 2016-12-28 2021-06-01 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 一种降低细胞质镉积累的短肽，其编码基因和用途
CN111041035A (zh) * 2020-01-14 2020-04-21 连云港市农业科学院 水稻转录因子OsNAC3在提高植物耐镉能力中的应用
CN111041035B (zh) * 2020-01-14 2022-08-23 连云港市农业科学院 水稻转录因子OsNAC3在提高植物耐镉能力中的应用
CN114507687A (zh) * 2022-04-02 2022-05-17 中国科学院华南植物园 水稻OsORM基因及其蛋白的应用
CN116083386A (zh) * 2022-12-13 2023-05-09 东北林业大学 绢毛委陵菜PsSPMS基因及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3325022B2 (ja) 植物中の増加された澱粉含量
CN105755021A (zh) 一种水稻耐镉基因OsGSTU37及其应用
CN110904071B (zh) Raf49蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性中的应用
JPS61224990A (ja) 外来タンパク質又はポリペプチドが葉緑体に存在する植物細胞の調製方法
CN111996181B (zh) Drk蛋白及其编码基因在植物抗旱中的应用
CN102634522B (zh) 控制水稻育性的基因及其编码蛋白和应用
CN105755022A (zh) 一种水稻耐镉基因OsGSTU5及其编码蛋白与应用
JPH05236971A (ja) 習性及び収量において変更されたトランスジェニック植物を作製するプラスミド
CN105063068A (zh) 编码突变的epsps基因、其表达载体、表达产物及其应用
JPWO2005006847A1 (ja) 窒素制限下における生育の改善された植物の作出方法
CN103014035B (zh) 茎瘤芥抗逆基因及其植物表达载体和构建方法及应用
CN109477091A (zh) 用于基因内植物转化的构建体和载体
CN104829699B (zh) 一种与植物抗逆性相关蛋白Gshdz4及其编码基因与应用
CN110881367A (zh) 一种玉米事件t抗-4及其使用方法
CN104328127A (zh) 茎瘤芥抗逆基因BjEFh1及其植物表达载体及应用
CN105400800B (zh) 一种调控植物开花的大豆E3泛素连接酶基因GmPUB2的应用
CN109134631B (zh) 大豆转录因子GmMYB521及其编码基因在调控植物油脂代谢中的应用
CN106632627B (zh) Lnsm蛋白及其编码基因在植物转基因中的应用
CN102559676B (zh) 水稻根特异性启动子及其应用
CN104073491A (zh) 植物高温诱导表达启动子Posheat2及其应用
Dhekney et al. Potential for introducing cold tolerance into papaya by transformation with C-repeat binding factor (CBF) genes
CN103320463B (zh) 用RNAi技术控制水稻育性基因获得水稻不育系的方法
JP5164093B2 (ja) イネの病原菌に対する抵抗性を高める方法及び病原菌耐性イネ形質転換体
CN109735560A (zh) 一种含完全植物来源的选择报告基因表达框的载体构建方法及应用
KR102573947B1 (ko) 콩 유전자교정 효율 증대를 위한 유전자교정 시스템 및 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160713

RJ01 Rejection of invention patent application after publication