CN108250280B

CN108250280B - 一种降低细胞质镉积累的短肽，其编码基因和用途

Info

Publication number: CN108250280B
Application number: CN201611234858.XA
Authority: CN
Inventors: 龚继明; 罗劲松
Original assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2016-12-28
Filing date: 2016-12-28
Publication date: 2021-06-01
Anticipated expiration: 2036-12-28
Also published as: CN108250280A

Abstract

本发明涉及一种降低细胞质镉积累的短肽，其编码基因和用途。具体而言，本发明涉及一种多肽，所述多肽选自：(1)SEQ ID NO:3所示的多肽；(2)SEQ ID NO:3第32－80位所示的多肽；(3)(1)或(2)所述多肽的具有一个或多个氨基酸插入、缺失或取代的突变体；和(4)由(1)、(2)或(3)所述多肽与用于促进(1)、(2)或(3)所述多肽的分泌、表达和/或纯化的多肽序列组成的多肽。本发明还涉及相关的核酸构建物、宿主细胞以及转基因植物构建方法。本发明的基因可极好地应用于培育Cd低积累品种和环境修复。本发明也为开发重金属解毒药物提供了有价值的基因资源。

Description

一种降低细胞质镉积累的短肽，其编码基因和用途

技术领域

本发明涉及一种降低细胞质镉积累的短肽，其编码基因和用途。

背景技术

目前我国受重金属污染的耕地面积已达千万公顷，约占耕地面积的10％以上。重金属主要指汞(水银)、镉、铅、铬以及类金属砷等生物毒性显著的重元素。重金属不能被生物降解，相反却能在食物链的生物放大作用下，成千百倍地富集，最后进入人体。重金属在人体的某些器官中累积，造成慢性中毒。其中Cd在人体富集会造成前列腺、肺部、肾脏、骨组织等功能失调，造成鼻炎，肺气肿，骨软化等疾病，有效将Cd排出这些组织的细胞具有重要的医学价值。

植物修复和利用分子标记辅助选择育种是应对Cd污染的重要方式，但目前农作物中Cd积累转移机理仍知之甚少。

因此，本领域还需深入研究植物中Cd迁移积累机制，为培育Cd低积累和植物修复提供基因资源。

发明内容

本发明第一方面提供一种多肽，所述多肽选自：

(1)SEQ ID NO:3所示的多肽；

(2)SEQ ID NO:3第32－80位所示的多肽；和

(3)由(1)或(2)所述多肽与用于促进(1)或(2)所述多肽的分泌、表达和/或纯化的多肽序列组成的多肽。

在一个或多个实施方案中，(3)所述的用于促进多肽的分泌、表达和/或纯化的多肽序列选自信号肽、末端延伸、GST、麦芽糖E结合蛋白、蛋白A和标签序列，如6His或Flag。

本发明第二方面提供一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自：

(1)编码本发明多肽的多核苷酸序列；

(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列；和

(3)(1)或(2)所述序列的长10－40个碱基、优选15－30个碱基的片段。

在一个或多个实施方案中，所述多核苷酸序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2第94－240位碱基所示。

本发明第三方面提供一种核酸构建物，所述核酸构建物含有本文所述的多核苷酸序列。

在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是克隆载体或表达载体。

在一个或多个实施方案中，所述表达载体适于经由农杆菌转入植物中。

本发明第四方面提供一种农杆菌，所述农杆菌含有表达本发明多肽的表达载体。

本发明第五方面提供一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞：

(1)含有本发明的表达载体；和/或

(2)表达本发明多肽。

本发明第六方面提供一种转基因植物，所述转基因植物：

(1)含有本发明的表达载体；和/或

(2)表达本发明多肽。

本发明第七方面提供一种构建转基因植物的方法，所述方法包括：

(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有本发明多肽的编码序列；

(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，使该编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(3)选择出转入所述编码序列的植物细胞或组织；和

(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织再生成植株。

本发明第八方面提供本发明多肽、多核苷酸序列、核酸构建物和宿主细胞在构建转基因植物中的应用。

本发明第九方面提供本发明多肽、多核苷酸序列、核酸构建物和宿主细胞在制备吸附隔的制剂中的应用。

附图说明

图1：图位克隆控制水稻叶片Cd积累基因CAL1。A，精细定位CAL1位点在56KB的遗传区间内，并确定其中Os02g0629800(CAL1)为目标基因；B，CAL1属于植物防御素家族，由N端分泌信号肽和C端富含半光氨酸结构域组成。数值为平均值±标准差。

图2：CAL1基因的表达模式。A，两叶一心时期水稻苗，10μM Cd处理一周。CAL1在水稻根中受Cd诱导表达，而在叶鞘和叶片中不受Cd诱导表达变化，内参基因为Actin；B，CAL1在不同水稻组织中的表达水平，YR(幼根)、YS(幼叶鞘)、YL(幼叶)、LS(叶鞘)、LB(叶片)、FS(旗叶鞘)、FB(旗叶)、Node I(节1)、Node 2(节2)、IN(节间)和Spikelet(幼穗)，内参基因为HistoneH3。数值为平均值±标准差，显著性差异T检验表示(*P<0.05，**P<0.01)。

图3：CAL1正调控水稻叶片和木质部伤流液Cd积累。叶片和木质部伤流液Cd含量为两叶一心时期水稻苗，10μM Cd处理一周的结果。其中CJ06为转基因阴性对照，N47为CAL1过量表达株系，cal1表示利用CRISPR技术得到CAL1功能缺失突变体。A，近等基因系NIL(TN1)叶片中Cd含量显著高于NIL(CJ06)；B，近等基因系NIL(TN1)木质部伤流液Cd含量显著高于NIL(CJ06)；C，CAL1过量表达增加了CJ06叶片中Cd含量；D，CAL1过量表达增加了CJ06木质部伤流液中Cd含量；E，CJ06背景下，cal1突变体叶片中Cd含量降低；F，CJ06背景下，cal1突变体木质部伤流液中Cd含量降低。数值为平均值±标准差，显著性差异T检验表示(*P<0.05，**P<0.01)。

图4：CAL1细胞水平和亚细胞水平定位。A和B分别显示TN1来源CAL1启动子GUS染色分析，其中A显示根横切在外皮层和维管束染色较深，B显示叶鞘横切在维管束染色较深。C和D分别显示CAL1^TN1pro:CAL1-mRFP转基因植物中CAL1原位荧光观察，其中C显示根横切显示CAL1主要定位于外皮层和维管组织，D显示叶鞘横切显示CAL1主要定位于维管组织。E-G分别显示CAL1在洋葱表皮细胞和水稻根表皮细胞中亚细胞定位，其中E显示洋葱表皮细胞瞬时转化mRFP经40％蔗糖质壁分离后，红色荧光定位于细胞质和细胞核；F显示洋葱表皮细胞瞬时转化CAL1-mRFP经40％蔗糖质壁分离后，红色荧光主要定位于质外体空间细胞壁；G显示水培生长两周35S:CAL1-mRFP转基因水稻根中表皮细胞经40％蔗糖质壁分离后，红色荧光主要定位于质外体空间细胞壁。

图5：CAL1重组蛋白具有Cd螯合活性。体外实验表明重组CAL1全长和去除信号肽的蛋白(ΔSPCAL1)都能结合Cd，其中CAL全长结合Cd具有pH依赖性。TF表示细菌来源的trigger factor，CAL1表示TF-CAL1融合蛋白，ΔSPCAL1表示TF-ΔSP CAL1融合蛋白。数值为平均值±标准差，显著性差异T检验表示(*P<0.05，**P<0.01)。

图6：CAL1促进原生质体Cd的外排。萌发的水稻种子生长在5μM Cd培养液中生长14天，提取原生质体。CJ06为转基因阴性对照，N47为CAL1过量表达株系，cal1表示CAL1功能缺失突变体。A，CAL过量表达降低原生质体Cd含量，其介导原生质体Cd的外排；B，cal1突变体中原生质体Cd含量增加，说明突变体中Cd外排受阻。数值为平均值±标准差，显著性差异T检验表示(*P<0.05，**P<0.01)。

图7：CAL1通过木质部伤流液长途转运向叶片积累。CAL1^TN1pro:CAL1-mRFP转基因植物在5μM Cd水培液中生长21天，收集木质部伤流液和不同组织。A，蛋白印迹表明CAL1蛋白存在于木质部伤流液中；B，组织总蛋白印迹表明CAL1在植物体内存在前体和成熟短肽两种形式，成熟形式在叶片积累。

图8：CAL1自然变异降低水稻叶片和木质部伤流液Cd积累。A，95份自然水稻品种中发现CAL1蛋白存在两种变异形式。两叶一心水稻幼苗，10μM Cd处理一周。B，CAL1自然变异降低了水稻叶片中Cd含量。C、CAL1自然变异降低了水稻木质部伤流液中Cd含量。数值为平均值±标准差，显著性差异T检验表示(*P<0.05，**P<0.01)。

图9：CAL1异源表达增加拟南芥地上部和木质部伤流液Cd含量。A，35S:CAL1-mRFP转基因拟南芥根，红色荧光表示CAL1成功表达。拟南芥水培生长4周，20μM Cd处理3天。B，CAL1异源表达增加了拟南芥地上部Cd含量。C，CAL1异源表达增加了拟南芥木质部伤流液中Cd含量。数值为平均值±标准差，显著性差异T检验表示(*P<0.05，**P<0.01)。

具体实施方式

本发明发现一种能降低植物细胞质镉(Cd)积累的短肽，该短肽能结合Cd并促进植物Cd向细胞外排，在降低细胞质Cd的同时促进了Cd向植物地上部的迁移积累。本发明的基因可极好地应用于培育Cd低积累品种和环境修复。本发明也为开发重金属解毒药物提供了有价值的基因资源。

本发明的多肽具有SEQ ID NO:3或其第32－80位所示的氨基酸序列。本发明的多肽也包括在SEQ ID NO:3或其第32－80位所示的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸突变的序列。突变可以是氨基酸的取代、缺失或插入。因此，本发明的多肽可以是含有SEQ IDNO:3或其第32－80位所示氨基酸序列的多肽，也可以是SEQ ID NO:3的截短的片段，或SEQID NO:3第32－80位所示氨基酸序列截短的片段。“片段”在本文中指全长序列的连续的一部分序列。

这些氨基酸突变改变或不改变所得突变体结合Cd、促进Cd向细胞外排和/或促进Cd向植物地上部迁移积累。本文中，蛋白结合Cd、促进Cd向细胞外排和/或促进Cd向植物地上部迁移积累的能力或蛋白活性的改变或不改变是针对SEQ ID NO:3所示的蛋白的能力或活性而言。

例如，这些氨基酸突变可提高突变所得突变体结合Cd、促进Cd向细胞外排和/或促进Cd向植物地上部迁移积累的能力，也可下调所得突变体结合Cd、促进Cd向细胞外排和/或促进Cd向植物地上部迁移积累的能力，或可不实质改变所述能力。因此，可对本发明的SEQID NO:3或其第32－80位所示的氨基酸序列做出任意突变，然后根据所得突变体的生物学功能将其用于合适的用途。

例如，对于发生突变后结合Cd、促进Cd向细胞外排和/或促进Cd向植物地上部迁移积累的能力提高的突变体，可将其用于需要促进Cd吸收的重金属解毒应用中。本文中，“重金属解毒应用”包括但不限于自然环境或人体环境中的重金属解毒。例如，对于富含重金属的土壤或水中，可利用表达所述突变体的植物吸附该土壤或水中的重金属Cd，从而实现土壤和水的修复。对于人体环境，也可采用本发明的能结合Cd的多肽(包括结合Cd的功能不变或提高的突变体)进行重金属解毒。对于发生突变后结合Cd、促进Cd向细胞外排和/或促进Cd向植物地上部迁移积累的能力下降的突变体，在植株中表达这类突变体有助于降低该植株中Cd的积累。

可采用本文所述的方法，例如本文实施例所述的方法，或本领域周知的技术测定本发明的突变体结合Cd、促进Cd向细胞外排和/或促进Cd向植物地上部迁移积累的能力是否发生改变，以及发生了何种改变。

例如，图8显示了本发明多肽的两种存在形式，所示多肽在70位存在氨基酸取代，采用本发明的方法可测定所述突变导致所得突变体的生物学活性发生了何种改变。此位点可作为分子标记用于筛选Cd低积累水稻品种。

此外，本领域技术人员公知，在基因克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，这势必在所表达的蛋白末端引入了一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的蛋白的活性。又如，为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化，常常需要将一些氨基酸序列添加至重组蛋白的N末端、C末端或该蛋白内的其它合适区域内，这些氨基酸序列包括但不限于适合的接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白、蛋白A、或Xa因子或凝血酶或肠激酶的蛋白水解酶位点，以及可对蛋白进行纯化的蛋白标签，如FLAG，HA，HA1，c-Myc，Poly-His，Poly-Arg，Strep-TagII，AU1，EE，T7，4A6，ε，B，gE以及Ty1等。应理解，这些氨基酸序列的存在不会影响到所得多肽的活性。

本发明也包括多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自本发明多肽的编码序列或其简并异构体，以及互补序列。作为示范性的例子，本发明多肽的编码序列可如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2第94－240位碱基所示。本文中，简并异构体表示编码相同的氨基酸序列但核苷酸序列不同的多核苷酸序列。本发明也包括本发明多核苷酸序列的长10－40个碱基、优选15－30个碱基的片段，这些片段可用作探针或引物。

本发明的多核苷酸序列中可存在一个或多个碱基突变，这类突变可导致所编码的蛋白的活性不变、下降或提高。编码具有不同活性的蛋白的本发明多核苷酸序列可用于不同的用途。例如，对于编码活性不变的蛋白的多核苷酸变异体，可将其克隆到表达载体中，并利用该表达载体构建过表达该蛋白的植株，这类植株可用于环境修复。而对于编码的蛋白活性下降的多核苷酸变异体，则可用于培育Cd低积累品种，尤其是各种作物，例如水稻、小麦、大麦、玉米、花生、大豆以及各类蔬菜等。对于编码的蛋白活性提高的多核苷酸变异体，则可用于构建用于环境修复的植株，例如各种在受污染的土壤和水中生长的植物。

本发明的多肽的编码序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可先采用常规的技术手段从基因组DNA，然后再根据本发明所公开的核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，用于从该基因组DNA中扩增出CAL1基因。另外，可采用本领域周知的方法在本发明的多核苷酸序列中引入一个或多个碱基突变。

本发明涉及核酸构建物，其含有本发明的多核苷酸序列以及与该多核苷酸序列操作性连接并指导该编码序列在宿主细胞中在合适的条件下表达的一个或多个调控序列。本发明的多核苷酸序列可以各种方式被操作，以保证本发明多肽的表达。

调控序列可以是合适的启动子序列，为用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的宿主细胞识别的核苷酸序列。启动子序列包含接到多肽表达的转录调控序列。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。

调控序列也可以是合适的转录终止子序列，为由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码该多肽的核苷酸序列的3′末端可操作连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。例如，用于细菌宿主的优选终止子可以是来自T7噬菌体的终止子。

调控序列也可以是合适的前导序列。前导序列与编码多肽的多核苷酸序列的5′末端可操作连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何前导序列都可用于本发明。

调控序列也可以是编码与多肽的氨基酸末端连接的氨基酸序列并且指导该多肽进入细胞分泌途径的信号肽编码区。核苷酸序列编码序列的5’端可固有地包含天然的信号肽编码区。或者，编码序列的5’端可包含与该编码区外源的信号肽编码区。任选地，外来的信号肽编码区可简单地替换天然的信号肽编码区以增强多肽的分泌。

本发明也涉及包括本发明多核苷酸序列的克隆载体或表达载体。这些载体可含有前文所述的各调控序列。

表达载体可以是能够方便地经受重组DNA方法并且可导致感兴趣的核苷酸序列表达的任何载体(如质粒或病毒)。载体的选择一般取决于载体与其中被导入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是线性或闭合的环形质粒。

载体可以是自主复制的载体，即作为染色体外实体存在，其复制不依赖于染色体复制的载体，例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可包含用于保证自我复制的任何方式。或者，载体可以是当被导入宿主细胞时，整合到基因组中并且与其已经被整合进入的染色体一起复制的载体。此外，可使用一起包含将被导入宿主细胞基因组的总DNA的单个载体或质粒或两个或多个载体或质粒，或转座子。载体也可以是同源重组载体，用于将编码本发明的生物学活性发生了改变的多肽的多核苷酸序列插入宿主细胞的基因组中，替换原有的CAL1基因，使得所得细胞表达生物学活性发生了改变的多肽。

本发明的载体优选包含一个或多个容许容易选择转化、转染、转导等细胞的可选择标记。可选择的标记是基因，其产物提供对抗生素或病毒的抗性、对重金属的抗性、原养型至营养缺陷型等。

一个以上拷贝的本发明的多核苷酸可被插入宿主细胞以增加该基因产物的产量。多核苷酸拷贝数的增加可通过将至少一个附加拷贝的序列整合进入宿主细胞基因组或通过包括可扩增的选择标记基因和该多核苷酸来获得，其中包含扩增拷贝的选择标记基因并且由此包含附加拷贝多核苷酸的细胞可通过在存在适当的选择剂时培养该细胞来筛选。

本发明的载体优选包含人工合成的一段序列，含有多个限制内切酶识别位点，能为外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案。本发明的表达载体更为优选包含有连续6个组氨酸序列的小肽，有利于蛋白质的提取和纯化。

含有本发明多核苷酸序列的克隆载体可用于复制足够多的目标质粒。因此，本发明的克隆载体带有较强的自我复制元件，如复制起始位点等。通常，本发明的克隆载体不具有表达元件。

本发明也涉及含有被用于重组生产多肽的本发明多核苷酸的重组宿主细胞。包括本发明多核苷酸的载体被导入宿主细胞以使得该载体如早先说明的作为染色体的组成部分或作为染色体外的自我复制载体来维持。宿主细胞的选择很大程度上取决于编码多肽的基因及其来源。

宿主细胞可以是植物细胞或单细胞微生物或非单细胞微生物。单细胞微生物例如革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌，包括但不限于大肠杆菌。宿主细胞也可以是真核生物，例如哺乳动物、昆虫、植物、酵母或真菌细胞。

可采用常规的转化方法将本发明多核苷酸序列的核酸构建物转入宿主细胞中。转染通常分为瞬时转染和稳定转染。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天。稳定转染中，外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体存在。转染的技术手段包括化学转染和物理转染，前者如DEAE-葡聚糖法、磷酸钙法和人工脂质体法，后者如显微注射、电穿孔和基因枪等。

在获得多肽的编码序列后，可采用如下方法生产本发明多肽，该方法包括：(a)在有助于生产多肽的条件下培养宿主细胞；以及(b)回收该多肽。

本发明的生产方法中，细胞可以利用本领域已知的方法在适于生产多肽的培养基中培养。例如，细胞可通过在实验室或工业发酵罐中进行的摇瓶培养和小规模或大规模的发酵(包括连续的、分批的、分批补料或固态发酵)，在合适的培养基和容许该多肽表达和/或分离的条件下进行培养。培养发生在利用本领域已知的方法包括碳源和氮源和无机盐的合适培养基中。合适的培养基可获得自商业供应者或可根据公开的组合物来制备。如果该多肽分泌进入培养基，该多肽可从培养基直接回收。如果该多肽不分泌进入培养基，它可从细胞裂解物回收。

本发明所描述的多肽可利用本领域已知的方法来回收。例如，多肽可通过常规方法，包括但不限于离心、过滤、超滤、萃取、层析、喷雾干燥、冷冻干燥、蒸发或沉淀等从培养基回收。

本发明的多肽可通过本领域已知的多种方法来纯化，包括但不限于色谱法(如离子交换、亲和性、疏水性、色谱聚焦、分子排阻)，电泳法(例如等电聚焦)、差异溶解度(如盐析沉淀)、SDS-PAGE或萃取法以获得基本上纯的多肽。

在某些方面中，本发明的宿主细胞是农杆菌，所述农杆菌含有表达本发明多肽的表达载体。农杆菌可以是本领域周知的农杆菌，例如根癌农杆菌和发根农杆菌。

在某些实施方案中，本发明的宿主细胞是植物细胞，所述细胞过表达本发明具有正常结合Cd活性(即SEQ ID NO:3或其成熟序列的结合Cd活性)或高结合Cd活性(即高于SEQID NO:3或其成熟序列的结合Cd活性)的本发明多肽；或者，在某些实施方案中，本发明的植物细胞也可正常表达高结合Cd活性的本发明多肽。在某些实施方案中，本发明的植物细胞表达低结合Cd活性(即低于SEQ ID NO:3或其成熟序列的结合Cd活性，甚至无结合Cd活性)的多肽或不表达SEQ ID NO:3或其成熟序列或其具有Cd结合活性的突变体。

应理解的是，可通过将编码本发明低结合Cd活性或无结合Cd活性的多肽的表达载体(例如重组同源载体)转入表达CAL1多肽的植物细胞中，将该植物细胞中编码CAL1多肽的基因替换成本发明的多核苷酸序列，从而构建表达低结合Cd活性或无结合Cd活性的植物细胞。或者，可利用基因敲除载体将本来表达CAL1多肽的细胞中的CAL1基因敲除，从而构建不表达CAL1多肽即无结合Cd活性的植物细胞。

在某些实施方案中，本发明提供植物组织，所述植物组织含有本文所述的植物细胞。例如，所述植物组织所含的细胞过表达本发明具有正常结合Cd活性或高结合Cd活性的本发明多肽，或表达低结合Cd活性的多肽，或不表达SEQ ID NO:3或其成熟序列或其具有Cd结合活性的突变体。植物组织可以是本领域周知的各种植物组织，例如种子或植物的一部分如叶子或木质部，或者是愈伤组织等。

在某些实施方案中，本发明提供一种转基因植物，所述转基因植物：

(1)含有本发明的表达载体；和/或

(2)表达本发明多肽。

如前文所述，本发明的转基因植物可以过表达本发明具有正常结合Cd活性或高结合Cd活性的本发明多肽，用于环境修复。这类植物可以是生长在受重金属污染尤其是Cd污染的环境中的各类植物。或者，本发明的转基因植物可以是表达低结合Cd活性或无结合Cd活性的本发明多肽，或者是不表达CAL1多肽；这类植物由于表达的CAL1多肽结合Cd的活性低，甚至无结合Cd的活性，或不表达能结合Cd的CAL1多肽，因此Cd含量低。优选的是，这类植物是各种作物，例如水稻、小麦、大麦、玉米、花生、大豆以及各类蔬菜等。

本发明转基因植物的构建方法包括：

(3)选择出转入所述编码序列的植物细胞或组织；和

(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织再生成植株。

采用所述方法可构建本文所述的具有不同用途的转基因植物，例如用于环境修复的转基因植物，以及Cd低积累的作物。

因此，本发明也包括本发明多肽、多核苷酸序列、核酸构建物和宿主细胞在构建转基因植物中的应用，以及在制备吸附隔的制剂中的应用。

在某些实施方案中，水稻基因Os02g0629800、SEQ ID NO:3或其第32－80位氨基酸序列，或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2第94－240位碱基所示多核苷酸序列可作为分子标记用于水稻育种或筛选Cd低积累水稻品种。在这些应用中，可采用本领域常规的技术手段克隆得到待测水稻中的Os02g0629800基因对其进行测序，若测序所得的基因含有本发明SEQID NO:2或SEQ ID NO:2第94－240位碱基所示多核苷酸序列，或其编码的多肽序列如本申请SEQ ID NO:3或其第32－80位氨基酸序列所示，则该水稻品种可能为Cd低积累品种。更进一步地，如果所测得的基因编码的多肽在对应于本发明SEQ ID NO:3第70位的氨基酸残基为V，则该水稻应为Cd低积累品种。在水稻育种过程中，也可基于上述方法判断相应的水稻品种是否为Cd低积累品种。任选地或进一步地，可测定水稻细胞表达的蛋白中是否存在含有SEQ ID NO:3或其第32－80位氨基酸序列的蛋白。若测得所述水稻细胞表达的蛋白中存在含有SEQ ID NO:3或其第32－80位氨基酸序列的蛋白，则将所述水稻品种作为Cd低积累品种的候选物；进一步地，若测得水稻细胞表达的蛋白中存在含有SEQ ID NO:3的蛋白且该蛋白对应于SEQ ID NO:3第70位的氨基酸残基为V，则确定该水稻应为Cd低积累品种。

因此，在某些实施方案中，本发明提供一种鉴定Cd低积累水稻品种的方法，所述方法包括对所述水稻的基因Os02g0629800进行测序，和/或测定所述水稻细胞表达的蛋白中是否存在含有SEQ ID NO:3或其第32－80位氨基酸序列的蛋白的步骤。若测序所得的基因含有本发明SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2第94－240位碱基所示多核苷酸序列，或其编码的多肽序列如本申请SEQ ID NO:3或其第32－80位氨基酸序列所示，和/或若测得所述水稻细胞表达的蛋白中存在含有SEQ ID NO:3或其第32－80位氨基酸序列的蛋白，则将所述水稻品种作为Cd低积累品种的候选物。优选地，若所测得的基因编码的多肽在对应于SEQ IDNO:3第70位的氨基酸残基为V，和/或若测得所述水稻细胞表达的蛋白中存在含有SEQ IDNO:3的蛋白且该蛋白对应于SEQ ID NO:3第70位的氨基酸残基为V，则确定该水稻应为Cd低积累品种。

下文将以具体实施例的方式阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等，《分子克隆：实验室指南》(美国纽约州：冷泉港实验室出版社，1989)所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。对于试剂的用法和用量，除非另有说明，否则按照常规的用法和用量使用。本发明中，除非另有说明，转基因植物如转基因作物(如水稻)叶片中Cd积累量低于15μg/g干重为Cd低积累。

实施例1、图位克隆CAL1基因和其序列信息

叶片Cd积累初定位群体为Cd高积累亲本TN1和Cd低积累亲本CJ06杂交获得的双单倍体。统计群体每个单株的基因型和叶片Cd积累表型，利用Map Marker/QTL软件计算得到主效QTL位点，并对2号染色体上主效QTL位点(CAL1)进行深入研究，然后以CJ06为轮回亲本，通过分子标记辅助选择和连续回交筛选得到了Cd高积累片段替换系HF93。最后通过HF93与CJ06的回交群体进行了精细定位和高精度连锁分析，并从中筛选出包含CAL1位点的近等基因系NIL。近等基因系包含了约200kb、TN1来源的包含CAL1位点的染色体片段，其余均为CJ06背景。拟南芥Col-0用来遗传转化。

利用21个分子标记对TN1和HF93回交群体BC₃F₂的200个单株进行基因型鉴定，并对其自交后代BC₃F₃叶片Cd积累进行测量，利用Map Marker/QTL软件计算，把CAL1定位在分子标记RM341和RM263之间。然后利用新开发的分子标记B3、X3、C1、D1、F1、H10、M6、E6对3651个重组自交个体BC₃F₃进行了基因型筛选，引物见下表1：

表1

实验获得了在CAL1区域发生交换的个体。然后继续自交得到交换区域固定的交换单株BC₃F₄，通过对其自交后代叶片Cd积累表型和基因型进行连锁分析，把叶片Cd积累定位在56kb区间，通过测序对候选基因进行了分析。结果如图1所示。

本实施例从水稻中图位克隆了控制水稻叶片Cd积累的主效QTL基因CAL1(Os02g0629800)，该基因由5UTR区，3UTR区，内含子和外显子组成，其基因序列如SEQ IDNO:1所示，CDS序列如SEQ ID NO:2所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，成熟序列如SEQ ID NO:3第32－80位氨基酸残基所示。

实施例2、CAL1受Cd诱导的表达模式分析

CAL1受Cd诱导表达模式分析：NIL材料水培生长至两叶一心幼苗期，10μM Cd处理一周，取叶片，叶鞘和根分析。

CAL1在水稻不同组织表达模式分析：NIL于松江大田生长至水稻抽穗时期，分不同部位取材分析。

采用英俊公司TRIZOL试剂提取植物总RNA，方法参照试剂说明书。反转录和实时荧光定量PCR参照Li et al.，2010，用到引物见表1。内参基因为HistonH3或Actin。结果如图2所示。

实施例3、CAL1正调控水稻叶片和木质部伤流液Cd积累

PCR扩增TN1中CAL1的基因组3.8kb的片段，该片段包含启动子，UTR区和开放阅读框，然后克隆到双元表达载体pCAMBIA1300中得到CAL1genomic/pCAMBIA1300，pCAMBIA1300载体如文献Zhang et al.,2014所示，从而获得CAL1过表达实验材料。

利用CRISPR/Cas9系统得到cal1突变体，CAS9和导向RNA片段酶切克隆至双元表达载体pCAMBIA1300中。农杆菌介导上述两个载体转化至水稻CJ06中，得到转基因株系。

水稻种子在42℃培养箱烘干两周以打破休眠，然后在28℃培养箱中用水浸泡两天，去除水分，28℃催芽一天，催芽良好的种子播在去除孔的96孔板。水稻水培液为Yoshida，光周期为28℃、13小时光照，11小时黑暗，湿度60％。包括TN1，CJ06，NIL(CAL1)，HF93，双单倍体，精细定位群体，交换个体和T1代转基因株系，其中T1代转基因株系用HYG筛选阳性苗，然后用相应的Cd处理，收集到二叶和根组织，进行ICP分析，ICP分析方法参考Gong et al.，2003。水稻木质部伤流液收集方法参照Ueno et al.，2009。幼苗期水稻经过相应条件的Cd处理后，用锋利的刀片去除地上部，伤流液收集两个小时，每30分钟收集一次，进行ICP分析。结果如图3所示。

实施例4、CAL1细胞水平和亚细胞水平定位

GUS组化：PCR扩增TN1中CAL1长1.9kb的启动子片段，然后克隆到载体35S::GUS/pCAMBIA1300中(获自University of California，San Diego，US)，通过农杆菌介导转化CJ06得到转基因株系，GUS组织组化分析参照Li et al.，2010。

为观察CAL1原位荧光，PCR扩增CAL1的启动子区和CDS序列(SEQ ID NO:2)，克隆到载体mRFP/pCAMBIA1300(载体参照文献Huang et al；2014)中，得到proCAL1::CAL1-mRFP/pCAMBIA1300。为观察CAL1在水稻体内亚细胞定位，CAL1的CDS序列(SEQ ID NO:2)通过PCR扩增克隆至载体35S::mRFP/pCAMBIA1300(载体参照文献Huang et al；2014)中得到35S::CAL1-mRFP/1300。上述载体通过农杆菌介导水稻转化CJ06得到转基因株系。

为观察CAL1在洋葱表皮细胞定位，PCR扩增得到CAL1CDS片段(SEQ ID NO:2)，然后克隆得到瞬时表达载体PA7(载体参照文献Zhang et al；2012)中，得到35S::CAL1-mRFP/PA7或35S::mRFP-CAL1/PA7构建。载体经金粉包裹利用基因枪轰击转入洋葱表皮细胞。28℃暗培养16小时，显微观察红色荧光。引物序列见附表1。

结果如图4所示。

实施例5、CAL1重组蛋白具有Cd螯合活性

将编码CAL1全长蛋白(SEQ ID NO:3)和去除信号肽的CAL1片段ΔSP-CAL1包含32-80位氨基酸(SEQ ID NO:3的第32－80位氨基酸)的多核苷酸序列克隆至Pcold-TF(Takara公司)中，16℃、0.1mM IPTG诱导19小时。蛋白纯化方法参照Zhang et al.，2014。引物序列见附表1。

采用35ug蛋白与100μM金属离子孵育60分钟进行CAL1与金属的结合实验，缓冲液为Elution buffer(250mM咪唑，300mM NaCl，50mM NaH₂PO₄，pH为8.0或5.5)，然后用脱盐柱去除游离态的离子，ICP定量蛋白结合的离子数目。结果如图5所示。

实施例6、CAL1促进原生质体Cd的外排

转基因阴性对照株系(CJ06)、CAL1过表达株系(N47)和CAL1功能缺失突变体(cal1)在5μM Cd水培液中生长14天，取叶鞘提取原生质体，提取方法参照zhang etal，2011。Cd含量标准化至原生质体蛋白浓度，ICP分析Cd含量。结果如图6所示。

实施例7、CAL1通过木质部伤流液长途转运向叶片积累

为了检测植物体内CAL1蛋白的存在形式以及是否长途转运，ProCAL1^TN1::CAL1-mRFP/pCAMBIA1300转基因植物在5μM Cd水培液生长21天，取不同组织用Buffer E(125mMTris-HCl，pH 8.0，1％[w/v]SDS，10％[v/v]甘油，和50mMNaS₂O₅)提取总蛋白，或收集木质部伤流液。30ug蛋白或30ul木质部伤流液通过10％SDS-PAG分离后，用康为试剂公司鼠源mRFP单克隆抗体杂交，以1:2000稀释。然后用辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1:5000孵育。最后与密理博公司显影液孵育后拍照。结果如图7所示。

实施例8、CAL1自然变异降低水稻叶片和木质部伤流液Cd积累

通过对95份水稻品种CAL1基因测序发现，CAL1在自然群体中存在两种变异形式(CTC→GTC，L70V)。测序两叶一心水稻幼苗，10μM Cd处理一周，收集木质部和叶片ICP分析。结果如图8所示。

实施例9、CAL1异源表达增加拟南芥地上部和木质部伤流液Cd含量

CAL1的CDS序列(SEQ ID NO:2)通过PCR扩增克隆至载体35S::mRFP/pCAMBIA1300中，得到35S::CAL1-mRFP/pCAMBIA1300，上述载体通过农杆菌介导拟南芥转化得到转基因株系。拟南芥水培参考Gong et al.，2003。光周期为22℃，16小时光照，8小时黑暗。拟南芥四周水培苗，10μM Cd处理3天，收集地上部，同时用锋利刀片去除莲坐叶和地上部。收集伤流液1小时，每15分钟收集一次。拟南芥水培生长4周，20μM Cd处理3天，收集伤流液和地上部ICP分析。结果如图9所示。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 一种降低细胞质镉积累的短肽，其编码基因和用途

<130> 168263

<160> 47

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 702

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 1

aaccaagagc tagcacagca ccggtggcag tagcaaagta gcagcctcat cactcatcag 60

tgagcgcagt tcgagtcgcc ggtacagatg gctccgtctc gtcgcatggt cgcgtccgcc 120

ttcctcctcc tggccatcct cgtcgccaca ggtacgtgct cctcgtcgag cactacattg 180

gctgcgttaa gcaatttttt gcatgcacgg atgcagtgca atgtgtgatg gttgtgtggt 240

tgtgtgtgca gagatgggga cgaccaaggt ggcggaggcg aggcactgcc tgtcgcagag 300

ccacaggttc aagggcatgt gcgtgagcag caacaactgc gccaacgtgt gcaggacgga 360

gagcttcccc gacggcgagt gcaagtcgca cggcctcgag cgcaagtgct tctgcaagaa 420

ggtctgctag tgcatgctag ccccgctgtc tctgcagtcg cattgctcgt cggctgtgta 480

tctgcagaga ttgtagtcgc gtgttctcct ttgtctgttg ttcatgacga gcttctgttc 540

ttggcttaca ggctagttga gttgctttcg attatccttg cttagaataa gtaataagta 600

cgcgctggat acatgctcca gcttagttag ttgttgggta tttgcaagct gctgtcatgt 660

aaggttccac atttcagcat taatgaattg gcatacgtga tg 702

<210> 2

<211> 243

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<220>

<221> misc_feature

<222> (208)..(208)

<223> n是c或g

<400> 2

atggctccgt ctcgtcgcat ggtcgcgtcc gccttcctcc tcctggccat cctcgtcgcc 60

acagagatgg ggacgaccaa ggtggcggag gcgaggcact gcctgtcgca gagccacagg 120

ttcaagggca tgtgcgtgag cagcaacaac tgcgccaacg tgtgcaggac ggagagcttc 180

cccgacggcg agtgcaagtc gcacggcntc gagcgcaagt gcttctgcaa gaaggtctgc 240

tag 243

<210> 3

<211> 80

<212> PRT

<213> 水稻（Oryza sativa）

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (70)..(70)

<223> X为亮氨酸或缬氨酸

<400> 3

Met Ala Pro Ser Arg Arg Met Val Ala Ser Ala Phe Leu Leu Leu Ala

1 5 10 15

Ile Leu Val Ala Thr Glu Met Gly Thr Thr Lys Val Ala Glu Ala Arg

20 25 30

His Cys Leu Ser Gln Ser His Arg Phe Lys Gly Met Cys Val Ser Ser

35 40 45

Asn Asn Cys Ala Asn Val Cys Arg Thr Glu Ser Phe Pro Asp Gly Glu

50 55 60

Cys Lys Ser His Gly Xaa Glu Arg Lys Cys Phe Cys Lys Lys Val Cys

65 70 75 80

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 4

ctgattccac acacttgtgc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 5

gattccacgt caggatcttc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 6

ggagagtgag agccaaatga 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 7

gccttaatag tcggcttagc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 8

cagctgacct aactacgccc 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 9

gccaaggatt cttctgtgca 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 10

ggtgagtcta ggccaatatg 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 11

agagaaccaa gagggattgc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 12

atgtgggccc cgctatttta 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 13

gtaagcacac agattcatca 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 14

gagacgtctc cgacaacacc 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 15

cagcatttag cgcctagttg 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 16

accacgcatc agttgcacgc 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 17

cgggtctcac gcaattgttc 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 18

gtaatggttt aatgcaatgc 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 19

actgaggtgg tcaatgagtt 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 20

agtacttgta cttgcaaagg 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 21

tatatgtttg ctaacgatcg 20

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 22

ttaagtttcg gctccttcac tcg 23

<210> 23

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 23

cacacatatg catccacagt tcc 23

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 24

ctgtccgtgc acgacgtatt 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 25

gaggtggatt tggaactgtg 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 26

cccaggctag ctcatgaacc 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 27

gctacgtttg agctaccacg 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 28

agtcgcgtgt tctcctttgt 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 29

catgacagca gcttgcaaat 20

<210> 30

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 30

ggtcaacttg ttgattcccc tct 23

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 31

aaccgcaaaa tccaaagaac g 21

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 32

tccatcttgg catctctcag 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 33

gtacccgcat caggcatctg 20

<210> 34

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 34

aagcttccca tgtgggcccc gctatt 26

<210> 35

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 35

ggatccctgt accggcgact cgaact 26

<210> 36

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 36

tggcggggac gaccaaggtg gcgg 24

<210> 37

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 37

aaacccgcca ccttggtcgt cccc 24

<210> 38

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 38

aagcttatgt gggccccgct atttta 26

<210> 39

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 39

gagctcgtaa gcacacagat tcatca 26

<210> 40

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 40

ggatccatgg ctccgtctcg tcgcat 26

<210> 41

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 41

actagtgcag accttcttgc agaagc 26

<210> 42

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 42

actagtatgg cctcctccga ggacgt 26

<210> 43

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 43

gagctcttag gcgccggtgg agtggc 26

<210> 44

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 44

ggatccaggc actgcctgtc gcagag 26

<210> 45

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 45

gaattcctag cagaccttct tgcaga 26

<210> 46

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 46

ggatccatgg ctccgtctcg tcgcat 26

<210> 47

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 47

gaattcctag cagaccttct tgcaga 26

Claims

1.一种多肽，其特征在于，所述多肽选自：

（1）SEQ ID NO:3所示的多肽；

（2）SEQ ID NO:3第32－80位所示的多肽；

（3）由（1）或（2）所述多肽与用于促进（1）或（2）所述多肽的分泌、表达和/或纯化的多肽序列组成的多肽；

其中，SEQ ID NO:3中第70位氨基酸残基为缬氨酸。

2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，（3）所述的用于促进多肽的分泌、表达和/或纯化的多肽序列选自信号肽、末端延伸、蛋白A和标签序列。

3.如权利要求2所述的多肽，其特征在于，所述标签序列为GST、麦芽糖E结合蛋白、6His或Flag。

4.一种多核苷酸分子，其特征在于，所述多核苷酸分子选自：

（1）编码权利要求1-3中任一项所述多肽的多核苷酸分子；和

（2）（1）所述多核苷酸分子的互补序列。

5.一种核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物含有权利要求4所述的多核苷酸分子。

6.如权利要求5所述的核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物是克隆载体或表达载体。

7.如权利要求6所述的核酸构建物，其特征在于，所述表达载体适于经由农杆菌转入植物中。

8.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞：

（1）含有相对于该宿主细胞而言为外源的权利要求4所述的多核苷酸序列；

（2）含有权利要求6的表达载体；和/或

（3）表达权利要求1-3中任一项所述的多肽。

9.如权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为农杆菌。

10.一种调控植物镉积累的方法，所述方法包括在所述植物中过表达选自以下的多肽：

（a）SEQ ID NO:3所示的多肽；

（b）SEQ ID NO:3第32－80位所示的多肽；

（c）由（a）或（b）所述多肽与用于促进（a）或（b）所述多肽的分泌、表达和/或纯化的多肽序列组成的多肽。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，（c）所述的用于促进多肽的分泌、表达和/或纯化的多肽序列选自信号肽、末端延伸、蛋白A和标签序列。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述标签序列为GST、麦芽糖E结合蛋白、6His或Flag。

13.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述植物为在受镉污染的环境中生长的植物。

14.一种降低水稻地上部镉积累的方法，所述方法包括敲除水稻细胞中编码SEQ IDNO:3所示多肽的基因。

15.一种构建细胞质镉积累降低的转基因植物的方法，其特征在于，所述方法包括：

（1）提供携带表达载体的农杆菌；

（2）将植物细胞或组织或器官与步骤（1）中的农杆菌接触，使所述表达载体所含的所述多核苷酸序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

（3）选择出转入所述编码序列的植物细胞或组织；和

（4）将步骤（3）中的植物细胞或组织再生成植株；

其中，所述表达载体含有编码以下多肽的多核苷酸分子：

（a）SEQ ID NO:3所示的多肽；

（b）SEQ ID NO:3第32－80位所示的多肽；或

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，（c）所述的用于促进多肽的分泌、表达和/或纯化的多肽序列选自信号肽、末端延伸、蛋白A和标签序列。

17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述标签序列为GST、麦芽糖E结合蛋白、6His或Flag。

18.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述转基因植物为作物。

19.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述转基因植物为水稻、小麦、大麦、玉米、花生、大豆或蔬菜。

20.选自以下的多肽、编码所述多肽的多核苷酸分子、含有所述多核苷酸分子的核酸构建物或含有所述核酸构建物的宿主细胞在构建细胞质镉积累降低的转基因植物中的应用，或在制备吸附隔的制剂中的应用：

（a）SEQ ID NO:3所示的多肽；

（b）SEQ ID NO:3第32－80位所示的多肽；或

21.如权利要求20所述的应用，其特征在于，（c）所述的用于促进多肽的分泌、表达和/或纯化的多肽序列选自信号肽、末端延伸、蛋白A和标签序列。

22.如权利要求21所述的应用，其特征在于，所述标签序列为GST、麦芽糖E结合蛋白、6His或Flag。

23.如权利要求20所述的应用，其特征在于，所述多核苷酸分子如SEQ ID NO:2或SEQID NO:2第94－240位碱基所示。

24.SEQ ID NO:3或其第32－80位氨基酸序列，或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2第94－240位碱基所示作为分子标记在水稻育种或筛选Cd低积累水稻中的应用。

25.采用权利要求10-13和15-19中任一项所述的方法获得的植物在受镉污染的环境的修复中的应用。

26.一种鉴定Cd低积累水稻品种的方法，其特征在于，所述方法包括对所述水稻的基因Os02g0629800进行测序，和/或测定所述水稻细胞表达的蛋白中是否存在含有SEQ ID NO:3或其第32－80位氨基酸序列的蛋白的步骤；

其中，若测序所得的基因含有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2第94－240位碱基所示多核苷酸序列，或其编码的多肽序列如SEQ ID NO:3或其第32－80位氨基酸序列所示，和/或若测得所述水稻细胞表达的蛋白中存在含有SEQ ID NO:3或其第32－80位氨基酸序列的蛋白，则将所述水稻品种作为Cd低积累品种的候选物；其中，若所测得的基因编码的多肽在对应于SEQ ID NO:3第70位的氨基酸残基为V，和/或若测得所述水稻细胞表达的蛋白中存在含有SEQ ID NO:3的蛋白且该蛋白对应于SEQ ID NO:3第70位的氨基酸残基为V，则确定该水稻为Cd低积累品种。