CN104902748A

CN104902748A - 抗病原体方法

Info

Publication number: CN104902748A
Application number: CN201380061188.4A
Authority: CN
Inventors: 妮科尔·万德尔韦尔登; 玛里琳·安妮·安德森
Original assignee: Hexima Ltd
Current assignee: Hexima Ltd
Priority date: 2012-11-23
Filing date: 2013-11-22
Publication date: 2015-09-09
Also published as: CA2891989A1; AU2013350317A1; US20150283204A1; ZA201503067B; JP6457945B2; US20180214512A1; US10357536B2; WO2014078900A1; IN2015DN04018A; US9943564B2; JP2016507474A; EP2922398A4; EP2922398A1; AU2013350317B2; BR112015011680A2

Abstract

本公开内容教导了保护植物以及人和非人对象免受病原体之害。本公开内容能够以多价方式抑制植物以及人和非人动物对象中的病原体感染，减轻对易感性对象的损伤。

Description

抗病原体方法

申请数据

本申请与2012年11月23日提交的名称为“Anti-pathogenic methods”的美国临时申请No.61/729,467有关并要求其优先权，所述申请的全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本公开内容教导了保护植物以及人和非人对象免受病原体之害。本公开内容能够以多价方式抑制植物以及人和非人动物对象中的病原体感染，减少对易感性对象的损伤。

背景技术

在说明书的结尾以字母顺序收录了由本申请的作者引用的出版物的文献详情。

本说明书中对任何现有技术的引用没有也不应视为承认或以任何形式暗示该现有技术形成了任何国家公知常识的一部分。

由植物病原体(例如真菌和昆虫病原体)的感染造成的作物损失是农业产业中的主要问题，每年要花费数百万美元来施用杀真菌剂控制这些损失(Oerke和Dehne(2004)Crop Protection 23：275-285)。需要鉴定新的抗植物病原体策略。特别重要的是考虑病原体出现抗性的倾向。人和非人对象的真菌感染还可导致显著不适和严重的健康问题。病原真菌对于人类健康和经济也是严重问题。人类真菌病原体造成威胁生命的医院获得性疾病，其具有高死亡率和较不严重的表面感染。

植物已经进化成产生肽来保护免受病原体。其特异性可能受到响应于对多种病原体暴露的进化的影响。

植物防卫素代表了一类抗病原体分子。存在多种防卫素，其具有不同的空间和时间表达模式和活性谱。通常，植物防卫素可分为两大类：I类防卫素由内质网(ER)序列接成熟防卫素结构域组成。II类防卫素作为较大前体产生，除了ER信号序列和成熟结构域外还具有约33个氨基酸的C末端前结构域或前肽(CTPP)。

对于这些肽的特异性背后的机理尚未完全阐明，但是推测包括与质膜组分的相互作用。由于膜透化是许多抗病原体肽的共同活动，并且多种细胞类型的膜组成高度可变，假设在一些情况下存在特定脂质来负责抗病原体肽的效力。

植物病原体引起显著的植物产量损失，目前用于病原体控制的策略很昂贵并且可能破坏环境。考虑到对改善农业生产的经济的需求，需要新的策略来保护农业植物和重要的观赏植物免受多种疾病，尤其是真菌性疾病。病原性(pathogenic)真菌还严重关系到人类健康和经济。目前的疗法需要长期治疗方案，患者通常遭受到相关的肝毒性。对于目前疗法的抗性也形成了建立新疗法的需求。

发明内容

贯穿本说明书，除非上下文另有要求，否则词语“包括”或变化形式如“包含”或“含有”应理解为意指包括述及的要素或整体或方法步骤或者要素或整体或方法步骤的组，但是不排除任何要素或整体或方法步骤或者要素或整体或方法步骤的组。

如本说明书中使用的，未用数量词限定的名词包括单数和复数方面，除非上下文另外明确指出。因此，例如，提到“透化防卫素”包括单一透化防卫素，以及两种或更多种透化防卫素；提到试剂包括单一试剂，以及两种或更多种试剂。提到“本发明”包括本公开内容教导的单个或多个方面。能够使本发明的所有方面均在权利要求的范围内。

核苷酸和氨基酸序列由序列标识符编号(SEQ ID NO)指示。SEQ IDNO在数字上对应于序列标识符<400>1(SEQ ID NO：1)、<400>2(SEQ IDNO：2)等。在表1中提供了对序列标识符的总结。

本文公开了用于减少病原体(例如真菌和昆虫)对作物和观赏植物造成的损失的方法。常规控制方法包括施用化学杀真菌剂。这增加了作物和花卉生产的成本。根据本公开内容，在I类防卫素和透化防卫素之间鉴定到了令人惊讶的协同效应，导致提高了在预防和减轻植物的真菌和昆虫疾病状态中的效力。所述方法还能够治疗或预防人和非人动物对象中的病原体感染。提到的“I类”防卫素包括透化防卫素和非透化防卫素。因此，可使用一种或更多种透化防卫素。提到的“透化防卫素”包括I类防卫素、II类防卫素和是透化防卫素的变体防卫素。“变体”防卫素包括这样的防卫素，其中II类防卫素的环1B区被I类防卫素上的环1B区替换或者通过其他方式对II类环1B区进行一个或更多个氨基酸替换、添加或缺失。环1B区域位于防卫素N末端部分(也称为第一柔性环)上的第一β链(β链1)和α-螺旋之间。

如上所述，植物防卫素可分为两大类。I类防卫素由内质网(ER)信号序列接着成熟防卫素结构域组成。II类防卫素作为较大前体产生，除了ER信号序列和成熟结构域外还具有约33个氨基酸的C末端前结构域或前肽(CTPP)。

按照观察到的由两种防卫素的组合引起的真菌生长抑制％(Io值)和两种防卫素基于每种防卫素自身的真菌生长抑制％之和的预期真菌生长抑制％(根据Richer等(1987)Pestic Sci 19：309-315使用的Limpel公式计算的Ee值)之间的差对协同作用分类。差Io-Ee是协同值。小于15的协同值均意味着没有显著协同，15-30是低协同水平，30-60是中等协同水平，＞60是高协同水平。

因此，本公开内容教导了保护植物免受与病原体感染有关的疾病的方法，所述方法包括向细胞提供I类植物防卫素和透化防卫素或者其一或两者的前体或其功能同源物、类似物、衍生物或变体。在一个实施方案中，植物病原体是真菌。在另一个实施方案中，植物病原体是昆虫。在一个方面，提到的“植物”包括遗传修饰的植物，所述遗传修饰的植物含有产生I类防卫素和透化防卫素的细胞，其中在遗传修饰之前细胞不产生任一种防卫素。提到的“植物”包括遗传修饰的植物的后代，其包含因亲本的遗传修饰而产生一种或另一种或两种防卫素的细胞。因亲本的遗传修饰导致产生两种防卫素，并且传递给后代的这种性状赋予了在不产生两种防卫素的植物中观察不到的对真菌或昆虫病原体的抗性水平。I类防卫素可以是透化防卫素或非透化防卫素。本公开内容还教导了保护人或非人动物对象免受与病原体感染有关的疾病的方法，所述方法包括向细胞提供I类植物防卫素和透化防卫素或者其一或两者的前体或其功能同源物、类似物、衍生物或变体。在一个实施方案中，病原体是真菌。提到的非人动物对象包括农场动物(例如，牛、羊、猪、马、驴、美洲驼、羊驼、禽类动物)、家养动物(例如，狗、猫)、实验室测试动物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠、兔、仓鼠、非人灵长类动物)和捕获的野生动物。

术语“遗传修饰”意指通过DNA重组技术对植物或植物细胞进行遗传修饰以引入编码两种防卫素的遗传物质。或者，使用这种技术引入编码至少一种防卫素的遗传物质，并使用常规育种引入另一种防卫素基因。

在一个实施方案中，I类防卫素是透化防卫素。在另一个实施方案中，I类防卫素是非透化防卫素。在一个实施方案中，第二透化防卫素选自I类防卫、II类防卫素或变体防卫素。

本公开内容实现了用于保护植物免受真菌或昆虫病原体感染和/或降低严重的真菌或昆虫病原体相关疾病之发病率的方法。本公开内容还可用于将植物和/或其周围根系或土壤的真菌或昆虫感染降低至可接受水平。所述方法包括使用至少一种I类防卫素和一种透化防卫素的组合的多价方式。后者透化防卫素的实例是I类防卫素、II类防卫素或变体防卫素。变体防卫素教导在PCT/AU2012/000112中，其内容通过引用并入本文。出人意料地，给定的I类防卫素和给定的透化防卫素的的联合作用对于给定的真菌或昆虫病原体是协同的，即，当(至少)两种组分在植物环境中组合时，其抗病原体活性大于任一种防卫素单独作用的抑制效果的总和。协同的水平各不相同(The level of synergy is from low to high)。

因此，本公开内容教导了用于保护保护植物免受与真菌或昆虫病原体感染有关的疾病的方法，所述方法包括以协同有效量向所述植物的细胞提供I类防卫素和透化防卫素或者其一或两者的前体或其功能同源物、类似物、衍生物或变体以减少病原体的感染。

本发明上下文提到的“方法”包括植物管理系统、方案和流程。如上所述，在一个实施方案中，病原体是真菌病原体。在另一个实施方案中，病原体是昆虫病原体。

提到的“向植物的细胞提供”包括提供来自外源的两种防卫素，或者从细胞内(通过遗传修饰)提供它们二者，或者外源提供一种并且细胞内提供一种。因此，可使用局部施用和遗传改造并且任选地还包括常规育种以使遗传植物暴露于两种防卫素。本文还实现了包含两种防卫素的组合的局部种子包衣，或者向改造为表达另一种防卫素的植物或植物种子局部施用一种防卫素。

本文还实现了用于保护人或非人动物对象免受与真菌或昆虫病原体感染有关的疾病的方法，所述方法包括以协同有效量向人或非人动物的细胞提供I类防卫素和透化防卫素或者其一或两者的前体或其功能同源物、类似物、衍生物或变体以减少病原体的感染。

本公开内容还预期了I类防卫素和透化防卫素或者其一或两者的前体形式在制造对真菌或昆虫感染较不敏感或展示出较少真菌或昆虫感染相关损伤的遗传修饰植物中的用途。

本公开内容还预期了I类防卫素和透化防卫素或者其一者或两者的前体形式在制造用于治疗人或非人动物对象中的真菌感染的药物中的用途。

在一个实施方案中，本发明提供了用于保护作物或观赏植物免受真菌或昆虫攻击的方法，其包括向所述植物提供I类防卫素和透化防卫素或者其功能同源物、类似物或变体或等同物。在该实施方案中，与每种单独组分的各自效果的组合相比，认为两种组分的真菌或昆虫抑制程度是协同的。在一个实施方案中，通过至少一种I类防卫素和至少一种透化防卫素的组合协同抑制镰刀菌属(Fusarium)的种。I类防卫素的实例包括hordothionin(γ1-H)、zeathionin(γ-Zea2)、PsD1、DmAMP1、SBI6、VP42、VP45、VP135、RsAFP2、MsDef1、MtDef2、MtDef4、HsAFP1、VaD2、VrD2、ZmESR6和HXL防卫素(参见表2)。透化防卫素的实例包括NaD1、TPP3、PhD1A、PhD2、HXL001、HXL002、HXL004、HXL007、HXL008、HXP4、HXP34和HXP35以及NoD173(参见表2)。所述方法还可额外包括使用蛋白酶抑制剂或其前体形式，例如半胱氨酸或丝氨酸蛋白酶抑制剂(例如，马铃薯StPin1A[以前称为Pot1A(美国专利No.7,462,695)])、HvCPI6、SICys9、At2g38870、牛胰腺胰蛋白酶抑制剂(BPTI)或牛胰蛋白酶抑制剂I-P。单独地对系统的每一种组分的抑制敏感的任何真菌或昆虫均可使用组合以比使用任一种组分本身更有效地控制。特别有用的组合包括HXP4、NaD1、HXL004、HXL001和/或HXL008作为透化防卫素，HXL012、HXL015、SB16、HXL009、HXL008和/或HXL021作为I类防卫素。

本公开内容还提供了保护植物免受与真菌或昆虫病原体感染有关的疾病的方法。所述方法包括向植物细胞提供I类防卫素和透化防卫素以及任选地蛋白酶抑制剂，或者这些组分的任意一种或全部的前体或其功能同源物、类似物、衍生物或变体。

本发明方法的多价方式包括一起协同作用的I类防卫素和透化防卫素，或者还包含蛋白酶抑制剂或其前体形式。这些组分可通过重组手段在植物细胞中产生，或者可局部地向植物细胞提供，例如作为喷雾、气雾剂、粉末的形式，或作为肥料或植物养料的一部分。如上所述，在另一个选择中，一种组分通过重组手段提供，另一种组分外源提供。本文还实现了局部种子包衣剂(seed coatings)。将两种防卫素施用到种皮中，或者将一种防卫素局部施用到已改造为表达另一种防卫素的植物或种子。在一个实施方案中，通过基因工程手段提供一种或另一种防卫素，并通过常规育种提供另一种防卫素。

本文教导的另一个方面是用于抑制真菌或昆虫生长、复制、感染和/或保持的方法，所述方法包括使真菌或昆虫暴露于I类防卫素和透化防卫素的组合。还可使用蛋白酶抑制剂或其前体形式。这适用于植物以及人和非人动物对象。

另外，同与组合暴露所使用相同剂量的任一种组分单独接触真菌所提供的抑制的总和相比，在两种防卫素存在下的真菌或昆虫抑制的程度是协同性的。

如果每一种组分单独对真菌或昆虫发挥抑制活性，或者组合中的组分发挥协同的组合抑制效果，则真菌或昆虫是对系统的每一种单独组分“抑制敏感”。

基于是否嵌合防卫素被认为是I类防卫素或透化防卫素或它们二者，也可将保留抗真菌活性的嵌合防卫素分子和/或防卫素变体用在用于本发明的植物保护方法中。

本文还实现了多基因表达载体(MGEV)，其包含具有2至8个结构域区段的多核苷酸，每个结构域编码功能蛋白，其中至少一个结构域编码I类防卫素并且至少一个另外的结构域编码透化防卫素，每个结构域在线性序列中通过接头序列与下一个结构域相连，所述接头序列编码具有SEQ ID NO：86所示出的氨基酸序列的接头肽。MGEV载体在USSN2007-0277263中公开，其内容通过引用并入本文。

在一个实施方案中，至少一个另外的结构域编码蛋白酶抑制剂或其前体形式。

接头肽包含氨基酸序列X₁X₂X₃X₄X₅(SEQ ID NO：86)，其中：

X₁＝E或D

X₂＝E或D

X₃＝K或R

X₄＝K或R

X₅＝N或Q。

本公开内容还教导了I类防卫素和透化防卫素以及任选地蛋白酶抑制剂或者这些组分的任意一种或全部的功能同源物、类似物、衍生物或其变体在制造抗真菌或昆虫病原体感染的遗传修饰植物或其后代中的用途。

本公开内容还教导了I类防卫素和透化防卫素以及任选地蛋白酶抑制剂或者这些组分的任意一种或全部的功能同源物、类似物、衍生物或变体在使人或非人动物对象或其后代抵抗真菌或昆虫病原体侵袭方面的用途。

可用在本发明方法的实施方案中的蛋白酶抑制剂包括但不限于半胱氨酸蛋白酶抑制剂和丝氨酸蛋白酶抑制剂。

可通过本发明方法保护免受真菌或昆虫感染的植物包括对真菌或昆虫敏感的那些植物，或者可向其施用包含防卫素和蛋白酶抑制剂的组合物的那些植物，所述真菌或昆虫对可在所述植物中作为转基因表达的蛋白酶抑制剂和植物防卫素敏感。本文还预期了组合转基因和局部施用的方式。“局部施用方式”包括种子包衣剂。蛋白酶抑制剂通常是蛋白质或肽或其化学类似物。植物可以是单子叶植物或双子叶植物。具体植物包括玉米(玉蜀黍)、大豆、棉花、加拿大油菜和小麦等，以及茄科、十字花科、锦葵科和豆科植物。

可使用本发明系统控制多种植物物种中的来自多种真菌病原体的感染和损伤，尤其是丝状真菌的那些。可控制的真菌和卵菌病原体的实例包括但不限于镰刀菌属、轮枝孢属(Verticillium)、腐霉属(Pythium)、丝核菌属(Rhizoctonia)、核盘菌属(Sclerotinia)、小球腔菌属(Leptosphaeria)、疫霉属(Phytophthora)、炭疽菌属(Colletotrichum)、尾孢属(Cercospora)和链格孢属(Alternaria)的种以及锈菌。重要应用包括但不限于蛋白酶抑制剂和抗真菌防卫素的协同组合，其用于例如保护植物免受以下真菌：禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum，Fgr)、尖孢镰刀菌萎蔫专化型(Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum，Fov)、禾生炭疽菌(Colletotrichum graminicola，Cgr)、十字花科小球腔菌(Leptosphaeria maculans)、甘蓝链格孢菌(Alternaria brassicicola)、互隔交链孢霉菌(Alternaria alternata)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、灰霉病菌(Botrytis cinerea)、甜菜生尾孢(Cercospora beticola)、玉米尾孢(Cercospora zeae maydis)、异旋腔孢菌(Cochliobolus heterostrophus)、玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)、大刀镰刀菌(Fusariumculmorum)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、尖孢镰刀菌石竹专化型(Fusarium oxysporum f.sp.dianthi)、尖孢镰刀菌番茄专化型(Fusariumoxysporum f.sp.lycopersici)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、小麦冠腐病菌(Fusarium pseudograminearum)、轮枝镰孢菌(Fusariumverticilloides，Fve)、禾顶囊壳小麦变种(Gaeumannomyces graminis var.tritici)、芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae)、核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)、玉米干腐病菌(Stenocarpella(Diplodia)maydis)、根串珠霉(Thielaviopsis basicola)、大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)、玉米黑粉菌(Ustilago zeae)、玉米柄锈菌(Puccinia sorghi)、菜豆壳球孢菌(Macrophomina phaseolina)、大豆茎褐腐病菌(Phialophora gregata)、大豆茎溃疡病菌(Diaporthe phaseolorum)、大豆灰斑病菌(Cercosporasojina)、大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)、立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi)、大孢链格孢(Alternariamacrospora)、棉尾孢(Cercospora gossypina)、短小茎点霉(Phomaexigua)、Puccinia schedonnardii、Puccinia cacabata、根腐病菌(Phymatotrichopsis omnivora)、燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum)、芸薹链格孢(Alternaria brassicae)、萝卜链格孢(Alternaria raphani)、禾白粉菌(Erysiphe graminis)(布氏白粉菌(Blumeria graminis))、小麦壳针孢(Septoria tritici)、狗牙根壳针孢(Septoria nodorum)、Mycosphaerellazeae、禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)、小麦散黑粉病菌(Ustilago tritici)、禾柄锈菌(Puccinia graminis)、小麦叶锈菌(Puccinia triticina)、小麦印度腥黑穗病菌(Tilletia indica)、小麦网腥黑穗菌(Tilletia caries)和腥黑粉菌(Tilletia)。

昆虫病原体包括西南玉米螟虫(Diatraea grandiosella)、欧洲玉米螟(Ostrinia nubialis)、缢管蚜属(Rhopalosiphum spp)、铃夜蛾属(Helicoverpa spp)、小菜蛾(Plutella xylostella)和草盲蝽属(Lygus spp)。

本文还预期了包含I类防卫素和透化防卫素或者其抗真菌或抗昆虫的同源物、类似物、变体和功能等效物或者它们的前体形式的农艺组合物。组合物还可包含蛋白酶抑制剂或其前体形式。农艺组合物包括种子包衣制剂。

本文还预期了用于控制植物病原体感染植物的方案，其包括操控植物环境以提供抑制病原体的量的I类防卫素和透化防卫素。

在一个具体实施方案中，提到的“植物病原体”包括真菌和昆虫或其他相关生物体。真菌包括锈菌。通常，当方法包括对植物进行遗传修饰以表达两种防卫素时，术语“植物”包括其后代。当方法包括局部施用防卫素的组合时，效果通常限于特定植物。

虽然本公开内容特别地涉及抗植物病原体方法，但是该多价方式还可用于人和非人对象，包括农场动物、家养动物、实验室试验动物和捕获的野生动物。一般而言，在这些情况下使用局部方式。通常地，人和非人对象中的多价方式尤其针对酵母，例如假丝酵母属(Candida)和隐球酵母属(Cryptococcus)，皮肤真菌，例如毛癣菌属(Trichophyton)，包括趾间毛癣菌(Trichophyton interdigitale)和红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)以及其他丝状真菌，包括曲霉属(Aspergillus spp)，例如黑曲霉(Aspergillusniger)。

本文还实现了用于保护植物免受与病原体感染有关的疾病的方法，所述方法包括向其中的细胞提供I类防卫素、透化防卫素或者其一或两者的前体或其功能同源物、类似物、衍生物或变体，所述I类防卫素具有包含选自SEQ ID NO：81、83、85、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57、60、63、66和69的氨基酸序列的成熟结构域，所述透化防卫素具有选自由NaD1、TPP3、PhD1A、PhD2、NoD173、SEQ ID NO：3、6、12、21、24、70、71和72组成之列表的成熟结构域。

本文还实现了用于保护植物免受与病原体感染有关的疾病的方法，所述方法包括向其中的细胞提供I类防卫素、透化防卫素或者其一或两者的前体或其功能同源物、类似物、衍生物或变体，所述I类防卫素具有包含选自SEQ ID NO：81、83、85、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57、60、63、66和69的氨基酸序列的成熟结构域，所述透化防卫素具有选自由SEQ ID NO：3、6、12、21、24、70、71和72组成之列表的成熟结构域。

本文还实现了用于保护人或非人动物对象免受与病原体感染有关的疾病的方法，所述方法包括向其中的细胞提供I类防卫素、透化防卫素或者其一或两者的前体或其功能同源物、类似物、衍生物或变体，所述I类防卫素具有包含选自SEQ ID NO：81、83、85、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57、60、63、66和69的氨基酸序列的成熟结构域，所述透化防卫素具有选自由NaD1、TPP3、PhD1A、PhD2、NoD173、SEQ ID NO：3、6、12、21、24、70、71和72组成之列表的成熟结构域。

表1

序列标识符总结

附图简述

图1是示出了在Fov菌丝上进行的透化测定的结果的图示，其证明了透化防卫素(NaD1、HXP4、HXL002、HXL007和HXL008)与非透化防卫素(DmAMP1)之间的差异。

图2是示出了在Fgr菌丝上进行的透化测定的结果的图示，其证明了透化防卫素(NaD1、HXP4、HXL002、HXL004、HXL008和HXL013)与非透化防卫素(Hordothionin、RsAFP2、HXL009和HXL021)之间的差异。

发明详述

植物病原体真菌包括但不局限于禾谷镰刀菌(Fgr)、尖孢镰刀菌萎蔫专化型(Fov)、禾生炭疽菌(Cgr)、十字花科小球腔菌、甘蓝链格孢菌、互隔交链孢霉菌、构巢曲霉、灰霉病菌、甜菜生尾孢、玉米尾孢、异旋腔孢菌、玉米大斑病菌、大刀镰刀菌、尖孢镰刀菌、尖孢镰刀菌石竹专化型、尖孢镰刀菌番茄专化型、腐皮镰刀菌、小麦冠腐病菌、轮枝镰孢菌(Fve)、禾顶囊壳小麦变种、芸薹根肿菌、核盘菌、玉米干腐病菌、根串珠霉、大丽轮枝菌、玉米黑粉菌、玉米柄锈菌、菜豆壳球孢菌、大豆茎褐腐病菌、大豆茎溃疡病菌、大豆灰斑病菌、大豆疫霉菌、立枯丝核菌、豆薯层锈菌、大孢链格孢、棉尾孢、短小茎点霉、Puccinia schedonnardii、Pucciniacacabata、根腐病菌、燕麦镰刀菌、芸薹链格孢、萝卜链格孢、禾白粉菌(布氏白粉菌)、小麦壳针孢、狗牙根壳针孢、Mycosphaerella zeae、禾谷丝核菌、小麦散黑粉病菌、禾柄锈菌、小麦叶锈菌、小麦印度腥黑穗病菌、小麦网腥黑穗菌和腥黑粉菌。

人和非人对象的真菌病原体包括酵母菌例如假丝酵母和隐球酵母、皮肤真菌例如毛癣菌属，如趾间毛癣菌和红色毛癣菌，以及其他丝状真菌包括曲霉属例如黑曲霉。

植物病原性(phytopathogenic)昆虫包括西南玉米螟、欧洲玉米螟、缢管蚜属、铃夜蛾属、小菜蛾和草盲蝽属。

提及的“变体”包括特定序列的衍生物以及天然变体例如多态性变体。其还包括合成变体例如包含来自例如另一种防卫素的异源结构域或环的防卫素，例如PCT/AU2012/000112中所述的防卫素，其内容通过引用并入文本。

本文中提出给定防卫素对的抑制作用是协同的。Greco等(1995)Pharmacol Rev 47：331-385已根据以下对不同类型的协同作用进行了定义：两种成分中的一种、两种或没有一种当在不存在另一种成分的情况下进行测定时是否具有可测量的活性。本文中采用的定义包括所有这样的情况，只要两种成分一同作用时的组合作用大于单一成分单独作用之和即可。应当理解的是，仅在某些条件下，例如当一种或更多种成分以比单独效力的最大浓度低的浓度存在时，两种或更多种成分的协同组合可产生大于加和的活性。如果存在一组这样的条件，包括但不局限于浓度，当成分一同作用时的组合作用大于单一成分单独作用之和时，则认为这些成分的组合是协同的，如该术语在本文中的含义。Richer(1987)(同上)描述了建立协同证据的数学方法。该方法使用Limpel公式，Limpel公式在Richer(1987)(同上)中进行了定义并且Harman等美国专利No.US 6,512,166曾使用其来证明真菌细胞壁降解酶与影响真菌细胞膜的化合物之间对植物病原体真菌的生长的协同。类似的方法可用于昆虫。

按照观察到的由两种防卫素之组合引起的真菌生长抑制％(Io值)和这两种防卫素基于每种防卫素自身的真菌生长抑制％之和的预期生长抑制％(Ee值根据Richer等(1987)(同上)使用的Limpel公式计算)之间的差值来对协同作用进行分类。差值Io-Ee是协同值。协同值小于15意味着没有显著的协同；15至30是低协同水平；30至60是中等协同水平；而＞60是高协同水平。

“真菌抑制”包括杀真菌活性和抑制真菌活性两者，如通过相比较于对照的真菌生长降低(或存活力丧失)所测量的。真菌生长可通过本领域中已知的很多不同的方法进行测量。测量丝状真菌生长的常用方法需要使孢子在合适的生长培养基中萌发、孵育足以获得可测量的生长的时间并在指定孵育时间后测量培养物中增加的光密度。光密度随生长增加而增加。一般情况下，真菌生长对发病机理来说是必需的。因此，真菌生长的抑制为保护免受真菌疾病提供了合适的指示，即抑制越大，保护作用越有效。类似地，“昆虫抑制”包括杀昆虫活性和抑制昆虫活性两者。抗昆虫活性可在喂养试验中进行有效测量。

本文中的“预防感染”指与不表达两种防卫素转基因或未经两种防卫素治疗的植物相比时，经本发明的方法治疗的植物或人或非人动物对象避免了病原体感染或疾病症状或以上所有，或者表现出减少或最小化或较不频繁的病原体感染或疾病症状或以上所有，而所述病原体感染或疾病症状或以上所有是对象-病原体相互作用的自然结果。也就是说，防止或减少病原体引起的疾病和/或相关疾病症状。与未如此经本发明教导的方法治疗的植物相比，感染和/或症状减少至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％或更多。在一方面，本文公开的方法导致在存在两种防卫素的情况下致病真菌的孢子形成在较大程度上被减少。

因此，防卫素的组合作用是抑制真菌生长、复制、感染和/或保持，以及其他抑制活性和/或抑制昆虫感染。

可通过本领域中已知的方法对植物保护(疾病抗性或减少)进行评价。参见，Uknes(1993)Molecular Plant Microbe Interactions 6：680-685、Gorlach等(1996)Plant Cell 8：629-643、Alexander等(1993)ProcNatl AcadSci USA90：7327-7331。技术人员将认识到用于确定通过植物病原体的植物感染和疾病的方法取决于被测试的病原体和植物。

提及的“I类”防卫素包括透化防卫素和非透化防卫素。提及的“透化防卫素”包括I类防卫素、II类防卫素和是透化防卫素的变体防卫素。“变体”防卫素包括这样的防卫素，其中II类防卫素的环1B区被I类防卫素上的环1B区替换或者通过其他方式对II类环1B区进行一个或更多个氨基酸替换、添加或缺失。环1B区位于防卫素N端末端部分上的第一β-链(β-链1)和α-螺旋之间(也称为第一柔性环)。如上所述，植物防卫素分为两个主要类别。I类防卫素由内质网(ER)序列接成熟防卫素结构域组成。II类防卫素作为较大前体产生，除了ER信号序列和成熟结构域外还具有约33个氨基酸的C末端前结构域或前肽(CTPP)。

透化防卫素是允许DNA结合染料(例如SYTOX(注册商标))进入菌丝细胞中的防卫素。例如，将菌丝生长并与DNA结合染料孵育10分钟，之后加入待测试的肽以测试其透化能力。然后，测量DNA结合染料摄取量。在SYTOX的情况下，测量借助于激发和发射波长分别为488nm和538nm的荧光。方便地，使用尖孢镰刀菌萎蔫专化型(Fusariumoxysporum f.sp.Vasinfectum，Fov)来进行透化测定。在该测定中，将透化防卫素NaD1设定为1.0，并认为提供0.12以上的渗透性指数的任何防卫素肽为透化防卫素。参见图1和表12a。更多信息可见于PCT/AU2009/000106中。

另一种测定涉及禾谷镰刀菌(Fgr)，也使用NaD1作为阳性对照，并将其设置在1.0的渗透指数。参见图2和表12b。

提及的I类防卫素包括hordothionin(γ1-H)、zeathionin(γ-Zea2)、PsD1、DmAMP1、SBI6、VP42、VP45、VP135、RsAFP2、MsDef1、MtDef2、MtDef4、HsAFP1、VaD2、VrD2、ZmESR6或HXL防卫素(参见表2)。提及的透化防卫素包括II类防卫素例如NaD1、TPP3、PhD1A或PhD2、NoD173；I类防卫素例如HXL001、HXL002、HXL004、HXL007或HXL008；或变体防卫素例如HXP4、HXP34或HXP35(参见表2)。特别有用的组合包括作为透化防卫素的HXP4、NaD1、HXL004、HXL001和/或HXL008与作为I类防卫素的HXL012、HXL015、SB16、HXL009、HXL008和/或HXL021。

本文还实现了用于保护植物或人或非人动物对象免受与病原体感染有关的疾病的方法，所述方法包括向其中的细胞提供I类防卫素、透化防卫素或者其一或两者的前体或其功能同源物、类似物、衍生物或变体，所述I类防卫素具有包含选自SEQ ID NO：81、83、85、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57、60、63、66和69的氨基酸序列的成熟结构域，所述透化防卫素具有选自由NaD1、TPP3、PhD1A、PhD2、NoD173、SEQ ID NO：3、6、12、21、24、70、71和72组成之列表的成熟结构域。

本文还实现了用于保护植物或人或非人动物对象免受与病原体感染有关的疾病的方法，所述方法包括向其中的细胞提供I类防卫素、透化防卫素或者其一或两者的前体或其功能同源物、类似物、衍生物或变体，所述I类防卫素具有包含选自SEQ ID NO：81、83、85、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57、60、63、66和69的氨基酸序列的成熟结构域，所述透化防卫素具有选自由SEQ IDNO：3、6、12、21、24、70、71和72组成之列表的成熟结构域。

本文使用的术语“蛋白酶抑制剂”包括用于抑制真菌或昆虫蛋白酶活性和保护植物或人或非人动物对象免受真菌或昆虫疾病的蛋白质或肽。本文还包括蛋白酶抑制剂的化学类似物或功能性等同物。

蛋白酶抑制剂还可以以前体形式提供，所述前体形式加工成活性形式后变得有效。

半胱氨酸蛋白酶抑制剂或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白是半胱氨酸蛋白酶的紧密且可逆结合抑制剂。其包括一个超家族，而该超家族又细分为三个家族：stefin、抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和激肽原(Turk和Bode(1991)FEBSLett.285：213-219)。

丝氨酸蛋白酶抑制剂或丝氨酸肽链内切酶切割肽键，其中丝氨酸起亲核氨基酸的作用。一般有两种类型：胰凝乳蛋白酶样酶，其包括胰蛋白酶样酶、胰凝乳蛋白酶样酶和弹性蛋白酶样酶；以及枯草杆菌蛋白酶样酶(Madala等(2010)Chem Rev 110(6)：1-31)。

当本发明方法中的两种或更多种成分产生的组合作用大于每种成分单独作用时的单独作用之和时，发生“协同作用”。所述作用可以是效力、稳定性、速率和/或毒性水平中的一种或更多种。如本文所述，在I类防卫素和透化防卫素组合存在下测量的协同病原体生长抑制大于在特定浓度范围的每种防卫素成分单独存在而在其他方面相同的条件下测量的抑制之和。应当理解的是，并非必需对两种成分的每个浓度组合都观察到大于加和作用的作用才被认为是协同的。两种成分的协同作用在某些浓度组合下可被观察到，而在另一些中则观察不到。例如，如果不能进入真菌细胞限制毒性，则透化防卫素的存在可与第二防卫素产生协同，特别是如果该防卫素的浓度在抑制方面不是最大的。在一个实施方案中，两种防卫素中的一种或两种的浓度不是最大的。类似地，如果一种或两种成分以产生最大的可观察抑制的高水平(最大水平)存在，协同可被掩盖。因此，将用于防卫素-防卫素组合的一般系统称为“协同性的”；因为即使在所有条件下都观察不到协同作用的情况下，也是可能存在的协同作用。对于至少一些剂量而言，与可通过任一种成分单独作用时获得的真菌抑制相比，两种植物防卫素之间的协同作用提供了更大的真菌抑制。本公开内容教导了增加的保护植物免受真菌疾病和昆虫侵袭，并降低对化学杀真菌剂或杀虫剂的依赖性。这意味着种植者的投入成本降低、针对植物病原体的活性谱更广和对环境损害的可能性降低。此外，极大地降低了形成抗杀病原性病原体菌株的选择压力，其能够延长商业寿命以及减少抗性真菌菌株的增殖并降低出现多重抗性菌株的可能性。

因此，本公开内容的方法可用于降低由真菌或昆虫感染或侵袭而引起的经济损失。本公开内容的方法还有利于改善由人和非人动物对象暴露于病原体引起的疾病或疾病症状。

在本文教导的一个方面，提供了用于保护植物免受病原体(例如真菌或昆虫病原)有关的疾病的方法，以及引起对植物或植物部分进行杀病原治疗(pathogenicide treatment)的需求降低的预防或治疗，从而降低材料、劳力和环境污染的成本或延长这些植物的产品(例如，果实、种子等)之货架期。

在一个实施方案中，病原体是真菌。提及的非人动物对象包括农场动物(例如，牛、绵羊、猪、马、驴、美洲驼、羊驼、禽类动物)、家养动物(例如狗、猫)、实验室测试动物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠、兔、仓鼠、非人灵长类动物)和捕获的野生动物。

术语“植物”包括整个植物及其部分，包括但不局限于，枝条、营养器官/结构(例如叶、茎和块茎)、根、花和花器官/结构(例如苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药和胚珠)、种子(包括胚、胚乳和种皮)和果实(成熟子房)、植物组织(例如维管组织、基本组织等)和细胞(例如保卫细胞、卵细胞等)及其后代。可使用本文所述的方法保护的植物包括高等植物和低等植物，包括被子植物(单子叶植物和双子叶植物)、裸子植物、蕨类植物、木贼类植物、裸蕨植物、石松类植物(lycophytes)、苔藓植物和多细胞藻类植物。本发明方法中使用的植物包括任何维管植物，例如单子叶植物或双子叶植物或裸子植物，包括但不局限于，玉米(玉蜀黍)、大豆、棉花、棉籽、加拿大油菜、小麦、苜蓿、苹果、拟南芥(Arabidopsis)、香蕉、大麦、蓖麻、菊花、三叶草、可可、咖啡、海甘蓝、蔓越莓、黄瓜、密花石斛、薯蓣属、桉树、羊茅草、亚麻、剑兰、百合科、亚麻籽、粟、香瓜、芥菜、燕麦、油棕、油菜(oilseed rape、rape、rapa)、番木瓜、花生、菠萝、观赏植物、菜豆属(Phaseolus)、马铃薯、油菜籽、稻、黑麦、黑麦草、红花、芝麻、高粱、甜菜、甘蔗、向日葵、草莓、烟草、番茄、草皮草和蔬菜作物如莴苣、芹菜、西兰花(croccoli)、花椰菜、葫芦、洋葱(包括大蒜、葱、韭葱、和细香葱)；果树和坚果树，例如苹果树、梨树、桃树、橙树、葡萄柚树、柠檬树、酸橙、杏树、美洲山核桃树、胡桃树、榛树(hazelnut)；藤本植物，诸如葡萄、猕猴桃(kiwifruit)、蛇麻草；果实灌木和荆棘，例如树莓、黑莓、醋栗；和森林树木，例如白蜡木(ash)、松树、冷杉、枫树、橡树、栗树和杨树。

本文中预期的特定植物包括玉米、大豆、棉花、加拿大油菜和小麦。

提及的“昆虫病原体”包括以下类别的昆虫：西南玉米螟、欧洲玉米螟、缢管蚜属、铃夜蛾属、小菜蛾和草盲蝽属。

“转基因植物”指包含相同物种、变种或品种的野生型植物中不存在(即，“外源”)的遗传物质的植物或其种子或其后代。遗传物质可包括转基因、插入诱变事件(例如通过转座子或T-DNA插入诱变)、激活标签序列、突变序列、同源重组事件或经嵌合修复术(chimeraplasty)改造的序列。一般情况下，外来遗传物质已通过人为操作导入到植物中，但是可使用本领域技术人员认识到的任何方法。还可使用术语“遗传修饰的植物”，其与本文中的“转基因植物”具有相同的含义。在一个实施方案中，植物或其部分(例如种子)被遗传改造成表达一种防卫素，而第二种防卫素外源性地提供，例如种子包衣或局部制剂。

转基因植物可包含表达载体或表达盒。表达盒一般包含多肽编码序列，其与允许该多肽表达的合适诱导型或组成型调控序列有效连接(一般受控于其)。可通过转化或通过在转化亲本植物后进行育种来将表达盒导入植物中。合适的表达盒的一个实例公开在美国专利申请No.11/753,072[相当于PCT/AU2007/000712]中，其内容通过引用并入文本。

本发明方法中使用的植物或植物部分包括任何植物发育阶段的植物。方便地，应用发生在萌发、幼苗生长、营养生长和生殖生长阶段期间。特别地，在营养生长和生殖生长阶段期间进行本发明方法的应用。本文中也将营养生长和生殖生长阶段的植物称为“成年”或“成熟”植物。本文中还教导了植物遗传工程和局部施用防卫素的组合。此外，可将防卫素中的一种或另外的一种通过遗传工程手段导入，而将另一种通过传统的育种实践导入。

本公开内容提供了利用I类防卫素与透化防卫素之间的协同作用来保护植物免受真菌或昆虫感染的方法，同时应当理解的是可向该组合添加另外的材料以对植物健康实现更多益处，例如通过掺入蛋白酶抑制剂或杀真菌或杀昆虫蛋白，或者通过利用属于这两类防卫素中任一类或两类的一种以上防卫素。例如，可潜在地通过使用另外的试剂来扩大针对植物病原体的活性谱。

防卫素成分方便地由遗传修饰后要被保护的植物提供，但是本发明的方法延伸至表面喷雾剂或种子包衣剂以及被掺入肥料或植物养分中。在一个实施方案中，将植物用本领域中公知的方法遗传修饰表达期望的两种防卫素。

可通过本领域中已知的方法对植物保护(疾病抗性或减少)进行评价。参见，Uknes(1993)Molecular Plant Microbe Interactions 6：680-685、Gorlach等(1996)(同上)、Alexander等(1993)(同上)。技术人员将认识到用于通过植物病原体确定植物感染和疾病的方法取决于被测试的病原体和植物。

本文还实现了用于保护人或非人动物对象免受与真菌或昆虫病原体感染有关的疾病的方法，所述方法包括以协同有效量向所述人或非人动物的细胞提供I类防卫素和透化防卫素或者其一或两者的前体或功能同源物、类似物、衍生物或变体以减少病原体的感染。

本公开内容还预期了I类防卫素和透化防卫素或者其一或两者的前体形式在制备用于治疗人或非人动物对象中真菌侵袭的药物中的用途。

如上所述，I类防卫素可以是透化防卫素或非透化防卫素。因此，可使用一种或两种透化防卫素。

在一个实施方案中，将核酸有效地与启动子连接并导入植物细胞的基因组中。在合适的条件下，启动子能够表达核酸分子并产生mRNA，而mRNA随后被翻译成防卫素蛋白。使用植物细胞来再生被称为“遗传修饰的植物”的植物。遗传修饰是导入能够产生防卫素的可表达核酸分子，而防卫素进而赋予植物细胞对真菌病原体侵袭的抗性。

核酸序列可在植物细胞中进行表达。预期本领域中的技术人员知道很多可用于表达编码防卫素蛋白之核酸的表达系统。所以，不再试图对多种已知的用于在植物细胞中表达蛋白质的方法进行详细描述。

本文使用的术语“异源”在提及核酸时指这样的核酸，其来源于的植物物种或菌株不同于该核酸的目的受体植物。例如，与异源核苷酸序列有效地连接的启动子来自的植物物种可不同于该核苷酸序列来源于的植物。

“遗传修饰的植物”指包含含有异源核酸序列的细胞的植物。遗传修饰的植物可直接从再生植物、其后代获得，或者通过遗传工程和传统育种的组合获得。本文中的“异源”核酸指编码一种或另一种或两种防卫素和任选的蛋白酶抑制剂或其前体形式的核酸。

防卫素序列一般提供在以用于在目的植物中表达的表达盒或DNA构建体中。所述盒将包括与本发明的防卫素序列有效地连接的5’和3’调控序列。“有效连接”指启动子与第二序列之间的功能性连接，目的是启动子序列启动并介导对应于第二序列的DNA序列的转录。一般情况下，有效连接指被连接的核酸序列是连续的，并且在需要将两个蛋白质编码区连接时是连续的且在同一阅读框中。所述盒可另外包含至少一个被共转化到生物体中的另外基因。或者，可将所述的一个或更多个另外基因提供在多个表达盒上。

这样的表达盒提供有用于插入受调控区转录调控的防卫素序列的多个限制性位点。所述表达盒可另外包含选择性标记基因。

所述表达盒在5’-3’转录方向上包括在植物中具有功能的转录和翻译起始区、本发明的防卫素DNA序列以及转录和翻译终止区。转录起始区，即启动子，对植物宿主而言可以是同源的(native)或类似的或外来的或异源的。另外地，启动子可以是天然序列，或者可替代地是合成序列。“外来的”指转录起始区在该转录起始区导入到天然植物之前不在其中存在。本文所用的嵌合基因包含这样的编码序列，其与对该编码序列是异源的转录起始区有效连接。

尽管使用异源启动子来表达序列可能是有用的，但是也可使用天然启动子序列。

终止区可以是转录起始区的天然终止区、可以是有效连接的目的DNA序列的天然终止区或者可来源于另一来源。合适的终止区可获自根癌农杆菌(A.tumefaciens)的Ti-质粒，例如章鱼碱合酶和胭脂碱合成酶(nopaline synthase)终止区。还参见Guerineau等(1991)Mol.Gen.Genet.262：141-144；Proudfoot(1991)Cell 64：671-674；Sanfacon等(1991)GenesDev.5：141-149；Mogen等(1990)Plant Cell 2：1261-1272；Munroe等(1990)Gene 91：151-158；Ballas等(1989)Nucleic Acids Res.17：7891-7903和Joshi等(1987)Nucleic Acid Res.15：9627-9639。

适当时，可对一个或更多个基因进行优化以增加在转化植物细胞中的表达。即，可使用植物优选的密码子来合成基因以提高表达。关于宿主优选密码子使用的讨论，参见，例如Campbell和Gowri(1990)Plant Physiol.92：1-11。用于合成植物优选的基因的方法在本领域中是可获得的。参见，例如美国专利No.5,380,831、5,436,391和Murray等(1989)Nucleic AcidsRes.17：477-498。

用于增强细胞宿主中基因表达的另外序列修饰是已知的。这些包括去除编码假多腺苷酸化信号、外显子-内含子剪接位点信号、转座子样重复的序列和那些可能对基因表达有害的经充分表征序列。可将序列的G-C含量调节至给定细胞宿主的平均水平，如通过参考在该宿主细胞中表达的已知基因计算的。可能时，对序列进行修饰以避免预测的发夹二级mRNA结构。

表达盒可另外在表达盒构建体中包含5’前导序列。这样的前导序列可起增强翻译的作用。翻译前导区(leader)在本领域中是已知的，并且包括小RNA病毒前导区，例如EMCV前导区(脑心肌炎5’非编码区)(Elroy-Stein等(1989)PNAS USA 86：6126-6130)；马铃薯Y病毒属(potyvirus)前导序列，例如TEV前导区(烟草蚀纹病毒，Tobacco EtchVirus)[Allison等(1986)；MDMV前导区(玉米矮花叶病毒，Maize DwarfMosaic Virus)；Virology 154：9-20]，和人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)，(Macejak等(1991)Nature 353：90-94)；来自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mRNA(AMV RNA 4)的非翻译前导区[Jobling等(1987)Nature325：622-625]；烟草花叶病毒前导区(TMV)(Gallie等(1989)In MolecularBiology of RNA，编辑.Cech(Liss，New York)，第237-256页)；和玉米褪绿斑驳病毒前导区(MCMV)[Lommel等(1991)Virology 81：382-385]。还参见Della-Cioppa等(1987)Plant Physiol.84：965-968。还可利用其他的已知方法来增强翻译，例如内含子等。

在制备表达盒中，可对不同的DNA片段进行操作以提供合适方向的(并且适当时在合适阅读框中的)DNA序列。为此，可采用连接物或接头来将DNA片段连接，或者可涉及其他操作以提供方便的限制性位点、除去多余DNA、除去限制性位点等。出于这一目的，可包括体外诱变、引物修复、限制、退火、再置换(resubstitution)(例如转换和颠换)。

一般情况下，表达盒将包含用于选择转化细胞的选择性标记基因。可利用选择性标记基因来选择转化的细胞或组织。标记基因包括编码抗生素抗性的基因，例如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的那些基因，以及赋予对除草剂化合物(如草甘膦、草铵膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2，4-二氯苯氧乙酸酯(2，4-D))的抗性的基因。一般参见Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.3：506-511；Christopherson等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6314-6318。

上文列出的选择性标记基因并不意味着是限制性的。可使用任何的选择性标记基因。

多种启动子可用于产生表达构建体。可根据期望结果来选择启动子。即，可将核酸与组成型、组织优选型或用于在目的宿主细胞中表达的其他启动子组合。此类组成型启动子包括，例如Rsyn7启动子的核心启动子以及WO 99/43838和美国专利No.6,072,050中公开的其他组成型启动子；核心CaMV 35S启动子(Odell等(1985)Nature 313：810-812)；稻肌动蛋白(McElroy等(1990)Plant Cell 2：163-171)；泛素(Christensen等(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632和Christensen等(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689)；pEMU(Last等(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-588)；MAS(Velten等(1984)EMBO J.3：2723-2730)；ALS启动子(美国专利No.5,659,026)等。其他的组成型启动子包括，例如美国专利No.5,608,149、5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142；和6,177,611中公开的那些。这些参考文献均通过引用并入文本。

本文还实现了多基因表达载体(MGEV)，其包含具有2至8个结构域区段的多核苷酸，每个结构域编码功能蛋白，其中至少一个结构域编码I类防卫素，并且至少一个另外的结构域编码透化防卫素，每个结构域在线性序列中通过接头序列与下一个结构域相连，所述接头序列编码具有SEQ ID NO：86所示出的氨基酸序列的接头肽。

在一个实施方案中，至少一个另外的结构域编码蛋白酶抑制剂或其前体形式。如上所述，MGEV载体在USSN 2007-0277263中进行了描述，其通过引用并入文本。

所述接头肽包含氨基酸序列X₁X₂X₃X₄X₅(SEQ ID NO：86)，其中

X₁＝E或D

X₂＝E或D

X₃＝K或R

X₄＝K或R

X₅＝N或Q。

转化/转染的方法对本公开内容而言不是关键的；目前，可获得多种转化或转染方法。如果有更新的方法可用于转化作物或其他宿主细胞，可直接应用这些更新的方法。因此，已开发了很多种方法来将DNA序列插入到宿主细胞的基因组中以获得该序列的转录和/翻译从而引起生物体发生表型改变。因此，可采用提供有效转化/转染的任何方法。

转化方案以及用于将核苷酸序列导入植物中的方案可能因转化所靶向的植物或植物细胞的类型(即，单子叶植物或双子叶植物)而有所不同。适用于将核苷酸序列导入植物细胞中并随后插入植物基因组中的方法包括微注射(Crossway等(1986)Biotechniques 4：320-334)；电穿孔(Riggs等(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5602-5606；农杆菌介导的转化(Townsend等，美国专利No.5,563,055；Zhao等，美国专利No.5,981,840)；直接基因转移(Paszkowski等(1984)EMBO J.3：2717-2722)；和弹道粒子加速(ballistic particle acceleration)(参见，例如，Sanford等，美国专利No.4,945,050；Tomes等，美国专利No.5,879,918；Tomes等，美国专利No.5,886,244；Bidney等，美国专利No.5,932,782；McCabe等(1988)Biotechnology 6：923-926)；以及Lec1转化(WO 00/28058)。还参见Weising等(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477；Sanford等(1987)Particulate Science and Technology 5：27-37(洋葱)；Christou等(1988)Plant Physiol.87：671-674(大豆)；McCabe等(1988)(同上)(大豆)；Finer和McMullen(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.27P：175-182(大豆)；Singh等(1998)Theor.Appl.Genet.96：319-324(大豆)；Datta等(1990)Biotechnology 8：736-740(稻)；Klein等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：4305-4309(玉米)；Klein等(1988)Biotechnology 6：559-563(玉米)；Tomes，美国专利No.5,240,855；Buising等美国专利No.5,322,783和5,324,646；Tomes等(1995)“Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells viaMicroprojectile Bombardment，”in Plant Cell，Tissue，and Organ Culture：Fundamental Methods，编辑Gamborg(Springer-Verlag，Berlin)(玉米)；Klein等(1989)Plant Physiol.91：440-444(玉米)；Fromm等(1990)Biotechnology 8：833-839(玉米)；Hooykaas-Van Slogteren等(1984)Nature(London)311：763-764；Bowen等，美国专利No.5,736,369(谷类)；Bytebier等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5345-5349(百合科)；De Wet等(1985)的The Experimental Manipulation of Ovule Tissues，编辑Chapman等(Longman，N.Y.)，第197-209页(花粉)；Kaeppler等(1990)Plant CellReports 9：415-418和Kaeppler等(1992)Theor.Appl.Genet.84：560-566(颈须介导的转化)；D’Halluin等(1992)Plant Cell 4：1495-1505(电穿孔)；Li等(1993)Plant Cell Reports 12：250-255以及Christou和Ford(1995)Annals of Botany 75：407-413(稻)；Ishida等(1996)Nature Biotechnology14：745-750(玉米经由根癌农杆菌)。这些参考文献与USSN 2010-0095408一起通过引用并入文本。

如有需要，可使用纯化的防卫素蛋白或者可任选地将其与蛋白酶抑制剂组合成混合物，只要他们能够一起配制或者通过分的开施用方式依次配制即可。在另一个实施方案中，可使用多重方法，其中一种成分被改造成由植物产生而另一种成分通过外源性提供。可将这些不受限制地应用或使用在选定的位置上，例如种子包衣或根组织周围或周围土壤。

在一个方面，本公开内容教导了用于保护植物免受与真菌病原体有关的疾病的方法以及导致对植物或植物部分进行杀病原治疗需求降低的预防或治疗，从而降低材料、劳力和环境污染的成本或者延长这些植物之产品(例如果实、种子等)的货架期。所述方法要求将植物遗传改造成表达I类防卫素和透化防卫素或者要求局部施用这些防卫素。术语“植物”包括整个植物及其部分，包括但不局限于，枝条、营养器官/结构(例如叶、茎和块茎)、根、花和花器官/结构(例如苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药和胚珠)、种子(包括胚、胚乳和种皮)和果实(成熟子房)、植物组织(例如维管组织、基本组织等)和细胞(例如保卫细胞、卵细胞等)及其后代。

适用于本文公开的系统中之农学上有用的组合物包括这样的组合物，其中以有效量包含一种或更多种活性成分以达到预期目的，此类组合物包括种子包衣剂。有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，特别是基于本文中提供的公开内容。

除活性成分之外，抗真菌方法中使用的这些组合物还可包含有利于活性化合物被加工成可在田间、温室中或实验室环境中使用的制剂的合适的农学上可接受载体，包括赋形剂和辅助剂。

抗真菌制剂包括水溶性形式的活性化合物的水溶液剂。另外，可将活性化合物的混悬剂制备成合适的油性混悬剂。合适的亲脂性溶剂或载剂包括脂肪油例如芝麻油；合成脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯；或脂质体。水性注射混悬剂可包含增加该混悬剂粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。任选地，所述混悬剂还可包含合适的稳定剂或增加化合物的溶解性的物质，以允许制备高度浓缩的溶液剂。其他成分可包括增粘剂、凝胶、润湿剂、紫外线保护剂等。

可如下获得用于表面施用的制剂：将活性成分与固体赋形剂组合、任选地研磨得到的混合物并在加入合适的辅助剂之后(如有需要)对颗粒混合物进行加工以获得用于在需要保护的植物上直接施用或用于溶解，之后才能喷到其上的粉末。合适的赋形剂特别是，填料例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇；纤维素或淀粉制剂、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如有需要，还可加入崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或褐藻酸或其盐例如褐藻酸钠。

虽然本公开内容特别涉及抗植物病原的方法，但是也可将所述多价方法用在人和非人对象中，包括农场动物和家养动物。在这些情况下，一般使用局部方法。通常，对人和非人对象而言，所述多价方法特别靶向酵母(例如假丝酵母属和隐球酵母属)、皮肤真菌(例如毛癣菌)和其他的丝状真菌(例如曲霉属，例如黑曲霉)。

本公开内容还教导了I类防卫素和透化防卫素以及任选的蛋白酶抑制剂或者这些成分中任一种或所有的功能同源物、类似物、衍生物或变体在使人或非人动物对象或其后代对真菌或昆虫病原体侵袭具有抗性方面的用途。

本文还实现了用于保护人或非人动物对象免受与病原体感染有关的疾病的方法，所述方法包括向其中的细胞提供I类防卫素、透化防卫素或者其一或两者的前体或功能同源物、类似物、衍生物或变体，所述I类防卫素具有包含选自SEQ ID NO：81、83、85、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57、60、63、66和69的氨基酸序列的成熟结构域，所述透化防卫素具有选自由NaD1、TPP3、PhD1A、PhD2、NoD173、SEQ ID NO：3、6、12、21、24、70、71和72组成之列表的成熟结构域。

本文还包括用于保护人或非人动物对象免受与病原体感染有关的疾病的方法，所述方法包括向其中的细胞提供I类防卫素、透化防卫素或者其一或两者的前体或功能同源物、类似物、衍生物或变体，所述I类防卫素具有包含选自SEQ ID NO：81、83、85、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57、60、63、66和69的氨基酸序列的成熟结构域，所述透化防卫素具有选自由SEQ ID NO：3、6、12、21、24、70、71和72组成之列表的成熟结构域。

本文还包括用于治疗植物以及人和非人动物对象的局部组合物，所述局部组合物包含I类防卫素和透化防卫素或者其一或两者的前体或功能同源物、类似物、衍生物或变体。还可包括另外的赋形剂或载体。

实施例

在以下非限制性实施例中对本发明进行进一步描述。

方法

从巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中纯化防卫素

使用单一的pPINK-防卫素巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)PichiaPink(商标)菌株1菌落来接种250mL烧瓶中的25mL BMG培养基(在Invitrogen毕赤酵母表达手册中进行了描述)并将其在30℃震荡培养箱(140rpm)中孵育2至3天。将该培养物用于接种1L三角烧瓶中的200mL BMG，并将该1L三角烧瓶放置在30℃震荡培养箱(140rpm)中过夜。通过离心(2,500×g，10分钟，4℃)收获细胞，将细胞重悬于5L三角烧瓶中的1L BMG培养基中并在28℃震荡培养箱中孵育3天。在t＝24小时和48小时时诱导培养物。通过离心(6000rpm，20分钟)将表达培养基与细胞分离。将培养基调节至pH 3.0，之后将其施加到经100mM磷酸钾缓冲液(pH 6.0)预平衡的SP Sepharose柱(1cm×1cm，AmershamBiosciences)上。然后，将该柱用100mL的100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)洗涤并用10×10mL的包含500mMNaCl的100mM磷酸钾缓冲液洗脱结合的蛋白质。将洗脱的蛋白质用离心柱浓缩至1mL，并用无菌milliQ超纯水洗涤5×。使用二喹啉甲酸(BCA)蛋白质测定(Pierce ChemicalCo.)来确定毕赤酵母表达的防卫素的蛋白质浓度，并以牛血清白蛋白(BSA)作为蛋白质标准物。

分析防卫素的抗真菌活性

基本按照Broekaert等(1990)FEMS Microbiol Lett 69：55-59所述测量每种防卫素对以下真菌的生长的抑制作用：禾谷镰刀菌(Giberellazea)(Fgr，Pioneer Hybrid International(PHI)分离株73B1A)、尖孢镰刀菌萎蔫专化型(Fov，分离自棉花的澳大利亚分离株VCG01111；来自Farming Systems Institute，Department of Agriculture，Fisheries&Forestry，Queensland，Australia)或禾生炭疽菌(Cgr，PHI分离株Carroll-1A-9)、玉米干腐病菌(DAR51549)(NSW Department of PrimaryIndustries Agricultural Scientific Collections Trust(ASCU)或黑曲霉(来自School of Molecular and Microbial Biosciences，University of Sydney，NSW，Australia)。

从生长在合成型营养缺乏琼脂(synthetic nutrient poor agar)(Fgr)、V8琼脂(Cgr、Fve)、1/2强度马铃薯葡萄糖肉汤琼脂(Fov，黑曲霉)、酵母提取物蛋白胨葡萄糖琼脂(白色念珠菌、格特隐球菌)或1/2强度沙氏葡萄糖琼脂(趾间毛癣菌、红色毛癣菌)上的孢子形成型真菌属分离孢子。通过加入1/2强度马铃薯葡萄糖肉汤(PDB)将孢子从平板上移除。使用血细胞计数器测量孢子浓度。

在无菌水中制备每种防卫素的10×贮存液。使用Tecan液体操作机器人来连续稀释每种防卫素，并以一式三份方式将每个浓度的20μl转移至96孔微量滴定板。向每个96孔微量滴定板添加孢子，即80μl 1/2强度PDB中5×10⁴孢子/ml。将这些板在25℃(Fgr、Cgr、Fve、Fov、腐皮镰刀菌(F.solani)、玉米干腐病菌(S.maydis)、黑曲霉)或30℃(白色念珠菌(C.albicans)、格特隐球菌(C.gattii)、趾间毛癣菌(T.interdigitale)、红色毛癣菌(T.rubrum))下孵育。通过使用微量滴定板读数仪(SpectraMax Pro M2；Molecular Devices)测量595nm(A595)的光密度来测定真菌生长。允许继续生长直至在不存在任何测试防卫素的情况下真菌的光密度(OD)达到0.2的OD。每个测试以一式四份的方式进行。

透化测定

将尖孢镰刀菌萎蔫专化型(Fov)或禾谷镰刀菌(Fgr)从5x 10⁴孢子/mL的起始浓度开始在25℃下生长在半强度PDB中18小时。然后，将菌丝混悬液(90μL)转移至96孔微量滴定板并与SYTOX(注册商标)绿(0.5uM)孵育10分钟，之后加入10μL肽溶液以得到10μM(Fov)或5μM(Fgr)的最终蛋白质浓度。SYTOX绿摄取(表示透化)通过使用微量滴定板读数仪(SpectraMax M5e；Molecular Devices)分别以488nm和538nm的激发和发射波长测量荧光来量化。每2分钟进行读数，持续2小时。透化测定的实施例结果示于图1和表12a中。

本文中对相对渗透性指数进行了定义，其中真菌菌株由限定浓度的防卫素引起的透化程度相对于相同浓度NaD1的1.0值得到确定。

图1示出了用10μM NaD1、HXP4、HXL002、HXL007、HXL008和DmAMP1处理后，Fov菌丝中SYTOX绿的相对摄取。还参见表12a。防卫素NaD1、HXP4、HXL002、HXL007和HXL008能够使Fov菌丝透化而防卫素DmAMP1则不能。每种防卫素的相对渗透性指数示于表12a中。出于本发明的目的，认为对Fov的相对渗透性指数大于0.2的防卫素是透化的。

图2示出了用5μM NaD1、HXP4、HXL001、HXL002、HXL004、HXL008、HXL009、HXL013、HXL021、Hordothionin和RsAFP2处理后，Fgr菌丝中SYTOX绿的相对摄取。与防卫素HXL009、HXL021、hordothionin和RsAFP2相比，防卫素NaD1、HXP4、HXL002、HXL004和HXL008引起Fgr菌丝发生显著更多的透化。每种防卫素的相对透化性指数示于表12b中。出于本发明的目的，认为对Fgr的相对渗透性指数大于0.5的防卫素是透化的。

产生转基因细胞和/或组织

用于将异源DNA导入植物细胞和/或组织并选择其是否存在的的技术和试剂是公知的。允许在植物细胞中选择异源DNA的遗传标记也是公知的，例如携带对抗生素(例如卡那霉素、潮霉素、艮他霉素或博莱霉素)的抗性的基因。所述标记允许选择成功转化的在含有合适抗生素的培养基中生长的植物细胞，因为这些细胞将携带相应的抗性基因。在大多数情况下，插入到植物细胞中的异源DNA包含编码选择性标记(例如抗生素抗性标记)的基因，但这不是强制性的。一个示例性的抗药性标记是其表达产生卡那霉素抗性的基因，即包含胭脂碱合成酶启动子、Tn5新霉素磷酸转移酶II和胭脂碱合成酶3’非翻译区的嵌合基因，由Rogers等(1988)Methods for Plant Molecular Biology所述。

用表达盒遗传改造植物细胞和/或组织的技术是将其通过农杆菌介导的转化、电穿孔、微注射、粒子轰击或本领域已知的其他技术导入植物细胞或组织中，所述表达盒包含与异源编码序列和转录终止序列融合的诱导型启动子或嵌合启动子。所述表达盒还有利地包含允许在植物细胞中选择异源DNA的标记，例如携带对抗生素例如卡那霉素、潮霉素、艮他霉素或博莱霉素的抗性的基因。

可将携带植物可表达基因或其他目的DNA的DNA构建体通过任何合适的方法插入植物基因组中。这样的方法可包括，例如使用脂质体、电穿孔、扩散、粒子轰击、微注射、基因枪、增加游离DNA摄取的化学物质例如磷酸钙共沉淀法、病毒载体和本领域中实践的其他技术。合适的植物转化载体包括衍生自根癌农杆菌的Ti质粒的那些，例如Herrera-Estrella等(1983)EMBO J 2：987-995；Bevan等(1983)NucleicAcids Res 11(2)：369-385；Klee等(1985)Bio/Technology 3：637-642和EPO公开120，516(Schilperoort等，欧洲专利公开120，516)所述的那些。除衍生自农杆菌的Ti质粒或根诱导型(Ri)质粒的植物转化载体之外，可使用替代的方法来将本发明的DNA构建体插入植物细胞中。

如本领域中所公知的，对与目的DNA有效地连接的载体的选择直接取决于所期望的功能特性(例如复制、蛋白质表达)和待转化的宿主细胞，这些是构建重组DNA分子领域中固有的限制。期望所述载体包括原核复制子，即当被导入原核生物宿主细胞(例如细菌宿主细胞)中时能够指导重组DNA分子自主复制并使其维持在染色体外的DNA序列。这样的复制子在本领域中是公知的。此外，包括原核复制子的优选实施方案还包括当被导入这些转化细胞中时其表达赋予细菌宿主细胞选择性优势(例如抗药性)的基因。典型的细菌抗药性基因是赋予对氨苄青霉素或四环素及其他选择的物质的抗性的那些基因。新霉素磷酸转移酶基因具有以下优势：其在原核细胞以及真核细胞中都表达。

包括原核复制子的那些载体一般还包括用于插入本发明的重组DNA分子的合适限制性位点。典型的这样的载体质粒是获自BioRadLaboratories(Richmond，CA)的pUC8、pUC9、pBR322和pBR329；获自Pharmacia(Piscataway，NJ)的pPL、pK和K223；和获自Stratagene(La Jolla，CA)的pBLUESCRIPT tmand pBS。本发明的载体还可以是本领域中已知的λ噬菌体载体和λZAP载体(获自Stratagene La Jolla，CA)。另一种载体包括，例如pCMU(Nilsson等(1989)Cell 58：707)。其他的合适载体还可以是根据已知方法合成的，例如本文中用在不同应用中的载体pCMU/Kb和pCMUII是pCMUIV的改进形式(Nilsson等(1989)(同上))。

能够在植物细胞中表达重组核酸序列并能够在该宿主植物细胞中指导稳定整合的典型表达载体包括衍生自根癌农杆菌的肿瘤诱导型(Ti)质粒的载体。

转基因植物可通过本领域已知的任何标准方法产生，包括但不局限于根癌农杆菌介导的DNA转移(优选用错臂(disarmed)T-DNA载体)、电穿孔、直接DNA转移和粒子轰击。用于将DNA导入单子叶植物以及双子叶植物的技术是本领域公知的，同样地用于培养此类植物组织并再生这些组织的技术也是本领域公知的。

协同分类

按照观察到的由两种防卫素之组合引起的真菌生长抑制％(Io值)与这两种防卫素之基于每种防卫素自身的真菌生长抑制％之和的预期生长抑制％(Ee值根据Richer等(1987)(同上)使用的Limpel公式计算)之间的差值来对协同作用进行分类。差值Io-Ee是协同值。协同值小于15意味着无显著的协同；15至30是低协同水平；30至60是中等协同水平；而＞60是高协同水平。

用于植物原位研究(In planta study)的生物测定方法

制备禾生炭疽菌接种物

禾生炭疽菌(美国分离株Carroll-1A-99)分离自玉蜀黍属玉米(Zeamaize)(Pioneer Hi-Bred International，Inc.Johnston，Iowa，USA)。孢子分离自在V8琼脂上生长约2至3周的孢子形成培养物。如下收集禾生炭疽菌孢子：将平板表面物刮到无菌水中并经通过面巾纸(facial tissue)的过滤来将孢子与菌丝物质分离。使用血细胞计数器测量滤液中的孢子浓度。

制备禾谷镰刀菌接种物

禾谷镰刀菌分离株(73B1A)分离自玉蜀黍属玉米(Zea maize)(Pioneer Hi-Bred International，Inc.Johnston，Iowa，USA)。孢子分离自在SNP琼脂上生长约2至3周的孢子形成培养物。通过将平板表面物刮到无菌水中来收集禾谷镰刀菌孢子。使用血细胞计数器测量孢子浓度。

接种玉米植物

在出瓶(deflasking)后，将用于生物测定的植物在玻璃暖房中培养约8至10周。

接种禾生炭疽菌

在玉米叶鞘的相对侧上制造两个长度为2.0mm的伤口，然后用1×10⁶禾生炭疽菌孢子/mL覆盖。然后，将伤口用Glad Press’n’Seal密封3天。在接种后10天通过数码摄影测量感染面积。

接种禾谷镰刀菌

在玉米叶鞘的相对侧上制造两个长度为2.0mm的伤口。将伤口用已在1×10⁶禾谷镰刀菌孢子/mL中浸过的6mm直径纸盘覆盖。然后，将伤口用Glad Press’n’Seal密封3天。在接种后10天通过数码摄影测量感染面积。

分析玉米植物中的转基因表达

ELISA方法

蛋白质提取：从在玻璃暖房中生长的植物切下叶鞘。将该组织(50mg)冷冻在液氮中并在混磨机(Retsch MM300)中以30s^-1的频率研磨2×15秒。通过加入450μL 2％不溶性PVPP(Polyclar)/PBS/0.05％v/v Tween 20并涡旋20秒来进行蛋白质提取。将样品离心10分钟并收集上清液。

将ELISA板(NuncMaxisorp#442404)与100μL/孔的PBS中的一抗(每孔100ng抗防卫素抗体)温育。将板在湿润的盒中在4℃下孵育过夜。然后，将他们用PBS/0.05％v/v Tween 20洗涤2分钟×4。将ELISA板用200μL/孔的PBS中的3％w/v BSA(Sigma A-7030：98％ELISA级)封闭，并在25℃下孵育2小时。然后，将板用PBS/0.05％v/v Tween 20洗涤2分钟×4。

然后，将玉米鞘蛋白质提取物(100μL/孔，在PBS/0.05％v/v Tween20中进行稀释)施加到板，并随后将其在25℃下孵育2小时。然后，将板用PBS/0.05％v/v Tween 20洗涤2分钟×4，并施加100μL/孔的PBS中的二抗(例如75ng/孔生物素标记的防卫素抗体)。该生物素标记的抗体通过使用EZ-连接磺基-NHS-LC-生物素化试剂盒(Pierce)来制备；使用2mL蛋白质A纯化的抗体和2mg生物素试剂。将板在25℃下温育1小时，随后用PBS/0.05％v/v Tween 20洗涤2分钟×4，并施加100μL/孔的PBS中的NeutriAvidin HRP-缀合物((Pierce#31001；1∶1000稀释；0.1μL/孔)。将ELISA板在25℃下温育1小时，之后用PBS/0.05％v/vTween 20洗涤2分钟×2，接着用H₂O洗涤2分钟×2。在临用前，通过将1个ImmunoPure OPD片剂(Pierce#34006)溶解于9mL H₂O中，然后加入1mL稳定的过氧化物缓冲液(10X，Pierce#34062)来制备底物。将底物以100μL/孔施加并将板在25℃下孵育，直至产生颜色。通过施加50uL 2.5M硫酸来停止反应。在板读出仪(Molecular Devices)中测量490nm的吸光度。

实施例1

真菌病原体之在透化防卫素和I类防卫素的存在下的体外生长抑制

基本按照Broekaert等(1990)(同上)所述测量透化防卫素与I类防卫素的组合对以下真菌的生长的抑制作用：对禾谷镰刀菌(Giberellazea)(Fgr，Pioneer Hybrid International(PHI)分离株73B1A)、尖孢镰刀菌萎蔫专化型(Fov，分离自棉花的澳大利亚分离株VCG01111；来自Farming Systems Institute，Department of Agriculture，Fisheries&Forestry，Queensland，Australia)、腐皮镰刀菌(来自School of Botany，University of Melbourne，Victoria，Australia)、禾生炭疽菌(Cgr，PHI分离株Carroll-1A-9)、玉米干腐病菌(DARS1549)(NSW Department ofPrimary Industries Agricultural Scientific Collections Trust(ASCU)黑曲霉(来自School of Molecular and Microbial Biosciences，University ofSydney，NSW，Australia)、白色念珠菌(分离株DAY185，Department ofBiochemistry and Molecular Biology，Monash University，Victoria，Australia)、格特隐球菌(分离株BALl1)、趾间毛癣菌或红色毛癣菌(两者均获自National Mycology Reference Centre，South Au stralia Pathologyat the Women’s and Childre’s Hospital，Adelaide，Australia)。

从生长在合成型营养缺乏琼脂(Fgr)、V8琼脂(Cgr)、1/2强度马铃薯葡萄糖肉汤琼脂(Fov，黑曲霉)、酵母提取物蛋白胨葡萄糖琼脂(白色念珠菌、格特隐球菌)或1/2强度沙氏葡萄糖琼脂(趾间毛癣菌、红色毛癣菌)上的孢子形成型真菌属分离孢子。将孢子通过添加1/2强度马铃薯葡萄糖肉汤(PDB)从平板上移除。使用血细胞计数器测量孢子浓度。

基本按照发明详述中所述在96孔微量滴定板中进行抗真菌测定(分析防卫素的抗真菌活性)。向孔中上样10μL经过滤灭菌(0.22μm注射过滤器，Millipore)的防卫素1(每个终浓度的10×贮存液)或水、10μL经过滤灭菌(0.22μm注射过滤器，Millipore)的防卫素2(每个终浓度的10×贮存液)或水以及80μL1/2强度PDB中的5×10⁴孢子/mL。将这些板在25℃(Fgr、Cgr、Fov、腐皮镰刀菌、玉米干腐病菌、黑曲霉)或30℃(白色念珠菌、格特隐球菌、趾间毛癣菌、红色毛癣菌)下孵育。通过使用微量滴定板读数仪(SpectraMax Pro M2；Molecular Devices)测量595nm(A595)的光密度来测定真菌生长。允许继续生长直至在不存在任何测试防卫素的情况下真菌的光密度(OD)达到0.2的OD。每个测试以一式四份的方式进行。

按照观察到的由两种防卫素之组合引起的真菌生长抑制％(Io值)与这两种防卫素之基于每种防卫素自身的真菌生长抑制％之和的预期生长抑制％(Ee值根据Richer等(1987)(同上)使用的Limpel公式计算)之间的差值来对协同作用进行分类。差值Io-Ee是协同值。协同值小于15意味着无显著的协同；15至30是低协同水平；30至60是中等协同水平；而＞60是高协同水平。协同计算示于表3至表11中，其中如上所述，Ee是来自根据Limpel公式的加和响应的以抑制百分数表示的预期作用，而Io值是观察到的抑制百分数。当Io值高于Ee值时，发生协同作用。

结果

结果示于表3至表11中。

实施例2

HXP4与SBI6对禾谷镰刀菌和禾生炭疽菌的植物在体协同作用

转基因玉米植物是使用标准方案，例如美国专利号5,981,840；美国专利号7,528,293；美国专利号7,589,176；美国专利号7,785,828；Frame等(2002)Plant Physiology 129：13-22中所述的那些通过农杆菌介导的转化或粒子轰击产生的。将包含作为选择标记的GAT、用于组成型表达的泛素启动子和编码HXP4、SBI6或HXP4+SBI6(通过双表达载体)的密码子优化序列的双元载体(binary vector)通过电穿孔转移到根癌农杆菌菌株中。如下感染未成熟的玉米胚：将其浸没在农杆菌的混悬液中，之后在固体培养基上进行一段时间的共培养。然后，任选地将这些胚“静置”，期间将它们在存在至少一种抑制农杆菌生长的抗生素的情况下孵育。接下来，通过在包含抑制非转化细胞生长的草甘膦(glyphosphate)的固体培养基上培养经感染的胚来获得转化的愈伤组织。然后，使用标准方法能够将转化的愈伤组织再生成植物。还可通过个体事件杂交来产生同时表达HXP4和SBI6两者的植物。

通过例如ELISA筛选(参见方法部分)确定PCR阳性植物中的HXP4和SBI6的表达水平。使用方法部分中所述的生物测定来评价表达HXP4＞10ppm和/或SBI6＞0.9ppm的植物对禾谷镰刀菌和禾生炭疽菌的抗性增加。

本领域中的技术人员将认识到，本文中所述的发明很容易进行不同于具体描述的那些的改变和修改。应当理解，本发明包括所有这样的变化和修改。本发明还包括本说明书中单独或一起提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，并包括所述步骤或特征中任何两个或更多个的任何和所有组合。

表3

禾谷镰刀菌

表4

禾生炭疽菌

表5

腐皮镰刀菌

表6

黑曲霉

表7

玉米干腐病菌

表8

白色念珠菌

表9

格特隐球菌

表10

趾间毛癣菌

表11

红色毛癣菌

表12a

表12b

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Claims

1.用于保护对象免受与病原体感染有关的疾病的方法，所述方法包括向所述植物的细胞提供I类防卫素和透化防卫素或者其一或两者的前体或其功能同源物、类似物、衍生物或变体。

2.根据权利要求1所述的方法，其中同与组合接触所使用相同剂量的任一种组分单独接触病原体所提供的抑制相比，由组合的第一组分和第二组分提供的病原体抑制的程度是协同性的。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述对象是植物。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述对象是人或非人动物。

5.根据权利要求3所述的方法，其中两种防卫素均由遗传修饰的植物细胞产生，并且其中在遗传修饰之前，所述植物细胞不产生任一种防卫素。

6.根据权利要求3所述的方法，其中两种防卫素均局部施用给所述植物，或者作为表面喷雾剂或作为种子包衣通过植物的根系施用给所述植物。

7.根据权利要求4所述的方法，其中两种防卫素均局部施用给所述对象。

8.根据权利要求3所述的方法，其中一种防卫素通过所述细胞产生，并且将另一种防卫素或其前体形式或其功能同源物、类似物、衍生物或变体局部施用给所述植物，或者作为表面喷雾剂或作为种子包衣通过植物的根系施用给所述植物。

9.根据权利要求1或2所述的方法，所述方法还包括提供蛋白酶抑制剂或其前体形式。

10.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述I类防卫素选自由以下组成的列表：hordothionin(γ1-H)、zeathionin(γ-Zea2)、PsD1、DmAMP1、SBI6、PPQ1、VP42、VP45、VP135、FPY1、RsAFP2、MsDef1、MtDef2、MtDef4、HsAFP1、VaD2、VrD2、ZmESR6和HXL防卫素。

11.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述透化防卫素是NaD1、TPP3、PhD1A、PhD2、NoD173、HXL001、HXL002、HXL004、HXL007、HXL008、HXP4、HXP34或HXP35。

12.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述防卫素选自由以下组成的列表：作为透化防卫素的HXP4、NaD1、HXL004、HXL001和HXL008和作为I类防卫素的HXL012、HXL015、SB16、HXL009、HXL008和HXL021。

13.根据权利要求8所述的方法，其中所述蛋白酶抑制剂选自包含以下的列表：一系列蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、phytocystatin、抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和蛋白酶抑制剂。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述病原体是真菌。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述真菌是丝状真菌。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述丝状真菌选自镰刀菌属(Fusarium)、核盘菌属(Sclerotinia)、腐霉属(Pythium)、轮枝孢菌属(Verticillium)和疫霉属(Phytopthera)。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述真菌选自包含以下的列表：禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum，Fgr)、尖孢镰刀菌萎蔫专化型(Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum，Fov)、禾生炭疽菌(Colletotrichum graminicola，Cgr)、十字花科小球腔菌(Leptosphaeriamaculans)、甘蓝链格孢菌(Alternaria brassicicola)、互隔交链孢霉菌(Alternaria alternata)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、灰霉病菌(Botrytis cinerea)、甜菜生尾孢(Cercospora beticola)、玉米尾孢(Cercospora zeae maydis)、异旋腔孢菌(Cochliobolus heterostrophus)、玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)、大刀镰刀菌(Fusariumculmorum)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、尖孢镰刀菌石竹专化型(Fusarium oxysporum f. sp. dianthi)、尖孢镰刀菌番茄专化型(Fusariumoxysporum f. sp. lycopersici)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、小麦冠腐病菌(Fusarium pseudograminearum)、轮枝镰孢菌(Fusariumverticilloides，Fve)、禾顶囊壳小麦变种(Gaeumannomyces graminis var.tritici)、芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae)、核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)、玉米干腐病菌(Stenocarpella(Diplodia)maydis)、根串珠霉(Thielaviopsis basicola)、大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)、玉米黑粉菌(Ustilago zeae)、玉米柄锈菌(Puccinia sorghi)、菜豆壳球孢菌(Macrophomina phaseolina)、大豆茎褐腐病菌(Phialophora gregata)、大豆茎溃疡病菌(Diaporthe phaseolorum)、大豆灰斑病菌(Cercosporasojina)、大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)、立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi)、大孢链格孢(Alternariamacrospora)、棉尾孢(Cercospora gossypina)、短小茎点霉(Phomaexigua)、Puccinia schedonnardii、Puccinia cacabata、根腐病菌(Phymatotrichopsis omnivora)、燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum)、芸薹链格孢(Alternaria brassicae)、萝卜链格孢(Alternaria raphani)、禾白粉菌(Erysiphe graminis)(布氏白粉菌(Blumeria graminis))、小麦壳针孢(Septoria tritici)、狗牙根壳针孢(Septoria nodorum)、Mycosphaerellazeae、禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)、小麦散黑粉病菌(Ustilago tritici)、禾柄锈菌(Puccinia graminis)、小麦叶锈菌(Puccinia triticina)、小麦印度腥黑穗病菌(Tilletia indica)、小麦网腥黑穗菌(Tilletia caries)和小麦矮腥黑粉菌(Tilletia controversa)。

18.根据权利要求16所述的方法，其中所述真菌选自包含以下的列表：禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌萎蔫专化型(Fov)、禾生炭疽菌、十字花科小球腔菌、甘蓝链格孢菌、互隔交链孢霉菌、构巢曲霉、黑曲霉(Aspergillusniger)、灰霉病菌、假丝酵母属(Candida)、甜菜生尾孢、玉米尾孢、异旋腔孢菌、隐球菌属(Cryptococcus)、玉米大斑病菌、大刀镰刀菌、尖孢镰刀菌、尖孢镰刀菌石竹专化型、尖孢镰刀菌番茄专化型、腐皮镰刀菌、小麦冠腐病菌、轮枝镰孢菌、禾顶囊壳小麦变种、芸薹根肿菌、核盘菌、玉米干腐病菌、根串珠霉、大丽轮枝菌、玉米黑粉菌、玉米柄锈菌、菜豆壳球孢菌、大豆茎褐腐病菌、大豆茎溃疡病菌、大豆灰斑病菌、大豆疫霉菌、立枯丝核菌、豆薯层锈菌、大孢链格孢、棉尾孢、短小茎点霉、Pucciniaschedonnardii、Puccinia cacabata、根腐病菌、燕麦镰刀菌、芸薹链格孢、萝卜链格孢、禾白粉菌(布氏白粉菌)、小麦壳针孢、狗牙根壳针孢、Mycosphaerella zeae、禾谷丝核菌、小麦散黑粉病菌、禾柄锈菌、小麦叶锈菌、小麦印度腥黑穗病菌、小麦网腥黑穗菌、小麦矮腥黑粉菌、趾间毛癣菌(Trichophyton interdigitale)、红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)、玉米(Zea mays)、普通小麦(Triticum aestivum)、本氏烟草(Nicotianabenthaminana)、橡胶草(Taraxacum kok-saghyz)、瓜尔豆(Cyamopsistetragonoloba)、Picramnia pentrandra、巨桉(Eucalyptus grandis)、反枝苋(Amarant hus retroflexus)、大豆(Glycine max)、郁金香(Tulipagesneriana)、水稻(Oryza satiiva)、灰白银胶菊(Parthenium argentatum)、花生(Arachis hypogaea)、番茄(Solanum lycopersicum)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)、大麦(Hordeum vulgare)、萝卜(Raphanussativus)、大丽花属(Dahlia merckii)、紫花苜蓿(Medicago sativa)、豌豆(Pisum sativum)、珊瑚钟(Heucheras anguinea)、红豆(Vignaangularis)、绿豆(Vigna radiata)和Nicotiana occidentalis spp oblique。

19.根据权利要求4所述的方法，其中所述病原体选自假丝酵母属、隐球酵母属(Cryptococus)、毛癣菌属(Trichophyton)和曲霉属(Aspergillus)。

20.根据权利要求1所述的方法，其中所述病原体是昆虫。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述昆虫选自西南玉米螟虫(Diatraea grandiosella)、欧洲玉米螟(Ostrinia nubialis)、缢管蚜属(Rhopalosiphum spp)、铃夜蛾属(Helicoverpa spp)、小菜蛾(Plutellaxylostella)和草盲蝽属(Lygus spp)。

22.根据权利要求3所述的方法，其中所述植物是单子叶植物或双子叶植物。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述植物选自包含单子叶植物或双子叶植物或裸子植物的列表，包括但不限于：玉米(玉蜀黍)、大豆、棉花、棉籽、加拿大油菜、小麦、苜蓿、苹果、拟南芥(Arabidopsis)、香蕉、大麦、蓖麻、菊花、三叶草、可可、咖啡、海甘蓝、蔓越莓、黄瓜、密花石斛、薯蓣属、桉树、羊茅草、亚麻、剑兰、百合科、亚麻籽、粟、香瓜、芥菜、燕麦、油棕、油菜、番木瓜、花生、菠萝、观赏植物、菜豆属(Phaseolus)、马铃薯、油菜籽、稻、黑麦、黑麦草、红花、芝麻、高粱、甜菜、甘蔗、向日葵、草莓、烟草、番茄、草皮草和蔬菜作物如莴苣、芹菜、西兰花、花椰菜、葫芦、洋葱(包括大蒜、葱、韭葱和细香葱)；果树和坚果树，例如苹果树、梨树、桃树、橙树、葡萄柚树、柠檬树、酸橙树、杏树、美洲山核桃树、胡桃树、榛树；藤本植物，例如葡萄、猕猴桃、蛇麻草；果实灌木和荆棘，例如树莓、黑莓、醋栗；以及森林树木，例如白蜡木、松树、冷杉、枫树、橡树、粟树和杨树。

24.根据权利要求22所述的方法，其中所述植物选自包含以下的列表：作物植物、饲料作物、油料种子作物、谷类作物、水果作物、蔬菜作物、纤维作物、香料作物、坚果作物、草地作物、糖作物、饮料作物和森林作物。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述作物植物是大豆、小麦、玉米、棉花或小麦。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述植物是棉花。

27.I类防卫素和透化防卫素在制造对与病原体感染有关的损伤较不敏感的遗传修饰植物中的用途。

28.I类防卫素和透化防卫素二者在制造保护植物或人或非人动物对象免受病原体感染有关之损伤的组合物中的用途。

29.根据权利要求27或28所述的用途，其中所述病原体是真菌或昆虫。

30.根据权利要求29所述的用途，其还包括使用蛋白酶抑制剂或其前体形式。

31.抗病原体感染的遗传修饰植物或其后代，所述植物包含被遗传改造以产生I类防卫素和透化防卫素的细胞。

32.根据权利要求31所述的遗传修饰植物或后代，其还被遗传改造以产生蛋白酶抑制剂。

33.人工建立的多基因表达载体(MGEV)形式的遗传构建体，其包含具有2至8个区段的多核苷酸，每个结构域编码功能蛋白，其中至少一个结构域编码I类防卫素并且至少一个结构域编码透化防卫素，每个结构域在线性序列中通过接头区段与下一个结构域相连，所述接头区段编码具有SEQ ID NO：86示出的氨基酸序列的接头肽，所述结构域和接头区段均在同一阅读框中。

34.用于保护植物免受与病原体感染有关的疾病的方法，所述方法包括向其中的细胞提供I类防卫素、透化防卫素或者其一或两者的前体或其功能同源物、类似物、衍生物或变体，所述I类防卫素具有包含选自SEQID NO：81、83、85、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57、60、63、66和69之氨基酸序列的成熟结构域，所述透化防卫素具有选自由NaD1、TPP3、PhD1A、PhD2、NoD173、SEQ ID NO：3、6、12、21、24、70、71和72组成之列表的成熟结构域。

35.用于保护植物免受与病原体感染有关的疾病的方法，所述方法包括向其中的细胞提供I类防卫素、透化防卫素或者其一或两者的前体或其功能同源物、类似物、衍生物或变体，所述I类防卫素具有包含选自SEQID NO：81、83、85、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57、60、63、66和69之氨基酸序列的成熟结构域，所述透化防卫素具有选自由SEQ ID NO：3、6、12、21、24、70、71和72组成之列表的成熟结构域。

36.用于保护人或非人动物对象免受与病原体感染有关的疾病的方法，所述方法包括向其中的细胞提供I类防卫素、透化防卫素或者其一或两者的前体或其功能同源物、类似物、衍生物或变体，所述I类防卫素具有包含选自SEQ ID NO：81、83、85、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57、60、63、66和69之氨基酸序列的成熟结构域，所述透化防卫素具有选自由NaD1、TPP3、PhD1A、PhD2、NoD173、SEQ ID NO：3、6、12、21、24、70、71和72组成之列表的成熟结构域。

37.用于保护人或非人动物对象免受与病原体感染有关的疾病的方法，所述方法包括向其中的细胞提供I类防卫素、透化防卫素或者其一或两者的前体或其功能同源物、类似物、衍生物或变体，所述I类防卫素具有包含选自SEQ ID NO：81、83、85、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57、60、63、66和69之氨基酸序列的成熟结构域，所述透化防卫素具有选自由SEQ ID NO：3、6、12、21、24、70、71和72组成之列表的成熟结构域。

38.根据权利要求33所述的遗传构建体，其中至少一个另外的结构域编码蛋白酶抑制剂或其前体形式。

39.用于治疗或预防植物的真菌或昆虫侵袭的局部组合物，所述局部组合物包含I类防卫素和透化防卫素。

40.根据权利要求38的局部组合物，其中所述组合物是种子包衣。