JPH05236971A - 習性及び収量において変更されたトランスジェニック植物を作製するプラスミド - Google Patents
習性及び収量において変更されたトランスジェニック植物を作製するプラスミドInfo
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 可溶性糖質の代謝を変更する蛋白質をコード
するＤＮＡ配列、例えば無機ピロホスファターゼを含む
プラスミド及び、習性及び収量に関して変更されている
トランスジェニック植物を作製するための、これらのプ
ラスミドを含む植物細胞。これらの植物は、植物内部で
の糖質代謝又は糖質分布に介在する遺伝子の転移及び発
現によって習性に関して変更される。 【効果】 植物の大きさ、葉の形状、内節間隔、細胞壁
構造、種子、球根及び根の形成のようなその習性及び特
に刈り取り時の収量において変更された植物が得られ
る。
するＤＮＡ配列、例えば無機ピロホスファターゼを含む
プラスミド及び、習性及び収量に関して変更されている
トランスジェニック植物を作製するための、これらのプ
ラスミドを含む植物細胞。これらの植物は、植物内部で
の糖質代謝又は糖質分布に介在する遺伝子の転移及び発
現によって習性に関して変更される。 【効果】 植物の大きさ、葉の形状、内節間隔、細胞壁
構造、種子、球根及び根の形成のようなその習性及び特
に刈り取り時の収量において変更された植物が得られ
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、習性及び収量において
変更されたトランスジェニック植物を作製するためのプ
ラスミドに関する。
変更されたトランスジェニック植物を作製するためのプ
ラスミドに関する。
【０００２】
【従来の技術】生産植物又は観賞植物の成長、発生及び
収量は、植物が光合成過程で炭水化物にＣＯ2を固定す
ることによって得るエネルギーに左右される。光合成の
主要な箇所は葉及び茎組織（葉よりも劣る）である。
根、種子又は塊茎のような他の植物器官は光同化物の成
立には実質的には寄与せず、逆に、その成長に関しては
光合成活性器官による補給に依存している。この事実は
光合成的に得られたエネルギーが植物の光合成活性組織
から光合成不活性部位に流れることを意味する。
収量は、植物が光合成過程で炭水化物にＣＯ2を固定す
ることによって得るエネルギーに左右される。光合成の
主要な箇所は葉及び茎組織（葉よりも劣る）である。
根、種子又は塊茎のような他の植物器官は光同化物の成
立には実質的には寄与せず、逆に、その成長に関しては
光合成活性器官による補給に依存している。この事実は
光合成的に得られたエネルギーが植物の光合成活性組織
から光合成不活性部位に流れることを意味する。
【０００３】光合成活性組織はソース（ｓｏｕｒｓｅ）
と呼ばれ、固定された二酸化炭素のネットエクスポータ
ー（ｎｅｔ ｅｘｐｏｒｔｅｒ）と定義される。また植
物の光合成不活性部はシンク（ｓｉｎｋ）と呼ばれ、光
合成的に固定された二酸化炭素のネットインポーター
（ｎｅｔ ｉｍｐｏｒｔｅｒ）と定義される。
と呼ばれ、固定された二酸化炭素のネットエクスポータ
ー（ｎｅｔ ｅｘｐｏｒｔｅｒ）と定義される。また植
物の光合成不活性部はシンク（ｓｉｎｋ）と呼ばれ、光
合成的に固定された二酸化炭素のネットインポーター
（ｎｅｔ ｉｍｐｏｒｔｅｒ）と定義される。
【０００４】光合成生産物の効率的な使用及び植物内で
のその分布はいくつかの点で植物に強い影響力を有する
ものと考えることができる。植物の習性は１つの例とし
て挙げることができる。極めて若い葉のような新たに発
生する器官又は、根及び種子のような他の部位はソース
の光合成能力に完全に依存する。このことは、この種の
器官の発生がソース内で形成された光同化物の植物内部
における分布に左右されることを意味する。若葉の形成
又は根の形成可能性は、例えば植物の大きさ、内節間
隔、葉の大きさ及び形状、葉の外観及び、形成した根の
量及び形状のような植物の習性に決定的な影響力を有す
る。更に光同化物の分布は植物の収量に対して極めて重
大な作用を及ぼすものと考えられる。例えば小麦の全光
合成能力はこの数１０年間実質的に変化していないが、
人間に対する小麦植物の収穫可能な量は増大している。
このことは、種子のような収量に関して重要なシンクが
例えば茎のような収量にとって大切でない植物の他の部
位におけるよりも多量に光同化物を捕獲するように、各
競合するシンク間の割合が効果的に変えられたという事
実に大きく依存する。これは刈り取り後の茎を短かくす
ることによって、人間にとって一層好ましいシンク対ソ
ースの比を小麦内に得ることにより可能であった。この
事実は、背の高い植物にあっては一次ソースで形成され
た光同化物の分布がその植物の習性及び収量の双方に関
して重要であることを示している。
のその分布はいくつかの点で植物に強い影響力を有する
ものと考えることができる。植物の習性は１つの例とし
て挙げることができる。極めて若い葉のような新たに発
生する器官又は、根及び種子のような他の部位はソース
の光合成能力に完全に依存する。このことは、この種の
器官の発生がソース内で形成された光同化物の植物内部
における分布に左右されることを意味する。若葉の形成
又は根の形成可能性は、例えば植物の大きさ、内節間
隔、葉の大きさ及び形状、葉の外観及び、形成した根の
量及び形状のような植物の習性に決定的な影響力を有す
る。更に光同化物の分布は植物の収量に対して極めて重
大な作用を及ぼすものと考えられる。例えば小麦の全光
合成能力はこの数１０年間実質的に変化していないが、
人間に対する小麦植物の収穫可能な量は増大している。
このことは、種子のような収量に関して重要なシンクが
例えば茎のような収量にとって大切でない植物の他の部
位におけるよりも多量に光同化物を捕獲するように、各
競合するシンク間の割合が効果的に変えられたという事
実に大きく依存する。これは刈り取り後の茎を短かくす
ることによって、人間にとって一層好ましいシンク対ソ
ースの比を小麦内に得ることにより可能であった。この
事実は、背の高い植物にあっては一次ソースで形成され
た光同化物の分布がその植物の習性及び収量の双方に関
して重要であることを示している。
【０００５】植物の習性、耐旱ばつ性及び／又は耐霜性
の変更及び特に収量の変更は公知植物に比べて明らかに
改良されている。
の変更及び特に収量の変更は公知植物に比べて明らかに
改良されている。
【０００６】双子葉及び単子葉植物の遺伝的変異に対す
る生命工学的処理は公知である（Ｇａｓｓｅｒ及びＦｒ
ａｌｅｙ著、１９８９、“Ｓｃｉｅｎｃｅ”、２４４、
１２９３〜１２９９）。
る生命工学的処理は公知である（Ｇａｓｓｅｒ及びＦｒ
ａｌｅｙ著、１９８９、“Ｓｃｉｅｎｃｅ”、２４４、
１２９３〜１２９９）。
【０００７】シンク対ソースの比がどのように生化学機
構を調節するかは知られていない。
構を調節するかは知られていない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、植物
の大きさ、葉の形状、内節間隔、細胞壁構造、種子、球
根及び根の形成のようなその習性及び特に刈取りに際し
ての収量において変更された植物を得ることにある。
の大きさ、葉の形状、内節間隔、細胞壁構造、種子、球
根及び根の形成のようなその習性及び特に刈取りに際し
ての収量において変更された植物を得ることにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明は、糖質代謝又は
糖質分布を変更する蛋白質をコードするＤＮＡを含む植
物を提供する。このＤＮＡ配列は生じるトランスジェニ
ック植物に発現性であり、これは例えばこれらのトラン
スジェニック植物において、ソース葉中に可溶性糖質の
形で存在する光同化物の割合を増加させる。
糖質分布を変更する蛋白質をコードするＤＮＡを含む植
物を提供する。このＤＮＡ配列は生じるトランスジェニ
ック植物に発現性であり、これは例えばこれらのトラン
スジェニック植物において、ソース葉中に可溶性糖質の
形で存在する光同化物の割合を増加させる。
【００１０】このため可溶性糖質の代謝を変更する蛋白
質をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドが提供さ
れ、これらのプラスミドは植物細胞内に挿入されまたこ
れらの細胞は全植物に再生される。ＤＮＡ配列によって
コードされた生産物は有利に燐酸／ピロ燐酸代謝に介在
し、ＤＮＡ配列は特に無機ピロホスファターゼ遺伝子の
ＤＮＡ配列である。
質をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドが提供さ
れ、これらのプラスミドは植物細胞内に挿入されまたこ
れらの細胞は全植物に再生される。ＤＮＡ配列によって
コードされた生産物は有利に燐酸／ピロ燐酸代謝に介在
し、ＤＮＡ配列は特に無機ピロホスファターゼ遺伝子の
ＤＮＡ配列である。
【００１１】多くの植物にあっては光同化物は糖質の形
で、特にサッカロースの形で植物内に分布されている。
サッカロースは炭水化物をソースからシンクに輸送する
最も重要な形であることから、ソースの強さ、従ってま
たシンクへの効果的な供給に関する他の重要な決定因子
は、葉内の可溶性糖質（例えばフルクトース、グルコー
ス及びサッカロースのような種々の単糖類、二糖類及び
三糖類）の有効性及び含有量である。例えばソース葉中
のサッカロース含有量が比較的高い場合、シンクへの供
給量は増大し、従ってまた収穫可能の器官内の光同化物
の割合も増大する。これは収量を増加させることにな
る。
で、特にサッカロースの形で植物内に分布されている。
サッカロースは炭水化物をソースからシンクに輸送する
最も重要な形であることから、ソースの強さ、従ってま
たシンクへの効果的な供給に関する他の重要な決定因子
は、葉内の可溶性糖質（例えばフルクトース、グルコー
ス及びサッカロースのような種々の単糖類、二糖類及び
三糖類）の有効性及び含有量である。例えばソース葉中
のサッカロース含有量が比較的高い場合、シンクへの供
給量は増大し、従ってまた収穫可能の器官内の光同化物
の割合も増大する。これは収量を増加させることにな
る。
【００１２】ソース葉中の可溶性糖質とデンプンとの比
率は植物のシンク及びソース部間における炭水化物の分
布に極めて重要な役割を有するものと考えられる。ソー
ス葉からシンクへのサッカロースの効果的な供給は、植
物の習性を変更させるが、ほとんどの場合種子及び塊茎
又は根のようなシンク貯蔵量によって決定される収量を
特に増加させる。
率は植物のシンク及びソース部間における炭水化物の分
布に極めて重要な役割を有するものと考えられる。ソー
ス葉からシンクへのサッカロースの効果的な供給は、植
物の習性を変更させるが、ほとんどの場合種子及び塊茎
又は根のようなシンク貯蔵量によって決定される収量を
特に増加させる。
【００１３】サッカロース生合成での重要な制御点の１
つは、フルクトース−６−燐酸（Ｆｒｕ−６−Ｐ）への
フルクトース−１，６−二燐酸（Ｆｒｕ−１，６−Ｐ
２）の変換である。この工程で必要とされる酵素の１つ
はピロ燐酸塩：フルクトース−６−ホスフェート−１−
ホスホトランスフェラーゼ（ＰＦＰ）である。この酵素
は一方でＦｒｕ−１，６−Ｐ２を無機ピロ燐酸塩の放出
下にＦｒｕ−６−Ｐに変換すると共に、燐酸化物である
Ｆｒｕ−６−Ｐを無機ピロ燐酸塩の消費下にＦｒｕ−
１，６−Ｐ２に変換することができる。ＰＦＰによって
触媒される反応の方向は無機ピロ燐酸塩及び無機燐酸塩
の相対的な含有量によって制御される。
つは、フルクトース−６−燐酸（Ｆｒｕ−６−Ｐ）への
フルクトース−１，６−二燐酸（Ｆｒｕ−１，６−Ｐ
２）の変換である。この工程で必要とされる酵素の１つ
はピロ燐酸塩：フルクトース−６−ホスフェート−１−
ホスホトランスフェラーゼ（ＰＦＰ）である。この酵素
は一方でＦｒｕ−１，６−Ｐ２を無機ピロ燐酸塩の放出
下にＦｒｕ−６−Ｐに変換すると共に、燐酸化物である
Ｆｒｕ−６−Ｐを無機ピロ燐酸塩の消費下にＦｒｕ−
１，６−Ｐ２に変換することができる。ＰＦＰによって
触媒される反応の方向は無機ピロ燐酸塩及び無機燐酸塩
の相対的な含有量によって制御される。
【００１４】無機ピロホスファターゼによる無機ピロ燐
酸塩の連続除去は、Ｆｒｕ−６−Ｐの方向における上記
の平衡に転換をもたらし、例えばヘキソース及び／又は
サッカロースのような可溶性糖質の形成を増加させる。
更に無機ピロホスファターゼを使用してピロ燐酸塩を除
去することによる光同化物の分布における変化は、ＵＤ
Ｐ−グルコースの方向に転換される反応（これはＵＤＰ
−グルコース−ピロホスホリラーゼによって触媒され
る）を引き起す： グルコース−１−ホスフェート＋ＵＴＰ---→ＵＤＰ−
グルコース＋ＰＰｉ こうして増大したＵＤＰ−グルコースの貯蔵量は例えば
一層厚い細胞壁のような、植物の他の変更された特性を
もたらす。これは細胞壁生合成用前駆体の貯蔵量が増大
した結果である。細胞壁の厚化は、蒸散の減速によって
達成される、これらの植物の耐旱ばつ性を高める。
酸塩の連続除去は、Ｆｒｕ−６−Ｐの方向における上記
の平衡に転換をもたらし、例えばヘキソース及び／又は
サッカロースのような可溶性糖質の形成を増加させる。
更に無機ピロホスファターゼを使用してピロ燐酸塩を除
去することによる光同化物の分布における変化は、ＵＤ
Ｐ−グルコースの方向に転換される反応（これはＵＤＰ
−グルコース−ピロホスホリラーゼによって触媒され
る）を引き起す： グルコース−１−ホスフェート＋ＵＴＰ---→ＵＤＰ−
グルコース＋ＰＰｉ こうして増大したＵＤＰ−グルコースの貯蔵量は例えば
一層厚い細胞壁のような、植物の他の変更された特性を
もたらす。これは細胞壁生合成用前駆体の貯蔵量が増大
した結果である。細胞壁の厚化は、蒸散の減速によって
達成される、これらの植物の耐旱ばつ性を高める。
【００１５】大腸菌中の複数系及び形質転換細胞の選択
を可能にするマーカーを含む多数のクローニングベクタ
ーは、背の高い植物への外来遺伝子の挿入を調製するの
に有用である。これらのベクターは例えばｐＢＲ３２
２、ｐＵＣ系、Ｍ１３ｍｐ系、ｐＡＣＹＣ１８４等を含
む。この配列は適当な制限部位でベクター内に挿入する
ことができる。生じるプラスミドは大腸菌への形質転換
で使用される。大腸菌細胞を適当な栄養培地で培養し、
次いで収穫し、分離する。プラスミドは回収される。配
列分析、制限分析、電気泳動及び他の生化学的−分子生
物学的方法は一般に分析法として実施される。各操作の
後、使用したＤＮＡ配列を切断し、次のＤＮＡ配列に結
合することができる。各プラスミド配列は同じ又は他の
プラスミドにクローン化することができる。植物に所望
の遺伝子を挿入する方法に応じて、他のＤＮＡ配列が必
要となり得る。例えばＴｉ又はＲｉプラスミドを植物細
胞の形質転換に使用する場合、Ｔｉ又はＲｉプラスミド
Ｔ−ＤＮＡの少なくとも右領域、しかししばしば右及び
左領域が、挿入されるべき遺伝子のフランキング領域と
して結合されなければならない。
を可能にするマーカーを含む多数のクローニングベクタ
ーは、背の高い植物への外来遺伝子の挿入を調製するの
に有用である。これらのベクターは例えばｐＢＲ３２
２、ｐＵＣ系、Ｍ１３ｍｐ系、ｐＡＣＹＣ１８４等を含
む。この配列は適当な制限部位でベクター内に挿入する
ことができる。生じるプラスミドは大腸菌への形質転換
で使用される。大腸菌細胞を適当な栄養培地で培養し、
次いで収穫し、分離する。プラスミドは回収される。配
列分析、制限分析、電気泳動及び他の生化学的−分子生
物学的方法は一般に分析法として実施される。各操作の
後、使用したＤＮＡ配列を切断し、次のＤＮＡ配列に結
合することができる。各プラスミド配列は同じ又は他の
プラスミドにクローン化することができる。植物に所望
の遺伝子を挿入する方法に応じて、他のＤＮＡ配列が必
要となり得る。例えばＴｉ又はＲｉプラスミドを植物細
胞の形質転換に使用する場合、Ｔｉ又はＲｉプラスミド
Ｔ−ＤＮＡの少なくとも右領域、しかししばしば右及び
左領域が、挿入されるべき遺伝子のフランキング領域と
して結合されなければならない。
【００１６】植物細胞の形質転換にＴ−ＤＮＡを使用す
ることは、次の諸文献において徹底的に探求されまた十
分に記載されている：欧州特許第１２０５１６号明細
書；Ｈｏｅｋｅｍａ著、“Ｔｈｅ Ｂｉｎａｒｙ Ｐｌ
ａｎｔ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ Ｏｆｆｓｅｔ−
ｄｒｕｋｋｅｒｉｊｉ Ｋａｎｔｅｒｓ Ｂ．Ｖ．”、
Ａｌｂｌａｓｓｅｒｄａｍ、１９８５、第Ｖ章；Ｆｒａ
ｌｅｙその他著、“Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｓ
ｃｉ．”４：１−４６及び、Ａｎその他著、“ＥＭＢＯ
Ｊ．”（１９８５）４：２７７−２８７。
ることは、次の諸文献において徹底的に探求されまた十
分に記載されている：欧州特許第１２０５１６号明細
書；Ｈｏｅｋｅｍａ著、“Ｔｈｅ Ｂｉｎａｒｙ Ｐｌ
ａｎｔ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ Ｏｆｆｓｅｔ−
ｄｒｕｋｋｅｒｉｊｉ Ｋａｎｔｅｒｓ Ｂ．Ｖ．”、
Ａｌｂｌａｓｓｅｒｄａｍ、１９８５、第Ｖ章；Ｆｒａ
ｌｅｙその他著、“Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｓ
ｃｉ．”４：１−４６及び、Ａｎその他著、“ＥＭＢＯ
Ｊ．”（１９８５）４：２７７−２８７。
【００１７】挿入されたＤＮＡは１度ゲノム内に組み込
まれると、これはそこでは比較的安定であり、一般に再
び出現することはない。これは通常、形質転換植物細胞
に生物致死剤に対する耐性又は、特にカナマイシン、Ｇ
４１８、ブレオマイシン、ヒグロマイシン又はクロラム
フェニコールのような抗生物質に対する耐性を付与する
選択マーカーを含む。個々に使用されるマーカーは相応
して、挿入されたＤＮＡを含まない細胞よりもむしろ形
質転換細胞を選択する。
まれると、これはそこでは比較的安定であり、一般に再
び出現することはない。これは通常、形質転換植物細胞
に生物致死剤に対する耐性又は、特にカナマイシン、Ｇ
４１８、ブレオマイシン、ヒグロマイシン又はクロラム
フェニコールのような抗生物質に対する耐性を付与する
選択マーカーを含む。個々に使用されるマーカーは相応
して、挿入されたＤＮＡを含まない細胞よりもむしろ形
質転換細胞を選択する。
【００１８】ところで１個以上の他の遺伝子の調節部位
に融合可能のＤＮＡ配列を含むプラスミドは、植物細胞
又は植物中にこの遺伝子を発現させ得ることが判明し
た。この調節部位は植物遺伝子のプロモーター部位及び
同じ又は異なる植物遺伝子の終止コドンを含む。
に融合可能のＤＮＡ配列を含むプラスミドは、植物細胞
又は植物中にこの遺伝子を発現させ得ることが判明し
た。この調節部位は植物遺伝子のプロモーター部位及び
同じ又は異なる植物遺伝子の終止コドンを含む。
【００１９】プロモーター、例えば構成発現をもたらす
カリフラワーモザイクウイルス・プロモーター（ＣａＭ
Ｖ）及び植物終止コドンを使用することができる。他の
可能なプロモーターは光合成活性細胞でのみ特異的に発
現をコードする各プロモーター（例えばＳＴ−ＬｓＩプ
ロモーター、Ｓｔｏｃｋｈａｕｓその他著、“ＥＭＢＯ
Ｊ”、８、２４４５〜２４５１）であり、これはサッ
カロース代謝における変化が葉に及ぼされるべき場合に
は、シンク器官のローディング中（すなわち特殊な発生
時期）でのみ活性のソース−特異的プロモーターが、ま
た根における特異的発現が例えば一層厚い細胞壁を必要
とすることにより有利な場合には根−特異的プロモータ
ーが特に有利であり、更に達成すべき変化がシンク組織
に対して特異的に有利な場合には例えばジャガイモの塊
茎、テンサイの主根、トマトのような果実においてのみ
活性の貯蔵−シンク−特異的プロモーターがクラスＩパ
タチンプロモーターに代るものである。
カリフラワーモザイクウイルス・プロモーター（ＣａＭ
Ｖ）及び植物終止コドンを使用することができる。他の
可能なプロモーターは光合成活性細胞でのみ特異的に発
現をコードする各プロモーター（例えばＳＴ−ＬｓＩプ
ロモーター、Ｓｔｏｃｋｈａｕｓその他著、“ＥＭＢＯ
Ｊ”、８、２４４５〜２４５１）であり、これはサッ
カロース代謝における変化が葉に及ぼされるべき場合に
は、シンク器官のローディング中（すなわち特殊な発生
時期）でのみ活性のソース−特異的プロモーターが、ま
た根における特異的発現が例えば一層厚い細胞壁を必要
とすることにより有利な場合には根−特異的プロモータ
ーが特に有利であり、更に達成すべき変化がシンク組織
に対して特異的に有利な場合には例えばジャガイモの塊
茎、テンサイの主根、トマトのような果実においてのみ
活性の貯蔵−シンク−特異的プロモーターがクラスＩパ
タチンプロモーターに代るものである。
【００２０】植物終止コドンはオクトピン合成遺伝子の
ポリ−Ａ側鎖の３′−末端を含んでいてよい。
ポリ−Ａ側鎖の３′−末端を含んでいてよい。
【００２１】多数の技術が植物宿主細胞にＤＮＡを挿入
するのに有用である。これらの技術には、形質転換剤と
してアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）又はア
グロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）を使用して融合、注入
又は電気穿孔法並びに他の可能な方法によりＴ−ＤＮＡ
で形質転換するものが含まれる。アグロバクテリアを形
質転換に使用した場合、挿入すべきＤＮＡは特殊なプラ
スミドに、すなわち中間ベクター又はバイナリーベクタ
ーにクローン化されなければならない。中間ベクター
は、Ｔ−ＤＮＡ中の配列に相同的である配列に原因する
相同的組換えによってＴｉ又はＲｉ−プラスミドに組込
むことができる。Ｔｉ又はＲｉプラスミドはまたＴ−Ｄ
ＮＡの転移に必要なｖｉｒ部位を含む。中間ベクターは
アグロバクテリアでそれ自身を複製することはできな
い。中間ベクターはヘルパープラスミドによってアグロ
バクテリウム・ツメファシエンスに転移可能である（接
合）。バイナリーベクターは大腸菌及びアグロバクテリ
アの双方においてそれ自身を複製することができる。こ
れらは選択標識遺伝子及びリンカー又はポリリンカー
（これらは左右のＴ−ＤＮＡ境界部位によって枠組みさ
れている）を含む。これらはアグロバクテリア内で直接
形質転換可能である（Ｈｏｌｓｔｅｒその他著、“Ｍｏ
ｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．”、（１９７８）、１６３：
１８１〜１８７）。宿主細胞として使用したアグロバク
テリウムはｖｉｒ部位を運搬するプラスミドを含んでい
るべきである。ｖｉｒ部位は植物細胞にＴ−ＤＮＡを転
移するのに必要である。付加的なＴ−ＤＮＡを含んでい
てもよい。こうして形質転換された細菌は植物細胞を形
質転換するのに使用される。植物外植片は、植物細胞に
ＤＮＡを転移するためのアグロバクテリウム・ツメファ
シエンス又はアグロバクテリウム・リゾゲネスを用いて
有利に培養することができる。更に全植物を、選択のた
め抗生物質又は生物致死剤を含んでいてもよい適当な培
地中で感染植物材料（例えば葉片、茎の切片、根、並び
に原形質体又は懸濁培養細胞）から再生することができ
る。こうして得られた植物を挿入ＤＮＡの存在につき試
験する。注入法及び電気穿孔法の場合、プラスミドは特
殊な要件なしに製造される。例えばｐＵＣ誘導体のよう
な常態のプラスミドを使用することができる。
するのに有用である。これらの技術には、形質転換剤と
してアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）又はア
グロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）を使用して融合、注入
又は電気穿孔法並びに他の可能な方法によりＴ−ＤＮＡ
で形質転換するものが含まれる。アグロバクテリアを形
質転換に使用した場合、挿入すべきＤＮＡは特殊なプラ
スミドに、すなわち中間ベクター又はバイナリーベクタ
ーにクローン化されなければならない。中間ベクター
は、Ｔ−ＤＮＡ中の配列に相同的である配列に原因する
相同的組換えによってＴｉ又はＲｉ−プラスミドに組込
むことができる。Ｔｉ又はＲｉプラスミドはまたＴ−Ｄ
ＮＡの転移に必要なｖｉｒ部位を含む。中間ベクターは
アグロバクテリアでそれ自身を複製することはできな
い。中間ベクターはヘルパープラスミドによってアグロ
バクテリウム・ツメファシエンスに転移可能である（接
合）。バイナリーベクターは大腸菌及びアグロバクテリ
アの双方においてそれ自身を複製することができる。こ
れらは選択標識遺伝子及びリンカー又はポリリンカー
（これらは左右のＴ−ＤＮＡ境界部位によって枠組みさ
れている）を含む。これらはアグロバクテリア内で直接
形質転換可能である（Ｈｏｌｓｔｅｒその他著、“Ｍｏ
ｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．”、（１９７８）、１６３：
１８１〜１８７）。宿主細胞として使用したアグロバク
テリウムはｖｉｒ部位を運搬するプラスミドを含んでい
るべきである。ｖｉｒ部位は植物細胞にＴ−ＤＮＡを転
移するのに必要である。付加的なＴ−ＤＮＡを含んでい
てもよい。こうして形質転換された細菌は植物細胞を形
質転換するのに使用される。植物外植片は、植物細胞に
ＤＮＡを転移するためのアグロバクテリウム・ツメファ
シエンス又はアグロバクテリウム・リゾゲネスを用いて
有利に培養することができる。更に全植物を、選択のた
め抗生物質又は生物致死剤を含んでいてもよい適当な培
地中で感染植物材料（例えば葉片、茎の切片、根、並び
に原形質体又は懸濁培養細胞）から再生することができ
る。こうして得られた植物を挿入ＤＮＡの存在につき試
験する。注入法及び電気穿孔法の場合、プラスミドは特
殊な要件なしに製造される。例えばｐＵＣ誘導体のよう
な常態のプラスミドを使用することができる。
【００２２】形質転換細胞は常法で植物内で成長する。
これらの植物は常法で成長させまた同じ形質転換遺伝因
子又は他の遺伝因子を有する植物と交雑させることがで
きる。生じる雑種個体は相応する表現型特性を有する。
これらの植物は常法で成長させまた同じ形質転換遺伝因
子又は他の遺伝因子を有する植物と交雑させることがで
きる。生じる雑種個体は相応する表現型特性を有する。
【００２３】用語及び略語 略 語 ｂｐ、ｋｂ＝塩基対、キロベース ＤＮＡ ＝デオキシリボ核酸、遺伝情報の担体 ＨＥＰＥＳ＝Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−
Ｎ′−２−エタンスルホン酸 ＳＤＳ ＝ドデシル硫酸ナトリウム ｔｒｉｓ ＝トリス（２−アミノエチル）アミン ＥＤＴＡ ＝エチレンジアミン四酢酸 Ｕ ＝単位（酵素単位）。
Ｎ′−２−エタンスルホン酸 ＳＤＳ ＝ドデシル硫酸ナトリウム ｔｒｉｓ ＝トリス（２−アミノエチル）アミン ＥＤＴＡ ＝エチレンジアミン四酢酸 Ｕ ＝単位（酵素単位）。
【００２４】次のプラスミドをドイツ微生物寄託所（Ｄ
ＳＭ）、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツ連邦共和
国、２０、０８、１９９０及び１０、１０、１９９１に
寄託した（寄託番号）： プラスミドｐ３５Ｓ−Ω−ｐｐａｓｅ（ＤＳＭ６１４
１）−２０、０８、１９９０ プラスミドＬ−７００：ｐｐａ（ＤＳＭ６７３３）−１
０、１０、１９９１。
ＳＭ）、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツ連邦共和
国、２０、０８、１９９０及び１０、１０、１９９１に
寄託した（寄託番号）： プラスミドｐ３５Ｓ−Ω−ｐｐａｓｅ（ＤＳＭ６１４
１）−２０、０８、１９９０ プラスミドＬ−７００：ｐｐａ（ＤＳＭ６７３３）−１
０、１０、１９９１。
【００２５】図面の説明 図１は４．０ｋｂのプラスミドｐ３５Ｓ−Ω−ｐｐａｓ
ｅの構造を示すものである。
ｅの構造を示すものである。
【００２６】このプラスミドは次の断片を含む： Ａ＝断片Ａ（５２９ｂｐ）：カリフラワ−モザイクウイ
ルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーターを含む。この断
片はＣａＭＶのヌクレオチド６９０９〜７４３７を含
む。
ルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーターを含む。この断
片はＣａＭＶのヌクレオチド６９０９〜７４３７を含
む。
【００２７】Ｂ＝断片Ｂ（７３ｂｐ）：配列の６１ヌク
レオチドを含む： ＴＴＴＡＣＡＡＣＡＡＴＴＡＣＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡ
ＡＡＣＡＡＣＡＡＡＣＡＡＣＡＴＴＡＣＡＡＴＴＡＣＴ
ＡＴＴＴＡＣＡＡＴＴＡ 配列ＧＧＴＡＣＣのＡｓｐ７１８リンカーは上記配列の
５′−末端に位置しまた配列ＣＣＡＴＧＧのＮｃｏＩリ
ンカーは３′−末端に位置している。
レオチドを含む： ＴＴＴＡＣＡＡＣＡＡＴＴＡＣＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡ
ＡＡＣＡＡＣＡＡＡＣＡＡＣＡＴＴＡＣＡＡＴＴＡＣＴ
ＡＴＴＴＡＣＡＡＴＴＡ 配列ＧＧＴＡＣＣのＡｓｐ７１８リンカーは上記配列の
５′−末端に位置しまた配列ＣＣＡＴＧＧのＮｃｏＩリ
ンカーは３′−末端に位置している。
【００２８】Ｃ＝断片Ｃ（５５４ｂｐ）：大腸菌からの
無機ピロホスファターゼ（ｐｐａ）の蛋白質コード部位
を含む（Ｌａｈｔｉその他による配列のヌクレオチド位
置＋３９〜＋５６５）。
無機ピロホスファターゼ（ｐｐａ）の蛋白質コード部位
を含む（Ｌａｈｔｉその他による配列のヌクレオチド位
置＋３９〜＋５６５）。
【００２９】Ｄ＝断片Ｄ（１９２ｂｐ）：Ｔｉ−プラス
ミドｐＴｉＡＣＨ５のＴ−ＤＮＡの遺伝子３のポリアデ
ニル化信号を含む。
ミドｐＴｉＡＣＨ５のＴ−ＤＮＡの遺伝子３のポリアデ
ニル化信号を含む。
【００３０】本例に記載された切断部位も示されてい
る。
る。
【００３１】図２はノーザンブロット分析法によりトラ
ンスジェニックジャガイモ及びタバコ植物中の、ピロホ
スファターゼ遺伝子によりコードされたＲＮＡの検出を
示すものである。
ンスジェニックジャガイモ及びタバコ植物中の、ピロホ
スファターゼ遺伝子によりコードされたＲＮＡの検出を
示すものである。
【００３２】位置１〜１９ ：プラスミドｐ３５Ｓ−Ω
−ｐｐａｓｅで形質転換されまた再生されたジャガイモ
植物の葉から得られた全ＲＮＡの標本 位置２０〜２８：プラスミドｐ３５Ｓ−Ω−ｐｐａｓｅ
によって形質転換されまた再生されたタバコ植物の葉か
ら得られた全ＲＮＡの標本 位置Ａ ：非形質転換ジャガイモ植物からの標本 位置Ｂ ：非形質転換タバコ植物からの標本。
−ｐｐａｓｅで形質転換されまた再生されたジャガイモ
植物の葉から得られた全ＲＮＡの標本 位置２０〜２８：プラスミドｐ３５Ｓ−Ω−ｐｐａｓｅ
によって形質転換されまた再生されたタバコ植物の葉か
ら得られた全ＲＮＡの標本 位置Ａ ：非形質転換ジャガイモ植物からの標本 位置Ｂ ：非形質転換タバコ植物からの標本。
【００３３】黒点はピロホスファターゼによってコード
されたＲＮＡを示す。
されたＲＮＡを示す。
【００３４】図３はＳＤＳポリアクリルアミドゲル中で
の、ｐ３５Ｓ−Ω−ｐｐａｓｅプラスミドにより形質転
換されたトランスジェニックジャガイモ及びタバコ植物
の葉からの蛋白質抽出物における新ピロホスファターゼ
活性の発生検出を示すものである。
の、ｐ３５Ｓ−Ω−ｐｐａｓｅプラスミドにより形質転
換されたトランスジェニックジャガイモ及びタバコ植物
の葉からの蛋白質抽出物における新ピロホスファターゼ
活性の発生検出を示すものである。
【００３５】位置１〜７ ：形質転換されたジャガイ
モ植物の葉からの蛋白質抽出物 位置８及び９ ：形質転換されたタバコ植物の葉からの
蛋白質抽出物 位置Ａ ：非形質転換タバコ植物の葉からの蛋白
質抽出物 位置Ｂ及びＣ ：非形質転換ジャガイモ植物の葉からの
蛋白質抽出物 位置Ｘ及びＹ ：大腸菌からの蛋白質抽出物。
モ植物の葉からの蛋白質抽出物 位置８及び９ ：形質転換されたタバコ植物の葉からの
蛋白質抽出物 位置Ａ ：非形質転換タバコ植物の葉からの蛋白
質抽出物 位置Ｂ及びＣ ：非形質転換ジャガイモ植物の葉からの
蛋白質抽出物 位置Ｘ及びＹ ：大腸菌からの蛋白質抽出物。
【００３６】図４は種々異なる時期（エージ）の葉にお
ける、ｐ３５Ｓ−Ω−ｐｐａｓｅ遺伝子を発現するタバ
コ植物（□）及び非形質転換タバコ植物（■）中のグル
コース、フルクトース、サッカロース及びデンプンの各
含有量（ｍモル／ｍ2）を比較して示すものである。
ける、ｐ３５Ｓ−Ω−ｐｐａｓｅ遺伝子を発現するタバ
コ植物（□）及び非形質転換タバコ植物（■）中のグル
コース、フルクトース、サッカロース及びデンプンの各
含有量（ｍモル／ｍ2）を比較して示すものである。
【００３７】図中：１＝極めて若い葉 ２〜４＝成熟葉 ５〜６＝古葉。
【００３８】図５は形質転換された植物の葉中のサッカ
ロース／デンプン比で、トランスジェニックジャガイモ
植物(位置１〜１２）におけるｐ３５Ｓ−Ω−ｐｐａｓ
ｅ遺伝子の発現効果を示す図である。
ロース／デンプン比で、トランスジェニックジャガイモ
植物(位置１〜１２）におけるｐ３５Ｓ−Ω−ｐｐａｓ
ｅ遺伝子の発現効果を示す図である。
【００３９】図中Ｃ ＝非形質転換ジャガイモ植物。
【００４０】図６は５．０ｋｂのプラスミドＬ７００：
ｐｐａの構造を示すものである。
ｐｐａの構造を示すものである。
【００４１】このプラスミドは次の断片を含む： Ａ＝断片Ａ（１５８５ｂｐ）：ＳＴ−ＬＳ１遺伝子のプ
ロモーターを含む。この断片はＳＴ−ＬＳ１遺伝子のヌ
クレオチド、位置＋１〜＋１５８５を含む。
ロモーターを含む。この断片はＳＴ−ＬＳ１遺伝子のヌ
クレオチド、位置＋１〜＋１５８５を含む。
【００４２】Ｂ＝断片Ｂ（５２８ｂｐ）：無機ピロホス
ファターゼ（ｐｐａ）の蛋白質−コード部位を含む。こ
の断片はヌクレオチド、位置＋３９〜＋５６５を含む。
ファターゼ（ｐｐａ）の蛋白質−コード部位を含む。こ
の断片はヌクレオチド、位置＋３９〜＋５６５を含む。
【００４３】Ｃ＝断片Ｃ（１９２ｂｐ）：Ｔｉプラスミ
ドｐＴｉＡＣＨ５のＴ−ＤＮＡの遺伝子３のポリアデニ
ル化信号（ヌクレオチド、位置１１７４９〜１１９３
９）を含む。
ドｐＴｉＡＣＨ５のＴ−ＤＮＡの遺伝子３のポリアデニ
ル化信号（ヌクレオチド、位置１１７４９〜１１９３
９）を含む。
【００４４】本例に記載された切断部位も示されてい
る。
る。
【００４５】
【実施例】本発明に基づき実施される各例を一層理解し
易くするため、これらのテストで必要とされまたそれ自
体公知のすべての方法をまず第１に列記する： １．クローニング法 ベクターｐＵＣ１８（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎそ
の他著、“Ｇｅｎｅ（１９８５）”、３３、１０３〜１
１９）をクローニングのために使用した。
易くするため、これらのテストで必要とされまたそれ自
体公知のすべての方法をまず第１に列記する： １．クローニング法 ベクターｐＵＣ１８（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎそ
の他著、“Ｇｅｎｅ（１９８５）”、３３、１０３〜１
１９）をクローニングのために使用した。
【００４６】植物形質転換のため、遺伝子構造をバイナ
リーベクターＢＩＮ１９（Ｂｅｖａｎ，“Ｎｕｃｌ．Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．”（１９８４）、１２、８７１１〜
８７２０）中でクローン化した。
リーベクターＢＩＮ１９（Ｂｅｖａｎ，“Ｎｕｃｌ．Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．”（１９８４）、１２、８７１１〜
８７２０）中でクローン化した。
【００４７】２．細菌株 大腸菌株ＢＭＨ７１−１８（Ｍｅｓｓｉｎｇその他著、
“Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．”、ＵＳＡ
（１９７７）、２４、６３４２〜６３４６）又はＴＢ１
をｐＵＣベクターに対して使用した。ＴＢ１は株ＪＭ１
０１の組換え陰性で、テトラサイクリン耐性の誘導体で
ある（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎその他著、“Ｇｅ
ｎｅ”、（１９８５）、３３、１０３〜１１９）。ＴＢ
１株の遺伝子型は
“Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．”、ＵＳＡ
（１９７７）、２４、６３４２〜６３４６）又はＴＢ１
をｐＵＣベクターに対して使用した。ＴＢ１は株ＪＭ１
０１の組換え陰性で、テトラサイクリン耐性の誘導体で
ある（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎその他著、“Ｇｅ
ｎｅ”、（１９８５）、３３、１０３〜１１９）。ＴＢ
１株の遺伝子型は
【００４８】
【外１】
【００４９】である。
【００５０】植物形質転換はアグロバクテリウム・ツメ
ファシエンス株ＬＢＡ４４０４（Ｂｅｖａｎ，Ｍ．、
“Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．”、１２、８７１１
〜８７２１、（１９８４）：ＢＩＮ１９誘導体）により
実施した。
ファシエンス株ＬＢＡ４４０４（Ｂｅｖａｎ，Ｍ．、
“Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．”、１２、８７１１
〜８７２１、（１９８４）：ＢＩＮ１９誘導体）により
実施した。
【００５１】３．アグロバクテリウム・ツメファシエン
スの形質転換 ＢＩＮ１９誘導体の場合、アグロバクテリアへのＤＮＡ
の挿入はＨｏｌｓｔｅｒｓその他によって開発された方
法で直接形質転換することにより行った（“Ｍｏｌ−Ｇ
ｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．”（１９７８）、１６３、１８１〜
１８７）。形質転換されたアグロバクテリアのプラスミ
ドＤＮＡをＢｉｒｎｂｏｉｍ及びＤｏｌｙによって開発
された方法で分離し（“Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．”（１９７９）、７、１５１３〜１５２３）、適当
に制限切断した後ゲル電気泳動法により単離した。
スの形質転換 ＢＩＮ１９誘導体の場合、アグロバクテリアへのＤＮＡ
の挿入はＨｏｌｓｔｅｒｓその他によって開発された方
法で直接形質転換することにより行った（“Ｍｏｌ−Ｇ
ｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．”（１９７８）、１６３、１８１〜
１８７）。形質転換されたアグロバクテリアのプラスミ
ドＤＮＡをＢｉｒｎｂｏｉｍ及びＤｏｌｙによって開発
された方法で分離し（“Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．”（１９７９）、７、１５１３〜１５２３）、適当
に制限切断した後ゲル電気泳動法により単離した。
【００５２】４．植物形質転換 Ａ）タバコ：アグロバクテリウム・ツメファシエンスの
１夜培養菌１０ｍｌを選択下に成長させ、遠心分離し、
上澄みを捨て、細菌を同じ容量の抗生物質不含の培地に
再度懸濁させた。無菌のペトリ皿中で、その中央葉脈を
除去した不稔性植物の葉盤（約１ｃｍ2）をこの細菌懸
濁液に浸漬した。次いで葉盤をサッカロース２％及びバ
クトアガール０．８％を有するＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈ
ｉｇｅ及びＳｋｏｏｇ法“Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ Ｐ
ｌａｎｔａｒｕｍ”、（１９６２）、１５、４７３〜４
９７）を含むペトリ皿に厳重に包装して配置した。暗所
で２５℃で２日培養した後、これをカナマイシン１００
ｍｇ／ｌ、クラホラン５００ｍｇ／ｌ、ベンジルアミノ
プリン（ＢＡＰ）１ｍｇ／ｌ、ナフチル酢酸（ＮＡＡ）
０．２ｍｇ／ｌ及びバクトアガール０．８％を含むＭＳ
培地に移した。成長苗条をクラホラン２５０ｍｇ／ｌを
有するホルモン不含のＭＳ培地に移した。
１夜培養菌１０ｍｌを選択下に成長させ、遠心分離し、
上澄みを捨て、細菌を同じ容量の抗生物質不含の培地に
再度懸濁させた。無菌のペトリ皿中で、その中央葉脈を
除去した不稔性植物の葉盤（約１ｃｍ2）をこの細菌懸
濁液に浸漬した。次いで葉盤をサッカロース２％及びバ
クトアガール０．８％を有するＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈ
ｉｇｅ及びＳｋｏｏｇ法“Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ Ｐ
ｌａｎｔａｒｕｍ”、（１９６２）、１５、４７３〜４
９７）を含むペトリ皿に厳重に包装して配置した。暗所
で２５℃で２日培養した後、これをカナマイシン１００
ｍｇ／ｌ、クラホラン５００ｍｇ／ｌ、ベンジルアミノ
プリン（ＢＡＰ）１ｍｇ／ｌ、ナフチル酢酸（ＮＡＡ）
０．２ｍｇ／ｌ及びバクトアガール０．８％を含むＭＳ
培地に移した。成長苗条をクラホラン２５０ｍｇ／ｌを
有するホルモン不含のＭＳ培地に移した。
【００５３】Ｂ）ジャガイモ：不稔ジャガイモ培養の、
メスで傷を付けた小葉１０枚を、選択下に成長させたア
グロバクテリウム・ツメファシエンスの１夜培養菌３０
〜５０μｌを含むサッカロース２％を有するＭＳ培地１
０ｍｌに配置した。３〜５分間緩かに振った後、ペトリ
皿を暗所で２５℃でインキュベートした。２日後各葉
を、グルコース１．６％、ゼアチンリボース２ｍｇ／
ｌ、ナフチル酢酸０．０２ｍｇ／ｌ、ジベレリン酸０．
０２ｍｇ／ｌ、クラホラン５００ｍｇ／ｌ、カナマイシ
ン５０ｍｇ／ｌ及びバクトアガール０．８％を有するＭ
Ｓ培地に広げた。２５℃及び３０００ルックスで１週間
インキュベートした後、培地中のクラホラン濃度を半分
に下げた。Ｒｏｃｈａ−Ｓｏｓａその他によって記載さ
れた方法（“ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ”、８、２９
（１９８９）で更に培養した。
メスで傷を付けた小葉１０枚を、選択下に成長させたア
グロバクテリウム・ツメファシエンスの１夜培養菌３０
〜５０μｌを含むサッカロース２％を有するＭＳ培地１
０ｍｌに配置した。３〜５分間緩かに振った後、ペトリ
皿を暗所で２５℃でインキュベートした。２日後各葉
を、グルコース１．６％、ゼアチンリボース２ｍｇ／
ｌ、ナフチル酢酸０．０２ｍｇ／ｌ、ジベレリン酸０．
０２ｍｇ／ｌ、クラホラン５００ｍｇ／ｌ、カナマイシ
ン５０ｍｇ／ｌ及びバクトアガール０．８％を有するＭ
Ｓ培地に広げた。２５℃及び３０００ルックスで１週間
インキュベートした後、培地中のクラホラン濃度を半分
に下げた。Ｒｏｃｈａ−Ｓｏｓａその他によって記載さ
れた方法（“ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ”、８、２９
（１９８９）で更に培養した。
【００５４】５．トランスジェニック植物からのゲノム
ＤＮＡの分析 ゲノム植物ＤＮＡの分離をＲｏｇｅｒｓ及びＢｅｎｄｉ
ｃｈ法（“ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ”、（１９８
５）、５、６９〜７６）で行った。
ＤＮＡの分析 ゲノム植物ＤＮＡの分離をＲｏｇｅｒｓ及びＢｅｎｄｉ
ｃｈ法（“ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ”、（１９８
５）、５、６９〜７６）で行った。
【００５５】ＤＮＡ分析のため、適当に制限切断した後
ＤＮＡ１０〜２０μｇを、調査すべきＤＮＡ配列の組込
みに関しサザンブロット法により分析した。
ＤＮＡ１０〜２０μｇを、調査すべきＤＮＡ配列の組込
みに関しサザンブロット法により分析した。
【００５６】６．トランスジェニック植物からの全ＲＮ
Ａの分析 植物全ＲＮＡの分離をＬｏｇｅｍａｎｎその他による方
法（“Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．”、
(１９８７)、１６３、１６〜２０)で実施した。
Ａの分析 植物全ＲＮＡの分離をＬｏｇｅｍａｎｎその他による方
法（“Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．”、
(１９８７)、１６３、１６〜２０)で実施した。
【００５７】分析のため全ＲＮＡの部分５０μｇを、探
求した転写の存在につきノーザンブロット法により調査
した。
求した転写の存在につきノーザンブロット法により調査
した。
【００５８】７．蛋白質抽出 植物組織から全蛋白質を抽出するため組織片を、不溶性
ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）０．１％（ｗ／ｖ）を
付加した蛋白質抽出緩衝液（ｐＨ７．０の燐酸ナトリウ
ム２５ｍＭ、亜硫酸水素ナトリウム２ｍＭ、フェニルメ
チルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）２ｍＭ）中で均
質化した。
ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）０．１％（ｗ／ｖ）を
付加した蛋白質抽出緩衝液（ｐＨ７．０の燐酸ナトリウ
ム２５ｍＭ、亜硫酸水素ナトリウム２ｍＭ、フェニルメ
チルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）２ｍＭ）中で均
質化した。
【００５９】セルロースを介して濾過した後、細胞片を
毎分１０，０００回転で２０分間遠心分離し、上澄みの
蛋白質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄにより開発された方法
（“Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．”(１９７６)／７２、
２４８〜２５４)で決定した。
毎分１０，０００回転で２０分間遠心分離し、上澄みの
蛋白質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄにより開発された方法
（“Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．”(１９７６)／７２、
２４８〜２５４)で決定した。
【００６０】８．無機ピロホスファターゼ活性の検出
（Ｂａｙｋｏｖその他により変更“Ａｎａｌｙｔｉｃａ
ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”、１７１、２７１〜２
７６（１９８８）） 全蛋白質を上記第７項に記載した植物から抽出し、未変
更ＳＢ緩衝液（ｐＨ６．８のトリス／ＨＣｌ １２５ｍ
Ｍ、２−メルカプトエタノール１０％、グリコール２０
％、ブロモフェノール・ブルー０．００４％）を加え、
全体を１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルに加えた。
混合物を加熱によってではなしに変性し、その後ＳＤＳ
ポリアクリルアミドゲル中で単離した。電気泳動で単離
後、ゲルを水中で簡単に洗い、ピロ燐酸塩緩衝液（ｐＨ
９．０のトリス／ＨＣｌ ０．０５Ｍ、無機ピロ燐酸塩
（Ｎａ4Ｐ2Ｏ7）０．０３ｍＭ、ＭｇＣｌ2５ｍＭ）中で
３７℃で１時間インキュベートした。次いで染色粉末
（モリブデン酸アンモニウム１４０ｍｇ、２．５Ｍ Ｈ
2ＳＯ4１０ｍｌ中のマラカイトグリーン１１．５ｍｇ）
１７容量％をこの溶液に加えた。青緑色の沈殿の発生は
ピロホスファターゼ活性が存在することを示した。
（Ｂａｙｋｏｖその他により変更“Ａｎａｌｙｔｉｃａ
ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”、１７１、２７１〜２
７６（１９８８）） 全蛋白質を上記第７項に記載した植物から抽出し、未変
更ＳＢ緩衝液（ｐＨ６．８のトリス／ＨＣｌ １２５ｍ
Ｍ、２−メルカプトエタノール１０％、グリコール２０
％、ブロモフェノール・ブルー０．００４％）を加え、
全体を１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルに加えた。
混合物を加熱によってではなしに変性し、その後ＳＤＳ
ポリアクリルアミドゲル中で単離した。電気泳動で単離
後、ゲルを水中で簡単に洗い、ピロ燐酸塩緩衝液（ｐＨ
９．０のトリス／ＨＣｌ ０．０５Ｍ、無機ピロ燐酸塩
（Ｎａ4Ｐ2Ｏ7）０．０３ｍＭ、ＭｇＣｌ2５ｍＭ）中で
３７℃で１時間インキュベートした。次いで染色粉末
（モリブデン酸アンモニウム１４０ｍｇ、２．５Ｍ Ｈ
2ＳＯ4１０ｍｌ中のマラカイトグリーン１１．５ｍｇ）
１７容量％をこの溶液に加えた。青緑色の沈殿の発生は
ピロホスファターゼ活性が存在することを示した。
【００６１】９．サッカロース、グルコース、フルクト
ース及びデンプンの決定 ａ）抽出 液体窒素中で凍結させた小葉盤（直径１０ｍｍ）を水浴
中の緩衝液（エタノール８０％（ｖ／ｖ）、ＨＥＰＥＳ
１０ｍＭ、ｐＨ７．５）０．５ｍｌ中で８０℃で３０
分間抽出した。可溶性成分を含む上澄みを除去し、容量
を決定した。上澄みは可溶性糖質を決定するのに使用し
た。
ース及びデンプンの決定 ａ）抽出 液体窒素中で凍結させた小葉盤（直径１０ｍｍ）を水浴
中の緩衝液（エタノール８０％（ｖ／ｖ）、ＨＥＰＥＳ
１０ｍＭ、ｐＨ７．５）０．５ｍｌ中で８０℃で３０
分間抽出した。可溶性成分を含む上澄みを除去し、容量
を決定した。上澄みは可溶性糖質を決定するのに使用し
た。
【００６２】残った不溶性物質を水で洗い、乳鉢中で微
粉砕した。次いで抽出物を０．２Ｍ水酸化カリウム溶液
中で９５℃で１時間沸騰させ、１Ｎ酢酸７０μｌで中和
し、次いで遠心分離した。得られるデンプン溶液の分割
量をデンプンを定量するのに使用した。
粉砕した。次いで抽出物を０．２Ｍ水酸化カリウム溶液
中で９５℃で１時間沸騰させ、１Ｎ酢酸７０μｌで中和
し、次いで遠心分離した。得られるデンプン溶液の分割
量をデンプンを定量するのに使用した。
【００６３】ｂ）可溶性グルコース、フルクトース及び
サッカロースの定量決定 可溶性グルコース、フルクトース及びサッカロースの定
量決定を次のテスト混合物で行った：
サッカロースの定量決定 可溶性グルコース、フルクトース及びサッカロースの定
量決定を次のテスト混合物で行った：
【００６４】
【表１】
【００６５】混合物を５分間インキュベートした。次い
で各糖質の決定を、以下の物質を連続的に加えることに
よって光度測定法により実施した： 酵母からのヘキソキナーゼ（グルコース決定用）
１．０Ｕ 酵母からのホスホログルコース異性化酵素（フルクトー
ス決定用）１．０Ｕ 酵母からのインベルターゼ（サッカロース決定用）
２０．０Ｕ ｃ）デンプン決定 加水分解酵素を、ａ）でのエタノール抽出後に得られた
デンプン溶液に５５℃で加え、全体を次の混合物中で１
２時間インキュベートした： ｐＨ４．８の酢酸ナトリウム ５０．０ｍＭ アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎ
ｉｇｅｒ）からのアミログルコシダーゼ １．４Ｕ ブタの膵臓からのα−アミラーゼ ２．０Ｕ。
で各糖質の決定を、以下の物質を連続的に加えることに
よって光度測定法により実施した： 酵母からのヘキソキナーゼ（グルコース決定用）
１．０Ｕ 酵母からのホスホログルコース異性化酵素（フルクトー
ス決定用）１．０Ｕ 酵母からのインベルターゼ（サッカロース決定用）
２０．０Ｕ ｃ）デンプン決定 加水分解酵素を、ａ）でのエタノール抽出後に得られた
デンプン溶液に５５℃で加え、全体を次の混合物中で１
２時間インキュベートした： ｐＨ４．８の酢酸ナトリウム ５０．０ｍＭ アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎ
ｉｇｅｒ）からのアミログルコシダーゼ １．４Ｕ ブタの膵臓からのα−アミラーゼ ２．０Ｕ。
【００６６】インキュベート後、不溶性の構成分を１
６，０００ｇで４分間遠心分離することによって除去し
た。次いで上澄み中に得られるグルコースをｂ）に記載
したようにして酵素的に決定した。
６，０００ｇで４分間遠心分離することによって除去し
た。次いで上澄み中に得られるグルコースをｂ）に記載
したようにして酵素的に決定した。
【００６７】例 １ プラスミドｐ３５Ｓ−Ω−ｐｐａｓｅの調製及び植物ゲ
ノムへのこのプラスミドの挿入 無機ピロホスファターゼをコードする大腸菌Ｋ１２株か
らのＤＮＡ配列は、構成発現を引き起すカリフラワーモ
ザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓ ＲＮＡのプロモ
ーター、翻訳アンプリファイアとして作用するタバコモ
ザイクウイルスからのＤＮＡセグメント、及び植物終止
コドンを提供した。植物終止コドンはオクトピン合成遺
伝子のポリ−Ａ側鎖の３′−末端を含む。無機ピロホス
ファターゼに関する配列の翻訳開始コドンＡＴＧの付近
は、真核細胞に最良の発現を得るため制限された変異誘
発を受けた。プラスミドｐ３５Ｓ−Ω−ｐｐａｓｅはｐ
ＵＣ１８のポリリンカーの切断部位でクローン化された
４つの断片Ａ，Ｂ，Ｃ及びＤを含む。
ノムへのこのプラスミドの挿入 無機ピロホスファターゼをコードする大腸菌Ｋ１２株か
らのＤＮＡ配列は、構成発現を引き起すカリフラワーモ
ザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓ ＲＮＡのプロモ
ーター、翻訳アンプリファイアとして作用するタバコモ
ザイクウイルスからのＤＮＡセグメント、及び植物終止
コドンを提供した。植物終止コドンはオクトピン合成遺
伝子のポリ−Ａ側鎖の３′−末端を含む。無機ピロホス
ファターゼに関する配列の翻訳開始コドンＡＴＧの付近
は、真核細胞に最良の発現を得るため制限された変異誘
発を受けた。プラスミドｐ３５Ｓ−Ω−ｐｐａｓｅはｐ
ＵＣ１８のポリリンカーの切断部位でクローン化された
４つの断片Ａ，Ｂ，Ｃ及びＤを含む。
【００６８】断片Ａ（５２９ｂｐ）はカリフラワーモザ
イクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーターを含
む。この断片はＣａＭＶのヌクレオチド６９０９〜７４
３７を含む（Ｆｒａｎｃｋその他“Ｃｅｌｌ ２１”、
２８５〜２９４）。これはプラスミドｐＤＨ５１からＥ
ｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ断片の形で分離され（Ｐｉｅｔｒｚ
ａｋその他、“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ １４”、５８５７〜５８６８）、またプラス
ミドｐＵＣ１８のポリリンカーのＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ
切断部位間でクローン化された。
イクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーターを含
む。この断片はＣａＭＶのヌクレオチド６９０９〜７４
３７を含む（Ｆｒａｎｃｋその他“Ｃｅｌｌ ２１”、
２８５〜２９４）。これはプラスミドｐＤＨ５１からＥ
ｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ断片の形で分離され（Ｐｉｅｔｒｚ
ａｋその他、“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ １４”、５８５７〜５８６８）、またプラス
ミドｐＵＣ１８のポリリンカーのＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ
切断部位間でクローン化された。
【００６９】断片Ｂは、ＤＮＡセグメントの１部に対し
て相同性の次の配列： ＴＴＴＡＣＡＡＣＡＡＴＴＡＣＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡ
ＡＡＣＡＡＣＡＡＡＣＡＡＣＡＴＴＡＣＡＡＴＴＡＣＴ
ＡＴＴＴＡＣＡＡＴＴＡ を有しまた翻訳アンプリファイアとして作用する、タバ
コモザイクウイルス株Ｕからの６１ヌクレオチドからな
るセグメントを含む（Ｇａｌｌｉｅその他、“Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５”、３２５７〜３２
７３）。ＤＮＡ合成により作製されたこのセグメントは
５′−末端で配列： ＧＧＴＴＡＣＣ を有するＡｓｐ７１８をまた３′−末端で配列 ＣＣＡＴＧＧ を有するＮｃｏＩ−リンカーを提供した。
て相同性の次の配列： ＴＴＴＡＣＡＡＣＡＡＴＴＡＣＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡ
ＡＡＣＡＡＣＡＡＡＣＡＡＣＡＴＴＡＣＡＡＴＴＡＣＴ
ＡＴＴＴＡＣＡＡＴＴＡ を有しまた翻訳アンプリファイアとして作用する、タバ
コモザイクウイルス株Ｕからの６１ヌクレオチドからな
るセグメントを含む（Ｇａｌｌｉｅその他、“Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５”、３２５７〜３２
７３）。ＤＮＡ合成により作製されたこのセグメントは
５′−末端で配列： ＧＧＴＴＡＣＣ を有するＡｓｐ７１８をまた３′−末端で配列 ＣＣＡＴＧＧ を有するＮｃｏＩ−リンカーを提供した。
【００７０】断片ＢはｐＵＣ１８のポリリンカーのＫｐ
ｎＩ及びＳｍａＩ切断部位間でクローン化された。
ｎＩ及びＳｍａＩ切断部位間でクローン化された。
【００７１】断片ＣはＬａｈｔｉその他による配列
（“Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１７０”、５９０１
〜５９０７）のヌクレオチド（位置＋３９〜＋５６５）
を含む、大腸菌からの無機ピロホスファターゼ（ｐｐ
ａ）の蛋白質−コード化部位を含む。
（“Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１７０”、５９０１
〜５９０７）のヌクレオチド（位置＋３９〜＋５６５）
を含む、大腸菌からの無機ピロホスファターゼ（ｐｐ
ａ）の蛋白質−コード化部位を含む。
【００７２】断片Ｃは断片ＢのＮｃｏＩ部位とｐＵＣ１
８のポリリンカーＳａｌＩ部位との間でクローン化され
た。
８のポリリンカーＳａｌＩ部位との間でクローン化され
た。
【００７３】断片Ｄ（１９２ｂｐ）はＴｉプラスミドｐ
ＴｉＡＣＨ５（Ｇｉｅｌｅｎその他、“ＥＭＢＯ Ｊ．
３”、８３５〜８４６）のＴ−ＤＮＡの遺伝子３のポリ
アデニル化信号、ヌクレオチド１１７４９−１１９３９
を含み、これはプラスミドｐＡＧＶ４０（Ｈｅｒｒｅｒ
ａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａその他、“（１９８３）Ｎａｔｕ
ｒｅ３０３”、２０９〜２１３）からＰｖｕＩＩ−Ｈｉ
ｎｄＩＩＩの形で分離され、ＳｐｈＩリンカーをＰｖｕ
ＩＩ切断部位に付加した後、ｐＵＣ１８のポリリンカー
のＳｐｈＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位間でクローン化さ
れた。
ＴｉＡＣＨ５（Ｇｉｅｌｅｎその他、“ＥＭＢＯ Ｊ．
３”、８３５〜８４６）のＴ−ＤＮＡの遺伝子３のポリ
アデニル化信号、ヌクレオチド１１７４９−１１９３９
を含み、これはプラスミドｐＡＧＶ４０（Ｈｅｒｒｅｒ
ａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａその他、“（１９８３）Ｎａｔｕ
ｒｅ３０３”、２０９〜２１３）からＰｖｕＩＩ−Ｈｉ
ｎｄＩＩＩの形で分離され、ＳｐｈＩリンカーをＰｖｕ
ＩＩ切断部位に付加した後、ｐＵＣ１８のポリリンカー
のＳｐｈＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位間でクローン化さ
れた。
【００７４】プラスミドｐ３５Ｓ−Ω−ｐｐａｓｅの大
きさは４．０ｋｂである。
きさは４．０ｋｂである。
【００７５】プラスミドｐ３５Ｓ−Ω−ｐｐａｓｅをバ
イナリーベクターに挿入し、次いでアグロバクテリア系
によりタバコ及びジャガイモ植物に挿入した。無傷の稔
性植物が無質転換細胞から再生された。
イナリーベクターに挿入し、次いでアグロバクテリア系
によりタバコ及びジャガイモ植物に挿入した。無傷の稔
性植物が無質転換細胞から再生された。
【００７６】サザンブロット分析による形質転換植物の
分析結果は、トランスジェニック植物に無傷のキメラピ
ロホスファターゼ遺伝子が存在することを示した。
分析結果は、トランスジェニック植物に無傷のキメラピ
ロホスファターゼ遺伝子が存在することを示した。
【００７７】トランスジェニックジャガイモ及びタバコ
植物中のピロホスファターゼ遺伝子によりコードされた
ＲＮＡを検出するため、全ＲＮＡ３０μｇを、形質転換
しまた再生したジャガイモ及びタバコ植物の葉から及び
非形質転換ジャガイモ及びタバコ植物から分離した。Ｒ
ＮＡをノーザンブロット分析により調べた。再生された
植物（ジャガイモ：位置１，２，８，１１，１２，１５
及び１８、タバコ：位置２１〜２６）の分析結果は組織
中において特異的に無機ピロホスファターゼのコード化
配列で雑種形成するＲＮＡの存在を示したが、これは非
形質転換植物（ジャガイモ植物：位置Ａ、タバコ植物：
位置Ｂ）には存在しない（図２）。
植物中のピロホスファターゼ遺伝子によりコードされた
ＲＮＡを検出するため、全ＲＮＡ３０μｇを、形質転換
しまた再生したジャガイモ及びタバコ植物の葉から及び
非形質転換ジャガイモ及びタバコ植物から分離した。Ｒ
ＮＡをノーザンブロット分析により調べた。再生された
植物（ジャガイモ：位置１，２，８，１１，１２，１５
及び１８、タバコ：位置２１〜２６）の分析結果は組織
中において特異的に無機ピロホスファターゼのコード化
配列で雑種形成するＲＮＡの存在を示したが、これは非
形質転換植物（ジャガイモ植物：位置Ａ、タバコ植物：
位置Ｂ）には存在しない（図２）。
【００７８】ｐ３５Ｓ−Ω−ｐｐａｓｅプラスミドで形
質転換されたトランスジェニックジャガイモ及びタバコ
植物の葉からの蛋白質抽出物における新規ピロホスファ
ターゼ活性の検出を、先の第８項で記載したように部分
的に変性した遺伝子で実施した。
質転換されたトランスジェニックジャガイモ及びタバコ
植物の葉からの蛋白質抽出物における新規ピロホスファ
ターゼ活性の検出を、先の第８項で記載したように部分
的に変性した遺伝子で実施した。
【００７９】特異的に無機ピロホスファターゼのコード
化配列で雑種形成するＲＮＡを含む形質転換植物の蛋白
質抽出物は無機ピロホスファターゼ活性を示した（ジャ
ガイモ植物：位置１〜７、タバコ植物：位置８及び９）
が、これは非形質転換植物には存在しなかった（位置Ａ
〜Ｃ）（図３参照）。
化配列で雑種形成するＲＮＡを含む形質転換植物の蛋白
質抽出物は無機ピロホスファターゼ活性を示した（ジャ
ガイモ植物：位置１〜７、タバコ植物：位置８及び９）
が、これは非形質転換植物には存在しなかった（位置Ａ
〜Ｃ）（図３参照）。
【００８０】こうしてこれらの植物に挿入された大腸菌
遺伝子に由来する新規無機ピロホスファターゼ活性を含
むトランスジェニックタバコ及びジャガイモ植物が作製
された（図３）。
遺伝子に由来する新規無機ピロホスファターゼ活性を含
むトランスジェニックタバコ及びジャガイモ植物が作製
された（図３）。
【００８１】再生されたタバコ及びジャガイモ植物は表
現型及び生化学パラメータに関して多くの違いを示し
た。
現型及び生化学パラメータに関して多くの違いを示し
た。
【００８２】ａ）トランスジェニックタバコ植物 ピロホスファターゼ遺伝子の発現が高水準のトランスジ
ェニックタバコ植物は植物の大きさに関して顕著な減少
を示したが、ピロホスファターゼ遺伝子の発現水準が中
程度のタバコ植物は大きさに関して極く僅かな減少を示
したにすぎなかった。その緻密性は葉の枚数の減少に依
るのではなく、内節間隔の縮少に帰すことができる。
ェニックタバコ植物は植物の大きさに関して顕著な減少
を示したが、ピロホスファターゼ遺伝子の発現水準が中
程度のタバコ植物は大きさに関して極く僅かな減少を示
したにすぎなかった。その緻密性は葉の枚数の減少に依
るのではなく、内節間隔の縮少に帰すことができる。
【００８３】ピロホスファターゼを発現するタバコ植物
の若葉は、非形質転換対照植物と比較して顕著な表現型
差違を示さなかった。これに対しピロホスファターゼ発
現葉の古葉は、葉の著しい肥厚を示した。ピロホスファ
ターゼ遺伝子を極めて高度に発現する植物には、古葉の
褪色が観察された。これらの発現型の差違とは別に、ピ
ロホスファターゼ遺伝子を発現するタバコ植物は異なる
時期の葉における炭水化物の組成において著しい変化を
示した（図４参照）。例えば可溶性糖質、特にグルコー
ス、フルクトース及びサッカロースの量は非形質転換植
物の葉と比較して全ての葉において明らかに増大し、古
葉にあっては２０〜５０倍の増大が観察された。同時に
少なくとも古葉においては形成されたデンプンの量が増
大しているが、その増大は可溶性糖質の割合での増大ほ
ど大きくはなかった。総体的にピロホスファターゼの発
現の結果としてデンプン及び可溶性糖質の全含有量にお
いて顕著な増大が観察されたが、デンプン及び可溶性糖
質間での光同化物の分布には可溶性糖質の方に明らかに
転換があった。
の若葉は、非形質転換対照植物と比較して顕著な表現型
差違を示さなかった。これに対しピロホスファターゼ発
現葉の古葉は、葉の著しい肥厚を示した。ピロホスファ
ターゼ遺伝子を極めて高度に発現する植物には、古葉の
褪色が観察された。これらの発現型の差違とは別に、ピ
ロホスファターゼ遺伝子を発現するタバコ植物は異なる
時期の葉における炭水化物の組成において著しい変化を
示した（図４参照）。例えば可溶性糖質、特にグルコー
ス、フルクトース及びサッカロースの量は非形質転換植
物の葉と比較して全ての葉において明らかに増大し、古
葉にあっては２０〜５０倍の増大が観察された。同時に
少なくとも古葉においては形成されたデンプンの量が増
大しているが、その増大は可溶性糖質の割合での増大ほ
ど大きくはなかった。総体的にピロホスファターゼの発
現の結果としてデンプン及び可溶性糖質の全含有量にお
いて顕著な増大が観察されたが、デンプン及び可溶性糖
質間での光同化物の分布には可溶性糖質の方に明らかに
転換があった。
【００８４】ｂ）トランスジェニックジャガイモ植物 ピロホスファターゼ遺伝子を発現するトランスジェニッ
クジャガイモ植物は第１の実質的な表現型特異性として
極めてコンパクトな大きさを示した。この緻密性は、主
若枝の形成が増加することにより増加した植物の分枝を
伴なう。このコンパクトな成長が風に対する安定性及び
感性に関して多くの利点を有することは明らかである。
クジャガイモ植物は第１の実質的な表現型特異性として
極めてコンパクトな大きさを示した。この緻密性は、主
若枝の形成が増加することにより増加した植物の分枝を
伴なう。このコンパクトな成長が風に対する安定性及び
感性に関して多くの利点を有することは明らかである。
【００８５】更にピロホスファターゼ遺伝子を発現する
ジャガイモ植物は葉における炭水化物の組成に関して著
しい変化を示した（図５参照）。例えばジャガイモ植物
は増大したサッカロース：デンプン比を有する。この比
の増大は２０倍であり得る。タバコ植物とは異なり、ト
ランスジェニックジャガイモ植物はヘキソース（グルコ
ース及びフルクトース）においては顕著な増大を示さな
かった。
ジャガイモ植物は葉における炭水化物の組成に関して著
しい変化を示した（図５参照）。例えばジャガイモ植物
は増大したサッカロース：デンプン比を有する。この比
の増大は２０倍であり得る。タバコ植物とは異なり、ト
ランスジェニックジャガイモ植物はヘキソース（グルコ
ース及びフルクトース）においては顕著な増大を示さな
かった。
【００８６】トランスジェニックジャガイモ植物中に無
機ピロホスファターゼをコードする遺伝子が発現する結
果として、サッカロース／デンプン比に変更を生ぜし
め、相応してソース葉の容量を変更することができた。
機ピロホスファターゼをコードする遺伝子が発現する結
果として、サッカロース／デンプン比に変更を生ぜし
め、相応してソース葉の容量を変更することができた。
【００８７】ピロホスファターゼ遺伝子は多くの他のソ
ースからクローン化することができまた同様の実験に使
用することができる。更にピロホスファターゼの一次配
列は、一層高い発現水準を達成し及び／又はｐｐａｓｅ
を例えば他の細胞下オルガネラ（葉緑体、ミトコンドリ
ア、液胞、細胞外空間）にターゲットし又は例えば光合
成活性細胞例えば種子、塊茎、主根、果実、根、茎、花
等にのみ又は旱ばつ、熱、冷気、高塩分土壌等のような
特殊な環境条件下で特異的に発現する他のプロモーター
を使用するように変更することができる。
ースからクローン化することができまた同様の実験に使
用することができる。更にピロホスファターゼの一次配
列は、一層高い発現水準を達成し及び／又はｐｐａｓｅ
を例えば他の細胞下オルガネラ（葉緑体、ミトコンドリ
ア、液胞、細胞外空間）にターゲットし又は例えば光合
成活性細胞例えば種子、塊茎、主根、果実、根、茎、花
等にのみ又は旱ばつ、熱、冷気、高塩分土壌等のような
特殊な環境条件下で特異的に発現する他のプロモーター
を使用するように変更することができる。
【００８８】例 ２ プラスミドＬ７００：ｐｐａの調製及び植物ゲノムへの
このプラスミドの挿入無機ピロホスファターゼをコード
する大腸菌Ｋ１２株からのＤＮＡ配列は、光合成活性細
胞に特異的発現をもたらすＳＴ−ＬＳ１遺伝子のプロモ
ーター（Ｓｔｏｃｋｈａｕｓその他著、“ＥＭＢＯ
Ｊ．”８、２４４５〜２４５１（１９８９））及び植物
終止コドンを提供した。この植物終止コドンはオクトピ
ン合成遺伝子のポリ−Ａ側鎖の３′−末端を含む。プラ
スミドＬ７００：ｐｐａはｐＵＣ１８のポリリンカーの
切断部位にクローン化された３つの断片Ａ，Ｂ及びＣを
含む（図６）。
このプラスミドの挿入無機ピロホスファターゼをコード
する大腸菌Ｋ１２株からのＤＮＡ配列は、光合成活性細
胞に特異的発現をもたらすＳＴ−ＬＳ１遺伝子のプロモ
ーター（Ｓｔｏｃｋｈａｕｓその他著、“ＥＭＢＯ
Ｊ．”８、２４４５〜２４５１（１９８９））及び植物
終止コドンを提供した。この植物終止コドンはオクトピ
ン合成遺伝子のポリ−Ａ側鎖の３′−末端を含む。プラ
スミドＬ７００：ｐｐａはｐＵＣ１８のポリリンカーの
切断部位にクローン化された３つの断片Ａ，Ｂ及びＣを
含む（図６）。
【００８９】断片Ａ（１５８５ｂｐ）はＳＴ−ＬＳ１遺
伝子のプロモーター（前掲の引用文中の）を含む。この
断片はＳＴ−ＬＳ１遺伝子のヌクレオチド＋１〜＋１５
８５（Ｅｃｋｅｒｓその他著、“Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ”、２０Ｓ、１４〜２２）を含む。これを
ＥｃｏＲＩ−ＭｂｏＩＩ断片の形で分離し、ＭｂｏＩＩ
部位をＴ４−ＤＮＡポリメラーゼで流した後、プラスミ
ドｐＵＣ１８のポリリンカーのＥｃｏＲＩ−ＳｍａＩ切
断部位間でクローン化した。
伝子のプロモーター（前掲の引用文中の）を含む。この
断片はＳＴ−ＬＳ１遺伝子のヌクレオチド＋１〜＋１５
８５（Ｅｃｋｅｒｓその他著、“Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ”、２０Ｓ、１４〜２２）を含む。これを
ＥｃｏＲＩ−ＭｂｏＩＩ断片の形で分離し、ＭｂｏＩＩ
部位をＴ４−ＤＮＡポリメラーゼで流した後、プラスミ
ドｐＵＣ１８のポリリンカーのＥｃｏＲＩ−ＳｍａＩ切
断部位間でクローン化した。
【００９０】断片ＢはＬａｈｔｉその他（“Ｊ．Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌｏｇｙ”、１７０、５９０１〜５９０７）
による配列のヌクレオチド（位置＋３９〜＋５６５）を
含む、大腸菌からの無機ピロホスファターゼ（ｐｐａ）
の蛋白質コード化部位を含む。これをプラスミドｐ３５
Ｓ−Ω−ｐｐａｓｅからＮｃｏＩ−ＳａｌＩ断片の形で
分離した（図１参照）。ＮｃｏＩ部位及びＢａｍＨＩ部
位にフィルイン反応により平滑断端を作った後、断片Ｂ
をｐＵＣ１８のポリリンカーのＢａｍＨＩ及びＳＡＬＩ
部位間でクローン化した。
ｔｅｒｉｏｌｏｇｙ”、１７０、５９０１〜５９０７）
による配列のヌクレオチド（位置＋３９〜＋５６５）を
含む、大腸菌からの無機ピロホスファターゼ（ｐｐａ）
の蛋白質コード化部位を含む。これをプラスミドｐ３５
Ｓ−Ω−ｐｐａｓｅからＮｃｏＩ−ＳａｌＩ断片の形で
分離した（図１参照）。ＮｃｏＩ部位及びＢａｍＨＩ部
位にフィルイン反応により平滑断端を作った後、断片Ｂ
をｐＵＣ１８のポリリンカーのＢａｍＨＩ及びＳＡＬＩ
部位間でクローン化した。
【００９１】断片Ｃ（１９２ｂｐ）はＴｉプラスミドｐ
ＴｉＡＣＨ５（Ｇｉｅｌｅｎその他著、“ＥＭＢＯ
Ｊ”、３、８３５〜８４６）のＴ−ＤＮＡ（ヌクレオチ
ド１１７４９〜１１９３９）の遺伝子３のポリアデニル
化信号を含む。これをプラスミドｐＡＧＶ４０（Ｈｅｒ
ｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａその他著、“（１９８３）
Ｎａｔｕｒｅ３０３．”２０９〜２１３）からのＰｖｕ
ＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片の形で分離し、ＰｖｕＩＩ切
断部位にＳｐｈＩリンカーを付加した後、ｐＵＣ１８の
ポリリンカーのＳｐｈＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位間で
クローン化した。
ＴｉＡＣＨ５（Ｇｉｅｌｅｎその他著、“ＥＭＢＯ
Ｊ”、３、８３５〜８４６）のＴ−ＤＮＡ（ヌクレオチ
ド１１７４９〜１１９３９）の遺伝子３のポリアデニル
化信号を含む。これをプラスミドｐＡＧＶ４０（Ｈｅｒ
ｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａその他著、“（１９８３）
Ｎａｔｕｒｅ３０３．”２０９〜２１３）からのＰｖｕ
ＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片の形で分離し、ＰｖｕＩＩ切
断部位にＳｐｈＩリンカーを付加した後、ｐＵＣ１８の
ポリリンカーのＳｐｈＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位間で
クローン化した。
【００９２】プラスミドＬ７００：ｐｐａの大きさは
５．０ｋｂである。
５．０ｋｂである。
【００９３】プラスミドＬ７００：ｐｐａをバイナリー
ベクターに挿入し、次いでアグロバクテリア系によりタ
バコ及びジャガイモ植物に挿入した。無傷の稔性植物が
形質転換細胞から再生された。
ベクターに挿入し、次いでアグロバクテリア系によりタ
バコ及びジャガイモ植物に挿入した。無傷の稔性植物が
形質転換細胞から再生された。
【００９４】サザンブロット、ＲＮＡブロット及びザイ
モグラム分析による形質転換植物の分析結果は、トラン
スジェニック植物中のピロホスファターゼ遺伝子の存在
及び発現を葉組織（それぞれ光合成活性細胞）において
のみ示した。
モグラム分析による形質転換植物の分析結果は、トラン
スジェニック植物中のピロホスファターゼ遺伝子の存在
及び発現を葉組織（それぞれ光合成活性細胞）において
のみ示した。
【００９５】光合成活性細胞（葉）での大腸菌ピロホス
ファターゼの特異的発現はシンク器官（根、塊茎）への
サッカロース供給を増大させ、従って収量は増大する。
ファターゼの特異的発現はシンク器官（根、塊茎）への
サッカロース供給を増大させ、従って収量は増大する。
【図１】４．０ｋｂのプラスミドｐ３５Ｓ−Ω−ｐｐａ
ｓｅの構造を示す図。
ｓｅの構造を示す図。
【図２】ノーザンブロット分析法によってトランスジェ
ニックジャガイモ及びタバコ植物中の、ピロホスファタ
ーゼ遺伝子によりコードされたＲＮＡの検出を示す図。
ニックジャガイモ及びタバコ植物中の、ピロホスファタ
ーゼ遺伝子によりコードされたＲＮＡの検出を示す図。
【図３】ＳＤＳポリアクリルアミドゲル中での、ｐ３５
Ｓ−Ω−ｐｐａｓｅプラスミドにより形質転換されたト
ランスジェニックジャガイモ及びタバコ植物の葉からの
蛋白質抽出物における新ピロホスファターゼ活性の発生
検出を示す図。
Ｓ−Ω−ｐｐａｓｅプラスミドにより形質転換されたト
ランスジェニックジャガイモ及びタバコ植物の葉からの
蛋白質抽出物における新ピロホスファターゼ活性の発生
検出を示す図。
【図４】種々異なる時期の葉における、ｐ３５Ｓ−Ω−
ｐｐａｓｅ遺伝子を発現するタバコ植物（□）及び非形
質転換タバコ植物（■）中のグルコース、フルクトー
ス、サッカロース及びデンプンの各含有量を比較して示
す図。
ｐｐａｓｅ遺伝子を発現するタバコ植物（□）及び非形
質転換タバコ植物（■）中のグルコース、フルクトー
ス、サッカロース及びデンプンの各含有量を比較して示
す図。
【図５】形質転換された植物の葉中のサッカロース／デ
ンプン比で、トランスジェニックジャガイモ植物におけ
るｐ３５Ｓ−Ω−ｐｐａｓｅ遺伝子の発現効果を示す
図。
ンプン比で、トランスジェニックジャガイモ植物におけ
るｐ３５Ｓ−Ω−ｐｐａｓｅ遺伝子の発現効果を示す
図。
【図６】５．０ｋｂのプラスミドＬ７００：ｐｐａの構
造を示す図。
造を示す図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/55
Claims (15)
- 【請求項１】 可溶性糖質の代謝を変更する蛋白質をコ
ードするＤＮＡ配列を含むプラスミド。 - 【請求項２】 ＤＮＡ配列が、燐酸／ピロ燐酸代謝に介
在する生産物をコードする請求項１記載のプラスミド。 - 【請求項３】 ＤＮＡ配列が無機ピロホスファターゼ遺
伝子をコードする請求項２記載のプラスミド。 - 【請求項４】 ＤＮＡ配列が大腸菌のピロホスファター
ゼ遺伝子をコードする請求項３記載のプラスミド。 - 【請求項５】 ＤＮＡ配列が、植物細胞内又は植物内に
その遺伝子を発現させることのできる、１種以上の他の
遺伝子の調節部位に融合されている請求項１から４まで
のいずれか１項記載のプラスミド。 - 【請求項６】 調節部位が植物遺伝子のプロモーター部
位及び、同じ又は異なる植物遺伝子の終止コドンを含む
請求項５記載のプラスミド。 - 【請求項７】 終止コドンがオクトピン合成酵素遺伝子
のポリＡ側鎖の３′−末端位を含む請求項６記載のプラ
スミド。 - 【請求項８】 プロモーターがカリフラワーモザイクウ
イルスの３５ＳＲＮＡのプロモーター又は葉に特異的に
発現した遺伝子のプロモーターである請求項６記載のプ
ラスミド。 - 【請求項９】 遺伝子のプロモーターがＳＴ−ＬＳ１遺
伝子である請求項８記載のプラスミド。 - 【請求項１０】 プラスミドｐ３５Ｓ−Ω−ｐｐａｓ
ｅ(ＤＳＭ６１４１)。 - 【請求項１１】 プラスミドＬ７００：ｐｐａ（ＤＳＭ
６７３３）。 - 【請求項１２】 請求項１から９までのいずれか１項記
載のＤＮＡ配列を含む植物細胞又は植物。 - 【請求項１３】 請求項１から１１までのいずれか１項
記載のプラスミドを含む植物細胞又は植物。 - 【請求項１４】 変更された可溶性糖質代謝を有するト
ランスジェニック植物を作製するのに使用する、請求項
１から１１までのいずれか１項記載のプラスミド。 - 【請求項１５】 習性、耐旱ばつ性、耐霜性及び収量の
少なくとも１つに関して変更されているトランスジェニ
ック植物を作製するのに使用する、請求項１から１１ま
でのいずれか１項記載のプラスミド。
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| DE4337597C2 (de) * | 1993-10-28 | 2002-07-18 | Aventis Cropscience Gmbh | DNA-Sequenzen für Ammoniumtransporter, Plasmide, Bakterien, Hefen, Pflanzenzellen und Pflanzen enthaltend den Transporter |
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| US6420629B1 (en) * | 1996-09-09 | 2002-07-16 | B.C. Research Inc. | Process of increasing plant growth and yield and modifying cellulose production in plants |
| US6416985B1 (en) | 1996-10-15 | 2002-07-09 | Board Of Trustees Of Michigan State University | DNA encoding mannose 6-phosphate reductase and recombinants produced therefrom |
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| US6274319B1 (en) * | 1999-01-29 | 2001-08-14 | Walter Messier | Methods to identify evolutionarily significant changes in polynucleotide and polypeptide sequences in domesticated plants and animals |
| US7439018B2 (en) * | 1999-01-29 | 2008-10-21 | Evolutionary Genomics, Inc. | EG1117 Polynucleotides and uses thereof |
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| AU3026301A (en) * | 2000-02-02 | 2001-08-14 | Univ Navarra Publica | Plant adpglucose pyrophosphatase, method for the production thereof, its use in the production of assay devices and for obtaining transgenic plants |
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