JP3288395B2 - プラスミド、トランスジェニック植物の製法、トランスジェニック植物、及び特異ｄｎａ配列を含有する植物細胞もしくは植物 - Google Patents
プラスミド、トランスジェニック植物の製法、トランスジェニック植物、及び特異ｄｎａ配列を含有する植物細胞もしくは植物Info
- Publication number
- JP3288395B2 JP3288395B2 JP01998491A JP1998491A JP3288395B2 JP 3288395 B2 JP3288395 B2 JP 3288395B2 JP 01998491 A JP01998491 A JP 01998491A JP 1998491 A JP1998491 A JP 1998491A JP 3288395 B2 JP3288395 B2 JP 3288395B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- plant
- gene
- plasmid
- dna sequence
- promoter
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
- C07K14/8114—Kunitz type inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
- C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、トランスジェニック植
物を製造するための新規のプラスミド、並びに該プラス
ミド上に局在化される植物内の糖代謝又は糖分配に作用
する遺伝子の転移及び発現を介して変更された植物に関
する。
物を製造するための新規のプラスミド、並びに該プラス
ミド上に局在化される植物内の糖代謝又は糖分配に作用
する遺伝子の転移及び発現を介して変更された植物に関
する。
【０００２】
【従来の技術】穀物又は鑑賞用植物の生長、発育及び収
穫量は、植物が光合成中にＣＯ2を炭水化物中に固定す
ることにより取得するエネルギに依存する。光合成のた
めの最初の位置は葉でありかつ僅かに茎組織に延びてい
るのに対して、植物のその他の器官、例えば根、種又は
塊茎は光同化物の形成に実質的な貢献はしない、しかし
それとは反対にそれらの生長のためには光合成活性器官
からの供給に依存する。このことは、植物の光合成活性
組織から光合成不活性部分への光合成で取得されたエネ
ルギの流れが存在することを意味する。
穫量は、植物が光合成中にＣＯ2を炭水化物中に固定す
ることにより取得するエネルギに依存する。光合成のた
めの最初の位置は葉でありかつ僅かに茎組織に延びてい
るのに対して、植物のその他の器官、例えば根、種又は
塊茎は光同化物の形成に実質的な貢献はしない、しかし
それとは反対にそれらの生長のためには光合成活性器官
からの供給に依存する。このことは、植物の光合成活性
組織から光合成不活性部分への光合成で取得されたエネ
ルギの流れが存在することを意味する。
【０００３】光合成活性組織はソース(source)として設
計されている。これらは固定された二酸化炭素のネット
エクスポータ(net exporter)として定義される。植物の
光合成不活性部分はシンク(sink)として設計されてい
る。これらは光合成で固定された二酸化炭素のネットイ
ンポータ(net importer)として定義される。
計されている。これらは固定された二酸化炭素のネット
エクスポータ(net exporter)として定義される。植物の
光合成不活性部分はシンク(sink)として設計されてい
る。これらは光合成で固定された二酸化炭素のネットイ
ンポータ(net importer)として定義される。
【０００４】該シンクは、光合成生成物の有効利用並び
にそれらの植物内の分配の両者に若干の方式で強力な影
響を及ぼすと信じられている。1つの例は植物の習性で
ある。新しく発育する器官、例えば極めて若い葉又はそ
の他の領域例えば根及び種は、完全にソースの光合成機
能に依存する。このことはこのような器官の発育は植物
内部ソースから形成された光同化物の分配に依存するこ
とを意味する。若葉の形成の可能性或はまた根の形成
は、例えば植物のサイズ、節間の分離、葉のサイズ及び
形状、葉の外見、及び根の数及び形状のような植物の習
性に著しい影響を及ぼすことができる。更に、光同化物
の分配は、植物の収穫量のために全く重要な意味を持つ
ことがある。ここ１０年間、コムギの収穫量は増大して
来たが、コムギの全体的光合成機能は大してたいして変
わっていない。このことは、種のような収穫のために重
要であるシンクが茎のような収穫量に関する限り重要で
ない植物の他の部分よりも実質的に多くの光同化物を摂
取するように、シンクのソースに対する相対関係が変化
されることにより説明される。この場合には、茎の短縮
化によって、小麦にける極めて大きな確かなシンクのソ
ースに対する相対関係が達成されるはずである。このこ
とは、植物の習性及びまた収穫量の両者に相関して最初
のソースで形成された高級植物における光同化物の分配
に重要性を強調するものである。
にそれらの植物内の分配の両者に若干の方式で強力な影
響を及ぼすと信じられている。1つの例は植物の習性で
ある。新しく発育する器官、例えば極めて若い葉又はそ
の他の領域例えば根及び種は、完全にソースの光合成機
能に依存する。このことはこのような器官の発育は植物
内部ソースから形成された光同化物の分配に依存するこ
とを意味する。若葉の形成の可能性或はまた根の形成
は、例えば植物のサイズ、節間の分離、葉のサイズ及び
形状、葉の外見、及び根の数及び形状のような植物の習
性に著しい影響を及ぼすことができる。更に、光同化物
の分配は、植物の収穫量のために全く重要な意味を持つ
ことがある。ここ１０年間、コムギの収穫量は増大して
来たが、コムギの全体的光合成機能は大してたいして変
わっていない。このことは、種のような収穫のために重
要であるシンクが茎のような収穫量に関する限り重要で
ない植物の他の部分よりも実質的に多くの光同化物を摂
取するように、シンクのソースに対する相対関係が変化
されることにより説明される。この場合には、茎の短縮
化によって、小麦にける極めて大きな確かなシンクのソ
ースに対する相対関係が達成されるはずである。このこ
とは、植物の習性及びまた収穫量の両者に相関して最初
のソースで形成された高級植物における光同化物の分配
に重要性を強調するものである。
【０００５】いかなる生化学機構によりシンクとソース
の相対関係が調節されるかは知られていない。
の相対関係が調節されるかは知られていない。
【０００６】単子葉植物及び双子葉植物の遺伝子変化の
ための新規の生物工学的方法は公知である（Gasser and
Fraley, 1989, Science 244, 1293-1299）。
ための新規の生物工学的方法は公知である（Gasser and
Fraley, 1989, Science 244, 1293-1299）。
【０００７】たいていの植物においては、光同化物は植
物内に糖の形及び特にスクロースの形で分配される。ソ
ースとシンク組織の間のスクロースの分配は、師部を介
するスクロースの輸送により行われる。シンクの強度に
とって重要な決定子の１つは、シンク内での師部のアン
ローディングであると見なされる。師部からシンクへの
スクロースの強力なアンローディングを達成するために
は、スクロースは可能な限り師部から出た後に、もはや
スクロースに対して化学的類縁を有しない異なった化学
成分に転化されねばならない。
物内に糖の形及び特にスクロースの形で分配される。ソ
ースとシンク組織の間のスクロースの分配は、師部を介
するスクロースの輸送により行われる。シンクの強度に
とって重要な決定子の１つは、シンク内での師部のアン
ローディングであると見なされる。師部からシンクへの
スクロースの強力なアンローディングを達成するために
は、スクロースは可能な限り師部から出た後に、もはや
スクロースに対して化学的類縁を有しない異なった化学
成分に転化されねばならない。
【０００８】植物の習性の変化は、既知の植物において
重要な改善を意味する。例えば、このことはより強力な
風に対する抵抗力を有する変種を生成するために茎を短
縮を惹起することができる。例えばオオムギ、コムギ、
ダイズ又はトウモロコシの種、例えばタバコの葉、サト
ウキビの茎、例えばジャガイモの塊茎、例えばアニマル
・フィード・ビート及びサトウダイコンのビートのよう
な収穫器官内の光同化物の好ましい分配は、植物の一層
の収穫量をもたらすはずである。これらの変化はまた、
完全に新しい習性を有する植物を生じる鑑賞用及び園芸
植物にも適用される。
重要な改善を意味する。例えば、このことはより強力な
風に対する抵抗力を有する変種を生成するために茎を短
縮を惹起することができる。例えばオオムギ、コムギ、
ダイズ又はトウモロコシの種、例えばタバコの葉、サト
ウキビの茎、例えばジャガイモの塊茎、例えばアニマル
・フィード・ビート及びサトウダイコンのビートのよう
な収穫器官内の光同化物の好ましい分配は、植物の一層
の収穫量をもたらすはずである。これらの変化はまた、
完全に新しい習性を有する植物を生じる鑑賞用及び園芸
植物にも適用される。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、サイ
ズ、葉の形状、節間分離及び根形成のような植物の習性
並びにそれらの収穫量を変化させた植物を製造するため
のプラスミドを提供することであった。本発明のもう１
つの課題は、これらのプラスミドを含有する植物を提供
することであった。
ズ、葉の形状、節間分離及び根形成のような植物の習性
並びにそれらの収穫量を変化させた植物を製造するため
のプラスミドを提供することであった。本発明のもう１
つの課題は、これらのプラスミドを含有する植物を提供
することであった。
【００１０】
【課題を解決するための手段】ところで、糖代謝又は糖
分配に影響を及ぼす遺伝子が配置されたプラスミドは、
植物への標的した導入後に、それらのトランスジェニッ
ク植物において発現され、それによりコードした産物は
それらのトランスジェニック植物における光同化物の変
化した分配を惹起することが判明した。このようにし
て、驚異的にも、個々の遺伝子の導入が習性及び収穫量
に重要な変更をもたらすことが判明した。
分配に影響を及ぼす遺伝子が配置されたプラスミドは、
植物への標的した導入後に、それらのトランスジェニッ
ク植物において発現され、それによりコードした産物は
それらのトランスジェニック植物における光同化物の変
化した分配を惹起することが判明した。このようにし
て、驚異的にも、個々の遺伝子の導入が習性及び収穫量
に重要な変更をもたらすことが判明した。
【００１１】例えばジャガイモ及びタバコのような植物
の習性及び収穫量における特に重要な変化は、スクロー
ス変更酵素の遺伝子のＤＮＡ配列を含有するプラスミド
で達成することができる、それにより該遺伝子は、例え
ば酵母由来のインベルターゼ遺伝子ｓｕｃ２のようなイ
ンベルターゼ遺伝子であり、かつこの遺伝子の配列は、
植物細胞及び植物中のインベルターゼ遺伝子の発現を保
証する別の遺伝子の調節領域、並びに場合により植物及
び植物細胞の液胞に向かうインベルターゼ蛋白質の配向
を保証するＤＮＡ配列に融合される。
の習性及び収穫量における特に重要な変化は、スクロー
ス変更酵素の遺伝子のＤＮＡ配列を含有するプラスミド
で達成することができる、それにより該遺伝子は、例え
ば酵母由来のインベルターゼ遺伝子ｓｕｃ２のようなイ
ンベルターゼ遺伝子であり、かつこの遺伝子の配列は、
植物細胞及び植物中のインベルターゼ遺伝子の発現を保
証する別の遺伝子の調節領域、並びに場合により植物及
び植物細胞の液胞に向かうインベルターゼ蛋白質の配向
を保証するＤＮＡ配列に融合される。
【００１２】インベルターゼ遺伝子のＤＮＡ配列は、場
合により植物及び植物細胞の小胞体内への摂取のために
必要なシグナルペプチドに融合された別のＤＮＡ配列に
隣接して配置することもできる。この場合には、調節領
域が植物遺伝子のプロモータ及び終止シグナルである。
使用することができるプロモータは、近似の構成発現を
有するもの、例えばカリフラワーモザイクウイルスの３
５Ｓ ＲＮＡのプロモータ、特異化された組織内でのみ
発現を有するもの、例えば光合成的活性細胞において
は、例えばＳＴ−ＬＳ１遺伝子のプロモータ、又は例え
ば塊茎、ビート又は果実のような貯蔵シンクにおいて、
例えばクラスＩパタチン(patatin)遺伝子Ｂ３３のプロ
モータ、又は種のような貯蔵シンクにおいては、例えば
種特異的に発現されるプロモータである。
合により植物及び植物細胞の小胞体内への摂取のために
必要なシグナルペプチドに融合された別のＤＮＡ配列に
隣接して配置することもできる。この場合には、調節領
域が植物遺伝子のプロモータ及び終止シグナルである。
使用することができるプロモータは、近似の構成発現を
有するもの、例えばカリフラワーモザイクウイルスの３
５Ｓ ＲＮＡのプロモータ、特異化された組織内でのみ
発現を有するもの、例えば光合成的活性細胞において
は、例えばＳＴ−ＬＳ１遺伝子のプロモータ、又は例え
ば塊茎、ビート又は果実のような貯蔵シンクにおいて、
例えばクラスＩパタチン(patatin)遺伝子Ｂ３３のプロ
モータ、又は種のような貯蔵シンクにおいては、例えば
種特異的に発現されるプロモータである。
【００１３】使用することができるシグナルペプチド
は、例えばソラヌム・ツベロスム(Solanum tub erosum)
由来のプロテイナーゼ阻害物質ＩＩ遺伝子であり、この
場合にはシグナルペプチドは場合により別の遺伝子、例
えばオクトピンシンテターゼ遺伝子の部分と融合させる
ことができる。
は、例えばソラヌム・ツベロスム(Solanum tub erosum)
由来のプロテイナーゼ阻害物質ＩＩ遺伝子であり、この
場合にはシグナルペプチドは場合により別の遺伝子、例
えばオクトピンシンテターゼ遺伝子の部分と融合させる
ことができる。
【００１４】異質の蛋白質、例えば植物もしくは植物細
胞内の液胞内のインベルターゼ蛋白質の配向を保証する
ＤＮＡ配列は、例えばソラヌム・ツベロスム由来のパタ
チン遺伝子ｐｇＴ５のＤＮＡ配列であってよい。液胞内
の異質蛋白質の配向を保証するＤＮＡ配列は、概して異
質蛋白質を有する融合生成物を生じる。
胞内の液胞内のインベルターゼ蛋白質の配向を保証する
ＤＮＡ配列は、例えばソラヌム・ツベロスム由来のパタ
チン遺伝子ｐｇＴ５のＤＮＡ配列であってよい。液胞内
の異質蛋白質の配向を保証するＤＮＡ配列は、概して異
質蛋白質を有する融合生成物を生じる。
【００１５】高級植物への異質遺伝子の導入のために
は、大多数のクローニングベクターが利用可能であり、
これにはＥ．ｃｏｌｉ内の複製機構、及び形質転換した
細胞の選択を可能にするマーカが含まれる。ベクターは
例えばｐＢＲ３３２、ｐＵＣシリーズ、Ｍ１３ ｍｐ シ
リーズ、ｐＡＣＹＣ１８４等を包含する。従って、該配
列はベクター内の適当な制限位置に導入することができ
る。該プラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉ内の形質転換のため
に得られる。この際には、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を適当な栄
養培地中で培養しかつ次いで収穫しかつ溶解する。プラ
スミドを回収する。一般に、分析のためには、配列分
析、制限分析、電気泳動及び更に生化学的分子生物学的
方法を実施することができる。その都度の操作後に、使
用されるＤＮＡ配列に分割しかつ次のＤＮＡ配列は接合
することができる。各プラスミド配列は、同じ又は異な
ったプラスミド内でクローニングすることができる。所
望の遺伝子を植物に導入するそれぞれの方法に基づき、
別のＤＮＡ配列が必要になる場合がある。例えば植物細
胞の形質転換のために使用されるＴｉプラスミド又はＲ
ｉプラスミドを使用すべきである、従ってＴｉ−及びＲ
ｉプラスミドＴ−ＤＮＡの少なくとも右側の境界、但し
しばしば右側と左側の両者の境界は、導入される遺伝子
の側面領域として結合されるべきである。
は、大多数のクローニングベクターが利用可能であり、
これにはＥ．ｃｏｌｉ内の複製機構、及び形質転換した
細胞の選択を可能にするマーカが含まれる。ベクターは
例えばｐＢＲ３３２、ｐＵＣシリーズ、Ｍ１３ ｍｐ シ
リーズ、ｐＡＣＹＣ１８４等を包含する。従って、該配
列はベクター内の適当な制限位置に導入することができ
る。該プラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉ内の形質転換のため
に得られる。この際には、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を適当な栄
養培地中で培養しかつ次いで収穫しかつ溶解する。プラ
スミドを回収する。一般に、分析のためには、配列分
析、制限分析、電気泳動及び更に生化学的分子生物学的
方法を実施することができる。その都度の操作後に、使
用されるＤＮＡ配列に分割しかつ次のＤＮＡ配列は接合
することができる。各プラスミド配列は、同じ又は異な
ったプラスミド内でクローニングすることができる。所
望の遺伝子を植物に導入するそれぞれの方法に基づき、
別のＤＮＡ配列が必要になる場合がある。例えば植物細
胞の形質転換のために使用されるＴｉプラスミド又はＲ
ｉプラスミドを使用すべきである、従ってＴｉ−及びＲ
ｉプラスミドＴ−ＤＮＡの少なくとも右側の境界、但し
しばしば右側と左側の両者の境界は、導入される遺伝子
の側面領域として結合されるべきである。
【００１６】植物細胞の形質転換のためのＴ−ＤＮＡの
使用は、徹底的に研究されかつ特に欧州特許第１２０５
１６号明細書；Hoekema, The Binary Plant Vector Sy
stemOffset-drukkerij Kanters BV, Alblasserdam, 198
5, Chapter V; Fraley, etal., Crit. Rev. Plant Sc
i., 4: 1-46 及び An et al, EMBO J. (1985) 4: 277-2
87に記載されている。
使用は、徹底的に研究されかつ特に欧州特許第１２０５
１６号明細書；Hoekema, The Binary Plant Vector Sy
stemOffset-drukkerij Kanters BV, Alblasserdam, 198
5, Chapter V; Fraley, etal., Crit. Rev. Plant Sc
i., 4: 1-46 及び An et al, EMBO J. (1985) 4: 277-2
87に記載されている。
【００１７】一旦導入されたＤＮＡはまずゲノム内に組
み込まれる、これはまたそこで比較的安定でありかつ概
して通常は消滅しない。該ＤＮＡは通常、形質転換した
植物細胞に、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシ
ン、ハイグロマイシン又はクロラムフェニコールその他
のような、生物致死剤又は抗生物質に対する抵抗性を付
与する選択マーカを含有する。従って、個々に使用され
るマーカは、導入されたＤＮＡを制限する細胞に対立す
るものとして形質転換した細胞の選択を可能にすべきで
ある。
み込まれる、これはまたそこで比較的安定でありかつ概
して通常は消滅しない。該ＤＮＡは通常、形質転換した
植物細胞に、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシ
ン、ハイグロマイシン又はクロラムフェニコールその他
のような、生物致死剤又は抗生物質に対する抵抗性を付
与する選択マーカを含有する。従って、個々に使用され
るマーカは、導入されたＤＮＡを制限する細胞に対立す
るものとして形質転換した細胞の選択を可能にすべきで
ある。
【００１８】植物宿主細胞内にＤＮＡを導入するために
は、多数の技術が利用できる。これらの技術は、形質転
換媒質としてアグロバクテリウム・ツメファシエンス(A
grobacterium tumefaciens)又はアグロバクテリウム・
リゾジェンス(Agrobacteriumrhizogenes)を使用するＴ
−ＤＮＡでの形質転換、融合、注射又はエレクトロポレ
ーション(electroporation)並びにその他の可能性を包
含する。形質転換のためにアグロバクテアを使用すべき
場合には、導入されるべきＤＮＡを特殊なプラスミド内
で、中間ベクター又はバイナリーベクターのいずれかで
クローニングする。中間ベクターは、Ｔ−ＤＮＡ中の配
列に相同である配列を基礎として、相同な組換えにより
Ｔｉ−及びＲｉプラスミドに組み込むことができる。ま
たこれらは、Ｔ−ＤＮＡの転移のために必要なＶｉｒ−
領域を含有する。中間ベクターはアグロバクテア内では
複製できない。ヘルパープラスミドを使用することによ
り、中間ベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエ
ンス（複合）に転移させることができる。バイナリーベ
クターはＥ．ｃｏｌｉ内でもまたアグロバクテリア内で
も複製することができる。これらは選択マーカ遺伝子及
びリンカ−もしくはポリリンカーを含有し、これらは右
側及び左側のＴ−ＤＮＡ境界領域によってフレーミング
される。これらは直接的にアグロバクテリアに形質転換
させることができる（Holsters et al., Mol. Gen. Gen
et. (1987), 163: 181-187)。宿主細胞として機能する
アグロバクテリアは、Ｖｉｒ−領域を有するプラスミド
を含有するべきである。Ｖｉｒ−領域はＴ−ＤＮＡを植
物細胞に転移させるために必要である。該プラスミドは
付加的Ｔ−ＤＮＡを含有することができる。そのように
形質転換したバクテリウムは、植物細胞の形質転換のた
めに使用される。ＤＮＡの植物細胞への転移のために
は、植物の外植体を適当な方法でアグロバクテリウム・
ツメファシエンス又はアグロバクテリウム・リゾジェン
スと一緒に培養することができる。感染した植物材料
（例えば葉片、茎分節、根及びまたプロトプラスト又は
懸濁液培養した細胞）から、植物全体を適当な培地内で
再生させることができる、該媒体は選択のための抗生物
質又は生物致死剤を含有していてもよい。こうして得ら
れた植物を、次いで導入されたＤＮＡの存在に関して試
験することができる。注射及びエレクトロポレーション
のためには、プラスミドの特殊な条件は不必要である。
例えばｐＵＣ誘導体のような単純なプラスミドを使用す
ることができる。
は、多数の技術が利用できる。これらの技術は、形質転
換媒質としてアグロバクテリウム・ツメファシエンス(A
grobacterium tumefaciens)又はアグロバクテリウム・
リゾジェンス(Agrobacteriumrhizogenes)を使用するＴ
−ＤＮＡでの形質転換、融合、注射又はエレクトロポレ
ーション(electroporation)並びにその他の可能性を包
含する。形質転換のためにアグロバクテアを使用すべき
場合には、導入されるべきＤＮＡを特殊なプラスミド内
で、中間ベクター又はバイナリーベクターのいずれかで
クローニングする。中間ベクターは、Ｔ−ＤＮＡ中の配
列に相同である配列を基礎として、相同な組換えにより
Ｔｉ−及びＲｉプラスミドに組み込むことができる。ま
たこれらは、Ｔ−ＤＮＡの転移のために必要なＶｉｒ−
領域を含有する。中間ベクターはアグロバクテア内では
複製できない。ヘルパープラスミドを使用することによ
り、中間ベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエ
ンス（複合）に転移させることができる。バイナリーベ
クターはＥ．ｃｏｌｉ内でもまたアグロバクテリア内で
も複製することができる。これらは選択マーカ遺伝子及
びリンカ−もしくはポリリンカーを含有し、これらは右
側及び左側のＴ−ＤＮＡ境界領域によってフレーミング
される。これらは直接的にアグロバクテリアに形質転換
させることができる（Holsters et al., Mol. Gen. Gen
et. (1987), 163: 181-187)。宿主細胞として機能する
アグロバクテリアは、Ｖｉｒ−領域を有するプラスミド
を含有するべきである。Ｖｉｒ−領域はＴ−ＤＮＡを植
物細胞に転移させるために必要である。該プラスミドは
付加的Ｔ−ＤＮＡを含有することができる。そのように
形質転換したバクテリウムは、植物細胞の形質転換のた
めに使用される。ＤＮＡの植物細胞への転移のために
は、植物の外植体を適当な方法でアグロバクテリウム・
ツメファシエンス又はアグロバクテリウム・リゾジェン
スと一緒に培養することができる。感染した植物材料
（例えば葉片、茎分節、根及びまたプロトプラスト又は
懸濁液培養した細胞）から、植物全体を適当な培地内で
再生させることができる、該媒体は選択のための抗生物
質又は生物致死剤を含有していてもよい。こうして得ら
れた植物を、次いで導入されたＤＮＡの存在に関して試
験することができる。注射及びエレクトロポレーション
のためには、プラスミドの特殊な条件は不必要である。
例えばｐＵＣ誘導体のような単純なプラスミドを使用す
ることができる。
【００１９】形質転換した細胞は通常の方法で植物内で
生長する。これらの植物を通常の方法で生長させ、かつ
同じ形質転換した遺伝子又は別の遺伝子を有する植物と
交雑させることができる。これから生じるハイブリッド
個体は、相応する表現型特性を有する。
生長する。これらの植物を通常の方法で生長させ、かつ
同じ形質転換した遺伝子又は別の遺伝子を有する植物と
交雑させることができる。これから生じるハイブリッド
個体は、相応する表現型特性を有する。
【００２０】表示及び略語 略語 ： ｂｐ＝塩基対、キロ塩基 ｄ，ｋｄ＝ダルトン、キロダルトン ＳＤＳ＝ドデシル硫酸ナトリウム トリス＝トリス（２−アミノエチル）アミン。
【００２１】表示： クローン＝それ自体の母細胞の１つから誘導される細胞
集団。子孫は遺伝子型的に同じである。クローニングに
より、細胞系統の均一性を更に増大させることができ
る。
集団。子孫は遺伝子型的に同じである。クローニングに
より、細胞系統の均一性を更に増大させることができ
る。
【００２２】電気泳動＝蛋白質からサイズ及び荷電に基
づき核酸を分離するための生化学的分離法。
づき核酸を分離するための生化学的分離法。
【００２３】小胞体＝化学及び生化学的物質を輸送する
ために機能する細胞間膜通路。
ために機能する細胞間膜通路。
【００２４】発現＝遺伝子の活性。
【００２５】遺伝子＝遺伝因子；遺伝の１単位、特に特
異化された特性のための部分情報の担体、核酸からなる
遺伝子（例えばＤＮＡ，ＲＮＡ）。
異化された特性のための部分情報の担体、核酸からなる
遺伝子（例えばＤＮＡ，ＲＮＡ）。
【００２６】ゲノム＝細胞の染色体内に局在化した遺伝
子の総計。
子の総計。
【００２７】節間＝節により互いに分離された苗条区分
（例えば茎）。葉は該節の上にある。
（例えば茎）。葉は該節の上にある。
【００２８】節間距離＝節からの種々の苗条区分までの
距離。
距離。
【００２９】クレノーフラグメント＝スブチリシンでス
プリットすることにより得られたサイズ７６，０００ｄ
のＤＮＡポリメラーゼのフラグメント。５′−３′ポリ
メラーゼ及び３′−５′エクソヌクレアーゼはホロ酵素
の活性を有するが、但し５′−３′エクソヌクレアーゼ
はホロ酵素の活性を有しない。
プリットすることにより得られたサイズ７６，０００ｄ
のＤＮＡポリメラーゼのフラグメント。５′−３′ポリ
メラーゼ及び３′−５′エクソヌクレアーゼはホロ酵素
の活性を有するが、但し５′−３′エクソヌクレアーゼ
はホロ酵素の活性を有しない。
【００３０】連鎖反応＝ＤＮＡの５′−ホスフェート基
と３′−ヒドロキシ基の間のホスホジエステル結合の酵
素形成。
と３′−ヒドロキシ基の間のホスホジエステル結合の酵
素形成。
【００３１】リンカー、ポリリンカー＝ダイレクト配列
において単数又は複数（ポリリンカー）の制限切断領域
を含有する合成ＤＮＡ配列。
において単数又は複数（ポリリンカー）の制限切断領域
を含有する合成ＤＮＡ配列。
【００３２】ノーザン法、サザン法＝電気泳動法で分離
したＲＮＡ又はＤＮＡのニトロセルロース又はナイロン
膜への転移又は固定。
したＲＮＡ又はＤＮＡのニトロセルロース又はナイロン
膜への転移又は固定。
【００３３】表現型＝その遺伝子型に対立して生物内に
発現される特性の和。
発現される特性の和。
【００３４】師部＝水が溶解された物質と一緒に貫流す
る植物の導管束のシーブ素子。
る植物の導管束のシーブ素子。
【００３５】プロモータ＝相同又は異型のＤＮＡ遺伝子
配列の転写をレリースするＤＮＡ発現の制御配列。
配列の転写をレリースするＤＮＡ発現の制御配列。
【００３６】複製＝ＤＮＡ配列の倍増。 制限酵素＝エンドデオキシリボヌクレアーゼクラスの
サブグループである制限エンドヌクレアーゼ［例えば、
Ｅ．ｃｏｌｉからのＥｃｏＲＩ（特異性Ｇ↓ＡＡＴＴＣ
及びＥｃｏＲＩＩ↓ＣＣ（AT）ＧＧは、高い基質特異性
を有する（↓＝分割位置）］。
サブグループである制限エンドヌクレアーゼ［例えば、
Ｅ．ｃｏｌｉからのＥｃｏＲＩ（特異性Ｇ↓ＡＡＴＴＣ
及びＥｃｏＲＩＩ↓ＣＣ（AT）ＧＧは、高い基質特異性
を有する（↓＝分割位置）］。
【００３７】制限位置＝制限酵素によって特異的に作ら
れた切断位置。
れた切断位置。
【００３８】終末＝ポリペプチド鎖が完成した、蛋白質
合成の最終段階。
合成の最終段階。
【００３９】形質転換＝細菌種の外生ＤＮＡの受容細胞
への導入。
への導入。
【００４０】転写＝ＤＮＡ内に含有される遺伝情報のＲ
ＮＡへのコピー。
ＮＡへのコピー。
【００４１】ベクター＝遺伝子を摂取しかつ該遺伝子を
他の細胞に運搬する、宿主特異的に複製可能な構造体。
プラスミドをベクターとして使用することもできる。
他の細胞に運搬する、宿主特異的に複製可能な構造体。
プラスミドをベクターとして使用することもできる。
【００４２】以下のプラスミドを、ドイツ国のブラウン
シュバイク在の微生物のドイツ寄託所に寄託した（寄託
番号）：１９９０年２月１２日 プラスミドｐ３５Ｓ−Ｃｙ−ＩＮＶ（ＤＳＭ５７８５） プラスミドｐ３５Ｓ−ＣＷ−ＩＮＶ（ＤＳＭ５７８８） プラスミドｐ３３−ＣＷ−ＩＮＶ（ＤＳＭ５７８７） プラスミドｐ１７００−ＣＷ−ＩＮＶ（ＤＳＭ５７８
９） プラスミドｐ３３−Ｃｙ−ＩＮＶ（ＤＳＭ５７８６）１９９０年８月２０日 プラスミドｐ３５Ｓ−Ｖ−ＩＮＶ（ＤＳＭ６１４２） 以下に添付図面につき説明する：図１は、５．１ｋｂサ
イズのプラスミドｐ３５Ｓ−Ｃｙ−ＩＮＶの構造を示
す。該プラスミドは以下のフラグメントからなる： Ａ＝フラグメントＡ（５２９ｂｐ）：カリフラワーモザ
イクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモータを含有す
る。これはＣａＭＶのヌクレオチド６９０９〜７４３７
を包含するフラグメントを含有する。
シュバイク在の微生物のドイツ寄託所に寄託した（寄託
番号）：１９９０年２月１２日 プラスミドｐ３５Ｓ−Ｃｙ−ＩＮＶ（ＤＳＭ５７８５） プラスミドｐ３５Ｓ−ＣＷ−ＩＮＶ（ＤＳＭ５７８８） プラスミドｐ３３−ＣＷ−ＩＮＶ（ＤＳＭ５７８７） プラスミドｐ１７００−ＣＷ−ＩＮＶ（ＤＳＭ５７８
９） プラスミドｐ３３−Ｃｙ−ＩＮＶ（ＤＳＭ５７８６）１９９０年８月２０日 プラスミドｐ３５Ｓ−Ｖ−ＩＮＶ（ＤＳＭ６１４２） 以下に添付図面につき説明する：図１は、５．１ｋｂサ
イズのプラスミドｐ３５Ｓ−Ｃｙ−ＩＮＶの構造を示
す。該プラスミドは以下のフラグメントからなる： Ａ＝フラグメントＡ（５２９ｂｐ）：カリフラワーモザ
イクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモータを含有す
る。これはＣａＭＶのヌクレオチド６９０９〜７４３７
を包含するフラグメントを含有する。
【００４３】Ｂ＝フラグメントＢ（１７２６ｂｐ）：ジ
ャガイモのプロテイナーゼ疎外物質ＩＩ遺伝子の２３個
のヌクレオチド（ヌクレオチド９２３−９４２）を含有
する、該ヌクレオチドは７個の塩基対を介して酵母由来
のｓｕｃ２に融合されており、ヌクレオチド＋６４〜＋
１７６５を含む。
ャガイモのプロテイナーゼ疎外物質ＩＩ遺伝子の２３個
のヌクレオチド（ヌクレオチド９２３−９４２）を含有
する、該ヌクレオチドは７個の塩基対を介して酵母由来
のｓｕｃ２に融合されており、ヌクレオチド＋６４〜＋
１７６５を含む。
【００４４】Ｃ＝フラグメントＣ（１９２ｂｐ）：Ｔｉ
−プラスミドｐＴｉＡＣＨ５のＴ−ＤＮＡの遺伝子３の
ポリアデニル化シグナルを含有する。
−プラスミドｐＴｉＡＣＨ５のＴ−ＤＮＡの遺伝子３の
ポリアデニル化シグナルを含有する。
【００４５】切断位置は、以下の例１に示す。
【００４６】図２は、７．１ｋｂサイズのプラスミドｐ
３５Ｓ−ＣＷ−ＩＮＶの構造を示す。該プラスミドは以
下のフラグメントを含有する： Ａ＝フラグメントＡ（５２９ｂｐ）：カリフラワーモザ
イクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモータを含有す
る。これはＣａＭＶのヌクレオチド６９０９〜７４３７
を包含するフラグメントを含有する。
３５Ｓ−ＣＷ−ＩＮＶの構造を示す。該プラスミドは以
下のフラグメントを含有する： Ａ＝フラグメントＡ（５２９ｂｐ）：カリフラワーモザ
イクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモータを含有す
る。これはＣａＭＶのヌクレオチド６９０９〜７４３７
を包含するフラグメントを含有する。
【００４７】Ｂ＝フラグメントＢ（１９６３ｂｐ）：ジ
ャガイモのプロテイナーゼ阻害物質剤ＩＩ遺伝子のヌク
レオチド（ヌクレオチド９２３−１１５９）を含有す
る、該ヌクレオチドはリンカーを介して酵母由来のｓｕ
ｃ２に融合されており、ヌクレオチド＋６４〜＋１７６
５を含む。
ャガイモのプロテイナーゼ阻害物質剤ＩＩ遺伝子のヌク
レオチド（ヌクレオチド９２３−１１５９）を含有す
る、該ヌクレオチドはリンカーを介して酵母由来のｓｕ
ｃ２に融合されており、ヌクレオチド＋６４〜＋１７６
５を含む。
【００４８】Ｃ＝フラグメントＣ（１９２ｂｐ）：Ｔｉ
−プラスミドｐＴｉＡＣＨ５のＴ−ＤＮＡの遺伝子３の
ポリアデニル化シグナルを含有する。
−プラスミドｐＴｉＡＣＨ５のＴ−ＤＮＡの遺伝子３の
ポリアデニル化シグナルを含有する。
【００４９】切断位置は、以下の例２に示す。
【００５０】図３は、７．０ｋｂサイズのプラスミドｐ
３３−ＣＷ−ＩＮＶの構造を示す。該プラスミドは以下
のフラグメントを含有する： Ａ＝フラグメントＡ（１５２６ｂｐ）：パタチン遺伝子
Ｂ３３のプロモータ領域のＤｒａＩ−ＤｒａＩフラグメ
ント（位置−１５１２〜位置＋１４）を含有する。
３３−ＣＷ−ＩＮＶの構造を示す。該プラスミドは以下
のフラグメントを含有する： Ａ＝フラグメントＡ（１５２６ｂｐ）：パタチン遺伝子
Ｂ３３のプロモータ領域のＤｒａＩ−ＤｒａＩフラグメ
ント（位置−１５１２〜位置＋１４）を含有する。
【００５１】Ｂ＆Ｃ＝フラグメントＢ（１９６３ｂｐ）
及びＣ（１９２ｂｐ）：これらはプラスミドｐ３５−Ｃ
Ｗ−ＩＮＶ内のフラグメントＢ＆Ｃに相当する（図
２）。
及びＣ（１９２ｂｐ）：これらはプラスミドｐ３５−Ｃ
Ｗ−ＩＮＶ内のフラグメントＢ＆Ｃに相当する（図
２）。
【００５２】切断位置は以下の例３に示す。
【００５３】図４は、８．４ｋｂサイズのプラスミドｐ
１７００−ＣＷ−ＩＮＶの構造を示す。該プラスミドは
以下のフラグメントを含有する：Ａ＝フラグメントＡ
（１５８５ｂｐ）：ジャガイモ由来のＳＴ−ＬＳ１遺伝
子のＥｃｏＲＩ−ＭｂｏＩＩフラグメントを含有する。
１７００−ＣＷ−ＩＮＶの構造を示す。該プラスミドは
以下のフラグメントを含有する：Ａ＝フラグメントＡ
（１５８５ｂｐ）：ジャガイモ由来のＳＴ−ＬＳ１遺伝
子のＥｃｏＲＩ−ＭｂｏＩＩフラグメントを含有する。
【００５４】Ｂ＆Ｃ＝フラグメントＢ（１９６３ｂｐ）
及びＣ（１９２ｂｐ）：これらはプラスミドｐ３５−Ｃ
Ｗ−ＩＮＶ内のフラグメントＢ及びＣに相当する（図
２）。
及びＣ（１９２ｂｐ）：これらはプラスミドｐ３５−Ｃ
Ｗ−ＩＮＶ内のフラグメントＢ及びＣに相当する（図
２）。
【００５５】切断位置は以下の例４示す。
【００５６】図５は、６．８ｋｂサイズのプラスミドｐ
３３−Ｃｙ−ＩＮＶの構造を示す。該プラスミドは以下
のフラグメントを含有する：Ａ＝フラグメントＡ（１５
２６ｂｐ）：パタチン遺伝子Ｂ３３のプロモータ領域の
ＤｒａＩ−ＤｒａＩフラグメント（位置−１５１２〜位
置＋１４）を含有する。
３３−Ｃｙ−ＩＮＶの構造を示す。該プラスミドは以下
のフラグメントを含有する：Ａ＝フラグメントＡ（１５
２６ｂｐ）：パタチン遺伝子Ｂ３３のプロモータ領域の
ＤｒａＩ−ＤｒａＩフラグメント（位置−１５１２〜位
置＋１４）を含有する。
【００５７】Ｂ＆Ｃ＝フラグメントＢ（１７２６ｂｐ）
及びＣ（１９２ｂｐ）：これらはプラスミドｐ３５Ｓ−
Ｃｙ−ＩＮＶ内のフラグメントＢ＆Ｃに相当する（図
１）。
及びＣ（１９２ｂｐ）：これらはプラスミドｐ３５Ｓ−
Ｃｙ−ＩＮＶ内のフラグメントＢ＆Ｃに相当する（図
１）。
【００５８】切断位置は以下の例５に示す。図６は、
６．３ｋｂサイズのプラスミドｐ３５Ｓ−Ｖ−ＩＮＶの
構造を示す。該プラスミドは以下のフラグメントを含有
する： Ａ＝フラグメントＡ（５２９ｂｐ）：カリフラワーモザ
イクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモータを含有す
る。
６．３ｋｂサイズのプラスミドｐ３５Ｓ−Ｖ−ＩＮＶの
構造を示す。該プラスミドは以下のフラグメントを含有
する： Ａ＝フラグメントＡ（５２９ｂｐ）：カリフラワーモザ
イクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモータを含有す
る。
【００５９】Ｂ＝フラグメントＢ（２８９８ｂｐ）：ゲ
ノムパタチンクローンｐｇＴ５の配列のヌクレオチド＋
７０７〜＋１８９５、配列ＡＧＣＴＴＴＣのリンカー及
び酵母由来のｓｕｃ２遺伝子（ヌクレオチド＋６４〜＋
１７６５）を含有する。
ノムパタチンクローンｐｇＴ５の配列のヌクレオチド＋
７０７〜＋１８９５、配列ＡＧＣＴＴＴＣのリンカー及
び酵母由来のｓｕｃ２遺伝子（ヌクレオチド＋６４〜＋
１７６５）を含有する。
【００６０】Ｃ＝フラグメントＣ（１９２ｂｐ）；Ｔｉ
−プラスミドｐＴｉＡＣＨ５のＴ−ＤＮＡの遺伝子３の
ポリアデニル化シグナル（ヌクレオチド１１７４９〜１
１９３９）を含有する。
−プラスミドｐＴｉＡＣＨ５のＴ−ＤＮＡの遺伝子３の
ポリアデニル化シグナル（ヌクレオチド１１７４９〜１
１９３９）を含有する。
【００６１】切断位置は、以下の例６に示す。
【００６２】図７は、５株の独立したトランスジェニッ
クタバコからの葉抽出物中のインベルターゼ活性のｉｎ
ｓｉｔｕ証明（トレース１〜５）並びに形質転換され
ていない植物における同活性の不在（トレースＷ３８）
のための遺伝子を示す。
クタバコからの葉抽出物中のインベルターゼ活性のｉｎ
ｓｉｔｕ証明（トレース１〜５）並びに形質転換され
ていない植物における同活性の不在（トレースＷ３８）
のための遺伝子を示す。
【００６３】Ａ＝還元糖を含有するゲル領域。トレース
１〜５における黒塗り部分は、対照（トレースＷ３８）
と比較した還元糖（インベルターゼ活性）の存在を示
す。
１〜５における黒塗り部分は、対照（トレースＷ３８）
と比較した還元糖（インベルターゼ活性）の存在を示
す。
【００６４】Ｂ＝蛋白質フラクションのゲル領域。
【００６５】図８は、プラスミドｐ３３−ＣＷ−ＩＮＶ
で形質転換した２株のジャガイモ（左側、植物Ｂ３３−
Ｃｗ−ＩＮ−４及びＢ３３−Ｃｗ−ＩＮ−１）と、正確
に同じ条件下で、但し形質転換せずに生長させた２株の
対照植物（右側、対照１及び対照２）の塊茎の数、サイ
ズ分布（生鮮重量）及び総生鮮重量を示す。それぞれの
垂直な棒は１つの塊茎を表し、その重量はグラムで該棒
の上に記載されている。総重量もグラムで示されてい
る。
で形質転換した２株のジャガイモ（左側、植物Ｂ３３−
Ｃｗ−ＩＮ−４及びＢ３３−Ｃｗ−ＩＮ−１）と、正確
に同じ条件下で、但し形質転換せずに生長させた２株の
対照植物（右側、対照１及び対照２）の塊茎の数、サイ
ズ分布（生鮮重量）及び総生鮮重量を示す。それぞれの
垂直な棒は１つの塊茎を表し、その重量はグラムで該棒
の上に記載されている。総重量もグラムで示されてい
る。
【００６６】図９は、プラスミドｐ３５Ｓ−Ｖ−ＩＮＶ
で形質転換したタバコの液胞内の該プラスミドからコー
ドしたインベルターゼ活性のｉｎ ｓｉｔｕ証明のため
のゲルを示す。
で形質転換したタバコの液胞内の該プラスミドからコー
ドしたインベルターゼ活性のｉｎ ｓｉｔｕ証明のため
のゲルを示す。
【００６７】トレース１：形質転換しなかったタバコの
プロトプラスト； トレース２：形質転換しなかったタバコの液胞； トレース３：トランスジェニックタバコのプロトプラス
ト； トレース４：トランスジェニックタバコの液胞。
プロトプラスト； トレース２：形質転換しなかったタバコの液胞； トレース３：トランスジェニックタバコのプロトプラス
ト； トレース４：トランスジェニックタバコの液胞。
【００６８】各トレースにおいて、α−マンノシダーゼ
活性を介して標準化したプロトプラスト及び／又は液胞
の比較可能な量を適用した。トレース３及び４内の黒塗
りは還元糖の形成によるインベルターゼ活性を示す。両
者のトレースないの強度は同じ程度であり、このことは
液胞内のインベルターゼの排他的局在化を示す。該イン
ベルターゼ活性は、形質転換しなかったタバコのプロト
プラスト及び液胞内には含有されない（トレース１及び
２）。
活性を介して標準化したプロトプラスト及び／又は液胞
の比較可能な量を適用した。トレース３及び４内の黒塗
りは還元糖の形成によるインベルターゼ活性を示す。両
者のトレースないの強度は同じ程度であり、このことは
液胞内のインベルターゼの排他的局在化を示す。該イン
ベルターゼ活性は、形質転換しなかったタバコのプロト
プラスト及び液胞内には含有されない（トレース１及び
２）。
【００６９】
【実施例】次に、本発明を一層理解し易くするために実
施例を示す。これらの実験のための説明を以下に示す。
施例を示す。これらの実験のための説明を以下に示す。
【００７０】１．クローニングベクター クローニングのために、ベクターｐＵＣ１８／１９及び
ｐＵＣ１１８(Yanisch-Perron et al., Gene(1985), 3
3, 103-119)及びｐＭＰＫ１１０（Eckes, Dissertatio
n, University of Cologne (1984))を使用した。
ｐＵＣ１１８(Yanisch-Perron et al., Gene(1985), 3
3, 103-119)及びｐＭＰＫ１１０（Eckes, Dissertatio
n, University of Cologne (1984))を使用した。
【００７１】植物形質転換のために、遺伝子構造をバイ
ナリーベクターＢＩＮ１９内でクローニングした(Beva
n, Nucl. Acids Res.(1984), 12, 8711-8720)。
ナリーベクターＢＩＮ１９内でクローニングした(Beva
n, Nucl. Acids Res.(1984), 12, 8711-8720)。
【００７２】２．細菌種 ｐＣＵ及びＭ１３ベクターのために、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株
ＢＭＨ７１−１８（Messing et al., Proc. Nat. Acad.
Sci.USA (1977), 24, 6342-6346）又はＴＢ１を使用し
た。ベクターｐＭＰＫ１１０及びＢＩＮ１９のために
は、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＴＢ１を専ら使用した。ＴＢ１は
種ＪＭ１０１の組換え−陰性のテトラサイクリン耐性誘
導体である(Yanisch-Perron et al., Gene(1985), 33,
103-119)。ＴＢ１種の遺伝子型は、Ｆ′（ｔｒａＤ３
６，ｐｒｏＡＢ，ｌａｃｌ，ｌａｃＺΔＭ１５），Δ
（ｌａｃ，ｐｒｏ），ＳｕｐＥ，ｔｈｉＳ，ｒｅｃＡ，
Ｓｒｌ：：Ｔｎ１０（ＴｃR）である（Bart Barrel, pe
rsonal communication)。
ＢＭＨ７１−１８（Messing et al., Proc. Nat. Acad.
Sci.USA (1977), 24, 6342-6346）又はＴＢ１を使用し
た。ベクターｐＭＰＫ１１０及びＢＩＮ１９のために
は、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＴＢ１を専ら使用した。ＴＢ１は
種ＪＭ１０１の組換え−陰性のテトラサイクリン耐性誘
導体である(Yanisch-Perron et al., Gene(1985), 33,
103-119)。ＴＢ１種の遺伝子型は、Ｆ′（ｔｒａＤ３
６，ｐｒｏＡＢ，ｌａｃｌ，ｌａｃＺΔＭ１５），Δ
（ｌａｃ，ｐｒｏ），ＳｕｐＥ，ｔｈｉＳ，ｒｅｃＡ，
Ｓｒｌ：：Ｔｎ１０（ＴｃR）である（Bart Barrel, pe
rsonal communication)。
【００７３】植物形質転換は、アグロバクテリウム・ツ
メファシエンス種ＬＢＡ４４０４（Bevan, M., Nucl. A
cids Res. 12, 8711-8721, (1984); ＢＩＮ１９誘導
体）を使用して実施した。
メファシエンス種ＬＢＡ４４０４（Bevan, M., Nucl. A
cids Res. 12, 8711-8721, (1984); ＢＩＮ１９誘導
体）を使用して実施した。
【００７４】３．アグロバクテリウム・ツメファシエン
スの形質転換 ＢＩＮ１９誘導体のためには、アグロバクテリア内のＤ
ＮＡの導入を、ホスタース他(Holsters at al.)による
方法(Mol. Gen. Genet. (1978), 163, 181-187)による
直接的形質転換にによって実施した。プラスミドＤＮＡ
形質転換したアグロバクテリアを、バーンボイム(Birnb
oim）及びドリー(Doly)による方法(Nucl.Acids Res. (1
979), 7, 1513-1523)により単離しかつ適当な制限分割
によりゲル電気泳動的に解放した。
スの形質転換 ＢＩＮ１９誘導体のためには、アグロバクテリア内のＤ
ＮＡの導入を、ホスタース他(Holsters at al.)による
方法(Mol. Gen. Genet. (1978), 163, 181-187)による
直接的形質転換にによって実施した。プラスミドＤＮＡ
形質転換したアグロバクテリアを、バーンボイム(Birnb
oim）及びドリー(Doly)による方法(Nucl.Acids Res. (1
979), 7, 1513-1523)により単離しかつ適当な制限分割
によりゲル電気泳動的に解放した。
【００７５】４．植物形質転換 Ａ）タバコ： 選択しながら洗浄した、アグロバクテリ
ウム・ツメフェシエンスの１夜培養体１０ｍｌを遠心分
離し、上澄を捨てかつ該細菌を同じ容量の抗生物質不含
の培地中に再懸濁させた。無菌ペトリシャーレ内で、中
央葉脈を除いた無菌植物の円形の葉片（約１ｃｍ2）
を、上記細菌懸濁液に浸けた。次いで、該円形の葉片を
スクロース２２％及びバクト寒天０．８％を有するＭＳ
培地を入れたペトリシャーレ内に密に横たえた。暗所内
で２５℃で２日間保温した後に、これらをカナマイシン
１００ｍｇ／ｌ、クラフォラン５００ｍｇ／ｌ、ベンジ
ルアミノプリン（ＢＡＰ）１ｍｇ／ｌ、ナフチル酢酸
（ＮＡＡ）１ｍｇ／ｌ及びバクト寒天０．８％を入れた
ＭＳ培地に移した。生長する苗条をクラフォラン２５０
ｍｇ／ｌを有するホルモン不含のＭＳ培地に入れた。
ウム・ツメフェシエンスの１夜培養体１０ｍｌを遠心分
離し、上澄を捨てかつ該細菌を同じ容量の抗生物質不含
の培地中に再懸濁させた。無菌ペトリシャーレ内で、中
央葉脈を除いた無菌植物の円形の葉片（約１ｃｍ2）
を、上記細菌懸濁液に浸けた。次いで、該円形の葉片を
スクロース２２％及びバクト寒天０．８％を有するＭＳ
培地を入れたペトリシャーレ内に密に横たえた。暗所内
で２５℃で２日間保温した後に、これらをカナマイシン
１００ｍｇ／ｌ、クラフォラン５００ｍｇ／ｌ、ベンジ
ルアミノプリン（ＢＡＰ）１ｍｇ／ｌ、ナフチル酢酸
（ＮＡＡ）１ｍｇ／ｌ及びバクト寒天０．８％を入れた
ＭＳ培地に移した。生長する苗条をクラフォラン２５０
ｍｇ／ｌを有するホルモン不含のＭＳ培地に入れた。
【００７６】Ｂ）ジャガイモ：外科用メスで傷付けた無
菌ジャガイモの１０枚の小さな葉を、選択下に洗浄し
た、アグロバクテリウム・ツメフェシエンスの１夜培養
体３０〜５０μｌを含有するスクロース２％を有するＭ
Ｓ培地１０ｍｌに入れた。３〜５分間温和に振とうした
後に、該ペトリシャーレを暗所内で２５℃で保温した。
２日後に、該葉をグルコース１．６％、ゼアチンリボー
ス２ｍｇ／ｌ、ナフチル酢酸０．０２ｍｇ／ｌ、ジベレ
リン酸０．０２ｍｇ／ｌ、クラフォラン５００ｍｇ／
ｌ、カナマイシン５０ｍｇ／ｌ及びバクト寒天０．８％
を有するＭＳ培地に横たえた。２５℃及び３０００ｌｕ
ｘで１週間保温した後に、培地中のクラフォラン濃度を
半分に低下させた。
菌ジャガイモの１０枚の小さな葉を、選択下に洗浄し
た、アグロバクテリウム・ツメフェシエンスの１夜培養
体３０〜５０μｌを含有するスクロース２％を有するＭ
Ｓ培地１０ｍｌに入れた。３〜５分間温和に振とうした
後に、該ペトリシャーレを暗所内で２５℃で保温した。
２日後に、該葉をグルコース１．６％、ゼアチンリボー
ス２ｍｇ／ｌ、ナフチル酢酸０．０２ｍｇ／ｌ、ジベレ
リン酸０．０２ｍｇ／ｌ、クラフォラン５００ｍｇ／
ｌ、カナマイシン５０ｍｇ／ｌ及びバクト寒天０．８％
を有するＭＳ培地に横たえた。２５℃及び３０００ｌｕ
ｘで１週間保温した後に、培地中のクラフォラン濃度を
半分に低下させた。
【００７７】５．トランスジェニック植物由来のゲノム
ＤＮＡの分析 ゲノム植物ＤＮＡの単離を、ロガース(Rogers)及びベン
ディッヒ(Bendich)の方法(Plant Mol. Biol.(1985), 5,
69-76)によって実施した。 ＤＮＡ分析のために、Ｄ
ＮＡ１０〜２０μｇを、サザン法を使用して適当な制限
分割後にＤＮＡ配列の組込みを分析することにより試験
した。
ＤＮＡの分析 ゲノム植物ＤＮＡの単離を、ロガース(Rogers)及びベン
ディッヒ(Bendich)の方法(Plant Mol. Biol.(1985), 5,
69-76)によって実施した。 ＤＮＡ分析のために、Ｄ
ＮＡ１０〜２０μｇを、サザン法を使用して適当な制限
分割後にＤＮＡ配列の組込みを分析することにより試験
した。
【００７８】６．トランスジェニック植物由来の全ＲＮ
Ａの分析 全植物ＲＮＡの単離を、ロンゲマン他（Longemann et a
l.)の方法(AnalyticalBiochem. (1987), 163, 16-20)に
よって実施した。
Ａの分析 全植物ＲＮＡの単離を、ロンゲマン他（Longemann et a
l.)の方法(AnalyticalBiochem. (1987), 163, 16-20)に
よって実施した。
【００７９】分析のために、全ＲＮＡの試料５０μｇ
を、ノザン法を使用して探査トランスクリプトの存在を
決定するために試験した。
を、ノザン法を使用して探査トランスクリプトの存在を
決定するために試験した。
【００８０】７．蛋白質抽出 植物組織から全蛋白質を抽出するために、組織片を蛋白
質抽出緩衝液［燐酸ナトリウム（ｐＨ７．０）２５ミリ
モル、重亜硫酸ナトリウム２ミリモル、フェニルメチル
−スルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）２ミリモル］中
で、可溶性のポリビニルピリロリドン（ＰＶＰ）０．１
％（ｗ／ｖ）を添加して、均質化した。
質抽出緩衝液［燐酸ナトリウム（ｐＨ７．０）２５ミリ
モル、重亜硫酸ナトリウム２ミリモル、フェニルメチル
−スルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）２ミリモル］中
で、可溶性のポリビニルピリロリドン（ＰＶＰ）０．１
％（ｗ／ｖ）を添加して、均質化した。
【００８１】セルロースを通して濾過した後に、細胞粒
子を１００００ｒｐｍで２０分間遠心分離しかつ上澄の
蛋白質濃度をブラッドフォード(Bradford)の方法(Anal.
Biochem. (1976), 72, 248-254)によって測定した。
子を１００００ｒｐｍで２０分間遠心分離しかつ上澄の
蛋白質濃度をブラッドフォード(Bradford)の方法(Anal.
Biochem. (1976), 72, 248-254)によって測定した。
【００８２】８．免疫学的方法(ウエスタ-ン法：Wester
n-Blot)を使用した異質蛋白質の測定 蛋白質抽出物を、分子量に基づきＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ド
デシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド）ゲル中で
のゲル電気泳動法を使用して分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ後に、蛋白質ゲルを黒鉛電極のための移動緩衝液（ト
リス４８ｇ／ｌ、グリセリン３９ｇ／ｌ、ＳＤＳ０．０
３７５％、メタノール２０％）中で１５〜３０分間平衡
させかつ次いで冷房室内にニトロセルロースフィルタ上
で移しかつ１．３ｍＡ／ｃｍ2で１〜２時間分離した。
該フィルタをＴＢＳ緩衝液（トリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）２０ミリモル、ＮａＣｌ５５ミリモル）中の３％ゼ
ラチンで３０分間飽和させかつ次いで該フィルタを相応
する抗血清と共に適当に希釈して（ＴＢＳ緩衝液中１：
１０００〜１００００）室温で保温した。該フィルタを
次いでＴＢＳ、ＴＴＢＳ（ツゥイーン（Tween）２０
０．１％を有するＴＢＳ緩衝液）及びＴＢＳでそれぞれ
１５分間洗浄した。洗浄後に、該フィルタをアルカリ性
ホスフェターゼ結合したゴート−アンチ−ラビット（Ｇ
ＡＲ）抗体（ＴＢＳ中１：７５００）と共に室温で１時
間保温した。次いで、該フィルタを前記のように洗浄し
かつＡＰ緩衝液（トリス／ＨＣｌ１００ミリモル、ｐＨ
９．５、ＮａＣｌ１００ミリモル、ＭｇＣｌ2３ミリモ
ル）中で平衡させた。アルカリ性ホスフェターゼ反応
は、４−ニトロテトラゾリウム（ＮＢＴ）溶液（７０％
ジメチルホルムアミド中のＮＢＴ５０ｍｇ／ｍｌ）７０
μｌ及びＡＰ緩衝液５０ｍｌ中の５−ブロモ−４−クロ
ロ−３−インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）３５μｌ
の基質添加により開始させた。５分後に、概して、最初
のシグナルを見ることができた。
n-Blot)を使用した異質蛋白質の測定 蛋白質抽出物を、分子量に基づきＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ド
デシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド）ゲル中で
のゲル電気泳動法を使用して分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ後に、蛋白質ゲルを黒鉛電極のための移動緩衝液（ト
リス４８ｇ／ｌ、グリセリン３９ｇ／ｌ、ＳＤＳ０．０
３７５％、メタノール２０％）中で１５〜３０分間平衡
させかつ次いで冷房室内にニトロセルロースフィルタ上
で移しかつ１．３ｍＡ／ｃｍ2で１〜２時間分離した。
該フィルタをＴＢＳ緩衝液（トリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）２０ミリモル、ＮａＣｌ５５ミリモル）中の３％ゼ
ラチンで３０分間飽和させかつ次いで該フィルタを相応
する抗血清と共に適当に希釈して（ＴＢＳ緩衝液中１：
１０００〜１００００）室温で保温した。該フィルタを
次いでＴＢＳ、ＴＴＢＳ（ツゥイーン（Tween）２０
０．１％を有するＴＢＳ緩衝液）及びＴＢＳでそれぞれ
１５分間洗浄した。洗浄後に、該フィルタをアルカリ性
ホスフェターゼ結合したゴート−アンチ−ラビット（Ｇ
ＡＲ）抗体（ＴＢＳ中１：７５００）と共に室温で１時
間保温した。次いで、該フィルタを前記のように洗浄し
かつＡＰ緩衝液（トリス／ＨＣｌ１００ミリモル、ｐＨ
９．５、ＮａＣｌ１００ミリモル、ＭｇＣｌ2３ミリモ
ル）中で平衡させた。アルカリ性ホスフェターゼ反応
は、４−ニトロテトラゾリウム（ＮＢＴ）溶液（７０％
ジメチルホルムアミド中のＮＢＴ５０ｍｇ／ｍｌ）７０
μｌ及びＡＰ緩衝液５０ｍｌ中の５−ブロモ−４−クロ
ロ−３−インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）３５μｌ
の基質添加により開始させた。５分後に、概して、最初
のシグナルを見ることができた。
【００８３】該反応はフィルタを停止溶液（トリス／Ｈ
Ｃｌ２０ミリモル、ｐＨ８．０、ＥＤＴＡ５ミリモルを
有する）中に移すことにより終了させることができる。
該反応は暗所で実施した。
Ｃｌ２０ミリモル、ｐＨ８．０、ＥＤＴＡ５ミリモルを
有する）中に移すことにより終了させることができる。
該反応は暗所で実施した。
【００８４】９．インベルターゼ活性の同定 酸性インベルターゼはスクロースをグルコースとフルク
トースに分割する。酸性インベルターゼの酵素活性は、
植物蛋白質抽出物内にＳＤＳポリアクリルアミドゲル内
で分離した後に呈することができる。
トースに分割する。酸性インベルターゼの酵素活性は、
植物蛋白質抽出物内にＳＤＳポリアクリルアミドゲル内
で分離した後に呈することができる。
【００８５】全蛋白質を植物からパラグラフ７に記載し
たと同様に抽出しかつ自然ＳＢ緩衝液（トリス／ＨＣｌ
１２５ミリモル、ｐＨ６．８、２−メルカプトエタノー
ル１０％、グリコール２０％、ブロモフェノールブルー
０．００４％）で２回処理しかつ０．２％ＳＤＳゲルに
加えた。該抽出物は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル内
で分離する前には加熱によって変性しなかった。電気泳
動分離後に、該ゲルを水中で短時間洗浄しかつスクロー
ス溶液（スクロース０．１モル、酢酸ナトリウム０．１
モルｐＨ５．０）中で３０℃で１時間保温した。次い
で、過剰のスクロースを水で数回洗浄する（３×５分
間）ことにより分離した。還元糖の試験は、該ゲルをマ
イクロ波炉内でＴＰＴＣ反応溶液（０．５Ｎ苛性ソーダ
中の２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリド
０．１％）中で煮沸することにより実施した。該反応を
１０％酢酸で停止した。次いで、該ゲルを洗浄後に乾燥
させた。ゲル内での激しい赤変は、還元糖の存在を呈し
た（図７参照、Ａの下に黒塗として示されている）。
たと同様に抽出しかつ自然ＳＢ緩衝液（トリス／ＨＣｌ
１２５ミリモル、ｐＨ６．８、２−メルカプトエタノー
ル１０％、グリコール２０％、ブロモフェノールブルー
０．００４％）で２回処理しかつ０．２％ＳＤＳゲルに
加えた。該抽出物は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル内
で分離する前には加熱によって変性しなかった。電気泳
動分離後に、該ゲルを水中で短時間洗浄しかつスクロー
ス溶液（スクロース０．１モル、酢酸ナトリウム０．１
モルｐＨ５．０）中で３０℃で１時間保温した。次い
で、過剰のスクロースを水で数回洗浄する（３×５分
間）ことにより分離した。還元糖の試験は、該ゲルをマ
イクロ波炉内でＴＰＴＣ反応溶液（０．５Ｎ苛性ソーダ
中の２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリド
０．１％）中で煮沸することにより実施した。該反応を
１０％酢酸で停止した。次いで、該ゲルを洗浄後に乾燥
させた。ゲル内での激しい赤変は、還元糖の存在を呈し
た（図７参照、Ａの下に黒塗として示されている）。
【００８６】１０．トランスジェニック 及び非トランス
ジェニック タバコからの液胞の単離 プロトプラストを、公知方法（Damm and Willmitzer, M
ol. Gen. Genetics 217, 15-20 (1988)）に基づき製造
した３〜４週間目の無菌タバコから製造した。約１千万
個のプロトプラストを、公知方法（Boller und Kende,
Plant Physiology 63, 1123-1132 (1979)）によって液
胞を分離した。該液胞の純度は、顕微鏡的にかつα−マ
ンノシダーゼ活性の測定（Van der Wilden et al., Pla
nt Physiology 66, 390-394 (1980)）を測定することに
より確認した。インベルターゼ活性測定はα−マンノシ
ダーゼ均等化後にゲル電気泳動で実施した。
ジェニック タバコからの液胞の単離 プロトプラストを、公知方法（Damm and Willmitzer, M
ol. Gen. Genetics 217, 15-20 (1988)）に基づき製造
した３〜４週間目の無菌タバコから製造した。約１千万
個のプロトプラストを、公知方法（Boller und Kende,
Plant Physiology 63, 1123-1132 (1979)）によって液
胞を分離した。該液胞の純度は、顕微鏡的にかつα−マ
ンノシダーゼ活性の測定（Van der Wilden et al., Pla
nt Physiology 66, 390-394 (1980)）を測定することに
より確認した。インベルターゼ活性測定はα−マンノシ
ダーゼ均等化後にゲル電気泳動で実施した。
【００８７】図８には、上記液胞フラクションが、液胞
単離のために処理したプロトプラストと同様に比較可能
なインベルターゼ活性を有することが示されている。こ
の結果は、該インベルターゼの細胞下分画がα−マンノ
シダーゼの液胞マーカー酵素に相当することを示す。
単離のために処理したプロトプラストと同様に比較可能
なインベルターゼ活性を有することが示されている。こ
の結果は、該インベルターゼの細胞下分画がα−マンノ
シダーゼの液胞マーカー酵素に相当することを示す。
【００８８】例１プラスミドｐ３５Ｓ−Ｃｙ −ＩＮＶの製造及び該プラ ス
ミドのタバコ及びジャガ イモの植物ゲノム内への導 入 スクロースを酵素インベルターゼによって２つのヘキソ
ースグルコース及びフルクトースに分割した。これらの
２つのヘキソースグルコースはスクロースに対して化学
的に同等ではない、従って師部からのスクロースのアン
ローディングのフィードバックを惹起しない。ｓｕｃ２
遺伝子のためにコードする酵母由来のＤＮＡ配列を、カ
リフラワモザイクウイルスの３５Ｓプロモータを有する
もの並びに植物終止シグナルで製造する。該植物終止シ
グナルは、オクトピンシンテターゼ遺伝子のポリ−Ａ側
の３′−末端を含有する。プラスミドｐ３５Ｓ−Ｃｙ−
ＩＮＶは３つのフラグメントＡ，Ｂ及びＣからなり、こ
れらをｐＵＣ１８のポリリンカーの制限酵素のための切
断位置内にクローニングする（図１参照）。
ミドのタバコ及びジャガ イモの植物ゲノム内への導 入 スクロースを酵素インベルターゼによって２つのヘキソ
ースグルコース及びフルクトースに分割した。これらの
２つのヘキソースグルコースはスクロースに対して化学
的に同等ではない、従って師部からのスクロースのアン
ローディングのフィードバックを惹起しない。ｓｕｃ２
遺伝子のためにコードする酵母由来のＤＮＡ配列を、カ
リフラワモザイクウイルスの３５Ｓプロモータを有する
もの並びに植物終止シグナルで製造する。該植物終止シ
グナルは、オクトピンシンテターゼ遺伝子のポリ−Ａ側
の３′−末端を含有する。プラスミドｐ３５Ｓ−Ｃｙ−
ＩＮＶは３つのフラグメントＡ，Ｂ及びＣからなり、こ
れらをｐＵＣ１８のポリリンカーの制限酵素のための切
断位置内にクローニングする（図１参照）。
【００８９】フラグメントＡは、カリフラワーモザイク
ウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモータを含有する。
これはＣａＭＶのヌクレオチド６９０９〜７４３７（Fr
ancket al. (1980) Cell 21, 285-294)を包含するフラ
グメントからなり、プラスミドｐＤＨ５１(Pietrzak et
al. (1986) Nucleic Acids Res. 14, 5857-5868)由来
のＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩフラグメントとして単離しかつ
プラスミドｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ切断部位
の間でクローニングした。
ウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモータを含有する。
これはＣａＭＶのヌクレオチド６９０９〜７４３７（Fr
ancket al. (1980) Cell 21, 285-294)を包含するフラ
グメントからなり、プラスミドｐＤＨ５１(Pietrzak et
al. (1986) Nucleic Acids Res. 14, 5857-5868)由来
のＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩフラグメントとして単離しかつ
プラスミドｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ切断部位
の間でクローニングした。
【００９０】フラグメントＢは、ヌクレオチド＋６４〜
＋１７６５(Taussig and Carlson(1983) Nucleic Acids
Res. 11, 1943-1945)を包含する、酵母由来のｓｕｃ２
遺伝子に配列ＡＧＣＴＴＴＣを有する７個の塩基対のリ
ンカーを介して融合されるジャガイモ（ソラヌム・ツベ
ロスム）由来のプロテイナーゼ阻害物質ＩＩ遺伝子の２
３個のヌクレオチド（ヌクレオチド９２３〜９４５、Ke
il et al (1986), Nucleic Acids Res. 14, 5641-5650)
を含有する。
＋１７６５(Taussig and Carlson(1983) Nucleic Acids
Res. 11, 1943-1945)を包含する、酵母由来のｓｕｃ２
遺伝子に配列ＡＧＣＴＴＴＣを有する７個の塩基対のリ
ンカーを介して融合されるジャガイモ（ソラヌム・ツベ
ロスム）由来のプロテイナーゼ阻害物質ＩＩ遺伝子の２
３個のヌクレオチド（ヌクレオチド９２３〜９４５、Ke
il et al (1986), Nucleic Acids Res. 14, 5641-5650)
を含有する。
【００９１】フラグメントＢをＳｃａ／ＸｍｎＩフラグ
メントとしてｐＵＣ１８のポリリンカーのＳｍａＩ／Ｐ
ｓｔＩ切断部位の間に挿入した。それによって、連結反
応の前に、ＰｓｔＩの３′−オーバハンギング末端を、
Ｔａ−ＤＮＡポリメラーゼと一緒に保温することにより
ブラントにした。
メントとしてｐＵＣ１８のポリリンカーのＳｍａＩ／Ｐ
ｓｔＩ切断部位の間に挿入した。それによって、連結反
応の前に、ＰｓｔＩの３′−オーバハンギング末端を、
Ｔａ−ＤＮＡポリメラーゼと一緒に保温することにより
ブラントにした。
【００９２】フラグメントＣは、Ｔｉ−プラスミドｐＴ
ｉＡＣＨ５(Gielen et al. (1984);EMBO J. 3, 835-84
6)のＴ−ＤＮＡの遺伝子３のポリアデニル化シグナル及
びヌクレオチド１１７４９〜１１９３９を含有してお
り、これらをプラスミドｐＡＧＶ４０(Herrera-Estrell
a et al. (1983) Nature 303, 209-213)からＰｖｕＩＩ
−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとして単離し、かつＳｐ
ｈＩ−リンカーを添加した後に、ｐＵＣ１８のポリリン
カーのＨｉｎｄＩＩＩ切断部位間のＰｖｕＩＩ切断部位
内にクローニングした。該プラスミドｐ３５Ｓ−Ｃｙ−
ＩＮＶは、５．１ｂのサイズを有する（図１参照）。
ｉＡＣＨ５(Gielen et al. (1984);EMBO J. 3, 835-84
6)のＴ−ＤＮＡの遺伝子３のポリアデニル化シグナル及
びヌクレオチド１１７４９〜１１９３９を含有してお
り、これらをプラスミドｐＡＧＶ４０(Herrera-Estrell
a et al. (1983) Nature 303, 209-213)からＰｖｕＩＩ
−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとして単離し、かつＳｐ
ｈＩ−リンカーを添加した後に、ｐＵＣ１８のポリリン
カーのＨｉｎｄＩＩＩ切断部位間のＰｖｕＩＩ切断部位
内にクローニングした。該プラスミドｐ３５Ｓ−Ｃｙ−
ＩＮＶは、５．１ｂのサイズを有する（図１参照）。
【００９３】フラグメントＡ，Ｂ及びＣを含有するプラ
スミドｐ３５Ｓ−Ｃｙ−ＩＮＶの部分をバイナリーベク
ターに導入し、アグロバクテリウム系を使用してタバコ
及びジャガイモに導入した。形質転換した細胞から、完
全かつ繁殖力のある植物を再生した。再生した植物の分
析は、総ての分析した組織（葉及び茎）において、イン
ベルターゼ活性を示したが、該活性は形質転換しなかっ
た植物では検出されなかった。免疫学的方法により、こ
のインベルターゼが酵母インベルターゼであることを立
証することができた。このインベルターゼは、細胞質ゾ
ル及び／又は細胞質内に局在化されている。従って、総
ての器官及び細胞内に、植物内に導入された酵母インベ
ルターゼ遺伝子から惹起される新規のインベルターゼ活
性を有するトランスジェニックタバコ及びジャガイモが
製造された。再生したタバコ及びジャガイモは形質転換
しなかった植物に比較して明らかな差異を示した。従っ
て、葉は緑色における変化を示した。更に、個々に形質
転換した植物は様々に強力な生長強度を呈し、これは同
じ繁殖力において節間距離を短縮させた。更に、若葉は
僅かに内側に向かって曲がることが観察された。
スミドｐ３５Ｓ−Ｃｙ−ＩＮＶの部分をバイナリーベク
ターに導入し、アグロバクテリウム系を使用してタバコ
及びジャガイモに導入した。形質転換した細胞から、完
全かつ繁殖力のある植物を再生した。再生した植物の分
析は、総ての分析した組織（葉及び茎）において、イン
ベルターゼ活性を示したが、該活性は形質転換しなかっ
た植物では検出されなかった。免疫学的方法により、こ
のインベルターゼが酵母インベルターゼであることを立
証することができた。このインベルターゼは、細胞質ゾ
ル及び／又は細胞質内に局在化されている。従って、総
ての器官及び細胞内に、植物内に導入された酵母インベ
ルターゼ遺伝子から惹起される新規のインベルターゼ活
性を有するトランスジェニックタバコ及びジャガイモが
製造された。再生したタバコ及びジャガイモは形質転換
しなかった植物に比較して明らかな差異を示した。従っ
て、葉は緑色における変化を示した。更に、個々に形質
転換した植物は様々に強力な生長強度を呈し、これは同
じ繁殖力において節間距離を短縮させた。更に、若葉は
僅かに内側に向かって曲がることが観察された。
【００９４】例２プラスミドｐ３５Ｓ−ＣＷ −ＩＮＶの製造及び該プラ ス
ミドのタバコ及びジャガ イモの植物ゲノム内への導 入 例１に記載したと類似した方法で、プラスミドｐ３５Ｓ
−ＣＷ−ＩＮＶを製造したが、但しこの場合には、植物
遺伝子の小胞体内に取り入れるために必要な単一ペプチ
ド［ジャガイモ(ソラヌム・ツベロスム)由来のプロテイ
ナーゼ阻害物質ＩＩ遺伝子、Keil et al. 1968］をイン
ベルターゼ遺伝子のコーディング配列の前に導入する点
を変更した。該プラスミドｐ３５Ｓ−ＣＷ−ＩＮＶは配
列７．１ｋｂのサイズを有しかつ３つのフラグメント
Ａ，Ｂ及びＣからなっており、これらをｐＭＰＫ１１０
のポリリンカーの制限酵素のための所定の切断部位内で
クローニングした（図２参照）。
ミドのタバコ及びジャガ イモの植物ゲノム内への導 入 例１に記載したと類似した方法で、プラスミドｐ３５Ｓ
−ＣＷ−ＩＮＶを製造したが、但しこの場合には、植物
遺伝子の小胞体内に取り入れるために必要な単一ペプチ
ド［ジャガイモ(ソラヌム・ツベロスム)由来のプロテイ
ナーゼ阻害物質ＩＩ遺伝子、Keil et al. 1968］をイン
ベルターゼ遺伝子のコーディング配列の前に導入する点
を変更した。該プラスミドｐ３５Ｓ−ＣＷ−ＩＮＶは配
列７．１ｋｂのサイズを有しかつ３つのフラグメント
Ａ，Ｂ及びＣからなっており、これらをｐＭＰＫ１１０
のポリリンカーの制限酵素のための所定の切断部位内で
クローニングした（図２参照）。
【００９５】フラグメントＡは、カリフラワーモザイク
ウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモータからなる。こ
れはＣａＭＶのヌクレオチド６９０９〜７４３７(Franc
k etal (1980) Cell 21, 285-294)を包含するフラグメ
ントを含有し、該フラグメントをプラスミドｐＤＨ５１
(Pietzak et al (1986) Nucleic acids Res 14, 5857-5
868)からＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩフラグメントとして単離
しかつプラスミドｐＭＰＫ１１０のＥｃｏＲＩ−Ｋｐｎ
Ｉ切断部位の間でクローニングした。
ウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモータからなる。こ
れはＣａＭＶのヌクレオチド６９０９〜７４３７(Franc
k etal (1980) Cell 21, 285-294)を包含するフラグメ
ントを含有し、該フラグメントをプラスミドｐＤＨ５１
(Pietzak et al (1986) Nucleic acids Res 14, 5857-5
868)からＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩフラグメントとして単離
しかつプラスミドｐＭＰＫ１１０のＥｃｏＲＩ−Ｋｐｎ
Ｉ切断部位の間でクローニングした。
【００９６】フラグメントＢは、ヌクレオチド＋６４〜
＋１７６５(Taussing und Carlson(1983) Nucleic Acid
Res 11, 1943-1954)を包含する、酵母由来のｓｕｃ２
遺伝子に配列ＡＣＣ ＧＡＡ ＴＴＧ ＧＧＧ ＡＴＣ
ＣＣＡ ＧＣＴ ＴＴＣを有するリンカーを介して融
合される、ジャガイモ（ソラヌム・ツベロスム）のプロ
テイナーゼ阻害物質ＩＩ遺伝子のヌクレオチド９２３〜
１１５９(Keilet al(1986) Nucleic Acid Res 14, 5641
-5650)を含有する。従って、小胞体内に蛋白質を摂取す
るために必要である植物蛋白質Ｎ−末端位のシグナルペ
プチドは、インベルターゼ配列に融合されている。該フ
ラグメントＢをＳｃａ／ＸｍｎＩフラグメントとしてｐ
ＭＰＫ１１０のポリリンカーのＳｍａＩ／ＰｓｔＩ位置
の間に導入した。それによって、連結反応の前に、Ｐｓ
ｔＩ切断部位の３′−オーバハンギング末端を、Ｔ４−
ＤＮＡポリメラーゼと一緒に保温することによりブラン
トにした。
＋１７６５(Taussing und Carlson(1983) Nucleic Acid
Res 11, 1943-1954)を包含する、酵母由来のｓｕｃ２
遺伝子に配列ＡＣＣ ＧＡＡ ＴＴＧ ＧＧＧ ＡＴＣ
ＣＣＡ ＧＣＴ ＴＴＣを有するリンカーを介して融
合される、ジャガイモ（ソラヌム・ツベロスム）のプロ
テイナーゼ阻害物質ＩＩ遺伝子のヌクレオチド９２３〜
１１５９(Keilet al(1986) Nucleic Acid Res 14, 5641
-5650)を含有する。従って、小胞体内に蛋白質を摂取す
るために必要である植物蛋白質Ｎ−末端位のシグナルペ
プチドは、インベルターゼ配列に融合されている。該フ
ラグメントＢをＳｃａ／ＸｍｎＩフラグメントとしてｐ
ＭＰＫ１１０のポリリンカーのＳｍａＩ／ＰｓｔＩ位置
の間に導入した。それによって、連結反応の前に、Ｐｓ
ｔＩ切断部位の３′−オーバハンギング末端を、Ｔ４−
ＤＮＡポリメラーゼと一緒に保温することによりブラン
トにした。
【００９７】フラグメントＣは、Ｔｉ−プラスミドｐＴ
ｉＡＣＨ５(Gielen et al. (1984);EMBO J. 3, 835-84
6)のＴ−ＤＮＡの遺伝子３のポリアデニル化シグナル及
びヌクレオチド１１７４９〜１１９３９を含有してお
り、これらをプラスミドｐＡＧＶ４０(Herrera-Estrell
a et al. (1983) Nature 303, 209-213)からＰｖｕＩＩ
−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとして単離し、かつＰｖ
ｕＩＩ切断部位にＳｐｈＩ−リンカーを添加した後に、
ｐＭＰＫ１１０のポリリンカーのＳＰｈＩ−ＨｉｎｄＩ
ＩＩ切断部位間でクローニングした（図２参照）。
ｉＡＣＨ５(Gielen et al. (1984);EMBO J. 3, 835-84
6)のＴ−ＤＮＡの遺伝子３のポリアデニル化シグナル及
びヌクレオチド１１７４９〜１１９３９を含有してお
り、これらをプラスミドｐＡＧＶ４０(Herrera-Estrell
a et al. (1983) Nature 303, 209-213)からＰｖｕＩＩ
−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとして単離し、かつＰｖ
ｕＩＩ切断部位にＳｐｈＩ−リンカーを添加した後に、
ｐＭＰＫ１１０のポリリンカーのＳＰｈＩ−ＨｉｎｄＩ
ＩＩ切断部位間でクローニングした（図２参照）。
【００９８】フラグメントＡ，Ｂ及びＣｙを含有するプ
ラスミドｐ３５Ｓ−Ｃｙ−ＩＮＶの部分を例１に記載し
たと類似した方法で植物に導入した。ウエスターン法及
び活性試験によりトランスジェニック植物の分析によれ
ば、ｓｕｃ２遺伝子からコードしたインベルターゼは今
や細胞外スペース内に局在化していることが判明した。
このモザイク遺伝子を含有するトランスジェニックタバ
コ及びジャガイモは、短縮した節間距離を基礎とし植物
の短縮に加えて、モザイクパターンの形成部から緑及び
クロチック領域まで延び、該領域がネクロチック領域の
形成部まで広がる新しい葉の表現型を示す。更に、これ
らは強度に短縮した根形成を示す。
ラスミドｐ３５Ｓ−Ｃｙ−ＩＮＶの部分を例１に記載し
たと類似した方法で植物に導入した。ウエスターン法及
び活性試験によりトランスジェニック植物の分析によれ
ば、ｓｕｃ２遺伝子からコードしたインベルターゼは今
や細胞外スペース内に局在化していることが判明した。
このモザイク遺伝子を含有するトランスジェニックタバ
コ及びジャガイモは、短縮した節間距離を基礎とし植物
の短縮に加えて、モザイクパターンの形成部から緑及び
クロチック領域まで延び、該領域がネクロチック領域の
形成部まで広がる新しい葉の表現型を示す。更に、これ
らは強度に短縮した根形成を示す。
【００９９】例３プラスミドｐ３３−ＣＷ− ＩＮＶの製造及び該プラス ミ
ドのジャガイモのゲノム 内への導入 例２に記載したと類似した方法で、但し３５Ｓプロモー
タの代わりにクラスＩパタチン遺伝子Ｂ３３(Rocha-Sos
a et al (1989) WMBO J. 8, 23-29)を使用して、プラス
ミドｐ３３−ＣＷ−ＩＮＶを製造した。該プラスミドｐ
３３−ＣＷ−ＩＮＶは７．０ｋｂのサイズを有しかつ３
つのフラグメントＡ，Ｂ及びＣからなっており、これら
をｐＵＣ１１８のポリリンカーの制限酵素のための切断
部位内でクローニングした（図３参照）。
ドのジャガイモのゲノム 内への導入 例２に記載したと類似した方法で、但し３５Ｓプロモー
タの代わりにクラスＩパタチン遺伝子Ｂ３３(Rocha-Sos
a et al (1989) WMBO J. 8, 23-29)を使用して、プラス
ミドｐ３３−ＣＷ−ＩＮＶを製造した。該プラスミドｐ
３３−ＣＷ−ＩＮＶは７．０ｋｂのサイズを有しかつ３
つのフラグメントＡ，Ｂ及びＣからなっており、これら
をｐＵＣ１１８のポリリンカーの制限酵素のための切断
部位内でクローニングした（図３参照）。
【０１００】該フラグメントＡは、パラチン遺伝子Ｂ３
３（Rocha-Sosa et al (1989) WMBOJ. 8, 23-29)のプロ
モータ領域のＤｒａＩ−ＤｒａＩフラグメント（位置−
１５１２〜位置＋１４）を含有する。これをｐＵＣ１１
８のポリリンカーのＳｍａＩ内でクローニングした。
３（Rocha-Sosa et al (1989) WMBOJ. 8, 23-29)のプロ
モータ領域のＤｒａＩ−ＤｒａＩフラグメント（位置−
１５１２〜位置＋１４）を含有する。これをｐＵＣ１１
８のポリリンカーのＳｍａＩ内でクローニングした。
【０１０１】フラグメントＢ及びＣは、プラスミドｐ３
５Ｓ−ＣＷ−ＩＮＶ内のフラグメントＢ及びＣに相当す
る（図２参照）。フラグメントＢ及びＣのクローニング
のために、プラスミドｐ３５Ｓ−ＣＷ−ＩＮＶをＡｓｐ
７１８（部分）及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、生じたＨ
ｉｎｄＩＩＩ切断部位の末端をＤＮＡポリメラーゼ（ク
レノーフラグメント）で完全にした、かつ両者の完全な
フラグメントＢ及びＣを含有するフラグメントは、別の
フラグメントからゲル電気泳動法によって分離した。次
いで、このフラグメントを前記オリエンテーションによ
り部分的にＧ＋Ａを有する、ＤＮＡフラグメント（クレ
ノーフラグメント）を充填したＥｃｏＲＩ切断部位と、
Ａｓｐ７１８切断部位との間でクローニングした。部分
充填により、ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位が得られた。
５Ｓ−ＣＷ−ＩＮＶ内のフラグメントＢ及びＣに相当す
る（図２参照）。フラグメントＢ及びＣのクローニング
のために、プラスミドｐ３５Ｓ−ＣＷ−ＩＮＶをＡｓｐ
７１８（部分）及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、生じたＨ
ｉｎｄＩＩＩ切断部位の末端をＤＮＡポリメラーゼ（ク
レノーフラグメント）で完全にした、かつ両者の完全な
フラグメントＢ及びＣを含有するフラグメントは、別の
フラグメントからゲル電気泳動法によって分離した。次
いで、このフラグメントを前記オリエンテーションによ
り部分的にＧ＋Ａを有する、ＤＮＡフラグメント（クレ
ノーフラグメント）を充填したＥｃｏＲＩ切断部位と、
Ａｓｐ７１８切断部位との間でクローニングした。部分
充填により、ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位が得られた。
【０１０２】プラスミドｐ３３−ＣＷ−ＩＮＶを、例１
に記載したと類似した方法で植物内に導入した。ジャガ
イモにおいて、該モザイク遺伝子はインベルターゼの塊
茎特異性発現をもたらした。
に記載したと類似した方法で植物内に導入した。ジャガ
イモにおいて、該モザイク遺伝子はインベルターゼの塊
茎特異性発現をもたらした。
【０１０３】該プラスミドｐ３３−ＣＷ−ＩＮＶで形質
転換したデジレー(Desiree)種の２株のトランスジェニ
ックジャガイモは、習性及び収穫似にして生長条件下
で、形質転換しなかった対照植物と完全に匹敵した。し
かしながら、最も重要な相異は驚異的にも塊茎収穫にあ
った。温室条件下で生長したプラスミドｐ３３−ＣＷ−
ＩＮＶで形質転換した２株の植物は、それぞれ２８３ｇ
及び２２３ｇの収穫量を示した、それに対して両者の対
照植物は単に生鮮重量それぞれ１５５ｇ及び２２３ｇの
ジャガイモ収穫量を示したにすぎない。これらのジャガ
イモの乾燥重量並びに全澱粉含量の測定で、プラスミド
ｐ３３−ＣＷ−ＩＮＶで形質転換した植物は、対照植物
と比較して同じ相対的摂取量を示した。このことは、ト
ランスジェニックジャガイモにおけるプラスミドｐ３３
−ＣＷ−ＩＮＶの導入及び塊茎特異性発現は、約５０〜
１００％のこれらの植物の収穫量を増大させたことを意
味する。塊茎のサイズ分布に関しては、プラスミドｐ３
３−ＣＷ−ＩＮＶで形質転換した植物は極めて大きなの
塊茎を得た（図８参照）。このことは、プラスミドｐ３
３−ＣＷ−ＩＮＶの導入及び発現は、ジャガイモにおい
て全ジャガイモ塊茎収穫量の著しい増大を生じただけで
なく、また個々のジャガイモ塊茎のサイズをも増大させ
たことを意味する。 例４プラスミドｐ１７００−Ｃ Ｗ−ＩＮＶの製造及び該プ ラ
スミドのタバコ及びジャガイモの植物ゲノム内への導入 例２に記載したと類似した方法で、但し３５Ｓプロモー
タの代わりにＳＴ−ＬＳ１遺伝子(Stockhaus et al (19
87) Proc. Natl. Sci. USA 84, 7943-7947)を使用し
て、プラスミドｐ１７００−ＣＷ−ＩＮＶを製造した。
転換したデジレー(Desiree)種の２株のトランスジェニ
ックジャガイモは、習性及び収穫似にして生長条件下
で、形質転換しなかった対照植物と完全に匹敵した。し
かしながら、最も重要な相異は驚異的にも塊茎収穫にあ
った。温室条件下で生長したプラスミドｐ３３−ＣＷ−
ＩＮＶで形質転換した２株の植物は、それぞれ２８３ｇ
及び２２３ｇの収穫量を示した、それに対して両者の対
照植物は単に生鮮重量それぞれ１５５ｇ及び２２３ｇの
ジャガイモ収穫量を示したにすぎない。これらのジャガ
イモの乾燥重量並びに全澱粉含量の測定で、プラスミド
ｐ３３−ＣＷ−ＩＮＶで形質転換した植物は、対照植物
と比較して同じ相対的摂取量を示した。このことは、ト
ランスジェニックジャガイモにおけるプラスミドｐ３３
−ＣＷ−ＩＮＶの導入及び塊茎特異性発現は、約５０〜
１００％のこれらの植物の収穫量を増大させたことを意
味する。塊茎のサイズ分布に関しては、プラスミドｐ３
３−ＣＷ−ＩＮＶで形質転換した植物は極めて大きなの
塊茎を得た（図８参照）。このことは、プラスミドｐ３
３−ＣＷ−ＩＮＶの導入及び発現は、ジャガイモにおい
て全ジャガイモ塊茎収穫量の著しい増大を生じただけで
なく、また個々のジャガイモ塊茎のサイズをも増大させ
たことを意味する。 例４プラスミドｐ１７００−Ｃ Ｗ−ＩＮＶの製造及び該プ ラ
スミドのタバコ及びジャガイモの植物ゲノム内への導入 例２に記載したと類似した方法で、但し３５Ｓプロモー
タの代わりにＳＴ−ＬＳ１遺伝子(Stockhaus et al (19
87) Proc. Natl. Sci. USA 84, 7943-7947)を使用し
て、プラスミドｐ１７００−ＣＷ−ＩＮＶを製造した。
【０１０４】該プラスミドｐ１７００−ＣＷ−ＩＮＶは
８．４ｋｂのサイズを有しかつ３つのフラグメントＡ，
Ｂ及びＣからなっており、これらをｐＭＰＫ１１０のポ
リリンカー内の制限部位内にクローニングした（図４参
照）。
８．４ｋｂのサイズを有しかつ３つのフラグメントＡ，
Ｂ及びＣからなっており、これらをｐＭＰＫ１１０のポ
リリンカー内の制限部位内にクローニングした（図４参
照）。
【０１０５】該フラグメントＡは、ＳＴ−ＬＳ１遺伝子
のＥｃｏＲＩ−ＭｂｏＩＩフラグメントを含有してい
た。発表された配列(Eckes et al (1986) Mol Gen Gene
tic 205, 14-22)に対するＭｂｏＩＩ側の位置は、位置
１５８５（位置＋１〜位置＋１５８５）にある。このフ
ラグメントを、ＭｂｏＩＩ切断部位のオーバハンギング
３′末端を予めＴ４−ＤＮＡポリメラーゼによってブラ
ントにした、ＰＵＣ１８のポリリンカーのＥｃｏＲＩ−
ＳｍａＩ切断部位間でクローニングした。
のＥｃｏＲＩ−ＭｂｏＩＩフラグメントを含有してい
た。発表された配列(Eckes et al (1986) Mol Gen Gene
tic 205, 14-22)に対するＭｂｏＩＩ側の位置は、位置
１５８５（位置＋１〜位置＋１５８５）にある。このフ
ラグメントを、ＭｂｏＩＩ切断部位のオーバハンギング
３′末端を予めＴ４−ＤＮＡポリメラーゼによってブラ
ントにした、ＰＵＣ１８のポリリンカーのＥｃｏＲＩ−
ＳｍａＩ切断部位間でクローニングした。
【０１０６】フラグメントＢ及びＣは、プラスミドｐ３
５Ｓ−ＣＷ−ＩＮＶ内のフラグメントＢ及びＣに相当す
る（図２参照）。フラグメントＢ及びＣのクローニング
のために、プラスミドｐ３５Ｓ−ＣＷ−ＩＮＶをＡｓｐ
７１８で部分的に消化した。生じた３′末端をＤＮＡポ
リメラーゼ（クレノーフラグメント）で完全にし、次い
で該フラグメントをＨｉｎｄＩＩＩで分割した。両者の
完全なフラグメントＢ及びＣを含有するフラグメント
を、ゲル電気泳動法により別のフラグメントから分離
し、精製しかつｐＭＰＫ１１０のポリリンカーのＢａｍ
ＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位の間でクローニングし
た。該ＢａｍＨＩ切断は予めＤＮＡポリメラーゼＩを充
填することによりブラントにした。
５Ｓ−ＣＷ−ＩＮＶ内のフラグメントＢ及びＣに相当す
る（図２参照）。フラグメントＢ及びＣのクローニング
のために、プラスミドｐ３５Ｓ−ＣＷ−ＩＮＶをＡｓｐ
７１８で部分的に消化した。生じた３′末端をＤＮＡポ
リメラーゼ（クレノーフラグメント）で完全にし、次い
で該フラグメントをＨｉｎｄＩＩＩで分割した。両者の
完全なフラグメントＢ及びＣを含有するフラグメント
を、ゲル電気泳動法により別のフラグメントから分離
し、精製しかつｐＭＰＫ１１０のポリリンカーのＢａｍ
ＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位の間でクローニングし
た。該ＢａｍＨＩ切断は予めＤＮＡポリメラーゼＩを充
填することによりブラントにした。
【０１０７】フラグメントＡ，Ｂ及びＣを含有するプラ
スミドｐ１７００−ＣＷ−ＩＮＶの部分を、例１に記載
したと類似した方法で植物に導入した。
スミドｐ１７００−ＣＷ−ＩＮＶの部分を、例１に記載
したと類似した方法で植物に導入した。
【０１０８】例５プラスミドｐ３３−Ｃｙ− ＣＷ−ＩＮＶの製造及び該 プ
ラスミドのタバコ及びジ ャガイモの植物ゲノム内へ の導
入 例２に記載したと類似した方法で、但し３５Ｓプロモー
タの代わりにクラスＩパラチン遺伝子のプロモータ(Roc
ka-Rosa et (1989) EMBO J 8, 23-29)を使用して、プラ
スミドｐ３３−Ｃｙ−ＩＮＶを製造した。
ラスミドのタバコ及びジ ャガイモの植物ゲノム内へ の導
入 例２に記載したと類似した方法で、但し３５Ｓプロモー
タの代わりにクラスＩパラチン遺伝子のプロモータ(Roc
ka-Rosa et (1989) EMBO J 8, 23-29)を使用して、プラ
スミドｐ３３−Ｃｙ−ＩＮＶを製造した。
【０１０９】該プラスミドｐ３３−Ｃｙ−ＩＮＶは６．
８ｋｂのサイズを有しかつ３つのフラグメントＡ，Ｂ及
びＣからなっており、これらをｐＵＣ１１８のポリリン
カーの制限酵素切断部位内でクローニングした（図５参
照）。
８ｋｂのサイズを有しかつ３つのフラグメントＡ，Ｂ及
びＣからなっており、これらをｐＵＣ１１８のポリリン
カーの制限酵素切断部位内でクローニングした（図５参
照）。
【０１１０】該フラグメントＡは、パタチン遺伝子Ｂ３
３（Rocha-Sosa et al (1989) EWBOJ. 8, 23-29)のプロ
モータ領域のＤｒａＩ−ＤｒａＩフラグメント（位置−
１５１２〜位置＋１４）を含有していた。これをｐＵＣ
１１８のポリリンカーのＳｍａＩ内でクローニングし
た。
３（Rocha-Sosa et al (1989) EWBOJ. 8, 23-29)のプロ
モータ領域のＤｒａＩ−ＤｒａＩフラグメント（位置−
１５１２〜位置＋１４）を含有していた。これをｐＵＣ
１１８のポリリンカーのＳｍａＩ内でクローニングし
た。
【０１１１】フラグメントＢ及びＣは、プラスミドｐ３
５Ｓ−Ｃｙ−ＩＮＶ内のフラグメントＢ及びＣに相当す
る。フラグメントＢ及びＣのクローニングのために、プ
ラスミドｐ３５Ｓ−Ｃｙ−ＩＮＶをＨｉｎｄＩＩＩで消
化し、生じた３′末端をＤＮＡポリメラーゼ（クレノー
フラグメント）で完全にした。該プラスミドを部分的に
Ａｓｐ７１８で消化させかつ両者の完全なフラグメント
Ｂ３及びＣを別のフラグメントからのゲル電気泳動法に
よって分離した。次いで、これらのフラグメントを部分
的にＧ＋Ａを有する、ＤＮＡポリメラーゼを充填したｐ
ＵＣ１１８のポリリンカーのＥｃｏＲＩ切断部位と、Ａ
ｓｐ７１８切断部位との間でクローニングした。部分的
充填により、ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位が得られた。
５Ｓ−Ｃｙ−ＩＮＶ内のフラグメントＢ及びＣに相当す
る。フラグメントＢ及びＣのクローニングのために、プ
ラスミドｐ３５Ｓ−Ｃｙ−ＩＮＶをＨｉｎｄＩＩＩで消
化し、生じた３′末端をＤＮＡポリメラーゼ（クレノー
フラグメント）で完全にした。該プラスミドを部分的に
Ａｓｐ７１８で消化させかつ両者の完全なフラグメント
Ｂ３及びＣを別のフラグメントからのゲル電気泳動法に
よって分離した。次いで、これらのフラグメントを部分
的にＧ＋Ａを有する、ＤＮＡポリメラーゼを充填したｐ
ＵＣ１１８のポリリンカーのＥｃｏＲＩ切断部位と、Ａ
ｓｐ７１８切断部位との間でクローニングした。部分的
充填により、ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位が得られた。
【０１１２】該プラスミドｐ３３−Ｃｙ−ＩＮＶを、例
１に記載したと類似した方法で植物内に導入した。
１に記載したと類似した方法で植物内に導入した。
【０１１３】例６プラスミドｐ３５Ｓ−Ｖ− ＩＮＶの製造及び該プラス ミ
ドのタバコの植物ゲノム への導入 例１に記載したと類似した方法で、プラスミドｐ３５Ｓ
−Ｖ−ＩＮＶを製造したが、但しこの場合には、インベ
ルターゼ遺伝子のコード化配列の前に、インベルターゼ
蛋白質の液胞への配向のために必要である植物遺伝子の
ペプチド（ジャガイモ由来のパタチン遺伝子ｐｇＴ５、
Rosahl et al., Mol. General Genetics203, 214-220)
を融合させた。該プラスミドｐ３５Ｓ−Ｖ−ＩＮＶは
６．３ｋｂのサイズを有しかつ３つのフラグメントＡ，
Ｂ及びＣからなっており、これらをｐＵＣ１８のポリリ
ンカーの所定の切断部位内にクローニングした（図６参
照）。フラグメントＡ（５２９ｂｐ）はカリフラワーモ
ザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモータを含有
する。該フラグメントはＣａＭＶのヌクレオチド６９０
９〜７４３７（Franck et al., Cell 21, 285-294)を包
含する、かつ該フラグメントをプラスミドｐＤＨ５１(P
ietrzak et al., Nucleic Acid Reserach 14,5857-586
8)からＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩとして単離しかつプラスミ
ドｐＵＣ１８のポリリンカーのＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ切
断部位の間でクローニングした。
ドのタバコの植物ゲノム への導入 例１に記載したと類似した方法で、プラスミドｐ３５Ｓ
−Ｖ−ＩＮＶを製造したが、但しこの場合には、インベ
ルターゼ遺伝子のコード化配列の前に、インベルターゼ
蛋白質の液胞への配向のために必要である植物遺伝子の
ペプチド（ジャガイモ由来のパタチン遺伝子ｐｇＴ５、
Rosahl et al., Mol. General Genetics203, 214-220)
を融合させた。該プラスミドｐ３５Ｓ−Ｖ−ＩＮＶは
６．３ｋｂのサイズを有しかつ３つのフラグメントＡ，
Ｂ及びＣからなっており、これらをｐＵＣ１８のポリリ
ンカーの所定の切断部位内にクローニングした（図６参
照）。フラグメントＡ（５２９ｂｐ）はカリフラワーモ
ザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモータを含有
する。該フラグメントはＣａＭＶのヌクレオチド６９０
９〜７４３７（Franck et al., Cell 21, 285-294)を包
含する、かつ該フラグメントをプラスミドｐＤＨ５１(P
ietrzak et al., Nucleic Acid Reserach 14,5857-586
8)からＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩとして単離しかつプラスミ
ドｐＵＣ１８のポリリンカーのＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ切
断部位の間でクローニングした。
【０１１４】フラグメントＢはゲノミックパラチンクロ
ーンｐｇＴ５の配列のヌクレオチド７０７〜１８９５(R
osahl et al., 1986)を含有し、該ヌクレオチドはヌク
レオチド＋６４〜＋１７６５(Taussig und Carlson (19
83) Nucleic Acids Res. 11,1943-1945)を包含する、酵
母由来のｓｕｃ２遺伝子に配列ＡＧＣＴＴＴＣを有する
リンカーを介して融合される。このうにして、高級植物
の液胞内の蛋白質の配向を担いかつ相応する液胞Ｎ−末
端ターゲッティングシグナルを有するペプチドは、イン
ベルターゼ配列に融合される。該フラグメントＢをＥｃ
ｏＲＶ−ＸｍｎＩフラグメントとして、連鎖反応の前に
ＰｓｔＩの３′−オーバハンギィング末端をＴ４−ＤＮ
Ａ−ポリメラーゼで保温することによりブラントにした
ｐＵＴ１８のポリリンカーのＳｍａＩ／ＰｓｔＩ切断部
位間に導入した（図６参照）。 フラグメントＣ（１９
２ｂｐ）はヌクレオチド１１７４９〜１１９３９を有す
るＴｉ−プラスミドｐＴｉＡＣＨ５(Gielen et al,. E
MBO J. 3, 835-846)のＴ−ＤＮＡ遺伝子のポリアデニル
化シグナルを包含する、該フラグメントをＰｖｕＩＩ−
ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとしてプラスミドｐＡＧＶ
４０(Herrera-Estrella et al. (1983) Nature 303, 20
9-213)から単離しかつＳｐｈＩリンカーの添加後に、ｐ
ＵＣ１８のポリリンカーのＳｐｈＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ切
断部位の間のＰｖｕＩＩ切断部位にクローニングした。
ーンｐｇＴ５の配列のヌクレオチド７０７〜１８９５(R
osahl et al., 1986)を含有し、該ヌクレオチドはヌク
レオチド＋６４〜＋１７６５(Taussig und Carlson (19
83) Nucleic Acids Res. 11,1943-1945)を包含する、酵
母由来のｓｕｃ２遺伝子に配列ＡＧＣＴＴＴＣを有する
リンカーを介して融合される。このうにして、高級植物
の液胞内の蛋白質の配向を担いかつ相応する液胞Ｎ−末
端ターゲッティングシグナルを有するペプチドは、イン
ベルターゼ配列に融合される。該フラグメントＢをＥｃ
ｏＲＶ−ＸｍｎＩフラグメントとして、連鎖反応の前に
ＰｓｔＩの３′−オーバハンギィング末端をＴ４−ＤＮ
Ａ−ポリメラーゼで保温することによりブラントにした
ｐＵＴ１８のポリリンカーのＳｍａＩ／ＰｓｔＩ切断部
位間に導入した（図６参照）。 フラグメントＣ（１９
２ｂｐ）はヌクレオチド１１７４９〜１１９３９を有す
るＴｉ−プラスミドｐＴｉＡＣＨ５(Gielen et al,. E
MBO J. 3, 835-846)のＴ−ＤＮＡ遺伝子のポリアデニル
化シグナルを包含する、該フラグメントをＰｖｕＩＩ−
ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとしてプラスミドｐＡＧＶ
４０(Herrera-Estrella et al. (1983) Nature 303, 20
9-213)から単離しかつＳｐｈＩリンカーの添加後に、ｐ
ＵＣ１８のポリリンカーのＳｐｈＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ切
断部位の間のＰｖｕＩＩ切断部位にクローニングした。
【０１１５】インベルターゼ活性試験により得られたト
ランスジェニックタバコの分析によれば、ｓｕｃ２遺伝
子からコードした得らインベルターゼは今や液胞内に局
在化されていること判明した（図９参照）。該トランス
ジェニックタバコは、植物の短縮に加えて、新しい葉の
発現型を示した。このことは、古い葉に、葉の先端から
開始するクロロチック領域が発育しているという事実に
より観察された。
ランスジェニックタバコの分析によれば、ｓｕｃ２遺伝
子からコードした得らインベルターゼは今や液胞内に局
在化されていること判明した（図９参照）。該トランス
ジェニックタバコは、植物の短縮に加えて、新しい葉の
発現型を示した。このことは、古い葉に、葉の先端から
開始するクロロチック領域が発育しているという事実に
より観察された。
【図１】５．１ｋｂサイズのプラスミドｐ３５Ｓ−Ｃｙ
−ＩＮＶの構造を示す。
−ＩＮＶの構造を示す。
【図２】７．１ｋｂサイズのプラスミドｐ３５Ｓ−ＣＷ
−ＩＮＶの構造を示す。
−ＩＮＶの構造を示す。
【図３】７．０ｋｂサイズのプラスミドｐ３３−ＣＷ−
ＩＮＶの構造を示す。
ＩＮＶの構造を示す。
【図４】８．４ｋｂサイズのプラスミドｐ１７００−Ｃ
Ｗ−ＩＮＶの構造を示す。
Ｗ−ＩＮＶの構造を示す。
【図５】６．８ｋｂサイズのプラスミドｐ３３−Ｃｙ−
ＩＮＶの構造を示す。
ＩＮＶの構造を示す。
【図６】６．３ｋｂサイズのプラスミドｐ３５Ｓ−Ｖ−
ＩＮＶの構造を示す。
ＩＮＶの構造を示す。
【図７】５株の独立したトランスジェニックタバコから
の葉抽出物中のインベルターゼ活性のｉｎ ｓｉｔｕ証
明（トレース１〜５）並びに形質転換されていない植物
にける同活性の不在（トレースＷ３８）のための遺伝子
を示す。
の葉抽出物中のインベルターゼ活性のｉｎ ｓｉｔｕ証
明（トレース１〜５）並びに形質転換されていない植物
にける同活性の不在（トレースＷ３８）のための遺伝子
を示す。
【図８】プラスミドｐ３３−ＣＷ−ＩＮＶで形質転換し
た２株のジャガイモ（左側、植物Ｂ３３−Ｃｗ−ＩＮ−
４及びＢ３３−Ｃｗ−ＩＮ−１）と、正確に同じ条件下
で、但し形質転換せずに生長させた２株の対照植物（右
側、対照１及び対照２）の塊茎の数、サイズ分布（生鮮
重量）及び総生鮮重量を示す。
た２株のジャガイモ（左側、植物Ｂ３３−Ｃｗ−ＩＮ−
４及びＢ３３−Ｃｗ−ＩＮ−１）と、正確に同じ条件下
で、但し形質転換せずに生長させた２株の対照植物（右
側、対照１及び対照２）の塊茎の数、サイズ分布（生鮮
重量）及び総生鮮重量を示す。
【図９】プラスミドｐ３５Ｓ−Ｖ−ＩＮＶで形質転換し
たタバコの液胞内の該プラスミドからコードしたインベ
ルターゼ活性のｉｎ ｓｉｔｕ証明のためのゲルを示
す。
たタバコの液胞内の該プラスミドからコードしたインベ
ルターゼ活性のｉｎ ｓｉｔｕ証明のためのゲルを示
す。
フロントページの続き (73)特許権者 597113365 ＭｉｒａｕｓｔｒａＢｅ54，Ｂｅｒｈ ｎ，ＢＲＤ (72)発明者 ウーヴェ ゾンネヴァルト ドイツ連邦共和国 ベルリン 10 ギー ルケツァイレ34 (72)発明者 アンチエ フォン シェーフェン ドイツ連邦共和国 ベラウ ドルフシュ トラーセ 67アー (56)参考文献 国際公開89／12386（ＷＯ，Ａ１) Ｃｅｌｌ．Ｖｏｌ．48，Ｎｏ．５ （1987）ｐ．875−885 Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ. 108，Ｎｏ．２（1989）ｐ．327−337 Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｓ ｕｐｐｌ．13ｐａｒｔＤ（1989）ｐ. 230 Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．１, Ｎｏ．１（1989）ｐ．95−104 Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．１, Ｎｏ．３（1989）ｐ．381−390 Ｐｌａｎｔａ，Ｖｏｌ．179，Ｎｏ. ２（1989）ｐ．171−180 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A01H 5/00 C12N 15/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (35)
- 【請求項１】 アグロバクテリウムにより形質転換され
ることが可能であり、変更した光同化物の分配および／
または生産を有するトランスジェニック植物又はその細
胞を製造する方法において、該方法が次の工程： −植物細胞中でのインベルターゼ蛋白質の発現を保証す
る好適な調節領域に融合されているインベルターゼ遺伝
子のＤＮＡ配列を有するＤＮＡを植物細胞のゲノム中に
導入し、かつ −前記植物細胞から植物を再生し、場合により、該植物
から細胞を取得すること、 からなることを特徴とする、アグロバクテリウムにより
形質転換されることが可能であり、変更した光同化物の
分配および／または生産を有するトランスジェニック植
物またはその細胞の製造法。 - 【請求項２】 インベルターゼ遺伝子のＤＮＡ配列が酵
母からのインベルターゼ遺伝子ＳＵＣ２のＤＮＡ配列で
ある、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 調節領域が、植物のほぼ全ての細胞中で
インベルターゼ遺伝子のＤＮＡ配列を構成的に発現させ
るプロモータである、請求項１または２記載の方法。 - 【請求項４】 プロモータがカリフラワーモザイクウイ
ルスの３５Ｓ ＲＮＡのプロモータである、請求項３記
載の方法。 - 【請求項５】 該調節領域が植物の“シンク”又は“ソ
ース”組織中でインベルターゼ遺伝子のＤＮＡ配列を発
現させるプロモータからなる、請求項１又は２記載の方
法。 - 【請求項６】 プロモータがクラスＩパタチン遺伝子Ｂ
３３のプロモータである、請求項５記載の方法。 - 【請求項７】 プロモータがＳＴ−ＬＳ１遺伝子のプロ
モータである、請求項５記載の方法。 - 【請求項８】 インベルターゼ遺伝子のＤＮＡ配列が植
物細胞および植物の液胞中に該インベルターゼ蛋白質の
移動を保証するペプチドをコードするＤＮＡ配列に融合
されている、請求項１から７までのいずれか１項に記載
の方法。 - 【請求項９】 植物及び植物細胞の液胞中にインベルタ
ーゼ蛋白質の移動を保証するペプチドをコードするＤＮ
Ａ配列が、ヌクレオチド位置＋７０７〜＋１８９５のソ
ラヌム・ツベロスム由来のパタチン遺伝子ｐｇＴ５のＤ
ＮＡ配列である、請求項８記載の方法。 - 【請求項１０】 インベルターゼ遺伝子のＤＮＡ配列
が、植物及び植物細胞の小胞体中へのインベルターゼ蛋
白質の摂取を保証するシグナルペプチドをコードするＤ
ＮＡ配列に融合されている、請求項１から７までのいず
れか１項記載の記載の方法。 - 【請求項１１】 植物及び植物細胞の小胞体中へのイン
ベルターゼ蛋白質の摂取を保証するシグナルペプチドを
コードするＤＮＡ配列がソラヌム・ツベロスムのプロテ
イナーゼ阻害物質ＩＩ遺伝子のＤＮＡ配列から由来す
る、請求項１０記載の方法。 - 【請求項１２】 該調節領域がオクトピンシンターゼ遺
伝子のポリ−Ａ側の３′末端からなる、請求項１から１
１までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１３】 種子、果実、根および／または塊茎の
高い乾燥重量を有する植物の製造のための、請求項１か
ら１２までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１４】 アグロバクテリウムにより形質転換さ
れることが可能であり、変更した光同化物の分配および
／または生産を有するトランスジェニック植物またはそ
の細胞、またはその子孫を製造する方法において、該方
法が次の工程： −植物細胞中でのインベルターゼ蛋白質の発現を保証す
る好適な調節領域に融合されているインベルターゼ遺伝
子のＤＮＡ配列を有するＤＮＡを有するプラスミドで植
物細胞を形質転換し、かつ −前記植物細胞から植物を再生し、場合により、その子
孫または植物細胞を取得すること、 からなることを特徴とする、アグロバクテリウムにより
形質転換されることが可能であり、変更した光同化物の
分配および／または生産を有するトランスジェニック植
物またはその細胞、またはその子孫の製造法。 - 【請求項１５】 プラスミドがＤＳＭ Ｎｏ.５７８５
として寄託されてい るプラスミドｐ３５Ｓ−Ｃｙ−ＩＮ
Ｖである、請求項１４記載の方法。 - 【請求項１６】 プラスミドがＤＳＭ Ｎｏ.５７８８
として寄託されているプラスミドｐ３５Ｓ−ＣＷ−ＩＮ
Ｖである、請求項１４記載の方法。 - 【請求項１７】 プラスミドがＤＳＭ Ｎｏ.５７８７
として寄託されているプラスミドｐ３３−ＣＷ−ＩＮＶ
である、請求項１４記載の方法。 - 【請求項１８】 プラスミドがＤＳＭ Ｎｏ.５７８９
として寄託されているプラスミドｐ１７００−ＣＷ−Ｉ
ＮＶである、請求項１４記載の方法。 - 【請求項１９】 プラスミドがＤＳＭ Ｎｏ.５７８６
として寄託されているプラスミドｐ３３−Ｃｙ−ＩＮＶ
である、請求項１４記載の方法。 - 【請求項２０】 プラスミドがＤＳＭ Ｎｏ.６１４２
として寄託されているプラスミドｐ３５Ｓ−Ｖ−ＩＮＶ
である、請求項１４記載の方法。 - 【請求項２１】 アグロバクテリウムにより形質転換さ
れることが可能であり、変更した光同化物の分配および
／または生産を有するトランスジェニック植物におい
て、植物細胞中でインベルターゼ蛋白質の発現を保証す
る好適な調節領域に融合されているインベルターゼ遺伝
子のＤＮＡ配列からなるＤＮＡ配列を、その細胞のゲノ
ム中に組み込んで有するトランスジェニック植物である
が、但し該植物はタバコではないトランスジェニック植
物。 - 【請求項２２】 インベルターゼ遺伝子のＤＮＡ配列が
酵母からのインベルターゼ遺伝子ＳＵＣ２のＤＮＡ配列
である、請求項２１記載の植物。 - 【請求項２３】 調節領域が、植物のほぼ全ての細胞中
でインベルターゼ遺伝子のＤＮＡ配列を構成的に発現さ
せるプロモータである、請求項２１または２２記載の植
物。 - 【請求項２４】 プロモータがカリフラワーモザイクウ
イルスの３５Ｓ ＲＮＡのプロモータである、請求項２
３記載の植物。 - 【請求項２５】 該調節領域が植物の“シンク”又は
“ソース”組織中にインベルターゼ遺伝子のＤＮＡ配列
を発現させるプロモータからなる、請求項２１又は２２
記載の植物。 - 【請求項２６】 プロモータがクラスＩパタチン遺伝子
Ｂ３３のプロモータである、請求項２２記載の植物。 - 【請求項２７】 プロモータがＳＴ−ＬＳ１遺伝子のプ
ロモータである、請求項２２記載の植物。 - 【請求項２８】 インベルターゼ遺伝子のＤＮＡ配列が
植物細胞および植物の液胞中に該インベルターゼ蛋白質
の移動を保証するペプチドをコードするＤＮＡ配列に融
合されている、請求項２１から２７までのいずれか１項
に記載の植物。 - 【請求項２９】 植物及び植物細胞の液胞中にインベル
ターゼ蛋白質の移動を保証するペプチドをコードするＤ
ＮＡ配列が、ヌクレオチド位置＋７０７〜＋１８９５の
ソラヌム・ツベロスム由来のパタチン遺伝子ｐｇＴ５の
ＤＮＡ配列である、請求項２８記載の植物。 - 【請求項３０】 インベルターゼ遺伝子のＤＮＡ配列
が、植物及び植物細胞の小胞体中へのインベルターゼ蛋
白質の摂取を保証するシグナルペプチドをコードするＤ
ＮＡ配列に融合されている、請求項２１から２９までの
いずれか１項記載の記載の植物。 - 【請求項３１】 植物及び植物細胞の小胞体中へのイン
ベルターゼ蛋白質の摂取を保証するシグナルペプチドを
コードするＤＮＡ配列がソラヌム・ツベロスムのプロテ
イナーゼ阻害物質ＩＩ遺伝子のＤＮＡ配列から由来す
る、請求項３０記載の植物。 - 【請求項３２】 該調節領域がオクトピンシンターゼ遺
伝子のポリ−Ａ側の３′末端からなる、請求項２１から
３１までのいずれか１項記載の植物。 - 【請求項３３】 種子、果実、根および／または塊茎の
高い乾燥重量を有する、請求項２１から３１までのいず
れか１項記載の植物。 - 【請求項３４】 ダイズ、トウモロコシ、サトウキビ、
サトウダイコン又はトマトから選択された、請求項２１
から３３項のいずれか１項記載の植物。 - 【請求項３５】 ジャガイモである、請求項２１から３
３までのいずれか１項記載の植物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4004800.4 | 1990-02-13 | ||
| DE4004800A DE4004800C2 (de) | 1990-02-13 | 1990-02-13 | Im Habitus und Ertrag veränderte transgene Pflanzen |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0549482A JPH0549482A (ja) | 1993-03-02 |
| JP3288395B2 true JP3288395B2 (ja) | 2002-06-04 |
Family
ID=6400273
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP01998491A Expired - Fee Related JP3288395B2 (ja) | 1990-02-13 | 1991-02-13 | プラスミド、トランスジェニック植物の製法、トランスジェニック植物、及び特異ｄｎａ配列を含有する植物細胞もしくは植物 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5436394A (ja) |
| EP (1) | EP0442592A3 (ja) |
| JP (1) | JP3288395B2 (ja) |
| AU (1) | AU650639B2 (ja) |
| CA (1) | CA2036103A1 (ja) |
| DE (1) | DE4004800C2 (ja) |
| HU (1) | HU218048B (ja) |
| IE (1) | IE910480A1 (ja) |
| IL (1) | IL97157A0 (ja) |
Families Citing this family (30)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5917127A (en) * | 1990-02-13 | 1999-06-29 | Hoechst Schering Agrevo Gmbh | Plasmids useful for and methods of preparing transgenic plants with modifications of habit and yield |
| JPH05502168A (ja) * | 1990-06-07 | 1993-04-22 | シンヘンタ モーヘン ベースローテン フェンノートシャップ | 新規な抗菌調製物、該調製物の製造方法および菌類耐性の大きい植物の作製方法 |
| EP0462065B1 (de) * | 1990-06-15 | 2005-03-02 | Syngenta Participations AG | Neue Signalsequenzen |
| DE4035756A1 (de) * | 1990-11-08 | 1992-05-14 | Inst Genbiologische Forschung | Neue plasmide zur herstellung von im habitus und ertrag veraenderten transgenen pflanzen |
| IL100908A0 (en) * | 1991-02-22 | 1992-11-15 | Salk Inst Biotech Ind | Invertase genes and their use |
| CA2084348A1 (en) * | 1991-12-31 | 1993-07-01 | David F. Hildebrand | Fatty acid alteration by a d9 desaturase in transgenic plant tissue |
| US5646023A (en) * | 1993-04-15 | 1997-07-08 | J.R. Simplot Company | Modulation of sugar content in plants |
| US5716837A (en) | 1995-02-10 | 1998-02-10 | Monsanto Company | Expression of sucrose phosphorylase in plants |
| DE19529696A1 (de) * | 1995-08-11 | 1997-02-13 | Inst Genbiologische Forschung | Transgene Pflanzenzellen und Pflanzen mit gesteigerter Glykolyserate |
| IN1997CH00924A (en) | 1996-05-03 | 2005-03-04 | Syngenta Mogen Bv | Regulating metabolism by modifying the level of trehalose-6-phosphate |
| DE19630738A1 (de) * | 1996-07-30 | 1998-02-05 | Univ Heidelberg | Invertase-Inhibitoren |
| US6420629B1 (en) | 1996-09-09 | 2002-07-16 | B.C. Research Inc. | Process of increasing plant growth and yield and modifying cellulose production in plants |
| AU758055B2 (en) | 1997-12-11 | 2003-03-13 | Syngenta Limited | Genetic method |
| US6518486B1 (en) | 1998-06-12 | 2003-02-11 | University Of Guelph | Enhanced storage organ production in plants |
| US7514598B2 (en) | 1998-08-12 | 2009-04-07 | Thomas Rausch | Transgenic plants and plant cells with reduced expression of invertase inhibitors |
| DE19836405C1 (de) * | 1998-08-12 | 2000-03-02 | Thomas Rausch | Transgene Pflanzen und Pflanzenzellen mit verminderter Expression von Invertaseinhibitoren |
| AU5756800A (en) * | 1999-06-21 | 2001-01-09 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Enhanced floral sink strength and increased stability of seed set in plants |
| US8802422B2 (en) * | 2007-06-01 | 2014-08-12 | Solazyme, Inc. | Renewable diesel and jet fuel from microbial sources |
| ES2564685T3 (es) * | 2007-07-03 | 2016-03-28 | Idemitsu Kosan Co., Ltd. | Vacuna contra la enfermedad de edema porcino |
| AU2009234176B2 (en) | 2008-04-09 | 2014-08-07 | Corbion Biotech, Inc. | Direct chemical modification of microbial biomass and microbial oils |
| CN104770424A (zh) * | 2008-10-14 | 2015-07-15 | 索拉兹米公司 | 微藻生物质的食品组合物 |
| JP5859311B2 (ja) | 2008-11-28 | 2016-02-10 | ソラザイム, インコーポレイテッドSolazyme Inc | 組み換え従属栄養微生物における、用途に応じた油の生産 |
| CA3039432A1 (en) | 2010-05-28 | 2011-12-01 | Corbion Biotech, Inc. | Tailored oils produced from recombinant heterotrophic microorganisms |
| CA3024641A1 (en) | 2010-11-03 | 2012-05-10 | Corbion Biotech, Inc. | Microbial oils with lowered pour points, dielectric fluids produced therefrom, and related methods |
| CA2825691C (en) | 2011-02-02 | 2020-08-25 | Solazyme, Inc. | Tailored oils produced from recombinant oleaginous microorganisms |
| ES2744868T3 (es) | 2012-04-18 | 2020-02-26 | Corbion Biotech Inc | Aceites hechos a medida |
| US10098371B2 (en) | 2013-01-28 | 2018-10-16 | Solazyme Roquette Nutritionals, LLC | Microalgal flour |
| FR3009619B1 (fr) | 2013-08-07 | 2017-12-29 | Roquette Freres | Compositions de biomasse de microalgues riches en proteines de qualite sensorielle optimisee |
| EP3052636A2 (en) | 2013-10-04 | 2016-08-10 | Solazyme, Inc. | Tailored oils |
| WO2016007862A2 (en) | 2014-07-10 | 2016-01-14 | Solazyme, Inc. | Novel ketoacyl acp synthase genes and uses thereof |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4771002A (en) * | 1984-02-24 | 1988-09-13 | Lubrizol Genetics, Inc. | Transcription in plants and bacteria |
| US4801540A (en) * | 1986-10-17 | 1989-01-31 | Calgene, Inc. | PG gene and its use in plants |
| GB8927048D0 (en) * | 1989-11-30 | 1990-01-31 | Ici Plc | Dna,constructs,cells and plants derived therefrom |
| NZ224787A (en) * | 1987-05-26 | 1990-08-28 | Calgene Inc | A dna construct for specifically modifying the phenotype of fruit as distinct from other plant tissue |
| EP0319353B1 (en) * | 1987-10-20 | 1996-10-02 | Plant Genetic Systems N.V. | A process for the production of biologically active peptide via the expression of modified storage seed protein genes in transgenic plants |
| DE3810286A1 (de) * | 1988-03-25 | 1989-10-12 | Max Planck Gesellschaft | Transgene pflanze mit modifizierter physiologie, morphologie und modifiziertem hormonmetabolismus, gewebekulturen dieser pflanze und verfahren zu ihrer herstellung |
| WO1989012386A1 (en) * | 1988-06-21 | 1989-12-28 | Calgene, Inc. | Methods and compositions for altering physical characteristics of fruit and fruit products |
| EP0428572A1 (en) * | 1988-07-29 | 1991-05-29 | Washington University School Of Medicine | Producing commercially valuable polypeptides with genetically transformed endosperm tissue |
| AU638438B2 (en) * | 1989-02-24 | 1993-07-01 | Monsanto Technology Llc | Synthetic plant genes and method for preparation |
| AU644619B2 (en) * | 1989-12-21 | 1993-12-16 | Advanced Technologies (Cambridge) Limited | Modification of plant metabolism |
| EP0462065B1 (de) * | 1990-06-15 | 2005-03-02 | Syngenta Participations AG | Neue Signalsequenzen |
-
1990
- 1990-02-13 DE DE4004800A patent/DE4004800C2/de not_active Expired - Lifetime
-
1991
- 1991-02-06 IL IL97157A patent/IL97157A0/xx unknown
- 1991-02-08 EP EP19910250035 patent/EP0442592A3/de not_active Withdrawn
- 1991-02-08 AU AU70898/91A patent/AU650639B2/en not_active Ceased
- 1991-02-11 CA CA002036103A patent/CA2036103A1/en not_active Abandoned
- 1991-02-12 HU HU68/91A patent/HU218048B/hu not_active IP Right Cessation
- 1991-02-13 IE IE048091A patent/IE910480A1/en not_active Application Discontinuation
- 1991-02-13 JP JP01998491A patent/JP3288395B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1993
- 1993-11-23 US US08/156,876 patent/US5436394A/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| Ｃｅｌｌ．Ｖｏｌ．４８，Ｎｏ．５（１９８７）ｐ．８７５−８８５ |
| Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｓｕｐｐｌ．１３ｐａｒｔＤ（１９８９）ｐ．２３０ |
| Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１０８，Ｎｏ．２（１９８９）ｐ．３２７−３３７ |
| Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．１，Ｎｏ．１（１９８９）ｐ．９５−１０４ |
| Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．１，Ｎｏ．３（１９８９）ｐ．３８１−３９０ |
| Ｐｌａｎｔａ，Ｖｏｌ．１７９，Ｎｏ．２（１９８９）ｐ．１７１−１８０ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HUT58810A (en) | 1992-03-30 |
| AU7089891A (en) | 1991-08-15 |
| CA2036103A1 (en) | 1991-08-14 |
| HU218048B (hu) | 2000-05-28 |
| AU650639B2 (en) | 1994-06-30 |
| IE910480A1 (en) | 1991-08-14 |
| JPH0549482A (ja) | 1993-03-02 |
| HU910468D0 (en) | 1991-08-28 |
| EP0442592A3 (en) | 1992-05-27 |
| DE4004800C2 (de) | 2000-12-21 |
| EP0442592A2 (de) | 1991-08-21 |
| IL97157A0 (en) | 1992-05-25 |
| US5436394A (en) | 1995-07-25 |
| DE4004800A1 (de) | 1991-08-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3288395B2 (ja) | プラスミド、トランスジェニック植物の製法、トランスジェニック植物、及び特異ｄｎａ配列を含有する植物細胞もしくは植物 | |
| US9756871B2 (en) | TAL-mediated transfer DNA insertion | |
| CA2006454C (en) | Potatoe tuber specific transcriptional regulation | |
| JP4101304B2 (ja) | フルクトシルポリメラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子 | |
| US20140363561A1 (en) | Tal-mediated transfer dna insertion | |
| AU645302B2 (en) | Plasmids containing DNA sequences that bring about changes in the carbohydrate and protein concentration and the carbohydrate and protein composition in plants, and plant cells and plants containing those plasmids | |
| JP3431177B2 (ja) | 習性及び収量において変更されたトランスジェニック植物を作製するプラスミド | |
| AU715002B2 (en) | Transgenic plants with improved biomass production | |
| KR100275200B1 (ko) | 씨4 식물의 광합성 효소를 발현하는 씨3 식물 | |
| AU734951B2 (en) | Processes for increasing the yield in plants | |
| US5917127A (en) | Plasmids useful for and methods of preparing transgenic plants with modifications of habit and yield | |
| US5723757A (en) | Plant promoters specific for sink organ expression of genes | |
| US6025544A (en) | Processes for modifying plant flowering behavior | |
| AU2001276398B2 (en) | Transgenic plants which produce isomalt | |
| US20040168214A1 (en) | Process for increasing the yield in plants by expressing stably integrated recombinant polypeptides | |
| MXPA00001296A (en) | Processes for increasing the yield in plants | |
| CZ2000451A3 (cs) | Způsob zvýšení výnosů rostlin |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |