CN106574255A - 酮脂酰acp合酶基因及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及KASI/KASIV型的β‑酮脂酰ACP合酶基因和由这些基因编码的蛋白质。这些基因可以包括在核酸构建体、载体或宿主细胞中。基因产物的表达可以改变宿主细胞的脂肪酸谱。可以将KAS基因与FATA或FATB硫酯酶基因组合以产生生产增加量的C8‑C16脂肪酸的细胞。合适的宿主细胞包括植物或微藻的质体细胞。披露了具有这些新基因的产油微藻宿主细胞。

Description

酮脂酰ACP合酶基因及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年7月10日提交的美国临时专利申请号62/023,112和2014年11月18日提交的美国临时专利申请号62/081,143在35U.S.C.119(e)下的权益，所述文献各自通过引用以其全文结合在此。本申请包括与于2014年7月10日提交的名称为“定制油(Tailored Oils)”的美国临时专利申请号62/023,109(代理人案卷号057518-448593)中披露的主题相关的主题，将该申请出于所有目的通过引用以其全文特此结合。
序列表的引用
本申请包括在详细说明的最后所显示的序列表。
技术领域
本发明涉及新颖的β-酮脂酰ACP合酶基因和用于使用这些基因的方法，该方法包括在产油宿主细胞中表达这些基因以产生具有改变的脂肪酸谱的甘油三酸酯。
背景
某些有机体(包括植物和一些微藻)使用II型脂肪酸生物合成途径，该途径表征为使用离散的酶在多聚复合物中用于脂肪酸合成。相比之下，哺乳动物和真菌使用一种单一的大的多功能蛋白。
在使用II型脂肪酸生物合成途径的生物体中，β-酮脂酰-ACP合酶I(KAS I，EC2.3.1.41)是负责将长度为从4至16个碳原子的越来越多的中链脂肪酰基-ACP延长的酶之一。KAS I使用C2-C14酰基-ACP作为用于与衍生自丙二酰基-ACP的C2单元缩合的底物。KASIV是一种具有类似的延长功能的相关酶。因此，KASI和KASIV两者都可以被认为是KASI样酶。
此类基因已经使用重组DNA技术引入植物。参见例如US 7301070、US 6348642、US6660849、US 6770465和US 2006/0094088(其中194-200和该文献的全部内容通过引用并入本文)。在质体细胞如来自植物、巨藻和微藻的质体细胞中，KAS I样酶与脂肪酸合成(FAS)途径的其他酶一起位于叶绿体或其他质体中。
PCT公开案WO 2010/063032、WO 2011/150411、WO 2012/106560、和WO 2013/158938披露了产油微藻的遗传工程化，包括将外源FAS基因产物靶向到微藻质体中。
概述
在一个方面，本发明的实施例包括非天然的、分离的多核苷酸或该多核苷酸的互补体，该多核苷酸由于遗传密码的简并性与SEQ ID NO:21-37、或39-55中任一项具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列一致性或具有其等价序列，或该多核苷酸编码与SEQ ID NO:2-18、62-72中任一项具有至少80％、85％、85.5％、86％、86.5％、87％、87.5％、88％、88.5％、89％、89.5％、90％、90.5％、91％、91.5％、92％、92.5％、93％、93.5％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％或99.5％氨基酸序列一致性的KASI样蛋白，或由其产生的成熟蛋白。
在另一个方面，本发明的实施例包括包含cDNA分子的转化载体，该cDNA分子包括如以上讨论的多核苷酸。在一些情况下，该载体包括可操作地连接到cDNA的启动子和3'UTR序列、和任选地用于同源重组的侧翼序列。启动子或3’UTR序列是异源核苷酸序列。异源启动子或异源3'UTR序列可来自与最早从其中获得编码KAS的核苷酸序列的生物体不同的生物体。
在一个方面，该转化载体包括获得自最早从其中分离出KAS基因的相同生物体的异源启动子或异源3'UTR序列。当启动子序列、3’UTR序列和KAS核苷酸序列来自相同生物体时，异源启动子不天然驱动KAS的表达，并且3'UTR不天然存在于源生物体中的KAS核苷酸序列的下游。
在又另一个方面，转化载体用于在最早从其中分离出KAS基因的生物体中表达KAS基因。当KAS基因在最早从其中分离出KAS基因的生物体中重组表达时，该基因在与KAS基因的天然染色体基因座不同的染色体基因座中表达。可替代地，KAS基因在细胞质中表达。
在另一个方面，本发明的实施例包括宿主细胞，该宿主细胞包括以上讨论的多核苷酸和/或载体，并且表达由cDNA编码的功能性KAS蛋白。在一些情况下，宿主细胞还包括编码功能性FATA酰基-ACP硫酯酶或FATB酰基-ACP硫酯酶的外源基因。在一个方面，FATB酰基-ACP硫酯酶与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:57中任一项具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％氨基酸序列一致性。在一些情况下，该宿主细胞产生由具有如下各项的脂肪酸谱表征的细胞油：(i)至少30％、40％、50％、或55％C14:0，(ii)至少7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、或14％C8:0，(iii)针对C8:0和C10:0的总和至少10、15、20、25、30、或35面积％，或(iv)在2.2-2.5、2.5-3.0、或3.0-3.4范围内的C8/C10比率。在一些情况下，宿主细胞是具有II型脂肪酸生物合成途径的质体产油细胞。在一些情况下，宿主细胞是微藻。在一些情况下，宿主细胞属于四胞藻纲(Trebouxiophyceae)，并且任选地属于小球藻属(Chlorella)或无绿藻属(Prototheca)。在一些情况下，微藻属于物种桑椹型无绿藻(Prototheca moriformis)。
在另一个方面，本发明的实施例包括用于制备细胞油的方法，该方法包括培养如上所讨论的宿主细胞以产生细胞油，其中该油包括甘油三酸酯和微藻固醇。在一些情况下，细胞油包括由固醇谱表征的固醇，并且该固醇谱具有超过β-谷固醇的过量的麦角固醇和/或22,23-二氢菜籽固醇、多孔固醇或穿贝海绵固醇的存在。
附图简述
图1显示了与实例3相关的KASI样基因的进化树。
本发明实施方式的详细说明
如关于核酸所使用，术语“分离的”是指核酸不含典型地与天然存在的核酸一起存在的至少一种其他组分。因此，如果一种天然存在的核酸已经被纯化而远离至少一种与该核酸一起天然存在的其他组分，则它是分离的。
“细胞油”或“细胞脂肪”应当是指从有机体获得的主要含甘油三酸酯的油，其中该油未经历与另一种天然油或合成油掺混，或分馏以实质上改变该甘油三酸酯的脂肪酸谱。结合一种包含了具有特定区域特异性的甘油三酸酯的油，该细胞油或细胞脂肪未经历酯交换或其他合成工艺以致未获得该区域特异性甘油三酸酯谱，而是由一个细胞或细胞群天然地产生区域特异性。对于由细胞产生的细胞油或细胞脂肪而言，油的固醇谱通常通过细胞产生的固醇来确定，而不是通过添加固醇以便模拟该细胞油进行该油的人工重建来确定。结合细胞油或细胞脂肪，并且如本披露通篇总体上所使用，术语油和脂肪可互换地使用，除非另作注释。因此，“油”或“脂肪”取决于该物质的组成和其他条件，在室温下可以是液体、固体或部分固体的。在此，术语“分馏”表示以相对于由有机体所产生的谱而改变其脂肪酸谱的方式来从该油去除物质，不管用何种方法完成。术语“细胞油”和“细胞脂肪”包括如从有机体获得的油，其中该油已经历最低限度的不实质上改变其甘油三酸酯谱的加工，包括精炼、漂白和/或脱胶。细胞油还可以是“非酯交换的细胞油”，表示该细胞油未经历这样一种加工，其中脂肪酸与甘油的酰基连接被重新分布且基本上保持了与从有机体中回收时相同的构型。
“外源基因”应当是指已经被引入到细胞中(例如通过转化/转染)的编码RNA和/或蛋白质的表达的一种核酸，并且还被称为“转基因”。包含外源基因的细胞可以被称为重组细胞，可以向其中引入另外的外源基因。相对于正在转化的细胞，外源基因可以来自不同的物种(并因此是异源的)，或来自相同的物种(并因此是同源的)。因此，外源基因相对于该基因的内源拷贝，可以包括占据了细胞基因组中不同位置或处于不同控制下的同源基因。外源基因可以在细胞中以多于一个副本存在。外源基因可以在细胞中例如作为基因组(核或质体)中的插入物或作为游离型分子而维持。
“脂肪酸”应当表示游离脂肪酸、脂肪酸盐、或甘油脂中的脂肪酰基部分。应理解的是，甘油脂的脂肪酰基可以根据甘油三酸酯水解或皂化时产生的羧酸或羧酸阴离子来描述。
“微藻”是含有叶绿体或其他质体并且任选地能够进行光合作用的微生物有机体，或能够进行光合作用的原核微生物有机体。微藻包括不能代谢固定碳源作为能量的专性光能自养生物，以及能够仅以固定碳源为生的异养生物。微藻包括细胞分裂后不久与姊妹细胞分开的单细胞有机体，如衣藻属，连同微生物，例如像，团藻属，它是两种不同细胞类型的简单多细胞光合性微生物。微藻包括细胞例如小球藻属、杜氏藻属(Dunaliella)和无绿藻属。微藻还包括了展现出细胞-细胞粘附的其他微生物光合有机体，例如阿格门氏藻属(Agmenellum)、鱼腥藻属、以及桑椹藻属(Pyrobotrys)。微藻还包括专性异养微生物，它们已经丧失进行光合作用的能力，如某些双鞭甲藻属(dinoflagellate)藻类物种和无绿藻属物种。
“产油”细胞是能够天然地或通过重组或经典品系改良而产生以干细胞重量计至少20％的脂质的一种细胞。“产油微生物(oleaginous microbe)”或“产油微生物(oleaginous microorganism)”是一种微生物，包括产油的微藻。
在两个或更多个氨基酸或核酸序列的背景下，术语“序列一致性百分比”是指如使用序列比较算法或通过目测进行测量，当比较和比对最大对应性时，两个或更多个序列或子序列是相同的或具有指定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸。关于确定核苷酸或氨基酸一致性百分比的序列比较，典型地以一个序列作为参比序列，将测试序列与之进行比较。当使用序列比较算法时，把测试序列和参比序列输入计算机中，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。基于指定的程序参数，序列比较算法随后相对于参比序列计算检验序列的序列一致性百分比。用于比较的序列的最佳比对可以使用设置为默认参数的NCBIBLAST软件(ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)进行。例如，为了比较两个核酸序列，可以使用blastn与设置为以下默认参数的“BLAST 2序列”工具版本2.0.12(2000年4月21日)：矩阵：BLOSUM62；匹配加分：1；错配罚分：-2；开放空位：5个罚分和延伸空位：2个罚分；空位x下降(drop-off)：50；期望：10；字长：11；滤波器：开。对于两个氨基酸序列的成对比较，可以使用“BLAST 2序列”工具版本2.0.12(2000年4月21日)与blastp设置，例如，设置为以下默认参数：矩阵：BLOSUM62；开放空位：11个罚分和延伸空位：1个罚分；空位x下降50；期望：10；字长：3；滤波器：开。
当对具有一对外源基因的品系给出多个序列一致性时，这涵盖序列一致性的所有组合。例如，与基因A具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的编码第一蛋白的第一基因和与基因A具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的编码第二蛋白的第二基因的共表达应理解为涵盖(i)与基因A具有至少85％一致性和与基因B具有至少85％一致性，(ii)与基因A具有至少85％一致性和与基因B具有至少99％一致性，(iii)与基因A具有至少92％一致性和与基因B具有至少95％一致性，和所有其他组合。
结合细胞油，“谱”是在该油内甘油三酸酯或脂肪酰基的特定种类的分布。“脂肪酸谱”是在不参考与甘油主链的连接的情况下，该油的甘油三酸酯中脂肪酰基的分布。脂肪酸谱典型地是通过转化成脂肪酸甲酯(FAME)，随后进行气相色谱(GC)分析与火焰离子化检测(FID)来确定。脂肪酸谱可以表示为由一种脂肪酸的曲线下面积测定的总脂肪酸信号中该脂肪酸的一个或多个百分比。FAME-GC-FID测量值近似为这些脂肪酸的重量百分含量。
如在此所使用，如果相对于非富含油，在一种油中一种或多种特定脂肪酸的质量增加至少10％，则将该油说成“富含”该脂肪酸。例如，在表达在此描述的异源FatB基因的细胞的情况下，如果例如C8和C16脂肪酸在由该细胞产生的油中的质量比由相同类型的不表达该异源FatB基因的细胞产生的油(例如，野生型油)中的质量大至少10％，则将该油说成富含这些脂肪酸。
“重组体”是因引入外源核酸或改变天然核酸而已经被修饰的细胞、核酸、蛋白质或载体。因而，例如，重组(宿主)细胞可以表达在天然(非重组)形式的细胞内部找不到的基因，或以与非重组细胞表达这些基因不同的方式表达天然基因。重组细胞可以但不限于包括编码基因产物或抑制元件(如降低细胞中的活性基因产物的水平的突变、敲除、反义、干扰RNA(RNAi)或dsRNA)的重组核酸。“重组核酸”是最初在体外形成(总的来说，通过操作核酸，例如使用聚合酶、连接酶、核酸外切酶及核酸内切酶)、使用化学合成的核酸，或另外地呈通常未见于自然界中的形式。可以产生重组核酸，例如，以使两个或更多个核酸处于可操作连接。因此，出于本发明的目的，通过连接通常在自然界中不接合的DNA分子而由核在体外形成的分离的核酸或表达载体均被认为是重组体。还可以按其他方式产生重组核酸；例如，使用化学DNA合成。一旦重组核酸被制备并且导入到宿主细胞或生物中，它可以使用该宿主细胞的体内细胞机器来复制；然而，此类核酸一旦被重组产生，即使随后经细胞内复制，出于本发明的目的仍然被视为重组的。类似地，“重组蛋白”是使用重组技术，即，通过表达重组核酸所产生的蛋白质。
“KAS I样”基因或酶应意指KAS I或KAS IV基因或酶。
本发明的实施例涉及从植物或其他生物体分离的KASI样基因的用途，这些基因可在转基因宿主细胞中表达以改变由宿主细胞产生的细胞油的脂肪酸谱。尽管使用微藻桑椹型无绿藻来筛选这些基因改变脂肪酸谱的能力，但是发现的这些基因在已知遗传转化技术的多种宿主细胞中也是有用的。例如，这些基因可以在细菌、蓝藻细菌、其他真核微藻或高等植物中表达。根据美国专利号US 7301070、US 6348642、US 6660849和US 6770465中披露的方法，这些基因可以在高等植物中表达。我们已经发现KASI样转基因可以单独使用或与FatB转基因(编码活性酰基-ACP硫酯酶)组合使用，可以提高中链脂肪酸(例如癸酸、辛酸、月桂酸、肉豆蔻酸或棕榈酸)在细胞油的脂肪酸谱中的水平。在宿主细胞中将外源KASI样基因与外源FATA或FATB基因组合可以给出大于单独外源基因的中链脂肪酸和/或长链脂肪酸(例如，硬脂酸或油酸)的水平。细胞油的脂肪酸可以进一步经合成或经生物合成转化为甘油三酸酯、脂肪醛、脂肪醇和其他油脂化学品。
在具体实施例中，甘油三酸酯由表达新颖KASI样基因(来自新颖cDNA和/或在异源启动子控制下)的宿主细胞产生。可以从宿主细胞回收细胞油。通常，细胞油主要包括甘油三酸酯和固醇。可以将细胞油精炼、脱胶、漂白和/或除臭。处于其未加工的或加工形式的油可以用于食品、化学品、燃料、化妆品、塑料以及其他用途。在其他实施例中，KASI样基因可以不是新颖的，但是该基因在微藻中的表达是新颖的。
这些KAS基因可以用于多种遗传构建体(包括质粒或其他载体)中，以用于在宿主细胞中表达或重组。这些基因可以被密码子优化以用于在靶宿主细胞中表达。这些基因可以包括在包括启动子(例如，异源启动子)和下游调节元件的表达盒中。载体可以包括用于同源重组的侧翼序列。例如，载体可以引起向宿主细胞的染色体中的插入，在该染色体中它可以稳定表达。由这些基因产生的蛋白质可以在体内或以纯化形式使用。在一个实施例中，表达盒包括同源启动子，可操作以表达表1的KASI样酶的CDS和3'UTR。3’UTR可以包括聚腺苷酸化位点。
如下文实例所述，从植物种子mRNA转录物产生的cDNA中发现了新颖的KAS基因。这些基因序列是非天然的，因为它们缺乏在mRNA剪接之前存在于植物基因和基因的mRNA转录物中的内含子。因此，本发明包括表1的分离的非天然KASI样基因。与天然基因的进一步偏离在于异源调节元件的使用和在宿主细胞中的表达，因此这样的基因在自然界中不存在。
例如，可以在包含可操作连接的启动子和5’UTR的表达载体中制备该基因。当质体细胞用作宿主时，适当活性的质体靶向肽(以下还称为“转运肽”)可以与KASI样基因融合，如下文实例所述。所披露的基因包括疏水性N-末端质体靶向序列，其可以替换为可替代的靶向序列并且长度可变。改变质体靶向肽可以改进给定宿主细胞类型的细胞定位和酶活性。因此，本发明考虑了缺失以及融合蛋白，以便优化给定宿主细胞中的酶活性。例如，可以使用来自宿主或相关物种的转运肽替代在此描述的新发现的植物基因的转运肽。只要保持酶活性，可以制备另外的末端或内部缺失。靶向肽可被宿主细胞切割以产生缺乏靶向肽的成熟KASI样蛋白。
选择性标记基因可以被包括在载体中，以帮助分离转化的细胞。用于微藻的选择性标记的实例包括蔗糖转化酶，α半乳糖苷酶(用于针对蜜二糖的选择)和抗生素抗性基因。
还可以使用披露的基因序列制备反义或抑制性RNA(例如，RNAi或发夹RNA)，以在植物或其他有机体中抑制互补基因。例如，利用表1的基因序列的知识，人们可以工程化具有相同或相似KASI样基因的植物以表达RNAi构建体，进行基因敲除、点突变等，并且从而降低植物种子的KASI或KASIV活性。结果，植物可以产生具有改变的脂肪酸谱的油，其中减少或增加了平均链长，这取决于其他脂肪酸合成基因的存在。
发现可用于在细胞中产生所希望的脂肪酸谱的KASI样基因/蛋白总结在下表1中，并且从转录物测序(如实例1-2)中发现的相关蛋白质示于表1a中。可以使用具有SEQ IDNO:2-18、59、62-72、21-37或39-55的序列的核酸或蛋白质改变重组细胞的脂肪酸谱。也可以使用变体核酸；例如与SEQ ID NO:21-37或39-55具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的变体。考虑了针对多种宿主有机体的基因的密码子优化，同样考虑了基因片段的使用。无绿藻属品系和原始小球藻的偏好密码子分别示于表2和3中。赖特氏萼距花(Cuphea wrightii)的密码子使用示于表4中。拟南芥属(Arabidopsis)的密码子使用示于表5中；例如，可以选择每种氨基酸的最偏好密码子。其他有机体(包括微藻和高等植物)的密码子表在本领域是已知的。在一些实施例中，使用第一和/或第二最偏好无绿藻属密码子进行密码子优化。在特定实施例中，根据如表2至3b所述的无绿藻属、小球藻属、赖特氏萼距花或拟南芥属中的最偏好密码子使用，将包含在以下序列表中的新颖的氨基酸序列转化成核酸序列或与那些得到的核酸序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的核酸序列。例如，可以通过用根据表2的最偏好密码子取代至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的所有密码子，将KASI样基因针对桑椹型无绿藻进行密码子优化。同样，可以通过用根据表3的最偏好密码子取代至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的所有密码子，将KASI样基因针对原始小球藻进行密码子优化。可替代地，可以通过用根据表2或3的第一或第二最偏好密码子取代至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的所有密码子，将KASI样基因针对原始小球藻或桑椹型无绿藻进行密码子优化。密码子优化的基因是非天然存在的，因为它们被优化用于在宿主生物体中表达。
在某些实施例中，可以通过使用全长核酸序列(例如，SEQ ID NO:21-37或39-55之一)或全长氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:2-18之一)作为参比序列并将全长测试序列与该参比序列进行比较来计算以上讨论的核酸或蛋白的变体的序列一致性百分比。针对片段，可以在片段的整个长度上计算核酸或蛋白质片段变体的序列一致性百分比。在某些实施例中，存在与SEQ ID NO:21-37、39-55或2-18之一具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％序列一致性的核酸或蛋白片段。
任选地，可以将质体靶向肽与另一种肽交换，该另一种肽用于将KASI样酶运输至合成质体宿主细胞的脂肪酸合成质体。因此，在本发明的各个实施例中，转基因或转基因宿主细胞包括质体靶向序列和酶-结构域序列(缺失转运肽后剩余的序列)的核苷酸或相应的肽融合物，其中成熟蛋白与表1或表1a中所列的成熟蛋白质序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性。质体转运/靶向肽在随附的非正式序列表中是加下划线的。靶向肽的实例包括表1的那些和本领域已知的其他，特别是与将KAS I、KAS II、KAS III、FATA、FATB和SAD(硬脂酰基-ACP去饱和酶)基因产物靶向叶绿体或植物和微藻的其他质体相关的那些。参见，PCT公开物WO 2010/063032、WO 2011/150411、WO 2012/106560、和WO 2013/158938中给出的绿藻门(Chorophyta)的实例。任选地，与已知的截短序列相反，KASI样基因编码450、475或500个氨基酸或更多(具有或不具有转运肽)，或约555个残基(具有转运肽)。
表1.KASI样基因：用于测试与FATB转基因组合的基因的表达盒在SEQ ID NO:38中给出(即，用表1的各种其他编码序列取代SEQ ID NO:38的Cpal KASIV编码序列)，除了使用SEQ ID NO:61的表达盒测试细叶萼距花(Cuphea hookeriana)KASIV外。参见实例1-4。
表1a.由从种子的转录物谱分析发现的cDNA编码的另外的蛋白质。编码序列可以源自各种宿主细胞的密码子表。
表2.无绿藻属品系中的密码子使用
表3.原始小球藻中偏好密码子使用
错误！不能通过编辑域代码创建对象。
表4：赖特氏萼距花的密码子使用(密码子、氨基酸、频率、千分率、数量)
表5：拟南芥属的密码子使用(密码子、氨基酸、频率、千分率)
基因组合
在一个实施例中，表1的基因/基因产物在宿主细胞中与外源FATA或FATB酰基-ACP硫酯酶基因共表达。在一个具体的实施例中，FATB基因产物与湿地萼距花FATB2(“CpalFATB2”，登录号AAC49180，SEQ IDNO:1)或细叶萼距花FATB2(“Ch FATB2”，登录号U39834，SEQ ID NO:57)或其片段具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％或99％的氨基酸序列一致性。任选地，FATB基因产物与湿地萼距花FATB2(“Cpal FATB2”，登录号AAC49180，SEQ ID NO:1)或细叶萼距花FATB2(“ChFATB2”，登录号U39834，SEQ ID No:57)的非转运肽结构域具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％或99％的氨基酸序列一致性。
FATA基因编码优先但不排他地以对C18:1的最高活性水解长链脂肪酸的酶。FATB基因编码一组具有更多种异质底物特异性，但通常对饱和脂肪酸显示更高的活性的酶。FATB酶的底物特异性是非常异质的；存在许多对C18:0和C18:1显示高活性的FATB酶。FATA和FATB酶通过水解酰基部分和酰基载体蛋白(ACP)之间的硫酯键来终止脂肪酸的合成。
在一个实施例中，转化宿主细胞以表达FATA或FATB和KASI样转基因两者。宿主细胞产生细胞油。总之，表达FATA或FATB和KASI样基因以产生它们各自的基因产物，并且从而改变细胞油的脂肪酸谱。这两个基因相对于缺乏两个基因之一的对照品系附加或协同地起作用。任选地，宿主细胞是产油的，并且可以是产油真核微藻，如上文或下文所述的那些。细胞油的脂肪酸谱可以富含(相对于适当的对照)C14:0(肉豆蔻酸)、C8:0、C10:0或C8/C10的组合。
在一个实施例中，细胞的脂肪酸谱富含C14:0脂肪酸。在该实施例中，FATB基因表达与SEQ ID NO:1的酶具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、或99％氨基酸序列一致性百分比的氨基酸一致性的酰基ACP硫酯酶。共表达的KASI样基因编码β-酮脂酰ACP合酶，该β-酮脂酰ACP合酶与SEQ IDNO:2的酶具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％或99％的氨基酸序列一致性百分比的氨基酸一致性。可替代地，共表达的KASI样基因编码β-酮脂酰ACP合酶，该β-酮脂酰ACP合酶与SEQ ID NO:7的酶具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％或99％的氨基酸序列一致性百分比的氨基酸一致性。任选地，细胞油具有以至少10％、20％、30％、40％、50％或至少55％C14:0(FAME-GC-FID的面积％)表征的脂肪酸谱。
在另一个实施例中，细胞的脂肪酸谱富含C8:0和/或C10:0脂肪酸。在该实施例中，FATB基因表达与SEQ ID NO:57的酶具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、或99％氨基酸序列一致性百分比的氨基酸一致性的酰基ACP硫酯酶。共表达的KASI样基因编码β-酮脂酰ACP合酶，该β-酮脂酰ACP合酶与SEQ ID NO:2、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、19、37之一的酶具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％或99％的氨基酸序列一致性百分比的氨基酸一致性。在相关实施例中，共表达的KASI样基因编码β-酮脂酰ACP合酶，该β-酮脂酰ACP合酶与SEQ ID NO:2、8、11、12、13、14、或15之一的酶具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％或99％的氨基酸序列一致性百分比的氨基酸一致性。任选地，细胞油具有以至少7、8、9、10、11、12、13、或14面积％C8:0(通过FAME-GC-FID)表征的脂肪酸谱。任选地，细胞油具有由至少10、15、20、25、30、或35面积％C8:0和C10:0脂肪酸总和(通过FAME-GC-FID)表征的脂肪酸谱。任选地，细胞油的C8/C10比率在2.2-2.5、2.5-3.0、或3.0-3.4的范围内。
任选地，通过这些方法产生的油可以具有与下述那些相符的固醇谱。
宿主细胞
宿主细胞可以是单个细胞(例如，微藻、细菌、酵母)或多细胞有机体(如植物或真菌)的一部分。用于在植物中表达KASI样基因的方法给出于US 7301070、US 6348642、US6660849、和US 6770465中，或可以使用通常在植物生物技术中已知的其他技术完成。包括真核微藻(例如，属于绿藻门)的真核产油微生物的工程化披露于WO 2010/063032、WO2011/150411、和WO 2012/106560以及以下实例中。
产油宿主细胞的实例包括具有II型脂肪酸生物合成途径的植物细胞和微生物细胞，包括质体产油细胞，如产油藻类的那些。微藻细胞的具体实例包括绿藻门、四胞藻纲、小球藻目或小球藻科的异养或专性异养真核微藻。真核产油微藻宿主细胞的实例提供于公开的PCT专利申请WO 2008/151149、WO 2010/06032、WO 2011/150410及WO 2011/150411中，包括小球藻属和无绿藻属(一种包括专性异养生物的属)的物种。产油细胞可以例如能够产生以细胞重量计25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％或约90％的油，±5％。任选地，所产生的油可以具有较少的DHA或EPA脂肪酸。举例来说，这些油可以包含不到5％、2％或1％的DHA和/或EPA。以上提到的公开物还披露了用于培养这些细胞并提取油(尤其是从微藻细胞提取)的方法；这些方法适用于在此披露的细胞并且针对这些传授内容通过引用来结合。当使用微藻细胞时，可以将它们自养地培养(除非是专性异养生物)或在黑暗中使用糖(例如，葡萄糖、果糖和/或蔗糖)培养。当异养培养时，细胞和细胞油可以包括小于200ppm、20ppm、或2ppm的产色杂质或叶绿素。在此所描述的实施例的任一个中，这些细胞可以是包含外源转化酶基因的异养细胞，以便使这些细胞能够从蔗糖原料中生产油。作为替代方案，或此外，这些细胞可以由纤维素原料代谢木糖。举例来说，这些细胞可以被遗传工程改造成表达一个或多个木糖代谢基因，如编码活性木糖转运蛋白、木酮糖-5-磷酸转运蛋白、木糖异构酶、木酮糖激酶、木糖醇脱氢酶及木糖还原酶的那些。参见2012年11月15日公开的WO 2012/154626，“经过遗传工程改造的代谢木糖的微生物(GENETICALLY ENGINEEREDMICROORGANISMS THAT METABOLIZE XYLOSE)”。细胞可以在解聚的纤维素原料如酸或酶水解的甘蔗渣、甜菜浆、玉米秸秆、木屑、锯屑或柳枝稷上培养。任选地，可以在包括葡萄糖和至少5％、10％、20％、30％或40％木糖的解聚的纤维素原料上培养细胞，同时产生按干重计至少20％脂质。任选地，脂质包括具有由至少10％、15％或20％C12:0表征的脂肪酸谱的甘油三酸酯。
任选地，宿主细胞包括与SEQ ID NO:58具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％核苷酸序列一致性的23S rRNA。
油及相关产品
产油细胞表达一个或多个编码脂肪酸生物合酶的外源基因。因此，一些实施例的特征在于从非植物或非种子油无法获得或根本无法获得的细胞油。
产油细胞产生一种储存油，该油主要是三酰甘油酯并且可以被储存在细胞的储存体中。可以通过破坏细胞并分离出油来从细胞中获得粗油。WO 2008/151149、WO 2010/06032、WO 2011/150410及WO 2011/1504披露了异养培养和油分离技术。例如，可以通过培养、干燥并压榨这些细胞来获得油。如种子油领域中所知或如WO 2010/120939中所描述的，所产生的细胞油可以进行精炼、漂白并除臭(RBD)。精制步骤可以包括脱胶。粗油、精炼油或RBD油可以被用于多种食品、化学品或工业产品或工艺中。在回收油之后，有价值的残留生物质保留下来。残留生物质的用途包括制造纸、塑料、吸收剂、吸附剂、作为动物饲料、用于人类营养或用于肥料。
在此处给出甘油三酸酯(又称为“三酰甘油酯”或“TAG”)细胞油的脂肪酸谱的情况下，应了解的是，这是指从细胞提取的储存油的未分馏样品，该样品在已经去除磷脂的条件下或用实质上对磷脂的脂肪酸不敏感的分析方法(例如，使用色谱法和质谱法)进行分析。该油可以经历RBD工艺以去除磷脂，游离脂肪酸和气味对于该油中甘油三酸酯的脂肪酸谱仅具有微小或可忽略的改变。由于这些细胞是产油的，故在一些情形中，储存油将构成该细胞中全部TAG的大部分。
稳定碳同位素值δ13C是相对于标准品(例如PDB，来自美国南卡罗来纳州皮迪组(Peedee formation)的美洲箭石的化石骨架的天然焦)的13C/12C的比率的一种表示。油的稳定碳同位素值δ13C(0/00)可以与所用原料的δ13C值相关。在一些实施例中，这些油衍生自异养地生长于衍生自C4植物(如玉米或甘蔗)的糖上的产油有机体。在一些实施例中，油的δ13C(0/00)是从-10到-170/00或从-13到-160/00。
根据以上方法生产的油在一些情形中是使用微藻宿主细胞制造。如上所述，微藻可以是，但不限于，属于绿藻门，四胞藻纲，小球藻目，小球藻科或绿藻纲的分类中的真核微藻。已经发现，四胞藻纲的微藻基于其固醇谱而可以与植物油相区别。发现由原始小球藻(桑椹型无绿藻的近亲)产生的油产生固醇，当通过GC-MS检测时，这些固醇似乎是菜籽固醇、麦角固醇、菜油固醇、豆固醇、或β-谷固醇。然而，据信由小球藻属产生的所有固醇都具有C24β立体化学。因此，据信检测为菜油固醇、豆固醇、或β-谷固醇的分子实际上分别是22,23-二氢菜籽固醇、多孔固醇和穿贝海绵固醇。因此，上述由微藻产生的油可以因具有C24α立体化学性的固醇的存在以及存在的固醇中C24α立体化学性的缺乏而区别于植物油。举例来说，产生的油可能包含22,23-二氢菜籽固醇，但缺乏菜油固醇；包含穿贝海绵固醇，但缺乏β-谷固醇，和/或包含多孔固醇但缺乏豆固醇。可替代地或另外地，这些油可以包含大量的Δ7-多孔固醇。
在一个实施例中，在此提供的这些油不是植物油。植物油是从植物和植物种子中提取的油。植物油可以基于其油含量而与在此提供的非植物油相区分。用于分析油含量的多种方式都可以用于确定该油的来源或在此提供的油是否掺杂了具有不同(例如植物)起源的油。该确定可以基于分析方法之一或组合来作出。这些测试包括但不限于以下各项中一种或多种的分析：游离脂肪酸、脂肪酸谱、总三酰基甘油含量、二酰基甘油含量、过氧化物值、光谱特性(例如UV吸收)、固醇谱、固醇降解产物、抗氧化剂(例如生育酚)、颜料(例如叶绿素)、d13C值及感官分析(例如，味道、气味及口感)。许多此类测试已经针对商业油进行标准化，如食品法典有关可食用脂肪和油的标准。
固醇谱分析是一种特别众所周知的用于确定有机物质的生物来源的方法。菜油固醇、β-谷固醇及豆固醇是常见的植物固醇，其中β-谷固醇是一种主要的植物固醇。举例来说，在某些种子油的分析中发现β-谷固醇是最丰富的，在玉米种接近64％，在油菜籽中为29％，在向日葵中为64％，在棉籽中为74％，在大豆中为26％并且在橄榄油中为79％(古尔(Gul)等人，《细胞和分子生物学杂志》(J.Cell and Molecular Biology)5:71-79,2006)。
从桑椹型无绿藻品系UTEX1435分离的油单独地被澄清(CL)，精炼并漂白(RB)，或精炼，漂白并除臭(RBD)并且根据JAOCS第60卷，第8期，1983年8月中所描述的程序针对固醇含量进行测试。分析结果示于下表6(以mg/100g为单位)。
表6.微藻油中的固醇。
这些结果显示出三个显著特征。第一，发现麦角固醇是所有固醇中最丰富的，占总固醇约50％或更高。麦角固醇的量大于菜油固醇、β-谷固醇以及豆固醇组合的量。麦角固醇是常见于真菌中的类固醇并且不常见于植物中，并且它的特别大量的存在用作非植物油的有用标记物。第二，发现该油含有菜籽固醇。除油菜籽油外，菜籽固醇不常见于基于植物的油中。第三，发现存在小于2％的β-谷固醇。β-谷固醇是通常不在微藻中发现的一种主要的植物固醇，并且其特别大量存在充当了植物来源的油的有用标记。总之，已经发现桑椹型无绿藻品系UTEX1435以总固醇内含物的百分含量计含有大量的麦角固醇和仅痕量的β-谷固醇。因此，麦角固醇:β-谷固醇的比率或与菜籽固醇的存在组合可以被用于将这一油与植物油相区分。
在一些实施例中，在此提供的油的油内含物以占总固醇的百分含量计含有低于20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的β-谷固醇。在其他实施例中，该油不含有β-谷固醇。
在一些实施例中，该油不含以下各项中的一种或多种：β-谷固醇、菜油固醇或豆固醇。在一些实施例中，该油不含有β-谷固醇、菜油固醇以及豆固醇。在一些实施例中，该油不含有菜油固醇。在一些实施例中，该油不含豆固醇。
在一些实施例中，在此提供的油的油内含物以占总固醇的百分含量计包含低于20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的24-乙基胆固-5-烯-3-醇。在一些实施例中，该24-乙基胆固-5-烯-3-醇是穿贝海绵固醇。在一些实施例中，在此提供的油的油内含物以占总固醇的百分含量计包含至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％的穿贝海绵固醇。
在一些实施例中，在此提供的油的油内含物以占总固醇的百分含量计含有低于20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的24-甲基胆固-5-烯-3-醇。在一些实施例中，该24-甲基胆甾-5-烯-3-醇是22,23-二氢菜籽固醇。在一些实施例中，在此提供的油的油内含物以占总固醇的百分含量计包含至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％的22,23-二氢菜籽固醇。
在一些实施例中，在此提供的油的油内含物以占总固醇的百分含量计含有低于20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的5,22-二烯胆固-24-乙基-3-醇。在一些实施例中，该5,22-胆甾二烯-24-乙基-3-醇是多孔固醇。在一些实施例中，在此提供的油的油内含物以占总固醇的百分含量计包含至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％的多孔固醇。
在一些实施例中，在此提供的油的油内含物含有麦角固醇或菜籽固醇或二者的组合。在一些实施例中，该油内含物以占总固醇的百分含量计含有至少5％、10％、20％、25％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或65％的麦角固醇。在一些实施例中，该油内含物以占总固醇的百分含量计含有至少25％的麦角固醇。在一些实施例中，该油内含物以占总固醇的百分含量计含有至少40％的麦角固醇。在一些实施例中，该油内含物以占总固醇的百分含量计含有至少5％、10％、20％、25％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或65％的麦角固醇与菜籽固醇的组合。
在一些实施例中，该油内含物以占总固醇的百分含量计含有至少1％、2％、3％、4％或5％的菜籽固醇。在一些实施例中，该油内含物以占总固醇的百分含量计含有低于10％、9％、8％、7％、6％或5％的菜籽固醇。
在一些实施例中，麦角固醇与菜籽固醇的比率为至少5:1、10:1、15:1或20:1。
在一些实施例中，该油内含物以占总固醇的百分含量计含有至少5％、10％、20％、25％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或65％的麦角固醇和低于20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的β-谷固醇。在一些实施例中，油内容物含有，以占总固醇的百分比计，至少25％的麦角固醇以及小于5％的β-谷固醇。在一些实施例中，油内容物进一步包括菜籽固醇。对于披露于本申请中的油或细胞油中的任一项而言，该油可以具有以上表6任一列的固醇谱，其中固醇间的变化为30％、20％、10％或更少。
固醇含有27至29个碳原子(C27至C29)并且在所有真核生物中发现。动物仅产生C27固醇，因为他们缺乏进一步修饰C27固醇以产生C28和C29固醇的能力。然而，植物能够合成C28和C29固醇，并且C28/C29植物固醇通常被称为植物固醇。给定植物的固醇谱富含C29固醇，并且植物中的主要固醇通常是C29固醇β-谷固醇和豆固醇。相比之下，非植物有机体的固醇谱含有更大百分比的C27和C28固醇。例如，真菌和许多微藻中的固醇主要是C28固醇。植物中的固醇谱并且特别是C29固醇相比C28固醇的突出优势已被用来确定土壤样品中植物和海洋物质的比例(黄，文颜(Huang,Wen-Yen)，梅恩斯尚W.G.(Meinschein W.G.)，“作为生态指示的固醇(Sterols as ecological indicators)”；地球化学与宇宙化学学报(Geochimica et Cosmochimia Acta.)，第43卷，第739-745页)。
在一些实施例中，在此提供的微藻油中的主要固醇是β-谷固醇和豆固醇以外的固醇。在微藻油的一些实施例中，C29固醇以重量计占总固醇含量的小于50％、40％、30％、20％、10％、或5％。
在一些实施例中，在此提供的微藻油含有超过C29固醇的C28固醇。在微藻油的一些实施例中，C28固醇以重量计占总固醇含量的大于50％、60％、70％、80％、90％、或95％。在一些实施例中，C28固醇是麦角固醇。在一些实施例中，C28固醇是菜籽固醇。
在本发明的实施例中，表达表1的基因中的一种或多种的产油细胞可以产生具有至少20％、40％、60％或70％的C8、C10、C12、C14或C16脂肪酸的油。在一个特定实施例中，油中的豆蔻酸(C14:0)的水平大于30％。
因此，在本发明的实施例中，存在一种用于产生油、甘油三酸酯、脂肪酸或这些物质中的任一种的衍生物的工艺，该工艺包括用在此讨论的任何核酸转化细胞。在另一个实施例中，培养转化的细胞，以产生一种油，并且任选地，提取该油。以这种方式提取的油可以用于产生食品、油脂化学品或其他产品。
以上单独或组合论述的油可用于制造食品、燃料及化学品(包括塑料、泡沫、膜、洗涤剂、肥皂等)。这些油、甘油三酸酯、来自这些油的脂肪酸可以经历C-H活化、氢氨基甲基化反应、甲氧基-碳酸化反应、臭氧分解、酶促转化、环氧化反应、甲基化反应、二聚合反应、硫醇化反应、复分解反应、氢烷基化反应、内酯化反应或其他化学过程。
提取油后，可以留下残留生物质，其可以用作燃料、用作动物饲料或用作纸、塑料或其他产品的成分。例如，来自异养藻类的残留生物质可以用于此类产品。
实例
实例1：筛选与湿地萼距花FATB2酰基-ACP硫酯酶组合的KAS基因
如WO 2013/158938，实例53(第231页)中所述构建表达密码子优化的湿地萼距花(Cpal)FATB2的桑椹形无绿藻品系。Cpal FATB2基因的氨基酸序列在SEQ ID NO:1中给出。该品系(S6336)产生由具有约38％肉豆蔻酸(C14:0)的脂肪酸谱表征的细胞油。
从种子油基因组克隆六个KASI样基因。使用液氮冷却的研钵和杵从干燥的成熟种子中提取总RNA以打开种子壁。然后用8M脲、3M LiCl溶液沉淀RNA，随后通过苯酚-氯仿萃取。使用纯化的RNA用寡dT引物产生cDNA文库，并进行下一代测序。使用具有已知KAS基因作为诱饵的BLAST从装配的转录组中鉴定新颖的KAS基因。将所鉴定的KAS基因序列进行密码子优化以在无绿藻属中表达，并合成以并入表达盒中。
为了测试对肉豆蔻酸积累的影响，将S6336用线性化质粒进行转化，该线性化质粒被设计用于在pLOOP基因座处的同源重组并且表达具有选择标志物的共表达的KASI样基因(参见WO 2013/1589380)。载体描述于SEQ ID NO 38中，在转化前将剩余的密码子优化的KAS基因替换到该载体的KAS CDS区段中。如表7所示，在樟树KASIV(D3147)、樟树KASI(D3148)、加州月桂KASI(D3150)或加州月桂(D3152)基因在S6336中表达的情况下，观察到提取的细胞油中C14:0水平的增加。C14:0水平的甚至更大的增加由来自湿地萼距花KASIV(D3145)或赖特氏萼距花KASAI(D3153)的KASI基因表达引起，其中一些个别株系产生>50％或>55％C14:0。C14产量远远超过在野生型油中发现的可忽略的量(参见表7a)。
表7.实现真核微藻油中C14脂肪酸的增加的KAS基因。
表7a.野生型桑椹型无绿藻油的脂肪酸谱(面积％)。
实例2：与细叶萼距花FATB酰基-ACP硫酯酶组合筛选KAS基因。
构建了与选自十个KASI、一个KASIII和一个线粒体KAS的KAS基因一起表达ChFATB2酰基-ACP硫酯酶的桑椹型无绿藻品系，该KAS基因是如实例1所述从种子油基因组中克隆、密码子优化并导入到无绿藻属中的。将KAS基因与每个KAS的c-末端处的HA表位TAG融合以允许蛋白质表达的确认。
表8.源自用分离自种子油基因组的KASI样基因转化表达FATB2的微藻菌株的平均C8:0-C10:0脂肪酸谱。
亲本品系是在pH5-相容的PmUAPA1启动子控制下表达细叶萼距花FATB2的稳定的微藻品系。亲本品系以2.6的C10/C8比率累积27.8％C8:0-C10:0。所有转化体源自亲本品系的pLOOP基因座处的KASI转基因的整合。针对每种KAS转基因，从至少19个单独的转化体计算平均值(NL＝未列出的)。
从表8可以看出，以下KAS基因的表达显着增加C8:0-C10:0水平：艾薇格萼距花KASIVb(D3287)、平卧萼距花KASIV(D3290)、寡瓣萼距花KASIVa(D3291)、艾薇格萼距花KASIVa(D3293)、和火红萼距花KASIVa(D3294)。重要的是，艾薇格萼距花KASIVb(D3287)的表达增加了C8:0和C10:0两者脂肪酸的积累，而在D3290、D3291、D3293和D3294表达时仅增加C10:0水平。在一些情况下，脂肪酸谱中C8:0和C10:0脂肪酸的总和为至少30％，或至少35％(通过FAME-GC-FID计算的面积％)。中链产量远远超过在野生型油中发现的可忽略的量(参见表7a)。
表8的平均C8/C10比率范围为从2.2至3.4。平均C8和C10的总和范围为从25.4至39.4。
发现的产生最高C8:0的品系是D3287，其将艾薇格萼距花KASIV与细叶萼距花FATB2组合。平均值为11.0％C8:0，范围为12.4至14.8。因此，产生具有大于14％C8的脂肪酸谱的细胞油。此外，C10/C8比率小于2.5。
实例3：KAS分支和共有序列的鉴定
将新鉴定的KASI样基因的序列与使用blast算法由爱荷华州立大学(enzyme.cbirc.iastate.edu)维持的硫酯活性酶的ThYme数据库中的那些进行比较，并提取顶部匹配记录。下载前50个BLAST匹配记录，并使用ClustalW比对算法创建多重比对，并使用具有Jukes-Cantor邻接法的比对创建进化树(图1)。在50个可能中，与仅4个ThYme KAS基因一组的新的KASIV基因进入该组内。总ThYme KAS序列减少至12，因为几乎所有ThymeKAS都与新的KAS序列离开分组。ThYme序列仅为222个残基，而新的KASIV长度为约555个残基，包括靶向肽。
鉴定了两个新的分支，分支1和分支2，由包括转运肽的共有序列SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:70表征。分支还可以分别由成熟共有蛋白SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:72的序列表征。基于与实例2中的FATB酰基-ACP硫酯酶组合的桑椹型无绿藻中的转化，分支1的KAS基因与升高的C8和C10脂肪酸的产生有关。基于与实例2中的FATB酰基-ACP硫酯酶组合的桑椹型无绿藻中的转化，分支2的KAS基因与升高的C10脂肪酸的产生有关。
虽然以上讨论披露了本发明的各种示例性实施例，但是显而易见的是，本领域技术人员可以进行各种修改以实现本发明的一些优点，而不脱离本发明的真实范围。

Claims (21)

1.一种非天然的、分离的多核苷酸或该多核苷酸的互补体，该多核苷酸由于遗传密码的简并性与SEQ ID NO:21-37、或39-55中任一项具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列一致性或具有其等价序列，或该多核苷酸编码与SEQ ID NO:2-18、62-72中任一项具有至少80％、85％、85.5％、86％、86.5％、87％、87.5％、88％、88.5％、89％、89.5％、90％、90.5％、91％、91.5％、92％、92.5％、93％、93.5％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％或99.5％氨基酸序列一致性的KASI样蛋白，或由其产生的成熟蛋白。
2.一种包括如权利要求1所述的cDNA的转化载体。
3.如权利要求2所述的载体，包括可操作地连接到cDNA的启动子和3'UTR序列，和任选地用于同源重组的侧翼序列。
4.一种宿主细胞，包括如权利要求1所述的多核苷酸和/或如权利要求2或3所述的载体。
5.如权利要求4所述的宿主细胞，其中该宿主细胞是一种具有II型脂肪酸生物合成途径的质体产油细胞。
6.如权利要求5所述的宿主细胞，其中该宿主细胞是一种微藻。
7.如权利要求6所述的宿主细胞，其中该宿主细胞属于四胞藻纲，并且任选地属于小球藻属或无绿藻属。
8.如权利要求7所述的宿主细胞，其中该微藻属于物种桑椹型无绿藻。
9.一种用于制备细胞油的方法，该方法包括培养如权利要求4至8中任一项所述的宿主细胞，以产生细胞油，其中该油包括甘油三酸酯和微藻固醇。
10.如权利要求9所述的方法，其中该细胞油包括由固醇谱表征的固醇，并且该固醇谱具有超过β-谷固醇的过量的麦角固醇和/或22,23-二氢菜籽固醇、多孔固醇或穿贝海绵固醇的存在。
11.一种宿主细胞，包括
a)一种非天然的、分离的多核苷酸或该多核苷酸的互补体，该多核苷酸由于遗传密码的简并性与SEQ ID NO:21-37、或39-55中任一项具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列一致性或具有其等价序列，或该多核苷酸编码与SEQ ID NO:2-18、62-72中任一项具有至少80％、85％、85.5％、86％、86.5％、87％、87.5％、88％、88.5％、89％、89.5％、90％、90.5％、91％、91.5％、92％、92.5％、93％、93.5％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％或99.5％氨基酸序列一致性的KASI样蛋白，或由其产生的成熟蛋白；和
b)一种编码FATA酰基-ACP硫酯酶或FATB酰基-ACP硫酯酶的非天然的、分离的多核苷酸。
12.如权利要求11所述的宿主细胞，其中该FATB酰基-ACP硫酯酶与SEQ ID NO:1或SEQID NO:57具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％氨基酸序列一致性。
13.如权利要求12所述的宿主细胞，其中该宿主细胞产生由具有如下各项的脂肪酸谱表征的细胞油：(i)至少30％、40％、50％、或55％C14:0，(ii)至少7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、或14％C8:0，(iii)针对C8:0和C10:0的总和至少10、15、20、25、30、或35面积％，或(iv)在2.2-2.5、2.5-3.0、或3.0-3.4范围内的C8/C10比率。
14.如权利要求11-13中任一项所述的宿主细胞，其中该宿主细胞是一种具有II型脂肪酸生物合成途径的质体产油细胞。
15.如权利要求14所述的宿主细胞，其中该宿主细胞是一种微藻。
16.如权利要求15所述的宿主细胞，其中该宿主细胞属于四胞藻纲，并且任选地属于小球藻属或无绿藻属。
17.如权利要求16所述的宿主细胞，其中该微藻属于物种桑椹型无绿藻。
18.如权利要求11-17中任一项所述的宿主细胞，其中将一个或多个该多核苷酸进行密码子优化以用于在该宿主细胞中表达，这样使得该多核苷酸的编码序列包含编码序列的密码子的至少60％的最偏好或第二最偏好密码子，这样使得相对于非优化序列，在该宿主细胞中更有效地翻译该密码子优化的序列。
19.如权利要求18所述的宿主细胞，其中该编码序列包含该编码序列的密码子的至少80％最偏好密码子。
20.一种用于制备细胞油的方法，该方法包括培养如权利要求11-19中任一项所述的宿主细胞，以产生细胞油，其中该油包括甘油三酸酯和微藻固醇。
21.如权利要求20所述的方法，其中该细胞油包括由固醇谱表征的固醇，并且该固醇谱具有超过β-谷固醇的过量的麦角固醇和/或22,23-二氢菜籽固醇、多孔固醇或穿贝海绵固醇的存在。
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